发明详述
本发明实施除非另外说明,将使用化学、生物化学、重组DNA技术和免疫学本领域技术范围内的常规方法。这些技术在文献中有完整的解释。见例如Foudamental Virology,第二版,vol.I & II(B.N.Fields和D.M.Knipe编);Handbook of Experimental Immunology,Vols I-IV(D.M.Weir和C.C.Blackwell编,Blackwell Scientific Publications);T.E.Creighton,Proteins:Structureand Molecular Properties(W.H.Freeman and Company,1993);A.L.Lehninger,Biochemistry(Worth Publishers,Inc.最新版);Sambrook等,MolecularCloning,A Laboratory Mannual,第二版,1989;Methods in Enzymology(S.Colowick和N.Kaplan编,Academic Press,Inc.)。
需要注意的是,如本说明书中和权利要求中使用的,单数形式“一”、“一个”、“该”包括复数参考,除非内容明显说明。因此,“一抗原”的应用包括两个或多个抗原的混合物等。
在文章中使用了下列氨基酸缩写:
丙氨酸:Ala(A) |
精氨酸:Arg(R) |
天冬酰胺:Asn(N) |
天冬氨酸:Asp(D) |
半胱氨酸:Cys(C) |
谷氨酰胺:Gln(Q) |
谷氨酸:Glu(E) |
甘氨酸:Gln(Q) |
组氨酸:His(H) |
异亮氨酸:Ile(I) |
亮氨酸:Leu(L) |
赖氨酸:Lys(K) |
甲硫氨酸:Met(M) |
苯丙氨酸:Phe(F) |
脯氨酸:Pro(P) |
丝氨酸:Ser(S) |
苏氨酸:Thr(T) |
色氨酸:Trp(W) |
酪氨酸:Tyr(Y) |
缬氨酸:Val(V) |
I.定义
在描述本发明中,使用了下列术语,并如下定义。
术语“多肽”和“蛋白质”指氨基酸残基的聚合物,不限于产物的最小长度。因此肽、寡肽、二聚物、多聚物等包括在该定义中。全长的蛋白质及其片段包括在该定义中。术语还包括多肽的表达后修饰,例如糖基化、乙酰化、磷酸化等。另外,为了本发明的应用,“多肽”指包括天然序列的修饰,例如缺失、添加和取代(通常为性质保守)的蛋白质。只要蛋白质维持所需活性。这些修饰可以通过定点诱变设计,或可以是偶然的,例如通过生产蛋白质的宿主突变,或用PCR扩增产生的错误。
HCV多肽是一种如上所述衍生自HCV多蛋白的多肽。多肽不需要物理衍生自HCV,但可以是合成或重组产生的。另外,多肽可衍生自任意的各种HCV株,例如来HCV自1,2,3或4。在这些病毒株之间有许多保守和可变的区域,一般当两条序列排列比较时,衍生自这些区域的表位的氨基酸序列将具有高度的序列同源性,例如大于30%,优选高于40%的氨基酸序列的同源性。因此,例如术语“NS3/4a”多肽指任意各种HCV株的天然NS3/4a和NS3/4a类似物、突变蛋白和免疫学片段,如下进一步定义。许多这些病毒株的完整基因型是已知的。见例如美国专利号6,150,087和GenBank登录号AJ238800和AJ238799。
术语“类似物”和“突变蛋白”指参照分子的生物学活性衍生物,或这些衍生物保留所需活性,例如在本文所述的试验中的免疫反应性的片段。一般术语“类似物”指具有天然多肽序列和结构,以及相对于天然分子的一个或多个氨基酸添加、取代(通常为性质保守)和/或缺失的化合物,只要所修饰不破坏免疫活性。术语“突变蛋白”指具有一种或多种肽拟物(“类肽”),例如国际出版物号WO91/04282中所述的。优选类似物或突变蛋白具有与天然分子至少相同的免疫活性。制备多肽类似物和突变蛋白的方法是本领域已知的,如下进一步所述。
特别优选的类似物包括性质上保守的取代,即这些取代发生在与它们的侧链有关的一类氨基酸中。具体而言,氨基酸一般被分成四类:(1)酸性——天冬氨酸和谷氨酸;(2)碱性——赖氨酸、精氨酸、组氨酸;(3)非极性——丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸;(4)无电荷的极性氨基酸——甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。有时将苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸归为芳族氨基酸。例如,有理由预测,单独用异亮氨酸或缬氨酸取代亮氨酸、用谷氨酸取代天冬氨酸、用丝氨酸取代苏氨酸,或者使用结构上相关的氨基酸取代类似的保守的氨基酸,这样的取代将不会过于影响生物学活性。例如,感兴趣的多肽可包括达到5-10个保守的或不保守的氨基酸取代,甚至达到15-25个保守的或不保守的氨基酸取代,或者为2-25之间的整数,只要该分子的所需功能仍维持完整。本领域的熟练技术人员可结合本领域熟知的Hopp/Woods和Kyte-Doolittle曲线图,容易地测定感兴趣的分子中可耐受改变的区域。
术语“片段”指仅由完整的全长多肽序列和结构的一部分组成的多肽。该片段可包括该天然多肽的C末端删除和/或N末端删除。具体的HCV蛋白质的“免疫原性片段”一般至少包括该全长分子的约5-10个连续的氨基酸残基,较佳至少约含有该全长分子的15-25个连续的氨基酸残基,最佳至少约含有该全长分子的20-50个或以上的连续的氨基酸残基,这些氨基酸残基限定了一个表位;或者含有5个到该全长序列氨基酸数目之间的任何整数的氨基酸残基,只要所述的片段保留了免疫原性活性。例如,优选的免疫片段,包括但不限于HCV片段,选自例如多蛋白的氨基酸10-45、67-88和120-130,表位5-1-1(在病毒基因组NS3区中)和HCV多蛋白的E1、E2、c33c(NS3)、c100(NS4)、NS3/4a和NS5区衍生的限定的表位,和任何其它各种HCV多蛋白中鉴定出的各种表位。见例如Chien等,Preoc.Natl.Acad.Sci.USA(1992),
89:10011-10015;Chien等,J.Gastroent.Hepatol.,(1993),
8:S33-39;Chien等,国际出版物第WO93/00365;Chien,D.Y.,国际出版物第WO94/01778;美国专利号6,150,087和6,121,020。
术语“表位”在文中指至少约有3-5个、较佳约有5到10或15个、但不超过约1000个氨基酸(或其中的任何整数)的序列;它定义了一个其自身或作为更大序列的一部分而与在对其应答中产生的抗体结合的序列。该片段的长度没有严格的上限,它几乎可含有蛋白质序列的全长,或者甚至可包括含有HCV多蛋白的两个或多个表位的融合蛋白。用于本发明的表位并不限于具有其母体蛋白质一部分的该确切序列的多肽。实际上,病毒基因组处于不断变动的状态,它们含有几种在隔离种群间具有高度的变动性的可变的结构域。因而,术语“表位”包括与天然序列相同的序列,以及该天然序列的修饰物,如删除、添加和取代(一般仍保留其性质)。
可使用本领域周知的各种表位作图技术中的任何一种来鉴别包括表位在内的给定多肽的区域。见例如Methods in Molecular Biology中的Epitope MappingProtocols,第66卷(Glenn E.Morris编辑,1996),Humana Press,Totowa,New Jersey。例如,通过如同时在固相载体上合成大量的对应于蛋白质分子的一些部分的肽,然后在这些肽仍连接在该载体上的情况下使它们与抗体反应,就可测定各线性表位。这些技术在本领域中是已知的,并在美国专利第4,708,871;Geysen等人(1984),Proc.Natl.Acad.Sci.USA,
81:3998-4002;Geysen等(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:178-182;Geysen等(1986),Molec.Immunol.,
23:709-715中有所描述。用这些技术鉴定出了许多HCV表位。见例如Chien等,
Viral Hepatitis and Liver Disease(1994),pp320-324和下文。类似的,通过使用如X-射线结晶学和二维核磁共振法测定氨基酸的空间构象,从而可容易地鉴定构象表位。例如参见Epitope Mapping Protocols(同上)。使用如供计算使用的标准的抗原性曲线图和亲水性图,如用Oxford Molecular Group获得的Omiga 1.0版软件计算,也可鉴别出蛋白质的抗原区域。这个计算机程序采用Hopp/Woods方法(Hopp等人,Proc.Natl.Acad.Sci USA(1981),
78:3824-3828)绘制抗原性曲线图,使用Kyte-Doolittle技术(Kyte等人,J.Mol.Biol.(1982),
157:105-132)绘制亲水性图。
术语“构象表位”在本文中是指全长蛋白质的一部分,或其类似物或突变蛋白,它具有编码该全长天然蛋白质内的表位的氨基酸序列的结构特征。天然的结构特征包括但不限于糖基化和三维结构。表位限定序列的长度可广泛改变,因为据信这些表位是通过抗原的三维形状形成的(例如折叠)。因此形成该表位的氨基酸可能数量较少,但在全长分子中分散很开(或甚至在二聚物的情况下是不同分子上等),通过折叠形成正确的表位构象。限定表位的残基之间的抗原部分对于表位的构象结构不是关键的。例如,这些中间序列的缺失或取代可能不影响构象表位,条件是保留对于表位构象关键的序列(例如涉及二硫键形成的半胱氨酸糖基化位点等)。
可用上述方法容易的识别NS3/4a区中存在的构象表位。另外,给定的多肽中构象表位的存在与否可通过用抗体(构象表位的多克隆血清或单克隆抗体)筛查抗原,并将其反应性与抗原维持仅线性表位(如存在)的变性形式比较来确定。在用多克隆抗体的筛选中,有利的是首先用变性的抗原吸附多克隆血清,看它是否保留针对感兴趣抗原的抗体。另外,在NS3/4a的例子中,保留天然构象的分子还可以具有蛋白酶,可任选的解旋酶活性。这些活性可用酶试验检测,如下所述。
优选重组产生的构象表位,并使它在一种在能保留其所需结构特征的条件下(如表位没有变性)能被抽提出来的细胞中表达。这样的细胞包括细菌、酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞。重组构象表位在HCV多蛋白中的表达和从中分离的技术在如国际出版物第WO 96/04301、WO 94/01778、WO 95/33053、WO 92/08734中有所描述。另外,可能表达抗原并在回收后恢复其蛋白质性质。还理解化学合成也可提供构象抗原模拟表位,它与“天然”抗原的构象表位交叉反应。
本文所用的术语“多表位融合抗原”或“MEFA”指一种多肽,其中多个HCV抗原是一条连续的氨基酸链的部分,该链在天然不存在。HCV抗原可以通过肽键彼此直接连接,或通过插入氨基酸序列分隔。融合抗原还可以含有HCV多蛋白外源的序列。另外,存在的HCV序列可以来自多基因型和/或HCV的分离物。本免疫试验中所用的具体的MEFA的例子在例如国际出版号WO97/44469中详述,并在下文中进一步详述。
“抗体”指通过化学或物理方式与感兴趣的多肽专一性结合的分子。因此,HCV抗体是一种与HCV核心蛋白特异性结合的分子。本文所用的术语“抗体”包括多克隆和单克隆制备物获得的抗体,以及如下:杂交(嵌合)抗体分子(见例如Winter等(1991)
Nature 249:293-299;和美国专利号4,816,567);F(ab′)2和F(ab)片段;Fv分子(非共价杂二聚体,见例如Inbar等(1972)
Proc.Natl.Acad.Sci.USA69:2659-2662;和Ehrlich等(1980)Biochem 19:4091-4096);单链Fv分子(sFv)(见例如Huston等(1988)
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883);二聚和三聚抗体片段构建物;小抗体(见例如Pack等(1992)
Biochem 31:1579-1584;Cumber等(1992)J Immunology 149B:120-126);人源化抗体分子(见例如Riechmann等(1988)
Nature332:323-327;Verhoeyan等(1988)
Science 239:1534-1536;和英国专利申请号GB 2,276,169,1994年9月21日出版);和从这些分子获得的任何功能性片段,其中这些片段维持专利抗体分子的免疫结合性质。
本文所用的术语“单克隆抗体”指具有同源抗体群的抗体组合物。术语不限于抗体种类或来源,也不受其制备的方式限制。因此,该术语包括从小鼠杂交瘤获得的抗体,用人而不是小鼠杂交瘤获得的人单克隆抗体。见例如Cote等,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,1985,p.77。
“重组”蛋白质是一种维持所需活性的蛋白质,它是用本文所述的重组DNA技术制备的。一般克隆感兴趣的基因,然后在转化的生物体中表达,如下所述。宿主机体表达外源基因,在表达条件下产生蛋白质。
当对多肽使用时,“分离的”意味着所述的分子从发现该分子天然存在的整个生物体中分离和分开,或基本不存在其它相同类型的生物大分子。术语“的”对于多肽是:一种核酸分子,它完全或部分缺乏与其天然结合的序列;或如天然存在的序列,但具有与其结合的异源序列;或染色体分离的分子。
“HCV,例如来自HCV1、2或3的的抗原决定簇。更具体的,已知表位,例如5-1-1,这些表位在病毒株1、2和3之间变化。因此,这三种不同病毒株之间的表位5-1-1是等价的抗原决定簇,因此是“序列具有高度的序列同源性,例如大于30%、40%的氨基酸序列同源性。
“同源性”指两条多核苷酸或两条多肽分子之间的相似性百分数。两条DNA或两条多肽序列是“基本同源的”,是指在确定的长度内有至少约50%,优选至少约为75%、更佳至少约为80-85%、尤其佳至少约为90%、最佳至少约为95-98%序列相似性。如本文所用的,基本同源也指与特定的DNA或多肽序列完全相同的序列。
通常,“相同性”指两条多核苷酸或多肽序列上准确的核苷酸对核苷酸或者氨基酸对氨基酸对应。通过排列两个分子的序列直接比较它们的序列信息,计算两条排列的序列间匹配的准确数量,将其除以最短序列的长度,然后乘以100,从而可得到相同性百分数。
在相似性和相同性分析中可辅助使用易于获得的计算机程序,如ALIGH、Dayhoff、M.O.(Atlas of Protein Sequence and Structure、M.O.Dayhoff编辑,5 Suppl.,3:353-358,National Biomedical Research Foundation,Washington,DC),它适用于Smith和Waterman分析肽用的局部同源性算法(Advances in Appl.Math.,
2:482-489,1981)。可从Wisconsin Sequence Analysis Package(第8版,从GeneticsComputer Group,Madison,WI获得)获得测定核苷酸序列相同性的程序,例如,BESTFIT、FASTA和GAP程序,这些程序也依赖于Smith和Waterman算法。使用制造者建议的和上述Wisconsin Sequence Analysis Package所述的默认参数可容易地使用这些程序。例如,可使用Smith和Warerman的同源性算法的默认计分表和6个核苷酸位置的间隔罚分(gap penalty)测定具体的核苷酸序列与参比序列的相同性百分数。
本发明建立相似性百分数的另一方法是使用版权属于University ofEdinburgh、由John F.Collins和Shane S.Sturrok开发、由IntelliGenetics,Inc.(Mountain View,CA)发行的MPSRCH程序包。Smith-Waterman算法可在这套程序包中使用,其中,在计分表中使用默认参数(例如,间隔开放罚分=12,间隔延伸罚分=1,间隔=6)。从这批数据产生的“匹配”值反映出“序列相似性”。计算序列间的相同性百分数或相似性百分数的其它合适的程序在本领域中一般都是已知的,例如,另一种排列校正程序是BLAST,可使用默认参数。例如,可使用下述默认参数的BLASTN和BLASTP:基因编码=标准;过滤=无;链=二;截留=60;期望值=10;矩阵=BLOSUM62;描述=50个序列;排序=HIGH SCORE;数据库=无冗余,GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS翻译+Swiss蛋白+Spupdate+PIR。在http://www.ncbi.nim.gov/cgi-bin/BLAST网址上可查到这些程序的详细描述。
或者,在各同源区域之间形成稳定的双链的条件下进行多核苷酸杂交,接着用单链特异性核酸酶消化,然后测定消化后片段的大小,从而测出同源性。在如(对具体的体系所定义的)严格条件下进行的Southern杂交试验中,可鉴别基本同源的DNA序列。确定适当的杂交条件在本领域熟练技术人员所掌握的知识之内。例如,参见Sambrook等人,同上;DNA Cloning,同上;Nucleic Acid Hybridization,同上。
“编码序列”或“编码”选定多肽的序列,是指当它处于适当的调节序列的控制下时,它在体外或体内被转录(对于DNA)和翻译(对于mRNA)成多肽的一种核酸分子。该编码序列的界限可由5′(氨基)末端的起始密码子和3′(羧基)末端的翻译终止密码子来限定。转录终止序列可以位于该编码序列的3′端。
“可操纵性连接”指各元件的排列,其中,所述成分被构建在一起,以便执行它们的预定功能。因而,可操纵性连接于编码序列的给定的启动子,在存在正确的转录因子等时,能使该编码序列有效表达。该启动子不需要与该编码序列邻接,只要它起到指导该序列表达的功能即可。因此例如,不参与翻译但转录的序列可存在于启动子序列和编码序列之间,与可转录的内含子一样;并且仍可认为该启动子序列“可操纵性连接”于该编码序列。
“控制元件”指帮助与其连接的编码序列表达的多核苷酸。该术语包括启动子、转录终止序列、上游调节结构域、聚腺苷酸化信号、非翻译区域(包括5′-UTR和3′UTR)、适当时还有前导序列和增强子,这些序列共同使宿主细胞中的编码序列转录和翻译。
“启动子”在本文中指能结合宿主细胞中的RNA聚合酶并启动与之操作性连接的下游(3′方向)编码序列的转录的DNA调节区域。用于本发明的启动子包含以高于背景值的可检测的水平启动感兴趣的基因的转录所需的最小数量的碱基或元件。在该启动子序列中有转录启动位点以及负责RNA聚合酶结合的蛋白质结合结构域(共有序列)。真核细胞启动子常常(但不总是)含有“TATA”盒和“CAT”盒。
当在RNA聚合酶结合到启动子序列时,控制序列“指导转录”了细胞中的编码序列,并将该编码序列转录成mRNA,之后,该mRNA被翻译成由该编码序列编码的多肽。
“表达盒”或“表达构建物”指能指导感兴趣的序列或基因的表达的装配物。该表达盒包括上述控制元件,如操作性连接于感兴趣的序列或基因(以指导其转录)的启动子,该表达盒还常常包括多腺苷酸化序列。在本发明的某些实施例中,在此所述的表达盒可被包含在质粒构建物中。除了该表达盒的组分外,该质粒构建物还含有一种或多种选择性标记物、使该质粒构建物以单链DNA(如M13复制源)存在的信号、至少一个多克隆位点和“哺乳动物”复制源(如SV40或腺病毒复制源性)。
“转化”在本文中指将外源多核苷酸导入宿主细胞中,而不考虑插入的方法:例如,通过直接摄取、转染、感染等的转化。下文进一步描述具体的转染方法。该外源多核苷酸可维持为未整合的载体,例如,游离型载体,或者可以被整合到宿主基因组中。
“宿主细胞”是已被转化的细胞,或者能被外源DNA序列转化的细胞。
“一般固相载体”指一个固相基质,本免疫试验所用的HCV多肽与其共价或通过非共价方式,例如疏水性吸附结合。
“免疫反应性”意味着所关心的抗原与存在HCV感染的个体的生物学样品中的抗-HCV抗体反应。
“免疫复合物”意味着当抗体和抗原上的表位结合时,形成的组合。
本文所用的“生物学样品”指个体分离的组织或液体的样品,它包括但不限于例如血液、血浆、粪便物质、尿液、骨髓、胆汁、脊髓液、淋巴液、皮肤样品、皮肤、呼吸道、肠道和泌尿生殖道的外分泌物、泪液、唾液、乳液、血细胞、器官、活组织检查和体外细胞培养组分的样品,包括但不限于细胞和组织在培养基中生长获得的条件培养基,例如重组细胞和细胞成分。
本文所用的术语“标记”和“可检测标记”指能检测的分子,包括但不限于放射性同位素、荧光素、化学发光物、生色基团、酶、酶底物、酶辅助因子、酶抑制剂、生色团、染料、金属离子、金属盐、配体(例如生物素、链霉亲和素和肝素)等。术语“荧光素”指能在可检测范围内显示荧光的物质或其部分。可在本发明中使用的特定标记的例子包括但不限于,辣根过氧化物酶(HRP)、荧光素、FITC、罗丹明、丹磺酰、伞形酮、二甲基吖啶鎓酯(DMAE)、德州红(Texas Red)、鲁米诺、NADPH和α-β-半乳糖苷酶。
II.实施本发明的方式
在详细描述本发明之前,应理解本发明并非局限于特定的制剂或加工参数,显然它们是可以变化的。还应理解本文所用的术语仅用于说明本发明具体实施例的目的而并非对其限定。
虽然大量与本文所述类似的组合物和方法可用于本发明的实践中,但本文描述了优选的材料和方法。
如上所述,本发明的基础是发现了用于精确检测早期HCV感染的新型诊断方法。该方法依靠鉴定和使用HCV血清转化的早期阶段中存在的高免疫原性的HCV抗原,从而增加检测精确性并降低错误结果的发生。该方法可方便地以单次试验形式实施。
更具体的,试验在固相载体上进行,在该载体上结合有一种或多种HCV抗核心抗体(针对相同或不同的HCV核心表位)和衍生自HCV多蛋白NS3/4a区域的表位。本发明中有用的具体抗-核心抗体的例子包括但不限于针对氨基酸10-53;氨基酸10-45;氨基酸67-88;氨基酸120-130之间发现的核心区域中的表位的单克隆抗体等分子,或针对任何核心表位的抗体,这些核心表位在例如Houghton等,美国专利号5,350,671;Chien等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1992)89:10011-10015;Chien等,J.Gatroent.Hepatol.(1993)8:S33-39;Chien等,国际出版物号WO 93/00365;Chien,D.Y.,国际出版物号WO 94/01778;和共有的美国专利申请号08/403,590和08/444,818中所述。
已有人描述过HCV多蛋白的NS3/4a结构域,且该蛋白的氨基酸序列和整体结构公开于:如Yao等人,Structure(1999年11月)7:1353-1363;Sali等人,Biochem.(1998)37:3392-3401;和Bartenschlager,R.,
J.Viral Hepat.(1999)6:165-181。同样,可参见Dasmahapatra等人的美国专利No.5,843,752。所进行的免疫分析使用至少一种自NS3/4a区域衍生的构象表位,其以天然的HCV粒子或其传染性产物中所发现的构象存在,这可通过由NS3/4a基因产物正常表现的蛋白酶和任选地解旋酶活性的保存和/或抗原与受HCV感染的对象的生物学样品中的抗体的免疫反应性以及抗原变性后表位的免疫反应性验证。例如,通过加热、pH变化至极酸性或碱性或通过添加已知的有机变性剂(如二硫苏糖醇(DTT))或适当的去污剂破坏构象表位。参见,如“蛋白质的纯化方法,实用方法(E.L.Harris和S.Angal编辑,IRL Press),并将变性的产物与未进行上述处理的产物相比。
可用本领域已知的标准酶试验确定蛋白酶和解旋酶的活性。例如,可用以下实例中所述的方法和本领域已知的方法确定蛋白酶的活性。参见,如Takeshita等,
Anal.Biochem.(1997)247:242-246;Kakiuchi等,
J. Biochem.(1997)122:749-755;Sali等,
Biochemistry(1998)37:3392-3401;Cho等,
J.Virol.Meth(1998)72:109-115;Cerretani等,
Anal.Biochem.(1999)266:192-197;Zhang等,
Anal.Biochem.(1999)270:268-275;Kakiuchi等,J.Virol.Meth(1999)80:77-84;Fowler等,
J.Biomol.Screen.(2000)5:153-158;和Kim等,
Anal.Biochem.(2000)284:42-48。
类似地,解旋酶的活性分析是本领域熟知的,且NS3/4a表位的解旋酶活性可用如下方法确定,例如ELISA分析(如Hsu等,Biochem.Biophys,Res.Commun.(1998)253:594-599中所述);闪烁亲近测定法(如Kyono等人,Anal.Biochem.(1998)257:120-126中所述);高通量筛选测定法(如Hicham等人,Antiviral Res.(200)46:181-193和Kwong等,MethodsMol.Med.(2000)24:97-116中所述的);以及本领域已知的其它测定法。例如,参见Khu等,J.Virol.(2001)75:205-214;Utama等人,Virology(2000)273:316-324;Paolini等,J.Gen.Virol.(2000)81:1335-1345;Preugschat等,Biochemistry(2000)39:5174-5183;Preugschat等,MethodsMol.Med.(1998)19:353-364;和Hesson等,Biochemistry(2000)39:2619-2625。
抗原的长度足以维持免疫反应性的构象表位。通常,含有所用抗原的多肽几乎是全长的,然而也可以截短该多肽,例如用于增加溶解性或改善分泌。一般而言,在细胞中以重组多肽形式表达NS3/4a的构象表位,且多肽提供表位所需形式(如下详述)。
图3和图4A-3D显示了NS3/4a多肽的代表性氨基酸序列。图3的182位的斜体丙氨酸取代该位置发现的天然丝氨酸,以防止分子可能发生的自切割。图4A-4D的位置2-686所示的氨基酸序列相应于HCV-1的1027-1711位的氨基酸。在1位显示了编码Met的起始密码子(ATG)。另外,在HCV-1的1428位的Thr(图3的氨基酸403位)突变为Pro,通常在HCV-1的1429位的Ser(图3的氨基酸404位)突变为Ile。然而,无论是天然序列(有或无N-末端Met)、所示的类似物(有或无N-末端Met)或其它类似物和片段都可用于试验,只要使用保存或恢复表位的天然构象(如保留蛋白酶活性和任选地解旋酶活性)的方法制备该表位。Dasmahapatra等人,美国专利No.5,843,752和Zhang等人,美国专利No.5,990,276,它们都描述了NS3/4a的类似物。
在约1027-1207位发现NS3/4a的NS3蛋白酶,相对于HCV-1编号,图4上为2-182位。NS3蛋白酶的结构和活性位点是已知的,参见如De Francescod等人,Antivir.Ther.(1998)3:99-109;Koch等人,Biochemistry(2001)40:631-640。通常可以耐受的天然序列的变化将是分子活性位点以外的变化。具体说,需要维持图4的氨基酸1-或2-155(有少量或仅有保守性替代)。155以外的氨基酸可以耐受更多的变化。另外,如果使用图4中的NS3/4a序列的片段,这些片段通常至少包括氨基酸1-或2-155,较佳地包括氨基酸1-或2-175,且最宣包括氨基酸1-或2-182(有或无N-末端Met)。发现解旋酶区域约在HCV-1的1193-1657(图3的207-632位)。因此,如果需要解旋酶活性,就要维持分子的该区域有少量或仅有保守性变化。本领域技术人员根据NS3/4a的已知结构易确定可以耐受变化的其它区域。
固相载体上还可以含有其它抗原。例如,多表位融合抗原(称为“MEFA”),如国际出版物No.WO97/44469所述可以与固相载体结合用于分析试验。这些MEFA包括从HCV多蛋白的两种或多种不同的病毒区域衍生的多种表位(如图1和表1所示)。具体说,如图1和表1所示,切割后HCV多蛋白产生至少10种不同的产物,其顺序为NH2-核心-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4a-NS4b-NS5a-NS5b-COOH。其中核心多肽的位置为1-191,相对于HCV-1编号(HCV-1的基因组可参见,Choo等人,(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:2451-2455)。进一步加工该多肽产生约1-173个氨基酸的HCV多肽。包膜多肽E1和E2的位点分别为192-383和384-746。发现P7区域为约747-809位点。NS2是具有解蛋白活性的膜内在蛋白,且约位于多蛋白的810-1026。NS2,单独或与NS3结合(位于1027-1657),切割NS2-NS3的酰胺(sissle)键,从而产生NS3 N-末端并释放大多蛋白,具有丝氨酸蛋白酶和RNA解旋酶活性。在约1027-1207位发现的NS蛋白酶在剩下的多蛋白加工中起作用。在约1193-1657位发现解旋酶活性。用在NS3-NS4a接头的自动催化(用NS3丝氨酸蛋白酶催化)切割引发多蛋白突变的完成。随后的NS3-介导的HCV多蛋白的切割表现为包括另一种多蛋白的NS3分子识别多蛋白的切割接头。在这些反应中,NS3释放出NS3辅因子(NS4a,位置为约1658-1711)、两种蛋白质(NS4b的位置为约1712-1972,和NS5a的位置为约1973-2420)和RNA-依赖性RNA聚合酶(NS5b的位置为约2421-3011)。
表1 |
区域 |
大约的边界* |
C(核心) |
1-191 |
E1 |
192-383 |
E2 |
384-746 |
P7 |
747-809 |
NS2 |
810-1026 |
NS3 |
1027-1657 |
NS4a |
1658-1711 |
NS4b |
1712-1972 |
NS5a |
1973-2420 |
NS5b |
2421-3011 |
*相对于HCV-1编号。参见Choo等人(1991)
Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:2451-2455。
多重HCV抗原是氨基酸连续单链(天然不存在的)的一部分。因此,该表位的直线排列与其基因组中的直线排列不同。宜排列本文所用的MEFA序列的直线排列,使之抗原性最佳。较佳地,这些本文来自多种HCV毒株,因此增加了在单次分析中检测多种HCV毒株的能力。所以,用于本文的MEFA可能包含自上述多蛋白衍生的各种不同的免疫原性区域。另外,可将由多蛋白核心区域中读框移位产生的蛋白质(如国际出版物No.WO99/63941所述)用于MEFA。如果需要,在融合蛋白中可能发生至少2、3、4、5、6、7、8、9、或10或更多的一种或多种HCV多蛋白的表位。
例如,在MEFA抗原中可以包含自如E2的高变区衍生的表位,如跨越氨基酸384-410或390-410的区域。特别有效的E2表位是包含自该区域衍生的共有序列的表位,如共有序列Gly-Ser-Ala-Ala-Arg-Thr-Thr-Ser-Gly-Phe-Val-Ser-Leu-Phe-Ala-Pro-Gly-Ala-Lys-Gln-Asn,其代表1型HCV基因组的氨基酸390-10的共有序列。本发明MEFA中存在的典型E2表位包含跨越氨基酸390-444的杂交表位。这种杂交表位可包含表现氨基酸390-410的共有序列,该序列融合于HCV E2的氨基酸411-444的天然氨基酸序列。
另外,可从各种HCV毒株衍生抗原。已知HCV的多种病毒株,且在融合代表中可用从任何这些毒株衍生的表位。任何特定品种的生物体的个体间互不相同,而且特定生物体如病毒可以有大量不同的毒株。例如,如上所述,HCV包括至少6种基因型。这些基因型各包括等效的抗原性决定簇。更具体地说,各毒株包括大量抗原性决定簇,它们存在于该病毒的所有毒株中,但各病毒毒株之间略有差异。例如,HCV包括已知为5-1-1的抗原性决定簇(参见图1)。这种特定的抗原性决定簇在HCV的三种不同的病毒毒株中有三种不同的形式。因此,在本发明的一个优选实施例中,用于免疫分析的多重表位融合抗原上表现了三种形式的5-1-1。类似地,也可能存在来自不同HCV毒株的核心区域的等效抗原性决定簇。通常,等效抗原性决定簇的氨基酸序列具有高度同源性,序列对比时其同源性程度通常为30%或更高,较佳的为40%或更高。本发明的多重拷贝表位还可包含多重同一表位的精确拷贝。
国际出版号WO97/44469中描述了用于本试验的代表性MEFA。用于本文的其它代表性MEFA包括称为MEFA12、MEFA13和MEFA13.1的那些。应理解这些MEFA仅是代表性的,其它衍生自HCV基因组的表位也可用于本发明,并掺入这些和其它MEFA。
图7A到7F显示了MEFA12的DNA序列及相应的氨基酸序列。图6显示了MEFA12的结构通式,其如下:hSOD-E1(1型)-E2 HVR共有序列(1a型)-E2 HVR共有序列(1和2型)-c33c短(1型)-5-1-1(1型)-5-1-1(3型)-5-1-1(2型)-c100(1型)-NS5(1型)-NS5(1型)-核心(1+2型)-核心(1+2型)。这种多拷贝表位包括以下氨基酸序列,相对于HCV-1编号(以下所述的氨基酸编号是按照Choo等人(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:2451-2455中的编号标志进行的,其中氨基酸#1是由核心区域的编码序列编码的第一个甲硫氨酸):超氧化物歧化酶的氨基酸1-69(SOD,用于提高蛋白质的重组表达);E1区域多蛋白的氨基酸303-320;多蛋白的氨基酸390-410,表现HCV-1a E2超变区的共有序列;区域E2多蛋白的氨基酸384-414,表现HCV-1和HCV-2的E2超变区的共有序列;HCV-1多蛋白的氨基酸1211-1457,其确定解旋酶;5-1-1,氨基酸1689-1735的表位的三种拷贝,一种来自HCV-1,一种来自HCV-3,另一种来自HCV-2,这些拷贝是HCV的三种不同病毒毒株的典型抗原性决定簇;HCV-1的多肽C100,多蛋白的氨基酸1901-1936;HCV-1的NS5区域表位的两种精确拷贝,各具有HCV多蛋白的氨基酸2278-2313;和核心区域表位的两种拷贝,一种来自HCV-1和一种来自HCV-2,这两种拷贝是由HCV-1的氨基酸9-32、39-42和64-88以及HCV-2的氨基酸67-84表现的等效抗原性决定簇。
表2显示了参考本文图7A-7F的各种表位的氨基酸位置。表格中的编号是根据HCV-1。见Choo等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:2451-2455。MEFA 13和13.1还共有MEFA12上面详述的通式,具有分别在表3和表4表明的修改。
表2 MEFA12
MEFA aa# |
5’末端位点 |
表位 |
hcv aa# |
病毒株 |
1-69* |
Ncol |
hSOD | | |
72-89 |
MluI |
E1 |
303-320 |
1 |
92-112 |
HindIII |
E2 HVR1a共有 |
390-410 |
1 |
113-143 | |
E2 HVR1+2共有 |
384-414 |
1,2 |
146-392 |
SpeI |
C33C短 |
1211-1457 |
1 |
395-441 |
SphI |
5-1-1 |
1689-1735 |
1 |
444-490 |
NruI |
5-1-1 |
1689-1735 |
3 |
493-539 |
ClaI |
5-1-1 |
1689-1735 |
2 |
542-577 |
AvaI |
C100 |
1901-1936 |
1 |
580-615 |
XbaI |
NS5 |
2278-2313 |
1 |
618-653 |
BglII |
NS5 |
2278-2313 |
1 |
654-741 |
NcoI |
核心表位 |
9-53,R47L64-8867-84 |
112 |
742-829 |
BalI |
核心表位 |
9-53,R47L64-8867-84 |
112 |
*截短SOD蛋白质,从而检测偶联物、HRP-标记的抗-SOD抗体不结合MEFA。核心表位突变,防止针对HCV核心的用于检测的抗体与MEFA结合。
表3 MEFA13
MEFA aa# |
5’末端位点 |
表位 |
hcv aa# |
病毒株 |
1-156 |
Ncol |
突变的hSOD(aa 70-72,ALA) | | |
161-178 |
MluI |
E1 |
303-320 |
1 |
181-201 |
HindIII |
E2 HVR1a共有 |
390-410 |
1 |
202-232 | |
E2 HVRI+2共有 |
384-414 |
1,2 |
235-451 | |
C33C短 |
1211-1457 |
1 |
454-500 |
HindIII |
5-1-1 PI突变 |
1689-1735 |
1 |
| |
* | | |
503-549 |
NruI |
5-1-1 PI突变* |
1689-1735 |
3 |
552-598 |
ClaI |
5-1-1 PI突变* |
1689-1735 |
2 |
601-636 |
AvaI |
C100 |
1901-1936 |
1 |
639-674 |
XbaI |
NS5 |
2278-2313 |
1 |
677-712 |
BglII |
NS5 |
2278-2313 |
1 |
713-800 | |
核心表位 |
9-53,R47L64-8867-84 |
112 |
801-888 | |
核心表位 |
9-53,R47L64-8867-84 |
112 |
*通过消除可能的NS3/4a重组蛋白针对的切割位点(CS或CA)修饰5-1-1表位。序列被变成PI,代替CS或CA。另外,SOD蛋白突变,从而使HRP标记的抗SOD抗体不和MEFA结合。核心表位突变成防止用于检测的针对HCV核心的抗体与MEFA结合。
表4 MEFA13.1
MEFA aa# |
5’末端位点 |
表位 |
hcv aa# |
病毒株 |
1-86 |
Ncol |
突变的hSOD(aa 70-72,ALA) | | |
89-106 |
MluI |
E1 |
303-320 |
1 |
109-129 |
HindIII |
E2 HVR1a共有 |
390-410 |
1 |
130-160 | |
E2 HVR1+2共有 |
384-414 |
1,2 |
163-379 | |
C33C短 |
1211-1457 |
1 |
382-428 |
HindIII |
5-1-1 PI突变* |
1689-1735 |
1 |
431-477 |
NruI |
5-1-1 PI突变* |
1689-1735 |
3 |
480-526 |
ClaI |
5-1-1 PI突变* |
1689-1735 |
2 |
529-564 |
AvaI |
C100 |
1901-1936 |
1 |
567-602 |
XbaI |
NS5 |
2278-2313 |
1 |
605-640 |
BglII |
NS5 |
2278-2313 |
1 |
641-728 | |
核心表位 |
9-53,R47L64-8867-84 |
112 |
729-816 | |
核心表位 |
9-53,R47L64-8867-84 |
112 |
*通过消除可能的NS3/4a重组蛋白针对的切割位点(CS或CA)修饰5-1-1表位。序列被变成PI,代替CS或CA。另外,SOD蛋白突变,从而使HRP标记的抗SOD抗体不和MEFA结合。核心表位突变成防止用于检测的针对HCV核心的抗体与MEFA结合。
在一个试验模式中,样品如下所述与固相载体混合,如果样品被HCV感染,核心抗原和与存在于固相载体表面的HCV抗体将与固相载体成分结合。然后加入带可检测标记抗核心抗体。带标记的抗核心抗体针对与固相载体结合的抗核心抗体不同的表位。该抗核心抗体与固相载体上的抗核心抗体捕获的核心抗原结合。
还加入了与来自生物学样品的捕获的HCV抗体反应的抗原,该捕获的样品HCV抗体与NS3/4a表位反应。该抗原优选是衍生自HCV多蛋白NS3区的表位。该抗原与样品的捕获的HCV抗体结合。已知许多包含这些表位的抗体,包括但不限于衍生自c33c和c100区的抗原,以及含有NS3表位,例如c25的融合蛋白。这些和其它NS3表位用于本试验,是本领域已知的,在Houghton等,美国专利号5,350,671;Chien等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1992)89:10011-10015;Chien等,J.Gastroent.Hepatol.(1993)8:S33-39;Chien等,国际出版号WO 93/00365;Chien,D.Y.,国际出版号WO 94/01778;和共有的美国专利申请No.08/403,590和08/444,818中有所描述。
加入针对上述抗原的带标记的第二抗体。该抗体针对抗原所含的任何表位。例如,抗体可针对抗原中存在的NS3区域。另外,如果上述抗原表达成融合蛋白,则带标记的第二抗体可针对融合子的配体。可在试验中加入其它抗原和抗体,特别是如果固相载体含有MEFA。这些试验模式如下所解释。
本发明中的代表性试验如图2所述。如图所示,固相载体含有两种抗核心单克隆抗体,称为c11-3和c11-7。这些抗体针对核心蛋白氨基酸10-53处发现的N-区域中发现的一个表位,数目是根据HCV1的多蛋白序列。该固相载体还包括对于NS3/4a的表位。在固相载体中加入生物学样品。样品中存在的HCV核心抗原和针对NS3/4a表位的抗体将与固相载体上的捕获试剂结合。
然后加入辣根过氧化物酶(HRP)-标记的抗核心单克隆抗体c11-14,针对氨基酸位置120-130发现的核心C-末端区域,编号根据HCV1多蛋白序列。加入含有人SOD(hSOD)和来自c33c区域的表位的融合蛋白,作为第二个HRP标记的抗体,针对融合蛋白的SOD区域。SOD-c33c融合蛋白将与抗-NS3抗体结合,抗SOD抗体还与SOd-c33c融合蛋白结合。标记的检测表明HCV蛋白的存在。
本发明中使用的另一个代表性试验如图8所示。抗体试验形式是使用NS3/4a和MEFA12的抗原-抗体-抗原夹心捕获试验。固相载体包括上述的两个抗-核心单克隆抗体,NS3/4a的表位,以及代表性MEFA、MEFA12,它包括截短形式的人SOD。在上述试验中,在固相载体中加入生物学样品。存在于样品中的HCV核心抗原和针对NS3/4a表位和MEFA表位的抗体,将与固相载体上的捕获试剂结合。加入两种抗原,一种与结合NS3/4a(如上所述)的样品抗体反应,一种与结合MEFA12的样品抗体反应。在图8中,与MEFA12/样品抗体复合物反应的抗原是SOD分子和c22ksΔ47-L44W之间的融合蛋白。c22ks抗原来自核心区域,并包括多蛋白的氨基酸Lys10-Ser99,以及通常存在的Arg47缺失,和44位的Leu取代Trp。抗体检测偶联物是上述的第二种HRP-标记的单克隆抗-SOD抗体。
上述抗原/抗体组合试验特别有利,因为HCV核心抗原和针对NS3/4a的抗体和/或核心可以在同一试验中用同一载体检测。另外,如上所述,其它HCV表位,例如与c100、5-1-1、NS5抗原,以及多蛋白核心区域框架漂移获得的蛋白质(如国际出版物号WO 99/63941)可用于组合混合物以覆盖其它HCV的非结构表位。
为了进一步理解本发明,在下文关于产生用于免疫试验的抗体;产生用于免疫试验的多肽;和进行免疫试验的方法部分提供了更详细的讨论。
生产用于HCV免疫试验的抗体
如上所述,本试验利用各种结合于固相载体的抗体(例如一种或多种抗核心抗体)和当样品中存在HCV感染时,能检测形成的抗原/抗体复合物的抗体。这些抗体可以是多克隆或单克隆抗体制备物、单特异性抗血清、人抗体或可以是杂交或嵌合的抗体,例如人源化抗体、改变的抗体、F(ab’)2片段、F(ab)片段、Fv片段、单结构域抗体、二聚或三聚抗体片段构建物、小体或其功能性片段,它能与感兴趣的抗原结合。
利用本领域技术人员熟知的技术生产抗体,公开于例如:美国专利号4,011,308;4,722,890;4,016,043;3,876,504;3,770,380和4,372,745。例如,多克隆抗体是通过用感兴趣的抗原免疫合适的动物,例如小鼠、大鼠、家兔、绵羊或山羊产生的。为了增强免疫原性,抗原可以与载体在免疫接种前连接。这些载体是本领域一般技术人员熟知的。免疫接种通常是通过在盐水,优选佐剂(例如弗氏完全佐剂)中混合或乳化抗原,然后在胃肠外(皮下或肌内)注射混合物或乳液进行的。动物在2-6周后用一次或多次注射抗原的盐水溶液(优选用弗氏完全佐剂)增强免疫动物。抗体还可以通过本领域已知的方法体外免疫接种产生。然后从免疫的动物获得多克隆抗血清。见例如Houghton等,美国专利号5,350,671对于产生抗HCV多克隆抗体的描述。
通常用Kohler和Milstein(1975)Nature 256:495-497的方法或其改变形式制备单克隆抗体。通常,如上所述接种小鼠或大鼠。然而,不对动物放血提取血清,而是除去脾脏(可任选的几个大的淋巴结)分解成单细胞。如需要,可通过将细胞悬液涂到平板上或用抗原包裹良好,筛选脾细胞(除去非特异性附着的细胞后)。表达对抗原特异性的膜结合免疫球蛋白的B细胞将与平板结合,用剩余的悬液漂洗不去。得到的B-细胞和所有分散的脾细胞被诱导与骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤,并在选择性培养基(例如次黄嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶培养基“HAT”)中培养。通过限制性稀释将得到的杂交瘤铺板,并测试与免疫接种的抗原(不和无关抗原)特异性结合的抗体的产生。所选的分泌单克隆抗体的杂交瘤然后体外(例如在组织培养瓶或空心纤维反应器中)或体内(例如作为小鼠中的腹水)培养。
各种抗-HCV单克隆抗体的产生如Houghton等,美国专利号5,350,671;Chien等,国际出版号WO93/00365;共有的美国专利申请号08/403,590和08/444,818;和Kashiwakuma等,美国专利号5,871,904中所述。
如上所解释的,保留能识别感兴趣抗原能力的抗体片段也能用于本免疫试验。许多抗体片段是本领域已知的,它们含有能显示完整抗体分子的免疫学结合性质的抗原结合位点。例如,可通过在抗体分子上,使用例如胃蛋白酶切下不负责抗原结合的恒定区产生F(ab’)2片段,从而产生功能性抗体片段。这些片段将含有两个抗原结合位点,但各重量上缺少一部分恒定区。类似的,如果需要,可产生含有单个抗原结合位点的Fab片段,例如通过用木瓜蛋白酶消化多克隆抗体或单克隆抗体。还可产生仅含重链和轻链的可变区的功能性片段。这些片段称为Fv。见例如Inbar等(1972)
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 69:2659-2662;Hochman等(1976)Biochem15:2706-2710;和Ehrlich等(1980)
Biochem 19:4091-4096。
单链Fv(“sFv”或“scFv”)多肽是共价连接的Vh-Vl异二聚体,它是从含有VH和VL编码的基因通过肽编码的接头的基因融合物表达的。Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883。已描述了许多方法,来辨别和开发化学结构(接头),用于将来自抗体V区域的天然聚集的、但化学分开的轻链和重链多肽转换成sFv分子,它将折叠成与抗原结合位点相似的立体结构。见例如美国专利号5,091,513、5,132,405和4,946,778。sFv分子可以用本领域所述的方法产生。见例如Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883;美国专利号5,091,513、5,132,405和4,946,778。设计条件包括确定跨越一条链的C-末端和另一条的N-末端的距离的合适长度,其中通常用小亲水氨基酸残基形成接头,它们不会卷曲或形成二级结构。这些方法在本领域中有所描述。见例如美国专利号5,091,513、5,132,405和4,946,778。合适的接头通常包括甘氨酸和丝氨酸残基可替换的组的多肽链,还可以包括插入以增强稳定性的谷氨酸和赖氨酸残基。
“小抗体”或“小体”也可用于本发明。小体是在C-末端具有寡聚结构域,与sFv通过铰链区分隔的sFv多肽链。Pack等(1992)Biochem 31:1579-1584。寡聚结构域含有自身结合的α-螺旋,例如亮氨酸拉链,它可以通过额外的二硫键进一步稳定。设计寡聚结构域与跨膜的载体折叠相容,该过程被认为是促进多肽体内折叠成功能性结合蛋白。一般,小体是用本领域已知的重组方法产生的。见例如Pack等(1992)Biochem 31:1579-1584;Cumber等(1992)J Immunology 149B:120-126。
HCV免疫试验中所用的抗原生产
如上解释的,本发明分子通常是重组产生的。因此,本发明所用的编码HCV抗原的多核苷酸可用分子生物学的标准技术产生。例如,编码上述分子的多核苷酸序列可以用重组方法获得,例如通过筛选来自表达该基因的细胞的cDNA和基因组文库,或通过从已知含有该基因的载体中衍生出该基因。另外,所需基因可以直接从病毒核酸分子中分离,使用本领域所描述的技术例如Houghton等,美国专利号5,350,671。还可以合成产生感兴趣的基因,而不是用克隆。然后从标准方法制备的重叠寡核苷酸装配完整的序列,并装配成完整的编码序列。参见,如Edge(1981)Nature 292:756;Nambair等人(1984)Science 223:1299;和Jay等人(1984)J.Biol.Chem.259:6311。
因此,从携带所需序列的载体获得具体的核苷酸序列,或用本领域已知的各种寡核苷酸合成方法,如定位诱变和聚合酶链式反应(PCR),完全或部分合成。参见,如Sambrook,上述。具体说,获得编码所需序列的核苷酸序列的方法是退火整套用常规的自动多核苷酸合成仪制备的重叠的合成的寡核苷酸,然后用适当的DNA连接酶连接,并用PVR扩增连接的核苷酸序列。参见,如Jayaraman等人(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:4084-4088。另外,在本发明中也可使用寡核苷酸定向的合成(Jones等人,(1986)Nature 54:75-82)、寡核苷酸定向的原有核苷酸区域的诱变(Riechmann等人,(1988)Nature 332:323-327和Verhoeyen等人(1988)Science 239:1534-1536)和用T4DNA聚合酶进行的酶促充填带缺口的寡核苷酸(Queen等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:10029-10033),以提供抗原结合能力变化或提高的和/或免疫原性降低的分子。
一旦制备或分离了编码序列,就可将这些序列克隆入任何适合的载体或复制子中。对本领域技术人员而言各种克隆载体是已知的,且对适当的克隆载体的筛选仅是一种选择方式。合适的载体包括(但并非限制于):质粒、噬菌体、转位子、粘粒、染色体或当与适当的控制元件结合时能复制的病毒。
然后将克隆序列置于适当的控制元件的控制下,这取决于用于表达的系统。因此,可以将编码序列置于启动子、核糖体结合位点(用于细菌表达)和任选地操纵子的控制下,从而由合适的转化体将感兴趣的DNA序列转录到RNA中。该编码序列可以包含或不包含信号肽或前导序列(随后可由宿主在翻译后加工除去)。参见,如美国专利No.4,431,739;4,425,437;4,338,397。
除了控制序列外,可以添加调节序列,从而可以相对于宿主细胞的生长调节序列的表达。调节序列是本领域技术人员已知的,其实例包括那些能导致应答化学或物理刺激(包括调节化合物的存在)启动护关闭基因表达的调节序列。载体中还可存在其它类型的调节元件。例如,可以使用增强子元件以增加构建物的表达水平。实例包括SV40早期基因增强子(Dijkema等人(1985)EMBO J.4:761);从Rous肉瘤病毒的长末端重复序列(LTR)衍生的增强子/启动子(Gorman等人(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79:6777);和从人CMV衍生的元件(Boshart等人,(1985)Cell 41:521),如CMV内含子A序列中包括的元件(美国专利No.5,688,688)。表达盒中还可包括在适合的宿主细胞中自动复制的复制起点、一种或多种可选择的标记物、一个或多个限制内切位点、高拷贝数量的可能性和强启动子。
构建表达载体,使具体的编码序列位于该具有适合调节序列的载体中,相对于控制序列编码序列的位置和起点使编码序列在控制序列的“控制”下转录(即,结合于控制序列中DNA分子的RNA聚合酶转录该编码序列)。可能需要对编码感兴趣分子的序列进行修饰来实现此目的。例如,在一些情况中可能需要修饰该序列,从而使其连接于适合方向的控制序列,即维持读框。在插入到载体中之前,控制序列和其它调节序列可能连接于编码序列。或者,可以将编码序列直接克隆入已包含控制序列和合适的限制内切位点的表达载体。
如以上解释,还可能需要制备感兴趣抗原的突变体或类似物。尤其对NS3/4a而言。如此制备的方法在如下文献中有描述,如Dasmahapatra等人的美国专利No.5,843,752和Zhang等人的美国专利No.5,990,276。通过缺失编码感兴趣多肽的一部分序列、插入序列、和/或替代该序列中的一个或多个核苷酸,可以制备用于分析的这种和其它HCV蛋白的突变体或类似物。修饰核苷酸序列的方法,如定向诱变等是本领域技术人员所熟知的。参见,如Sambrook等人,上述;Kunkel,T.A.(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1985)82:448;Geisselsoder等人(1987)BioiTechniques 5:786;Zoller和Smith(1983)Methods Enzymol.100:468;Dalbie-McFarland等人(1982)Proc.Natl.Acad.Sci USA 79:6409。这种分子可以在各种系统中表达,包括本领域熟知的昆虫、哺乳动物、细菌、病毒和酵母表达系统。
例如,昆虫细胞表达系统如杆状病毒系统是本领域技术人员已知的,描述于如Summers和Smith,Texas Aguricultural Experiment Station BulletinNo.1555(1987)。用于杆状病毒/昆虫细胞表达系统的材料和方法都是可以试剂盒形式购得的,尤其可从Invitrogen,San Diego CA(″MaxBac″试剂盒)。类似地,细菌和哺乳动物序列表达系统也是本领域熟知的,其描述见如Sambrook等人,如上。酵母表达系统也是本领域熟知的,其描述见如Yeast GeneticEngineering(Barr等人编辑,1989)Butterworths,London。
大量用于上述系统的适合的宿主细胞也是已知的。例如,哺乳动物细胞系是本领域已知的,其包括可从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的永生化的细胞系,如(但并非限制于)中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、Hela细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人胚肾细胞、人肝细胞癌细胞(如Hep G2)、Madin-Darby牛肾(″MDBK″)细胞等。类似地,在本发明的表达构建物中也可使用细菌宿主,如大肠杆菌、枯草杆菌和链球菌。在本发明中还可用酵母宿主,特别包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、白假丝酵母(Candida maltosa)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、季也蒙毕赤酵母(Pichia guillerimondii)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)和yarrowia lipolytica。可与杆状病毒表达系统一起使用的昆虫细胞特别包括埃及伊蚊(Aedes aegypti)、桃木菌(Autographa californica)、家蚕(Bombyxmori)、果蝇(Drosophila melanogaster)、表皮球菌(Spodoptera frugiperda)和阴道炎菌(Trichoplusia ni)。
用本领域所熟知的各种基因送递的方法,可将包含感兴趣核苷酸序列的核酸分子稳定地整合入宿主细胞基因组中或在合适的宿主细胞的稳定的附加型元件上维持。参见,如美国专利No.5,399,346。
根据所选用的表达系统和宿主,在表达蛋白质的条件下,培养用如上所述的表达载体转化的宿主细胞制备该分子。然后从宿主细胞分离出表达的蛋白质并纯化。如果表达系统将蛋白质分泌到培养基中,则直接从培养基纯化产物。如果不是分泌的,则从细胞裂解液分离。适合的培养条件和回收方法的选择都是本领域技术人员能力之内的。
已描述了各种HCV抗原的制备,包括用于如上所述的多重表位融合蛋白的抗原。参见,如Houghton等人,美国专利No.5,350,671和5,683,864;Chien等人,J.Gastroent.Hepatol.(1993)8:S33-39;Chien等人,国际出版物No.WO93/00365;Chien,D.Y.,国际出版物No.WO 94/01778;Chien等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1992)89:10011-10015;Chien,D.Y.,国际出版物No.WO94/01778;和共同拥有的美国专利申请No.08/403,590和08/444,818。
免疫诊断试验
一旦产生,上述抗核心抗体和NS3/4a抗原可以置于合适的固相载体上,用于该免疫试验。为了本发明,固相载体可以是任何物质,它是不溶性的基质,并可具有粗糙或半粗糙的表面。示范性的固态支持物包括(但并非限制于)基质如硝化纤维素(如以膜或微量滴定孔形式);聚氯乙烯(如板或微量滴定孔);聚苯乙烯乳胶(如珠或微量滴定板);聚偏二氟乙烯;重氮化纸;尼龙膜;活化的小珠、磁力感应小珠等。具体的支持物包括板、小球、皿、毛细管、空心纤维、针、钉、固体纤维、纤维素小珠、微孔玻璃小珠、硅胶、聚苯乙烯小珠(任选地与二乙烯苯交联)、嫁接的共聚小珠、聚丙烯酰胺小珠、乳胶小珠、二甲基丙烯酰胺小珠(任选地与N-N’-二-丙烯酰乙烯二胺交联)和用疏水聚合物包膜的玻璃珠。
如果需要,易将待加到固态支持物上的分子功能化,产生苯乙烯或丙烯酸部分,能让该分子掺入聚苯乙烯、聚丙酸酯或其它聚合物如聚酰亚胺、聚丙烯酰胺、聚乙烯、聚乙烯、聚二乙炔、聚苯撑-乙烯、多肽、多糖、聚砜、聚吡咯、聚咪唑、聚噻吩、聚醚、环氧树脂、硅石玻璃、硅氧烷、多磷酸盐、水凝胶、琼脂糖、纤维素等。
在一实例中,首先在合适的结合条件下,如让分子充分地固定于支持物上,将固态支持物与HCV抗原反应。有时可以提高支持物的固定化,通过首先将抗原和/或抗体与具有较好固相结合特性的蛋白质偶联。适合的偶联蛋白包括(但并非限制于)大分子如血清白蛋白,包括:牛血清白蛋白(BSA)、匙孔血蓝蛋白、免疫球蛋白分子、甲状腺球蛋白、卵白蛋白和本领域技术人员已知的其它蛋白质。其它可用于将分子结合于支持物的试剂包括多糖、聚乳酸、聚羟基乙酸、多聚氨基酸、氨基酸共聚物等。将这些分子与抗原偶联的分子和方法是本领域技术人员所熟知的。参见,如Brinkley,M.A.(1992)Bioconjugate Chem.3:2-13;Hashida等人(1984)J.Appl.Biochem.6:56-63;和Anjaneyulu和Staros(1987)International J.of Peptide and Protein Res.30:117-124。
在固相支持物上与固相成分反应后,冲洗除去支持物上未固定化的固相成分,然后在适合的结合条件下,将与支持物结合的成分与怀疑含有HCV抗体(本文将其总称为“配体分子)的生物样品接触。冲洗除去未结合的配体分子后,在合适的条件下加入针对与载体结合的抗核心抗体所针对的不同的表位的第二种抗核心抗体。加入的抗核心抗体带如上所述的可检测标记,并能结合任何存在于样品中,与载体结合的抗核心抗体反应的任何核心抗原结合。还加入一种或多种能与样品中存在的抗体反应的抗原,这些抗体反过来与NS3/4a表位反应。根据上面的解释,抗原通常衍生自HCV多蛋白的NS3区,特别是来自HCV的c33c区。见Houghton等,美国专利号5,350,671;Chien等,Proc.Natl.Acad.Sci.(1989)89:10011-10015;国际出版号WO 93/00365;和共同拥有的美国专利申请号08/403,590和08/444,818,对于该区域和从其衍生的表位的描述。还加入了针对该抗原的标记的抗体。因此该抗体与抗原结合,它们与存在于样品中的抗NS3抗体反应。为此,c33c表位可方便的作为用Houghton等,美国专利号5,350,671提供的方法重组产生的c33c和人超氧化物歧化酶(hSOD)之间的融合蛋白。人SOD的核苷酸和氨基酸序列是已知的,在Hallewell等,美国专利号5,710,033中报道。因此,针对人SOD的标记的抗体可用于检测在NS3/4a表位、样品中与该表位反应的任何抗体、和与样品中抗体结合的HCV多肽之间形成的复合物的存在。
如果在固相载体表面存在MEFA,可在试验中加入与来自生物学样品的抗体有反应性的抗原,所述抗体与存在于MEFA上的抗原结合。在该情况下特别有用的一种衍生自HCV核心区域的抗原,更具体的是来自c22的抗原,它含有HCV多蛋白的119个N-末端核心氨基酸。衍生自c22的一种特定抗原是c22ksΔ47-L44W,它含有多蛋白的氨基酸Lys10-Ser99,以及通常存在的Arg47的缺失和44位的Trp到Leu的取代。对于上述的c33c表位,该抗原可作为与hSOD的融合蛋白提供,同一针对人SOD的标记抗体可用于检测存在于样品中的抗体和NS3/4a和/或MEFA形成的复合物的存在,该复合物还和HCV抗原(例如c33c和c22)结合。
更具体的,可用ELISA法,其中微量滴定板的孔用固相成分包裹。然后在包裹的孔中加入含有或怀疑含有配体分子的生物学样品。一段足够使配体分子与固定的固相载体成分结合的时间后,洗涤平板以除去未结合的分子,加入可检测标记的第二种结合分子(标记的抗核心抗体)、含NS3表位的分子和针对含NS3表位的分子的抗体。这些分子能与任何捕获的样品抗原和抗体反应,洗涤平板并用本领域熟知的方法检测。
上述试验试剂,包括具有结合的抗体和抗原的免疫试剂固相载体和与捕获样品反应的抗原,可以具有合适的说明书和其它必需试剂的试剂盒提供,以进行如上所述的免疫试验。试剂盒还可以视所用的特定免疫试验而定,含有合适的标记和其它包装的试剂和物质(即洗涤缓冲液等)。标准免疫试验,例如上述的可用这些试剂盒进行。
III.实验
下面是实施本发明所需的特定实施例的例子。这些实施例仅为了说明,而不是要以任何形式限制本发明的范围。
进行了努力,确保使用的数据(例如量和温度等)的准确性,但应理解一些实验错误和偏差是允许的。
实施例1
HCV抗原/抗体组合免疫试验
将本HCV抗原/抗体组合免疫试验与其它HCV试验比较,以测试血清转化检测极限,并如下与其它市售试验获得的比较其极限。
A.材料和方法
血液样品:使用了市售人血液平板。这些平板购自例如Boston Biomedia,Inc.,West Bridgewater,MA(BBI);Bioclinical Partners,Franklin,MA(BCP);和NorthAmerican Biologics,Inc.,BocoRatan,FL(NABI)。表5和6中指出的日子是从个体收集血液的日子。
单克隆抗体:单克隆抗体c11-3、c11-7和c11-4从Ortho Clinical Diagnostics,Raritan,New Jersey获得。c11-3和c11-7抗体针对核心的N-末端部分(氨基酸10-53,根据HCV1多蛋白编号)。单克隆抗体c11-14针对核心的C-末端部分(氨基酸120-130,根据HCV1多蛋白编号)。c11-14抗体与辣根过氧化物酶(HRP)用标准方法偶联。
单克隆抗体5A-3是抗SOD抗体,针对SOD的氨基酸1-65,用标准技术制备。抗体与HRP如上偶联。
B.抗原:
c33c抗原(266氨基酸,HCV1多蛋白氨基酸1192-1457)作为内部SOD融合多肽在大肠杆菌中用合成5-1-1抗原的方法表达(Choo等,Science(1989)244:359-362)。重组抗原如Chien等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1989)89:10011-10015所述纯化。另见Houghton等,美国专利号5,350,671产生SOD-c33c的方案。
本试验中使用的NS3/4a表位是具有图3所示的序列的构象表位。
C.免疫试验模式:
Abbott PRISM试验(Abbott Laboratories,Abbott Park,IL)是市售的,并且是基于抗体的检测试验。用厂商的说明进行试验。
ORTHO HCV 3.0版ELISA测试系统(本文中称为Ortho 3.0试验,Ortho ClinicalDiagnostics,Raritan,New Jersey)是一种基于抗体的检测试验。用厂商的说明进行试验。
Roche Amplicor试验(Roche,Pleasant,CA)是市售的基于PCR的试验。用厂商的说明进行试验。
Ortho抗原试验(Ortho Clinical Diagnostics,Raritan,New Jersey)是基于抗原的检测试验。用厂商的说明进行试验。
如下进行HCV抗原/抗体组合免疫试验。混合4mg/ml纯化的单克隆抗体C11-7和C11-3和1x磷酸缓冲盐(PBS),pH7.4并充分混合。在同一封闭缓冲液中加入90ngNS3/4a重组抗原。混合溶液30分钟,然后封闭。在96孔Costar培养基结合微量滴定板(Corning,Inc.)中每孔加入200mL溶液。平板在15-30℃培养16-24小时。用dH2O洗涤平板两次,然后用300微升/孔封闭后缓冲液(1%牛血清白蛋白(BSA),1xPBS)1小时,300微升/孔稳定缓冲液(1xPBS,1%BSA,甘露醇,聚乙二醇(PEG),明胶)1小时。吹洗平板并在4℃在冻干器上干燥24小时。平板与干燥剂一起入袋。
为了进行抗原/抗体组合免疫试验,在平板中加入100微升增强裂解缓冲液(1%N-十二烷基肌氨酸,0.65M NaCl,50mg/ml小鼠IgG原料级(Sigma,St.Louis,MO),1%巯基修饰的BSA(Bayer),0.1%酪蛋白)。然后加入100ml样品。这在摇床中40℃保温1小时。用1xPBS、0.1%Tween-20在Ortho Plate Washer上洗涤平板6次。200mL偶联溶液(1∶75稀释的c11-14-HRP和250ng/试验的SOD-c33c抗原加上1∶5000稀释的小鼠抗-SOD-HRP的HCV 3.0样品稀释剂(来自ORTHO HCV 3.0版ELISA测试系统,Ortho Clinical Diagnostics,Raritan,New Jersey),不含SOD提取物,全部在加入前30分钟制备)。溶液40℃振摇保温45分钟如上洗涤6次,加入200ml底物溶液(1OPD片剂/10ml)。OPD片剂含有辣根过氧化物酶反应显色所需的对苯二胺二盐酸和过氧化氢,购自Sigma,St.Louis,MO。这避光15-30℃保温30分钟。加入50ml 4N H2SO4终止反应,并在492nm阅读平板,相对于690nm处的吸光度作为对照。
D.结果:
各种试验的结果如表5和6所示,描述了如所示,对接触HCV感染的血液样品进行两个独立试验。阴影区表示检测到病毒。如下文所示,Chiron的组合抗原/抗体试验在所有样品中检测到血清转化,而所有其它基于抗体和抗原的实验不能检测至少一种样品中的血清转化。特别是在至少18天前,没有基于抗体的试验能检测血清转化(表5)。表6显示基于抗体的试验在第22天都检测不到HCV感染的存在。另外,Ortho基于抗原的试验从第85天起不能检测血清转化。
因此基于上述结果,清楚的是新组合抗体/抗原试验减少了用其它常规基于抗体或抗原的试验的假阴性数量。
表5 HCV血清转化
天 |
AbbottPRISM |
Ortho 3.0 |
RocheAmplicor |
Gen-ProbeTMA |
Ortho Ag |
ChironAg/Ab |
0 |
0.1 |
0.0 |
>5×105 |
9.25 |
18.6 |
2.8 |
4 |
0.1 |
0.0 |
>5×105 |
9.29 |
19.0 |
3.1 |
7 | 0.1 | 0.0 | >5×105 | 9.52 | 22.3 | 1.5 |
13 |
0.3 |
0.1 |
>5×105 |
9.59 |
26.2 |
1.7 |
18 |
1.3 |
0.4 |
>5×105 |
9.70 |
15.9 |
1.2 |
21 |
2.2 |
1.0 |
>5×105 |
9.39 |
11.3 |
1.5 |
164 |
4.2 |
4.4 |
4×104 |
9.28 |
0.11 |
2.5 |
表6
HCV血清转化
天 |
AbbottPRISM |
Ortho 3.0 |
RocheAmplicor |
Gen-ProbeTMA |
Ortho Ag |
ChironAg/Ab |
0 |
0.1 |
0.0 |
BLD | |
0.11 |
0.5 |
13 |
0.1 |
0.0 |
>5×105 | |
44.0 |
3.0 |
20 |
0.1 |
0.0 |
>5×105 | |
24.2 |
1.3 |
22 |
0.3 |
0.0 |
>5×105 | |
29.2 |
1.6 |
85 |
5.4 |
4.7 |
BQR | |
0.06 |
1.1 |
131 |
4.3 |
4.7 |
BQR | |
0.09 |
1.0 |
135 |
4.6 |
4.7 |
3×103 | |
0.09 |
1.2 |
138 |
5.5 |
4.7 |
BLD | |
0.08 |
1.2 |
146 |
5.9 |
4.7 |
BLD | |
0.11 |
2.1 |
152 |
5.2 |
4.7 |
BQR | |
0.07 |
1.8 |
实施例2
具有Thr到Pro和Ser到Ile的取代的NS3/4a构象表位的制备
如下获得NS3/4a的构象表位。该表位具有图4A-4D所述的序列,与403位(HCV-1全长序列的氨基酸1428)和404位(HCV-1全长序列的氨基酸1429)的天然序列不同。具体说,在天然序列1428位上通常出现的Thr已突变成Pro,且天然序列1429位上出现的Ser已突变为Ile。
具体说,所用的酵母表达载体是pBS24.1(如上所述)。如下制备质粒pd.hcvla.ns3ns4aPI,其编码用于本发明免疫测定的典型NS3/4a表位。使用两步流程。首先,将以下的DNA片段连接在一起:(a)合成的寡核苷酸,其提供5′HindIII克隆位点,随后接序列ACAAAACAAA,起始密码子ATG,和HCV1a的密码子,从氨基酸1027开始继续到氨基酸1046的BglI位点;(b)来自pAcHLTns3ns4aPI的683bp的BglI-ClaI限制性片段(编码氨基酸1046-1274);和(c)HindIII和ClaI消化,去磷酸和凝胶纯化的的pSP72载体(Promega,Madison,WI,GenBank/EMBLAccession Number X65332)。质粒pAcHLTns3ns4aPI衍生自pAcHLT,一种BDPharmingen(San Diego,CA)购得的杆状病毒表达载体。特别是制备了pAcHLTEcoRI-PstI载体和如下片段:EcoRI-AlwnI,935bp,对应于HCV-1基因组的氨基酸1027-1036,AlwnI-SacII,247bp,对应于HCV-1基因组的氨基酸1336-1419;HinfI-BglI,175bp,对应于HCV-1基因组的氨基酸1449-1509;BglI-PstI,619bp,对应于HCV-1基因组的氨基酸1510-1711,加上转录终止密码子。SacII-HinfI合成产生的91bp片段(对应于HCV-1基因组的氨基酸1420-1448,含有PI突变(Thr-1428突变成Pro,Ser-1429突变成Ile))与上述的175bp HinfI-BglI和619bp的BglI-PstI片段连接,并亚克隆入用SacII和PstI消化的pGEM-5Zf(+)载体。pGEM-5Zf(+)是市售的大肠杆菌载体(Promega,Madison,WI,GenBank/EMBL登录号X65308)。在转化感受态HB101细胞,单个克隆小筛选分析并证实序列后,凝胶纯化pGEM5.PI克隆2的885bp的SacII-PstI片段。该片段与上述的EcoRI-AlwnI 935bp片段、AlwnI-SacII 247bp片段和pAcHLT EcoRI-PstI载体连接。得到的构建物命名为pAcHLTns3ns4aPI。
上述连接混合物转化入HB101-感受态细胞,并铺在含有100微克/毫升青霉素的Luria琼脂平板上。单个克隆的少量制备物分析鉴定了可能的阳性,扩增了其中两个用Qiagen Maxiprep试剂盒制备pSP72 1aHC,克隆#1和#2的质粒DNA,并测序。
接着,连接下列片段:(a)来自pSP721aHC#1761bpHindIII-ClaI片段(pSP72.1aHC是通过连接下列片段产生的:用HindIII和ClaI消化的pSP72,提供5′HindIII克隆位点的寡核苷酸,接着是序列ACAAAACAAA,起始密码子ATG和HCV1a的密码子,从氨基酸1027开始,直到氨基酸1046处的BglII位点,和来自pAcHLTns3ns4aPI的683bp BglII-ClaI限制性片段(编码氨基酸1046-1274));(b)酵母杂交启动子ADH2/GAPDH的1353bp的BamHI-HindIII片段;(c)来自pAcHLTns3ns4aPI的1320bpClaI-SalI片段(编码HCV1a氨基酸1046-1711,其中Thr1428突变成Pro,Ser1429突变成Ile);和(d)被BamHI和SacI消化,去磷酸化和凝胶纯化的pBS23.1酵母表达载体。该连接混合物转化入感受态HB101细胞,并铺在含有100微克/毫升青霉素的Luria琼脂平板上。单个克隆的小制备物分析鉴定了具有预期的3446bp的BamHI-SalI插入的克隆,该片段包括ADH2/GAPDH启动子,起始密码子ATG和氨基酸1027-1711的HCV1a NS3/4a(显示图4A-4D的氨基酸1-686),Thr1428(图4A-4D的氨基酸位置403)突变成Pro,Ser1429(图4A-4D的氨基酸位置404)突变成Ile。构建物称为pd.HCV1a.ns3ns4aPI(见图5)。
用pd.HCV1a.ns3ns4aPI转化酿酒酵母株,在耗尽培养基中的葡萄糖后检查单个转化子的表达。在酵母中高水平表达重组蛋白质,如考马斯亮蓝染色检测到的,并由针对解旋酶结构域NS3的多克隆抗体来确定。
实施例3
NS3/4a构象表位的纯化
如下纯化NS3/4a构象表位。如上所述收集表达NS3/4a表位的酿酒酵母细胞。将细胞悬浮在裂解缓冲液(50mM Tris pH8.0,150mM NaCl,1mM EDTA,1mMPMSF,0.1μM抑胃酶肽),并以细胞∶缓冲液∶玻璃珠1∶1∶1的比例,用Dyno-Mill(Wab Willy a Bachofon,Basel,Switzerland)或等价装置来裂解。裂解液在30100xg中4℃离心30分钟,并在洗涤缓冲液(6ml/g起始细胞沉淀重量)中加入含有不溶性细胞组分的沉淀团块,室温振摇15分钟。洗涤缓冲液含有50mM NaPO4pH8.0、0.3M NaCl、5mM β-巯基乙醇、10%甘油、0.05%辛基葡糖苷、1mM EDTA、1mM PMSF、0.1μM抑胃酶肽、1μM亮抑肽酶。30100xg 4℃离心30分钟除去细胞碎片。丢弃上清液并保留沉淀。
如下从沉淀中抽提蛋白质。加入6ml/g抽提缓冲液并在室温振摇15分钟。抽提缓冲液含有30mM Tris pH8.0、1M NaCl、5mM β-巯基乙醇、10%甘油、1mMEDTA、1mM PMSF、0.1μM抑胃酶肽、1μM亮抑肽酶。这在30100xg 4℃离心30分钟。保留上清液并用下列配方加入达到17.55的硫酸铵:上清液的体积(ml)乘以x%硫酸铵/(1-x%硫酸铵)=加到上清液中的4.1M饱和硫酸铵的毫升数。一边在冰上搅拌,一边滴加硫酸铵,溶液在冰上搅拌10分钟。17700xg 4℃离心溶液30分钟,保留沉淀,储藏在2℃-8℃达48小时。
重新悬浮沉淀,并4℃如下过Poly U柱(Poly U Sepharose 4B,AmershamPharmacia)。沉淀重新悬浮在6ml Poly U平衡缓冲液/克沉淀重量中。平衡缓冲液含有25mM HEPES pH8.0、200mM NaCl、5mM DTT(新鲜加入)、10%甘油、1.2%辛基葡糖苷。4℃振摇溶液15分钟,31000xg离心30分钟。
制备Poly U柱(1ml树脂/克起始沉淀重量)。线性流速为60cm/hr,填充流速为133%60cm/hr。用平衡缓冲液平衡柱,并在平衡好的柱上加入重悬浮硫酸铵沉淀的上清液。用平衡缓冲液将柱洗到基线,在一步洗脱中用下列Poly U洗脱缓冲液洗脱蛋白质:25mM HEPES pH8.0、1M NaCl、5mM DTT(新鲜加入)、10%甘油、1.2%辛基葡糖苷。在SDS-PAGE上走柱洗脱物,冷冻等份并储藏在-80℃。用蛋白质印迹,使用针对NS3蛋白酶结构域的多克隆抗体和针对5-1-1表位(HCV 4a)的单克隆抗体肯定了NS3/4a表位的存在。
另外,在纯化过程中如下监测蛋白酶的酶活性。用90微升反应缓冲液(25mMTris,pH7.5,0.15M NaCl,0.5mM EDTA,10%甘油,0.05正十二烷基B-D-麦芽苷,5mM DTT)稀释NS4A肽(KKGSVVIVGRIVLSGKPAIIPKK)和含有NS3/4a构象表位的样品,并在室温下混合30分钟。将90微升该混合物加到微量滴定板(Costar,Inc.,Corning,NY)中,加入10微升HCV底物(AnaSpec,Inc.,San Jose CA)。混合平板并在Fluostar平板阅读仪上阅读。结果表达成相对荧光单位(RFU)/分钟。
用这些方法,1M NaCl抽提物的产物含有3.7RFU/分钟的活性,硫酸铵沉淀具有7.5RFU/分钟的活性,Poly U纯化的产物具有18.5 RFU/分钟的活性。
实施例4
竞争性研究
进行了下列竞争性研究,以评估NS3/4a构象表位检测的抗体是否与其它HCV抗原不同。具体说,将NS3/4a抗原与c200抗原如下比较。
如上所述产生的0.5μg和1.0μg NS3/4a,或c200(Hepatology(1992)15:19-25,在ORTHO HCv 3.0版ELISA测试系统,Ortho-Clinical Diagnostics,Raritan,NewJersey中可得)与20微升样品PHV914-5(感染个人获得的早期血清转化血液)以总体积220微升(1xPBS)混合。混合物在微孔中37℃培养1小时。然后将混合物转移到NS3/4a-包裹的平板中,并在37℃培育1小时。洗涤平板并如下测试。在总体积为约220微升的10微升样品PHV914-5中加入1微克c200抗原。混合物在微孔中37℃保温1小时,将200微升转移到NS3/4a-包裹的平板(100ng/试验)中,37℃保温1小时。用1xPBS、0.1%Tween-20、200微升偶联溶液(如上所述)洗涤平板5次,培养平板并测试。含有PHV914-5和1xPBS(不含抗原)的对照如下处理。
结果如表7所示。栏4中所示的百分数抑制结果计算成栏3负(栏2/栏3×100)。如所见,数据显示NS3/4a被早血清转化抗体中和,而c200没有。当PHV914-5c33c早血清转化组成员中的抗体与平板包裹的NS34a反应,显示强信号。c200抗原不被这些抗体中和。这显示于表7的顶部。当NS34a与PHV914-5样品混合时被中和,因此在样品中不存在与包裹在微量滴定板上的NS34a反应的抗体。数据表明NS34a检测的抗体类型可能与c200检测的不同。
表7
显示NS34a抗原在早期c33c血清转化组中,与c200检测不同的抗体竞争性研究
|
1 |
2 |
3 |
4 |
c200 |
+ |
PHV914-5 |
对照1xPBS |
%抑制 |
| |
s |
s | |
1微克 | |
1.450 |
1.645 |
12 |
1微克 | |
1.545 |
1.687 |
8 |
0.5微克 | |
1.557 |
1.913 |
19 |
0.5微克 | |
1.719 |
1.804 |
5 |
NS3/4a |
+ |
PHV914-5 | | |
| |
s |
s | |
1微克 | |
0.054 |
1.599 |
97 |
1微克 | |
0.037 |
1.677 |
98 |
0.5微克 | |
0.066 |
1.672 |
96 |
0.5微克 | |
NA |
1.524 |
NA |
实施例5
NS3/4a构象表位的稳定性研究
为了评估NS3/4a表位的稳定性对测试表现的影响,进行了下列试验,以测定在温室下NS3/4a免疫反应性在室温下对时间的关系。将小等份的储藏NS3/4a置于室温下,并在表8所示的间隔冷冻。所有小管同时包裹并针对两个NS3血清转化组测试。
如表8所见,NS3/4a储液不稳定,免疫反应性随时间下降。另外,维持NS3/4a构象是免疫反应性必需的。
如下进行了进一步的稳定性研究。用标准程序针对NS3/4a制备的两个构象单克隆抗体替换抗-HCV早期血清转化组。储藏NS3/4a试管在时间间隔3、6和24小时储藏在室温下。来自冷冻试管的NS3/4a以90ng/ml被包裹,并用上述方法试验。结果提示两种单克隆实际是构象性的,其反应性对于在室温下搬运NS3/4a抗原是敏感的。阳性对照的单克隆抗体的反应性不变。
表8
时间(hr) |
0 |
6 |
21.4 |
29 |
35.5 |
46 |
52 |
对照 |
|
A |
D |
G |
H |
I |
K |
N |
参照 |
|
s/co |
s/co |
s/co |
s/co |
s/co |
s/co |
s/co |
s/co |
PHV 904-1 |
0.0 |
0.0 |
0.0 |
0.0 |
0.0 |
0.0 |
0.0 |
0.0 |
PHV 904-2 |
0.0 |
0.0 |
0.0 |
0.0 |
0.0 |
0.0 |
0.0 |
0.0 |
PHV 904-3 |
1.5 |
0.3 |
0.1 |
0.0 |
0.0 |
0.0 |
0.0 |
1.8 |
PHV 904-4 |
3.7 |
1.0 |
0.2 |
0.1 |
0.1 |
0.1 |
0.1 |
44 |
PHV 904-5 |
4.8 |
2.0 |
0.7 |
0.6 |
0.3 |
0.2 |
0.3 |
5.5 |
PHV 904-6 |
5.4 |
2.8 |
1.1 |
1.0 |
0.6 |
0.5 |
0.6 |
5.8 |
PHV 904-7 |
5.1 |
3.4 |
1.5 |
1.0 |
1.1 |
0.5 |
0.7 |
5.4 |
PHV 914-1 |
0.0 |
0.0 |
0.0 |
0.0 |
0.0 |
0.0 |
0.0 |
0.0 |
PHV 914-2 |
0.0 |
0.0 |
0.0 |
0.0 |
0.0 |
0.0 |
0.0 |
0.0 |
PHV 914-3 |
0.0 |
0.0 |
0.0 |
0.0 |
0.0 |
0.0 |
0.0 |
0.0 |
PHV 914-4 |
0.5 |
0.1 |
0.0 |
0.0 |
0.0 |
0.0 |
0.0 |
0.7 |
PHV 914-5 |
2.1 |
0.4 |
0.0 |
0.0 |
0.0 |
0.0 |
0.0 |
3.0 |
PHV 914-6 |
2.3 |
0.4 |
0.0 |
0.0 |
0.0 |
0.0 |
0.0 |
3.4 |
PHV 914-7 |
2.8 |
0.5 |
0.1 |
0.1 |
0.0 |
0.0 |
0.0 |
4.9 |
PHV 914-8 |
2.9 |
0.7 |
0.1 |
0.1 |
0.1 |
0.1 |
0.1 |
4.9 |
酶 | | | | | | | | |
RFU/分钟 |
8.74 |
4.14 |
3.08 |
1.88 |
1.75 |
1.75 |
0.75 | |
实施例6
NS3/4a构象表位对变性NS3/4a的免疫反应性
将如上所述产生的NS3/4a构象表位的免疫反应性与通过在NS3/4a构象表位制备物中加入SDS,达到最终浓度2%而使之变性的NS3/4a进行比较。变性的NS3/4a和构象NS3/4a包裹在微量滴定板上。也将c200抗原(Hepatology(1992)15:19-25,在ORTHO HCv 3.0版ELISA测试系统,Ortho-Clinical Diagnostics,Raritan,New Jersey中可得)包裹在微量滴定板上。用c200作为比较,假定它是非构象的,由于在其配方中存在还原剂(DTT)和去污剂。
针对两个早期HCV血清转化组,PHV904和PHV914(市售人血样,购自BostonBiomeida,Inc.,West Bridgewater,MA)。结果如表9所示。数据提示NS3/4a(和c200)变性或线性化的形式不能像NS3/4a构象表位那么早检测到血清转化组。
表9
|
NS3/4a对变性的NS3/4a | | | | |
| *掺入2%SDS对储藏NS3/4a | | | | |
| |
NS3/4a |
dNS3/4a* |
c200 | |
NS3/4a |
dNS3/4a* |
c200 |
| |
OD |
OD |
OD | |
s/co |
s/co |
s/co |
HCV |
PHV 904-1 |
0.012 |
0.012 |
0.009 | |
0.02 |
0.02 |
0.01 |
血清转化 |
PHV 904-2 |
0.011 |
0.009 |
0.008 | |
0.02 |
0.01 |
0.01 |
|
PHV 904-3 |
1.124 |
0.071 |
0.045 | |
1.80 |
0.11 |
0.07 |
|
PHV 904-4 |
2.401 |
0.273 |
0.129 | |
3.85 |
0.44 |
0.21 |
|
PHV 904-5 |
3.022 |
0.793 |
0.347 | |
4.85 |
1.28 |
0.57 |
|
PHV 904-6 |
2.711 |
1.472 |
0.774 | |
4.35 |
2.37 |
1.28 |
|
PHV 904-7 |
3.294 |
1.860 |
0.943 | |
5.28 |
2.99 |
1.55 |
| | | | | | | | |
|
PHV 914-1 |
0.006 |
0.004 |
0.001 | |
0.01 |
0.01 |
0.00 |
|
PHV 914-2 |
0.005 |
0.004 |
0.002 | |
0.01 |
0.01 |
0.00 |
|
PHV 914-3 |
0.098 |
0.003 |
0.001 | |
0.16 |
0.00 |
0.00 |
|
PHV 914-4 |
1.118 |
0.006 |
0.004 | |
1.79 |
0.01 |
0.01 |
|
PHV 914-5 |
2.035 |
0.044 |
0.022 | |
3.26 |
0.07 |
0.04 |
|
PHV 914-6 |
2.092 |
0.074 |
0.025 | |
3.35 |
0.12 |
0.04 |
|
PHV 914-7 |
2.519 |
0.281 |
0.132 | |
4.04 |
0.45 |
0.22 |
|
PHV 914-8 |
2.746 |
0.907 |
0.500 | |
4.40 |
1.46 |
0.82 |
|
PHV 914-9 |
3.084 |
1.730 |
0.931 | |
4.94 |
2.78 |
1.53 |
| | | | | | | | |
HCV 3.0 |
阴性对照 |
0.023 |
0.024 |
0.008 | | | | |
对照 |
阴性对照 |
0.027 |
0.024 |
0.007 | | | | |
|
阴性对照 |
0.021 |
0.017 |
0.005 | | | | |
|
平均 |
0.024 |
0.022 |
0.007 | | | | |
|
截留 |
0.624 |
0.622 |
0.607 | | | | |
| | | | | | | | |
|
阳性对照 |
1.239 |
0.903 |
0.575 | |
1.99 |
1.45 |
0.95 |
|
阳性对照 |
1.445 |
0.916 |
0.614 | |
2.32 |
1.47 |
1.01 |
还用使用标准程序制备的针对NS3/4a的单克隆抗体测试了构象表位的免疫反应性。然后在针对NS3/4a和变性NS3/4a和c200抗原的ELISA试验中测试这些单克隆抗体。数据显示抗-NS3/4a单克隆抗体与NS3/4a和变性的NS3/4a以与表10显示的血清转化组相似的方式反应。该结果还提供了NS3/4a天然是构象表位的进一步证据,因为可制备反应性与早期c33c血清转化组相似的单克隆抗体。
表10
| |
平板 | | |
| |
NS3/4a |
dNS3/4a |
c200 |
单克隆 | |
OD |
OD |
OD |
4B9/E3 |
1∶100 |
1.820 |
0.616 |
0.369 |
|
1∶1000 |
1.397 |
0.380 |
0.246 |
|
1∶10000 |
0.864 |
0.173 |
0.070 |
|
1∶20000 |
0.607 |
0.116 |
0.085 |
5B7/D7 |
1∶100 |
2.885 |
0.898 |
0.436 |
|
1∶1000 |
2.866 |
0.541 |
0.267 |
|
1∶10000 |
1.672 |
0.215 |
0.086 |
|
1∶20000 |
1.053 |
0.124 |
0.059 |
1A8/H2 |
1∶100 |
1.020 |
0.169 |
0.080 |
|
1∶1000 |
0.921 |
0.101 |
0.043 |
|
1∶10000 |
0.653 |
0.037 |
0.013 |
|
1∶20000 |
0.337 |
0.027 |
0.011 |
因此,公开了新颖的HCV检测试验。从上述可见,应理解虽然本文为了说明描述了本发明的具体实施例,但是可作出许多改变,而不未被本文公开的精神和范围。