CN1538852A - 包含聚亚烷基二醇的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物、其应用及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种偶联物的混合物，其中所述混合物中每个偶联物包含与含有聚亚烷基二醇部分的寡聚体偶合的生长激素药物。

Description

包含聚亚烷基二醇的生长激素药物-寡聚体偶联物的 混合物、其应用及其制备方法
                          发明领域
本发明涉及药物-寡聚体偶联物，更具体涉及生长激素药物-寡聚体偶联物。
                          发明背景
生长激素已被用于生长激素缺乏儿童的替代治疗。生长激素还被研究作为一种治疗多种分解代谢病症如烧伤、外科手术和吸收不良的助剂。生长激素对钙离子潴留和骨生成的积极作用也可以用于治疗骨质疏松和非愈合性骨折。
生长激素可以通过肌内或皮下注射给药。在这些方法中，可以优选皮下注射，因为它有利于自我给药。但是，这两种方法由于导致可能与注射给药有关的生理和/或心理创伤，特别是儿童的生理和/或心理创伤，因而可能不是最佳的方法。
已将药学活性分子如蛋白质和多肽与多分散的聚乙二醇的混合物或多分散的含有聚乙二醇的聚合物的混合物偶联得到多分散的药物-寡聚体偶联物的混合物。例如，Ekwuribe的美国专利5,359,030提出将多肽如促生长素抑制素、生长激素和/或促生长因子与多分散的聚乙二醇修饰的糖脂聚合物和多分散的聚乙二醇修饰的脂肪酸聚合物偶联。由各种组合得到的多分散的聚合物的数均分子量优选范围在大约500至大约10,000道尔顿内。
聚乙二醇(PEG)一般由碱催化的环氧乙烷的开环聚合反应生产。所述反应通过将环氧乙烷加到乙二醇，并以氢氧化钾作为催化剂而引发。这种方法得到数均分子量在确定的分子量范围之内的多分散的聚乙二醇聚合物的混合物。例如，由Sigma-Aldrich of Milwaukee，Wisconsin提供的PEG产物是作为多分散的混合物得到的，例如PEG400(Mn 380-420)、PEG 1,000(Mn 950-1,050)、PEG 1,500(Mn 1,400-1,600)和PEG 2,000(Mn 1,900-2,200)。
期望得到非多分散的生长激素-寡聚体偶联物的混合物，其中所述寡聚体包含聚亚烷基二醇。
                          发明概述
包含根据本发明的实施方案的聚亚烷基二醇的生长激素-寡聚体偶联物的混合物可能表现出比多分散的类似的偶联物的混合物更高的体内活性，其中所述多分散的混合物具有与本发明的混合物相同的数均分子量。这种增高的活性可能导致较低的剂量要求。而且，包含根据本发明的聚亚烷基二醇的生长激素-寡聚体偶联物的混合物可以比多分散的类似的偶联物的混合物更有效地在体外肠消化模型中存留。而且，包含根据本发明的实施方案的聚亚烷基二醇的生长激素-寡聚体偶联物的混合物还可能导致比多分散的类似的偶联物的混合物更小的受试者间的差异。
本发明的实施方案提供一种基本上单分散的偶联物的混合物，其中每个偶联物包括与含有聚亚烷基二醇部分的寡聚体偶合的生长激素药物。所述聚亚烷基二醇部分优选具有至少2、3或4个聚亚烷基二醇亚基，并最优选具有至少7个聚亚烷基二醇亚基。所述聚亚烷基二醇部分优选为聚丙二醇。所述寡聚体优选还包含亲脂部分。所述生长激素药物优选为人生长激素。寡聚体优选与人生长激素的氨基官能团共价偶合。所述偶联物优选为两亲平衡，因而溶于水并能够穿透生物膜。所述寡聚体可以包含通过不可水解的键与药物共价偶合的第一聚亚烷基二醇部分和通过可水解的键与第一聚亚烷基二醇部分共价偶合的第二聚亚烷基二醇部分。所述混合物优选为单分散的混合物，最优选为完全单分散的混合物。
本发明的其它实施方案提供一种基本上单分散的偶联物的混合物，其中每个偶联物包含与含有聚亚烷基二醇部分的寡聚体偶合的生长激素药物，且所述的混合物的体内活性大于具有与所述基本上单分散的混合物相同的数均分子量的多分散的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物的体内活性。
本发明的进一步的其它实施方案提供一种基本上单分散的偶联物的混合物，其中每个偶联物包含与含有聚亚烷基二醇部分的寡聚体偶合的生长激素药物，且所述混合物体外活性大于具有与所述基本上单分散的混合物相同的数均分子量的多分散的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物的体外活性。
本发明的其它实施方案提供一种基本上单分散的偶联物的混合物，其中每个偶联物包含与含有聚亚烷基二醇部分的寡聚体偶合的生长激素药物，且与具有与所述基本上单分散的混合物相同的数均分子量的多分散的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物对胰凝乳蛋白酶降解的抵抗力相比，所述混合物对胰凝乳蛋白酶降解的抵抗力增大。
本发明的进一步的其它实施方案提供一种基本上单分散的偶联物的混合物，其中每个偶联物包含与含有聚亚烷基二醇部分的寡聚体偶合的生长激素药物，且所述混合物的受试者间的差异性小于具有与所述基本上单分散的混合物相同的数均分子量的多分散的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物的受试者间的差异性。
本发明的其它实施方案提供一种偶联物的混合物，其中每个偶联物包括与含有聚亚烷基二醇部分的寡聚体偶合的生长激素药物，且所述混合物具有标准偏差小于大约22道尔顿的的分子量分布。
本发明的进一步的其它实施方案提供一种偶联物的混合物，其中每个偶联物包括与含有聚亚烷基二醇部分的寡聚体偶合的生长激素药物，且所述混合物的分散系数(DC)大于10,000，其中
DC = ( Σ i = 1 n N i M i ) 2 Σ i = 1 n N i M i 2 Σ i = 1 n N i - ( Σ i = 1 n N i M i ) 2
其中：
n为样品中不同分子的数量；
Ni为样品中ith分子的数量；和
Mi为i th 分子的质量。
本发明的其它实施方案提供一种偶联物的混合物，其中每个偶联物包括与寡聚体偶合的生长激素药物，并具有相同数量的聚亚烷基二醇亚基。
本发明的其它实施方案提供一种偶联物的混合物，其中每个偶联物具有相同的分子量并具有下式：
生长激素药物
其中：
B为键合部分；
L为接头部分；
G、G′和G″为独立选择的间隔部分；
R为亲脂部分而R′为聚亚烷基二醇部分，或者R′为亲脂部分而R为聚亚烷基二醇部分；
T为末端部分；
h、i、j、k、m和n独立地为0或1，
附带条件是当R为聚亚烷基二醇部分时，m为1；当R′为聚亚烷基二醇部分时，n为1；和
p为1至生长激素药物上亲核残基数的整数。
本发明还提供不同实施方案的混合物的合成方法。
本发明还提供包含本发明的偶联物的混合物的药物组合物。还提供通过给需要治疗的受试者施用有效量的这种药物组合物而治疗生长激素缺乏的方法。
本发明还提供通过给动物施用有效量的上述不同实施方案的偶联物的混合物而加速动物的生长速率的方法。
根据本发明的实施方案的生长激素药物-寡聚体的偶联物的混合物与常规的多分散的生长激素药物-寡聚体的偶联物的混合物相比，可以增加体内活性和/或降低受试者间的差异性和/或减少胰凝乳蛋白酶降解。
                          图的简要说明
图1例示根据本发明的实施方案的包含聚乙二醇部分和脂肪酸部分的活化的聚合物的混合物的一般合成路线；
图2例示根据本发明的实施方案的mPEG的混合物的合成路线；
图3例示根据本发明的实施方案的活化的mPEG7-己基寡聚体的混合物的合成路线；
图4例示根据本发明的实施方案的活化的mPEG7-辛基寡聚体的混合物的合成路线；
图5例示根据本发明的实施方案的活化的PEG-癸基寡聚体的混合物的合成路线；
图6例示根据本发明的实施方案的活化的硬脂酸酯-PEG6寡聚体的混合物的合成路线；
图7例示根据本发明的实施方案的活化的硬脂酸酯-PEG8寡聚体的混合物的合成路线；
图8例示根据本发明的实施方案的活化的PEG3寡聚体的混合物的合成路线；
图9例示根据本发明的实施方案的活化的棕榈酸酯-PEG3寡聚体的混合物的合成路线；
图10例示根据本发明的实施方案的活化的PEG6寡聚体的混合物的合成和人生长激素与活化的PEG6寡聚体偶联的路线；
图11例示根据本发明的实施方案的不同的丙二醇单体的合成路线；
图12例示根据本发明的实施方案的不同的丙二醇聚合物的合成路线；
图13例示根据本发明的实施方案的不同的丙二醇聚合物的合成路线；
图14为使用2当量的活化的MPEG6寡聚体和5当量的活化的MPEG6寡聚体的图10所示的偶联反应的HPLC痕迹(HPLC梯度：50％-90％乙腈，30分钟)；
图15为使用30当量的活化的MPEG6寡聚体的图10所示的偶联反应的HPLC痕迹(HPLC梯度：0％-95％乙腈，20分钟)；
图16为使用2当量的活化的MPEG6寡聚体的图10所示的偶联反应的MALDI光谱；
图17为使用5当量的活化的MPEG6寡聚体的图10所示的偶联反应的HPLC痕迹(HPLC梯度：50％-70％乙腈，30分钟)；
图18为来自图17所示的部分纯化的馏分B的MALDI光谱；
图19为来自图17所示的部分纯化的馏分C的MALDI光谱；
图20为来自图17所示的部分纯化的馏分D和E的MALDI光谱；
图21为来自图17所示的部分纯化的馏分E的电喷雾光谱；
图22为来自使用30当量的活化的MPEG6寡聚体的图10所示的偶联反应的反应混合物的电喷雾光谱；
图23为人生长激素与图9的活化的寡聚体的偶联反应的HPLC痕迹；
图24为使用1当量的人生长激素和2当量的图9的活化的寡聚体的偶联反应的的HPLC痕迹；
图25为使用1当量的人生长激素和5当量的图8的活化的寡聚体的偶联反应的的HPLC痕迹；
图26为对应于图25的偶联HPLC痕迹的峰的左半部分的馏分的MALDI光谱；
图27为对应于图25的偶联HPLC痕迹的峰的右半部分的馏分的MALDI光谱；
图28为使用1当量的人生激素和9当量的图8的活化的寡聚体的偶联反应的HPLC痕迹；
图29例示的柱形图表明通过根据本发明的实施方案的生长激素偶联物的混合物的萤虫素酶试验测得的与人生长激素标准品的活性相比的活性，它们仅供比较目的而不形成本发明的部分；和
图30例示的柱形图表明通过根据本发明的实施方案的生长激素偶联物的混合物的萤虫素酶试验测得的与人生长激素标准品的活性相比的活性，它们仅供比较目的而不形成本发明的部分。
                          优选实施方案的详述
现在将根据这里所述的优选的实施方案描述本发明。但应该认识到这些实施方案用于例示本发明的目的，而不被理解为对由权利要求定义的本发明的保护范围进行限定。
这里所用的术语“非多分散的”用于描述具有与Ekwuribe的美国专利5,359,030所述的多分散的混合物形成对比的分散度的化合物的混合物。
这里所用的术语“基本上单分散的”用于描述化合物的混合物，其中所述混合物中至少大约95％的化合物具有相同的分子量。
这里所用的术语“单分散的”用于描述化合物的混合物，其中所述混合物中大约100％的化合物具有相同的分子量。
这里所用的术语“基本上完全单分散的”用于描述化合物的混合物，其中所述混合物中至少大约95％的化合物具有相同的分子量和具有相同的分子结构。因此，基本上完全单分散的混合物为基本上单分散的混合物，但是基本上单分散的混合物不一定是基本上完全单分散的混合物。
这里所述的术语“完全单分散的”用于描述化合物的混合物，其中所述混合物中大约100％的化合物具有相同的分子量和具有相同的分子结构。因此，完全单分散的混合物为单分散的混合物，但单分散的混合物不一定为完全单分散的混合物。
这里所用的术语“重均分子量”定义为混合物中确定的分子的重量分数与混合物中各分子的分子质量的乘积。“重均分子量”以符号Mw表示。
这里所用的术语“数均分子量”定义混合物的总重量除以混合物中分子数量，并由符号Mn表示。
这里所用的术语“分散系数”(DC)由下式定义：
DC = ( Σ i = 1 n N i M i ) 2 Σ i = 1 n N i M i 2 Σ i = 1 n N i - ( Σ i = 1 n N i M i ) 2
其中：
n为样品中不同分子的数量；
Ni为样品中i th 分子的数量；和
Mi为i th 分子的质量。
这里所用的术语“受试者内的差异性”意指在不同的时间施用相同剂量的药物组合物时同一受试者内存在的活性差异。
这里所用的术语“受试者间的差异性”意指在给每名受试者施用相同剂量的药物或药剂时两名或多名受试者之间的活性差异。
这里所用的术语“生长激素药物”意指具有生长激素肽的全部或某些生物活性的药物。
这里所用的术语“生长激素肽”意指人生长激素、人生长激素-释放激素、动物生长激素或动物生长激素-释放激素，其中任一种可以由天然、合成或基因工程来源获得。
这里所用的术语“生长激素肽类似物”意指其中一个或多个氨基酸已被取代但保留了生长激素肽的某些和全部的活性的生长激素肽。对类似物的描述方法是将取代氨基酸和取代位置记录为一个上标和跟在其后的关于生长激素的描述。例如，“Pro41生长激素，人”意指通常在人生长激素分子的41位发现的氨基酸被脯氨酸取代。
本领域技术人员已知可以通过不同的方法得到生长激素类似物。例如生长激素结构中的某些氨基酸可以被其它氨基酸取代同时不明显地丧失与结构如抗体的抗原结合区或底物分子上的结合部位的相互结合能力。生长激素的相互作用能力和性质决定了它的生物功能活性，可以在氨基酸序列上完成某些氨基酸序列取代，但仍保持具有类似性能的多肽。
在进行这种取代过程中，可以考虑氨基酸的亲水指数。在本技术中一般认识到赋予多肽相互作用的生物功能的亲水氨基酸指数的重要性。已知氨基酸的相对亲水特征影响所得的多肽的二级结构，进而决定多肽与其它分子如酶、底物、受体、DNA、抗体、抗原等的相互作用。根据疏水性和电荷特征为每种氨基酸指定如下的亲水指数：异亮氨酸(+4.5)、缬氨酸(+4.2)、亮氨酸(+3.8)、苯基丙氨酸(+2.8)、半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)、蛋氨酸(+1.9)、丙氨酸(+1.8)、甘氨酸(-0.4)、苏氨酸(-0.7)、丝氨酸(-0.8)、色氨酸(-0.9)、酪氨酸(-1.3)、脯氨酸(-1.6)、组氨酸(-3.2)、谷氨酸(-3.5)、谷氨酰胺(-3.5)、门冬氨酸(-3.5)、天冬酰胺(-3.5)、赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。本领域技术人员已知，某些氨基酸可以被其它具有类似的亲水指数或分数的氨基酸取代，并仍然得到具有类似生物活性的多肽，即仍获得生物功能等同的多肽。在完成这些改变过程中，优选亲水指数相互在±2范围之内的氨基酸的取代，特别优选亲水指数相互在±1范围之内的氨基酸的取代，更特别优选亲水指数相互在±0.5范围之内的氨基酸的取代。
在本技术中还认识到类似的氨基酸的取代可以根据亲水性而有效地完成。美国专利4,554,101认为蛋白质的最大的局部平均亲水性由其相邻的氨基酸的亲水性决定，与蛋白质的生物性能有关。如美国专利4,554,101详述，对氨基酸残基赋予以下的亲水性值：精氨酸(+3.0)、赖氨酸(±3.0)、门冬氨酸(+3.0±1)、谷氨酸(+3.0±1)、丝氨酸(+0.3)、天冬酰胺(+0.2)、谷氨酰胺(+0.2)、甘氨酸(0)、苏氨酸(-0.4)、脯氨酸(-0.5±1)、丙氨酸(-0.5)、组氨酸(-0.5)、半胱氨酸(-1.0)、蛋氨酸(-1.3)、缬氨酸(-1.5)、亮氨酸(-1.8)、异亮氨酸(-1.8)、酪氨酸(-2.3)、苯基丙氨酸(-2.5)、色氨酸(-3.4)。本领域技术人员已知，氨基酸可以被另一种具有类似的亲水值的氨基酸取代，并仍然获得生物学等同，特别是免疫学等同的多肽。在这些改变中，优选亲水值彼此在±2范围之内的氨基酸取代，特别优选亲水值彼此在±1范围之内的氨基酸取代，更特别优选亲水值彼此在±0.5范围之内的氨基酸取代。
因此如以上所述，氨基酸取代一般基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如它们的疏水性、亲水性、电荷、尺寸等。考虑前述的多个特征的例举性取代(即可能相互交换但不显著的改变多肽的生物活性的氨基酸)对于本领域技术人员来说是已知的，例如它包括精氨酸和赖氨酸、谷氨酸和门冬氨酸、丝氨酸和苏氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺、和缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。
这里所用的术语“生长激素肽片断”意指在生长激素中发现的保持生长激素多肽的某些或全部活性的氨基酸序列的片断。
这里所用的术语“生长激素肽片断类似物”意指在生长激素肽上发现并保留所述生长激素多肽的某些或全部的活性的氨基酸序列的节段，其中该节段中的一个或多个氨基酸已被取代。
这里所用的术语“聚亚烷基二醇”指直链或支链聚亚烷基二醇聚合物。术语“聚亚烷基二醇亚基”指单一的聚亚烷基二醇单位。例如，聚乙二醇亚基为-(CH2CH2O)-。
这里所用的术语“亲脂性”意指溶于脂质的能力和/或穿透生物膜、与生物膜相互作用和/或横穿生物膜的能力，而术语“亲脂部分”或“亲脂体”意指亲脂性的部分和/或在与另一种化学实体结合时增加这种化学实体的亲油性的部分。亲脂性部分的实例包括但不限于烷基、脂肪酸、脂肪酸酯、胆甾醇基、金刚烷基等。
这里所用的术语“低级烷基”指取代或未取代的具有1-5个碳原子的烷基部分。
这里所用的术语“高级烷基”指取代或未取代的具有6或更多个碳原子的烷基部分。
本发明的实施方案提供基本上单分散的生长激素药物的混合物-寡聚体偶联物。所述单分散的混合物中的每个生长激素药物-寡聚体偶联物包括与含有聚亚烷基二醇部分的寡聚体偶合的生长激素药物。优选所述混合物中至少大约96％、97％、98％或99％的偶联物的混合物具有相同的分子量。更优选所述混合物为单分散的混合物。甚至更优选所述混合物为基本上完全单分散的混合物。进一步更优选所述混合物中至少大约96％、97％、98％或99％的偶联物具有相同的分子量和具有相同的分子结构。最优选所述混合物为完全单分散的混合物。
所述的生长激素药物优选为人生长激素。但是，应理解生长激素药物可以选自本领域技术人员已知的不同的生长激素药物，例如它包括生长激素肽、生长激素肽类似物、生长激素肽片断和生长激素肽片断类似物。生长激素肽包括但不限于生长激素，人(hGH)；生长激素，猪；生长激素，牛；生长激素，鸡；生长激素，大鼠；生长激素，小鼠；生长激素，绵羊；生长激素释放因子，人；生长激素pro-释放因子，人；生长激素释放因子，小鼠；生长激素释放因子，绵羊；生长激素释放因子，大鼠；生长激素释放因子，牛；生长激素释放因子，猪；和生长激素释放因子，鸡。生长激素肽类似物可以如上述通过取代生长激素肽中的一个或多个氨基酸而得到。生长激素肽片断包括但不限于生长激素1-43，人；生长激素6-13；生长激素释放因子1-37，人；生长激素释放因子1-40，人；生长激素释放因子1-40，酰胺，人；生长激素释放因子30-44，酰胺，人；生长激素释放因子1-29，酰胺，大鼠；海沙瑞林(生长激素释放六肽)；和生长激素释放因子1-29，酰胺，人。生长激素肽片断类似物包括但不限于[D-Ala2]-生长激素释放因子1-29，酰胺，人；[N-Ac-Tyr’，D-Arg2]-生长激素释放因子1-29，酰胺；[His’，Nle27]-生长激素释放因子1-32，酰胺；生长激素释放肽-6([His’，Lys6]-GHRP)；和[D-Lys3]-GHRP-6。
本领域技术人员已知所述的寡聚体可以是包含聚亚烷基二醇部分的不同的寡聚体。优选所述的聚亚烷基二醇部分具有至少2、3或4个聚亚烷基二醇亚基。更优选所述聚亚烷基二醇部分具有至少5或6个聚亚烷基二醇亚基。最优选所述寡聚体的聚亚烷基二醇部分具有至少7个聚亚烷基二醇亚基。所述寡聚体的聚亚烷基二醇部分优选为低级烷基聚亚烷基二醇部分如聚乙二醇部分、聚丙二醇部分或聚丁二醇部分。所述聚亚烷基二醇部分为更优选为具有均一结构的聚丙二醇部分。具有均一结构的聚丙二醇部分实例如下：
这种均一的聚丙二醇结构可以描述为仅具有一个与聚丙二醇链中的每个氧原子相邻的甲基取代的碳原子。这种均一的聚丙二醇部分可以表现出亲脂和亲水特征，因而可以用于在不使用亲脂聚合物部分的情况下提供两亲型生长激素药物-寡聚体偶联物。而且，聚丙二醇部分的仲醇部分与生长激素药物的偶合可以得到对酶，例如在肠中发现的胰岛素和胰凝乳蛋白酶的降解的抵抗力提高的生长激素药物(例如人生长激素)。
根据本发明的实施方案的均一的聚丙二醇优选如图11-13合成，现在将对其进行详述。如图11所示，1，2-丙二醇53与伯醇封端剂反应得到仲醇延长单体54。所述伯醇封端剂可以是本领域技术人员理的不同的伯醇封端剂(包括但不限于甲硅烷基氯化合物如叔丁基联苯甲硅烷基氯和叔丁基二甲基甲硅烷基氯)和酯化试剂如Ac2O。优选所述伯醇封端剂为基本上不与仲醇反应的伯醇封端剂，例如叔丁基联苯甲硅烷基氯或叔丁基二甲基甲硅烷基氯。仲醇延长单体(54)可以与甲基磺酰氯(MeSO2Cl)反应得到伯醇延长单体甲磺酸酯55。
可选择地，仲醇延长单体54可以与仲醇封端剂反应得到化合物56。所述仲醇封端剂可以是本领域技术人员已知的不同的仲醇封端剂，包括但不限于苄基氯。化合物56可以与B1解封剂反应除去封端部分B，并得到伯醇延长单体57。所述B1解封剂可以选自本领域技术人员已知的不同的解封剂。当通过形成酯将伯醇封端时，B1解封剂为脱酯剂，例如碱(例如碳酸钾)。当使用甲硅烷基氯将伯醇封端时，B1解封剂优选为四丁基氟化铵(TBAF)。伯醇延长单体57可以与甲基磺酰氯反应得到仲醇延长单体甲磺酸酯58。
可以如下将伯醇延长单体54和仲醇延长单体57封端。仲醇延长单体54可以与封端剂反应得到化合物59。所述封端剂可以是本领域技术人员已知的不同的封端剂，包括但不限于烷基卤如氯甲烷。化合物59可以与上述的B1解封剂反应得到伯醇封端单体60。
伯醇封端单体60可以与甲基磺酰氯反应得到仲醇封端单体甲磺酸酯61。伯醇延长单体57可以与封端剂反应得到化合物62。封端剂可以是如上述的不同的封端剂。化合物62可以与B2解封剂反应以除去封端部分B2并得到仲醇封端单体63。B2解封剂可以是本领域技术人员已知的不同的解封剂，包括但不限于钯/活性碳催化剂存在下的H2。仲醇封端单体可以与甲基磺酰氯反应得到伯醇封端单体甲磺酸酯64。虽然图11所示的实施方案表示封端单体的合成，但应理解可以进行类似的反应得到封端聚合物。
一般地，链延长可以通过伯醇延长单体或聚合物如伯醇延长单体57与伯醇延长单体或聚合物甲磺酸酯如伯醇延长单体甲磺酸酯55反应而进行，以得到不同的均一的聚丙烯链；或者通过仲醇延长单体或聚合物如仲醇延长单体54与仲醇延长单体或聚合物甲磺酸酯如仲醇延长单体甲磺酸酯58反应而进行。
例如，在图13中，伯醇延长单体甲磺酸酯55与伯醇延长单体57得到二聚物化合物65。可选择地，仲醇延长单体甲磺酸酯58可以与仲醇延长单体54反应得到二聚物化合物65。二聚物化合物65上的B1封端部分可以使用上述的B1解封剂除去以得到伯醇延长二聚物66。伯醇延长二聚物66可以与甲基磺酰氯反应得到仲醇延长二聚物甲磺酸酯67。可选择地，二聚物化合物65上的B2封端部分可以使用上述的B2解封剂除去以得到仲醇延长二聚物69。仲醇延长二聚物69可以与甲基磺酰氯反应得到伯醇延长二聚物甲磺酸酯70。
本领域技术人员已知，链延长过程可以重复进行以得到不同的其它链长度。例如如图13所示，伯醇延长二聚物66可以与伯醇延长二聚物甲磺酸酯70反应得到四聚物化合物72。如图13进一步所示，普通链延长反应路线包括伯醇延长单体或聚合物73与伯醇延长单体或聚合物甲磺酸酯74反应得到均一的聚丙烯聚合物75。m和n的值的范围各为0-1000，或者更优选m和n各为0-50。虽然图13所示的实施方案表示伯醇延长单体和/或聚合物与伯醇延长单体和/或聚合物甲磺酸酯反应，应该理解类似的反应可以使用仲醇延长单体和/或聚合物和仲醇延长单体和/或聚合物甲磺酸酯完成。
伯醇延长单体或聚合物的末端或者伯醇延长单体或聚合物甲磺酸酯的末端可以分别与伯醇封端单体或聚合物甲磺酸酯或伯醇封端单体或聚合物反应得到封端的均一的聚丙烯链。例如，如图12所示，伯醇延长二聚物甲磺酸酯70与伯醇封端单体60反应得到封端的(capped/blocked)伯醇延长三聚物71。本领域技术人员已知，B1封端部分可以除去，而所得的封端的伯醇延长三聚物可以与伯醇延长单体或聚合物甲磺酸酯反应以延长封端的三聚物71的链。
仲醇延长单体或聚合物的末端或者仲醇延长单体或聚合物的末端甲磺酸酯可以分别与仲醇封端单体或聚合物甲磺酸酯或仲醇封端单体或聚合物反应得到封端的均一的聚丙烯链。例如，如图12所示，仲醇延长二聚物甲磺酸酯67与仲醇封端单体63反应得到封端的(capped/blocked)伯醇延长三聚物68。B2封端部分可以如上述除去，而所得的封端的仲醇延长三聚物可以与仲醇延长链节甲磺酸酯反应以延封端的三聚物68的链。虽然图12所示的合成表示二聚物与封端单体反应得到三聚物，应该理解封端过程可以在均一的聚丙二醇部分的合成的任何点上进行，或者可选择地，可以得到不被封端的均一的聚丙二醇部分。虽然图12所示的实施方案表示通过用封端单体的合成而进行的聚丁烯寡聚体的封端，应该理解本发明的聚丁烯寡聚体可以使用如以上图11所述的封端剂直接封端(即不加入封端单体)。
根据本发明的实施方案的均一的聚丙二醇部分可以通过本领域技术人员已知的不同的方法与生长激素药物，亲脂部分如羧酸和/或不同的其它部分偶合，所述方法包括但不限于这里关于聚乙二醇部分所述的方法。
所述寡聚体可以包含一个或多个本领域技术人员已知的其它部分，包括但不限于亲水部分、亲脂部分、间隔部分、接头部分和末端部分。寡聚体中的不同部分彼此通过可水解或不可水解的键共价偶合。
所述寡聚体还可以包含一个或多个亲水部分，包括但不限于糖、聚亚烷基二醇和聚胺/PEG共聚物。相邻的聚亚烷基二醇部分考虑是相同的部分，如果它们通过醚键偶合或具有相同的烷基结构的话。例如，以下部分
-O-C2H4-O-C2H4-O-C2H4-O-C2H4-O-C2H4-O-C2H4-是单一的具有6个聚乙二醇亚基的聚乙二醇部分。相邻的聚亚烷基二醇部分考虑是不同的部分，如果它们通过除了醚键之外的键偶合或者如果它们具有不同的烷基结构的话。例如，以下部分
Figure A0281530100221
是具有4个聚乙二醇亚基的聚乙二醇部分和具有2个聚乙二醇亚基的亲水部分。优选根据本发明的实施方案的寡聚体包含聚亚烷基二醇部分，且不进一步包含亲水部分。
所述寡聚体还可以包含一个或多个本领域技术人员已知的亲脂部分。所述亲脂部分优选为饱和或不饱和、直链或支链烷基部分或饱和或不饱和、直链或支链脂肪酸部分。当所述亲脂部分为烷基部分时，它优选为直链、饱和或不饱和的具有1-28个碳原子的烷基部分。更优选，所述烷基部分具有2-12个碳原子。当亲脂部分为脂肪酸部分时，它优选为天然的直链、饱和或不饱、具有2-18个碳原子的脂肪酸部分。更优选，所述脂肪酸部分具有3-14个碳原子。最优选所述脂肪酸部分具有至少4、5或6个碳原子。
所述寡聚体还可以包含一个或多个本领域技术人员已知的间隔部分。例如，间隔部分可以用于分隔亲水部分与亲脂部分，用于分隔亲脂部分或亲水部分与生长激素药物，用于分隔第一亲水或亲脂部分与第二亲水或亲脂部分，或者用于分隔亲水部分或亲脂部分与接头部分。间隔部分优选糖，胆固醇和甘油部分。
所述寡聚体还可以包含一个或多个用于将寡聚体与本领域技术人员已知的生长激素药物偶合的接头部分。接头部分优选选自烷基和脂肪酸部分。
所述寡聚体还可以包含一个或多个处在不与生长激素药物偶合的寡聚体的一个或多个末端的末端部分。所述末端部分优选为烷基或烷氧基部分，更优选为低级烷基或低级烷氧基部分。最优选所述末端部分为甲基或甲氧基。虽然末端部分优选为烷基或烷氧基部分，应该理解末端部分可以是本领域技术人员已知的不同的部分，包括但不限于糖、胆固醇、醇和脂肪酸。
所述寡聚体优选与生长激素药物共价偶合。在某些实施方案中，利用可水解的键(例如酯或碳酸酯键)将生长激素药物与寡聚体偶合。可水解的偶合可以提供用作前药的生长激素药物-寡聚体偶联物。在某些情况下，例如其中的生长激素药物-寡聚体偶联物不具有活性(即所述偶联物缺乏通过生长激素药物的主要作用机制影响身体的能力)，可水解的偶合可能提供延时释放或控释效果，在一个或多个寡聚体从它们各自的生长激素药物-寡聚体偶联物上裂解得到活性药物时在确定的时间内施用生长激素药物。在其它实施方案中，利用不可水解的键(例如氨基甲酸酯、酰胺或醚键)将生长激素药物与寡聚体偶合。当期望生长激素药物-寡聚体偶联物在血流中进行长期，优选至少2小时的循环时，可以优选使用不可水解的键。当寡聚体与生长激素药物共价偶合时，所述寡聚体还包含一个或多个用于将寡聚体与本领域技术人员已知的生长激素药物共价偶合的键合部分。键合部分优选选自共价键、酯部分、碳酸酯部分、氨基甲酸酯部分、酰胺部分和仲胺部分。寡聚体上的多于一个的部分可以与生长激素药物共价偶合。
虽然所述寡聚体优选与生长激素药物共价偶合，但应该理解所述寡聚体可以与生长激素药物非共价偶合形成非共价偶联的生长激素药物-寡聚体复合物。本领域技术人员已知，非共价偶合包括但不限于氢键、离子键、范德瓦尔斯键和胶束或脂质体包囊。本领域技术人员已知，根据本发明的实施方案，寡聚体可以被适宜地构造、修饰和/或适宜地官能化以赋予以所选择的方式进行非共价偶联的能力(例如赋予氢键能力)。根据本发明的其它实施方案，寡聚体可以由不同的化合物衍生，这些化合物包括但不限于氨基酸、寡肽、肽、胆汁酸、胆汁酸衍生物、脂肪酸、脂肪酸衍生物、水杨酸、水杨酸衍生物、氨基水杨酸和氨基水杨酸衍生物。所得的寡聚体可以与药物分子、药品和/或药物赋形剂非价偶合(复合)。所得的复合物优选具有平衡的亲脂和亲水性能。根据本发明的进一步的其它实施方案，寡聚体可以由胺和/或烷基胺衍生。在适宜的酸性条件下，所得的寡聚体可以与药物分子、药品和/或药物赋形剂形成非共价偶联的复合物。由这种复合作用得到的产品优选具有平衡的亲脂和亲水性能。
多于一个寡聚体(即多个寡聚体)可以与生长激素药物偶合。多数的寡聚体优选相同。但是，应该理解多数寡聚体可以彼此不同，或者可选择地，多数寡聚体中有一些可以相同而有一些可以不同。当多个寡聚体与生长激素药物偶合时，可以优选将一个或多个寡聚体与具有可水解的键的生长激素药物偶合和将一个或多个寡聚体与具有不可水解的键的生长激素药物偶合。可选择地，所有将多数寡聚体与生长激素药物偶合的键可以是可水解的，但具有不同的水解程度，因而例如一个或多个寡聚体通过在体内水解而快速地从生长激素药物上除去和一个或多个寡聚体通过在体内水解而缓慢地从生长激素药物上除去。
所述寡聚体可以在药物的不同亲核残基上与生长激素药物偶合，所述亲核残基包括但不限于亲核羟基官能团和/或氨基官能团。例如，亲核羟基官能团可以见于丝氨酸和/或酪氨酸残基，而亲核氨基官能团可以见于组氨酸和/或赖氨酸残基和/或一个或多个多肽的N-末端。当寡聚体与一个或多个生长激素多肽的N-末端偶合时，所述偶合优选形成仲胺。例如，当所述生长激素药物为人生长激素时，所述寡聚体可以是与Phe1、Lys38、Lys41、Lys70、Lys115、Lys140、Lys145、Lys158、Lys168和/或Lys172的氨基官能团偶合。
基本上单分散的本发明的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物可以通过不同的方法合成。例如，通过以下方法合成基本上单分散的羧酸和聚乙二醇组成的寡聚体的混合物：使基本上单分散的羧酸的混合物与基本上单分散的聚乙二醇的混合物在足以得到基本上单分散的寡聚体的混合物的条件下反应。然后将所述基本上单分散的混合物的寡聚体活化，从而使它们能够与生长激素药物反应得到生长激素药物-寡聚体偶联物。用于得到基本上单分散的活化的寡聚体的混合物的合成路线的一个实施方案如图3所示，并如以下的实施例11-18所述。用于得到基本上单分散的活化的寡聚体的混合物的合成路线的另一个实施方案如图4所示并如以下的实施例19-24所述。用于得到基本上单分散的活化的寡聚体的混合物的合成路线的进一步的另一个实施方案如图5所示，并如以下的实施例25-29所述。用于得到基本上单分散的活化的寡聚体的混合物的合成路线的另一个实施方案如图6所示，并如以下的实施例30-31所述。用于得到基本上单分散的活化的寡聚体的混合物的合成路线的另一个实施方案如图7所示，并如以下的实施例32-37所述。用于得到基本上单分散的活化的寡聚体的混合物的合成路线的进一步的另一个实施方案如图8所示，并如以下的实施例38所述。用于得到基本上单分散的活化的寡聚体的混合物的合成路线的另一个实施方案如图9所示，并如以下的实施例39所述。用于得到基本上单分散的活化的寡聚体的混合物的合成路线的另一个实施方案如图10所示，并如以下的实施例40所述。
所述的基本上单分散的活化的寡聚体的混合物可以与基本上单分散的生长激素药物的混合物在足以得到生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物的条件下反应。在以下的实施例40-42中描述了合成的实例。本领域技术人员已知，可以控制反应条件(例如所选择的摩尔比、溶剂混合物和/或pH)以使通过基本上单分散的活化的寡聚体的混合物与基本上单分散的生长激素药物的混合物的反应而得到的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物为基本上单分散的混合物。例如，可以通过将反应溶液的pH保持在赖氨酸的pKa以下而抑制在赖氨酸的氨基官能团处的偶联。
可选择地，例如所述的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物可以利用HPLC分离(separated和solated)得到基本上单分散的生长激素药物的混合物-寡聚体偶联物，例如一、二或三偶联物。可以利用本领域技术人员已知的不同的技术测定和/或检验特定的分离的偶联物的偶联程度(例如分离的分子为一、二或三偶联物)，这些技术包括但不限于质谱。可以利用本领域技术人员已知的不同的技术测定和/或检验特定的偶联物结构(例如所述寡聚体位于人生长激素一偶联物的Phe1、Lys38、Lys41、Lys70、Lys115、Lys140、Lys145、Lys158、Lys168或Lys172)，这些技术包括但不限于序列分析、肽图分析、选择性酶切和/或内肽酶切割。
本领域技术人员已知，生长激素药物上的一个或多个作用部位可以通过所述生长激素药物与适宜的封端剂如N-叔丁氧基羰基(t-BOC)或N-(9-芴基甲氧基羰基)(N-FMOC)反应而被封端。例如在所述的生长激素药物为多肽并期望形成不饱和的在一个或多个多肽N-末端具有寡聚体的偶联物(即其中并非所有的亲核残基发生偶联的偶联物)时，优选这种方法。在这种封端之后，可以使基本上单分散的封端的生长激素药物的混合物与基本上单分散的活化的寡聚体的混合物反应得到具有与一个或多个亲核残基偶合的寡聚体和具有与其它亲核残基偶合的封端部分的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物。本领域技术人员已知，在偶联反应之后，可以将生长激素药物-寡聚体偶联物解封。如果需要的话，随后可以如上述分离生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物得到基本上单分散的生长激素药物的混合物-寡聚体偶联物。可选择地，可以在解封之前分离所述的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物。
与常规混合物的性能相比，根据本发明的实施方案的基本上单分散的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物优选具有改善的性能。例如，基本上单分散的生长激素药物的混合物-寡聚体偶联物优选体内活性大于多分散的具有与所述的基本上单分散的混合物相同的数均分子量的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物的体内活性。本领域技术人员已知，基本上单分散的混合物的数均分子量和多分散的混合物的数均分子量可以由不同的方法测定，这些方法包括但不限于体积排阻色谱法，例如H.R.Allcock & F.W.Lam pe，CONTEMPORARY POLYMERCHEMISTRY 394-402(第二版，1991)所述的凝胶渗透色谱法。
作为另一个实例，基本上单分散的生长激素药物的混合物寡聚体偶联物优选体外活性大于具有与所述基本上单分散的混合物相同的数均分子量的多分散的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物的体外活性。本领域技术人员已知，基本上单分散的混合物的数均分子量和多分散的混合物的数均分子量可以由不同的方法测定，这些方法包括但不限于体积排阻色谱法。本领域技术人员已知，特定混合物的体外活性可以通过不同的方法测定。优选使用从Molecular Devices Corporation ofSunnyvale，California商购得到的Cytosensor微生理机能测定仪测定体外活性。所述微生理机能测定仪监测对被加到在Transwell(Corning，Inc.，Acton，Massachusetts)中培养的细胞的药物作出反应而发生的细胞外酸化速率的细微变化。这种反应与研究的分子的活性成比例。
作为进一步的另一个实例，与具有与所述基本上单分散的混合物相同的数均分子量的多分散的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物对胰凝乳蛋白酶的降解的抵抗力相比，基本上单分散的生长激素药物的混合物-寡聚体偶联物优选对胰凝乳蛋白酶的降解的抵抗力增大。本领域技术人员已知，基本上单分散的混合物的数均分子量和多分散的混合物的数均分子量可以通过不同的方法测定，这些方法包括但不限于体积排阻色谱法。
作为另一个实例，基本上单分散的生长激素药物的混合物-寡聚体偶联物的受试者间的差异性小于具有与所述基本上单分散的混合物相同的数均分子量的多分散的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物的受试者间的差异性。本领域技术人员已知，基本上单分散的混合物的数均分子量和多分散的混合物的数均分子量可以是由不同的方法测定，这些方法包括但不限于体积排阻色谱法。本领域技术人员已知，受试者间的差异性可以通过不同的方法测定。受试者间的差异性优选如下计算。测定每名受试者的剂量反应曲线下的面积(AUC)(即剂量反应曲线和基线值之间的面积)。通过计算每名受试者的AUC的总数并用该总数除以受试者数量而确定所有受试者的平均AUC。然后对每名受试者测定受试者的AUC与平均AUC之间的差别的绝对值。随后计算所得的差异的绝对值的总数得到代表受试者间的差异性的值。较低的值代表较低的受试者间的差异性，而较高的值代表较大的受试者间的差异性。
根据本发明的实施方案的基本上单分散的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物优选具有二个或更多个上述的改善的性能。更优选，根据本发明的实施方案的基本上单分散的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物具有三个或更多个上述的改善的性能。最优选，根据本发明的实施方案的基本上单分散的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物具有所有四个上述的改善的性能。
进一步的其它的根据本发明的实施方案提供具有标准偏差小于大约22道尔顿的分子量分布的偶联物的混合物。所述混合物中的每个偶联物包括与含有聚亚烷基二醇部分的寡聚体偶合的生长激素药物。所述标准偏差优选为小于大约14道尔顿，更优选小于大约11道尔顿。所述分子量分布可以通过本领域技术人员已知的方法测定，所述的方法包括但不限于体积排阻色谱法，例如H.R.Allcock & F.W.Lampe，CONTEMPORARY POLYMER CHEMISTRY 394-402(第二版1991)所述的凝胶渗透色谱法。分子量分布的标准偏差则可以由本领域技术人员已知的统计方法测定。
所述生长激素药物优选为人生长激素。但是，应该理解所述生长激素药物可以选自本领域技术人员已知的不同的生长激素药物，例如它包括生长激素肽、生长激素肽类似物、生长激素肽片断和生长激素肽片断类似物。生长激素肽包括但不限于生长激素，人(hGH)；生长激素，猪；生长激素，牛；生长激素，鸡；生长激素，大鼠；生长激素，小鼠；生长激素，绵羊；生长激素释放因子，人；生长激素pro-释放因子，人；生长激素释放因子，小鼠；生长激素释放因子，绵羊；生长激素释放因子，大鼠；生长激素释放因子，牛；生长激素释放因子，猪；和生长激素释放因子，鸡。生长激素肽类似物可以如上述通过取代生长激素肽中的一个或多个氨基酸而得到。生长激素肽片断包括但不限于生长激素1-43，人；生长激素6-13；生长激素释放因子1-37，人；生长激素释放因子1-40，人；生长激素释放因子1-40，酰胺，人；生长激素释放因子30-44，酰胺，人；生长激素释放因子1-29，酰胺，大鼠；海沙瑞林(生长激素释放六肽)；和生长激素释放因子1-29，酰胺，人。生长激素肽片断类似物包括但不限于[D-Ala2]-生长激素释放因子1-29，酰胺，人；[N-Ac-Tyr1，D-Arg2]-生长激素释放因子1-29，酰胺；[His1，Nle27]-生长激素释放因子1-32，酰胺；生长激素释放肽-6([His1，Lys6]-GHRP)和[D-Lys3]-GHRP-6。
所述寡聚体可以是包含本领域技术人员已知的聚亚烷基二醇部分的不同的寡聚体。优选所述的聚亚烷基二醇部分具有至少2、3或4个聚亚烷基二醇亚基。更优选所述的聚亚烷基二醇部分具有至少5或6个聚亚烷基二醇亚基。最优选所述的寡聚体的聚亚烷基二醇部分具有至少7个聚亚烷基二醇亚基。所述的寡聚体的聚亚烷基二醇部分优选为低级烷基聚亚烷基二醇部分如聚乙二醇部分、聚丙二醇部分或聚丁二醇部分。所述的聚亚烷基二醇部分更优选具有均一的结构的聚丙二醇部分。具有均一的结构的聚丙二醇部分的实例如下：
Figure A0281530100281
这种均一的聚丙二醇结构可以描述为仅具有一个与聚丙二醇链上的每个氧原子相邻的甲基取代的碳原子。这种均一的聚丙二醇部分可能表现出亲脂和亲水特征，因而用于在不使用亲脂聚合物部分的情况下得到两亲型生长激素药物-寡聚体偶联物。而且聚丙二醇部分的仲醇部分与生长激素药物的偶合可以得到对酶如肠中发现的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶导致的降解的抵抗力增大的生长激素药物(例如人生长激素)。
根据本发明的实施方案的均一的聚丙二醇优选如图11-13所示合成，现在将对此进行详述。如图11所示，1，2-丙二醇53与伯醇封端剂反应得到仲醇延长单体54。所述伯醇封端剂可以是本领域技术人员已知的不同的伯醇封端剂(包括但不限于甲硅烷基氯化合物如叔丁基联苯甲硅烷基氯和叔丁基二甲基甲硅烷基氯)和酯化剂如Ac2O。优选所述的伯醇封端剂为基本上不与仲醇反应的伯醇封端剂，例如叔丁基联苯甲硅烷基氯或叔丁基二甲基甲硅烷基氯。所述的仲醇延长单体(54)可以与甲基磺酰氯(MeSO2Cl)反应得到伯醇延长单体甲磺酸酯55。
可选择地，仲醇延长单体54可以与仲醇封端剂反应得到化合物56。所述仲醇封端剂可以是本领域技术人员已知的不同的仲醇封端剂，包括但不限于苄基氯。化合物56可以与B1解封剂反应以除去封端部分B1并得到伯醇延长单体57。所述B1解封剂可以选自本领域技术人员已知的不同的解封剂。当通过成酯将所述伯醇封端时，B1解封剂为脱酯剂，例如碱(例如碳酸钾)。当使用甲硅烷基氯将伯醇封端时，B1解封剂优选为四丁基氟化铵(TBAF)。伯醇延长单体57可以与甲基磺酰氯反应得到仲醇延长单体甲磺酸酯58。
可以如下将伯醇延长单体54和仲醇延长单体57封端。仲醇延长单体54可以与封端剂反应得到化合物59。所述封端剂可以是本领域技术人员已知的不同的封端剂，包括但不限于烷基卤如氯甲烷。化合物59可以与上述的B1解封剂反应得到伯醇封端单体60。伯醇封端单体60可以与甲基磺酰氯反应得到仲醇封端单体甲磺酸酯61。伯醇延长单体57可以与封端剂反应得到化合物62。所述封端剂可以是如上述的不同的封端剂。化合物62可以与B2解封剂反应以除去封端部分B2和得到仲醇封端单体63。所述B2解封剂可以是本领域技术人员已知的不同的解封剂，包括但不限于钯/活性碳催化剂存在下的H2。所述仲醇封端单体可以与甲基磺酰氯反应得到伯醇封端单体甲磺酸酯64。虽然图11所示的实施方案表示封端单体的合成，应该理解可以进行类似的反应以得到封端聚合物。
一般地，链延长可以通过以下方法进行：使伯醇延长单体或聚合物如伯醇延长单体57与伯醇延长单体或聚合物甲磺酸酯如伯醇延长单体甲磺酸酯55反应得到不同的均一的聚丙烯链，或者使仲醇延长单体或聚合物如仲醇延长单体54与仲醇延长单体或聚合物甲磺酸酯如仲醇延长单体甲磺酸酯58反应。
例如，在图13中，伯醇延长单体甲磺酸酯55与伯醇延长单体57反应得到二聚物化合物65。可选择地，仲醇延长单体甲磺酸酯58可以与仲醇延长单体54反应得到二聚物化合物65。可以使用上述的B1解封剂除去二聚物化合物65上的B1封端部分得到伯醇延长二聚物66。伯醇延长二聚物66可以与甲基磺酰氯反应得到仲醇延长二聚物甲磺酸酯67。可选择地，可以使用上述的B2解封剂除去二聚物化合物65上的B2封端部分得到仲醇延长二聚物69。仲醇延长二聚物69可以与甲基磺酰氯反应得到伯醇延长二聚物甲磺酸酯70。
本领域技术人员已知，链延长过程可以重复进行以得到不同的其它链长度。例如如图13所示，伯醇延长二聚物66可以与伯醇延长二聚物甲磺酸酯70反应得到四聚物化合物72。如图13进一步显示，一般的链延长反应路线包括伯醇延长单体或聚合物73与伯醇延长单体或聚合物甲磺酸酯74反应得到均一的聚丙烯聚合物75。m和n的值的范围可以是0-1000，或者更优选m和n各自为0-50。虽然图13所示的实施方案表示伯醇延长单体和/或聚合物与伯醇延长单体和/或聚合物甲磺酸酯，但应该理解可以使用仲醇延长单体和/或聚合物和仲醇延长单体和/或聚合物甲磺酸酯完成类似的反应。
伯醇延长单体或聚合物的末端或者伯醇延长单体或聚合物甲磺酸酯的末端可以分别与伯醇封端单体或聚合物甲磺酸酯或伯醇封端单体或聚合物反应得到封端的均一的聚丙烯链。例如，如图12所示，伯醇延长二聚物甲磺酸酯70与伯醇封端单体60反应得到封端的(capped/blocked)伯醇延长三聚物71。本领域技术人员已知，可以除去B1封端部分，且所得的封端的伯醇延长三聚物可以与伯醇延长单体或聚合物甲磺酸酯反应以延长封端的三聚物71的链。
仲醇延长单体或聚合物的末端或者仲醇延长单体或聚合物的末端甲磺酸酯可以分别与仲醇封端单体或聚合物甲磺酸酯或仲醇封端单体或聚合物反应得到封端的均一的聚丙烯链。例如，如图12所示，仲醇延长二聚物甲磺酸酯67与仲醇封端单体63反应得到封端的(capped/blocked)伯醇延长三聚物68。可以如以上所述除去所述的B2封端部分，且所得的封端的仲醇延长三聚物可以与仲醇延长链节甲磺酸酯反以延长封端的三聚物68的链。虽然图12所示的合成表示二聚物与封端单体反应得到三聚物，但应该理解封端过程可以在均一的聚丙二醇部分的合成中的任何点进行，或者可选择地，可以得到未被封端的均一的聚丙二醇部分。虽然图12所示的实施方案表示通过使用封端单体进行合成而将聚丁烯寡聚体封端，应该理解本发明的聚丁烯寡聚体可以是使用以上图11所述的封端剂而进行直接封端(即不加入封端单体)。
根据本发明的实施方案的均一的聚丙二醇部分可以通过本领域技术人员已知的不同的方法与生长激素药物、亲脂部分如羧酸和/或不同的其它部分偶合，这些方法包括但不限于这里关于聚乙二醇部分所述的方法。
所述寡聚体可以包含一个或多个本领域技术人员已知的其它部分，包括不限于亲水部分、亲脂部分、间隔部分、接头部分和末端部分。所述寡聚体中的不同的部分通过可水解或不可水解的键与另一寡聚体共价偶合。
所述寡聚体还可以包含一个或多个亲水部分，包括但不限于糖、聚亚烷基二醇和聚胺/PEG共聚物。相邻的聚亚烷基二醇部分考虑是相同的部分，如果它们通过醚键偶合并具有相同的烷基结构的话。例如，以下部分：
-O-C2H4-O-C2H4-O-C2H4-O-C2H4-O-C2H4-O-C2H4-是单一的具有6个聚乙二醇亚基的聚乙二醇部分。相邻的聚亚烷基二醇部分认为是不同的部分，如果它们与除了醚键之外的键偶合或者它们具有不同的烷基结构。例如，以下部分
是具有4个乙二醇亚基的聚乙二醇部分和具有2个聚乙二醇亚基的亲水部分。优选，根据本发明的寡聚体的的实施方案包含聚亚烷基二醇部分，并不进一步包含亲水部分。
所述的寡聚体还可以包含一个或多个本领域技术人员已知的亲脂部分。所述的亲脂部分优选为饱和或不饱和、直链或支链烷基部分或饱和或不饱和、直链或支链脂肪酸部分。当所述的亲脂部分为烷基部分时，优选直链、饱和或不饱和具有1-28个，更优选具有具有2-12个碳原子的碳原子的烷基部分。当所述的亲脂部分为脂肪酸部分时，优选天然的脂肪酸是直链、天然脂肪酸部分，具有2-18个碳原子。更优选，所述脂肪酸部分具有3-14个碳原子。最优选所述脂肪酸部分具有至少4、5或6个碳原子。
所述寡聚体还可以包含一个或多个本领域技术人员已知的间隔部分。例如间隔部分可以用于分隔亲水部分与亲脂部分，用于分隔亲脂部分或亲水部分与生长激素药物，用于分隔第一亲水或亲脂部分与第二亲水或亲脂部分，或用于分隔亲水部分或亲脂部分与接头部分。间隔部分优选自糖、胆固醇和甘油部分。
所述的寡聚体还可以包含一个或多个用于将寡聚体与本领域技术人员已知的生长激素药物偶合。优选接头部分选自烷基和脂肪酸部分。
所述寡聚体还可以包含一个或多个处在不与生长激素药物偶合的寡聚体的末端的末端部分。所述末端部分优选为烷基或烷氧基部分，更优选低级烷基或低级烷氧基部分。最优选所述的末端部分为甲基或甲氧基。虽然所述末端部分优选为烷基或烷氧基部分，但应该理解所述的末端部分可以是本领域技术人员已知的不同的部分，包括但不限于糖、胆固醇、醇和脂肪酸。
所述寡聚体优选与生长激素药物共价偶合。在某些实施方案中，利用可水解的键(酯或碳酸酯键)将生长激素药物与寡聚体偶合。可水解的偶合可以得到用作前药的生长激素药物-寡聚体偶联物。例如在某些实施方案中，其中所述的生长激素药物-寡聚体偶联物无活性(即所述偶联物缺乏通过生长激素药物的主要作用机理而影响效果的能力)，可水解的偶合可以用于延时释放或控释效果。在一个或多个寡聚体从它们的各自的生长激素药物-寡聚体偶联物上裂解得到活性药物时，可以在确定的时间内施用生长激素药物。在其它实施方案中，利用不可水解的键(例如氨基甲酸酯、酰胺或醚键)将生长激素药物与寡聚体偶合。当期望使生长激素药物-寡聚体偶联物在血流中进行长期，优选至少2小时的循环时，可以优选使用不可水解的键。当寡聚体与生长激素药物共价偶合时，所述寡聚体还包含一个或多个用于与本领域技术人员已知的生长激素药物的寡聚体共价偶合的键合部分。键合部分优选选自共价键、酯部分、碳酸酯部分、氨基甲酸酯部分、酰胺部分和仲胺部分。所述寡聚体上多于1个部分可以与生长激素药物共价偶合。
虽然所述寡聚体优选与生长激素药物共价偶合，但应该理解所述寡聚体可以与生长激素药物非共价偶合形成非共价偶联的生长激素药物-寡聚体复合物。本领域技术人员已知，非共价偶合包括但不限于氢键、离子键、范德瓦尔斯键和胶束或脂质体包囊。本领域技术人员已知，根据本发明的实施方案，寡聚体可以被适宜构建、修饰和/或适宜地官能化以赋予以所选择地方式进行非共价偶联的能力(例如赋予氢键能力)。根据本发明的其它实施方案，寡聚体可以由不同的化合物的衍生，这些化合物包括但不限于氨基酸、寡肽、肽、胆汁酸、胆汁酸衍生物、脂肪酸、脂肪酸衍生物、水杨酸、水杨酸衍生物、氨基水杨酸和氨基水杨酸衍生物。所得的寡聚体可以与药物分子、药品和/或药物赋形剂非共价偶合(复合)。所得的复合物优选具有平衡的亲脂和亲水性能。根据本发明的进一步的其它实施方案，寡聚体可以由胺和/或烷基胺衍生。在适宜的酸性条件下，所得的寡聚体可以与药物分子、药品和/或药物赋形剂形成非共价偶联的复合物。由这种复合作用得到的产品优选具有平衡的亲脂和亲水性能。
多于一个寡聚体(即多个寡聚体)可以与生长激素药物偶合。多数的寡聚体优选相同。但是，应该理解多数寡聚体可以彼此不同，或者可选择地，多数寡聚体中有一些可以相同而有一些可以不同。当多个寡聚体与生长激素药物偶合时，可以优选将一个或多个寡聚体与具有可水解的键的生长激素药物偶合和将一个或多个寡聚体与具有不可水解的键的生长激素药物偶合。可选择地，所有将多数寡聚体与生长激素药物偶合的键可以是可水解的，但具有不同的水解程度，因而例如一个或多个寡聚体通过在体内水解而快速地从生长激素药物上除去和一个或多个寡聚体通过在体内水解而缓慢地从生长激素药物上除去。
所述寡聚体可以在药物的不同亲核残基上与生长激素药物偶合，所述亲核残基包括但不限于亲核羟基官能团和/或氨基官能团。例如，亲核羟基官能团可以见于丝氨酸和/或酪氨酸残基，而亲核氨基官能团可以见于组氨酸和/或赖氨酸残基和/或一个或多个多肽的N-末端。当寡聚体与一个或多个生长激素多肽的N-末端偶合时，所述偶合优选形成仲胺。例如，当所述生长激素药物为人生长激素时，所述寡聚体可以是与Phe1、Lys38、Lys41、Lys70、Lys115、Lys140、Lys145、Lys158、Lys168和/或Lys172的氨基官能团偶合。
具有标准偏差小于大约22道尔顿的分子量分布的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物可以是由不同的方法合成。例如，通过以下方法合成具有标准偏差小于大约22道尔顿的分子量分布并由羧酸和聚乙二醇组成的寡聚体的混合物：使具有标准偏差小于大约22道尔顿的分子量分布的羧酸的混合物与具有标准偏差小于大约22道尔顿的分子量分布的聚乙二醇的混合物在足以得到具有标准偏差小于大约22道尔顿的分子量分布的寡聚体的混合物接触。然后将具有标准偏差小于大约22道尔顿的分子量分布的混合物的寡聚体活化，从而使它们能够与生长激素药物反应得到生长激素药物-寡聚体偶联物。
用于得到具有标准偏差小于大约22道尔顿的分子量分布的活化的寡聚体的混合物的合成路线的一个实施方案如图3所示，并如以下实施例11-18所述。用于得到具有标准偏差小于大约22道尔顿的分子量分布的活化的寡聚体的混合物的合成路线的另一个实施方案如图4所示，并如以下实施例19-24所述。用于得到具有标准偏差小于大约22道尔顿的分子量分布的活化的寡聚体的混合物的合成路线的进一步的另一个实施方案如图5所示，并如以下的实施例25-29所述。用于得到具有标准偏差小于大约22道尔顿的分子量分布的活化的寡聚体的混合物的合成路线的另一个实施方案如图6所示，并如以下的实施例30-31所述。用于得到具有标准偏差小于大约22道尔顿的分子量分布的活化的寡聚体的混合物的合成路线的另一个实施方案如图7所示，并如以下的实施例32-37所述。用于得到具有标准偏差小于大约22道尔顿的分子量分布的活化的寡聚体的混合物的合成路线的另一个实施方案如图8所示，并如下以下的实施例38所述。用于得到具有标准偏差小于大约22道尔顿的分子量分布的活化的寡聚体的混合物的合成路线的另一个实施方案如图9所示，并如以下的实施例39所述。用于得到具有标准偏差小于大约22道尔顿的分子量分布的活化的寡聚体的混合物的合成路线的另一个实施方案如图10所示，并如以下实施例40所述。
使所述的具有标准偏差小于大约22道尔顿的分子量分布的活化的寡聚体的混合物与具有标准偏差小于大约22道尔顿的分子量分布的生长激素药物的混合物在足以得到生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物的条件下反应。合成实例如以下实施例40-42所述。本领域技术人员已知，可以控制反应条件(例如所选择的摩尔比、溶剂混合物和/或pH)以使由具有标准偏差小于大约22道尔顿的分子量分布的活化的寡聚体的混合物和具有标准偏差小于大约22道尔顿的分子量分布的生长激素药物的混合物反应得到的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物是具有标准偏差小于大约22道尔顿的分子量分布的混合物。例如，可以通过将反应溶液的pH保持在赖氨酸的pKa以下而抑制在赖氨酸的氨基官能团上的偶联。可选择地，所述的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物可以利用HPLC分离(separated和isolated)得到具有标准偏差小于大约22道尔顿的分子量分布的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物，例如一、二或三偶联物。可以利用本领域技术人员已知的不同的技术测定和/或检验特定的分离的偶联物的偶联程度(例如所分离的分子为一、二或三偶联物)，这些技术包括但不限于质谱。可以利用本领域技术人员已知的不同的技术测定和/或检验特定的偶联物结构(例如所述寡聚体处在人生长激素一偶联物的Phe1、Lys38、Lys41、Lys70、Lys115、Lys140、Lys145、Lys158、Lys168或Lys172)，这些技术包括但不限于序列分析、肽图分析、选择性酶切和/或内肽酶切割。
本领域技术人员已知，例如可以通过使生长激素药物与适宜的封端剂如N-叔丁氧基羰基(t-BOC)或N-(9-芴基甲氧基羰基)(N-FMOC)反应而将生长激素药物上的一个或多个反应部位封端。例如在所述的生长激素药物为多肽并期望形成在多肽的一个或多个N-末端具有一个或多个寡聚体的不饱和的偶联物(即并非所有的亲核残基被偶联)时可以优选这种方法。在进行这种封端之后，具有标准偏差小于大约22道尔顿的分子量分布的封端的生长激素药物的混合物可以与具有标准偏差小于大约22道尔顿的分子量分布的活化的寡聚体的混合物反应得到具有与一个或多个亲核残基偶合的寡聚体和具有与其它亲核残基偶合的封端部分的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物。本领域技术人员已知，在偶联反应之后可以将生长激素药物-寡聚体偶联物解封。如果需要的话，然后可以如上述分离所述的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物得到具有标准偏差小于大约22道尔顿的分子量分布的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物。可选择地，可以在解封之前分离所述的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物。
根据本发明的实施方案的具有标准偏差小于大约22道尔顿的分子量分布的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物优选具有比常规混合物改善的性能。例如，具有标准偏差小于大约22道尔顿的分子量分布的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物优选的体内活性大于具有与具备标准偏差小于大约22道尔顿的分子量分布的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物相同的数均分子量的多分散的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物的体内活性。本领域技术人员已知，具有标准偏差小于大约22道尔顿的分子量分布的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物的数均分子量和多分散的混合物的数均分子量可以由不同的方法测定，这些方法包括但不限于体积排阻色谱法，例如H.R.Allcock & F.W.Lampe，CONTEMPORARY POLYMER CHEMISTRY 394-402(第二版，1991)所述的凝胶渗透色谱法。
作为另一个实例，具有标准偏差小于大约22道尔顿的分子量分布的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物优选体外活性大于具有与具备标准偏差小于大约22道尔顿的分子量分布的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物相同的数均分子量的多分散的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物的体外活性。本领域技术人员已知，具有标准偏差小于大约22道尔顿的分子量分布的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物的数均分子量和多分散的混合物的数均分子量可以通过不同的方法测定，所述的方法包括但不限于体积排阻色谱法。
本领域技术人员已知，可以通过不同的方法测定特定混合物的体外活性。优选使用从Molecular Devices Corporation of Sunnyvale，California商购的Cytosensort微生理机能测定仪测定体外活性。所述微生理机能测定仪监测对被加到在Transwell中培养的细胞中的药物作出反应而发生的细胞外酸化速率的细微变化。这种反应与研究的分子的活性成比例。
作为另一个实例，当与具有与具备标准偏差小于大约22道尔顿的分子量分布的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物相同的数均分子量的多分散的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物对胰凝乳蛋白酶降解的抵抗力相比，具有标准偏差小于大约22道尔顿的分子量分布的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物对胰凝乳蛋白酶降解的抵抗力增大。本领域技术人员已知，具有标准偏差小于大约22道尔顿的分子量分布的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物的数均分子量和多分散的混合物的数均分子量可以通过不同的方法测定，这些方法包括但不限于体积排阻色谱法。
作为另一个实例，具有具有标准偏差小于大约22道尔顿的分子量分布的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物优选其受试者间的差异性小于具有与具备标准偏差小于大约22道尔顿的分子量分布的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物相同的数均分子量的多分散的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物的受试者间的差异性。本领域技术人员已知，具有标准偏差小于大约22道尔顿的分子量分布的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物的数均分子量和多分散的混合物的数均分子量可以通过不同的方法测定，这些方法包括不但不限于体积排阻色谱法。可以通过本领域技术人员已知的不同的方法测定受试者间的差异性。优选如下计算受试者间的差异性。测定每名受试者的剂量反应曲线下的面积(AUC)(即剂量反应曲线和基线值之间的面积)。所有受试者的平均AUC通过计算每名受试者的AUC并将此总和除去受试者的数量来确定。然后对每名受试者测定受试者的AUC和平均AUC之间的差异的绝对值。然后计算所得的差异的绝对值的总和得到代表受试者间的差异性的值。较低的值代表较低的受试者间的差异性，而较高的值代表较高的受试者间的差异性。
根据本发明的实施方案的具有标准偏差小于大约22道尔顿的分子量分布的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物优选具有二种或更多种上述的改善性能。更优选，根据本发明的实施方案的具有标准偏差小于大约22道尔顿的分子量分布的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物具有三种或更多种上述的改善的性能。最优选，根据本发明的实施方案的具有标准偏差小于大约22道尔顿的分子量分布的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物具有所有上述的改善性能。
根据本发明的另一个实施方案提供一种偶联物的混合物，其中每个偶联物包括与含有聚亚烷基二醇部分的寡聚体偶合的生长激素药物，且所述混合物的分散系数(DC)大于10,000，其中
DC = ( Σ i = 1 n N i M i ) 2 Σ i = 1 n N i M i 2 Σ i = 1 n N i - ( Σ i = 1 N N i M i ) 2
其中：
n为样品中不同分子的数量；
Ni为样品中i th 分子的数量；和
Mi为i th 分子的质量。
所述偶联物的混合物优选其分散系数大于100,000。更优选，所述偶联物的混合物的分散系数大于500,000，并最优选其分散系数大于10,000,000。变量n、Ni和Mi可以由本领域技术人员已知的不同的方法测定，这些方法包括但不限于以下实施例44所述的方法。
所述的生长激素药物优选为人生长激素。但是，应该理解所述的生长激素药物可以选自本领域技术人员已知的不同的生长激素药物，例如它包括生长激素肽、生长激素肽类似物、生长激素肽片断和生长激素肽片断类似物。生长激素肽包括但不限于生长激素，人(hGH)；生长激素，猪；生长激素，牛；生长激素，鸡；生长激素，大鼠；生长激素，小鼠；生长激素，绵羊；生长激素释放因子，人；生长激素pro-释放因子，人；生长激素释放因子，小鼠；生长激素释放因子，绵羊；生长激素释放因子，大鼠；生长激素释放因子，牛；生长激素释放因子，猪；和生长激素释放因子，鸡。可以如上述通过取代生长激素肽上的一个或多个氨基酸而得到生长激素肽类似物。生长激素肽片断包括但不限于生长激素1-43，人；生长激素6-13；生长激素释放因子1-37，人；生长激素释放因子1-40，人；生长激素释放因子1-40，酰胺，人；生长激素释放因子30-44，酰胺，人；生长激素释放因子1-29，酰胺，大鼠；海沙瑞林(生长激素释放六肽)；和生长激素释放因子1-29，酰胺，人。生长激素肽片断类似物包括但不限于[D-Ala2]-生长激素释放因子1-29，酰胺，人；[N-Ac-Tyr1，D-Arg2]-生长激素释放因子1-29，酰胺；[His1，Nle27]-生长激素释放因子1-32，酰胺；生长激素释放肽-6([His1，Lys6]-GHRP)和[D-Lys3]-GHRP-6。
所述的寡聚体可以是包含本领域技术人员已知的聚亚烷基二醇部分的不同的寡聚体。优选所述的聚亚烷基二醇部分具有至少2、3或4个聚亚烷基二醇亚基。更优选，所述的聚亚烷基二醇部分具有至少5或6个聚亚烷基二醇亚基。最优选所述的寡聚体的聚亚烷基二醇部分具有至少7个聚亚烷基二醇亚基。所述的寡聚体的聚亚烷基二醇部分优选为低级烷基聚亚烷基二醇部分如聚乙二醇部分、聚丙二醇部分或聚丁二醇部分。所述聚亚烷基二醇部分更优选为具有均一结构的聚丙二醇部分。具有均一的结构的聚丙二醇部分的一个实例如下：
Figure A0281530100391
此均一的聚丙二醇结构可以描述为仅具有一个与聚丙二醇链上的每个氧原子相邻的甲基取代的碳原子。这种均一的聚丙二醇部分可以表现出亲脂和亲水特征，因而用于在不使用亲脂聚合物部分的情况下得到两亲型生长激素药物-寡聚体偶联物。而且，聚丙二醇部分的仲醇部分与生长激素药物偶合可得到对酶如肠中发现的胰岛素和胰凝乳蛋白酶导致的降解的抵抗力增大的生长激素药物(例如人生长激素)。
根据本发明的实施方案的均一的聚丙二醇优选如图11-13所示合成，现在将对其进行详述。如图11所示，1，2-丙二醇53与伯醇封端剂反应得到仲醇延长单体54。所述伯醇封端剂可以是本领域技术人员已知的不同的伯醇封端剂(包括但不限于甲硅烷基氯化合物如叔丁基联苯甲硅烷基氯和叔丁基二甲基甲硅烷基氯)和酯化剂如AC2O。优选所述的伯醇封端剂为基本上不与仲醇反应的伯醇封端剂，例如叔丁基联苯甲硅烷基氯或叔丁基二甲基甲硅烷基氯。所述的仲醇延长单体(54)可以与甲基磺酰氯(MeSO2Cl)反应得到伯醇延长单体甲磺酸酯55。
可选择地，仲醇延长单体54可以与仲醇封端剂反应得到化合物56。所述仲醇封端剂可以是本领域技术人员已知的不同的仲醇封端剂，包括但不限于苄基氯。化合物56可以与B1解封剂反应以除去封端部分B1并得到伯醇延长单体57。所述B1解封剂可以选自本领域技术人员已知的不同的解封剂。当通过成酯将所述伯醇封端时，B1解封剂为脱酯剂，例如碱(例如碳酸钾)。当使用甲硅烷基氯将伯醇封端时，B1解封剂优选为四丁基氟化铵(TBAF)。伯醇延长单体57可以与甲基磺酰氯反应得到仲醇延长单体甲磺酸酯58。
可以如下将伯醇延长单体54和仲醇延长单体57封端。仲醇延长单体54可以与封端剂反应得到化合物59。所述封端剂可以是本领域技术人员已知的不同的封端剂，包括但不限于烷基卤如氯甲烷。化合物59可以与上述的B1解封剂反应得到伯醇封端单体60。伯醇封端单体60可以与甲基磺酰氯反应得到仲醇封端单体甲磺酸酯61。伯醇延长单体57可以与封端剂反应得到化合物62。所述封端剂可以是如上述的不同的封端剂。化合物62可以与B2解封剂反应以除去封端部分B2和得到仲醇封端单体63。所述B2解封剂可以是本领域技术人员已知的不同的解封剂，包括但不限于钯/活性碳催化剂存在下的H2。所述仲醇封端单体可以与甲基磺酰氯反应得到伯醇封端单体甲磺酸酯64。虽然图11所示的实施方案表示封端单体的合成，应该理解可以进行类似的反应以得到封端聚合物。
一般地，链延长可以通过以下方法进行：使伯醇延长单体或聚合物如伯醇延长单体57与伯醇延长单体或聚合物甲磺酸酯如伯醇延长单体甲磺酸酯55反应得到不同的均一的聚丙烯链，或者使仲醇延长单体或聚合物如仲醇延长单体54与仲醇延长单体或聚合物甲磺酸酯如仲醇延长单体甲磺酸酯58反应。
例如在图13中，伯醇延长单体甲磺酸酯55与伯醇延长单体57反应得到二聚物化合物65。可选择地，仲醇延长单体甲磺酸酯58可以与仲醇延长单体54反应得到二聚物化合物65。可以使用上述的B1解封剂除去二聚物化合物65上的B1封端部分得到伯醇延长二聚物66。伯醇延长二聚物66可以与甲基磺酰氯反应得到仲醇延长二聚物甲磺酸酯67。可选择地，可以使用上述的B2解封剂除去二聚物化合物65上的B2封端部分得到仲醇延长二聚物69。仲醇延长二聚物69可以与甲基磺酰氯反应得到伯醇延长二聚物甲磺酸酯70。
本领域技术人员已知，链延长过程可以重复进行以得到不同的其它链长度。例如如图13所示，伯醇延长二聚物66可以与伯醇延长二聚物甲磺酸酯70反应得到四聚物化合物72。如图13进一步显示，一般的链延长反应路线包括伯醇延长单体或聚合物73与伯醇延长单体或聚合物甲磺酸酯74反应得到均一的聚丙烯聚合物75。m和n的值的范围可以是0-1000，或者更优选m和n各自为0-50。虽然图13所示的实施方案表示伯醇延长单体和/或聚合物与伯醇延长单体和/或聚合物甲磺酸酯，但应该理解可以使用仲醇延长单体和/或聚合物和仲醇延长单体和/或聚合物甲磺酸酯完成类似的反应。
伯醇延长单体或聚合物的末端或者伯醇延长单体或聚合物甲磺酸酯的末端可以分别与伯醇封端单体或聚合物甲磺酸酯或伯醇封端单体或聚合物反应得到封端的均一的聚丙烯链。例如，如图12所示，伯醇延长二聚物甲磺酸酯70与伯醇封端单体60反应得到封端的(capped/blocked)伯醇延长三聚物71。本领域技术人员已知，可以除去B1封端部分，且所得的封端的伯醇延长三聚物可以与伯醇延长单体或聚合物甲磺酸酯反应以延长封端的三聚物71的链。
仲醇延长单体或聚合物的末端或者仲醇延长单体或聚合物的末端甲磺酸酯可以分别与仲醇封端单体或聚合物甲磺酸酯或仲醇封端单体或聚合物反应得到封端的均一的聚丙烯链。例如，如图12所示，仲醇延长二聚物甲磺酸酯67与仲醇封端单体63反应得到封端的(capped/blocked)伯醇延长三聚物68。可以如以上所述除去所述的B2封端部分，且所得的封端的仲醇延长三聚物可以与仲醇延长链节甲磺酸酯反以延长封端的三聚物68的链。虽然图12所示的合成表示二聚物与封端单体反应得到三聚物，但应该理解封端过程可以在均一的聚丙二醇部分的合成中的任何点进行，或者可选择地，可以得到未被封端的均一的聚丙二醇部分。虽然图12所示的实施方案表示通过使用封端单体进行合成而将聚丁烯寡聚体封端，应该理解本发明的聚丁烯寡聚体可以是使用以上图11所述的封端剂而进行直接封端(即不加入封端单体)。
根据本发明的实施方案的均一的聚丙二醇部分可以通过本领域技术人员已知的不同的方法与生长激素药物、亲脂部分如羧酸和/或不同的其它部分偶合，这些方法包括但不限于这里关于聚乙二醇部分所述的方法。
所述的寡聚体可以包含一个或多个本领域技术人员已知的其它部分，包括不限于亲水部分、亲脂部分、间隔部分、接头部分和末端部分。所述寡聚体中的不同的部分通过可水解或不可水解的键与另一寡聚体共价偶合。
所述寡聚体还可以包含一个或多个亲水部分，包括但不限于糖、聚亚烷基二醇和聚胺/PEG共聚物。相邻的聚亚烷基二醇部分考虑是相同的部分，如果它们通过醚键偶合并具有相同的烷基结构的话。例如，以下部分：-O-C2H4-O-C2H4-O-C2H4-O-C2H4-O-C2H4-O-C2H4-是单一的具有6个聚乙二醇亚基的聚乙二醇部分。相邻的聚亚烷基二醇部分认为是不同的部分，如果它们与除了醚键之外的键偶合或者它们具有不同的烷基结构。例如，以下部分
是具有4个乙二醇亚基的聚乙二醇部分和具有2个聚乙二醇亚基的亲水部分。优选，根据本发明的寡聚体的的实施方案包含聚亚烷基二醇部分，并不进一步包含亲水部分。
所述的寡聚体还可以包含一个或多个本领域技术人员已知的亲脂部分。所述的亲脂部分优选为饱和或不饱和、直链或支链烷基部分或饱和或不饱和、直链或支链脂肪酸部分。当所述的亲脂部分为烷基部分时，优选直链、饱和或不饱和具有1-28个，更优选具有具有2-12个碳原子的碳原子的烷基部分。当所述的亲脂部分为脂肪酸部分时，优选天然的脂肪酸是直链、天然脂肪酸部分，具有2-18个碳原子。更优选，所述脂肪酸部分具有3-14个碳原子。最优选所述脂肪酸部分具有至少4、5或6个碳原子。
所述寡聚体还可以包含一个或多个本领域技术人员已知的间隔部分。例如间隔部分可以用于分隔亲水部分与亲脂部分，用于分隔亲脂部分或亲水部分与生长激素药物，用于分隔第一亲水或亲脂部分与第二亲水或亲脂部分，或用于分隔亲水部分或亲脂部分与接头部分。间隔部分优选自糖、胆固醇和甘油部分。
所述的寡聚体还可以包含一个或多个用于将寡聚体与本领域技术人员已知的生长激素药物偶合。优选接头部分选自烷基和脂肪酸部分。
所述寡聚体还可以包含一个或多个处在不与生长激素药物偶合的寡聚体的末端的末端部分。所述末端部分优选为烷基或烷氧基部分，更优选低级烷基或低级烷氧基部分。最优选所述的末端部分为甲基或甲氧基。虽然所述末端部分优选为烷基或烷氧基部分，但应该理解所述的末端部分可以是本领域技术人员已知的不同的部分，包括但不限于糖、胆固醇、醇和脂肪酸。
所述寡聚体优选与生长激素药物共价偶合。在某些实施方案中，利用可水解的键(酯或碳酸酯键)将生长激素药物与寡聚体偶合。可水解的偶合可以得到用作前药的生长激素药物-寡聚体偶联物。例如在某些实施方案中，其中所述的生长激素药物-寡聚体偶联物无活性(即所述偶联物缺乏通过生长激素药物的主要作用机理而影响效果的能力)，可水解的偶合可以用于延时释放或控释效果。在一个或多个寡聚体从它们的各自的生长激素药物-寡聚体偶联物上裂解得到活性药物时，可以在确定的时间内施用生长激素药物。在其它实施方案中，利用不可水解的键(例如氨基甲酸酯、酰胺或醚键)将生长激素药物与寡聚体偶合。当期望使生长激素药物-寡聚体偶联物在血流中进行长期，优选至少2小时的循环时，可以优选使用不可水解的键。当寡聚体与生长激素药物共价偶合时，所述寡聚体还包含一个或多个用于与本领域技术人员已知的生长激素药物的寡聚体共价偶合的键合部分。键合部分优选选自共价键、酯部分、碳酸酯部分、氨基甲酸酯部分、酰胺部分和仲胺部分。所述寡聚体上多于1个部分可以与生长激素药物共价偶合。
虽然所述寡聚体优选与生长激素药物共价偶合，但应该理解所述寡聚体可以与生长激素药物非共价偶合形成非共价偶联的生长激素药物-寡聚体复合物。本领域技术人员已知，非共价偶合包括但不限于氢键、离子键、范德瓦尔斯键和胶束或脂质体包囊。本领域技术人员已知，根据本发明的实施方案，寡聚体可以被适宜构建、修饰和/或适宜地官能化以赋予以所选择地方式进行非共价偶联的能力(例如赋予氢键能力)。根据本发明的其它实施方案，寡聚体可以由不同的化合物的衍生，这些化合物包括但不限于氨基酸、寡肽、肽、胆汁酸、胆汁酸衍生物、脂肪酸、脂肪酸衍生物、水杨酸、水杨酸衍生物、氨基水杨酸和氨基水杨酸衍生物。所得的寡聚体可以与药物分子、药品和/或药物赋形剂非共价偶合(复合)。所得的复合物优选具有平衡的亲脂和亲水性能。根据本发明的进一步的其它实施方案，寡聚体可以由胺和/或烷基胺衍生。在适宜的酸性条件下，所得的寡聚体可以与药物分子、药品和/或药物赋形剂形成非共价偶联的复合物。由这种复合作用得到的产品优选具有平衡的亲脂和亲水性能。
多于一个寡聚体(即多个寡聚体)可以与生长激素药物偶合。多数的寡聚体优选相同。但是，应该理解多数寡聚体可以彼此不同，或者可选择地，多数寡聚体中有一些可以相同而有一些可以不同。当多个寡聚体与生长激素药物偶合时，可以优选将一个或多个寡聚体与具有可水解的键的生长激素药物偶合和将一个或多个寡聚体与具有不可水解的键的生长激素药物偶合。可选择地，所有将多数寡聚体与生长激素药物偶合的键可以是可水解的，但具有不同的水解程度，因而例如一个或多个寡聚体通过在体内水解而快速地从生长激素药物上除去和一个或多个寡聚体通过在体内水解而缓慢地从生长激素药物上除去。
所述寡聚体可以在药物的不同亲核残基上与生长激素药物偶合，所述亲核残基包括但不限于亲核羟基官能团和/或氨基官能团。例如，亲核羟基官能团可以见于丝氨酸和/或酪氨酸残基，而亲核氨基官能团可以见于组氨酸和/或赖氨酸残基和/或一个或多个多肽的N-末端。当寡聚体与一个或多个生长激素多肽的N-末端偶合时，所述偶合优选形成仲胺。例如，当所述生长激素药物为人生长激素时，所述寡聚体可以是与Phe1、Lys38、Lys41、Lys70、Lys115、Lys140、Lys145、Lys158、Lys168和/或Lys172的氨基官能团偶合。
可以由不同的方法合成分散系数大于10,000的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物。例如，通过以下方法合成由羧酸和聚乙二醇组成的分散系数大于10,000的寡聚体的混合物：使分散系数大于10,000的羧酸的混合物与分散系数大于10,000的聚乙二醇的混合物在足以得到分散系数大于10,000的寡聚体的混合物的条件下接触。然后将分散系数大于10,000的混合物的寡聚体活化，从而使它们能够与生长激素药物反应得到生长激素药物-寡聚体偶联物。用于得到分散系数大于10,000的活化的寡聚体的混合物的合成路线的一个实施方案如图3所示，并如以下的实施例11-18所述。用于得到分散系数大于10,000的活化的寡聚体的混合物的合成路线的另一个实施方案如图4所示，并如以下的实施例19-24所述。用于得到分散系数大于10,000的活化的寡聚体的混合物的合成路线的另一个实施方案如图5所示，并如以下的实施例25-29所述。用于得到分散系数大于10,000的活化的寡聚体的混合物的合成路线的另一个实施方案如图6所示，并如以下实施例30-31所述。用于得到分散系数大于10,000的活化的寡聚体的混合物的合成路线的另一个实施方案如图7所示，并如以下的实施例32-37所述。用于得到分散系数大于10,000的活化的寡聚体的混合物的合成路线的另一个实施方案如图8所示，并如以下的实施例38所述。用于得到分散系数大于10,000的活化的寡聚体的混合物的合成路线的另一个实施方案如图9所示，并如以下的实施例39所述。用于得到分散系数大于10,000的活化的寡聚体的混合物的合成路线的另一个实施方案如图10所示，并如以下的实施例40所述。
将分散系数大于10,000的活化的寡聚体的混合物与分散系数大于10,000的生长激素药物的混合物在足以得到生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物的条件下反应。合成实例如以下实施例40-42所述。本领域技术人员已知，可以控制反应条件(例如所选择的摩尔比、溶剂混合物和/或pH)以使由分散系数大于10,000的活化的寡聚体的混合物和分散系数大于10,000的生长激素药物的混合物反应得到的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物是分散系数大于10,000的混合物。例如，可以通过将反应溶液的pH保持在赖氨酸的pKa以下而抑制在赖氨酸的氨基官能团上的偶联。可选择地，所述的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物可以利用HPLC分离(separated和isolated)得到分散系数大于10,000的一、二或三偶联物。可以利用本领域技术人员已知的不同的技术测定和/或检验特定的分离的偶联物的偶联程度(例如所分离的分子为一、二或三偶联物)，这些技术包括但不限于质谱。可以利用本领域技术人员已知的不同的技术测定和/或检验特定的偶联物结构(例如所述寡聚体处在人生长激素一偶联物的Phe1、Lys38、Lys41、Lys70、Lys115、Lys140、Lys145、Lys158、Lys168或Lys172)，这些技术包括但不限于序列分析、肽图分析、选择性酶切和/或内肽酶切割。
本领域技术人员已知，例如可以通过使生长激素药物与适宜的封端剂如N-叔丁氧基羰基(t-BOC)或N-(9-芴基甲氧基羰基)(N-FMOC)反应而将生长激素药物上的一个或多个反应部位封端。例如在所述的生长激素药物为多肽并期望形成在多肽的一个或多个N-末端具有一个或多个寡聚体的不饱和的偶联物(即并非所有的亲核残基被偶联)时可以优选这种方法。在进行这种封端之后，分散系数大于10,000的封端的生长激素药物的混合物可以与分散系数大于10,000的活化的寡聚体的混合物反应得到具有与一个或多个亲核残基偶合的寡聚体和具有与其它亲核残基偶合的封端部分的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物。本领域技术人员已知，在偶联反应之后可以将生长激素药物-寡聚体偶联物解封。如果需要的话，然后可以如上述分离所述的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物得到分散系数大于10,000的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物。可选择地，可以在解封之前分离所述的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物。
根据本发明的实施方案的分散系数大于10,000的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物优选具有比常规混合物改善的性能。例如，分散系数大于10,000的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物优选其体内活性大于具有与分散系数大于10,000的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物相同的数均分子量的多分散的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物的体内活性。本领域技术人员已知，可以通过不同的方法测定分散系数大于10,000的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物的数均分子量和多分散的混合物的数均分子量，这些方法包括不但不限于体积排阻色谱法，例如H.R.Allcock & F.W.Lampe，CONTEMPORARYPOLYMER CHEMISTRY 394-402(第二版，1991)所述的凝胶渗透色谱法。
作为另一个实例，分散系数大于10,000的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物优选其体外活性大于具有与分散系数大于10,000的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物相同的数均分子量的多分散的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物的体外活性。本领域技术人员已知，可以通过不同的方法测定分散系数大于10,000的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物的数均分子量和多分散的混合物的数均分子量，这些方法包括不但不限于体积排阻色谱法。
本领域技术人员已知，可以通过不同的方法测定特定的混合物的体外活性。优选使用从Molecular Devices Corporation of Sunnyvale，California商购的Cytosensort微生理机能测定仪测定体外活性。所述微生理机能测定仪监测对被加到在Transwell中培养的细胞的药物作出反应而发生的细胞外酸化速率的细微变化。这种反应与研究的分子的活性成比例。
作为另一个实例，当与具有与分散系数大于10,000的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物相同的数均分子量的多分散的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物对胰凝乳蛋白酶降解的抵抗力相比时，分散系数大于10,000的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物对胰凝乳蛋白酶降解的抵抗力增大。本领域技术人员已知，分散系数大于10,000的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物的数均分子量和多分散的混合物的数均分子量可以通过不同的方法测定，这些方法包括不但不限于体积排阻色谱法。
作为另一个实例，分散系数大于10,000的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物优选其受试者间的差异性小于具有与分散系数大于10,000的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物相同的数均分子量的多分散的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物的受试者间的差异性。本领域技术人员已知，分散系数大于10,000的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物的数均分子量和多分散的混合物的数均分子量可以通过不同的方法测定，这些方法包括不但不限于体积排阻色谱法。可以通过本领域技术人员已知的不同的方法测定受试者间的差异性。优选如下计算受试者间的差异性。测定每名受试者的剂量反应曲线下的面积(AUC)(即剂量反应曲线和基线值之间的面积)。所有受试者的平均AUC通过计算每名受试者的AUC并将此总和除去受试者的数量来确定。然后对每名受试者测定受试者的AUC和平均AUC之间的差异的绝对值。然后计算所得的差异的绝对值的总和得到代表受试者间的差异性的值。较低的值代表较低的受试者间的差异性，而较高的值代表较高的受试者间的差异性。
根据本发明的实施方案的分散系数大于10,000的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物优选具有二种或更多种上述的改善性能。更优选，根据本发明的实施方案的分散系数大于10,000的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物具有三种或更多种上述的改善性能。最优选根据本发明的实施方案的分散系数大于10,000的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物具有所有4种上述的改善性能。
根据本发明的其它实施方案，在偶联物的混合物中，每个偶联物包括与寡聚体偶合的生长激素药物并具有相同数量的聚亚烷基二醇亚基。
所述的生长激素药物优选为人生长激素。但是，应该理解所述的生长激素药物可以选自不同的本领域技术人员已知的生长激素药物，例如它包括但不限于生长激素肽、生长激素肽类似物、生长激素肽片断和生长激素肽片断类似物。生长激素肽包括但不限于生长激素，人(hGH)；生长激素，猪；生长激素，牛；生长激素，鸡；生长激素，大鼠；生长激素，小鼠；生长激素，绵羊；生长激素释放因子，人；生长激素pro-释放因子，人；生长激素释放因子，小鼠；生长激素释放因子，绵羊；生长激素释放因子，大鼠；生长激素释放因子，牛；生长激素释放因子，猪；和生长激素释放因子，鸡。生长激素肽类似物可以如上述通过取代生长激素肽上的一个或多个氨基酸而得到。生长激素肽片断包括但不限于生长激素1-43，人；生长激素6-13；生长激素释放因子1-37，人；生长激素释放因子1-40，人；生长激素释放因子1-40，酰胺，人；生长激素释放因子30-44，酰胺，人；生长激素释放因子1-29，酰胺，大鼠；海沙瑞林(生长激素释放六肽)；和生长激素释放因子1-29，酰胺，人。生长激素肽片断类似物包括但不限于[D-Ala2]-生长激素释放因子1-29，酰胺，人；[N-Ac-Tyr1，D-Arg2]-生长激素释放因子1-29，酰胺；[His1，Nle27]-生长激素释放因子1-32，酰胺；生长激素释放肽-6([His1，Lys6]-GHRP)和[D-Lys3]-GHRP-6。
所述的寡聚体可以是包含本领域技术人员已知的聚亚烷基二醇部分的不同的寡聚体。优选所述的聚亚烷基二醇部分具有至少2、3或4个聚亚烷基二醇亚基。更优选，所述的聚亚烷基二醇部分具有至少5或6个聚亚烷基二醇亚基。最优选所述的寡聚体的聚亚烷基二醇部分具有至少7个聚亚烷基二醇亚基。所述的寡聚体的聚亚烷基二醇部分优选为低级烷基聚亚烷基二醇部分如聚乙二醇部分、聚丙二醇部分或聚丁二醇部分。所述聚亚烷基二醇部分更优选为具有均一结构的聚丙二醇部分。具有均一的结构的聚丙二醇部分的一个实例如下：
此均一的聚丙二醇结构可以描述为仅具有一个与聚丙二醇链上的每个氧原子相邻的甲基取代的碳原子。这种均一的聚丙二醇部分可以表现出亲脂和亲水特征，因而用于在不使用亲脂聚合物部分的情况下得到两亲型生长激素药物-寡聚体偶联物。而且，聚丙二醇部分的仲醇部分与生长激素药物偶合可得到对酶如肠中发现的胰岛素和胰凝乳蛋白酶导致的降解的抵抗力增大的生长激素药物(例如人生长激素)。
根据本发明的实施方案的均一的聚丙二醇优选如图11-13所示合成，现在将对其进行详述。如图11所示，1，2-丙二醇53与伯醇封端剂反应得到仲醇延长单体54。所述伯醇封端剂可以是本领域技术人员已知的不同的伯醇封端剂(包括但不限于甲硅烷基氯化合物如叔丁基联苯甲硅烷基氯和叔丁基二甲基甲硅烷基氯)和酯化剂如AC2O。优选所述的伯醇封端剂为基本上不与仲醇反应的伯醇封端剂，例如叔丁基联苯甲硅烷基氯或叔丁基二甲基甲硅烷基氯。所述的仲醇延长单体(54)可以与甲基磺酰氯(MeSO2Cl)反应得到伯醇延长单体甲磺酸酯55。
可选择地，仲醇延长单体54可以与仲醇封端剂反应得到化合物56。所述仲醇封端剂可以是本领域技术人员已知的不同的仲醇封端剂，包括但不限于苄基氯。化合物56可以与B1解封剂反应以除去封端部分B1并得到伯醇延长单体57。所述B1解封剂可以选自本领域技术人员已知的不同的解封剂。当通过成酯将所述伯醇封端时，B1解封剂为脱酯剂，例如碱(例如碳酸钾)。当使用甲硅烷基氯将伯醇封端时，B1解封剂优选为四丁基氟化铵(TBAF)。伯醇延长单体57可以与甲基磺酰氯反应得到仲醇延长单体甲磺酸酯58。
可以如下将伯醇延长单体54和仲醇延长单体57封端。仲醇延长单体54可以与封端剂反应得到化合物59。所述封端剂可以是本领域技术人员已知的不同的封端剂，包括但不限于烷基卤如氯甲烷。化合物59可以与上述的B1解封剂反应得到伯醇封端单体60。伯醇封端单体60可以与甲基磺酰氯反应得到仲醇封端单体甲磺酸酯61。伯醇延长单体57可以与封端剂反应得到化合物62。所述封端剂可以是如上述的不同的封端剂。化合物62可以与B2解封剂反应以除去封端部分B2和得到仲醇封端单体63。所述B2解封剂可以是本领域技术人员已知的不同的解封剂，包括但不限于钯/活性碳催化剂存在下的H2。所述仲醇封端单体可以与甲基磺酰氯反应得到伯醇封端单体甲磺酸酯64。虽然图11所示的实施方案表示封端单体的合成，应该理解可以进行类似的反应以得到封端聚合物。
一般地，链延长可以通过以下方法进行：使伯醇延长单体或聚合物如伯醇延长单体57与伯醇延长单体或聚合物甲磺酸酯如伯醇延长单体甲磺酸酯55反应得到不同的均一的聚丙烯链，或者使仲醇延长单体或聚合物如仲醇延长单体54与仲醇延长单体或聚合物甲磺酸酯如仲醇延长单体甲磺酸酯58反应。
例如在图13中，伯醇延长单体甲磺酸酯55与伯醇延长单体57反应得到二聚物化合物65。可选择地，仲醇延长单体甲磺酸酯58可以与仲醇延长单体54反应得到二聚物化合物65。可以使用上述的B1解封剂除去二聚物化合物65上的B1封端部分得到伯醇延长二聚物66。伯醇延长二聚物66可以与甲基磺酰氯反应得到仲醇延长二聚物甲磺酸酯67。可选择地，可以使用上述的B2解封剂除去二聚物化合物65上的B2封端部分得到仲醇延长二聚物69。仲醇延长二聚物69可以与甲基磺酰氯反应得到伯醇延长二聚物甲磺酸酯70。
本领域技术人员已知，链延长过程可以重复进行以得到不同的其它链长度。例如如图13所示，伯醇延长二聚物66可以与伯醇延长二聚物甲磺酸酯70反应得到四聚物化合物72。如图13进一步显示，一般的链延长反应路线包括伯醇延长单体或聚合物73与伯醇延长单体或聚合物甲磺酸酯74反应得到均一的聚丙烯聚合物75。m和n的值的范围可以是0-1000，或者更优选m和n各自为0-50。虽然图13所示的实施方案表示伯醇延长单体和/或聚合物与伯醇延长单体和/或聚合物甲磺酸酯，但应该理解可以使用仲醇延长单体和/或聚合物和仲醇延长单体和/或聚合物甲磺酸酯完成类似的反应。
伯醇延长单体或聚合物的末端或者伯醇延长单体或聚合物甲磺酸酯的末端可以分别与伯醇封端单体或聚合物甲磺酸酯或伯醇封端单体或聚合物反应得到封端的均一的聚丙烯链。例如，如图12所示，伯醇延长二聚物甲磺酸酯70与伯醇封端单体60反应得到封端的(capped/blocked)伯醇延长三聚物71。本领域技术人员已知，可以除去B1封端部分，且所得的封端的伯醇延长三聚物可以与伯醇延长单体或聚合物甲磺酸酯反应以延长封端的三聚物71的链。
仲醇延长单体或聚合物的末端或者仲醇延长单体或聚合物的末端甲磺酸酯可以分别与仲醇封端单体或聚合物甲磺酸酯或仲醇封端单体或聚合物反应得到封端的均一的聚丙烯链。例如，如图12所示，仲醇延长二聚物甲磺酸酯67与仲醇封端单体63反应得到封端的(capped/blocked)伯醇延长三聚物68。可以如以上所述除去所述的B2封端部分，且所得的封端的仲醇延长三聚物可以与仲醇延长链节甲磺酸酯反以延长封端的三聚物68的链。虽然图12所示的合成表示二聚物与封端单体反应得到三聚物，但应该理解封端过程可以在均一的聚丙二醇部分的合成中的任何点进行，或者可选择地，可以得到未被封端的均一的聚丙二醇部分。虽然图12所示的实施方案表示通过使用封端单体进行合成而将聚丁烯寡聚体封端，应该理解本发明的聚丁烯寡聚体可以是使用以上图11所述的封端剂而进行直接封端(即不加入封端单体)。
根据本发明的实施方案的均一的聚丙二醇部分可以通过本领域技术人员已知的不同的方法与生长激素药物、亲脂部分如羧酸和/或不同的其它部分偶合，这些方法包括但不限于这里关于聚乙二醇部分所述的方法。
所述的寡聚体可以包含一个或多个本领域技术人员已知的其它部分，包括不限于亲水部分、亲脂部分、间隔部分、接头部分和末端部分。所述寡聚体中的不同的部分通过可水解或不可水解的键与另一寡聚体共价偶合。
所述寡聚体还可以包含一个或多个亲水部分，包括但不限于糖、聚亚烷基二醇和聚胺/PEG共聚物。相邻的聚亚烷基二醇部分考虑是相同的部分，如果它们通过醚键偶合并具有相同的烷基结构的话。例如，以下部分：
-O-C2H4-O-C2H4-O-C2H4-O-C2H4-O-C2H4-O-C2H4-是单一的具有6个聚乙二醇亚基的聚乙二醇部分。相邻的聚亚烷基二醇部分认为是不同的部分，如果它们与除了醚键之外的键偶合或者它们具有不同的烷基结构。例如，以下部分
Figure A0281530100511
是具有4个乙二醇亚基的聚乙二醇部分和具有2个聚乙二醇亚基的亲水部分。优选，根据本发明的寡聚体的的实施方案包含聚亚烷基二醇部分，并不进一步包含亲水部分。
所述的寡聚体还可以包含一个或多个本领域技术人员已知的亲脂部分。所述的亲脂部分优选为饱和或不饱和、直链或支链烷基部分或饱和或不饱和、直链或支链脂肪酸部分。当所述的亲脂部分为烷基部分时，优选直链、饱和或不饱和具有1-28个，更优选具有具有2-12个碳原子的碳原子的烷基部分。当所述的亲脂部分为脂肪酸部分时，优选天然的脂肪酸是直链、天然脂肪酸部分，具有2-18个碳原子。更优选，所述脂肪酸部分具有3-14个碳原子。最优选所述脂肪酸部分具有至少4、5或6个碳原子。
所述寡聚体还可以包含一个或多个本领域技术人员已知的间隔部分。例如间隔部分可以用于分隔亲水部分与亲脂部分，用于分隔亲脂部分或亲水部分与生长激素药物，用于分隔第一亲水或亲脂部分与第二亲水或亲脂部分，或用于分隔亲水部分或亲脂部分与接头部分。间隔部分优选自糖、胆固醇和甘油部分。
所述的寡聚体还可以包含一个或多个用于将寡聚体与本领域技术人员已知的生长激素药物偶合。优选接头部分选自烷基和脂肪酸部分。
所述寡聚体还可以包含一个或多个处在不与生长激素药物偶合的寡聚体的末端的末端部分。所述末端部分优选为烷基或烷氧基部分，更优选低级烷基或低级烷氧基部分。最优选所述的末端部分为甲基或甲氧基。虽然所述末端部分优选为烷基或烷氧基部分，但应该理解所述的末端部分可以是本领域技术人员已知的不同的部分，包括但不限于糖、胆固醇、醇和脂肪酸。
所述寡聚体优选与生长激素药物共价偶合。在某些实施方案中，利用可水解的键(酯或碳酸酯键)将生长激素药物与寡聚体偶合。可水解的偶合可以得到用作前药的生长激素药物-寡聚体偶联物。例如在某些实施方案中，其中所述的生长激素药物-寡聚体偶联物无活性(即所述偶联物缺乏通过生长激素药物的主要作用机理而影响效果的能力)，可水解的偶合可以用于延时释放或控释效果。在一个或多个寡聚体从它们的各自的生长激素药物-寡聚体偶联物上裂解得到活性药物时，可以在确定的时间内施用生长激素药物。在其它实施方案中，利用不可水解的键(例如氨基甲酸酯、酰胺或醚键)将生长激素药物与寡聚体偶合。当期望使生长激素药物-寡聚体偶联物在血流中进行长期，优选至少2小时的循环时，可以优选使用不可水解的键。当寡聚体与生长激素药物共价偶合时，所述寡聚体还包含一个或多个用于与本领域技术人员已知的生长激素药物的寡聚体共价偶合的键合部分。键合部分优选选自共价键、酯部分、碳酸酯部分、氨基甲酸酯部分、酰胺部分和仲胺部分。所述寡聚体上多于1个部分可以与生长激素药物共价偶合。
虽然所述寡聚体优选与生长激素药物共价偶合，但应该理解所述寡聚体可以与生长激素药物非共价偶合形成非共价偶联的生长激素药物-寡聚体复合物。本领域技术人员已知，非共价偶合包括但不限于氢键、离子键、范德瓦尔斯键和胶束或脂质体包囊。本领域技术人员已知，根据本发明的实施方案，寡聚体可以被适宜构建、修饰和/或适宜地官能化以赋予以所选择地方式进行非共价偶联的能力(例如赋予氢键能力)。根据本发明的其它实施方案，寡聚体可以由不同的化合物的衍生，这些化合物包括但不限于氨基酸、寡肽、肽、胆汁酸、胆汁酸衍生物、脂肪酸、脂肪酸衍生物、水杨酸、水杨酸衍生物、氨基水杨酸和氨基水杨酸衍生物。所得的寡聚体可以与药物分子、药品和/或药物赋形剂非共价偶合(复合)。所得的复合物优选具有平衡的亲脂和亲水性能。根据本发明的进一步的其它实施方案，寡聚体可以由胺和/或烷基胺衍生。在适宜的酸性条件下，所得的寡聚体可以与药物分子、药品和/或药物赋形剂形成非共价偶联的复合物。由这种复合作用得到的产品优选具有平衡的亲脂和亲水性能。
多于一个寡聚体(即多个寡聚体)可以与生长激素药物偶合。多数的寡聚体优选相同。但是，应该理解多数寡聚体可以彼此不同，或者可选择地，多数寡聚体中有一些可以相同而有一些可以不同。当多个寡聚体与生长激素药物偶合时，可以优选将一个或多个寡聚体与具有可水解的键的生长激素药物偶合和将一个或多个寡聚体与具有不可水解的键的生长激素药物偶合。可选择地，所有将多数寡聚体与生长激素药物偶合的键可以是可水解的，但具有不同的水解程度，因而例如一个或多个寡聚体通过在体内水解而快速地从生长激素药物上除去和一个或多个寡聚体通过在体内水解而缓慢地从生长激素药物上除去。
所述寡聚体可以在药物的不同亲核残基上与生长激素药物偶合，所述亲核残基包括但不限于亲核羟基官能团和/或氨基官能团。例如，亲核羟基官能团可以见于丝氨酸和/或酪氨酸残基，而亲核氨基官能团可以见于组氨酸和/或赖氨酸残基和/或一个或多个多肽的N-末端。当寡聚体与一个或多个生长激素多肽的N-末端偶合时，所述偶合优选形成仲胺。例如，当所述生长激素药物为人生长激素时，所述寡聚体可以是与Phe1、Lys38、Lys41、Lys70、Lys115、Lys140、Lys145、Lys158、Lys168和/或Lys172的氨基官能团偶合。
可以通过不同的方法合成其中的每个偶联物具有相同数量的聚乙二醇亚基的生长激素药物寡聚体偶联物的混合物。例如，通过以下方法合成羧酸和聚乙二醇组成的寡聚体的混合物，其中所述混合物中的每个寡聚体具有相同数量的聚乙二醇亚基：使羧酸的混合物与其中的每个聚乙二醇分子具有相同数量的聚乙二醇亚基的聚乙二醇的混合物在足以得到其中的每个寡聚体具有相同数量的聚乙二醇亚基的寡聚体的混合物的条件下接触。然后将其中的每个寡聚体具有相同数量的聚乙二醇亚基的混合物中的寡聚体活化，从而使它们能够与生长激素药物得到生长激素药物-寡聚体偶联物反应。用于得到其中的每个寡聚体具有相同数量的聚乙二醇亚基的活化的寡聚体的混合物的合成路线的一个实施方案如图3所示，并如以下的实施例11-18所述。用于得到其中的每个寡聚体具有相同数量的聚乙二醇亚基的活化的寡聚体的混合物的混合物的合成路线的另一个实施方案如图4所示，并如以下的实施例19-24所述。用于得到其中的每个寡聚体具有相同数量的聚乙二醇亚基的活化的寡聚体的混合物的混合物的合成路线的另一个实施方案如图5所示，并如以下的实施例25-29所述。用于得到其中的每个寡聚体具有相同数量的聚乙二醇亚基的活化的寡聚体的混合物的混合物的合成路线的另一个实施方案如图6所示，并如以下的实施例30-31所述。用于得到其中的每个寡聚体具有相同数量的聚乙二醇亚基的活化的寡聚体的混合物的混合物的合成路线的另一个实施方案如图7所示，并如以下的实施例32-37所述。用于得到其中的每个寡聚体具有相同数量的聚乙二醇亚基的活化的寡聚体的混合物的混合物的合成路线的另一个实施方案如图8所示，并如以下的实施例38所述。用于得到其中的每个寡聚体具有相同数量的聚乙二醇亚基的活化的寡聚体的混合物的混合物的合成路线的另一个实施方案如图9所示，并如以下的实施例39所述。用于得到其中的每个寡聚体具有相同数量的聚乙二醇亚基的活化的寡聚体的混合物的混合物的合成路线的另一个实施方案如图10所示，并如以下的实施例40所述。
所述的其中的每个寡聚体具有相同数量的聚乙二醇亚基的活化的寡聚体的混合物与生长激素药物的混合物在足以得到生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物的条件下反应。合成的实例如以下实施例40-42所述。本领域技术人员已知，可以控制反应条件(例如所选择的摩尔比，溶剂混合物和/或pH)以使由其中的每个寡聚体具有相同数量的聚乙二醇亚基的活化的寡聚体的混合物和生长激素药物的混合物反应得到的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物是其中的每个偶联物具有相同数量的聚乙二醇亚基的偶联物的混合物。例如，可以通过将反应溶液的pH保持在赖氨酸的pKa下以下而抑制赖氨酸的氨基官能团处的偶联。可选择地，可以利用HPLC分离(separated和isolated)生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物得到生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物，例如一、二或三偶联物，其中所述混合物中的每个偶联物具有相同数量的聚乙二醇亚基。可以利用本领域技术人员已知的不同的技术测定和/或检验特定的分离的偶联物的偶联程度(例如所分离的分子为一、二或三偶联物)，这些技术包括但不限于质谱。可以利用本领域技术人员已知的不同的技术测定和/或检验特定的偶联物结构(例如所述寡聚体处在人生长激素一偶联物的Phe1、Lys38、Lys41、Lys70、Lys115、Lys140、Lys145、Lys158、Lys168或Lys172)，这些技术包括但不限于序列分析、肽图分析、选择性酶切和/或内肽酶切割。
本领域技术人员已知，例如可以通过使生长激素药物与适宜的封端剂如N-叔丁氧基羰基(t-BOC)或N-(9-芴基甲氧基羰基)(N-FMOC)反应而将生长激素药物上的一个或多个反应部位封端。例如在所述的生长激素药物为多肽并期望形成在多肽的一个或多个N-末端具有一个或多个寡聚体的不饱和的偶联物(即并非所有的亲核残基被偶联)时可以优选这种方法。在进行这种封端之后，可以使封端的生长激素药物的混合物与其中的每个寡聚体具有相同数量的聚乙二醇亚基的活化的寡聚体的混合物反应得到具有与一个或多个亲核残基偶合的寡聚体和具有与亲核残基偶合的封端部分的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物。本领域技术人员已知，在偶联反应之后可以将生长激素药物-寡聚体偶联物解封。如果需要的话，然后可以如上述分离所述的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物得到所述的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物(其中混合物中的每个寡聚体具有相同数量的聚乙二醇亚基)。可选择地，可以在解封之前分离所述的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物。
根据本发明的实施方案的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物(其中混合物中的每个寡聚体具有相同数量的聚乙二醇亚基)优选具有比常规的混合物改善的性能。例如，所述的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物(其中混合物中的每个寡聚体具有相同数量的聚乙二醇亚基)优选其体内活性大于具有与所述的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物(其中混合物中的每个寡聚体具有相同数量的聚乙二醇亚基)相同的数均分子量的多分散的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物的体内活性。本领域技术人员已知，所述的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物(其中混合物中的每个寡聚体具有相同数量的聚乙二醇亚基)的数均分子量和多分散的混合物的数均分子量可以通过不同的方法测定，这些方法包括不但不限于体积排阻色谱法，例如H.R.Allcock & F.W.Lampe，CONTEMPORARY POLYMER CHEMISTRY 394-402(第二版，1991)所述的凝胶渗透色谱法。
作为另一个实施例，所述的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物(其中混合物中的每个寡聚体具有相同数量的聚乙二醇亚基)优选其体外活性大于具有与所述的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物(其中混合物中的每个寡聚体具有相同数量的聚乙二醇亚基)相同的数均分子量的多分散的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物的体外活性。本领域技术人员已知，所述的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物(其中混合物中的每个寡聚体具有相同数量的聚乙二醇亚基)的数均分子量和多分散的混合物的数均分子量可以通过不同的方法测定，这些方法包括不但不限于体积排阻色谱法。
本领域技术人员已知，可以通过不同的方法测定特定的混合物的体外活性。优选使用从Molecular Devices Corporation of Sunnyvale，California商购的Cytosensort微生理机能测定仪测定体外活性。所述微生理机能测定仪监测对被加到在Transwell中培养的细胞的药物作出反应而发生的细胞外酸化速率的细微变化。这种反应与研究的分子的活性成比例。
作为另一个实例，同具有与生长激素药物寡聚体偶联物的混合物(其中混合物中的每个偶联物具有相同数量的聚乙二醇亚基)相同数均分子量的多分散的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物对胰凝乳蛋白酶的降解的抵抗力相比，根据本发明的其它实施方案的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物(其中混合物中的每个寡聚体具有相同数量的聚乙二醇亚基)对胰凝乳蛋白酶的降解的抵抗力增大。
本领域技术人员已知，所述的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物(其中混合物中的每个寡聚体具有相同数量的聚乙二醇亚基)的数均分子量和多分散的混合物的数均分子量可以通过不同的方法测定，这些方法包括不但不限于体积排阻色谱法。
作为另一个实例，根据本发明的其它实施方案的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物(其中混合物中的每个偶联物具有相同数量的聚乙二醇亚基)的受试者间的差异性小于具有与生长激素药物寡聚体偶联物的混合物(其中混合物中的每个偶联物具有相同数量的聚乙二醇亚基)相同数均分子量的多分散的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物的受试者间的差异性。本领域技术人员已知，所述的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物(其中混合物中的每个寡聚体具有相同数量的聚乙二醇亚基)的数均分子量和多分散的混合物的数均分子量可以通过不同的方法测定，这些方法包括不但不限于体积排阻色谱法。可以通过本领域技术人员已知的不同的方法测定受试者间的差异性。优选如下计算受试者间的差异性。测定每名受试者的剂量反应曲线下的面积(AUC)(即剂量反应曲线和基线值之间的面积)。所有受试者的平均AUC通过计算每名受试者的AUC并将此总和除去受试者的数量来确定。然后对每名受试者测定受试者的AUC和平均AUC之间的差异的绝对值。然后计算所得的差异的绝对值的总和得到代表受试者间的差异性的值。较低的值代表较低的受试者间的差异性，而较高的值代表较高的受试者间的差异性。
根据本发明的实施方案的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物(其中混合物中的每个寡聚体具有相同数量的聚乙二醇亚基)优选具有二种或更多种以上所述的改善性能。更优选，根据本发明的实施方案的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物(其中混合物中的每个寡聚体具有相同数量的聚乙二醇亚基)具有三个或更多个上述的改善性能。最优选，根据本发明的实施方案的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物(其中混合物中的每个寡聚体具有相同数量的聚乙二醇亚基)具有所有上述的的改善性能。
根据本发明的其它实施方案得到一种偶联物的混合物，其中每个偶联物具有相同的分子量并具有下式
生长激素药物
其中：
其中：
B为键合部分；
L为接头部分；
G、G′和G″为独立选择的间隔部分；
R为亲脂部分而R′为聚亚烷基二醇部分，或者R′为亲脂部分而R为聚亚烷基二醇部分；
T为末端部分；
h、i、j、k、m和n独立地为0或1，
附带条件是当R为聚亚烷基二醇部分时，m为1；当R′为聚亚烷基二醇部分时，n为1；和
p为1至生长激素药物上亲核残基数的整数。
所述的生长激素药物优选为人生长激素。但是，应该理解所述的生长激素药物可以选自本领域技术人员已知的不同的生长激素药物，例如它包括但不限于生长激素肽、生长激素肽类似物、生长激素肽片断和生长激素肽片断类似物。生长激素肽包括但不限于生长激素，人(hGH)；生长激素，猪；生长激素，牛；生长激素，鸡；生长激素，大鼠；生长激素，小鼠；生长激素，绵羊；生长激素释放因子，人；生长激素pro-释放因子，人；生长激素释放因子，小鼠；生长激素释放因子，绵羊；生长激素释放因子，大鼠；生长激素释放因子，牛；生长激素释放因子，猪；和生长激素释放因子，鸡。可以如上述通过取代生长激素肽中的一个或多个氨基酸而得到生长激素肽类似物。生长激素肽片断包括但不限于生长激素1-43，人；生长激素6-13；生长激素释放因子1-37，人；生长激素释放因子1-40，人；生长激素释放因子1-40，酰胺，人；生长激素释放因子30-44，酰胺，人；生长激素释放因子1-29，酰胺，大鼠；海沙瑞林(生长激素释放六肽)；和生长激素释放因子1-29，酰胺，人。生长激素肽片断类似物包括但不限于[D-Ala2]-生长激素释放因子1-29，酰胺，人；[N-Ac-Tyr’，D-Arg2]-生长激素释放因子1-29，酰胺；[His’，Nle27]-生长激素释放因子1-32，酰胺；生长激素释放肽-6([His’，Lys6]-GHRP)；和[D-Lys3]-GHRP-6。
根据本发明的这些实施方案，R或R′为聚亚烷基部分。所述的聚亚烷基二醇部分优选具有至少2、3或4个聚亚烷基二醇亚基。更优选所述的聚亚烷基二醇部分具有至少5或6个聚亚烷基二醇亚基。最优选所述的寡聚体的聚亚烷基二醇部具有至少7个聚亚烷基二醇亚基。所述的寡聚体的聚亚烷基二醇部分优选为低级烷基聚亚烷基二醇部分如聚乙二醇部分、聚丙二醇部分或聚丁二醇部分。所述的聚亚烷基二醇部分更优选为具有均一的结构的聚丙二醇部分。具有均一的结构的聚丙二醇部分的实例如下：
Figure A0281530100591
这种均一的聚丙二醇结构可以描述为仅具有一个与聚丙二醇链中的每个氧原子相邻的甲基取代的碳原子。这种均一的聚丙二醇部分可以表现出亲脂和亲水特征，因而可以用于在不使用亲脂聚合物部分的情况下提供两亲型生长激素药物-寡聚体偶联物(即m+n之和为1)。而且，聚丙二醇部分的仲醇部分与生长激素药物的偶合可以得到对酶，例如在肠中发现的胰岛素和胰凝乳蛋白酶的降解的抵抗力提高的生长激素药物(例如人生长激素)。
根据本发明的实施方案的均一的聚丙二醇优选如图11-13合成，现在将对其进行详述。如图11所示，1，2-丙二醇53与伯醇封端剂反应得到仲醇延长单体54。所述伯醇封端剂可以是本领域技术人员理的不同的伯醇封端剂(包括但不限于甲硅烷基氯化合物如叔丁基联苯甲硅烷基氯和叔丁基二甲基甲硅烷基氯)和酯化试剂如Ac2O。优选所述伯醇封端剂为基本上不与仲醇反应的伯醇封端剂，例如叔丁基联苯甲硅烷基氯或叔丁基二甲基甲硅烷基氯。仲醇延长单体(54)可以与甲基磺酰氯(MeSO2Cl)反应得到伯醇延长单体甲磺酸酯55。
可选择地，仲醇延长单体54可以与仲醇封端剂反应得到化合物56。所述仲醇封端剂可以是本领域技术人员已知的不同的仲醇封端剂，包括但不限于苄基氯。化合物56可以与B1解封剂反应除去封端部分B，并得到伯醇延长单体57。所述B1解封剂可以选自本领域技术人员已知的不同的解封剂。当通过形成酯将伯醇封端时，B1解封剂为脱酯剂，例如碱(例如碳酸钾)。当使用甲硅烷基氯将伯醇封端时，B1解封剂优选为四丁基氟化铵(TBAF)。伯醇延长单体57可以与甲基磺酰氯反应得到仲醇延长单体甲磺酸酯58。
可以如下将伯醇延长单体54和仲醇延长单体57封端。仲醇延长单体54可以与封端剂反应得到化合物59。所述封端剂可以是本领域技术人员已知的不同的封端剂，包括但不限于烷基卤如氯甲烷。化合物59可以与上述的B1解封剂反应得到伯醇封端单体60。
伯醇封端单体60可以与甲基磺酰氯反应得到仲醇封端单体甲磺酸酯61。伯醇延长单体57可以与封端剂反应得到化合物62。封端剂可以是如上述的不同的封端剂。化合物62可以与B2解封剂反应以除去封端部分B2并得到仲醇封端单体63。B2解封剂可以是本领域技术人员已知的不同的解封剂，包括但不限于钯/活性碳催化剂存在下的H2。仲醇封端单体可以与甲基磺酰氯反应得到伯醇封端单体甲磺酸酯64。虽然图11所示的实施方案表示封端单体的合成，但应理解可以进行类似的反应得到封端聚合物。
一般地，链延长可以通过伯醇延长单体或聚合物如伯醇延长单体57与伯醇延长单体或聚合物甲磺酸酯如伯醇延长单体甲磺酸酯55反应而进行，以得到不同的均一的聚丙烯链；或者通过仲醇延长单体或聚合物如仲醇延长单体54与仲醇延长单体或聚合物甲磺酸酯如仲醇延长单体甲磺酸酯58反应而进行。
例如，在图13中，伯醇延长单体甲磺酸酯55与伯醇延长单体57得到二聚物化合物65。可选择地，仲醇延长单体甲磺酸酯58可以与仲醇延长单体54反应得到二聚物化合物65。二聚物化合物65上的B1封端部分可以使用上述的B1解封剂除去以得到伯醇延长二聚物66。伯醇延长二聚物66可以与甲基磺酰氯反应得到仲醇延长二聚物甲磺酸酯67。可选择地，二聚物化合物65上的B2封端部分可以使用上述的B2解封剂除去以得到仲醇延长二聚物69。仲醇延长二聚物69可以与甲基磺酰氯反应得到伯醇延长二聚物甲磺酸酯70。
本领域技术人员已知，链延长过程可以重复进行以得到不同的其它链长度。例如如图13所示，伯醇延长二聚物66可以与伯醇延长二聚物甲磺酸酯70反应得到四聚物化合物72。如图13进一步所示，普通链延长反应路线包括伯醇延长单体或聚合物73与伯醇延长单体或聚合物甲磺酸酯74反应得到均一的聚丙烯聚合物75。m和n的值的范围各为0-1000，或者更优选m和n各为0-50。虽然图13所示的实施方案表示伯醇延长单体和/或聚合物与伯醇延长单体和/或聚合物甲磺酸酯反应，应该理解类似的反应可以使用仲醇延长单体和/或聚合物和仲醇延长单体和/或聚合物甲磺酸酯完成。
伯醇延长单体或聚合物的末端或伯醇延长单体或聚合物甲磺酸酯的末端可以分别与伯醇封端单体或聚合物甲磺酸酯或伯醇封端单体或聚合物反应得到封端的均一的聚丙烯链。例如，如图12所示，伯醇延长二聚物甲磺酸酯70与伯醇封端单体60反应得到封端的(capped/blocked)伯醇延长三聚物71。本领域技术人员已知，B1封端部分可以除去，而所得的封端的伯醇延长三聚物可以与伯醇延长单体或聚合物甲磺酸酯反应以延长封端的三聚物71的链。
仲醇延长单体或聚合物的末端或仲醇延长单体或聚合物的末端甲磺酸酯可以分别与仲醇封端单体或聚合物甲磺酸酯或仲醇封端单体或聚合物反应得到封端的均一的聚丙烯链。例如，如图12所示，仲醇延长二聚物甲磺酸酯67与仲醇封端单体63反应得到封端的(capped/blocked)伯醇延长三聚物68。B2封端部分可以如上述除去，而所得的封端的仲醇延长三聚物可以与仲醇延长链节甲磺酸酯反应以延封端的三聚物68的链。虽然图12所示的合成表示二聚物与封端单体反应得到三聚物，应该理解封端过程可以在均一的聚丙二醇部分的合成的任何点上进行，或者可选择地，可以得到不被封端的均一的聚丙二醇部分。虽然图12所示的实施方案表示通过用封端单体的合成而进行的聚丁烯寡聚体的封端，应该理解本发明的聚丁烯寡聚体可以使用如以上图11所述的封端剂直接封端(即不加入封端单体)。
根据本发明的实施方案的均一的聚丙二醇部分可以通过本领域技术人员已知的不同的方法与生长激素药物，亲脂部分如羧酸和/或不同的其它部分偶合，所述方法包括但不限于这里关于聚乙二醇部分所述的方法。
根据本发明的这些实施方案，R或R′为本领域技术人员已知的亲脂部分。所述亲脂部分优选为饱和或不饱和、直链或支链烷基部分或饱和或不饱和、直链或支链脂肪酸部分。当所述亲脂部分为烷基部分时，它优选为直链、饱和或不饱和的具有1-28个碳原子的烷基部分。更优选，所述烷基部分具有2-12个碳原子。当亲脂部分为脂肪酸部分时，它优选为天然的直链、饱和或不饱、具有2-18个碳原子的脂肪酸部分。更优选，所述脂肪酸部分具有3-14个碳原子。最优选所述脂肪酸部分具有至少4、5或6个碳原子。
根据本发明的这些实施方案，间隔部分G、G′和G″是本领域技术人员已知的间隔部分。间隔部分优选选自糖、胆固醇和甘油部分。优选这些实施方案的寡聚体不包括间隔部分(即i、j和k优选为0)。
根据本发明的这些实施方案，接头部分L可以用于将所述的寡聚体与本领域技术人员已知的生长激素药物偶合。接头部分优选选自烷基和脂肪酸。
根据本发明的这些实施方案，所述的末端部分优选为烷基或烷氧基部分，更优选为低级烷基或低级烷氧基部分。最优选所述末端部分为甲基或甲氧基。虽然所述的末端部分优选为烷基或烷氧基部分，但应该理解所述的末端部分可以是本领域技术人员已知的不同的部分，包括但不限于糖、胆固醇、醇和脂肪酸。
根据本发明的这些实施方案，由式A的结构的方括号部分表示的寡聚体与生长激素药物共价偶合。在某些实施方案中，利用可水解的键(例如酯或碳酸酯键)将生长激素药物与寡聚体偶合。可水解的偶合可以得到用作前药的生长激素药物-寡聚体偶联物。在某些情况下，例如在其中的生长激素药物-寡聚体偶联物不具有活性(即所述偶联物缺乏通过生长激素药物的主要作用机理影响身体的能力)的情况下，可水解的偶合可以提供延时释放或控释效果，在一个或多个寡聚体从它们各自的生长激素药物-寡聚体偶联物上裂解得到活性药物时在确定的时间内施用生长激素药物。在其它实施方案中，利用不可水解的键(例如氨基甲酸酯、酰胺或醚键)将生长激素药物与寡聚体偶合。当期望生长激素药物-寡聚体偶联物在血流中进行长期，优选至少2小时的循环时，可以优选使用不可水解的键。当寡聚体与生长激素药物共价偶合时，所述寡聚体还包含一个或多个用于将寡聚体与本领域技术人员已知的生长激素药物共价偶合的键合部分。键合部分优选选自共价键、酯部分、碳酸酯部分、氨基甲酸酯部分、酰胺部分和仲胺部分。
变量p为1至生长激素药物上亲核残基数的整数。当p大于1小时，多于一个寡聚体(即多个寡聚体)与药物偶合。根据本发明的这些实施方案，所述的多数寡聚体相同。
所述寡聚体可以在药物的不同的亲核残基处与生长激素药物偶合，所述亲核残基包括但不限于亲核羟基官能团和/或氨基官能团。例如，亲核羟基官能团可以见于丝氨酸和/或酪氨酸残基，而亲核氨基官能团可以见于组氨酸和/或赖氨酸残基和/或多肽的一个或多个N-末端。当寡聚体与一个或多个生长激素多肽的N-末端偶合时，所述的偶合优选形成仲胺。例如当所述的生长激素药物为人生长激素时，所述的寡聚体可以与Phe1、Lys38、Lys41、Lys70、Lys115、Lys140、Lys145、Lys158、Lys168、和/或Lys172的氨基官能团偶合。
生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物(其中混合物中的每个偶联物具有相同的分子量并具有式A的结构)可以由不同的方法合成。例如通过以下方法合成羧酸和聚乙二醇组成的寡聚体的混合物：使羧酸的混合物与聚乙二醇的混合物在足以得到寡聚体的混合物的条件下接触。然后将所述的混合物的寡聚体活化，从而使它们能够与生长激素药物反应得到生长激素药物-寡聚体偶联物。
用于得到其中的各寡聚体具有相同的分子量并具有式A的寡聚体的结构的活化的寡聚体的混合物的合成路线的一个实施方案如图3所示，并如以下的实施例11-18所述。用于得到其中的各寡聚体具有相同的分子量并具有式A的寡聚体的结构的活化的寡聚体的混合物如图4所示，并如以下的实施例19-24所述。用于得到其中的各寡聚体具有相同的分子量并具有式A的寡聚体的结构的活化的寡聚体的混合物的合成路线的另一个实施方案如图5所示，并如以下实施例25-29所述。用于得到其中的各寡聚体具有相同的分子量并具有式A的寡聚体的结构的活化的寡聚体的混合物的合成路线的另一个实施方案如图6所示，并如以下实施例30-31所述。用于得到其中的各寡聚体具有相同的分子量并具有式A的寡聚体的结构的活化的寡聚体的混合物的合成路线的另一个实施方案如图7所示，并如以下实施例32-37所述。用于得到其中的各寡聚体具有相同的分子量并具有式A的寡聚体的结构的活化的寡聚体的混合物的合成路线的另一个实施方案如图8所示，并如以下实施例38所述。用于得到其中的各寡聚体具有相同的分子量并具有式A的寡聚体的结构的活化的寡聚体的混合物的合成路线的另一个实施方案如图9所示，并如以下实施例39所述。用于得到其中的各寡聚体具有相同的分子量并具有式A的寡聚体的结构的活化的寡聚体的混合物的合成路线的另一个实施方案如图10所示，并如以下实施例40所述。
使其中的各寡聚体具有相同的分子量并具有式A的寡聚体的结构的活化的寡聚体的混合物与其中的每个药物具有相同的分子量的生长激素药物的混合物在足以得到生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物的条件下反应。合成实施例如以下的实施例40-42所述。本领域技术人员已知，可以控制反应条件(例如所选择的摩尔比、溶剂混合物和/或pH)以使由其中的各寡聚体具有相同的分子量并具有式A的寡聚体的结构的活化的寡聚体的混合物与生长激素的混合物反应得到的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物反应得到的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物是其中的每个偶联物具有相同的分子量并具有式A的结构的偶联物的混合物。例如，可以通过将反应溶液的pH保持在赖氨酸的pKa以下而抑制赖氨酸的氨基官能团处的偶联。可选择地，可以利用HPLC分离(separated和isolated)所述的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物得到生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物，例如一、二或三偶联物，其中混合物中的每个偶联物具有相同的分子量并具有式A的结构。可以利用本领域技术人员已知的不同技术测定和/或检验特定的分离的偶联物的偶联程度(例如所述分离的分子为一、二或三偶联物)，所述技术包括但不限于质谱。可以利用本领域技术人员已知的不同的技术测定和/或检验特定的偶联物结构(例如所述寡聚体位于人生长激素一偶联物的Phe1、Lys38、Lys41、Lys70、Lys115、Lys140、Lys145、Lys158、Lys168或Lys172)，这些技术包括但不限于序列分析、肽图分析、选择性酶切和/或内肽酶切割。
本领域技术人员已知，生长激素药物上的一个或多个反应部位可以通过生长激素药物与适宜的封端剂如N-叔丁氧基羰基(t-BOC)或N-(9-芴基甲氧基羰基)(N-FMOC)反应而封端。例如可以在所述的生长激素药物为多肽并期望形成具有在肽的一个或多个N-末端的寡聚体的不饱和的偶联物(即并非所有的亲核残基发生偶联的偶联物)时，优选这种方法。在这种封端之后，封端的生长激素药物的混合物可以与其中的每个寡聚体具有相同的分子量并具有式A的寡聚体结构的活化的寡聚体的混合物反应得到具有与一个或多个亲核残基偶合的寡聚体和具有与亲核残基偶合的封端部分的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物。本领域技术人员已知，在偶联反应之后，可以将生长激素药物-寡聚体偶联物解封。如果需要的话，随后可以如上述分离生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物得到生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物，其中所述混合物中的每个偶联物具有相同的分子量并具有式A的结构。可选择地，所述的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物可以是在解封之前分离。
根据本发明的实施方案，其中每个偶联物具有相同的分子量并具有式A的结构的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物优选具有比常规的混合物改善的性能。例如，其中的每个偶联物具有相同的分子量并具有式A的结构的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物优选其体内活性大于具有与其中的每个偶联物具有相同的分子量并具有式A的结构的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物相同的数均分子量的多分散的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物的体内活性。本领域技术人员已知，其中的每个偶联物具有相同的分子量并具有式A的结构的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物的数均分子量和多分散的混合物的数均分子量可以通过不同的方法测定，这些方法包括不但不限于体积排阻色谱法如H.R.Allcock & F.W.Lampe，CONTEMPORARYPOLYMER CHEMISTRY 394-402(第二版，1991)所述的凝胶渗透色谱法。
作为另一个实例，其中的每个偶联物具有相同的分子量并具有式A的结构的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物优选其体外活性大于具有与其中的每个偶联物具有相同的分子量并具有式A的结构的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物相同的数均分子量的多分散的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物的体外活性。本领域技术人员已知，其中的每个偶联物具有相同的分子量并具有式A的结构的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物的数均分子量和多分散的混合物的数均分子量可以通过不同的方法测定，这些方法包括不但不限于体积排阻色谱法。
本领域技术人员已知，特定的混合物的体外活性可以由不同的方法测定。优选使用可从Molecular Devices Corporation of Sunnyvale，California商购得到的Cytosensort微生理机能测定仪测定体外活性。所述微生理机能测定仪监测对被加到在Transwell中培养的细胞的药物作出反应而发生的细胞外酸化速率的细微变化。这种反应与研究的分子的活性成比例。
作为另一个实例，在同具有与其中的每个偶联物具有相同的分子量并具有式A的结构的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物相同的数均分子量的多分散的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物对胰凝乳蛋白酶降解的抵抗力相比，其中的每个偶联物具有相同的分子量并具有式A的结构的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物优选对胰凝乳蛋白酶降解的抵抗力增大。本领域技术人员已知，其中的每个偶联物具有相同的分子量并具有式A的结构的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物的数均分子量和多分散的混合物的数均分子量可以通过不同的方法测定，这些方法包括不但不限于体积排阻色谱法。
作为另一个实例，其中的每个偶联物具有相同的分子量并具有式A的结构的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物优选其受试者间的差异性小于具有与其中的每个偶联物具有相同的分子量并具有式A的结构的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物相同的数均分子量的多分散的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物的受试者间的差异性。本领域技术人员已知，其中的每个偶联物具有相同的分子量并具有式A的结构的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物的数均分子量和多分散的混合物的数均分子量可以通过不同的方法测定，这些方法包括不但不限于体积排阻色谱法。可以通过本领域技术人员已知的不同方法测定受试者间的差异性。所述受试者间的差异性优选如下测定。测定每名受试者的剂量反应曲线下的面积(AUC)(即剂量反应曲线和基线值之间的面积)。通过计算每名受试者的AUC的总数并用该总数除以受试者数量而确定所有受试者的平均AUC。然后对每名受试者测定受试者的AUC与平均AUC之间的差别的绝对值。随后计算所得的差异的绝对值的总数得到代表受试者间的差异性的值。较低的值代表较低的受试者间的差异性，而较高的值代表较大的受试者间的差异性。
根据本发明的实施方案，其中每个偶联物具有相同的分子量并具有式A的结构的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物优选具有二种或更多种上述的改善性能。更优选，根据本发明的实施方案，其中每个偶联物具有相同的分子量并具有式A的结构的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物具有三种或更多种上述的改善的性能。最优选，根据本发明的实施方案，其中每个偶联物具有相同的分子量并具有式A的结构的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物具有上述的改善的性能。
本发明还提供包含根据本发明的实施方案的偶联物的混合物的药物组合物。上述的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物可以根据已知的技术制备用于在药学载体中给药。例如参见Remington，The Scienceand Practiceof Pharmacy(第9版，1995)。在根据本发明的实施方案的药物组合物的制备中，一般将生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物与药学上可接受的载体混合。当然所述的载体在与药物组合物中的任何其它成分相容的含义上是可接受的，并不应对患者有伤害。所述的载体可以是固体或液体，或者同为固体和液体，并优选与所述的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物制成单元剂型，例如可能包含大约0.01或0.5wt％至大约95％或99wt％的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物的片剂。所述的药物组合物可以通过任何已知的药学技术制备，这些药学技术包括但不限于混合组分，所述组分任选包括一种或多种辅助成分。
根据本发明的实施方案的药物组合物包括适用于以下的药物组合物：口、直肠、局部、吸入(例如通过气溶胶)、颊(例如舌下)、阴道、肠胃外(例如皮下、肌内、真皮内、关节内、胸膜内、腹膜内、大脑内、动脉内或静脉内)、局部(即皮肤和粘膜表面，包括气道表面)和透皮给药，但在任何既定的情况下的最适宜的途径取决于所治疗的症状的性质与严重程度和所使用的特定的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物的性质。
适于口服的药物组合物可以以下形式存在：独立的单元，如胶囊、扁囊剂、锭剂或片剂，各包含预定量的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物；散剂或颗粒剂；在水或非水液体中的溶液或悬浮液；或者水包油型或油包水型乳液。这种制剂可以通过任何适宜的药学方法制备，所述方法包括将生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物和适宜的载体(可以包含一个或多个上述的辅助成分)缔合的步骤。一般地，根据本发明的实施方案的药物组合物通过以下方法制备：均一和紧密地混合生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物和液体或细分的固体载体，或者液体和细分的固体，然后如果需要的话将所得的混合物成形。例如，可以通过以下方法制备片剂：将包含生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物和任选的一个或多个辅助成分的粉末或颗粒压制或模制。压制片可以通过在适宜的机器中将混合物压制成任选混有粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂和/或表面活性/分散剂的自由流动形式，如散剂或颗粒。模制片可以通过在适宜的机器中模制用惰性液体粘合剂湿润的粉末化合物。
适于颊(舌下)给药的药物组合物包括含有在调味碱，通常为蔗糖和阿拉伯胶或黄芪胶中的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物的糖锭；和包含在惰性碱如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶中的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物的锭剂。
适于肠胃外给药的根据本发明的实施方案的药物组合物包含生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物的无菌水和非水注射液，所述制剂优选与目标受者的血液等渗。这些制剂可以包含抗氧剂、缓冲剂、抑菌剂和使组合物与目标受者的血液等渗的溶质。水和非水无菌悬浮液可以包含悬浮剂和增稠剂。所述组合物可以存在于单元剂量和多剂量容器，例如密闭的安瓿和小瓶，并可以在仅要求使用前立即加入无菌液体载体如盐水和注射用水的冷冻干燥的(冻干的)条件下储存。可以由前述种类的无菌粉末、颗粒和片剂制备临时注射溶液和悬浮液。例如，可以得到在密闭容器中的包含生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物的可注射、稳定无菌组合物的单元剂型。本发明提供能够与适宜的药学上可接受的载体重组形成适于注射至受者的液体组合物的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物的冻干物形式。所述的单元剂型一般包含大约10mg至大约10克的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物。
当所述的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物基本上不溶于水时，可以使用足量的生理学上可接受的乳化剂乳化在含水载体中的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物。一种这样的有用的乳化剂为磷脂酰胆碱。
适于直肠给药的药物组合物优选作为单元剂量栓剂存在。这些组合物可以通过以下方法制备：将生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物与一种或多种常规固体载体如可可油混合，然后将所得的混合物成型。
适于皮肤局部应用的药物组合物优选为药膏、乳膏、洗液、糊剂、凝胶、喷雾剂、气溶胶或油的形式。可以使用的载体包括凡士林油、羊毛脂、聚乙二醇、醇、透皮增强剂和其二种或更多种的组合。
适于直肠给药的药物组合物可以作为适于与受者的表皮保持长期紧密接触的独立的贴剂存在。适于透皮给药的组合物还可以通过离子电渗法(例如参见Pharmaceutical Research 3(6)：318(1986))递送，且一般采用任选的生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物的缓冲水溶液的形式。适宜的制剂包含柠檬酸盐或二\三缓冲液(pH 6)或乙醇/水，并包含0.1-0.2M活性成分。
本发明还提供通过施用有效量的这种药物组合物而治疗需要这种治疗的受试者的生长激素缺乏的方法。在本发明的范围内使用的任何生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物的有效量在一定程度上将随不同的混合物、患者而变，并取决于因素如患者的年龄和症状与递送途径。可以根据本领域技术人员已知的常规药代动力学方法确定这种剂量。作为一种一般性的建议，大约0.1至大约50mg/kg的剂量具有疗效，其中所有的重量基于生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物的重量计算。较高水平时的毒性考虑可能将静脉内剂量限定到较低的水平，如至多大约10mg/kg，其中所述的重量基于活性碱的重量计算。大约10mg/kg至大约50mg/kg的剂量可以用于口服。一般地，大约0.5mg/kg至5mg/kg的剂量可以用于肌内注射。给药频率一般为每天一、二或三次或控制症状所需的给药频率。可选择地，所述的药物-寡聚体偶联物可以通过连续地灌输而施用。治疗的持续时间取决于所治疗的生长激素缺乏的类型。
加速动物的生长速率的方法包括给动物施用有效量的根据上述的不同的实施方案的偶联物的混合物。当然，生长激素的有效量取决于进行给药的动物，并可以由本领域技术人员来确定。
本发明还提供根据本发明的实施方案的偶联物的混合物的合成方法。虽然以下的合成路线实施方案涉及基本上单分散的混合物的合成，但可以使用类似的合成路线合成根据本发明的实施方案的其它生长激素药物-寡聚体偶联物的混合物。
如反应1所示提供基本上单分散的包含聚乙二醇部分的聚合物的混合物：
    1
   (I)                       (II)                (III)
R1为H或亲脂部分。R1优选为H、烷基、芳基烷基、芳香部分、脂肪酸部分、脂肪酸部分的酯、胆甾醇基或金刚烷基。R1更优选为H、低级烷基或芳香部分。R1为最优选H、甲基或苄基。
在式I中，n为1-25。优选n为1-6。
X+为阳离子。优选X+为化合物如强碱中的任何阳离子，能够将PEG上的羟基部分离子。阳离子的实例包括但不限于钠离子、钾离子、锂离子、铯离子和铊离子。
R2为H或亲脂部分。R2优选为直链或支链烷基、芳基烷基、芳香部分、脂肪酸部分或脂肪酸部分的酯。R2更优选为低级烷基、苄基、具有1-24个碳原子的脂肪酸部分或具有1-24个碳原子的脂肪酸部分的酯。R2最优选为甲基、具有1-18个碳原子的脂肪酸部分或具有1-18个碳原子的脂肪酸部分的乙酯。
在式II中，m为1-25。优选m为1-6。
M为甲磺酸酯部分(即CH3S(O2)-)。
如反应1所示，具有式I的结构的化合物的混合物与具有式II的结构的化合物的混合物反应得到包含聚乙二醇部分并具有式III的结构的混合物。所述的具有式I的结构的化合物的混合物为基本上单分散的混合物。优选式I的化合物的混合物中至少大约96％、97％、98％或99％的化合物具有相同的分子量，更优选式I的化合物的混合物为单分散的混合物。所述的式II的化合物的混合物为基本上单分散的混合物。优选式II的化合物的混合物中至少大约96％、97％、98％或99％的化合物具有相同的分子量，更优选式II的化合物的混合物为单分散的混合物。所述的式III的化合物的混合物为基本上单分散的混合物。优选式III的化合物的混合物中至少大约96％、97％、98％或99％的化合物具有相同的分子量。更优选，式III的化合物的混合物为单分散的混合物。
反应1优选在大约0℃至40℃下进行，更优选在大约15℃至大约35℃下进行，最优选在室温(大约25℃)下进行。
本领域技术人员已知，反应1可以进行不同的时间。反应1优选进行大约0.25、0.5或0.75小时至大约2、4或8小时。
反应1优选在质子惰性溶剂中进行，例如所述质子惰性溶剂包括但不限于N，N-二甲基乙酰胺(DMA)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲亚砜(DMSO)、六甲基磷三酰胺、四氢呋喃(THF)、二噁烷、二乙醚、甲基叔丁基醚(MTBE)、甲苯、苯、己烷、戊烷、N-甲基吡咯烷酮、四氢萘、十氢萘、1，2-二氯苯、1，3-二甲基-2-咪唑烷酮或它们的混合物。更优选所述为DMF、DMA或甲苯。
式I的化合物与式II的化合物的摩尔比优选大于大约1∶1。更优选所述的摩尔比为至少大约2∶1。通过提供过量的式I的化合物可以确保基本上所有式II的化合物发生反应，从而有助于回收下述的式III的化合物。
式I的化合物优选如反应2所示制备：
                      能将式IV的PEG
    2
                      子化的化合物
   (IV)                                (I)
R1和X+如上述，且所述的式IV的化合物的混合物基本上是单分散的；优选式IV的化合物的混合物中至少大约96％、97％、98％或99％的化合物具有相同的分子量；更优选式IV的化合物的混合物为单分散的混合物。
本领域技术人员已知能够将式IV的化合物的PEG部分的羟基部分离子的不同的化合物。能够将羟基部分离子化的化合物优选为强碱。更优选能够将羟基离子化的化合物选自氢化钠、氢化钾、叔丁醇钠、叔丁醇钾、丁基锂(BuLi)和二异丙基胺锂。能够将羟基部分离子化的化合物更优选为氢化钠。
能够将式IV的化合物的PEG部分上的羟基部分离子化的化合物与式IV的化合物的摩尔比优选为至少大约1∶1，更优选为至少大约2∶1。确信通过提供过量的能够将羟基部分离子化的化合物，基本上所有的式IV的化合物发生反应得到式I的化合物。因此可以避免在式IV的化合物和式I的化合物在反应产物混合物中同时存在时可能发生的分离困难。
反应2优选在大约0℃至大约40℃下进行，更优选在大约0℃至大约35℃下进行，最优选在大约0℃至室温(大约25℃)下进行。
本领域技术人员已知反应2可以进行不同的时间。反应2优选进行大约0.25、0.5或0.75小时和大约2、4或8小时的时间。
反应2优选在质子惰性溶剂中完成，所述质子惰性溶剂包括但不限于N，N-二甲基乙酰胺(DMA)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲亚砜(DMSO)、六甲基磷三酰胺、四氢呋喃(THF)、二噁烷、二乙醚、甲基叔丁基醚(MTBE)、甲苯、苯、己烷、戊烷、N-甲基吡咯烷酮、二氯甲烷、氯仿、四氢萘、十氢萘、1，2-二氯苯、1，3-二甲基-2-咪唑烷酮或它们的混合物。更优选所述的溶剂为DMF、二氯甲烷或甲苯。
式II的化合物优选如反应3所示制备：
R2和Ms如上述，而式V的化合物作为基本上单分散的式V的化合物的混合物存在；优选式V的化合物的混合物中至少大约96％、97％、98％或99％的化合物具有相同的分子量；更优选式V的化合物的混合物为单分散的混合物。
Q为卤化物，优选氯化物或氟化物。
CH3S(O2)Q为甲基磺酰卤化物。所述甲基磺酰卤化物优选为甲基磺酰氯或甲烷磺酰基氟化物。更优选，所述的甲基磺酰卤化物为甲基磺酰氯。
甲基磺酰基卤化物与式V的化合物的摩尔比优选大于大约1∶1，更优选至少大约2∶1。确信通过提供过量的甲基磺酰基卤化物，基本上所有的式V的化合物发生反应得到式II的化合物。因此可以避免在式V的化合物和式II的化合物在反应产物混合物中同时存在时可能发生的分离困难。
反应3优选在大约0℃至大约40℃下进行，更优选在大约0℃至大约35℃下进行，最优选在大约0℃至室温(大约25℃)下进行。
本领域技术人员已知反应3可以进行不同的时间。反应2优选进行大约0.25、0.5或0.75小时和大约2、4或8小时的时间。
反应3优选在脂肪胺存在下完成，所述脂肪胺包括但不限于一甲基胺、二甲基胺、三甲基胺、一乙基胺、二乙基胺、三乙基胺、一异丙基胺、二异丙基胺、一正丁基胺、二正丁基胺、三正丁基胺、一环己基胺、二环己基胺或它们的混合物。更优选，所述脂肪胺为叔胺如三乙基胺。
本领域技术人员已知，不同的基本上单分散的式V的化合物的混合物可以商购得到。例如，当R2为H或甲基时，式V的化合物分别为PEG或mPEG化合物，并可以从Aldrich of Milwaukee，Wisconsin；Fluka of Switzerland和/或TC1 America of Portland，Oregon商购得到。
当R2为亲脂部分如高级烷基、脂肪酸、脂肪酸的酯、胆甾醇基或金刚烷基时，可以由本领域技术人员已知的不同方法得到式V的化合物。式V的化合物优选如下得到：
    4
 (VI)          (VII)             (VIII)
R3(OC2H4)m-OR2→H(OC2H4)m-OR2              5
 (VIII)             (V)
R2为亲脂部分，优选高级烷基、脂肪酸酯、胆甾醇基或金刚烷基，更优选脂肪酸的低级烷基酯，最优选具有1-18个碳原子的脂肪酸的乙酯。
R3为H、苄基、三苯甲基、四氢吡喃或本领域技术人员已知的其它醇保护基。
X2 +为以上关于X+所述的阳离子。
m的值如上述。
关于反应4，使式VI的化合物混合物与式VII的化合物的混合物在类似于关于反应1所述的条件下进行反应。式V
式VI的化合物的混合物为基本上单分散的混合物。优选式VI的化合物的混合物中至少大约96％、97％、98％或99％的化合物具有相同的分子量。更优选式VI的化合物的混合物为单分散的混合物。式VII的化合物的混合物为基本上单分散的混合物。优选式VII的化合物的混合物中至少大约96％、97％、98％或99％的化合物具有相同的分子量。更优选，式VII的化合物的混合物为单分散的混合物。
关于反应5，可以由本领域技术人员已知的不同方法将式VIII的化合物水解以将R3部分转化为醇。当R3为苄基或三苯甲基时，所述的水解优选利用H2在本领域技术人员已知的钯-碳催化剂存在下进行。当然当R3为H时，反应5没有必要。
式VI的化合物可以商购得到，或者如以上关于反应3所述得到。式VII的化合物可以如以上关于反应2所述得到。
基本上单分散的包含PEG部分并具有式III的结构的聚合物的混合物还可以与其它基本上单分散的包含PEG部分的聚合物反应以延长PEG链。例如可以使用以下路线：
Figure A0281530100741
  7
       (IX)             (X)                           (XI)
Ms、m和n如以上关于反应1所述；p与n和m类似，而X2 +与如以上关于反应1所述的X+类似。Q如以上关于反应3所述。R2如以上关于反应1所述，并优选为低级烷基。R1为H。反应6优选以类似于关于反应3所述的方式进行。反应7优选在类似于关于反应1所述的方式进行。优选式III的化合物的混合物中至少大约96％、97％、98％或99％的化合物具有相同的分子量，更优选式III的化合物的混合物为单分散的混合物。式X的化合物的混合物为基本上单分散的混合物。优选混合物中至少大约96％、97％、98％或99％的化合物具有相同的分子量，更优选式X的化合物的混合物为单分散的混合物。
根据本发明的实施方案的方法由图1所示的路线表示，现在将其进行详述。含有基本上单分散的聚乙二醇的寡聚体的合成起始于基本上单分散的聚乙二醇的一苄基醚(1)的制备。使过量的可商购得到的基本上单分散的聚乙二醇与苄基氯在如Coudert等人所述的氢氧化钠水溶液存在下反应(Synthetic Communications，16(1)：19-26(1986))。然后通过加入NaH制备1的钠盐，并使此钠盐与由羟基链烷酸(2)的酯合成的甲磺酸酯反应。通过催化氢化将甲磺酸酯的取代产物(3)脱苄基化以得到醇(4)。这种醇的甲磺酸酯(5)可以通过加入甲基磺氯制备，并用作与基本上单分散的聚乙二醇衍生物的一甲醚的钠盐进行的反应中的亲电子试剂，从而将寡聚体的聚乙二醇部分延长至目标长度，得到延长的酯(6)。可以在碱水溶液中将酯水解成酸(7)，并通过与碳化二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺反应转化成活化的酯(8)。虽然使用N-羟基琥珀酰亚胺将图1所示的寡聚体活化，但应该理解可以用其它不同的试剂活化本发明的寡聚体，包括但不限于活性氯甲酸苯基酯如氯甲酸对硝基苯基酯、氯甲酸苯基酯、氯甲酸3，4-苯基酯、二氯甲酸苯基酯和二氯甲酸3，4-苯基酯；tresylation和缩醛形成。
进一步参照图1，q为1-24。优选q为1-18，且q更优选为4-16。R4为能够经过水解得到羧酸的部分。R4优选为低级烷基，并更优选为乙基。变量n和m如以上关于反应1所述。
用于这里所述的方法的所有原料可以商购得到或可以由本技术中已知的方法使用可商购得到的原料制备。
现在参照以下的实施例对本发明进行详述。应该认识到这些实施例的目的在于例示本发明的方面，而不是对权利要求定义的范围进行限定。
                          实施例
                        实施例1-10
除非另外特指，实施例1-10的反应在氮气氛下使用磁搅拌完成。“加工”意指用有机溶剂萃取，用饱和NaCl溶液洗涤有机相，干燥(MgSO4)，并蒸发(旋转蒸发器)。用预涂布硅胶60 F-254的Merck玻璃板进行薄层色谱处理，并用碘液将斑点可视化。所有的质谱由Macromolecular Resources Colorado State University，CO测定，并以级数m/z(相对强度)报道。由Galbraith Laboratories，Inc.，Knoxville，TN进行元素分析和熔点测定。实施例1-10指图2所示的路线。
                          实施例1
         8-甲氧基-1-(甲基磺酰基)氧-3，6-二氧杂辛烷(9)
在冰浴上冷却在无水二氯甲烷(50mL)中的非多分散的三乙二醇一甲基醚分子(4.00mL，4.19g，25.5mmol)和三乙基胺(4.26mL，3.09g，30.6mmol)的溶液，并将其放置在氮气氛下。从添加漏斗滴加在无水二氯甲烷(20mL)中的甲基磺酰氯(2.37mL，3.51g，30.6mmol)的溶液。在完成氯化物加入后10分钟，从冰浴中移出反应混合物，并使其达到室温。将混合物再搅拌1小时，此时TLC(CHCl3和15％MeOH作为洗脱剂)表明未残留三乙二醇一甲基醚。
用另外75mL二氯甲烷稀释反应混合物，并用饱和NaHCO3、水和盐水连续洗涤。用Na2SO4干燥有机物，过滤并真空浓缩得到非多分散的化合物9的混合物，为一种橙清的油(5.31g，86％)。
                          实施例2
               乙二醇一甲基醚(10)(m＝4，5，6)
在N2气氛下往在无水DMF(25.7mL)中的非多分散的化合物11(35.7mmol)的搅拌溶液分部分加入在矿物油中的60％NaH的分散体，并将混合物于室温下搅拌1小时。往此盐12中一次性加入在无水DMF(4ml)中的非多分散的甲磺酸酯9(23.36)的溶液，并将混合物于室温下搅拌3.5小时。通过TLC(12％CH3OH-CHCl3)监测反应的进行。反应混合物用等量的1N HCl稀释，用乙酸乙酯(2×20ml)萃取并弃去。萃取水溶液并加工得到非多分散的聚合物10(82-84％产率)。
                          实施例3
3，6，9，12，15，18，21-七氧杂二十二醇(10)(m＝4)
油；Rf 0.46(甲醇∶氯仿＝3∶22)；MS m/z计算值C15H32O8340.21(M++1)，实测值341.2。
                          实施例4
3，6，9，12，15，18，21，24-八氧杂二十五醇(10)(m＝5)
油；Rf 0.43(甲醇∶氯仿＝6∶10)；MS m/z计算值C17H36O9384.24(M++1)，实测值385.3。
                          实施例5
3，6，9，12，15，18，21，24，27-九氧杂二十八醇(10)(m＝6)
油；Rf 0.42(甲醇∶氯仿＝6∶10)；MS m/z计算值C19H40O10428.26(M++1)，实测值429.3。
                          实施例6
20-甲氧基-1-(甲基磺酰基)氧-3，6，9，12，15，18-六氧杂二十烷(14)
由醇13(m＝4)和关于9所述的甲基磺酰氯以定量产率得到非多分散的化合物14，为一种油；Rf 0.4(乙酸乙酯∶乙腈＝1∶5)；MS m/z计算值C17H37O10 433.21(M++1)，实测值433.469。
                          实施例7
               乙二醇一甲基醚(15)(m＝3，4，5)
使用以上关于化合物10所述的方法由二醇制备非多分散的化合15。
                          实施例8
3，6，9，12，15，18，21，24，27，30-十氧杂二十一醇(15)(m＝3)油；Rf 0.41(甲醇∶氯仿＝6∶10)；MS m/z计算值C21H44O11472.29(M++1)，实测值472.29。
                          实施例9
3，6，9，12，15，18，21，24，27，30，33-十一氧杂四二十三烷醇(15)(m＝4)
油；Rf 0.41(甲醇∶氯仿＝6∶10)；MS m/z计算值C23H48O12516.31(M++1)，实测值516.31。
                          实施例10
3，6，9，12，15，18，21，24，27，30，33，36-十二氧杂七二十三烷醇(15)(m＝5)
油；Rf 0.41(甲醇∶氯仿＝6∶10)；MS m/z计算值C25H52O13560.67(M++1)，实测值560.67。
实施例11-18指图3所示的路线。
                          实施例11
                     六乙二醇一苄基醚(16)
将通过把3.99g(100mmol)NaOH溶于水而制备的氢氧化钠水溶液缓慢加到非多分散的六乙二醇(28.175g，25mL，100mmol)。加入苄基氯(3.9g，30.8mmol，3.54ml)，并将反应混合物搅拌在100℃下加热18小时。然后将反应混合物冷却，用盐水(250ml)稀释，并用二氯甲烷(200ml×2)萃取。用盐水将合并的有机层洗涤一次，用Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩到一种深褐色的油。通过快速色谱法(硅胶，梯度洗脱：乙酸乙酯至9/1乙酸乙酯/甲醇)纯化粗产物混合物得到8.099g(70％)非多分散的16，为一种黄色的油。
                          实施例12
                  6-甲基磺酰氧基己酸乙酯(17)
在冰浴中冷却在无水二氯甲烷(75ml)中的非多分散的6-羟基己酸乙酯(50.76mL，50.41g，227mmol)的溶液，并将其置于氮气氛下。加入三乙基胺(34.43mL，24.99g，247mmol)。由添加漏斗滴加在无水二氯甲烷(75ml)中的甲基磺酰氯(19.15mL，28.3g，247mmol)的溶液。将混合物搅拌3.5小时，并使其在冰浴熔化时缓慢地到达室温。用硅胶过滤混合物，连续地用水、饱和NaHCO3、水和盐水冼涤滤液。用Na2SO4干燥有机物，过滤并真空浓缩至一种浅黄色的油。最后通过快速色谱法(硅胶，1/1己烷/乙酸乙酯)纯化粗产物得到非多分散的产物(46.13g，85％)，为一种澄清的无色油。FAB MS：m/z239(M+H)，193(M-C2H5O)。
                          实施例13
6-12-[2-(2-12-[2-(2-苄氧基乙氧基)乙氧基]乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙
                     氧基}-己酸乙酯(18)
将氢化钠(3.225g或60％油悬浮液，80.6mmol)悬浮在80ml无水甲苯，放置在氮气氛下并在冰浴中冷却。将在80ml无水甲苯中的非多分散的醇16(27.3g，73.3mmol)的溶液加到NaH悬浮液。将混合物于0℃下搅拌30分钟，使其冷却至室温，并再搅拌5小时，在此期望混合物变为澄清的褐色溶液。将在80ml无水甲苯中的非多分散的甲磺酸酯17(19.21g，80.6mmol)加到NaH/醇混合物，并将合并的溶液于室温下搅拌3天。用50ml甲醇终止反应混合物的反应，用碱性氧化铝过滤。将滤液真空浓缩，并用快速色谱法(硅胶，梯度洗脱：3/1乙酸乙酯/己烷至乙酸乙酯)纯化得到非多分散的产物，为一种浅黄色油(16.52g，44％)。FAB MS：m/e 515(M+H)。
                          实施例14
6-{2-[2-(2-{2-[2-(2-羟基乙氧基)乙氧基]乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧
                     基}-己酸乙酯(19)
将非多分散的苄基醚18(1.03g，2.0mmol)溶于25ml乙醇。往此溶液加入270mg 10％Pd/C，将混合物置于氢气氛下并搅拌4小时，此时TLC表明原料完全消失。用C盐545过滤反应混合物以除去催化剂，并将滤液真空浓缩得到非多分散的标题化合物，为一种澄清的油(0.67g，79％)。FAB MS：m/e 425(M+H)，447(M+Na)。
                          实施例15
6-{2-[2-(2-{2-[2-(2-甲基磺酰基乙氧基)乙氧基]乙氧基}-乙氧基)-乙氧
                     基]-乙氧基}-己酸乙酯(20)
将非多分散的醇19(0.835g，1.97mmol)溶于3.5ml无水二氯甲烷并将其放置在氮气氛下。加入三乙基胺(0.301mL，0.219g，2.16mmol)，并在冰浴中冷冻混合物。2分钟后，加入甲烷磺酰氯(0.16mL，0.248g，2.16mmol)。将混合物于0℃下搅拌15分钟，然后在室温下搅拌2小时。用硅胶过滤反应混合物以除去三乙基氯化铵，并连续地用水、饱和NaHCO3、水和盐水洗涤滤液。用Na2SO4干燥有机物，过滤并真空浓缩。用柱色谱法(硅胶，9/1乙酸乙酯/甲醇)纯化残余物得到非多分散的化合物，为一种澄清的油(0.819g，83％)。FAB MS：m/e 503(M+H)。
                          实施例16
6-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-
                     乙氧基}-乙氧基)-己酸乙酯(21)
在N2气氛下将NaH(88mg 60％在油中悬浮液，2.2mmol)悬浮在无水甲苯(3ml)中，并冷却至0℃。加入已通过与甲苯共沸蒸馏而干燥的非多分散的二乙二醇一甲基醚(0.26mL，0.26g，2.2mmol)。将反应混合物缓慢加热至室温，并搅拌4小时，在此期间混浊的灰色悬浮液变为澄清的黄色，然后变成褐色。加入在2.5ml无水甲苯中的甲磺酸酯20(0.50g，1.0mmol)。
室温下搅拌过夜后，加入2ml甲醇终止反应，用硅胶过滤所得的溶液。将滤液真空浓缩，FAB MS：m/e 499(M+H)，521(M+Na)。再通过制备色谱法(硅胶，19/3氯仿/甲醇)进行纯化得到非多分散的产物，为一种澄清的黄色油(0.302g 57％)。FAB MS：m/z 527(M+H)，549(M+Na)。
                          实施例17
6-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-
                     乙氧基}-乙氧基)-己酸(22)
将非多分散的酯21(0.25g，0.46mmol)在0.71ml 1N NaOH中搅拌18小时。18小时后，将混合物真空浓缩以除去醇，并将残余物溶于另10ml水。用2N HCl将水溶液酸化至pH 2，并将产物萃取至二氯甲烷(30ml×2)。然后用盐水(25ml×2)洗涤合并的有机物，用Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩得到非多分散的标题化合物，为一种黄色的油(0.147g，62％)。FAB MS：m/z 499(M+H)，521(M+Na)。
                          实施例18
6-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-
         乙氧基}-乙氧基)-己酸2，5-二氧代-吡咯烷-1-基酯(23)
将非多分散的酸22(0.209g，0.42mmol)溶于4ml无水二氯甲烷，并在N2气氛下将其加到包含NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)(57.8mg，0.502mmol)和EDC(1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐)(98.0mg，0.502mmol)的无水烧瓶。将溶液于室温下搅拌过夜，用硅胶过滤以除去过量的试剂，并在EDC中形成脲。将滤液真空浓缩得到非多分散的产物，为一种深黄色油(O.235g，94％)。FAB MS：m/e 596(M+H)，618(M+Na)。
实施例19-24指图4所示的路线。
                          实施例19
             三乙二醇一甲基醚的甲磺酸酯(24)
往在冰浴中冷却至0℃的CH2Cl2(100mL)的溶液加入非多分散的三乙二醇一甲基醚(25g，0.15mol)。然后加入三乙基胺(29.5mL，0.22mol)，并将溶液在0℃下搅拌15分钟，随后滴加甲基磺酰氯(13.8mL，0.18mol，溶于20mLCH2Cl2)。将反应混合物于0℃下搅拌30分钟，将其加热至室温，然后搅拌2小时。用C盐(用CH2Cl2，～200mL洗涤)过滤粗反应混合物，然后用H2O(300mL)、5％NaHCO3(300mL)、H2O(300mL)、饱和NaCl(300mL)洗涤，用MgSO4干燥，并蒸发至干。然后将油于真空管中放置2小时以确保干燥，并得到非多分散的标题化合物，为一种黄色的油(29.15g，80％产率)。
                          实施例20
                  七乙二醇一甲基醚(25)
往在THF(1L)中的非多分散的四乙二醇(51.5g，0.27mol)的溶液加入叔丁醇钾(14.8g，0.13mol，少部分～30分钟)。然后将反应混合物搅拌1小时，随后滴加溶于THF(90mL)的24(29.15g，0.12mol)，并将反应混合物搅拌过夜。用C盐(用CH2Cl2，～200mL洗涤)过滤粗反应混合物并蒸发至干。然后将油溶于HCl(250mL，1N)，并用乙酸乙酯(250mL)洗涤以除去过量的24。可能需要附加的乙酸乙酯(125mL)洗涤以除去残余的24。重复地用CH2Cl2(125mL体积)洗涤含水相直至已从含水相中除去大部分的25。第一萃取物包含24、25和双偶合的副产物，并应该用HCl(125mL，1N)反萃取。合并有机层，并蒸发至干。然后将所得的油溶于CH2Cl2(100mL)，并重复地用H2O(50mL体积)洗涤直至除去25。合并含水馏分，总体积500mL，并加入NaCl直至溶液变混浊，然后用CH2Cl2(2×500mL)洗涤。合并有机层，用MgSO4干燥，并蒸发至干得到非多分散的标题化合物，为一种油(16.9g，41％产率)。期望重复纯化方法中的一个或多个步骤以确保高纯度。
                          实施例21
                       8-溴辛酸酯(26)
往在乙醇(100mL)中的8-溴辛酸(5.0g，22mmol)的溶液加入H2SO4(0.36mL，7.5mmol)，将反应物加热回流，并搅拌3小时。将粗反应混合物冷却至室温，并用H2O(100mL)、饱和NaHCO3(2×100mL)、H2O(100mL)、无水MgSO4洗涤，并蒸发至干得到一种澄清的油(5.5g，98％产率)。
                          实施例22
                    合成MPEG7-C8酯(27)
往在醚(90mL)中的非多分散的化合物25(3.0g，8.8mmol)的溶液加入叔丁醇钾(1.2g，9.6mmol)，并将反应混合物搅拌1小时。然后滴加溶于醚(10mL)的非多分散的化合物26(2.4g，9.6mmol)，并将反应混合物搅拌过夜。用C盐(用CH2Cl2，～200mL洗涤)将粗反应混合物过滤并蒸发至干。将所得的油溶于乙酸乙酯并用H2O(2×200mL)洗涤，用MgSO4干燥，并蒸发至干。进行柱色谱处理(硅胶，乙酸乙酯至乙酸乙酯/甲醇，10∶1)，并得到非多分散的标题化合物，为一种澄清的油(0.843g，19％产率)。
                          实施例23
                       MPEG7-C8酸(28)
往非多分散的化合物27(0.70g，1.4mmol)的油中加入1N NaOH(2.0mL)，并将反应混合物搅拌4小时。将粗反应混合物浓缩，酸化(pH～2)，用NaCl饱和并用CH2Cl2(2×50mL)洗涤。合并有机层，用饱和NaCl洗涤，用MgSO4干燥，并蒸发至干得到非多分散的标题化合物，为一种澄清的油(0.35g，53％产率)。
                     实施例24
                活化MPEG7-C8酸(29)
将非多分散的mPEG7-C8-酸28(0.31g，0.64mmol)溶于3ml无水二氯甲烷，然后加入在无水二氯甲烷中的N-羟基琥珀酰亚胺(0.079g，0.69mmol)和EDCI-HCl(135.6mg，0.71mmol)的溶液。将反应物搅拌数小时，然后用1N HCl、水洗涤，用MgSO4干燥，过滤并浓缩。通过柱色谱法纯化粗产物，浓缩得到非多分散的标题化合物，为一种澄清的油，并真空干燥。
实施例25-29指图5所示的路线。
                       实施例25
                   10-羟基癸酸酯(30)
往在乙醇(100mL)中的非多分散的10-羟基癸酸(5.0g，26.5mmol)的溶液加入H2SO4(0.43mL，8.8mmol)，将反应物加热回流并搅拌3小时。将粗反应混合物冷却至室温，并用H2O(100mL)、饱和NaHCO3(2×100mL)、H2O(100mL)洗涤，用MgSO4干燥，并蒸发至干得到非多分散的标题化合物，为一种澄清的油(6.9g，98％产率)。
                          实施例26
                  10-羟基癸酸酯的甲磺酸酯(31)
往CH2Cl2的溶液(27mL)加入非多分散的10-羟基癸酸酯30(5.6g，26mmol)，并在冰浴中冷却至0℃。然后加入三乙基胺(5mL，37mmol)，并将反应混合物于0℃下搅拌15分钟。然后加入溶于CH2Cl2(3mL)的甲基磺酰氯(2.7mL，24mmol)，并将混合物于0℃下搅拌30分钟，除去冰浴，并将反应物于室温下再搅拌2小时。用C盐(用CH2Cl2，80mL洗涤)过滤粗反应混合物，并用H2O(100mL)、5％NaHCO3(2×100mL)、H2O(100mL)、饱和NaCl(100mL)洗涤，用MgSO4干燥，并蒸发至干得到非多分散的标题化合物，为一种微黄色的油(7.42g，97％产率)。
                          实施例27
                     MPEG7-C10酯(32)
往在四氢呋喃(100mL)中的非多分散的七乙二醇一甲基醚25(2.5g，7.3mmol)的溶液加入氢化钠(0.194g，8.1mmol)，并将反应混合物搅拌1小时。滴加溶于四氢呋喃(10mL)的非多分散的10-羟基癸酸酯31(2.4g，8.1mmol)的甲磺酸酯，并将反应混合物搅拌过夜。用C盐(用CH2Cl2，～200mL洗涤)过滤反应混合物，并蒸发至干。将得到的油溶于乙酸乙酯，并用H2O(2×200mL)洗涤，用MgSO4干燥，蒸发至干，色谱处理(硅胶，乙酸乙酯/甲醇，10∶1)，色谱处理(硅胶，乙酸乙酯)得到非多分散的标题化合物，为一种澄清的油(0.570g，15％产率)。
                          实施例28
                      MPEG7-C10酸(33)
往非多分散的mPEG7-C10酯32(0.570g，1.1mmol)的油中加入1NNaOH(1.6mL)，并将反应混合物搅拌过夜。将粗反应混合物浓缩，酸化(pH～2)，用NaCl饱和，并用CH2Cl2(2×50mL)洗涤。合并有机层，用饱和NaCl(2×50mL)洗涤，用MgSO4干燥，并蒸发至干得到非多分散的标题化合物，为一种澄清的油(0.340g，62％产率)。
                          实施例29
                     活化MPEG7-C10酸(34)
使用类似于以上在实施例24中所述的方法将非多分散的酸33活化。
实施例30和31指图6所示的路线。
                          实施例30
                    合成C18(PEG6)寡聚体(36)
将非多分散的硬脂酰氯35(0.7g，2.31mmol)缓慢加到在苯中的PEG6(5g，17.7mmol)和吡啶(0.97g，12.4mmol)的混合物。将反应混合物搅拌数小时(～5)。反应后使用乙酸乙酯/甲醇作为显色溶剂进行TLC处理。然后用水洗涤反应混合物，用MgSO4干燥，浓缩并真空干燥。通过FABMS分析纯化的非多分散的化合物36：m/e 549/M+H。
                    实施例31
               活化C18(PEG6)寡聚体
在以下两步中完成非多散的C18(PEG6)寡聚体的活化：
1)将非多分散的硬脂酰基-PEG6 36(0.8g，1.46mmol)溶于甲苯，并将其加到光气溶液(10mL，20％，在甲苯中)，用冰浴进行冷却。将反应混合物于0℃下搅拌1小时，然后于室温下搅拌3小时。随后蒸馏掉光气和甲苯，并用P2O5将残余的非多分散的硬脂酰基PEG6氯甲酸酯37干燥过夜。
2)往在无水二氯甲烷中的非多分散的硬脂酰基PEG6氯甲酸酯36(0.78g，1.27mmol)和TEA(128mg，1.27mmol)的溶液加入在二氯甲烷中的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶液。将反应混合物搅拌16小时，然后用水洗涤，用MgSO4干燥，过滤，浓缩并真空干燥得到非多分散的活化的C18(PEG6)寡聚体38。
实施例32-37指图7所示的路线。
                        实施例32
                  四乙二醇一苄基醚(39)
往非多分散的四乙二醇(19.4g，0.10mol)的油加入NaOH溶液(4.0g，在4.0mL中)，并将反应物搅拌15分钟。然后加入苄基氯(3.54mL，30.8mmol)，并将反应混合物加热至100℃，并搅拌过夜。将反应混合物冷却至室温，用饱和NaCl(250mL)稀释，并用CH2Cl2(2×200mL)洗涤。合并有机层，用饱和NaCl洗涤，用MgSO4干燥，并进行色谱处理(硅胶，乙酸乙酯)得到非多分散的标题化合物，为一种黄色的油(6.21g，71％产率)。
                     实施例33
           四乙二醇一苄基醚的甲磺酸酯(40)
往CH2Cl2的溶液(20mL)加入非多分散的四乙二醇一苄基醚39(6.21g，22mmol)，并在冰浴中冷却至0℃。然后加入三乙基胺(3.2mL，24mmol)，并将反应混合物于0℃下搅拌15分钟。然后加入溶于CH2Cl2(2mL)的甲基磺酰氯(1.7mL，24mmol)，并将反应混合物于0℃下搅拌30分钟，除去冰浴，并将反应物于室温下再搅拌2小时。用C盐(用CH2Cl2，80mL洗涤)过滤粗反应混合物，用H2O(100mL)、5％NaHCO3(2×100mL)、H2O(100mL)、饱和NaCl(100mL)洗涤滤液，并用MgSO4干燥。用含有活性碳(10g)的衬垫色谱处理所得的黄色的油得到非多分散的标题化合物，为一种澄清的油(7.10g，89％产率)。
                      实施例34
               八乙二醇一苄基醚(41)
往含有氢化钠(0.43g，18mmol)的四氢呋喃(140mL)的溶液滴加在四氢呋喃(10mL)中的非多分散的四乙二醇(3.5g，18mmol)的溶液，并将反应混合物搅拌1小时。然后滴加溶于四氢呋喃(10mL)的非多分散的四乙二醇一苄基醚的甲磺酸酯40(6.0g，16.5mmol)，将反应混合物搅拌过夜。用C盐(用CH2Cl2，250mL洗涤)过滤粗反应混合物，用C盐(用CH2Cl2，250mL洗涤)过滤粗反应产物，并用H2O洗涤滤液，用MgSO4干燥，并蒸发至干。对所得的油进行色谱处理(硅胶，乙酸乙酯/甲醇，10∶1)和色谱处理(硅胶，氯仿/甲醇，25∶1)得到非多分散的标题化合物，为一种澄清的油(2.62g，34％产率)。
                    实施例35
           合成硬脂酸酯PEG8-苄基(43)
往非多分散的八乙二醇一苄基醚41(0.998g，2.07mmol)和吡啶(163.9mg，2.07mmol)的搅拌和冷却的溶液中加入在苯中的非多分散的硬脂酰氯42(627.7mg，2.07mmol)。将反应混合物搅拌过夜(18小时)。第二天用水洗涤反应混合物，用MgSO4干燥，浓缩并真空干燥。然后用快速硅胶柱色谱处理粗产物，使用10％甲醇/90％氯仿为洗脱剂。合并含有产物的馏分，浓缩并真空干燥得到非多分散的标题化合物。
                     实施例36
             硬脂酸酯-PEG8-苄基的水解
往非多分散的硬脂酸酯-PEG8-Bzl43(0.854g，1.138mmol)的甲醇溶液加入Pd/C(10％)(钯，10％wt，担载在活性碳上)。将反应混合物在氢气氛下搅拌过夜(18小时)。然后将溶液过滤，浓缩并通过快速柱色谱法使用10％甲醇/90％氯仿进行纯化，收集Rf＝0.6的馏分，浓缩并干燥得以非多分散的酸44。
                        实施例37
                  活化C18(PEG8)寡聚体
如关于以上实施例31中的硬脂酸酯-PEG6所述对非多分散的硬脂酸酯-PEG8寡聚体进行两步活化得到非多分散的活化的C18(PEG8)寡聚体45。
                         实施例38
             合成活化的三乙二醇一甲基寡聚体
以下的描述指图8所示的路线。在N2气氛下将含有20％的光气(100mL，大约18.7g，189mmol光气)的甲苯溶液冷却至0℃。将非多分散的mTEG(三乙二醇，一甲基醚，7.8g，47.5mmol)溶于25mL无水乙酸乙酯，并将其加到冷却的光气溶液。将混合物于0℃下搅拌1小时，然后将其加热至室温，并再搅拌2.5小时。通过真空蒸馏法除去残余的光气、乙酸乙酯和甲苯，以留下非多分散的mTEG氯甲酸酯46，为一种澄清的油残余物。
将非多分散的残余物46溶于加入TEA(三乙基胺，6.62mL，47.5mmol)和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺，5.8g，50.4mmol)的50mL无水二氯甲烷。将混合物于室温和无水气压下搅拌20小时，在此期间出现大量白色沉淀。将混合物过滤除去沉淀，并真空浓缩。在二氯甲烷中加工所得的油47，并用冷的去离子洗涤二次，用1N HCl洗涤二次，并用盐水洗涤一次。用MgSO4干燥有机物，过滤并浓缩得到非多分散的标题化合物，为一种澄清的浅黄色油。如果需要的话，还可以通过快速硅胶色谱法，使用EtOAc作为洗脱剂纯化NHS酯。
                     实施例39
          合成活化的棕榈酸酯-TEG寡聚体
以下的描述指图9所示的路线。将非多分散的棕榈酸酐(5g；10mmol)溶于无水THF(20mL)，并在室温下搅拌。往搅拌的溶液加入3mol过量的吡啶，然后加入非多分散的三乙二醇(1.4mL)。将反应混合物搅拌1小时(用TLC监测反应的进行；乙酸乙酯-氯仿；3∶7)。
在反应结束时，除去THF，将产物与10％H2SO4酸混合，并用乙酸乙酯(3×30mL)萃取。连续地用水、盐水洗涤合并的萃取物，用MgSO4干燥，并蒸发得到非多分散的产物48。
将在DMF(～10mL)中的N，N′-二琥珀酰亚胺基碳酸酯(3mmol)的溶液加到在10mL无水DMF中的非多分散的产物48(1mmol)的溶液，同时进行搅拌。将氢化钠(3mmol)缓慢地加到反应混合物。将反应混合物搅拌数小时(例如5小时)。加入二乙醚以沉淀活化的寡聚体。此过程重复3次，并在最后干燥产物。
                          实施例40
用活化的六乙二醇一甲基寡聚体合成人生长激素-寡聚体偶联物
以下的描述指图10所示的路线。与以上实施例38中的非多分散的三乙二醇类似地制备非多分散的活化的六乙二醇一甲基醚。在N2气氛下和在冰/盐水浴中冷却在甲苯中的20％光气的溶液(35mL，6.66g，67.4mmol光气)。将非多分散的六乙二醇50(1.85mL，2.0g，6.74mmol)溶于5mL无水EtOAc，并通过注射器加到光气溶液。将反应混合物在冰浴中保持搅拌1小时，移出并再在室温下搅拌2.5小时。通过真空蒸馏除去光气、EtOAc和甲苯，余下非多分散的化合物51，为一种澄清的油残余物。
将非多分散的残余物51溶于20mL无水二氯甲烷，并放置在无水惰性气氛下。加入三乙基胺(0.94mL，0.68g，6.7mmol)，然后加入NHS(N-羟基琥珀酰亚胺，0.82g，7.1mmol)，并将反应混合物在室温下搅拌18小时。用硅胶将混合物过滤以除去白色沉淀物，并真空浓缩。将残余物回收于二氯甲烷，用冷水洗涤二次，用1N HCl洗涤一次并用盐水洗涤一次。有机物用Na2SO4干燥，过滤并浓缩。通过快速色谱法(硅胶，EtOAc)完成最终的纯化得到UV活性非多分散的NHS酯52。
将根据购自Serono of Randolph，Massachusetts的商品名为SaizenTM的人生长激素(生长激素(rDNA来源)用于注射)溶于DMSO，以使hGH浓度为0.58mmol。加入TEA(278当量)并将溶液搅拌大约10分钟。加入2当量、5当量或30当量来自在无水THF中的0.2M活化的寡聚体的溶液的非多分散的活化的六乙二醇52。将反应物于室温下搅拌45分钟至1小时。用在600μl 0.1％在水中的TFA终止各反应混合物的等分试样的反应。在图14中显示2个聚合物当量和5个聚合物当量的反应混合物与未偶联的hGH的HPLC的比较。图15显示30个聚合物当量反应的HPLC分析。
通过分析HPLC，采用反相C18柱和水/乙腈梯度纯化进行质谱分析的偶联物的样品。收集来自2当量反应混合物的全部峰，浓缩并用MALDI质谱分析。这种材料的质谱表明一偶联、二偶联、三偶联和四偶联的hGH和某些残余的未反应的hGH的质谱(图16)。如图17所示，根据极性初步纯化5当量的反应混合物。浓缩的馏分的MALDI质谱(图18、图19和图20)表明蛋白质的偶联水平随保留时间而增大。馏分E的电喷雾质谱，图21得到的结果与六偶联的hGH的存在相符。收集来自30个聚合物当量的反应混合物的全部峰并浓缩。电喷雾质谱色析，图22显示十或更高偶联的物质。
类似的方法用于将hGH与实施例18、24、29、31或37的活化的寡聚体偶联。
                          实施例41
用活化的棕榈酸酯-TEG寡聚体合成人生长激素-寡聚体偶联物
使用来自实施例39的活化的聚合物进行类似于以上在实施例41中所述的方法。通过HPLC检查偶联的进行，将20μL偶联反应混合物置于小瓶，并用100μL的0.1％ TFA-水-IPA(1∶1)稀释。结果如图23所示。2小时后，通过加入0.1％TFA-水而终止反应。通过制备HPLC纯化偶联产物。
                          实施例42
        用活化的TEG寡聚体合成人生长激素-寡聚体偶联物
将1当量购自Serono of Randolph，Massachusetts的商品名为SaizenTM的人生长激素(hGH)(生长激素(rDNA origin)，用于注射)溶于DMSO(1mg/125μL)，并在室温下搅拌2-4分钟。加入2当量的TEA，然后加入2当量的溶于THF的实施例39的活化的寡聚体。2小时后，通过加入0.1％TFA-水终止反应。通过图24所示的制备HHPLC纯化偶联产物。
用5当量的TEA和5当量的实施例39的活化的寡聚体进行类似的操作。如图25所示通过制备HPLC法，使用C18柱纯化偶联产物。流动相和洗脱时间如下：
    时间     mL/分     溶剂A     溶剂B
    0     3.5     80     20
    55     3.5     0     100
将收集的馏分冻干成白色粉末。该化合物的质谱如图26和27所示。
使用9当量的TEA和9当量的实施例39的活化的寡聚体行类似的操作。如图28所示，通过制备HPLC法，使用C18柱纯化偶联产物。
                          实施例43
       测定人生长激素的混合物-寡聚体偶联物的分散系数
如下测定人生长激素的混合物-寡聚体偶联物的分散系数。例如，如以上实施例40所述，提供人生长激素的混合物-寡聚体偶联物。通过HPLC纯化第一混合物样品以分离(separate和isolate)样品中的不同的人生长激素寡聚体偶联物。假定每种分离的馏分包含完全单分散的偶联物的混合物，则“n”等于收集的馏分数。所述混合物可以包括一种或多种偶联物，包括一、二、三、四、五、六、七、八和/或九偶联物。每种分离的混合物的馏分通过质谱法分析测定馏分的质量，从而根据偶联的程度将每种分离的馏分分类，并得到样品中的每个偶联物的变量“Mw”的值。
第二混合物样品通过HPLC法分析得到HPLC迹线。假定偶联并没导致摩尔吸光度的改变，则由对应于特定偶联物的HPLC的峰之下的面积得到混合物中特定偶联物的重量百分数，为HPLC迹线的所有峰之下的总面积的百分数。收集样品并冻干以确定样品的无水克重量。将样品的克重量乘以样品每个组分的重量百分数来确定样品中每个偶联物的克重量。通过以下方法确定特定偶联物(i th 偶联物)的变量“Ni”：将样品中特定偶联物的克重量除去特定偶联物的质量并将此商值乘以Avagadro数(6.02205×1023mole-1)，以上确定的Mi，得到样品中特定的偶联物的分子数量，Ni。然后利用驿每个偶联物所测得的n、Mi和对每个偶联物所测得的Ni计算分散系数。
                          实施例44
如下进行试验：
细胞培养：如前述，在293细胞(人肾胚胎细胞系)中产物表达全长人GHR的稳定的克隆，指定为293GHR。
转录试验：用所报道的包含融合到最小的TK启动子上的Stat5结合元件(LHRE)和萤虫素酶的构建体在293 GHR细胞中进行这些试验。将β-半乳糖苷酶表达载体作为转染对照进行共同转染，并校正萤虫素酶的β-半乳糖苷酶活性值。在转染后16小时，将细胞转染至不含血清的培养基，并用GH或激动剂处理6小时。萤虫素酶活性报道为在特定的实验中由GH的允许在重复的实验之间进行比较的最大活性的百分数。由GH刺激的最大活性是GH刺激的倍数诱导，即将校对的细胞刺激的GH的萤虫素酶值除以校对的未刺激的细胞的萤虫素酶值。试验的结果如图29和30所示，其中Genotropin为人生长激素(标准品，不是本发明的部分)，GH-002为2当量mTEG偶联物，GH-003为5当量mTEG偶联物，GH-004为5当量mTEG偶联物，Prot hGH为人生长激素(标准品，不是本发明的部分)，而hGH-TEG为9当量mTEG偶联物。
在本说明书中已公开了本发明的典型的优选实施方案。虽然使用了具体的术语，但它们仅在一般和描述的含义上使用，且其目的不在于限定以下权利要求所述的本发明的保护范围。

Claims (67)

1.一种偶联物的混合物，所述每个偶联物包含与含有聚亚烷基二醇部分的寡聚体偶合的生长激素药物，该混合物具有标准偏差小于大约22道尔顿的分子量分布。
2.根据权利要求1的混合物，其中所述分子量分布的标准偏差小于大约14道尔顿。
3.根据权利要求1的混合物，其中所述分子量分布的标准偏差小于大约11道尔顿。
4.根据权利要求1的混合物，其中所述聚亚烷基二醇部分具有至少2、3或4个聚亚烷基二醇亚基。
5.根据权利要求1的混合物，其中所述聚亚烷基二醇部分具有至少5或6个聚亚烷基二醇亚基。
6.根据权利要求1的混合物，其中所述聚亚烷基二醇部分具有至少7个聚亚烷基二醇亚基。
7.根据权利要求6的混合物，其中所述聚亚烷基二醇部分为聚丙二醇部分。
8.根据权利要求7的混合物，其中所述聚丙二醇是均一的。
9.根据权利要求1的混合物，其中所述生长激素药物为人生长激素。
10.根据权利要求9的混合物，其中所述寡聚体与人生长激素的氨基官能团共价偶合。
11.根据权利要求10的混合物，其中所述氨基官能团为选自以下的人生长激素的氨基酸残基：Phe1、Lys38、Lys41、Lys70、Lys115、Lys140、Lys145、Lys158、Lys168和Lys172。
12.根据权利要求9的混合物，其中所述偶联物包含多数寡聚体。
13.根据权利要求1的混合物，其中所述聚亚烷基二醇部分为聚丙二醇部分。
14.根据权利要求13的混合物，其中所述聚丙二醇部分为均一的。
15.根据权利要求1的混合物，其中所述寡聚体由均一的聚丙二醇部分组成，且其中所述偶联物各自是两亲平衡的，因而每个偶联物溶于水并能够穿透生物膜。
16.根据权利要求1的混合物，其中所述生长激素药物与寡聚体共价偶合。
17.根据权利要求16的混合物，其中所述生长激素药物与寡聚体通过可水解的键共价偶合。
18.根据权利要求1的混合物，其中所述生长激素药物与聚亚烷基二醇部分共价偶合。
19.根据权利要求18的混合物，其中所述寡聚体还包含与聚亚烷基二醇部分共价偶合的亲脂部分。
20.根据权利要求1的混合物，其中所述寡聚体还包含亲脂部分。
21.根据权利要求20的混合物，其中所述生长激素药物与亲脂部分共价偶合。
22.根据权利要求1的混合物，其中所述偶联物包含多数寡聚体。
23.根据权利要求22的混合物，其中所述多数寡聚体中的每一个寡聚体相同。
24.根据权利要求1的混合物，其中所述寡聚体包含通过不可水解的键与生长激素药物共价偶合的第一聚亚烷基二醇部分和通过可水解的键与第一聚亚烷基二醇部分共价偶合的第二聚亚烷基二醇部分。
25.根据权利要求24的混合物，其中所述寡聚体还包含与第二聚亚烷基二醇部分共价偶合的亲脂部分。
26.根据权利要求1的混合物，其中所述偶联物各自为两亲平衡的，因而每个偶联物溶于水并能够穿透生物膜。
27.一种药物组合物，所述组合物包含：
根据权利要求1的混合物；
和药学上可接受的载体。
28.一种治疗需要这种治疗的受试者的生长激素缺乏的方法，该包括：给患者施用有效量的偶联物的混合物以治疗生长激素缺乏，该偶联物各自包含与含有聚亚烷基二醇部分的寡聚体偶合的生长激素药物，该混合物具有标准偏差小于大约22道尔顿的分子量分布。
29.一种加速动物生长速率的方法，该方法包括：给动物施用足以加速动物生长速率的数量的偶联物的混合物，该偶联物各自包含与含有聚亚烷基二醇部分的寡聚体偶合的生长激素药物，该混合物具有标准偏差小于大约22道尔顿的分子量分布。
30.一种基本上单分散的偶联物的混合物，每个偶联物包含与含有聚亚烷基二醇部分的寡聚体偶合的生长激素药物。
31.根据权利要求30的混合物，其中该聚亚烷基二醇部分具有至少2、3或4个聚亚烷基二醇亚基。
32.根据权利要求30的混合物，其中该聚亚烷基二醇部分具有至少5或6个聚亚烷基二醇亚基。
33.根据权利要求30的混合物，其中该聚亚烷基二醇部分具有至少7个聚亚烷基二醇亚基。
34.根据权利要求30的混合物，其中所述混合物中至少大约96％、97％、98％或99％的偶联物具有相同的分子量。
35.根据权利要求30的混合物，其中所述混合物为单分散的混合物。
36.根据权利要求30的混合物，其中所述混合物为基本上完全单分散的混合物。
37.根据权利要求30的混合物，其中所述混合物中至少大约96％、97％、98％或99％的偶联物具有相同的分子量并具有相同的分子结构。
38.根据权利要求30的混合物，其中所述混合物为完全单分散的混合物。
39.根据权利要求30的混合物，其中所述聚亚烷基二醇部分为均一的聚丙烯部分。
40.一种基本上单分散的偶联物的混合物，每个偶联物包含与寡聚体共价偶合的人生长激素，所述寡聚体包含均一的具有至少7个聚丙二醇亚基的聚丙二醇部分。
41.根据权利要求40的混合物，其中所述寡聚体由均一的具有至少7个聚丙二醇亚基的聚丙二醇部分组成，且其中每个偶联物是两亲平衡的，因而每个偶联物溶于水并能够穿透生物膜。
42.一种偶联物的混合物，所述的每个偶联物包含与具有聚亚烷基二醇部分的聚合物偶合的生长激素药物，其中述混合物的分散系数(DC)大于10,000，其中
DC = ( Σ i = 1 n N i M i ) 2 Σ i = 1 n N i M i 2 Σ i = 1 n N i - ( Σ i = 1 n N i M i ) 2
其中：
n为样品中不同分子的数量；
Ni为样品中i th 分子的数量；和
Mi为i th 分子的质量。
43.根据权利要求42的混合物，其中所述分散系数大于100,000。
44.根据权利要求42的混合物，其中所述分散系数大于500,000。
45.根据权利要求42的混合物，其中所述生长激素药物为人生长激素。
46.根据权利要求42的混合物，其中所述聚亚烷基二醇部分为聚丙二醇部分。
47.根据权利要求42的混合物，其中所述聚丙二醇部分是均一的。
48.根据权利要求42的混合物，其中所述聚亚烷基二醇部分具有至少7个聚亚烷基二醇亚基。
49.一种偶联物的混合物，其中每个偶联物：
包含与寡聚体偶合的生长激素药物；和
具有相同数量的聚亚烷基二醇亚基。
50.根据权利要求49的混合物，其中所述生长激素药物为人生长激素。
51.根据权利要求49的混合物，其中所述聚亚烷基二醇部分为聚丙二醇部分。
52.根据权利要求51的混合物，其中所述聚丙二醇部分是均一的。
53.根据权利要求49的混合物，其中所述聚亚烷基二醇部分具有至少7个聚亚烷基二醇亚基。
54.一种偶联物的混合物，其中每个偶联物具有相同的分子量并具有下式：
生长激素药物
Figure A028153010005C2
其中：
B为键合部分；
L为接头部分；
G、G′和G″为独立选择的间隔部分；
R为亲脂部分而R′为聚亚烷基二醇部分，或者R′为亲脂部分而R为聚亚烷基二醇部分；
T为末端部分；
h、i、j、k、m和n独立地为0或1，
附带条件是当R为聚亚烷基二醇部分时，m为1；当R′为聚亚烷基二醇部分时，n为1；和
p为1至生长激素药物上亲核残基数的整数。
55.根据权利要求54的混合物，其中所述聚亚烷基二醇基团为聚丙二醇部分。
56.根据权利要求55的混合物，其中所述聚丙二醇基团是均一的。
57.根据权利要求54的混合物，其中：
i、j、k和n为0；
R为均一的聚丙二醇；和
所述偶联物各自是两亲平衡的，因而每个偶联物溶于水并能够穿透生物膜。
58.根据权利要求54的混合物，其中R为具有至少7个聚亚烷基二醇亚基的聚亚烷基二醇部分。
59.一种用于合成基本上单分散的偶联物的混合物的方法，每个偶联物包含与含有聚乙二醇部分的寡聚体偶合的生长激素药物，该方法包括：
使基本上单分散的包含具有式I的结构的化合物的混合物与基本上单分散的包含具有式II的结构的化合物的混合物在足以得到基本上单分散的包含具有式III的结构的聚合物的条件下反应，
             R1(OC2H4)m-O-X+          (I)
其中R1为H或亲脂部分；m为1-25；而X+为阳离子，
            R2(OC2H4)n-OMs          (II)
其中R2为H或亲脂部分；而n为1-25，
            R2(OC2H4)m+n-OR′       (III)
将基本上单分散的包含式III的聚合物的混合物活化得到基本上单分散的能够与生长激素药物反应的活化的聚合物的混合物；和
使所述基本上单分散的活化的聚合物的混合物与基本上单分散的生长激素药物的混合物在足以得到基本上单分散的偶联物的混合物的条件下反应，所述偶联物各自包含与寡聚体偶合的生长激素药物，所述寡聚体包含具有m+n个亚基的聚乙二醇部分。
60.根据权利要求59的方法，其中R2为脂肪酸部分或脂肪酸部分的酯。
61.根据权利要求60的方法，其中所述脂肪酸部分或脂肪酸部分的酯包含长度至少为5个碳原子的烷基部分。
62.根据权利要求59的方法，其中R1为甲基。
63.根据权利要求59的方法，所述方法还包括：
使基本上单分散的包含具有式V的结构的化合物的混合物与甲基磺酰卤化物在足以得到基本上单分散的包含具有式II的结构的化合物的混合物反应，
            R2(OC2H4)n-OH            (V)
            R2(OC2H4)n-Oms           (II)。
64.根据权利要求63的方法，所述方法还包括：
使基本上单分散的包含具有式VI的结构的化合物的混合物与基本上单分散的包含具有式VII的结构的化合物的混合物在足以得到基本上单分散的包含具有式VIII的结构的化合物的混合物的条件下反应：
            R2-OMs                  (VI)
其中R2为亲脂部分；
            R3(OC2H4)m-O-X2 +        (VII)
其中R3为苄基、三苯甲基或THP，而X2 +为阳离子；
            R3(OC2H4)m-OR2          (VIII)；和
使基本上单分散的包含具有式VIII的结构的化合物的混合物在足以得到基本上单分散的包含具有式V的结构的化合物的混合物的条件下反应：
            R2(OC2H4)m-OH           (V)。
65.根据权利要求59的方法，所述方法还包括：
使基本上单分散的包含具有式IV的结构的化合物的混合物在足以得到基本上单分散的包含具有式I的结构的化合物的混合物的条件下反应：
            R1(OC2H4)n-OH           (IV)
            R1(OC2H4)n-O-X+         (I)。
66.根据权利要求59的方法，其中所述基本上单分散的混合物的活化包括使基本上单分散的式III的聚合物的混合物与N-羟基琥珀酰亚胺反应得到能够与生长激素药物反应的活化的聚合物。
67.根据权利要求59的方法，其中所述生长激素药物为人生长激素，且其中所述基本上单分散的活化的聚合物的混合物与基本上单分散的人生长激素的混合物的反应包括：使基本上单分散的活化的聚合物的混合物与选自Phe1、Lys38、Lys41、Lys70、Lys115、Lys140、Lys145、Lys158、Lys168、Lys172及其组合的人生长激素的氨基酸残基的氨基官能团反应得到基本上单分散的偶联物的混合物，所述偶联物各自包含与一个或多个寡聚体偶合的人生长激素，所述寡聚体包含具有m+n个亚基的聚乙二醇部分。
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