CN1549924A - 通过等电点分析生物分子的缓冲液的阵列 - Google Patents

Abstract

本发明涉及根据生物分子的等电点任选与第二维分析联合使用来分析生物分子的矩阵、阵列、系统和方法。本发明提供的矩阵、阵列和系统的分类用于使生物分子在电场影响下积聚到IEF缓冲中，所述IEF缓冲液的pH值与生物分子的等电点相同。本发明的方法可用于例如研究和诊断目的。

Description

通过等电点分析生物分子的缓冲液的阵列

发明领域

本发明涉及根据生物分子的等电点在电场内进行一维方向分离和任选接着在第二维方向进行第二分析技术以制备、分类、积聚或分析生物分子的矩阵、阵列、系统和方法，及其应用。

发明背景

等电聚焦或pH梯度聚焦的基本原理是：当带电分子迁移到pH梯度内的一个位置时，其在电场中会不动，此位置的pH等于带电分子的等电点(零净电荷)。这个过程的发生独立于溶液中特殊蛋白质的初始位置。这是因为当蛋白质迁移到pH等于pI区域时，其有效电荷消失。

已经描述了多种用于测定蛋白质等电点的技术。典型地，目的蛋白质被注射或直接施加到含有pH梯度的凝胶中，其中pH梯度与电场方向平行，蛋白质在到达与其等电点相等的pH环境之前，只能通过单向迁移经过许多不同的pH环境从而与其它蛋白质分离。这些技术的缺点在于：(1)它们需要相对长的时间才使蛋白质分离，因为组分速度渐近地趋向于零；(2)它们需要相对高的电压(一般为1000V或更高)；和(3)它们需要冷却机制。常规的IEF方法是费力、耗时、非标准、昂贵和不灵敏的。传统的等电聚焦凝胶的另一个应用限制是难以制造pH梯度内pH改变逐渐小的凝胶以改善蛋白质的线性分散。

使用上述等电聚焦步骤的蛋白质两维分析存在同样问题。例如，Zuo等人，(2000)Analytical Biochemistry 284：266-278描述了根据蛋白质的等电点通过单向迁移穿过pH范围继之以十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白质。Becker等人(1998)J.Micromech.Microeng.8：24-28提出蛋白质单向迁移穿过pH范围，继之在平面芯片上进行第二维分离。也参见美国专利6,254,754(Ross)。

因为这些限制，仅仅某些单元、泳道与矩阵的设计；室内的单元、泳道与矩阵的取向；以及某些用于一维和两维分析的系统可能限制了用于样品的一维和两维分析，包括自动化、高通量分析系统的更快速、更灵敏、更精确、更灵活及较低廉的方法的开发。用于生物分子的一维和两维分析的更好工具和方法可用于，例如，药物研发、医学研究和疾病的预诊断和/或诊断。特别地，需要更好的工具和方法用于蛋白质组分析。本发明解决了这些问题及其它问题。

发明概述

本发明涉及通过生物分子在一维内的等电点和任选与其它分析方法相联合用于分析或制备生物分子的矩阵、阵列、系统和方法。在此提供的单元、矩阵、阵列和系统的分类具有独特的结构和要素组合。

根据一个实施方案，生物分子穿过本发明室内的流动缓冲液，被俘获在本发明的IEF缓冲液或含有本发明IEF缓冲液的单元内。根据另一个实施方案，俘获在本发明的IEF缓冲液或单元内的生物分子在IEF缓冲液或单元内保持俘获，而pI值不同于IEF缓冲液pH值的生物分子通过电场方向交变而迁移。如果IEF缓冲液或单元封闭以阻止电流从其进入IEF缓冲液或单元入口的对侧流出，则根据一个优选的实施方案，该电场是可逆的。如果IEF缓冲液或单元是开放的，则该电场可以是单向的。根据另一个本发明的实施方案，通过电场产生的对流热增加流动缓冲液内的生物分子的迁移。

根据本发明的另一个实施方案，通过一种装置增加流动缓冲液内的生物分子的迁移，所述装置使含有生物分子的流动缓冲液循环穿过IEF缓冲液(例如，通过搅动棒、通过泵或通过IEF缓冲液相对于流动缓冲液的运动)。

根据又一个实施方案，IEF缓冲液的pH范围可以极窄(例如，跨度为0.1pH单位或更小；0.02pH单位或更小；或0.01pH单位或更小)。根据一个实施方案，含有流动缓冲液的室进一步包括多个通过物理分离或通过可基本上防止生物分子直接从一个IEF缓冲液/单元迁移到另一个IEF缓冲液/单元而不经过流动缓冲液的物质而彼此隔离的IEF缓冲液和/或单元。因此，生物分子主要穿过流动缓冲液到达不同的IEF缓冲液或单元。在另一个实施方案中，IEF缓冲液或单元具有相同或不同的pH值。根据又一个实施方案，本发明包括很多个非连续的隔离的IEF缓冲液，所述缓冲液具有极窄的基本上不相重叠的pH范围，使所得分离材料的图像与传统IEF凝胶图像位置相当，但是比传统IEF凝胶具有更大的分辨率。

根据本发明，本发明的生物分子可根据其等电点被分离成单一实体或作为复合体的一部分。例如，生物分子(“靶生物分子”)可与另一个可特异识别它的分子(“靶识别分子”)形成复合体。根据复合体的等电点，所述复合体可使用本发明的矩阵、阵列、系统和方法而与其它非复合的生物分子分离。

根据本发明的一个实施方案，使用多个具有窄pH范围的非连续的隔离的IEF缓冲液和梯度，例如0.1pH单位或更小，提供了改进的一维或两维分析方法。更优选地，pH范围或梯度为0.02pH单位或更小。本发明的一个目的是提供一种用于分析pI值为0.02pH单位或更小单位间隔的生物分子的改进的一维和两维方法。根据所述系统的一种构造，通过使用生物分子不能穿透的膜或材料，避免生物分子从一个单元向邻接单元内的扩散，例如，在包括具有稍有不同pH值的IEF缓冲液的单元之间的扩散。例如，每种IEF缓冲液或包括所述IEF缓冲液的单元可被物理地分离为间断的非连续的实体。

本发明的一个目的是提供一种分析方法，该方法可在低外加电压下使用高电场，任选避免使用kV范围的电源。在一个优选实施方案中，本发明的方法和系统使用了一种用于可逆地指导电场进出单元内IEF缓冲液的装置，以及任选使用用于使缓冲液同时循环在多种单元周围的设备。本发明的另一个目的是提供一种几乎不需要室冷却用装置或不需要室冷却用装置的分析方法。本发明的又一个目的是提供一种两维矩阵，该矩阵在第一维和第二维分离期间需要最小限度地操作生物分子或不需要操作生物分子，因此节约时间和力气，使得被测生物分子的损失最小。

本发明的另一个实施方案提供一种适用于与第二维分析(例如，高效液相色谱法(HPLC)、质谱法、亲和色谱法、凝胶电泳等)联合使用的IEF技术。本发明的又一个目的是能分离和/或纯化少量或大量具体的生物分子如蛋白质或核酸分子的系统或方法。本发明也提供用于检测与靶识别生物分子相复合的靶生物分子的方法。靶生物分子在支持或阻止复合体形成的环境中形成TB的复合体。在本发明的一个实施方案中，在引入含靶分子的样品之前，将被标记的靶识别生物分子直接置于IEF缓冲单元、泳道或矩阵内。

本发明的又一个实施方案是提供用于一维和两维分析的系统和/或方法，所述系统和/或方法可微型化和自动化，以用于药物筛选的高通量分析样品、医学研究，如提高用于药物发现的生物反应模式的检测、药物治疗监测、遗传或蛋白质组分析和临床诊断，以及诊断学如蛋白质组分析。本发明的系统可经构建而具有自动相互作用组件，如使用pH溶液或凝胶(固定化电解质、两性电解质混合物等等)填充通道所用的滴定器、从含有IEF缓冲液的单元回收生物分子所用的提取器、用于染色生物分子的装置、用于检测和扫描生物分子的装置、用于记录和分析图像的装置。本发明的系统和/或方法可自动化以高通量筛选用于期望药效的候选物。

本发明提供的方法用于增强检测生物分子对各种干扰和刺激的响应，诸如对药物、候选药物或设计用于探查生物学路径的试验条件以及与特定的疾病或病态相对应、或与特定的疾病或病态的治疗相对应的动物或人的改变的响应。

附图简述

图1描述(A)本发明的一个单元，其含有IEF缓冲液和在单元的相对侧具有蛋白质及离子渗透膜；和(B)包括多个本发明单元的矩阵。

图2描述了本发明的一个仪器，其包括位于室两侧的两个电极板和电极之间包括多种单元的矩阵。所述室处于磁力搅拌器的上方。电场方向是可逆的。

图3描述了本发明的一个仪器，其包括在两个电极板之间的悬浮于室底部上方的矩阵，其中流动缓冲液通过搅动棒可围绕矩阵流动。电场的方向是可逆的。

图4描述本发明的一个仪器，其中矩阵旋转使流动缓冲液内的生物分子分布穿过单元开口端。选择性地，该室也可有搅拌棒以使流动缓冲液循环。电场方向是可逆的。

图5描述了本发明的三种仪器：(A)多个单元被分别和任意地安装在室内流动缓冲液内的绝缘支撑上介于二电极板之间；(B)多个单元自由漂浮在室内介于二电极板之间；或(C)多个单元彼此依附并在二电极板之间旋转。使用搅拌棒使流动缓冲液循环。电场方向是可逆的。

图6描述一个室的俯视图，该室包括多个串联联接并由可基本上保持各个单元内pH范围的膜分离的单元，和与电场方向平行的阵列(A)或与电场方向垂直的阵列(B)。使用搅拌棒使流动缓冲液循环。电场方向是可逆的。

图7描述了本发明的矩阵单元内的生物分子正在进行第二维SDS-PAGE毛细管电泳。

图8描述了本发明的矩阵，其中单元可被调整成为线性系列，用于依附于第二维电泳所用的SDS聚丙烯酰胺凝胶。

图9描述本发明的矩阵，其包括具有通道的琼脂糖凝胶，所述通道含有多种IEF缓冲液。除了通道的第四列不含有缓冲液之外，每个通道的垂直系列都含有相同的IEF缓冲液。铁蛋白、藻蓝蛋白(第一条带)、藻蓝蛋白(第二条带)和血红蛋白分别积聚在第一、第二、第三和第五垂直系列内。

图10是本发明一个实施方案的芯片的图像，本文所绘制的芯片被设计用于分析样品内的三个靶生物分子。芯片的第一排、第二排和第三排中每个单元内各种IEF缓冲液的pH分别与包括各种TBs/TRMs，例如，TB1/TRM1、TB2/TRM2或TB3/TRM3的复合体的pI相同。第四排包括的单元被设计用于接受非TB分子，该分子被添加到流动缓冲液中用作校准曲线绘制用的对照点、标准点或数据点。因此，第四排内的IEF缓冲液的pH值与非TB生物分子的pI值相同。

图11是本发明的一个实施方案，其是位于二个电极板之间的包括多元芯片的室。该室可连接于能使电场极性反转的电源。该室可进一步包括一种机械装置，该装置用于搅拌多元芯片两侧上的两个隔室内的流动缓冲液。

图12是本发明一个的实施方案，其是用于多元芯片的检测装置。在一种或多种复合体被芯片内多个单元接受后，可将芯片置于检测装置内。通过光源(例如单色光源)刺激多元芯片内的荧光标记复合体以用于检测，然后，从标记发出的光可通过光二极管俘获，转变成电子信号(读出单位)，并通过电脑分析。芯片可嵌入在相对于光源或二极管可移动的支架内。或者，光源和二极管相对于芯片是可移动的。

图13表示各种浓度的血红蛋白在610nm处的吸收。每个数据点代表从充满不同浓度血红蛋白溶液的矩形标准比色杯中读取的吸收。

图14是用于检测糖尿病的血样的校准曲线。X轴是糖化血红蛋白的摩尔浓度与糖化血红蛋白和非糖化血红蛋白的总摩尔浓度的比值，用百分数表示。Y轴是糖化血红蛋白的吸收与糖化血红蛋白和非糖化血红蛋白的总吸收的百分数。

图15描述本发明的矩阵和阵列的实施例。图15A描述了本发明矩阵的四个实施例的侧视图，每个矩阵含有IEF缓冲液(“b”)。矩阵A和D具有其中包括IEF缓冲液的凹槽。矩阵B和C在矩阵表面上装有IEF缓冲液。矩阵C和D具有称为“c”的区域，其为泳道。矩阵A-D可与本发明系统内的第二层联合使用，用于两维分析。用于等电聚焦步骤的电场方向表示为“E1”。矩阵A和B中的部分“b”也可用作本发明的第二维分离的泳道(例如，在第二维分离期间通过向流动缓冲液中添加十二烷基硫酸钠)。根据本发明的另一个实施方案，矩阵A-D在等电聚焦步骤期间在相同的E1场内可以任何方向旋转90度(未表示)。图15B描述了一种阵列，其中包括穿孔的第二层可置于矩阵上，使得矩阵内的IEF缓冲液在第一维分离期间能够与流动缓冲液接触。

图16涉及本发明阵列的一个实施例。(A)是一个阵列第二层实施例的俯视图，在这个实施例中，第二层由一种材料制造而成，该材料不能透过生物分子但能透过流动缓冲液中的离子。(B)是本发明矩阵的一个实施例的俯视图。该矩阵包括由充满凝胶的矩形凹槽形成的泳道和充满IEF缓冲液的圆槽。(C)是在矩阵(B)的上方排列成行的第二层(A)的俯视图，使得IEF缓冲液经过第二层的穿孔而暴露。(D)是阵列(C)的一个IEF/泳道单元侧视图。(E)是部分阵列(C)的放大侧视图(虚线圈)。顶层是第二层(A)，而底层是矩阵(B)。

图17描述本发明系统的一个实施例的俯视图，该系统在含有流动缓冲液的室中包含本发明的阵列。搅拌棒处于室内使生物分子通过“b”内的IEF缓冲液或单元循环。电极A1和B1在等电聚焦步骤期间产生周期性反转方向的电场。

图18是下文实施例1制备的市售标准蛋白质的银染色凝胶的电子扫描。

图19是下文实施例2制备的人血浆的银染色凝胶的电子扫描。

图20是使用本发明的方法在分离pI为7.5-8.5的人血浆蛋白中使用的矩阵俯视图。该矩阵是1×1cm的Lucite芯片。矩阵上的每条线通过储存IEF缓冲液和丙烯酰胺混合物的改进的墨喷式打印机绘制，使得凝胶的平行泳道中的每个泳道具有100微米的统一宽度和厚度及1cm的长度，但是具有不同的pH值(即，从7.50、7.52、7.54、7.56、7.58等开始直到8.50的五十个泳道)。将矩阵置于室内的某些流动缓冲液内，使得每一泳道的一个端部浸入流动缓冲液中。用搅拌棒使人血浆样品在流动缓冲液内循环穿过泳道端部，同时向流动缓冲液施加周期性反转方向的电场。数分钟后，关掉电场，向流动缓冲液中添加3％的SDS溶液，把整个芯片浸入流动缓冲液内。然后，以远离与等电聚焦步骤中所用的IEF缓冲液末端的方向和沿泳道长度方向施加与泳道平行的单向电场，然后芯片进行银染色。在图20中观察到的灰点和黑点是已被银染色的蛋白质。

图21比较了本发明的两维分析制备的人血浆与根据传统两维IEF-SDS-PAGE分析制备的人血浆。(A)是在实施例3中使用的银染色芯片的数字化光学扫描。该扫描被放大到能用于与Swiss蛋白质2D图像进行比较的尺寸。(B)是公开的pI为7.50-8.50的人血浆蛋白的银染色两维凝胶。

图22比较了通过本发明的两维分析制备的人血浆与根据传统两维IEF-SDS-PAGE分析制备的人血浆。(A)是公开的pI为5.50-6.00的人血浆蛋白的银染色两维凝胶。(B)是在实施例4中使用的银染色芯片的数字化光学扫描。该扫描被放大十倍。

图23是单一毛细管SDS-PAGE泳道的光学扫描。泳道内的暗色区域是pI约为7.0的银染色人血浆蛋白。使用如实施例5制备的本发明的阵列对人血浆蛋白进行分离。

图24是单一毛细管SDS-PAGE泳道的光学扫描。泳道内的暗色区域是pI约为7.0的银染色人血浆蛋白。使用如实施例5制备的本发明的阵列在如实施例6的三电极系统内对人血浆蛋白进行分离。

图25是一种仪器的图解，该仪器可在矩阵上制造IEF缓冲液区域。使用一种装置混合酸性和碱性溶液，以形成具有需要pH值的缓冲液(“滴定器”)。缓冲液与单体(如丙烯酰胺)和聚合剂结合，并装样于另一个装置内(“矩阵式打印机”)，该装置将IEF缓冲液放置在阵列上需要的位置内。

图26是一种仪器的图解，该仪器可在矩阵上制造泳道。将丙烯酰胺溶液和聚合剂装料于装置内(“矩阵式打印机”)，该装置将泳道铺于阵列上的需要位置内。

图27是本发明的一个自动化系统的示意实施例。该系统提供了例如一种用于把样品加料于本发明的两维电泳分析室内的装置(“样品进料器”)、一种用于移出废物的装置(“废物处置器”)、一种用于添加新流动缓冲液的装置(“缓冲液进料器”)、一种用于在两维分析后染色的装置(“染色剂进料器”)、一种用于将染色芯片引入扫描器内的装置(“阵列处理系统”)、一种用于扫描芯片的装置(“扫描器”)、一种用于接受和记录扫描图像的装置(“计算机”)、一种用于分析被记录图像的装置(“软件”)和一种用于显示被记录图像的装置(“显示器”)。

图28是本发明的三电极系统的实施例的图示。

图29是用标记蛋白质经过凝胶分散所检测的校准荧光对等电聚焦10分钟后所观测到的标记抗体在荧光作图来表示IEF系统内分离效率的图表。数字代表样品内蛋白质分子总数，表明蛋白质分离的效率接近100％。

发明详述

一种IEF缓冲液包括缓冲能力为给定pH值范围的组分(缓冲剂)或可用于形成pH梯度的组分(例如，两性电解质、固定化电解质或与缓冲剂的结合)。本发明的IEF缓冲液是液体或淤浆或凝胶形式，除了非生物分子的pI处于IEF缓冲液的pH范围内，否则生物分子可以穿过IEF缓冲液。本发明的IEF缓冲液可包括其它需要的组分，诸如尿素、清洁剂和还原剂。例如，参见Malloy等人的Anal.Biochem.280：1-10页(2000)。希望本发明的IEF缓冲液在电场影响下在功能上稳定。

IEF缓冲液或包含IEF缓冲液的单元可通过手工或使用各种装置形成。例如，IEF缓冲液可以沉积(例如，涂布、印刷或定点)于基材的表面上或基材的凹槽或通道内。基材可以是如下所述的矩阵或是由与矩阵相同的材料制造的小珠。根据本发明的一个实施方案，IEF缓冲液可以通过一种混合酸性和碱性溶液而形成具有期望pH值的缓冲液的装置(“滴定器”)制备。缓冲液与单体(例如，丙烯酰胺)和聚合剂结合，并装料于另一个装置中(“矩阵式打印机”)，该装置将IEF缓冲液铺在矩阵上期望的位置。例如，参见图25。这些装置可被并入本发明的自动化系统。

本发明的两性电解质是一组两性的(即，在酸性介质带正电和在碱性介质中带负电荷)、可溶的和M_r值为约300-1000u的各种寡氨基酸和/或寡羧酸。用于本发明的两性电解质可以制备或购买。例如，本领域已知几种载体两性电解质(例如，第31-50页，Righetti，P.G.(1983)，等电聚焦：理论、方法论和应用，T.S.Work和R.H.Burdon编辑，ElsevierScience出版社，B.V.，Amsterdam；美国专利3,485,736)。或者，市售两性电解质包括Ampholines(LKB)、Servalytes(Serva)、Biolytes或Pharmalytes(Amersham Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)。

固定化电解质是通式为CH₂＝CH-CO-NH-R的非两性的双官能丙烯酰氨基衍生物。本发明有用的固定化电解质可以制备或购买。例如，本领域已知用于合成固定化电解质的方法(Bjellquist等人，(1983)，J.Biochem.Biophys.Methods.6：317)。固定化电解质可以与丙烯酰胺共聚合形成IPG(固定pH梯度)。IPG可以通过本领域已知方法制备或购买。

本发明的pH梯度可以通过混合两性缓冲液或非两性缓冲液而得到。例如，这些缓冲液组合在Allen，R C等人的Gel Electrophoresis andIsoelectric Focusing of Proteins：Selected Techniques，Berlin：Walter deGruyter & Co.(1984)；和美国专利5,447,612(Bier)中有描述。一些IEF缓冲剂包括那些选自50mM甘氨酸、14mM NaOH；50mM HEPES、12mMNaOH；50mM THMA、44.6mM HCl；52mM柠檬酸、96mM Na₂HPO₄；50mM BICINE、18mM NaOH；和50mM DMGA、40mM NaOH的缓冲液。每个单元内通过IEF缓冲液制造的pH梯度可具有窄或宽的pH范围(例如，分别为pH6.8-pH7.8或pH6.8-pH12.8)。

本发明的IEF缓冲液可以具有极窄的pH范围，例如，5.50-5.60(0.1pH单位或更小差异)或超窄pH范围，例如，5.52-5.54(0.02pH单位或更小差异)。这成为可能是因为本发明的IEF缓冲液可以是一种被调整到某pH值的一种缓冲剂。在这种情况下，IEF缓冲液的pH范围相当于缓冲剂调整到所述pH值附近所具有的缓冲能力。

术语“间隔”是指通过IEF缓冲液制造的pH梯度内pH值的递增差。术语“梯度”是指在两种不同IEF缓冲液之间的pH值的递增差。例如，在一个单元内，贯穿单元内全部pH范围的间隔可以小至0.02pH单位(例如，在该单元内，pH6.8、pH7.0、pH7.2等)。在另一个实施例中，在单元#1和单元#2之间的IEF缓冲液的pH“梯度”可以是0.1pH单位。例如，单元#1内的IEF缓冲液可以具有起始于pH6.8和终止于pH7.8的pH梯度，而单元#2内的IEF缓冲液可以具有起始于pH7.9和终止于pH8.9的pH梯度(即，pH7.9减去pH7.8)。术语“pH范围”是指IEF缓冲液或包含IEF缓冲液的单元内最高到最低的pH值(例如，pH7.9-pH8.9)，或是指IEF缓冲液或包含IEF缓冲液的单元内最高和最低pH值之间的差(例如，1.0pH单位)。依据本发明，单元内的间隔不必统一。此外，多个单元的两个单元之间的pH梯度不必统一。根据一个实施方案，矩阵包括IEF缓冲液或具有极窄或超窄的pH范围的IEF缓冲液的单元，并在每个单元之间具有小的pH梯度。

根据本发明的一个实施方案，单元内IEF缓冲液的pH范围是窄pH梯度，例如，小于一个pH单位或最高达几个pH单位。根据另一个实施方案，单元内的pH梯度跨越几个pH单位。根据本发明的一个实施方案，IEF缓冲液的pH间隔是0.1pH单位或更小。在另一个实施方案中，IEF缓冲液的pH间隔是0.02单位或更小。根据本发明的一个实施方案，两个或多个IEF缓冲液之间的pH梯度是0.01单位或更小。根据本发明的另一个实施方案，两个或多个IGF缓冲液之间的pH梯度是0.02单位或更小。

本发明的单元是一种空心结构，其内具有IEF缓冲液和/或将IEF缓冲液整合到其壁内。单元可以具有任何形状，包括球形、三角形、正方形、矩形和圆筒形。根据结构形状，单元可以具有一个或多个壁。单元的壁具有朝向结构中心的内侧和朝向单元外部的外侧，例如，参见图1。根据期望的用途，本发明的单元的壁可制成生物分子可渗透的、生物分子不渗透的和/或通过电场可穿透的或不能穿透的膜、栅网或固体。

单元的一些壁对于电场可以是不能穿透的。然而，应构建单元的壁使得电流可以进入所述单元。可以将IEF缓冲液整合到单元壁内。例如，可以将Whatman GF/D玻璃纤维过滤器圆盘浸泡在丙烯酰胺中，使丙烯酰胺聚合成凝胶，然后吸入IEF缓冲液。该圆盘可以用于形成单元壁。因此，生物分子可以俘获在具有吸收了IEF缓冲液的壁的单元内，所述IEF缓冲液具有与生物分子的pI值相同的pH值。

如果包含目的生物分子的样品被添加到系统的流动缓冲液中，则单元的至少一个壁应该是对一种或多种目的生物分子所能渗透的。在一个实施方案中，单元的所有壁是目的生物分子所能渗透的。在另一个实施方案中，除了一个壁之外，单元的所有壁是生物分子不渗透的和/或不能被电场穿透的。在一个实施方案中，朝向电场并与电场方向相同的单元壁在第一维内是对目的生物分子所能渗透的。

根据供选择的实施方案，单元的一个壁或多个壁基本上可以是对目的生物分子不能渗透的，如果目的生物分子的制备方法是(1)将包含目的生物分子的样品添加到系统单元内的IEF缓冲液中，和(2)使得非目的生物分子和/或离子迁移离开单元。以这种方法，单元可与本发明的矩阵、阵列、系统和方法结合一起用于第一维步骤中。

单元可以以几种方法进行空间排列。例如，单元可以连续地排列，例如，其中生物分子可渗透材料或生物分子不可渗透材料使得彼此靠近的单元分离，例如，参见图6a和6b。根据一个实施方案，IEF缓冲液或单元被“隔离”，使得生物分子基本上从一种IEF缓冲液通过迁移穿过围绕IEF缓冲液或单元循环的流动缓冲液向另一种IEF缓冲液迁移，而不是穿过一种IEF缓冲液直接进入另一种IEF缓冲液或穿过一个单元壁直接进入另一个单元。例如，参见图5a、5b或图2。根据一个实施方案，隔离单元是毗连的但是具有使其分离的生物分子不可渗透材料，例如，参见图6。或者，隔离的IEF缓冲液或单元不是毗连的。根据本发明的一个实施方案，如果IEF缓冲液或单元连续排列，则与另一个IEF缓冲液或单元不相毗连的IEF缓冲液或单元中的至少一个壁与流动的缓冲液接触，并且是对被检测生物分子所能渗透的。根据本发明的一个实施方案，IEF缓冲液或单元形成为矩阵的一部分。根据一个实施方案，当单元与第一维电场平行排列时，IEF缓冲液或单元不是彼此串联联接的。

生物分子可渗透材料或生物分子不可渗透材料取决于期望结果，其可以是膜。根据本发明的一个实施方案，可以制备膜，使得电场内膜的小孔处几乎不具有净电荷。在供选择的实施方案中，膜的pH可以是介于膜两侧pH之间的pH值。这是希望使由膜上存在或获得的电荷所引起的穿过该膜的液体总体流动(电内渗)最小化。根据期望结果，用于本发明的膜包括在美国专利4,243,507(Martin)中所述的膜。或者，本发明的膜可包括与固定化电解质共价键合的膜，如美国专利4,971,670(Faupel)所述。

只要单元能够与流动的缓冲液接触，本发明的单元可以直接地或间接地连接在室上。例如，该单元可直接连接在室的底部或侧面或通过绝缘支座安装在室上，例如，参见图5a或5c。或者，该单元可置于矩阵内，该矩阵连接在室或连接在与室相连的支柱上。在又一个实施方案中，包含作为缓冲剂的IEF缓冲液的单元可自由漂浮在缓冲液内，但是应该辨别单元以指明单元内IEF缓冲液的pH范围，例如，参见图5b。依据本发明，矩阵或个别单元可以连接在室上，使得它们在室内旋转。

随着IEF缓冲液或单元的尺寸减小时，本发明的方法和系统的敏感性增加。根据本发明的一个实施方案，IEF缓冲液或单元的尺寸，特别是IEF缓冲液或单元的长度应尽可能地小。IEF缓冲液或单元长度是指在第二维上与电场方向平行的IEF缓冲液或单元的最宽横截面。IEF缓冲液或单元的宽度是指在第二维上与电场方向垂直的IEF缓冲液或单元的最宽横截面。在本发明的一个实施方案中，单元的长度可以是任何尺寸，例如，10微米-5.0毫米。在本发明的另一个实施方案中，单元的宽度可以是任何尺寸，例如，10微米-10.0毫米。

本发明的泳道可以是各种尺寸。根据一个实施方案，泳道的宽度是20微米到1毫米。例如，泳道的宽度可以是100微米。根据另一个实施方案，每个泳道的长度是3-10毫米。

泳道可以包含适于分离技术(例如，根据尺寸、形状、电荷、亲合力或其组合)的材料。如包括适用于色谱法、电泳法如SDS-PAGE、区带电泳、亲和电泳、毛细管电泳和电色谱法的材料。因此，在一个实施方案中，泳道可以是充满色谱物质的毛细管(例如，液相色谱)或是用于电泳(例如，使用交联和非交联凝胶剂的毛细管区带电泳、毛细管凝胶电泳)和毛细管等电聚焦的物质。根据一个实施方案，第二维是电场介导的分离技术。

本发明一个实施方案的泳道可以包含凝胶状材料，该凝胶状材料适用于电泳分离，例如，美国专利6,197,173(Kirpatrick)。胶状材料可以由已聚合的单体组成。用于研究生物分子的凝胶可以是变性的或非变性的。凝胶可以具有各种孔大小。因此，泳道可以包含额外的组分，诸如所需的尿素、清洁剂和还原剂，例如，参见Malloy等人的Anal.Biochem.280：1-10页(2000)。泳道本身可以包含一种IEF缓冲液，用于进一步分离已在第一维IEF缓冲液内积聚的生物分子。或者，包含IEF缓冲液的泳道通过向流动缓冲液中添加SDS可转变成含SDS的凝胶。因此，生物分子可以根据分子量进行第二维分离。

根据一个实施方案，将泳道预制成包含十二烷基磺酸钠(SDS)和聚丙烯酰胺凝胶。根据另一个实施方案，泳道的长度夹在两个生物分子不渗透层之间。根据另一个实施方案，如果泳道包含SDS和聚丙烯酰胺凝胶，则泳道可以夹在矩阵的一层和另一个层之间，其中两个层可以是生物分子不渗透的和离子不渗透的，只要电场可以穿透泳道和指导电场沿着泳道方向远离IEF缓冲液，例如，参见图16。

泳道可以通过手工或使用各种装置形成。例如，可将丙烯酰胺溶液和聚合剂装料于一种装置内(“矩阵式打印机”)，该装置将泳道置于阵列上的期望位置内，例如，参见图26。改进的办公喷墨式打印机是一个例子。这些装置可以并入本发明的自动化系统内。

除了常规丙烯酰胺/双-丙烯酰胺溶液或琼脂糖溶液之外，可使用各种单体制造供本发明的第一维和/或第二维梯度之用的凝胶。已知在常规的化学聚合凝胶内使用甲基丙烯酸羟乙酯及其它低分子量丙烯酸酯型化合物作为单体；这些单体在商业上称作“Lone-Ranger”凝胶。用一种或多种丙烯酸酯型基团取代的聚合物的使用也已在文献(Zewert和Harrington，Electrophoresis 13：824-831页(1992))中有描述，其特别适用于在水与可混溶的有机溶剂如醇或丙酮的混合溶剂内的分离。形成凝胶的单体还可以是含有光可聚合活性基团的任何基本上为水溶性的分子与可形成交联的材料的组合，条件是组合一旦聚合，就可形成适用于特定类型电泳法的凝胶。

示例的材料包括与亚甲基双丙烯酰胺或其它已知交联剂结合的丙烯酰胺；甲基丙烯酸羟乙酯和丙烯酸、甲基丙烯酸和其烷基取代衍生物如巴豆酸的低分子量(小于约300道尔顿)衍生物；乙烯基吡咯烷酮和其它低分子量乙烯基和烯丙基化合物；非离子聚合物的乙烯、烯丙基、丙烯酸和甲基丙烯酸衍生物，包括琼脂糖(“Acrylaide”交联剂，FMCCorp.)的这些衍生物、右旋糖酐及其它多糖和衍生物，如包括羟乙基纤维素的纤维素衍生物；聚乙烯醇；乙二醇的单体、寡聚和聚合衍生物，包括环氧乙烷、环氧丙烷、环氧丁烷的聚合物及其共聚物；其它水相容性聚合物的丙烯基、乙烯基或烯丙基衍生物，如聚HEMA(聚丙烯酸羟乙酯)、聚合N-异丙基丙烯酰胺(其对温度敏感)、马来酸聚合物和共聚物、部分水解的EVAC(乙烯与醋酸乙烯酯的聚合物)、乙亚胺、聚氨基酸、多核苷酸和这些化合物的亚单位彼此形成的共聚物和这些亚单位与更疏水的化合物如吡啶、吡咯烷酮、恶唑烷、苯乙烯和羟酸的共聚物。可聚合材料不必是完全水溶的，特别是在形成凝胶的溶液中含有溶剂或表面活性剂时。

制造普通聚合物的可聚合衍生物的方法在本领域是已知的，例如，已知向羟基中添加烯丙基缩水甘油醚，其为用酸、酸酐或酰氯如丙烯酸酐使羟基酯化。胺可容易地用酰基酸酐或氯化物进行衍生化。上述的许多衍生化聚合物将含有一个以上的活性基团，因此是自身交联的。需要添加每分子含有平均一个以上活性基团的交联剂，以从仅具有一个活性基团如丙烯酰胺的单体形成凝胶。除了多重衍生化聚合物之外，这些交联剂包括亚甲基双丙烯酰胺、二丙烯酸乙二醇酯及其它具有一个以上烯键的不饱和官能度如丙烯基、乙烯基或烯丙基的小分子。

候选的非丙烯酰胺单体可以包括，例如，烯丙醇、HEMA((甲基)丙烯酸羟乙酯)、单丙烯酸聚乙二醇酯、双丙烯酸聚乙二醇酯、单丙烯酸乙二醇酯、双丙烯酸乙二醇酯、乙烯基己内酰胺、乙烯基吡硌烷酮、烯丙基缩水甘油基右旋糖酐、聚乙烯醇和纤维素及其衍生物的烯丙基缩水甘油基衍生物、醋酸乙烯酯和含有一个或多个丙烯基、乙烯基或烯丙基的其它分子。

本发明的IEF/泳道单位是IEF缓冲液或包含IEF缓冲液的单元和本发明泳道。在一个实施方案中，预制造IEF/泳道单位使得IEF缓冲液与泳道接触，例如，参见图16D。在另一个实施方案中，预制造IEF/泳道单位使得IEF缓冲液和泳道分离，但是可以使其彼此接触。例如，IEF缓冲液和泳道可以在矩阵内移动使得它们可以在期望时间强行结合。在另一个实施方案中，IEF缓冲液和泳道可以通过将它们连接到一起的凝胶塞相连接。当IEF缓冲液或单元与泳道连接时，IEF缓冲液或单元和泳道之间的连接必须可允许目的或所研究的生物分子迁移。

本发明的矩阵(或矩阵层)是固体材料或半固体材料，例如，陶瓷、玻璃、聚苯乙烯、聚(甲基丙烯酸甲酯)诸如Lucite或凝胶，其包含一个或多个单元和/或IEF/泳道单位。根据一个实施方案，形成矩阵的材料是弱导电的。根据另一个实施方案，矩阵部分地或完全地由生物分子不渗透的和离子不渗透的(BIA)材料制成，以与泳道长度接触。IEF/泳道单位可以设置于矩阵表面上，例如，作为凝胶，图15，矩阵B或C可以设置于蚀刻在矩阵层内的凹槽内或可以贯穿矩阵层，只要IEF缓冲液或单元可以与第一维内的流动缓冲液接触。根据本发明的一个实施方案，如果IEF缓冲液、单元或泳道贯穿矩阵，则与流动缓冲液接触的IEF缓冲液、单元或泳道的一个侧面被生物分子不渗透层覆盖。矩阵是可移动的或处于室内。

矩阵可以通过例如贯穿矩阵一侧向外通过矩阵对侧钻孔、用IEF缓冲液充满通道和用离子可渗透的、蛋白质可渗透膜封闭通道内开端而制造。或者，可以用与可固化成具有特定pH范围的凝胶的IEF缓冲液混合的聚合物，如琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶充满通道。矩阵内单元还可以通过产生一个或多个凹槽而制造，所述凹槽没有贯穿矩阵对侧，例如图15，矩阵A或D。可以在矩阵的任何一侧制造凹槽。根据一个实施方案，凹槽位于矩阵的一侧。凹槽可以充满一种或多种IEF缓冲液。

根据本发明的一个实施方案，IEF缓冲液或单元被隔离，使得生物分子基本上从IEF缓冲液或单元通过流动缓冲液向另一个IEF缓冲液或单元迁移，而不是彼此间直接迁移。当单元从矩阵的一侧向矩阵的对侧贯穿时，它可以称为通道。矩阵内的通道可典型地彼此平行排列。根据一个实施方案，矩阵层包含多个相同取向的IEF/泳道单位。根据另一个实施方案，多个相同取向的IEF/泳道单位可以彼此平行排列和/或串联排列。根据另一个实施方案，预设计本发明的矩阵或芯片，使其含有IEF缓冲液的单元子集，用于产生校准曲线或具有与从其它单元所得结果相比的标准，例如图15。根据另一个实施方案，可将本发明的矩阵或芯片预制成包含预选组的IEF缓冲液的诊断工具，所述IEF缓冲液的pH值与已知目的生物分子(例如，病态的生物分子标记物)的pI或系列指示病态的生物分子相对应。

本发明的校准曲线用于检测样品内靶生物分子(“TB”)的量。通过混合已知浓度的已知生物分子或包含已知生物分子的复合体和评价具有适当IEF缓冲液的单元内已知生物分子或复合体的聚集而产生定量的校准曲线。优选地，如果TB和/或靶识别分子(“TRM”)是市售的或可容易地获得，市售或容易获得的TB用作已知的生物分子或与市售或容易获得的TRM接触以形成用于校准曲线的复合体。已知的生物分子可以进行标记或可以存在于被标记的复合体内。优选地，在产生校准曲线和检测样品期间使用相同的标记。添加到流动缓冲液中的已知生物分子或复合体的浓度可以根据其聚集的单元中的信号量绘图。该图可用作一种基于生物分子聚集的单元的信号量而外推出样品内的TB浓度的方法。例如，参见图29。

在复合体被分离到每个单元后，复合体可以进行第二维分析，即，在单元外分析。例如，第二维分析包括如SDS PAGE、质谱法和高效液相色谱法的分析方法。

第一维的电场将能进入IEF缓冲液内。只要电场可以进入通道内的IEF缓冲液，则电场和矩阵方向之间的角可以相互处于+90到-90度之间。在一个实施方案中，角是+90度。在本发明的另一个实施方案中，电流不是可逆的而是单向流过系统的，在系统中，IEF缓冲液和单元是非邻接的以及对目的生物分子能渗透的壁垂直于电流方向，样品直接加入到流动缓冲液。在另一个实施方案中，所述系统具有搅拌设备如磁力搅拌棒。在本发明的又一个实施方案中，实验过程中在流动缓冲液内产生的对流是搅动系统的唯一方式。

在一个实施方案中，为了样品的高通量筛选，可用的包含单元的矩阵为小芯片状结构。该芯片可由任何可进行微制的材料制造以得到需要的微型化表面特征，所述微制为，例如，干蚀刻、湿蚀刻、激光蚀刻或机制、制模或压花。该芯片可以是聚合物、陶瓷、玻璃及其复合材料和层压材料等。在本发明实践中，使用微制技术，如但不限于整体蚀刻、表面微细加工、厚膜工艺、激光烧蚀、激光蚀刻、制模和压花，使得在微刻度组件和结构的对准中高度精确，例如，E.W.Becker等人，(1986)，Microelectronic Engineering 4：35-56页。在一个实施方案中，该芯片包含多个单元，其中两个或多个单元具有不同的IEF缓冲液，例如，参见图11。在另一个实施方案中，单元子集的IEF缓冲液的pH值与其中包含TB的复合体聚集的单元的IEF缓冲液的pH值不同。

矩阵的尺寸可以是例如，1×1cm-10×10cm。根据一个实施方案，取决于泳道数目、长度和间距，矩阵是5×5cm或4×10cm。根据一个实施方案，矩阵的厚度是1mm。

本发明的阵列是另外包含第二层的矩阵。第二层通常起到覆盖泳道的一面的作用，以防止样品内相当量的生物分子在IEF分离步骤期间停留在泳道内，而使得电场在第二维步骤期间穿透泳道。因此，第二层包含长度和宽度与泳道的长度和宽度相同或更大的泳道筛选区域(LSA)，其中LSA是生物分子不可渗透的和离子可渗透的。第二层可完全由LSA材料制造或它可以被构建成具有部分与泳道尺寸相同的LSA材料。根据本发明的一个实施方案，LSA不是导电的。根据另一个实施方案，泳道夹在矩阵层和LSA之间。

生物分子不能渗透而离子可渗透的材料在本领域内是公知的，例如，玻璃纸、聚醚砜、尼龙、醋酸纤维素、聚偏氟乙烯(PVDF)、全氟化硫酸盐阳离子交换膜(例如，Nafion膜)和其它全氟化离子交换膜。

本发明的第二层可任选另包含贯穿第二层平面的穿孔。该穿孔的排列使得穿孔位于IEF缓冲液或包含IEF缓冲液的单元的上方。穿孔的作用是使样品内生物分子在IEF分离步骤期间可以到达IEF缓冲液或单元，例如，参见图16a和16b。第二层可以与矩阵分开、永久性连接在矩阵上或根本不与矩阵连接。本发明的阵列实施例可以参见图1 5B和16C和图17中“第二”和“矩阵”的结合。

本发明的室是包含流动缓冲液的容器，例如，参见图2。根据本发明的一个实施方案，室设计用来容纳小体积的流动缓冲液，即，使单元和电极接触所需的最小量的流动缓冲液，使得电场可以进入IEF缓冲液或单元和泳道。根据本发明的另一个实施方案，室外侧进一步包括连接器，以使电流通过室内到达电极。根据本发明的又一个实施方案，室是可处理的。

本发明的流动缓冲液是室内可传送电流的溶液，例如，流动缓冲液可以是0.01M K₂SO₄。流动缓冲液可包含其它试剂，例如，可用于保持生物分子的活性和/或稳定性的试剂如蛋白酶抑制剂或洗涤剂。在第一维中使用的流动缓冲液可任选被转换成与第二维步骤内相同或不同的缓冲液。或者，在第二维步骤中没有流动缓冲液存在。根据一个实施方案，对流动缓冲液优化其中的pH范围和目的生物分子可使复合体聚集在适当的单元中。可调整流动缓冲液到一个pH值，所述pH值可增加或减少进入IEF缓冲液或单元的生物分子的流动性。

本发明的用于指导电场通过IEF缓冲液或单元的装置可以，例如，包括阴极和阳极和电压电源的使用。根据一个实施方案，该装置能够产生交变电场。电极可以位于IEF缓冲液或单元的对侧，使得电场进入IEF缓冲液或单元。根据本发明的一个实施方案，电极是导线。根据本发明的另一个实施方案，电极是平行的导线或薄板组，例如，参见图2-6。该装置可以供给AC或DC电压。如果IEF缓冲液或单元处于封闭系统内(例如，电场不能进入IEF缓冲液或单元的一侧和到达IEF缓冲液或单元的对侧)，则装置能够指导电场进出IEF缓冲液或包含IEF缓冲液的单元是有利的(即，交变电场)。交变场的取向不必须垂直于阵列的平面或IEF缓冲液或单元的表平面。它相对于阵列平面可以为+90到-90度，始终保持与IEF缓冲液或单元轴平行的场分量。

根据一个实施方案，电极由铂或钛或镀有铂或钛的材料制成。根据本发明的一个实施方案，电极之间相隔0.5-10cm。根据另一个实施方案，电极间相隔5cm。根据另一个实施方案，电极之间的距离是最小距离，其仍然允许流动缓冲液循环穿过单元。根据另一个实施方案，电极相隔距离与矩阵相隔距离或单元长度近似相同。

施用到流动缓冲液的电压可以是DC或AC。如果IEF缓冲液或单元密闭的，外加电压是DC，则一定有一种方法用于手动或自动地交变电场方向，使得电场被指导而进出IEF缓冲液或单元。根据本发明的一个实施方案，电场方向可以是改变的，例如，通过手动或自动交换外加电压的极性或使恒定电场内的IEF缓冲液或单元旋转180度。根据一个更优实施方案，电压是AC。

用于使流动缓冲液同时循环穿过IEF缓冲液或单元的装置包括，例如，置于室内并通过磁性板控制的搅拌棒或本领域已知的其它循环液体用装置(例如，泵、振荡器，例如，压电振荡器、搅拌器、倾翻装置)，参见图2。在另一个实施方案中，循环用装置可以是使IEF缓冲液或单元相对于流动缓冲液移动的机械装置，例如，IEF缓冲液或单元可以在流动缓冲液内旋转。这些装置在本发明方法和系统内的第一维步骤(IEF步骤)期间是有用的。根据本发明，流动缓冲液或单元相对于流动缓冲液的循环促进目的生物分子高效率接触它们各自的IEF缓冲液或单元。或者，本发明的方法和系统可以缺乏这样的循环装置。在本发明的另一个实施方案中，循环可单独由等电聚焦期间自然产生的对流提供。根据本发明的一个实施方案，足以使生物分子循环的对流能源量是每1cm³流动缓冲液为10^-10焦耳。

用于指导电场沿着泳道长度远离IEF缓冲液或单元的装置可以包含几个不同组件的配置。该装置的作用是使IEF缓冲液内生物分子迁移进入泳道和沿着泳道方向迁移。因此，包括泳道分离的第二维内电场方向应该显著地远离IEF缓冲液和沿泳道方向。例如，一个电极可以位于IEF/泳道单位的一端(例如，位于IEF缓冲液的顶端)以及另一个电极位于IEF/泳道单位的另一端(例如，位于泳道的末端)。或者，一个电极可以位于泳道的末端而另一个电极可以是先前IEF分离步骤中所用的一种电极，参见图28。供给电压可以是DC。可以供给DC电流的电源供给和电极是市售的和本领域公知的。

本发明的系统包括几种可作为拆卸或组装的配套元件出售的组件。配套元件的组件包括：IEF缓冲液、单元、本发明的矩阵或阵列；和任选一种用于指导电场进出IEF缓冲液和单元和/或包含流动缓冲液的室的装置。该系统还任选包括一种用于指导电场沿泳道长度远离IEF缓冲液或单元方向的装置。该系统任选另包括一种用于使流动缓冲液循环穿过IEF缓冲液或单元的装置。本发明系统的实施例包括图17和图28。根据本发明的一个实施方案，室是可处理的并具有连接在室的底部或侧面的连接器以与电压供应接触。

本发明的系统可以另外包含以下任何一种：一种用于检测单元或泳道内样品生物分子的装置；一种用于接受来自检测装置数据的装置；和一种用于处理收到的数据的装置。根据一个实施方案，扫描微型光密度计检测、接受和处理来自单元或泳道的信号。

检测单元或泳道内样品中的生物分子、接收来自检测装置的数据和加工所收到的数据所需的一种或多种装置可以组合成为一个计算机。

检测装置可以用来将多个波长或一个波长的光谱的电磁辐射同时或顺序地投射到泳道上。根据一个实施方案，照明光源是单色的。例如，该检测装置可以是定制的光度计，其在窄光谱被投射到每个IEF缓冲液、单元或泳道上之后，可迅速、顺序地读取每个IEF缓冲液、单元或泳道在特定波长的吸收量度。或者，该检测装置可以用来同时读取每个IEF缓冲液、单元或泳道和/或采集与从每个IEF缓冲液、单元或泳道在几个波长处所发出的电磁辐射有关的读数。

根据生物分子是否被标记和标记类型，适当的检测装置包括但不限于裸眼、分光光度计探测仪器、化学发光探测仪器、光度计/光密度探测仪器、电化学探测仪器或放射化学探测仪器。该标记可需要其它组件来引发反应产生信号或增强根据以上方法可检测的信号。适当的信号产生系统的详细讨论可以参见Ullman等人的美国专利5,185,243第11-13栏，其作为参考引入本文。附加标记用技术的细节在本领域是公知的，例如，参见Matthews等人，Anal.Biochem.(1985)，151：205-209和Engelhardt等人，欧洲专利申请0302175。

根据本发明的一个实施方案，计算机包括一个模块，它能使计算机执行以下步骤：(a)接收来自泳道的试验数据和(b)产生代表样品内生物分子和/或样品内目的生物分子特征的图谱。这种模块可以用于迅速识别、分类和选择疾病中更多功能性地注释的靶药物。根据本发明的另一个实施方案，计算机含有一个模块，它能使计算机执行以下步骤：(a)接收来自泳道的试验数据并生成样品内生物分子的图谱；(b)接收参考数据图谱；和(c)计算两个图谱之间相似性的客观量度。参考图谱可以是本领域公知的值或是由研究员编程的值。

计算机可以与网络连接，所述网络可以属于与其它局部计算机系统连接的以太网、远程计算机系统或广域通信网络如因特网。网络链接使计算机与其它计算机链接共享数据和加工任务。共享数据通路特别适用于诊断、预诊断或一般研究目的基因或蛋白质组分析。例如，可以使用已知信息来预置计算机使其识别特定图谱(例如，蛋白质或核糖核酸表达模式)，该特定图谱表明特定的病态或对特定疾病的敏感性。然后，来自受试者的样品可以使用本发明的系统进行测试以确定样品内的生物分子是否显示相同的图谱。

此外，本发明的系统仍然可以另外包括以下组件中的至少一个、组合或全部：样品进料器、废物处理器、缓冲液进料器、染色剂进料器、阵列处理系统和显示器。本发明的样品进料器可以被编程来向室添加等份的样品。本发明的废物处理器可以被编程来在分析期间的任何时候除去废物(例如，其用后的流动缓冲液)。本发明的缓冲液进料器可以被编程来在分析期间的任何时候释放新的或不同的缓冲液。染色剂进料器可以被编程来释放和曝光生物分子于染色下一段时间。阵列处理系统可以被编程来在分析期间根据需要移动矩阵、阵列或室。本发明的显示器可以是提供与一维或两维分析结果有关信息的屏幕或其它的装置，例如，参见图27。

根据本发明的一个实施方案，该系统是完全或部分自动化的，使得一种或多种样品可用本发明的方法进行分析。例如，将样品添加到被编程用于执行所有一维或两维分析步骤的系统中，以收集泳道图像和接收、处理和测定是否存在具体生物分子或生物分子模式。

本发明系统可以被构建而具有额外的、自动的、相互作用组件，例如，用于使pH溶液或凝胶(固定化电解质、两性电解质混合物等)充满通道的滴定器和用于从IEF缓冲液、单元或泳道回收生物分子的提取器。根据一个实施方案，本发明系统是自动化的以用于样品、化合物或药物的高通量筛选。

本发明的生物分子包括任何存在于生物样品内带电荷的有机分子，如肽、蛋白质、低聚糖、脂质、甾体、前列腺素、环前列腺素和核酸(包括DNA和RNA)。如本文所用的术语“生物分子”包括未修饰、糖化、未糖化、磷酸化、未磷酸化的及其它修饰的生物分子。例如，本发明的生物分子可以在第一维分离之前被标记(例如，通过³⁵S甲硫氨酸标记或³²P-标记)。根据本发明的一个实施方案，生物分子为蛋白质。根据本发明的另一个实施方案，生物分子可以是人造的或天然存在的。根据本发明的又一个实施方案，蛋白质是肽，它的长度可以是，选自但不限于，小于500残基、小于300残基、小于200残基、小于100残基、小于50残基、小于25残基和小于15残基。

本发明的靶生物分子(“TB”)是通过靶识别分子(“TRM”)特异识别的目的生物分子。在一个实施方案中，靶生物分子是用于疾病或症状的标记物。靶生物分子对于样品可以是内原性或外原性，即被添加到样品或流动缓冲液中的生物分子。目的生物分子可以进行修饰，使得其是对TRM具有亲合力或更大亲合力的TB。例如，目的生物分子可以进行共价修饰以另外包括一种肽，所述的肽含有与TRM如抗体特异性结合的表位。

TRM是与部分TB特异性结合的分子。TRM可用于提供或放大探测用信号和/或提供区别于背景的信号。例如，TRM可以是特异性识别TB，如单价的(单表位)或多价的(多表位)多克隆抗体、单克隆抗体或抗体片段(例如，Fab，Fv和F(ab′)2、Fab′等)的标记抗体。另外，只要能保持对特定靶生物分子的结合亲合力，如果合适，可以使用免疫球蛋白质或其片段的聚合体、聚合物和偶联体。当靶生物分子是抗体时，可使用与该抗体特异性结合的抗体。在另一个实施例中，当TB分别是受体或配体时，TRM可以是与TB结合的配体或受体。在又一个实施例中，当TB是核酸分子时，TRM可以是与TB特异性结合或杂交的单链核酸分子。或者，TRM可以是与核酸分子结合的核酸结合蛋白，诸如转录因子、剪接因子、组蛋白等。在又一个实施例中，当TB是酶时，TRM可以是与该酶的活性部位特异性结合的分子。

因此，TB和TRM可以选自多核苷酸，诸如m-RNA、r-RNA、t-RNA、DNA、DNA-RNA双链体；多核苷酸结合剂，诸如，但不限于限制性内切酶、激活剂、阻遏剂、核酸酶、聚合酶、组蛋白、修复酶、化疗剂；抗原和抗体；非免疫对，诸如抗生物素蛋白质和生物素；受体和配体，包括膜结合受体，诸如G蛋白受体(例如，毒蕈碱、肾上腺素能、前列腺素和多巴胺诸如D2受体)、酪氨酸激酶(胰岛素样IGF、表皮EGF、神经NGF、成纤维细胞FGF生长因素)、离子通道和T-细胞受体。

生物分子可以通过，例如，裸眼、分光光度法、化学发光法、光度计/光密度法、电化学法或放射化学法或通过表面细胞质基因组共振图像在检测用IEF分离步骤之前或第二维分离后标记。该标记物可以是可检测分子，诸如被标记的化合物、核酸或蛋白质(例如，抗体)或是内源性可检测的并能特异性识别生物分子。当生物分子在IEF分离步骤之前加以标签时，因为标记物的存在，生物分子的pI将可能改变，因此IEF缓冲液或单元的pH值将因此改变以俘获复合体，例如，参见2001年10月29日提交的美国临时专利申请60/340,698，其作为参考引入本文。生物分子可以在第二维分离之后通过本领域公知方法诸如，例如蛋白质印迹法标记。

几种用于生物分子的非特异染色剂在本领域是公知的并用于标记本发明的生物分子，例如，考马斯蓝、银染色、Hoechst染料和4′，6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)。所用的染色剂和标记物根据目的生物分子不同而不同。

可用于检测生物分子的标记可以包括荧光团、底物、电子转移试剂、辅酶、增强剂、酶、与酶产品反应的物质、催化剂、激活剂、辅助因子、抑制剂、清除剂、金属离子和对与产生信号物质结合所需的特异性结合物质。可用于本发明的荧光团的实例包括荧光素、花青染料、香豆素、藻红蛋白、藻胆蛋白、丹磺酰氯、异硫氰酸酯、若丹明化合物、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二甲醛和荧光胺和得克萨斯红。适当的标记物包括，作为例证而非限制，酶，诸如碱性磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(“G6PDH”)和辣根过氧化物酶；促进剂；染料；场致发光的标记物，诸如钌螯合物；化学发光剂，诸如异鲁米诺；敏化剂；辅酶；酶底物；放射性同位素，诸如¹²⁵I、¹³¹I、¹⁴C、³H、⁵⁷Co和⁷⁵Se。适当的酶和辅酶在Litman等人的美国专利4,275,149，第19-28栏；和Boguslaski等人的美国专利4,318,980，第10-14栏中描述；适合的荧光剂和化学发光剂在Litman等人的美国专利4,275,149，第30-31栏中描述，其作为参考引入本文。

根据一个实施方案，针对目的生物分子研发的抗体用荧光团标记。根据一个实施方案，荧光团选择在特定波长具有高吸光系数或高荧光收率。

根据一个实施方案，无标记检测(例如，表面细胞质基因组共振)可用于检测单一生物分子或复合体。例如，单元或矩阵可安置在室内的固相支持物，所述室已以某种方式得以生物素酰化，使得不同pH范围的单元位于一种或多种生物素分子上。靶生物分子或靶识别分子可与链亲和素结合进行修饰，然后被引入单元或流动缓冲液内。具有适当pI的复合体将扩散进入具有适当pH的一个或多个单元内，并将与存在的生物素分子形成第三复合体。这种结合可以通过固态支撑下方的表面细胞质基因组共振传感器检测，用所述探测方法检测和加工共振信号。

包括TB和TRM的复合体，其中复合体的组分彼此进行共价或非共价结合，可仅仅包括TB和TRM，或另外包含其它分子，诸如其它生物分子、金属离子、检测部分或标记。复合体的总pI值将指示该复合体是否在仪器的特定单元内或不在仪器的特定单元内聚集。如果在单一样品内有监测到多种目的复合体，则非常理想的是复合体不具有相同的pI值也不使用相同的标记。

本发明的样品是指任何得自任何活生物、由其排泄或分泌的固体或液体样品，包括单细胞微生物(如细菌和酵母)和多细胞生物(如植物和动物，例如脊椎动物或哺乳动物，特别是健康的或表面上健康的人类受试者或患有有待诊断或研究症状或疾病的的病人)。生物样品可以是得自任何部位的生物流体(例如，血液、血浆、血清、尿、胆汁、关节液、脑脊髓液、羊水、精液、子宫颈粘液、痰液、唾液、齿龈液、含水或玻璃体液、或任何的身体分泌物)、漏出液、渗液(例如，得自脓肿或任何其它的感染或炎症部位的液体)、或得自关节(例如，正常关节或患有疾病如类风湿性关节炎、骨关节炎、痛风或脓毒性关节炎的关节)的液体。

或者，样品可得自任何的器官或组织(包括活体解剖样品或尸体解剖样品)或可包含细胞(无论初级细胞或培养细胞)或由任何细胞、组织或器官制约的介质。如果需要，生物样品可以进行初步加工，包括初步分离技术。例如，细胞或组织可以进行提取和进行亚细胞分级分离，用于分离分析在截然不同的亚细胞组分内的生物分子，例如，在细胞的不同部分发现的蛋白质或药物。参见Deutscher(编辑)，Methods InEnzymology，182卷，147-238页(1990)(全文作为参考引入本文)。

本发明的矩阵、阵列、系统和方法通过使研究员检测不同的宽或窄的pH值范围用于迅速检测生物分子的pI。在本发明的一个实施方案中，样品内的目的生物分子可直接置于具有不同pH范围的多个单元内，并通过前述检测装置和系统手动或自动进行分析。在本发明的另一个实施方案中，样品内的目的生物分子可直接置于具有IEF缓冲液/单元或泳道的流动缓冲液内，并通过前述检测装置和系统进行手动或自动分析。

使用本发明的矩阵、阵列、系统和方法进行分类、分离、表征、定量和/或与其它分子进行比较的生物分子可以进一步通过本领域公知的方法和商业系统(例如，银染色、免疫染色、高效液相色谱法(HPLC)、亲和色谱法、毛细管电泳、聚丙烯酰胺电泳法、SDS-PAGE、离心法、梯度凝胶电泳、等电聚焦技术、切除含蛋白质区域继之以本领域公知的其它分析方法，如质谱分析，例如质谱法(PE Biosystem、PerSeptiveDE-STR MALDI-TOF-MS和Bruker Esquire Ion-Trap MS))进行评价。与传统IEF聚焦继之以MALDI TOF光谱测定法不同，本发明可检测少量的生物分子。例如，本发明能够使用银染色检测10-200kD标准范围内的低10^-15摩尔量的蛋白质、高10^-18摩尔量的蛋白质或1-200pg的蛋白质。

根据一个实施方案，实现此的方法是使用5×5cm或更小的包含IEF缓冲液/泳道单位的矩阵进行小规模两维分析，将分离的生物分子与根据传统的较大IEF聚焦凝胶分离的生物分子进行比较，并用更小量分析以确定适当的待切除区域在传统IEF聚焦凝胶上的位置以通过另一种技术(例如，质谱)进一步分析。具有放大镜和定制切削器的专用刀架可以有助于切除含有目的生物分子的位置。切除部分内的蛋白质量可进行估计，例如，通过使用由本发明方法分离的已知量生物分子的染色而制备的光密度校准表进行估计。

因此，本发明通过质谱分析扩大了可检测的生物分子的范围，并能分析在细胞内倾向于低水平表达的蛋白质。因此，可以通过质谱分析检测和观察亚微微克量范围内的蛋白质。本发明提供了一种用于观察生物分子的pI值及其质量的精确和重现性的方法。

当得自血液或组织样品的样品内蛋白质进行本发明方法时，疾病特异蛋白质可以在一维和两维内分离，并且泳道内的那些蛋白质可以通过本领域公知方法进行评价(例如，银染色。免疫染色。高效液相色谱法(HPLC)、亲和色谱法、毛细管电泳、聚丙烯酰胺电泳法、SDS-PAGE、离心法、梯度凝胶电泳、等电聚焦技术、切除含蛋白质区域继之以本领域公知的其它分析方法，例如质谱分析等)。

使用本发明的方法，一种或多种生物分子可根据pI加以聚焦、分类、分离、纯化、表征、定量和/或与其它生物分子进行比较。生物分子的浓度可以在样品内增减，或对于一个事件的响应而进行物理修饰。例如，本发明的方法和系统可以定量地和/或定性地监测生物分子对病态、药物治疗、生活周期或其它刺激的响应的改变。例如，在用刺激物处理蛋白质或蛋白质周围环境之前或之后，可监测蛋白质或蛋白质水平的磷酸酯修饰。本发明的系统和方法可用于观察用刺激物处理后的蛋白质在具有不同pH值单元内的聚集。

来自相对于非患病动物或植物的动物或植物的样品内蛋白质的异常表达可以作为特定疾病的标志。生物分子的相对丰度可以与标准图形进行进行比较用以诊断或预诊断疾病(例如，癌症)。细胞内生物分子的相对丰度可以通过在分离前向样品内引入已知量的特殊蛋白质和将光密度测量值与添加蛋白质的光密度进行比较而标准化。在供选择的实施方案中，在与正常动物或植物相比较的实验动物或植物内生物分子物理性质的出现或消失或变化可用于诊断或预诊断患病状态。在又一个实施方案中，在与正常动物或植物相比较的实验动物或植物内生物分子的修饰可以用于诊断或预诊断患病状态。

本发明的患病状态是任何可以通过样品内生物分子的改变(例如，糖尿病受试者体内的血红蛋白)或生物分子的缺失或增加(例如，来自细菌传染的蛋白质)来检测的疾病。例如，以下遗传性疾病可以通过在DNA或蛋白质水平的改变进行诊断：亨庭顿氏疾病、前列腺癌、Fragile X综合征A型、萎缩性肌强直I型Kennedy氏疾病、Machado-Joseph疾病、dentatorubral和pallidolyusian萎缩以及脊髓-延髓肌肉萎缩。该疾病或症状也可与基因如编码BRCA1、BRCA2、APC的基因；编码dystrophin的基因、β-球蛋白、因子IX、因子VIIc、鸟氨酸-d-氨基转移酶、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶、或囊性纤维化跨膜受体(CFTR)；或原癌基因有关。可进行监测的蛋白质的实例是用于前列腺癌的前列腺特异抗原(PSA)和用于心脏病的心脏酶。或者，可以监测一组蛋白质。在本发明的又一个实施方案中，可以分析特异mRNA浓度图以确定潜在的病态。

在又一个供选择的实施方案中，样品可得自细胞培养物或无细胞的体外试验。例如，在细胞组分用药物或其它刺激物干扰之前或之后，得自包括使用细胞组分的试验的样品可以进行本发明的一维或两维分析。在本发明的另一个实施方案中，得自发展的有机体或得自受试者组织的提取物可进行分析以理解在生活周期过程中发生在有机体或动物内的变化。例如，可以识别的化合物是生物学事件的抑制剂、增强剂或引发剂。在所有这些试验中，在将刺激物施用到提取物、受试者或待检测有机体上之后，可以向提取物中添加TB和TRM。在一个实施方案中，也考虑了一种用于候选分子，包括蛋白质和化合物的高通量筛选的方法，所述侯选分子可引起包括使用本发明的系统或方法检测样品内TB步骤的生物学事件。

根据本发明的一个实施方案，在将包含TB的样品添加到流动缓冲液之前或之后可以向样品内添加TRM。根据本发明的一个实施方案，在样品被添加到流动缓冲液之前向样品内添加TRM。在所有情况下，最希望使TB和TRM在不会抑制或破坏它们彼此结合的条件下彼此暴露。

术语蛋白质组(proteome)是指所有通过基因组表达的蛋白质。蛋白质组学(proteomics)包括识别和研究体内蛋白质和确定它们在生理学和病理生理学功能中的作用。本发明的方法、矩阵、阵列和系统能使用于监测蛋白质组的技术更迅速和更敏感。使用本发明，可以开发细胞活动的更详细和精确的功能蛋白质组图，以更好地理解疾病和发现新的药物。

本文使用的术语“监测”包括连续测量和终点测量。在某些实施方案中，样品的生物分子进行连续测量。在其它实施方案中，生物分子在细胞或受试者被刺激或干扰(例如，通过添加药物，或细胞或受试者周围环境改变)之前或之后进行分析。在另外的其它实施方案中，生物分子在未受干扰的样品对照组内测量，几个实验组的细胞组分被测量并与对照组的细胞组分进行比较。也适用于本发明方法以检测生物分子对干扰的响应而改变的其它试验设计对于本领域的技术人员是显而易见的。

本发明提供一种用于使样品内的生物分子彼此远离的分类方法。根据本发明的一个实施方案，将包含生物分子的样品添加到本发明的系统内，并循环穿过IEF缓冲液或单元、暴露于进出IEF缓冲液或单元的交变可逆电场下；然后，任选在第二维中进行分离，例如，将生物分子暴露于被指导沿泳道方向而远离IEF缓冲液或单元的电场。

本发明提供一种用于表征样品内生物分子的方法。根据本发明的一个实施方案，目的生物分子在一维中进行分离、制备和/或分析的方法是将样品添加到本发明的IEF仪器内的流动缓冲液中，产生电场，使流动缓冲液循环并周期改变电场方向。或者，可将样品直接添加到单元、通道或泳道内。根据本方法的另一个实施方案，将包含生物分子的样品添加到本发明的系统内并使其循环穿过IEF缓冲液或单元，暴露于进出IEF缓冲液或单元的交变电场下；在第二维中进行分离，例如，通过将生物分子暴露于被指导沿着泳道方向而远离IEF缓冲液或单元的电场下，然后确定泳道内生物分子的位置或量。泳道内生物分子位置或量的识别可以用于测量生物分子的pI、生物分子的分子量和/或其修饰状态。试验样品内生物分子位置的改变与对照样品内相同生物分子进行比较可以表示出该生物分子的修饰(例如，磷酸化作用等)。试验样品内生物分子与对照样品内相同生物分子进行比较，量的改变可表示被检测生物分子的量由于如生物分子表达或生物分子稳定性改变所引起的增加或减小。

本发明提供一种使用本发明的矩阵、阵列或系统定量分析样品内生物分子量的方法。本发明泳道内生物分子的量可以通过上述本领域公知仪器进行检测。或者，泳道内的生物分子可以与另一个可通过本领域公知仪器检测的分子结合。生物分子的量可以从用已知量的同样生物分子或类似的生物分子(用于蛋白质含量测定法的BSA)得到的标准曲线外推得到。泳道内的生物分子还可以从该泳道切除以分析和定量。

根据该方法的一个实施方案，监控一个生物分子。根据该方法的另一个实施方案，通过本发明的计算机监控多种生物分子。根据本发明的另一个实施方案，把相应于一种或多种目的生物分子的数据与没有疾病或不易患有此疾病的受试者(即正常受试者)的一种或多种目的生物分子的数据进行比较。最好是本发明的计算机能进行比较和计算两组数据之间的异同。计算机的参数可设置到一阈值，超过阈值就得到正或负的结果。

根据另一个实施方案，通过把包括目的生物分子的样品添加到系统的单元中，本发明的系统可用于使样品中的生物分子和/或离子除去而与目的生物分子远离。在这种情况下，单元内的IEF缓冲液具有的pH值包括目的生物分子的pI。因此，如果系统中施加可逆的电场和循环方式，其它的生物分子或离子便会从单元迁移出去，而目的生物分子留在单元内。目的生物分子可以从IEF缓冲液或单元中回收。或者，样品可被置于单元内并有电流单向通过IEF缓冲液或单元，该方向垂直于缓冲液或单元中生物分子可渗透的壁的平面。

本发明的受试者包括植物、动物或人。在一个实施方案中，受试者是人。

在说明书中，单词“包含”或如“包括”或“含有”等变体应理解为包括整数或整数组，然而并不排除任何其它的整数或整数组。

此处引用的所有参考、专利和专利申请被全文引用作为参考。美国临时申请No.60/305,802(2001年7月16日提交)、60/310,316(2001年8月6日提交)、60/340,698(2001年10月28日提交)和60/377,044(2002年4月30日提交)在此处被全文引用作为参考。

虽然提供了本发明的许多实施方案，很明显利用本发明的组成和方法可以改变基本结构得到其它的实施方案。因此本发明的范围包括此处和说明书所述的实施方案而不只是以下作为示例的具体实施例。

实施例1

分子量标准

在一薄的对-甲氧基甲基苯异丙胺(PMMA)板上刻有尺寸为0.1×0.1×3.0mm的凹槽。用10％SDS聚丙烯酰胺凝胶充满凹槽，在泳道的一端储存一丁点具有固定pH8.80(任意选择)的IEF缓冲液。把AmershamPharmacia Biotech(分子量为10到250kD)的100ng蛋白质阶梯标识物RPN 800注入到该点。把一金属电极连接到该固定pH梯度凝胶，而另一金属电极连接到远离pH的泳道末端。

把板浸入1％SDS 50mM的三甘氨酸缓冲液中(pH8.3)。将36伏特(电场约100v/cm)电压施加到电极上5分钟，然后泳道进行银染色和固定。图18是在显微镜下观察得到的分离条带的光学扫描。

实施例2

血浆蛋白在pH8.65±0.05的两维分析

pH值8.65±0.05、直径100微米的pH凝胶斑点(聚丙烯酰胺凝胶与缓冲溶液混合)被置于聚合物晶片上，如置于1cm×1cm×0.3mm的PMMA上。把晶片置于小室中，该小室包含搅拌棒并充满作为流动缓冲液的1M硫酸钠缓冲液。将100ng的血浆样品置于包含200ul流动缓冲液的室中。垂直于晶片平面施加50V的电压5分钟，电流方向每0.5分钟改变180度。然后，从流动缓冲液中取出晶片并用蒸馏水清洗。从晶片取下凝胶斑点并如实施例1所述置于板上泳道(10％SDS-PAGE)的一端。

把板浸入1％SDS 50mM三甘氨酸缓冲液(pH8.3)。在电极上施加36伏特的电压(电场约100v/cm)5分钟。然后，泳道进行银染色并固定。图19是血浆样品中蛋白质的光学扫描图，该蛋白质的等电点近似为8.65±0.05并通过泳道内的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳得到分离。泳道是在显微镜下观察的视野。

实施例3

血浆在pH7.50到8.50两维分析

(1)IEF缓冲液

制备五十份pH值为7.50到8.50、梯度为0.02pH单位的IEF缓冲液。

a. pH为7.50-7.68、10％聚丙烯酰胺的IEF缓冲液

25ml 0.1M N-2-羟乙基哌嗪-N-3-丙磺酸(N-2-hydrosyethylpiperisine-N-3-propan-sulfonic acid)(EPPS)(25,232g/L)与5克聚丙烯酰胺(Biorad)和下列体积的0.1M NaOH混合。在25℃用水使混合物的体积增加到50ml。

pH＝7.50	0.1M NaOH 5.9ml
		pH＝7.52	0.1M NaOH 6.1ml
pH＝7.54	0.1M NaOH 6.3ml
		pH＝7.56	0.1M NaOH 6.7ml
pH＝7.58	0.1M NaOH 6.9ml
		pH＝7.60	0.1M NaOH 7.0ml
pH＝7.62	0.1M NaOH 7.2ml
		pH＝7.64	0.1M NaOH 7.3ml
pH＝7.66	0.1M NaOH 7.4ml
		pH＝7.68	0.1M NaOH 7.5ml

b. pH为7.70-7.88、7％聚丙烯酰胺的IEF缓冲液

25ml 0.1M N，N-双(2-羟甲基)甘氨酸(BICINE)(16,317g/L)与3.5克聚丙烯酰胺凝胶(Biorad)和下列体积的0.1M NaOH混合。在25℃用水使混合物的体积增加到50ml。

pH＝7.70	0.1M NaOH 6.5ml
		pH＝7.72	0.1M NaOH 6.6ml
pH＝7.74	0.1M NaOH 6.7ml
		pH＝7.76	0.1M NaOH 7.9ml
pH＝7.78	0.1M NaOH 7.2ml
		pH＝7.80	0.1M NaOH 7.5ml
pH＝7.82	0.1M NaOH 8.7ml
		pH＝7.84	0.1M NaOH 8.0ml
pH＝7.86	0.1M NaOH 8.2ml
		pH＝7.88	0.1M NaOH 8.6ml

c. pH为7.90-8.26、10％聚丙烯酰胺的IEF缓冲液

50ml 0.1M三氨基甲烷(Tris)(12.114g/L)与7.0克聚丙烯酰胺凝胶(Biorad)和下列体积的0.1M HCl混合。用水使混合物的体积增加到100ml。

pH＝7.90	0.1M HCl 34.5ml
		pH＝7.92	0.1M HCl 34.3ml
pH＝7.94	0.1M HCl 34.1ml
		pH＝7.96	0.1M HCl 34.0ml
pH＝7.98	0.1M HCl 33.6ml
		pH＝8.00	0.1M HCl 36.5ml
pH＝8.02	0.1M HCl 33.2ml
		pH＝8.04	0.1M HCl 33.0ml
pH＝8.06	0.1M HCl 32.9ml
		pH＝8.08	0.1M HCl 32.7ml
pH＝8.10	0.1M HCl 32.5ml
		pH＝8.12	0.1M HCl 32.2ml
pH＝8.14	0.1M HCl 32.0ml
		pH＝8.16	0.1M HCl 31.8ml
pH＝8.18	0.1M HCl 31.7ml
		pH＝8.20	0.1M HCl 31.5ml
pH＝8.22	0.1M HCl 31.3ml
		pH＝8.24	0.1M HCl 31.2ml
pH＝8.26	0.1M HCl 31.1ml
		pH＝8.26	0.1M HCl 30.8ml

d. pH为8.30-8.50、8％聚丙烯酰胺的IEF缓冲液

100ml 0.04M 5，5-二乙基巴比妥钠(巴比妥钠)与8.9克聚丙烯酰胺凝胶(Biorad)和下列体积的0.2M HCl混合。

pH＝8.30	0.2M HCl 13.4ml
		pH＝8.32	0.2M HCl 13.1ml
pH＝8.34	0.2M HCl 12.9ml
		pH＝8.36	0.2M HCl 12.7ml
pH＝8.38	0.2M HCl 12.5ml
		pH＝8.40	0.2M HCl 12.1ml
pH＝8.42	0.2M HCl 11.7ml
		pH＝8.44	0.2M HCl 11.2ml
pH＝8.46	0.2M HCl 11.0ml
		pH＝8.50	0.2M HCl 10.74ml

IEF缓冲液分别与过硫酸铵混合并沉积在一薄Lucite芯片上成平行线，每个线的宽度和厚度为100微米、长度1厘米并具有不同的pH。放置IEF缓冲液的芯片的尺寸是1.2cm×1.2cm。

(2) 流动缓冲液

使5ml最终浓度为7M尿素、2.2M硫脲、1.1％(w/v)的四癸酰胺基丙基二甲基氨基丙磺酸盐(ASB14)、10％(w/v)二甲基乙酰胺(DMAc)、0.55mM乙二胺四乙酸(EDTA)的去离子蒸馏水(ddH₂O)的溶液在30℃于旋转台上混合30分钟直到溶解。如果溶解需要，则添加5ml的ddH₂O。然后，加入0.4g amberlite，溶液在32℃旋转10分钟。随后在不产生泡沫情况下使溶液通过0.45μm针筒式滤器。接着添加以下成分与水，直到最终浓度为2％柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH4.0)(w/v)，2mM三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)；2mM丙烯酰胺；1％甘油。最终体积为10ml。流动缓冲液一些组分的最终浓度为：7.7M尿素、2.2m硫脲、1.1％ASB14、11％DMAc、0.55mM EDTA。

流动缓冲液的pH用HCl调节到4.0。

(3) 第二维分离：等电聚焦步骤

为进行第一维分离(IEF)，将上述有IEF缓冲液沉积的芯片置于间隔1cm的两个电极之间的室中。室容量为2ml，然而，在这个步骤，它只用一定量的流动缓冲液充满，以使Lucite芯片的一端浸在流动缓冲液中，深度为0.2毫米。因此每一泳道端部的小区域，而非泳道的全部区域浸在流动缓冲液中。1微克人血浆蛋白混合物加入到流动缓冲液中，在芯片上施加电场。电场通过+80V到-80V和频率为1HZ矩形波形产生。在10分钟期间内，搅拌棒用于使血浆蛋白围绕室循环并与IEF缓冲液混合。

(4) 第二维分离：SDS-聚丙烯酰胺电泳法

在进行第一维分离之后，使芯片在间隔1.3cm的两个电极间的室内重新定向，浸在相同的流动缓冲液中，以使电极之间产生的电场与泳道平行，并且指导该电场远离泳道上的区域，而积聚在IEF梯度的蛋白质朝向泳道的相反端。向流动缓冲液加入3％SDS溶液使最后浓度为2％SDS流动缓冲液。在加入SDS之后立即用100V电压约5分钟产生电场。

在第二维分离之后，芯片浸在亚硝酸银溶液中并暴露于紫外线灯进行快速银染色。在银染色之后，通过商用办公扫描器(UMAX ASTRA2200)扫描芯片。扫描图像被数字化并扩大10倍(图7A)。图7B是使用传统等电聚焦方法、pI为7.50-8.50的人血浆银染色凝胶的光学扫描(从Swiss Data Base获得)。

图21A和21B中许多蛋白质的位置是相同的。图21A说明利用本发明的矩阵、阵列、系统和方法可得到比传统方法好得多的结果。两维IEF-SDS分析的分辨率和灵敏度改善许多。

实施例4

血浆在pH5.50到6.00的两维分析

(1)IEF缓冲液

制备二十五份pH值为5.50到6.00、梯度为0.02pH单位的IEF缓冲液。

a.pH为5.50-5.72、7％聚丙烯酰胺的IEF缓冲液

25ml 0.1M 2-N-吗啉乙磺酸(MES)(2-(N-morfolin)ethanolsulfonicacid)与3.5克聚丙烯酰胺凝胶(Biorad)和下列体积的0.1M NaOH混合。用水使混合物的体积增加到50ml。

pH＝5.50	4.4ml 0.1M NaOH
		pH＝5.52	4.8ml 0.1M NaOH
pH＝5.54	5.1ml 0.1M NaOH
		pH＝5.56	5.3ml 0.1M NaOH
pH＝5.58	5.5ml 0.1M NaOH
		pH＝5.60	5.7ml 0.1M NaOH
pH＝5.62	5.9ml 0.1M NaOH
		pH＝5.64	6.0ml 0.1M NaOH
pH＝5.66	6.4ml 0.1M NaOH
		pH＝5.68	6.35ml 0.1M NaOH
pH＝5.70	6.7ml 0.1M NaOH
		pH＝5.72	6.8ml 0.1M NaOH

b.pH为5.74-5.98、9％聚丙烯酰胺的IEF缓冲液

25ml 0.1M三羟甲基氨基甲烷-maleat(Tris-maleat)与9克聚丙烯酰胺(Biorad)和下列体积的0.2M NaOH混合。用水使混合物的体积增加到100ml。

pH＝5.74	7.8ml 0.2M NaOH
		pH＝5.76	7.9ml 0.2 MnaOH
pH＝5.78	8.1ml 0.2M NaOH
		pH＝5.80	8.2ml 0.2M NaOH
pH＝5.82	8.4ml 0.2M NaOH
		pH＝5.84	8.8ml 0.2M NaOH
pH＝5.86	9.3ml 0.2M NaOH
		pH＝5.88	9.8ml 0.2M NaOH
pH＝5.90	10.5ml 0.2M NaOH
		pH＝5.92	11.6ml 0.2M NaOH
pH＝5.94	12.0ml 0.2M NaOH
		pH＝5.96	12.5ml 0.2M NaOH
pH＝5.98	12.97ml 0.2M NaOH

IEF缓冲液分别与过硫酸铵混合并沉积在一薄Lucite芯片上成平行线，每个线的宽度和厚度为100微米、长度1厘米并具有不同的pH。沉积IEF缓冲液芯片的尺寸是1.2cm×1.2cm。

(2) 流动缓冲液

流动缓冲液与实施例3所述的相同。

(3) 第一维分离：等电聚焦步骤

为进行第一维分离(IEF)，上述有IEF缓冲液沉积的芯片被放置于间隔1cm的两个电极之间的室中。室容量为2ml，然而，在这个步骤，它只被用一定量的流动缓冲液充满，以使Lucite芯片的一端浸在流动缓冲液中，深度为0.2毫米。因此每一泳道端部的小区域而非泳道的全部区域浸在流动缓冲液中。1微克人血浆蛋白混合物加入到流动缓冲液中，在芯片上施加电场。电场通过+80V到-80V和频率为1HZ矩形波形产生。在10分钟期间内，搅拌棒用于使血浆蛋白围绕室循环并与IEF缓冲液混合。

(4) 第二维分离：SDS-聚丙烯酰胺电泳法

在进行第一维分离之后，将芯片在间隔1.3cm的两个电极间的室中重新定向，浸在相同的流动缓冲液中，以使电极之间产生的电场与泳道平行，并且指导该电场远离泳道上的区域，而积聚在IEF梯度的蛋白质朝向泳道的相反端。向流动缓冲液加入3％SDS溶液使最后浓度为2％SDS流动缓冲液。在加入SDS之后立即用100V电压约5分钟产生电场。

在第二维分离之后，芯片浸在亚硝酸银溶液中并暴露于紫外线灯进行快速银染色。在银染色之后，通过商用办公扫描器(UMAX ASTRA2200)扫描芯片。扫描图像被数字化并扩大10倍(图22B)。图22A是使用传统等电聚焦方法、pI为5.50-6.00的人血浆银染色凝胶的光学扫描(从Swiss Data Base获得)。

图22A和22B中许多蛋白质的位置是相同的。图22B说明利用本发明的矩阵、阵列、系统和方法可得到比传统方法好得多的结果。两维IEF-SDS分析的分辨率和灵敏度改善许多。

实施例5

使用阵列的两维分析

根据本发明构建一种阵列并用在两维分离中，该阵列包括一个IEF/泳道单位，

(1) 阵列

将含有2％SDS的10％聚丙烯酰胺凝胶放置在1mm厚的Lucite晶片上作为窄泳道。泳道尺寸为10mm长、0.1mm宽和50微米厚。用直径200微米、厚度100微米、具有环状穿孔的玻璃纸层覆盖泳道。玻璃纸层与泳道排成直线以使环状穿孔的位于泳道的一端。

混合聚丙烯酰胺凝胶、pH7.00缓冲液和过硫酸铵形成7％聚丙烯酰胺凝胶制备IEF缓冲液。pH7.00缓冲液通过混合50ml的N-乙基吗啉盐酸盐(N-ethylmorfolin-HCl)(Sigma)与8ml 1M HCl和42ml水制备。在穿孔中放置一滴IEF缓冲液，并让其固化。

(2) 第一维分离：等电聚焦

将上述制备的阵列置于包含流动缓冲液(pH6.9)、搅拌棒和电极的室中。流动缓冲液由1μM K₂SO₄与HCl混合组成。把包括1微克人血浆蛋白的样品加入到流动缓冲液中。当流动缓冲液循环时产生电压为+30V到-30V、频率为1Hz的方形波形8分钟。

(3)第二维分离：SDS-PAGE

为进行第二维分离，沿泳道方向施加30V的DC电压5分钟。

在第二维分离之后，将阵列浸入亚硝酸银溶液使泳道染色。泳道在紫外线照射下进行银染色3分钟。

图23所示为放大的银染色晶片的光学扫描。暗色区域是染色的pI值约7.0的人血浆蛋白。

实施例6

使用三电极的两维分析

制备如实施例5所述的阵列

(1) 第一维分离：等电聚焦

将阵列置于包括流动缓冲液(pH6.9)、搅拌棒和三个电极的室中，流动缓冲液由1μM K₂SO₄与HCl混合组成。向流动缓冲液中加入包含1微克人血浆蛋白的样品。使用与阵列的平面平行的两个电极，在流动缓冲液循环时产生电压为+30V到-30V、频率为1Hz的方形波形8分钟。

(2) 第二维分离：SDS-PAGE

为了进行两维分离，沿泳道施加30V的DC电压5分钟。实现此目的的方法是从电源除去用于IEF步骤的电极之一，再把它附着在泳道的端，该端与IEF缓冲液相距最远，并激活电场等，图28。在这种情况下，虽然有一个与泳道不平行的不受欢迎的小电力，但仍有显著的更多的电力沿泳道远离IEF缓冲液方向而被施加，使得泳道中的蛋白质得到显著和有效地分离。

在进行等两维分离之后，把阵列浸入亚硝酸银溶液使泳道染色。泳道在紫外线照射下进行银染色三分钟。

图24表示已被放大的银染色晶片的放大光学扫描图。暗色区域是染色的pI值约7.0的人血浆蛋白。

实施例7

使用Lucite矩阵分离蛋白质混合组分

在矩形塑性(Lucite)板面上钻二十五个直径1mm、深2mm的孔，用2％琼脂糖凝胶充满。孔(以下称为“通道”)以格子样形式排列，彼此相距约3mm。每个通道的一面用市售尼龙膜(ICN Irvine Calif.)制成的蛋白质离子透明膜密封。

制备pH值与细胞色素C、脱氧血红蛋白、血红蛋白α₂β₂、C藻蓝蛋白、扁豆外源凝集素和铁蛋白(BioRad)的等电点相当的等电聚焦缓冲液。通过使甘氨酸、HEPES(N-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙烷磺酸)、三羟甲基氨基甲烷(THMAM)、柠檬酸、BICINE(N，N-双(2-羟甲基)甘氨酸)或β，β-二甲基谷氨酸与水混合制备通道缓冲液(以下称为“IEF缓冲液”)，并使用氢氧化钠、盐酸或磷酸氢二钠滴定每个IEF缓冲液。见下面表1。

表1.IEF缓冲液和相应蛋白质

缓冲液编号	IEF缓冲液浓度(水溶液)	蛋白质	蛋白质的pI	缓冲液中蛋白质的颜色
					1	50mM甘氨酸；14mM NaOH	细胞色素C	9.28±0.02	红色
2	50mMHEPES；12mM NaOH	脱氧血红蛋白	7.07±0.02	棕红色
					3	50mMTHMAM；44.6mM HCl	血红蛋白α+ 2β+ 2	7.2±0.04	红色
4	50mM柠檬酸；96mM Na2HPO4	C-藻青蛋白	4.65±0.02	蓝色
					5	50mMBICINE；18mMNaOH	小扁豆外源凝集素	8.2±0.07	无色
6	50mM DMGA；40mM NaOH	铁蛋白	4.6±0.05	红色

在矩阵中每个垂直系列的通道用3μl表1中的一种IEF缓冲液充满。充满的通道用透明的蛋白质离子膜密封(同上所述)。

将包括通道和IEF缓冲液的矩阵置于内部尺寸为宽50mm、高100mm和长50mm的室中的两个铂电极之间。每个电极与矩阵具有近似相同的尺寸，彼此约距5cm平行几何排列。室还包含50ml的0.01M K₂SO₄流动缓冲液，从而使矩阵和电极浸入流动缓冲液中。室中有搅拌棒，以确保流动缓冲液循环通过通道。室被置于磁力搅拌器上。

向室内的流动缓冲液中加入1微克任一种下列蛋白质：细胞色素C、脱氧血红蛋白、血红蛋白α⁺ ₂β⁺ ₂、C-藻蓝蛋白、扁豆外源凝集素和铁蛋白(BioRad)。当在25℃搅拌室中的蛋白时，施加100V DC的电压(E＝20V/cm)于电极2分钟，此后，电场的方向反转再施加2分钟。该过程重复5次。

每种蛋白质的蛋白质分类可通过蛋白质累积到垂直系列(列)的通道中的一种得以观察。通常，蛋白质分类在10分钟内完成。

实施例8

除了五个垂直系列通道中的每一列用下列的表1所述缓冲液充满之外：缓冲液6、缓冲液4和缓冲液3，如实施例7所述制备25个通道的矩阵。分别从左至右，参见图9。如实施例7所述，将矩阵置于含有流动缓冲液的室中。把1微克的铁蛋白、藻蓝蛋白(IEF标准的第一条带，目录号161-0310)、藻蓝蛋白(IEF标准的第二条带，目录号161-0310)和血红蛋白α⁺ ₂β⁺ ₂加入到流动缓冲液中。当在25℃搅拌室中的蛋白质时，施加100V DC(E＝20V/cm)的电压于电极上2分钟，此后电场方向反转再施加2分钟。这个过程重复5次。

每种蛋白质的蛋白质分类通过观察铁蛋白累积到第一垂直系列通道、藻蓝蛋白(第一条带)累积到第二垂直系列通道、藻蓝蛋白(第二条带)累积到第三垂直系列通道和血红蛋白α⁺ ₂β⁺ ₂累积到第五垂直系列通道。参见图9。阴性对照，即，第四垂直系列通道未显示任何的蛋白质累积。此外，在含有的pH值与蛋白质的等电点不相当的IEF缓冲液的通道中几乎无蛋白质累积或无蛋白质累积。通常，蛋白质分类在10分钟内完成。

实施例9

用于诊断糖尿病的方法

糖尿病的诊断标志是测试患者血液中糖化血红蛋白量的增加。血液中糖化血红蛋白的量可表示为糖化血红蛋白占总血红蛋白的百分数。因此，应测量糖化血红蛋白(HbAlc)和非糖化血红蛋白(HbAl)的浓度以用于诊断糖尿病。

使用传统的IEF凝胶电泳确定糖化血红蛋白和非糖化血红蛋白的pH分别为pH6.95和pH7.22。因此，制备包含两个pH，即pH6.95和pH7.22的隔室的诊断芯片。

通过在矩形的塑性(Lucite)板面上钻两个2mm直径、1毫米深的孔并用3％聚丙烯酰胺凝胶充满而制备芯片。孔(以下称为“通道”)彼此以约3mm间距排列。每个通道的一边用市售尼龙膜(ICN，Irvine CA)制成的透明蛋白质离子膜密封。

通过混合22.4ml的0.1M NaOH与50ml的0.1M KH₂PO₄并加水至总体积为100ml制备pH值为6.95的等电聚焦缓冲液。通过混合36ml的0.2M Na₂HPO₄与14ml的0.2M KH₂PO₄并加水至总体积为100ml制备pH值为7.22的等电聚焦缓冲液。IEF缓冲液与丙烯酰胺过硫酸盐混合。混合物被加入到分离通道内并在那里聚合。充满的通道用透明的蛋白质离子膜密封(同上所述)。

如图2所示，把芯片置于两个铂电极之间的分离室中。分离室的内部尺寸是宽50mm、高100mm和长50mm。每个电极的尺寸与矩阵大致相同并彼此相距约5cm平行几何排列。室还包含10ml的10％HEPES缓冲液(pH7.44)流动缓冲液，使得矩阵和电极浸入流动缓冲液中。室中有搅拌棒，以确保流动缓冲液循环通过通道。室被放置在磁力搅拌器上。电极连接到可反转极性的电源上。

用于形成校准曲线的糖化血红蛋白购自Abbot[N1A86-10]，非糖化血红蛋白H-3883购自Sigma[9008-02-0]。在制备用于校准曲线的每种混合物之前，测量若干浓度的糖化血红蛋白和非糖化血红蛋白的消光系数，以证实它们在校准曲线范围内保持恒定。参见，例如，如下的表1和图13。每种消光系数在两个数量级浓度内是恒定的。使用市售的Pharmacia生产的分光光度计LKB 2202进行测量。

浓度(Mole/L)	消光系数(任意单位)
		1E-6	0.015
3E-6	0.044
		4E-6	0.063
5E-6	0.077
		6E-6	0.092
7E-6	0.107
		8E-6	0.121
9E-6	0.138
		1E-5	0.151
2E-5	0.317
		3E-5	0.456
4E-5	0.611
		5E-5	0.748
6E-5	0.901
		7E-5	1.06
8E-5	1.196
		9E-5	1.377
1E-4	1.497

为生成校准曲线，将六个多元芯片暴露于具有不同比率的市售血红蛋白和糖化血红蛋白的混合物下，每个芯片具有两个单元，单元的pH分别为pH6.95和pH7.22。例如，将糖化Hb与非糖化Hb的混合物重新悬浮在恒定体积的HEPES-NaOH(pH7.5)中。参见表2。测量每个单元在610nm的吸收读数。通过糖化血红蛋白的吸收读数除以血红蛋白和血红蛋白的总吸收读数来计算吸收百分数。每种混合物中糖化血红蛋白的浓度百分数(X轴)通过用每种混合物中的已知摩尔浓度的糖化血红蛋白除以每种混合物中的糖化血红蛋白和非糖化血红蛋白已知摩尔浓度的总和计算得到。从计算数据绘制出糖化血红蛋白的吸收百分数对浓度百分数相关的直线。“x”表示由pH为6.95和pH为7.22的样品在校准曲线上的吸收读数计算得到的吸收百分数。样品中糖化血红蛋白占总血红蛋白的百分数从校准曲线外推得出。参见表2。

表2.使用不同浓度的HbAlc和HbAl的校正

浓度C1HbAlc(摩尔/升)	吸收(任意单位)	浓度C2HbAl(摩尔/升)	吸收(任意单位)	C1/(C1+C2)(％)	A1/(A1+A2)(％)
						1e-6	0.0157	1e-4	1.495	0.99	1.03
2e-6	0.037	7e-5	1.090	2.77	3.28
						4e-6	0.661	1e-4	1.5	3.8	4.22
5e-6	0.070	1e-4	1.461	4.76	4.57
						7e-6	0.111	9e-5	1.333	7.2	7.69
9e-6	0.141	1e-4	1.421	8.25	9.02

对于每个混合物，将10ul的样品加入到如上所述的包括芯片的室中，并置于150伏特10分钟。电场的方向每分钟反转1次。可以通过这一试验检测到血红蛋白在610nm具有强吸收。因此，检测糖化血红蛋白或非糖化血红蛋白不需要加入TRM或标记。

使用分光光度计分别测量在pH6.95和pH7.22的隔室内积聚的糖化血红蛋白和非糖化血红蛋白的光学吸收。结果表示为糖化血红蛋白占总血红蛋白的浓度百分数对吸收百分数(分别为X轴对Y轴)。参见图14。具体地，被测混合物中糖化血红蛋白的吸收百分数的计算通过得自pH6.95隔室的吸收读数除以pH6.95和pH7.22隔室的总吸收读数并乘以100。每种混合物的糖化血红蛋白的浓度百分数通过每种混合物中已知浓度的糖化血红蛋白除以每种混合物中糖化血红蛋白和非糖化血红蛋白已知浓度的总和得到。从计算数据绘制出糖化血红蛋白的吸收百分数对浓度百分数相关直线。参见图14。

然后，自患者采集血液样品。以500g离心血液。把10ul等份的上清液加入到包含如上所述的芯片的室中，并置于150伏特10分钟。如上所述计算样品中糖化血红蛋白的吸收百分数(“Y”值)。样品的糖化血红蛋白的浓度百分数从图14的直线用外推法得到为约5.2％。结果表明测试者患有糖尿病。这个百分数对于受控糖尿病人是典型的，但是该值比正常范围高3-4％。

实施例10

测定等电聚焦的收集效率的方法

将本发明的等电聚焦方法作为一种测量效率的方法用来分离蛋白质，把已知量的Alexa Fluor 594山羊抗小鼠IgG(重链和轻链，JacksonImmuno Research Laboratories，pI＝8.2)放入本发明系统的流动缓冲液中。该室包含“分离芯片”：直径100微米的单一通道，其总体积为1nl。每个通道具有pH范围为pH8.2±0.05pH单位的IEF缓冲液。通过向标准聚丙烯酰胺凝胶中混合三羟甲基氨基甲烷甘氨酸(pH8.2±0.05，Biorad，目录号161-0771)制备IEF缓冲液。

为了校准系统，把10,000、50,000、100,000、300,000、700,000和1,000,000个分子的上述IgG加入到丙烯酰胺中并分别在pH8.2通道内聚合。通过Zeiss Axiovert 200荧光显微镜测量它们的荧光，使用Axiovision 2.05定量确定荧光强度。得到的荧光标识物的荧光强度对浓度的校准曲线用于与实验荧光强度相比较。

然后，在上述系统中检测50,000、100,000、和1,000,000个分子的上述IgG。将每种量分别放入室内的流动缓冲液中。如上所述，对每种量在固定的分离条件下使用相同的分离芯片进行等电聚焦(在30VDC电流下，通过处于0.1ml的三羟甲基氨基甲烷甘氨酸缓冲液(pH4.8)中的窄pH通道，分离10分钟)。在每次实验之后，用Zeiss Axiovert 200荧光显微镜测量荧光强度并与校准结果进行比较。

结果显示所述方法的收集效率接近100％，相关系数r＝0.9999，表明几乎所有的蛋白质在10分钟的实验时间内被分离到各自的pH室中。参见图29。S拟合值是45.85。横坐标代表在校准操作内测量的荧光值，而纵座标代表等电聚焦操作后获得的荧光值。数字代表样品中蛋白质分子的总数，表明在窄pH通道内进行的等电聚焦的高灵敏度。

Claims (189)

1.一种矩阵层，其包括隔离的等电聚焦(IEF)缓冲液或含有IEF缓冲液的隔离单元，其中IEF缓冲液的pH范围为0.1pH单位或更小。

2.权利要求1的矩阵层，其中IEF缓冲液或含有IEF缓冲液的单元的pH范围为0.02pH单位或更小。

3.权利要求1的矩阵层，其中矩阵层包括多个隔离的等电聚焦(IEF)缓冲液或含有IEF缓冲液的隔离单元。

4.权利要求3的矩阵层，其中IEF缓冲液或单元的pH梯度为0.1pH单位或更小。

5.权利要求4的矩阵层，其中pH梯度为0.02pH单位或更小。

6.权利要求1的矩阵层，其中除了一面以外，IEF缓冲液或单元的所有面为生物分子不可渗透区域，并任选为离子不可渗透区域。

7.权利要求3的矩阵层，其中除了一面以外，多个IEF缓冲液或单元的所有面为生物分子不可渗透区域，并任选为离子不可渗透区域。

8.一种系统，其包括：

(a)包含流动缓冲液的室；

(b)IEF缓冲液或包含IEF缓冲液的单元；

(c)用于产生进出IEF缓冲液或者单元的交变电场的装置；和任选

(d)用于使流动缓冲液循环穿过IEF缓冲液或者单元的装置。

9.权利要求8的系统，其中IEF缓冲液的pH范围为0.1pH单位或更小。

10.权利要求9的系统，其中IEF缓冲液的pH范围为0.02pH单位或更小。

11.权利要求8-10中任一项的系统，其中系统包括多个IEF缓冲液或包含IEF缓冲液的单元。

12.权利要求11的系统，其中多个IEF缓冲液或单元彼此隔离。

13.权利要求11的系统，其中多个IEF缓冲液或单元的pH梯度为0.1pH单位或更小。

14.权利要求11的系统，其中多个IEF缓冲液或单元的pH梯度为0.02pH单位或更小。

15.权利要求8的系统，其中系统进一步包括用于使流动缓冲液循环穿过IEF缓冲液或单元的装置。

16.权利要求11的系统，其中多个IEF缓冲液或单元当被排列成与电场平行的直线时彼此隔离。

17.权利要求11的系统，其中多个IEF缓冲液或单元彼此平行排列并与电场方向平行。

18.权利要求11的系统，其中多个单元被嵌入矩阵内。

19.权利要求11的系统，其中多个IEF缓冲液或单元形成可分离成相互连接的单元链的矩阵。

20.权利要求8的系统，其中IEF缓冲液或单元的长度为0.1mm到2.0mm。

21.权利要求8的系统，其中IEF缓冲液或单元的长度为2mm。

22.权利要求8的系统，其中IEF缓冲液或单元的宽度为0.1mm到2.0mm。

23.权利要求8的系统，其中IEF缓冲液或单元的宽度为1mm。

24.权利要求8的系统，其中IEF缓冲液包含缓冲剂。

25.权利要求8的系统，其中IEF缓冲液在电场中形成窄的pH梯度。

26.权利要求11的系统，其中多个IEF缓冲液或单元具有多个彼此相比不同的pH范围。

27.权利要求11的系统，其中单元的壁对生物分子和离子是可渗透的。

28.权利要求8的系统，其中除了一面以外，IEF缓冲液或单元的所有面是生物分子不可渗透区域，并任选为离子不可渗透区域。

29.一种用于对样品中的生物分子进行等电聚焦的方法，其包括下列步骤：(1)将样品置于被指导进出IEF缓冲液或包含IEF缓冲液的单元的交变电场下，和任选使包含生物分子的流动缓冲液循环穿过IEF缓冲液；和

(2)在IEF缓冲液中俘获生物分子。

30.一种表征样品中生物分子的方法，其包括下列步骤：

(1)将样品置于被指导进出IEF缓冲液的交变电场下，和任选使包含样品的流动缓冲液循环穿过IEF缓冲液；和

(2)使IEF缓冲液中的生物分子与得自另一样品的生物分子进行比较。

31.一种定量测定样品中生物分子的方法，其包括下列步骤：

(1)将样品置于被指导进出IEF缓冲液的交变电场下，和任选使包含样品的流动缓冲液循环穿过IEF缓冲液；和

(2)测定IEF缓冲液中生物分子的量。

32.一种测定样品中生物分子存在或不存在的方法，其包括下列步骤：

(1)将样品置于被指导进出IEF缓冲液的交变电场下，和任选使包含样品的流动缓冲液循环穿过IEF缓冲液；和

(2)测定生物分子是否存在于IEF缓冲液中。

33.一种诊断或预诊断受试者的病态的方法，其包括下列步骤：

(1)将含有受试者生物分子的样品置于被指导进出IEF缓冲液的交变电场下，和任选使包含样品的流动缓冲液循环穿过IEF缓冲液；和

(2)使进行步骤1的生物分子与得自没有疾病或不易患有此疾病的正常受试者的样品的生物分子进行比较。

34.权利要求33的方法，其中通过将得自正常受试者的样品置于被指导进出IEF缓冲液的交变电场下，和任选使包含生物分子的流动缓冲液循环穿过IEF缓冲液而制备得自正常受试者的生物分子。

35.一种制备生物分子的方法，其包括下列步骤：

(1)通过产生进出IEF缓冲液的交变电场，和任选使包含生物分子的流动缓冲液循环穿过IEF缓冲液而在IEF中俘获生物分子；和

(2)回收生物分子。

36.一种分类生物分子的方法，其包括下列步骤：把包含生物分子的样品加入到权利要求8-14中任一项的系统内的流动缓冲液中，产生交变电场，和任选使流动缓冲液循环穿过IEF缓冲液。

37.一种诊断或预诊断受试者的病态的方法，其包括下列步骤：

(1)把包含生物分子的样品加入到权利要求8-14中任一项的系统内的流动缓冲液中，产生交变电场，和任选使流动缓冲液循环穿过IEF缓冲液；和

(2)使IEF中得自受试者的生物分子与得自没有疾病或不易患有此疾病的正常受试者的样品的生物分子进行比较。

38.权利要求33的方法，其中通过把包含得自正常受试者的生物分子的样品加入到权利要求8-14中任一项的系统内的流动缓冲液中，产生交变电场，和任选使流动缓冲液循环穿过IEF缓冲液而制备得自正常受试者的生物分子。

39.权利要求36的方法，其进一步包括将生物分子置于第二维分析的步骤。

40.权利要求39的方法，其中第二维分析通过生物分子的质量进行。

41.权利要求40的方法，其中第二维分析通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)进行。

42.权利要求40的方法，其中第二维分析通过质谱、毛细管电泳和液相色谱进行。

43.权利要求39的方法，其进一步包括选自以下的步骤：

(a)  比较第二维分析中生物分子与第二维分析中另一生物分子的存在；

(b)  测定第二维分析中生物分子的量；

(c)  测定第二维分析中是否存在生物分子；和

(d)  回收第二维分析中的生物分子。

44.一种包含隔离的IEF/泳道单位的矩阵层，其中IEF/泳道单位包括：

(a)  隔离的等电聚焦(IEF)缓冲液或包含IEF缓冲液的隔离单元；和

(b)  泳道，

其中IEF缓冲液的pH范围为0.1pH单位或更小。

45.权利要求44的矩阵层，其中IEF缓冲液的pH范围为0.02pH单位或更小。

46.权利要求44的矩阵层，其中IEF缓冲液或单元与泳道接触或与泳道是可连接的。

47.权利要求44的矩阵层，其中矩阵层包括多个相同取向的IEF/泳道单位，以及其中每种IEF缓冲液或单元彼此隔离。

48.权利要求47的矩阵层，其中多个IEF缓冲液或单元的pH梯度为0.1pH单位或更小。

49.权利要求47的矩阵层，其中pH梯度为0.02pH单位或更小。

50.权利要求44的矩阵层，其中IEF/泳道单位沿其长度和宽度由生物分子不可渗透区域(BIA)支撑。

51.权利要求44的矩阵层，其中泳道包括十二烷基硫酸钠和聚丙烯酰胺凝胶。

52.权利要求51的矩阵层，其中泳道位于一个矩阵层和另一个矩阵层之间，其中两个矩阵层都是生物分子和离子可渗透的。

53.一种包含矩阵层和第二层的阵列：其中矩阵层包括IEF/泳道单位和生物分子不可渗透区域(BIA)，

其中IEF/泳道单位包括：

(a)  IEF缓冲液或包含缓冲液的单元；和

(b)  泳道，

其中BIA越过其长度和宽度与泳道接触；

其中第二层包括长度和宽度与泳道相同或更大的泳道筛选区域(LSA)，其中LSA是离子可渗透的和生物分子不可渗透的；和

其中泳道位于矩阵层和LSA之间。

54.权利要求53的阵列，其中IEF缓冲液或单元与泳道接触或与泳道是可连接的。

55.权利要求53的阵列，其中第二层进一步包括垂直于第二层平面的穿孔，其中穿孔的排列使得穿孔位于IEF缓冲液或单元的上方。

56.权利要求53的阵列，其中IEF缓冲液或单元的pH范围为0.1pH单位或更小。

57.权利要求56的阵列，其中pH范围为0.02pH单位或更小。

58.权利要求53的阵列，其中矩阵层包括多个相同取向的IEF/泳道单位，以及其中第二层包括多个LSA，其排列使泳道位于矩阵层和LSA之间。

59.权利要求58的阵列，其中多个IEF缓冲液或单元彼此隔离。

60.权利要求59的阵列，其中多个IEF缓冲液或单元没有重叠的pH范围。

61.权利要求58的阵列，其中两个或多个IEF缓冲液之间的pH梯度为0.1pH单位或更小。

62.权利要求61的阵列，其中两个或多个IEF缓冲液之间的pH梯度为0.02pH单位或更小。

63.权利要求53或58的阵列，其中IEF缓冲液或单元包括的pH范围是预先选择的以俘获目的生物分子。

64.权利要求58的阵列，其中每个泳道的宽度选自20μm-1mm并且每个泳道的长度选自3-10mm。

65.权利要求58的阵列，其中每个泳道的宽度为100μm。

66.权利要求53的阵列，其中矩阵层的厚度为1mm。

67.权利要求53的阵列，其中第二层的厚度为100μm。

68.权利要求58的阵列，其中阵列的面积选自1×1cm到最大为10×10cm。

69.权利要求68的阵列，其中阵列的面积为5×5cm或4×10cm。

70.权利要求53的阵列，其中泳道包括十二烷基硫酸钠和聚丙烯酰胺凝胶。

71.权利要求53的阵列，其中第二层与矩阵层相连接。

72.权利要求53的阵列，其中LSA不是可导电的。

73.一种系统，其包括：

(a)包含流动缓冲液的室；

(b)包含隔离的IEF/泳道单位的矩阵层，其中IEF/泳道单位包括：

(i)IEF缓冲液或包含IEF缓冲液的单元；和

(ii)泳道；

(c)用于产生被指导进出IEF缓冲液或单元的交变电场的装置；

(d)用于指导电场沿泳道长度远离IEF缓冲液或单元方向的装置；和任选

(e)用于使流动缓冲液循环穿过IEF缓冲液或单元的装置。

74.权利要求73的系统，其中IEF缓冲液或单元与泳道接触或与泳道是可连接的。

75.一种系统，其包括：

(a)包含流动缓冲液的室；

(b)包含矩阵层和第二层的阵列；

其中矩阵层包括IEF/泳道单位和生物分子不可渗透区域(BIA)，

其中IEF/泳道单位包括：

(i)IEF缓冲液或包含IEF缓冲液的单元；和

(ii)泳道；

其中BIA越过其长度和宽度与泳道接触；

其中第二层包括长度和宽度与泳道相同或更大的泳道筛选区域(LSA)，其中LSA是离子可渗透的和生物分子不可渗透的；

其中泳道位于矩阵层和LSA之间；

(c)用于产生被指导进出IEF缓冲液或单元的交变电场的装置；

(d)用于指导电场沿泳道长度远离IEF缓冲液或单元方向的装置；和任选

(e)用于使流动缓冲液循环穿过IEF缓冲液或单元的装置。

76.权利要求73-75中任一项的系统，其中IEF缓冲液或单元的pH范围为0.1pH单位或更小。

77.权利要求76的系统，其中pH范围为0.02pH单位或更小。

78.权利要求73-75中任一项的系统，其中系统包括多个IEF/泳道单位。

79.权利要求78的系统，其中IEF/泳道单位中的IEF缓冲液或单元彼此隔离。

80.权利要求73-75中任一项的系统，其中IEF缓冲液或单元与泳道接触或与泳道是可连接的。

81.权利要求75的系统，其中第二层进一步包括垂直于第二层平面的穿孔，其中穿孔位于IEF缓冲液或单元的上方。

82.权利要求75的系统，其中第二层包括多个LSA，其排列使得泳道位于矩阵层和LSA之间。

83.权利要求78的系统，其中第二层进一步包括多个垂直于第二层平面的穿孔，其中穿孔位于多个IEF缓冲液或单元的上方。

84.权利要求73的系统，其中矩阵位于室中，使交变电场的方向垂直于矩阵层平面。

85.权利要求82的系统，其中多个IEF缓冲液或单元的pH范围彼此不重叠。

86.权利要求78的系统，其中多个IEF缓冲液或单元的pH梯度为0.1pH单位或更小。

87.权利要求86的系统，其中pH梯度为0.02pH单位或更小。

88.权利要求78的系统，其中每个泳道的宽度选自20μm-1mm并且每个泳道的长度选自3-10mm。

89.权利要求78的系统，其中每个泳道的宽度为100μm。

90.权利要求73或75的系统，其中矩阵层的厚度为1mm。

91.权利要求75的系统，其中第二层的厚度为100μm。

92.权利要求75的系统，其中阵列的面积为1×1cm到最大为10×10cm。

93.权利要求92的系统，其中阵列的面积为5×5cm或4×10cm。

94.权利要求73或75的系统，其中泳道包括十二烷基硫酸钠和聚丙烯酰胺凝胶。

95.权利要求75的系统，其中第二层与矩阵层相连接。

96.权利要求75的系统，其中LSA不是可导电的。

97.权利要求73或75的系统，其中系统进一步包括：

(1)用于检测泳道中样品的生物分子的装置；

(2)用于接受来自检测装置的数据的装置；和

(3)用于处理接收到的数据的装置。

98.权利要求73-75的系统，其中系统进一步包括扫描微型光密度计，用于检测、接收和处理来自多个泳道的信号。

99.权利要求98的系统，其中系统进一步包括选自下列装置中的任何一种：

(1)样品进料器，

(2)废物处理器，

(3)缓冲液进料器，

(4)染色剂进料器，

(5)阵列操作系统，和

(6)显示器。

100.权利要求75或78的系统，其是自动化的。

101.一种使样品中生物分子分类的方法，其包括下列步骤：

(1)使样品暴露于被指导进出IEF/泳道单位的IEF缓冲液的交变电场下，和任选使流动缓冲液循环穿过IEF缓冲液；和

(2)产生沿泳道远离IEF缓冲液方向的电场。

102.一种表征样品中生物分子的方法，其包括下列步骤：

(1)使样品暴露于被指导进出IEF/泳道单位的IEF缓冲液的交变电场下，和任选使流动缓冲液循环穿过IEF缓冲液；

(2)产生沿泳道远离IEF缓冲液方向的电场；和

(3)使泳道中的生物分子与得自另一样品的生物分子进行比较。

103.一种定量测定样品中生物分子的方法，其包括下列步骤：

(1)使样品暴露于被指导进出IEF/泳道单位的IEF缓冲液的交变电场下，和任选使流动缓冲液循环穿过IEF缓冲液；

(2)产生沿泳道远离IEF缓冲液或单元方向的电场；和

(3)测定泳道中的生物分子的量。

104.一种确定样品中生物分子存在或不存在的方法，其包括下列步骤：

(1)使样品暴露于被指导进出IEF/泳道单位的IEF缓冲液的交变电场下，和任选使流动缓冲液循环穿过IEF缓冲液；

(2)产生沿泳道远离IEF缓冲液方向的电场；和

(3)检测泳道中是否有生物分子存在。

105.一种诊断或预诊断受试者病态的方法，其包括下列步骤：

(1)使样品暴露于被指导进出IEF/泳道单位的IEF缓冲液的交变电场下，和任选使流动缓冲液循环穿过IEF缓冲液；

(2)产生沿泳道远离IEF缓冲液方向的电场以形成生物分子图形；和

(3)使泳道中的生物分子图形与得自没有疾病或不易患有此疾病的正常受试者的样品的生物分子图形进行比较。

106.权利要求105的方法，其中正常受试者的生物分子图形的制备方法是：

(1)使得自正常受试者的样品暴露于被指导进出IEF/泳道单位的IEF缓冲液的交变电场下，和任选使流动缓冲液循环穿过IEF缓冲液；

(2)产生沿泳道远离IEF缓冲液方向的电场以形成泳道中的生物分子图形。

107.一种诊断或预诊断受试者病态的方法，其包括下列步骤：

(1)使含有受试者生物分子的样品暴露于被指导进出IEF/泳道单位的IEF缓冲液的交变电场下，和任选使流动缓冲液循环穿过IEF缓冲液；

(2)产生沿泳道远离IEF缓冲液方向的电场；和

(3)使泳道内生物分子与得自没有疾病或不易患有此疾病的正常受试者的样品的生物分子进行比较。

108.权利要求107的方法，其中正常受试者的样品的制备方法是：

(1)使得自正常受试者的样品暴露于被指导进出IEF/泳道单位的IEF缓冲液的交变电场下，和任选使流动缓冲液循环穿过IEF缓冲液；

(2)产生沿泳道远离IEF缓冲液方向的电场。

109.一种用于对样品中的生物分子进行等电聚焦的方法，其包括下列步骤：把包含生物分子的样品加入到权利要求73-78中任一项的系统内的流动缓冲液中，产生进出IEF缓冲液或单元的交变电场和使流动缓冲液循环穿过IEF缓冲液或单元。

110.一种分离样品中生物分子的方法，其包括下列步骤：

(1)把包含所述生物分子的样品加入到权利要求73-78中任一项的系统内的流动缓冲液中；

(2)产生交变电场；和

(3)产生沿泳道远离IEF缓冲液或单元方向的电场。

111.一种表征样品中生物分子的方法，其包括下列步骤：

(1)把包含所述生物分子的样品加入到权利要求73-78中任一项的系统内的流动缓冲液中；

(2)产生交变电场；

(3)产生沿泳道远离IEF缓冲液或单元方向的电场；和

(4)测定泳道中生物分子的位置。

112.一种用于定量测定样品中生物分子的方法，其包括下列步骤：

(1)把包含所述生物分子的样品加入到权利要求73-78中任一项的系统内的流动缓冲液中；

(2)产生交变电场；

(3)产生沿泳道远离IEF缓冲液或单元方向的电场；和

(4)测定泳道中生物分子的量。

113.一种用于测定样品中生物分子存在或不存在的方法，其包括下列步骤：

(1)把样品加入到权利要求73-78中任一项的系统内的流动缓冲液中；

(2)产生交变电场；

(3)产生沿泳道远离IEF缓冲液或单元方向的电场；和

(4)测定泳道中是否存在生物分子。

114.一种用于诊断或预诊断受试者的病态的方法，其包括下列步骤：

(1)把包含得自患有或怀疑易患有所述病态的受试者的生物分子的样品加入到权利要求73-78中任一项的系统内的流动缓冲液中；

(2)产生交变电场；

(3)产生沿泳道远离IEF缓冲液或单元方向的电场以形成生物分子图形；和

(4)使泳道中的生物分子图形与得自没有疾病或不易患有此疾病的正常受试者的样品的生物分子图形进行比较。

115.权利要求114的方法，其中得自正常受试者的样品的制备方法是：

(1)把包含得自正常受试者的生物分子的样品加入到权利要求73-78中任一项的系统内的流动缓冲液中；

(2)产生交变电场；和

(3)产生沿泳道远离IEF缓冲液或单元方向的电场以形成生物分子图形。

116.一种用于诊断或预诊断受试者的病态的方法，其包括下列步骤：

(1)把包含得自患有或怀疑易患有所述病态的受试者的生物分子的样品加入到权利要求73-78中任一项的系统内的流动缓冲液中；

(2)产生交变电场；

(3)产生沿泳道远离IEF缓冲液或单元方向的电场；和

(4)使泳道中的生物分子与得自没有疾病或不易患有此疾病的正常受试者的样品的生物分子进行比较。

117.权利要求114的方法，其中来自正常受试者的样品的制备方法是：

(1)把包含得自正常受试者的生物分子的样品加入到权利要求73-78中任一项的系统内的流动缓冲液中；

(2)产生交变电场；和

(3)产生沿泳道远离IEF缓冲液或单元方向的电场。

118.权利要求110-117中任一项的方法，其中在交变电场的步骤过程中有一种装置使流动缓冲液循环穿过IEF缓冲液或单元。

119.权利要求110-117中任一项的方法，其中样品来自人。

120.权利要求110-117中任一项的方法，其中生物分子包含氨基酸。

121.权利要求110-117中任一项的方法，其中泳道包含十二烷基硫酸钠和聚丙烯酰胺凝胶。

122.权利要求110-117中任一项的方法，其中在产生交变电场步骤后和在产生沿泳道远离IEF缓冲液或单元方向的电场的步骤过程中或之前向流动缓冲液中加入十二烷基硫酸钠。

123.权利要求110-117中任一项的方法，其进一步包括通过选自质谱、毛细管电泳和液相色谱的方法分析生物分子的步骤。

124.一种用于分析样品中靶生物分子(“TB”)存在、不存在或其量的TB系统，其包括：

a.权利要求8-12中任一项的系统；和

b.在复合体中与TB结合的靶识别分子(“TRM”)；

其中系统内至少一个单元中IEF缓冲液的pH值等于复合体的等电点(pI)，该复合体包含与TB结合的TRM。

125.一种用于分析样品中靶生物分子(“TB”)存在、不存在或其量的TB系统，其包括：

a.权利要求73-80中任一项的系统；和

b.在复合体中与TB结合的靶识别分子(“TRM”)；

其中系统内至少一个单元中IEF缓冲液的pH值等于复合体的等电点(pI)，该复合体包括与TB结合的TRM。

126.权利要求124或125的系统，其进一步包括用于在等电聚焦系统的单元中检测复合体的装置，所述复合体含有与TB结合的TRM。

127.权利要求124或125的系统，其中TRM是一种抗体。

128.权利要求124或125的系统，其中TRM是被标记的或与检测部分结合。

129.权利要求124或125的系统，其中TRM用荧光团标记。

130.权利要求124或125的系统，其中系统另外包括已知量的多种已知分子和IEF缓冲液子集，所述IEF缓冲液的pH值与已知分子的pI值相等。

131.权利要求124或125的系统，其中系统用于诊断受试者的疾病或症状。

132.权利要求124或125的系统，其中IEF的单元在芯片中。

133.一种用于对TB-TRM复合体进行分类的方法，其包括下列步骤：把TB-TRM复合体暴露于被指导进出IEF缓冲液的交变电场下；以及其中IEF缓冲液的pH值与TB-TRM复合体的pI值相同。

134.一种用于分析样品中TB存在、不存在或其量的方法，其包括下列步骤：

a.在允许TB和TRM结合的条件下使TRM与样品结合；和

b.通过产生进出IEF缓冲液或包含IEF缓冲液的单元的交变电场使包括与TRM结合的TB的复合体与未结合的TB在包含流动缓冲液的室中分离；和任选使流动缓冲液循环穿过IEF缓冲液；和

c.观察IEF缓冲液中TB-TRM复合体存在、不存在或其量，

其中IEF缓冲液的pH值与TB-TRM复合体的pI值相同。

135.一种用于分析样品中TB存在、不存在或其量的方法，其包括下列步骤：

a.在允许TB和TRM结合的条件下把TRM与样品结合；和

b.通过产生进出IEF/泳道单位的IEF缓冲液的交变电场使包括与TRM结合的TB的复合体与未结合的TB在包含流动缓冲液的室中分离；和任选使流动缓冲液循环穿过IEF缓冲液；和

c.产生沿泳道远离IEF缓冲液方向的电场；和

d.观察泳道中TB-TRM复合体存在、不存在或其量，

其中IEF缓冲液的pH值与TB-TRM复合体的pI值相同。

136.一种用于分析样品中TB存在、不存在或其量的方法，其包括下列步骤：

a.在允许TB和TRM结合的条件下把TRM与样品结合；和

b.在权利要求124的TB系统内使包括与TRM结合的TB的复合体与未结合的TB分离；和任选使流动缓冲液循环穿过IEF缓冲液；和

c.观察IEF缓冲液中TB-TRM复合体存在、不存在或其量，其中IEF缓冲液的pH值与TB-TRM复合体的pI值相同。

137.一种用于分析样品中TB存在、不存在或其量的方法，其包括下列步骤：

a.在允许TB和TRM结合的条件下把TRM与样品结合；和

b.使用IEF/泳道单位的IEF缓冲液，在权利要求125的TB系统内，使包括与TRM结合的TB的复合体与未结合的TB分离；和任选使流动缓冲液循环穿过IEF缓冲液；和

c.产生沿泳道远离IEF缓冲液方向的电场；和

d.观察泳道中TB-TRM复合体存在、不存在或其量。

138.权利要求134-137中任一项的方法，其中TRM与检测部分结合或被标记。

139.权利要求134-137中任一项的方法，其中TRM为用荧光团标记的抗体。

140.权利要求110-117和134-137中任一项的方法，其中已知量的多种已知分子用于形成校准曲线，其方法是(1)向步骤(a)中的样品中加入已知分子，和(2)使每种已知分子在单元中分离和聚集。

141.权利要求134-137中任一项的方法，其中所述方法用于诊断动物的疾病或症状。

142.权利要求134-137的方法，其中所述方法用于观察生物学事件。

143.权利要求134-137中任一项的方法，其中所述方法用于筛选化合物或生物分子。

144.一种系统，其包括：

(a)包含流动缓冲液的室；

(b)IEF缓冲液或包含IEF缓冲液的单元，所述IEF缓冲液的pH范围为0.1pH单位或更小；

(c)用于指导第一电场进入IEF缓冲液的装置；和任选

(d)用于使流动缓冲液循环穿过IEF缓冲液或单元的装置。

145.一种系统，其包括：

(a)包含流动缓冲液的室；

(b)包含隔离的IEF/泳道单位的矩阵层，其中IEF/泳道单位包括：

(i)IEF缓冲液或包含IEF缓冲液的单元；和

(ii)泳道；

其中IEF缓冲液或包含IEF缓冲液的单元的pH范围为0.1pH单位或更小；

(c)用于在第一维中指导电场进入IEF缓冲液的装置；

(d)用于指导电场沿泳道长度远离IEF缓冲液或单元方向的装置；和任选

(e)用于使流动缓冲液循环穿过IEF缓冲液或单元的装置。

146.一种系统，其包括：

(a)包含流动缓冲液的室；

(b)包含矩阵层和第二层的阵列：

其中矩阵层包括IEF/泳道单位和生物分子不可渗透区域(BIA)，

其中IEF/泳道单位包括：

(i)IEF缓冲液或包含IEF缓冲液的单元；和

(ii)泳道；

其中BIA越过其长度和宽度与泳道接触；

其中第二层包括与泳道长度和宽度相同或更大的泳道筛选区域(LSA)，其中LSA是离子可渗透和生物分子不可渗透的；

其中泳道位于矩阵层和LSA之间；

其中IEF缓冲液或包含IEF缓冲液的单元的pH范围为0.1pH单位或更小；

(c)用于在第一维中指导电场进入IEF缓冲液或单元的装置；

(d)用于指导电场沿泳道长度远离IEF缓冲液或单元方向的装置；和任选

(f)用于使流动缓冲液循环穿过IEF缓冲液的装置。

147.权利要求144-146中任一项的系统，其中IEF缓冲液的pH范围为0.02pH单位或更小。

148.权利要求144-147中任一项的系统，其中系统包括多个IEF缓冲液或包含IEF缓冲液的单元。

149.权利要求148的系统，其中多个IEF缓冲液或单元彼此隔离。

150.权利要求148的系统，其中多个IEF缓冲液或单元的pH梯度是0.02pH单位或更小。

151.权利要求144-146中任一项的系统，其中系统进一步包括使流动缓冲液循环穿过IEF缓冲液或单元的装置。

152.权利要求144-146中任一项的系统，其中第一维电场由AC或DC电压装置产生。

153.权利要求145-146中任一项的系统，其中IEF缓冲液或单元与泳道接触或与泳道是可连接的。

154.权利要求146的系统，其中第二层进一步包括垂直于第二层平面的穿孔，其中穿孔位于IEF缓冲液或单元的上方。

155.权利要求146的系统，其中第二层包括多个LSA，其排列使得泳道位于矩阵层和LSA之间。

156.权利要求155的系统，其中第二层进一步包括多个垂直于第二层平面的穿孔，其中穿孔位于多个IEF缓冲液或单元的上方。

157.一种对样品中的生物分子进行等电聚焦的方法，其包括下列步骤：向权利要求144-152中任一项的系统内的流动缓冲液中加入包含生物分子的样品，产生进入IEF缓冲液或单元的电场，和任选使流动缓冲液循环穿过IEF缓冲液或单元。

158.一种分离样品中生物分子的方法，其包括下列步骤：

(1)向权利要求中145-152任一项的系统内的流动缓冲液中加入包含所述生物分子的样品；

(2)产生进入IEF缓冲液的电场；和

(3)产生沿泳道远离IEF缓冲液或单元方向的电场。

159.一种表征样品中生物分子的方法，其包括下列步骤：

(1)向权利要求144或147-152中任一项的系统内的流动缓冲液中加入包含所述生物分子的样品；

(2)产生进入IEF缓冲液的电场；和

(3)测定IEF缓冲液中是否存在生物分子。

160.一种表征样品中生物分子的方法，其包括下列步骤：

(1)向权利要求145-152中任一项的系统内的流动缓冲液中加入包含所述生物分子的样品；

(2)产生进入IEF缓冲液的电场；

(3)产生沿泳道远离IEF缓冲液或单元方向的电场；和

(4)测定泳道中生物分子的位置。

161.一种定量测定样品中生物分子的方法，其包括下列步骤：

(1)向权利要求144或147-152中任一项的系统内的流动缓冲液中加入包含所述生物分子的样品；

(2)产生进入IEF缓冲液的电场；和

(3)测定IEF缓冲液中生物分子的量。

162.一种定量测定样品中生物分子的方法，其包括下列步骤：

(1)向权利要求145-152中任一项的系统内的流动缓冲液中加入包含所述生物分子的样品；

(2)产生进入IEF缓冲液的电场；

(3)产生沿泳道远离IEF缓冲液或单元方向的电场；和

(4)测定泳道中生物分子的量。

163.一种用于测定样品中生物分子存在或不存在的方法，其包括下列步骤：

(1)向权利要求144或147-152中任一项的系统内的流动缓冲液中加入样品；

(2)产生进入IEF缓冲液的电场；和

(3)测定IEF缓冲液中是否存在生物分子。

164.一种用于测定样品中生物分子存在或不存在的方法，其包括下列步骤：

(1)向权利要求147-152中任一项的系统内的流动缓冲液中加入样品；

(2)产生进入IEF缓冲液的电场；

(3)产生沿泳道远离IEF缓冲液或单元方向的电场；和

(4)测定泳道中是否存在生物分子。

165.一种诊断或预诊断受试者的病态的方法，其包括下列步骤：

(1)把包含得自患有或怀疑易患有所述病态的受试者的生物分子的样品加入到权利要求144或147-152中任一项的系统内的流动缓冲液中；

(2)产生进入IEF缓冲液的电场；

(3)使泳道中的生物分子图形与得自没有疾病或不易患有此疾病的正常受试者的样品的生物分子图形进行比较。

166.一种诊断或预诊断受试者的病态的方法，其包括下列步骤：

(1)把包含得自患有或怀疑易患有所述病态的受试者的生物分子的样品加入到权利要求147-152中任一项的系统内的流动缓冲液中；

(2)产生进入IEF缓冲液的电场；

(3)产生沿泳道远离IEF缓冲液或单元方向的电场以形成生物分子图形；和

(4)使泳道中的生物分子图形与得自没有疾病或不易患有此疾病的正常受试者的样品的生物分子图形进行比较。

167.一种系统，其包括：

(a)包含流动缓冲液的室；

(b)隔离的IEF缓冲液或包含IEF缓冲液的隔离单元；

(c)用于指导电场进入IEF缓冲液的装置；和任选

(d)用于使流动缓冲液循环穿过IEF缓冲液或单元的装置。

168.一种系统，其包括：

(a)包含流动缓冲液的室；

(b)包含隔离的IEF/泳道单位的矩阵层，其中IEF/泳道单位包括：

(i)隔离的IEF缓冲液或包含隔离的IEF缓冲液的单元；和

(ii)泳道；

(c)用于在第一维中指导电场进入IEF缓冲液的装置；

(d)用于指导电场沿泳道长度远离IEF缓冲液或单元方向的装置；和任选

(e)用于使流动缓冲液循环穿过IEF缓冲液或单元的装置。

169.一种系统，其包括：

(a)包含流动缓冲液的室；

(b)包含矩阵层和第二层的阵列：

其中矩阵层包括IEF/泳道单位和生物分子不可渗透区域(BIA)，

其中IEF/泳道单位包括：

(i)隔离的IEF缓冲液或包含IEF缓冲液的隔离单元；和

(ii)泳道；

其中BIA越过其长度和宽度与泳道接触；

其中第二层包括与泳道长度和宽度相同或更大的泳道筛选区域(LSA)，其中LSA是离子可渗透的和生物分子不可渗透的；

其中泳道位于矩阵层和LSA之间；

(c)用于在第一维中指导电场进入IEF缓冲液或单元的装置；

(d)用于指导电场沿泳道长度远离IEF缓冲液或单元方向的装置；和任选

(e)用于使流动缓冲液循环穿过IEF缓冲液或单元的装置。

170.权利要求167-169中任一项的系统，其中IEF缓冲液的pH范围为0.1pH单位或0.02pH单位或更小。

171.权利要求167-170中任一项的系统，其中系统包括多个IEF缓冲液或包含IEF缓冲液的单元。

172.权利要求171的系统，其中多个IEF缓冲液或单元的pH梯度是0.02pH单位或更小。

173.权利要求167-170中任一项的系统，其中系统进一步包括使流动缓冲液循环穿过IEF缓冲液或单元的装置。

174.权利要求167的系统，其中电场由AC或DC电压装置产生。

175.权利要求168-169中任一项的系统，其中处于第一维的电场由AC或DC电压装置产生。

176.权利要求168-169中任一项的系统，其中IEF缓冲液或单元与泳道接触或与泳道是可连接的。

177.权利要求169的系统，其中第二层进一步包括垂直于第二层平面的穿孔，其中穿孔位于IEF缓冲液或单元的上方。

178.权利要求169的系统，其中第二层包括多个LSA，其排列使得泳道位于矩阵层和LSA之间。

179.权利要求169的系统，其中第二层进一步包括多个垂直于第二层平面的穿孔，其中穿孔位于多个IEF缓冲液或单元的上方。

180.一种对样品中的生物分子进行等电聚焦的方法，其包括下列步骤：向权利要求167-174中任一项的系统内的流动缓冲液中加入包含生物分子的样品，产生进入IEF缓冲液的电场，和任选使流动缓冲液循环穿过IEF缓冲液或单元。

181.一种分离样品中生物分子的方法，其包括下列步骤：

(1)向权利要求168-174中任一项的系统内的流动缓冲液中加入包含所述生物分子的样品；

(2)产生进入IEF缓冲液的电场；和

(3)产生沿泳道远离IEF缓冲液或单元方向的电场。

182.一种表征样品中生物分子的方法，其包括下列步骤：

(1)向权利要求167或170-174中任一项的系统内的流动缓冲液中加入包含所述生物分子的样品；

(2)产生进入IEF缓冲液的电场；和

(3)测定泳道中生物分子的位置。

183.一种表征样品中生物分子的方法，其包括下列步骤：

(1)向权利要求168-174中任一项的系统内的流动缓冲液中加入包含所述生物分子的样品；

(2)产生进入IEF缓冲液的电场；

(3)产生沿泳道远离IEF缓冲液或单元方向的电场；和

(4)测定泳道中生物分子的位置。

184.一种定量测定样品中生物分子的方法，其包括下列步骤：

(1)向权利要求167或170-174中任一项的系统内的流动缓冲液中加入包含所述生物分子的样品；

(2)产生进入IEF缓冲液的电场；和

(3)测定IEF缓冲液中生物分子的量。

185.一种定量测定样品中生物分子的方法，其包括下列步骤：

(1)向权利要求167-174中任一项的系统内的流动缓冲液中加入包含所述生物分子的样品；

(2)产生进入IEF缓冲液的电场；

(3)产生沿泳道远离IEF缓冲液或单元方向的电场；和

(4)测定泳道中生物分子的量。

186.一种用于测定样品中生物分子存在或不存在的方法，其包括下列步骤：

(1)向权利要求167或170-174中任一项的系统内的流动缓冲液中加入样品；

(2)产生进入IEF缓冲液的电场；和

(3)测定IEF缓冲液中是否存在生物分子。

187.一种用于测定样品中生物分子存在或不存在的方法，其包括下列步骤：

(1)向权利要求168-174中任一项的系统内的流动缓冲液中加入样品；

(2)产生进入IEF缓冲液的电场；

(3)产生沿泳道远离IEF缓冲液或单元方向的电场；和

(4)测定泳道中是否存在生物分子。

188.一种诊断或预诊断受试者的病态的方法，其包括下列步骤：

(1)把包含得自患有或怀疑易患有所述病态的受试者的生物分子的样品加入到权利要求167或170-174中任一项的系统内的流动缓冲液中；

(2)产生进入IEF缓冲液的电场；

(3)使泳道中的生物分子图形与得自没有疾病或不易患有此疾病的正常受试者的样品的生物分子图形进行比较。

189.一种诊断或预诊断受试者的病态的方法，其包括下列步骤：

(5)把包含得自患有或怀疑易患有所述病态的受试者的生物分子的样品加入到权利要求168-174中任一项的系统内的流动缓冲液中；

(6)产生进入IEF缓冲液的电场；

(7)产生沿泳道远离IEF缓冲液或单元方向的电场以形成生物分子图形；和

(8)使泳道中的生物分子图形与得自没有疾病或不易患有此疾病的正常受试者的样品的生物分子图形进行比较。

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