CN1477190A - 控制细胞融合的方法和相关组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种当成肌细胞注射到退化病患者体内一个或多个肌肉后控制、启动或促进细胞融合的方法。通过人为地增加大6－硫酸软骨素蛋白多糖(LC6SP)的浓度至患者内源性浓度水平之上，便能增强和控制被转移的供体成肌细胞之间或其与其它类型细胞之间的融合。本发明还提供用于控制身体部位的大小、形状或密度的组合物，其中含有培养的成肌细胞和脂肪细胞。

Description

控制细胞融合的方法和相关组合物
相关申请
本申请是1994年12月13日提交的美国专利申请No.08/354,944的部分延续。该参考文献在此引入作为参考。
                     本发明的背景
本发明的领域
本发明涉及治疗致弱的、致死性的、遗传性的、退化性的和/或不良的哺乳动物疾病的组合物和方法。具体地说，本发明涉及将正常的、或遗传工程转导的、或细胞系转换(cytocline-converted)的生肌细胞移植到功能障碍的和/或退化的组织或器官。
现有技术的描述成肌细胞特性
在哺乳动物中，成肌细胞是唯一的一种分布广泛、可迁移、自然融合形成合胞体、融合后迅速失去其主要组织相容性一级抗原(MHC-1)、并发展至占人体50％体重的细胞。这些特性使得成肌细胞可以理想地用于基因转移和体细胞治疗(SCT)。成肌细胞治疗是体细胞治疗和基因治疗的结合。成肌细胞治疗
虽然成肌细胞/卫星细胞在肌肉生成和肌肉再生中的作用可追溯到20世纪六十年代初(Konigsberg，I.R.，科学，140：1273(1963)。Mauro，A.J.，Biophys.Biochem.Cytol.，9：493-495(1961))，但其用于动物的治疗直到1978年才见报道(Law，P.K.，Exp.Neurol.，60：231-2431978))。
1990年2月15日，首例成肌细胞转移治疗(MTT)一位患杜兴氏肌营养障碍(DMD)的男孩，标志着人类基因转移的首例临床试验。已报道其成功(Law.P.K.等人，Lancet，336：114-115(1990)；Kolata，G.纽约时报，，星期天，(1990年6月3日))。骨髓移植严格地以正常细胞取代遗传异常的细胞，与之不同，成肌细胞转移治疗通过自然的细胞融合实际上将供体成肌细胞核内的所有正常基因插入到营养障碍肌纤维中而修复它。此外，供体的成肌细胞之间也相互融合，形成遗传正常的肌纤维以取代退化的部分。这样，通过再生的自然发展过程，全部正常基因被整合到异常细胞和异常器官中。
美国专利局1992年7月14日给本发明人授予了名为“治疗肌肉退化及虚弱的组合物和方法”的专利(#5,130,141)。
1993年10月，食品及药物管理局(FDA)正式地开始管理体细胞治疗(SCT)，将之定义为：“经繁殖、扩增、筛选、药物处理、或通过间接体外生物学特征筛选的自体固有的、异常发生的、或异体的细胞，用于人体预防、处理、治疗、诊断、或减轻疾病或损伤”。(联邦注册，58：53248-53251(1993))。
成肌细胞转移治疗(MTT)属于体细胞治疗(SCT)的范围，成肌细胞及其自然的、遗传工程的或化学的衍生物成为潜在治疗哺乳动物疾病的生物学方法。
1994年5月25日，FDA准予细胞治疗研究基金会(CTRF)对每个患者收费63806美元。CTRF是由本发明人于1991年创建的一个非赢利的研究基金会。FDA批准CTRF向这些临床试验患者收取治疗费用，对于建立MTT和CTRF应得到的科学可信度是极为重要的，引用1994年6月17日Memphis健康治疗新闻的一段话：“很少批准允许为一项研究性产品付费”，FDA发言人Monica Revelle说，“申请人必须经过许许多多的过程，而且必须有在一系列近于科学幻想的研究之后看来似乎可行的产品。这主要用于支持对小公司的有前途的技术进行试验”。这是关于CTRF研究的描述。
现在，CTRF正在进行第一项、也是唯一的FDA批准的申请MTT的研究中新药(IND)的人体临床试验。这对于认识CTRF已经和FDA在用于遗传细胞治疗的该IND的批准过程中为建立标准和政策进行了密切的合作，是极为重要。用病毒载体介导的基因治疗用于人类神经肌肉疾病还没有通过FDA批准。用成肌细胞进行细胞治疗
细胞是所有生命的基本单位。生命正是由这些无数的小实体形成的。用人类的巨大智慧和知识，我们还不能从非生命的成分，如DNA、离子和生化物质生产出活的细胞。
细胞培养是已知的人类能够体外复制细胞的唯一方法。用适当的技术和预防措施，可以培养正常细胞或转化细胞至足够量以修复和代替退化和损伤的组织。
细胞移植弥补体外和体内系统间的间隙，并使得“新生命”能在已有遗传缺陷或机体损伤的生命体内的退化组织或器官繁殖。
细胞融合将细胞核内所有正常的基因，象送去一个修理盒一样，转移到异常细胞内。为了正确安装及进一步操作，染色体上的软件还需要其它细胞器作为硬件来操作，认识到这一点非常重要。
细胞融合后，基因缺陷的修正自发地发生在细胞水平。全部80,000个正常基因的自然整合、调控和表达，将正常表型传递给异核体。因为宿主基因组具有遗传缺陷，宿主基因组不能产生的蛋白质或因子是由供体的正常基因组产生的。来源于其它基团表达的不同辅因子证实了正常表型的恢复。用成肌细胞进行基因治疗
本发明人在用成肌细胞作为基因转移的载体方面已经作了广泛研究。在哺乳动物中，成肌细胞是唯一的一种分布广泛、可迁移的、自然融合形成合胞体，融合后迅速失去MHC-1抗原，并发展至占人体50％体重的细胞。这些复合特性使其可理想地用于基团转移。
正常细胞核的自然转导确保DMD患者的营养障碍蛋白(dystrophin)和相关蛋白质在细胞水平的有序取代。这种理想的基因转移过程对于肌肉而言是独有的。毕竟在人体内只有成肌细胞能够融合并且唯有肌纤维是多核的。正是利用了这些固有的特征，MTT才能转移所有正常基因以有效地进行基因修复。在MTT中供体的成肌细胞间相互融合，形成正常肌纤维，肌肉也从加入遗传正常细胞获益。成肌细胞治疗是未来医学
健康是所有人体细胞处理良好状态。在遗传性或退化性疾病中，病态细胞需要修复，死亡细胞需要取代，以保持健康。
细胞培养是产生新的、活的细胞，使之移植到人体后能够存活、发展、并具正常功能、取代失去功能的退化细胞的唯一途径。
成肌细胞是人体内唯一能够进行自然细胞融合的细胞。自然细胞融合使全部正常基因转移至遗传缺陷细胞，通过弥补缺陷进行有效的表型修复。DMD的MTT治疗法是第一个安全、有效的人类基因治疗法。用MTT转移其它基因及其启动子/增强子用以治疗其它疾病的工作正在进行。成肌细胞是有效、安全、通用的基因转移载体，因为它对于机体是内源性的。由于外源性基因总能在细胞内发挥其作用，细胞治疗将永远是通向健康的常用途径。毕竟细胞是生命的基础。
DMD：疾病示例
DMD是一种遗传的、退化的、使人衰弱的、致死的和不良的哺乳动物疾病。它以进行性肌肉退化和力量减弱为特征。这些症状开始于3岁或更小并贯穿整个病程。每3300名男性人口中有1人由于DMD而衰弱并死亡，DMD是居第二位的人类最常见的致死性遗传疾病。典型的DMD患者在12岁靠轮椅代步，75％的患者在20岁前死亡。由于伴有呼吸肌退化，不能吸入足够氧气和排除肺部感染，肺炎通常是DMD的急性死因。10％的DMD患者在青春期中段发展至心肌病症状。18岁前，所有DMD患者发展为心肌病，但心衰很少是原发死因。
1950年前，对80多种化合物进行了评价并报道有33种可能有效(Milhorat.A.T.，哥伦比亚地区医学年鉴，23：15(1954))。没有一种现在仍在使用(Wood，D.S.，In：Kakulas，B.A.and Mastaglia，F.L.，eds.：杜兴氏和贝氏肌营养障碍的病理和治疗。New York：RavenPress；85-99(1990))。未肯定的DMD治疗报道有用维生素、氨基酸(Van  Meter.J.R.，加州医学，79：297(1953))，ATR(Nakahara，M.，Arzneim.Forsch.，15：591(1965))，辅酶Q(Folkers，K.等人，Excerpta Med.Int.Congr.Ser.，334：158(1974))，腺苷酸琥珀酸(Bonsett，C.A.，印第安那医药，79：236(1986))，以及生长激素抑制剂(Coakley，J.H.等人，Lancet，1(8578)：184(1988))。筛选了数百种药物(Wood，同上)，一些研究表明类固醇是有效的(Entrikin，R.K.等人，肌肉神经，7：130-136(1984))。
首次报道强的松对DMD有效大约已有20年(Drachman，D.B.等人，Lancet，2：1409-1412(1974))。研究者报道，强的松能延缓退化过程，而且在一些病例中甚至短暂地增强肌肉力量。这些证明强的松效果的证据不是没有争议(Munsat，T.L.and Walton，J.N.，Lancet，1：276-277(1985)；Rowland，L.P.，Lancet，1：277(1975)；and  Siegel，I.M.等人，I.M.J.145：32-33(1974))。虽然强的松的作用机制还没有确定。强的松引起的众多的副作用，以及长期使用引起的反作用，已经超过了报道的有争议的正面效果。
基因操作和基因转移是正在被用来治疗遗传性和退化性疾病的另一途径。然而，这种治疗方法应用于DMD的临床仍需要相当长一段时间(Law，P.K.In：Kakulas，B.A.等人，eds.：杜兴氏和贝氏肌营养障碍的病理和治疗。纽约：Raven Press，190(1990)；and Watsson，J.D.等人，重组DNA.New York：W.H.Freeman and Co.；576(1992))。据称肌肉内注射DNA获得成功(Acsad：G.等人，自然，352：815-818(1991)；and Wolff，J.A.等人，科学，247：1465-1468(1990))而动脉内释放不成熟的肌细胞(或称为成肌细胞)到骨骼肌(Neumeyer，A.M.等人，神经学，42：2258-2262(1992))则极为有限并仍存疑问。试图使用转染的自身固有的成肌细胞导致了较低的功效以及转染过程中产生突变(Barr，E.and Laideh，J.M.，科学，254：1507-1509(1991)；Dhawom，J.等人， 自然，254：1509-1512(1991)；and Smith，B.F.等人，分子细胞生物学，10：3268-3271(1990))。这种途径将难以产生足够的生肌细胞以提供全身成肌细胞转移疗法(MTT)治疗DMD病人(Law，同上)。基于转基因鼠研究的囊性纤维变性(CF)的临床试验目前正在进行(Hyde，S.C.等人，同上，362：250-255(1993))。严重联合免疫缺陷病(SCID)的基因治疗的临床试验也已经进行。CF和SCID的遗传缺陷是通过酶缺失介导的，与之不同，DMD的遗传缺陷表现为细胞膜上的称之为营养障碍蛋白的结构蛋白的缺失，而不是调节蛋白缺失。
虽然营养障碍蛋白在评价肌肉改善方面可作为一个好的遗传学/生物化学指征(Hoffman，E.P.等人，Cell，51：919-928(1987))，但营养障碍蛋白的替换仅构成治疗过程的一部分。这已经被本发明者和其他人用MTT在对以下对象的实验中证实：mdx鼠(Chen，M.等人，细胞移植，1：17-22(1992)；Karpati，G.等人，美国病理杂志，135：27-32(1989)；and Patridge，T.A.，等人，自然，337：176-179(1989))以及人(Gussoni，E.，等人，自然，356：435-438(1992)；Huard，J.等人，临床科学，81：287-288(1991)；Huard，J.等人，肌肉神经，15：550-560(1992)；Law，P.K.等人，Lancet，336：114-115(1990)；Law P.K.et al.，Acta  Paediatr.Jpn.，33：206-215(1991)；Law P.K.et al.，Adv.临床神经科学，2：463-470(1990)；Law，P.K.et al.，In：Angelini，C.et al.，eds.肌营养障碍研究。纽约：Elsevier科学出版社，109-116(1991)；and LawP.K.et al.，Acta Cardiomilogica，3：281-301(1991))。由于DMD的病理是肌肉的退化和衰弱，结构尤其是功能的改善是首先需要考虑的。这两个参量已经被用dy2Jdy2J营养障碍鼠作为遗传性肌肉退化的动物模型进行了广泛的研究(Law，P.K.，实验神经学，60：231-243(1978)；Law，P.K.，肌肉神经，5：619-627(1982)；Law，P.K.et al.，移植进展，20：1114-1119(1988)；Law，P.K.et al.，In：Griggs，R.C.；Karpat；G.，eds.成肌细胞转移治疗。New：Plenum Press；75-87(1990)；Law，P.K.et al.，肌肉神经，11：525-533(1988)；Law，P.K.et al.，In  Kakulas，B.A.；Mastaglia，F.L.，eds.杜兴氏和贝氏肌营养障碍病理和治疗，纽约：Raven Press；101-118(1990)；andLaw，P.K.and Yap，J.L.，肌肉神经，2：356-363(1979))。这些研究导致了首例MTT临床试验或单肌肉治疗(SMT)(Gussoni，E.et al.，自然，356：435-438(1992)；Huard，J.et al.，临床科学，81：287-288(1991)；Huard，J.et al.，肌肉神经，15：550-560(1992)；Law，P.K.，et al.，Lamcet.336：114-115(1990)；Law，P.K.et al.，Acta Paediatr.Jpn.，33：206-215(1991)；Law，P.K.et al.，高级临床神经科学，2：463-470(1992)；Law，P.K.et al.，In：Angelini，C.et al.，eds.肌营养障碍研究，纽约：Elsevier SciencePublishers：109-116(1991)；and Law，P.K.et al.，ActaCardiomiologica 3：281-301(1991))。
本发明者通过下肢治疗实验，对MTT的可行性、安全性和有效性进行了评价。病例包括32位年龄在6-14岁的男性患者，其中一半不能步行(Law，P.K.et al.，细胞移植，2：485-505(1993))。通过48次注射，将50亿(55.6×106/ml)个正常成肌细胞转移到每个病者的双下肢的22个主要肌肉中。除其他情况外，MTT治疗9个月后结果表明，(1)MTT是一种安全的治疗方法；(2)改善了DMD患者的肌肉功能；(3)50亿以上的成肌细胞对于改善6～14岁DMD男性患儿的双下肢肌肉力量是必要的。其它疾病状况
MTT可能对任何遗传性疾病均有效。通过自然的细胞融合，将供体成肌细胞的全部正常基因插入到遗传功能异常细胞内去修复它。缺陷基因的启动子和增强子将被提供、或激活、或抑制，以获得基因转录和翻译从而使移植和生肌细胞中释放激素或酶。同样地，能产生出结构蛋白以预防或减轻疾病症状。
转导的成肌细胞可以被选择使用。其过程包括a)从患者体内取肌肉活组织，b)用正常基因转染一个“种子”量的卫星细胞，c)确定转染细胞的生肌性，d)扩增被转染的成肌细胞至足够产生有效作用的数量，以及e)将成肌细胞施入患者体内。
反转录病毒载体已被用于在原代培养时，在允许转染的成肌细胞分化为表达转移的基因的肌管的条件下，将基因转导到鼠和狗的成肌细胞内(Smith，B.F.et al.，分子细胞生物学，10：3268-3271(1990))。而且，小鼠注射了转染了人生长激素(hGH)的鼠成肌细胞后，在肌肉和血清中表现出显著的hGH水平，并保持3个月(Dhawan，J.et al.，科学，254：1509-1512(1991)；Barr E.and J.M.Leiden，科学，254：1507-1509(1991))。
经转导的成肌细胞的转移受一种类似于腺苷脱氨酶(ADA)缺损途径的激励。在ADA缺损状态下，来自患者的T细胞功能性ADA基因转染后，通过对已转染细胞进行细胞培养增殖，再回输给患者(Culver，K.W.et al.，移植进展，23：170-171(1991))。
用遗传工程转导的成肌细胞治疗其它疾病的类似途径也已进行了动物试验，如血友病B(Yao，S.N.et al.，基因治疗，1：99-107(1994))，心肌病(Marelli，D.，细胞移植，1：383-390(1992)；Koh，G.Y.et al.，临床观察杂志，92：1548-1554(1993))，贫血(Hamamori，Y.et al.，人类基因治疗，5：1349-1356(1994))。毫无疑问，成肌细胞治疗将用于许多遗传性疾病的治疗。
成肌细胞虽然已分化，但仍然是能去分化或甚至转换的胚细胞。最近表明成肌细胞在骨形成蛋白-2作用下可以转化为成骨细胞(Katagiri，T.et al.，J.Cell Biol.，127-1755-1766(1994))。该研究表明，细胞素转化的成肌细胞可用于骨/软骨退化疾病患者的治疗。相应地还表明，鼠的皮肤成纤维细胞可转化为生肌细胞谱系(Gibson，A.J.et al.，J.细胞科学，108：207-214(1995))。
用成肌细胞转移治疗方法治疗癌症和II型糖尿病的糖尿症的有关应用在下文描述。为什么进行成肌细胞治疗
在遗传性或退化性疾病中，基因缺陷导致细胞随时间退化并死亡。有效的治疗不仅必须修复退化的细胞，而且要补充死亡细胞。这最好是通过遗传上正常的细胞的移植或体细胞治疗方法来实现。分子遗传学的出现促进了单基因操作，后者目前正被探索用于治疗遗传性疾病。象药物一样，单基因操作不能补充失去的细胞，而且能证明这种途径可修复退化细胞的证据非常有限。
在美国专利No.5,130,141中，发明者首次公开了治疗肌肉退化和衰弱的组合物和方法。该组合物包括将从供体获得的遗传正常的成肌细胞注射到患有遗传性神经肌肉紊乱患者宿主的一个或多个肌肉组织中。注入后肌肉结构和功能显著地改善，从而预防和减轻肌肉虚弱，后者是导致遗传性肌肉营养障碍患者致残和呼吸衰竭的主要原因。这种将遗传正常的肌肉细胞移植到患遗传性肌肉营养障碍患者的病态肌肉的方法被称为MTT。
MTT与通常的单基因转移形式在许多方面有显著不同。在单基因治疗中，低分子的、小的营养障碍基因的单基因拷贝被作为病毒的轭合物转导到成熟的营养障碍的肌纤维中，该肌纤维缺失许多蛋白质，包括结构蛋白和调节蛋白。多基因插入对于修复这些缺失蛋白是必要的(图1)。需要更多的基因插入以产生辅因子来调节和表达这些失去的蛋白，从而修复退化的细胞。
                    发明概要
成肌细胞转移治疗MTT的初步的可行性、安全性和有效性的结果(Law et al.，细胞移植，2：485(1992))促使本发明人开始了一项全身整体试验(WBT)，分别将250亿个成肌细胞注射到64例杜兴氏肌肉营养障碍(DMA)男孩和1例婴儿面肩胛骨营养障碍(IFSH)男孩的体内。得到FDA和Essex IRB(IND II期)认可的随机的双育法临床试验方案包括两个MTT疗程，间隔3～9个月。每个疗程进行200次注射或释放125亿个成肌细胞至患者上肢的28块肌肉(VBT)或者下肢的36块肌肉(LBT)。注射的肌肉包括颈部、肩部、背部、胸部、腹部、臂部、臀部和腿部肌肉。每次MTT疗程后受试者口服环孢菌素3个月。在过去的17个月里，1例IFSH和10例DMD男孩接受了全身整体治疗试验(WBT)，另外20例DMD男孩接受了UBT或LBT，未出现有害作用。这些初步结果表明WBT是可行和安全的。育法试验将继续进行，直到研究结束，以确定哪一组的肱二头肌或股四头肌接受了成肌细胞或安慰剂，在MTT治疗3～9个月的一次组织活检中已有5例表现出有肌营养缺陷蛋白的免疫细胞化学证据。而对应组的肌肉活组织检查表现没有肌营养缺陷蛋白。MTT治疗后3～6个，超过80％的受试者的肺功能(FVC)表现无衰退或者增强了15～25％。约50％受试者报告在跑步、平衡、爬梯和打球方面行为改善。1例14岁DMD受试者在MTT治疗后不需要轮椅就可以活动(Law，P.K.et al.，美国神经移植科学摘要，p27(1995)；Law，P.K.et al.，应用细胞生物化学，21A：367(1995))。
施用300亿成肌细胞于受试人的可行性和安全性的结果为成肌细胞用作生物学方法治疗人类疾病提供了关键性的证据。剂量效应结果进一步证明了这一设想：成肌细胞治疗能用来治疗各种不同的遗传性、退变性、致弱性、致死性或不良的哺乳动物疾病。
本发明提供了为遗传性或退化性疾病患者，尤其是那些以肌肉功能障碍、退化和虚弱为特征的患者，修复退化细胞和补充失去的细胞的组合物和方法。在实施本发明时，任何生肌细胞均可采用，无论其是否来源于骨骼肌、平滑肌或心肌。转移的细胞类型包括成肌细胞、肌管和/或幼肌纤维。生肌细胞可以是原代培养的或克隆自正常供体的肌肉活检组织。它们还可以是细胞素转化或遗传性转导的生肌细胞。典型情况是父母、同胞或朋友作为肌营养障碍患者的供体。此外，计划通过建立优选成肌细胞的细胞系，无论来源于人还是动物，为没有合适供体的患者提供准备好的健康供体的细胞，(图2-5，Law，P.K.成肌细胞转移，Lamdes，Austin，(1994))。进一步期望细胞移植疗程将改善大小、形状、外观或功能，和/或减轻病情。
本发明还提供了一种当成肌细胞注射到退化病患者体内一个或多个肌肉后控制、启动或促进细胞融合的方法。通过人为地增加大6-硫酸软骨素蛋白多糖(LC6SP)的浓度至患者内源性浓度水平之上，便能增强和控制被转移的供体成肌细胞之间或其与其它类型细胞之间的融合。(Law，P.K.，成肌细胞转移Lamdes，Austin(1994))。本发明的另一目标是提高宿主细胞和供体细胞之间的融合率。为此进行了不同的注射方法试验和比较，包括斜穿肌纤维、垂直于肌纤维表面、平行于肌纤维、和仅限于肌肉的某一点。目的是以最少的注射获得最多的细胞融合(图6-8，also Law，P.K.，Myoblast Transfer，Lamdes，Austin，(1994))。
在进一步的实施方案中，体外受精及胚胎分裂球重组技术能用于已知的杜兴氏病携带者以增加其拥有正常孩子机会。(图9～13；alsoLaw，P.K.，成肌细胞转移，Lamdes，Austin，(1994))。
本发明的另一目标是提供一种自动细胞处理器，一种生产大量(一个循环超过1000亿)的活的、无菌的、遗传功能正常的、功能性的生肌细胞的方法。它们是经过基因转化或细胞素转导的。这种细胞处理器有一个保持不同人体组织的活组织的输入系统。该细胞处理器的计算机可以编程，以处理组织、控制时间、空间、培养成分的比例以及设备仪器的功能。在该过程中可随时监测细胞状况。输出系统提供适于作细胞转移治疗用的或商用的细胞产品。(图14～15)。
另一个实施方案是成肌细胞和/或其自然的、遗传的、化学的衍生物被用来治疗癌症。图16-18说明暴露于成肌细胞融合介质的黑素瘤癌细胞死亡。根据Greenwald，P.，Kramer，B.S.和Weed，D.L.编著的《癌症预防和控制》(Marcel Dekker公司，纽约，1995)，虽然所有其它器官都曾发现有恶性肿瘤和转移性，但骨骼肌似乎没有癌肿。极少数的肉瘤病例报道是少见的例外现象。
MTT治疗9个月后DMD患者肌肉的营养障碍蛋白的免疫细胞化学证据说明成肌细胞治疗能引起长期的基因缺陷修复(图19)。这一特性可用于治疗II型糖尿病胰岛素抗性功能异常的肌肉。作为一种通用的基因转移载体，供体的成肌细胞插入全部正常基因组，使之能修复任何功能异常的骨骼肌细胞，使得它们恢复正常的胰岛素敏感性(图20)。
其它特性和优越性通过和将通过优选的实施方案和附图的详细描述来说明和表现。而且，这里描述的所有参考文献都被引入作为参考。
                   附图简述
图1是DMD患者肌肉细胞不同于正常细胞的一些已知蛋白缺损简图。这些缺损蛋白包括DMD患者减少或缺失的膜结构蛋白，如营养障碍蛋白(DIN)、营养障碍蛋白相关蛋白(DRP)和营养障碍相关糖蛋白(DAG)，在DMD患者血清水平升高的酶，如肌酸磷酸激酶(CPK)、醛缩酶(ALD)和天门冬酰胺转移酶(AST)，以及线粒体蛋白(Mito)的不同型。虽然这些蛋白缺损是由于营养蛋白基因缺损而原发或继发产生，但其修复即需要多基因(G1～G7)转移。
图2说明MHC阴性成肌细胞和MHC阳性成肌细胞。(A)表示用抗MHC I级抗体分析人成肌细胞并在荧光显微镜下观察。箭头指示MHC阴性成肌细胞。(B)是同样涂片在常规光学显微镜下观察。箭头指示MHC阴性成肌细胞。线长＝20μm。
图3说明用细胞荧光计(cytofluorometry)分析成肌细胞。对照组：没有抗MHC I级抗体的成肌细胞反应。样本组：有抗MHC I级抗体的成肌细胞反应。
图4是细胞荧光计表现的MHC-1抗原阴性的成肌细胞分离的散布简图。
图5说明经细胞荧光计分散后两组成肌细胞的荧光强度。(A)代表MHC阳性成肌细胞。(B)代表MHC阴性或微弱表达的成肌细胞。(A)和(B)经同样放大并且图象经过同样过程处理。线长＝30μm。
图6表示决定成肌细胞分布的注射的角度(A)将成肌细胞斜向注射到受体肌细胞覆盖尽可能广的区域而且漏出最少，释放供体成肌细胞，引起最多的嵌合纤维的形成。(B)横向注射释放供体成肌细胞至大量肌纤维，但覆盖较小的区域并且似乎更容易引起注射渗漏。(C)纵向注射导致供体成肌细胞之间相互融合，形成较少的嵌合体肌纤维。(D)局部注射仅产生小范围少数受体肌纤维可接受到供体成肌细胞。
图7说明用荧光金(FG)标记的供体成肌细胞核以及在MTT治疗后7天出现在宿主肌肉中的情况。(A)带有供体和受体肌细胞核的嵌合体肌纤维(黑箭头)以及带有供体肌细胞核的肌管(白箭头)。(B)带有供体(白箭头)和受体(黑箭头)肌核的嵌合体肌纤维。
图8说明以FG标记的供体成肌细胞在宿主肌肉的分布。即使斜形注射成肌细胞也能获得供体成肌细胞分布(A，B)，或者供体成肌细胞核出现在斑中(C，D，白箭头)，该斑渐渐地表现出越来越多的正常核和碎屑。(C)表示垂直注射以及(D)表示纵向注射。
图9说明两种不同形成机制的异型细胞的产生过程。
图10说明了3种不同结果：1是正常的，1是异型的，1是营养障碍的(自顶至底)。
图11说明正常、异型和营养障碍的比目鱼肌在80Hz电刺激时最大等长收缩和强直性紧张的生理记录。异型肌收缩的记录类似正常的、超过营养障碍肌收缩的记录。
图12说明异常鼠的比目鱼肌横断面表现出DMD携带者肌肉特征的有核肌纤维(箭头)。虽然大多数肌纤维仍表现正常，但也表现出一些退化特征，如纤维断裂和中央核化。
图13进一步说明异常鼠的比目鱼肌横断面表现出DMD携带者肌肉特征有有核肌纤维(箭头)。虽然绝大多数肌纤维仍表现正常，但仍可见一些退化特征，如纤维断裂和中央核化。
图14说明自动细胞处理器的总体布局。
图15说明培养和收获自动操作的详细设计。
图16是用癌细胞生长介质和成肌细胞生长介质在培养黑素瘤细胞(CRL 6322)方面的比较。(A、C、E、G)低倍放大；(B、D、F、H)高倍放大。(A、B)黑素瘤细胞在癌细胞生长介质中培养9天，其数量、伸长形状和分化过程证明其表现仍然健康。(C、D)相同数量的黑素瘤细胞在成肌细胞生长介质中种植和培养9天，数量更多并分化。(E、F)在癌细胞生长介质中14天后，大量的黑素瘤细胞变为球形并从表面脱离，表明细胞已死亡(E)。在高倍放大下，仅很少健康细胞残存(F)。(G、H)在成肌细胞生长介质中14天后，黑素瘤细胞仍表现较大数量并健康。
图17说明成肌细胞和黑素瘤细胞(浓度比2∶1)在成肌细胞生长介质中共培养。(A，C)低倍放大；(B，D)高倍放大。(A，B)培养9天后，成肌细胞和黑素瘤细胞数量多并保持分化。(C，D)培养14天后，成肌细胞占培养优势，黑素瘤细胞仍存活。
图18说明成肌细胞和黑素瘤细胞在成肌细胞生长介质中共培养4天，然后在成肌细胞融合介质中共培养。(A、C、E、G)低倍放大；(B、D、F、H)高倍放大。(A、B)成肌细胞和黑素瘤细胞(1∶1浓度比)在成肌细胞融合介质中培养5天后。许多黑素瘤变成球形并从表面脱离，在此介质中不存活。成肌细胞仍健康并开始融合。(C、D)成肌细胞和黑素瘤细胞(1∶1浓度比)在成肌细胞融合介质中培养10天后出现大量死亡细胞。仅少数能在此介质中活存这么长时间，并且它们分离并死亡(D)。(E、F)成肌细胞和黑素瘤细胞(1∶1浓度比)在成肌细胞融合介质中培养19天后，活存的成肌细胞保持其纺锤形并相互紧密排列。黑素瘤细胞则变成球形并脱离。(G，H)成肌细胞和黑素瘤细胞(3∶1浓度比)在成肌细胞融合介质中培养19天后，成肌细胞开始融合，形成肌管。
图19是人肌肉营养障碍蛋白的免疫细胞化学证据。在正常对照肌肉出现营养障碍蛋白定位于肌纤维膜(A)，而在DMD肌肉则不然(B)。(C，D)取自MTT受试者的DMD肱二头肌，在组织活检前9个月该受试者一侧肱二头肌注射MTT，而另一侧注射安慰剂。由于盲法试验要持续到该研究结束，所以MTT肌肉的标示还没有显露出来。然而，仅一个肌肉表现出营养障碍蛋白的肌纤维定位。(B)，(C)和(D)是有意过度曝光以表明免疫反应的背景因素与肌纤维膜无关。
图20说明(a)正常骨骼肌细胞通过胰岛素的葡萄糖代谢。(b)对于II型糖尿病，主要的胰岛素抗性后遗症是降低了肌肉对葡萄糖的摄取。肌肉内葡萄糖转运异常是可能的。已知胰岛素介导的酪氨酸激酶激增和自动磷酸化被减弱。后面的这些缺陷能够通过MTT的正常基因表达来修正。(代谢6∶6，1993)。
                 优选实施方案的详细描述
这里所描述的组合物和方法将被用于治疗患有遗传性神经肌肉疾病的患者的说明。但本发明的组合物和方法也可能被用于治疗其它宿主和其它疾病。
A.受控的细胞融合
成肌细胞有与其它细胞融合的独特的能力。通过使用正常的成肌细胞，经细胞融合将全部正常基因成分导入任何遗传功能异常的细胞内。例如，遗传异常细胞可以是肝细胞、心肌细胞或甚至脑细胞。该设想是将全部正常基因成分转移到异常细胞，并因此在基因水平，而不是在激素或生化水平治疗遗传性疾病。
对于治疗由于结构蛋白异常而不是调节蛋白异常的遗传性疾病，当成肌细胞注射到体内时、控制、启动或促进细胞融合是有用的。已知在低血清浓度培养时成肌细胞已可以融合。在体内环境中该过程更为复杂。当成肌细胞在肌肉内注射至细胞外基质(ECM)时，注射创伤导致基础成纤维细胞生长因子(bFGF)和大6-硫酸软骨素蛋白多糖(LC6SP)的释放(Young，H.E.，et al.，J.Morph.，201：85-103(1989))。后面得到的这些生长因子刺激成肌细胞增殖，不幸的是，它们也刺激那些在营养障碍肌肉中已经存在的大量激增的成纤维细胞的增殖。因此有必要用MTT方法注射尽可能纯净的成肌细胞而不污染纤维细胞。
通过在转移部位人为地增加LC6SP的局部浓度至内源性水平以上，可以获得控制下的细胞融合。在肌肉内，可以通过在转移介质中加入约5μM的LC6SP来实现。此外，胰岛素在体外促进该发展的进程，并可导致在成肌细胞注射后迅速形成肌管。在转移介质中LC6SP的使用(从约5μM到大约5mM)将可能导致MTT的巨大成功。
B.成肌细胞：通用的基因转移载体
由于MTT导致体内基因转移时遗传性镶嵌的形成，体外异核体的产生具有广泛的医学应用。这可以通过使用成肌细胞控制细胞融合来达到。
本研究涉及在培养器中将供体成肌细胞正常胞核的全部正常基因转移到遗传性正常和/或异常的细胞，例如心肌细胞。该进展尤其重要的是，考虑到在大约10％的DMD患者中，心肌病症发生在青春期。到18岁，所有DMD患者发展至心肌病。无疑，取代已退变的和正在退变的心肌细胞的能力对于甚至正常人群的心脏治疗都具有巨大的影响，因为供移植的心脏非常短缺。
正常心肌细胞在体内和在体外具有非常有限的增殖能力。心脏病或遗传性心肌病造成的心肌损伤不能通过再生来自我修复。通过整合骨骼肌细胞特征，有丝分裂，异核体的心肌细胞将能在体外增殖。
正常成肌细胞和正常心肌细胞间受控的细胞融合可导致异核体表现出两种父辈生肌细胞型的特征。细胞移植后，在经过体外有丝分裂形成桥粒、间隙连接和同步强烈收缩的能力基础上，可选择克隆。
在描绘出损伤点的图谱后，这些超级遗传细胞可以通过Jaikman WM等描述的导管释放(In：Zipes DP，and Jalife J.eds.心脏电生理。从细胞到临床，费城：WB Saunders Company，491-502(1990))。由于这些心肌细胞的能大量生长的能力，使得能够先在营养障碍的、心肌病的仓鼠，继而在人体检测到心肌病的结构性、电生理性和收缩性的异常的修复。
用体外控制的细胞融合将成肌细胞的有丝分离性质遗传到心肌细胞，使得异核体的心肌细胞能够增殖、生长至足够数量的细胞供有效的细胞移植。
最近有报道胎鼠心肌细胞移植到有性生殖的宿主的心肌在宿主和供体细胞之间形成初生的间介性盘。(Soonpaa MH，et al.，科学，264：98-(1994))。用胚胎细胞供细胞移植已经并将继续引起伦理问题。事实仍是胚胎细胞不能产生足够心肌细胞以修复心肌梗死。考虑到有研究报道被转移到心肌细胞的重组基因至少能表达6个月，并且被体液信号正常调 节，因此用成肌细胞使心脏细胞有丝分裂的生物工程提供了一种解决问题的方法。
鉴于成肌细胞转移到营养障碍的心肌，继而在体内控制的细胞融合可能在梗死时提供一种结构障碍，考虑到心泵功能会打散来自宿主心肌的发展中的细胞，成肌细胞与心肌细胞良好的整合仍有待证明。
C.美容性应用
在更广泛的意义上，细胞治疗概念可以对整形外科领域有显著贡献。使用细胞治疗可避免硅胶植入。成肌细胞和/或脂肪细胞可用来更自然的方法取代硅胶注射用于面部、胸部和臀部的丰隆。修饰的脂肪组织含有混合的和/或杂交的成肌细胞和脂肪细胞，可用来控制身体部位的大小、形状和坚松度。由于肌肉细胞不象脂肪细胞那样易于消亡，良好的效果可以长时间维持。如今的健美者们正寻找在恰当的部位增强肌肉群和功能。用成肌细胞转移来增强肌肉群是一种自然解决方法。
D.超级细胞系
建立成肌细胞的超级细胞系是个高风险的挑战，但其益处是显著的。这些细胞应该是高度生肌性、非致肿瘤性、非抗原性并能发展成非常强壮的肌肉。
成肌细胞的一个特有的性质是在其融合后迅速失去其主要组织相容性I级表面抗原。这对于在成细胞转移治疗后应用免疫抑制具有重要影响。(See HuardJ.et al.，肌肉神经，17：224-34(1994)；Roy R.et al.，移植进展，25：995-7(1993)；and Huard J.et al.，移植进展，24：3049-51(1992))。免疫抑制期依赖于MTT后成肌细胞失去其MHC-I抗原的迅速程度。更理想的是建立MHC-I抗原缺失的成肌细胞系，这样允许MTT没有免疫抑制。
在我们的研究中，人成肌细胞的培养是取自正常肌肉活组织，根据Law，P，K.，et al.，细胞移植，1：235(1992)和Law，P.K.，et al.，细胞移植，2：485(1993)的公开的方法进行的。成肌细胞表达的MHC-I抗原是利用荧光免疫分析来表现的。成肌细胞的细胞周期同步化是通过在生长介质中加入秋水仙碱并保温48小时来进行的。用于实验的成肌细胞准备剂用量用单克隆抗体(MAb)anti-Leu-19免疫染色分析，纯度98％。
成肌细胞与抗MHC-I单克隆抗体(鼠1∶25稀释，Silenus实验室，澳大利亚)一起在室温下保温。洗脱后，成肌细胞与FITC连接的抗鼠IgG(Sigma)一起保温45分钟并在用宽带紫外线(UV)激发滤片的荧光显微镜下检查。细胞荧光计与在488mM下工作的Becton-Dickinson细胞分类计一起使用。成肌细胞控制通过在免疫分析中忽略第一抗体作为自动荧光背景来进行。
91.7％的成肌细胞MHC-1 MAb反应。反应由强到弱不等。剩下的8.3％成肌细胞呈MHC-1抗原表达阴性。图2说明MHC阴性成肌细胞和MHC阳性成肌细胞。MHC阴性成肌细胞被细胞荧光计成功地分离，这在图3、4说明。然后两组成肌细胞培养3周在增殖方面没有显著区别。
这些成肌细胞缺乏MHC-1抗原可促进在MTT后这些成肌细胞在受体体内的存活。图5说明细胞荧光计分离后的MHC阳性成肌细胞、MHC阴性或弱表达的成肌细胞的荧光强度。
免疫抑制剂环孢菌素有许多副作用，并通过抑制免疫系统，造成感染盛行。没有MHC-1抗原表达的成肌细胞可能成为一种新的细胞系，比普通成肌细胞更能够在宿主存活。这种超级细胞系将减少使用免疫抑制剂的必要，并将提供给病人一种准备好的制品而不需要供体。
这些超级细胞系必须来源于原代成肌细胞培养的克隆，因为要选择其特有的特性。遗憾的是据显示所有的成肌细胞克隆如果允许过度增殖，最终都产生肿瘤。因此这些细胞系不应允许其增殖超过30代。
E.成肌细胞注射方法
除供体细胞在免疫学敌对性宿主的存活外，细胞融合是增强MTT后营养障碍性肌肉的关键。为增强宿主和供体细胞间的融合率，对目的在于使供体成肌细胞广泛分布的不同注射方法进行了试验和比较。这些方法包括斜穿肌纤维，垂直于肌纤维表面，平行于肌纤维，和在一个点注射剂肌纤维。图6说明注射再对成肌细胞分布的作用。目的是以最少的注射次数获得最大的细胞融合。
荧光金(FG，0.01％)标记的人或鼠(C57BL/6J-gpi-1c/c)成肌细胞(0.05ml的105细胞/ml溶液)被注射到20只3月龄的正常鼠(C57BL/6J-gpi-1b/b)的腓肠肌内。宿主鼠被每日皮下注射环孢菌素50mg/kg体重进行免疫抑制。各组鼠在细胞注射后7、14、24、34和44天被分别处死，用荧光显微镜检查注射的肌肉的转移部分。通过计算带有供体细胞核的宿主肌纤维占该供体细胞覆盖区域的肌纤维总数的百分数来估计细胞融合率。用琼脂糖凝胶电泳(200V，3h，pH8.6)检查注射肌肉的葡萄糖磷酸异构酶(GPI)。在组织区段首先出现嵌合体肌纤维是在细胞注射后7天内。这在图7中说明。最高融合率达到72.2％。GPI电泳图显示肌肉标本中宿主供体的和嵌合的GPI至少至MTT后44天。斜穿肌纤维注射的成肌细胞随着注射针从注射肌纤维拔针而广泛和均匀分布。如图8。垂直注射到肌纤维的成肌细胞则呈局部地分布，而通过肌肉的核心纵向注射的成肌细胞和与肌纤维平行注射的分布很少，与之相似，单点注射的分布和融合都很少。考虑到小体积高浓度比相对较大体积较低浓度引起较少的肌肉损伤，并考虑到注射引起的创伤降低营养障碍肌肉的再生能力，成肌细胞的释放技术是MTT成功的基础。
虽然斜行注射已被用于我们的临床试验，但所有改进的余地。因为人体的肌肉很大并且不同肌肉群的肌纤维方向有必要由负责成肌细胞注射的矫形外科专家去深入研究。根据过去的鼠研究判断，在营养障碍的肌纤维，有20％的正常肌核能够保持正常的表型。
F.训练和物理治疗
强力训练会导致营养障碍性肌纤维损伤。营养障碍蛋白导致肌纤维膜脆弱，易在肌收缩时撕碎。其它细胞型某种程度上与退化无关，因为它们不收缩。因此，对DMD病人健美就是补偿失去的肌群并使之强健。
然而使用与MTT有关的训练还没有研究。在营养障碍的动物，众所周知训练促进肌纤维退化并因此恶化营养障碍状况，这仅限于营养障碍性的肌肉纤维而已。这情况与MTT不同，在MTT，试图产生一种含有正常的、嵌合的和营养障碍的肌纤维的嵌合性肌肉。MTT立足于重建其遗传性并改善营养障碍肌肉的表型。因此，强度训练可能诱导宿主释放卫星细胞，使之与正常成肌细胞融合，产生嵌合性纤维。无疑，这种营养障碍性退化将诱导正常的肌肉的再生。植入的成肌细胞不仅与损伤的肌纤维的新愈合区融合，而且作为卫星细胞生存。可以设计在MTT后较短时间进行一些温和的锻练，以促进成肌细胞混合，排列和融合，并给所形成的纤维提供物理治疗。在新形成纤维受神经支配后进行中等强度的训练似乎可以增进正常的和嵌合的纤维的发展。废用在营养障碍性肌肉的技术性退化中起重要作用，常给肌营养障碍患者以物理治疗。废用或缺乏桥式相互作用导致钙结合能力降低，结果过多的细胞内钙促进营养障碍性肌肉的损害。
G.肌管转移
在DMD的晚期，仍残存少数成肌纤维可被MTT修复。新的肌纤维形成以补充退化细胞被过度的结缔组织和脂肪组织的存在进一步复杂化。供体肌核被结合进营养障碍性纤维供修复需要大约1～3周，供体成肌细胞在体内发展新生的成熟的正常纤维以补充失去的细胞需要4个月，而形成肌管并被血管化、神经支配化和与肌腱连结方面的障碍都威胁着其生存。足够的营养对发展肌纤维以建造收缩性的肌球蛋白和肌动蛋白是必要的。无论是电生理的还是收缩性运动都不是肌纤维发展正常的，这正是肌管移植会起作用的时候。
本发明者显示了将新生的正常的肌肉或肌管移植到dy2Jdy2J营养障碍性鼠的肌肉以产生正常肌肉功能和结构。(See Law，P.K.and Yap，J.L.，肌肉神经，2：356-63(1979))。通过将融合的培养物暴露于融合介质的自然成肌细胞融合可容易地获得肌管。事实上，在培养中，小肌肉同时由收缩纤维产生。新生纤维表现肌节和肌球蛋白阳性免疫着色。
肌管转移可以用大号针头注射给药。更好的方法是，可以将其手术植入到被外科医生解剖或取出的脂肪和结缔组织层。由于肌肉可发展得非常有力量，而疤痕组织是无活力的，成长发展的肌肉会在其存在的整个过程压迫周围疤痕组织。
肌管转移提供了体外的生物工程的新生纤维。这些纤维失去了其MHC-I表面抗原并因而无抗原性。肌管转移将不再需要使用环孢菌素。对以前感染过巨细胞病毒(CMV)或其它病毒的病人，肌管移植将是可选的。
此外，对于常染色体疾病，如面肩胛骨营养障碍(FSH)、先天性肌强直、肌强直性营养障碍和肢带性营养障碍，嵌合性纤维的形成可能是没有用的，因为核的互补可能是无效的。而用完全正常的肌管通过肌管移植将无疑开创了治疗的新纪元。
H.异型鼠
异型鼠或鼠嵌合体是带有2种或更多基因型的鼠嵌合体。它们通过分裂球重组(See Hogan，B.，et al.，鼠胚操作手册，冷泉港实验室，(1986))或者人工聚合来源于2种不同鼠株的胚胎来产生。除了作为研究体节克隆起源及其肌肉衍生的重要样本外，异型鼠还被本发明人及其他人用来表现当遗传性正常和营养障碍性生肌并存时自然发展的营养障碍抑制。
通过如图9所示聚合正常(129株)和营养障碍(C57BL/6Jdy2Jdy2J株)鼠的各一半胚胎，产生了含有嵌合体鼠及其正常和营养障碍性同胞的异型对(图10)。虽然根据基因型标记分析，营养障碍性基因存在于肌纤维中，这些异型鼠表现出正常的行为、寿命和图11所示的基本正常肌肉功能和图12、13所示的正常肌肉结构。
这些异型鼠的肌纤维高度相似于那些杜兴氏病的雌性携带者。鉴于营养障碍性比目鱼肌含有70％或更多的退化纤维，仅3～5％的异型的肌纤维异常的。象杜兴氏携带者一样这些异常的肌纤维中许多可见“核”。通过自然细胞融合，正常成肌细胞与营养障碍细胞融合以形成嵌合性肌管，它发展为表型正常的纤维。
I.使杜兴氏携带者能有正常的孩子
可以想象，体外受精技术和用于异型鼠研究的分裂球重组织技术可以用于人类。已知的携带者可因此而获得生育正常孩子的更好的机会。
据此，可获取从携带者和正常女性得到的卵细胞，与来源于携带者的丈夫的精细胞在体外受精。携带者的受精卵正常或营养障碍的机会是50/50。不管其基因型如何，其与正常受精卵混合将确保发育为正常表型。在胚胎培养至胚泡期后，可将其移植至携带者的子宫内。携带者的子宫可用人促腺激素来诱导假孕，以使移植易于实现。
用体外受精可保护母亲。可丢弃分裂球重组后异常发育的胚胎，而且，不需要移出分裂球作遗传分析。
由于携带者的受精卵有50％的机率可能是正常的。可从人卵泡期的胚胎上移取部分分裂球，用PCR方法分析营养障碍蛋白的信使RNA。不幸的是，这存在着因在胚胎发育早期移去部分胚胎而造成胚胎损伤的危险。
J.自动细胞处理器
由于大量需要正常成肌细胞、肌管和新生肌肉，细胞培养、收获和分装劳动强度大、费用高，以及人操作不精确易犯错误等，需要自动细胞处理器。这种处理器将能够生产大量的，每流程1000亿，活存的、无菌的、遗传性能确定的以及具有生物学表现功能的细胞，例如，生肌细胞。
这种自动细胞处理器将是现代计算机科学、机械工程和细胞遗传学的极其重要的产物之一(图14)。其输入的将是不同的人体活检组织。计算机将用程序处理组织，同时时间、空间、培养成分的比例和设备操作可精确控制。细胞的状况可在处理过程中的任何时刻进行监控，并具有一定的弹性以允许变化。培养、控制细胞融合、收获和分装的不同方案都可以编程到软件中。输出将供应细胞，将是已准备好的供运输或供细胞疗法注射用的细胞产品。该自动细胞处理器将被封闭在一个足够大的可以包容在其内部进行细胞培养和操作的硬件的无菌密闭体内，(图15)。
本发明建立了一种转移介质，能够保持被包裹的成肌细胞在室温下存活并具生肌性3天以上，当成肌细胞处于冷冻状态时可存活达7天以上。这将使得细胞包裹可送达世界上遥远的应用地点。
自动细胞处理器将轻易地取代现在的庞大的低级的培养设备和繁重的人力，对人类健康的贡献将无疑是显著的，并且造价估计也相对较低。
K.细胞库
自动细胞处理器将只构建细胞库的一部分。理想地，可从8～22岁的年轻人获得供体肌肉活检组织作为自动细胞处理器的输入“种子”。这将取决于是否有健康的志愿者供体。每个供体必须承受一次费时并且昂贵的试验的创痛。在试验结果和供体的生理状况的基础上，才能确定供体细胞是否有遗传性缺陷或感染了病毒和/或细菌。这些是从成年人的成熟组织取得活检组织的优点。然而，主要的缺点是，成熟细胞通常不分裂，即使分裂，在变成致瘤性或有丝分裂之前能繁殖产生的数量也有限。
人胎儿组织可潜在提供无限的分裂细胞来源。但除了伦理学原因外，尽管存在不同于筛检许多人类遗传病的聚合酶链式反应(PCR)技术，确定这些细胞遗传正常性仍然困难。
至于肌肉营养障碍病，用源于遗传背景清楚的体外受精的牛胎的肌肉原基，可能是一种选择。精子和卵子选自那些肌肉强大有力的牛近交系。体外受精后进行胚胎培养并移植到假孕的牛的子宫内。在胚胎的特殊发育期通过Sicilian切开术移出胚胎。然后便能将富含成肌细胞的肌肉原基切碎，输入自动细胞处理器。
将牛细胞移植进人体构成了异种移植。由于人和牛的免疫系统有着显著差别，这些异种移植似乎可以在受体体内成活、发展并实现正常功能而不需要免疫抑制剂。但是这种方法将被使用或不使用免疫抑制剂进行实验。
L.成肌细胞衍生物与癌症
进化是一种伴随大量统计的长期的连续性实验。在骨骼肌中几乎没有癌的转移说明成肌细胞及其衍生物的生理的、电学的、机械的、化学的存在预防或消灭癌症。
在我们的研究中表明，在细胞融合期成肌细胞的生理的和生化的条件导致黑素瘤癌细胞的死亡(图16至18)。这并不排除类似的或不同的条件，这包括其它在不同发育期的生肌性细胞和电学的、机械的可能影响。
应该理解对这里所描述的现行优选的实施方案的不同变化和修饰对本领域的技术人员将是显而易见的。而采取的这些变化和修饰没有离开本发明的精神和范围。并且没有减少其相关的优点。因此，这意味着这些变化和修饰将归入所附的权利要求。

Claims (5)

1.一种控制细胞融合的方法，其包括：增加细胞培养介质或转移介质中大6-硫酸软骨素蛋白多糖的浓度，使其足以超过内源性大6-硫酸软骨素蛋白多糖的浓度5μM至5mM。
2.权利要求1的方法，其中大6-硫酸软骨素蛋白多糖的浓度是在细胞培养介质中增加的。
3.权利要求1的方法，其中大6-硫酸软骨素蛋白多糖的浓度是在供其转移到病人或宿主的介质中增加的。
4.权利要求1的方法，其中大6-硫酸软骨素蛋白多糖的浓度是5μM至5mM。
5.用于控制身体部位的大小、形状或密度的组合物，它是用下述方法制备的：培养至少十亿源于哺乳动物的成肌细胞，培养来自哺乳动物的脂肪细胞，将成肌细胞和培养的脂肪细胞混入共同的培养物中。
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