CN1469755A - 包含病毒唑的疫苗及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了增强动物(例如家养、运动或宠物物种)和人中疫苗效应的组合物和方法。更具体而言，本发明公开了包含病毒唑和抗原(优选具有丙型肝炎病毒(HCV)上表位的抗原)的疫苗组合物，用于治疗和预防疾病，优选HCV感染。

Description

包含病毒唑的疫苗及其使用方法
发明领域
本发明涉及增强动物(例如家养、运动或宠物物种)和人中疫苗效应的组合物和方法。更具体而言，优选实施方案涉及病毒唑作为佐剂的用途，以及具有病毒唑和抗原的组合物。
发明背景
利用疫苗预防人、家畜、运动动物和家养宠物的疾病，司空见惯。然而，用于疫苗的抗原常常免疫源性不足，难以将抗体滴度提高到足以防护后续攻击的水平，或者保持经过一段时间后达到该水平的潜力。另外，许多疫苗诱导细胞介导免疫完全不足，而细胞介导免疫是针对细菌和病毒感染主要的免疫防御。大量研究当前集中在开发更有效的疫苗以及增强含抗原制剂的免疫原性。(例如参见U.S.Pat.Nos.6,056,961；6,060,068；6,063,380；以及Li等人，Science 288：2219-2222(2000))。
乙型肝炎疫苗是有名的这种＂弱＂疫苗。例如针对乙型肝炎病毒的重组疫苗，如Genhevacb(Pasteur Merieux Serums et Vaccines，58，Avenue Leclerc 69007 Lyon，France)、Engerixb(Smith，Kline andSymbol French)以及Recombivaxhb(Merck，Sharp和Dhome)，只是在0、30、和60或180天至少3次注射、继之以一年后必须加强以后才有效。(Chedid等人，U.S.Patent No.6,063,380)。另外，许多接受这些疫苗的患者即使有应答，也很差。由于世界上许多地区对HBV感染具有地方性，现有HBV疫苗免疫源性差的特性成为极其严重的问题。
为了获得更强的体液和/或细胞应答，通常在能增强患者对疫苗中抗原免疫应答的物质中施用疫苗。最常用的疫苗规程佐剂为油制剂和明矾。(Chedid等人，U.S.Patent No.6,063,380)。需要许多安全有效佐剂。
核苷类似物因其降低病毒复制的能力，已经广泛用于抗病毒治疗。(Hosoya等人，J.Inf.Dis.，168：641-646(1993))。病毒唑(1-β-D-呋喃核糖基-1，2，4-三唑-3-羧酰胺)是合成的鸟嘌呤核苷类似物，已经用于抑制RNA和DNA病毒复制。(Huffman等人，Antimicrob.Agents.Chemother，3：235(1973)；Sidwell等人，Science，177：705(1972))。已经证明病毒唑是肌醇磷酸(IMP)脱氢酶(IMPDH)的竞争性抑制物，IMPDH将IMP转变为IMX(其然后转变为GMP)。De Clercq， Anti viral Agents：characteristic activity spectrum depending on the molecular target with which they interact，Academic press，Inc.，NewYork N.Y.，pp.1-55(1993)。病毒唑长期治疗引起细胞内GTP池的消耗。
除抗病毒活性之外，研究者观察到某些鸟嘌呤核苷类似物影响免疫系统。(美国专利No.6,063,772和4,950,647)。已经表明病毒唑抑制功能性体液免疫应答(Peavy等人，J.Immunol.，126：861-864(1981)；Powers等人，Antimicrob.Agents.Chemother.，22：108-114(1982))以及IgE介导的调节肥大细胞分泌。(Marquardt等人，J Pharmacol.Exp.Therapeutics，240：145-149(1987))。据有些研究者报道，病毒唑的日常口服治疗对人和小鼠具有免疫调节作用。(Hultgren等人，J.Gen.Virol，79：2381-2391(1998)和Cramp等人，Gastron.Enterol，118：346-355(2000))。然而，目前关于病毒唑对免疫系统作用的理解尚处于初期。
发明概述
已经发现病毒唑能够用作佐剂，以增强或促进对抗原的免疫应答。此处所述本发明的实施方案包括含有抗原和病毒唑的＂强＂疫苗制剂。这些制剂一般具有足以增强或促进对抗原免疫应答的相当数量病毒唑。本发明的其它方面包括增强或促进动物、包括人对抗原免疫应答的方法。例如，通过一种方法，鉴别需要对抗原有效免疫应答的动物，然后提供相当数量的病毒唑连同抗原。某些方法中，联合提供病毒唑和抗原(例如于单一组合物中)，而其它方法中则分别提供病毒唑和抗原。一些实施方案还涉及制造和使用具有病毒唑和抗原的组合物。
尽管包含的组合物包括病毒唑以及实际上任何的抗原或表位，优选的组合物包含病毒唑和肝炎病毒抗原或表位。抗原或表位可以基于肽或核酸(例如，编码肽抗原的RNA或者引入受试者时表达肽抗原的构建体)。实施方案为具有病毒唑、以及包含甲型肝炎病毒(HAV)抗原或表位的肽或者编码所述肽的核酸的组合物。实施方案为具有病毒唑、以及包含乙型肝炎病毒HBV)抗原或表位的肽或者编码所述肽的核酸的组合物。合适的HBV抗原包括，例如乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、肝炎核心抗原(HBcAg)、肝炎e抗原(HBeAg)以及编码这些分子的核酸。实施方案还是具有病毒唑、并包含丙型肝炎病毒(HCV)抗原或表位的肽或者编码所述肽的核酸的组合物。合适的HCV抗原包括而不限于，HCV序列的一个或多个结构域(例如NS3和/或NS4A)以及编码所述分子的核酸。
还发现了新的HCV序列。从感染HCV患者克隆并测序了HCV基因组新的NS3/4A片段(SEQ.ID.NO.：16)。发现该序列与最紧密相关的HCV序列只有93％的同源性。该新肽(SEQ.ID.NO.：17)及其至少3、4、6、8、10、12、15或20个氨基酸长度的片段、编码这些分子的核酸、具有所述核酸的载体以及具有所述载体、核酸或肽的细胞也是本发明的实施方案。特别优选的实施方案是疫苗组合物，其包含病毒唑以及SEQ.ID.NO.：17的HCV肽、或其至少3、4、6、8、10、12、15或20个氨基酸长度的片段(例如SEQ.ID.NO.：25)、或编码所述肽或片段的核酸。
此外，人们发现截短的突变体以及缺少蛋白水解裂解位点的NS3/4A肽的突变体具有高度免疫源性。这些新肽(SEQ.ID.NO.：29-32和43-49)及其至少3、4、6、8、10、12、15或20个氨基酸长度的片段(例如SEQ.ID.NO.：26、27和33-42)、编码这些分子的核酸、具有所述核酸的载体以及具有所述载体、核酸或肽的细胞也是实施方案。特别优选的实施方案是疫苗组合物，其包含病毒唑以及SEQ.ID.NO.：29-32和43-49的至少一个HCV肽、或其至少3、4、6、8、10、12、15或20个氨基酸长度的片段(例如SEQ.ID.NO.：26、27和33-42)、或编码所述肽或片段的核酸。
另外，具有上述抗原混合物的组合物是本发明的实施方案。例如，一些组合物包含HBV抗原、HAV抗原和病毒唑，或者HBV抗原、HCV抗原和病毒唑，或者HAV抗原、HCV抗原和病毒唑，或者HBV抗原、HAV抗原、HCV抗原和病毒唑。其它实施方案包含病毒唑和编码上述抗原混合物的核酸。某些实施方案也包括本领域已知的其它佐剂、粘合剂、乳化剂、载体和填料，包括但不限于明矾、油及其它增强免疫应答的化合物。
本发明的方面也包括此处所述组合物的制造和使用方法。某些方法将病毒唑与肽或核酸抗原(例如HAV、HBV、HCV抗原)混合，制成单一组合物(例如疫苗组合物)而实现。优选的方法包括，将病毒唑与具有HCV一个或多个结构域(例如NS3和/或NS4A)上的表位的HCV抗原混合。
此处所述组合物的优选用法包括，提供有此需要的动物足量的病毒唑和肝炎病毒抗原(例如HBV抗原、HAV抗原、HCV抗原，或编码这些抗原之一的核酸或其任意组合)。例如，通过一种方法，鉴别需要对肝炎病毒抗原有效免疫应答的动物(例如，具有肝炎感染的风险或者已经感染上肝炎的动物)，并提供所述动物相当数量的有效增强或促进对肝炎病毒抗原免疫应答的病毒唑和肝炎病毒抗原(于单一组合物中或者分别提供)。优选地，鉴别需要对HCV有效免疫应答的动物，提供所述动物一种组合物，其中包含病毒唑和含有SEQ.ID.NO.：1、6、7或17所示的抗原或表位的肽、或者编码所述肽的核酸。特别优选的方法包括，鉴别需要对HCV有效免疫应答的动物，并提供所述动物一种组合物，其中包含病毒唑和相当数量的HCV抗原(例如NS3/4A(SEQ.ID.NO.：17)、NS3/4A突变体SEQ.ID.NO.：29-32和43-49、或其至少3、4-10、10-20、20-30、或30-50个氨基酸长度的片段(例如SEQ.ID.NO.：25-27和33-42)或者编码一种或多种这些分子的核酸)，其足以增强或促进对所述抗原免疫应答。
附图简述
图1显示当与单剂量1mg病毒唑共同给药时，对10和100μg重组丙型肝炎病毒(HCV)非结构3蛋白质(NS3)的体液应答，由平均终点滴度确定。
图2显示当与单剂量的0.1、1.0或10mg病毒唑共同给药时，对20μg重组丙型肝炎病毒(HCV)非结构3蛋白质(NS3)的体液应答，由平均终点滴度确定。
图3显示单剂量1mg病毒唑对NS3特异性淋巴结增生应答的作用，由体外记忆性应答确定。
图4显示H-2d小鼠初次免疫后针对NS3抗体滴度对时间的函数。菱形表示NS3/4A-pVAX免疫小鼠的抗体滴度，正方形表示NS3-pVAX免疫小鼠的抗体滴度。
图5A显示特异性CTL介导的SP2/0靶细胞裂解百分比对效应细胞和靶细胞比值的函数。磷酸盐缓冲盐水(PBS)用作对照免疫原。
图5B显示特异性CTL介导的SP2/0靶细胞裂解百分比对效应细胞和靶细胞比值的函数。质粒NS3/4A-pVAX用作免疫原。
发明详述
已经发现了包含病毒唑和抗原(例如，包含病原体如病毒、细菌、霉菌、酵母或寄生虫的表位的分子)的组合物增强和/或促进动物对抗原的免疫应答。更确切地说，人们发现病毒唑是有效的＂佐剂＂，为本公开目的，其是指能够增强或促进对特定抗原免疫应答的物质。病毒唑显著增强免疫介导的抗原防护、提高抗原引起的抗体滴度以及增强增殖性T细胞应答证明了其佐剂活性。
此处描述了包含病毒唑和抗原或表位的几种组合物(例如疫苗)。例如，包含病毒唑的疫苗制剂可以根据病毒唑的量、病毒唑的形式以及抗原类型而变化。抗原可以是肽或核酸(例如，编码肽抗原的RNA或者引入受试者时表达肽抗原的构建体)。优选的组合物包含病毒唑和肝炎病毒抗原(例如HAV抗原、HBV抗原、HCV抗原、编码这些这些的核酸或其任意组合)。特别地，希望将至少一种HCV抗原、或SEQ.ID.NO.：1所示的表位、或编码所述HCV抗原的核酸与病毒唑混合，以制备所述组合物。也就是说，某些实施方案包括而不限于含有病毒唑以及包含SEQ.ID.NO.：1或其具有SEQ.ID.NO.：1的至少2500、2000、1600、1200、800、400、200、100、50、10或3个连续氨基酸片段的肽的组合物。另外的实施方案涉及包含病毒唑以及SEQ.ID.NO.：13或其具有SEQ.ID.NO.：13的至少9、12、15、20、30、50、75、100、200、500个连续核苷酸的片段的编码核酸。
其它实施方案包括组合物(例如疫苗)，其包含病毒唑以及SEQ.ID.NO.：1的特定片段，其中所述片段对应于HCV的特定结构域。例如，某些实施方案包含对应于SEQ.ID.NO.：1的1-182，、183-379、380-729、730-1044、1045-1657、1658-1711、1712-1971或1972-30111氨基酸的HCV片段。包含病毒唑以及编码一种或多种这些片段的核酸的组合物也是本发明的实施方案。
另外发现了新的HCV序列。从感染HCV患者克隆了新的核酸以及对应于HCV NS3/4A结构域的蛋白质(SEQ.ID.NO.：16)。Genebank检索显示该克隆序列与HCV序列具有最大的同源性，但与最接近的HCV亲本(relative)只有93％同源性(登录号AJ278830)。该新肽(SEQ.ID.NO.：17)及其至少3、4、6、8、10、12、15或20个氨基酸长度的片段、编码这些分子的核酸、具有所述核酸的载体以及具有所述载体、核酸或肽的细胞也是本发明的实施方案。另外，此处所述的某些疫苗实施方案包含病毒唑以及该新的NS3/4A肽、或其至少3、4、6、8、10、12、15或20个氨基酸长度的片段(例如SEQ.ID.NO.：25)、或编码一种或多种这些分子的核酸。
也制备了该新NS3/4A肽的突变体。人们发现截短的突变体(例如SEQ.ID.NO.：29)以及缺少蛋白水解裂解位点的突变体，具有高度免疫源性。这些新肽SEQ.ID.NO.：29-32和43-49及其至少3、4、6、8、10、12、15或20个氨基酸长度的片段(例如SEQ.ID.NO.：26、27和33-42)、编码这些分子的核酸、具有所述核酸的载体以及具有所述载体、核酸或肽的细胞也是实施方案。此外，此处所述的某些组合物包含病毒唑以及至少一种上述HCV肽突变体、或其至少3、4、6、8、10、12、15或20个氨基酸长度的片段。其它疫苗实施方案包含病毒唑以及编码一种或多种上述肽的核酸(例如DNA)。
制备和使用上述组合物的方法也是实施方案。例如，通过提供病毒唑、提供抗原(例如包含HCV抗原的肽或编码所述肽的核酸)以及将所述病毒唑与所述抗原混合以配制可用于增强或促进受试者对所述抗原免疫应答的组合物，可以制备上述组合物。优选的方法要求将优选抗原或表位(例如包含SEQ.ID.NO.：1、6、7或17、或其特定片段如SEQ.ID.NO.：1的1-182、183-379、380-729、730-1044、1045-1657、1658-1711、1712-1971、1972-3011氨基酸的肽以及编码这些分子的核酸)与病毒唑混合。其它抗原或表位也可以与病毒唑混合，包括而不限于具有SEQ.ID.NO.：1至少2500、2000、1600、1200、800、400、200、100、50、10或3个连续氨基酸的片段以及编码这些片段的核酸。特别优选的方法涉及制备包含新发现的NS3/4A片段或NS3/4A突变体(例如截短的突变体或缺少蛋白水解裂解位点的突变体)、或其至少4个氨基酸长度的片段、或编码一种或多种这些分子的核酸的疫苗组合物。
增强或促进动物、包括人对抗原免疫应答的方法是本发明的实施方案。例如，通过鉴别需要对抗原/表位有效免疫应答的动物，并提供所述动物包含抗原/表位以及有效增强或促进对抗原/表位免疫应答的相当数量病毒唑的组合物，可以实现这种方法。在某些实施方案中，病毒唑和抗原分别给予，而不是在单一混合物中。在这种情况下，优选在给予抗原之前或之后短时间给予病毒唑。优选的方法包括提供有此需要的动物病毒唑和肝炎抗原(例如HAV抗原、HBV抗原、HCV抗原、编码这些分子的核酸或其任意组合)。其中某些方法包括HCV抗原，例如包含SEQ.ID.NO.：1或其具有SEQ.ID.NO.：1的至少2500、2000、1600、1200、800、400、200、100、50、10或3个连续氨基酸的片段的肽。另外的方法包括包含病毒唑和SEQ.ID.NO.：13的编码核酸或者编码一种或多种上述片段的核酸的组合物。
例如，某些优选的方法涉及利用组合物(例如疫苗)，其包含病毒唑以及包含SEQ.ID.NO.：1或其对应于HCV结构域的特定片段的肽，包括但不限于包含SEQ.ID.NO.：1的1-182、183-379、380-729、730-1044、1045-1657、1658-1711、1712-1971或者1972-3011氨基酸的肽。特别优选的方法涉及利用疫苗组合物，其包含SEQ.ID.NO.：17的NS3/4A片段或缺少蛋白水解裂解位点的NS3/4A突变体(例如SEQ.ID.NO.：.29-32和43-49)、或其至少3、4、6、8、10、12、15或20个氨基酸长度的片段(例如SEQ.ID.NO.：.26、27和33-42)。包含病毒唑以及编码这些片段的核酸的组合物也可以用于此处所述方法。
其它实施方案涉及治疗和预防HCV感染的方法。通过一种方法，病毒唑和HCV抗原或表位用于制备治疗和/或预防HCV感染的药物。通过另一种方法，鉴别需要预防和/或治疗HCV感染的药物的个体，并提供所述个体包含病毒唑和HCV抗原或表位的药物，其优选SEQ.ID.NO.：1所示的表位，更优选具有SEQ.ID.NO.：1至少2500、2000、1600、1200、800、400、200、100、50、10或3个连续氨基酸的片段，或最优选SEQ.ID.NO.：1的例如1-182、183-379、380-729、730-1044、1045-1657、1658-1711、1712-1971或1972-3011的片段，或编码SEQ.ID.NO.：1或上述片段的核酸。特别优选的方法涉及利用疫苗组合物，其包含病毒唑以及SEQ.ID.NO.：17的NS3/4A片段或缺少蛋白水解裂解位点的NS3/4A突变体(例如SEQ.ID.NO.：.29-32和43-49)、或其至少3、4、6、8、10、12、15或20个氨基酸长度的片段(例如SEQ.ID.NO.：.25-27和33-42)、编码一种或多种这些分子的核酸。下节更详细讨论了病毒唑作为佐剂的用途。
病毒唑
可以根据草药药剂学的以生产给予动物(例如包括人在内的哺乳动物)的药物的常规方法制备此处所述组合物。病毒唑可以从市场供应商处获得(例如Sigma和ICN)。病毒唑和/或抗原可以经过或未经改变而配制成疫苗。例如，病毒唑和/或抗原可以改变或衍生，以制备更为稳定的分子和/或更有效的佐剂。通过一种方法，可以将分子偶联到支持物，例如亲水聚合物(例如聚乙二醇)，从而能增强病毒唑和/或抗原的稳定性。
利用合理药物设计和组合化学的常规方法可以产生很多的病毒唑衍生物。例如，Molecular Simulations Inc.(MSI)以及其它许多供应商，提供能使技术人员构建有机分子组合文库的软件。例如，C2.AnalogBuilder程序可以整合MSI的Cerius2分子多样性软件套件，以产生病毒唑衍生物文库，其能够用于此处所述实施方案。(例如参见http：//msi.com/life/products/cerius2/index.html)。
通过一种方法，在计算机可读介质上记录病毒唑的化学结构，可由一种或多种模建软件应用程序访问。C2.Analog Builder程序与C2Diversity程序联用，可以使用户基于例如每个取代基位置的R-基团的多样性，而产生非常大的虚拟文库。然后利用常规化学方法制备或可以从商业来源获得在虚拟文库中创造的与模建病毒唑衍生物结构相同的化合物。
然后利用试验筛选新制备的病毒唑衍生物，确定分子的佐剂活性大小和/或其调节免疫应答能力的大小。某些试验可以包括虚拟的药物筛选软件，例如C2.Ludi。C2.Ludi软件程序使用户探测分子(例如病毒唑衍生物)数据库，确定其与目的蛋白质(例如RAC2或另一种GTP结合蛋白质)的活性部位相互作用的能力。以虚拟药物筛选软件发现的预测的相互作用为基础，利用常规试验确定佐剂活性和/或分子调节免疫应答的大小，按另外特征排列病毒唑衍生物的优先次序。实施例1描述了用于评价病毒唑的佐剂活性的若干试验。
实施例1
下列试验可用于任何病毒唑衍生物或病毒唑衍生物的组合，以确定特定组合物的佐剂活性程度。第一组实验中，在第0和第4周用10μg或100μg重组丙型肝炎病毒非结构3(rNS3)蛋白质i.p(腹膜内)或s.c.(皮下)(例如在尾尖)免疫每组3-5只Balb/c小鼠(BK Universal，Uppsala，Sweden)。rNS3溶于磷酸盐缓冲盐水(PBS)或包含1mg病毒唑(得自ICN，Costa Mesa，CA)的PBS。小鼠每次注射总体积100μl。
在首次i.p.免疫后2、4和6周，所有小鼠通过后眼窝放血取样。收集血清样品，分析针对rNS3抗体的存在。为确定抗体滴度，进行酶免疫分析(EIA)。(例如参见Hultgren等人，J Gen Virol.79：2381-91(1998)和Hultgren等人，Clin.Diagn.Lab.Immunol.4：630-632(1997))。将405nm处光密度超过非免疫小鼠两倍时的最高血清稀释度，记为抗体水平。
接受混合1mg病毒唑的10μg或100μg rNS3的PBS的小鼠，一致显示较高水平的NS3抗体。免疫2周后EIA检测的抗体滴度如表1所示。具有1mg病毒唑以及10μg或100μg rNS3的疫苗制剂诱导的抗体滴度显著高于仅由rNS3组成的疫苗制剂。
第二组实验中，在第0和第4周用包含0mg、1mg、3mg或10mg病毒唑(Sigma)的10μg或50μg rNS3的100μl磷酸盐缓冲盐水腹膜内免疫每组8只Balb/c小鼠。在第4、6和8周，小鼠取血，分离血清并冷冻。研究完成以后，如上所述测试血清的重组NS3抗体的水平。利用Student＇s t检验(参数分析)或Mann-Whitney(非参数分析)以及StatView4.5程序包(Abacus Concepts，Berkely，CA)对rNS3的平均抗体水平进行组间比较。病毒唑以3个剂量加入10μg NS3时，其佐剂效应列于表1。病毒唑以3个剂量加入50μg NS3时，其佐剂效应列于表2。接受不同的10μg或50μg rNS3以及不同剂量病毒唑的小鼠，其平均rNS3抗体滴度的参数比较分别列于表3和4。接受不同的10μg或50μg rNS3以及不同剂量病毒唑的小鼠，其平均NS3抗体滴度的非参数比较分别列于表5和6。给出的数值代表重组rNS3的终点滴度。
                                          表1
  病毒唑量(mg/剂量)   免疫原量(μg/剂量         小鼠ID           指定周rNS3抗体滴度
    第4周     第6周     第8周
  无   10         5∶1     300     1500     1500
  无   10         5∶2     ＜60     7500     1500
  无   10         5∶3     ＜60     1500     300
  无   10         5∶4     60     1500     1500
  无   10         5∶5     ＜60     1500     nt
  无   10         5∶6     60     1500     1500
  无   10         5∶7     ＜60     7500     7500
  无   10         5∶8     300     37500     7500
          组平均滴度(平均值±SD)     180±139     7500±12421     3042±3076
  1     10     6∶1     300     37500     37500
  1     10     6∶2     ＜60     1500     1500
  1     10     6∶3     300     37500     187500
  1     10     6∶4     300     37500     7500
  1     10     6∶5     60     nt     nt
  1     10     6∶6     ＜60     37500     7500
  1     10     6∶7     ＜60     37500     7500
  1     10     6∶8     300     7500     7500
          组平均滴度(平均值±SD)     252±107     28071±16195     36642±67565
  3     10     7∶1     60     37500     7500
  3     10     7∶2     60     37500     37500
  3     10     7∶3     300     7500     7500
  3     10     7∶4     300     37500     7500
  3     10     7∶5     300     37500     37500
  3     10     7∶6     300     37500     37500
  3     10     7∶7     60     7500     7500
  3     10     7∶8     60     37500     37500
    组平均滴度(平均值±SD)     180±128     30000±13887     22500±34637
  10     10     8∶1     300     37500     37500
  10     10     8∶2     300     37500     37500
  10     10     8∶3     ＜60     300     300
  10     10     8∶4     60     7500     7500
  10     10     8∶5     ＜60     300     300
  10     10     8∶6     ＜60     37500     37500
  10     10     8∶7     ＜60     7500     7500
  10     10     8∶8     ＜60     nt     nt
  组平均滴度(平均值±SD)     220±139     18300±18199     18300±18199
                              表2
   病毒唑量(mg/剂量)   免疫原量(μg/剂量)     小鼠ID                指定周rNS3抗体滴度
    第4周     第6周     第8周
   无   50     1∶1     60     7500     7500
   无   50     1∶2     60     7500     7500
   无   50     1∶3     60     7500     7500
   无   50     1∶4     ＜60     1500     300
   无   50     1∶5     300     37500     37500
   无   50     1∶6     60     7500     7500
   无   50     1∶7     60     37500     7500
   无   50     1∶8     ·     ·     ·
      组平均滴度(平均值±SD)     100±98     15214±15380     10757±12094
   1     50 2∶1     60     7500     7500
   1     50 2∶2     300     37500     7500
   1     50 2∶3     60     187500     7500
   1     50 2∶4     60     37500     187500
   1     50 2∶5     60     37500     7500
   1     50 2∶6     60     37500     37500
   1     50 2∶7     300     37500     7500
   1     50 2∶8     300     37500     37500
      组平均滴度(平均值±SD)     150±124     52500±55549     37500±62105
   3     50 3∶1     60     37500     7500
   3     50 3∶2     300     37500     37500
   3     50 3∶3     300     37500     7500
   3     50 3∶4     60     37500     7500
   3     50 3∶5     300     37500     7500
   3     50 3∶6     60     37500     7500
   3     50 3∶7     -     7500     37500
   3     50 3∶8     1500     7500     37500
      组平均滴度(平均值±SD)     387±513     30000±13887     18750±15526
   10     50 4∶1     300     7500     7500
   10     50 4∶2     300     37500     37500
   10     50 4∶3     60     7500     7500
   10     50 4∶4     60     7500     7500
   10     50 4∶5     60     1500     1500
   10     50 4∶6     60     7500     37500
   10     50 4∶7     -     7500     7500
   10     50 8∶8     60     37500     7500
      组平均滴度(平均值±SD)     140±124     10929±11928     15214±15380
                                          表3
组     周     平均值±SD  组   平均值±SD 分析 p值
10μgNS3/无病毒唑     4     180±139  10μgNS3/1mg病毒唑   252±107 Studentst检验 0.4071
    6     7500±12421   28071±16195 Studentst检验 0.0156
    8     3042±3076   36642±67565 Studentst检验 0.2133
10μgNS3/无病毒唑     4     180±139  10μgNS3/3mg病毒唑   180±128 Studentst检验 1.000
    6     7500±12421   30000±13887 Studentst检验 0.0042
    8     3042±3076   22500±34637 Studentst检验 0.0077
10μgNS3/无病毒唑     4     180±139  10ugNS3/10mg病毒唑   220±139 Studentst检验 0.7210
    6     7500±12421   18300±18199 Studentst检验 0.1974
    8     3042±3076   18300±18199 Studentst检验 0.0493
                                          表4
组    周     平均值±SD  组   平均值±SD  分析 p值
50μgNS3/无病毒唑    4     100±98 50μgNS3/1mg病毒唑   150±124  Studentst检验 0.4326
   6     15214±15380   52500±55549  Studentst检验 0.1106
   8     10757±12094   37500±62105  Studentst检验 0.2847
50μgNS3/无病毒唑    4     100±98 50ugNS3/3mg病毒唑   387±513  Studentst检验 0.2355
   6     15214±15380   30000±13887  Studentst检验 0.0721
   8     10757±12094   18750±15526  Studentst检验 0.2915
50μgNS3/无病毒唑    4     100±98 50μgNS3/10mg病毒唑   140±124  Studentst检验 0.5490
   6     15214±15380   10929±11928  Studentst检验 0.5710
   8     10757±12094   15214±15380  Studentst检验 0.5579
显著性水平：NS＝不显著；*＝p＜0.05；**＝p＜0.01；***＝p＜0.001
                                          表5
组     周   平均值±SD   组   平均值±SD  分析   p值
10μgNS3/无病毒唑     4   180±139   10ugNS3/1mg病毒唑   252±107  Mann-Whitney   0.4280
    6   7500±12421   28071±16195  Mann-Whitney   0.0253
    8   3042±3076   36642±67565  Mann-Whitney   0.0245
10μgNS3/无病毒唑     4   180±139   10μgNS3/3mg病毒唑   180±128  Mann-Whitney   0.0736
    6   7500±12421   30000±13887  Maann-Whitney   0.0050
    8   3042±3076   22500±34637  Mann-Whtney   0.0034
10μgNS3/无病毒唑     4   180±139   10μgNS3/10mg病毒唑   220±139  Mann-Whitney   0.8986
    6   7500±12421   18300±18199  Mann-Whitney   0.4346
    8   3042±3076   18300±18199  Mann-Whitney   0.2102
                                      表6
组   周   平均值±SD 组   平均值±SD  分析   p值
50μgNS3/无病毒唑   4   100±98 50ugNS3/1mg病毒唑   150±124  Mann-Whitney   0.1128
  6   15214±15380   52500±55549  Mann-Whitney   0.0210
  8   10757±12094   37500±62105  Mann-Whitney   0.1883
50μgNS3/无病毒唑   4   100±98 50ugNS3/3mg病毒唑   387±513  Mann-Whitney   0.1400
  6   15214±15380   30000±13887  Mann-Whitney   0.0679
  8   10757±12094   18750±15526  Mann-Whitney   0.2091
50μgNS3/无病毒唑   4   100±98 50ugNS3/10mg病毒唑   140±124  Mann-Whitney   0.4292
  6   15214±15380   10929±11928  Mann-Whitney   0.9473
  8   10757±12094   15214±15380  Mann-Whitney   0.6279
显著性水平：NS＝不显著；*＝p＜0.05；**＝p＜0.01；***p＜0.001
上述数据证明，病毒唑促进或增强对HCV抗原或HCV表位的免疫应答。用包含仅仅1mg病毒唑和10μg rNS3抗原的疫苗组合物免疫以后，激发了对rNS3的有效免疫应答。上述数据也提供了证据，表明足以促进25-30g小鼠对抗原免疫应答的病毒唑的量介于每次注射1-3mg。然而，应该明白该量仅仅意在指导，而不应理解为以任何方式限制本发明的范畴。尽管如此，数据表明包含大约1-3mg剂量病毒唑的疫苗组合物，诱导的免疫应答比没有病毒唑激发的免疫应答高出12倍多(表3和4)。因此，病毒唑对动物体液免疫应答具有显著的佐剂效应，从而增强或促进对抗原的免疫应答。以下实施例描述了为更好理解增强或促进对抗原免疫应答所需的病毒唑量进行的实验。
实施例2
为确定足以提供佐剂效应的病毒唑剂量，进行下列实验。第一组实验中，用单独20μg rNS3或20μg rNS3与0.1mg、1mg或10mg病毒唑的混合物免疫各组小鼠(每组3只)。然后通过EIA测定针对抗原的抗体水平。绘制第1和第3周的平均终点滴度曲线，如图2所示。发现病毒唑提供的佐剂效应依赖所提供病毒唑的剂量而具有不同的动力学。例如，发现低剂量(＜1mg)病毒唑甚至在第1周而不是第3周增强抗体水平，然而发现较高剂量(1-10mg)在第3周增强抗体水平。
也进行了第二组实验。在这些实验中，各组小鼠注射包含不同量病毒唑和rNS3的疫苗组合物，并监控这些动物中的IgG应答。疫苗组合物包含大约100μl磷酸盐缓冲盐水和20μg rNS3，以及含或不含0.1mg、1.0mg或10mg病毒唑(Sigma)。第6周小鼠取血，如前所述通过EIA确定rNS3特异性IgG水平。如表7所示，对25-30g小鼠在每次注射1-10mg剂量范围内，维持抗体水平的佐剂效应最显著。
                                          表7
  免疫原   与免疫原混合的病毒唑的量(mg)     小鼠ID          指定周rNS3IgG终点滴度
    第1周     第2周     第3周
  20μg rNS3   无     1     60     360     360
  20μg rNS3   无     2     360     360     2160
  20μg rNS3   无     3     360     2160     2160
    平均     260±173     960±1039     1560±1039
  20μg rNS3   0.1     4     2160     12960     2160
  20μg rNS3   0.1     5     60     60     60
  20μg rNS3   0.1     6     ＜60     2160     2160
    1110±1484     5060±6921     1460±1212
  20μg rNS3   1.0     7     ＜60     60     12960
  20μg rNS3   1.0     8     ＜60     2160     2160
  20μg rNS3   1.0     9     360     2160     2160
    平均     360     1460±1212     5760±6235
  20μg rNS3   10.0     10     360     12960     77760
  20μg rNS3   10.0     11     ＜60     2160     12960
  20μg rNS3   10.0     12     360     2160     2160
    平均     360     5760±6235     30960±40888
第三组实验中，研究首次和加强注射后病毒唑的佐剂效应。在这些实验中，小鼠两次腹膜内注射包含10μg rNS3以及含或不含病毒唑的疫苗组合物，如前所述监控对抗原的IgG亚类应答。相应的，在第0周和第4周用包含单独10μg重组NS3、含或不含0.1或1.0mg病毒唑(Sigma)的100μl磷酸盐缓冲液免疫小鼠。第6周小鼠取血，如前所述通过EIA确定NS3特异性IgG亚类。如表8所示，注射之前于免疫原中加入病毒唑，不改变NS3特异性免疫应答中IgG亚类应答。因此，Th1/Th2平衡的改变无法解释包含病毒唑和抗原的疫苗组合物的佐剂效应。似乎另一机理可能负责病毒唑的佐剂效应。
                                        表8
  免疫原   与免疫原混合的病毒唑的量(mg)     小鼠ID            指定的NS3 IgG亚类终点滴度
    IgG1    IgG2a   IgG2b     IgG3
  10μg rNS3   无     1     360    60   ＜60     60
  10μg rNS3   无     2     360    ＜60   ＜60     60
  10μg rNS3   无     3     2160    60   ＜60     360
    平均     960±1039    60   -     160±173
  10μg rNS3   0.1     4     360    ＜60   ＜60     60
  10μg rNS3   0.1     5     60    ＜60   ＜60     ＜60
  10μg rNS3   0.1     6     2160    60   60     360
    860±1136    60   60     210±212
  10μg rNS3   1.0     7     2160    ＜60   ＜60     60
  10μg rNS3   1.0     8     360    ＜60   ＜60     ＜60
  10μg rNS3   1.0     9     2160    ＜60   ＜60     60
    平均     1560±1039    -   -     60
本实施例的数据另外证明，病毒唑可以作为佐剂给药，并证实病毒唑的剂量可以调节佐剂效应的动力学。以下实施例描述了为评价病毒唑增强或促进对抗原免疫应答的能力进行的另一项试验。
实施例3
这项试验可用于任何病毒唑衍生物或病毒唑衍生物的组合，以确定特定疫苗制剂调节细胞免疫应答的程度。为了确定CD4+T细胞对包含病毒唑疫苗的应答，用100μg rNS3的PBS或者100μg rNS3和1mg病毒唑的PBSs.c.免疫各组小鼠。免疫10天后处死小鼠，采集其淋巴结并引流(drain)。然后进行体外记忆试验。(例如参见Hultgren等人，J Gen Virol.79：2381-91(1998)以及Hultgren等人，Clin.Diagn.Lab.Jmnmnol.4：630-632(1997))。由培养96h掺入的[3H]胸苷测定CD4+T细胞增殖量。
如图3所示，用混合1mg病毒唑的100μg rNS3免疫的小鼠，其T细胞增殖应答比用100μg rNS3的PBS免疫的小鼠大很多。这些数据提供了病毒唑增强或促进细胞免疫应答(例如，通过促进有效致敏T细胞)的进一步证据。下节讨论可用于此处所述实施方案的一些抗原和表位。
抗原和表位
实际上能用于在动物中产生免疫应答的任何抗原都可以与病毒唑组合，以制备此处所述组合物。也就是说，能够掺入该组合物(例如疫苗)的抗原包含细菌抗原或表位、真菌抗原或表位、植物抗原或表位、霉菌抗原或表位、病毒抗原或表位、癌细胞抗原或表位、毒素抗原或表位、化学抗原或表位以及自身抗原或表位。尽管这些分子中许多无需佐剂诱导显著的免疫应答，病毒唑能够连同或结合＂强＂或＂弱＂抗原或表位而给药，以增强或促进对所述抗原或表位的免疫应答。此外，利用病毒唑为佐剂可以允许使用更少量的抗原而保持免疫原性。
除肽抗原之外，基于核酸的抗原可用于此处所述疫苗组合物。已知多种基于核酸的疫苗，预期通过利用病毒唑重新配制，能够加强这些组合物以及免疫治疗方法。(例如参见U.S.Pat.No.5,589,466和6,235,888)。例如，通过一种方法，编码目的多肽抗原的基因克隆到引入受试者中能够表达该多肽的表达载体。利用与病毒唑的混合物或者连同病毒唑一起(例如，在表达构建体之后不久，于相同位点给予病毒唑)，将该表达构建体引入受试者。另选地，利用与病毒唑的混合物或者连同病毒唑一起，将编码目的多肽抗原的RNA提供给受试者。
抗原是DNA时(例如DNA疫苗组合物制剂)，可以使用合适启动子，包括猿猴病毒40(SV40)、小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)启动子、人类免疫缺陷性病毒(HIV)例如HIV长末端重复(LTR)启动子、莫洛尼(Moloney)病毒、ALV、巨细胞病毒(CMV)例如CMV立即早期启动子、Epstein Barr病毒(埃-巴二氏病毒，EB病毒)(EBV)、劳氏肉瘤病毒(RSV)以及人类基因例如人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌肉肌酸和人金属硫蛋白的启动子。某些实施方案，特别是生产人基因疫苗中利用的多腺苷酸化信号的实例，包括而不限于SV40多腺苷酸化信号和LTR多腺苷酸化信号。特别使用pCEP4质粒(Invitrogen，San Diego Calif.)中的SV40多腺苷酸化信号(称为SV40多腺苷酸化信号)。
除基因表达所需调节元件之外，基因构建体中还可能包括其它元件。这些另外的元件包括增强子。增强子可能选自包括而不限于：人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌肉肌酸以及病毒增强子，例如来自CMV、RSV和EBV。基因构建体能够具备哺乳动物复制起点，以使该构建体在染色体外维持并于细胞中产生多拷贝的构建体。Invitrogen(San Diego，CA)的质粒pCEP4和pREP4包含Epstein Barr病毒复制起点以及核抗原EBNA-1编码区，其不整合而产生高拷贝的附加型复制。一切形式的DNA，不论复制型或非复制型，只要不整合到基因组中，并且可以表达，都可以使用。以下实施例描述了包含基于核酸的抗原以及病毒唑的组合物的用途。
实施例4
以下描述了用包含基于核酸的抗原以及病毒唑的疫苗免疫动物。5-6周龄雌雄Balb/c小鼠通过腹膜内注射0.3ml 2.5％阿佛丁(Avertin)进行麻醉。在前大腿造成1.5cm切口，四头肌直接可见。一组小鼠注射大约20:g具有巨细胞病毒(CMV)启动子驱动的gp-120基因的表达构建体，另一组小鼠注射大约5:g编码gp-120的加帽的体外转录RNA(例如SP6、T7或T3(Ambion))。这两组是对照。第三组小鼠注射与1mg病毒唑混合的大约20:g具有gp-120基因和CMV启动子的表达载体，第四组小鼠注射与1mg病毒唑混合的大约5:g加帽的体外转录RNA。疫苗在0.1ml溶液中通过1cc注射器27口径针头注射一分钟，从肌肉远端插入点大约0.5cm处插入膝部大约0.2cm深。为将来定位，注射部位放置缝线，用不锈钢夹封闭皮肤。
注射前(第0天)直到注射后40天以上获取血样。各样品血清系列稀释，利用酵母中制备的重组gp-120蛋白质为抗原，以标准ELISA技术分析检测抗体。所有样品都将检测到gp-120特异性的IgG和IgM抗体，但根据血清中检测的抗体量和/或滴度测量包含病毒唑的第3和第4组将具有较高的对gp-120的免疫应答。
本发明优选实施方案包含病毒唑和病毒优选肝炎病毒抗原或表位。例如，组合物包含病毒唑和HAV抗原、HBV抗原、HCV抗原、或一种或多种这些病毒上这些抗原和表位的任何组合。肝炎抗原可以是肽或核酸。例如，可用于抗HAV感染接种的组合物包含病毒唑以及具有SEQ ID.NO.：12的长度为至少3-10个连续氨基酸、10-50个连续氨基酸、50-100个连续氨基酸、100-200个连续氨基酸、200-400个连续氨基酸、400-800个连续氨基酸、800-1200个连续氨基酸、1200-1600个连续氨基酸、1600-2000个连续氨基酸以及2000-2227个连续氨基酸的HAV肽。
此外，上述包含病毒唑和编码一种或多种HAV肽的核酸的组合物可以用于治疗或预防HAV感染。优选的基于核酸的抗原包括HAV序列的至少9个连续核苷酸的核苷酸序列(例如SEQ.ID.NO.：15)。也就是说，基于核酸的抗原可以包含SEQ.ID.NO.：15的至少9-25个连续核苷酸、25-50个连续核苷酸、50-100个连续核苷酸、100-200个连续核苷酸、200-500个连续核苷酸、500-1000个连续核苷酸、1000-2000个连续核苷酸、2000-4000个连续核苷酸、4000-8000个连续核苷酸以及8000-9416个连续核苷酸、或者对应于这些序列的RNA。
类似地，优选的HBV疫苗实施方案包含病毒唑以及HBsAg(SEQ.ID.NO.：10)或HBcAg和HBeAg(SEQ.ID.NO.：11)的至少3个连续氨基酸的HBV肽。也就是说，某些实施方案具有病毒唑以及具有SEQ.ID.NO.：10或SEQ.ID.NO.：11的长为至少3-10个连续氨基酸、10-15个连续氨基酸、50-100个连续氨基酸、100-150个连续氨基酸、150-200个连续氨基酸以及200-226个连续氨基酸的HBV肽。
此外，上述包含病毒唑和编码一种或多种HBV肽的核酸的组合物，可以用于治疗或预防HBV感染。优选的基于核酸的抗原包括HBV的至少9个连续核苷酸的核苷酸序列(例如SEQ.ID.NO.：14)。也就是说，基于核酸的抗原可以包含SEQ.ID.NO.：14的至少9-25个连续核苷酸、25-50个连续核苷酸、50-100个连续核苷酸、100-200个连续核苷酸、200-500个连续核苷酸、500-1000个连续核苷酸、1000-2000个连续核苷酸、2000-4000个连续核苷酸、4000-8000个连续核苷酸以及8000-9416个连续核苷酸、或者对应于这些序列的RNA。以下实施例描述了病毒唑连同商品化HBV疫苗制剂的用途。
实施例5
与包含HBsAg和明矾的两个剂量商品化疫苗(Engerix，SKB)混合，测定病毒唑的佐剂效应。大约0.2μg或2μg Engerix疫苗与PBS或1mg病毒唑的PBS混合，混合物腹膜内注射各组小鼠(每组3只)。第4周给与包含相同混合物的加强剂量，所有小鼠第6周取血。血清样品从1∶60稀释到1∶37500，如上所述EIA测定稀释物，只是以纯化的人HBsAg用作固相抗原。如表9所示，具有病毒唑的疫苗制剂增强对2μg现有疫苗的应答，即使该疫苗已经含有明矾。也就是说，通过将病毒唑加入亚适疫苗剂量(即单独不诱导可检测抗体的剂量)，抗体变得可以检测，提供证据证明加入病毒唑可以使在疫苗制剂中使用较低的抗原量，而不影响免疫应答。
                                                         表9
  周                                         EIA中HBsAg的终点抗体滴度
                     002μg Engerix                      0.2μg Engerix
        无病毒唑          1mg病毒唑           无病毒唑          1mg病毒唑
  #1   #2  #3  #1  #2   #3   #1    #2    #3     #1     #2   #3
  6   ＜60   ＜60  ＜60  ＜60  ＜60   ＜60   ＜60    ＜60    ＜60     300     60   ＜60
某些HCV疫苗组合物包含病毒唑和SEQ.ID.NO.：1的至少3个连续氨基酸的HCV肽、或者编码所述HCV肽的核酸。也就是说，疫苗组合物可以包含病毒唑以及具有SEQ ID.NO.：12的长度至少为3-10个连续氨基酸、10-50个连续氨基酸、50-100个连续氨基酸、100-200个连续氨基酸、200-400个连续氨基酸、400-800个连续氨基酸、800-1200个连续氨基酸、1200-1600个连续氨基酸、1600-2000个连续氨基酸、2000-2500个连续氨基酸以及2500-3011个连续氨基酸的一种或多种HCV肽、或者编码一种或多种所述片段的核酸。
优选的HCV组合物包含病毒唑以及HCV核心蛋白质(SEQ.ID.NO.：2)、HCV E1蛋白质(SEQ.ID.NO.：3)、HCV E2蛋白质(SEQ.ID.NO.：4)、HCV NS2(SEQ.ID.NO.：5)、HCV NS3(SEQ.ID.NO.：6)、HCV NS4A(SEQ.ID.NO.：7)、HCV NS4B(SEQ.ID.NO.：8)或者HCVNS5A/B(SEQ.ID.NO.：9)的至少3个连续氨基酸的肽、或者由这些结构域的组合组成的肽。也就是说，优选的HCV疫苗包含病毒唑以及具有(SEQ.ID.NO.：2-9)中任意一种或多种的长为至少3-10个连续氨基酸、10-50个连续氨基酸、50-100个连续氨基酸、100-200个连续氨基酸、200-400个连续氨基酸、400-800个连续氨基酸以及800-1040个连续氨基酸的肽。这些结构域对应于SEQ.ID.NO.：1的氨基酸残基1-182、183-379、380-729、730-1044、1045-1657、1658-1711、1712-1971或1972-3011。因此，优选实施方案也包括SEQ.ID.NO.：1的1-182、183-379、380-729、730-1044、1045-1657、1658-1711、1712-1971或1972-3011中的一种或多种、或其片段。
包含病毒唑以及编码一种或多种上述肽的疫苗组合物也是实施方案。优选的基于核酸的抗原包括HCV的至少9个连续核苷酸的核苷酸序列(SEQ.ID.NO.：13)。也就是说，基于核酸的抗原可以包含SEQ.ID.NO.：13中任何一个的至少9-25个连续核苷酸、25-50个连续核苷酸、50-100个连续核苷酸、100-200个连续核苷酸、200-500个连续核苷酸、500-1000个连续核苷酸、1000-2000个连续核苷酸、2000-4000个连续核苷酸、4000-8000个连续核苷酸以及8000-9416个连续核苷酸、或者对应于这些序列的RNA。下节讨论包含病毒唑和抗原的某些组合物。
包含病毒唑和抗原的组合物
包含病毒唑和病原体(例如病毒、细菌、霉菌、酵母和寄生虫)的抗原或表位的组合物(例如疫苗)可能包含其它成分，包括但不限于佐剂、粘合剂、赋形剂例如稳定剂(以促进长期储存)、乳化剂、增稠剂、盐、防腐剂、溶剂、分散剂、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂以及吸收延迟剂等。这些组合物适合于治疗动物，作为预防措施避免疾病或不适、或者作为治疗手段治疗已经受疾病或不适折磨的动物。
疫苗中可以存在其它许多成分。例如，病毒唑和抗原可以与常规赋形剂(例如不与病毒唑和/或抗原发生有害反应的、适于肠道外、肠内(例如经口)或局部施用的、药学可接受的有机或无机载体物质)混合使用。药学可接受的合适载体包括而不限于水、盐溶液、醇、阿拉伯胶、植物油、苯甲醇、聚乙二醇、明胶、碳水化合物例如乳糖、直链淀粉或淀粉、硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘性石蜡、芳香油、脂肪酸、甘油一酯和甘油二酯、季戊四醇脂肪酸酯、羟基甲基纤维素、聚乙烯基吡咯烷酮等。Remmington＇s Pharmaceutical Sciences，第15版，Easton：Mack Publishing Company，1405-1412和1461-1487页(1975)以及The National Formulary XIV，第14版，Washington，AmericanPharmaceutical Association(1975)描述了更多的合适载体。
此处所述基因构建体可能用试剂配制或连同试剂一起给药，相对于缺少该试剂时给予相同基因疫苗时细胞对基因构建体的摄取和表达，该试剂增加细胞摄取和/或表达该基因构建体。1993.1.26申请的美国系列No.08/008,342、1993.3.11申请的美国系列No.08/029,336、1993.9.21申请的美国系列No.08/125,012、1994.1.26申请的PCT专利申请序号PCT/US94/00899以及1994.4.1申请的美国系列No.08/221,579中描述了该试剂及其连同基因构建体的给药规程。该试剂的实例包括：CaPO4，DEAE葡聚糖，阴离子脂类；细胞外基质活化酶类；皂甙类；凝集素类；雌激素化合物和甾类激素；羟基化低级烷；二甲基亚砜(DMSO)；脲；以及苯甲酸酯酰基苯胺(anilides)、脒、氨基甲酸乙酯及其盐酸盐，例如局部麻醉剂家族。此外，该基因构建体封进脂类/聚阳离子复合物胶囊内部，或连同脂类/聚阳离子复合物一起给药。
疫苗可以被灭菌，并且如果需要，可以混合辅助剂，例如不与病毒唑或抗原发生有害反应的润滑剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、影响渗透压的盐、缓冲剂、着色剂、调味剂和/或芳香物质等。
可以根据患者个体和疾病的类型与阶段，以及本领域技术人员已知的其它因素，改变特定疫苗制剂给药的有效剂量和方法。利用细胞培养或实验动物的标准药学程序，例如ED50(50％群体的有效治疗剂量)，确定疫苗的疗效和毒性。细胞培养分析和动物研究获取的数据，可用于制订人用剂量范围。疫苗剂量最好处于包括ED50而无毒的循环浓度范围内。在此范围内，依赖病毒唑衍生物和抗原的类型、使用的剂型、患者的敏感性以及给药途径而改变剂量。
病毒唑已经上市几年了，已知很多剂型和给药途径。此处所述实施方案的范围内可以提供所有已知的剂型和给药途径。优选地，有效增强动物对抗原免疫应答的病毒唑量可以认为是足以在动物中达到大约0.25-12.5μg/ml、优选大约2.8μg/ml的抗原血清水平的量。某些实施方案中，根据给予疫苗的动物的体重确定病毒唑的量。因此，疫苗制剂中病毒唑的量可以为大约0.1-6.0mg/kg体重。也就是说，某些实施方案具有相当于大约0.1-1.0mg/kg、1.1-2.0mg/kg、2.1-3.0mg/kg、3.1-4.0mg/kg、4.1-5.0mg/kg、5.1和6.0mg/kg动物体重的病毒唑的量。疫苗更常规包含大约0.25mg-2000mg病毒唑的毒唑的量。也就是说，某些实施方案具有大约250μg、500μg、1mg、25mg、50mg、100mg、150mg、200mg、250mg、300mg、350mg、400mg、450mg、500mg、550mg、600mg、650mg、700mg、750mg、800mg、850mg、900mg、1g、1.1g、1.2g、1.3g、1.4g、1.5g、1.6g、1.7g、1.8g、1.9g和2g的病毒唑。
可以通过加入足以增强对抗原免疫应答的相当数量病毒唑而改变常规疫苗制剂。也就是说，通过制剂中简单加入病毒唑，或者通过连同病毒唑施用常规疫苗(例如在提供抗原之前或之后不久)，可以改变现有常规疫苗制剂。本领域技术人员应当理解，疫苗中抗原量可以依赖抗原类型及其免疫原性而变化。可以相应地改变疫苗中抗原数量。尽管如此，作为一般指导，疫苗可以具有大约0.25mg-5mg、5-10mg、10-100mg、100-500mg以及2000mg以上的抗原(例如肝炎病毒抗原)。
此处所述某些方法中，由医生个人考虑所治疗的患者选择精确的病毒唑和/或抗原量。另外，病毒唑的量可以与相同或相当量的抗原联合或分别加入，在特定疫苗接种程序期间可以根据特定患者或特定抗原的因素调整这些量，以便提供充足水平。因此，可以考虑的特定患者和特定抗原的因素包括而不限于，患者疾病状态的严重性、年龄和患者体重、饮食、给药时间和频率、药物组合、反应敏感性以及对治疗的耐受/反应。下节描述可用于此处所述实施方案的新的HCV基因的发现以及突变体HCV序列的制备。
新的NS3/44和突变体NS3/44序列
从感染HCV患者克隆了新的核酸以及对应于HCV NS3/4A结构域的蛋白质(SEQ.ID.NOs.：16和17)。检索Genebank，显示该克隆序列与HCV序列具有最大的同源性，但与最接近的HCV亲本只有93％同源性(登录号AJ 278830)。也制备了新NS3/4A肽的截短突变体以及缺少蛋白水解裂解位点的NS3/4A突变体。发现这些新肽和编码所述肽的核酸是有效的免疫原，其可以混合病毒唑，从而制备提供受者对HCV有效免疫应答的组合物。以下实施例描述了新NS3/4A结构域的克隆以及各种NS3/4A突变体的制备。
实施例6
利用聚合酶链式反应(PCR)从感染HCV患者(HCV基因型1a)的血清扩增NS3/4A序列。根据标准程序从血清提取总RNA、合成cDNA、进行PCR(Chen M等人，J.Med.Virol.43：223-226(1995))。利用反义引物＂NS4KR＂(5＇-CCG TCT AGA TCA GCA CTC TTC CAT TTCATC-3＇(SEQ.ID.NO.：18))起始cDNA合成。由此cDNA扩增2079bp的HCV DNA片段，对应于包含NS3和NS4A基因的1007-1711氨基酸。高保真度聚合酶(Expand High Fidelity PCR，Boehringer-Mannheim，Mannheim，Germany用于＂NS3KF＂引物(5＇-CCT GAA TTC ATG GCG CCT ATC ACG GCC TAT-3＇(SEQ.ID.NO.：19)和NS4KR引物。NS3KF引物包含EcoRI限制酶裂解位点和起始密码子，NS4KR引物包含XbaI限制酶裂解位点和终止密码子。
然后测序扩增的片段SEQ.ID.NO.：16。序列比较分析揭示，该基因片段确实扩增自基因型1a的病毒株。利用NCBI站点对Genbank数据库进行计算机BLAST检索，揭示最靠近的HCV同源物具有93％的核苷酸序列一致性。
然后用EcoRI和XbaI消化扩增的DNA片段，插入用相同酶消化的pcDNA3.1/His质粒(Invitrogen)。然后用EcoRI和Xba I消化质粒NS3/4A-pcDNA3.1，利用QiaQuick试剂盒(Qiagen，Hamburg，Germany)纯化插入片段，连接到EcoRI/Xba I消化的pVAX载体(Invitrogen)，得到NS3/4A-pVAX质粒。
通过缺失NS3/4A DNA的NS4A序列，获得rNS3截短突变体。相应地，利用分别包含EcoRI和Not I限制性位点的引物NS3KF和3＇NotI(5＇-CCA CGC GGC CGC GAC GAC CTA CAG-3＇(SEQ.ID.NO.：20))，PCR扩增NS3/4A-pVAX的NS3基因序列。NS3片段(1850bp)然后连接EcoRI和Not I消化的pVAX质粒，得到NS3-pVAX载体。质粒在BL21大肠杆菌(E.coli)细胞中扩增。质粒测序，利用限制性裂解检验，结果与依据原始序列所预期的一致。
为改变NS3和NS4A之间的蛋白水解裂解位点，利用QUICKCHANGETM诱变试剂盒(Stratagene)，按照厂家说明，诱变NS3/4A-pVAX质粒。为产生＂TPT＂突变，利用引物5＇-CTGGAGGTCGTCACGCCTACCTGGGTGCTCGTT-3＇(SEQ.ID.NO.：21)和5＇-ACCGAGCACCCAGGTAGGCGTGACGACCTCCAG-3＇(SEQ.TD.NO.：22)扩增质粒，得到NS3/4A-TPT-pVAX。为产生＂RGT＂突变，利用引物5＇-CTGGAGGTCGTCCGCGGTACCTGGGTGCTCGTT-3＇(SEQ.ID.NO.：23)和5＇-ACCGAGCACCCAGGTACC-GCGGACGACCTCCAG-3＇(SEQ.ID.NO.：24)扩增质粒，得到NS3/4A-RGT-pVAX。
测序所有诱变构建体以验证已经正确产生了突变。质粒在感受态BL21大肠杆菌中扩增。根据厂家说明(Qiagen GmbH，Hilden，FRG)，利用Qiagen DNA纯化柱纯化用来体内注射的质粒DNA。分光光度法(Dynaquant，Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)测定得到的质粒DNA的浓度，纯化的DNA以1mg/ml浓度溶于无菌磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)中。野生型和突变接头的氨基酸序列如表10所示。下节描述编码HCV肽的若干核酸。
                            表10
质粒                  推测的氨基酸序列
*NS3/4A-pVAX          TKYMTCMSADLEVV TSTWVLVGGVL(SEQ.ID.NO.：25)
NS3/4A-TGT-pVAX       TKYMTCMSADLEVV TGTWVLVGGVL(SEQ.ID.NO.：26)
NS3/4A-RGT-pVAX       TKYMTCMSADLEVV RGTWVLVGGVL(SEQ.ID.NO.：27)
NS3/4A-TPT-pVAX       TKYMTCMSADLEVV TPTWVLVGGVL(SEQ.ID.NO.：33)
NS3/4A-RPT-pVAX       TKYMTCMSADLEVV RPTWVLVGGVL(SEQ.ID.NO.：34)
NS3/4A-RPA-pVAX       TKYMTCMSADLEVV RPAWVLVGGVL(SEQ.ID.NO.：35)
NS3/4A-CST-pVAX       TKYMTCMSADLEVV CSTWVLVGGVL(SEQ.ID.NO.：36)
NS3/4A-CCST-pVAX      TKYMTCMSADLEVC CSTWVLVGGVL(SEQ.ID.NO.：37)
NS3/4A-SSST-pVAX      TKYMTCMSADLEVS SSTWVLVGGVL(SEQ.ID.NO.：38)
NS3/4A-SSSSCST-pVAX   TKYMTCMSADSSSS CSTWVLVGGVL(SEQ.ID.NO.：39)
NS3A/4A-VVVVTST-pVAX  TKYMTCMSADVVVV TSTWVLVGGVL(SEQ.ID.NO.：40)
NS5-pVAX              ASEDVVC CSMSYTWTG(SEQ.ID.NO.：41)
NS5A/B-pVAX           SSEDVVC CSMWVLVGGVL(SEQ.ID.NO.：42)
*NS3/4A片段的野生型序列是NS3/4A-pVAX。NS3/4A断裂点由下划线标出，其中P1位置对应第一个Thr(T)，P1＇位置对应NS3/4A-pVAX序列的下一个后续氨基酸。野生型NS3/4A序列中，NS3蛋白酶在P1和P1＇位置之间断裂。
编码HCV肽的核酸
核酸实施方案包括此处所述编码HCV肽的核苷酸(例如SEQ.ID.NO.：17、29、31、32和43-49)或其至少4、6、8、10、12、15或20个氨基酸长度的片段(例如SEQ.ID.NOs.：25-27以及33-42)。例如，某些实施方案包括编码这些HCV肽的基因组DNA、RNA以及cDNA。HCV核苷酸实施方案不仅包括序列表所示DNA序列(例如SEQ.ID.NO.：16)，而且包括编码序列表所示氨基酸顺序的核苷酸序列(例如SEQ.ID.NO.：17)，以及在严谨条件(例如，在0.5 M NaHPO4、7.0％十二烷基磺酸钠(SDS)、1mM EDTA、50℃下与结合滤膜的DNA杂交)以及0.2 X SSC/0.2％SDS、50℃洗涤条件下与序列表所示DNA序列杂交的任何核苷酸序列，以及在较低严谨性的条件下(例如在0.5MNaHPO4、7.0％十二烷基磺酸钠(SDS)、1mM EDTA、37℃杂交，于0.2XSSC/0.2％SDS、37℃洗涤)与编码序列表提供的氨基酸序列(SEQ.ID.NOs.：17)的DNA序列杂交的任何核苷酸序列。
核酸实施方案也包括上述序列的片段、修饰物、衍生物以及变体。例如，理想实施方案包括具有一个新的HCV序列的至少12个连续碱基的核酸或其互补序列，优选片段包括编码SEQ.ID.NO.：17的NS3/4A分子的核酸的至少12个连续碱基或其互补序列。
在这方面，本发明核酸实施方案可以具有12-约2079个连续核苷酸。例如，本发明的某些DNA片段包括具有SEQ.ID.NO.：16的至少12-15、15-20、20-30、30-50、50-100、100-200、200-500、500-1000、1000-1500、1500-2079个连续核苷酸的核酸或其互补序列。核酸实施方案还可以通过突变例如置换、添加或缺失而改变。例如，由于核苷酸编码序列的简并性，编码与SEQ.ID.NOs：17所述基本上相同的HCV氨基酸序列的其它DNA序列可用于某些实施方案。这些包括而不限于已经改变的编码全部或部分NS3/4A(SEQ.ID.NO.：16)的核酸序列，或者与该序列全部或部分互补的核酸，其通过置换为编码序列内部功能等价的氨基酸残基的不同密码子而产生沉默变化，或者置换编码序列内部功能不同的氨基酸残基的不同密码子而产生可检测的变化。
利用上述核酸序列，可以设计与这些分子互补的探针，并通过寡核苷酸合成制备。理想探针包含该HCV分离物特异的的核酸序列(SEQ.ID.NO.：16)。这些探针可用于从患者中筛选cDNA，以分离天然来源的HCV，其中有些可能本身即是新的HCV序列。例如，可以通过滤膜杂交或PCR筛选。对于滤膜杂交，标记探针优选包含该NS3/4A肽特异的(SEQ.ID.NO.：16)核酸序列至少15-30bp的碱基对。使用的杂交洗涤条件优选高严谨性的介质。可以在0.5M NaHPO4、7.0％十二烷基磺酸钠(SDS)、1mM EDTA中42℃过夜进行杂交，在0.2X SSC/0.2％SDS中42℃进行洗涤。有关该条件的指南，参见例如Sambrook等人，1989， Molecular Cloning，A Laboratory Manual，ColdSprings Harbor Press，N.Y.；以及Ausubel等人，1989， Current Protocols in Molecular Biology，Green Publishing Associates andWiley Interscience，N.Y.
还可以利用此处所述核酸从感染HCV的患者分离HCV核酸。(也参见实施例6)。相应地，从感染HCV的患者获得的RNA反转录，利用PCR或另一扩增技术扩增获得的cDNA。引物优选自NS3/4A序列(SEQ.ID.NO.：16)。
PCR技术的综述参见Molecular Cloning to Genetic Engineering，White，B.A.Ed.in  Methods in Molecular Riology 67：Humana PressTotowa(1997)以及题为＂PCR Methods and Applications＂(1991，ColdSpring Harbor Laboratory Press)的出版物。在本发明范畴内，为扩增mRNA，mRNA反转录为cDNA，随后PCR(RT-PCR)；或者使用如美国专利号5,322,770所述的单个酶进行两步操作。另一技术涉及利用反转录酶非对称性缺口连接酶链式反应(Reverse TranscriptaseAsymmetric Gap Ligase Chain Reaction，RT-AGLCR)，如MarshallR.L.等人所述(PCR Methods and Applications 4：80-84，1994)。
简言之，按照标准程序分离RNA。利用扩增片段的最5＇端寡核苷酸引物作为第一链合成的引物，对RNA进行反转录反应。然后利用标准末端转移酶反应，将得到的RNA/DNA杂合体用鸟嘌呤＂加尾＂。然后用RNAse H消化该杂合体，用poly-C引物引发第二链合成。从而易于分离扩增片段上游的cDNA序列。可以使用的克隆策略的综述，参见例如上述Sambrook等人，1989，同前。
在其中每个扩增程序中，待扩增序列两侧的引物均加入适当制备的核酸样品、以及dNTPs和耐热聚合酶，例如Taq聚合酶、Pfu聚合酶或Vent聚合酶。样品中核酸变性，引物与样品中互补核酸序列特异性杂交。杂交的引物然后延伸。此后，开始另一轮变性、杂交和延伸的循环。循重复多次，以产生包含引物位点之间核酸序列的扩增片段。若干专利，包括美国专利4,683,195、4,683,202和4,965,188进一步描述了PCR。
选择与NS3/4A分子特有的(SEQ.ID.NO.：16)核酸序列的一部分基本上互补的引物，从而使引物之间序列被扩增。引物优选至少16-20、20-25或25-30个核苷酸长度。稳定杂合体的形成有赖于DNA的解链温度(Tm)。Tm取决于引物长度、溶液的离子强度以及G+C含量。G:C对带有3个氢键，而A:T对只有2个，因而引物的G+C含量越高，解链温度越高。此处所述所述扩增引物的G+C含量优选介于10-75％，更优选介于35-60％，最优选介于40-55％。在一套特定分析条件下的适当的引物长度可以由本领域技术人员按经验确定。
引物间距与欲扩增片段的长度有关。在此处所述实施方案的范围内，携带编码HCV肽的核酸序列的扩增片段，其大小可以从至少大约25bp到全长HCV基因组范围内。典型为25-1000bp扩增片段，优选为50-1000bp片段，非常优选100-600bp片段。应当理解，扩增引物可以是允许特异性扩增NS3/4A区域的任何序列，并且可以例如包括如便于克隆的限制性位点的修改。
可以亚克隆和测序PCR产物以保证扩增序列显示HCV肽序列。然后该PCR片段可以通过多种方法用于分离全长cDNA克隆。例如，可以标记扩增片段，用于筛选cDNA文库，例如噬菌体cDNA文库。通过筛选基因组文库，标记片段可另外用于分离基因组克隆。此外，利用例如从感染患者分离的RNA合成的cDNA可以构建表达文库。照这样，利用标准抗体筛选技术连同针对HCV基因产物产生的抗体，可以分离HCV基因产物。(筛选技术参见例如Harlow，E.和Lane，eds.，1988， Antibodies：A Iaboratory Manual.Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor.)。
实施方案还包括(a)包含任何上述核酸序列和/或其互补序列(即反义序列)的DNA载体；(b)包含与指导该核酸表达的调节元件有效连接的任何上述核酸序列的DNA表达载体；以及(c)包含与宿主细胞中指导该编码序列表达的调节元件有效连接的任何上述核酸序列的基因工程宿主细胞。这些重组构建体在宿主细胞中能够自主复制。另外，重组构建体可以整合到宿主细胞染色体DNA中。这种重组多核苷酸一般包含依靠人工作半合成、或合成的HCV基因组或cDNA多核苷酸。因此，提供包含这些序列及其互补序列的非天然存在的重组核酸。
尽管可以使用天然存在的编码HCV肽的核酸或者具有HCV基因互补序列的核酸，它们可能常常通过例如缺失、置换或插入而改变，并可以带有人类不存在的序列。此处所用调节元件包括而不限于诱导型和非诱导型启动子、增强子、操纵子以及为本领域技术人员已知的驱动和调节表达的其它元件。这种调节元件包括而不限于巨细胞病毒hCMV立即早期基因、SV40腺病毒早期或晚期启动子、lac系统、trp系统、TAC系统、TRC系统、噬菌体A的主要操纵子和启动子区、fd外壳蛋白的控制区、3-磷酸甘油酸激酶启动子、酸性磷酸酶启动子以及酵母α-交配因子的启动子。
此外，可以改造重组HCV肽的编码核酸序列及其互补序列，以便改变其加工或表达。例如，但并非为了限制，此处所述HCV核酸可以结合启动子序列和/或核糖体结合位点，或者在HCV肽编码序列上游插入信号序列，而使肽分泌，因而便于收集或生物利用。另外，给定的HCV核酸可以在体外或体内突变，以产生和/或破坏翻译、起始和/或终止序列，或者在编码区引起变异，和/或形成新的限制性位点或破坏先前存在的位点，或便于体外进一步改造。(参见实施例6)。可以使用本领域已知的任何诱变技术，包括而不限于体外定点诱变。(Hutchinson等人，J.Biol. Chem.，253：6551(1978))。
此外，编码其它蛋白质或其它蛋白质的结构域的核酸可以连接至HCV肽的编码核酸以形成融合蛋白质。编码融合蛋白质的核苷酸可以包括而不限于与无关蛋白质或肽(例如，如下所述聚组氨酸、红细胞凝集素、酶、荧光蛋白质或发光蛋白质)融合的全长NS3/4A序列(SEQ.ID.NO.：16)、截短的NS3/4A序列或NS3/4A序列的肽片段。
令人吃惊的是，发现NS3-pVAX和NS3/4A-pVAX载体注入免疫活性的哺乳动物时，能够激发有效的免疫应答。以下实施例更详细地描述了这些实验。
实施例7
为确定NS3-pVAX和NS3/4A-pVAX载体是否激发体液免疫应答，利用Qiagen DNA纯化系统，根据厂家说明书纯化实施例6所述表达构建体，纯化的DNA载体用于免疫每组4-10只Balb/c小鼠。质粒直接注射进再生的胫骨前肌(TA)肌肉中，如前所述。(Davis等人，HumanGene Therapy 4(6)：733(1993))。简言之，小鼠用50ul/TA、0.01mM心脏毒素(Latoxan，Rosans，France)的0.9％无菌NaCl肌内注射。5天后，各个TA肌肉注射包含rNS3或DNA的50μl PBS。
小鼠近交系C57/13L6(H-2b)Balb/C(H-2d)和CBA(H-2k)得自Mllegard Denmark，Charles River Uppsala，Sweden 或 B&KSollentuna Sweden的育种场。所有小鼠均为雌性，在4-8周龄使用。为了监控体液应答，所有小鼠每4周接受一次50μl/TA的质粒DNA加强注射。此外，给予某些小鼠如此处所述纯化的重组NS3(rNS3)蛋白质。接受rNS3的小鼠仅仅免疫两次。所有小鼠每月取血两次。
酶免疫吸附分析(EIA)用于检测小鼠NS3抗体的存在。基本上如(Chen等人，Hepatology 28(1)：219(1998))所述进行这些分析。简言之，96孔微量滴定板(Nunc，Copenhagen，Denmark)4℃过夜被动吸附50mM碳酸钠缓冲液(pH9.6)中的1ug/ml rNS3。然后用包含PBS、2％山羊血清和1％牛血清白蛋白的稀释缓冲液37℃温育1小时封闭平板。然后，小鼠血清从1∶60开始的系列稀释物在平板上温育1小时。利用碱性磷酸酶缀合的山羊抗小鼠IgG(Sigma Cell Products，SaintLouis，MO)、随后加入pNPP底物(1片/5ml的1M二乙醇胺、0.5mMMgCl2缓冲液)，检测结合的小鼠血清抗体。加入1M NaOH终止反应，读取405nm吸光度。
4周后，用NS3/4A-pVAX免疫的5只小鼠中4只产生NS3抗体，而用NS3-pVAX免疫的5只小鼠中1只产生抗体(图4)。6周后，用NS3/4A-pVAX免疫的5只小鼠中4只产生高水平(＞104)NS3抗体(平均水平10800±4830)，1只滴度为2160。尽管用NS3-pVAX免疫的所有小鼠都产生NS3抗体，但均未产生高达NS3/4A-pVAX构建体所产生的水平(平均水平1800±805)。6周时，NS3/4A融合构建体激发的抗体水平显著高于NS3-pVAX诱导的抗体水平(平均秩7.6对比3.4，p＜0.05，Mann Whitney秩和检验，以及p＜0.01，Students t检验)。因此，用NS3-pVAX或NS3/4A-pVAX免疫导致抗NS3抗体产生，但NS3/4A融合基因是更有效的免疫原。以下实施例描述了为确定NS3/4A-TPT-pVAX构建体是否激发有效免疫应答而进行的实验。
实施例8
为测试NS3/4A增强的免疫原性是否可以只归因于NS4A的存在，或者NS3/4A融合蛋白质此外是否必须在NS3/4A接点处断裂，进行新的实验。一个实验中，在Balb/c小鼠中比较NS3-pVAX、NS3/4A-pVAX和NS3/4A-TPT-pVAX载体的免疫原性。如上所述在第0周免疫小鼠，所有小鼠2周后取血，确定1∶60血清稀释度时NS3抗体的存在(表11)。小鼠第4周再次取血。虽然NS3/4A-TPT-pVAX载体与NS3-pVAX载体相似(4/10对比0/10；NS，Fisher＇s精确检验)，但NS3/4A-pVAX载体一直是最有效的免疫原。因此，所有引入小鼠的HCV构建体都能激发针对NS3的免疫应答，但是NS4A序列以及位于NS3和NS4A序列之间的功能性蛋白水解断裂位点提供更有效的免疫应答。
                         表11
首次免疫后周数     一次100μgi.m免疫后各自免疫原的抗体响应数
    NS3-pVAX     NS3/4A-pVAX   NS3/4A-TPT-pVAX
2     0/10     17/20   4/10
4 0/10(＜60) 20/20(2415±3715)55％＞10310％＞104   10/10(390±639)50％＞10210％＞103
在感染的慢性期，HCV在肝细胞中复制，肝内传播。对抗慢性和持续性病毒感染的主要因素是细胞介导的免疫防御系统。CD4+和CD8+淋巴细胞在HCV感染的慢性期浸润肝脏，但不能清除病毒或预防肝损害。此外，持续性HCV感染与肝细胞癌(HCC)的发生有关。以下实施例描述了为确定NS3和NS3/4A构建体是否能够激发针对NS3的T细胞介导免疫应答而进行的实验。
实施例9
为研究上述构建体是否能够激发针对NS3的细胞介导应答，进行体内肿瘤生长测定。为此制备了用NS3/4A基因稳定转染的SP2/0肿瘤细胞系。利用BglII消化，将包含NS3/4A基因的pcDNA3.1质粒线性化。总共5μg线性化质粒DNA与60μg转染试剂(Superfect，Qiagen，Germany)混合，混合物加到35mm平皿中50％贴壁的SP2/0细胞层。转染的SP2/0细胞(NS3/4A-SP2/0)在800μg/ml遗传霉素(geneticin)存在下生长14天，分离单个克隆。利用PCR和RTPCR鉴定稳定表达NS3/4A的SP2/0克隆。克隆的细胞系在包含10％胎牛血清、L-谷氨酰胺和青霉素-链霉素的DMEM中培养。
然后在Balb/c小鼠中评价SP2/0和NS3/4A-SP2/0细胞系的体内生长动力学。小鼠右肋皮下注射2×106肿瘤细胞。每天透过皮肤确定肿瘤大小。两个细胞系的生长动力学类似。例如，任何时间点两个细胞系之间的肿瘤平均大小没有差别(参见表12)。以下实施例描述了为确定NS3/4A构建体免疫的小鼠是否已经产生针对NS3的T细胞应答而进行的实验。
                                表12
  小鼠ID  肿瘤细胞系                                      指定时间点最大体内肿瘤大小
    5     6     7     8     11     12     13     14     15
  1  SP2/0     1.6     2.5     4.5     6.0     10.0     10.5     11.0     12.0     12.0
  2  SP2/0     1.0     1.0     2.0     3.0     7.5     7.5     8.0     11.5     11.5
  3  SP2/0     2.0     5.0     7.5     8.0     11.0     11.5     12.0     12.0     13.0
  4  SP2/0     4.0     7.0     8.0     10.0     13.0     15.0     16.5     16.5     17.0
  5  SP2/0     1.0     1.0     3.0     4.0     5.0     6.0     6.0     6.0     7.0
    5     6     7     8     11     12     13     14     15
      组平均     1,92     3.3     5.0     6.2     9.3     10.1     10.7     11.6     12.1
  6  NS3/4A-SP2/0     1.0     2.0     3.0     3.5     4.0     5.5     6.0     7.0     8.0
  7  NS3/4A-SP2/0     2.0     2.5     3.0     5.0     7.0     9.0     9.5     9.5     11.0
  8  NS3/4A-SP2/0     1.0     2.0     3.5     3.5     9.5     11.0     12.0     14.0     14.0
  9  NS3/4A-SP2/0     1.0     1.0     2.0     6.0     11.5     13.0     14.5     16.0     18.0
  10  NS3/4A-SP2/0     3.5     6.0     7.0     10.5     15.0     15.0     15.0     15.5     20.0
      组平均     1,7     2.7     3.7     5.7     9.4     10.7     11.4     12.4     14.2
  组平均值之间Student’s t检验的p值     0,7736     0.6918     0.4027     0.7903     0.9670     0.7986     0.7927     0.7508     0.4623
实施例10
为检测NS3/4A免疫是否激发T细胞应答，分析免疫小鼠的免疫防御系统攻击表达NS3的肿瘤细胞的能力。先前已细致描述了检测Balb/c小鼠SP2/0骨髓瘤细胞肿瘤生长体内抑制的方法(Encke等人，J.Immunol.161：4917(1998))。此模型中肿瘤生长的抑制取决于细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的引发。简言之，各组10只小鼠用100μgNS3-pVAX或100μg NS3/4A-pVAX i.m.免疫5次，每次间隔一个月。末次免疫2周以后，每只小鼠的右肋注入2×106 SP2/0或NS3/4A-SP2/0细胞。2周以后处死小鼠，测量最大肿瘤大小。NS3-pVAX免疫小鼠的SP2/0和NS3/4A-SP2/0肿瘤平均大小之间没有差异(参见表13)。
                                     表13
小鼠ID  免疫原  剂量(μg)   肿瘤细胞系   肿瘤生长      最大肿瘤大小(mm)
1  NS3-pVAX  100   SP2/0   是      5
2  NS3-pVAX  100   SP2/0   是      15
3  NS3-pVAX  100   SP2/0   否      -
4  NS3-pVAX  100   SP2/0   是      6
5  NS3-pVAX  100   SP2/0   是      13
组总数   4/5      9.75±4.992
6  NS3-pVAX  100   NS3/4A-SP2/0   是      9
7  NS3-pVAX  100   NS3/4A-SP2/0   是      8
8  NS3-pVAX  100   NS3/4A-SP2/0   是      7
9  NS3-pVAX  100   NS3/4A-SP2/0   否      -
10  NS3-pVAX  100   NS3/4A-SP2/0   否      -
  3/5      8.00±1.00
注：统计分析(StatView)：最大肿瘤大小的Student＇s t检验。P值＜0.05认为显著。
最大直径的不配对t检验
成组变量：第1列
假设差异＝0
排扣除：NS3DNA-肿瘤-001213
                                                   平均差                  DF                   t值             P值
   1.750   5   0.58   0.584
NS3-sp2，NS3-spNS3
最大直径的成组信息
成组变量：第1列
排扣除：NS3DNA-肿瘤-001213
                   计数                   平均值                 方差                   标准差                标准误
  4     9.750     24.917     4.992     2.496
  3     8.000     1.000     1.000     0.57
NS3-sp2NS3-spNS3
下一组实验中，评价NS3/4A-pVAX免疫的Balb/c小鼠中SP2/0或NS3/4A-SP2/0肿瘤生长的抑制。NS3/4A-pVAX质粒免疫的小鼠，其NS3/4A-SP2/0肿瘤细胞与未转染的SP2/0细胞相比，生长显著受抑制(参见表14)。因此，NS3/4A-pVAX免疫激发CTL抑制体内NS3/4A表达细胞的生长。以下实施例描述了为分析各种包含NS3组合物激发针对NS3的细胞介导应答的效率而进行的实验。
                                        表14
小鼠ID  免疫原  剂量(μg)  肿瘤细胞系   肿瘤生长     最大肿瘤大小(mm)
11  NS3/4A-pVAX  100  SP2/0   否     -
12  NS3/4A-pVAX  100  SP2/0   是     24
13  NS3/4A-pVAX  100  Sp2/0   是     9
14  NS3/4A-pVAX  100  Sp2/0   是     11
15  NS3/4A-pVAX  100  SP2/0   是     25
  4/5     17.25±8.421
16  NS3/4A-pVAX  100  NS3/4A-SP2/0   否     -
17  NS3/4A-pVAX  100  NS3/4A-SP2/0   是     9
18  NS3/4A-pVAX  100  NS3/4A-SP2/0   是     7
19  NS3/4A-pVAX  100  NS3/4A-SP2/0   是     5
20  NS3/4A-pVAX  100  NS3/4A-SP2/0   是     4
  4/5     6.25±2.217
注意：统计分析(StatView)：最大肿瘤大小的Student＇s t检验。P值＜0.05认为显著。
最大直径的不配对t检验
成组变量：第1列
假设差异＝0
排扣除：NS3DNA-肿瘤-001213
                                                  平均差               DF                   t值                  P值
  11.000    6     2.526     0.044
NS3/4-sp2，NS3/4-spNS3
最大直径的成组信息
成组变量：第1列
排扣除：NS3DNA-肿瘤-001213
                       计数                 平均值                 方差                  标准差                标准误
  4     17.250     70.917     8.421     4.211
  4     6.250     4.917     2.217     1.109
NS3/4-sp2NS3/4-spNS3
实施例11
为分析给予包含NS3的不同组合物是否影响激发细胞介导的免疫反应，如上所述用PBS、rNS3、无关DNA或NS3/4A构建体免疫小鼠，测定肿瘤大小。只有NS3/4A构建体能够激发足以导致肿瘤大小统计上显著降低的T细胞应答(参见表15)。下列实施例描述了为确定肿瘤大小降低是否能够归因于产生NS3特异性T淋巴细胞而进行的实验。
                                        表15
小鼠ID   免疫原     剂量(ug)  肿瘤细胞系 抗-NS3     肿瘤生长 最大肿瘤大小(mm)
1   NS3-pVAX     10  NS3/4A-SP2/0 ＜60     + 12.0
2   NS3-pVAX     10  NS3/4A-SP2/0 ＜60     + 20.0
3   NS3-pVAX     10  NS3/4A-SP2/0 60     + 18.0
4   NS3-pVAX     10  NS3/4A-SP2/0 ＜60     + 13.0
5   NS3-pVAX     10  NS3/4A-SP2/0 ＜60     + 17.0
组平均 60     5/5 16.0±3.391
6   NS3-pVAX     100  NS3/4A-SP2/0 2160     + 10.0
7   NS3-pVAX     100  NS3/4A-SP2/0 ＜60     - -
8   NS3-pVAX     100  NS3/4A-SP2/0 ＜60     - -
9   NS3-pVAX     100  NS3/4A-SP2/0 360     - -
10   NS3-pVAX     100  NS3/4A-SP2/0 ＜60     + 12.5
组平均 1260     2/5 11.25±1.768
11   NS3/4A-pVAX     10  NS3/4A-SP2/0 ＜60     + 10.0
12   NS3/4A-pVAX     10  NS3/4A-SP2/0 ＜60     - -
13   NS3/4A-pVAX     10  NS3/4A-SP2/0 ＜60     - -
14   NS3/4A-pVAX     10  NS3/4A-SP2/0 ＜60     + 13.0
15   NS3/4A-pVAX     10  NS3/4A-SP2/0 ＜60     + 13.5
组平均 ＜60     3/5 12.167±1.893
16   NS3/4A-pVAX     100  NS3/4A-SP2/0 60     + 10.0
17   NS3/4A-pVAX     100  NS3/4A-SP2/0 360     - -
18   NS3/4A-pVAX     100  NS3/4A-SP2/0 2160     + 8.0
19   NS3/4A-pVAX     100  NS3/4A-SP2/0 2160     + 12.0
20   NS3/4A-pVAX     100  NS3/4A-SP2/0 2160     + 7.0
组平均 1380     4/5 9.25±2.217
36   p17-pcDNA3     100  NS3/4A-SP2/0 ＜60     + 20.0
37   p17-pcDNA3     100  NS3/4A-SP2/0 ＜60     + 7.0
38   p17-pcDNA3     100  NS3/4A-SP2/0 ＜60     + 11.0
39   p17-pcDNA3     100  NS3/4A-SP2/0 ＜60     + 15.0
40   p17-pcDNA3     100  NS3/4A-SP2/0 ＜60     + 18.0
组平均 ＜60     5/5 14.20±5.263
41   rNS3/CFA     20  NS3/4A-SP2/0 ＞466560     + 13.0
42   rNS3/CFA     20  NS3/4A-SP2/0 ＞466560     - -
43   rNS3/CFA     20  NS3/4A-SP2/0 ＞466560     + 3.5
44   rNS3/CFA     20  NS3/4A-SP2/0 ＞466560     + 22.0
45   rNS3/CFA     20  NS3/4A-SP2/0 ＞466560     + 17.0
组平均 466560     4/5 17333±4.509
46   PBS     -  NS3/4A-SP2/0 ＜60     + 10.0
47   PBS     -  NS3/4A-SP2/0 ＜60     + 16.5
48   PBS     -  NS3/4A-SP2/0 60     + 15.0
49   PBS     -  NS3/4A-SP2/0 ＜60     + 21.0
50   PBS     -  NS3/4A-SP2/0 ＜60     + 15.0
51   PBS     -  NS3/4A-SP2/0 ＜60     - -
组平均 60     5/6 15.50±3.937
注意：统计分析(StatView)：最大肿瘤大小的Student＇s t检验。P值＜0.05认为显著。
最大肿瘤的不配对t检验
成组变量：组
假设差异＝0
                                                 平均差                       DF         t-值                  p-值
    2.950     5     .739     .4933
    2.033     6     .628     .5532
    -1.800     8     -.643     .5383
    4.950     7     1.742     .1250
    -1.300     8     -.442     .6700
    -3.133     6     -.854     .4259
    -.917     3     -.542     .6254
    -4.750     5     -1.811     .1299
    2.000     4     1.092     .3360
    -4.250     5     -1.408     .2183
    -6.083     3     -1.744     .1795
    -3.833     6     -1.763     .1283
    2.917     5     1.824     .1277
    -3.333     6     -1.344     .2274
    -5.167     4     -1.830     .1412
    6.750     7     3.416     .0112
    .500     8     .215     .8350
    -1.333     6     -.480     .6480
    -6.250     7     -2.814     .0260
    -8.083     5     -3.179     .0246
    -1.833     6     -.607     5662
p17-sp3-4，NS3-100-sp3-4p17-sp3-4，NS3/4-10-sp3-4p17-sp3-4，NS3-10-sp3-4p17-sp3-4，NS3/4-100-sp3-4p17-sp3-4，PBS-sp3-4p17-sp3-4，rNS3-sp3-4NS3-100-sp3-4，NS3/4-10-sp3-4NS3-100-sp3-4，NS3-10-sp3-4NS3-100-sp3-4，NS3/4-100-sp3-4NS3-100-sp3-4，PBS-sp3-4NS3-100-sp3-4，rNS3-sp3-4NS3/4-10-sp3-4，NS3-10-sp3-4NS3/4-10-sp3-4，NS3/4-100-sp3-4NS3/4-10-sp3-4，PBS-sp3-4NS3/4-10-sp3-4，rNS3-sp3-4NS3-10-sp3-4，NS3/4-100-sp3-4NS3-10-sp3-4，PBS-sp3-4NS3-10-sp3-4，rNS3-sp3-4NS3/4-100-sp3-4，PBS-sp3-4NS3/4-100-sp3-4，rNS3-sp3-4PBS-sp3-4，rNS3-sp3-4
实施例12
使用体外T细胞介导的肿瘤细胞裂解分析确定NS3特异性T细胞是否由NS314A免疫激发。该分析先前已经详细描述于( Townsend等 人，J.Virol.71：3365(1997))。简言之，各组5只Balb/c小鼠用100μgNS3/4A-pVAX i.m免疫3次。末次注射2周以后，处死小鼠，收集脾细胞。用3×106脾细胞和3×106 NS3/4A-SP2/0细胞进行再刺激培养。5天后利用NS3/4A-SP2/0或SP2/0细胞为靶细胞进行标准的Cr51释放分析。以NS3/4A-SP2/0细胞裂解与SP2/0细胞裂解之间的比值计算特异性裂解百分比。利用效应细胞与靶细胞之比为20∶1，5只测试小鼠的4只中，只有用NS3/4A-pVAX免疫的小鼠显示特异性裂解超过10％(参见图5A和B)。相应的，NS3/4A免疫的小鼠显示癌细胞增殖减少和/或NS3/4A引起的癌细胞裂解。下节详细描述了包含的若干HCV多肽。
HCV肽
可以利用常规分子生物学技术操作上节所述编码HCV肽的核酸以便产生表达HCV肽的重组构建体。包含的HCV肽或其衍生物包括而不限于，包含基本上如序列表(SEQ.ID.NO.：17、29-32和43-49)所示全部氨基酸序列为主要氨基酸序列，及其至少4个氨基酸长度的片段(例如SEQ.ID.NO.：25-27以及33-42)，包括改变的序列，其中该序列内的残基置换为功能相同的氨基酸残基而导致沉默变化。序列SEQ.ID.NO.：17、29-32以及43-49的优选片段为至少4个氨基酸，并包含发现的NS3/4A肽(SEQ.ID.NO.：17)特异的氨基酸序列，包括改变的序列，其中该序列内的残基置换为功能相同的氨基酸残基而导致沉默变化。例如，HCV肽可以是至少12-15，15-20，20-25，25-50，50-100，100-150，150-250，250-500或500-704个氨基酸长度。其它片段(例如SEQ.ID.NO.：25-27和33-42)也是本发明的方面。
本发明的实施方案也包括与如上所述基本上相同的HCV肽。也就是具有SEQ.ID.NO.：17内一个或多个氨基酸残基的HCV肽及其片段，其被行使相同功能、极性相似的另一个氨基酸置换而导致沉默变化。序列内部的氨基酸置换可以选自该氨基酸所属类别的其它成员。例如，非极性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天门冬酰胺和谷氨酰胺。带正电(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。带负电(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。芳香族氨基酸包括苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。
可以利用本领域已知技术，例如Merrifield等人，J.Am.Chem.Soc.85：2149(1964)，Houghten等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82∶51：32(1985)，Stewart和Young(Solid phase peptide synthesis，Pierce Chem Co.，Rockford，IL(1984)，以及Creighton，1983，Proteins：Structures and Molecular Principles，W.H.Freeman & Co.，N.Y.所述技术，通过化学合成方法(例如固相肽合成)方法制备此处所述HCV肽。可以合成氨基端有或者没有甲硫氨酸的多肽。化学合成的HCV肽可以利用这些参考文献所述方法氧化，形成二硫键。
虽然此处所述HCV肽可以化学合成，可以利用DNA重组技术更有效地制备这些多肽。例如，该方法可用于构建包含上述HCV核苷酸序列以及合适的转录和翻译控制信号的表达载体。这些方法包括，例如体外重组DNA技术、合成技术以及体内基因重组。另外，利用例如合成仪，可以化学合成能够编码HCV核苷酸序列的RNA。例如参见Oligonucleotide Synthesis，1984，Gait，M.J.ed.，IRL Press，Oxford所述技术。因此，若干实施方案涉及为表达包含的HCV肽而改造的细胞系。例如，制备表达(SEQ.ID.NO.：17、29-32以及43-49)的HCV肽或这些分子的片段的一些细胞。
可以利用多种宿主表达载体系统表达包含的HCV肽。合适的表达系统包括而不限于用包含HCV核苷酸序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的微生物，例如细菌(例如大肠杆菌或枯草杆菌(B.subitlis))；用包含HCV核苷酸序列的重组酵母表达载体转化的酵母(例如酿酒酵母(Saccharomyces)、毕赤氏(Pichia)酵母)；用包含HCV序列的重组病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用包含HCV序列的重组病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒CaMV；烟草花叶病毒TMV)感染、或者用包含HCV序列的重组质粒表达载体(例如Ti质粒)转化的植物细胞系统；或者带有包含来源于哺乳动物细胞基因组(例如金属硫因启动子)或哺乳动物病毒(例如腺病毒晚期启动子；痘苗病毒7.5K启动子)的启动子的重组表达构建体哺乳动物细胞系统(例如COS、CHO、BHK、293、3T3)。
在细菌系统中，根据所表达的HCV基因产物的用途，可以方便地选择许多表达载体。例如，为制备HCV肽的药物组合物或者为产生HCV肽的抗体而大量生产该蛋白质时，需要指导高水平表达易于纯化的融合蛋白质产物的载体。这种载体包括而不限于大肠杆菌表达载体pUR278(Ruther等人，EMBO J.，2：1791(1983)，其中HCV编码序列与lacZ编码区可以分别符合读框地连接到该载体，以产生融合蛋白质)；pIN载体(Inouye & Inouye，Nucleic Acids Res.，13：3101-3109(1985)；Van Heeke & Schuster，J.Biol. Chem.，264：5503-5509(1989))；等等。也可以使用pGEX载体，将外源多肽表达为与谷胱甘肽S-转移酶(GST)的融合蛋白质。这种融合蛋白质一般可溶，并可通过吸附谷胱甘肽琼脂糖小珠，然后在游离谷胱甘肽存在下洗脱，能够从裂解的细胞中进行纯化。PGEX载体设计为包括凝血酶或Xa因子蛋白酶裂解位点，因此能够从GST部分释放克隆的靶基因产物。
在昆虫系统中，苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)核型多角体病毒(AcNPV)用作表达外源基因的载体。病毒在草地夜蛾(Spodopterafrugiprda)细胞中生长。HCV编码序列可以分别克隆到病毒的非必需区域(例如多角体蛋白基因)，并置于AcNPV启动子(例如多角体蛋白启动子)控制之下。HCV基因编码序列的成功插入将导致多角体蛋白基因失活，产生非封闭型重组病毒(即缺少多角体蛋白基因编码的蛋白质外壳)。这些重组病毒然后用于感染草地夜蛾细胞，在其中表达插入的基因。(例如参见Smith等人，J.Virol.46：584(1983)；以及Smith，U.S.Pat.No.4,215,051)。
在哺乳动物宿主细胞中，可以使用许多基于病毒的表达系统。如果腺病毒用作表达载体，目的HCV核苷酸序列可以连接至腺病毒转录/翻译控制复合物，例如晚期启动子和三联前导序列。该嵌合基因然后通过体外或体内重组插入腺病毒基因组。插入病毒基因组的非必需区(例如E1或E3区)将产生能够在受感染宿主中表达HCV基因产物的活的重组病毒。(例如参见Logan & Shenk，Proc.Natl.4cad.Sci.USA 81：3655-3659(1984))。有效翻译插入的HCV核苷酸序列还会需要特定起始信号。这些信号包括ATG起始密码子和邻近序列。
然而，如果只插入一部分HCV编码序列，可以提供外源翻译控制信号，或许包括ATG起始密码子。此外，起始密码子可以与目的编码序列的阅读框架相位相符，以确保翻译整个插入序列。这些外源翻译控制信号和起始密码子可以是天然和合成的多种来源。通过包含合适的转录增强子元件、转录终止子等可以增强表达效率。(参见Bittner等人，Methods in Enzyrnol.，153：516-544(1987))。
此外，可以选择调节插入序列表达、或按所要求的特定方式修饰和加工基因产物的宿主细胞株。蛋白质产物的这种修饰(例如糖基化)和加工(例如断裂)对于蛋白质的功能是重要的。不同的宿主细胞具有蛋白质和基因产物翻译后加工和修饰的特性和特有机制。可以选择合适的细胞系或宿主系统，以确保所表达的外源蛋白质正确的修饰和加工。为此目的，可以使用真核宿主细胞，其具有供原初转录产物适当加工、基因产物糖基化和磷酸化的细胞器。这种哺乳动物宿主细胞包括而不限于CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、3T3和W138。
为长期、高产率生产重组蛋白质，优选稳定表达。例如，可以改造稳定表达上述HCV肽的细胞系。与其利用包含病毒复制起点的表达载体，不如可以利用合适的表达控制元件(例如启动子、增强子序列、转录终止子、多腺苷酸化位点等)控制的DNA和选择标志转化宿主细胞。引入外源DNA之后，使改造的细胞在丰富培养基中生长1-2天；然后转到选择培养基。重组质粒的选择标志赋予选择抗性，使细胞稳定整合质粒到其染色体，生长形成斑点，其依次被克隆并扩增为细胞系。该方法方便地用于改造表达HCV基因产物的细胞系。
可以使用多种选择系统，包括而不限于单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等人，Cell 11：223(1977)、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Szybalska & Szybalski，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 48：2026(1962)，以及腺嘌呤磷酸核糖转移酶(Lowy等人，Cell 22：817(1980)基因可以分别用于tk-、hgprt-或aprt-细胞。此外，可以使用抗代谢物抗性作为基础选择下列基因：带来氨甲蝶呤抗性的dhfr(Wigler等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：3567(1980)；O＇Hare等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：1527(1981)；带来霉酚酸抗性的gpt(Mulligan & Berg，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：2072(1981)；带来氨基糖苷类G-418抗性的neo(ColberreGarapin等人，J.Mol.Biol.150：1(1981)；以及带来潮霉素抗性的hygro(Santerre等人，Gene 30：147(1984))。
另外，利用表达的融合蛋白质特异性的抗体能够容易纯化任何融合蛋白质。例如，Janknecht等人描述的系统能迅速纯化人细胞系中表达的非变性融合蛋白质。(Janknecht等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：8972-8976(1991))。在该系统中，目的基因亚克隆到牛痘重组质粒，使该基因的开放阅读框架翻译上融合由6个组氨酸残基组成的氨基端标记。重组牛痘病毒感染细胞的提取物上样Ni2+氮川乙酸琼脂糖柱，用包含咪唑的缓冲液选择性洗脱组氨酸标记的蛋白质。以下实施例描述了用于表达由包含的核酸编码的HCV肽的方法。
实施例13
为了表征NS3/4A融合蛋白质及其截短和突变的变体，体外转录并翻译实施例6所述载体构建体，通过十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)观察得到的多肽。利用T7偶联的网织红细胞裂解产物系统(Promega，Madison，WI)，按照厂家说明，进行体外转录和翻译。利用35S标记的甲硫氨酸(Amersham International，Plc，Buckinghamshire，UK)，在30℃进行表达构建体的全部体外翻译反应。利用12％SDS-PAGE凝胶分离标记的蛋白质，通过X光胶片(Hyper Film-MP，Amersham)曝光6-18小时进行观察。
体外分析揭示，各自表达构建体的所有蛋白质均高量表达。rNS3构建体(NS3-pVAX载体)产生大约61kDa的单肽，而TPT构建体(NS3/4A-TPT-pVAX)和RGT构建体(NS3/4A-RGT-pVAX)产生大约67kDa的单多肽，与NS3/4A-pVAX构建体产生的未断裂的NS3/4A肽的分子量相同。表达的NS3/4A肽产生的断裂产物大约61kDa，与NS3-pVAX载体产生的rNS3大小相同。这些结果表明，表达构建体是功能性的，NS3/4A构建体具有酶活性，rNS3产生预计大小的肽，TPT和RGT突变完全消除了NS3-NS4A接点处的断裂。
序列、构建体、载体、克隆以及包括包含的HCV核酸和肽的其它材料可以是浓缩(enriched)或分离形式。此处所用＂浓缩＂是指物质的浓度至少是其天然浓度的约2、5、10、100或1000倍(例如)，方便按重量为0.01％，优选按重量至少约0.1％。也包括按重量大约0.5％、1％、5％、10％和20％的浓缩制剂。术语＂分离＂要求该物质从其原始环境(例如，如果是天然存在，则为自然环境)移去。例如，活的动物中天然存在的多核苷酸不是分离的，但是与天然体系中某些或全部共存物质分离的相同的多核苷酸，就是分离的。序列处于纯化形式也是有利的。术语＂纯化＂不要求绝对纯净；更确切些，是指相对定义。分离的蛋白质通常纯化为例如经过考马斯染色电泳均一性。特别包括原材料或天然物质纯度至少为1个数量级，优选2或3个数量级，更优选4或5个数量级。
还可以在植物、昆虫和动物中表达此处所述HCV基因产物，产生转基因生物。具有HCV肽的理想的转基因植物系统包括拟南芥属(Arabadopsis)、玉蜀黍和衣藻属(Chlamydonionas)。具有HCV肽的理想的昆虫系统包括而不限于黑尾果蝇(D.mnelanogaster)和小卵翅蝗(C.elegans)。任何物种的动物，包括但不限于两栖类、爬行类、鸟类、小鼠、仓鼠、大鼠、兔、豚鼠、猪、小型猪、山羊、狗、猫以及非人灵长类，例如狒狒、猴子和黑猩猩，可用于产生具有包含的HCV分子的转基因动物。这些转基因生物期望地显示此处所述HCV肽的种系传递。
本领域已知的任何技术优选用于将HCV转基因引入动物，产生转基因动物的原始系，或者敲除或替换现有的HCV基因。这种技术包括而不限于原核的显微注射(Hoppe，P.C.和Wagner，T.E.，1989，U.S.Pat.No.4,873，191)；逆转录病毒介导基因转入生殖系(Van der Putten等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 82：6148-6152(1985)；胚胎干细胞在基因打靶(Thompson等人，Cell 56：313-321(1989)；胚胎的电穿孔(Lo，Mol Cell Buol.3：1803-1814(1983)；以及精子介导的基因转移(Lavitrano等人，Cell 57：717-723(1989)；也参见Gordon，TransgenicAnimals，Intl.Rev.Cytol 115：171-229(1989)。下节描述制备与此处所述HCV肽相互作用的抗体。
抗HCV抗体
合成或表达以及分离或纯化HCV肽以后，分离或纯化的肽可用于产生抗体。根据情况，术语＂抗体＂可以包括多克隆、单克隆、嵌合、单链、Fab片段以及由Fab表达文库产生的片段。识别HCV肽的抗体具有多种用途，包括但不限于生物技术应用、治疗/预防应用以及诊断应用。
为了产生抗体，可以通过注射HCV肽而免疫多种宿主，包括山羊、兔、大鼠、小鼠和人等。根据宿主物种，多种佐剂可用于增强免疫应答。这种佐剂包括而不限于病毒唑、弗氏佐剂、矿物胶例如氢氧化铝，以及表面活性物质，例如溶血卵磷脂、多聚醇、聚阴离子、肽、乳化油、匙孔血蓝蛋白和二硝基酚。BCG(卡介苗)和小棒状杆菌(corynebacterium parvum)也是非常有用的佐剂。
用于诱导特异性抗体的肽可以具有由至少4个氨基酸、优选至少10-15个氨基酸组成的氨基酸序列。一种方法，编码NS3/4A片段的短链氨基酸与另一蛋白质，例如匙孔血蓝蛋白的短链氨基酸融合，以便产生针对该嵌合分子的抗体。另外，给予动物包含病毒唑以及NS3/4A(SEQ.ID.NO.：17)、其至少4、6、8、10、12、15或20个氨基酸长度的片段、或编码一种或多种这些分子的核酸的组合物。虽然通过注射小鼠对应于HCV肽的合成的三聚体、十聚体和15聚体的肽可以产生能够特异性识别HCV的抗体，利用如上所述制备的重组HCV肽可以产生更多种类的抗体。
为了产生HCV肽的抗体，从转染或转化细胞中分离基本纯的肽。调整最终制剂中肽的浓度到几微克/ml的水平，例如通过Amicon过滤装置浓缩。因此能够如下制备目的肽的单克隆或多克隆抗体：
可以利用通过培养的传代细胞系提供抗体分子产生的任何技术制备HCV肽的单克隆抗体。这些技术包括而不限于：Koehler和Milstein最先描述的杂交瘤技术(Nature 256：495-497(1975)，人B细胞杂交瘤技术(Kosbor等人，Immunol Today 4：72(1983)；Cote等人，Proc NatlAcad Sci 80：2026-2030(1983)，以及EBV杂交瘤技术Cole等人，Monoclonal Antihodies and Cancer Therapy， Alan R.Liss Inc， NewYork N.Y.，pp 77-96(1985)。此外，可以使用为制备＂嵌合抗体＂而开发的技术，将小鼠抗体基因与人抗体基因拼接，获得具有适当的抗原特异性以及生物活性的分子。(Morrison等人，Proc Natl Acad Sci81：6851-6855(1984)；Neuberger等人，Nature 312：604-608(1984)；Takeda等人，Nature 314：452-454(1985)。另外，为制备单链抗体而描述的技术(美国专利号4,946,778)可以适于制备HCV特异性单链抗体。还可以通过诱导淋巴细胞群体的体内产生或者筛选重组免疫球蛋白文库或高特异性结合试剂组而制备抗体，如Orlandi等人，Proc NatlAcad Sci 86：3833-3837(1989)以及Winter G.和Milstein C；Nature349：293-299(1991)所公开。
还可以产生包含HCV肽特异性结合位点的抗体片段。例如，这种片段包括而不限于，可以由胃蛋白酶消化抗体分子产生的F(ab＇)2片段，以及可以由还原F(ab＇)2片段的二硫键产生的Fab片段。另外，可以构建Fab表达文库，以能够快速、容易地鉴别具有目的特异性的单克隆Fab片段。(Huse W.D.等人，Science 256：1275-1281(1989))。
利用一种方法，如下制备HCV肽的单克隆抗体。简言之，小鼠在几周之内反复输注几微克选择的蛋白质或由其得到的肽。然后处死小鼠，分离脾的产抗体细胞。脾细胞在聚乙二醇存在下与小鼠骨髓瘤细胞融合，通过该体系在包含氨基蝶呤的选择培养基(HAT培养基)中生长，破坏过剩的未融合细胞。稀释成功融合的细胞，稀释物等份放入微量滴定板的孔中，培养物继续生长。通过免疫测定方法，例如ELISA，检测孔中上清液的抗体，鉴定产生抗体克隆，如最初由Engvall，E.，Meth.Enzymol.70：419(1980)及其衍生方法所述。选择阳性克隆扩增，收集其单克隆抗体产物备用。Davis，L.等人Basic Methods inMolecular Biology Elsevier，New York.21章-2描述了制备单克隆抗体的详细步骤。
通过用如上所述表达的蛋白质或由其得到的肽(可以未修饰、或修饰以增强免疫原性)免疫合适的动物，可以制备含有单个蛋白质异源表位的抗体的多克隆抗血清。有效的多克隆抗体生产受与抗原和宿主物种有关的多种因素影响。例如，小分子往往比其它分子的免疫原性小，需要利用载体和佐剂。宿主动物也因接种位点和剂量而不同，抗原剂量不足或过量均导致低滴度抗血清。皮下多位点给予小剂量(ng水平)抗原，似乎最可靠。在Vaitukaitis，J.等人，J Clin.EndocrinolMetab.33：988-991(1971)中可以找到家兔的有效免疫规程。
每隔一定间隔给以加强注射，其抗体滴度开始下降时收集抗血清，抗体滴度由半定量测定，例如通过针对已知浓度抗原的琼脂双向免疫扩散方法。例如参见Ouchterlony，O.等人， Handbook of Experimental Immunology第十九章，D.Wier(ed)Blackwell(1973)。抗体的平台期浓度通常为0.1-0.2mg/ml血清(大约12μM)。制备竞争性结合曲线测定抗血清对抗原的亲合力，例如Fisher，D. Manual of Clinical Immunology，2d Ed，第42章.(Rose and Friedman，Eds.)Amer.Soc.For Microbiol.，Washington，D.C.(1980)所述。按照每种方法制备的抗体制剂用于确定生物样品中抗原结合物质的浓度的定量免疫测定法；也半定量或定性使用(例如，在鉴定生物样品中HCV存在的诊断性实施方案中)。下节详细描述一些诊断性实施方案。
诊断性实施方案
一般根据使用基于核酸还是蛋白质的分析，对包含的诊断进行分类。一些诊断分析检测从患者获得的样品中存在或不存在包含的HCV核酸序列，其它分析则设法鉴定从患者获得的样品中是否存在包含的HCV肽。另外，也包含生产包括此处所述试剂和方法、能快速检测和鉴定HCV的试剂盒。这些诊断试剂盒可以包括，例如包含的特异性检测HCV的核酸探针或抗体。一般与以下一种或多种试剂组合提供试剂盒的检测组分。通常提供能够吸收或结合DNA、RNA或蛋白质的支持物。可用的支持物包括硝酸纤维、尼龙或衍生的尼龙薄膜，其特征在于带有正电荷取代基阵列。这些试剂盒可以备有一种或多种限制酶、对照试剂、缓冲液、扩增酶以及类似小牛胸腺或鲑鱼精DNA的非人多核苷酸。
基于核酸的有用的诊断包括而不限于直接DNA测序、Southern印迹分析、点印迹分析、核酸扩增以及这些方法的组合。这些分析的起点在于，从怀疑感染HCV或者有感染HCV风险的患者获得的生物样品中分离或纯化核酸。从样品中提取核酸，然后通过利用对应于包含的HCV核酸序列(例如NS3/4A(SEQ.ID.NO.：16))侧翼区域的引物进行RT-PCR扩增和/或DNA扩增。
某些实施方案中，与HCV序列特异性杂交的核酸探针按有序阵列附于支持物，其中核酸探针附于支持物的不同区域，彼此不重叠。这种有序阵列优选设计为＂可以寻址的(addressable)＂，记录探针的不同位置，并可作为分析程序的一部分。这些探针在不同的已知位置与支持物连接。知道每个核酸探针的精确位置，使得这些＂可寻址＂阵列对结合分析特别有用。然后通过常规方法(例如放射性或者荧光)标记来源于若干生物样品制剂的核酸，标记的样品在允许杂交的条件下施加到该阵列。
如果样品中核酸与阵列上的探针杂交，在支持物上对应杂合体的位置将检测到信号。由于每种标记样品的身份已知，施加标记样品的支持物的区域已知，因此可以快速确定存在多态性变体。利用本领域技术人员已知的高通量诊断或检测分析技术，这些方法易于自动化。
另外，可以使用与以上介绍相反的方法。可以将生物样品中存在的核酸置于支持物上产生可寻址的阵列。样品优选置于支持物上不重叠的已知位置。通过施加标记的核酸探针，其在阵列上相应于放置生物样品的位置与编码HCV肽的核酸互补，以确定每个样品中HCV核酸的存在。由于已知生物样品的身份及其在阵列上的位置，因此可以快速确定已经感染HCV的患者。利用本领域技术人员已知的高通量诊断分析技术，这些方法也易于自动化。
可以使用本领域已知的任何可寻址阵列技术。一个特定的多核苷酸阵列实施方案称为GenechipsTM，已经一般描述于美国专利5,143,854；PCT公布WO 90/15070和92/10092。一般利用机械合成方法或者光控合成方法(其引入光刻方法以及固相寡核苷酸的组合)生产这些阵列。(Fodor等人，Science，251：767-777，(1991))。通过开发一种通称为＂超大规模固化聚合物合成＂(VLSPISTM)的技术(其中探针一般以高密度阵列固化于芯片的固相表面)在固相支持物上固化寡核苷酸阵列已经成为可能。美国专利5,143,854和5,412,087以及PCT公布WO 90/15070、WO 92/10092和WO 95/11995提供了VLSPISTM技术的实例，其描述了通过例如光控合成技术形成寡核苷酸阵列的方法。在设计旨在提供固化于固相支持物上的核苷酸阵列的策略中，发展了另外的展示策略，在芯片上排序并显示寡核苷酸阵列，试图最佳化杂交模式和诊断信息。这种展示策略的实例公开于PCT公布WO94/12305、WO 94/11530、WO 97/29212和WO 97/31256中。
本领域技术人员已知多种标记和连接技术可用于多种核酸分析。有若干方法制备供杂交或PCR的标记核酸，包括但不限于寡标记(oligolabeling)、切口平移、末端标记或利用标记的核苷酸进行PCR扩增。另外，可以将编码HCV肽的核酸克隆到载体中，以制备mRNA探针。这种载体为本领域已知，能够商业获得，通过添加适当的RNA聚合酶，例如T7、T3或SP6以及标记的核苷酸，可用于体外合成RNA探针。许多公司，例如Pharmacia Biotech(Piscataway N.J.)、Promega(Madison Wis.)和U.S.Biochemical Corp(Cleveland Ohio)供应这些方法的商品试剂盒和规程。合适的报告分子或标记包括放射性核素、酶、荧光、化学发光或生色剂，以及底物、辅因子、抑制剂、磁颗粒等。
利用常规分析和此处所述实施方案还可以检测在来自患者的蛋白质样品中存在的HCV肽。例如，与公开的HCV肽免疫反应的抗体可用于筛选生物样品存在的HCV感染。优选实施方案中，与包含的HCV肽反应的抗体用于从生物样品中免疫沉淀公开的HCV肽，或者用于Western或免疫印迹中与来自生物样品的蛋白质反应。优选的诊断性实施方案也包括酶联免疫吸附分析(ELISA)、放射免疫分析(RIA)、免疫放射分析(IRMA)以及免疫酶分析(IEMA)，其包括利用公开的HCV肽特异性的单克隆和/或多克隆抗体的夹心分析。David等人在美国专利号4,376,110和4,486,530中描述了典型的夹心分析。其它实施方案使用美国专利号5,290,678；5,604,105；5,710,008；5,744,358和5,747,274公开的免疫条带(immune-strip)技术。
另一个优选的基于蛋白质的诊断中，此处所述抗体以有序阵列附于支持物，其中多数抗体附于支持物的不同区域，彼此不重叠。如同基于核酸的阵列一样，基于蛋白质的阵列设计为＂可寻址＂的排序阵列，以便记录不同位置，并作为分析程序的一部分。这些探针在不同的已知位置与支持物连接。知道每个核酸探针的精确位置使得这些＂可寻址＂阵列对结合分析特别有用。例如，可寻址阵列可以包含具有若干区域与多数抗体探针相连的支持物，该探针特异性识别生物样品中存在的HCV肽，并区分此处鉴定的同型HCV。
通过一种方法，从生物样品获得蛋白质，然后利用常规方法(例如放射性、生色或荧光)标记。然后在允许结合的条件下，将标记的样品施加于阵列。如果样品中蛋白质结合阵列上的抗体探针，在支持物上对应抗体-蛋白质复合物的位置将检测到信号。由于每个标记样品的身份已知，施加标记样品的支持物的区域已知，可以快速确定存在、浓度和/或表达水平。也就是说，通过使用标记的已知浓度HCV肽的标准物，研究者可以精确测定测试样品中特定肽的蛋白质浓度，还可以评价HCV肽的表达水平。也可以使用常规光密度分析方法，更精确测定HCV肽的浓度或表达水平。利用本领域技术人员已知的高通量诊断分析技术，这些方法易于自动化。
另一个实施方案中，可以使用与以上介绍相反的方法。可以将生物样品中存在的蛋白质置于支持物上产生可寻址的阵列。蛋白质样品优选置于支持物上不重叠的已知位置。然后通过施加标记的、识别HCV肽特异性表位的抗体探针确定每个样品中存在的HCV肽。由于已知生物样品的身份及其在阵列上的位置，因此可以快速确定HCV肽的存在、浓度和/或表达水平。
也就是说，通过使用标记的已知浓度HCV肽的标准物，研究者可以精确测定样品中肽的浓度，并可以由此信息评价肽的表达水平。也可以使用常规光密度分析方法更精确测定HCV肽的浓度或表达水平。利用本领域技术人员已知的高通量诊断分析技术，这些方法也易于自动化。如上详述，可以使用本领域已知的任何可寻址阵列技术。下节描述能够具有一种或多种包含的HCV核酸或HCV肽的一些组合物。
含有包含的HCV核酸或肽的组合物
某些实施方案包含至少一种与支持物连接的HCV核酸或肽。优选地，制备这些支持物，以便产生多聚体介质。这些多聚体介质以获得足够的分子亲合力的形式或方式提供HCV肽或核酸。通过将目的分子与大分子支持物相连可以获得具有HCV核酸或肽的多聚体介质。＂支持物＂可以是用于连接或固化这种分子的载体、蛋白质、树脂、细胞膜或任何大分子结构。固相支持物包括而不限于反应板(reactiontray)的孔壁、试管聚苯乙烯小珠、磁性小珠、硝化纤维素条、薄膜、微粒例如胶乳粒子、动物细胞、Duracyte、人工细胞等。HCV核酸或肽还可以通过例如羟基、羧基或氨基与载体上反应基团的共价键连接无机载体，例如二氧化硅物质(例如硅胶、沸石、硅藻土或胺化玻璃)。
在若干多聚体介质中，大分子支持物具有通过疏水性非共价相互作用与HCV核酸或肽的一部分相互作用的疏水表面。有时支持物的疏水表面是诸如塑料的高聚物或任何其它高聚物，其中疏水基团已经联接诸如聚苯乙烯、聚乙烯或聚乙烯基。另外，HCV核酸或肽可以共价连接包含蛋白质和寡/多糖(例如纤维素、淀粉、糖原、甲壳素(chitosane)或胺化琼脂糖凝胶)的载体。在这些后面的多聚体介质中，分子上的反应基团，例如羟基或氨基，用于连接载体上的反应基团，以便形成共价键。另外的多聚体介质包括具有其它反应基团的支持物，该反应基团化学活化的，以便连接HCV核酸或肽。例如，使用溴化氰活化介质、环氧活化介质、硫化和硫丙基(thiopropyl)凝胶、硝基苯基氯甲酸酯和N-羟基琥珀酰亚胺氯甲酸酯连接物、或丙烯酸环氧乙烷支持物。(Sigma)。
供体内使用(即供预防或治疗应用)的载体期望生理性、无毒，优选无免疫反应性的。供体内使用的合适载体包括聚L-赖氨酸、聚D、L-丙氨酸、脂质体以及Chromosorb(Johns-Manville Products，DenverCo.)。结合Chromosorb的配基(Synsorb-Pk)已经在人中测试了其预防溶血性尿毒综合征，据报告不存在不良反应。(Armstrong等人，J.Infctious Diseases 171：1042-1045(1995))。某些实施方案给予＂裸＂载体(即缺少结合的HCV核酸或肽)，其在生物体内具有结合HCV核酸或肽的能力。通过这种方法，预见到＂前药类型＂的治疗，其中裸载体和HCV核酸或肽分开给予，一旦两者均处于生物体内，载体和HCV核酸或肽组合为多聚体复合物。
还包含插入的接头，例如在HCV核酸或肽与支持物之间适当长度的接头(例如，类似λ噬菌体柔性区而改造的＂λ接头＂)，以便促进HCV肽、杂合体或结合配偶体更大的柔韧性，从而克服可由支持物引起的任何空间位阻。通过在本说明书详述的分析中筛选具有不同接头的HCV核酸或肽，可以确定产生最佳细胞应答或缺乏其的适当长度的接头。
也预见了包含一种以上类型的HCV核酸或肽的复合体支持物。＂复合体支持物＂可以是用于结合或固化两种或多种不同的HCV核酸或肽的载体、树脂或任何大分子结构。同上，也包含在HCV核酸或肽与支持物之间具有适当长度的插入的接头，例如λ接头，以促进分子中更大的柔韧性，从而克服能够发生的任何空间位阻。通过在本说明书详述的分析中筛选具有不同接头的HCV核酸或肽，可以确定产生最佳细胞应答或缺乏其的适当长度的接头。
其它实施方案中，上述多聚体和复合体支持物可以结合多聚化的HCV核酸或肽，以分别形成＂多聚化-多聚体支持物＂以及＂多聚化-组合物支持物＂。例如，利用常规分子生物学方法，串联偶联两个或多个HCV核酸或肽，可以获得多聚化配基。多聚化形式的HCV核酸或肽由于例如能够获得较高亲合力的介质，而可以有利于许多应用。在组成多聚化介质的各个结构域之间引入接头或间隔物，例如柔性λ接头，也可以有利于某些实施方案。例如，在蛋白质结合结构域之间插入适当长度的λ接头，可以促进分子中更大的柔韧性并克服空间位阻。类似地，在多聚化HCV核酸或肽与支持物之间插入接头，可以促进更大的柔韧性，并限制由支持物引起的空间位阻。通过在本说明书详述的分析中筛选HCV核酸或肽可以确定接头的适当长度。
如上所述，本发明的实施方案也包括基因疫苗。这些组合物优选包含病毒唑以及编码NS3/4A(SEQ.ID.NO.：17)、NS3(SEQ.ID.NO.：29)或突变体(例如SEQ.ID.NO.：30-32和43-49)或其片段(例如SEQ.ID.NO.：25-27和33-42)的核酸。以下实施例描述了制备适合人用的基因疫苗。
实施例14
设计HCV表达质粒用来表达NS3/4A肽。通过用EcoRl和Xbal消化，去除NS3/4A-pVAX的NS3/4A编码序列，分离的片段插入质粒A中，因此其位于CMV启动子和RSV增强子元件的转录控制之下。(参见Pachuk等人，美国专利号6,235,888)。质粒A主链长度为3969bp；它包含供大肠杆菌中复制的PBR复制起点以及卡那霉素抗性基因。插入序列，例如NS3/4A，克隆到多接头区，其将插入序列置于启动子和多聚腺苷酸化信号之间，并与其有效连接。在CMV启动子和RSV增强子元件的控制之下，转录克隆的插入序列。由刚好位于克隆位点的3＇的SV40多聚腺苷酸信号其提供多聚腺苷酸化信号。然后将500μgrNS3/4A构建体与1mg病毒唑混合，制备包含NS3/4A的疫苗组合物。
所述疫苗组合物可用于在哺乳动物(例如小鼠或家兔)中产生抗体，或者可以肌内注射到人，产生抗体，优选慢性感染HCV病毒的人。受者优选接受该混合物3次加强免疫，间隔4周。通过第三次加强，HCV特异性抗体的滴度将显著提高。另外，通过EIA检测到NS3特异性抗体成分增加，RT-PCR检测到病毒负荷减少，证明所述受试者此时将经受增强的针对NS3的抗体和T细胞介导的免疫应答。
实施方案也包括NS3/4A融合蛋白质或者编码这些分子的核酸。例如，通过加入辅助氨基酸形成＂标签＂，可能有利于生产和纯化重组蛋白质。这种标签包括而不限于His-6、Flag、Myc和GST。标签可以加到C端、N端或NS3/4A氨基酸序列内部。另外的实施方案包括氨基或羧基端截短、或内部缺失、或者氨基或羧基末端、或内部加入另外的多肽序列的NS3/4A融合蛋白质。其它实施方案包括NS3/4A融合蛋白质、或其截短或突变的变体，其中NS3/4A蛋白水解断裂位点的残基已经被置换。这种置换包括而不限于，P1＇位点为Ser、Gly或Pro或者P1位点为Arg的序列，或者其P8-P4＇序列为Ser-Ala-Asp-Leu-Glu-Val-Val-Thr-Ser-Thr-Trp-Val(SEQ.ID.NO.：28)。
其它实施方案涉及包含NS3/4A融合蛋白质、或其截短或修饰的变体的免疫源，其能够激发针对NS3的增强的免疫应签。能够以基本纯的形式提供免疫原，这意味着已经基本使得免疫原没有其它蛋白质、脂类、碳水化合物或与其天然结合的其它化合物。实施方案也包括包含NS3/4A融合蛋白质(SEQ.ID.NO.：17)、或其截短或突变的变体(例如SEQ.ID.NO.：29-32和43-49)或其片段(例如SEQ.ID.NO.：25-27和33-42)以及佐剂(例如病毒唑)的疫苗组合物。以下实施例描述了制备包含NS3/4A融合蛋白质和佐剂的疫苗组合物的方法。
实施例15
为了产生带标签的NS3/4A构建体，通过EcoRI和XbaI消化去除NS3/4A-pVAX的NS3/4A编码序列，分离的片段插入Xpress载体(Invitrogen)。Xpress载体能制备重组融合蛋白质，其具有短的N端前导肽，对二价阳离子具有高亲合力。利用镍螯合树脂(Invitrogen)，能够一步纯化重组蛋白质，随后可以用肠激酶断裂除去前导序列。优选载体为pBlueBacHis2 Xpress。pBlueBacHis2 Xpress载体是杆状病毒表达载体，包含多克隆位点、氨苄青霉素抗性基因以及lac z基因。消化的扩增片段于是克隆到pBlueBacHis2 Xpress载体，感染SF9细胞。然后根据厂家说明书分离或纯化表达的蛋白质。然后将100μg rNS3/4A与1mg病毒唑混合，制备包含NS3/4A的疫苗组合物。
所述疫苗组合物可用于在哺乳动物(例如小鼠或家兔)中产生抗体，或者可以肌内注射到人，产生抗体，优选慢性感染HCV病毒的人。受者优选接受该混合物3次免疫加强，间隔4周。通过第三次加强，HCV特异性抗体的滴度将显著提高。另外，通过EIA检测到NS3特异性抗体成分增加，RT-PCR检测到病毒负荷减少，证明所述受试者此时将经受增强的针对NS3的抗体和T细胞介导的免疫应答。下节提供涉及此处所述组合物使用方法的更多说明。
包含病毒唑和抗原的组合物使用方法
此处所述疫苗的给药途径包括而不限于透过皮肤、肠胃外、肠胃、透过支气管(transbronchial)以及透过肺泡(transalveolar)。透过皮肤给药可以施用乳膏、冲洗剂、凝胶或者能够让病毒唑和抗原渗入皮肤的其它化合物。肠胃外给药途径包括而不限于，用电或直接注射，例如直接注入中央静脉、静脉内、肌肉内、腹膜内、真皮内或皮下注射。肠胃给药途径包括而不限于口服(ingestion)和直肠。透过支气管和透过肺泡给药途径包括而不限于通过口腔或鼻内吸入。
适于透过皮肤给药的具有病毒唑和抗原的组合物包括而不限于药学可接受的混悬液、油剂、乳膏剂和软膏，直接施用皮肤或者掺入保护性载体，例如透皮装置(＂透皮片＂)。例如，在Physician＇s DeskReference中可以找到合适乳膏剂、软膏等的实例。例如，Chinen等人1989年4月4日发布的美国专利号4,818,540描述了合适的透皮装置的实例。
适于肠胃外投药的具有病毒唑和抗原的组合物，包括而不限于药学可接受的无菌等渗溶液。这种溶液包括而不限于供注入中央静脉、静脉内、肌肉内、腹膜内、真皮内或皮下注射的盐、磷酸盐缓冲盐溶液以及油制剂。
适于透过支气管或透过肺泡给药的具有病毒唑和抗原的组合物包括但不限于供吸入的各种类型气雾剂。适于其透过支气管和透过肺泡给药的装置也是实施方案。这种装置包括而不限于喷雾器和汽化器。现用的多种形式喷雾器和汽化器可以轻易适合输送具有病毒唑和抗原的疫苗。
适于肠胃给药的具有病毒唑和抗原的组合物，包括但不限于药学可接受的口服粉剂、丸剂或液体，以及供直肠给药的栓剂。
此处所述基因构建体可能特别通过包括但不限于传统的注射器、无针注入装置或者＂微弹轰击基因枪(microprojectile bombardmentgene guns)＂的方法给药。另外，可能通过多种方法将基因疫苗引入离开个体的细胞中。这种方法包括，例如体外转染、电穿孔、显微注射以及微弹轰击。细胞摄取基因构建体以后，重新植入个体。可以预计，即使免疫接种的细胞最初取自另一个体，可以将其中带有基因构建体的另外的非免疫原性细胞植入个体。
根据某些实施方案，利用无针注入装置将基因构建体给予个体。根据某些实施方案，利用无针注入装置将基因构建体同时皮内、皮下和肌肉内给予个体。无针注入装置众所周知并广泛应用。本领域普通技术人员按照此处指导，可以使用无针注入装置输送遗传物质给个体的细胞。无针注入装置很适于输送遗传物质给所有组织。它们特别用于输送遗传物质给皮肤和肌肉细胞。某些实施方案中，无针注入装置可能用来向个体的皮肤表面推进包含DNA分子的液体。以足够速度推进液体，压紧皮肤，液体渗入皮肤表面，弥漫其下的皮肤和肌肉组织。遗传物质从而同时皮内、皮下和肌肉内给药。某些实施方案中，无针注入装置可能用来输送遗传物质到其它器官的组织，将核酸分子引入该器官的细胞。
包含病毒唑和抗原的疫苗可用于治疗和预防广谱的疾病，能够增强动物对抗原的免疫应答。本领域技术人员应当理解，需要治疗或预防细菌性疾病、病毒性疾病、真菌性疾病以及癌症的患者已经给予常规疫苗。由于此处所述疫苗包括已经通过加入病毒唑而改变的常规疫苗，此处所述方法包括利用包含抗原和病毒唑的疫苗治疗和预防疾病。
优选实施方案涉及治疗或预防肝炎感染的方法。这些实施方案中，提供有此需要的动物肝炎抗原(例如肽抗原或基于核酸的抗原)以及足以在所述动物中显示佐剂活性的相当量的病毒唑。相应地，利用现有的诊断测试或临床评价方法，可以鉴定有此需要的动物。这些实施方案可以使用的肝炎病毒抗原的范围多样。优选的肝炎病毒抗原包括HBV抗原、HAV抗原、HCV抗原、编码这些这抗原的核酸、或其任意组合。非常优选的实施方案包括选自乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、肝炎核心抗原(HBcAg)以及肝炎E抗原(HBeAg)的HBV抗原，特别是上述肽和基于核酸的抗原。病毒唑和抗原可以分别或联合提供，其它佐剂(例如油、明矾或者增强免疫应答的其它试剂)也可以提供给有此需要的动物。因此，优选实施方案包括通过鉴定受感染动物或者有感染风险的动物，并提供所述动物肝炎抗原(例如HBsAg、HBcAg和HBeAg)以及足以显示佐剂活性的相当量的病毒唑，而治疗或预防动物中肝炎的方法。
其它实施方案包括通过提供给有此需要的动物有效增强所述免疫应答的相当量的病毒唑而增强对抗原免疫应答的方法。这些实施方案中，利用现用的诊断测试或临床评价方法鉴定需要增强对抗原免疫应答的动物。这些个体将时常罹患疾病(例如细菌性、真菌性、霉菌性、病毒性或癌症)，或者有感染疾病的风险。但是，需要增强免疫应答的动物可以是已经中毒(例如受有毒昆虫或动物叮咬)，或者已经暴露于毒素或其它有毒化合物的动物。这些动物一旦鉴定，即提供给适当的抗原以及有效增强动物免疫应答的相当量的病毒唑。
同上，这些实施方案可以使用的肝炎病毒抗原，包括而不限于HBV抗原、HAV抗原、HCV抗原、编码这些这分子的核酸或其任意组合。非常优选的实施方案包括选自乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、肝炎核心抗原(HBcAg)以及肝炎E抗原(HBeAg)的HBV抗原，特别是上述肽和基于核酸的抗原。病毒唑和抗原可以分别或联合提供，其它佐剂(例如油、明矾或者增强免疫应答的其它试剂)也可以提供给所需动物。因此，优选实施方案包括通过鉴定有此需要的动物，并提供该动物肝炎抗原(例如HBsAg、HBcAg和HBeAg)以及有效增强动物免疫应答的相当量的病毒唑，而增强对肝炎抗原(例如HBV)免疫应答的方法。
一种方法，例如提供给未感染个体量足以激发对NS3的细胞和体液免疫应答的上述疫苗组合物，以便保护所述个体免受HCV感染。另一实施方案中，鉴定HCV感染的个体，并提供给包含病毒唑以及量足以增强对NS3的细胞和体液免疫应答的NS3，以便降低或消除HCV感染。这种个体可能处于感染的慢性或急性期。另一实施方案中，提供给罹患HCC的HCV感染个体组合物，其包含病毒唑和NS3/4A融合基因，其量足以激发针对表达NS3的肿瘤细胞的细胞和体液免疫应答。
虽然已经参考实施方案以及实施例描述了本发明，应当理解可以不背离本发明的精神而进行各种修饰。因此，本发明只受以下权利要求的限制。
                               序列表<110>TRIPEP AB
Matti SALLBERG
Catharina HULTGREN<120>包含病毒唑的疫苗及其使用方法<130>TRIPEP.023VPC<150>US 09/705,547<151>2000-11-03<150>US 60/229,175<151>2000-08-29<150>US 60/225,767<151>2000-08-17<160>49<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>3011<212>PRT<213>人工序列<220><223>丙型肝炎病毒序列<400>lMet Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn1               5                  10                  15Arg Arg Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly
        20                  25                  30Gly Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg Ala
    35                  40                  45Thr Arg Lys Thr Ser Glu Arg Ser Gln Pro Arg Gly Arg Arg Gln Pro
50                  55                   60Ile Pro Lys Ala Arg Arg Pro Glu Gly Arg Thr Trp Ala Gln Pro Gly65                  70                  75                  80Tyr Pro Trp Pro Leu Tyr Gly Asn Glu Gly Cys Gly Trp Ala Gly Trp
            85                  90                  95Leu Leu Ser Pro Arg Gly Ser Arg Pro Ser Trp Gly Pro Thr Asp Pro
        100                 105                 110Arg Arg Arg Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Ile Asp Thr Leu Thr Cys
    115                 120                 125Gly Phe Ala Asp Leu Met Gly Tyr Ile Pro Leu Val Gly Ala Pro Leu
130                 135                 140Gly Gly Ala Ala Arg Ala Leu Ala His Gly Val Arg Val Leu Glu Asp145                 150                 155                 160Gly Val Asn Tyr Ala Thr Gly Asn Leu Pro Gly Cys Ser Phe Ser Ile
            165                 170                 175Phe Leu Leu Ala Leu Leu Ser Cys Leu Thr Val Pro Ala Ser Ala Tyr
        180                 185                 190Gln Val Arg Asn Ser Ser Gly Leu Tyr His Val Thr Asn Asp Cys Pro
    195                 200                 205Asn Ser Ser Val Val Tyr Glu Ala Ala Asp Ala Ile Leu His Thr Pro
    210             215                 220Gly Cys Val Pro Cys Val Arg Glu Gly Asn Ala Ser Arg Cys Trp Val225                 230                 235                 240Ala Val Thr Pro Thr Val Ala Thr Arg Asp Gly Lys Leu Pro Thr Thr
            245                 250                 255Gln Leu Arg Arg His Ile Asp Leu Leu Val Gly Ser Ala Thr Leu Cys
        260                 265                 270Ser Ala Leu Tyr Val Gly Asp Leu Cys Gly Ser Val Phe Leu Val Gly
    275                 280                 285Gln Leu Phe Thr Phe Ser Pro Arg His His Trp Thr Thr Gln Asp Cys
290                 295                 300Asn Cys Ser Ile Tyr Pro Gly His Ile Thr Gly His Arg Met Ala Trp305                 310                 315                 320Asn Met Met Met Asn Trp Ser Pro Thr Ala Ala Leu Val Val Ala Gln
            325                 330                 335Leu Leu Arg Ile Pro Gln Ala Ile Met Asp Met Ile Ala Gly Ala His
        340                 345                 350Trp Gly Val Leu Ala Gly Ile Lys Tyr Phe Ser Met Val Gly Asn Trp
    355                 360                 365Ala Lys Val Leu Val Val Leu Leu Leu Phe Ala Gly Val Asp Ala Glu
370                 375                 380Thr His Val Thr Gly Gly Asn Ala Gly Arg Thr Thr Ala Gly Leu Val385                 390                 395                 400Gly Leu Leu Thr Pro Gly Ala Lys Gln Asn Ile Gln Leu Ile Asn Thr
            405                 410                 415Asn Gly Ser Trp His Ile Asn Ser Thr Ala Leu Asn Cys Asn Glu Ser
        420                 425                 430Leu Asn Thr Gly Trp Leu Ala Gly Leu Phe Tyr Gln His Lys Phe Asn
    435                 440                 445Ser Ser Gly Cys Pro Glu Arg Leu Ala Ser Cys Arg Arg Leu Thr Asp
450                 455                 460Phe Ala Gln Gly Trp Gly Pro Ile Ser Tyr Ala Asn Gly Ser Gly Leu465                 470                 475                 480Asp Glu Arg Pro Tyr Cys Trp His Tyr Pro Pro Arg Pro Cys Gly Ile
            485                 490                 495Val Pro Ala Lys Ser Val Cys Gly Pro Val Tyr Cys Phe Thr Pro Ser
        500                 505                 510Pro Val Val Val Gly Thr Thr Asp Arg Ser Gly Ala Pro Thr Tyr Ser
    515                 520                 525Trp Gly Ala Asn Asp Thr Asp Val Phe Val Leu Asn Asn Thr Arg Pro
530                 535                 540Pro Leu Gly Asn Trp Phe Gly Cys Thr Trp Met Asn Ser Thr Gly Phe545                 550                 555                 560Thr Lys Val Cys Gly Ala Pro Pro Cys Val Ile Gly Gly Val Gly Asn
            565                 570                 575Asn Thr Leu Leu Cys Pro Thr Asp Cys Phe Arg Lys Tyr Pro Glu Ala
        580                 585                 590Thr Tyr Ser Arg Cys Gly Ser Gly Pro Arg Ile Thr Pro Arg Cys Met
    595                 600                 605Val Asp Tyr Pro Tyr Arg Leu Trp His Tyr Pro Cys Thr Ile Asn Tyr
610                 615                 620Thr Ile Phe Lys Val Arg Met Tyr Val Gly Gly Val Glu His Arg Leu625                 630                 635                 640Glu Ala Ala Cys Asn Trp Thr Arg Gly Glu Arg Cys Asp Leu Glu Asp
            645                 650                 655Arg Asp Arg Ser Glu Leu Ser Pro Leu Leu Leu Ser Thr Thr Gln Trp
        660                 665                 670Gln Val Leu Pro Cys Ser Phe Thr Thr Leu Pro Ala Leu Ser Thr Gly
    675                 680                 685Leu Ile His Leu His Gln Asn Ile Val Asp Val Gln Tyr Leu Tyr Gly
690                 695                 700Val Gly Ser Ser Ile Ala Ser Trp Ala Ile Lys Trp Glu Tyr Val Val705                 710                 715                 720Leu Leu Phe Leu Leu Leu Ala Asp Ala Arg Val Cys Ser Cys Leu Trp
            725                 730                 735Met Met Leu Leu Ile Ser Gln Ala Glu Ala Ala Leu Glu Asn Leu Val
        740                 745                 750Ile Leu Asn Ala Ala Ser Leu Ala Gly Thr His Gly Leu Val Ser Phe
    755                 760                 765Leu Val Phe Phe Cys Phe Ala Trp Tyr Leu Lys Gly Arg Trp Val Pro
770                 775                 780Gly Ala Val Tyr Ala Leu Tyr Gly Met Trp Pro Leu Leu Leu Leu Leu785                 790                 795                 800Leu Ala Leu Pro Gln Arg Ala Tyr Ala Leu Asp Thr Glu Val Ala Ala
            805                 810                 815Ser Cys Gly Gly Val Val Leu Val Gly Leu Met Ala Leu Thr Leu Ser
        820                 825                 830Pro Tyr Tyr Lys Arg Tyr Ile Ser Trp Cys Met Trp Trp Leu Gln Tyr
    835                 840                 845Phe Leu Thr Arg Val Glu Ala Gln Leu His Val Trp Val Pro Pro Leu
850                 855                 860Asn Val Arg Gly Gly Arg Asp Ala Val Ile Leu Leu Thr Cys Val Val865                 870                 875                 880His Pro Ala Leu Val Phe Asp Ile Thr Lys Leu Leu Leu Ala Ile Phe
            885                 890                 895Gly Pro Leu Trp Ile Leu Gln Ala Ser Leu Leu Lys Val Pro Tyr Phe
        900                 905                 910Val Arg Val Gln Gly Leu Leu Arg Ile Cys Ala Leu Ala Arg Lys Ile
    915                 920                 925Ala Gly Gly His Tyr Val Gln Met Ala Ile Ile Lys Leu Gly Ala Leu
930                 935                 940Thr Gly Thr Cys Val Tyr Asn His Leu Ala Pro Leu Arg Asp Trp Ala945                 950                 955                 960His Asn Gly Leu Arg Asp Leu Ala Val Ala Val Glu Pro Val Val Phe
            965                 970                 975Ser Arg Met Glu Thr Lys Leu Ile Thr Trp Gly Ala Asp Thr Ala Ala
        980                 985                 990Cys Gly Asp Ile Ile Asn Gly Leu Pro Val Ser Ala Arg Arg Gly Gln
    995                 1000                1005Glu Ile Leu Leu Gly Pro Ala Asp Gly Met Val Ser Lys Gly Trp Arg
1010                1015                1020Leu Leu Ala Pro Ile Thr Ala Tyr Ala Gln Gln Thr Arg Gly Leu Leu1025                1030                1035                1040Gly Cys Ile Ile Thr Ser Leu Thr Gly Arg Asp Lys Asn Gln Val Glu
            1045                1050                1055Gly Glu Val Gln Ile Val Ser Thr Ala Thr Gln Thr Phe Leu Ala Thr
        1060                1065                1070Cys Ile Asn Gly Val Cys Trp Thr Val Tyr His Gly Ala Gly Thr Arg
    1075            1080                    1085Thr Ile Ala Ser Pro Lys Gly Pro Val Ile Gln Thr Tyr Thr Asn Val
1090                1095                1100Asp Gln Asp Leu Val Gly Trp Pro Ala Pro Gln Gly Ser Arg Ser Leu1105                1110                1115                1120Thr Pro Cys Thr Cys Gly Ser Ser Asp Leu Tyr Leu Val Thr Arg His
            1125                1130                1135Ala Asp Val Ile Pro Val Arg Arg Arg Gly Asp Ser Arg Gly Ser Leu
        1140                1145                1150Leu Ser Pro Arg Pro Ile Ser Tyr Leu Lys Gly Ser Ser Gly Gly Pro
    1155                1160            1165Leu Leu Cys Pro Thr Gly His Ala Val Gly Leu Phe Arg Ala Ala Val
1170                1175                1180Cys Thr Arg Gly Val Ala Lys Ala Val Asp Phe Ile Pro Val Glu Asn1185                1190                1195                1200Leu Glu Thr Thr Met Arg Ser Pro Val Phe Thr Asp Asn Ser Ser Pro
            1205                1210            1215Pro Ala Val Pro Gln Ser Phe Gln Val Ala His Leu His Ala Pro Thr
        1220                1225                1230Gly Ser Gly Lys Ser Thr Lys Val Pro Ala Ala Tyr Ala Ala Lys Gly
    1235                1240                1245Tyr Lys Val Leu Val Leu Asn Pro Ser Val Ala Ala Thr Leu Gly Phe
1250                1255                1260Gly Ala Tyr Met Ser Lys Ala His Gly Val Asp Pro Asn Ile Arg Thr1265                1270                1275                1280Gly Val Arg Thr Ile Thr Thr Gly Ser Pro Ile Thr Tyr Ser Thr Tyr
            1285                1290                1295Gly Lys Phe Leu Ala Asp Ala Gly Cys Ser Gly Gly Ala Tyr Asp Ile
        1300                1305                1310Ile Ile Cys Asp Glu Cys His Ser Thr Asp Ala Thr Ser Ile Ser Gly
    1315                1320                1325Ile Gly Thr Val Leu Asp Gln Ala Glu Thr Ala Gly Ala Arg Leu Val
1330                1335                1340Val Leu Ala Thr Ala Thr Pro Pro Gly Ser Val Thr Val Ser His Pro1345                1350                1355                1360Asn Ile Glu Glu Val Ala Leu Ser Thr Thr Gly Glu Ile Pro Phe Tyr
            1365                1370                1375Gly Lys Ala Ile Pro Leu Glu Val Ile Lys Gly Gly Arg His Leu Ile
        1380                1385                1390Phe Cys His Ser Lys Lys Lys Cys Asp Glu Leu Ala Ala Lys Leu Val
    1395                1400                1405Ala Leu Gly Ile Asn Ala Val Ala Tyr Tyr Arg Gly Leu Asp Val Ser
1410                1415                1420Val Ile Pro Thr Ser Gly Asp Val Val Val Val Ser Thr Asp Ala Leu1425                1430                1435                1440Met Thr Gly Phe Thr Gly Asp Phe Asp Ser Val Ile Asp Cys Asn Thr
            1445                1450                1455Cys Val Thr Gln Thr Val Asp Phe Ser Leu Asp Pro Thr Phe Thr Ile
        1460                1465                1470Glu Thr Thr Thr Leu Pro Gln Asp Ala Val Ser Arg Thr Gln Arg Arg
    1475                1480               1485Gly Arg Thr Gly Arg Gly Lys Pro Gly Ile Tyr Arg Phe Val Ala Pro
 1490               1495                1500Gly Glu Arg Pro Ser Gly Met Phe Asp Ser Ser Val Leu Cys Glu Cys1505                1510                1515               1520Tyr Asp Ala Gly Cys Ala Trp Tyr Glu Leu Thr Pro Ala Glu Thr Thr
            1525                1530                1535Val Arg Leu Arg Ala Tyr Met Asn Thr Pro Gly Leu Pro Val Cys Gln
        1540                1545                1550Asp His Leu Gly Phe Trp Glu Gly Val Phe Thr Gly Leu Thr His Ile
    1555                1560                1565Asp Ala His Phe Leu Ser Gln Thr Lys Gln Ser Gly Glu Asn Phe Pro
1570                1575                 1580Tyr Leu Val Ala Tyr Gln Ala Thr Val Cys Ala Arg Ala Gln Ala Pro1585                1590                1595                1600Pro Pro Ser Trp Asp Gln Met Arg Lys Cys Leu Ile Arg Leu Lys Pro
            605                 1610                1615Thr Leu His Gly Pro Thr Pro Leu Leu Tyr Arg Leu Gly Ala Val Gln
        1620                1625                1630Asn Glu Val Thr Leu Thr His Pro Ile Thr Lys Tyr Ile Met Thr Cys
    1635                1640                1645Met Ser Ala Asp LeuGlu Val Val Thr Ser Thr Trp Val Leu Val Gly
1650               1655                1660Gly Val Leu Ala Ala Leu Ala Ala Tyr Cys Leu Ser Thr Gly Cys Val1665                1670                1675                1680Val Ile Val Gly Arg Ile Val Leu Ser Gly Lys Pro Ala Ile Ile Pro
            1685                1690                1695Asp Arg Glu Val Leu Tyr Gln Glu Phe Asp Glu Met Glu Glu Cys Ser
        1700                1705                1710Gln His Leu Pro Tyr Ile Glu Gln Gly Met Met Leu Ala Glu Gln Phe
    1715                1720                1725Lys Gln Lys Ala Leu Gly Leu Leu Gln Thr Ala Ser Arg His Ala Glu
1730                1735                1740Val Ile Thr Pro Ala Val Gln Thr Asn Trp Gln Lys Leu Glu Val Phe1745                1750                1755                1760Trp Ala Lys His Met Trp Asn Phe Ile Ser Gly Ile Gln Tyr Leu Ala
            1765                1770                1775Gly Leu Ser Thr Leu Pro Gly Asn Pro Ala Ile Ala Ser Leu Met Ala
        1780                1785                1790Phe Thr Ala Ala Val Thr Ser Pro Leu Thr Thr Gly Gln Thr Leu Leu
    1795                1800                1805Phe Asn Ile Leu Gly Gly Trp Val Ala Ala Gln Leu Ala Ala Pro Gly
1810                1815                1820Ala Ala Thr Ala Phe Val Gly Ala Gly Leu Ala Gly Ala Ala Leu Asp1825                1830                1835                1840Ser Val Gly Leu Gly Lys Val Leu Val Asp Ile Leu Ala Gly Tyr Gly
            1845                1850                1855Ala Gly Val Ala Gly Ala Leu Val Ala Phe Lys Ile Met Ser Gly Glu
        1860                1865                1870Val Pro Ser Thr Glu Asp Leu Val Asn Leu Leu Pro Ala Ile Leu Ser
    1875                1880                1885Pro Gly Ala Leu Ala Val Gly Val Val Phe Ala Ser Ile Leu Arg Arg
1890                1895                1900Arg Val Gly Pro Gly Glu Gly Ala Val Gln Trp Met Asn Arg Leu Ile1905                1910                1915                1920Ala Phe Ala Ser Arg Gly Asn His Val Ser Pro Thr His Tyr Val Pro
            1925                1930                1935Glu Ser Asp Ala Ala Ala Arg Val Thr Ala Ile Leu Ser Ser Leu Thr
        1940                1945                1950Val Thr Gln Leu Leu Arg Arg Leu His Gln Trp Ile Ser Ser Glu Cys
    1955                1960                1965Thr Thr Pro Cys Ser Gly Ser Trp Leu Arg Asp Ile Trp Asp Trp Ile
1970                1975                1980Cys Glu Val Leu Ser Asp Phe Lys Thr Trp Leu Lys Ala Lys Leu Met1985                1990                1995                2000Pro Gln Leu Pro Gly Ile Pro Phe Val Ser Cys Gln Arg Gly Tyr Arg
            2005                2010                2015Gly Val Trp Arg Gly Asp Gly Ile Met His Thr Arg Cys His Cys Gly
        2020                 2025               2030Ala Glu Ile Thr Gly His Val Lys Asn Gly Thr Met Arg Ile Val Gly
    2035                2040                2045Pro Arg Thr Cys Lys Asn Met Trp Ser Gly Thr Phe Phe Ile Asn Ala
2050                2055                2060Tyr Thr Thr Gly Pro Cys Thr Pro Leu Pro Ala Pro Asn Tyr Lys Phe2065                2070                2075                2080Ala Leu Trp Arg Val Ser Ala Glu Glu Tyr Val Glu Ile Arg Arg Val
            2085                 2090               2095Gly Asp Phe His Tyr Val Ser Gly Met Thr Thr Asp Asn Leu Lys Cys
        2100                2105                2110Pro Cys Gln Ile Pro Ser Pro Glu Phe Phe Thr Glu Leu Asp Gly Val
    2115                2120                2125Arg Leu His Arg Phe Ala Pro Pro Cys Lys Pro Leu Leu Arg Glu Glu
2130                2135                2140Val Ser Phe Arg Val Gly Leu His Glu Tyr Pro Val Gly Ser Gln Leu2145                2150                2155                2160Pro Cys Glu Pro Glu Pro Asp Val Ala Val Leu Thr Ser Met Leu Thr
            2165                2170                2175Asp Pro Ser His Ile Thr Ala Glu Ala Ala Gly Arg Arg Leu Ala Arg
        2180                2185                2190Gly Ser Pro Pro Ser Met Ala Ser Ser Ser Ala Ser Gln Leu Ser Ala
    2195                2200                2205Pro Ser Leu Lys Ala Thr Cys Thr Ala Asn His Asp Ser Pro Asp Ala
2210                2215                2220Glu Leu Ile Glu Ala Asn Leu Leu Trp Arg Gln Glu Met Gly Gly Asn2225                2230                2235                2240Ile Thr Arg Val Glu Ser Glu Asn Lys Val Val Ile Leu Asp Ser Phe
            2245                2250                2255Asp Pro Leu Val Ala Glu Glu Asp Glu Arg Glu Val Ser Val Pro Ala
        2260                2265                2270Glu Ile Leu Arg Lys Ser Arg Arg Phe Ala Pro Ala Leu Pro Val Trp
    2275                2280                2285Ala Arg Pro Asp Tyr Asn Pro Leu Leu Val Glu Thr Trp Lys Lys Pro
2290                2295                2300Asp Tyr Glu Pro Pro Val Val His Gly Cys Pro Leu Pro Pro Pro Arg2305                2310                2315                2320ser Pro Pro Val Pro Pro Pro Arg Lys Lys Arg Thr Val Val Leu Thr
            2325                2330                    2335Glu Ser Thr Leu Pro Thr Ala Leu Ala Glu Leu Ala Thr Lys Ser Phe
        2340        2345                        2350Gly Ser Ser Ser Thr Ser Gly Ile Thr Gly Asp Asn Thr Thr Thr Ser
    2355                2360                2365Ser Glu Pro Ala Pro Ser Gly Cys Pro Pro Asp Ser Asp Val Glu Ser
2370                2375                2380Tyr Ser Ser Met Pro Pro Leu Glu Gly Glu Pro Gly Asp Pro Asp Leu2385                2390                2395                2400Ser Asp Gly Ser Trp Ser Thr Val Ser Ser Gly Ala Asp Thr Glu Asp
            2405                2410                2415Val Val Cys Cys Ser Met Ser Tyr Ser Trp Thr Gly Ala Leu Val Thr
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    2435                2440                2445Ser Leu Leu Arg His His Asn Leu Val Tyr Ser Thr Thr Ser Arg Ser
2450                2455                2460Ala Cys Gln Arg Lys Lys Lys Val Thr Phe Asp Arg Leu Gln Val Leu2465                2470                2475                2480Asp Ser His Tyr Gln Asp Val Leu Lys Glu Val Lys Ala Ala Ala Ser
            2485                2490                2495Lys Val Lys Ala Asn Leu Leu Ser Val Glu Glu Ala Cys Ser Leu Ala
        2500                2505                2510Pro Pro His Ser Ala Lys Ser Lys Phe Gly Tyr Gly Ala Lys Asp Val
    2515                2520                2525Arg Cys His Ala Arg Lys Ala Val Ala His Ile Asn Ser Val Trp Lys
2530                2535                2540Asp Leu Leu Glu Asp Ser Val Thr Pro Ile Asp Thr Thr Ile Met Ala2545                2550                2555                2560Lys Asn Glu Val Phe Cys Val Gln Pro Glu Lys Gly Gly Arg Lys Pro
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    2595                2600                2605Ser Ser Tyr Gly Phe Gln Tyr Ser Pro Gly Gln Arg Val Glu Phe Leu
2610                2615                2620Val Gln Ala Trp Lys Ser Lys Lys Thr Pro Met Gly Leu Ser Tyr Asp2625                2630                2635                2640Thr Arg Cys Phe Asp Ser Thr Val Thr Glu Ser Asp Ile Arg Thr Glu
            2645                2650                2655Glu Ala Ile Tyr Gln Cys Cys Asp Leu Asp Pro Gln Ala Arg Val Ala
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    2675                2680                2685Ser Arg Gly Glu Asn Cys Gly Tyr Arg Arg Cys Arg Ala Ser Arg Val
2690                2695                2700Leu Thr Thr Ser Cys Gly Asn Thr Leu Thr Arg Tyr Ile Lys Ala Arg2705                2710                2715                2720Ala Ala Cys Arg Ala Ala Gly Leu Gln Asp Cys Thr Met Leu Val Cys
            2725                2730                2735Gly Asp Asp Leu Val Val Ile Cys Glu Ser Ala Gly Val Gln Glu Asp
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2770                2775                2780Ser Cys Ser Ser Asn Val Ser Val Ala His Asp Gly Ala Gly Lys Arg2785                2790                2795                2800Val Tyr Tyr Leu Thr Arg Asp Pro Thr Thr Pro Leu Ala Arg Ala Ala
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        2820                2825                2830Ile Met Phe Ala Pro Thr Leu Trp Ala Arg Met Ile Leu Met Thr His
    2835                2840                2845Phe Phe Ser Val Leu Ile Ala Arg Asp Gln Leu Glu Gln Ala Leu Asn
2850                2855                2860Cys Glu Ile Tyr Gly Ala Cys Tyr Ser Ile Glu Pro Leu Asp Leu Pro2865                2870                2875                2880Pro Ile Ile Gln Arg Leu His Gly Leu Ser Ala Phe Ser Leu His Ser
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    2915                2920                2925Ala Arg Leu Leu Ala Arg Gly Gly Lys Ala Ala Ile Cys Gly Lys Tyr
2930                2935                2940Leu Phe Asn Trp Ala Val Arg Thr Lys Leu Lys Leu Thr Pro Ile Thr2945                2950                2955                2960Ala Ala Gly Arg Leu Asp Leu Ser Gly Trp Phe Thr Ala Gly Tyr Ser
            2965                2970                2975Gly Gly Asp Ile Tyr His Ser Val Ser His Ala Arg Pro Arg Trp Phe
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3010<210>2<211>182<212>PRT<213>人工序列<220><223>丙型肝炎病毒核心蛋白序列<400>2Met Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn1               5                  10                  15Arg Arg Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly
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130                 135                 140Gly Gly Ala Ala Arg Ala Leu Ala His Gly Val Arg Val Leu Glu Asp145                 150                 155                 160Gly Val Asn Tyr Ala Thr Gly Asn Leu Pro Gly Cys Ser Phe Ser Ile
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        180<210>3<211>197<212>PRT<213>人工序列<220><223>丙型肝炎病毒E1蛋白序列<400>3Ser Cys Leu Thr Val Pro Ala Ser Ala Tyr Gln Val Arg Asn Ser Ser1               5                  10                  15Gly Leu Tyr His Val Thr Asn Asp Cys Pro Asn Ser Ser Val Val Tyr
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    35                  40                  45Arg Glu Gly Asn Ala Ser Arg Cys Trp Val Ala Val Thr Pro Thr Val
50                  55                  60Ala Thr Arg Asp Gly Lys Leu Pro Thr Thr Gln Leu Arg Arg His Ile65                  70                  75                  80Asp Leu Leu Val Gly Ser Ala Thr Leu Cys Ser Ala Leu Tyr Val Gly
            85                  90                  95Asp Leu Cys Gly Ser Val Phe Leu Val Gly Gln Leu Phe Thr Phe Ser
        100                 105                 110Pro Arg His His Trp Thr Thr Gln Asp Cys Asn Cys Ser Ile Tyr Pro
    115                 120                 125Gly His Ile Thr Gly His Arg Met Ala Trp Asn Met Met Met Asn Trp
130                 135                 140Ser Pro Thr Ala Ala Leu Val Val Ala Gln Leu Leu Arg Ile Pro Gln145                 150                 155                 160Ala Ile Met Asp Met Ile Ala Gly Ala His Trp Gly Val Leu Ala Gly
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130                 135                 140Ala Pro Thr Tyr Ser Trp Gly Ala Asn Asp Thr Asp Val Phe Val Leu145                 150                 155                 160Asn Asn Thr Arg Pro Pro Leu Gly Asn Trp Phe Gly Cys Thr Trp Met
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        180                 185                 190Gly Gly Val Gly Asn Asn Thr Leu Leu Cys Pro Thr Asp Cys Phe Arg
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210                 215                 220Thr Pro Arg Cys Met Val Asp Tyr Pro Tyr Arg Leu Trp His Tyr Pro225                 230                 235                 240Cys Thr Ile Asn Tyr Thr Ile Phe Lys Val Arg Met Tyr Val Gly Gly
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    275                 280                 285Ser Thr Thr Gln Trp Gln Val Leu Pro Cys Ser Phe Thr Thr Leu Pro
290                 295                 300Ala Leu Ser Thr Gly Leu Ile His Leu His Gln Asn Ile Val Asp Val305                 310                 315                 320Gln Tyr Leu Tyr Gly Val Gly Ser Ser Ile Ala Ser Trp Ala Ile Lys
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50                  55                  60Trp Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Leu Pro Gln Arg Ala Tyr Ala65                  70                  75                  80Leu Asp Thr Glu Val Ala Ala Ser Cys Gly Gly Val Val Leu Val Gly
            85                  90                  95Leu Met Ala Leu Thr Leu Ser Pro Tyr Tyr Lys Arg Tyr Ile Ser Trp
        100                 105                 110Cys Met Trp Trp Leu Gln Tyr Phe Leu Thr Arg Val Glu Ala Gln Leu
    115                 120                 125His Val Trp Val Pro Pro Leu Asn Val Arg Gly Gly Arg Asp Ala Val
130                 135                 140Ile Leu Leu Thr Cys Val Val His Pro Ala Leu Val Phe Asp Ile Thr145                 150                 155                 160Lys Leu Leu Leu Ala Ile Phe Gly Pro Leu Trp Ile Leu Gln Ala Ser
            165                 170                 175Leu Leu Lys Val Pro Tyr Phe Val Arg Val Gln Gly Leu Leu Arg Ile
        180                 185                 190Cys Ala Leu Ala Arg Lys Ile Ala Gly Gly His Tyr Val Gln Met Ala
    195                 200                 205Ile Ile Lys Leu Gly Ala Leu Thr Gly Thr Cys Val Tyr Asn His Leu
210                 215                 220Ala Pro Leu Arg Asp Trp Ala His Asn Gly Leu Arg Asp Leu Ala Val225                 230                 235                 240Ala Val Glu Pro Val Val Phe Ser Arg Met Glu Thr Lys Leu Ile Thr
            245                 250                 255Trp Gly Ala Asp Thr Ala Ala Cys Gly Asp Ile Ile Asn Gly Leu Pro
        260                 265                 270Val Ser Ala Arg Arg Gly Gln Glu Ile Leu Leu Gly Pro Ala Asp Gly
    275                  280                285Met Val Ser Lys Gly Trp Arg Leu Leu Ala Pro Ile Thr Ala Tyr Ala
290                 295                 300Gln Gln Thr Arg Gly Leu Leu Gly Cys Ile Ile305                 310                 315<210>6<211>613<212>PRT<213>人工序列<220><223>丙型肝炎病毒NS3蛋白序列<400>6Thr Ser Leu Thr Gly Arg Asp Lys Asn Gln Val Glu Gly Glu Val Gln1              5                           10          15Ile Val Ser Thr Ala Thr Gln Thr Phe Leu Ala Thr Cys Ile Asn Gly
        20                  25                  30Val Cys Trp Thr Val Tyr His Gly Ala Gly Thr Arg Thr Ile Ala Ser
    35                  40                  45Pro Lys Gly Pro Val Ile Gln Thr Tyr Thr Asn Val Asp Gln Asp Leu
50                  55                  60Val Gly Trp Pro Ala Pro Gln Gly Ser Arg Ser Leu Thr Pro Cys Thr65                  70                  75                  80Cys Gly Ser Ser Asp Leu Tyr Leu Val Thr Arg His Ala Asp Val Ile
            85                  90                  95Pro Val Arg Arg Arg Gly Asp Ser Arg Gly Ser Leu Leu Ser Pro Arg
        100                 105                 110Pro Ile Ser Tyr Leu Lys Gly Ser Ser Gly Gly Pro Leu Leu Cys Pro
    115                 120                 125Thr Gly His Ala Val Gly Leu Phe Arg Ala Ala Val Cys Thr Arg Gly
130                 135                 140Val Ala Lys Ala Val Asp Phe Ile Pro Val Glu Asn Leu Glu Thr Thr145                 150                 155                 160Met Arg Ser Pro Val Phe Thr Asp Asn Ser Ser Pro Pro Ala Val Pro
            165                     170             175Gln Ser Phe Gln Val Ala His Leu His Ala Pro Thr Gly Ser Gly Lys
        180                 185                 190Ser Thr Lys Val Pro Ala Ala Tyr Ala Ala Lys Gly Tyr Lys Val Leu
    195                 200                 205Val Leu Asn Pro Ser Val Ala Ala Thr Leu Gly Phe Gly Ala Tyr Met
210                 215                 220Ser Lys Ala His Gly Val Asp Pro Asn Ile Arg Thr Gly Val Arg Thr225                 230                 235                 240Ile Thr Thr Gly Ser Pro Ile Thr Tyr Ser Thr Tyr Gly Lys Phe Leu
            245                 250                 255Ala Asp Ala Gly Cys Ser Gly Gly Ala Tyr Asp Ile Ile Ile Cys Asp
        260                 265                 270Glu Cys His Ser Thr Asp Ala Thr Ser Ile Ser Gly Ile Gly Thr Val
    275                 280                 285Leu Asp Gln Ala Glu Thr Ala Gly Ala Arg Leu Val Val Leu Ala Thr
290                 295                 300Ala Thr Pro Pro Gly Ser Val Thr Val Ser His Pro Asn Ile Glu Glu305                 310                 315                 320Val Ala Leu Ser Thr Thr Gly Glu Ile Pro Phe Tyr Gly Lys Ala Ile
            325                 330                 335Pro Leu Glu Val Ile Lys Gly Gly Arg His Leu Ile Phe Cys His Ser
        340                 345                 350Lys Lys Lys Cys Asp Glu Leu Ala Ala Lys Leu Val Ala Leu Gly Ile
    355                 360                 365Asn Ala Val Ala Tyr Tyr Arg Gly Leu Asp Val Ser Val Ile Pro Thr
370                 375                 380Ser Gly Asp Val Val Val Val Ser Thr Asp Ala Leu Met Thr Gly Phe385                 390                 395                 400Thr Gly Asp Phe Asp Ser Val Ile Asp Cys Asn Thr Cys Val Thr Gln
            405                 410                 415Thr Val Asp Phe Ser Leu Asp Pro Thr Phe Thr Ile Glu Thr Thr Thr
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450                 455                 460Ser Gly Met Phe Asp Ser Ser Val Leu Cys Glu Cys Tyr Asp Ala Gly465                 470                 475                 480Cys Ala Trp Tyr Glu Leu Thr Pro Ala Glu Thr Thr Val Arg Leu Arg
            485                 490                 495Ala Tyr Met Asn Thr Pro Gly Leu Pro Val Cys Gln Asp His Leu Gly
        500                 505                 510Phe Trp Glu Gly Val Phe Thr Gly Leu Thr His Ile Asp Ala His Phe
    515                 520                 525Leu Ser Gln Thr Lys Gln Ser Gly Glu Asn Phe Pro Tyr Leu Val Ala
530                 535                 540Tyr Gln Ala Thr Val Cys Ala Arg Ala Gln Ala Pro Pro Pro Ser Trp545                 550                 555                 560Asp Gln Met Arg Lys Cys Leu Ile Arg Leu Lys Pro Thr Leu His Gly
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610<210>7<211>54<212>PRT<213>人工序列<220><223>丙型肝炎病毒NS4A蛋白序列<400>7Ser Thr Trp Val Leu Val Gly Gly Val Leu Ala Ala Leu Ala Ala Tyr1               5                  10                  15Cys Leu Ser Thr Gly Cys Val Val Ile Val Gly Arg Ile Val Leu Ser
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50<210>8<211>260<212>PRT<213>人工序列<220><223>丙型肝炎病毒NS4B蛋白序列<400>8Ser Gln His Leu Pro Tyr Ile Glu Gln Gly Met Met Leu Ala Glu Gln1               5                  10                  15Phe Lys Gln Lys Ala Leu Gly Leu Leu Gln Thr Ala Ser Arg His Ala
        20                  25                  30Glu Val Ile Thr Pro Ala Val Gln Thr Asn Trp Gln Lys Leu Glu Val
    35                 40                  45Phe Trp Ala Lys HisMet Trp Asn Phe Ile Ser Gly Ile Gln Tyr Leu
50                 55                  60Ala Gly Leu Ser Thr Leu Pro Gly Asn Pro Ala Ile Ala Ser Leu Met65                  70                  75                  80Ala Phe Thr Ala Ala Val Thr Ser Pro Leu Thr Thr Gly Gln Thr Leu
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210                 215                 220Pro Glu Ser Asp Ala Ala Ala Arg Val Thr Ala Ile Leu Ser Ser Leu225                 230                 235                 240Thr Val Thr Gln Leu Leu Arg Arg Leu His Gln Trp Ile Ser Ser Glu
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    115                 120                 125His Tyr Val Ser Gly Met Thr Thr Asp Asn Leu Lys Cys Pro Cys Gln
130                 135                 140Ile Pro Ser Pro Glu Phe Phe Thr Glu Leu Asp Gly Val Arg Leu His145                 150                 155                 60Arg Phe Ala Pro Pro Cys Lys Pro Leu Leu Arg Glu Glu Val Ser Phe
            165                 170                 175Arg Val Gly Leu His Glu Tyr Pro Val Gly Ser Gln Leu Pro Cys Glu
        180                 185                 190Pro Glu Pro Asp Val Ala Val Leu Thr Ser Met Leu Thr Asp Pro Ser
    195                 200                 205His Ile Thr Ala Glu Ala Ala Gly Arg Arg Leu Ala Arg Gly Ser Pro
210                 215                 220Pro Ser Met Ala Ser Ser Ser Ala Ser Gln Leu Ser Ala Pro Ser Leu225                 230                 235                 240Lys Ala Thr Cys Thr Ala Asn His Asp Ser Pro Asp Ala Glu Leu Ile
            245                 250                 255Glu Ala Asn Leu Leu Trp Arg Gln Glu Met Gly Gly Asn Ile Thr Arg
        260                 265                 270Val Glu Ser Glu Asn Lys Val Val Ile Leu Asp Ser Phe Asp Pro Leu
    275                 280                 285Val Ala Glu Glu Asp Glu Arg Glu Val Ser Val Pro Ala Glu Ile Leu
290                 295                 300Arg Lys Ser Arg Arg Phe Ala Pro Ala Leu Pro Val Trp Ala Arg Pro305                 310                 315                 320Asp Tyr Asn Pro Leu Leu Val Glu Thr Trp Lys Lys Pro Asp Tyr Glu
            325                 330                 335Pro Pro Val Val His Gly Cys Pro Leu Pro Pro Pro Arg Ser Pro Pro
        340                 345                 350Val Pro Pro Pro Arg Lys Lys Arg Thr Val Val Leu Thr Glu Ser Thr
    355                 360                 365Leu Pro Thr Ala Leu Ala Glu Leu Ala Thr Lys Ser Phe Gly Ser Ser
370                 375                 380Ser Thr Ser Gly Ile Thr Gly Asp Asn Thr Thr Thr Ser Ser Glu Pro385                390                 395                 400Ala Pro Ser Gly Cys Pro Pro Asp Ser Asp Val Glu Ser Tyr Ser Ser
            405                 410                 415Met Pro Pro Leu Glu Gly Glu Pro Gly Asp Pro Asp Leu Ser Asp Gly
        420                 425                 430Ser Trp Ser Thr Val Ser Ser Gly Ala Asp Thr Glu Asp Val Val Cys
    435                 440                 445Cys Ser Met Ser Tyr Ser Trp Thr Gly Ala Leu Val Thr Pro Cys Ala
450                 455                 460Ala Glu Glu Gln Lys Leu Pro Ile Asn Ala Leu Ser Asn Ser Leu Leu465                 470                 475                 480Arg His His Asn Leu Val Tyr Ser Thr Thr Ser Arg Ser Ala Cys Gln
            485                 490                 495Arg Lys Lys Lys Val Thr Phe Asp Arg Leu Gln Val Leu Asp Ser His
        500                 505                 510Tyr Gln Asp Val Leu Lys Glu Val Lys Ala Ala Ala Ser Lys Val Lys
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530                 535                 540Ser Ala Lys Ser Lys Phe Gly Tyr Gly Ala Lys Asp Val Arg Cys His545                 550                 555                 560Ala Arg Lys Ala Val Ala His Ile Asn Ser Val Trp Lys Asp Leu Leu
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        580                 585                 590Val Phe Cys Val Gln Pro Glu Lys Gly Gly Arg Lys Pro Ala Arg Leu
    595                 600                 605Ile Val Phe Pro Asp Leu Gly Val Arg Val Cys Glu Lys Met Ala Leu
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930                935                 940Pro Leu Arg Ala Trp Arg His Arg Ala Trp Ser Val Arg Ala Arg Leu945                 950                 955                 960Leu Ala Arg Gly Gly Lys Ala Ala Ile Cys Gly Lys Tyr Leu Phe Asn
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        980                 985                 990Arg Leu Asp Leu Ser Gly Trp Phe Thr Ala Gly Tyr Ser Gly Gly Asp
    995                 1000                1005Ile Tyr His Ser Val Ser His Ala Arg Pro Arg Trp Phe Trp Phe Cys
1010                1015                1020Leu Leu Leu Leu Ala Ala Gly Val Gly Ile Tyr Leu Leu Pro Asn Arg1025                1030                1035                1040<210>10<211>226<212>PRT<213>人工序列<220><223>乙型肝炎病毒S抗原(HBsAg)序列<400>10Met Glu Asn Ile Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln1               5                  10                  15Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu
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50                  55                  60Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His65                  70                  75                  80His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Thr
            85                  90                  95Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Asp
        100                 105                 110Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln
    115                 120                 125Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val
130                 135                 140Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala145                 150                 155                 160Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr
            165                 170                 175Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro
        180                 185                 190Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg
    195                 200                 205Glu Ser Gln Cys
210<210>12<211>2227<212>PRT<213>人工序列<220><223>甲型肝炎病毒序列<400>12Met Asn Met Ser Lys Gln Gly Ile Phe Gln Thr Val Gly Ser Gly Leu1               5                   10                  15Asp His Ile Leu Ser Leu A la Asp Ile Glu Glu Glu Gln Met Ile Gln
        20                   25                  30Ser Val Asp Arg Thr Ala Val Thr Gly Ala Ser Tyr Phe Thr Ser Val
    35                  40                  45Asp Gln Ser Ser Val His Thr Ala Glu Val Gly Ser His Gln Ile Glu
50                  55                  60Pro Leu Lys Thr Ser Val Asp Lys Pro Gly Ser Lys Lys Thr Gln Gly65                  70                  75                  80Glu Lys Phe Phe Leu Ile His Ser Ala Asp Trp Leu Thr Thr His Ala
            85                  90                  95Leu Phe His Glu Val Ala Lys Leu Asp Val Val Lys Leu Leu Tyr Asn
        100                 105                 110Glu Gln Phe Ala Val Gln Gly Leu Leu Arg Tyr His Thr Tyr Ala Arg
    115                 120                 125Phe Gly Ile Glu Ile Gln Val Gln Ile Asn Pro Thr Pro Phe Gln Gln
130                 135                 140Gly Gly Leu Ile Cys Ala Met Val Pro Gly Asp Gln Ser Tyr Gly Ser145                 150                 155                 160Ile Ala Ser Leu Thr Val Tyr Pro His Gly Leu Leu Asn Cys Asn Ile
            165                 170                 175Asn Asn Val Val Arg Ile Lys Val Pro Phe Ile Tyr Thr Arg Gly Ala
        180                 185                 190Tyr His Phe Lys Asp Pro Gln Tyr Pro Val Trp Glu Leu Thr Ile Arg
    195                 200                 205Val Trp Ser Glu Leu Asn Ile Gly Thr Gly Thr Ser Ala Tyr Thr Ser
210                 215                 220Leu Asn Val Leu Ala Arg Phe Thr Asp Leu Glu Leu His Gly Leu Thr225                 230                 235                 240Pro Leu Ser Thr Gln Met Met Arg Asn Glu Phe Arg Val Ser Thr Thr
            245                 250                 255Glu Asn Val Val Asn Leu Ser Asn Tyr Glu Asp Ala Arg Ala Lys Met
        260                 265                 270Ser Phe Ala Leu Asp Gln Glu Asp Trp Lys Ser Asp Pro Ser Gln Gly
    275                 280                 285Gly Gly Ile Lys Ile Thr His Phe Thr Thr Trp Thr Ser Ile Pro Thr
290                 295                 300Leu Ala Ala Gln Phe Pro Phe Asn Ala Ser Asp Ser Val Gly Gln Gln305                 310                 315                 320Ile Lys Val Ile Pro Val Asp Pro Tyr Phe Phe Gln Met Thr Asn Thr
            325                 330                 335Asn Pro Asp Gln Lys Cys Ile Thr Ala Leu Ala Ser Ile Cys Gln Met
        340                 345                 350Phe Cys Phe Trp Arg Gly Asp Leu Val Phe Asp Phe Gln Val Phe Pro
    355                 360                 365Thr Lys Tyr His Ser Gly Arg Leu Leu Phe Cys Phe Val Pro Gly Asn
370                 375                 380Glu Leu Ile Asp Val Thr Gly Ile Thr Leu Lys Gln Ala Thr Thr Ala385                 390                 395                 400Pro Cys Ala Val Met Asp Ile Thr Gly Val Gln Ser Thr Leu Arg Phe
            405                 410                 415Arg Val Pro Trp Ile Ser Asp Thr Pro Tyr Arg Val Asn Arg Tyr Thr
        420                 425                 430Lys Ser Ala His Gln Lys Gly Glu Tyr Thr Ala Ile Gly Lys Leu Ile
    435                 440                 445Val Tyr Cys Tyr Asn Arg Leu Thr Ser Pro Ser Asn Val Ala Ser His
450                 455                 460Val Arg Val Asn Val Tyr Leu Ser Ala Ile Asn Leu Glu Cys Phe Ala465                 470                 475                 480Pro Leu Tyr His Ala Met Asp Val Thr Thr Gln Val Gly Asp Asp Ser
            485                 490                 495Gly Gly Phe Ser Thr Thr Val Ser Thr Glu Gln Asn Val Pro Asp Pro
        500                 505                 510Gln Val Gly Ile Thr Thr Met Arg Asp Leu Lys Gly Lys Ala Asn Arg
    515                 520                 525Gly Lys Met Asp Val Ser Gly Val Gln Ala Pro Arg Gly Ser Tyr Gln
530                 535                 540Gln Gln Leu Ash Asp Pro Val Leu Ala Lys Lys Val Pro Glu Thr Phe545                 550                 555                 560Pro Glu Leu Lys Pro Gly Glu Ser Arg His Thr Ser Asp His Met Ser
            565                 570                 575Ile Tyr Lys Phe Met Gly Arg Ser His Phe Leu Cys Thr Phe Thr Phe
        580                 585                 590Asn Ser Asn Asn Lys Glu Tyr Thr Phe Pro Ile Thr Leu Ser Ser Thr
    595                 600                 605Ser Asn Pro Pro His Gly Leu Pro Ser Thr Leu Arg Trp Phe Phe Asn
610                 615                 620Leu Phe Gln Leu Tyr Arg Gly Pro Leu Asp Leu Thr Ile Ile Ile Thr625                 630                 635                 640Gly Ala Thr Asp Val Asp Gly Met Ala Trp Phe Thr Pro Val Gly Leu
            645                 650                 655Ala Val Asp Pro Trp Val Glu Lys Glu Ser Ala Leu Ser Ile Asp Tyr
        660                 665                 670Lys Thr Ala Leu Gly Ala Val Arg Phe Asn Thr Arg Arg Thr Gly Asn
    675                 680                 685Ile Gln Ile Arg Leu Pro Trp Tyr Ser Tyr Leu Tyr Ala Val Ser Gly
690                 695                 700Ala Leu Asp Gly Leu Gly Asp Lys Thr Asp Ser Thr Phe Gly Leu Phe705                 710                 715                 720Leu Phe Glu Ile Ala Asn Tyr Asn His Ser Asp Glu Tyr Leu Ser Phe
            725                 730                 735Ser Cys Tyr Leu SerVal Thr Glu Gln Ser Glu Phe Tyr Phe Pro Arg
        740                745                 750Ala Pro Leu Asn Ser Asn Ala Met Leu Ser Thr Glu Ser Met Met Ser
    755                 760                 765Arg Ile Ala Ala Gly Asp Leu Glu Ser Ser Val Asp Asp Pro Arg Ser
770                 775                 780Glu Glu Asp Arg Arg Phe Glu Ser His Ile Glu Cys Arg Lys Pro Tyr785                 790                 795                 800Lys Glu Leu Arg Leu Glu Val Gly Lys Gln Arg Leu Lys Tyr Ala Gln
            805                 810                 815Glu Glu Leu Ser Asn Glu Val Leu Pro Pro Pro Arg Lys Met Lys Gly
        820                 825                 830Leu Phe Ser Gln Ala Lys Ile Ser Leu Phe Tyr Thr Glu Glu His Glu
    835                 840                 845Ile Met Lys Phe Ser Trp Arg Gly Val Thr Ala Asp Thr Arg Ala Leu
850                 855                 860Arg Arg Phe Gly Phe Ser Leu Ala Ala Gly Arg Ser Val Trp Thr Leu865                 870                 875                 880Glu Met Asp Ala Gly Val Leu Thr Gly Arg Leu Ile Arg Leu Asn Asp
            885                 890                 895Glu Lys Trp Thr Glu Met Lys Asp Asp Lys Ile Val Ser Leu Ile Glu
        900                 905                 910Lys Phe Thr Ser Asn Lys Tyr Trp Ser Lys Val Asn Phe Pro His Gly
    915                 920                 925Met Leu Asp Leu Glu Glu Ile Ala Ala Asn Ser Lys Asp Phe Pro Asn
930                 935                 940Met Ser Glu Thr Asp Leu Cys Phe Leu Leu His Trp Leu Asn Pro Lys945                 950                 955                 960Lys Ile Asn Leu Ala Asp Arg Met Leu Gly Leu Ser Gly Val Gln Glu
            965                 970                 975Ile Lys Glu Gln Gly Val Gly Leu Ile Ala Glu Cys Arg Thr Phe Leu
        980                 985                 990Asp Ser Ile Ala Gly Thr Leu Lys Ser Met Met Phe Gly Phe His His
    995                 1000                1005Ser Val Thr Val Glu Ile Ile Asn Thr Val Leu Cys Phe Val Lys Ser
1010                1015                1020Gly Ile Leu Leu Tyr Val Ile Gln Gln Leu Asn Gln Asp Glu His Ser1025                1030                1035                1040His Ile Ile Gly Leu Leu Arg Val Met Asn Tyr Ala Asp Ile Gly Cys
            1045                1050                1055Ser Val Ile Ser Cys Gly Lys Val Phe Ser Lys Met Leu Glu Thr Val
        1060                1065                1070Phe Asn Trp Gln Met Asp Ser Arg Met Met Glu Leu Arg Thr Gln Ser
    1075                1080                1085Phe Ser Asn Trp Leu Arg Asp Ile Cys Ser Gly Ile Thr Ile Phe Lys
1090                1095                1100Ser Phe Lys Asp Ala Ile Tyr Trp Leu Tyr Thr Lys Leu Lys Asp Phe1105                1110                1115                1120Tyr Glu Val Asn Tyr Gly Lys Lys Lys Asp Ile Leu Asn Ile Leu Lys
            1125                1130                1135Asp Asn Gln Gln Lys Ile Glu Lys Ala Ile Glu Glu Ala Asp Asn Phe
        1140                1145                1150Cys Ile Leu Gln Ile Gln Asp Val Glu Lys Phe Asp Gln Tyr Gln Lys
    1155                1160                1165Gly Val Asp Leu Ile Gln Lys Leu Arg Thr Val His Ser Met Ala Gln
1170                1175                1180Val Asp Pro Asn Leu Gly Val His Leu Ser Pro Leu Arg Asp Cys Ile1185                1190                1195                1200Ala Arg Val His Gln Lys Leu Lys Asn Leu Gly Ser Ile Asn Gln Ala
            1205                1210                1215Met Val Thr Arg Cys Glu Pro Val Val Cys Tyr Leu Tyr Gly Lys Arg
        1220                1225                1230Gly Gly Gly Lys Ser Leu Thr Ser Ile Ala Leu Ala Thr Lys Ile Cys
    1235                1240                1245Lys His Tyr Gly Val Glu Pro Glu Lys Asn Ile Tyr Thr Lys Pro Val
1250                1255                1260Ala Ser Asp Tyr Trp Asp Gly Tyr Ser Gly Gln Leu Val Cys Ile Ile1265                1270                1275                1280Asp Asp Ile Gly Gln Asn Thr Thr Asp Glu Asp Trp Ser Asp Phe Cys
            1285                1290                1295Gln Leu Val Ser Gly Cys Pro Met Arg Leu Asn Met Ala Ser Leu Glu
        1300                1305                1310Glu Lys Gly Arg His Phe Ser Ser Pro Phe Ile Ile Ala Thr Ser Asn
    1315                1320                1325Trp Ser Asn Pro Ser Pro Lys Thr Val Tyr Val Lys Glu Ala Ile Asp
1330                1335                1340Arg Arg Leu His Phe Lys Val Glu Val Lys Pro Ala Ser Phe Phe Lys1345                1350                1355                1360Asn Pro His Asn Asp Met Leu Asn Val Asn Leu Ala Lys Thr Asn Asp
            1365                1370                1375Ala Ile Lys Asp Met Ser Cys Val Asp Leu Ile Met Asp Gly His Asn
        1380                1385                1390Ile Ser Leu Met AspLeu Leu Ser Ser Leu Val Met Thr Val Glu Ile
    1395               1400                1405Arg Lys Gln Asn Met Ser Glu Phe Met Glu Leu Trp Ser Gln Gly Ile
1410                1415                1420Ser Asp Asp Asp Asn Asp Ser Ala Val Ala Glu Phe Phe Gln Ser Phe1425                1430                1435                1440Pro Ser Gly Glu Pro Ser Asn Trp Lys Leu Ser Ser Phe Phe Gln Ser
            1445                1450                1455Val Thr Asn His Lys Trp Val Ala Val Gly Ala Ala Val Gly Ile Leu
        1460                1465                1470Gly Val Leu Val Gly Gly Trp Phe Val Tyr Lys His Phe Ser Arg Lys
    1475                1480                1485Glu Glu Glu Pro Ile Pro Ala Glu Gly Val Tyr His Gly Val Thr Lys
1490                1495                1500Pro Lys Gln Val Ile Lys Leu Asp Ala Asp Pro Val Glu Ser Gln Ser1505                1510                1515                1520Thr Leu Glu Ile Ala Gly Leu Val Arg Lys Asn Leu Val Gln Phe Gly
            1525                1530                1535Val Gly Glu Lys Asn Gly Cys Val Arg Trp Val Met Asn Ala Leu Gly
        1540                1545                1550Val Lys Asp Asp Trp Leu Leu Val Pro Ser His Ala Tyr Lys Phe Glu
    1555                1560                1565Lys Asp Tyr Glu Met Met Glu Phe Tyr Phe Asn Arg Gly Gly Thr Tyr
1570                1575                1580Tyr Ser Ile Ser Ala Gly Asn Val Val Ile Gln Ser Leu Asp Val Gly1585                1590                1595                1600Phe Gln Asp Val Val Leu Met Lys Val Pro Thr Ile Pro Lys Phe Arg
            1605                1610                1615Asp Ile Thr Gln His Phe Ile Lys Lys Gly Asp Val Pro Arg Ala Leu
        1620                1625                1630Asn Arg Leu Ala Thr Leu Val Thr Thr Val Asn Gly Thr Pro Met Leu
    1635                1640                1645Ile Ser Glu Gly Pro Leu Lys Met Glu Glu Lys Ala Thr Tyr Val His
1650                1655                1660Lys Lys Asn Asp Gly Thr Thr Val Asp Leu Thr Val Asp Gln Ala Trp1665                1670                1675                1680Arg Gly Lys Gly Glu Gly Leu Pro Gly Met Cys Gly Gly Ala Leu Val
            1685                1690                1695Ser Ser Asn Gln Ser Ile Gln Asn Ala Ile Leu Gly Ile His Val Ala
        1700                1705                1710Gly Gly Asn Ser Ile Leu Val Ala Lys Leu Val Thr Gln Glu Met Phe
    1715                1720                1725Gln Asn Ile Asp Lys Lys Ile Glu Ser Gln Arg Ile Met Lys Val Glu
1730                1735                1740Phe Thr Gln Cys Ser Met Asn Val Val Ser Lys Thr Leu Phe Arg Lys1745                1750                1755                1760Ser Pro Ile His His His Ile Asp Lys Thr Met Ile Asn Phe Pro Ala
            1765                1770                1775Ala Met Pro Phe Ser Lys Ala Glu Ile Asp Pro Met Ala Met Met Leu
        1780                1785                1790Ser Lys Tyr Ser Leu Pro Ile Val Glu Glu Pro Glu Asp Tyr Lys Glu
    1795                1800                1805Ala Ser Val Phe Tyr Gln Asn Lys Ile Val Gly Lys Thr Gln Leu Val
1810                1815                1820Asp Asp Phe Leu Asp Leu Asp Met Ala Ile Thr Gly Ala Pro Gly Ile1825                1830                1835                1840Asp Ala Ile Asn Met Asp Ser Ser Pro Gly Phe Pro Tyr Val Gln Glu
            1845                1850                1855Lys Leu Thr Lys Arg Asp Leu Ile Trp Leu Asp Glu Asn Gly Leu Leu
        1860                1865                1870Leu Gly Val His Pro Arg Leu Ala Gln Arg Ile Leu Phe Asn Thr Val
    1875                1880                1885Met Met Glu Asn Cys Ser Asp Leu Asp Val Val Phe Thr Thr Cys Pro
1890                1895                1900Lys Asp Glu Leu Arg Pro Leu Glu Lys Val Leu Glu Ser Lys Thr Arg1905                1910                1915                1920Ala Ile Asp Ala Cys Pro Leu Asp Tyr Thr Ile Leu Cys Arg Met Tyr
            1925                1930                1935Trp Gly Pro Ala Ile Ser Tyr Phe His Leu Asn Pro Gly Phe His Thr
        1940                1945                1950Gly Val Ala Ile Gly Ile Asp Pro Asp Arg Gln Trp Asp Glu Leu Phe
    1955                1960                1965Lys Thr Met Ile Arg Phe Gly Asp Val Gly Leu Asp Leu Asp Phe Ser
1970                1975                1980Ala Phe Asp Ala Ser Leu Ser Pro Phe Met Ile Arg Glu Ala Gly Arg1985                1990                1995                2000Ile Met Ser Glu Leu Ser Gly Thr Pro Ser His Phe Gly Thr Ala Leu
            2005                2010                2015Ile Asn Thr Ile Ile Tyr Ser Lys His Leu Leu Tyr Asn Cys Cys Tyr
        2020                2025                2030His Val Cys Gly Ser Met Pro Ser Gly Ser Pro Cys Thr Ala Leu Leu
    2035                2040                2045Asn Ser Ile Ile Asn Asn Ile Asn Leu Tyr Tyr Val Phe Ser Lys Ile
2050                2055                2060Phe Gly Lys Ser Pro Val Phe Phe Cys Gln Ala Leu Arg Ile Leu Cys2065                2070                2075                2080Tyr Gly Asp Asp Val Leu Ile Val Phe Ser Arg Asp Val Gln Ile Asp
            2085                2090                2095Asn Leu Asp Leu Ile Gly Gln Lys Ile Val Asp Glu Phe Lys Lys Leu
         2100               2105                2110Gly Met Thr Ala Thr Ser Ala Asp Lys Asn Val Pro Gln Leu Lys Pro
    2115                2120                2125Val Ser Glu Leu ThrPhe Leu Lys Arg Ser Phe Asn Leu Val Glu Asp
2130               2135                2140Arg Ile Arg Pro Ala Ile Ser Glu Lys Thr Ile Trp Ser Leu Met Ala2145                2150                2155                2160Trp Gln Arg Ser Asn Ala Glu Phe Glu Gln Asn Leu Glu Asn Ala Gln
            2165                2170                2175Trp Phe Ala Phe Met His Gly Tyr Glu Phe Tyr Gln Lys Phe Tyr Tyr
        2180                2185                2190Phe Val Gln Ser Cys Leu Glu Lys Glu Met Ile Glu Tyr Arg Leu Lys
    2195                2200                2205Ser Tyr Asp Trp Trp Arg Met Arg Phe Tyr Asp Gln Cys Phe Ile Cys
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        20                      25              30Glu Val Gln Ile Val Ser Thr Ala Ala Gln Thr Phe Leu Ala Thr Cys
    35                  40                  45Ile Asn Gly Val Cys Trp Thr Val Tyr His Gly Ala Gly Thr Arg Thr
50                  55                  60Ile Ala Ser Pro Lys Gly Pro Val Ile Gln Met Tyr Thr Asn Val Asp65                  70                  75                  80Gln Asp Leu Val Gly Trp Pro Ala Pro Gln Gly Ala Arg Ser Leu Thr
            85                  90                  95Pro Cys Thr Cys Gly Ser Ser Asp Leu Tyr Leu Val Thr Arg His Ala
        100                 105                 110Asp Val Ile Pro Val Arg Arg Arg Gly Asp Gly Arg Gly Ser Leu Leu
    115                 120                 125Ser Pro Arg Pro Ile Ser Tyr Leu Lys Gly Ser Ser Gly Gly Pro Leu
130                 135                 140Leu Cys Pro Ala Gly His Ala Val Gly Ile Phe Arg Ala Ala Val Cys145                 150                 155                 160Thr Arg Gly Val Ala Lys Ala Val Asp Phe Ile Pro Val Glu Ser Leu
            165                 170                 175Glu Thr Thr Met Arg Ser Pro Val Phe Ser Asp Asn Ser Ser Pro Pro
        180                 185                 190Ala Val Pro Gln Ser Tyr Gln Val Ala His Leu His Ala Pro Thr Gly
    195                 200                 205Ser Gly Lys Ser Thr Lys Val Pro Ala Ala Tyr Ala Ala Gln Gly Tyr
210                 215                 220Lys Val Leu Val Leu Asn Pro Ser Val Ala Ala Thr Met Gly Phe Gly225                 230                 235                 240Ala Tyr Met Ser Lys Ala His Gly Ile Asp Pro Asn Ile Arg Thr Gly
            245                 250                 255Val Arg Thr Ile Thr Thr Gly Ser Pro Ile Thr Tyr Ser Thr Tyr Gly
        260                 265                 270Lys Phe Leu Ala Asp Gly Gly Cys Ser Gly Gly Ala Tyr Asp Ile Ile
    275                 280                 285Ile Cys Asp Glu Cys His Ser Thr Asp Ala Thr Ser Ile Leu Gly Ile
290                 295                 300Gly Thr Val Leu Asp Gln Ala Glu Thr Ala Gly Ala Arg Leu Thr Val305                 310                 315                 320Leu Ala Thr Ala Thr Pro Pro Gly Ser Val Thr Val Pro His Pro Asn
                325             330                 335Ile Glu Glu Val Ala Leu Ser Thr Thr Gly Glu Ile Pro Phe Tyr Gly
        340                 345                 350Lys Ala Ile Pro Leu Glu Ala Ile Lys Gly Gly Arg His Leu Ile Phe
    355                 360                 365Cys His Ser Lys Lys Lys Cys Asp Glu Leu Ala Ala Lys Leu Val Ala
370                 375                 380Leu Gly Val Asn Ala Val Ala Tyr Tyr Arg Gly Leu Asp Val Ser Val385                 390                 395                 400Ile Pro Thr Ser Gly Asp Val Val Val Val Ala Thr Asp Ala Leu Met
            405                 410                 415Thr Gly Phe Thr Gly Asp Phe Asp Ser Val Ile Asp Cys Asn Thr Cys
        420                 425                 430Val Thr Gln Thr Val Asp Phe Ser Leu Asp Pro Thr Phe Thr Ile Glu
    435                 440                 445Thr Ile Thr Leu Pro Gln Asp Ala Val Ser Arg Thr Gln Arg Arg Gly
450                 455                 460Arg Thr Gly Arg Gly Lys Pro Gly Ile Tyr Arg Phe Val Ala Pro Gly465                 70                  475                 480Glu Arg Pro Ser Gly Met Phe Asp Ser Ser Val Leu Cys Glu Cys Tyr
            485             490                     495Asp Ala Gly Cys Ala Trp Tyr Glu Leu Thr Pro Ala Glu Thr Thr Val
        500                 505                 510Arg Leu Arg Ala Tyr Met Asn Thr Pro Gly Leu Pro Val Cys Gln Asp
    515                 520                 525His Leu Glu Phe Trp Glu Gly Val Phe Thr Gly Leu Thr His Ile Asp
530                 535                 540Ala His Phe Leu Ser Gln Thr Lys Gln Ser Gly Glu Asn Leu Pro Tyr545                 550                 555                 560Leu Val Ala Tyr Gln Ala Thr Val Cys Ala Arg Ala Gln Ala Pro Pro
            565                 570                 575Pro Ser Trp Asp Gln Met Trp Lys Cys Leu Ile Arg Leu Lys Pro Thr
        580                 585                 590Leu His Gly Pro Thr Pro Leu Leu Tyr Arg Leu Gly Ala Val Gln Asn
    595                 600                 605Glu Val Thr Leu Thr His Pro Val Thr Lys Tyr Ile Met Thr Cys Met
610                 615                 620Ser Ala Asp Leu Glu Val Val Thr Ser Thr Trp Val Leu Val Gly Gly625                 630                 635                 640Val Leu Ala Ala Leu Ala Ala Tyr Cys Leu Ser Thr Gly Cys Val Val
            645                 650                 655Ile Val Gly Arg Ile Val Leu Ser Gly Lys Pro Ala Ile Ile Pro Asp
        660                 665                 670Arg Glu Val Leu Tyr Arg Glu Phe Asp Glu Met Glu Glu Cys
    675                 680                 685<210>18<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>克隆寡核苷酸<400>18ccgtctagat  cagcactctt  ccatttcatc                                     30<210>19<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>克隆寡核苷酸<400>19cctgaattca tggcgcctat cacggcctat                                       30<210>20<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>克隆寡核苷酸<400>20ccacgcggcc gcgacgacct acag                                             24<210>21<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>克隆寡核苷酸<400>21ctggagg tcgtcacgcctac ctgggtgctc gtt                                   33<210>22<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>克隆寡核苷酸<400>22accgagcacc caggtaggcg tgacgacctc cag                               33<210>23<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>克隆寡核苷酸<400>23ctggaggtcg tccgcggtac ctgggtgctc gtt                               33<210>24<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>克隆寡核苷酸<400>24accgagcacc caggtaccgc ggacgacctc cag                               33<210>25<211>25<212>PRT<213>人工序列<220><223>丙型肝炎病毒NS3/4A肽<400>25Thr Lys Tyr Met Thr Cys Met Ser Ala Asp Leu Glu Val Val Thr Ser1              5                   10                  15Thr Trp Val Leu Val Gly Gly Val Leu
        20                  25<210>26<211>25<212>PRT<213>人工序列<220><223>突变的丙型肝炎病毒NS3/4A肽<400>26Thr Lys Tyr Met Thr Cys Met Ser Ala Asp Leu Glu Val Val Thr Gly1              5                   10                  15Thr Trp Val Leu Val Gly Gly Val Leu
        20                  25<210>27<211>25<212>PRT<213>人工序列<220><223>突变的丙型肝炎病毒NS3/4A肽<400>27Thr Lys Tyr Met Thr Cys Met Ser Ala Asp Leu Glu Val Val Arg Gly1              5                   10                  15Thr Trp Val Leu Val Gly Gly Val Leu
        20                  25<210>28<211>12<212>PRT<213>人工序列<220><223>丙型肝炎病毒NS3/4A肽<400>28Ser Ala Asp Leu Glu Val Val Thr Ser Thr Trp Val1               5                  10<210>29<211>632<212>PRT<213>丙型肝炎病毒NS3肽人工序列<220><223>丙型肝炎病毒NS3肽<400>29Met Ala Pro Ile Thr Ala Tyr Ala Gln Gln Thr Arg Gly Leu Leu Gly1              5                   10                  15Cys Ile Ile Thr Ser Leu Thr Gly Arg Asp Lys Asn Gln Val Glu Gly
        20                  25                  30Glu Val Gln Ile Val Ser Thr Ala Ala Gln Thr Phe Leu Ala Thr Cys
    35                  40                  45Ile Asn Gly Val Cys Trp Thr Val Tyr His Gly Ala Gly Thr Arg Thr
50                  55                  60Ile Ala Ser Pro Lys Gly Pro Val Ile Gln Met Tyr Thr Asn Val Asp65                  70                  75                  80Gln Asp Leu Val Gly Trp Pro Ala Pro Gln Gly Ala Arg Ser Leu Thr
            85                  90                  95Pro Cys Thr Cys Gly Ser Ser Asp Leu Tyr Leu Val Thr Arg His Ala
        100                 105                 110Asp Val Ile Pro Val Arg Arg Arg Gly Asp Gly Arg Gly Ser Leu Leu
    115                 120                 125Ser Pro Arg Pro Ile Ser Tyr Leu Lys Gly Ser Ser Gly Gly Pro Leu
130                 135                 140Leu Cys Pro Ala Gly His Ala Val Gly Ile Phe Arg Ala Ala Val Cys145                 150                 155                 160Thr Arg Gly Val Ala Lys Ala Val Asp Phe Ile Pro Val Glu Ser Leu
            165                 170                 175Glu Thr Thr Met Arg Ser Pro Val Phe Ser Asp Asn Ser Ser Pro Pro
        180                 185                 190Ala Val Pro Gln Ser Tyr Gln Val Ala His Leu His Ala Pro Thr Gly
    195                 200                 205Ser Gly Lys Ser Thr Lys Val Pro Ala Ala Tyr Ala Ala Gln Gly Tyr
210                 215                 220Lys Val Leu Val Leu Asn Pro Ser Val Ala Ala Thr Met Gly Phe Gly225                 230                 235                 240Ala Tyr Met Ser Lys Ala His Gly Ile Asp Pro Asn Ile Arg Thr Gly
            245                 250                 255Val Arg Thr Ile Thr Thr Gly Ser Pro Ile Thr Tyr Ser Thr Tyr Gly
        260                 265                 270Lys Phe Leu Ala Asp Gly Gly Cys Ser Gly Gly Ala Tyr Asp Ile Ile
    275                 280                 285Ile Cys Asp Glu Cys His Ser Thr Asp Ala Thr Ser Ile Leu Gly Ile
290                 295                 300Gly Thr Val Leu Asp Gln Ala Glu Thr Ala Gly Ala Arg Leu Thr Val305                 310                 315                 320Leu Ala Thr Ala Thr Pro Pro Gly Ser Val Thr Val Pro His Pro Asn
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        340                 345                 350Lys Ala Ile Pro Leu Glu Ala Ile Lys Gly Gly Arg His Leu Ile Phe
    355                 360                 365Cys His Ser Lys Lys Lys Cys Asp Glu Leu Ala Ala Lys Leu Val Ala
370                 375                 380Leu Gly Val ASn Ala Val Ala Tyr Tyr Arg Gly Leu Asp Val Ser Val385                 390                 395                 400Ile Pro Thr Ser Gly Asp Val Val Val Val Ala Thr Asp Ala Leu Met
            405                 410                 415Thr Gly Phe Thr Gly Asp Phe Asp Ser Val Ile Asp Cys Asn Thr Cys
        420                 425                 430Val Thr Gln Thr Val Asp Phe Ser Leu Asp Pro Thr Phe Thr Ile Glu
    435                 440                 445Thr Ile Thr Leu Pro Gln Asp Ala Val Ser Arg Thr Gln Arg Arg Gly
450                 455                 460Arg Thr Gly Arg Gly Lys Pro Gly Ile Tyr Arg Phe Val Ala Pro Gly465                 470                 475                 480Glu Arg Pro Ser Gly Met Phe Asp Ser Ser Val Leu Cys Glu Cys Tyr
            485                 490                 495Asp Ala Gly Cys Ala Trp Tyr Glu Leu Thr Pro Ala Glu Thr Thr Val
        500                 505                 510Arg Leu Arg Ala Tyr Met Asn Thr Pro Gly Leu Pro Val Cys Gln Asp
    515                 520                 525His Leu Glu Phe Trp Glu Gly Val Phe Thr Gly Leu Thr His Ile Asp
530                 535                 540Ala His Phe Leu Ser Gln Thr Lys Gln Ser Gly Glu Asn Leu Pro Tyr545                 550                 555                 560Leu Val Ala Tyr Gln Ala Thr Val Cys Ala Arg Ala Gln Ala Pro Pro
            565                 570                 575Pro Ser Trp Asp Gln Met Trp Lys Cys Leu Ile Arg Leu Lys Pro Thr
        580                 585                 590Leu His Gly Pro Thr Pro Leu Leu Tyr Arg Leu Gly Ala Val Gln Asn
    595                 600                 605Glu Val Thr Leu Thr His Pro Val Thr Lys Tyr Ile Met Thr Cys Met
610                 615                 620Ser Ala Asp Leu Glu Val Val Thr625                 630<210>30<211>54<212>PRT<213>人工序列<220><223>丙型肝炎病毒NS4A肽<400>30Ser Thr Trp Val Leu Val Gly Gly Val Leu Ala Ala Leu Ala Ala Tyr1               5                  10                  15Cys Leu Ser Thr Gly Cys Val Val Ile Val Gly Arg Ile Val Leu Ser
        20                  25                  30Gly Lys Pro Ala Ile Ile Pro Asp Arg Glu Val Leu Tyr Arg Glu Phe
    35                  40                  45Asp Glu Met Glu Glu Cys
50<210>31<211>686<212>PRT<213>人工序列<220><223>突变的丙型肝炎病毒NS3/4A<400>31Met Ala Pro Ile Thr Ala Tyr Ala Gln Gln Thr Arg Gly Leu Leu Gly1              5                   10                  15Cys Ile Ile Thr Ser Leu Thr Gly Arg Asp Lys Asn Gln Val Glu Gly
        20                  25                  30Glu Val Gln Ile Val Ser Thr Ala Ala Gln Thr Phe Leu Ala Thr Cys
    35                  40                  45Ile Asn Gly Val Cys Trp Thr Val Tyr His Gly Ala Gly Thr Arg Thr
50                  55                  60Ile Ala Ser Pro Lys Gly Pro Val Ile Gln Met Tyr Thr Asn Val Asp65                  70                  75                  80Gln Asp Leu Val Gly Trp Pro Ala Pro Gln Gly Ala Arg Ser Leu Thr
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370                 375                 380Leu Gly Val Asn Ala Val Ala Tyr Tyr Arg Gly Leu Asp Val Ser Val385                 390                 395                 400Ile Pro Thr Ser Gly Asp Val Val Val Val Ala Thr Asp Ala Leu Met
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450                 455                 460Arg Thr Gly Arg Gly Lys Pro Gly Ile Tyr Arg Phe Val Ala Pro Gly465                 470                 475                 480Glu Arg Pro Ser Gly Met Phe Asp Ser Ser Val Leu Cys Glu Cys Tyr
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530                 535                 540Ala His Phe Leu Ser Gln Thr Lys Gln Ser Gly Glu Asn Leu Pro Tyr545                 550                 555                 560Leu Val Ala Tyr Gln Ala Thr Val Cys Ala Arg Ala Gln Ala Pro Pro
            565                 570                 575Pro Ser Trp Asp Gln Met Trp Lys Cys Leu Ile Arg Leu Lys Pro Thr
        580                 585                 590Leu His Gly Pro Thr Pro Leu Leu Tyr Arg Leu Gly Ala Val Gln Asn
    595                 600                 605Glu Val Thr Leu Thr His Pro Val Thr Lys Tyr Ile Met Thr Cys Met
610                 615                 620Ser Ala Asp Leu Glu Val Val Thr Gly Thr Trp Val Leu Val Gly Gly625                 630                 635                 640Val Leu Ala Ala Leu Ala Ala Tyr Cys Leu Ser Thr Gly Cys Val Val
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        660                 665                 670Arg Glu Val Leu Tyr Arg Glu Phe Asp Glu Met Glu Glu Cys
    675                 680                 685<210>32<211>686<212>PRT<213>人工序列<220><223>突变的丙型肝炎病毒NS3/4A<400>32Met Ala Pro Ile Thr Ala Tyr Ala Gln Gln Thr Arg Gly Leu Leu Gly1               5                  10                  15Cys Ile Ile Thr Ser Leu Thr Gly Arg Asp Lys Asn Gln Val Glu Gly
        20                  25                  30Glu Val Gln Ile Val Ser Thr Ala Ala Gln Thr Phe Leu Ala Thr Cys
    35                  40                  45Ile Asn Gly Val Cys Trp Thr Val Tyr His Gly Ala Gly Thr Arg Thr
50                  55                  60Ile Ala Ser Pro Lys Gly Pro Val Ile Gln Met Tyr Thr Asn Val Asp65                  70                  75                  80Gln Asp Leu Val Gly Trp Pro Ala Pro Gln Gly Ala Arg Ser Leu Thr
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        100                 105                 110Asp Val Ile Pro Val Arg Arg Arg Gly Asp Gly Arg Gly Ser Leu Leu
    115                 120                 125Ser Pro Arg Pro Ile Ser Tyr Leu Lys Gly Ser Ser Gly Gly Pro Leu
130                 135             140Leu Cys Pro Ala Gly His Ala Val Gly Ile Phe Arg Ala Ala Val Cys145                 150                 155                 160Thr Arg Gly Val Ala Lys Ala Val Asp Phe Ile Pro Val Glu Ser Leu
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    195                 200                205Ser Gly Lys Ser Thr Lys Val Pro Ala Ala Tyr Ala Ala Gln Gly Tyr
210                 215                 220Lys Val Leu Val Leu Asn Pro Ser Val Ala Ala Thr Met Gly Phe Gly225                 230                 235                 240Ala Tyr Met Ser Lys Ala His Gly Ile Asp Pro Asn Ile Arg Thr Gly
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        340                 345                 350Lys Ala Ile Pro Leu Glu Ala Ile Lys Gly Gly Arg His Leu Ile Phe
    355                 360                 365Cys His Ser Lys Lys Lys Cys Asp Glu Leu Ala Ala Lys Leu Val Ala
370                 375                 380Leu Gly Val Asn Ala Val Ala Tyr Tyr Arg Gly Leu Asp Val Ser Val385                 390                 395                 400Ile Pro Thr Ser Gly Asp Val Val Val Val Ala Thr Asp Ala Leu Met
            405                 410                 415Thr Gly Phe Thr Gly Asp Phe Asp Ser Val Ile Asp Cys Asn Thr Cys
        420                 425                 430Val Thr Gln Thr Val Asp Phe Ser Leu Asp Pro Thr Phe Thr Ile Glu
    435                 440                 445Thr Ile Thr Leu Pro Gln Asp Ala Val Ser Arg Thr Gln Arg Arg Gly
450                 455                 460Arg Thr Gly Arg Gly Lys Pro Gly Ile Tyr Arg Phe Val Ala Pro Gly465                 470                 475                 480Glu Arg Pro Ser Gly Met Phe Asp Ser Ser Val Leu Cys Glu Cys Tyr
            485                 490                 495Asp Ala Gly Cys Ala Trp Tyr Glu Leu Thr Pro Ala Glu Thr Thr Val
        500                 505                 510Arg Leu Arg Ala Tyr Met Asn Thr Pro Gly Leu Pro Val Cys Gln Asp
    515                 520                 525His Leu Glu Phe Trp Glu Gly Val Phe Thr Gly Leu Thr His Ile Asp
530                 535                 540Ala His Phe Leu Ser Gln Thr Lys Gln Ser Gly Glu Asn Leu Pro Tyr545                 550                 555                 560Leu Val Ala Tyr Gln Ala Thr Val Cys Ala Arg Ala Gln Ala Pro Pro
            565                 570                575Pro Ser Trp Asp Gln Met Trp Lys Cys Leu Ile Arg Leu Lys Pro Thr
        580                 585                 590Leu His Gly Pro Thr Pro Leu Leu Tyr Arg Leu Gly Ala Val Gln Asn
    595                 600                 605Glu Val Thr Leu Thr His Pro Val Thr Lys Tyr Ile Met Thr Cys Met
610                 615                 620Ser Ala Asp Leu Glu Val Val Arg Gly Thr Trp Val Leu Val Gly Gly625                     630             635                 640Val Leu Ala Ala Leu Ala Ala Tyr Cys Leu Ser Thr Gly Cys Val Val
            645                 650                 655Ile Val Gly Arg Ile Val Leu Ser Gly Lys Pro Ala Ile Ile Pro Asp
        660                 665                 670Arg Glu Val Leu Tyr Arg Glu Phe Asp Glu Met Glu Glu Cys
    675                 680                 685<210>33<211>25<212>PRT<213>人工序列<220><223>突变的丙型肝炎病毒NS3/4A肽<400>33Thr Lys Tyr Met Thr Cys Met Ser Ala Asp Leu Glu Val Val Thr Pro1              5                   10                  15Thr Trp Val Leu Val Gly Gly Val Leu
        20                  25<210>34<211>25<212>PRT<213>人工序列<220><223>突变的丙型肝炎病毒NS3/4A肽<400>34Thr Lys Tyr Met Thr Cys Met Ser Ala Asp Leu Glu Val Val Arg Pro1               5                  10                  15Thr Trp Val Leu Val Gly Gly Val Leu
        20                  25<210>35<211>25<212>PRT<213>人工序列<220><223>突变的丙型肝炎病毒NS3/4A肽<400>35Thr Lys Tyr Met Thr Cys Met Ser Ala Asp Leu Glu Val Val Arg Pro1              5                   10                  15Ala Trp Val Leu Val Gly Gly Val Leu
        20                  25<210>36<211>25<212>PRT<213>人工序列<220><223>突变的丙型肝炎病毒NS3/4A肽<400>36Thr Lys Tyr Met Thr Cys Met Ser Ala Asp Leu Glu Val Val Cys Ser1              5                   10                  15Thr Trp Val Leu Val Gly Gly Val Leu
        20                  25<210>37<211>25<212>PRT<213>人工序列<220><223>突变的丙型肝炎病毒NS3/4A肽<400>37Thr Lys Tyr Met Thr Cys Met Ser Ala Asp Leu Glu Val Cys Cys Ser1               5                  10              15Thr Trp Val Leu Val Gly Gly Val Leu
        20                  25<210>38<211>25<212>PRT<213>人工序列<220><223>突变的丙型肝炎病毒NS3/4A肽<400>38Thr Lys Tyr Met Thr Cys Met Ser Ala Asp Leu Glu Val Ser Ser Ser1              5                   10                  15Thr Trp Val Leu Val Gly Gly Val Leu
        20                  25<210>39<211>25<212>PRT<213>人工序列<220><223>突变的丙型肝炎病毒NS3/4A肽<400>39Thr Lys Tyr Met Thr Cys Met Ser Ala Asp Ser Ser Ser Ser Cys Ser 1              5                 10                      15Thr Trp Val Leu Val Gly Gly Val Leu
        20                  25<210>40<211>25<212>PRT<213>人工序列<220><223>突变的丙型肝炎病毒NS3/4A肽<400>40Thr Lys Tyr Met Thr Cys Met Ser Ala Asp Val Val Val Val Thr Ser1              5                   10                  15Thr Trp Val Leu Val Gly Gly Val Leu
        20                  25<210>41<211>16<212>PRT<213>人工序列<220><223>丙型肝炎病毒NS5肽<400>41Ala Ser Glu Asp Val Val Cys  Cys  Ser Met  Ser Tyr Thr Trp Thr Gly1              5                     10                   15<210>42<211>18<212>PRT<213>人工序列<220><223>突变的丙型肝炎病毒NS5A/B肽<400>42Ser Ser Glu Asp Val Val Cys Cys Ser Met Trp Val Leu Val Gly Gly1              5                    10                 15Val Leu<210>43<211>686<212>PRT<213>人工序列<220><223>突变的丙型肝炎病毒NS3/4A<400> 43Met Ala Pro Ile Thr Ala Tyr Ala Gln Gln Thr Arg Gly Leu Leu Gly1              5                   10                  15Cys Ile Ile Thr Ser Leu Thr Gly Arg Asp Lys Asn Gln Val Glu Gly
        20                  25                  30Glu Val Gln Ile Val Ser Thr Ala Ala Gln Thr Phe Leu Ala Thr Cys
    35                  40                  45Ile Asn Gly Val Cys Trp Thr Val Tyr His Gly Ala Gly Thr Arg Thr
50                  55                  60Ile Ala Ser Pro Lys Gly Pro Val Ile Gln Met Tyr Thr Asn Val Asp65                  70                  75                  80Gln Asp Leu Val Gly Trp Pro Ala Pro Gln Gly Ala Arg Ser Leu Thr
            85                  90                  95Pro Cys Thr Cys Gly Ser Ser Asp Leu Tyr Leu Val Thr Arg His Ala
        100                 105                 110Asp Val Ile Pro Val Arg Arg Arg Gly Asp Gly Arg Gly Ser Leu Leu
    115                 120                 125Ser Pro Arg Pro Ile Ser Tyr Leu Lys Gly Ser Ser Gly Gly Pro Leu
130                 135                 140Leu Cys Pro Ala Gly His Ala Val Gly Ile Phe Arg Ala Ala Val Cys145                 150                 155                 160Thr Arg Gly Val Ala Lys Ala Val Asp Phe Ile Pro Val Glu Ser Leu
            165                 170                 175Glu Thr Thr Met Arg Ser Pro Val Phe Ser Asp Asn Ser Ser Pro Pro
        180                 185                 190Ala Val Pro Gln Ser Tyr Gln Val Ala His Leu His Ala Pro Thr Gly
    195                 200                 205Ser Gly Lys Ser Thr Lys Val Pro Ala Ala Tyr Ala Ala Gln Gly Tyr
210                 215                 220Lys Val Leu Val Leu Asn Pro Ser Val Ala Ala Thr Met Gly Phe Gly225                 230                 235                 240Ala Tyr Met Ser Lys Ala His Gly Ile Asp Pro Asn Ile Arg Thr Gly
            245                 250                 255Val Arg Thr Ile Thr Thr Gly Ser Pro Ile Thr Tyr Ser Thr Tyr Gly
        260                 265                 270Lys Phe Leu Ala Asp Gly Gly Cys Ser Gly Gly Ala Tyr Asp Ile Ile
    275                 280                  285Ile Cys Asp Glu Cys His Ser Thr Asp Ala Thr Ser Ile Leu Gly Ile
290                 295                 300Gly Thr Val Leu Asp Gln Ala Glu Thr Ala Gly Ala Arg Leu Thr Val305                 310                 315                 320Leu Ala Thr Ala Thr Pro Pro Gly Ser Val Thr Val Pro His Pro Asn
            325                 330                 335Ile Glu Glu Val Ala Leu Ser Thr Thr Gly Glu Ile Pro Phe Tyr Gly
        340                 345                 350Lys Ala Ile Pro Leu Glu Ala Ile Lys Gly Gly Arg His Leu Ile Phe
    355                 360                 365Cys His Ser Lys Lys Lys Cys Asp Glu Leu Ala Ala Lys Leu Val Ala
370                 375                 380Leu Gly Val Asn Ala Val Ala Tyr Tyr Arg Gly Leu Asp Val Ser Val385                 390                 395                 400Ile Pro Thr Ser Gly Asp Val Val Val Val Ala Thr Asp Ala Leu Met
            405                 410                 415Thr Gly Phe Thr Gly Asp Phe Asp Ser Val Ile Asp Cys Asn Thr Cys
        420                 425                 430Val Thr Gln Thr Val Asp Phe Ser Leu Asp Pro Thr Phe Thr Ile Glu
    435                 440                 445Thr Ile Thr Leu Pro Gln Asp Ala Val Ser Arg Thr Gln Arg Arg Gly
450                 455                 460Arg Thr Gly Arg Gly Lys Pro Gly Ile Tyr Arg Phe Val Ala Pro Gly465                 470                 475                 480Glu Arg Pro Ser Gly Met Phe Asp Ser Ser Val Leu Cys Glu Cys Tyr
            485                 490                 495Asp Ala Gly Cys Ala Trp Tyr Glu Leu Thr Pro Ala Glu Thr Thr Val
        500                 505                 510Arg Leu Arg Ala Tyr Met Asn Thr Pro Gly Leu Pro Val Cys Gln Asp
    515                 520                 525His Leu Glu Phe Trp Glu Gly Val Phe Thr Gly Leu Thr His Ile Asp
530                 535                 540Ala His Phe Leu Ser Gln Thr Lys Gln Ser Gly Glu Asn Leu Pro Tyr545                 550                 555                 560Leu Val Ala Tyr Gln Ala Thr Val Cys Ala Arg Ala Gln Ala Pro Pro
            565                 570                 575Pro Ser Trp Asp Gln Met Trp Lys Cys Leu Ile Arg Leu Lys Pro Thr
        580                 585                 590Leu His Gly Pro Thr Pro Leu Leu Tyr Arg Leu Gly Ala Val Gln Asn
    595                 600                 605Glu Val Thr Leu Thr His Pro Val Thr Lys Tyr Ile Met Thr Cys Met
610                 615                 620Ser Ala Asp Leu Glu Val Val Thr Pro Thr Trp Val Leu Val Gly Gly625                 630                 635                 640Val Leu Ala Ala Leu Ala Ala Tyr Cys Leu Ser Thr Gly Cys Val Val
            645                 650                 655Ile Val Gly Arg Ile Val Leu Ser Gly Lys Pro Ala Ile Ile Pro Asp
        660                 665                 670Arg Glu Val Leu Tyr Arg Glu Phe Asp Glu Met Glu Glu Cys
    675                 680                 685<210>44<211>686<212>PRT<213>人工序列<220><223>突变的丙型肝炎病毒NS3/4A<400>44Met Ala Pro Ile Thr Ala Tyr Ala Gln Gln Thr Arg Gly Leu Leu Gly1              5                  10                  15Cys Ile Ile Thr Ser Leu Thr Gly Arg Asp Lys Asn Gln Val Glu Gly
        20                   25                 30Glu Val Gln Ile Val Ser Thr Ala Ala Gln Thr Phe Leu Ala Thr Cys
    35                  40                  45Ile Asn Gly Val Cys Trp Thr Val Tyr His Gly Ala Gly Thr Arg Thr
50                  55                  60Ile Ala Ser Pro Lys Gly Pro Val Ile Gln Met Tyr Thr Asn Val Asp65                  70                  75                  80Gln Asp Leu Val Gly Trp Pro Ala Pro Gln Gly Ala Arg Ser Leu Thr
            85                  90                  95Pro Cys Thr Cys Gly Ser Ser Asp Leu Tyr Leu Val Thr Arg His Ala
        100                 105                 110Asp Val Ile Pro Val Arg Arg Arg Gly Asp Gly Arg Gly Ser Leu Leu
    115                 120                 125Ser Pro Arg Pro Ile Ser Tyr Leu Lys Gly Ser Ser Gly Gly Pro Leu
130                 135                 140Leu Cys Pro Ala Gly His Ala Val Gly Ile Phe Arg Ala Ala Val Cys145                 150                 155                 160Thr Arg Gly Val Ala Lys Ala Val Asp Phe Ile Pro Val Glu Ser Leu
        165                     170                 175Glu Thr Thr Met Arg Ser Pro Val Phe Ser Asp Asn Ser Ser Pro Pro
        180                 185                 190Ala Val Pro Gln Ser Tyr Gln Val Ala His Leu His Ala Pro Thr Gly
    195                 200                 205Ser Gly Lys Ser Thr Lys Val Pro Ala Ala Tyr Ala Ala Gln Gly Tyr
210                 215                 220Lys Val Leu Val Leu Asn Pro Ser Val Ala Ala Thr Met Gly Phe Gly225                 230                 235                 240Ala Tyr Met Ser Lys Ala His Gly Ile Asp Pro Asn Ile Arg Thr Gly
            245                 250                 255Val Arg Thr Ile Thr Thr Gly Ser Pro Ile Thr Tyr Ser Thr Tyr Gly
        260                 265                 270Lys Phe Leu Ala Asp Gly Gly Cys Ser Gly Gly Ala Tyr Asp Ile Ile
    275                 280                 285Ile Cys Asp Glu Cys His Ser Thr Asp Ala Thr Ser Ile Leu Gly Ile
290                 295                 300Gly Thr Val Leu Asp Gln Ala Glu Thr Ala Gly Ala Arg Leu Thr Val305                 310                 315                 320Leu Ala Thr Ala Thr Pro Pro Gly Ser Val Thr Val Pro His Pro Asn
            325                 330                 335Ile Glu Glu Val Ala Leu Ser Thr Thr Gly Glu Ile Pro Phe Tyr Gly
        340             345                     350Lys Ala Ile Pro Leu Glu Ala Ile Lys Gly Gly Arg His Leu Ile Phe
    355                 360                 365Cys His Ser Lys Lys Lys Cys Asp Glu Leu Ala Ala Lys Leu Val Ala
370                 375                 380Leu Gly Val Asn Ala Val Ala Tyr Tyr Arg Gly Leu Asp Val Ser Val385                 390                 395                 400Ile Pro Thr Ser Gly Asp Val Val Val Val Ala Thr Asp Ala Leu Met
            405                 410                 415Thr Gly Phe Thr Gly Asp Phe Asp Ser Val Ile Asp Cys Asn Thr Cys
        420                 425                 430Val Thr Gln Thr Val Asp Phe Ser Leu Asp Pro Thr Phe Thr Ile Glu
    435                 440                 445Thr Ile Thr Leu Pro Gln Asp Ala Val Ser Arg Thr Gln Arg Arg Gly
450                 455                 460Arg Thr Gly Arg Gly Lys Pro Gly Ile Tyr Arg Phe Val Ala Pro Gly465                 470                 475                 480Glu Arg Pro Ser Gly Met Phe Asp Ser Ser Val Leu Cys Glu Cys Tyr
            485                 490                 495Asp Ala Gly Cys Ala Trp Tyr Glu Leu Thr Pro Ala Glu Thr Thr Val
        500                 505                 510Arg Leu Arg Ala Tyr Met Asn Thr Pro Gly Leu Pro Val Cys Gln Asp
    515                 520                 525His Leu Glu Phe Trp Glu Gly Val Phe Thr Gly Leu Thr His Ile Asp
530                 535                 540Ala His Phe Leu Ser Gln Thr Lys Gln Ser Gly Glu Asn Leu Pro Tyr545                 550                 555                 560Leu Val Ala Tyr Gln Ala Thr Val Cys Ala Arg Ala Gln Ala Pro Pro
            565                 570                 575Pro Ser Trp Asp Gln Met Trp Lys Cys Leu Ile Arg Leu Lys Pro Thr
        580                 585                 590Leu His Gly Pro Thr Pro Leu Leu Tyr Arg Leu Gly Ala Val Gln Asn
    595                 600                 605Glu Val Thr Leu Thr His Pro Val Thr Lys Tyr Ile Met Thr Cys Met
610                 615                 620Ser Ala Asp Leu Glu Val Val Arg Pro Thr Trp Val Leu Val Gly Gly625                 630                 635                 640Val Leu Ala Ala Leu Ala Ala Tyr Cys Leu Ser Thr Gly Cys Val Val
            645                 650                 655Ile Val Gly Arg Ile Val Leu Ser Gly Lys Pro Ala Ile Ile Pro Asp
        660                 665                 670Arg Glu Val Leu Tyr Arg Glu Phe Asp Glu Met Glu Glu Cys
    675                 680                 685<210>45<211>686<212>PRT<213>人工序列<220><223>突变的丙型肝炎病毒NS3/4A<400>45Met Ala Pro Ile Thr Ala Tyr Ala Gln Gln Thr Arg Gly Leu Leu Gly1              5                   10                  15Cys Ile Ile Thr Ser Leu Thr Gly Arg Asp Lys Asn Gln Val Glu Gly
        20                  25                  30Glu Val Gln Ile Val Ser Thr Ala Ala Gln Thr Phe Leu Ala Thr Cys
    35                  40                  45Ile Asn Gly Val Cys Trp Thr Val Tyr His Gly Ala Gly Thr Arg Thr
50                  55                  60Ile Ala Ser Pro Lys Gly Pro Val Ile Gln Met Tyr Thr Asn Val Asp65                  70                  75                  80Gln Asp Leu Val Gly Trp Pro Ala Pro Gln Gly Ala Arg Ser Leu Thr
            85                  90                  95Pro Cys Thr Cys Gly Ser Ser Asp Leu Tyr Leu Val Thr Arg His Ala
        100                 105                 110Asp Val Ile Pro Val Arg Arg Arg Gly Asp Gly Arg Gly Ser Leu Leu
    115                 120                 125Ser Pro Arg Pro Ile Ser Tyr Leu Lys Gly Ser Ser Gly Gly Pro Leu
130                 135                 140Leu Cys Pro Ala Gly His Ala Val Gly Ile Phe Arg Ala Ala Val Cys145                 150                 155                 160Thr Arg Gly Val Ala Lys Ala Val Asp Phe Ile Pro Val Glu Ser Leu
            165                 170                 175Glu Thr Thr Met Arg Ser Pro Val Phe Ser Asp Asn Ser Ser Pro Pro
        180                 185                 190Ala Val Pro Gln Ser Tyr Gln Val Ala His Leu His Ala Pro Thr Gly
    195                 200                 205Ser Gly Lys Ser Thr Lys Val Pro Ala Ala Tyr Ala Ala Gln Gly Tyr
210                 215                 220Lys Val Leu Val Leu Asn Pro Ser Val Ala Ala Thr Met Gly Phe Gly225                 230                 235                 240Ala Tyr Met Ser Lys Ala His Gly Ile Asp Pro Asn Ile Arg Thr Gly
            245                 250                 255Val Arg Thr Ile Thr Thr Gly Ser Pro Ile Thr Tyr Ser Thr Tyr Gly
        260                 265                 270Lys Phe Leu Ala Asp Gly Gly Cys Ser Gly Gly Ala Tyr Asp Ile Ile
    275                 280                 285Ile Cys Asp Glu Cys His Ser Thr Asp Ala Thr Ser Ile Leu Gly Ile
290                 295                 300Gly Thr Val Leu Asp Gln Ala Glu Thr Ala Gly Ala Arg Leu Thr Val305                 310                 315                 320Leu Ala Thr Ala Thr Pro Pro Gly Ser Val Thr Val Pro His Pro Asn
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        340                 345                 350Lys Ala Ile Pro Leu Glu Ala Ile Lys Gly Gly Arg His Leu Ile Phe
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    515                 520                 525His Leu Glu Phe Trp Glu Gly Val Phe Thr Gly Leu Thr His Ile Asp
530                 535                 540Ala His Phe Leu Ser Gln Thr Lys Gln Ser Gly Glu Asn Leu Pro Tyr545                 550                 555                 560Leu Val Ala Tyr Gln Ala Thr Val Cys Ala Arg Ala Gln Ala Pro Pro
            565                 570                 575Pro Ser Trp Asp Gln Met Trp Lys Cys Leu Ile Arg Leu Lys Pro Thr
        580                 585                 590Leu His Gly Pro Thr Pro Leu Leu Tyr Arg Leu Gly Ala Val Gln Asn
    595                 600                 605Glu Val Thr Leu Thr His Pro Val Thr Lys Tyr Ile Met Thr Cys Met
610                 615                 620Ser Ala Asp Leu Glu Val Ser Ser Ser Thr Trp Val Leu Val Gly Gly625                 630                 635                 640Val Leu Ala Ala Leu Ala Ala Tyr Cys Leu Ser Thr Gly Cys Val Val
            645                 650                 655Ile Val Gly Arg Ile Val Leu Ser Gly Lys Pro Ala Ile Ile Pro Asp
        660                 665                 670Arg Glu Val Leu Tyr Arg Glu Phe Asp Glu Met Glu Glu Cys
    675                 680                 685<210>49<211>686<212>PRT<213>人工序列<220><223>突变的丙型肝炎病毒NS3/4A<400>49Met Ala Pro Ile Thr Ala Tyr Ala Gln Gln Thr Arg Gly Leu Leu Gly1              5                   10                  15Cys Ile Ile Thr Ser Leu Thr Gly Arg Asp Lys Asn Gln Val Glu Gly
        20                  25                  30Glu Val Gln Ile Val Ser Thr Ala Ala Gln Thr Phe Leu Ala Thr Cys
    35                  40                  45Ile Asn Gly Val Cys Trp Thr Val Tyr His Gly Ala Gly Thr Arg Thr
50                  55                  60Ile Ala Ser Pro Lys Gly Pro Val Ile Gln Met Tyr Thr Asn Val Asp65                  70                  75                  80Gln Asp Leu Val Gly Trp Pro Ala Pro Gln Gly Ala Arg Ser Leu Thr
            85                  90                  95Pro Cys Thr Cys Gly Ser Ser Asp Leu Tyr Leu Val Thr Arg His Ala
        100                 105                 110Asp Val Ile Pro Val Arg Arg Arg Gly Asp Gly Arg Gly Ser Leu Leu
    115                 120                 125Ser Pro Arg Pro Ile Ser Tyr Leu Lys Gly Ser Ser Gly Gly Pro Leu
130                 135                 140Leu Cys Pro Ala Gly His Ala Val Gly Ile Phe Arg Ala Ala Val Cys145                 150                 155                 160Thr Arg Gly Val Ala Lys Ala Val Asp Phe Ile Pro Val Glu Ser Leu
            165                 170                 175Glu Thr Thr Met Arg Ser Pro Val Phe Ser Asp Asn Ser Ser Pro Pro
        180                 185                 190Ala Val Pro Gln Ser Tyr Gln Val Ala His Leu His Ala Pro Thr Gly
    195                 200                 205Ser Gly Lys Ser Thr Lys Val Pro Ala Ala Tyr Ala Ala Gln Gly Tyr
210                 215                 220Lys Val Leu Val Leu Asn Pro Ser Val Ala Ala Thr Met Gly Phe Gly225                 230                 235                 240Ala Tyr Met Ser Lys Ala His Gly Ile Asp Pro Asn Ile Arg Thr Gly
            245                 250                 255Val Arg Thr Ile Thr Thr Gly Ser Pro Ile Thr Tyr Ser Thr Tyr Gly
        260                 265                 270Lys Phe Leu Ala Asp Gly Gly Cys Ser Gly Gly Ala Tyr Asp Ile Ile
    275                 280                 285Ile Cys Asp Glu Cys His Ser Thr Asp Ala Thr Ser Ile Leu Gly Ile
290                 295                 300Gly Thr Val Leu Asp Gln Ala Glu Thr Ala Gly Ala Arg Leu Thr Val305                 310                 315                 320Leu Ala Thr Ala Thr Pro Pro Gly Ser Val Thr Val  Pro His Pro Asn
            325                 330                  335Ile Glu Glu Val Ala Leu Ser Thr Thr Gly Glu Ile Pro Phe Tyr Gly
        340                 345                 350Lys Ala Ile Pro Leu Glu Ala Ile Lys Gly Gly Arg His Leu Ile Phe
    355                 360                 365Cys His Ser Lys Lys Lys Cys Asp Glu Leu Ala Ala Lys Leu Val Ala
370                 375                 380Leu Gly Val Asn Ala Val Ala Tyr Tyr Arg Gly Leu Asp Val Ser Val385                 390                 395                 400Ile Pro Thr Ser Gly Asp Val Val Val Val Ala Thr Asp Ala Leu Met
            405                 410                 415Thr Gly Phe Thr Gly Asp Phe Asp Ser Val Ile Asp Cys Asn Thr Cys
        420                 425                 430Val Thr Gln Thr Val Asp Phe Ser Leu Asp Pro Thr Phe Thr Ile Glu
    435                 440                 445Thr Ile Thr Leu Pro Gln Asp Ala Val Ser Arg Thr Gln Arg Arg Gly
450                 455                 460Arg Thr Gly Arg Gly Lys Pro Gly Ile Tyr Arg Phe Val Ala Pro Gly465                 470                 475                 480Glu Arg Pro Ser Gly Met Phe Asp Ser Ser Val Leu Cys Glu Cys Tyr
            485                 490                 495Asp Ala Gly Cys Ala Trp Tyr Glu Leu Thr Pro Ala Glu Thr Thr Val
        500                 505                 510Arg Leu Arg Ala Tyr Met Asn Thr Pro Gly Leu Pro Val Cys Gln Asp
    515                 520                 525His Leu Glu Phe Trp Glu Gly Val Phe Thr Gly Leu Thr His Ile Asp
530                 535                 540Ala His Phe Leu Ser Gln Thr Lys Gln Ser Gly Glu Asn Leu Pro Tyr545                 550                 555                 560Leu Val Ala Tyr Gln Ala Thr Val Cys Ala Arg Ala Gln Ala Pro Pro
            565                 570                 575Pro Ser Trp Asp Gln Met Trp Lys Cys Leu Ile Arg Leu Lys Pro Thr
        580                 585                 590Leu His Gly Pro Thr Pro Leu Leu Tyr Arg Leu Gly Ala Val Gln Asn
    595                 600                 605Glu Val Thr Leu Thr His Pro Val Thr Lys Tyr Ile Met Thr Cys Met
610                 615                 620Ser Ala Asp Ser Ser Ser Ser Cys Ser Thr Trp Val Leu Val Gly Gly625                 630                 635                 640Val Leu Ala Ala Leu Ala Ala Tyr Cys Leu Ser Thr Gly Cys Val Val
            645                 650                 655Ile Val Gly Arg Ile Val Leu Ser Gly Lys Pro A1a Ile Ile Pro Asp
        660                 665                 670Arg Glu Val Leu Tyr Arg Glu Phe Asp Glu Met Glu Glu Cys
    675                 680                 685

Claims (20)

1.一种组合物，其包含病毒唑以及SEQ.ID.NO.：16的核酸。
2.一种组合物，其包含病毒唑以及SEQ.ID.NO.：17的肽。
3.一种组合物，其包含病毒唑以及SEQ.ID.NO.：13的核酸或其至少18个连续核苷酸长度的片段。
4.一种组合物，其包含病毒唑以及SEQ.ID.NO.：1的肽或其至少6个连续氨基酸长度的片段。
5.一种组合物，其包含病毒唑和抗原。
6.权利要求5的组合物，其中所述抗原是核酸。
7.权利要求5的组合物，其中所述抗原是肽。
8.权利要求6的组合物，其中所述核酸来源于选自甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)以及丙型肝炎病毒(HCV)的病毒。
9.权利要求7的组合物，其中所述肽来源于选自甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)以及丙型肝炎病毒(HCV)的病毒。
10.权利要求5的组合物，其中所述抗原是对应于选自乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、肝炎核心抗原(HBcAg)以及肝炎E抗原(HBeAg)的抗原的核酸或肽。
11.权利要求7的组合物，其中所述肽包含选自SEQ.ID.NO.：1-12的序列的至少3个连续氨基酸。
12.权利要求6的组合物，其中所述核酸包含选自SEQ.ID.NO.：13-15的序列的至少9个连续核苷酸。
13.增强对丙型肝炎抗原免疫应答的方法，其包含：
鉴定需要增强的对丙型肝炎抗原免疫应答的动物；以及
提供给所述动物包含病毒唑以及SEQ.ID.NO.：16的核酸的组合物。
14.增强对丙型肝炎抗原免疫应答的方法，其包含：
鉴定需要增强的对丙型肝炎抗原免疫应答的动物；以及
提供给所述动物包含病毒唑以及SEQ.ID.NO.：17的肽的组合物。
15.增强对丙型肝炎抗原免疫应答的方法，其包含：
鉴定需要增强的对丙型肝炎抗原免疫应答的动物；以及
提供给所述动物包含病毒唑以及SEQ.ID.NO.：13的核酸或其至少18个连续核苷酸长度的片段的组合物。
16.增强对丙型肝炎抗原免疫应答的方法，其包含：
鉴定需要增强的对丙型肝炎抗原免疫应答的动物；以及
提供给所述动物包含病毒唑以及SEQ.ID.NO.：1的肽或其至少6个连续氨基酸长度的片段的组合物。
17.制备疫苗的方法，其包含：
提供病毒唑；
提供SEQ.ID.NO.：16的核酸；以及
混合所述病毒唑以及所述核酸以配制所述疫苗。
18.制备疫苗的方法，其包含：
提供病毒唑；
提供SEQ.ID.NO.：17的肽；以及
混合所述病毒唑以及所述肽以配制所述疫苗。
19.制备疫苗的方法，其包含：
提供病毒唑；
提供SEQ.ID.NO.：13的核酸或其至少18个连续核苷酸长度的片段；以及
混合所述病毒唑以及所述核酸以配制所述疫苗。
20.制备疫苗的方法，其包含：
提供病毒唑；
提供SEQ.ID.NO.：1的核酸或其6个连续氨基酸长度的片段；以及
混合所述病毒唑以及所述核酸以配制所述疫苗。
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