CN1430505A - 用于主动栓塞术的微球体 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一些可注射组合物，这些组合物含有能够在栓塞药物治疗中有效递送生物活性治疗因子的聚合物载体，这些载体具有生物相容性、可膨胀性、基本亲水性、无毒性，并且基本为球形。本发明还涉及利用这些可注射组合物进行栓塞基因治疗的方法，尤其用于血管发生依赖性和非血管发生依赖性疾病的治疗。

Description

用于主动栓塞术的微球体

1.发明领域

本发明涉及一些组合物和方法，用于疾病的治疗，其中包括癌症和其他多种血管发生依赖性疾病，更明确地说，本发明涉及一些组合物，这些组合物含有生物活性治疗因子，这些治疗因子与微球载体(涂有或含有这些因子)相结合，此外还涉及将这些组合物用于主动(active)栓塞治疗的方法。

2.发明背景

2.1 血管发生依赖性疾病

在寻求医学治疗方法的所有疾病中，血管发生依赖性疾病(即需要或诱导血管生长的疾病)是重要的一部分。例如在美国，癌症仍然是导致死亡的第二大原因，在总死亡率中占五分之一以上。简单地说，癌症的特征是细胞群体的分裂不受控制，最典型的是导致一个或多个肿瘤的形成。这些肿瘤的特征还包括，由吸引循环系统中的不同因子引发脉管系统的向内生长，从而使肿瘤能够继续生长。一般而言，癌症要比以往更容易诊断，但仍有多种形式的癌症即使在早期被检测到也无法治愈。

目前有多种方法被用来治疗癌症，其中包括，例如，多种外科手术方法。但是若只通过外科手术进行治疗，许多患者(特别是某些类型的癌症患者，如乳腺癌患者、脑癌患者、结肠癌患者和肝癌患者)会出现癌症复发。因而除外科手术之外，许多癌症还要用涉及细胞毒性化疗药物(如新长春碱、阿霉素、紫杉醇、长春碱、顺铂、氨甲蝶呤、5-FU，等等)和(或)放射性治疗的组合疗法进行治疗。但该方法的难题是放疗剂和化疗剂对正常组织具有毒性，并经常导致危及生命的副作用。此外，这些方法一般具有极高的失效率(缓解率)。

除手术治疗、化疗和放疗之外，还有人尝试利用个体自身的免疫系统来清除癌性细胞。例如，有人建议以细菌或病毒的组分为佐剂来刺激免疫系统，从而破坏肿瘤细胞。(参考《癌症的生物治疗原理》Oldham(ed.)Raven Press，New York，1987。)这些制剂已成为动物肿瘤模型中普遍有效的佐剂和非特异性刺激剂，但是仍未被证实在人体内普遍有效。

该方法的另一缺陷是，局部复发和局部疾病控制仍然是恶性肿瘤治疗的主要问题。详细地说，到目前为止，每年共有630,000名患者(美国)患有局限性疾病(没有远距离迁移扩散的迹象)；这在所有确诊的恶性肿瘤患者中(不包括非黑素瘤皮肤癌或原位癌)占64％。对这些患者中的绝大多数而言，最可能的治愈方法是对该疾病进行手术切除，实际上有428,000名患者可以在初次治疗后痊愈。但不幸的是，有202,000名患者(或是所有局限性疾病患者的32％)会在初次治疗后复发。在复发患者中，由于该疾病的局部复发而导致复发的患者每年可达133,000(或是所有局限性疾病患者的21％)。由于该疾病的远距离迁移而导致复发的患者每年为68,000(所有局限性疾病患者的11％)。每年还约有102,100名患者因该疾病的局部生长失控而直接导致死亡。以乳腺癌和肝癌作为癌症的实例来说明患者所面临的难题。

乳腺癌

该难题对乳腺癌而言显得尤为突出，每年约有186,000名美国妇女患乳腺癌，而该疾病的死亡率50年来没有发生变化。通过根治性乳房切除术、改良的根治性乳房切除术或肿块切除术对该疾病进行手术切除仍是治疗该疾病的主要方法。不幸的是，只通过肿块切除术进行治疗的患者有39％会出现疾病复发，并且奇怪的是有25％的患者会在切除边缘出现清晰的肿瘤组织学结构。这些局部复发中的90％都出现在原切除部位的2厘米范围内。

肝癌

1999年，死于原发性肝癌的人数在120万以上，其中大多数处在亚洲。原发性肝癌是指肝癌的原始癌性细胞是在肝脏中形成，而不是从身体的其他癌变部位迁移到肝脏中。已知某些类型的肝炎患者极有可能产生原发性肝癌，其中包括丙型肝炎，这是一种可导致肝脏炎症的病毒性疾病。据估计，美国的丙型肝炎阳性人数目前超过400万，因而原发性肝癌的发病率可能会急剧增加。

70％以上的原发性肝癌患者不宜通过手术治疗，但可以接受放射疗法和化学疗法。目前可选用的治疗方法如下：

化学疗法：化学疗法试图通过杀死快速分裂的肿瘤细胞来控制癌症。但体内的许多非癌性细胞，如骨髓细胞，也能够快速分裂，从而很容易被化学疗法无意中杀死。因此，足以根除癌症的剂量通常会由于破坏非癌性细胞而导致危及生命的副作用。

化学栓塞术以及多种仍未成熟的治疗方法：例如，经皮乙醇注射方法是会产生疼痛，并且只适用于3-4cm以内的小肿瘤。

移植术：移植术也是一种可使用的治疗方法，但费用昂贵，并且受器官可用性的限制，而且仍可能导致肿瘤复发。此外，有创性手术也会带来复发的危险。

此外，化学疗法还可能损害人体的天然抗肿瘤屏障。

子宫纤维瘤

非癌性肿瘤的相关例子为子宫纤维瘤，也称为平滑肌瘤。这些非癌性肿瘤由特定类型的肌纤维和纤维性结缔组织构成。子宫平滑肌瘤的病因仍然未知。大多数子宫平滑肌瘤患者最初都不表现出症状，并且在出现异常出血、尿频、疼痛、肿胀和性交困难之前都不接受治疗。在美国，每年约有25,000,000名妇女患子宫平滑肌瘤，其中约有5,500,000名表现出明显症状并寻求治疗。到目前为止，患有子宫平滑肌瘤的妇女几乎没有什么可行的疗法供选择，这些疗法包括子宫切除术、肌瘤切除术、医学管理以及“观望和等待”。目前可用于治疗子宫平滑肌瘤的疗法都带有明显的缺陷，其中包括：使育龄妇女暂时或永远丧失生育能力、漫长的恢复期、不良的心理影响导致更年期提前、费用昂贵，其中包括药费、手术费以及频繁的长期住院治疗的费用，有创性手术操作和激素治疗带来的不适及副作用，和(或)平滑肌瘤复发的危险。

因此，非常需要一种统一而有效的治疗方法对患者进行治疗，尤其是乳腺癌、肝癌、胰腺癌和子宫平滑肌瘤患者。

被动(passive)栓塞术

被动栓塞术是一种已尝试用于肿瘤治疗但成效有限的方法。简单地说，是把栓塞性物质注射到为肿瘤提供营养的血管中，从而蓄意将该血管堵塞。已尝试用于该方面的物质有很多种，其中包括自体同源物，如脂肪、血块和切下的肌肉片段，以及人工合成物，如毛织物、棉花、钢球、塑料或玻璃珠、钽粉、硅化合物、放射性颗粒、可吸收的无菌明胶海绵(Sterispon，Gelfoam)、氧化纤维素(Oxycel)、钢螺管、乙醇、冻结的人脑硬膜(Lyodura)、维管胶原蛋白(Avitene)、胶原原纤维(Tachotop)、聚乙烯醇海绵(PVA；Ivalon)、灌注有钡的硅球(Biss)以及可拆气球。利用这些方法可以使肿瘤暂时减小，但是肿瘤通常会因新血管的长入而继续生长。

与肿瘤形成有关的一个问题是产生癌性阻塞物，它可阻碍胆管、气管、食道、脉管系统或尿道等身体通道中的物质流动。目前已研制了一种支架装置用于使肿瘤或其他物质阻塞的管道保持通畅。常用支架的典型实例包括Wallstent、Strecker支架、Gianturco支架及Palmaz支架。但使用支架的主要问题是，它们不能阻止肿瘤向内生长或炎性物质穿过支架缝隙。如果该物质到达支架内部并损害支架的内腔，将会导致其插入的身体通道被阻塞。此外，身体内的支架可能会诱导反应性组织或炎性组织(如血管、成纤维细胞、白细胞)进入支架内腔，从而导致支架的局部封闭或完全封闭。

2.2 治疗性栓塞术或主动栓塞术

将细胞毒性药物给药至肿瘤附近可以提高肿瘤与正常组织的递送比率。这种区域性给药的实现方法可以是，直接通过肿瘤的供血将药物递送到肿瘤内或特定肿瘤所处的体腔中。局部药物灌注的优点是能够提高靶组织的最大药物浓度，但靶组织暴露于药物还只局限于血液第一次流经被灌注的器官。第一次流过时未被吸收的部分药物将流遍全身，从而将被正常组织吸收。

治疗性血管闭塞(栓塞术)是用于原位治疗某些病情的技术。其实现方法一般是采用导管，从而能够在显象监控的条件下将颗粒性阻塞剂(栓子)安置到循环系统中。这些技术还涉及肿瘤、血管畸形、出血等不同过程的血管。特别是用于肿瘤时，血管闭塞能够在栓塞手术中缓解疼痛、减少失血，甚至可导致肿瘤坏死，从而避免手术。当用于血管畸形时，这些技术能够使正常组织的血流恢复正常，有助于手术进行并降低出血的危险。当用于出血过程时，血管闭塞可导致血流量减少，从而促进动脉开口的愈合。

此外，还可根据治疗的病情，将栓塞术用于暂时性目的或永久性目的。

现有技术已知的有不同类型的栓子。具体地说，可包括流体剂(丙烯酸胶、凝胶、粘性悬液，等等)或颗粒剂(各种聚合物、硬脑膜、明胶海绵、球体、气囊、螺旋，等等)。已知流体栓子的主要缺点是对组织有毒性，从而可导致坏死现象，并且使导管有粘连的危险。流体栓子的另一缺陷是只能以被动方式发挥作用，并且不能用于药物递送。

利用微球体可以实现对靶位点进行局部给药以及使其损耗最小化的双重功能。经局部动脉引入的微球体可以被组织的脉管系统捕获并释放其携带的药物。这种双重作用被称为主动栓塞。微球体可以是固态组合物，也可以是多孔组合物，这些微球体可通过制备而含有离散的液态或固态药物分子(Zimmer and Kreuter，1995)。在治疗由单一输入动脉供血的诸如肝脏等器官内的肿瘤时，微球体具有独特的应用价值(Chen et al.1994)。当靶器官中的肿瘤是唯一需要治疗的区域时，微球体则具有极其重要的价值。

已知有涉及在基于栓塞药物的治疗方法中使用微球体的研究，但是在基因治疗中使用微球体的研究相对较少。例如，通常利用玻璃珠经静电引力从异源混合物中选择性提取DNA。也有利用羟磷灰石来纯化核酸(Kumazawa et al.，1992)，以及在超声的引导下直接将球形羟磷灰石植入肝脏肿瘤，从而用于持续释放阿霉素(Kunieda et al.，1993)，但其他一些研究表明，这种独特的基质可能根本不宜暴露于哺乳动物组织(Dass et al.，1997a，1997b)。还有将DNA保持在表面带有二乙氨乙基(DEAE)官能团的PDB微球体上(Katz et al.，1990；Maa et al.，1990)。

因此，确实需要再研制一些用于递送基因的微球体。所需的主要优点是能够通过血流将抗瘤剂特异性地导向肿瘤脉管系统。此外，就破坏肿瘤细胞而言，最希望得到的效果可能是阻断肿瘤的供血，同时破坏其营养供应和废物排出。

3.发明概述

在一项实施方案中，本发明提供一些组合物和方法，用于以多种不同的聚合材料为载体向哺乳动物递送药物、疫苗、多核苷酸以及诊断剂或成像剂。在一项优选实施方案中，本发明提供用于递送这些制剂的微颗粒，特别是微球体。在最优选的实施方案中，本发明提供由转染剂递送多核苷酸的微球体。

更详细地说，在优选实施方案中，本发明使用的聚合物载体包括任何能“携带”或能与本发明的生物活性治疗因子和转染剂相联接的颗粒。优选的聚合材料是以基本上呈球形、基本上具有亲水性、惰性和离子性的交联聚合物为基础，其大小足以导致栓塞并释放生物活性治疗因子。在一项优选实施方案中，所述生物活性治疗因子与所述转染剂物理连接，该转染剂则与微颗粒相连接。

在一项实施方案中，本发明提供一些生物活性治疗组合物，以及用这些组合物来治疗癌症和包括癌前病症在内的其他多种血管发生依赖性疾病的方法和装置。作为一方面，本发明提供的组合物含有(a)一种生物活性治疗因子、(b)一种聚合物载体和(c)一种转染剂。

作为另一优选方面，本发明提供的组合物含有(a)一种生物活性治疗因子的编码多核苷酸、(b)一种聚合物载体和(c)一种转染剂。

作为另一优选方面，本发明提供的组合物含有(a)一种生物活性治疗因子的编码多核苷酸、(b)一种聚合物载体和(c)一种脂多胺转染剂。

在本发明的范围内，可以用多种不同的分子做为生物活性治疗因子，例如包括，但不局限于，抗血管发生因子、抗瘤剂、肽和肽类似物、抗体或其片段、疫苗、酶、核酸、天然的或合成的RNA和DNA，其中包括重组RNA和重组DNA以及反义RNA和反义DNA；锤头状RNA、核酶、反义基因核酸、单链和双链的RNA和DNA及其类似物。

本发明的聚合材料包括，但不局限于，丙烯酸聚合物、乙烯醇聚合物、丙烯酸酯聚合物、聚乳酸、聚丙烯酰胺、聚酐、多糖、聚硅酮，或其混合物。更优选的聚合材料是丙烯酸家族的基本亲水的交联共聚物，如聚丙烯酰胺与其衍生物、聚丙烯酸酯与其衍生物，以及聚烯丙基化合物与聚乙烯基化合物。为获得稳定性和不可再吸收性，所有这些聚合物都可以是交联的形式。

在本发明公开的多项实施方案中，生物活性治疗因子都与转染剂物理结合，并且生物活性治疗因子-转染剂复合物与聚合载体物理结合。优选的是通过液相吸附色谱中熟知的结合力将生物活性治疗因子吸附，这些结合力包括，但不局限于，离子交换、疏水性、分子识别或其组合。在一项优选实施方案中，生物活性治疗因子先与转染剂结合成复合物，然后再与本发明的聚合载体混合或接触。

作为本发明的一方面，可以将选定的生物活性治疗因子与转染剂相混合，从而使生物活性治疗因子与转染剂形成一种具有特殊性质的复合物，如疏水性加强的复合物。

作为本发明的另一方面，可以将聚合物载体与充足剂量的可转染性生物活性治疗因子相混合。导致生物活性治疗因子与聚合物载体物理连接的是离子性结合力和疏水性结合力，这些结合力可通过添加盐来加强，例如，但不局限于，氯化钠或诸如含钡或含碘的盐等造影剂。

在本发明公开的多项实施方案中，吸附在栓塞性物质表面的生物活性治疗因子-转染剂复合物一旦被递送到适当部位，则会逐渐释放并通过多种机制进入周围细胞，这些机制包括，例如，但不局限于，自发的内吞作用、受体介导的内吞作用、内体分解作用以及细胞膜去稳定作用或其组合。生物体液中的天然成分可诱导生物活性治疗因子释放，这些成分可降低栓塞性物质与生物活性治疗因子之间的吸附强度，直至后者被完全释放。还可利用能够在体内水解的键来调节生物活性治疗因子的释放，其中包括，但不局限于，酯键或苷键。在其他多种实施方案中，还可利用与生物活性治疗因子结合的肽来调节生物活性治疗因子的释放，其中可肽键可以被细胞的蛋白水解酶分解。

另一方面，本发明提供一些用于使血管发生栓塞的方法，这些方法包括将治疗有效剂量的生物活性治疗因子给药于需要治疗的患者的血管，从而有效地封闭该血管。在一项实施方案中，可以同时或依次将生物活性治疗因子递送至滋养肿瘤的血管中。

另一方面，本发明提供一些方法，用于使肿瘤生成性血管发生依赖性疾病中的血管出现栓塞，这些方法包括将治疗有效剂量的一种组合物给药于需要治疗的患者的血管，从而有效地封闭该血管，其中，该组合物含有一种编码生物活性治疗因子的多核苷酸，这种多核苷酸与一种转染剂结合，并且这种多核苷酸-转染剂还与一种聚合物载体结合。

作为另一更优选的方面，本发明提供一些方法，用于使肿瘤生成性血管发生依赖性疾病中的血管出现栓塞，这些方法包括将治疗有效剂量的一种组合物给药于需要治疗的患者的血管，从而有效地封闭该血管，其中，该组合物含有一种编码生物活性治疗因子的多核苷酸，这种多核苷酸与一种脂多胺转染剂结合，并且这种结合的多核苷酸-转染剂还与一种基本亲水的微球体结合。

另一方面，本发明提供一些方法，用于使肿瘤生成性血管发生依赖性疾病中的血管出现栓塞，这些方法包括将治疗有效剂量的一种组合物给药于需要治疗的患者的血管，从而有效地封闭该血管，其中，该组合物含有一种病毒载体或一种病毒样颗粒，这种病毒载体或病毒样颗粒含有编码生物活性治疗因子的多核苷酸，并且与一种转染剂结合，此外，这种结合的病毒载体-转染剂还与一种基本亲水的微球体结合。

作为另一更优选的方面，本发明提供一些方法，用于使肿瘤生成性血管发生依赖性疾病中的血管出现栓塞，这些方法包括将治疗有效剂量的一种组合物给药于需要治疗的患者的血管，从而有效地封闭该血管，其中，该组合物含有一种病毒载体或一种病毒样颗粒，这种病毒载体或病毒样颗粒含有编码生物活性治疗因子的多核苷酸，并且与一种转染剂结合，此外，这种结合的病毒载体-转染剂还与一种基本亲水的微球体结合。

再一方面，本发明提供一些方法，用于抑制非肿瘤生成性血管发生依赖性疾病患者的血管发生，这些方法包括将治疗有效剂量的药物与编码生物活性治疗因子的多核苷酸一同给药于需要治疗的非肿瘤生成性血管发生依赖性疾病患者，从而抑制新血管形成，其中，所述多核苷酸与一种转染剂结合，并且这种结合的多核苷酸-转染剂还与一种聚合物载体结合。作为本发明的另一方面，可以将这种药物掺入到聚合物载体中，以避免对同时给药的生物活性治疗因子的递送产生干扰。

另一方面，本发明提供一些方法，用于对非肿瘤生成性非血管发生依赖性疾病患者进行治疗，这些方法包括将治疗有效剂量的药物与结合在转染剂上的可编码生物活性治疗因子的多核苷酸一同给药于需要治疗的患者，从而改善非肿瘤生成性非血管发生依赖性疾病的症状，其中，所述药物包含在聚合物载体中，从而避免对同时给药的与聚合物载体结合的生物活性治疗因子的递送产生干扰。

在其他优选实施方案中，本发明的组合物含有(a)一种编码生物活性治疗因子的多核苷酸、(b)一种聚合物载体和(c)带有一种较轻的d族过渡金属(如钒系、钼系、钨系、钛系、铌系或钽系)的可抑制新血管形成的脂多胺转染剂。

在其他优选实施方案中，本发明的组合物含有(a)一种编码生物活性治疗因子的多核苷酸、(b)一种阳离子交联的微颗粒和(c)一种带有转染增强剂的脂多胺转染剂。

在另一优选实施方案中，本发明提供一种用于将多核苷酸递送至哺乳动物宿主的方法，该方法包括，将一种结合有多核苷酸和转染剂的基本亲水的聚合物给药于患有疾病的哺乳动物。本发明还提供该方法的一些实施方案，其中包括，将结合有多核苷酸和转染剂的基本亲水的所述聚合物给药以用于基因治疗、所用聚合物微球体的大小足以使投药部位的血管发生栓塞，以及所用聚合物的大小不足以使投药部位的血管发生栓塞，但足以锚定在肿瘤中。

在另一优选实施方案中，本发明提供一种用于使哺乳动物宿主发生主动栓塞的方法，该方法包括，将结合有可表达抗血管发生物的生物活性治疗因子的一种基本亲水的聚合物给药于患有血管发生依赖性疾病的哺乳动物，其中的生物活性治疗因子与一种转染剂相结合。

另一方面，本发明提供一些用于处理肿瘤切除部位的方法，这些方法包括，在肿瘤切除之后，将上文描述的一种组合物给药于切除边缘，从而抑制癌症的局部复发和该部位的新血管形成，其中，该组合物含有一种聚合物载体和一种结合有生物活性治疗因子的转染剂。

其他方面，本发明提供一些方法，用于使非肿瘤生成性血管发生依赖性疾病中的血管出现栓塞，这些方法包括，将治疗有效剂量的一种组合物给药于血管，从而有效地封闭该血管，其中的组合物含有一种与编码生物活性治疗因子的多核苷酸结合的药物。

另一方面，本发明提供一些方法，用于使肿瘤生成性血管发生依赖性疾病中的血管出现栓塞，这些方法包括，将治疗有效剂量的一种组合物给药于血管，从而有效地封闭该血管，并将编码生物活性治疗因子的多核苷酸递送到细胞内用于表达，其中的组合物含有一种与编码生物活性治疗因子的多核苷酸相结合的药物。

另一方面，本发明提供一种用于使哺乳动物宿主发生主动栓塞的方法，该方法包括，将结合有生物活性治疗因子的一种基本亲水的聚合物给药于患有疾病的哺乳动物，其中的生物活性治疗因子与一种转染剂相结合。

另一方面，本发明提供一种适用于主动栓塞的微颗粒，这种微颗粒含有一种能够使血管发生栓塞的聚合物，其中的聚合物与一种连接有遗传物质的转染剂相连接。

其他方面，本发明提供一些用于对器官的新生血管性疾病进行治疗的方法，其中的器官包括眼，但不局限于此，该方法包括，将治疗有效剂量的生物活性治疗因子给药于需要治疗的患者，例如给药于患者的眼部，从而抑制其新血管形成。

本发明提供一些适用于治疗癌症和其他非肿瘤生成性血管发生依赖性疾病的组合物和方法，此外还提供其他一些相关的优势。这些癌症包括，但不局限于，肝癌、卵巢癌、肾癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、头及颈部肿瘤、乳腺癌、Kaposi肉瘤和表浅性膀胱癌。但是除癌症之外，还可利用本发明的生物活性治疗因子或组合物来治疗其他多种以血管生长异常为特征的非肿瘤生成性血管发生依赖性疾病。这些非肿瘤生成性血管发生依赖性疾病的典型实例包括，但不局限于，肥厚性瘢痕及瘢痕瘤、增生型糖尿病性视网膜病变、风湿性关节炎、动静脉畸形、动脉粥样硬化斑块、延迟性创伤愈合、血友病性关节炎、非愈合性骨折、Osier-Weber综合症、牛皮癣、生脓性肉芽肿、硬皮病、tracoma、月经过多和血管粘连。

在另一项实施方案中，本发明提供一些用于进行栓塞性基因治疗的试剂盒，这些试剂盒含有：(a)适用于栓塞术的微球体悬液；以及(b)适用于将遗传物质递送至细胞的转染剂。在另一实施方案中，本发明还提供一些试剂盒，其中，聚合物装在一个小瓶中，与编码生物活性治疗因子的多核苷酸结合的转染剂装在另一个小瓶中，将两个小瓶的内容物混合即可形成药用组合物。另一实施方案中，本发明还提供一些试剂盒，其中，聚合物装在一个小瓶中，转染剂装在另一个小瓶中，编码生物活性治疗因子的多核苷酸装在又一单独的小瓶中，将所有三个小瓶的内容物混合即可形成药用组合物。另一实施方案中，本发明还提供一些试剂盒，其中，组分(a)适用于栓塞术的微球体悬液以及组分(b)适用于将遗传物质递送至细胞的转染剂都装在一个小瓶中。

参考下文的详细描述和附图将可以了解本发明的这些方面以及其他方面。此外，下文列举的多篇参考文献都在此完整引入作为参考。

4.发明详述

定义：

文中使用的“基本为球形”通常是指接近完美球形的一种形状，完美球形的定义是外表面积最小的一种体积。明确地说，本发明的“基本呈球形”是指，从颗粒的任一横截面观察，大直径平均值与小直径平均值之间的差异不超过20％。本发明的微球体表面在放大高达1000倍时仍显得光滑。本发明的微球体除包括颗粒之外，还包括文中描述和定义的其他物质。

本发明中使用的“细胞粘连促进剂”是指因存在于微球体中或与微球体相结合而能够促进或加强细胞与微球体表面粘连的任何物质。这些物质通常是以共价键或相互渗透聚合的方式结合于微球体表面的蛋白质。

本发明中使用的“治疗剂”是指对血管发生依赖性疾病的进程或血管发生依赖性疾病导致的生物学或生理学反应具有治疗效果的任何物质。治疗剂的实例是抗炎剂，它能够预防或降低与血管发生依赖性疾病相关的炎症效应。

本发明中使用的“化学修饰”是指在微球体的产生过程中或通过微球体与多种制剂或组织的混合或接触而产生的微球体化学性质及特征的改变，从而使微球体一旦被注射到体内即能够行使肿瘤栓塞以及其他功能。

本发明中使用的“增稳物”或“增稳化合物”是指能提高文中描述的组合物、药物前体、靶配体和(或)其他生物活性治疗因子的稳定性的任何物质，其中包括，例如，混合物、悬浮液、乳剂、分散剂、囊泡，等等。“增稳物”的定义包括本发明的某些生物活性治疗因子和药物前体。“增稳物”的定义还包括本发明的某些转染剂。稳定性的增加包括，例如，维持在相对平衡的状态，其实例包括，例如，组合物对破坏、分解、降解等作用的抵抗能力提高。举例来说，转染剂中的阳离子悬垂头会降低转染的效率，例如化合物C₁₂GluPh_nN⁺和C₁₄GluPh_nN⁺就是如此，而DOTB/DOSC等化合物具有最短的间隔区，因而可产生最高的表面电荷密度和最佳的转染效率。

在涉及含有生物活性治疗因子、药物前体和(或)其他生物活性剂的微球体的优选实施方案中，增稳化合物可用于形成微球体，也可用于稳定微球体，这两种方式都可以在需要释放之前基本上(包括完全地)阻止微球体释放某些生物活性治疗因子、药物前体和(或)生物活性剂或使其减至最少。在本发明的有关阻止微球体释放某些生物活性治疗因子、药物前体和(或)其他生物活性剂的描述中，使用的术语“基本上”是指，在需要释放之前，与微球体表面结合或包含在其中的量约保持在50％以上，而优选的是在需要释放之前，与微球体表面结合或是在治疗性药物制剂的情况下包含在微球体中的量约在60％以上，更优选的则约在70％以上，再更优选的是约在80％以上，最优选的是约在90％以上。在特别优选的实施方案中，约有95％以上的生物活性治疗因子、药物前体和(或)生物活性剂在需要释放之前与微球体表面保持结合，或是在治疗性药物制剂的情况下包含在微球体中。生物活性治疗因子、药物前体和(或)生物活性剂还可以在需要释放之前完全与微球体表面保持结合或包含在微球体中(即与微球体表面保持结合或包含在其中的量为约100％)。

典型的增稳物包括，例如，脂类、蛋白质、聚合体、糖类和表面活性剂。所得的混合物、悬浮液、乳剂等可含有包裹生物活性治疗因子或生物活性剂的壁(即薄膜、膜，等等)，如果需要，也可以基本上不含壁或膜。增稳物还可以在需要的情况下形成微滴。增稳物还可含有盐和(或)糖。在某些实施方案中，增稳物可以是基本上(包括完全)交联的形式。增稳物可以是中性的，也可以带有正电荷或负电荷。

文中使用的“交联”、“交联的”、“交联性”通常是指两种或多种增稳物通过一种或多种桥相连接，这些增稳物包括脂类、蛋白质、聚合体、糖类、表面活性剂增稳物、生物活性治疗因子和(或)生物活性剂。这种桥可由一种或多种元素、基团或化合物组成，并且通常可用于将第一增稳物分子的原子与第二增稳物分子的原子相连接。交联桥可包括共价连接和(或)非共价连接。交联物中的桥可由多种元素、基团和(或)化合物中的任何一种来形成，增稳物的交联可以是天然形成的，也可以通过合成方法产生。举例来说，交联可以在角质素、胰岛素和其他蛋白质等由肽链构成的物质中天然产生，这些肽链可通过胱氨酸残基上的二硫键相连接。作为选择，还可通过适当的化学修饰来影响交联，例如，可以通过加热、高能辐射等方式使增稳物等化合物与充当交联剂的一种化学物质相结合。其实例包括，使硫形成二硫键而实现交联、利用有机过氧化物实现交联、利用高能辐射实现不饱和物的交联，与二羟甲替氨基甲酸酯交联，等等。如果需要，增稳化合物、生物活性治疗因子和(或)生物活性剂也可以是基本交联的。

文中使用的术语“基本上”是指约50％以上的增稳化合物含有交联桥。如果需要，也可以是约60％、70％、80％、90％、95％以上甚至100％的增稳化合物含有这些交联桥。作为选择，增稳物还可以是非交联的，即约50％以上的增稳化合物不含交联桥，如果需要，也可以是约60％、70％、80％、90％、95％以上甚至100％的增稳化合物不含交联桥。

文中使用的“结合”是指本发明的生物活性治疗剂、转染剂和微球体之间的连接。生物活性治疗剂与转染剂之间的结合可以导致一种复合物形成，也可以不导致复合物形成。这种结合可包括，但不局限于，共价结合、非共价结合，以及离子相互作用、静电相互作用、范得华力、氢键、亲水相互作用和疏水相互作用，其定义将在下文做进一步说明。

文中使用的“共价结合”是指涉及两个原子共用结合轨道中的电子的一种分子间结合或键。

文中使用的“非共价结合”是指两个或多个独立分子之间的不涉及共价键的分子间相互作用。分子间的相互作用取决于多种因素，其中包括相关分子的极性，如果存在的话，则还包括相关分子的电荷(正电荷或负电荷)。非共价结合可选自离子相互作用、偶极-偶极相互作用、范得华力及其组合。

文中使用的“离子相互作用”或“静电相互作用”是指带有正电荷或负电荷的两种或多种分子之间的一种相互作用。此时，“离子相互作用”或“静电相互作用”是指，例如，带正电荷的第一分子与带负电荷的第二分子之间的吸引。离子相互作用或静电相互作用包括，例如，带有负电荷的增稳物，如遗传物质，与带有正电荷的脂类，如溴化十二烷基三甲铵等阳离子脂，之间的吸引。

文中使用的“范得华力”是指非极性分子之间的吸引力，这种吸引力可以用量子力学来解释。范得华力通常与瞬时偶极矩有关，这种瞬时偶极矩由邻近的分子诱导产生，并且涉及电子排布的改变。

文中使用的“氢键”是指可以在共价连接于氧、硫或氮等负电性原子的氢原子与另一个负电性原子之间产生的吸引力或桥。氢键可以在第一分子的氢原子与第二分子的负电性原子之间产生(分子间氢键)。氢键还可以在单个分子中同时包含的氢原子与负电性原子之间产生(分子内氢键)。

文中使用的“亲水相互作用”是指基本上能结合、吸收和(或)溶解于水的分子或其部分。这种相互作用能够导致可逆型凝胶的膨胀和(或)形成。

文中使用的“疏水相互作用”是指基本上不能结合、吸收和(或)溶解于水的分子或其部分。

为了阐明本发明的公开内容，发明详述部分将分为以下几个小节，但这并不作为限制。

本发明提供一些安全有效的栓塞性基因治疗方法，这些方法适用于癌症和其他多种血管发生依赖性疾病的治疗。因此，这些栓塞性基因疗法可以使内科和(或)外科医生受益，其中包括，但不局限于，介入性放射学家。外科医生可以在手术前、手术中或手术后使用本发明的方法和组合物。

简单地说，基因治疗是将基因以DNA或RNA分子的形式递送到患者的细胞内。这些基因可作为核酸表达构建体盒的一部分，构建体盒可含有目的基因和能够指导该基因在靶细胞内高水平表达的启动子/增强子元件。细胞内的酶使该DNA转录成信使RNA分子，这些分子可作为模板将基因序列翻译成蛋白产物。然后该蛋白在靶细胞内或周围组织中执行某种功能，以校正细胞缺陷或杀死肿瘤细胞等细胞。

因此，基因疗法和细胞疗法包括将遗传信息引入细胞或受影响的组织，从而校正缺陷或异常(突变、异常表达，等等)，或确保治疗性目的蛋白的表达。可以在体外将这种遗传信息引入由器官提取的细胞，然后把改良的细胞重新引入体内，也可以直接在体内将遗传信息引入适当的组织。目前已描述了多种用于转移这种遗传信息的技术，其中包括涉及DNA与DEAE-葡聚糖(Pagano et al.，J.Virol.1(1967)891)、DNA与核蛋白(Kaneda et al.，Science.243(1989)375)、DNA与脂类(Felgner et al.，PNAS84(1987)7413)、DNA与聚赖氨酸、脂质转染法(Fraley et al.，J.Biol.Chem.255(1980)10431)，等等，的多种转染技术。

栓塞术是将血液流经的血管部分封闭或完全封闭。治疗性栓塞术是一种用来封闭动脉或静脉的方法，可用于纠正动静脉畸形等机能障碍，或阻止血液流动以中止对实性肿瘤(癌瘤)的营养供给。最常用的治疗性栓塞术不将任何活性分子运载和(或)递送到栓塞物质沉积的部位，因而是一种“被动”操作。

本发明涉及一种在减少血流的同时局限性递送可转染性遗传物质的“主动”栓塞术，这两种操作的目的相同，即减少或消除癌细胞。

一方面，本发明提供的组合物含有(a)一种生物活性治疗因子、(b)一种微球体载体和(c)一种转染剂。在一项优选实施方案中，本发明提供一些通过将可注射组合物给药于需要治疗的肿瘤及其他多种血管发生依赖性疾病患者来进行基因治疗的方法，所述可注射组合物含有(a)一种生物活性治疗因子、(b)一种微球体载体和(c)一种转染剂。

在另一项优选实施方案中，本发明提供一些通过将可注射组合物给药于需要治疗的肿瘤及其他多种血管发生依赖性疾病患者来进行基因治疗的方法，所述可注射组合物含有(a)一种生物活性治疗因子、(b)一种微球体载体和(c)一种转染剂，其中的可注射组合物借助于适当号的针头被直接给药于肿瘤或患病组织。

在又一项优选实施方案中，本发明提供一些通过将可注射组合物给药于需要治疗的肿瘤及其他多种血管发生依赖性疾病患者来进行基因治疗的方法，所述可注射组合物含有(a)一种生物活性治疗因子、(b)一种微球体载体和(c)一种转染剂，其中的可注射组合物通过脉管系统注射被直接递送至肿瘤或患病组织。

另一方面，本发明提供一些用于处理肿瘤切除部位的方法，这些方法包括，在肿瘤切除之后，将一种组合物给药于切除边缘，从而抑制癌症的局部复发和该部位的新血管形成，其中的组合物含有一种抗肿瘤药，如紫杉酚、阿霉素、顺铂、紫杉醇，但不局限于此。

还可以对本发明的聚合物载体或优选微球体进行化学修饰，使其具有治疗作用、血管发生作用、抗血管发生作用、生血管特性或其组合。在一项实施方案中，本发明的微球体含有由交联聚合物制成的颗粒，从而在其结构内可能含有不同性质的化学物质，此外，本发明的微球体的特性在于具有表面共价键，因此，可以对本发明的微球体进行化学修饰。此外，还可以通过微球体在给药后与邻近细胞和组织之间的相互作用来对本发明的微球体进行化学修饰。

本发明的方法具有以下优点：(1)被注射物在最初注射的组织中不容易转移，因而可以在无需反复给药或不对患者产生副作用的情况下实现基因治疗，(2)被注射物不容易因生物化学作用或免疫系统或淋巴系统而被降解、转移或清除，因而该方法更为有效和持久，(3)被注射物的大小适合用18-26号(gauge)或30或更小号的针头进行注射，因而该方法更为精确和有效，并且对患者的干扰最小，(4)被注射颗粒具有柔性，不易碎，这有助于在不破裂的情况下进行方便的注射，因而可用于简便而安全的注射，以及(5)被注射颗粒具有不规则的形状，并且不会结块，因而可同样用于简便而精确的注射。这些优点，无论是单独或是组合来看，都可以提高治疗的有效性，并且使患者感觉更安全、方便和舒适。

4.1 聚合物

4.1.1 微颗粒

能够与本发明的多核苷酸或其他遗传物质以及转染剂结合并且能定向于作用部位的任何聚合物都可用于递送本发明的多核苷酸或其他遗传物质。在一项优选实施方案中，使用的聚合物应能够携带多核苷酸或其他遗传物质，以及能引起栓塞。优选的是在本发明中使用一种微颗粒，最优选的是使用一种微球体。

有非常多种聚合性载体可用于本发明，这些聚合性载体的典型实例包括，但不局限于，聚乙烯乙酸乙烯酯(40％交联)、聚(D，L-乳酸)寡聚物及聚合物、聚(L-乳酸)寡聚物及聚合物、聚乙二醇酸、乳酸与乙二醇酸的共聚物、聚己内酯、聚戊内酯、聚酐、聚己内酯或聚乳酸与聚乙二醇的共聚物、多糖、聚硅酮，及其混合物。

4.1.2 微球体

在本发明所述药物的递送方面，优选的聚合物是微球体。在药物递送实施方案中，可以选择性使用转染剂。

用于在本发明中使用的优选微珠或微球体(文中统称为微球体)应基于具有生物相容性和亲水性的基本上呈球形的无毒聚合物。这些微球体可以用18或更小号的针头进行注射，并且不会被免疫系统或淋巴系统清除。优选的是用能够促进细胞粘连的制剂包被聚合物。还可以将活细胞连接于微球体，以形成能够与周围组织相连结的细胞层，从而加强微球体的长期稳定性。

本发明的微球体包含弹料，优选的弹料选自丙烯酸聚合物、乙烯醇聚合物、丙烯酸酯聚合物、多糖、聚硅酮，及其混合物。更优选而言，适用于该申请书的亲水性共聚物为丙烯酸家族的共聚物，如聚丙烯酰胺及其衍生物、聚丙烯酸酯及其衍生物，以及聚烯丙基化合物和聚乙烯基化合物。在另一项实施方案中，本发明的微球体还可基于聚乙酸乙烯酯与一种疏水性阳离子聚合物结合的组合。为获得稳定性和不可再吸收性，所有这些聚合物都可以是交联的形式，并且其结构中还可含有其他化学物质，这些化学物质可具有诸如趋化作用、促进细胞与细胞或组织粘连等特性。

本发明的一些微球体可用于植入身体的不同部位，优选是通过注射植入，这些微球体由一种不可再吸收的亲水性聚合物构成，该聚合物中含有适当的细胞粘连物，此外还可含有不透射线的分子或其他标记制剂，从而有助于在干预之前或在干预过程中利用放射学方法进行定位。

本发明使用的微球体对组织和细胞不产生毒性，并且具有生物相容性，此外还可通过促进细胞生长而粘连于植入部位的多种细胞和组织。此外，这些微球体具有不可再吸收性和生物不可降解性，因而在被植入所需部位之后能够保持稳定和持久，并且能维持其一般形状和位置。在一项可选实施方案中，本发明的微球体可以被再吸收，因而可以被生物降解。这种能够被再吸收和生物降解的微球体可基于，例如，多糖及多糖衍生物，但不局限于此。

一般而言，本发明使用的微球体可以是任意的形状，优选的是基本上呈球形的微球体。本发明所用微球体的直径可为约10μm-2000μm。本发明优选使用的能够使细胞粘连于表面的微球体的直径为约40μm-1000μm。

本发明优选的微球体能够用18号或更小的针头进行注射，并且可以被免疫系统和淋巴系统的巨噬细胞或其他成分清除。此时，微球体的优选平均直径为约40μm-400μm，更优选的则为约50μm-200μm。在最优选的实施方案中，可注射微球体的平均直径为约70μm-120μm。

作为本发明的另一方面，本发明使用的一类微球体是基于一些含有多种聚合物的颗粒，这些颗粒是无毒的、生物相容的、可膨胀性的和亲水的，并且基本上为球形。可膨胀型微球体是一些高度吸水的交联聚合物，因而在某些条件下，一旦与水性介质接触就能够膨胀。该领域的技术人员都了解，交联聚合物的膨胀程度通常取决于聚合材料的性质和交联的程度。用于悬浮微球体或与微球体接触的溶剂的盐浓度、离子浓度或pH等性质也可影响膨胀的程度。

通过精细控制某些可膨胀型交联聚合物的大小和膨胀程度，就可利用这些微球体实现栓塞和基因递送。本发明首选的是具有高度吸水性的聚合材料。该领域的技术人员都了解，可以用化学方法或放射学方法来调节聚合物的交联程度，从而进一步控制这些聚合物的膨胀性。

对含有这些聚合物的微球体而言，更重要的是通过控制用于悬浮微球体的溶剂来进一步调节这些微球体的膨胀。这可通过本文公开的两个步骤来实现。首先，可根据所用的特定微球体，在注射之前利用适当的溶剂、盐浓度和pH水平来精细调节微球体的大小。注射前的微球体可以保持其原始大小，也可将其与溶剂接触而使其膨胀至特定程度。控制注射前的膨胀程度，以使微球体易于用30号或更小的针头进行注射。其次，可在注射后以及在注射部位与组织接触时，将微球体进一步膨胀至预定大小或保持其注射前大小，这两种情况下的大小都能够使微球体稳定在注射部位，并且能实现所需的栓塞性基因治疗效果。注射前的膨胀程度以及注射后的膨胀程度取决于使用的特定微球体以及所治疗的皮肤缺陷的性质和部位。

本发明所用微球体的膨胀前直径为约10μm-400μm。膨胀前微球体的优选直径为约10μm-200μm，最优选的则为约10μm-120μm。注射和膨胀之后的微球体平均直径为约40μm以上，优选的是为约50μm以上，更优选的则为约70μm以上。本发明的微球体可膨胀至原始大小的约15倍。利用上述方法可以调节注射后微球体的充分膨胀尺寸，从而使其稳定在注射部位，同时不会对组织造成潜在伤害。另外，还可根据注射部位的生理状况、微球体的原始大小、使用的溶剂以及微球体的注射前膨胀程度等因素来预先确定注射后微球体的充分膨胀尺寸。因此，可以根据特定病情的栓塞性基因治疗要求来设计特定的注射策略。微球体的这些尺寸和性质的优势在于，能够使微球体易于用30号或更小的针头进行注射，同时微球体的大小足以使其稳定在注射部位，并且不会被免疫系统的巨噬细胞或其他成分清除。

对本发明的微球体而言，可能存在的变化包括将这些微球体替换成经过促细胞粘着剂处理的任何具有生物相容性、无毒性和不可再吸收性的聚合物颗粒、膜、纤维或其他固体基质。本发明还包括美国专利5,925,683公开的可胶凝流体溶液型栓塞性物质的应用，该专利的整个内容在此引入作为参考。本发明还包括能够在注射后进行原位交联并形成促细胞粘连性固体填充剂的可溶性线型聚合物。本发明还涉及空微球体(微泡)的制备和(或)注射方法，这些空微球体可以是预先制成的，也可以是通过使用适当导管而在适当位置产生的。

本发明使用的微球体或其他固体基质具有柔性，因而能够在不被永久改变的条件下很容易地进入和穿过注射装置及小导管，但本发明的微球体还对植入过程中及植入后产生的肌肉收缩力具有抵抗性。此外还具有热稳定性，因而能够简单方便地进行灭菌和冷冻保存。

本发明使用的微球体或其他固体基质还可以在悬浮液中保持稳定，因而可以在悬浮液中配制和保存微球体或其他固体基质，并且可以用不同的流体进行注射。更具体地说，微球体的亲水特性允许将其置于悬浮液中，特别是高热产生的(无热原的)可注射无菌溶液，并且可避免产生聚集或与储存容器以及导管、注射器、针头等植入装置的壁粘连。

在一项实施方案中，本发明的优选微球体同时具有亲水性和阳离子性。优选的是，这些微球体含有一种由中性亲水性单体、双功能单体、一种或多种带正电的单体，以及可选的能够使微球体被检测的功能化单体形成的共聚物。这些微球体还可含有一种或多种细胞粘连促进剂和一种标记制剂。优选的是该共聚物为亲水性丙烯酸类共聚物，其中含有共聚合形式的占重量约25-98％的中性亲水性丙烯酸单体、占重量约2-50％的双功能单体以及占重量约0-50％的一种或多种带正电的单体。举例来说，可按照本发明的描述，利用法国专利2,378,808描述的共聚物来制备基本的微球体共聚物，该专利在此引入作为参考。与亲水性丙烯酸单体相同，丙烯酰胺及其衍生物、甲基丙烯酰胺及其衍生物或羟甲基甲基丙烯酸酯也可以使用。双功能单体的实例包括，但不局限于，N’，N’-亚甲基-双-丙烯酰胺、N’，N’-二烯丙基酒石酰胺或乙二醛-双-丙烯酰胺。此外，带正电的单体包括，但不局限于，具有叔胺或季胺功能的单体，优选的是二乙氨乙基乙基丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺基丙基三甲铵或丙烯酰胺基乙基三乙铵。在一项特别优选的实施方案中，使用的共聚物含有占重量约25-98％的甲基丙烯酰胺以及占重量约2-50％的N’，N’-亚甲基-双-丙烯酰胺。

作为本发明另一相关方面，可以在认为必要的情况下对栓塞性物质的疏水性或离子特性进行修饰，方法是，例如，引入烃链和(或)可电离的亲水性化学基团，但不局限于此。对栓塞性物质进行的这些修饰可导致生物活性治疗因子与转染剂之间的吸附力增强，使其足以用来调节生物活性治疗因子的递送时间。还可通过调节生物活性治疗因子与转染剂之间的吸附力来控制与栓塞性物质结合的生物活性治疗因子的绝对量。

在本发明的一项特别有利的实施方案中，可以通过粘着剂的网状化来提高微球体的稳定性。以明胶为例，可以在能够作用于明胶胺的双功能化学剂中挑选网状化制剂(如戊二醛、甲醛、乙二醛，等等)。

本发明的另一实施方案是使微球体在光下和体内可见。例如，还可以在微球体合成之后对其进行标记。其实现方法可以是，例如，与荧光标记衍生物相连接(其中包括，例如，异硫氰酸荧光素(FITC)、罗丹明异硫氰酸盐(RITC)，等等)。获得功能化单体的方法一般是将单体与一种标记物耦联，以使微球体可以直接显象，所述标记物可以是一种化学染料，如Cibacron蓝和普施安红HE-3B(Boschetti，J.Biochem-Biophys.Meth.，19：21-36(1989))。可用于此类标记的功能化单体的实例包括N-丙烯酰环六亚甲基Cibacron蓝或N-丙烯酰环六亚甲基普施安红HE-3B；磁共振成像剂(铒、钆或磁石)；造影剂，如钡盐或碘盐，其中包括，例如，可按照Boschetti et al.描述的条件(Bull.Soc.Chim.，No.4 France，(1986))加以制备的酰氨基-邻-丙酰基-氨基-3-三碘-2，4，6-苯甲酸。当使用钡盐或磁石时，可直接以粉末形式将其添加到原始单体溶液中。

该领域熟知的多种细胞粘连促进剂都可以在本发明中使用。详细地说，细胞粘连促进剂可选自胶原、明胶、葡糖胺聚糖、纤连蛋白、植物凝集素、聚阳离子(如聚赖氨酸、壳多糖等)，或其他任何天然的或合成的生物细胞粘着剂。

优选的是，细胞粘连促进剂以每毫升沉积微球体中含有约0.1-1g的剂量存在于微球体或其他固体基质中。

微球体的制备方法包括悬液聚合、逐滴聚合或该领域技术人员已知的其他任何方法。选择的微球体制备方法通常取决于所得微球体的预期特性，如微球体的直径和化学组成。本发明的微球体还可以用该领域描述的标准聚合方法来加以制备(如参考《微球体、微囊和脂质体》John & Wiley Sons，Arshady R.，Ed.，vol.2，p.171-189(1999)中的E.Boschetti，用于生物层析和生物医学的微球体，第一篇，微珠的制备，在此引入作为参考)。微球体的制备是从含有胶原(明胶是一种变性胶原)等粘着剂的单体水溶液开始。然后将该溶液与一种非水相容性溶剂混合，以产生一种微滴悬液，再用适当的催化剂经过单体聚合作用使其转变成固体凝胶。然后用过滤或离心方法收集微球体并清洗。

将细胞粘连促进剂或标记制剂引入微球体的方法可以是亲和层析技术中众所周知的化学耦联法，该方法被称为“配体固定化法”。另一种引入方法是在组成微球体的凝胶网络中进行扩散，然后用沉淀或化学交联法原位捕获扩散的分子。

本发明的微球体还可以用该领域描述的标准聚合方法来加以制备，如法国专利2,378,808以及美国专利5,648,100、5,635,215和5,648,100，这些专利均在此引入作为参考。一般而言，在含有聚合反应引发剂的条件下，溶液中的单体聚合是在约0℃-100℃以及约40℃-60℃温度下进行的。

选自氧化还原系统的聚合反应引发剂具有其自身的优势。值得注意的是，还可以使用N，N，N’，N’-四甲基乙二胺或二甲氨基丙烯腈、有机过氧化物如苄基过氧化物或者甚至2，2’-偶氮-双-异丁腈，与碱金属过硫酸盐的组合物。该领域的技术人员可根据单体量和设定的聚合速率来调整引发剂的使用量。聚合反应可以在团块或乳剂中进行。

在进行团块聚合反应时，可以使引发剂与含有不同溶解成分的水基溶液在均质介质中发生聚合。这样可获得块状水样凝胶，然后可将其分割成微球体，方法是，例如，使其穿过网筛。

优选的制备方法是进行乳剂或悬液聚合，因为该方法可直接获得所需尺寸的微球体。其实施方法如下：将含有不同溶解成分(如不同单体、细胞粘着剂)的水基溶液与一种不与水互溶的液态有机相搅拌混合，此外还可以选择性地在乳化剂存在的条件下进行。调节搅拌速率，以使水相乳剂在有机相中形成所需直径的微滴。然后加入引发剂以启动聚合反应。该反应伴随有放热反应，因而可通过测量反应介质的温度来跟踪反应的进展情况。

还可以用植物油或矿物油、特定石油蒸馏产物、氯化烃或其混合物作为有机相。此外，当聚合引发剂包含多种成分(氧化还原系统)时，可以在乳化之前将其中的一种添加到水相中。

由此获得的微球体可通过冷却、倾析和过滤方法加以回收。然后按尺寸类别将其进行分离，并进行清洗，以去除任何痕量的副产物。

聚合反应期的跟踪方法可以是跟踪细胞粘着剂的网状形成期，对合成之后再通过接合而获得可识别性的微球体而言，也可根据标记制剂期进行跟踪。

4.2 生物活性治疗因子

本发明的生物活性治疗因子至少包括以下的一种或多种：抗瘤剂、抗血管发生剂、激素和类固醇、维生素、肽和肽类似物、抗体或其片段、抗有丝分裂因子、疫苗、酶、抗过敏剂、循环系统药物、抗结核剂、抗病毒剂、抗心绞痛剂、抗细菌剂、抗真菌剂、抗炎剂、抗原生动物剂、抗风湿剂、麻醉剂、强心苷、镇静剂、局部麻醉剂、抗组胺药、辐射敏感剂、全身麻醉剂，或其组合。

4.3 用于在基因疗法中使用的生物活性治疗因子

对基于多核苷酸的栓塞性基因疗法而言，使用的多核苷酸可以编码本发明的任一种生物活性治疗因子，其中，这些多核苷酸与本发明的一种转染剂相结合。编码本发明所述生物活性治疗因子的遗传物质包括，例如，但不局限于，天然的或合成的核酸、多核苷酸、RNA和DNA，其中包括重组RNA和重组DNA以及反义RNA和反义DNA；锤头状RNA、核酶、反义核酸，单链和双链的RNA和DNA，及其类似物，如脱氧核苷酸硫代磷酸酯和脱氧核苷酸二硫代磷酸酯。可使用的遗传物质的类型包括，例如，质粒、噬菌粒、粘粒、酵母人工染色体、缺陷型病毒或“辅助”病毒等表达载体上携带的基因，以及带有遗传物质的病毒样颗粒。这些多核苷酸还可以与其他元件结合使用，其中包括，例如，组织特异性增强子、核定位信号等，但不局限于此。

此外，这些遗传物质还可结合于，例如，蛋白或其他聚合物。例如在一项实施方案中，本发明还提供将定向多克隆抗体和定向单克隆抗体与聚合物载体、生物活性治疗因子和转染剂结合使用的方法。适用于本发明所述微球体的基因治疗剂的实例包括，至少编码部分HLA基因的DNA、至少编码部分营养障碍基因的DNA、至少编码部分囊性纤维化穿膜调节基因的DNA、至少编码部分IL-2基因的DNA、至少编码部分TNF的DNA、能够与至少编码部分Ras的DNA结合的反义寡核苷酸。在多种不同类型疾病的治疗中都可以使用编码特定蛋白的DNA。例如，肿瘤坏死因子和(或)白介素-2可用于治疗早发癌症；HDL受体可用于治疗肝脏疾病；胸腺嘧啶激酶可用于治疗卵巢癌、脑癌或HIV感染；HLA-B7可用于治疗恶性黑素瘤；白介素-2可用于治疗成神经细胞瘤、恶性黑素瘤或肾癌、白介素-4可用于治疗癌症；HIV包膜蛋白可用于治疗HIV感染；反义ras/p53可用于治疗肺癌；腺苷脱氨酶可用于治疗ADA缺陷；而因子VIII可用于治疗B型血友病。可参阅，例如，Science 258，744-746。

4.4 用于在药物疗法中使用的生物活性治疗因子

对本发明的基于药物的栓塞治疗而言，可使用的生物活性治疗因子包括一种或多种与微球体结合的下述制剂。

抗瘤剂，其中包括，例如，但不局限于，铂化合物(如螺铂、顺铂和卡铂)、阿霉素、丝裂霉素C、ansamitocin、博来霉素、硫酸博来霉素、阿糖胞苷、阿糖腺苷、硫酸酰聚赖氨酸、长春新碱、白消安、苯丁酸氮芥、左旋苯丙氨酸氮芥(如PAM、L-PAM或苯丙氨酸氮芥)、巯基嘌呤、米托坦、盐酸丙卡巴肼、放线菌素(放线菌素D)、盐酸柔红霉素、盐酸阿霉素、紫杉醇、丝裂霉素、普卡霉素(光辉霉素)、氨鲁米特、雌莫司汀磷酸盐、氟他胺、亮丙瑞林醋酸盐、甲地孕酮醋酸盐、他莫昔芬枸橼酸盐、睾内酯、曲洛司坦、安吖啶(m-AMSA)、天冬酰胺酶(L-天冬酰胺酶)、Erwina天冬酰胺酶、依托泊苷(VP-16)、α-2a干扰素、α-2b干扰素、替尼泊苷(VM-26)、长春碱硫酸盐(VLB)、长春新碱硫酸盐、氨甲蝶呤，以及carzelesin。

血液产物，其中包括，例如，但不局限于，促红细胞生成素、胃肠外离子、氯高铁血红素和血卟啉，及其衍生物。

生物学应答调节物，其中包括，例如，但不局限于，胞壁酰二肽、胞壁酰三肽、淋巴因子(如脂多糖、巨噬细胞活化因子等细菌内毒素)、细菌亚单位(如分支杆菌、棒状杆菌)、合成的二肽、N-乙酰-胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺，以及前列腺素。

抗真菌剂，其中包括，例如，但不局限于，酮康唑、制霉菌素、灰黄霉素、氟胞嘧啶(5-fc)、双氯苯咪唑、两性霉素B、蓖毒素，以及β-内酰胺类抗生素(如磺胺净素)。

激素和类固醇，其中包括，例如，但不局限于，生长激素、促黑素细胞激素、促肾上腺皮质激素、地塞米松、醋酸地塞米松、磷酸钠地塞米松、可的松、醋酸可的松、氢化可的松、醋酸氢化可的松、氢化可的松环戊丙酸酯、磷酸钠氢化可的松、氢化可的松琥珀酸钠、强的松、强的松龙、醋酸强的松龙、磷酸钠强的松龙、强的松龙叔丁乙酯、强的松龙特戊酸酯、曲安西龙、曲安奈德、己曲安西龙、曲安西龙双醋酸酯、甲基强的松、醋酸甲基强的松、甲基强的松琥珀酸钠、氟尼缩松、二丙酸氯地米松、磷酸钠氯地米松、倍他米松、磷酸二钠维他米松、磷酸钠维他米松、醋酸倍他米松、倍他米松磷酸二钠、醋酸氯泼尼松、皮质酮、去氧皮质酮、醋酸去氧皮质酮、去氧皮质酮特戊酸酯、去氧米松、雌二醇、氟甲松龙、醋酸氟甲松龙、醋酸二氯松、氟氢可的松、氟米龙、氟泼尼龙、帕拉米松、对氟米松醋酸酯、雄甾酮、氟甲睾酮、醛甾酮、去氢甲睾酮、甲雄烯二醇、甲睾酮、诺乙雄龙、睾酮、庚酸睾酮、丙酸睾酮、去氢马烯雌酮、马烯雌酮、雌二醇苯甲酸酯、双丙酸雌二醇、雌三醇、雌酮、雌酮苯甲酸酯、乙酰氧基孕烯醇酮、醋酸阿那孕酮、醋酸氯地孕酮、醋酸氟孕酮、羟甲基孕酮、醋酸羟甲基孕酮、羟基孕酮、醋酸羟基孕酮、羟基孕酮己酸酯、醋酸美仑孕酮、炔诺酮、孕烯醇酮、孕酮、乙炔雌二醇、美雌醇、二甲炔睾酮、炔孕酮、双醋炔诺醇、炔诺酮、炔诺酮醋酸酯、炔诺酮、氟西奈德、氟氢缩松、氟尼缩松、氢化可的松琥珀酸钠、琥钠甲强龙、强的松龙磷酸钠、曲安奈德、羟二酮琥钠螺内酯、氧雄龙、羟甲烯龙、丙甲松龙、环戊丙酸睾酮、苯乙酸睾酮、环戊丙酸雌二醇，以及异炔诺酮。

维生素，其中包括，例如，但不局限于，维生素B12 neinoicacid、视黄醛及其衍生物，如维生素A棕榈酸酯、α-维生素E、萘醌、维生素D3、维生素B及四氢叶酸。

肽和肽类似物，其中包括，例如，但不局限于，锰超氧化物歧化酶、组织纤溶酶原激活剂(t-PA)、谷胱甘肽、胰岛素、多巴胺、包含RGD、AGD、RGE、KGD、KGE或KQAGDV的肽类配基(与GPIIBIIIa受体具有亲和性的肽)、鸦片肽、脑啡肽、内啡肽及其类似物、人类绒毛膜促性腺激素(HCG)、促肾上腺皮质激素释放因子(CRF)、胆囊收缩素及其类似物、缓激肽及其类似物和促进剂及抑制剂、弹力蛋白、加压素、胃蛋白酶、胰高血糖素、P物质、整合蛋白、硫甲丙脯酸、依那普利、赖诺普利及其他ACE抑制剂、促肾上腺皮质激素(ACTH)、催产素、降钙素、IgG或其片段、IgA或其片段、IgM或其片段、效应细胞蛋白酶受体的配基(所有亚类)、凝血酶、链激酶、尿激酶、t-PA及其所有活性片段或类似物、蛋白激酶C及其结合配基、干扰素(α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素)、集落刺激因子(CSF)、粒细胞集落刺激因子(GCSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、肿瘤坏死因子(TNF)、神经生长因子(NGF)、血小板衍生生长因子、淋巴毒素、上皮生长因子、成纤维细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子、促红细胞素、转化生长因子、制瘤素M、白介素(1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11和12)、金属蛋白激酶配基、胶原酶，及其激动剂和拮抗剂。

文中使用的抗体包括，例如，但不局限于，基本纯化的抗体或其片段，其中包括非人类抗体或其片段。在多项实施方案中，本发明的基本纯化的抗体或其片段可以是人类抗体、非人类抗体、嵌合抗体和(或)人源化抗体。其中的非人类抗体可以是山羊抗体、小鼠抗体、绵羊抗体、马抗体、鸡抗体、兔抗体，或鼠抗体。作为选择，本发明的非人类抗体还可以是嵌合抗体和(或)人源化抗体。在治疗人类患者时，尤其需要完全的人类抗体。嵌合抗体是一种分子，其中的不同部分来自不同种动物，如含有鼠mAb可变区和人免疫球蛋白稳定区的嵌合抗体(Cabilly et al.，美国专利4,816,567；和Boss et al.，美国专利4,816397，在此完整引入作为参考。)此外，在本发明范围内的非人类抗体还可以是多克隆抗体或单克隆抗体。本发明的任一种抗体都可以与一种治疗性部分或可检测物质相结合。能与本发明的抗体结合的可检测物质的非限制性实例包括酶、辅基、荧光物质、发光物质、生物发光物质和放射性物质。

本发明提供与聚合物载体、生物活性治疗因子和转染剂结合的定向多克隆抗体及定向单克隆抗体的应用。这些抗体可有效地在本发明的方法中使用，并能够将结合于转染剂的聚合物和生物活性治疗因子定向递送至作用部位。文中使用的术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指一类抗体分子，这些抗体分子只含有一种能够与特定表位发生免疫反应的抗原结合部位。多克隆抗体的制备方法可以是，按照上文的描述用本发明的一种多肽作为免疫原对适当的主体进行免疫。优选的多克隆抗体组合物选自针对本发明的一种或多种多肽的抗体，这些多肽包括，例如，用本发明的组合物进行治疗的肿瘤的癌细胞表面的一种受体。

抗有丝分裂因子，其中包括，但不局限于，雌莫司汀及其磷酸化衍生物、雌莫司汀磷酸盐、阿霉素、amphethinile、combretastatinA4，以及秋水仙素。

疫苗，其中包括，例如，但不局限于，肺炎球菌疫苗、脊髓灰质炎疫苗、炭疽热疫苗、结核(BCG)疫苗、甲型肝炎疫苗、霍乱疫苗、脑膜炎球菌A、C、Y疫苗、W135疫苗、鼠疫疫苗、狂犬病(人类二倍体)疫苗、黄热病疫苗、日本脑炎疫苗、伤寒(苯酚灭活和热灭活的)疫苗、乙肝疫苗、白喉疫苗、破伤风疫苗、百日咳疫苗、b型流感嗜血杆菌疫苗、灰质炎疫苗、麻疹疫苗、腮腺炎疫苗、风疹疫苗、水痘疫苗、肺炎链球菌Ty(活体突变菌)疫苗、Vi(Vi荚膜多糖)疫苗、DT(类毒素)疫苗、Td(类毒素)疫苗、aP(灭活的细菌抗原/非细胞的(accelular)(DtaP))疫苗、Hib(细菌多糖-蛋白结合物)疫苗、乙肝病毒(来自病毒抗原/重组抗原的灭活血清)疫苗、流感疫苗、轮状病毒疫苗、呼吸道合胞体病毒(RSV)疫苗、人星状病毒疫苗、轮状病毒疫苗、人类A型及B型流感病毒疫苗、甲肝病毒疫苗、减毒的活体3型副流感病毒疫苗、肠道病毒疫苗、逆转录病毒疫苗，以及细小核糖核酸病毒疫苗。

能够用本发明的组合物和方法进行治疗的疾病包括，例如，但不局限于，与肝、肾有关的肿瘤、急性淋巴细胞白血病、急性髓样白血病、尤因肉瘤、妊娠滋养层癌、霍奇金氏病、非霍奇金氏淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、弥散性大细胞淋巴瘤、卵泡性混合淋巴瘤、淋巴细胞淋巴瘤、横纹肌肉瘤、睾丸癌、肾母细胞瘤、肛门癌、膀胱癌、乳腺癌、慢性淋巴细胞白血病、慢性骨髓性白血病、毛细胞白血病、头颈癌、肺(小细胞性)癌、多发性骨髓瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、卵泡性淋巴瘤、卵巢癌、脑瘤(星细胞瘤)、颈癌、结肠癌、肝细胞癌、卡波西肉瘤、肺(非小细胞性)癌、黑素瘤、胰腺癌、前列腺癌、软组织肉瘤、乳腺癌、结肠癌(第III期)、骨源性肉瘤、卵巢癌(第III期)、睾丸癌，或其组合。

酶，其中包括，例如，但不局限于，碱性磷酸酶、I型环加氧酶，及其激动剂和拮抗剂。

抗过敏剂，其中包括，例如，但不局限于，氨氯地平。

抗凝剂，其中包括，例如，但不局限于，苯丙香豆醇和肝素。

循环系统药物，其中包括，例如，但不局限于，心得安。

抗结核剂，其中包括，例如，但不局限于，对氨基水杨酸、异烟肼、卷曲霉素硫酸盐、环丝氨酸、乙胺丁醇盐酸盐、乙硫异烟胺、吡嗪酰胺、利福平，以及链霉素硫酸盐。

抗病毒剂，其中包括，例如，但不局限于，阿昔洛韦、金刚烷胺、叠氮胸苷(AZT或Zidovudine)、三唑核苷，以及一水阿糖腺苷(腺嘌呤阿糖腺苷，ara-A)。

抗心绞痛剂，其中包括，例如，但不局限于，硫氮卓酮、利心平、异搏停、丁四硝酯、硝异梨醇、硝酸甘油(三硝酸甘油酯)，以及季戊四醇四硝酸酯。

抗生素，其中包括，例如，氨苯砜、氯霉素、新霉素、头孢氯氨苄、头孢羟氨苄、头孢氨苄、头孢拉定、红霉素、氯林可霉素、林可霉素、阿莫西林、氨苄青霉素、巴氨西林、羧苄青霉素、双氯青霉素、环青霉素、哌氯青霉素、缩酮氨苄青霉素、甲氧苯青霉素、乙氧萘青霉素、苯唑青霉素、青霉素G、青霉素V、羟噻吩青霉素、利福平，以及四环素。

抗炎剂和镇痛剂，其中包括，例如，二氟苯水杨酸、布洛芬、吲哚美辛、甲氯灭酸盐、甲灭酸、萘普生、羟基保泰松、保泰松、吡罗昔康、舒林酸、托美丁、阿司匹林及其水杨酸盐。

抗原生动物剂，其中包括，例如，但不局限于，氯喹、甲消唑、羟基氯喹、奎宁，以及锑酸葡胺。

抗风湿剂，其中包括，例如，但不局限于，青霉胺。

麻醉剂，其中包括，例如，但不局限于，复方樟脑酊及鸦片制剂，如可待因、海洛因、非那酮、吗啡和鸦片。

强心苷，其中包括，例如，但不局限于，去乙酰毛花苷、洋地黄毒苷、地高辛、洋地黄苷和洋地黄。

神经肌肉阻断剂，其中包括，例如，但不局限于，阿曲库铵甲磺酸盐、三碘季铵酚、己芴溴铵、碘甲箭毒、泮库溴铵、氯化琥珀酰胆碱(氯琥珀胆碱)、氯化筒箭毒碱，以及维库溴铵。

镇静剂(催眠剂)，其中包括，例如，但不局限于，异戊巴比妥、异戊巴比妥钠、烯丙异丙巴比妥、仲丁巴比妥钠、水合氯醛、乙氯叔醇、炔己蚁胺、盐酸氟安定、导眠能、盐酸甲氧异丁嗪、甲乙哌啶酮、咪达唑仑盐酸盐、三聚乙醛、戊巴比妥、戊巴比妥钠、苯巴比妥钠、司可巴比妥钠、甲丙巴比妥、替马西泮，以及三唑仑。

局部麻醉剂，其中包括，例如，但不局限于，雅布必卡因盐酸盐、氯普鲁卡因盐酸盐、依替卡因盐酸盐、盐酸利多卡因、甲哌卡因盐酸盐、普鲁卡因盐酸盐，以及丁卡因盐酸盐。

全身麻醉剂，其中包括，例如，但不局限于，氟哌利多、甲苄咪唑、含氟哌利多的枸橼酸芬太尼、盐酸氯胺酮、美索比妥钠，以及硫喷妥钠。

放射性颗粒或放射性离子，其中包括，例如，但不局限于，锶、铼、钇、锝和钴。

优选的生物活性治疗因子是一种抗瘤剂、激素、类固醇、抗真菌剂、肽或肽类似物。更优选的生物活性治疗因子为氟美松、两性霉素B、阿德里亚霉素、丝裂霉素C、紫杉酚、阿霉素或组织纤溶酶原激活剂(t-PA)。优选的是本发明的生物活性治疗因子在低浓度下具有高活性。此外，本发明提供的涉及定向的方面还能够使体内治疗部位的有效浓度不被稀释，因而可以在治疗中使用更低的剂量。将本发明所述生物活性治疗因子向患者给药的剂量取决于，例如，采用的特定生物活性治疗因子及其给药方法，以及患者的年龄、性别、体重和生理状况。一般而言，可以在治疗初期采用小剂量，然后再小量增加，直到在特定情况下获得所需的效果。此外，该领域的技术人员还可以根据参考文献，如《Physician’s Desk Referenee》，Medical EconomicsCompany，Montvale，N.Y.07645-1742，来确定特定生物活性治疗因子的适当剂量，以及在通过本发明的方法组合使用治疗药物和基因疗法时，将本发明的相应药物前体给药于患者的剂量。根据本发明，还可以将药物前体给药于患者(如患者的某个区域)，从而用于，例如，治疗患者的病情(即病态、疾病、病症，等等)。药物前体可以按上述方法使用，也可以组合到其他实施方案中，如乳剂。

4.5 用于递送多核苷酸的转染剂

通过传统的转化或转染技术可以在真核细胞内引入含有天然的或合成的核酸、多核苷酸、RNA和DNA的遗传物质，其中包括重组RNA和重组DNA以及反义RNA和反义DNA；锤头状RNA、核酶、反义基因核酸，单链和双链的RNA和DNA，及其类似物，这些遗传物质可以与其他元件结合或不结合，其中包括，例如，组织特异性增强子以及核定位信号，但不局限于此。此处使用的术语“转化”和“转染”是指该领域已知的用于将外源核酸导入宿主细胞的多种技术，其中包括，例如，但不局限于，磷酸钙或氯化钙共沉淀法、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质转染或电穿孔。在Sambrook，et al.(见上文)和其他实验室手册中可以查阅到转化或转染宿主细胞的适当方法。

已知对哺乳动物细胞进行稳定转染时，只有小部分细胞能够将外源DNA整合到基因组中，具体的量将取决于使用的表达载体和转染技术。为了鉴定和筛选这些整合体，通常是将一种编码选择性标记的基因(如抗生素抗性基因)与目的基因一同引入到宿主细胞内。优选的选择性标记包括能够赋予抗药性的标记，如G418抗性、潮霉素抗性和氨甲蝶呤抗性。通过药物筛选可以鉴定出被引入核苷酸稳定转染的细胞(例如，带有选择性标记基因的细胞将会存活，其他细胞则会死亡)。

为了在体内有效地递送本发明的生物活性治疗组合物，可以采用多种转染剂。适于在本发明的方法中使用的转染剂的代表性实例包括，但不局限于，磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、季胺两亲性DOTMA((二油酰氧丙基)溴化三甲铵，由GIBCO-BRL公司生产，商品名为Lipofectin)(Felgner et al，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84，7413-7417；Malone et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86，6077-6081))；带有三甲铵悬垂头的亲脂性谷氨酸二酯(Ito et al.(1990)Biochem.Biophys.Acta1023，124-132)；可代谢的母体脂，如阳离子脂双-十八烷基氨基甘氨酰精胺(DOGS，Trandfectam，Promega)和二棕榈酰磷酯酰乙醇戊基精胺(DPPES)(J.P.Behr(1986)Tetrahedron Lett.27，5861-5864；J.P.Behr et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86，6982-6986)；可代谢的季铵盐(DOTB，甲基硫酸N-(1-[2，3-二油酰氧]丙基)-N，N，N-三甲铵(DOTAP)(Boehringer Mannheim)、聚乙烯亚胺(PEI)、二油酯、ChoTB、ChoSC、DOSC)(Leventis et al.(1990)Biochim.Inter.22，235-241)；3β[N-(N’，N’-二甲氨基乙烷)-氨基甲酰]胆固醇(DC-Chol)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)/3β[N-(N’，N’-二甲氨基乙烷)-氨基甲酰]胆固醇(DC-Chol)的1∶1混合物(Gao et al.，(1991)Biochem.Biophys.Acta 1065，8-14)，精胺、亚精胺、脂多胺(Behr et al.，Bioconjugate Chem，1994，5：382-389)，亲脂性聚赖氨酸(LPLL)(Zhou et al.，(1991)Biochem.Biophys.Acta 939，8-18)，含有过量磷酯酰胆碱/胆固醇的[[(1，1，3，3-四甲基丁基)甲苯氧基]乙氧基]乙基)二甲基苄基氢氧化铵(DEBDA氢氧化物)(Ballaset al.，(1988)Biochem.Biophys.Acta 939，8-18)，溴化鲸蜡基三甲铵(CTAB)/DOPE的混合物(Pinnaduwage et al.，(1989)Biochem.Biophys.Acta985，33-37)，谷氨酸(TMAG)与DOPE、CTAB、DEBDA的亲脂性二酯、双十二烷基溴化铵(DDAB)以及硬酯胺与磷酯酰乙醇胺的混合物(Roseet al.，(1991)Biotechnique 10，520-525)，DDAB/DOPE(TransfectACE，GIBCO BRL)，以及带有脂质的寡聚半乳糖(Remy etal.，待发表)。

本发明还包括利用多种转染促进剂来提高将生物活性治疗因子递送至细胞的效率。适当的转染促进剂包括，例如，但不局限于，DEAE-葡聚糖、polybrene、溶酶体-分裂性肽(Ohmori NI et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun 1997 Jun 27，235(3)：726-9)，基于软骨素的蛋白多糖、硫酸蛋白多糖、聚氮丙啶、聚赖氨酸(Pollard Hetal.J Biol Chem，1998 273(13)：7507-11)、整合蛋白结合肽CYGGRGDTP、非糖类线性葡聚糖、甘油、连接寡核苷酸3’-端的核苷间胆固醇基团(Letsinger，R.L.1989 Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：(17)：6553-6)、溶血磷酯、溶血磷酯酰胆碱、溶血磷酯酰乙醇胺，以及1-油基溶血磷酯酰胆碱。

适当转染剂的优选实例包括，但不局限于，在1992年12月15日授予Behr，et al.的美国专利5,171,678、1995年12月19日授予Behr，et al.的美国专利5,476,962以及1997年4月1日授予Behr，et al.的美国专利5,616,74 中公开的脂多胺，这些专利的全部公开内容均在此完整引入作为参考。

本发明的特别优选的转染剂包括在1992年12月15日授予Behr，et al.的美国专利5,171,678、1995年12月19日授予Behr，et al.的美国专利5,476,962以及1997年4月1日授予Behr，et al.的美国专利5,616,745中公开的通式(I)的脂多胺。

通式(I)的脂多胺尤其适用于作为转染真核细胞的载体。当通式(I)的脂多胺分散在水中时可以形成单层超微颗粒，这些颗粒在离子介质中不稳定，并且可通过其阳离子部分与质粒或寡核苷酸DNA紧密结合，从而压缩质粒或寡核苷酸DNA并将其包裹在脂质层中。通过使用相对于核苷酸过量的正电荷可以使脂质/DNA复合物吸附在细胞膜上，从而使DNA易于被细胞摄取。

此外，通式(I)的这些脂多胺还可用于转染脆弱细胞(其中包括，例如，但不局限于，中间垂体细胞或前垂体细胞、嗜铬细胞、周围或中枢神经元)，这些细胞不能用传统方法(磷酸钙共沉淀或葡聚糖技术)进行转染。

4.6 重组表达载体

另一方面，本发明涉及递送具有或不具有栓塞作用的载体。优选的是这些表达载体含有一种编码本发明所述生物活性治疗因子或多肽(或其部分)的核酸。此处使用的术语“载体”是指一种核酸分子，这种核酸分子能够转运与其连接的另一种核酸。一类载体为“质粒”，它是指能够连接附加DNA片段的一种双链环状DNA袢。另一类载体为病毒载体，其中的附加DNA片段可结合到病毒基因组中。病毒载体的具体实例包括，但不局限于，用于通过本发明的微球体和转染剂进行基因治疗的腺病毒和逆转录病毒。本发明还涉及含有生物活性治疗因子的病毒样颗粒的应用，其中的病毒样颗粒与转染剂物理连接，转染剂又连接于微颗粒。本发明还涉及含有生物活性治疗因子的病毒样颗粒的应用，其中的病毒样颗粒与转染剂物理连接，转染剂又连接于微颗粒。这些病毒样颗粒可以用聚氮丙啶(PEI)经二硫键形成而连接于整合蛋白结合肽CYGGRGDTP。这些PEI/RGD包含肽/复合物具有腺病毒的结构特性，如大小和以及受保护的中心核，此外还具有腺病毒的“早期”特性，例如由整合蛋白介导的细胞进入以及酸触发的内体逃逸(Erbacher et al.，待发表)。

某些载体能够在导入的宿主细胞中自主复制(如具有细菌复制起始点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其他载体(如非附加型哺乳动物载体)则能够在导入宿主细胞后整合到细胞的基因组中，从而与宿主基因组共同复制。此外，某些载体，即表达载体，能够指导与其有效连接的基因的表达。一般而言，重组DNA技术通常是以质粒(载体)作为表达载体。但本发明还应包括其他形式的具有类似功能的表达载体，如病毒载体(如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)。

本发明的重组表达载体含有本发明的一种适于在宿主细胞内表达的核酸。这说明该重组表达载体含有一种或多种根据用于表达的宿主细胞而选定的调控序列，这些序列有效连接于待表达的核酸序列。在重组表达载体中，“有效连接”是指目的核苷酸序列连接于调控序列，其连接方式能够使该核苷酸序列表达(例如在体外转录/翻译系统中，或将载体引入到宿主细胞中)。术语“调控序列”应包括启动子、增强子和其他表达调控元件(如多腺苷酸化信号)。有关这些调控序列的描述可参考，例如，Goeddel，《基因表达技术：酶学方法》185，Academic Press，San Diego，CA(1990)。调控序列包括在多种类型的宿主细胞中指导核苷酸序列组成型表达的调控序列，以及只在特定宿主细胞中指导核苷酸序列表达的调控序列(如组织特异性调控序列)。该领域的技术人员都会了解，表达载体的设计取决于某些因素，如选择用于转化的宿主细胞、预期的蛋白表达水平，等等。本发明的表达载体可以被引入宿主细胞，并由此产生上述核苷酸所编码的蛋白或肽，其中包括融合蛋白或肽。

本发明的重组表达载体经过设计可用于在原核细胞(如E.coli)或真核细胞(如昆虫细胞(采用杆状病毒表达载体)、酵母细胞或哺乳动物细胞)中表达本发明的多肽。有关适当宿主细胞的进一步论述可参考Goeddel，见上文。作为选择，还可以将重组表达载体进行体外转录和翻译，如使用T7启动子调控序列和T7聚合酶。

在另一项实施方案中，本发明的核酸是通过哺乳动物表达载体在哺乳动物细胞中表达。哺乳动物表达载体的实例包括pCDM8(Seed(1987)Nature 329：840)和pMT2PC(Kaufman et al.(1987)EMBOJ.6：187-195)。当在哺乳动物细胞中使用时，对这些表达载体的调控功能通常可以用病毒调控元件来实现。例如，常用的启动子是来自多瘤病毒、腺病毒2、巨细胞病毒和猿病毒40的启动子。有关适用于原核及真核细胞的其他适当表达载体，可参阅上文Sambrook et al.的第16和第17章。

在另一项实施方案中，哺乳动物重组表达载体能够指导核酸的表达，优选的是在特定细胞类型中指导核酸的表达(例如用组织特异性调控元件来表达核酸)。组织特异性调控元件已为该领域所了解。适当的组织特异性启动子的实例包括，但不局限于，白蛋白启动子(肝特异性；Pinkert et al.(1987)Genes Dev.1：268-277)、淋巴特异性启动子(Calame和Eaton(1988)Adv.Immumol.43：235-275)，特别是T细胞受体的启动子(Winoto and Baltimore(1989)EMBO J.8：729-733)和免疫球蛋白的启动子(Banerji et al.(1983)Cell33：729-740；Queen and Baltimore(1983)Cell 33：741-748)，神经元特异性启动子(如神经纤维启动子；Byrne and Ruddle(1989)Proc.Nat l.Acad.Sci.USA 86：5473-5477)、胰特异性启动子(Edlund et al.(1985)Science 230：912-916)、前列腺特异性启动子和(或)增强子(美国专利5,830,686和5,871,726，其全部内容在此完整引入作为参考)，以及乳腺特异性启动子(如乳清启动子；美国专利4,873,316和欧洲专利申请264,166)。此外还包括发育调控启动子，例如鼠hox启动子(Kessel and Gruss(1990)Science249：374-379)和α-胎蛋白启动子(Campes and Tilghman(1989)Genes Dev.3：537-546)。

本发明还提供一种包含本发明所述DNA分子的重组表达载体，其中的DNA分子以反义方向被克隆到表达载体中。也就是说，该DNA分子与一种调控序列有效连接，其连接方式可用于表达一种与编码指定多肽的mRNA反义的RNA分子(通过DNA分子的转录)。

与反义核酸有效连接的调控序列可选自能够在多种细胞类型中指导反义RNA分子持续表达的调控序列，如病毒启动子和(或)增强子，这些调控序列还可以选自能够指导反义RNA进行组成型表达、组织特异性表达或细胞类型特异性表达的调控序列。反义表达载体可以是重组质粒、噬菌粒或减毒病毒，其中，反义核酸的产生是在高效调控区的控制下进行，该调控区的活性是由引入载体的细胞类型所决定。关于利用反义基因来调控基因表达的论述可参阅Weintraub et al.(Reviews-Trends in Genetics，Vol.1(1)1986)。

作为本发明的一方面，对多种癌症进行治疗的方法可以是，在带有组织特异性增强子和(或)启动子的DNA模板上提供一种毒素基因，从而使该基因在肿瘤细胞内集中表达。毒素基因包括，例如，但不局限于，白喉毒素基因。白喉毒素在细胞内的表达可以杀死细胞。可以使用一些组织特异性启动子，如针对胰腺癌使用胰特异性启动子。而递送到胰腺细胞内的功能性白喉毒素基因理论上可以清除整个胰腺。这种策略可用于治疗胰腺癌。该组织特异性增强子可确保白喉毒素只在胰腺细胞中表达。含有受组织特异性增强子调控的白喉毒素基因的DNA/脂多胺/微球体复合物可以通过插管直接引入滋养胰腺的动脉。在需要根除胰腺组织的情况下，可按照一些给药计划表进行灌注。白喉毒素以外的其他一些致死基因也具有类似的效应，如蓖毒素基因、眼镜蛇毒素因子基因或肠毒素基因。

另一具体实例是用前列腺特异性抗原启动子/增强子来指导本发明的生物活性治疗因子在需要治疗的前列腺癌患者的前列腺中表达。此外还可以对特化癌症进行治疗，方法是递送一些能够抑制特定癌症的癌性状的基因，例如，但不局限于，p53基因、视网膜母细胞瘤基因(以及该基因家族的其他基因)。

4.7 腺病毒介导的基因导入

带有缺失的腺病毒被认为是用于基因治疗的适当载体。腺病毒属于无包膜DNA病毒。源于腺病毒的基因导入载体(称为腺病毒载体)具有许多使其特别适用于这种基因导入的特性。例如，已详细了解了腺病毒的生物学特性，腺病毒不涉及严重的人类疾病，该病毒能够非常高效地将其DAN导入宿主细胞，该病毒可感染多种细胞，并且有广泛的宿主范围，能够较容易地大量制备该病毒，尤其是可通过病毒基因组中早期区1(E1)的缺失使该病毒成为复制缺陷型。

腺病毒基因组是一种约36,000个碱基对的线性双链DNA分子，每条DNA链的5’末端与55-kDa的末端蛋白共价结合。Ad DNA含有相同的末端反向重复序列(ITRs)，该序列为约100个碱基对，其确切程度则取决于血清型。病毒的复制起始点精确定位在基因组末端的ITRs中。DNA的合成分为两个阶段。首先是通过链置换进行复制，并产生一条子代双链分子和一条亲本置换链。置换链为单链，并且可形成所谓的“锅柄状”中间体，该中间体能起始复制并产生子代双链分子。此外，复制也可以从基因组的两头同时进行，从而无需形成锅柄结构。

在生产性感染周期中，病毒基因的表达分为两个时期：早期和晚期，早期是指病毒DNA复制之前的时期，晚期则始于病毒DAN复制。在早期只表达由E1、E2、E3和E4区编码的早期基因产物，这些产物具有使细胞准备合成病毒结构蛋白的多种功能(Berk，1986)。在晚期，除早期基因产物之外还可以表达晚期病毒基因产物，并且宿主细胞的DNA合成和蛋白合成都被关闭。其结果是使细胞致力于生产病毒DNA和病毒结构蛋白(Tooze，1981)。

腺病毒有多种血清型，其结构和性质略有差异。在这些血清型中，优选的是在本发明的范围内使用2型或5型人类腺病毒(Ad2或Ad5)，或动物源性腺病毒(参考专利申请WO94/26914，其公开内容在此完整引入作为参考)。在能够用于本发明的动物源性腺病毒中，可以考虑来源于犬、牛、鼠(例如：Mavl，Beard et al.，Virology 75(1990)81)、绵羊、猪或鸟的腺病毒，也可以选择来源于猴的腺病毒(例如：SAV)。优选的动物源性腺病毒为犬腺病毒，更优选的为CAV-2腺病毒〔如Manhattan或A26/61毒株(ATCC VR-800)〕。优选的是在本发明的方法中使用来源于人或犬或混合来源的腺病毒。

用于在本发明的方法中使用的缺陷型重组腺病毒可通过该领域技术人员已知的任一种技术加以制备(Levrero et al.，Gene 101(1991)195，EP185 573；Graham，EMBO J.3(1984)2917)。具体的说，其制备方法可以是在腺病毒和一种质粒，尤其是带有一种包含目的基因的序列盒的质粒，之间进行同源重组。将腺病毒和质粒共转染到适当细胞系内，之后即可发生同源重组。优选的细胞系应该(i)能被上述元件转化，并且(ii)含有能补充腺病毒基因组缺陷部分的序列，优选的是整合形式的序列，以避免重组的危险。细胞系的实例包括人胚胎肾细胞系293(Graham et al.，J.Gen.Virol.36(1977)59)，该细胞系的独特之处是其基因组中整合了Ad5腺病毒基因组的左侧部分(12％)。在专利申请WO94/26914和FR 2,707,664中描述了腺病毒载体的构建策略，这些专利均在此完整引入作为参考。

4.8 逆转录病毒颗粒介导的基因导入

逆转录病毒载体是哺乳动物的基因导入工具，这些载体充分利用了逆转录病毒复制周期的特性，如高感染效率以及能够把病毒传递的信息稳定地共线性整合到靶细胞的染色体中。逆转录病毒载体日益成为基础研究、生物技术和基因治疗领域中的重要工具。

目前使用的大多数逆转录病毒载体都来源于鼠白血病病毒(MLVs)。由于MLVs在不同细胞类型中的转录模式都有详细的记载，并且其组合式遗传结构相对简单，因而尤其适合作为载体。

逆转录病毒的结构：逆转录病毒属于包膜病毒。其双脂层包膜来源于宿主的细胞膜，并且可通过病毒表面蛋白(SU)和跨膜蛋白(TM)的插入而被修饰。基质蛋白(MA)直接位于包裹内核的外膜之下。该内核含有衣壳蛋白(CA)。衣壳内部有两个拷贝的逆转录病毒基因组，其5’末端通过氢键彼此联接。病毒核心颗粒还含有病毒酶：逆转录酶(RT)、蛋白酶(PR)和整合酶(IN)，以及结合在病毒基因组上的核衣壳蛋白(NC)。除了病毒编码的这些蛋白外，病毒体还包含大量来自宿主细胞总tRNA的tRNA分子。

鼠白血病病毒(MLV)属于简单逆转录病毒。逆转录病毒具有特征性的遗传图谱：在三个结构基因gag、pol和env两侧具有两条长末端重复序列(LTRs)。LTRs可以进一步分为三个区：U3区含有能被细胞转录机识别的增强子和启动子元件，R区在逆转录过程中具有重要作用，并且还包含多腺苷酸化信号，U5区含有在逆转录过程中所需的重要序列，并且可包装逆转录病毒基因组。此外，LTRs还包含顺式元件以及在整合过程中具有重要作用的反向重复序列。

整合的原病毒可产生两种mRNA转录体，一种是编码gag蛋白和gag-pol多蛋白的全长mRNA，另一种是编码包膜糖蛋白的经过剪接的mRNA。其中的全长mRNA还可充当基因组RNA，该mRNA含有已描述的LTR部分组件，此外还在5’非翻译序列中含有三种重要的顺式元件。位于U5区下游的引物结合位点(PBS)含有与引物tRNA分子3’末端互补的18个核苷酸。包装信号(PSI)也位于5’非翻译区内，它定位在PBS与gag基因可读框起始位点之间。5’非翻译区还包含一种负责病毒体中两套病毒基因组二聚化的二聚体连锁域。聚嘌呤片段(PP)是直接位于U3区上游的另一种重要的顺式元件，该元件含有一段由A和G残基组成的序列。它可作为逆转录过程中正链DNA合成的引发位点。

逆转录病毒的生活周期：目前已提出两种不同的用于解释病毒颗粒进入宿主细胞质的机制。据推测，大多数逆转录病毒，其中包括MLV，是通过受体介导的内吞作用进入宿主细胞的，该过程使整个包膜病毒颗粒被内化到内体中。目前已克隆出同向性鼠白血病病毒的受体分子，通过鉴定，发现该分子是一种阳离子氨基酸转运蛋白。

当病毒核心颗粒进入宿主细胞的细胞质之后，在以前的宿主细胞中合成并由病毒体携带的病毒蛋白将控制所有导致双链DNA原病毒整合的酶功能。核心颗粒进入后的病毒蛋白命运仍不清楚，但逆转录酶、整合酶和衣壳蛋白仍与RNA基因组形成核蛋白复合物，并在该复合物中进行逆转录。最近还发现，基质蛋白也与这种核蛋白复合物结合。

逆转录完成后，核蛋白复合物迁移至宿主细胞核。负责这种核定位的机制仍不清楚，但是由Rous肉瘤病毒(RSV)获得的证据表明IN蛋白具有重要的作用，因为在哺乳动物细胞中表达的RSV IN蛋白定位于核内。有丝分裂是核蛋白复合物进入核内所必需的，这可能是因为核蛋白复合物不能穿过核膜。IN蛋白一旦进入核内即可介导整合作用。该蛋白可识别LTRs末端的保守反向重复序列，并且可以从两条链的3’羟基末端去除两个碱基。IN蛋白还可催化降解宿主DNA，并可介导原病毒DNA与宿主DNA之间的连接。在整合的专一性方面，有报道认为整合倾向于发生在DNase I超敏感位点附近，但至今仍未发现宿主DNA的共有靶序列。

简单逆转录病毒(其中包括MLV)的转录和翻译是通过宿主细胞的装置来进行。复合病毒(其中包括HIV和HTLV)可编码一些反式激活蛋白，这些蛋白可参与转录调控。MLV颗粒的组装发生在宿主的细胞膜上，该过程与出芽过程同时发生。在哺乳动物B型和C型病毒(分别为MMTV和HTLV)中，病毒核心颗粒是在宿主细胞质中组装的。顺式作用被囊化信号与Gga-或Gag-Pol前体蛋白的结合可介导病毒基因组RNA的被囊化。

出芽结束后，Gga-和Gag-Pol多蛋白被病毒蛋白酶(PR)剪切。病毒蛋白的成熟使病毒体的形态发生彻底改变。除了病毒多蛋白在病毒颗粒出芽后被蛋白酶剪切之外，基因组RNA也将经历一个成熟过程，该过程可导致形成致密的二倍体基因组。

逆转录病毒载体：用于产生逆转录病毒质粒载体的逆转录病毒包括，但不局限于，Moloney鼠白血病病毒、脾坏死病毒、逆转录病毒，如Rous肉瘤病毒、Harvey肉瘤病毒、鸟造白细胞组织增生病毒、长臂猿白血病病毒、人类免疫缺陷性病毒、腺病毒、骨髓增生性肉瘤病毒，以及乳腺肿瘤病毒。在一项实施方案中，使用的逆转录病毒质粒载体来自Moloney鼠白血病病毒。

该载体可包含一种或多种启动子。可使用的适当启动子包括，但不局限于，逆转录病毒LTR；SV40启动子；以及Miller，et al.，Biotechniques，Vol.7，No.9，980-990(1989)中描述的人类巨细胞病毒(CMV)启动子；或其他任何一种启动子(例如细胞启动子，如真核细胞启动子，其中包括，但不局限于，组蛋白启动子、pol III启动子和β-肌动蛋白启动子)。可使用的其他病毒启动子包括，但不局限于，腺病毒启动子、胸腺嘧啶激酶(TK)启动子，以及B19细小病毒启动子。根据本文讲述的内容，该领域的技术人员将会了解适当启动子的选择方法。

编码所需生物活性治疗因子的核酸序列可以受适当启动子的调控。可使用的适当启动子包括，但不局限于，腺病毒启动子，如腺病毒主要晚期启动子；或异源启动子，如巨细胞病毒(CMV)启动子；呼吸道合胞体病毒(RSV)启动子；诱导型启动子，如MMT启动子、金属硫蛋白启动子；热休克启动子；白蛋白启动子；ApoAI启动子；人珠蛋白启动子；病毒胸腺嘧啶激酶启动子，如单纯疱疹性胸腺嘧啶激酶启动子；逆转录病毒的LTRs(其中包括上文描述的经过修饰的逆转录病毒LTRs)；β-肌动蛋白的启动子；以及人生长激素启动子。此外，还可以使用能够调节所需生物活性治疗因子编码基因的天然启动子。

逆转录病毒质粒载体可用于将包装细胞系转换成生产性细胞系。可被转染的包装细胞的实例包括，但不局限于，PE501、PA317psi-2、psi-AM、PA12、T19-14X、VT-19-17-H2、psiCRE、psiCRIP、GP+E-86、GP+envAm12，以及Miller，《人类基因疗法》Vol.1，pgs.5-14(1990)中描述的DNA细胞系，其内容在此完整引入作为参考。载体对包装细胞的转换可采用该领域已知的任一种方法。这些方法包括，但不局限于，电穿孔法、脂质体法，以及磷酸钙沉淀法。

生产性细胞系可产生感染性逆转录病毒载体颗粒，这些载体颗粒含有编码所需生物活性治疗因子的多核苷酸序列。然后可以在体外或体内利用这些逆转录病毒载体颗粒转换真核细胞。经转换的真核细胞将表达编码所需生物活性治疗因子的多核苷酸序列。可被转换的真核细胞包括，但不局限于，胚胎干细胞、胚性癌细胞，以及造血干细胞、肝细胞、成纤维细胞、成肌细胞、角质细胞、内皮细胞和支气管上皮细胞。

在一项实施方案中，可以将含有编码所需生物活性治疗因子的多核苷酸序列的逆转录病毒质粒载体与上文描述的一种脂质相连接，然后再给药于宿主。在一项优选实施方案中，可以将所述逆转录病毒质粒载体与本发明的一种脂多胺转染剂结合，以形成一种复合物，再把该复合物与本发明的微球体混合，然后给药于需要进行栓塞性基因治疗的患者。

4.9 反义基因疗法

本发明还包括递送具有或不具有栓塞作用的反义核酸分子。反义核酸分子是指与编码本发明所述多肽的有义核酸互补的分子，例如与双链cDNA分子中的编码链互补或与mRNA序列互补的分子。因此，反义核酸能够与有义核酸形成氢键。反义核酸可以与整条编码链互补，也可以只与其部分互补，例如与所有的或部分的蛋白编码区(或可读框)互补。反义核酸分子可以与本发明所述多肽编码核苷酸序列的编码链的所有或部分非编码区互补。非编码区(“5’和3’非翻译区”)是指位于编码区侧翼并且不翻译成氨基酸的5’及3’序列。

反义寡核苷酸的长度可以是，例如，约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个核苷酸。本发明的反义核酸可通过该领域已知的方法由化学合成和酶催连接反应来加以构建。

举例来说，反义核酸(如反义寡核苷酸)的化学合成可采用天然的核苷酸，也可采用经过多种修饰的核苷酸，这些核苷酸可用于提高分子的生物稳定性，或用于提高反义核酸与有义核酸形成的双螺旋的物理稳定性，例如可使用偶磷硫代衍生物和吖啶取代的核苷酸。

可用于产生反义核酸的经过修饰的核苷酸的实例包括5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)-尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-galactosylqueosine、次黄苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基次黄苷、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-mannosylqueosine、5’-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-羟基乙酸(v)、wybutoxosine、假尿嘧啶、queosine、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-羟基乙酸甲基酯、尿嘧啶-5-羟基乙酸(v)、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶、(acp3)w和2，6-二氨基嘌呤。

作为选择，还可以将核酸以反义方向亚克隆到一种表达载体中，并通过生物学方法用该表达载体产生反义核酸(也就是说，由插入核酸转录出的RNA将与所需靶核酸呈反义方向，这将在下文做进一步描述)。

通常可以将本发明的反义核酸分子给药于主体，也可使其原位产生，以使这些分子能够与编码本发明的特定多肽的细胞mRNA和(或)基因组DNA杂交或结合，从而通过，例如，抑制转录和(或)翻译来抑制其表达。这种杂交可以是通过传统的核苷酸互补性而形成稳定的双螺旋，也可以是，例如在反义核酸分子能够与DNA双螺旋结合的情况下，在双螺旋的大沟中进行特定的相互作用。本发明所述反义核酸分子的给药途径的实例包括，直接将反义核酸分子/脂多胺转染剂复合物/微球体注射到特定的组织部位。

作为选择，还可以对反义核酸分子进行修饰，使其能被定向递送至特定的靶细胞，然后再利用本发明的微球体和转染剂进行系统性给药。例如，可以对用于系统性给药的反义分子进行修饰，使其能够与特定细胞表面的受体或抗原产生特异性结合，修饰方法可以是，例如，将反义核酸分子与能够结合细胞表面受体或抗原的肽或抗体相连接。这些肽或抗体可以使递送效率在因使用本发明所述微球体和转染剂而提高的基础上进一步提高。还可利用上文描述的载体将反义核酸分子递送至细胞。为了使细胞内的反义分子达到足够的浓度，优选的是用pol II或pol III强启动子来调控载体构建体中的反义核酸分子。本发明的反义核酸分子可以是α-异构体核酸分子。

α-异构体核酸分子可以与互补RNA形成特殊的双链杂交体，其中的两条链彼此平行，这与通常的β-结合体相反(Gaultier et al.(1987)Nucleic Acids Res.15：6625-6641)。反义核酸分子还可包括2’-邻-甲基核糖核苷酸(Inoue et al.(1987)Nucleic Acids Res.15：6131-6148)或RNA-DNA嵌合性类似物(Inoue et al.(1987)FEBSLett. 215：327-330)。

此外，本发明还包括核酶。核酶是具有核糖核酸酶活性的催化性RNA分子，它能剪切具有互补区域的单链核酸，如mRNA。因此，可以用核酶(如锤头状核酶(见Haselhiff and Gerlach(1988)Nature334：585-591中描述))来催化剪切mRNA转录体，从而抑制由该mRNA编码的蛋白的翻译。根据所需靶基因的核苷酸序列可以设计出对编码本发明所述多肽的核酸分子具有特异性的核酶。例如，在Cech et al.的美国专利4,987,071和Cech et al.的美国专利5,116,742中，可以构建四膜虫L-19 IVS RNA的一种衍生物，其中，活性部位的核苷酸序列与待剪切的核苷酸序列互补。作为选择，还可以用编码本发明所述生物活性治疗因子的mRNA从RNA分子库中筛选具有特定核糖核酸酶活性的催化性RNA。可参阅，例如，Bartel and Szostak(1993)Science261：1411-1418。

本发明还包括能够形成三螺旋结构的核酸分子。例如，对本发明所述生物活性治疗因子的表达进行抑制的方法可以是，利用与这种多肽的编码基因调控区(如启动子和(或)增强子)互补的核苷酸序列来形成三螺旋结构，从而抑制该基因在靶细胞内的转录。通常可参阅Helere(1991)Anticancer Drug Des.6(6)：569-84；Helene(1992)Ann.N.Y.Acad.Sci.660：27-36；以及Mahet(1992)Bioassays14(12)：807-15。

在不同的实施方案中，可以对本发明所述核酸分子的碱基部分、糖基部分或磷酸骨架进行修饰，以提高，例如，该分子的稳定性、杂交性或可溶性。举例来说，可以对该核酸的脱氧核糖磷酸骨架进行修饰，以产生肽核酸(可参阅Hyrup et al.(1996)Bioorganic &Medicinal Chemistry 4(1)：5-23)。此处使用的术语“肽核酸”或“PNAs”是指利用假肽骨架替换脱氧核糖磷酸骨架并且只保留四种天然碱基的核酸类似物，如DNA类似物。研究表明，PNAs的中性骨架使其能够在低离子强度的条件下与DNA和RNA产生特殊的杂交。PNA寡聚体可通过Hyrup et al.(1996)，见上文；Perry-O’Keefe et al.(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：14670-675中描述的标准固相肽合成方法来加以合成。

PNAs可用于本发明的治疗性及诊断性应用。例如，PNAs可作为反义制剂或抗基因制剂，用于通过，例如，抑制转录或翻译或抑制复制而对基因的表达进行序列特异性调节。PNAs还可用于，例如，基因的单碱基对突变分析，方法是，例如，进行PNA定向的PCR定位；与S1核酸酶等其他酶组合使用时充当人工限制性酶(Hyrup(1996)，见上文)；或充当DNA序列或杂交的探针或引物(Hyrup(1996)，见上文；Perry-O’Keefe et al.(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA93：14670-675)。

在另一项实施方案中，可以对PNAs进行修饰，以提高其稳定性或被细胞摄取的能力，修饰方法包括，将PNA与亲脂性基团或其他辅助基团相连接，形成PNA-DNA嵌合体，或最优选的是用脂多胺作为转染剂与PNA复合，然后再与本发明的微球体结合。例如，可以产生同时具有PNA有利特性及DNA有利特性的PNA-DNA嵌合体。这种嵌合体允许RNAse H或DNA聚合酶等DNA识别酶与其DNA部分相互作用，而PNA部分可提供高结合力和高特异性。PNA-DNA嵌合体的连接可采用适当长度的连接物，这些连接物可根据碱基堆积、核苷碱基之间的结合键数量以及方向来加以选择(Hyrup(1996)，见上文)。PNA-DNA嵌合体的合成可按照Hyrup(1996)，见上文，以及Finn et al.(1996)Nucleic Acids Res.24(17)：3357-63的描述来进行。例如，可以用标准的亚磷酰胺偶联化学物和经过修饰的核苷类似物在固体支持物上合成一条DNA链。并用5’-(4-甲氧三苯)氨基-5’-脱氧-胸腺嘧啶phosphoramidit等化合物作为PNA与DNA5’末端之间的连接物(Maget al.(1989)Nucleic Acids Res.17：5973-88)。然后使PNA单体逐步偶联，以产生一种带有5’PNA段和3’DNA段的嵌合分子(Finnet al.(1996)Nucleic Acids Res.24(17)：3357-63)。作为选择，也可以合成带有5’DNA段和3’PNA段的嵌合分子(Peterset et al.(1975)Bioorganic Med，Chem.Lett.5：1119-11124)。

在其他实施方案中，使用的寡核苷酸可含有其他附加基团，例如肽(如用于在体内定向于宿主细胞受体)或促进跨细胞膜运输的制剂(如参阅Letsinger et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：6553-6556；Lemaitre et al.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：648-652；PCT专利WO 88/09810)或促进跨血脑屏障运输的制剂(如参阅PCT专利WO 89/10134)。此外，还可以用杂交触发性剪切剂(如参阅Krol et al.(1988)Bio/Techniques 6：958-976)或嵌入剂(如参阅Zon(1988)Pharm.Res.5：539-549)对寡核苷酸进行修饰。因此，在与脂多胺转染剂和本发明的微球体结合之前或结合之后，可以将寡核苷酸与另一种分子结合，例如肽、杂交触发性交联剂、转运剂、杂交触发性剪切剂，等等。

4.10 用于药物递送和基因治疗的主动栓塞术

本发明的一个方面是利用微球体将药物、疫苗、诊断剂或显象剂给药于哺乳动物的方法。该实施方案并非必需使用转染剂。但也可选择使用转染剂，因为该转染剂能够与微球体和生物活性剂结合，即能够充当连接物，或能够促进内吞作用。

作为一方面，本发明提供一些用于使血管发生栓塞的方法，该方法的步骤包括，将治疗有效剂量的生物活性治疗因子转染剂微球体组合物递送到血管内，从而有效地阻塞血管。根据上文提供的公开内容可以很容易地确定适用于阻塞血管的治疗有效剂量。在一项特别优选的实施方案中，可以将生物活性治疗因子转染剂微球体组合物递送到滋养肿瘤的血管内。

简单地说，有多种临床表现(如出血、肿瘤发生)都需要减少或切断对某个器官或区域的血液供给。其实现方法可以是，将本发明的生物活性治疗因子转染剂微球体组合物通过选择性定位的针头或导管注射到所需血管中，该方法将在下文做更详细的描述。该组合物可通过血流进行传输，直到在血管内形成楔状物并物理性(或化学性)阻塞血管。该选定区域的血流减少或被切断，从而可导致梗塞(由于氧和营养物的供给不足而导致细胞死亡)或减少受损血管的血液流失。

用于栓塞疗法的本发明优选的生物活性治疗因子转染剂微球体组合物没有毒性，具有生血栓性，易于经导管注射，不透射线，效应快而持久，无菌，并且在使用时易于形成不同的形状或大小。此外，优选的是这些组合物能够缓慢地(理想的是能够持续几周至几个月)释放生物活性治疗因子。特别优选的生物活性治疗因子组合物在被注射至血管系统之后应具有15-200μm的预定大小。优选的是这些组合物在溶液中或被注射后不会凝集成较大的颗粒。此外，优选的组合物在使用前的储存期间不应出现物理特性的改变。

用本发明的栓塞疗法来协助肿瘤治疗的主要方式至少有三种：

(1)对肿瘤(通常为良性肿瘤)进行确定性治疗；(2)用于术前栓塞术；以及(3)用于姑息性栓塞术。简单地说，有时只用栓塞疗法就可以成功地治疗良性肿瘤。这些肿瘤的实例包括血管源性单纯性肿瘤(如血管瘤)、甲状旁腺瘤等内分泌肿瘤，以及良性骨肿瘤。

对其他肿瘤(如肾腺癌)而言，可以在切除手术的几小时或几天之前进行术前栓塞术，以减少手术性失血，缩短手术时间，以及降低因手术操作而导致肿瘤的存活恶性细胞扩散的危险。术前栓塞术可成功地用于多种肿瘤，其中包括，例如，鼻咽瘤、颈静脉血管球瘤、脑膜瘤、化学受体瘤和迷走神经瘤。

此外，还可以将栓塞术作为不宜通过手术治疗的恶性肿瘤的主要治疗方法，以延长晚期患者的存活时间。栓塞术可减轻失血、静脉梗阻和气管压迫等不良症状，从而可明显改善恶性肿瘤患者的生活质量。但是，最受益于姑息性肿瘤栓塞术的是因恶性内分泌性肿瘤的体液效应而受苦的患者，在这些患者体内，转移自良性肿瘤和其他内分泌性肿瘤，如胰岛素瘤和胰高血糖素瘤，的次生肿瘤可能会生长缓慢，但仍可通过其导致的内分泌症状而带来巨大的痛苦。

一般而言，采用本发明所述生物活性治疗因子转染剂微球体组合物的栓塞疗法通常可以不考虑部位而以类似的方式来实施。简单地说，首先是对需要栓塞的部位实施造影术，方法是在X射线照射的条件下通过动脉或静脉插管注射一种不透射线的造影剂。所述导管可以经皮肤插入，也可通过手术插入。然后是阻塞血管，方法是通过导管灌流本发明的生物活性治疗因子转染剂微球体组合物，直到发现血流停止。最后可通过反复的血管造影来确证发生了阻塞。

栓塞疗法通常可以使包含生物活性治疗因子的组合物遍布于需要治疗的肿瘤或血管肿块的空隙之间。栓塞颗粒的物理沉积可以阻塞动脉腔，从而可阻断血液供给。除这种效应外，生物活性治疗因子还可抑制滋养肿瘤或血管肿块的新血管的形成，从而加强因切断血液供给而产生的促老效应。

因此，很显然，通过使用本发明的生物活性治疗因子转染剂微球体组合物可以使大多数肿瘤发生栓塞。简单地说，通常将肿瘤分为两类：良性肿瘤和恶性肿瘤。良性肿瘤中的细胞能保持其分化特性，并且不会以完全失控的方式进行分裂。此外，这类肿瘤是局部化的和非转移性的肿瘤。恶性肿瘤中的细胞变成未分化的细胞，这些细胞不会对身体的生长信号和激素信号产生反应，并且会以不受控制的方式增殖；这类肿瘤具有侵袭性，并且能扩散至远处部位(转移性)。

作为本发明的一方面，可以用栓塞疗法对肝转移瘤(继发性肿瘤)进行治疗。简单地说，是将导管经由股动脉或臂动脉插入，然后在荧光镜的引导下使其穿过动脉系统，进而插入肝动脉。将该导管尽可能地推至肝动脉网中，以使滋养肿瘤的血管能够被完全阻塞，同时也要尽可能地保护滋养正常组织的动脉分支。理想的是只需阻塞肝动脉的一条节段性分支，但也可能要阻塞远离胃十二指肠动脉起始部的整个肝动脉，甚至多个独立的动脉，这将取决于肿瘤及其单独供血的范围。在导管到达所需位置之后即可阻塞动脉，方法是经由动脉导管注射抗血管发生性治疗组合物，直到需要阻塞的动脉中的血流停止，优选的是到发现血流停止5分钟后为止。确证动脉阻塞的方法可以是，经由导管注射不透射线的造影剂，再用荧光镜或X射线胶片证明先前充满造影剂的血管不再含有造影剂。该方法可重复用于需要阻塞的每条滋养动脉。

作为本发明的另一方面，还可以在手术过程中利用主动治疗性栓塞疗法来切除肿瘤或血管肿块或癌变器官。此外，本发明的另一方面还涉及利用主动治疗性栓塞疗法来抑制或改良转移肿瘤。

如上所述，良性肿瘤和恶性肿瘤都可以用本发明的抗血管发生性治疗组合物进行栓塞。良性肝肿瘤的典型实例包括肝细胞腺瘤、海绵状血管瘤和灶性结节状增生。此外还可以对更少见的以及通常不具有临床表现的其他良性肿瘤进行肿瘤。这些肿瘤包括胆管腺瘤、胆管囊腺瘤、纤维瘤、脂肪瘤、平滑肌瘤、间皮瘤、畸胎瘤、粘液瘤和结节再生性增生。

恶性肝肿瘤通常可再分为两类：原发性恶性肝肿瘤和继发性恶性肝肿瘤。原发性肿瘤直接在其被发现的组织中产生。因此，原发性肝肿瘤最初来源于组成肝组织的细胞(如肝细胞和胆细胞)。可利用动脉栓塞术进行治疗的原发性肝恶性瘤的典型实例包括肝细胞癌、肝胆管细胞癌、血管肉瘤、囊腺癌、鳞状细胞癌及肝胚细胞瘤。

继发性肿瘤或转移瘤是指起源于身体其他部位但随后扩散至远处器官的肿瘤。肿瘤转移的常规路线包括直接进入相邻结构中生长，经血管系统或淋巴系统扩散，以及循组织平面和身体间隙(腹膜液、脑脊液等)而行。继发性肝肿瘤是癌症患者中最常见的致死疾病之一，在目前以及将来都是肝肿瘤中最常见的形式。实际上，任何恶性肿瘤都能转移到肝脏，但极可能扩散到肝脏的肿瘤包括：胃癌、结肠癌和胰腺癌；黑素瘤；肺肿瘤、口咽瘤和膀胱瘤；霍奇金氏淋巴瘤和非霍奇金氏淋巴瘤；乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌。上述的每种原发性肿瘤都具有多种能够用动脉栓塞术进行治疗的不同肿瘤类型(例如，但不局限于，据报道，卵巢癌有32种以上的不同类型)。

如上所述，采用本发明所述生物活性治疗因子转染剂微球体组合物的栓塞疗法还可用于其他多种需要封闭血管的临床表现。作为本发明的一方面，可以对动静脉畸形进行治疗，方法是将上述的一种生物活性治疗因子转染剂微球体组合物进行给药。简单地说，动静脉畸形(血管畸形)是指一组疾病，其中，动脉与静脉间的交通至少有一处(通常情况下是多处)出现异常，从而产生一种主要由血管构成的局部瘤样肿块。这种疾病可以是先天的，也可以是后天的。

在本发明的一项实施方案中，对动静脉畸形进行治疗的方法可以是，经由股动脉或臂动脉插入导管，并在荧光镜引导下进而插入滋养动脉中。优选的是尽可能地推进该导管，以使血管畸形的滋养性血管完全被阻塞，同时也要尽可能地保护正常结构的滋养性动脉分支(理想的是只需阻塞单一动脉，但通常是要阻塞多个独立的动脉，这将取决于血管畸形及其单独供血的范围)。在导管到达所需位置之后，即可利用本发明的生物活性治疗因子转染剂微球体组合物使每条动脉发生栓塞。

作为本发明的另一方面，可以用栓塞术来治疗出血过多性病情。例如，用子宫动脉栓塞术可以容易地对月经过多(经期出血过多)进行治疗。简单地说，子宫动脉是双侧髂内动脉的分支。在本发明的一项实施方案中，可以经由股动脉或臂动脉插入导管，并在荧光镜引导下穿过动脉系统进而插入每条子宫动脉中。应尽可能地推进该导管，以使子宫的血管完全被阻塞，同时也要尽可能地保护源自子宫动脉和滋养正常结构的动脉分支。理想的是将双侧的单一子宫动脉都阻塞，但根据单独供血的情况，有时需要阻塞多条独立动脉。在导管到达所需位置之后，即可以按上文所述将生物活性治疗因子转染剂微球体组合物给药，以使每条动脉都发生栓塞。

还可利用类似的方法将动脉栓塞术用于其他多种病情，其中包括，例如，但不局限于，急性出血、血管异常、中枢神经系统紊乱及脾功能亢进。

4.10.1 主动栓塞术与基因疗法的结合使用

如上所述，采用本发明所述生物活性治疗因子转染剂微球体组合物的栓塞疗法还可用于其他多种希望在封闭血管的同时对需要治疗的患者进行基因治疗的临床表现。

作为本发明优选的一方面，所提供的组合物含有(a)一种生物活性治疗因子、(b)一种聚合物载体和(c)一种转染剂。

作为本发明优选的另一方面，所提供的组合物含有(a)一种生物活性治疗因子的编码多核苷酸、(b)一种聚合物载体和(c)一种转染剂。

作为本发明最优选的一方面，所提供的组合物含有(a)一种生物活性治疗因子的编码多核苷酸、(b)一种阳离子交联微球体和(c)一种脂多胺转染剂。

在本发明最优选的该方面中，所提供的组合物含有(a)一种生物活性治疗因子的编码多核苷酸、(b)一种阳离子交联微球体和(c)一种脂多胺转染剂，其中的多核苷酸包括天然的或合成的RNA和DNA，其中包括重组RNA和重组DNA以及反义RNA和反义DNA；锤头状RNA、核酶、反义核酸、单链或双链的RNA和DNA，及其类似物；其中的生物活性治疗因子包括抗瘤剂、激素和类固醇、维生素、肽和肽类似物、抗体或其片段、疫苗、酶、抗过敏剂、循环系统药物、抗结核剂、抗病毒剂、抗心绞痛剂、抗原生动物剂、抗风湿剂、麻醉剂、强心苷、镇静剂、局部麻醉剂和全身麻醉剂；其中的阳离子交联微球体基于一些具有无毒性、生物相容性、可膨胀性或非膨胀性、基本上呈球形、亲水性、惰性和离子性的交联聚合物，这些聚合物的大小足以引起栓塞，并且可释放生物活性治疗因子，其中，优选的阳离子交联微球体是选自丙烯酸钠聚合物、丙烯酰胺聚合物及丙烯酰胺衍生物聚合物、丙烯酸钠与乙烯醇的共聚物、乙酸乙烯酯与丙烯酸酯的共聚物的皂化产物、乙酸乙烯酯与丙烯酸酯的共聚物、异丁烯-马来酸酐交联共聚物、淀粉-丙烯腈接枝共聚物及其皂化产物、交联的聚丙烯酸钠聚合物以及交联的聚环氧乙烷的聚合物；其中的适当转染剂的优选实例包括，但不局限于，脂多胺和聚氮丙啶(PEI)。本发明的特别优选的转染剂包括在1992年12月15日授予Behr，et al.的美国专利5,171,678、1995年12月19日授予Behr，et al.的美国专利5,476,962以及1997年4月1日授予Behr，et al.的美国专利5,616,745中公开的通式(I)的脂多胺，这些专利的全部内容均在此引入作为参考。

在本发明公开的优选实施方案及最优选实施方案中，生物活性治疗因子都是与转染剂物理连接成一种复合物，这种生物活性治疗因子-转染剂复合物再与聚合物载体物理连接。优选的是通过液相吸附色谱中熟知的结合力将生物活性治疗因子吸附，这些结合力包括，但不局限于，离子交换、疏水性、分子识别，或其组合。可以将选定的生物活性治疗因子与转染剂相混合，这种转染剂可以使生物活性治疗因子-转染剂复合物具有独特的性质，如疏水性加强。然后可将含有栓塞性物质(如Embosphere)的微球体与充足剂量的可转染性生物活性治疗因子相混合，导致生物活性治疗因子与聚合物载体物理连接的是离子性结合力和疏水性结合力，这些结合力可通过添加盐而进一步加强，如添加氯化钠，但不局限于此。

在本发明公开的优选实施方案及最优选实施方案中，吸附或结合在栓塞性物质表面的生物活性治疗因子-转染剂复合物可以逐渐释放，并通过多种机制进入周围细胞，这些机制包括，例如，但不局限于，自发的内吞作用、受体介导的内吞作用、内体分解作用以及细胞膜去稳定作用或其组合。生物体液中的天然成分可诱导生物活性治疗因子释放，这些成分可降低栓塞性物质与生物活性治疗因子之间的吸附强度，直至后者被完全释放。

另一方面，本发明提供一些方法，用于使肿瘤生成性血管发生依赖性疾病中的血管出现栓塞，这些方法包括将治疗有效剂量的一种组合物给药于需要治疗的患者的血管，从而有效地封闭该血管，并改善这种肿瘤生成性血管发生依赖性疾病，其中的组合物含有一种与转染剂相结合的生物活性因子编码多核苷酸，这种与转染剂结合的生物活性因子编码多核苷酸还与一种微球体相结合。

4.11 诊断成像

如上所述，本发明的生物活性治疗因子转染剂微球体组合物可以与诊断成像、治疗成像以及治疗药递送结合使用，其中包括，例如，超声(US)、磁共振成像(I)、核磁共振(NMR)、计算机体层摄影术(CT)、电子顺磁共振(ESR)、核医学成像、光学成像、弹性描计术、用超声递送药物、射频(RF)以及微波激光。本发明的递送载体和增稳物可以与多种造影剂结合使用，其中包括常规的造影剂，当用于诊断成像和治疗成像时，这些造影剂可提高成像的效率。

可与本发明的增稳物结合使用的适当造影剂的实例包括，例如，稳定的自由基，如稳定的硝基氧，以及含有过渡元素、镧系元素和锕系元素的化合物，这些元素可以在需要的情况下以盐的形式存在，也可以共价或非共价结合于络合剂，其中包括络合剂的亲脂性衍生物，此外还可以与蛋白质大分子结合。优选的过渡元素、镧系元素和锕系元素包括，例如，Gd(III)、Mn(II)、Cu(II)、Cr(III)、Fe(II)、Fe(III)、Co(II)、Er(II)、Ni(II)、Eu(III)和Dy(III)。更优选的元素为Gd(III)、Mn(II)、Cu(II)、Fe(II)、Fe(III)、Eu(III)和Dy(III)，最优选的为Mn(II)和Gd(III)。上述元素可采用盐的形式，其中包括无机物，如锰盐，例如，氯化锰、碳酸锰、乙酸锰，此外还包括有机盐，如葡糖酸锰和羟基磷灰石锰。其他典型的盐包括铁盐，如硫化铁，以及三价铁盐，如氯化铁。

上述元素还可通过，例如，共价或非共价结合力而与络合剂结合，其中包括络合剂的亲脂性衍生物，此外还可以与蛋白质大分子结合。优选的络合剂包括，例如，二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、1，4，7，10-四氮杂环十二烷-N，N’，N’，N'''-四乙酸(DOTA)、1，4，7，10-四氮杂环十二烷-N，N’，N”-三乙酸(DOTA)、3，6，9-三氮杂-12-氧杂-3，6，9-三羧亚甲基-10-羧基-13-苯基十三烷酸(B-19036)、羟苄乙二胺二乙酸(HBED)、N，N’-双(pyridoxy1-5-磷酸)乙二胺、N，N’-二乙酸(DPDP)、1，4，7-三氮杂环壬烷-N，N’，N”-三乙酸(NOTA)、1，4，8，11-四氮杂环十四烷-N，N’，N’，N'''-四乙酸(TETA)、kryptands(大环类络合物)，以及去铁铵。更优选的络合物为EDTA、DTPA、DOTA、DO3A和kryptands，最为优选的为DTPA。优选的亲脂性络合物包括络合剂EDTA与DOTA的烷基化衍生物，如N，N’-双-(羧基癸基氨甲基-N-2，3-二羟基丙基)乙二胺-N，N’-二乙酸酯(EDTA-DDP)；N，N’-双-(羧基十八烷基氨甲基-N-2，3-二羟基丙基)乙二胺-N，N’-二乙酸酯(EDTA-ODP)；以及N，N’-双(羧基十二烷基氨甲基-N-2，3-二羟基丙基)乙二胺-N，N’-二乙酸酯(EDTA-LDP)；此外还包括美国专利5,312,617中描述的亲脂性络合剂，其公开内容在此完整引入作为参考。优选的蛋白质大分子包括，例如，白蛋白、胶原、聚精氨酸、聚赖氨酸、聚组氨酸、γ-球蛋白和β-球蛋白，更优选的是白蛋白、聚精氨酸、聚赖氨酸和聚组氨酸。因此，适当的络合物包括Mn(II)-DTPA、Mn(II)-EDTA、Mn(II)-DOTA、Mn(II)-DO3A、Mn(II)-krytands、Gd(III)-DTPA、Gd(III)-DOTA、Gd(III)-DO3A、Gd(III)-krytands、Cr(III)EDTA、Cu(II)-EDTA，或铁-去铁铵，更优选的是Mn(II)-DTPA或Gd(III)-DTPA。

硝基氧属于顺磁性造影剂，由于硝基氧中存在未配对电子，因而能增强MRI的T1和T2弛豫率。该领域的普通技术人员都将了解，用特定化合物作为MRI造影剂的顺磁效率至少在某种程度上与顺磁性核或顺磁性分子中的未配对电子数有关，明确地说，是与未配对电子数的平方相关。例如，钆具有七个未配对电子，而硝基氧具有一个未配对电子。因此，钆通常是一种比硝基氧强得多的MRI造影剂。但有效相关时间是评定造影剂效率的另一个重要参数，该参数使硝基氧可能具有更强的弛豫。当转动速率减小时，例如把顺磁造影剂与一种大分子连接时，其转动将更加缓慢，从而能更有效地传递能量，以加速水质子的弛豫。而钆的电子自旋弛豫时间很短，这将限制慢速旋转相关时间使弛豫增强的程度。但硝基氧的电子自旋相关时间更加有利，这些分子的旋转相关时间的减缓可导致弛豫的极大增强。尽管不受任何特定操作原理的约束，但可以考虑将硝基氧包被在微球体的外周，从而对所得的相关时间进行优化，包被的方法可以是，例如，制备其烷基化衍生物。此外，还可以将所得的本发明的对比性介质看成一种磁性球体，即驰豫最大化的一种几何构型。

适用于本发明所述组合物的超顺磁造影剂的实例包括经磁畴作用的金属氧化物和金属硫化物、亚铁类或铁类磁性化合物，如纯铁，磁性氧化铁，如磁石、γ-Fe₂O₃、Fe₃O₄、锰铁盐、钴铁盐以及镍铁盐。然后可利用MR整体显象法进行身体快速成像，例如，用于检查血栓形成，如果需要，还可以用超声来辅助血栓溶解。

造影剂，如上文描述的顺磁性造影剂和超顺磁性造影剂，可作为微球体和(或)增稳物中的一种成分。可以将造影剂包裹在囊泡的内部空腔中，并与微球体一同以溶液的形式进行给药，其中可掺入任何额外的增稳物，也可以将造影剂包被在囊泡表面或囊泡膜上。可以在该组合物中使用任一种或多种顺磁性制剂和(或)超顺磁性制剂的混合物。如果需要，还可以将顺磁性制剂和超顺磁性制剂单独进行共给药。

如果需要，还可以将顺磁性制剂或超顺磁性制剂以烷基化形式或其他衍生物形式掺入到组合物中，尤其是掺入到微球体的脂性壁中。详细地说，硝基氧2，2，5，5-四甲基-1-吡咯烷氧自由基和2，2，6，6-四甲基-1-哌啶烷氧自由基能够在没有被甲基占据的环位置上通过多种结合键与长链脂肪酸形成加合物，例如乙酰氧键。这些加合物非常适合于掺入到本发明的生物活性治疗因子转染剂微球体组合物中。

本发明的增稳物和(或)微球体，特别是微球体，不但可作为上述超顺磁性制剂的有效载体，还可以提高造影剂的磁化作用。超顺磁性造影剂包括经磁畴作用的金属氧化物，尤其是氧化铁，此外还包括氧化锰以及具有不同剂量锰、钴、镍的氧化铁。这些制剂均为超微球体或微球体，并且具有极高的批量磁化性和横向弛豫率。较大的颗粒，如直径约100nm的颗粒，的R₂弛豫要比R₁弛豫高得多。较小的颗粒，如直径约10-15nm的颗粒，的R₂弛豫稍有降低，但R₁和R₂值更加均衡。更小的颗粒，如直径约3-5nm的单晶氧化铁颗粒，的R₂弛豫较低，但R₁和R₂弛豫率可能最为均衡。此外，还可以用铁蛋白包裹由弛豫率极高的超顺磁性铁构成的核心。

可以简单地将氧化铁掺入到增稳物和(或)微球体中。在微球体是由脂类构成的情况下，优选的是将氧化铁掺入到微球体的壁中，如吸附在微球体表面或掺入到微球体内部。

4.12 药物制剂

治疗性制剂：多核苷酸盐：本发明包括将药学容许的盐形式的编码上述生物活性治疗因子的多核苷酸给药。这些盐可以用药学容许的非毒性碱来制备，其中包括有机碱和无机碱。来自无机碱的盐包括钠、钾、锂、铵、钙、镁，等等。来自药学容许的非毒性有机碱的盐包括一级、二级和三级铵盐、碱性氨基酸，等等。关于药用盐的论述，可参考S.M.Berge et al.，药物科学杂志66：1-99(1977)，其公开内容在此引入作为参考。

与本发明的适当转染剂混合或连接并与适当的可注射微颗粒结合的编码生物活性治疗因子的多核苷酸可置于单位剂量安瓿瓶中或多剂量容器中。这些多核苷酸的存在形式可以是悬液、溶液或油性乳液，优选的是存在于水性介质中。作为选择，还可以是冻干形式的多核苷酸盐，在递送时可以用适当的介质进行重构，如无热源的无菌水。流体形式与需要重构的冻干形式都应含有一些制剂，优选的是缓冲液，其剂量应足以适当调节注射液的pH值。当用于胃肠外给药时，特别是要将制剂进行静脉内给药时，应调节溶质的总浓度，以使制剂处于等渗、低渗或弱高渗状态。优选的是用非离子型物质来调节张力，如糖，特别优选的则是蔗糖。这些形式都可进一步含有适当的配制剂，如淀粉或糖、甘油或生理盐水。无论是流体还是固体形式，每单位剂量的组合物都可含有0.1％-99％的多核苷酸物质。

与本发明的适当转染剂混合或连接并与适当的可注射微颗粒结合的编码生物活性治疗因子的多核苷酸在使用之前可包装在单位剂量安瓿瓶或多剂量容器中，其中包括适用于所述多核苷酸的药学有效剂量或多倍有效剂量的密封容器，该容器封装有一定剂量的所述多核苷酸或其溶液。与本发明的适当转染剂混合或连接并与适当的可注射微颗粒结合的编码生物活性治疗因子的多核苷酸可被包装成无菌制剂的形式，所述密封容器则用于在该制剂被使用之前保持其无菌性。

用于包装与本发明的适当转染剂混合或连接并与适当的可注射微颗粒结合的编码生物活性治疗因子的多核苷酸的容器带有一种标签，该标签带有食品和药物管理局等政府机构授权的一种通告，该通告可说明联邦法律授权的机构已批准生产、使用、或销售这些用于人类给药的与本发明的适当转染剂混合或连接并与适当的可注射微颗粒结合的编码生物活性治疗因子的多核苷酸。联邦法律规定，用于对人类进行治疗的药剂应得到联邦政府机构的认可。强制执行的责任属于食品和药物管理局，该机构可颁布适当的法规来确保其批准的可靠性，详文见21U.S.C.301-392。42U.S.C.§262规定了一些适用于生物学物质的法令，其中包括由动物组织制备的产物。其他大多数国家也要求类似的批准。不同国家的法规也各不相同，但各自的特定程序已为该领域所熟知。

给药剂量和给药途径：给药剂量在很大程度上取决于治疗对象的状况和体格，以及治疗频率和给药途径。包括剂量和频率在内的连续治疗方案可以通过初期反应和临床判断来指导。优选的是通过胃肠外途径注射到组织间隙中，但是特定的给药方法可能要采用其他胃肠外途径，例如通过吸入气雾剂而给药于鼻粘膜、咽粘膜、支气管组织粘膜或肺粘膜。优选的方法是以每个部位约10μ1-1ml的剂量将溶解在水性介质中的制剂注射到组织内，其中的制剂含有与本发明的适当转染剂混合或连接并与微颗粒结合的编码生物活性治疗因子的多核苷酸。在该制剂中，编码生物活性治疗因子的多核苷酸的浓度为约0.1μg/ml-20mg/ml。

用于将多核苷酸和肽转染到细胞内的优选制剂可含有本发明的阳离子脂多胺转染剂，同时含有或不含有效促转染剂量的溶血磷酯。这种溶血磷酯可以具有中性或电负性头部基团。优选的是溶血磷酯酰胆碱和溶血磷酯酰乙醇胺，特别优选的是1-油基溶血磷酯酰胆碱。有利的是该制剂中含有溶血脂与阳离子脂的摩尔比为0.5的溶血磷酯。此外，还可以用选自本发明所述新型阳离子脂、DOTMA或DOTAP的溶血型阳离子脂来提高转染效率。有利的是在本发明的微球体制剂中含有有效剂量约高达总阳离子脂的三分之一的这些溶血型脂。

另一方面，本发明提供一种含有本发明所述阳离子脂的微球体组合物，其中的阳离子脂可作为转染剂与生物活性治疗因子组合物相结合。微球体组合物的脂质还可包括一种中性脂，这种中性脂可选自磷酯酰胆碱、磷酯酰乙醇胺、神经鞘磷酯或胆固醇。在这些微球体组合物中，阳离子脂与中性脂的优选摩尔比为约9∶1至1∶9；特别优选的摩尔比为约5∶5。微球体组合物还可含有一种溶血型酯，这种溶血型酯可选自溶血磷酯酰胆碱、溶血磷酯酰乙醇胺，或溶血型阳离子脂。

再一方面，本发明提供一些含有微球体的药学制品，其中的微球体通过本文公开的任一种阳离子脂或两亲性脂与生物活性治疗因子结合，并且带有药学有效剂量的一种附加的治疗剂，如治疗性药物。这些组合物中存在的阳离子脂或两亲性脂可促进生物活性治疗因子和(或)其他活性治疗剂的胞内运输。本发明还提供用于局部、肠内和胃肠外的制品。药学制品中的附加治疗剂可以是，例如，但不局限于，类固醇；这种附加治疗剂还可以是，例如，但不局限于，一种非甾体抗炎剂。

在本发明的另一种药学制品中，附加治疗剂可以是一种抗病毒核苷类似物，优选的则是抗病毒核苷类似物的脂类衍生物，其中包括磷酯酰衍生物或二磷酰甘油二酯衍生物。抗病毒核苷可以是双脱氧核苷、双脱氢核苷、核苷的卤代衍生物或叠氮衍生物，或非环化核苷。在优选的实施方案中，抗病毒核苷的脂类衍生物为(3’-叠氮-3’-脱氧)胸腺嘧啶-5’-二磷酸-3-二酰基甘油(AZT二磷酸甘油二酯)和双脱氧胸腺嘧啶二磷酸甘油二酯。在特别优选的实施方案中，抗病毒核苷的脂类衍生物为阿昔洛韦或更昔洛韦二磷酸甘油二酯或1-(2-脱氧-2’-氟-1-β-D-阿糖呋喃)-5-碘胞嘧啶(FIAC)或1(2’-脱氧-2’-氟-1-β-D-阿糖呋喃)-5-碘尿嘧啶(FIAU)的二磷酰甘油二酯衍生物。

4.13 试剂盒

本发明还涉及药物包或药物试剂盒，其中含有一个或多个装有本发明的一种或多种上述组合物成分的容器。这些容器可带有一种由药物或生物制品管理政府机构授权的通告，该通告可说明该机构已批准生产、使用、或销售这种用于人类给药的制品。文中所述的任一种检测或方法所使用的试剂也可作为试剂盒的成分而被包括在内。

在一种试剂盒中，本发明的商品化微珠或微颗粒可存在于一种含有本发明的转染剂和编码生物活性治疗因子的多核苷酸的生理相容性流体溶液中，其中的所有三种成分都存在于一个瓶中。在另一种试剂盒中，本发明的商品化微颗粒可存在于一个瓶中。与本发明的转染剂结合的编码生物活性治疗因子的多核苷酸可存在于另一个瓶中，然后可以将微颗粒与多核苷酸转染剂复合物相混合。最后，在另一种试剂盒中，本发明的商品化微珠或微颗粒可存在于一个装有生理相容性流体溶液的瓶中。商品化的转染剂可存在于另一个独立的瓶中。本发明的编码生物活性治疗因子的多核苷酸可存在于第三个瓶中。然后可将三种不同瓶中的成分合并，以形成本发明的结合有编码生物活性治疗因子的多核苷酸和转染剂的微颗粒。

在另一种试剂盒中，本发明的微珠或微颗粒可存在于一种含有与转染剂结合的编码生物活性治疗因子的多核苷酸的生理相容性流体溶液中，其中的转染剂与一种促转染剂相结合。在另一种试剂盒中，本发明的微珠或微颗粒可存在于一种含有与转染剂结合的编码生物活性治疗因子的多核苷酸的生理相容性流体溶液中，其中的转染剂与一种生物活性治疗剂吸附增强剂相结合。

以下实施例只用于说明，而不作为限制。

5.实施例

实施例1

在装有100ml去离子水的烧杯中溶解58g氯化钠和27g醋酸钠。加入400ml甘油，然后将pH值调至5.9-6.1。然后添加90g N-三-羟基-甲基甲基丙烯酰胺、35mg二乙基氨基乙基丙烯酰胺和10g N，N-亚甲基-双-丙烯酰胺。60-70C加热，并添加100mo的300mg/ml热明胶溶液。添加热水，将混合物的总体积调至980ml，然后加入20ml浓度为70mg/ml的过硫酸铵溶液和4mlN，N，N’，N’-四甲基乙二胺。

将该溶液倒入石蜡油中，50-70C搅拌。几分钟后，提高温度以显示丙烯酸单体的聚合反应。然后进行倾析、仔细清洗、筛滤，并在缓冲介质中高压灭菌，以回收微球体。

经过筛选校准的微球体具有栓塞术所需的特性，其中包括一种标记的阳离子电荷和一种有效的粘着剂(明胶或变性胶原)。

实施例2

按照实施例1的方法进行，但用三乙基氨基乙基丙烯酰胺代替二乙基氨基乙基丙烯酰胺。将微球体回收之后，用25％的戊二醛溶液(100ml所有微球体)使明胶形成网状。该处理需在4C条件下搅拌过夜。然后用去离子水清洗。

实施例3和实施例4

按照实施例1和实施例2的方法进行，但用10g丙烯酸代替10g N-三-羟基-甲基甲基丙烯酰胺。所得微球体具有高膨胀性，通过盐浓度、离子浓度和pH值可以控制其膨胀性。在进行操作时，直接从使用者的角度来考虑方便有效的微球体。

实施例5和实施例6

按照实施例1和实施例2的方法进行，但用10g N-丙烯酰环六亚甲基普施安红HE-3B代替N-三-羟基-甲基甲基丙烯酰胺。所得微球体具有浓烈的红色，这是因为丙烯酸染料结合到聚合物的晶格中。在进行操作时，直接从使用者的角度来考虑方便有效的微球体。

实施例7和实施例8

用0.1M pH8的硼酸盐缓冲液清洗按实施例1-4的方法获得的100ml微球体，然后将微球体悬浮在50ml的5mg/ml罗丹明异硫氰酸盐溶液中。将悬浮液至少搅拌15小时，然后用中性缓冲液清洗至上清液无色为止。

然后对这些荧光红色微球体进行标定和灭菌，并将其用于栓塞性基因疗法。

实施例9和实施例10

按照实施例1-4的方法进行，但用10g不透X-射线的(丙烯酰胺基-3-丙酰胺基)-3-三碘-2，4，6-苯甲酸单体代替10g N--三-羟基-甲基甲基丙烯酰胺。

所得微球体具有吸收X-射线的特性，因而对栓塞性基因疗法中的体内微球体跟踪尤为重要。

实施例11-14

按照实施例1和2的方法进行，在最初的单体溶液中添加5g不透射线的可溶性线性聚合物、丙烯酰胺基-3-三碘-2，4，6-苯甲多酸(实施例11和实施例12)或(丙烯酰胺基-3-丙酰胺基)-3-三碘-2，4，6-苯甲多酸(实施例13和实施例14)。

这些分子量超过100,000 Dalton的聚合物被束缚在聚合物晶格中，并且在不破坏该申请书所述微球体的一般特性的情况下，这些聚合物有可能具有不透射线的特性，该性质可用于栓塞性基因疗法的体内跟踪。

实施例15和实施例16

按照实施例1和2的方法进行，在最初的单体溶液中添加200g硫酸钡粉末。所得微球体既不透可见光，也不透X-射线。

实施例17和实施例18

按照实施例1和实施例2的方法进行，在最初的单体溶液中添加50mg磁铁矿(Fe3O4)。

所得微球体具有能够用磁共振成像(MRI)方法进行检测的特性。

实施例21

制备用于栓塞性基因疗法的可注射悬液

本发明的另一项实施方案包括使用上述实施例1-20中的任一种微球体，然后将这种微球体与受适当启动子调控的编码p53基因的多核苷酸相混合，其中的多核苷酸与一种转染剂相结合，如Transfectam(Biosphere Medical)。这些微球体/P53基因/Transfectam组合物可用于小动脉栓塞和改良，继而可用于清除多种癌症，如肝癌、肾癌和胰腺癌。

实施例22

制备用于组合栓塞性基因疗法和抗血管发生性疗法的可注射悬液

本发明的另一项实施方案包括使用上述实施例1-20中的任一种微球体，然后将这种微球体与一种由多核苷酸(在适当启动子的控制下)编码的抗血管发生剂相混合，其中的多核苷酸与一种转染剂相结合，如Transfectam(Biosphere Medical)。这些微球体/P53基因/Transfectam组合物可用于癌症的组合小动脉栓塞，继而可用于抑制血管发生，以改善症状，然后可用于清除多种癌症，如前列腺癌。

上文描述的本发明的实施方案只是作为说明，该领域的技术人员都将认可或能够确定与本文描述的特定方法等价的多种方法。所有这些等价方法都将被认为处在本发明的范围只内，并且将包括在下文的权利要求中。

文中描述的所有文献的内容都在此引入作为参考。其他实施方案将包括在下文的权利要求中。

Claims (44)

1.一种适用于主动栓塞术的微球体，该微球体含有一种生物相容性的、交联的和基本上亲水的聚合物以及一种或多种活性成分，所述活性成分包括药物、疫苗，或其任意组合。

2.权利要求1的微球体，其中的微球体含有一种或多种弹料。

3.权利要求2的微球体，其中的弹料选自丙烯酸聚合物、丙烯酰胺聚合物、乙烯醇聚合物、丙烯酸酯聚合物、多糖、聚硅酮，及其混合物。

4.权利要求2的微球体，其中微球体的直径为约10μm-2000μm。

5.权利要求4的微球体，其中微球体的直径为约50μm-300μm。

6.权利要求1的微球体，其中的微球体是可膨胀的。

7.权利要求6的微球体，其中的微球体包含一些聚合物，这些聚合物选自丙烯酸钠聚合物、丙烯酰胺聚合物、丙烯酰胺衍生物聚合物或共聚物、丙烯酸钠与乙烯醇的共聚物、乙酸乙烯酯与丙烯酸酯的共聚物、乙酸乙烯酯与马来酸甲酯的共聚物、异丁烯-马来酸酐交联共聚物、淀粉-丙烯腈接枝共聚物、交联的聚丙烯酸钠聚合物，以及交联的聚环氧乙烷。

8.权利要求6的微球体，其中的微球体的直径在膨胀之前为约10μm-400μm。

9.权利要求8的微球体，其中的微球体的直径在膨胀之前为约10μm-200μm。

10.权利要求6的微球体，其中的微球体的直径在膨胀之后为约10μm-2000μm。

11.权利要求1的微球体，其中的药物选自抗肿瘤药物、抗血管发生药物、抗真菌药物、抗病毒药物、抗炎药物、抗细菌药物，以及抗组胺药物。

12.权利要求1的微球体，其中的疫苗选自肺炎球菌疫苗、脊髓灰质炎疫苗、炭疽热疫苗、结核(BCG)疫苗、甲型肝炎疫苗、霍乱疫苗、脑膜炎球菌A、C、Y疫苗、W135疫苗、鼠疫疫苗、狂犬病(人类二倍体)疫苗、黄热病疫苗、日本脑炎疫苗、伤寒(苯酚灭活和热灭活的)疫苗、乙肝疫苗、白喉疫苗、破伤风疫苗、百日咳疫苗、b型流感嗜血杆菌疫苗、灰质炎疫苗、麻疹疫苗、腮腺炎疫苗、风疹疫苗、水痘疫苗、肺炎链球菌Ty(活体突变菌)疫苗、Vi(Vi荚膜多糖)疫苗、DT(类毒素)疫苗、Td(类毒素)疫苗、aP(灭活的细菌抗原/非细胞的(DtaP))疫苗、Hib(细菌多糖-蛋白结合物)疫苗、乙肝病毒(来自病毒抗原/重组抗原的灭活血清)疫苗、流感疫苗、轮状病毒疫苗、呼吸道合胞体病毒(RSV)疫苗、人星状病毒疫苗、轮状病毒疫苗、人类A型及B型流感病毒疫苗、甲肝病毒疫苗、减毒的活体3型副流感病毒疫苗、肠道病毒疫苗、逆转录病毒疫苗，以及细小核糖核酸病毒疫苗。

13.权利要求1的微球体，该微球体还包含一种选自荧光标记衍生物、化学染料和磁共振成像剂的成像剂或造影剂。

14.权利要求1的微球体，其中的聚合物具有占分子量约0.5％-20％的交联物。

15.一种可注射组合物，该组合物含有权利要求1的微球体和一种生物相容性载体。

16.权利要求15的组合物，其中组合物含有占重量约10％-90％的微球体以及占重量约10％-90％的生物相容性载体。

17.权利要求16的组合物，其中组合物含有占重量约10％-50％的微球体以及占重量约50％-90％的生物相容性载体。

18.权利要求15的组合物，其中的组合物是所述微球体在所述生物相容性载体中的一种悬液。

19.权利要求18的组合物，其中的生物相容性聚合物存在于一种乳剂中。

20.权利要求18的组合物，其中的生物相容性聚合物存在于一种有机溶液或非水性溶液中。

21.权利要求18的组合物，其中的生物相容性聚合物存在于一种水基溶液、一种水-有机溶液，或其混合物中。

22.权利要求18的组合物，其中的生物相容性载体含有约0.01M-5M的阳离子盐，其中的阳离子选自钠、钾、钙、镁、铁、锌和铵。

23.权利要求22的组合物，其中的盐是以造影剂的形式提供。

24.权利要求18的组合物，其中的造影剂为(丙烯酰胺基-3-丙酰胺基)-3-三碘-2，4，6-苯甲酸单体。

25.权利要求15的组合物，其中的组合物可以用18号或更小的针头进行注射。

26.一种用于在哺乳动物中进行主动栓塞术的方法，该方法包括将一种微球体给药于需要治疗的哺乳动物，该微球体含有一种生物相容性的、交联的和基本上亲水的聚合物，以及一种或多种药物、疫苗，或其组合。

27.权利要求26的方法，其中的微球体含有一种或多种弹料。

28.权利要求27的方法，其中的弹料选自丙烯酸聚合物、丙烯酰胺聚合物、乙烯醇聚合物、丙烯酸酯聚合物、多糖、聚硅酮，及其混合物。

29.权利要求27的方法，其中的微球体的直径为约10μm-2000μm。

30.权利要求27的方法，其中的微球体的直径为约50μm-300μm。

31.权利要求26的方法，其中的微球体是可膨胀的。

32.权利要求31的方法，其中所述微球体含有离子型多糖和离子型合成聚合物。

33.权利要求32的方法，其中的离子型多糖选自羧甲基葡聚糖、硫酸葡聚糖和藻酸。

34.权利要求32的方法，其中的离子型合成聚合物选自丙烯酸钠聚合物、丙烯酰胺聚合物、丙烯酰胺衍生物聚合物或共聚物、丙烯酸钠与乙烯醇的共聚物、乙酸乙烯酯与丙烯酸酯的共聚物、乙酸乙烯酯与马来酸甲酯的共聚物、异丁烯-马来酸酐交联共聚物、淀粉-丙烯腈接枝共聚物、交联的聚丙烯酸钠聚合物，以及交联的聚环氧乙烷。

35.权利要求31的方法，其中的微球体的直径在膨胀之前为约10μm-400μm。

36.权利要求35的方法，其中的微球体的直径在膨胀之前为约10μm-200μm。

37.权利要求31的方法，其中的微球体的直径在膨胀之后为约10μm-2000μm。

38.权利要求26的方法，其中的治疗性活性药物选自抗肿瘤药物、抗血管发生药物、抗真菌药物、抗病毒药物、抗炎药物、抗细菌药物、抗组胺药物、抗血管发生因子、抗瘤剂、激素和类固醇、维生素、肽和肽类似物、酶、抗过敏剂、循环系统药物、抗结核剂、抗病毒剂、抗心绞痛剂、抗原生动物剂、抗风湿剂、麻醉剂、强心苷、镇静剂、局部麻醉剂、全身麻醉剂。

39.权利要求26的方法，其中的疫苗选自肺炎球菌疫苗、脊髓灰质炎疫苗、炭疽热疫苗、结核(BCG)疫苗、甲型肝炎疫苗、霍乱疫苗、脑膜炎球菌A、C、Y疫苗、W135疫苗、鼠疫疫苗、狂犬病(人类二倍体)疫苗、黄热病疫苗、日本脑炎疫苗、伤寒(苯酚灭活和热灭活的)疫苗、乙肝疫苗、白喉疫苗、破伤风疫苗、百日咳疫苗、b型流感嗜血杆菌疫苗、灰质炎疫苗、麻疹疫苗、腮腺炎疫苗、风疹疫苗、水痘疫苗、肺炎链球菌Ty(活体突变菌)疫苗、Vi(Vi荚膜多糖)疫苗、DT(类毒素)疫苗、Td(类毒素)疫苗、aP(灭活的细菌抗原/非细胞的(DtaP))疫苗、Hib(细菌多糖-蛋白结合物)疫苗、乙肝病毒(来自病毒抗原/重组抗原的灭活血清)疫苗、流感疫苗、轮状病毒疫苗、呼吸道合胞体病毒(RSV)疫苗、人星状病毒疫苗、轮状病毒疫苗、人类A型及B型流感病毒疫苗、甲肝病毒疫苗、减毒的活体3型副流感病毒疫苗、肠道病毒疫苗、逆转录病毒疫苗，以及细小核糖核酸病毒疫苗。

40.权利要求26的方法，其中的微球体还包含一种选自荧光标记衍生物、化学染料和磁共振成像剂的成像剂或造影剂。

41.权利要求26的方法，其中的聚合物具有占分子量约0.5％-20％的交联物。

42.权利要求26的方法，其中的给药包括对需要栓塞的所述哺乳动物的某个区域进行注射。

43.权利要求1的微球体，其中的抗肿瘤药物为紫杉酚、阿霉素、他莫昔芬，或其组合。

44.一种用于在哺乳动物中进行主动栓塞术的方法，该方法包括将一种微球体给药于需要治疗的哺乳动物，该微球体含有一种生物相容性的、交联的和基本上亲水的聚合物，以及一种或多种药物、疫苗，或其组合，其中所述微球体是通过使用定向抗体而被递送至作用部位。