CN1561391A - 重组细菌肌醇六磷酸酶及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种来自大肠杆菌K12 appA肌醇六磷酸酶的纯化的和修饰的肌醇六磷酸酶。与野生型酶相比，该酶具有肌醇六磷酸酶活性和更高的耐热性。另外，在低pH值下，该酶具有更高的对蛋白水解酶的稳定性。修饰的肌醇六磷酸酶的糖基化提供了一种被进一步改进的酶，其具有更高的耐热性和对蛋白水解酶的稳定性。该酶可以从天然和重组宿主细胞产生，并在需要的地方可以被用来帮助肌醇六磷酸酶的消化。尤其是，本发明的肌醇六磷酸酶可以被用于食品中，以提高富含肌醇六磷酸酶成分的饲用价值。

Description

重组细菌肌醇六磷酸酶及其用途
发明领域
本发明涉及新近鉴定的多核苷酸、用这种多核苷酸编码的多肽、这种多核苷酸和多肽的用途，以及这种多核苷酸和多肽的产生和分离。更明确地说，本发明的多肽已经被鉴定为具有肌醇六磷酸酶活性的酶。
背景技术
矿物质是所有生物生长的必需元素。膳食矿物质可以来源于许多原材料，包括植物。例如，由于植物种子含有与肌醇六磷酸分子的磷酸基团复合的离子，所以它们是矿物质的丰富来源。这些与肌醇六磷酸相关的矿物质满足一些种类的饲养生物的膳食需求，如多胃反刍动物。因此，反刍动物不需要用无机磷酸和矿物质来进行膳食补充，这是因为瘤胃中的微生物产生了催化肌醇六磷酸(肌肉-肌醇-六磷酸)转化到肌醇和无机磷酸的酶。在该过程中，先前与肌醇六磷酸复合的矿物质被释放出来。然而，饲养生物中的绝大多数种类不能有效地利用与肌醇六磷酸相关的矿物质。因此，例如，在单胃动物的畜牧生产中(如猪、鸟和鱼)，通常用矿物质和/或用抗生素物质来补充饲料，这改变了消费生物的消化菌落环境，从而提高了生长率。
正如这样，有许多有问题-与营养有关的、来自离体的加工步骤、健康和医药、环境保护，以及资源管理-在许多应用中它们与肌醇六磷酸的不充分水解有关。下面是这些问题的非限定性实例：
1)用无机矿物质进行膳食补充的成本太高。
2)在许多离体应用中，未水解的肌醇六磷酸盐的存在是不受欢迎且是成问题的(如通过引起不必要的淤渣的存在)。
3)通过增加耐抗生素的病原体的数量，用抗生素进行膳食补充对人类和动物构成了医学威胁。
4)未吸收的粪便矿物质排放到环境中打破且损害了周围土壤、鱼类养殖水域和水域表层的整个生态系统。
5)许多潜在食品中有价值的营养供给仍然显著地保持在未使用状态，从而被浪费。
许多潜在的营养植物，尤其包括它们的种子，含有可观数量的营养素，如磷酸，它们以某种方式与肌醇六磷酸相缔合，即这些营养素在消费时不能被自由地利用。这些营养素的不可利用性被一些生物克服，包括牛和其它反刍动物，它们有足够的消化能力-主要由于它们消化管道中共生的生命形式的存在-来水解肌醇六磷酸并释放缔合的营养素。然而，饲养动物中的绝多种种类，包括猪、鱼、鸡、火鸡以及其它非反刍动物生物包括人类，在摄取后不能有效地释放这些营养素。
因此，含肌醇六磷酸的食品需要用外源营养素和/或用肌醇六磷酸酶活性源进行补充，以便改进它们被多种生物消费时其营养素供给的欠缺。
仍然在另一方面，未水解的肌醇六磷酸的存在导致了离体加工中成问题的后果，包括但不限于，食品的加工。正如EP0321004-B1(Vaara等人)中所描述的，在仅仅一个例证中，在玉米和高粱核的加工中有一个步骤，即通过将硬核浸泡在水中来将其软化。在该过程中滤出的水溶性物质成为玉米浸渍液的一部分，该浸渍液通过蒸发被浓缩。玉米浸渍液中未水解的肌醇六磷酸，主要是钙盐和镁盐的形式，结合有磷，并且与蛋白质和金属离子一起沉淀出不期望的淤渣。该淤渣在玉米浸渍液的蒸发、运输和储存中是成问题的。因此，即将公开的肌醇六磷酸酶分子-或者单独或者组合其它反应物(包括但不限于酶，包括蛋白酶)-不仅在本申请中有用(如用于防止不受欢迎的淤渣)而且在其它期望肌醇六磷酸水解的应用中有用。
用抗生素物质进行膳食补充在家畜生产中有许多有益的效果。例如，除了作为预防手段来驱除疾病，使用外源抗生素已经表现出使生长率增加了3～5％以上。该作用的机制也涉及-部分地-饲养动物的消化菌落环境的改变，这导致了对营养素吸收来说更理想的微菌群平衡。
然而，与过度使用抗生素有关的重大负作用是产生致病的抗生素抗性的微生物菌株库的危险。这个危险是很危急的，人类体中耐药病原体的出现已经与家畜中抗生素的使用联系在一起。例如，用于动物饲料的抗生素阿沃菌素，于1997年在许多地方已经被禁止，现在动物被喂养另一种抗生素维及尼霉素，该抗生素与新药Synercid非常类似，Synercid被用来替代用于人类的万古霉素。然而，研究已经表明饲养动物中的一些肠道球菌对Synercid有抵抗力。因此，不管何种新抗生素被用作饲养动物的毯式预防法，不期望的耐药性后果，如那些已经在使用阿沃菌素和万古霉素中发现的后果可能重新出现。因此，研究者呼吁对在该行业中的药物使用进行更严厉的控制。
用即将公开的肌醇六磷酸酶分子进行补充的食品饲养的动物中所达到的增长率的提高可以与-如果不是超过的话-那些用抗生素如阿沃菌素所达到的增长率相比。因此，即将公开的肌醇六磷酸酶分子-或者单独或者组合其它反应物(包括但不限于酶，包括蛋白酶)-不仅在本申请中有用(如用于提高饲养动物的增长率)而且在其它期望肌醇六磷酸水解的应用中有用。
环境后果是，任何缺乏肌醇六磷酸酶的生物种类消费含肌醇六磷酸的食品-不管这些食品是否用矿物质进行过补充-导致由未吸收的矿物质的排泄所产生的粪便污染。该污染不仅对直接的生活环境有负面影响，因此也对周围水域有负面影响。环境变化主要发生在食物链的下游，因此有潜力向生态系统的上游渗入，并渗透整个生态系统，以达到永久且灾难性的破坏-尤其在持续污染数年后。这个问题有潜力在任何发生浓缩肌醇六磷酸加工的地方证明自己-包括在体内(如通过家畜生产区、动物园、野生生物保留地等地方的动物)和体外(商业玉米湿磨法、谷类浸泡加工等)加工步骤中。
使用外源加入的肌醇六磷酸酶分子的决定-不管是完全取代还是加强外源使用的矿物质和/或抗生素的用途-基本上需要通过那些生计依赖于相关应用如家畜生产的用户的财务可行性和成本效率的检验。
因此，存在对于这样的方法的需求，即在各种应用中能达到肌醇六磷酸的高效且成本有效的水解的方法。尤其是，存在对于在商业应用上能最优化肌醇六磷酸水解的方法的需求。在一个特定方面，存在这样一个需求，即最优化改善用于人类和饲养动物消费的含肌醇六磷酸食品的营养供给的商业处理方法。
先前已有关于重组肌醇六磷酸酶的报导，但其较差的活性远不如本发明新发现的肌醇六磷酸酶分子的活性。因此，即将公开的肌醇六磷酸酶分子被认为可以提供比先前鉴定的肌醇六磷酸酶分子如真菌起源的肌醇六磷酸酶分子具有显著出色的商业性能。
肌醇六磷酸作为实际上所有植物种子中存储的磷的来源而出现(Graf(Ed.)，1986)。肌醇六磷酸构成谷物和豆类种子的一个正常部分。它的功能是结合新植物在其种子发芽时所必要的营养矿物质。当肌醇六磷酸的磷酸基团被种子酶肌醇六磷酸酶去除时，肌醇六磷酸结合金属离子的能力就会丧失，而且矿物质对植物变得可以利用。在家畜饲料谷物中，被肌醇六磷酸结合的微量矿物质对缺乏肌醇六磷酸酶活性的单胃动物来说在很大程度上是吸收不到的。
尽管一些肌醇六磷酸的水解发生在结肠中，但大部分肌醇六磷酸通过单胃动物的胃肠道，并且以排泄物被排泄出，从而在高密度家畜生产区造成了粪便磷污染问题。释放到结肠中的无机磷对家畜来说具有可以感知的营养价值的减少，这是因为无机磷主要在小肠中被吸收-如果不是全部的话。因此，肌醇六磷酸中在营养上很重要的膳食矿物质的可以感知的量对单胃动物来说是很难利用的。
总而言之，与肌醇六磷酸相关的营养素不仅包括与肌醇六磷酸共价连接的磷酸，而且包括同样被肌醇六磷酸螯合的其它矿物质。而且，一旦摄入，未水解的肌醇六磷酸可能进一步与其它矿物质相遇，并且与其缔合。矿物质的螯合会抑制酶的活性，这些矿物质是酶的辅因子。
可以用广泛称作肌醇六磷酸酶的微生物酶来催化肌醇六磷酸到肌醇和无机磷的转化。肌醇六磷酸酶如肌醇六磷酸酶#EC3.1.3.8可以催化肌醇六磷酸到D-肌醇1，2，4，5，6-五磷酸和正磷酸的水解。据报导，某些真菌肌醇六磷酸酶可以将肌醇五磷酸水解到四磷酸、三磷酸和更低磷酸。例如A.ficuum肌醇六磷酸酶据报导可以产生肌醇二磷酸和肌醇单磷酸的混合物(Ullah，1988)。产生肌醇六磷酸酶的微生物包括细菌如枯草芽孢杆菌(Powar和Jagannathan，1982)和假单胞杆菌属(Cosgrove，1970)；酵母如sacchoromyces cerevisiae(Nayini和Markakis，1984)；真菌如曲霉菌terreus(Yamada等人，1968)。
酸性磷酸酶是催化水解多种磷酸酯的酶，通常表现出最适pH低于6.0(Igarashi& Hollander，1968)。例如#EC 3.1.3.2酶催化正磷酸单酯到正磷酸产物的水解。据报导，一种酸性磷酸酶从A.ficuum纯化而来。酸性磷酸酶的去糖基化形式的表观分子量为32.6kDa(Ullah等人，1987)。
肌醇六磷酸酶和低专一性酸性磷酸酶是真菌曲霉菌ficuum作为胞外酶产生的(Shieh等人，1969)。Ullah报导从野生型A.ficuum纯化了肌醇六磷酸酶，其表观分子量为61.7kDA(SDS-PAGE；被校正为糖基化)。最适pH为2.5和5.5；Km为大约40μm；专一性活性为大约50U/mg(Ullah，1988)。PCT专利申请WO 91/05053也报导公开了从曲霉菌ficuum分离且分子克隆肌醇六磷酸酶，其最适pH为2.5和5.5，Km为大约250μm，专一性活性为大约100U/mg蛋白质。
概括来说，所引用这些先前报导的微生物酶的专一性活性大约在50～100U/mg蛋白质之间。相反，在本发明中公开的肌醇六磷酸酶活性被测量为大约4400U/mg。这相当于活性提高了大约40倍或更高。
使用能产生作为单胃动物饲料添加剂的肌醇六磷酸酶的微生物的可能性在以前已经有所报导(USPN 3,297,548，Shieh和Ware；Nelson等人，1971)。该方法的成本效益是该商业应用和其它商业应用的主要限制。因此改进的肌醇六磷酸酶分子是高度期望的。
据报导，微生物肌醇六磷酸酶也可以用某些工业方法如小麦和玉米废品来生产动物饲料。一方面，玉米的湿磨法加工产生了作为动物饲料出售的麸质。据报导，肌醇六磷酸酶的加入可以提高饲料产品的营养价值。例如，真菌肌醇六磷酸酶的使用及其加工条件(温度为50℃，pH为5.5)以前在(如EP 0 321 004)中已经有所报导。简单来说，在使用传统浸泡法来加工大豆粗粉中，即不添加外源肌醇六磷酸酶的方法，未水解的肌醇六磷酸的存在使粗粉和废料不适合用于饲养鱼类、家禽和其它非反刍动物以及用乳汁喂养的小牛所用的饲料。据报导，肌醇六磷酸可以提高该高蛋白大豆物质的营养素和商业价值(参考Finase Enzymes byAlko，Rajamaki，Finland)。真菌肌醇六磷酸酶和最适pH为2.5的酸性磷酸酶形式A.niger的联合已经被Alko，Ltd在它们的肌醇六磷酸降解产品Finas F和Finase S中用来对动物饲料进行补充。然而，该方法的成本效益仍然是更大范围使用的一个主要限制。因此，一种成本低廉的肌醇六磷酸酶的来源将大大地提高作为动物饲料的大豆粗粉的价值(Shieh等人，1969)。
为了解决所公开的问题，用外源肌醇六磷酸酶对食品进行处理已经被提了出来，但该方法不是完全最优化的，尤其考虑到可行性和成本效益。该最优化需要考虑大范围应用的存在，尤其在大规模生产中。例如，大范围食品及其制备方法，以及接受这种食品的生物种类。
在一个特定例证中，已经意识到鱼类颗粒饲料的制造需要将成分暴露在高温和/或高压下，以便产生遇到水时不会过早地溶解和/或降解(例如在消费之前)的颗粒。因此该制造方法所期望的是获得在高温和/或高压条件下稳定的添加酶。因此，可以理解不同的肌醇六磷酸酶对于不同的应用可以是分别优选或最优化。
而且也已经公认，使酶过程最优化的主要方式是通过修饰和提高关键催化酶。例如，可以形成包括表达肌醇六磷酸酶分子的表达系统的转基因植物。可以理解，通过试图提高与所表达的分子活性不直接相关的因素，如表达水平，最大限度地获得的最优化水平仅仅是有限且潜在不足的。因此，也存在获得具有改进特性的分子的需求。
实现分子特性改进的特定方式是通过一种叫做定向进化的技术方法，包括Diversa Corporation的专利方法，在该公司的方法中术语DirectEvolution已经被杜撰出来且注册。这些方法在Diversa的共有专利(美国专利5,830,696)以及在几个共同待审批的专利申请中进一步做了详细描述。简单来说，DirectEvolution包括：a)对一种或多种分子模板进行诱变以产生新分子，和b)在这些新分子的子代种类中选择具有更需要特性的新分子。
然而，定向进化的力量依赖于原始模板的起始选择，以及所选的诱变方法和所用的筛选方法。例如，在随机选择的分子模板和/或具有过度的次适合性能的起始分子模板上产生和评价全长诱变变换的方法常常是大得令人生畏的工作。使用这些模板最多提供一个曲折的次适合路径，其被充分改进的子代分子产生的潜在前景非常差。另外，应该意识到我们目前关于严格地预测有益修饰的能力的知识体系非常局限。
因此，期望有一种发现和使用在自然界中具有预进化特性-优选预进化酶优点的分子的方法。因此在即将公开的内容中可以看到自然界提供了(通过有时被称为“自然进化”的过程)可以直接在商业应用中使用的分子，或也就是说，可以被用于定向进化，从而实现更大改进的性质。
总而言之，存在对于新的、高活性的、有生理效应的且经济的肌醇六磷酸酶活性来源的需求。更明确地说，存在发现新肌醇六磷酸酶的需求，该肌醇六磷酸：a)在一种或多种特定应用中具有优异的活性，从而可以使这些特定应用最优化；b)可以用作定向进化的模板，从而得到更进一步改进的新分子；和c)可以用作通过某种方法如基于杂交的方法来鉴定其它相关分子的工具。本发明以新方式满足这些需求。
发明概述
本发明提供了一种多核苷酸和由其编码的已经被鉴定为具有肌醇六磷酸酶活性的肌醇六磷酸酶和多肽。本发明的一个方面提供了一种新重组酶，及其活性片断、类似物和衍生物。
更明确地说，本发明涉及细菌起源的重组肌醇六磷酸酶分子的用途，它们可以提高含肌醇六磷酸酶的食品的营养价值。以前的出版物已经公开了真菌肌醇六磷酸酶的用途，但用于该目的的细菌肌醇六磷酸酶的用途还是新颖的。
仍然更明确地说，本发明涉及新近鉴定的大肠杆菌(E.coli)起源的重组肌醇六磷酸酶分子的用途，它们可以提高含肌醇六磷酸的食品的营养价值。
该用途包括使用新近鉴定的分子水解食品中的肌醇六磷酸。水解可以发生在肌醇六磷酸摄入之前或摄入之后，或在摄入之前和之后都发生。该应用尤其关于，但不限于，非反刍生物，其包括：所公开的新肌醇六磷酸酶分子在转化宿主中的表达，所公开的新肌醇六磷酸酶分子与食品和其它物质中的肌醇六磷酸的接触，以及用所公开的新肌醇六磷酸酶分子处理动物消化系统。
另外，水解可以独立于消费发生，例如在体外应用中，如在反应容器中。因此，含肌醇六磷酸物质的处理包括大范围物质的处理，包括那些不被意指食品的物质，如排泄物(或粪便)物质的处理。
本发明的优选分子包括从大肠杆菌(Escherichia coli)B分离出来的重组肌醇六磷酸酶，它与先前鉴定的真菌肌醇六磷酸酶相比可以提高肌醇六磷酸和肌醇六磷酸盐中磷的释放效率。
在本发明的一个方面，提供了一种可以加入食品中的肌醇六磷酸酶。更明确地说，提供了一种可以提高含肌醇六磷酸的食品的营养价值的肌醇六磷酸酶。仍然更明确地说，提供了这样一种肌醇六磷酸酶，即当用于含肌醇六磷酸的食品时，可以提高消费它的生物的生长性能。理论上来说，肌醇六磷酸酶活性发挥作用的有益机理包括可感知的肌醇六磷酸的水解，即使如果不是充分的。有益的作用可以发生在含肌醇六磷酸食品的摄入之前，或可选择地在摄入之后，或可选择地在摄入之前和之后。在摄入后有益作用发生的情况中，本发明的一个目的是提供一种被非反刍生物消费时保持具有活性的肌醇六磷酸酶。
本发明的另一个方面是提供编码本发明所述酶的分离核酸分子-包括mRNA、DNA、cDNA、基因组DNA，以及这些酶的活性衍生物、类似物和片断。
仍然在本发明进一步的一个方面，提供了一种用重组技术产生此多肽的方法，该方法包括在促进所述酶的表达和所述酶的后续回收的条件下培养含有编码本发明所述酶的核酸序列的重组原核和/或真核宿主细胞。
仍然在本发明进一步的一个方面，提供了一种在转基因植物和植物器官中表达该酶，或编码该酶的多核苷酸的方法，及产生这些植物的方法。这是通过将包括编码该肌醇六磷酸酶的核酸序列的表达构建体引入植物中而实现的。
仍然在本发明进一步的一个方面，提供了一种用于商业工艺的使用这些酶、或编码这些酶的多核苷酸的方法，例如从植物物质的肌醇六磷酸释放矿物质的方法，或者在体外，即在饲料处理方法中，或在体内，即通过将酶施用于动物。
仍然在本发明进一步的一个方面，提供了用所公开的饲料处理方法生产的食品。
仍然在本发明进一步的一个方面，提供了用于与研究、发现及开发有关的体外目的而使用这些酶、或编码这些酶的多核苷酸的方法。在一个非限定性例证中，这些方法包括用于从其它生物识别和分离编码相似酶的相似序列的探针的产生。
在一个特殊的非限定性例证中，也提供了产生包括与本发明的核酸序列专一性杂交的足够长度的核酸分子的核酸探针的方法。作为优选例证，这些探针的基于杂交的用途包括，但绝不限于，PCR、Northern和Southern杂交、RNA保护分析和原位杂交。即将公开的分子以非限定性方式进一步包括诊断应用。
根据非限定性例证，这些方法包括所公开分子的抗体的产生，及这些抗体的用途，例如，包括用于从其它生物的酶中识别且分离类似序列。在另一个非限定性例证中，这些方法包括将这些酶用作定向进化的模板，包括通过产生新分子，随后基于筛选的方法来发现特性改进的子代分子。
也提供了转基因非人类生物，其基因组包括一个编码具有肌醇六磷酸酶活性的多肽的异源核酸序列，其中所述转基因导致肌醇六磷酸酶多肽的表达。
本发明也提供了编码肌醇六磷酸酶的多核苷酸，该多核苷酸包括一个与SEQID NO：7基本一样的核苷酸序列，一个选自核苷酸390为G；391为A；核苷酸438为T；439为G；440为G；471为C；473为T；477为T；448为G；449为T；690为G；691为A；692为G；729为T；730为A；731为T；864为T；865为G；1017为G或其任意组合的修饰核苷酸序列。进一步，本发明提供了一种多核苷酸，其包括一个与SEQ ID NO：7基本一样的核苷酸序列，包括一个选自核苷酸390为G和391为A；核苷酸438为T、439为G和440为G；471为C和473为T；477为T、448为G和449为T；690为G、691为A和692为G；729为T、730为A和731为T；864为T和865为G；1017为G或其任意组合的修饰核苷酸序列。后述序列的例证是SEQ ID NO：9，相应氨基酸序列是SEQ ID NO：10。
根据下面的教导，本发明的这些和其它方面应该对本领域的普通技术人员是显而易见的。
附图描述
下述附图是对本发明实施方案的说明，并不意味着限定如权利要求所包括的发明范围。
图1给出了本发明的酶的核苷酸和所推断的氨基酸序列。测序是用378自动DNA测序仪进行的(Applied Biosystems，Inc.)。
图2给出了pH值和温度图，以及本发明的肌醇六磷酸酶的稳定性数据。用于这些分析的试验是下述对肌醇六磷酸酶活性检测：通过用600μl的溶解在pH为7.5的100mM Tris HCl缓冲液中的2mM肌醇六磷酸钠温育150μl的酶制剂，然后在37℃用1mM CaCl2补充30分钟，对肌醇六磷酸酶活性进行测定。温育后，加入750μl的5％的三氯乙酸终止反应。在加入1500μl的显色试剂(溶解在5.5％硫酸中的4体积1.5％的钼酸铵，和1体积2.7％的硫酸亚铁；Shimizu，1992)后，根据磷标准分光光度法在700nm测量所释放的磷酸盐。700nm时的OD在图2的Y轴上表示。温度或pH值在图中的X轴上表示。
图3给出了SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：10(修饰的肌醇六磷酸酶)之间的耐热性分析结果。
图4给出了在模拟的消化性条件下的肌醇六磷酸酶的稳定性。
图5给出了在各种宿主细胞中野生型和修饰的肌醇六磷酸酶(SEQ ID NO：10)的表达。
图6给出了在含有胃蛋白酶的SGF中的残余的肌醇六磷酸酶活性。
图7给出了大肠杆菌appA肌醇六磷酸酶(SEQ ID NO：7)的核苷酸序列。
图8给出了大肠杆菌appA肌醇六磷酸酶(SEQ ID NO：8)和修饰肌醇六磷酸酶(SEQ ID NO：10)的氨基酸序列。
发明详述
本发明提供了一种热稳定的肌醇六磷酸酶，所述肌醇六磷酸酶具有修饰的多核苷酸和多肽序列，其修饰方式是提供一种与其它肌醇六磷酸酶相比具有热稳定性增加的肌醇六磷酸酶。例如，这种新肌醇六磷酸酶在S.pombe或P.pastoris中的表达导致了表现出额外耐热性的糖基化变体的产生。
本发明提供了图1所示的纯化的重组肌醇六磷酸酶。另外，本发明提供了编码具有图1所示的推断氨基酸序列的成熟酶的分离核酸分子(多核苷酸)。本发明也提供了如图8和SEQ ID NO：9和10所示的修饰肌醇六磷酸酶序列。
由于其结构，本发明的肌醇六磷酸酶分子是新颖的。另外，由于活性，该肌醇六磷酸酶分子在专利性上也是新颖的。例如，使用一种分析方法(如FoodChemicals Codex，4thEd.中描述的)，与真菌(曲霉属)肌醇六磷酸酶对照组相比，该肌醇六磷酸酶的活性被证明是非常优越的。尤其是，多种实验表明大肠杆菌肌醇六磷酸酶的活性为大约4400单位/mg，曲霉属肌醇六磷酸酶的活性为大约105单位/mg。这相当于活性差异超过了40倍。为了更容易地理解此处提供的实施例，下边将描述一些频繁出现的方法和/或术语。
在此所用，术语“抗体”指完整的免疫球蛋白分子，以及免疫球蛋白分子的片断，如Fab、Fab’、(Fab’)2、Fv和SCA片断，它们可以与肌醇六磷酸酶多肽的表位结合。可以用本领域已知的方法(例如，参见，Harlow和Lane，见上)来制备这些抗体片断，它们保留了一些与其所来源的抗体的抗原(如肌醇六磷酸酶抗原)选择性结合的能力，并且下面对这些片断做了进一步描述。
(1)Fab片断包括抗体分子的单价抗原结合片断，可以通过用木瓜蛋白酶来消化整个抗体分子而产生，从而产生包括一个完整的轻链和一个重链的一部分的片断。
(2)抗体分子的Fab’片断可以通过先用胃蛋白酶处理整个抗体分子，然后还原而获得，从而产生包括一个完整的轻链和一个重链的一部分的分子。用这种方式处理的每个抗体分子可以得到两个Fab’片断。
(3)抗体分子的(Fab’)2片断可以通过用胃蛋白酶处理整个抗体分子而获得，不需要进行随后的还原过程。(Fab’)2片断是用两个二硫化物键将两个Fab’片断结合在一起的二聚体。
(4)Fv片断被定义为以两个链进行表达的进行了遗传工程的片断，包括一个轻链的可变区和一个重链的可变区。
(5)单链抗体(“SCA”)是进行了遗传工程的单链分子，包括用一个合适的柔性多肽接头连接在一起的一个轻链的可变区和一个重链的可变区。
术语“降解有效”量是指与不接触酶的肌醇六磷酸相比，降解至少50％的肌醇六磷酸所需酶的数量，优选地，降解至少80％的肌醇六磷酸。
DNA的“消化”指用仅在DNA中的特定序列处发挥作用的限制性内切酶进行的DNA催化裂解。此处所用的各种限制性内切酶可以通过商业通路获得，并且正如普通技术人员所知的那样使用反应条件、辅助因子和其它要求。为了分析目的，通常在大约20μl的缓冲液中用大约2单位的酶来消化1μg质粒或DNA片断。为了分离用于质粒构建的DNA片断的目的，通常在一个较大的体积中用20～250单位的酶来消化5～50μg的DNA。用于特定限制性内切酶的缓冲液和底物的适当用量由制造商指定。在37℃，通常所用的温育时间为大约1小时，但可以按照供应商的说明书变化。在消化后，可以将反应物直接在凝胶上进行电泳以分离期望片断。
正如在本发明中所用，术语“表位”指抗原上的抗原决定簇，如肌醇六磷酸酶多肽，抗体的抗原互补位与其相结合，如肌醇六磷酸专一性抗体。抗原决定簇通常由分子中的化学活性的表面基团组成，如氨基酸或糖侧链，并且可以具有特异的三维结构特征，以及特殊电荷特征。
当指图1所述酶时，术语“片断”、“衍生物”和“类似物”包括一种保持了至少一种生物功能或活性的酶，且该生物功能或活性至少与参考酶的基本上相同。而且，术语“片断”、“衍生物”或者“类似物”以“前形式”分子为例证，如低活性前蛋白质，它们可以通过裂解修饰而产生具有显著较高活性的成熟酶。
术语“基因”指与产生多肽链有关的DNA片断；它包括编码区之前和之后的区域(前导区和非转录尾区)，以及单个编码片断(外显子)之间的间插序列(内含子)。
术语“分离的”指从原始环境(例如，如果是自然发生的话，即自然环境)分离出来的物质。例如，在活的动物体中存在的自然发生的多核苷酸或酶不是分离的，但从一些或所有自然系统中的共存物质中分离出来的该相同的多核苷酸或酶是分离的。这样的多核苷酸可以是载体的一部分和/或这样的多核苷酸或酶可以是组合物的一部分，它们仍然是分离的原因在于这些载体或组合物不是其自然环境的一部分。
“分离的核酸”指核酸，例如DNA或RNA分子，其不与5’和3’侧翼序列直接邻接，但当存在于其来源生物的自然发生的基因组中时，通常与5’和3’侧翼序列直接邻接。例如，该术语从而描述了一种整合进载体的核酸，如质粒或病毒载体；一种整合进异种细胞(或同种细胞的基因组，但在不同于其自然发生位点的位点)的基因组的核酸；一种以分离分子存在的核酸，如通过PCR扩增或限制性酶消化而产生的DNA片断，或通过体外转录产生的RNA分子。该术语也描述了一种重组核酸，其构成编码其它多肽序列的杂交基因的一部分，例如它可以在融合蛋白的产生中使用。
“连接反应”指在两个双链核酸片断之间形成磷酸二酯键的方法(Sambrook等人，1989)。除非另外的情况下，连接反应可以使用已知的缓冲液和条件实现，每0.5μg被连接的大约等摩尔的DNA片断使用10单位的T4 DNA连接酶(“连接酶”)。
正如此处所用，“核酸分子”包括至少一个核苷酸碱基或一个核苷酸碱基对，这分别依赖于核酸分子是单链还是双链。而且，核酸分子排他地或嵌合性地属于任何含核苷酸分子的组中，正如下述举例说明的核酸分子组，但不限于：RNA、DNA、基因组核酸、非基因组核酸、自然存在和非自然存在的核酸，以及合成核酸。这包括，以非限定性实例的方式，与任何细胞器官结合的核酸，如线粒体，核糖体RNA，以及嵌合性地包括一个或多个组分，它们与自然存在的组分不是自然地一起存在。
另外，“核酸分子”可以部分地包括一个或多个不基于核苷酸的组分，如举例说明，但不限于，氨基酸和糖。因此，作为例子，但不是限制性的，部分基于核苷酸和部分基于蛋白质的核酶被认为是“核酸分子”。
另外，作为例子，但不是限制性的，用可检测的部分标记的核酸分子，如放射性或也可以是非放射性标记，被同样地认为是“核酸分子”。
术语“编码特定酶的核酸序列”或“特定酶的DNA编码序列”或“编码特定酶的核苷酸序列”-以及其它同义术语-指当处于适当调节序列的控制下时，被转录及翻译为酶的DNA序列。“启动子序列”是一个能在细胞中结合RNA聚合酶且发动下游(3’方向)编码序列转录的DNA调节区。启动子是DNA序列的一部分。该序列区在其3’末端有一个起始密码子。启动子序列最小数量的碱基，其中包括在高于背景结合的可检测水平启动转录所需要的元件。然而，在RNA聚合酶结合到该序列上且转录在起始密码子(具有启动子的3’末端)被发动后，转录在3’方向朝下游进行。在启动子序列内将发现负责RNA聚合酶结合的转录起始位点(便利地通过用核酸酶S1作图来确定)以及蛋白质结合区域(共有序列)。
术语“编码酶(蛋白质)的核酸”或“编码酶(蛋白质)的DNA”或“编码酶(蛋白质)的多核苷酸”及其它同义术语包括一个仅包括编码酶序列的多核苷酸和一个包括额外的编码和/或非编码序列的多核苷酸。
在一个优选实施方案中，“特定核酸分子种类”是通过其化学结构定义的，作为举例说明，但不限于，其一级序列。在另一个优选实施方案中，特定“核酸分子种类”是通过核酸种类的功能或通过来源于核酸种类的产物的功能而定义的。因此，作为非限定性实例，“特定核酸分子种类”可以通过可归因于它的一个或多个活性或特性来定义，包括可归因于其表达产物的活性或特性。
该定义“将工作核酸样品装配进核酸文库”包括将核酸样品整合进基于载体的集体中的方法，如通过连接进载体及转化宿主。下文提供了对有关载体、宿主和其它试剂及其特定的非限定性实例的描述。该描述“将工作核酸样品装配进核酸文库”也包括将核酸样品整合进不基于载体的集体中的方法，如通过与接头的连接。优选地接头可以与PCR引物退火，以便有助于PCR扩增。
因此，在一个非限定性实施方案中，“核酸文库”包括一个或多个核酸分子的基于载体的集体。在另一个优选实施方案中，“核酸文库”包括核酸分子的不基于载体的集体。仍然在另一个优选实施方案中，“核酸文库”包括部分基于载体和部分不基于载体的核酸分子的联合集体。优选地，包括文库的分子集体可以根据单一的核酸分子种类进行查找和分离。
本发明提供了“核酸构建体”或也可以是“核苷酸构建体”或也可以是“DNA构建体”。此处用术语“构建体”来描述分子，如多核苷酸(如肌醇六磷酸酶多核苷酸)可以任选地与一个或多个其它分子部分化学结合，如载体或载体的一部分。在一个特定的-但决不是限定性的-方面，核苷酸构建体的例证是适合于宿主细胞转化的DNA表达构建体。
“寡核苷酸”指可以化学合成的单链多脱氧核苷酸或者两个互补的多脱氧核苷酸链。这样的合成寡核苷酸可以含有或可以不含5’磷酸。那些不含5’磷酸的合成寡核苷酸将不与另一个寡核苷酸连接，在存在激酶的情况下不需要用ATP添加磷酸。一个合成寡核苷酸将与未被脱去磷酸的片断连接。
当RNA聚合酶将两个编码序列转录为一个单一mRNA时，一个编码序列被“可操作地连接到”另一个编码序列上，然后这两个编码序列被翻译为一个单一多肽，其含有来自两个编码序列的氨基酸。编码序列不需要彼此邻接，只要表达序列被最终加工可以产生期望蛋白质。
术语“肌醇六磷酸酶专一性探针”，在本发明所述方法的上下文中，是指与编码肌醇六磷酸酶多肽的核酸结合，或与其互补序列结合的探针，相比于编码其它酶的核酸，或其互补序列，其具有的可检测程度更大。
严格意义上来说，术语“肌醇六磷酸酯”、“肌醇六磷酸”和“肌醇六磷酸钙镁”可以如下进行区分：“肌醇六磷酸盐”指肌醇六磷酸的阴离子形式；“肌醇六磷酸”指肌醇六磷酸，一种在植物中自然存在的化合物，尤其包括植物叶子，并且它可以作为酶肌醇六磷酸酶的模板；“肌醇六磷酸钙镁”指一种肌醇六磷酸盐，如肌醇六磷酸的钙镁盐。因此，可以理解到，“肌醇六磷酸酯(phytate)”、“肌醇六磷酸(phytic acid)”和“肌醇六磷酸钙镁(phytin)”是化学相关的，并且具有共用化学结构的可互相转化的形式。因此，在此所用，既然它们是高度相关、相似、化学可转化的，那么“肌醇六磷酸酯”、“肌醇六磷酸”和“肌醇六磷酸钙镁”是可互换的术语，而且它们全部(或者具有或者不具有所述化学互变)可以用即将公开的新肌醇六磷酸酶来消化。因此，“肌醇六磷酸酯”、“肌醇六磷酸”和“肌醇六磷酸钙镁”中仅一个术语被用于此处公开的方法的描述中，可以理解到，它可以作为进一步指包括“肌醇六磷酸酯”、“肌醇六磷酸”和“肌醇六磷酸钙镁”的酶肌醇六磷酸酶的任何底物的代表性术语。
“多核苷酸”是包括2个或更多个核苷酸碱基或核苷酸碱基对的分子。
具有“前形式(pre-form)”或“原形式(pro-form)”的分子指经历一个或多个共价和非共价化学修饰(如糖基化、蛋白酶剪切、二聚或寡聚作用、温度诱导或pH诱导构象变化、与辅因子的缔合等等)的任何组合的分子，在此过程中以得到一个与参考原形式分子相比，在特性上有差异(如活性增加)的更成熟的分子形式。当以“前形式”或“原形式”的前体分子能够经历两个或多个化学修饰(如两个蛋白酶剪切，或者一个蛋白酶剪切和一个糖基化变化)，在此过程以产生一个成熟分子，术语“前-原-形式”也可以用于参考前体分子。因此，前-原-酶是一种“前-原-形式”的酶。同样地，前-原激素是一种“前-原-形式”的激素。
在此所用，术语“试剂”包括本发明的肌醇六磷酸酶分子。优选地，这样的肌醇六磷酸酶分子催化肌醇六磷酸到肌醇和自由磷酸的水解，以便从肌醇六磷酸复合物中释放矿物质。代表性肌醇六磷酸酶分子是来自大肠杆菌B的肌醇六磷酸酶。这种代表性酶如图1的SEQ ID NO：2中所示。因此，正如此处所用，术语“试剂”包括本发明的底物试剂分子，如肌醇六磷酸分子。优选地，这样的肌醇六磷酸分子存在于食品、潜在食品、食品的副产物(体外副产物和体内副产物中，如体内反应产物和动物排泄物产物)、食品的前体，以及其它肌醇六磷酸来源中。
“重组”酶指通过重组DNA技术产生的酶，即用编码期望酶的外源DNA构建体所转化的细胞产生的酶。“合成”酶是通过化学合成制备的酶。
正如本领域所已知的，两种酶之间的“相似性”是通过将一个酶的氨基酸序列及其保守氨基酸取代物与第二个酶的序列相比较来确定的。相似性可以通过本领域熟知的方法来确定，例如，BLAST程序(Basic Local Alignment Search Tool atthe National Center for Biological Information)。
如果比其它的非专一性分子具有更大的亲和力而发生彼此结合，那么一对分子的成员(如抗体-抗原对或核酸对)被认为是彼此“专一性地结合”的。例如，由一种抗原所制备的抗体，相对于非专一性蛋白质，该抗原的结合性能更有效，那么该抗体可以被描述为专一性地与该抗原结合。(同样地，如果核酸探针通过碱基对相互作用与靶物质形成专一性复合，那么它可以被描述为专一性地与核酸靶物质结合(参考上边)。)
“严格的杂交条件”指只有在序列之间有至少90％的同一性，优选至少95％，最优选至少97％时才发生的杂交。参考Sambrook等人，1989，将其完整引用于此作为参考。
本发明中也包括具有与肌醇六磷酸酶多肽的序列“基本一样的”序列的多肽，如SEQ ID NO：1之一。“基本一样的”氨基酸序列是只在保守的氨基酸取代上不同于一个参考序列或多个序列的序列，例如，一个氨基酸取代同一类别的另一个氨基酸(如一个疏水氨基酸，如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸，取代另一个；或一个极性氨基酸取代另一个，如精氨酸取代赖氨酸，谷氨酸取代天门冬氨酸，或谷氨酰胺取代天冬酰胺)。
而且，“基本一样的”氨基酸序列是不同于一个参考序列或多个序列的氨基酸序列，或通过一个或多个非保守取代、缺失或插入不同的氨基酸序列，尤其当这样的取代发生在该分子中的不是活性位点的位点，只要该多肽基本上保持了其行为特性。例如，肌醇六磷酸酶多肽可以缺失一个或多个氨基酸，这导致了多肽结构的修饰，而不显著地改变其生物活性。例如，可以除去肌醇六磷酸酶生物活性不需要的氨基或羧基末端的氨基酸。这样的修饰导致较小的活性肌醇六磷酸酶多肽的开发。
本发明提供了一种“基本上纯化的酶”。术语“基本上纯化的酶”在此处用来描述分子，如基本上不含其它蛋白质、脂类、碳水化合物、核酸及其它与其自然缔合的生物物质的多肽(如肌醇六磷酸酶多肽或其片断)。例如，基本上纯化的分子，如多肽，以干重而言，可以是至少60％的相关分子。多肽的纯度可以用标准方法来确定，如聚丙烯酰胺凝胶电泳(如SDS-PAGE)、柱层析法(如高效液相层析法(HPLC))和氨基末端氨基酸序列分析。
本发明提供了催化肌醇六磷酸到肌醇和自由磷酸的水解的纯化的重组酶，以便从肌醇六磷酸复合物释放矿物质。代表性纯化酶是来自大肠杆菌B的肌醇六磷酸酶。该代表性酶如图1的SEQ ID NO：2所示。
本发明的酶包括，除了图1的酶(尤其是成熟酶)以外，具有与肌醇六磷酸酶多肽的序列“基本一样的”序列的多肽，如SEQ ID：1之一。
在一个实施方案中，本发明的SEQ ID NO：2的肌醇六磷酸酶的分子量为47,056千道尔顿，是用SDS-PAGE测量的，并从该基因的核苷酸序列推理而来。其pI是6.70。该酶的pH值和温度图及稳定性数据在图2中给出。该纯化酶可以在期望的地方用于催化肌醇六磷酸到肌醇和自由磷酸的水解。本发明的肌醇六磷酸酶具有很高的热稳定性；因此它尤其可以用于高温和/或高压应用中，包括但不限于，制备鱼类食品颗粒中，这种食品颗粒不会过早地溶解于水中。
在本发明中所包括的肌醇六磷酸酶多肽可以具有图1(SEQ ID NO：2)所示的肌醇六磷酸酶的氨基酸序列。肌醇六磷酸酶多肽，如那些从大肠杆菌B(E.coli B)分离的，特征在于催化肌醇六磷酸到肌醇和自由磷酸的水解，以便从肌醇六磷酸复合物释放矿物质。
在本发明中所包括的其它肌醇六磷酸酶多肽是具有与肌醇六磷酸酶多肽的氨基酸序列至少大约50％的同一性的氨基酸序列的多肽，如SEQ ID NO：2中的任何肌醇六磷酸酶。确定氨基酸序列同源性的对照长度可以是，例如至少15个氨基酸，及例如至少20、25或35个氨基酸。
同源性或同一性通常是用序列分析软件(如Sequence Analysis SoftwarePackage of the Genetics Computer Group，University of Wisconsin BiotechnologyCenter，1710 University Avenue，Madison，WI 53705)确定的。这样的软件通过将同源性等级分配给各种缺失、取代及其它修饰来匹配相似序列。在上下文中，术语两个或多个核酸或多肽序列的“同源性”和“同一性”指相同序列或子序列或者，当用许多序列比较算法或通过人工对比和视觉观察测量时，在比较窗口或指定区域比较且对比最大化对应时，或具有特定百分比的氨基酸残基或核苷酸相同的两个或更多个序列或者子序列。
对于序列比较，通常一个序列作为参考序列，测试序列与其进行比较，不过可以使用参考序列数据库。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机，如果必要，指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。可以使用默认程序参数，或可以指定备选参数。然后基于程序参数，用序列比较算法计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。
正如此处所用，“比较窗口”包括是指选自20～600，通常为大约50～大约200，更通常大约100～大约150的邻接位置的任一个数目的片断，在这些片断中，在两个序列被最优地对比后，一个序列可以与具有相同数目的邻接位置的参考序列进行比较。用于比较的序列对比方法在本领域是熟知的。可以进行最优的序列对比比较，如通过local homology algorithm，由Smith & Waterman，Adv.Appl.Math.2：482，1981提供；通过homology alignment algorithm，由Needleman&Wunsch，J.Mol.Biol 48：443，1970提供；通过search for similarity method，由person & Lipman，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 85：2444，1988提供，通过这些算法的计算机化实现(Wisconsin Genetics Software Package，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，WI中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)，或通过人工对比和视觉观察。例如，用于确定同源性或同一性的其它算法包括，除了BLAST程序(BasicLocal Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information)、ALIGN、AMAS(Analysis of Multiply Aligned Sequences)、AMPS(Protein MultipleSequence Alignment)、ASSET(Aligned Segment Statistical Evaluation Tool)、BANDS、BESTSCOR、BIOSCAN(Biological Sequence Comparative Analysis Node)、BLIMPS(Blocks IMProved Searcher)、FASTA、Intervals & Points、BMB、CLUSTALV、CLUSTAL W、CONSENSUS、LCONSENSUS、WCONSENSUS、Smith-Watermanalgorithm、DARWIN、Las Vegas algorithm、FNAT(Forced Nucleotide AlignmentTool)、Framealign、Framesearch、DYNAMIC、FILTER、FSAP(Fristensky SequenceAnalysis Package)、GAP(Global Alignment Program)、GENAL、GIBBS、GenQuest、ISSC(Sensitive Sequence Comparison)、LALIGN(Local Sequence Alignment)、LCP(Local Content Program)、MACAW(Multiple Alignment Construction & AnalysisWorkbench)、MAP(Multiple Alignment Program)、MBLKP、MBLKN、PIMA(Pattern-Induced Multi-sequence Alignment)、SAGA(Sequence Alignment byGenetic Algorithm)和WHAT-IF。这些算法程序也可以用来筛选基因组数据库，以区分序列基本上一样的多核苷酸序列。许多基因组数据库是可利用的，例如，人类基因组的实质部分可以作为人类基因组测序项目的一部分来利用(J.Roach，http：//weber.u.Washington.edu/～roach/human genome progress 2.html)(Gibbs，1995)。至少21个其它基因组已经被测序，例如包括M.genitalium(Fraser等人，1995)、M.jannaschii(Bult等人，1996)、H.influenzae(Fleischmann等人，1995)、大肠杆菌(Blattner等人，1997)和酵母(S.cerevisiae)(Mewes等人，1997)和D.melanogaster(Adams等人，2000)。在模型生物的基因组的测序上已经取得了显著的进步，如鼠、C.elegans和Arabadopsis sp。几个含有注解有某些功能信息的基因组信息由不同的组织所保存，可以通过因特网访问，例如www.tigr.org/tdb；www.genetics.wisc.edu；http：//genome-www.stanford.edu/～ball；hiv-we b.lanl.gov；www.ncbi.nlm.nih.gov；www.ebi.ac.uk；http：//Pasteur.fr/other/biology；和 www.genome.wi.mit.edu。
一个有用算法的实例是BLAST和BLAST 2.0算法，对它们的描述分别在Altschul等人，Nuc.Acids Res.25：3389-3402，1977和Altschul等人，J.Mol.Biol.215：403-410，1990中。完成BLAST分析的软件可以通过NationalCenter for Biotechnology Information( http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)公开获得。该算法首先涉及通过识别查询序列中的长度W的短单词来识别高计分序列对(HSP)，当在数据库序列中用相同长度的单词对比时，该高记录序列对或者匹配或者满足一些正阈值T。T优选指相邻单词分数阈值(Altschul等人，见上文)。这些起始的相邻单词命中作为寻找包括它们的更长HSP的初始搜索的种子。这些单词命中在两个方向沿着每一个序列一直延伸，直到累积对比值增加。对于核苷酸序列，用参数M(一对匹配残基的得分；通常＞0)对累积值进行计算。对于氨基酸序列，用计分矩阵来计算累积值。当发生下列情况时暂停在每一方向的单词命中的延伸：累积对比值随着数量X从其最大获得值下降；由于一个或多个负得分参加对比值的累积，累积值达到零或零以下；或者达到了任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X确定对比的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)使用的默认值为：单词长度(W)为11，期望值(E)为10，M＝5，N＝-4，以及两个链的比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用的默认值为：单词长度为3，期望值(E)为10，BLOSUM62计分矩阵(参考Henikoff &Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915，1989)对比值(B)为50，期望值(E)为10，M＝5，N＝-4，以及两个链的比较。
BLAST算法也进行两个序列之间相似性的统计分析(如参考Karlin&Altchul，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873，1993)。由BLAST算法提供的相似性的一个测量是最小的总计几率(P(N))，该值提供了几率指标，通过它两个核苷酸或氨基酸序列之间的匹配将偶然地发生。例如，如果测试核酸与参考核酸的比较中最小的总计几率小于大约0.2，更优选小于大约0.01，最优选小于大约0.001，那么核酸被认为与参考序列是相似的。
在一个实施方案中，用Basic Local Alignment Search Tool(“BLAST”)来评价蛋白质和核酸序列同源性。尤其是，使用五个特定BLAST程序来完成下述任务：
(1)BLASTP和BLAST3将氨基酸查询序列与蛋白质序列数据库进行比较；
(2)BLASTN将核苷酸查询序列与核苷酸序列数据库进行比较；
(3)BLASTX将查询核苷酸序列(两个链)的六读框概念翻译产物与蛋白质序列数据库进行比较；
(4)TBLASTN将查询蛋白质序列与以总共六个阅读框(两个链)翻译的核苷酸序列数据库进行比较；和
(5)TBLASTX将核苷酸查询序列的六读框翻译与核苷酸序列数据库的六读框翻译进行比较。
BLAST程序通过识别查询氨基酸或核酸序列与测试序列之间相似片断，在此处被称作“高计分片断对”，来识别同源序列，其中测试序列优选从蛋白质或核酸序列数据库获得。高计分片断对优选通过计分矩阵方法来识别(即对比)，其中大部分方法在本领域是已知的。优选地，所用的计分矩阵是BLOSUM62矩阵(Gonnet等人，Science 256：1443-1445，1992；Henikoff和Henikoff，Proteins 17：49-61，1993)。不太优选地，也可以使用PAM或PAM250矩阵(如参考Schwartz和Dayhoff编著，1978，Matrices for Detecting Distance Relationships：Atlas of Protein Sequence andStructure.Washington：National Biomedical Research Foundation)。BLAST程序可以通过美国National Library of Medicine获得。
可以根据序列长度和所研究的同源性程度对上述算法所用的参数进行修改。在一些实施方案中，在没有用户说明书的情况下，这些参数可以是这些算法所用的默认参数。
本发明进一步涉及一种具有图1的推断氨基酸序列的酶，以及这种酶的类似物、衍生物和片断。
图1所示酶的类似物、衍生物或片断可以是(a)其中用没有用遗传密码编码的氨基酸残基取代的一个或多个氨基酸残基的类似物、衍生物或片断，或(b)其中一个或多个氨基酸残基包括一个取代基团的类似物、衍生物或片断，或(c)其中用另一种化合物来融合成熟酶的类似物、衍生物或片断，如可以增加酶的半衰期的化合物(例如聚乙二醇)，或(d)提供一个标记或标志，如6xHis标志或绿色荧光蛋白质标志，(e)其中另外的氨基酸被融合到成熟酶上的类似物、衍生物或片断，如前导序列或分泌序列或用于纯化成熟酶的序列或前蛋白质序列。根据下面的教导，这些类似物、衍生物和片断被认为在本领域普通技术人员的知识范围内。
变体，如“片断”、“类似物”或“衍生物”酶，以及参考酶可以在氨基酸序列上不同，不同的方式有一个或多个取代、添加、缺失、融合和截短，这些方式可以任意组合而存在。
在优选变体中是那些通过保守氨基酸取代参考序列的变体。这些取代是，多肽中的一个给定氨基酸被另一个具有类似特征的氨基酸取代。通常看作保守取代的是，在脂肪族氨基酸Ala、Val、Leu和Ile中用一个替代另一个；带有羟基残基的Ser和Thr的互换，带有酸性残基的Asp和Glu的交换，带有氨基残基的Asn和Gln之间的取代，带有碱性残基的Lys和Arg的交换，带有芳族残基的Phe、Tyr中的替代。
因此，在一个特定的非限定性例证中，取代可以包括一个氨基酸被另一个具有类似特性的氨基酸取代。在另一个特定的非限定性例证中，取代可以包括一个氨基酸被一个不相似的氨基酸取代，在此处该变化是非抑制的或沉默的或对于酶的至少一种性质而言是改进的。
因此，在一个非限定性例证中，添加可以包括或者在蛋白质的氨基末端或羧基末端，或者可选择地在末端位点之间添加，在此处该变化是非抑制的或沉默的或对于酶的至少一种性质而言是改进的。
在另一个特定的非限定性例证中，在用参考多核苷酸(SEQ ID NO：1)编码的酶中，变化可以包括多种修饰，包括取代、添加、缺失、融合和/或截短，这样，不考虑单一修饰的效果，当一起看作一组时，修饰的效果是非抑制的或沉默的或对于酶的至少一个特性而言是改进的。
最优选的是基本上保留了与它变化而来的参考多肽具有相同生物功能和活性的变体。
术语“变体”指(分别)在一个或多个碱基对、密码子、内含子、外显子或氨基酸残基上发生修饰的本发明的多核苷酸或多肽，但仍然保持本发明的肌醇六磷酸酶的生物活性。可以通过许多方法来产生变体，例如包括如下面更详细讨论的方法：易错PCR、改组、寡核苷酸定向诱变、装配PCR、有性PCR诱变、体内诱变、盒式诱变、递推集团诱变、指数集团诱变、位点特异性诱变、连接重装配、GSSM及其任意组合。
本发明的一个方面是，提供了分离的核酸分子(多核苷酸)，其编码具有图1所示的推断氨基酸序列的成熟酶。
正如下边所描述的，编码SEQ ID NO：2的多核苷酸最初由从大肠杆菌B回收的基因组DNA分离而来。它包括一个编码432个氨基酸残基的蛋白质的可读框。
本发明的另一个方面是，提供了一种分离的多核苷酸，其编码本发明(SEQ IDNO：1)的代表性酶，包括图1所示DNA。
本反应也涉及不同于参考多核苷酸的多核苷酸，例如变化是沉默变化，例如变化不改变由多核苷酸编码的氨基酸序列。本发明也涉及多肽变化，这些变化在由参考多核苷酸(SEQ ID NO：1)编码的酶中导致氨基酸取代、添加、缺失、融合和截短。在本发明的一个优选方面，这些酶保持了与由参考多核苷酸编码的酶大概相同的生物作用。
本发明也提供分离的核酸分子，其编码上述肌醇六磷酸多肽。例如，编码SEQID NO：2的核酸包括在本发明中。这些核酸可以包括天然存在的核苷酸序列，或不同于那些编码肌醇六磷酸的天然序列，但由于遗传密码的简并性而编码相同氨基酸的核酸的序列。本发明的核酸可以包括DNA或RNA核苷酸，或其组合或修饰。本发明的代表性核酸在SEQ ID NO：1中给出。
本发明的多核苷酸可以是DNA形式，其包括cDNA、基因组DNA以及合成DNA。DNA可以是双链或单链的，并且如果是单链，可以是编码链或非编码(反义)链。编码成熟酶的编码序列可以与图1所示的编码序列和/或保藏克隆(SEQ IDNO：1)的编码序列相同，或可以是一个不同的编码序列，其作为遗传密码的冗余或简并的结果，编码与图1(如SEQ ID NO：1)的DNA编码相同的成熟酶。
编码图1(如SEQ ID NO：2)的成熟酶的多核苷酸可以包括但不限于：仅有成熟酶的编码序列；成熟酶的编码序列和附加编码序列，如前导序列或前蛋白质序列；成熟酶(以及任选地附加编码序列)的编码序列和非编码序列，如内含子或成熟酶的编码序列的5’端和/或3’端非编码序列。
本发明进一步涉及上文描述的多核苷酸的变体，其编码具有图1(如SEQ IDNO：2)的推断氨基酸序列的酶的片断、类似物和衍生物。多核苷酸的变体可以是多核苷酸的天然存在的等位基因变体或多核苷酸的非天然存在的变体。
因此，本发明包括编码与图1所示相同的成熟酶的多核苷酸，以及这些多核苷酸的变体，这些变体编码图1的酶的片断、衍生物或类似物。这样的核苷酸变体包括缺失变体、取代变体和添加或插入变体。
正如上文所说明的，多核苷酸可以具有一个编码序列，它是图1所示的编码序列的天然存在的等位基因变体。正如本领域所已知的，等位基因变体是可以具有一个或多个核苷酸的取代、缺失或添加的多核苷酸序列的可替代形式，它实质上不改变所编码酶的功能。
正如此处所讨论的，可以通过许多方法来产生变体，例如包括：易错聚合酶链式反应、改组、寡核苷酸定向诱变、装配PCR、有性PCR诱变、体内诱变、盒式诱变、递推集团诱变、指数集团诱变、位点特异性诱变、连接重装配、GSSM及其任意组合。
一方面，定义为合成连接重装配(SLR)的非随机方法可以用来产生变体，该方法在某种程度上与随机改组相关，只是核酸构筑模块不被随机地改组或连接或嵌合，而是被非随机性地装配。
SLR方法不依赖于被改组的多核苷酸之间的高水平同源性的存在。本发明可以被用来非随机地产生包括超过10100个不同嵌合体的子代分子文库(或集合)。可以想象，SLR甚至可以被用来产生包括超过101000个不同子代嵌合体的文库。
因此，一方面，本发明提供了一种非随机方法，该方法产生一组最终嵌合的核酸分子，该核酸分子具有由设计所选定的总装配次序，该方法包括下述步骤：通过设计来产生多种具有有用的相互匹配可连接末端的多个特定核酸构筑模块，和装配这些核酸构筑模块，这样就获得了计划的总装配次序。
被装配的核酸构建模块(building block)的相互匹配可连接末端被认为对这种类型的有序装配是“有用的”，如果它们可以使构筑模块以预定次序耦联。因此，一方面，其中核酸构筑模块可以被耦联的总装配次序由可连接末端的设计规定，如果使用了一个以上的装配步骤，那么其中核酸构筑模块可以被耦联的总装配次序也可以由装配步骤(多个装配步骤)的连续次序来规定。在本发明的一个实施方案中，用酶如连接酶(如T4 DNA连接酶)来处理退火的构筑片段以实现构筑片段的共价键合。
在另一个实施方案中，核酸构筑模块的设计是在分析了一组祖先核酸模板的序列的基础上得到的，这些模板可以作为产生最终嵌合核酸分子的子代组的基础。因此，这些祖先核酸底物作为一种序列信息的来源，其有助于设计被诱变即被嵌合或被改组的核酸构筑模块。
在一个例证中，本发明提供了相关基因家族和其相关产物的编码家族的嵌合。在一个特定例证中，被编码产物是酶。本发明的酶和多肽可以按照下面描述的方法来诱变。
因此根据本发明的一方面，将多种祖代核酸模板的序列进行对比，以便于选择一个或多个分界点，这些分界点可以位于一个同源区。这些分界点可以被用来描绘所产生的核酸构筑模块的分界。因此，在祖代分子中识别和选择的分界点在子代分子的装配中作为潜在的嵌合点。
通常有用的分界点是由至少两个祖代模板共享的一个同源区(包括至少一个同源核苷酸碱基)，但分界点可以是由至少半个祖代模板，至少三分之二个祖代模板，至少四方之三个祖代模板，优选地至多全部祖代模板共享的一个同源区。更优选地，有用的分界点仍然是由全部祖代模板共享的一个同源区。
在一个实施方案中，彻底地进行连接重装配过程，以便产生一个完整文库。换句话说，核酸构筑模块的所有可能的有序组合都出现在最终嵌合核酸分子集合中。同时，每一组合中的装配次序(即每一最终嵌合核酸的5’到3’序列中的每一构筑模块的装配次序)是经过设计的(或非随机的)。由于该方法的非随机特性，大大降低了不必要的副产品的可能性。
在另一个实施方案中，该方法提供了系统地进行连接重装配过程，例如为了产生一个被系统地区室化的文库，其具有可以被系统地，如一个接一个地进行筛选的区室。换句话说，本发明提供了通过特定核酸构筑模块的选择和明智使用，以及与顺序地阶段进行的装配反应的选择和明智使用相结合，可以实现在几个反应容器中的每一个中制备子代产物的特定集合的实验设计。这样使系统检验和筛选过程可以得到进行。从而，允许在较小的群体中对潜在的大量子代分子进行系统检验。
由于其以高度灵活但同样全面且系统的方式进行嵌合的能力，尤其当在祖先分子中有低水平同源性时，本发明提供了产生包括大量子代分子的文库(或集合)。由于该连接重装配发明的非随机特性，所产生的子代分子优选地包括一个最终嵌合核酸分子文库，其具有根据设计选定的总装配次序。在一个特定实施方案中，这样产生的文库包括超过103～101000个不同的子代分子种类。
一方面，如所描述产生的最终嵌合核酸分子的集合包括编码多肽的多核苷酸。根据一个实施方案，该多核苷酸是基因，它可以是人造基因。根据另一个实施方案，该多核苷酸是基因通路，它可以是人造基因通路。本发明所产生的一个或多个人造基因可以被整合进人造基因通路中，如可以在真核生物(包括植物)中操作的通路。
在另一个例证中，产生构筑模块步骤的合成特性允许设计和引入核苷酸(如一个或多个核苷酸，例如它们可以是密码子或内含子或调节序列)，其随后可以任选地在体外过程(如通过诱变)或体内过程(如通过利用宿主生物的基因剪接能力)去除。应该意识到在许多情况下，除了产生有用分界点的潜在好处之外，由于许多其它原因也期望引入这些核苷酸。
因此根据另一个实施方案，本发明提供，可以用核酸构筑模块来引入内含子。因此，本发明提供可以将功能内含子引入本发明的人造基因。本发明也提供可以将功能内含子引入本发明的人造基因通路。因此，本发明提供了产生嵌合多核苷酸，其为一个含有一个(或多个)人工引入的内含子的人造基因。
因此，本发明也提供了产生嵌合多核苷酸，其为一个含有一个(或多个)人工引入的内含子的人造基因通路。优选地，人工引入的内含子在一个或多个宿主细胞内对于基因剪接是有功能的，主要是以自然存在的内含子在基因剪接中所发挥功能性作用的方式进行。本发明提供了一种产生含有人造内含子的多核苷酸的方法，其中所述多核苷酸将被引入宿主生物用于重组和/或剪接。
用本发明产生的人造基因也可以作为与另一个核酸进行重组的底物。同样地，用本发明产生的人造基因通路也可以作为与另一个核酸进行重组的底物。在一个优选的情况中，重组是由含有人造内含子的基因和作为重组配对体的核酸之间的同源区来促进的，或者在该区发生的。在一个尤其优选的情况中，重组配偶体也可以是用本发明所产生的核酸，包括人造基因或人造基因通路。重组可以由在人造基因中一个(或多个)人工引入的内含子中存在的同源区来促进，或在该区发生。
本发明的合成连接重装配法使用了多种核酸构筑模块，其中每一个优选地具有两个可连接末端。在每一核酸构筑模块上的两个可连接末端可以是两个钝端(即每一个没有核苷酸的悬端)，或优选地是一个钝端和一个悬端，或优选地仍然是两个悬端。
用于该目的的有用的悬端可以是一个3’悬端或一个5’悬端。因此，核酸构筑模块可以具有一个3’悬端或可选择地具有一个5’悬端或可选择地具有两个3’悬端或可选择地具有两个5’悬端。通过有目的的实验设计确定总次序，而不是随机的，核酸构筑模块是以这种次序进行装配以形成一个最终嵌合核酸分子。
根据一个优选实施方案，核酸构筑模块是通过两个单链核酸(也称为单链寡核苷酸)的化学合成，然后接触来产生，这样使它们退火以形成一个双链核酸构筑模块。
双链核酸构筑模块可以是可变长度的。这些构筑模块的长度可小可大。构筑模块的优选尺寸在1个碱基对(不包括任何悬端)～100,000碱基对(不包括任何悬端)之间。也提供了其它的优选尺寸范围，其下限为1bp～10,000bp(包括其中的每一个整数)，上限为2bp～100,000bp(包括其中的每一个整数)。
存在许多方法，通过它们可以产生对本发明有用的双链核酸构筑模块；这些方法在本领域是已知的，并且熟练技术人员可以很容易地完成。
根据一个实施方案，双链核酸构筑模块是这样产生的，即首先产生两个单链核酸，使它们退火从而形成一个双链核酸构筑模块。双链核酸构筑模块的两个链在每一个远离任何形成悬端的位点上的核苷酸是互补的；从而在远离任何悬端(或多个悬端)的地方不含失配。根据另一个实施方案，双链核酸构筑模块的两个链在小于每一个远离任何形成悬端的位点上是互补的。因此，根据该实施方案，可以用双链核酸构筑模块来引入密码子简并。优选地，用此处描述的位点饱和诱变，用一个或多个N，N，G/T盒或可选择地用一个或多个N，N，N盒来引入密码子简并。
本发明的体内重组法可以以盲法在一个未知杂交或特定多核苷酸或序列的等位基因库上进行。然而，不必要知道特定多核苷酸的实际DNA或RNA序列。
在基因的混合种群内使用重组的方法对于任何有用蛋白质例如白细胞介素I、抗体、tPA和生长激素的产生都是有用的。该方法可以被用来产生具有被改变的专一性或活性的蛋白质。该方法也可以被用于产生杂交核酸序列，例如启动区、内含子、外显子、增强子序列、基因的3’非翻译区或5’非翻译区。因此该方法可以被用来产生具有增加的表达率的基因。该方法也可以用于重复DNA序列的研究。最后，该方法可以用来突变核酶或aptamer。
一方面，此处描述的多核苷酸和多肽的变体是通过使用还原性重配、重组和选择的重复循环而获得的，它们允许高复合线性序列的定向分子进化，如DNA、RNA或蛋白质完全重组。
分子的体内改组在提供变体中有用，可以用细胞的自然特性来重组多体而进行。虽然体内重组提供了分子多样性的主要自然通路，遗传重组仍然是一个相当复杂的过程，其包括1)同源性的识别；2)链裂解、链侵入和导致产生了重组交叉的代谢步骤；和最后3)交叉分解形成分离的重组分子。交叉的形成需要同源序列的识别。
在另一个实施方案中，本发明包括一个从至少第一个多核苷酸和第二个多核苷酸产生杂交多核苷酸的方法。通过将共享至少一个部分序列同源区的至少第一个多核苷酸和第二个多核苷酸引入一个合适的宿主细胞中，本发明可以被用来产生杂交多核苷酸。部分序列同源区可以促进导致产生杂交多核苷酸的序列再组织的过程。在此所用，术语“杂交多核苷酸”是用本发明的方法产生的任何核苷酸序列，其含有来自至少两个原始多核苷酸序列的序列。这样的杂交多核苷酸可以从促进DNA分子间序列整合的分子间重组事件来产生。另外，这样的杂交多核苷酸可以从分子内还原性重配方法来产生，其中该方法使用重复序列来改变DNA分子内的核苷酸序列。
本发明提供一种产生可以编码生物活性杂交多肽(如杂交肌醇六磷酸酶)的杂交多核苷酸的方法。一方面，原始多核苷酸编码生物活性多肽。本发明的方法通过使用整合原始多核苷酸序列的细胞方法产生新的杂交多肽，这样所产生的杂交多核苷酸编码表现了来自原始生物活性多肽的活性的多肽。例如，原始多核苷酸可以编码来自不同微生物的特定酶。用来自生物或变体的第一种多核苷酸编码的酶，例如，在特定环境条件，如高盐度下可以有效地发挥作用。用来自不同生物或变体的第二种多核苷酸编码的酶可以在不同环境条件，如极高温下有效地发挥作用。含有来自第一种和第二种原始多核苷酸的序列的杂交多核苷酸可以编码表现出由原始多核苷酸编码的两种酶的特征的酶。因此，杂交多核苷酸编码的酶在由第一种和第二种多核苷酸编码的每一种酶共享的环境条件，如高盐度和极高温下可以有效地发挥作用。
原始多核苷酸编码的酶包括但不限于肌醇六磷酸酶。用本发明的方法产生的杂交多肽可以表现出在原始酶中没有表现出来的特定酶活性。例如，在编码水解酶活性的多核苷酸的重组和/或还原性重配之后，可以对所得到的由杂交多核苷酸编码的杂交多肽进行筛选，以筛选从每一原始酶获得的专一性水解酶活性，即水解酶在其上发挥作用的键类型和水解酶发挥作用的温度。因此，例如可以对水解酶进行筛选以确定这些区分杂交水解酶和原始水解酶的化学官能度，例如官能度为：(a)酰胺(肽键)，即蛋白酶；(b)酯键，即酯酶和脂肪酶；(c)缩醛，即糖苷酶，以及例如温度、pH或杂交多肽发挥作用的盐浓度。
原始多核苷酸的材料分离自单一生物(“隔离群”)、在已知成分培养基(“富集培养基”)中培养的生物集合或未培养生物(“环境样品”)。使用不依赖于培养的方法从环境样品中得到编码新的生物活性的多核苷酸是最优选的，由于该方法允许人们得到未使用的生物多样性材料。
“环境文库”是从环境样品产生的，它代表可以在合适的原核宿主中繁殖的克隆载体中存储的自然存在的生物的集体基因组。由于克隆DNA最初是从环境样品直接提取的，所以该文库不限于可以在纯培养物中培养的原核生物的小片断。因此，在这些样品中存在的环境DNA的规格化可以允许比原始样品中存在的所用种类的DNA更相等的表现度。与优势种相比，这可以显著地增加从可能以几个数量级的程度低度存在的样品中的少数成分中发现有价值的基因的效率。
例如，对从一个或多个未培养微生物产生的基因文库进行筛选，以筛选出有价值的活性。编码有价值的生物活性分子的潜在通路首先被原核细胞以基因表达文库的形式捕获。从这样的文库中分离出编码有价值的活性的多核苷酸，并将其引入宿主细胞。在下述条件下培养宿主细胞，即可以促进产生具有新活性或增强活性的潜在活性生物分子的重组和/或还原性重配。
可以制备多核苷酸的微生物包括原核微生物，如黄色杆菌属、真细菌类和古细菌，低级真核微生物如真菌、一些藻类和原生动物。可以从环境样品中分离多核苷酸，其中不需要对生物进行培养就可以回收核酸或从一种或多种培养生物中回收核酸。一方面，这样的微生物可以是极端生物，如超嗜热生物、嗜冷生物、嗜冷菌、嗜盐生物、嗜压微生物和嗜酸生物。尤其优选的是从极端微生物分离出来的编码酶的多核苷酸。这样的酶可以在如下条件下发挥作用：在陆地温泉和深海热出口中高于100℃的温度下，在北极水域中低于0℃的温度下，在死海的饱和盐环境中，在煤藏和地热富含硫的温泉中pH大约为0的情况下，或者在污水污泥中pH值大于11的情况下。例如，从极端生物克隆和表达的几种酯酶和脂肪酶在整个大范围的温度和pH值下都表现出高活性。
将如上所述选择和分离的多核苷酸引入合适的宿主细胞中。合适的宿主细胞是能促进重组和/或还原性重配的任何细胞。所选择的多核苷酸优选地已经在包括适当控制序列的载体中。宿主细胞可以是高级真核细胞如哺乳动物细胞，或低级真核细胞如酵母细胞，或优选地宿主细胞可以是原核细胞如细菌细胞。可以通过磷酸钙转染、DEAE-右旋糖苷介导转染或电穿孔将构建体引入宿主细胞(Davis等人，1986)。
作为适当宿主的代表性实例，这里提及到：细菌细胞，如大肠杆菌、链酶菌属、鼠伤寒沙门氏杆菌；真菌细胞，如酵母；昆虫细胞，如果蝇属S2和秋粘虫Sf9；动物细胞如CHO、COS或Bowes黑素瘤；腺病毒；和植物细胞。根据下面的教导，适当宿主的选择被认为在本领域熟练技术人员的知识范围内。
特别参考可用于表达重组蛋白的各种哺乳动物细胞培养系统，哺乳动物表达系统的实例包括猴肾成纤维细胞的COS-7系，描述于“SV40-transformed simiancells support the replication of early SV40 mutants”(Gluzman，1981)，和其它能够表达相容载体的细胞系，例如C127、3T3、CHO、HeLa和BHK细胞系。哺乳动物表达载体将包括复制起点、合适的启动子和增强子，也包括任何必需的核糖体结合位点、聚腺苷酸化位点、剪接供体和受体位点、转录终止序列和5’侧冀非转录序列。来自SV40剪接的DNA序列和聚腺苷酸化位点可以被用来提供所需的非转录基因元件。
含有相关多核苷酸的宿主细胞可以在常规营养培养基中培养，这些培养基经过了修饰以适合于激活启动子、选择转化体或扩增基因。培养条件如温度、pH等等，为先前在选择用于表达的宿主细胞的培养中所用的条件，这些条件对普通技术人员也是显而易见的。然后对已经识别出具有特定酶活性的克隆进行测序，以识别编码具有增强活性的酶的多核苷酸序列。
另一方面，可以用一些方法从一个或多个操纵子或基因簇或其部分产生新的编码生物通路的多核苷酸。例如，细菌和许多真核细胞对于调控基因具有协调机理，调控基因的产物与相关过程有关。基因是成簇的，在结构上被称作“基因簇”，它们位于一个单个染色体上或彼此直接相邻，并且在单个调控序列的控制下被一起转录，调控序列包括一个单一启动子，其起始整个基因簇的转录。因此，基因簇是一群相邻基因，它们或者相同或者相关，通常是在功能上相同或者相关。由基因簇编码的生化通路的一个实例是聚酮化合物。聚酮化合物(polyketide)是这样的分子：具有生物活性的分子的极丰富来源，其中包括抗生素(如四环素和红霉素)、抗癌试剂(道诺霉素)、免疫抑制剂(FK506和纳巴霉素)和兽用产品(莫能菌素)。许多聚酮化合物(由聚酮化合物合酶产生)作为治疗药剂是有价值的。聚酮化合物合酶是多功能酶，其催化在长度和官能度类型和环化程度上不同的多种碳链的生物合成。聚酮化合物合酶基因属于基因簇，并且至少一种类型(类型I)的聚酮化合物合酶的基因和酶都较大，这使得基因操作和这些基因/蛋白质的体外研究变得复杂。
基因簇DNA可以从不同生物体分离，并且可以连接进载体，尤其是含有表达调控序列的载体，这些表达调控序列可以控制和调节从连接的基因簇产生可检测蛋白质或蛋白质相关排列活性。使用具有特别大容量的外源DNA引入的载体尤其适合于使用这样的基因簇，并且在此处以实施例的方式进行描述以包括大肠杆菌的f-因子(或致育因子)。该大肠杆菌的f-因子是质粒，它在接合过程中影响其本身的高频转移，并且它可以理想地获得且稳定地繁殖大DNA片断，如来自混合微生物样品的基因簇。一旦连接进一个适当的载体，两个或多个含有不同肌醇六磷酸酶基因簇的载体可以被引入合适的宿主细胞。由基因簇共享的部分序列同源区将促进导致产生了杂交基因簇的序列再组织的过程。然后对新的杂交基因簇进行筛选，以增强在原始基因簇中不存在的活性。
因此，在一个实施方案中，本发明涉及一种产生生物活性的杂交多肽且以通过如下步骤筛选这样的多肽以便增强活性的方法：
1)在合适的宿主细胞中引入至少可操作连接的第一种多核苷酸和可操作连接的第二种多核苷酸，所述第一种多核苷酸和第二种多核苷酸共享至少一个部分序列同源区；
2)在可以导致序列再组织的条件下培养宿主细胞，产生了可操作连接的杂交多核苷酸；
3)表达由杂交多核苷酸编码的杂交多肽；
4)在可以促进识别增强生物活性的条件下筛选杂交多肽；以及
5)分离编码杂交多肽的多核苷酸。
筛选各种酶活性的方法对本领域的熟练技术人员是已知的，并且在本发明整个说明书中对其进行了讨论。当分离本发明的多肽和多核苷酸时可以使用这样的方法。
作为可以在那些方法中使用的表达载体的代表性实例可以是所提及的病毒颗粒、杆状病毒、噬菌体1插入载体或取代载体、噬菌体、质粒、噬菌质粒、粘粒、fosmid、细菌人工染色体(BAC)、病毒DNA(如疫苗、腺病毒、禽痘病毒、假狂犬病和SV40的衍生物)、基于P1的人工染色体(PAC)、酵母质粒、酵母人工染色体(YAC)和对特定目的宿主(如杆状菌、曲霉菌和酵母)而言任何特定的其它载体。因此，例如DNA可以被包括在表达多肽的多种表达载体中的任一个。这样的载体包括染色体、非染色体和合成DNA序列。大量合适的载体对本领域熟练技术人员是已知的，而且可以通过商业通路获得。下述载体是通过实施例的方式提供的：细菌：pQE载体(Qiagen)、pBlusescript质粒、pNH载体、(lambda-ZAP载体(Stratagene)；ptrc99a、pKK223-3、pDR540、pRIT2T(Pharmacia)；真核：pXT1、pSG5(Stratagene)、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVLSV40(Pharmacia)。然而，可以使用任何其它质粒或其它载体，只要它们在宿主中可以复制且可以生存。低拷贝数载体或高拷贝数载体可用于本发明中。
用于本发明中的优选类型的载体包括f-因子起点复制。大肠杆菌中的f-因子(或致育因子)是质粒，它在接合过程中影响其本身的高频转移和细菌染色体本身的低频转移。尤其优选的实施方案使用了克隆载体，被称作“fosmids”或细菌人工染色体(BAC)载体。它们衍生自能稳定地整合基因组DNA大片断的大肠杆菌f-因子。当与来自混合未培养的环境样品的DNA整合时，这使得其获得稳定“环境DNA文库”形式的大基因组片断成为可能。
用于本发明中的另一种类型的载体是粘粒载体。粘粒载体最初是设计用于克隆和繁殖基因组DNA大片断的。克隆进粘粒载体在“Molecular Cloning：A laboratoryManual”(Sambrook等人，1989)中有详细描述。
表达载体中的DNA序列可操作地连接到一个适当的表达控制序列(启动子)上，以指导RNA合成。特别指定的细菌启动子包括lacI、lacZ、T3、T7、gpt、λPR、PL和trp。真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸腺嘧啶核苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、来自逆转录酶病毒的LTR启动子和小鼠金属硫蛋白-I启动子。适当载体和启动子的选择恰在本领域普通技术水平之内。表达载体也包括用于翻译起始的核糖体结合位点和转录终止子。载体也包括用于扩增表达的适当序列。可以从任何使用了带有可选择标记的CAT(氯霉素转移酶)载体或其它载体的期望基因来选择启动子区。另外，表达载体优选地包括一个或多个可选择标记基因，以提供用于选择转化宿主细胞的表型特征，如二氢叶酸还原酶或用于真核细胞培养的新酶素抗性，或四环素或大肠杆菌中的氨苄青霉素抗性。
体内重配主要指“分子间”方法，总称为“重组”，它在细菌中通常被看作“RecA-依赖性”现象。本发明可以依赖宿主细胞的重组过程对序列进行重组和重配，或者依赖细胞的能力来调控还原过程，以便通过缺失降低细胞中准重复序列的复杂性。“还原重配”方法通过“分子间”、RecA-非依赖性方法发生。
因此，在本发明的另一方面，可以通过还原重配方法产生变体多核苷酸。该方法包括产生含连续序列(原始编码序列)的构建体，将这些构建体插入适当载体，以及随后将它们引入适当宿主细胞。单一分子间识别的重配通过具有同源区的构建体中连续序列间的组合过程或准重复单元间的组合过程发生。重配法重组与和/或减小了重复序列的复杂性和程度，并且导致新分子种类的产生。可以用各种处理来提高重配比率。这些处理包括使用紫外线、或破坏DNA的化合物、和/或使用表现出“遗传不稳定性”水平增强的宿主细胞系。因此重配法可以用同源重组或准重复序列的自然特性来指导它们自己的进化。
重复或“准重复”序列在遗传不稳定性中发挥作用。在本发明中，“准重复”是不限于它们原始单元结构的重复。准重复单元可以以构建体中的一排序列而存在；类似序列的连续单元。一旦被连接，连续序列间的连接变得基本上不可见，所得构建体的准重复特性现在在分子间水平是连续的。细胞中的缺失过程降低了准重复序列间所得构建体操作的复杂性。准重复单元提供了实际上无限的模板的所有组成成分，在这些模板上发生滑动事件。包括准重复的构建体从而有效地提供了充分的分子间弹性，这样缺失(和潜在插入)事件可以实际上在准重复单元内的任何地方发生。
当在同一方向连接所用准重复序列时，例如朝着尾部或反之亦然，细胞不能区分单一单元。因此，还原性过程可以在整个序列中发生。相反，例如当这些单元头对头存在，而不是头对尾存在时，倒位确定了相邻单元的终点，这样缺失的形成将有利于不连续单元的损失。因此，本发明方法优选的是，这些序列朝相同方向。准重复序列的随机方向将导致重配效率的损失，而这些序列的一致方向将提供最高的效率。然而，虽然在相同方向具有较少的邻接序列降了效率，它仍然可以提供充分的弹性来有效地回收新分子。可以以相同方向用准重复序列制备构建体，以实现较高效率。
可以用多种方法中的任一种以头对尾方向装配这些序列，这些方法包括：
a)可以使用包括多聚腺苷酸头和多聚胸腺嘧啶核苷酸尾的引物，当多聚腺苷酸头和多聚胸腺嘧啶核苷酸尾成为单链时，可以提供定向作用。这是通过含有从RNA制备的引物的前几个碱基实现的，从而容易地去除RNAseH。
b)可以使用包括独特的限制性裂解位点的引物。将需要多个位点、一连串独特序列、重复合成和连接步骤。
c)引物内部的几个碱基可以被硫醇化，并且用核酸外切酶来产生适当的有尾分子。
重配序列的回收依赖于用还原RI识别克隆载体。然后通过扩增回收重配编码序列。将产物再克隆和表达。可以用下述情况来影响用还原RI回收克隆载体：
1)当该构建体的复杂性减少时，所用的载体才是稳定地被保持下来。
2)用物理方法对变短的载体进行回收。在这种情况下，可以使用标准质粒分离方法回收克隆载体，并用低分子量截流应用标准方法在琼脂糖凝胶或柱上进行大小分离。
3)当插入尺寸减少时，可以选择含有打断基因的载体的回收。
4)对表达载体和适当的选择使用直接选择技术。
来自相关生物的编码序列(例如，基因)可以表现出高度同源性，并且编码相当不同的蛋白质产物。这些类型的序列作为准重复在本发明中尤其有用。然而，虽然下述说明的实施例表明几乎相同的原始编码序列(准重复)的重配，但该方法不限于这些几乎相同的重复。
下述实施例对本发明的方法进行了说明。对衍生自三个独特种类的编码核酸序列(准重复)进行了描述。这些序列中的每一个，在该序列中的特定位置具有一个或几个碱基对的不同，分别称为“A”“B”和“C”。准重复序列时分别地或集体扩增，并且被连接进随机集合体中，这样在连接分子种群中可以得到所有可能的置换和重组。准重复单元的数量可以通过装配条件来控制。构建体中准重复单元的平均数量被定义为重复指数(RI)。
一旦形成，可以根据已出版的方法在琼脂糖凝胶上对构建体进行大小分级分离或不进行大小分级分离，插入克隆载体，并且转染进适当的宿主细胞。然后繁殖细胞，实现了“还原重配”。如果期望，通过引入DNA破坏来刺激还原重配方法的比率。不管RI降低是使用“分子间”机理通过重复序列间的缺失形成来调节的，还是通过“分子间”机理通过类似重组的事件来调节的，都是不重要的。最终的结果是这些分子被重配进所有可能的重组中。
可选地，该方法包括筛选改组库中的文库成员的进一步的步骤，以便识别具有结合或相互作用，或催化特定反应的能力的单一改组文库成员(例如催化卤代烷烃的水解)。
从这些文库中鉴定出的多肽可以用于治疗、诊断、研究和相关的用途(例如，催化剂，增加水溶液的渗透性的溶质，等等)和/或用于一个或多个改组和/或选择的进一步循环。
另一方面，在重组或重配之前或其过程中，本发明的多核苷酸或用此处所述方法产生的多核苷酸可以被用于可促进突变引入原始多核苷酸的试剂或方法。这些突变的引入将增加所得到的杂交多核苷酸和用其编码的多肽的多样性。可以促进诱变的试剂和方法包括但不限于：(+)-CC-1065或合成类似物如(+)-CC-1065-(N3-Adenine，参考Sun和Hurley，1992)；能抑制DNA合成的N-乙酰化或N-去乙酰化4’-氟-4-氨基二苯加成物(例如，参考van de Poll等人，1992)；或能抑制DNA合成的N-乙酰化或N-去乙酰化4-氨基二苯加成物(例如，同样参考van de Poll等人，1992，第751-758页)；三价铬、三价铬盐、能抑制DNA复制的多环芳族碳氢化合物(“PAH”)DNA加成物，如7-溴甲基-苯[α]蒽(“BMA”)、三(2，3-二溴丙基)磷酸(“Tris-BP”)、1，2-二溴-3-氯丙烷(“DBCP”)、2-溴丙烯醛(2BA)、苯[α]芘-7，8-二羟基二醇-9-10-环氧化物(“BPDE”)、铂(II)卤盐、N-羟基-2-氨基-3-甲基咪唑[4，5-f]-喹啉(“N-羟基-IQ”)和N-羟基-2-氨基-1-甲基-6-苯基咪唑[4，5-f]-吡啶(“N-羟基-PhIP”)。减缓或中断PCR扩增的尤其优选的方法包括UV光(+)-CC-1065和(+)-CC-1065-(N3-Adenine)。特别包括的方法是，DNA加成物或含有来自多核苷酸或多核苷酸库的DNA加成物的多核苷酸，在进一步处理之前，它们可以通过包括加热含有多核苷酸的溶液的方法释放或去除。
本发明的另一方面是关于一种产生具有生物活性的重组蛋白质的方法，该方法是在根据本发明所述提供杂交或重配多核苷酸的产生的条件下，通过处理包括编码野生型蛋白质的双链模板多核苷酸的样品而实现的。
本发明也提供使用专利密码子引物(含有简并N，N，N序列)将点突变引入多核苷酸，从而产生一组子代多肽，其中在每一氨基酸位置(基因位点饱和突变(GSSM))再现了全长单一氨基酸取代。所用的寡核苷酸连续地包括第一个同源序列、一个简并N，N，N序列和优选但不必需的第二个同源序列。由于N，N，N序列的简并包括所有20个氨基酸的密码子，所以来自使用了该寡核苷酸的下游子代翻译产物沿着多肽的每一氨基酸位点包括所有可能的氨基酸变化。
一方面，使用一个这样的简并寡核苷酸(包括一个简并N，N，G/T盒子)将亲本多核苷酸模板中的每一原始密码子用于全长密码子取代。另一方面，使用至少两个简并N，N，G/T盒子-或者在同一寡核苷酸或不同寡核苷酸中，将亲本多核苷酸模板中的至少两个原始密码子用于全长密码子取代。因此，一个寡核苷酸中可以包括一个以上的N，N，G/T序列，以便在一个以上的位点引入氨基酸突变。多种N，N，G/T序列可以直接邻接，或被一个或多个其它核苷酸序列隔断。另一方面，可以单独使用或与含有N，N，G/T序列的密码子组合使用对于引入添加和缺失有用的寡核苷酸，以便引入氨基酸添加、缺失和/或取代的任意组合或置换。
在一个特定例证中，用含有邻接N，N，G/T三联体，即简并(N，N，G/T)n序列的寡核苷酸来同时诱变两个或多个邻接氨基酸位置是可能的。
另一方面，本发明提供使用比N，N，G/T序列具有更低简并的简并盒子。例如，在一些情况下可能期望使用(如在寡核苷酸中)仅包括一个N的简并三联体序列，其中所述N可以在三联体的二分之一或三分之一位置。可以在保持三联体的两个位置中使用包括其任何组合和置换的任何其它碱基。另外，在一些情况下可能期望使用(如在寡核苷酸中)简并N，N，N三联体序列或N，N，G/C三联体序列。
然而，应该意识到，正如在本发明中所公布地，使用简并三联体(如N，N，G/T或N，N，G/C三联体序列)是有利的，这有几个原因。一方面，本发明提供一种方法，该方法可以系统地且相当容易地产生全长可能氨基酸(总共20个氨基酸)到多肽中每一氨基酸位置的取代。因此，对于100个氨基酸多肽，本发明提供一种方式来系统地且相当容易地产生2000个不同种类(即每个位置20个可能的氨基酸乘以100个氨基酸位置)。应该意识到，通过使用含有简并N，N，G/T或N，N，G/C三联体序列的寡核苷酸，此处提供了32个编码20个可能氨基酸的单一序列。因此，在一个使用一个该寡核苷酸将亲本多核苷酸序列用于饱和诱变的反应容器中，产生了32个编码20个变体多肽的不同的子代多核苷酸。相反，在位点定向诱变中使用非简并寡核苷酸导致了每个反应容器中仅有一个子代多肽产物。
本发明也提供使用非简并寡核苷酸，它可以被任选地与所公开的简并引物组合使用。应该意识到在某些情况下，使用非简并寡核苷酸在工作多核苷酸中产生特定点诱变是有利的。这提供了一种产生特定沉默点诱变、导致相应氨基酸变化的点诱变、引起产生终止密码子和多肽片断的相应表达的点诱变的方法。
因此，在一个实施方案中，每一饱和诱变反应容器含有编码至少20个子代多肽分子的多核苷酸，这样在一个与亲本多核苷酸中诱变的密码子位置相应的特定氨基酸位置再现了所有20个氨基酸。从每一饱和诱变反应容器中产生的32倍简并子代多肽可以被用于克隆扩增(例如，用表达载体克隆进一个合适的大肠杆菌中)且用于表达筛选。当通过筛选识别单一子代多肽以便在特性上表现出有利的变化(当与亲本多肽比较时)，可以对其进行测序以识别其中所含的相对有利的氨基酸取代。
应该意识到，正如此处所公开的一旦用饱和诱变在亲本多肽中诱变每一个氨基酸位置，可以在一个以上的氨基酸位置识别有利的氨基酸变化。产生含有这些有利的氨基酸取代的部分或全部的组合的一个或多个新子代分子。例如，如果在多肽中3个氨基酸位置中每一个位置中确定出有2个特定有利的氨基酸变化，置换在每一位置(与原始氨基酸没有变化，以及两个有利变化的每一个)包括3种可能性和3个位置。因此，总共有3×3×3或27种可能性，包括先前检验的7种-6个单一点诱变(即3个位置中每一个上有两个)以及任何位置没有变化。
仍然在另一方面，位点饱和诱变可以连同筛选与改组、嵌合、重组和其它诱变方法一起使用。本发明提供以迭代方式使用任何诱变方法，包括饱和诱变。在一个例证中，任何诱变方法的迭代使用是与筛选一起组合使用的。
因此，在一个非限定性例证中，本发明的多核苷酸和多肽可以用饱和诱变组合其它诱变方法来衍生，如两种或多种相关多核苷酸被引入合适的宿主细胞中的方法，这样就通过重组和还原重配产生了杂交多核苷酸。
除了沿着基因的整个序列进行诱变之外，诱变可以被用于在多核苷酸序列中取代许多碱基中的每一个，其中被诱变的碱基的数量优选地从15～100,000的每一个整数。因此，可以将每个碱基或离散数目的碱基(优选地是总数从15～100,000的子集)进行诱变，而不是沿着分子诱变每一位置。优选地，用分离核苷酸沿着多核苷酸序列来诱变每一位置或每一组位置。一组被诱变的3个位置可以是密码子。优选地用含有异源盒子，也称作诱变盒子的诱变引物来引入突变。优选的盒子可以具有1～500个碱基。在这样的异种盒子中的每一核苷酸位置是N、A、C、G、T、A/C、A/G、A/T、C/G、C/T、G/T、C/G/T、A/G/T、A/C/T、A/C/G或E，其中E是除A、C、G或T()之外的任意碱基(E可以被称作设计者寡核苷酸)。
总的来说，饱和诱变包括在被诱变的限定多核苷酸序列中(其中被诱变的序列的长度优选为大约15～100,000碱基)诱变一完整组的诱变盒子(其中每一盒子的长度优选为大约1～500个碱基)。因此，一群突变(1～100个突变)被引入被诱变的每一盒子中。在使用饱和诱变的一个循环中，被引入盒子的第一种突变定群可以与被引入第二个盒子中的第二种定群突变不同或相同。这些定群的例证为缺失、添加、特定密码子定群和特定核苷酸盒子定群。
被诱变的限定序列包括完整基因、通路、cDNA、完整开放阅读框(ORF)和完整启动子、增强子、阻遏蛋白/反式激活蛋白、复制起点、内含子、操纵基因或任何多核苷酸功能基团。通常，用于该用途的“限定序列”可以是长度在15～15,000个碱基之间(本发明特别定义了其间的每一个整数)的15碱基多核苷酸序列和多核苷酸序列的任何多核苷酸。在选择定群的密码子中应该考虑到的元素包括由简并诱变盒子编码的氨基酸类型。
在一个特别优选的例证中，可以被引入诱变盒子的突变定群，本发明突变提供了在每一位置编码2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20氨基酸的简并密码子取代(用简并寡核苷酸)，及其用它们编码的多肽文库。
本发明也包括多核苷酸，其中可以在同一阅读框中将成熟酶的编码序列融合为多核苷酸序列，该多核苷酸序列有助于表达和从宿主细胞释放酶，例如，控制酶从细胞向外的转运的前导序列。具有前导序列的酶的一个实例是前蛋白，并且可以包括由宿主细胞裂解的前导序列以形成成熟形式的酶。多核苷酸也可以编码先蛋白，其例证为成熟蛋白质加其它5’氨基酸残基。具有前序列的其它成熟蛋白质的例证为该蛋白质的非活性形式的先蛋白。一旦该前序列发生裂解，就会剩下活性的成熟蛋白质。
因此，例如本发明的所核苷酸可以编码成熟酶，或编码具有前序列的酶，或编码具有先序列和前序列(如前导序列)的酶。
本发明的肌醇六磷酸酶的编码序列是通过制备大肠杆菌B基因组DNA，例如从基因组DNA、编码肌醇六磷酸活性的DNA回收(例如通过PCR扩增)来识别的。这些回收方法在本领域是熟知的。例如，一种方法包括：设计扩增引物以回收编码序列，从基因组DNA扩增基因，将DNA亚克隆进载体，将所得到的构建体转化进宿主菌株，表达用于评价的肌醇六磷酸酶。这些方法在本领域是熟知的，例如在Sambrook等人，1989中提供了这些方法，此处将其完整引用于此作为参考。
在一个优选实施方案中，本发明的酶是通过下述技术从大肠杆菌B基因组DNA中分离出来的：
大肠杆菌B基因组DNA可以通过商业通路获得(Sigma：Catalog#D-2001，St.Louis，New Jersey)。下述引物被用来直接从基因组DNA对基因进行扩增：
5’引物gtttctgaattcaaggaggaatttaaATGAAAGCGATCTTAATCCCATT(SEQ IDNO：3)；和
3’引物gtttctggatccTTACAAACTGCACGCCGGTAT(SEQ ID NO：4)
根据制造商的方法来使用Pfu聚合酶(Stratagene Cloning Systems，Inc.，LaJolla，CA)。
PCR产物和pQE60载体(Qiagen)都是根据制造商的方法用EcoRI和BglII限制性内切酶(New England Biolabs)来消化。连接和转化进宿主细胞，以及M15pREP4宿主细胞(Qiagen)中的表达产生了羧基端用6X-His标记的蛋白质。
然后可以对分离的核酸序列和其它酶进行测量，对照本发明的酶，以测量它们的生物活性保留时间，例如在一项检测肌醇六磷酸酶活性的分析中(FoodChemicals Codex，4th Ed)。这样的酶包括肌醇六磷酸酶的截短形式，和变体如缺失和插入变体。
这种分析的体外实例是用于检测肌醇六磷酸酶活性的下述分析：通过将150μl的酶制剂与600μl的2mM溶解在pH为7.5的100mM Tris HCl缓冲液中的肌醇六磷酸钠在37℃温育30分钟，其中补充了1mM CaCl2，然后对肌醇六磷酸酶活性进行测量。温育后，加入750μl的5％的三氯乙酸终止反应。在加入1500μl的显色试剂(溶解在5.5％硫酸中的4体积1.5％的钼酸铵，和1体积2.7％的硫酸亚铁；Shimizu，1992)后，根据磷酸盐标准分光光度法在700nm测量所释放的磷酸盐。一个单位的酶活性被定义为在分析条件下每分钟释放1μmol Pi所需酶的数量。专一性活性可以以每毫克蛋白中酶活性单位来表示。
本发明的酶具有将肌醇六磷酸水解为肌醇和自由磷酸的酶活性。
本发明的酶和多核苷酸优选地以分离形式提供，并且优选地被纯化到同质性。本发明的肌醇六磷酸酶多肽可以通过几种标准方法中的任一种来获得。例如，肌醇六磷酸酶多肽可以在标准重组表达系统中(参考下面)产生，可以被化学合成(该方法可能限于小肌醇六磷酸酶肽片断)，或者从它们被自然表达的生物体纯化。有用的重组表达方法包括使用哺乳动物宿主、微生物宿主和植物宿主。
该肌醇六磷酸酶分子的重组表达可以组合一种或多种其它分子，例如其它酶来获得。该方法可用于产生组合产物，如含有该肌醇六磷酸酶分子以及一种或多种其它分子的植物或植物部分-优选地所述肌醇六磷酸酶分子和所述其它分子在组合处理中有用。所得到的重组表达分子可以以同质和/或纯化形式或可选择地以相对未纯化形式(如当与用于催化肌醇六磷酸降解的其它食品混合时，作为有用的可消费植物部分)使用。
总的来说，在一个非限定性实施方案中，本发明提供了一种在宿主中表达的重组酶。在另一个非限定性实施方案中，本发明提供了一种基本上纯化的肌醇六磷酸酶。因此，本发明的酶可以是重组酶、自然酶或合成酶，优选地是重组酶。
本发明也涉及包括本发明所述多核苷酸的载体、用本发明的载体进行了遗传工程的宿主细胞和通过重组技术产生本发明的酶。
用含有本发明所述多核苷酸的载体对宿主细胞进行遗传工程(如转导或转化或转染)。这样的载体可以是，例如克隆载体或表达载体。例如，载体可以是以质粒、病毒微粒、噬菌体、朊病毒形式等等。工程宿主细胞可以在常规营养培养基中培养，这些培养基经过了修饰以适合于激活启动子，和/或选择转化体或扩增本发明的基因。培养条件如温度、pH等等，为先前在选择用于表达的宿主细胞的培养中所用的条件，这些条件对普通技术人员也是显而易见的。
本发明的多核苷酸可以被用来通过重组技术产生酶。因此，例如多核苷酸可以被包括在用于表达酶的多种表达载体中的任一种之中。这样的载体包括染色体、非染色体和合成DNA序列，如SV40的衍生物；细菌质粒；噬菌体DNA；杆状病毒；酵母质粒；衍生于质粒和噬菌体DNA组合的载体，病毒DNA如牛痘、腺病毒、禽痘病毒和假狂犬病。然而，可以使用任何其它载体，只要它们在宿主中可以复制且可以生存。
可以通过多种方法将适当的DNA序列插入载体中。概括来说，用本领域已知的方法将DNA序列插入适当的限制性内切酶位点。在这个意义上，该方法包括的是使用可以通过使用限制性消化以及限制性消化非依赖性方法产生的钝端分子。可选择地，可以通过称作“连接酶非依赖性”方法将插入物整合进载体中。在一个特定方面，“连接酶非依赖性”方法的例证是在室温下使用拓扑异构酶介导连接，例如根据可通过商业通路获得的称作TOPO-TA Cloning(InvitrogenCorporation Carlsbad，CA)的试剂盒。可选择的酶包括拓扑异构酶的异构体以及相关性更远的重组酶(如重组酶)，也可以被用来调节这种类型的“连接酶非依赖性”整合。在另一个特定方面，“连接酶非依赖性”方法的例证是使用宿主修复机理。这样的方法和其它方法被认为在本领域的熟练技术人员的知识水平范围内。
表达载体中的DNA序列可操作地连接到一个适当的表达控制序列(启动子)上，以指导mRNA合成。作为这些启动子的代表性实例，此处提及到：LTR或SV40启动子、大肠杆菌lac或trp、噬菌体λPL启动子和已知在原核或真核细胞或它们的病毒中控制基因病毒的其它启动子。表达载体也包括用于翻译起始的核糖体结合位点和转录终止子。载体也包括用于扩增表达的适当序列。
另外，表达载体优选地包括一个或多个可选择标记基因，以提供用于选择转化宿主细胞的表型特征，如用于真核细胞培养的二氢叶酸还原酶或新霉素抗性，或如大肠杆菌中的四环素或氨苄青霉素抗性。
正如此处描述的含有适当DNA序列的载体，以及适当的启动子或控制序列，可以被用来转化适当宿主以允许宿主表达蛋白质。
作为适当宿主的代表性实例，这里提及到：细菌细胞，如大肠杆菌、链酶菌属、枯草芽孢杆菌；真菌细胞，如酵母；昆虫细胞，如果蝇属S2和秋粘虫Sf9；动物细胞如CHO、COS或Bowes黑素瘤；腺病毒；植物细胞等等。根据下面的教导，适当宿主细胞的选择被认为在本领域熟练技术水平范围内。
更明确地说，本发明也包括重组构建体，其包括一个或多个上边广泛描述的序列。构建体包括一个载体，如质粒或病毒载体，其中本发明的序列以正向或反向被插入该载体中。在该实施方案的一个优选方面，构建体进一步包括调节序列，例如包括一个可操作地与该序列连接的启动子。也可以整合一个或多个其它插入物，以导致一个或多个其它分子的表达，如另一个肌醇六磷酸酶或蛋白酶，优选地所述一个或多个其它分子可以与本发明的肌醇六磷酸酶组合用于组合处理中。
大量合适的载体和启动子对本领域熟练技术人员是已知的，而且可以通过商业通路获得。“质粒”用小写字母p来指定，其前和/或其后是大写字母和/或数字。起始质粒在此处或者可以通过商业通路以及在无约束的基础上从公开通路获得，或者可以根据已公开的方法用可利用的质粒构建。另外，与那些描述的质粒等效的质粒在本领域是已知的，并且对普通技术人员是显而易见的。
下述载体是通过实施例的方式提供的：细菌：pQE70、pQE60、pQE-9(Qiagen)、pBlusescript II(Stratagene)；pTRC99a、pKK223-3、pDR540、pRIT2T(Pharmacia)；真核：pXT1、pSG5(Stratagene)、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVLSV40(Pharmacia)。然而，可以使用任何其它质粒或其它载体，只要它们在宿主中可以复制且可以生存。
可以使用CAT(氯霉素转移酶)载体或其它带有可选择标记的载体从任何期望基因中选择启动区。两个适当的载体是pKK232-8和pCM7。特别指定的细菌启动子包括lacI、lacZ、T3、T7、gpt、λPR、PL和trp。真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸腺嘧啶核苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、来自逆转录酶病毒的LTR启动子和小鼠金属硫蛋白-I启动子。适当载体和启动子的选择恰在本领域普通技术水平之内。
在另一个实施方案中，本发明涉及含有上述构建体的宿主细胞。宿主细胞可以是高级真核细胞如哺乳动物细胞，或低级真核细胞如酵母细胞，或者宿主细胞可以是原核细胞如细菌细胞。可以通过磷酸钙转染、DEAE-右旋糖苷介导转染或电穿孔将构建体引入宿主细胞(Davis，1986)。
可以以传统方式用宿主细胞中的构建体产生由重组序列编码的基因产物。可选择地，本发明的酶可以通过传统肽合成仪合成产生。
在适当启动子的控制下，可以在哺乳动物细胞、酵母、细菌或其它细胞中对成熟蛋白质进行表达。也可以用衍生于本发明的DNA构建体的RNA通过不含细胞的翻译系统来产生这样的蛋白质。对使用原核和真核宿主的适当的克隆和表达载体已经有所描述(如Sambrook等人，1989，此处引用其公开内容作为参考)。
通过将增强子序列插入载体中增加了用高级真核生物转录编码本发明所述酶的DNA。增强子是DNA的顺式作用元件，通常大约从10到300bp，它作用于启动子来增加其转录。实例包括复制起点下游碱基对100到270的SV40增强子、细胞肥大病毒早期启动子增强子、复制起点下游的多形瘤增强子和腺病毒增强子。
通常，重组表达载体将包括复制起点和允许宿主细胞转化的可选择标记，如大肠杆菌中的氨苄青霉素抗性和啤酒酵母TRP1基因和衍生自高表达基因的启动子，以指导下游结构序列的转录。这样的启动子可以衍生于在其它生物中编码糖解酶如3-磷酸甘油酸激酶(PGK)的操纵子、A-因子、酸性磷酸酶或热休克蛋白。异种结构序列被装配在具有翻译起始序列和翻译终止序列的适当的相中，优选地是能指导翻译的酶释放的前导序列。任选地，异种序列可以编码融合酶，包括一个能赋予期望特征的N-末端识别肽，例如稳定性或表达重组产物的简单纯化。
用于细菌用途的有用的表达载体通过如下方式构建的，即将编码期望蛋白质的结构DNA序列，和合适的翻译起始信号和终止信号一起插入具有功能启动子的可操作阅读相中。载体将包括一个或多个表型可选择标记和一个复制起点，以确保维持载体，并且如果期望，在宿主内提供扩增。用于转化的合适的原核宿主包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、鼠伤寒沙门氏杆菌和假单胞杆菌属、链霉菌属和葡萄球菌属中的不同种类，尽管作为选择对象也可以使用其它原核宿主。
作为代表性但非限定性实例，用于细菌用途的有用的表达载体包括可选择标记和衍生自商业通路获得的质粒的细菌复制起点，其中该质粒含有熟知的克隆载体pBR322(ATCC 37017)的遗传元件。例如，这样的商业载体包括pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals，Uppsala，Sweden)和GEM1(Promega Biotec，Madison，WI，USA)。这些pBR322“骨架”部分是与适当的启动子和被表达的结构序列组合的。
在转化合适的宿主菌株之后，将宿主菌株培养到适当的细胞密度之后，用适当的方法(如变温或化学诱导)诱导所选择的启动子，并且将细胞再培养一段时间。
一般用离心法收获细胞，用物理或化学方法破裂细胞，保留所得到的粗糙提取物，用于进一步纯化。
可以用任何便利的方法来破裂用于蛋白质表达的微生物细胞，包括冷冻-融化循环、超声处理、机械破碎，或使用细胞裂解试剂，这些方法对本领域熟练技术人员是已知的。
也可以用各种哺乳动物细胞培养系统来表达重组蛋白质。正如(Gluzman，1981)所述，哺乳动物表达系统的实例包括猴肾成纤维细胞的COS-7系，和其它能表达相容载体的细胞系，例如C127、3T3、CHO、HeLa和BHK细胞系。哺乳动物表达载体包括复制起点、合适的启动子和增强子，也包括任何必需的核糖体结合位点、聚腺苷酸化位点、剪接供体位点和剪接受体位点、转录终止序列和5’侧冀非转录序列。可以用衍生自SV40剪接的DNA序列和聚腺苷酸化位点提供所需的非转录遗传元件。
可以用如下方法从重组细胞培养物中回收且纯化酶：硫酸铵或乙醇沉淀、酸性提取、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水交互层析、亲水层析、羟磷灰石层析和凝集素层析。当需要时，可以在完成成熟蛋白质的构型中使用蛋白质重折叠步骤。最后，可以在最后的纯化步骤使用高效液相层析(HPLC)。
本发明的酶可以是自然纯化的产品，或者是化学合成步骤的产品，或者通过重组技术从原核或真核宿主(例如，通过培养物中的细菌、酵母、高级植物、昆虫和哺乳动物细胞)产生。依赖于重组产生步骤中所用的宿主，本发明的酶可以被糖基化或不被糖基化。本发明的酶可以包括或不包括原始甲硫氨酸残基。
在一个优选实施方案中，本发明的酶是肌醇六磷酸酶，它在加热时很稳定，耐热，并且可以催化肌醇六磷酸的酶性水解，即该酶在很短(即5～30秒)或更长的时间之后可以复性且恢复活性，例如暴露于高达50℃或稍高于50℃的温度下数分钟或数小时。
参考此处所包括的实施例对本发明做了进一步描述；然而，应该理解到本发明不限于这些实施例。除非另外指出，所有份数或数量以重量计算。
本发明也提供了一种分离的变体肌醇六磷酸酶多核苷酸，或其寡核苷酸部分，其中包括此处所公开的突变。在此所用，当用于多核苷酸、寡核苷酸或多肽时，术语“分离的”或“纯化的”指，该物质存在的形式不同于其通常自然存在的形式。因此，多核苷酸或多肽存在于自然中的细胞中时，分离的多核苷酸或纯化的多肽可以是，从与其通常相关的物质分离出来的，至少是部分分离出来的多核苷酸或多肽。一般而言，分离的多核苷酸或纯化的多肽存在的形式是，它构成组合物的至少大约5％～10％，通常20％～50％，尤其大约50～75％，优选地大约90％～95％或更多。用于分离多核苷酸或多肽的方法是本领域已知且常规的。
作为分离的一部分或在分离之后，多核苷酸可以被连接到其它多核苷酸上，如DNA分子，例如，用于诱变研究，以形成融合蛋白，或用于宿主中多核苷酸的繁殖或表达。可以将单独或连接有其它多核苷酸如载体的分离的多核苷酸引入宿主细胞中，引入培养物中或引入整个生物体中。由于它们不是以其自然形式存在，所以当被引入培养物中的宿主细胞或整个生物体中的宿主细胞中时，这样的多核苷酸仍然被认为是“分离的”。同样地，多核苷酸、寡核苷酸和多肽可以存在于组合物中，如培养基配方中(将多核苷酸、寡核苷酸或多肽引入细胞或组合物或溶液中用于化学或酶反应的溶液，该溶液不是自然存在的组合物)，并且正如此处所用，它们在该术语意思范围内仍然是分离的多核苷酸、寡核苷酸或多肽。分离的多核苷酸可以是不与核苷酸序列直接邻接的多核苷酸，它可以与核苷酸序列在基因组或其它自然界中自然存在的细胞DNA分子中直接邻接。因此，重组多核苷酸，可以包括一个被整合进载体、自主复制质粒或病毒的多核苷酸；或整合进通常不表达特定多肽的原核或真核生物的基因组DNA中。
在此所用，术语“多核苷酸”或“寡核苷酸”或“核苷酸序列”或相似物指两种或多种核苷酸或核苷酸类似物的聚合物。多核苷酸可以是核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)分子，并且可以是单链或双链DNA或RNA，或双链的DNA:RNA杂交体。多核苷酸或寡核苷酸可以含有一个或多个修饰碱基，例如肌苷碱基或三苯甲酯碱基。在聚合物中连接核苷酸的键通常是磷酸二酯键，但可以是日常用于连接核苷酸的其它键，例如包括硫代磷酸键、硫酯键等等。多核苷酸也可以是经过化学、酶或代谢修饰的形式。
在此所用，术语“突变体或变体多核苷酸”指，例如与SEQ ID NO：1、7或9中所示的核苷酸序列相比，有一个或几个核苷酸发生了变化的核苷酸序列。核苷酸变化可以是缺失、插入或取代，并且可以是沉默的，这样在由野生型多核苷酸编码的多肽的阅读框中没有变化，或者可以是导致氨基酸变化或将终止密码子引入多核苷酸的变化，或者是涉及多核苷酸的转录或翻译的核苷酸序列中的变化，例如一种导致基因转录物成为mRNA的剪接更改的变化。
为了便于讨论且用作参考框架，在SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：7中列出的肌醇六磷酸酶核苷酸序列被称为“野生型”多核苷酸或“野生型”基因序列，并且同样地，SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：8中所示的多肽被称为野生型肌醇六磷酸酶多肽。
变体肌醇六磷酸酶多核苷酸的实例包括实质上在SEQ ID NO：7中所示的序列，其中多核苷酸具有一个在以下所示的多核苷酸序列：a)SEQ ID NO：9；b)SEQ IDNO：9中所示的核苷酸序列，其中所有的T是U(RNA)；其中编码肌醇六磷酸酶的核酸的表达导致产生了所述基本上纯化的肌醇六磷酸酶；和c)SEQ ID NO：7，其中390为G；391为A；核苷酸438为T；439为G；440为G；471为C；473为T；477为T；448为G；449为T；690为G；691为A；692为G；729为T；730为A；731为T；864为T；865为G；1017为G，或其任意组合。更明确地说，关于c)部分，本发明提供了一个与SEQ ID NO：7基本上相同的核苷酸序列，并具有一个选自核苷酸390为G和391为A；核苷酸438为T、439为G和440为G；471为C和473为T；477为T、448为G和449为T；690为G、691为A和692为G；729为T、730为A和731为T；864为T和865为G；1017为G或其任意组合的修饰核苷酸序列。
本发明的变体肌醇六磷酸酶多核苷酸的实例也包括一个编码具有基本上在SEQ ID NO：8中列出的多肽的多核苷酸，但具有W68E、Q84W、A95P、K97C、S168E、R180Y、N226C、Y277D或其任意组合，并且保持了肌醇六磷酸酶活性。
本发明的突变体多核苷酸的其它实例包括的多核苷酸序列为它们可以与这些多核苷酸序列的互补链，或它们的寡核苷酸部分可选择地杂交，正如此处所公开的，在高度严格杂交条件下，如在65℃的温度下，在0.5MNaHPO4、7％十二烷基磺酸钠(SDS)、1mM EDTA中与滤膜结合DNA杂交，并且在68℃的温度下，在0.1x SSC/0.1％ SDS中洗涤，(Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology，(Green Publishing Associates，Inc.，和John Wiley&Sons，Inc.，New York 1989)，和补遗：参考第2.10.3页；Sambrook等人，Molecular Cloning：A laboratory manual(ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)，将它们引用于此作为参考)，以及编码基本上在SEQ ID NO：8中列出的肌醇六磷酸酶多肽的多核苷酸，但具有一个或多个突变；或一个与这样的多核苷酸相应的RNA(如SEQ ID NO：9)。
与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：7的肌醇六磷酸酶多核苷酸或SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：8的多肽序列“基本上相同”的多核苷酸或多肽序列一般是至少80％或85％，通常至少大约90％，尤其至少大约95％，优选地至少大约99％分别与SEQ ID NO：1、7或9或SEQ ID NO：2、8或10中列出的核苷酸序列或氨基酸序列相同。在本发明的一个方面，基本上与SEQ ID NO：1、7或9或2、8或10相同的多核苷酸序列或多肽序列在具有一个突变的一个或多个位点有所变化，例如存在于上段中列出的变体肌醇六磷酸酶多核苷酸中的突变体。可以用序列分析软件(如Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group，University ofWisconsin Biotechnology Center，1710 University Avenue，Madison WI 53705)来测量序列同一性。
本发明的多核苷酸或其寡核苷酸部分是有用的，例如作为扩增反应的探针或引物。关于多核苷酸的“寡核苷酸部分”指变体或小于全长多核苷酸的突变体多核苷酸的核苷酸序列。一般而言，作为探针或引物有用的寡核苷酸包括至少大约10个核苷酸，通常包括大约15～30个核苷酸或更多(例如，参考表1和表2)。可以用任何合适的方法来制备多核苷酸和寡核苷酸，例如包括通过适当多核苷酸的限制性酶消化法，通过使用下述方法的直接化学合成，这些方法如磷酸三酯法(Narang等人，1979，Meth.Enzymol.，68：90-99)；磷酸二酯法(Brown等人，1979，Meth.Enzymol.，68：109-151)；二乙基亚磷酰胺法(Beaucage等人，1981，TetrahedronLett.，22：1859-1862)；三酯法(Matteucci等人，1981，J.Am.Chem.Soc.，103：3185-3191)，包括通过自动合成法；或通过固相支持法(例如，参考美国专利4,458,066)。另外，可以用此次公开的或本领域已知的重组DNA法来制备多核苷酸或寡核苷酸。
本发明的寡核苷酸可以包括肌醇六磷酸酶多核苷酸的一部分，例如包括与SEQ ID No：7的序列基本上相同的序列，除了其中核苷酸390为G；391为A；核苷酸438为T；439为G；440为G；471为C；473为T；477为T；448为G；449为T；690为G；691为A；692为G；729为T；730为A；731为T；864为T；865为G；1017为G，或其中寡核苷酸含有涉及SEQ ID NO：7中的取代的组合。因此，正如此处所公开的，寡核苷酸可以是任意长度，并且可以包括一个或多个上述突变。
本发明的寡核苷酸可以选择性地与此处所公开的突变体肌醇六磷酸酶多核苷酸序列杂交。在此所用，“选择性地杂交”指寡核苷酸(或多核苷酸)探针与突变体多核苷酸杂交，但基本上不与野生型序列杂交的能力。正如此处所描述的，可以通过改变杂交条件的严格性得到允许选择杂交的条件，而且允许选择杂交的条件部分依赖于探针的长度、相对的G∶C含量、盐浓度等等(参考Sambrook等人，见上文，1989)。例如，高度严格的杂交条件包括，在大约37℃的温度下(对于含有14个核苷酸的DNA探针)，在大约48℃的温度下(对于含有17个核苷酸的探针)，在大约55℃的温度下(对于一个含有20个核苷酸的探针)，在大约60℃的温度下(对于一个含有23个核苷酸的探针)，在6x SSC/0.05％焦磷酸钠中洗涤。
本发明的寡核苷酸可以被用作探针来筛选相关的特定变体或突变体。另外，本发明的寡核苷酸包括一个有用的反义分子，例如在多核苷酸序列包括突变体肌醇六磷酸酶多核苷酸序列的多核苷酸调控和扩增反应中有用。而且，这样的寡核苷酸可以被用作核酶的一部分，或用于肌醇六磷酸酶基因调控的三股螺旋序列。仍然进一步，这样的寡核苷酸可以被用作诊断方法的组分，这样可以确定肌醇六磷酸酶的转录水平。而且，可以使用这样的寡核苷酸，例如用于从其它种类筛选且识别肌醇六磷酸酶同系物。
术语“引物”或“PCR引物”指分离的天然或合成寡核苷酸，当处于合适引物延伸的条件下时，可以作为DNA合成的起始点。引物延伸产物的合成是在合适的温度下在适当的缓冲液中，在存在核苷三磷酸酯和聚合酶的情况下开始的。引物可以包括多个引物，例如其中在有关预合成的靶区的一端或两端的信息中存在不明确性。例如，如果核酸序列是从蛋白序列确定出来的，所产生的用于合成编码该蛋白序列的核酸序列的引物可以包括一个引物集合，其中包括代表基于遗传密码简并性的所有可能的密码子变异的序列。该集合中的一个或多个引物将与靶序列的末端或靶序列的侧冀序列是同源的。另外，如果保守区在一个种群中表现出显著水平的多态性，那么可以制备引物的混合物，用于扩增相邻序列。
在PCR扩增中，用相关靶序列的引物对侧冀来扩增靶序列。引物对通常包括一个与靶序列的5’端杂交的正向引物，和一个与靶序列的3’端杂交的反向引物。本发明的引物对包括至少一个正向引物和至少一个反向引物，该引物对允许产生扩增产物，该产物可以是大范围的肌醇六磷酸酶专一性扩增产物或该扩增产物的嵌套扩增产物，包括一个正向引物和一个反向引物，前提是参考靶多核苷酸序列，正向引物是反向引物的5’端(或下游)，并且这些引物足够接近，这样就可以产生扩增产物。
可以产生编码融合蛋白的核酸序列，并且可以将其可操作地连接到表达控制序列。这样的融合蛋白和组合物在开发抗体中有用，或者可以产生且纯化相关肽和多肽。在此所用，术语“可操作性地连接”指并置，其中这样描述的组分的关系是允许它们以预定的方式发挥作用。例如，将一个表达控制序列可操作地连接到一个编码序列上的连接导致编码序列的表达，其条件在于与表达控制序列相适应的条件下，然而可以连接两个可操作地连接的编码序列，这样它们处于同一阅读框中，从而编码融合蛋白。
在此所用，术语“表达控制序列”指调控与其可操作地连接的核酸序列的表达的核酸序列。当表现控制序列控制且调控核酸序列的转录和适当的翻译时，表达控制序列被可操作地与核酸序列连接。因此，表达控制序列可以包括适当的启动子、增强子、转录终止子、编码蛋白的基因前面的起始密码子(即ATG)、内含子的剪接信号、维持该基因的正确的阅读框以允许mRNA的正确翻译，以及终止密码子。控制序列以最小量包括因其存在可以影响表达的组分，并且也包括其它因其存在是有利的组分，例如前导序列和融合配偶体序列。表达控制序列可以包括一个启动子。
本发明的多核苷酸可以包括重组核酸分子的一部分，例如其可以编码融合蛋白。可以将多核苷酸或重组核酸分子插入载体中，该载体可以是表达载体，并且可以衍生自质粒、病毒等等。表达载体通常包括一个复制起点、一个启动子、一个或多个允许含有载体的转化细胞的表型选择的基因。适合用于本发明的载体包括但不限于，用于在细菌中表达的基于T7的表达载体(Rosenberg等人，Gene56：125，1987)、用于在哺乳动物细胞中表达的pMSXND表达载体(Lee和Nathans，J.Biol.Chem.263：3521，1988)；用于在昆虫细胞中表达的衍生于杆状病毒的载体；及类似物。
载体的选择也依赖于多核苷酸序列的大小以及在本发明的方法中所用的宿主细胞。因此，用于本发明的载体可以包括质粒、噬菌体、粘粒、噬菌质粒、病毒(如反转录病毒、副流感病毒、呼肠孤病毒、副粘病毒等等)，或其选择的部分(如外被蛋白、刺突糖蛋白、衣壳蛋白)。例如，通常在被分析或修饰的特定核酸序列很大时使用粘粒和噬菌质粒，这是因为这些载体能稳定地繁殖大的多核苷酸。粘粒和噬菌质粒尤其适合于SEQ ID NO：1或7的肌醇六磷酸酶多核苷酸或SEQ IDNO：9的突变体肌醇六磷酸酶多核苷酸的表达或操作。
在酵母中，可以使用许多含有组成型启动子或诱导型启动子的载体(参考Ausubel等人，见上文，1989；Grant等人，Meth.Enzymol.153：516-544，1987；和TheMolecular Biology of the Yeast Saccharomyces，Eds.Strathern等人，Cold SpringHarbor Press，Vols.I和II，1982)。可以使用组成型酵母启动子如ADH或LEU2或诱导型启动子如GAL(“Cloning in Yeast，”第三章，“DNA Cloning”第11卷，A PracticalApproach，ed.Glover，IRL Press，1986)。可选择地，可以使用可促进外源DNA序列整合进酵母染色体中的载体。转染细胞中表达载体的构建和基因的表达涉及使用同样在本领域已知的分子克隆技术(参考Sambrook等人，见上文，1989；Ausubel等人，见上文，1989)。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术和体内重组/遗传重组。
可以在载体中包括多核苷酸或寡核苷酸，并且可以通过细胞的转化或转染将其引入细胞中。通过“转化”或“转染”指整合了新DNA(即细胞外源的DNA)之后，在细胞中诱导的永久(稳定)或瞬时遗传变化。在细胞是哺乳动物细胞的场合，通常通过将DNA引入细胞的基因组中实现永久遗传变化。
转化细胞或宿主细胞可以是任何原核或真核细胞，其中已经通过重组DNA技术将本发明的多核苷酸序列或其片断引入该转化细胞或宿主细胞(或引入其祖细胞)中。可以用本领域熟练技术人员熟知的传统技术来进行宿主细胞的转化。在宿主是原核生物如大肠杆菌的场合，可以用本领域熟知的方法用指数生长期后收获的细胞，随后用CaCl2或用MgCl2或RbCl法对其进行处理制备能吸收DNA的感受态细胞。
当宿主是真核生物时，这些转染方法包括使用磷酸钙共沉淀、传统的机械方法如显微注射、电穿孔、插入嵌入脂质体中的质粒、或使用病毒载体、或其它本领域已知的方法。一种方法使用真核病毒载体如猿猴肾病毒40(SV40)或牛乳头瘤病毒，瞬时地感染或转化真核细胞且表达蛋白质。(Eukaryotic Viral Vectors，ColdSpring Harbor Laboratory，Gluzman ed.，1982)。优选地，真核宿主被用作此处描述的宿主细胞。真核细胞可以是酵母细胞(如酿酒酵母)，或可以是哺乳动物细胞，包括人类细胞。
可以用多种宿主表达载体相同来表达肌醇六磷酸酶多核苷酸序列，如SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：1的编码序列或突变体肌醇六磷酸酶多核苷酸如SEQ ID NO：9。这样的表达系统代表可以用来产生且随后纯化相关核苷酸序列的工具，当用编码序列的适当核苷酸转化或转染时，也代表可以表达蛋白质的细胞，包括其原位变体或突变体多核苷酸或其多肽部分。这样的细胞包括但不限于，微生物如用含有多核苷酸或其寡核苷酸部分(野生型、变体或其它突变体)的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌(如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌)；用含有多核苷酸或其寡核苷酸部分(野生型、变体或其它突变体)的重组酵母表达载体转化的酵母(如酿酒酵母、Pichia)；用含有多核苷酸或其寡核苷酸部分(野生型、变体或其它突变体)的重组病毒表达载体(如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用含有多核苷酸或寡核苷酸部分的重组病毒表达载体(花椰菜花叶病毒或烟草花叶病毒)感染或用含有多核苷酸或寡核苷酸部分的重组质粒表达载体(如Ti质粒)转化的植物细胞系统；或含有重组表达构建体的哺乳动物细胞系统(如COS、CHO、BHK、293、3T3)，其中重组表达构建体含有衍生自哺乳动物细胞的基因组的启动子(如金属硫蛋白启动子)或衍生自哺乳动物病毒的基因组的启动子(如腺病毒晚期启动子；牛痘病毒7.5K启动子)。
在细菌系统中，可以依赖使用被表达的肌醇六磷酸酶蛋白质(肌醇六磷酸酶的野生型、变体或其它突变体)有利地选择多种表达载体。例如，当将要产生出用于产生抗体或筛选肽文库的大量这样的蛋白质时，介导被很容易地纯化的高水平融合蛋白产物表达的载体是期望的。这样的载体包括但不限于，大肠杆菌表达载体pUR278(Ruther等人，1983，EMBO J.2：1791)，其中肌醇六磷酸酶多核苷酸或其寡核苷酸部分(野生型、变体或其它突变体)可以被单独地连接进lacZ编码区框架中的载体中，这样就产生了融合蛋白；pIN载体(Inouye和Inouye，Nucl.AcidsRes.13：3101-3109，1985；Van Heeke和Schuster，J.Biol.Chem.264：5503-5509，1989)；等等。pGEX载体也可以用于将外源多肽表达为与谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合的融合蛋白。一般而言，这样的融合蛋白是可溶的，且可以通过吸附到谷胱甘肽-琼脂糖颗粒上容易地从裂解的细胞中纯化蛋白质，随后在自由谷胱甘肽存在的情况下得到蛋白质。pGEX载体被设计包括凝血酶或因子Xa蛋白酶裂解位点，这样所克隆的肌醇六磷酸酶蛋白、变体或突变体就可以从GST部分释放出来。
在昆虫系统中，苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)被用作载体来表达外源基因。该病毒生长在草地夜蛾细胞中。肌醇六磷酸酶多核苷酸、或其寡核苷酸部分可以被单独克隆进该病毒的非必需区(例如多角体蛋白基因)，并且置于AcNPV启动子(例如多角体蛋白启动子)的控制下。成功插入肌醇六磷酸酶多核苷酸或其寡核苷酸部分将导致多角体基因失活和非包含体型重组病毒(即缺乏通过多角体基因编码的蛋白质表膜外壳)的产生。然后将这些重组病毒用于感染其中表达所插入基因的草地夜蛾细胞(参考Smith等人，1983，J.Virol.46：584；美国专利4,215,051)。
在哺乳动物宿主细胞中，可以使用许多基于病毒的表达系统。在腺病毒被用作表达载体的情况中，肌醇六磷酸酶多核苷酸或其寡核苷酸部分可以被连接到腺病毒转录/翻译控制复合物中，如晚期启动子和三联前导序列。然后通过体外或体内重组将该嵌合基因插入腺病毒基因组中。插入病毒基因组的非必需区如E1或E3区中在被感染宿主中产生了活的且能够表达肌醇六磷酸酶蛋白(如野生型、变体或其突变体)的重组病毒(Logan和Shenk，Proc.Natl.Acad.Sci.美国81：3655-3659，1984)。被插入肌醇六磷酸酶序列的充分翻译也需要特定起始信号。这些信号包括ATG起始密码子和相邻序列。在包括其本身的起始密码子和相邻序列的整个多核苷酸被插入适当的表达载体中的情况下，不需要其它翻译控制信号。然而，在仅有一部分插入的情况下，必需提供外源翻译控制信号，例如包括ATG起始密码子。而且，起始密码子必需与目标编码序列的阅读框同相，以确保翻译整个插入物。这些外源翻译控制信号和起始密码子可以有多种来源，天然的和合成的均可。可以通过包含适当的转录增强子元件、转录终止子等等来提高表达效率(参考Bittner等人，Meth.Enzymol.153：516-544，1987)。
另外，可以选择宿主细胞株，其调节插入序列的表达、或以特定方式修饰且加工被表达的多肽。对蛋白产物的这种修饰(如糖基化)和加工(如裂解)对蛋白质的功能很重要。不同宿主细胞对于蛋白质的翻译后加工和修饰具有特有的且专一的机理。可以选择适当的细胞系和宿主系统，以确保对将表达的外源蛋白质的正确的修饰和加工。为此目的，可以使用拥有多肽的初级转录、糖基化和磷酸化的正确加工细胞结构的真核宿主细胞。这样的哺乳动物宿主细胞包括但不限于CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、3T3、WI38等等。
为了长期、高产量的产生重组蛋白，优选的是稳定的表达。例如，可以对稳定地表达蛋白质的细胞系进行基因工程，该细胞系包括肌醇六磷酸酶的野生型、变体或突变体。使用含有病毒复制起点的表达载体，可以用受适当的表达控制元件(如启动子和/或增强子序列、转录终止子、聚腺苷酸化位点等等)控制的DNA和可选择标记来转化宿主细胞。在引入外源DNA之后，将进行了基因工程的细胞在富集培养基中培养1～2天，然后转入选择性培养基中。重组质粒中的可选择标记使其具有选择抗性，并且允许细胞将质粒稳定地整合进它们的染色体中并且生长到形成转化灶，该转化灶可以被克隆且扩展为细胞系。该方法可以被有利地用于对表达肌醇六磷酸酶变体或突变体多肽的细胞系进行基因工程。这样进行了基因工程的细胞系在筛选和评价影响变体或突变体肌醇六磷酸酶多肽的内源活性的化合物中尤其有用。这样进行了基因工程的细胞系也可以用来区别具有专一性或者非专一性影响的因子。尤其是，突变体细胞系应该缺少关键功能，并且不同突变体可以被用来用体内试验识别关键功能域。
可以使用许多选择系统，包括但不限于，单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等人，Cell 11：223，1977)、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Szybalska和Szybalski，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 48：2026，1962)和腺嘌呤磷酸核糖转移酶(Lowy等人，Cell 22：817，1980)基因可以被分别用于tk-、hgprt-或aprt-细胞。而且，抗代谢物抗性可以被用作选择如下基因的基础，这些基因包括dhfr，它赋予氨甲蝶呤抗性(Wilgler等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：3567，1980；O’Hare等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：1527，1981)；gpt，它使得对霉酚酸具有抗性(Mulligan和Berg，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：2072，1981)；neo，它使得对氨基糖苷G-418具有抗性(Colberre-Garapin等人，J.Mol.Biol.150：1，1981)；和hygro，它使得对潮霉素具有抗性(Santerre等人，Gene 30：147，1984)。因此，本发明提供了一种载体，其含有一个突变体肌醇六磷酸霉多核苷酸、或其寡核苷酸部分、或一个或多个引物或它们的互补物，包括任意的含有与调节元件可操作相关的前述序列的表达载体，其中所述调节元件指导编码序列或引物的表达；也提供了一种宿主细胞，其含有任意的与调节元件单独或可操作相关的前述序列，其中所述调节序列可以指导由多核苷酸编码的多肽适当的表达。
突变体肌醇六磷酸酶多核苷酸序列的同源物可以用两个寡核苷酸引物通过进行聚合酶链式反应(PCR；参考美国专利4,683,202，将其引用于此作为参考)来分离，其中所述两个寡核苷酸引物包括基于肌醇六磷酸酶多肽的氨基酸序列设计的简并引物集合体，诸如SEQ ID NO：8中阐明的或此处所公开的其突变体。反应模板可以是通过mRNA的反向转录获得的cDNA，其中mRNA是从已知表达肌醇六磷酸酶或相应物的生物体制备的。可以对PCR产物进行亚克隆和测序或用许多方式操作(如通过嵌套式PCR进一步操作)，以确保扩增的序列表示肌醇六磷酸酶的序列或突变体多核苷酸序列。然后可以将PCR片断用于通过标记扩增片断且筛选核酸文库(如噬菌体cDNA文库)来分离全长cDNA克隆(包括含有突变体多核苷酸序列的克隆)。可选择地，可以用标记的片断筛选基因组文库(对于克隆策略的综述，例如参考Sambrook等人，见上文，1989；Ausubel等人，见上文，1989)。
已经从野生型氨基酸序列修饰的肌醇六磷酸酶多肽包括氨基酸残基取代，例如负电荷氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；正电荷氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；包括具有相似亲水值的不带电的极性头部基团的氨基酸包括下述：亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。然而，在许多情况下，核苷酸取代可以是沉默的，不会在所编码的多肽中引起变化。
与肌醇六磷酸酶多肽SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：8或其肽部分基本上相同的突变体肌醇六磷酸酶多肽及其肽部分都包括在本发明的范围之内。
可以用化学合成来制备合成多肽或肽，例如所熟知的固相化学肽合成法(例如，参考Merrifield，J.Am.Chem.Soc.，85：2149-2154，1963；Stewart和Young，Solid PhasePeptide Synthesis，Second ed.，Pierce Chemical Co.，Rockford，I 11.，第11-12页)，并且这些合成多肽或肽已经被用于可通过商业通路获得的实验室肽设计和合成试剂盒(Cambridge Research Biochemicals)。这样的可通过商业通路获得的实验室试剂盒通常使用了Geysen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，81：3998(1984)的教导，并且提供了在多个棒(rods)或针(pins)的顶端上合成肽，每一个肽均与一个单板相连。当使用这样的系统时，由棒或针构成的板被颠倒过来而且插入到与其具有对应的孔或储存池第二个板中，其含有用于吸附或固定适当的氨基酸至针或棒的顶端的溶液。通过重复该过程步骤，即颠倒和将针或棒的顶端插入适当的溶液中，从而使氨基酸合成为期望肽。
许多可得到的FMOC肽合成系统是有用的。例如，可以用AppliedBiosystems，Inc.，Model 431A自动肽合成仪在固相支持体上装配多肽或片断。该设备提供了快速得到本发明的肽，或者通过直接合成或者通过合成一系列可以用其它已知技术偶联的片断。因此，多肽和肽的化学合成方法对本领域的普通技术人员是熟知的，如可以通过固相技术合成肽，可以从树脂裂解肽，和通过制备型高效液相层析纯化肽(例如，参考Creighton，1983，Proteins：Structures and MolecularPrinciples，W.H.Freeman&Co.，N.Y.，第50-60页)。合成肽的组分可以通过氨基酸分析或测序来确定，如使用Edman降解法(例如，参考Creighton，1983，见上文，第34-49页)。因此，可以化学合成肌醇六磷酸酶多肽、变体或突变体的片断。
在本发明的一方面，提供了一种产生如图1所示的那些肌醇六磷酸酶的方法。该方法包括在允许核酸表达的条件下培养含有编码酶(如SEQ ID No：1、7或9)的多核苷酸的宿主细胞，并且任选地分离由核酸编码的酶。培养宿主细胞的方法在实施例中进行了描述，并且这些方法对本领域的熟练技术人员是已知的。
在一个特定实施方案中，本发明提供了在转基因植物或植物器官中表达肌醇六磷酸酶及其生产方法。在能够指导肌醇六磷酸酶表达的调节序列的控制下，所提供的DNA表达构建体用于用编码肌醇六磷酸酶的基因转化植物。这些调节序列包括能够在植物中指导转录的序列，或者以组成型，或者以阶段专一和/或组织专一的方式。
表达的方式部分依赖于使用的植物或其部分。可以将本发明提供的转基因植物和植物器官用于多种工业方法中，或者直接地，例如在动物饲料中，或者可选择地，可以提取所表达的肌醇六磷酸酶，并且如果期望，可以在应用之前对其进行纯化。可选择地，可以直接使用重组宿主植物或植物部分。在一个特定方面，本发明提供了用含有增强量的肌醇六磷酸酶的种子催化肌醇六磷酸水解反应的方法。该方法涉及用含肌醇六磷酸的底物接触转基因、非野生型种子，种子优选地以残渣形式或压碎形式，并且涉及用种子中的酶增加反应率。通过将种子直接加入含肌醇六磷酸的底物中，本发明提供了一种针对提取且纯化该酶的昂贵且成问题的方法的溶液。在一个特定的-但决不是限定性的-例证中，本发明也提供了处理方法，其中对缺少足够酶供给的生物体使用含有该酶增强量的种子的形式。在一个优选实施方案中，将酶施用于生物体的时机的选择是与含肌醇六磷酸的食品的消费相协调的。
可以用多种方法实现肌醇六磷酸酶在植物中的表达。尤其是，例如可以用于转化大量植物种类的技术，所述大量植物种类包括双子叶种类(如烟草、马铃薯、西红柿、矮牵牛花、芸苔)。因此，例如在植物中表达外源基因的策略是可用的。因此，仍然来自植物基因的调节序列已经被识别出，它们可以用于可在植物和植物细胞中功能性表达的嵌合基因的构建(如Klee等人，1987；Clark等人，1990；Smith等人，1990)。
可以用几种技术，包括用根瘤农杆菌或毛根农杆菌转化，实现将基因构建体引入植物中。从而可以被转化的植物组织的非限定性实例包括原生质体、小孢子或花粉，外植体如叶子、茎干、根茎、下胚轴和cotyls。而且，可以通过显微注射、电穿孔、粒子轰击和直接DNA吸收将DNA直接引入原生质体和植物细胞或组织中。
可以通过多种表达系统在植物中产生蛋白质。例如，组成型启动子如花椰菜花叶病毒的35S启动子(Guilley等人，1982)对于在转基因植物的实质上所有器官中的已表达蛋白的积累是有用的。可选择地，高度组织专一和/或阶段专一的引物在本发明中是有用的(Higgins，1984；Shotwell，1989)，以使表达偏向于目标组织和/或偏向于目标发育时期。与在本发明所述肌醇六磷酸酶分子的植物中的表达相关的进一步详述已经公开，如美国专利5,770,413(Van Ooijen等人)和美国专利5,593,963(Van Ooijen等人)，尽管这些参考没有教导本发明的发明分子，而是教导了真菌肌醇六磷酸酶的使用。
总的来说，与本发明相关的是，可以用多种方法来实现肌醇六磷酸酶在转基因植物或植物部分中的重组表达。这样的转基因植物和植物部分可以作为重组表达的肌醇六磷酸酶的来源，可以被直接加入含肌醇六磷酸的材料中。可选择地，可以将重组植物表达的肌醇六磷酸酶从植物材料中分离出，如果期望，在接触肌醇六磷酸酶底物之前将其纯化。
在本发明的上下文中，所选择的植物包括但不限于，产生可食用花的农作物，如花椰菜(Brassica oleracea)、朝鲜蓟(Cynara scolymus)，水果如苹果(Malus，如domesticus)、香蕉(Musa，如acuminata)、浆果(如黑醋栗，Ribes如domesticus)、樱桃(如甜樱桃，Prunus，如avium)、黄瓜(Cucumis，如sativus)、葡萄(Vitis，如vinifera)、柠檬(Citrus limon)、甜瓜(Cucumis melo)、坚果(如胡桃，Juglans，如regia；花生，落花生hypogeae)、桔子(柑桔，如maxima)、桃子(Prunus，如persica)、梨(Pyra，如communis)、李子(Prunus，如domestica)、草莓(Fragaria，如moschata)、西红柿(Lycopersicon，如esculentum)，叶子如紫花苜蓿(Medicago，如sativa)、卷心菜(如Brassica oleracea)、菊苣(Cichoreum，如endivia)、韭葱(葱属植物，如porrum)、莴苣(Lactuca，如sativa)、菠菜(菠菜，如oleraceae)、烟草(烟草，如tabacum)，根茎如竹芋(竹芋，如arundinacea)、甜菜(Beta，如vulgaris)、胡萝卜(Daucus，如胡萝卜(carota)、木薯(木薯，如esculenta)、芜箐甘蓝(芸苔，如rapa)、萝卜(Raphanus，如sativus)、山药(薯蓣属，如esculenta)、甘薯(番茄属白薯(Ipomoea batatas))，和种子如豆(Phaseolus，如vulgaris)、豌豆(Pisum，如sativum)、大豆(Glycin，如max)、小麦(小麦属植物，如aestivum)、大麦(大麦属，如vulgare)、玉米(Zea，如mays)、稻米(Oryza，如sativa)、油菜籽(Brassica napus)、粟(黍L.)、向日葵(Helianthus annus)、燕麦(Avena sativa)，块茎如大头菜(芸苔如oleraceae)、马铃薯(茄属植物，如tuberosum)等等。
应该理解到，可以在本发明的上下文中使用其它植物以及非植物表达系统。植物种类的选择主要是通过植物或其部分的目标用途以及植物种类对于转化的可控制性决定的。
几种技术可以用于将含有编码肌醇六磷酸酶的DNA序列的表达构建体引入靶植物中。这样的技术包括但不限于用钙/聚乙二醇法、电穿孔或显微注射或(有被)粒子轰击来转化原生质体(Potrykus，1990)。除了这些所谓的直接DNA转化法，涉及载体的转化系统是可以广泛得到的，如病毒载体(如来自花椰菜花叶病毒(CaMV))和细菌载体(如来自农杆菌属)(Potrykus，1990)。在选择和/或筛选之后，可以用本领域已知的方法将已经被转化的原生质体、细胞或植物部分再生成为整个植物(Horsch等人，1985)。转化和/或再生技术的选择对本发明不是关键性的。
对于双子叶植物，本发明的优选实施方案使用了二元载体系统(Hoekema等人，1983；EP 0120516 Schiperoort等人)的原则，其中该系统使用了含有带有毒力基因的vir质粒和含有被转化的基因构建体的相容质粒的农杆菌菌株。该载体可以在大肠杆菌和农杆菌中复制，并且衍生自二元载体Bin19(Bevan，1984)，该载体在细节上做了一些变化，这些变化与本发明无关。在该实施例中所用的这些二元载体在T-DNA的左边界序列和右边界序列之间，含有一个编码卡那霉素抗性的同一NPT II-基因(Bevan，1984)和一个在必需的基因构建体中用于克隆的多克隆位点。
单子叶作物的转化和再生不是一个标准方法。然而，最近的科学进展表明单子叶植物大体上能适合转化，而且表明可以从转化细胞再生能育的转基因植物。这些作物的再生性组织培养系统以及用于将遗传物质引入植物细胞中的有效方法的开发已经促进了转化。目前，所选择的用于转化单子叶植物的方法是外植体或悬浮细胞的微粒轰击，和直接DNA吸收或原生质体的电穿孔。例如，已经用编码潮霉素抗性的细菌hph基因作为选择标记成功地获得了转基因水稻植物。基因是通过电穿孔引入的(Shimamoto等人，1993)。已经通过用微粒轰击将编码膦丝菌素乙酰转移酶(阻止除草剂膦丝菌素活动的酶)的链霉菌属hygroscopicus bar基因引入玉米悬浮培养物的胚胎细胞中获得了转基因玉米植物(Gordon-Kamm等人，1990)。已经报导了将遗传物质引入其它单子叶作物如小麦和大麦的糊粉原生质体中(Lee等人，1989)。已经通过仅选择老化的致密物和结节状胚胎悬浮培养物从胚胎悬浮培养物中再生出小麦植物，用于建立胚胎悬浮培养物(Vasil等人，1972：Vasil等人，1974)。将转化系统结合用于这些作物可以使本发明应用于单子叶植物。这些方法也可以被用于双子叶植物的转化和再生。
肌醇六磷酸酶构建体的表达涉及这样的细节，如通过植物聚合酶转录基因，mRNA的翻译等，这些细节在重组DNA技术领域对熟练技术人员是已知的。下面仅对与本发明的正确理解有关的细节做了描述。可以将已知或被发现引起肌醇六磷酸酶的表达的调节序列用于本发明。所用的调节序列的选择依赖于相关靶农作物和/或相关靶器官。这样的调节序列可以从植物或植物病毒获得，或者可以化学合成。这样的调节序列是在植物中指导转录的启动子，依赖于使用的植物或其器官，或者组成型，或者阶段专一和/或组织专一。这些启动子包括但不限于：表现出组成型表达的启动子，如花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子(Guiley等人，1982)；那些用于叶子专一性表达的启动子，如核酮糖二磷酸羧化酶小亚基基因的启动子(Coruzzi等人，1984)；那些用于根专一性表达的启动子，如来自谷氨酰胺合酶基因的启动子(Tingey等人，1987)；那些用于种子专一性表达的启动子，如来自Brassica napus的cruciferin A启动子(Ryan等人，1989)；那些用于块茎专一性表达的启动子，如来自马铃薯的I级patatin启动子(Koster-Topfer等人，1989；Wenzler等人，1989)或那些用于果实专一性表达的启动子，如来自西红柿的多聚半乳糖醛酸酶(PG)启动子(Bird等人，1988)。
其它调节序列如终止序列和聚腺苷酸化信号包括任何在植物中发挥指导转录作用的序列，选择哪种在熟练技术人员的知识水平之内。这样的序列的实例是根瘤农杆菌的胭脂氨酸合酶(nos)基因的3’侧冀区(Bevan，见上文)。调节序列也包括增强子序列，如在CaMV的35S启动子中发现的增强子序列，和mRNA稳定序列如苜蓿花叶病毒(AIMV)RNA4的前导序列(Brederode等人，1980)，或任何以类似方式发挥作用的其它序列。
应该在允许表达蛋白的稳定性的环境中表达肌醇六磷酸酶。可以依赖于肌醇六磷酸酶的生物物理参数，选择细胞区室如胞质溶胶、内质网、液泡、蛋白体或周质间隙用于本发明中，以创造这样的稳定环境。这样的参数包括但不限于，最适pH、对蛋白酶的灵敏度或对优选区室摩尔浓度的灵敏度。
为了达到在细胞的细胞质中的表达，被表达的酶不应该含有分泌信号肽或任何其它定向序列。为了在叶绿体和线粒体中表达，被表达的酶应该含有用于输入到这些细胞器官中的专一性所谓转运肽。可以附加在相关酶上以实现该目的的定向序列是已知的(Smeekens等人，1990；van den Broeck等人，1985；Wolter等人，1988)。如果在液泡中期望酶具有活性，那么必需存在分泌信号肽，以及指导该酶到达这些液泡的专一性定向序列(Tague等人，1990)。这对于种子中的蛋白体也是如此。编码相关酶的DNA序列以这样的一种方式被修饰，即该酶可以在细胞中期望位置发挥作用。
为了实现肌醇六磷酸酶的胞外表达，本发明的表达构建体使用了分泌信号序列。尽管与植物宿主物种同源(天然的)的信号序列是优选的，但也可以使用异源信号序列，即那些来源于其它植物物种或起始于微生物起源的信号序列。这样的信号序列对本领域的熟练技术水平的人员是已知的。可用于本发明上下文中的适当的信号序列在下述文献中已经公开：Blobel等人，1979；Von Heijne，1986；Garcia等人，1987；Sijmons等人，1990；Ng等人，1984；和Powers等人，1996。
如果期望，可以用本领域熟练技术水平人员已知的方法对本发明相关DNA构建体(启动子、调节序列、分泌序列、稳定序列、定向序列或终止序列)的所有部分进行修饰，以影响它们的控制特性。在此指出，可以使用含有通过本发明获得的肌醇六磷酸酶的植物，以获得更具有较高肌醇六磷酸酶水平的植物或植物器官。例如，通过使用体细胞克隆变异技术或通过杂交育种技术获得这样的植物或植物器官是可能的。这样的技术对于本领域的熟练技术水平人员是熟知的。
在一个实施方案中，本发明提供了一种获得用于肌醇六磷酸酶和其它分子的高效率过量表达系统的方法(及其产物)。在一个优选实施方案中，本发明提供了一种获得用于木霉菌属的肌醇六磷酸酶和pH为2.5的酸性磷酸酶的高效率过量表达系统的方法(及其产物)。该系统产生了在动物饲料行业尤其有用的酶组合物。关于该方法的其它细节在公共文献中和/或对熟练技术人员是已知的。在一个特定的非限定性例证中，这样的可以公开获得的文献包括EP 0659215(WO 9403612 A1)(Nevalainen等人)，尽管这些参考文献没有教导本申请的发明分子。
在一个实施方案中，本发明提供了一种方法(及其产物)，该方法产生了具有肌醇六磷酸酶活性的稳定的含水液体配方，该配方对酶活性的加热灭活表现出增强的抗性，并且在长时间的存储中保持了它们的肌醇六磷酸酶活性。液体配方是通过加入作为稳定剂的尿素和/或多元醇如山梨糖醇和丙三醇稳定的。本发明也提供了用于单胃动物的饲料制剂及其产生方法，所述饲料制剂是使用这样的稳定含水液体配方产生的。关于该方法的其它细节在公共文献中和/或对熟练技术人员是已知的。在一个特定的非限定性例证中，这种可以公开获得的文献包括EP 0626010(WO 9316175 A1)(Barendse等人)，尽管这种可通过公开通路获得文献中的参考没有教导本申请的发明分子。
在一个实施方案中，本发明提供了一种水解肌醇六磷酸的方法，包括将肌醇六磷酸与一种或多种此处公开的新肌醇六磷酸酶分子接触。因此，本发明提供了一种催化肌醇六磷酸到肌醇和自由磷酸的水解方法，以便从肌醇六磷酸复合物释放矿物质。该方法包括将肌醇六磷酸底物与本发明的降解有效量的酶接触，如SEQID NO：2中所示的酶。术语“降解有效”量指，与不用酶接触的肌醇六磷酸相比，降解至少50％的肌醇六磷酸的所需酶的数量，优选地，降解至少80％的肌醇六磷酸。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种在肌醇六磷酸中水解磷-单-酯键的方法。该方法包括使用有效量的本发明所述肌醇六磷酸酶分子(例如，SEQ ID NO：2)，以产生肌醇和自由磷酸。“有效”量指，与不用酶接触的肌醇六磷酸相比，降解至少50％的磷-单-酯键所需酶的数量，优选地，降解至少80％的键。
在一个特定方面，当期望时，肌醇六磷酸酶分子可以与其它试剂组合使用，如其它催化剂；以便影响肌醇六磷酸分子和/或底物来源的其它分子中的化学变化(如水解)。根据该方面，优选地肌醇六磷酸酶分子和其它试剂(或多种试剂)将不会互相抑制，更优选地肌醇六磷酸酶分子和其它试剂(或多种试剂)将产生总加成效应，更优选地仍然肌醇六磷酸酶分子和其它试剂(或多种试剂)将产生总协同效应。
底物肌醇六磷酸分子的相关来源包括食品、潜在食品、食品的副产品(体外副产品和体内副产品，如体内反应产物和动物的粪便产物)、食品的前体和任何其它肌醇六磷酸物质来源。
在一个非限定性方面，重组肌醇六磷酸酶可以被生物体消费，并且在消费时保持活性。在另一个例证中，可以用转基因方法来实现重组肌醇六磷酸酶的表达-优选地以可控方式(可以用来以阶段专一性和组织专一性方式控制转基因分子的表达的方法)。
在一个特定例证中，在消费时来源物质(如转基因植物来源或重组原核宿主)中的肌醇六磷酸酶活性可能增加；这种活性增加可能发生，例如，在原形式的前体肌醇六磷酸酶分子转化为更成熟形式的活性更显著的酶时，其中所述转化可能由，例如肌醇六磷酸酶来源的摄入和消化产生。在肌醇六磷酸酶与肌醇六磷酸接触时，肌醇六磷酸底物的水解可能在任意时间发生；例如，水解可能在底物或酶或两者摄入之前，或摄入之后，或摄入之前和摄入之后发生。因此应该意识到，肌醇六磷酸底物可以与-除了肌醇六磷酸酶-一种或多种其它试剂接触，如另一种酶，它们也可以被直接应用或从其它来源物质纯化之后应用。
应该意识到，肌醇六磷酸酶来源物质可以直接与肌醇六磷酸来源物质接触；如肌醇六磷酸酶来源和肌醇六磷酸来源之一或者两个的体外或体内研磨或咀爵。可选择地，在肌醇六磷酸酶分子与肌醇六磷酸底物接触之前，肌醇六磷酸酶分子可以从来源物质纯化，或者肌醇六磷酸底物可以从来源物质纯化，或者肌醇六磷酸酶分子和肌醇六磷酸底物可以从来源物质纯化。应该意识到，可以组合使用纯化和未纯化试剂-包括酶或底物或两者。
应该意识到，可以将一种以上的来源物质用作肌醇六磷酸酶活性来源。这可以作为一种方式来实现试剂从来源物质(或多种来源物质)的定时释放，其中从它们的来源物质的不同试剂中的释放的发生了不同，例如当被摄入的来源物质在体内被消化，或者当来源物质在体外应用中被处理。在可能遭遇的条件范围及其波动下-如pH值、温度、盐度和时间间隔-例如在一个应用的不同处理步骤中，也可以用一种以上的肌醇六磷酸酶活性来源物质来获得肌醇六磷酸酶活性。为了得到不同的试剂，也可以使用不同的来源物质，例如肌醇六磷酸酶和/或肌醇六磷酸和/或其它物质的一种或多种形式或异构体。
应该意识到，一种单一来源物质，如转基因植物物种(或其植物部分)可以是一种肌醇六磷酸酶和肌醇六磷酸的来源物质；并且酶和底物可以在所述单一来源中被不同地区室化-如分泌型与非分泌型，在不同植物部分或器官或组织或在同一植物部分或器官或组织的亚细胞区室中，被差别表达和/或具有差别丰度。其中所含的肌醇六磷酸酶分子的纯化可以包括，一个或多个期望植物部分或器官或组织或亚细胞区室的分离和/或进一步处理。
在一个特定方面，本方面提供了一种用含有增强量的酶的种子催化体内和/或体外反应的方法。该方法包括将转基因、非野生型种子，优选地以研磨形式，加入反应混合物中，并且使得种子中的酶增加反应率。通过将种子直接加入反应混合物中，该方法给更昂贵且更麻烦的提取且纯化酶的方法提供了一种溶液。由此这些处理方法也提供了将一种缺少足够酶供给的生物体以种子形式施用该酶，其中种子来源于一种或多种植物物种，优选地是转基因植物物种，含有增强量的酶。关于该方法的其它细节在公共文献中和/或对熟练技术人员是已知的。在一个特定的非限定性例证中，这种可以公开获得的文献包括美国专利5,543,576(Van Ooijen等人)和美国专利5,714,474(Van Ooijen等人)，尽管这些参考文献没有教导本申请的发明分子，而是教导了真菌肌醇六磷酸酶的使用。
在一个特定的非限定性实例中，本发明所述肌醇六磷酸酶分子可用于产生重组消化系统生命形式(或微生物或植物群)，并且在将所述重组消化系统生命形式施用于动物中有用。施用可以任选地单独进行或组合其它酶和/或其它可以在消化系统中提供酶活性的生命形式进行，其中所述其它酶和所述生命形式可以是重组的或其它的。例如，施用可以组合木聚糖水解细菌进行。
在一个非限定性方面，本方面提供了一种在存在含有一种或多种肌醇六磷酸钙镁降解酶的酶制剂的情况下，将玉米或高粱粒浸渍于含有二氧化硫的温水中的方法，优选地该酶制剂的量要使得玉米或高粱中存在的肌醇六磷酸钙镁被基本上降解。酶制剂可以包括肌醇六磷酸酶和/或酸性磷酸酶以及任选地其它植物物质降解酶。浸渍时间可以是12～18小时。可以用中间的研磨步骤中断浸渍，以降低浸渍时间。在一个优选实施方案中，在存在一种酶制剂包括一种或多种肌醇六磷酸钙镁降解酶，如肌醇六磷酸和酸性磷酸酶的情况下，将玉米或高粱粒浸渍于含有二氧化硫的温水中，以除去或大大地降低肌醇六磷酸和肌醇六磷酸的盐。关于该方法的其它细节在公共文献中和/或对熟练技术人员是已知的。在一个特定的非限定性例证中，这种可以公开获得的文献包括美国专利4,914,029(Caransa等人)和EP 0321004(Vaara等人)，尽管这些参考文献没有教导本申请的发明分子。
在一个非限定性方面，本方面提供了一种方法，以获得具有期望物理特性如非粘着性和弹性的面包面团，以及一种高质量的面包产品，如包括将肌醇六磷酸酶加入面包面团的特定体积。在一个优选实施方案中，本发明的肌醇六磷酸酶分子被加入到随后形成且烘干的工作面包面团制剂中。关于该方法的其它细节在公共文献中和/或对熟练技术人员是已知的。在一个特定的非限定性例证中，这种可以公开获得的文献包括日本专利03076529(Hara等人)，尽管该参考文献没有教导本申请的发明肌醇六磷酸酶分子。
在一个非限定性方面，本发明提供了一种产生提高大豆食品的方法。将大豆与本发明的肌醇六磷酸酶分子组合，以便从大豆中去除肌醇六磷酸，从而产生用于消费生物体的在其微量营养要素供给中和其蛋白质的消化性中得到改进的大豆食品。在一个优选实施方案中，在大豆奶的产生中，将本发明的肌醇六磷酸酶分子加入大豆中，或与大豆接触，以便降低肌醇六磷酸含量。在一个非限定性例证中，可以通过在加热下搅拌大豆奶和酶，或者通过用固定酶在搅拌容器中进行混合型反应来加速应用过程。关于该方法的其它细节在公共文献中和/或对熟练技术人员是已知的。在一个特定的非限定性例证中，这种可以公开获得的文献包括日本专利59166049(Kamikubo等人)，尽管该参考文献没有教导本申请的发明分子。
一方面，本发明提供了一种产生用于饮用水或动物饲料的液体形式的混合产物的方法，该方法包括使用矿物质混合物和维生素混合物，并且也使用了本发明的新肌醇六磷酸酶分子。在一个优选实施方案中，得到了一种正确剂量和组成的用于消费生物体必需的营养素混合物，而没有任何重要矿物质/维生素的沉淀和破坏风险，同时实现了饲料中肌醇六磷酸钙镁束缚的磷酸的最适利用。关于该方法的其它细节在公共文献中和/或对熟练技术人员是已知的。在一个特定的非限定性例证中，这种可以公开获得的文献包括EP 0772978(Bendixen等人)，尽管该参考文献没有教导本申请的发明分子。
应该意识到，也可以基于使用霉菌和/或基于谷物和/或基于其它植物，用本发明的肌醇六磷酸酶分子产生其它酒精和非酒精可饮用食品(或饮料)。这些可饮用食品包括酒精饮料、葡萄酒、混合酒精饮料(如葡萄酒冷却器、其它酒精咖啡如爱尔兰热咖啡等)、啤酒、薄啤酒、果汁、提取物、均浆和浓汤。在一个优选例证中，用即将公开的肌醇六磷酸酶分子来产生可用于产生这些可饮用食品的转基因型霉菌和/或谷物和/或其它植物。在另一个优选例证中，在这些可饮用食品的制造过程和/或最终含量中，即将公开的肌醇六磷酸酶分子被用作其它成分。关于该方法的其它细节在公共文献中和/或对熟练技术人员是已知的。然而-由于本发明的新颖性-可以公开获得的文献的参考中没有教导即将公开的发明分子。
在另一个非限定性例证中，本发明通过了一种方法，获得具有降低量的肌醇六磷酸钙镁和增加含量的肌醇的精制日本米酒。这种日本米酒对于肝病、动脉硬化和其它疾病可能具有-通过直接和/或心理效应-预防作用。在一个优选实施方案中，这种日本米酒是通过繁殖具有高肌醇六磷酸酶活性的大米日本酒曲霉菌用作为原材料的大米日本酒曲产生的。应该意识到，可以用本发明的肌醇六磷酸酶分子来产生一种有用的霉菌，其具有增强活性(优选地是转基因霉菌)和/或被外源加入来增强日本酒曲霉菌效果。该菌株被加入煮熟的大米中，并且日本酒曲是通过传统方法产生的。在一个优选实施方案中，使用了所制备的日本酒曲，在两个阶段制备全米，在15℃的恒定温度下产生日本米酒，以便产生目标精制日本米酒，其中肌醇六磷酸钙镁的量有所降低且肌醇的量有所增加。关于该方法的其它细节在公共文献中和/或对熟练技术人员是已知的。在一个特定的非限定性例证中，这种可以公开获得的文献包括日本专利06153896(Soga等人)和日本专利06070749(Soga等人)，尽管这些参考文献没有教导本申请的发明分子。
在一个非限定性方面，本发明提供了一种获得能促进矿物质吸收的吸收剂的方法，其中矿物质包括不需要被胃液或肠液以低成本消化的被摄取的钙。在一个优选的实施方案中，所述矿物质吸收剂含有一种肌醇六磷酸的部分水解产物作为活性成分。优选地，肌醇六磷酸的部分水解产物是通过用本发明的肌醇六磷酸酶分子水解肌醇六磷酸或其盐而产生的。具有所述的肌醇六磷酸酶分子的处理可以单独发生和/或在组合处理中发生(以抑制或增强最终效果)，随后在只要不释放所有肌醇六磷酸自由基的范围内抑制水解。关于该方法的其它细节在公共文献中和/或对熟练技术人员是已知的。在一个特定的非限定性例证中，这种可以公开获得的文献包括日本专利04270296(Hoshino)，尽管可以通过公开通路获得的文献中的参考没有教导本申请的发明分子。
在一个非限定性方面，本发明提供了一种方法(及其产物)，产生一种具有加成或优选地协同肌醇六磷酸水解活性的酶组合物；所述组合物包括本发明的新肌醇六磷酸酶分子和一种或多种其它试剂，以得到一种在组合处理中有用的组合物。在一个优选的实施方案中，本发明的组合处理是用至少两种具有不同位置专一性的肌醇六磷酸酶，即1-、2-、3-、4-、5-和6-肌醇六磷酸酶的任意组合。通过组合不同位置专一性的肌醇六磷酸酶，就可以达到加成或协同效应。在组合中包括这些肌醇六磷酸酶的组合物如食物和饲料，或食物和饲料添加剂也包括在本发明中，以及用于它们制备的方法也包括在本发明中。关于该方法的其它细节在公共文献中和/或对熟练技术人员是已知的。在一个特定的非限定性例证中，这种可以公开获得的文献包括WO 830681(Ohmann等人)，尽管可以通过公开通路获得的文献中的这些参考没有教导本申请的发明分子。
在另一个优选的实施方案中，本发明的组合处理是通过使用具有肌醇六磷酸水解活性的酸性磷酸酶实现的，在pH值为2.5，以相对于pH值为2.5∶5.0的低比率使用，活性分布从大约0.1∶1.0～10∶1，优选地从大约0.5∶1.0～5∶1，更优选地仍然从大约0.8∶1.0～3∶1，更优选地仍然从大约0.8∶1.0～2∶1。所述酶组合物优选地通过热处理表现出较高的协同肌醇六磷酸水解效率。可以将所述酶组合物用于食品(可饮用的和固体食物、饲料和饲料产物)处理中，以提高肌醇六磷酸水解。关于该方法的其它细节在公共文献中和/或对熟练技术人员是已知的。在一个特定的非限定性例证中，这种可以公开获得的文献包括美国专利5,554,399(Vanderbeke等人)和美国专利5,443,979(Vanderbeke等人)，尽管这些参考文献没有教导本申请的发明分子，但相反教导了真菌(尤其是Aspegillus)肌醇六磷酸酶的使用。
在一个非限定性方面，本方面提供了一种产生组合物的方法(及其产物)，该组合物包括作用于本发明新肌醇六磷酸的酶，组合了一种或多种其它作用于多糖的酶。这些多糖可以选自arabinan、果聚糖、脱氧半乳聚糖、半乳聚糖、聚半乳糖醛酸、葡聚糖、甘露聚糖、木聚糖、果聚糖、岩藻聚糖、角叉藻聚糖、半乳卡洛糖、果胶、果胶酸、直链淀粉、出芽短梗霉聚糖、糖原、支链淀粉、纤维素、羧基甲基纤维素、羟基丙基甲基纤维素、右旋糖酐、石耳素、几丁质、琼脂糖、角质素、软骨素、皮肤素、透明质酸、褐藻酸，以及含有至少一种醛糖、酮糖、酸或氨基的多糖，它们选自赤藓糖、苏糖、核糖、树胶醛醣、木糖、来苏糖、阿洛糖、阿卓糖、葡萄糖、甘露糖、古洛糖、艾杜糖、半乳糖、塔罗糖、赤藓酮糖、核酮糖、木酮糖、阿洛酮糖、果糖、山梨糖、塔格糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖酸、葡糖二酸、半乳糖醛酸、甘露糖醛酸、葡萄糖胺、半乳糖胺和神经氨糖酸。
在一个特定方面，本方面提供了一种方法(及其产物)，该方法用来产生具有协同肌醇六磷酸水解活性的组合物，该组合物包括本发明的一种或多种新肌醇六磷酸酶分子、纤维酶(优选地包括但不仅仅是木聚糖酶)，任选地蛋白酶，和任选地一种或多种其它试剂。在一个优选的实施方案中，这样的组合处理可以用于处理食品、木材制品，如纸制品，以及作为清洁用溶液和固体。
在另一个非限定性例证中，本发明的肌醇六磷酸酶分子可以与多纤维素酶体组分组合使用。已知许多纤维素分解细菌的纤维素酶被组织成为离散多酶复合物，称作多纤维素酶体。多纤维素酶体的多个亚单位由许多功能域构成，它们互相作用并且与纤维素底物互相作用。这些亚单位中的一个亚单位包括一种独特的新类别的非催化支架多肽，其选择性地将各种纤维素酶和木聚糖酶亚单位整合进内聚复合物中。多纤维素酶体杂交的巧妙应用和多纤维素酶体域的嵌合构建体应该使得更好的使用纤维素生物量，并且可以在研究、医药和工业上提供广泛的新应用。
在另一个非限定性例证中，本发明的肌醇六磷酸酶分子是有用的-或者单独或者在组合处理中-在期望降低传统上用于成浆和造纸行业的对环境有害的化学药品使用量的生物成浆和生物漂白领域。在生物酶已经表现出有效，不仅在脱色领域而且在将潜在有害的物质生物转化进有用的生物产品中的领域，废水处理代表着另一种广泛的应用领域。
在另一个非限定性例证中，本发明的肌醇六磷酸酶分子是可以用来产生能提供至少一种酶活性的生命形式-或者单独或者在组合处理中-在生物体的消化系统处理中。被处理的显著相关的生物体包括非反刍生物。更明确地说，应该意识到可以单独或者组合其它生物分子(例如木聚糖酶)进行该方法，以产生一种可以表达多种生物分子的重组宿主。也应该意识到，本发明的肌醇六磷酸酶分子和/或表达本发明肌醇六磷酸酶分子的重组宿主的施用可以单独或组合其它生物分子，和/或组合能在消化系统中提供酶活性的生命形式进行-其中所述酶和所述生命形式可以是重组的或其它形式。例如，施用可以组合木聚糖水解细菌进行。
例如，除了肌醇六磷酸，许多生物体也不能充分地消化半纤维素。半纤维素或木聚糖是植物物质的主要成分(35％)。对于反刍动物，大约50％的膳食木聚糖被降解，但在非反刍动物和人类的下肠道中仅有少量木聚糖被降解。在瘤胃中，主要的木聚糖水解种类是溶纤维丁酸弧菌和居瘤胃拟杆菌。在人类结肠中，类菌体卵圆形和类菌体脆壁亚种“a”是主要的木聚糖水解细菌。木聚糖是化学复合物，它们的降解需要多种酶。这些酶的通过肠道细菌的表达在这些种类中变化很大。溶纤维丁酸弧菌使得胞外木聚糖酶除类菌体种类具有细胞结合木聚糖酶活性。来自肠道细菌的木聚糖水解酶的生物化学特性还没有完全搞清楚。已经从溶纤维丁酸弧菌113克隆了木糖苷酶基因。使用克隆于溶纤维丁酸弧菌49的木糖苷酶基因的DNA杂交数据表明该基因可能存在于其它溶纤维丁酸弧菌菌株中。从居瘤胃拟杆菌克隆的木聚糖酶被转移进脆弱拟杆菌和单形拟杆菌，并且在其中被高度表达。来自卵形假杆菌的阿拉伯糖苷酶和木糖苷酶基因已经被克隆，并且两者的活性表现出被一种单一、双官能、新酶催化。
因此，应该意识到，本发明的肌醇六磷酸酶分子可用于：1转移进合适的宿主中(如溶纤维丁酸弧菌或居瘤胃拟杆菌)；2)在所获得的重组宿主中实现充分的表达；和3)将所述重组宿主施用于生物体，以提高被处理生物降解肌醇六磷酸的能力。在遗传和生物化学领域的持续研究将提供在肠道水平操纵消化的知识和洞察力，提高对结肠纤维消化的理解。
关于该方法的其它细节在公共文献中和/或对熟练技术人员是已知的。在一个特定的非限定性例证中，这种可以公开获得的文献包括美国专利5,624,678(Bedford等人)、美国专利5,683,911(Bodie等人)、美国专利5,720,971(Beauchemin等人)、美国专利5,759,840(Sung等人)、美国专利5,770,012(Cooper等人)、美国专利5,786,316(Baeck等人)、美国专利5,817,500(Hansen等人)和杂志文章(Jeffries，1996；Prade，1996；Bayer等人，1994；Duarte等人，1994；Hespell & Whitehead，1990；Wong等人，1988)，尽管这些参考文献没有教导本申请的发明分子，也没有教导将肌醇六磷酸酶分子加入食品、木材制品如纸制品的生产中，以及作为清洁用溶液和固体。相反，本发明教导了肌醇六磷酸酶分子-优选地本发明的发明肌醇六磷酸酶分子-可以被加入所公开的试剂(或多种试剂)中，以便得到具有其它肌醇六磷酸酶活性的制剂。优选地，所述试剂(或多种试剂)其它肌醇六磷酸酶分子将不互相抑制，更优选地所述(或多种试剂)其它肌醇六磷酸酶分子将具有总加成效应，更优选地仍然所述(或多种试剂)其它肌醇六磷酸酶分子将具有总协同效应。
在一个非限定性方面，本发明提供了一种方法(及其产物)，该方法通过给动物施用一种含有羟基化维生素D3衍生物的饲料组合物，用于在动物尤其是家禽中增强肌醇六磷酸磷的利用和处理以及阻止胫骨软骨发育障碍。优选地将维生素D3衍生物施用于含有低水平的钙和磷的动物饲料中，以增强肌醇六磷酸磷的利用。因此，优选地将维生素D3衍生物与本发明的新肌醇六磷酸酶分子组合使用，以进一步增强肌醇六磷酸磷的利用。关于该方法的其它细节在公共文献中和/或对熟练技术人员是已知的。在一个特定的非限定性例证中，这种可以公开获得的文献包括美国专利5,516,525(Edwards等人)和美国专利5,366,736(Edwards等人)、美国专利5,316,770(Edwards等人)，尽管这些参考文献没有教导本申请的发明分子。
在一个非限定性方面，本方面提供了一种生产食品的方法(及其产物)，以获得食品1)包括在生物体容易被吸收且以肌醇的形式被利用的肌醇六磷酸钙镁；2)能以粪便方式降低磷；和3)从而可以改善环境污染。所述食品包括一种含有肌醇六磷酸钙镁的谷物的混合物，一种产生乳酸的微生物和一种本发明的新肌醇六磷酸酶分子。在一个优选的实施方案中，所述食品是通过将含有肌醇六磷酸钙镁的谷物(优选地，例如米糠)与具有嗜酸特性的有效的微生物种群混合而产生的，从而产生乳酸，不产生丁酸，不具有致病性，且具有肌醇六磷酸酶。有效的微生物种群的实例包括，例如属于放线菌种群的链霉菌属sp.(ATCC 3004)和属于乳杆菌素种群的乳杆菌属sp.(IFO 3070)。进一步，根据基于谷物物质的细菌体重量，有效的微生物种群的优选添加量是0.2wt.％。而且，基于谷物物质中肌醇六磷酸钙镁的量，肌醇六磷酸酶的添加量优选地是1～2wt.％。关于该方法的其它细节在公共文献中和/或对熟练技术人员是已知的。在一个特定的非限定性例证中，这种可以公开获得的文献包括日本专利08205785(Akahori等人)，尽管在这种可以公开获得的文献中的参考没有教导本申请的发明分子。
在一个非限定性方面，本发明提供了一种提高蔬菜蛋白质溶解性的方法。更明确地说，本发明涉及用于溶解蔬菜蛋白质材料中的蛋白质的方法，这些方法包括用有效量的一种或多种肌醇六磷酸酶-包括本发明的肌醇六磷酸酶分子-处理蔬菜蛋白质材料，以及用有效量的一种或多种蛋白水解酶处理蔬菜蛋白质材料。另一方面，本发明提供了包括肌醇六磷酸酶和一种或多种蛋白水解酶的动物饲料添加剂。关于该方法的其它细节在公共文献中和/或对熟练技术人员是已知的。在一个特定的非限定性例证中，这种可以公开获得的文献包括EP 0756457(WO9528850 A1)(Nielsen和Knap)，尽管在这种可以公开获得的文献中的参考没有教导本申请的发明分子。
在一个非限定性方面，本发明提供了一种产生植物蛋白制剂的方法，该方法包括将蔬菜蛋白质材料物质分散于pH值在2～6之间的水中，并且将本发明的肌醇六磷酸酶分子混合于其中。分离出含有可溶性蛋白质的酸性提取物，并将其干燥以得到一种具有期望特性的固体蛋白质。也可以用一种或多种蛋白酶来提高蛋白质的特性。关于该方法的其它细节在公共文献中和/或对熟练技术人员是已知的。在一个特定的非限定性例证中，这种可以公开获得的文献包括美国专利3,966,971(Morehouse等人)，尽管在这种可以公开获得的文献中的参考没有教导本申请的发明分子。
在一个非限定性方面，本发明提供了一种方法(及其产物)，该方法用来激活土壤和/或混合肥料中的惰性磷，以提高氮化合物的使用率，并且通过将三种试剂、肌醇六磷酸酶、皂苷和脱乙酰壳多糖加入混合肥料中来抑制致病霉菌的繁殖。在一个非限定性实施方案中，该方法可以包括通过如下方式处理混合肥料：1)将含有肌醇六磷酸酶的微生物加入介质中-优选地是能过量表达本发明的新肌醇六磷酸酶分子的重组宿主-例如在100ml介质/100kg湿混合肥料；2)也可选择地加入含有肌醇六磷酸酶的植物材料-如麦麸-例如在0.2～1kg/100kg湿混合肥料；3)加入含有皂苷的材料-如泥炭、艾属植物和丝兰植物-例如0.5～3.0g/kg；4)加入含有脱乙酰壳多糖的物质-如虾、蟹等粉碎的壳-如在100～300g/kg湿混合肥料。在另一个非限定性实施方案中，重组材料使用了三种试剂-肌醇六磷酸酶、皂苷和脱乙酰壳多糖。关于该方法的其它细节在公共文献中和/或对熟练技术人员是已知的。在一个特定的非限定性例证中，这种可以公开获得的文献包括日本专利07277865(ToyaTaisuke)，尽管在这种可以公开获得的文献中的参考没有教导本申请的发明分子。
本发明全长基因的片断可以被用作cDNA或基因组文库的杂交探针，以分离全长DNA，并且分离其它具有与该基因具有高序列相似性或与其具有相似生物活性的DNA。这种类型的探针具有至少10个碱基，优选地至少15个，甚至更优选地至少30个，并且含有，例如至少50个或更多个碱基。该探针也可以被用于识别与全长转录和基因组克隆或含有包括调节区和启动区、外显子和内含子的完整基因的克隆相应的DNA克隆。
本发明提供了识别编码肌醇六磷酸酶多肽家族除SEQ ID NO：1之外的成员的核酸分子的方法。在这些方法中，用肌醇六磷酸酶专一性探针，例如肌醇六磷酸酶专一性核酸探针筛选含有编码肌醇六磷酸酶多肽的核酸的样品，例如核酸文库如cDNA文库。肌醇六磷酸酶专一性核酸探针是核酸分子(例如含有DNA或RNA核苷酸的分子，或其组合或修饰)，该核酸分子与编码肌醇六磷酸酶多肽的核酸特定地杂交，或与其互补序列杂交。术语“肌醇六磷酸酶专一性探针”，在本发明所述方法上下文中，指编码肌醇六磷酸酶多肽的核酸或与其互补序列结合的探针，且结合程度比结合编码其它酶或其互补序列的核酸更大。
本发明促进了肌醇六磷酸酶专一性核酸探针的产生。可以基于图1所示氨基酸序列设计获得这样的探针的方法。可以用几种标准方法中的任一种来产生这些可以含有至少12个核苷酸，例如至少15、25、35、50、100或150个核苷酸的探针(参考，例如Ausubel等人，见上文)。例如，优选地，这些探针是用PCR扩增方法产生的。在这些方法中，设计这些引物使得它们符合肌醇六磷酸酶保守序列(参考图1)，它们可以包括肌醇六磷酸酶专一性氨基酸，并且所得到的PCR产物被用作探针来筛选核酸文库，如cDNA文库。
可以用本发明来分离与编码图1(SEQ ID NO：1)中所公开的肌醇六磷酸酶的分离核酸分子基本上类似的核酸序列。如果分离核酸序列：(i)能在此处描述的严格条件下与SEQ ID NO：1杂交；或(ii)由于遗传密码的简并性(例如与SEQ IDNO：1简并)，它们编码SEQ ID NO：2中阐明的肌醇六磷酸酶多肽，它们是基本上类似的，。
简并DNA序列编码SEQ ID NO：2的氨基酸序列，但在核苷酸编码序列中有所变化。在此所用，“基本上类似”指与本发明的序列具有类似同一性的序列。可以通过杂交或通过序列比较来识别基本上类似的核苷酸序列。可以通过下述的一种或多种来识别基本上类似的酶序列：蛋白水解消化、凝胶电泳和/或微量测序。
一种分离编码肌醇六磷酸酶的核酸分子是使用本领域认可的方法，用天然或人工设计的探针来探查基因组基因文库(参考，例如Ausubel等人，见上文)。本领域的熟练技术人员应该意识到，SEQ ID NO：1或其片断(包括至少15个相邻核苷酸)是尤其有用的探针。用于该用途的其它尤其有用的探针是与SEQ ID NO：1序列可杂交的片断(即包括至少15个相邻核苷酸)。
也可以理解，这些探针可以是并且是优选地用分析检测试剂标记的，以促进探针的识别。有用的试剂包括但不限于放射性、荧光染料或能催化可检测产物形成的酶。因此这些探针可用于从动物材料分离DNA的互补拷贝，或者用于筛选用于相关序列的这种材料。
关于与此处公开的特定核酸序列杂交的核酸序列，杂交可以在非严格、中等严格或甚至严格条件下进行。作为寡核苷酸杂交的一个实例，首先将含有固定化变性核酸的聚合物膜在45℃的温度下，在含有0.9M NaCl、50mM NaH2PO4、pH为7.0、5.0mM Na2EDTA、0.5％SDS、10X Denhardt’s和0.5mg/mL多核糖腺苷酸的溶液中预杂交30分钟。然后将大约2×107cpm(比活性4-9×108cpm/ug)的32P末端标记的寡核苷酸探针加入上述溶液中。在温育12～16小时后，在含有0.5％SDS的1×SET(150mM NaCl、20mM Tris HCl、pH为7.8、1mM Na2EDTA)中在室温下将膜洗涤30分钟，随后在新鲜的1X SET中在Tm-10℃下将寡核苷酸探针洗涤30分钟。然后将膜暴露于自放射照相薄膜上用于检测杂交信号。
在产生肌醇六磷酸酶基因产物(例如肌醇六磷酸酶RNA和肌醇六磷酸酶多肽)的标准方法中，本发明的核酸分子可以被用作模板。另外，编码肌醇六磷酸酶多肽(及其片断)和相关核酸的核酸分子-如(1)含有与编码肌醇六磷酸酶多肽或其片断(例如，含有至少12、15、20或25个核苷酸的片断)的核酸互补或与杂交的序列的核酸；和(2)含有与编码肌醇六磷酸酶多肽或其片断(例如，含有至少12、15、20或25个核苷酸的片断)的核酸互补的序列杂交的序列的核酸-可以被用于研究其杂交特性的方法中。例如，正如在此处进一步的详述中所描述的，这些核酸分子可以被用于下述方法中：用于合成肌醇六磷酸酶核酸的PCR法、用于检测样品中肌醇六磷酸酶核酸存在的方法、用于识别编码新肌醇六磷酸酶家族成员的核酸的筛选方法。基于杂交的用途包括Southern-型、Northern-型、RNA保护和任何核酸被用作杂交配偶体的杂交方法。
本发明的多核苷酸的片断或部分可以被用来合成本发明的全长多核苷酸。因此，本发明所述酶的片断或部分可以被用来通过肽合成产生相应的全长酶；因此，这些片断可以被用作中间体，用于产生全长酶。正如文献中所描述的，通常用8％聚丙烯酰胺凝胶来进行裂解片断的大小选择(例如，通过Goeddel等人，1980)。
本发明提供酶、以及片断、其它衍生物及其类似物，和用于定向进化的相应核苷酸。与单一模板蛋白质的定向进化相比，正如此处所公开的，多种模板的发现和使用可以显著地增加定向进化的潜在产量。因此，发现的需求基于下述前提：自然界在分子定群的不同但相关的成员中提供大量潜在达不到的或不可预知的特征，并且对这些特征的利用可以大大地促进定向进化。因此，一方面，相关但不同的分子可以作为用于目标特性的定向进化的唯一起始模板。另一方面，它们可以作为结构功能信息库，包括但不限于，多种共有基元。两种用途有助于在任意给定分子上避免进行对极度广泛的突变置换进行迅速研究的逻辑上不切实际的工作。例如，在含有100个氨基酸的蛋白质上的全长突变置换有超过10130种可能性(假定在每一位置有20种氨基酸可能性)，这是一个对于实际研究来说太大的数据。
因此，尤其由于逻辑和技术限制，一种期望的方法-在进行“定向进化”中-用于发现且利用具有预进化差异的多种相关起始模板。这些模板可被用于多种诱变操纵中，包括通过非限定性例证的方式，DNA诱变和组合酶开发，该方法进一步详述在共同未决的美国专利5,830,696(Short等人)中。
然后通过多种方法筛选所产生的新分子的酶活性，包括通过非限定性例证的方式：a)分子淘选；b)重组克隆筛选；和c)提取物筛选。
本发明提供了酶、及其片断、其它衍生物和其类似物，以及表达它们的细胞，其可以被用作免疫原产生针对它们的抗体。这些抗体可以是，例如多克隆或单克隆抗体。本发明也包括嵌合、单链和人源化抗体，以及Fab片断、或Fab表达文库的产物。可以用本领域已知的各种方法来产生这样的抗体和片断。
对于相应于本发明的序列的酶的抗体的产生，可以通过将酶直接摄入动物或施用于动物，优选非人类动物来获得。然后如此获得的抗体将与该酶本身结合。用这种方式，甚至仅编码酶的一个片断的序列可以被用来产生结合整个天然酶的抗体。然后用这些抗体从编码上述酶的细胞来分离酶。
为了制备单克隆抗体，可以使用任何能提供由连续细胞系培养物产生的抗体的方法。实例包括杂交瘤技术(Kohler和Milstein，1975)、三元杂交瘤技术、人类B-细胞杂交瘤技术(Kozbor等人，1983)和产生人类单克隆抗体的EBV-杂交瘤技术(Cole等人，1985，第77-96页)。
可以用描述用于产生单链抗体的技术(美国专利4,946,778 Ladner等人)进行修改来产生本发明的免疫原酶产物的单链抗体。而且，可以用转基因小鼠来表达本发明的免疫原酶产物的人源化抗体。
用本发明的酶产生的抗体可以被用于从其它生物体和样品筛选类似酶。这些筛选技术在本领域是已知的。抗体也可以被用作探针来筛选从该生物或其它生物产生的基因文库，以识别这种或交叉反应活性。
可以用适合于特定系统的传统方法来进行在上边所述系统中产生的多肽的分离和纯化。例如，可以采用使用了抗体，如单克隆或多克隆抗体的制备型层析和免疫分离。
正如上边所提到的，可以被用于产生肌醇六磷酸酶专一性抗体的抗原包括肌醇六磷酸酶多肽，例如图1多肽片断中所示的任意肌醇六磷酸酶。可以通过标准重组、化学合成或纯化方法获得用于免疫动物的多肽或肽。正如本领域所熟知的，为了增加免疫原性，可以用抗原结合载体蛋白质。通常使用的载体包括匙孔血蓝蛋白(KLH)、甲状腺球蛋白、牛血清清蛋白(BSA)和破伤风类毒素。然后将偶联肽用于免疫动物(如小鼠、大鼠或兔)。除了这些载体，可以用已知的佐剂和抗原一起使用，以促进强烈免疫反应的诱导。
可以对肌醇六磷酸酶专一性多克隆和单克隆抗体进行纯化，例如通过与含有肌醇六磷酸酶多肽的基质结合，或从含有肌醇六磷酸酶多肽的基质洗脱，例如针对肌醇六磷酸酶多肽(或其片断)的抗体已经得到。其它抗体纯化和浓缩方法是本领域已知的，并且可以用本发明的肌醇六磷酸酶专一性抗体来实施(参考，例如Coligan等人，1986)。
与肌醇六磷酸酶专一性抗原相应的抗独特型抗体也包括在本发明中，并且可以用标准方法产生。这些抗体是针对肌醇六磷酸酶专一性抗体的，并且因此模拟了肌醇六磷酸酶专一性抗原决定簇。
本发明也包括肌醇六磷酸酶多肽的片断的其它用途，其中肌醇六磷酸酶多肽保留了至少一种肌醇六磷酸酶专一性活性或抗原决定簇。可以通过检验肌醇六磷酸催化为肌醇和自由磷酸来分析肌醇六磷酸酶活性。通过比较图1中发现的肌醇六磷酸酶的序列，可以容易地识别这些片断。
在一个非限定性例证中，在肌醇六磷酸酶专一性抗体的产生中，含有，例如至少8～10个氨基酸的肌醇六磷酸酶多肽片断可以被用作免疫原。该片断可以含有，例如在肌醇六磷酸酶中的氨基酸序列中是保守的氨基酸序列，并且该氨基酸序列可以含有在肌醇六磷酸酶中是保守的氨基酸。在另一个非限定性例证中，可以在免疫分析，如ELISA中使用上边所述肌醇六磷酸酶片断，以检测样品中肌醇六磷酸酶专一性抗体的存在。
可以使用多种方法制备本发明的转基因动物。总的来说，可以使用三种方法。在一种这样的方法中，从雌性动物收获前核阶段的胚胎(“单细胞胚胎”)，将转基因微量注射进胚胎中，在这种情况下转基因将被整合进所得到的成熟动物的生殖细胞和体细胞的染色体中。在一种这样的方法中，分离胚胎干细胞，并且通过电穿孔、质粒转染或微量注射将转基因引入胚胎干细胞中，随后将干细胞重新引入胚胎中，在那里它们移植且成为生殖细胞系。微量注射哺乳动物种类的方法在美国专利4,873,191中有所描述。仍然在另一个这样的方法中，用含有转基因的反转录病毒感染胚胎细胞，其中胚胎的干细胞含有整合进染色体的转基因。当被转基因的动物是鸟时，由于鸟的受精卵通常在输卵管中在最开始的20小时里进行细胞分裂，所以由于不能得到前核，因而将受精卵的前核微量注射进是有问题的。因此，在上面一般性描述到的用于制备转基因动物的方法中，对于鸟类而言优选的是反转录病毒感染，例如在美国专利5,162,215中描述的。然而，如果微量注射，可以使用由Love等人(Biotechnology，12，1994年1月)出版的方法，其中胚胎是从下了前一个所述鸡蛋之后大约2～1.5小时的供体母鸡获得的，将转基因微量注射进胚盘的细胞质中，并且将胚胎在宿主卵壳中培养，直到成熟。当被转基因的动物是牛或猪时，由于卵的不透明性会阻碍微量注射，从而使得难以用传统鉴别性干扰-相差显微镜术来识别细胞核。为了克服这个问题，首先将卵离心以分离前核，以便于更好的观察。
本发明的“非人类动物”是牛、猪、羊和鸟类动物(例如母牛、猪、绵羊、鸡)。本发明的“转基因非人类动物”是通过将“转基因”引入非人类动物的生殖系而产生的。可以用各种发育阶段的胚胎靶细胞来引入转基因。使用不同的方法依赖于胚胎靶细胞的发育阶段。受精卵是微量注射最好的靶物质。将受精卵作为基因转移的靶物质有一个主要优点，即在许多情况下被注射的DNA将在第一次卵裂前被引入宿主基因中(Brinster等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：4438-4442，1985)。结果，转基因非人类动物的所有细胞将携带有被整合的转基因。由于50％的干细胞将包含转基因，所以通常这也将在表现在转基因由起始代向子代的有效传递中。
术语“转基因”被用来描述，在其所有细胞中包括外源遗传物质的动物中。“转基因”动物可以通过杂交两种嵌合动物而产生，其中嵌合动物在其用于繁殖的细胞中包括外源遗传物质。所得到的子代中的25％将是转基因的，即在其两个等位基因中的所有细胞中包括外源遗传物质的动物，所得到的动物的50％在其一个等位基因中将包括外源遗传物质，25％将不包括外源遗传物质。
在用于主题发明的实践中的微量注射方法中，转基因被消化并且纯化，不含任何载体DNA，例如通过凝胶电泳。优选地，转基因包括一个可操作联合的启动子，它与涉及转录的细胞蛋白质相互作用，最终导致结构表达。在这点上有用的启动子包括那些来自巨细胞病毒(CMV)的启动子、来自莫洛尼氏白血病毒(MLV)的启动子和来自疱疹病毒的启动子，以及那些来自编码金属硫蛋白、骨骼肌动蛋白、P-烯酮丙酮酸羧化酶(PEPCK)、磷酸甘油酸(PGK)、DHFR和胸苷激酶的基因的启动子。也可以使用用于病毒长末端重复序列(LTR)如劳斯肉瘤病毒的启动子。当被转基因的动物是鸟时，优选的启动子包括那些用于鸡珠蛋白基因、鸡溶菌酶基因和鸟白血病病毒的启动子。在胚胎干细胞的质粒转染中有用的构建体将使用本领域熟知的其它调节元件，如刺激转录的增强子元件、剪接受体、终止和多腺苷酸化信号，以及允许翻译的核糖体结合位点。
正如上边所描述的，反转录病毒感染也可以被用来将转基因引入非人类动物。可以在体外将正在发育的非人类胚胎培养到胚泡阶段。在此时期，用于反转录病毒感染的靶物质可以是卵裂球(Jaenich，R.Proc.Natl.Acad.Sci USA73：1260-1264，1976)。用酶处理来达到卵裂球的有效感染，以去除透明带(Hogan等人，(1986)，Manipulating the Mouse Embryo，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.)。用于引入转基因的病毒载体系统通常是携带有转基因的复制缺陷型反转录病毒(Jahner等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：6927-6931，1985；Van der Putten等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：6148-6152，1985)。通过在一个单层病毒产生细胞上培养卵裂球，可以容易且有效地实现转染(Van der Putten，见上文；Stewart等人，EMBO J.6：383-388，1987)。可选择地，可以在后期进行感染。可以将病毒或病毒产生细胞摄入囊胚腔(D.Jahner等人，Nature 298：623-628，1982)。由于整合仅发生在形成转基因非人类动物的亚群细胞中，许多起始代将是转基因的嵌合体。进一步，起始代可以包括在基因组中不同位置的转基因的各种反转录病毒插入，所述基因组通常在子代将分离。另外，通过妊娠中胚胎的子宫内反转录病毒感染将转基因引入生殖系也是可能的，虽然效率比较低(D.Jahner等人，见上文)。
用于转基因引入的第三种类型的靶细胞是胚胎干细胞(ES)。ES细胞是从在体外培养的前移植胚胎获得的，并且将其与胚胎融合(M.J.Evans等人，Nature292：154-156，1981；M.O.Bradley等人，Nature 309：255-258，1984；Gossler等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA 83：9065-9069，1986；和Robertson等人，Nature322：445-448，1986)。通过DNA转染或通过反转录病毒介导的转导，可以将转基因有效地引入ES细胞中。随后将这样的转化ES细胞随后与来自非人类动物的胚泡结合。ES细胞随后移植进胚胎，并且成为所得到的嵌合动物的生殖系(参考综述Jaenisch，R.，Science 240：1468-1474，1988)。
“转化”指一种细胞，其中(或其祖先)已经通过重组核酸技术引入了异种核酸分子。“异种”指或者来源于另一物种的核酸序列，或者是从其原始形式或主要在细胞中被表达的形式修饰而来的核酸序列。
“转基因”指通过人工手段被插入到细胞中的DNA的任何片断，并且成为从此细胞发育而来的生物体基因组的一部分(即或者被稳定地整合，或者作为一个稳定的染色体外因子)。这样的转基因可以包括与转基因生物体部分或完全不同(即外源)的基因，或者可以表示与生物体的内源基因同源的基因。通过提供一个RNA序列而产生的基因也包括在该定义中，其中所述RNA序列是被转录进DNA，然后被整合进基因组的RNA序列。本发明的转基因包括编码肌醇六磷酸酶或具有肌醇六磷酸酶活性的多肽的DNA序列，并且包括可以在转基因非人类动物中表达的多核苷酸。在此所用，术语“转基因的”进一步包括任何生物体，该生物体的基因组已经通过早期胚胎或受精卵的体外操纵被改变，或者通过任何转基因技术被改变，以诱导特定基因敲除。在此所用，术语“基因敲除”指在体内具有完全功能损失的基因的定向破坏，这已经通过本领域熟知的任何转基因技术实现。在一个实施方案中，具有基因敲除的转基因动物是那些其中，靶基因已经通过同源重组将靶向欲使其丧失功能的该基因的插入物插入，使其丧失功能。在此所用，术语“转基因的”包括任何本领域熟知的转基因技术，这些技术可以产生携带有被引入的转基因的生物体，或其中内源基因被丧失了功能的或“敲除的”生物体。
用于本发明实施中的转基因是DNA序列，其包括一个编码肌醇六磷酸酶或具有肌醇六磷酸酶活性的多肽的序列。在一个实施方案中，根据此处所定义的术语，具有一个SEQ ID NO：1中阐明的序列、或一个编码具有SEQ ID NO：2中阐明的序列的多肽序列的多核苷酸是转基因。在适当的地方，此处也可以使用编码具有肌醇六磷酸酶活性但由于遗传密码的简并性使得核酸序列有所不同的DNA序列，可以是截短形式、等位基因变体和种间同源物。
在胚胎已经被微量注射之后，用转染的胚胎干细胞移植或用含有转基因的反转录病毒感染(除了在本文的其它地方论述到的鸟类用于本发明实施之外)，将胚胎植入假怀孕母体的输卵管中。通过血液或使用了转基因专一性探针的组织样品的DNA印迹分析，测试所得子代转基因的整合情况。在这方面，PCR尤其有用。将阳性子代(G0)杂交以产生子代(G1)，通过组织样品的Northern印迹分析，分析G1的转基因表达情况。
因此，本发明包括用于提高转基因动物中磷的吸收和/或降低转基因生物体的粪便中的污染物的方法，提高或降低量为大约15％，通常大约20％，更通常地大约20％～大约50％。
准备用于本发明的实践中的动物是那些通常认为是驯养动物包括宠物(例如犬、猫、鸟类等等)的动物，和那些用于食品加工的动物，即鸟如肉鸡和蛋鸡和火鸡，羊如小羊，牛如菜牛和奶牛，鱼和猪。对于本发明的用途，当这些动物已经具有一个异种DNA序列、或一个或多个通常内源于动物中的其它DNA序列(此处集体地被称作“转基因”)，整合该动物的生殖细胞的染色体中时，这些动物指“转基因的”。转基因动物(包括其子代)也将具有被偶然地整合进体细胞的染色体中的转基因。
在一些情况下，局部(例如在特定组织或细胞类型中)给予且表达本发明的肌醇六磷酸酶序列是有利的。例如，肌醇六磷酸酶或消化酶在动物肠道中的局部表达将分别有助于消化和吸收，例如肌醇六磷酸和磷的消化和吸收。例如，核酸序列可以被直接给予唾液腺、组织和细胞和/或给予排列于肠道中的上皮细胞。这样的给予方法是本领域已知的，其包括电穿孔、表达载体和直接DNA吸收。在本发明的方法中可以使用任何具有肌醇六磷酸酶活性的多肽(例如，那些此处特别描述的多肽，以及那些在本发明的其它部分所描述的多肽)。
例如，本发明的核酸序列构建体将包括适合吸收进宿主组织内的靶细胞的形式的核酸分子。核酸可以是裸DNA或RNA分子的形式，其中这些分子可以包括一个或多个结构基因、一个或多个调节基因、反义链、能形成三股形式的链等等。一般地，核酸构建体将包括至少一个在合适调节区的转录和翻译控制下的结构基因。更通常地，本发明的核酸构建体将包括被结合进释放载体中的核酸，以提高转染效率，其中将释放载体分散于包括干燥亲水性赋形剂物质的较大微粒中。
一种这样的释放载体包括病毒载体，如反转录病毒、腺病毒和腺相关病毒，这些载体已经被失活，以阻止自身复制，但它们保留了如下天然病毒能力：结合靶宿主细胞，将遗传物质传递到靶宿主细胞的细胞质中，和促进已经被结合进微粒中的结构基因和其它基因的表达。Kahn等人(1992)的CIRC.RES.71：1508-1517中对用于调节基因转移的合适的反转录病毒载体做了描述，将其公开引用于此作为参考。Rosenfeld等人(1991)的SCIENCE 252：431-434中对合适的腺病毒基因传递做了描述，将其公开引用于此作为参考。Friedman(1989)的SCIENCE244：1257-1281中对反转录病毒和腺病毒传递系统做了描述，也将其公开引用于此作为参考。
第二种类型的核酸释放载体包括脂质体转染小泡，其包括阴离子和阳离子脂质体构建体。阴离子脂质体的使用要求核酸被包裹进脂质体中。阳离子脂质体不需要核酸包裹，相反可以通过简单地混合核酸和脂质体来形成。阳离子脂质体与负电荷核酸分子密切结合，包括DNA和RNA，以便在许多细胞类型中产生能提供合理转染效率的复合物。参考Farhood等人(1992)BIOCHEM.BIOPHYS.ACTA.1111.239-246，将其公开引用于此作为参考。正如Felgner和Ringold(1989)的NATURE 337：387-388中所描述的，用于形成脂质体小泡的尤其优选的物质是脂质转染物，其包括二油烯基磷脂酰乙醇胺(DOPE)和二油烯基丙氧基-三乙基铵(DOTMA)的等摩尔混合物，将其公开引用于此作为参考。
将这两种类型的传递系统组合也是可能的。例如，Kahn等人(1992)，见上文，教导了可以将反转录病毒载体结合进阳离子DEAE-葡聚糖小泡中，以进一步提高转化效率。将核蛋白结合进病毒和/或脂质体传递小泡中也是可能的，以更进一步提高转染效率。参考Kaneda等人(1989)的SCIENCE 243：375-378，将其公开引用于此作为参考。
在另一个实施方案中，提供了一种含有一种酶的消化助剂，所含的酶或者作为唯一的活性成分，或者组合一种或多种其它试剂和/或酶(如共同未决的美国申请09/580,937中描述的，标题为“Dietary Aids and Methods of Use Thereof”，日期为2000年5月25日，将其公开引用于此作为参考)。家畜和驯养动物的消化助剂中的酶和其它试剂的使用不仅提高了动物的健康和平均寿命，而且有助于提高家畜的健康和有助于从家畜生产食品。
目前，用于家畜的一些类型的饲料高度添加了多种矿物质(例如无机磷)、酶、生长因子、药物和其它用于家畜的试剂。例如，这些补充物取代了谷物中存在的许多热量和天然营养素。
通过从饲料本身降低或除去无机磷补充物和其它补充物(例如，微量矿物质盐、增长因子、酶、抗体)，饲料将含有更多的营养素和能量。因此，剩余食物将含有更多可用的能量。例如，谷物-含油种子粗粉食物中，每千克食物通常含有3,200千卡代谢能，并且矿物质盐不提供代谢能。所以去除这些不必要的矿物质且用谷物取代将增加食物中可用的能量。因此，本发明可以大大不同于一般所用的含肌醇六磷酸酶的饲料。例如，在一个实施方案中，使用了一种生物相溶性物质，它对通过生物体的肠胃道消化具有抗性。
在许多生物体中，例如包括家禽或鸟如，例如鸡、火鸡、雌鹅、鸭、鹦鹉、孔雀、鸵鸟、雉、鹑、鸽子、鸸鹋、几维、潜鸟、澳洲鹦鹉、金丝雀、企鹅、火烈鸟和斑鸠，其消化道包括一个储存和消化坚硬的生物相溶性物质(例如，砂砾和带壳鱼的壳)的砂囊，该胃帮助鸟类消费的种子和其它饲料的消化。一般而言，这些生物种类的消化道包括含有一个囊的食道，称作嗉囊，在这里食物可以暂时存储一段时间。食物从嗉囊移动到真正的胃里，或前胃，在这里盐酸和胃蛋白酶开始消化过程。接着，食物移动到椭圆形而且壁很厚的砂囊中，它带有有力的肌肉。该砂囊的主要功能是磨碎或压碎食物颗粒-一个帮助吞下少量细小的砂砾或粗砂的鸟类的过程。食物从砂囊移动到十二指肠。鸟的小肠类似于哺乳动物。在小肠和大肠的接合处有两个隐蔽的囊或盲囊，长度大约4～6英寸。大肠较短，主要含有长度大约3～4英寸的直肠。直肠的东西全部进入泄殖腔，并且通过肛门排泄粪便。
消费(或换句话说，即摄入)并存在于砂囊中的坚硬且生物相溶性的物体为各种酶、化学、治疗和抗生素试剂的传递提供了有用的载体。这些坚硬物质的存在时间范围为几小时到几天，在一段时间之后被排泄出来。因此，本发明提供了用于将有用的消化或治疗试剂传递给生物体的包被的、浸渍的(例如，浸渍基质和膜)修饰食物助剂。这样的食物助剂包括通常被生物体摄取用于帮助砂囊中的消化作用的物体(例如，石块或砂砾)。本发明提供了其上包被或其中浸渍用作生物体的消化助剂或用于传送治疗或医药试剂或化合物的试剂。
在一个实施方案中，本发明提供了一种食物助剂，其含有一种生物相溶性组合物，设计用于帮助消化作用的试剂的释放，其中所述生物相溶性组合物是设计为口服消费，并且在生物的消化道(例如砂囊)中释放。“生物相溶性”是指一旦与宿主生物(例如，鸟)接触，不会引发足以导致该物质被排斥或者使该物质不能发挥作用的有害反应的物质。例如，这样的不起作用的情况可以通过在该物质的周围形成纤维质结构限制浸渍的试剂在宿主生物中的扩散，或者通过形成一种物质因为毒性或者感染导致该生物中的致死率和致病率上升。生物相溶性物质可以是非生物可降解的或者是生物可降解的。在一个实施方案中，生物相溶性组合物对于胃肠道的降解或消化具有抗性。在另一个实施方案中，生物相溶性组合物具有石块或石头的坚固性。
本发明可用的一种非生物可降解的材料是可以允许附着或者浸渍食物试剂的材料。例如，这种非生物可降解的材料包括热塑性塑料，例如丙烯酸，改良丙烯酸，聚酰胺，聚碳酸酯，聚酯，聚乙烯，聚丙烯，聚苯乙烯，聚砜，聚醚砜和聚偏1，1-二氟乙烯。弹性体也是有用的材料，例如，包括聚酰胺，聚酯，聚乙烯，聚丙烯，聚苯乙烯，聚氨酯，聚乙烯醇和硅氧烷(例如，硅氧烷基或者含有硅氧烷的二氧化硅)。本发明提供了生物相溶性组合物可以包含多种这样的材料，例如，其可以被掺合或者层覆形成掺合物，共聚物或者其组合。
在此所用，“可生物降解的”材料是指这种组合物可以在体内消蚀或者降解形成较小的化学物质。例如，降解可以通过酶、化学或物理过程发生。考虑用于本发明的适当的可生物降解的材料包括聚(交酯)，聚(乙醇酸交酯)，聚(乳酸)，聚(乙二醇酸)，聚酐，聚原酸酯，聚醚酯，聚己酸内酯，聚酰胺酯，聚碳酸酯，聚氰基丙烯酸酯，聚氨酯，聚丙烯酸酯。这种材料可以被掺合或者层覆形成掺合物，共聚物或者其组合。
考虑到不同数量的生物相溶性物质可以被摄取，或者换句话说，同时提供给相同生物体，或者以各种组合的形式(例如，一种物质在其它物质之前)。另外，生物相溶性物质可以被设计为缓慢通过消化道。例如，大的或者脂肪物质趋于更缓慢地通过消化道，因此，可以使用具有较大尺寸从而阻止了其快速通过消化道的生物相溶性物质。这样的大物质可以是非生物降解物质和生物降解物质的组合。例如，小的非生物降解物质可以被生物降解物质包裹，这样在一段时间内，生物降解部分将被降解，从而使非生物降解部分通过消化道。并且，已经公认可以将任何数目的作料提供给这种生物相溶性物质，以帮助消费。
可以将多种试剂单独或者组合其它试剂涂敷到这种生物相溶性物质上，例如，包括多肽(例如，酶、抗体、细胞因子或者治疗用小分子)和抗生素。特别有用的试剂的实例列于下边的表1和2。也可以考虑到可以将细胞包入本发明所述的生物相溶性物质中将其用于传送酶和治疗剂。例如，可以设计有孔物质，其中具有的孔大到足以使细胞在其中生长以及通过，这些多孔物质然后可以被摄取进入消化道。例如，生物相溶性物质可以包括多种微生物环境(例如，不同孔隙率，pH等)，其提供了对多种细胞类型的支持。细胞可以被进行遗传工程，给生物体传送特定药物、酶或者化学药品。细胞可以是真核的或原核的。
表1
  处理类型 化学药品 描述
  抗生素 羟氨苄青霉素及其组合物Mastox注射液(羟氨苄青霉素和5-甲基-3-邻氯苯基-4-异恶唑青霉素) 对由革兰氏阳性和阴性细菌引起的细菌性疾病进行治疗
氨苄青霉素及其组合物Biolox注射液(氨苄青霉素和5-甲基-3-邻氯苯基-4-异恶唑青霉素) 对由革兰氏阳性和阴性细菌引起的细菌性疾病进行处理
硝基糖腙+尿素Nefrea丸剂 生殖感染的治疗
三甲氧苄二氨嘧啶+磺胺甲基异恶唑Trizol丸剂 呼吸道感染、胃肠道感染、泌尿生殖器感染的治疗
甲硝基羟乙唑和呋喃唑酮Metofur丸剂 细菌性疾病和原虫病的治疗
邻苯二甲酰基磺胺噻唑、果胶和高岭土果胶pectolin大丸剂悬浮液 细菌性和非特异性腹泻、杆菌性痢疾和小牛腹泻的治疗
  驱虫药(Antihelmintics) 外寄生虫杀虫剂Germex Ointment(γ苯六氯化合物、磺酸原黄素半硫酸盐和溴棕三甲铵) 外寄生虫杀虫剂和抗菌剂
外寄生虫杀虫剂＞Albendazole及其组合物Alben(Albendazole)悬浮液(Albendazole 2.5％)增强悬浮液(Albendazole 5％)Forte丸剂(Albendazole1.5Gm)片剂(Albendazole 600Mg.)粉剂(Albendazole 5％，15％) 预防及治疗蛔虫、绦虫和吸虫感染
Alpraz(Albendazole和Praziquante)片剂 用于犬科动物和猫科动物中预防及治疗蛔虫和绦虫感染
Oxyclozanide及其组合物Clozan(Oxyclozanide)丸剂、悬浮液 预防及治疗吸虫感染
Tetzan(Oxyclozanide和四咪唑Hcl)丸剂、悬浮液 预防及治疗蛔虫和吸虫感染
Fluzan(Oxyclozanide和盐酸左旋咪唑)丸剂、悬浮液 预防及治疗蛔虫感染并增强免疫力
左旋咪唑Nemasol注射液Wormnil粉剂 预防及治疗蛔虫感染并增强免疫力
FenbendazoleFenzole片剂(Fenbendazole 150Mg.)丸剂(Fenbendazole 1.50Gm.)粉剂(Fenbendazole 2.5％W/W) 预防及治疗蛔虫和绦虫感染
滋补剂 复合维生素B，氨基酸和动物肝提取物Heptogen注射液 治疗厌食、肝炎、虚弱、神经痉挛、消瘦和生长障碍
含维生素B12和维生素D3的乙酰丙酸钙Hylactin注射液 预防和治疗缺血性贫血，疾病状态的支持性治疗(尤其是低体温)和软骨病的早期治疗
动物饲料补充剂  必需矿物质，硒和维生素EGynolactin丸剂 在乳品动物和马中引起不育和重复杂交的不动情期治疗
 必需矿物质，维生素E，和碘Hylactin粉剂 不育、不适当的哺乳、降低的免疫力、生长障碍和衰弱
 含有维生素C的必需电解质Electra-C粉剂 腹泻、脱水，在运输之前和之后，在极端温度下(高或低)，和其它逆境条件下
 Pyrenox Plus(DiclofenacSodium+扑热息痛)丸剂注射 乳腺炎的治疗，外科疼痛和炎症后的发热，子宫下垂，跛和关节炎
表2
治疗配方
产品 描述
Acutrim(苯丙醇胺) 每日一次，食欲抑制片剂
BaxterInfusor 用于抗凝血剂、抗生素、化学治疗试剂和其它广泛使用的药物的控制性静脉传送
Catapres-TTS(氯压定经皮治疗系统) 每周一次，用于治疗高血压的经皮系统
Covera HSTM(戊脉安氢氯化物) 每日一次，用于治疗高血压和心绞痛的发作控制缓释(COER-24)片剂
DynaCirc CR(isradipine) 每日一次，用于治疗高血压的缓释片剂
Efidac 24(氯苯吡胺马来酸酯) 每日一次，用于缓解过敏综合症的缓释片剂
Estraderm(雌二醇经皮系统) 一周两次，用于治疗某些绝经后综合症和预防骨质疏松症的经皮系统
Glucotrol XL(glipizide) 每日一次，用作食物助剂的缓释片剂，用于控制非胰岛素依赖型糖尿病病人的高血糖症
IVOMEC SR丸剂(双氢除虫菌素) 瘤胃传送系统，用于控制牛类中主要的内外寄生虫，有效期长达一个季节
Minipress XL(prazosin) 每日一次，用于治疗高血压的缓释片剂
NicoDermCQTM(尼古丁经皮系统) 经皮系统，每日一次用于戒烟的辅助手段，以便减轻尼古丁戒除综合症
Procardia XL(硝苯吡啶) 每日一次，用于治疗心绞痛和高血压的片剂
Sudafed24小时(假麻黄 每日一次的鼻解充血药，用于减轻感冒、鼻窦炎、干
碱) 草热和其它呼吸系统过敏症
Transderm-Nitro(硝化甘油经皮系统) 每日一次的经皮系统，用于预防由于冠状动脉疾病引起的心绞痛
Transderm Scorp(东莨菪碱经皮系统) 用于预防与运动疾病有关的恶心和呕吐的经皮系统
Volmax(albuterol) 用于缓解可逆的阻塞性气道疾病病人的支气管痉挛的缓释片剂
Actisite (盐酸四环素)牙周纤维，用作助剂来剥落和植根以减少囊深以及在探查患有成人牙周炎病人时的出血
ALZET 用于实验室研究的渗透泵
Amphotec(用于注射的两性霉素B胆甾醇硫酸酯复合物) AMPHOTEC是一种真菌杀菌剂治疗方法，用于病人中侵染性曲霉病，使用对象为当肾脏受损或不可接受的毒性阻止了以有效剂量使用两性霉素B时，和患有侵染性曲霉病的病人中先前的两性霉素B治疗已经失败。
BiCitra(柠檬酸钠和柠檬酸) 碱化试剂，在期望长期维持碱性尿的情况下使用
Ditropan(oxybutyninchloride) 用于缓解膀胱不稳定性的症状，这些症状是与非抑制性的神经原性或反射神经原性膀胱相联系(即尿急、尿频、遗尿、急性失禁、排尿困难)。
DitropanXL(oxybutyninchloride) 是一种每日一次的控制性释放片剂，适用于治疗过度活性膀胱，具有急性遗尿失禁、尿急和尿频的症状。
DOXIL(盐酸阿霉素脂质体注射液)
Duragesic(芬太奴经皮系统)CII 72小时的经皮系统，用于控制病人的慢性疼痛，这些病人需要连续使用阿片样物质止疼剂，这种疼痛不能被较弱的物质所控制，例如醋氨酚-阿片样物质组合物、非甾族止疼剂或具有短期作用的阿片样物质的PRN剂量
Elmiron(戊聚糖多硫酸钠) 适用于缓解膀胱疼痛或与间质膀胱炎相关的不适症状
ENACT AirWatchTM 一种哮喘监控和控制系统
Ethyol(amifostine) 适用于降低与顺式铂氨在病人中的重复用药相关的累积的肾脏毒性，病人具有晚期卵巢癌或非小细胞肺癌。
适用于降低经受了手术后对头颈部癌症进行了化疗的病人中中度到重度口腔干燥的发生率，其中放射性治疗的引入口包括腮腺的实质部分。
MycelexTroche(克霉唑) 用于口咽念珠菌病的局部治疗。也适用于预防减少口咽念珠菌病在病人中的发病率，这些病人指发生了免疫损害情况下的病人，这些情况包括在治疗白血病、实体瘤或肾脏移植中所用的化疗、放疗或类固醇治疗。
Neutra-Phos(磷酸钾和磷酸钠) 一种膳食/营养补充剂
PolyCitra-K Oral Solution和PolyCitra-K Crystals(柠檬酸钾和柠檬酸) 碱性剂，用于期望长期维持碱性尿的情况中，例如具有尿酸和泌尿道的胱氨酸结石的病人，尤其当不期望或禁忌使用钠盐时。
PolyCitra-K Syrup和LC(三柠檬酸) 碱性剂，用于期望长期维持碱性尿的情况中，例如具有尿酸和泌尿道的胱氨酸结石的病人。
Progestasert(孕酮) 子宫内孕酮避孕系统
TestodermTestodermwithAdhesive和TestodermTTS CIII 睾丸激素经皮系统Testoderm产品，是用于雄性中替代疗法，治疗与内源睾丸激素不足或缺乏有关的情况：(1)原发性性腺机能减退(先天的或后天的)或(2)促性腺激素分泌不足的性腺机能减退(先天的或后天的)
ViadurTM(leuprolideacetate移植物) 每年一次，用于前列腺癌症的缓解治疗。
某些试剂可以被设计为在一定条件下变成活性的或者失活的(例如，在一定的pH值下，在存在一种激活剂下，等等)。并且，在本发明的组合物中使用酶原是有益的(例如，一种存在于消化道的唾液蛋白酶，或者可以人为地引入生物消化道的唾液蛋白酶)。考虑到被本发明所述生物相溶性组合物所传送的试剂可以通过添加一种可以被摄取或者换句话说是可以被传送给该生物体的激活剂激活或者失活。另外一个控制消化道中试剂的机制是环境敏感试剂，其可以在消化道的适当部位被激活。例如，一种试剂可以在较低的pH值处失活，而在中性pH值处显示活性。相应地，这种试剂将在胃中为失活状态，但是在肠道中为活性状态。替代性地，该试剂可以响应于微生物专一性因子的存在而变成为活性形式(例如，存在于消化道中的微生物)。
总之，本发明的潜在益处包括，例如，(1)减少或者可能去除对动物(包括鱼)从日常饲料或谷物中获取矿物质添加(例如，无机磷的补充)，酶，或治疗药物的需要，从而增加饲料中的热量和营养物质的量，和(2)增进家畜或非家畜动物的健康和生长，包括，例如，家禽、猪、牛、马、犬和猫科的动物。
多种酶可以用于本发明所述的方法和组合物中。这些酶包括适当消化或适当代谢所消费的食物的必要的酶，化合物激活或者衍生，通过消化道传送给该动物的前体药物或者其它试剂或者化合物。可以交付或者掺入本发明所述组合物中的酶的实例包括，例如，饲料增强酶，选自α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶，尤其是乳糖酶、肌醇六磷酸酶，β-葡聚糖酶，尤其是内切-β-1，4-葡聚糖酶和内切-β-1，3(4)-葡聚糖酶、纤维素酶、木糖苷酶、半乳聚糖酶，尤其是阿拉伯半乳聚糖内切-1，4-β-半乳糖苷酶和阿拉伯半乳聚糖内切-1，3-β-半乳糖苷酶、内切葡聚糖酶，尤其是内切-1，2-β-葡聚糖酶、内切-1，3-α-葡聚糖酶和内切-1，3-β-葡聚糖酶，果胶降解酶，尤其是果胶酶、果胶酯酶、果胶裂解酶、多聚半乳糖醛酸酶、arabinanase、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖酶、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖乙酰酯酶、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖-α-鼠李糖苷酶、果胶酸裂解酶和α-galacturonisidase、甘露聚糖酶、β-甘露糖苷酶、甘露聚糖乙酰酯酶、木聚糖乙酰酯酶、蛋白水解酶、木聚糖酶、阿拉伯木聚糖酶和脂解酶如脂酶、磷脂酶和角质酶。SEQ ID NO：1和2和表3中所示的肌醇六磷酸酶是优选的。正如此处所描述的，表3中描述的序列是此处描述的具有氨基酸取代和核苷酸取代的SEQ ID NO：1和2。
表3
名称 来源 氨基酸序列 核苷酸序列
大肠杆菌B(参考) 大肠杆菌 S10；P26；D176；M298；A299；G312；I428
868PH1 Bison大肠杆菌 I428T
872PH1 袋鼠(Kangaroorat)大肠杆菌 D176G；G312S；M298K；A299T GAC(176)GGC；GGT(312)AGT；ATG(298)AAG；GCA(299)ACA；
875PH2 大肠杆菌W A160S；D176G；M298K；A299T；M298K；A299T GCG(160)TCG；GAC(176)GGC；ATG(298)AAG；GCA(299)ACA；
873PH1 小牛大肠杆菌 I428R
大肠杆菌B 大肠杆菌B K298M；T299A AAG(298)ATG；ACA(299)GCA；
K12 appA 大肠杆菌K12 M298K；A299T ATG(298)AAG；GCA(299)ACA；
本发明中所用酶可以被修饰以便提高它们的活性、传送、激活和降解。这种修饰可以在体内或者体外进行，并且使用本技术领域一般公知的方法和工艺，正如下面所详细描述的那样。这种方法一般使用多核苷酸或者多肽序列，它们或者是用自动合成仪合成或者是用重组DNA技术进行克隆、表达或者操作的。
在一个优选实施方案中，用于本发明所述组合物(例如，一种食物助剂)中的酶是肌醇六磷酸酶，其是热稳定的，并且具有抗热性，催化肌醇六磷酸的酶解水解，也就是，该酶可以在经历短暂的(即，5～30秒)，或者较长的，例如，几分钟到几小时，暴露于高于50℃的温度中之后，能够再次复性，再次获得活性。
“饲料”和“食物”，分别地，是指任何自然或者人工的饮食、膳食或者类似物或者这些膳食的成分，打算或者适合于被动物和人类分别食用、摄取、消化。“食物助剂”在此用于表示，例如，其中含有给动物或者生物提供治疗或者消化试剂的含组合物试剂。“食物助剂”一般不是生物热量吸收的来源，换句话说，食物助剂一般不是生物的能量来源，而是一种组合物，其随着一般意义的“饲料”或者“食物”被摄取。
一种试剂或者酶(例如，肌醇六磷酸酶)在体外或者体内发挥其作用，即，在被吸收前或者分别地在生物的胃或者砂囊中。联合作用也是可能的。
虽然任何酶可以被掺入食物助剂，但是在此使用肌醇六磷酸酶作为本发明所述的方法和组合物的例示性参考例证。本发明所述的食物助剂包括酶(例如，肌醇六磷酸酶)。一般而言，含食物助剂肌醇六磷酸酶的组合物是液体或者干燥态。
液体组合物不需要含有任何除了该酶以外的任何物质(例如，肌醇六磷酸酶)，优选地，以高度纯化形式。但是，通常也加入稳定剂，例如甘油、山梨糖醇或者单丙二醇。液体组合物也可包括其它添加剂，例如，盐、糖、防腐剂、pH值调节剂、蛋白质、肌醇六磷酸(肌醇六磷酸酶的底物)。一般的液体组合物是含水或油基浆状物。液体组合物可被加入生物相溶性组合物中，以便缓慢释放。优选地，将酶加入食物助剂组合物中，其是生物相溶性物质(例如，生物可降解或非生物可降解的)，并且包括将重组细胞加入，例如，多孔微珠中。
干组合物可以是喷雾干燥组合物，在这种情况下，该组合物不需要含有除了酶之外的任何干燥型物质。然而，通常干组合物是所谓的颗粒化的，其可以容易地与食物或饲料成分混合，或更优选地形成一种预混合物的成分。酶颗粒的颗粒大小优选地是与该混合物中的其它成分相容。这提供了一种将酶掺入动物饲料中的安全且便利的方法。优选地颗粒是生物相溶性的，更优选地这些生物相溶性的颗粒是非生物降解的。
可以用凝聚技术在高剪切力混合机中制备被酶包被的凝聚颗粒。吸附性颗粒可以通过将载体材料的包核体吸附/或者被酶涂敷而制备。优选地载体材料是生物相溶性非生物降解物质，其模拟了动物砂囊中石头或砂砾的作用。用于凝聚技术的一般填充剂材料包括盐，如硫酸二钠。其它填充剂是高岭土、滑石粉、硅酸铝镁和纤维素纤维。任选地，粘合剂如糊精也包括在凝聚颗粒中。载体物质可以是包括生物可降解和非生物可降解的任何生物相溶性物质(例如，石块、石头、陶瓷、各种聚合物)。任选地，用涂敷混合物涂敷颗粒。这样的混合物包括涂层剂，优选地是疏水涂层剂，如氢化棕榈油和牛脂，并且如果期望有其它添加剂，如碳酸钙或高岭土。
更进一步而言，食物助剂组合物(例如肌醇六磷酸镁食物助剂组合物)可以含有其它组成成分，如着色剂、香味化合物、稳定剂、维生素、矿物质、其它饲料或食物增强酶等。一般的添加剂通常包括一种或多种化合物如维生素、矿物质或饲料增强酶和合适的载体和/或赋形剂。
在一个实施方案中，本发明的食物助剂组合物进一步包括有效量的一种或多种饲料增强酶，特别是选自如下的饲料增强酶：α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶，尤其是乳糖酶、其它肌醇六磷酸酶，β-葡聚糖酶，尤其是内切-β-1，4-葡聚糖酶和内切-β-1，3(4)-葡聚糖酶、纤维素酶、木糖苷酶、半乳聚糖酶，尤其是阿拉伯半乳聚糖内切-1，4-β-半乳糖苷酶和阿拉伯半乳聚糖内切-1，3-β-半乳糖苷酶、内切葡聚糖酶，尤其是内切-1，2-β-葡聚糖酶、内切-1，3-α-葡聚糖酶和内切-1，3-β-葡聚糖酶，果胶降解酶，尤其是果胶酶、果胶酯酶、果胶裂解酶、多聚半乳糖醛酸酶、arabinanase、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖酶、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖乙酰酯酶、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖-α-鼠李糖苷酶、果胶酸裂解酶和α-galacturonisidase、甘露聚糖酶、β-甘露糖苷酶、甘露聚糖乙酰酯酶、木聚糖乙酰酯酶、蛋白水解酶、木聚糖酶、阿拉伯木聚糖酶和脂解酶如脂酶、磷脂酶和角质酶。
本发明的动物食物助剂补充给单胃动物，早于或与食物同时供给。在一个实施方案中，本发明的食物助剂补充给单胃动物，与食物同时供给。在另一个实施方案中，将食物助剂以颗粒状或稳定的液态形式加入到食物中。
本发明的食物助剂中的有效量的酶是每一千克食物助剂中大约10～20,000；优选地是大约10～15,000；更优选地是大约10～10,000，特别是大约100～5,000，尤其是大约100～大约2,000FYT。
本发明的肌醇六磷酸酶的其它特定用途的实例是在酱油加工中，和肌醇或其衍生物的制造中。
本发明也涉及一种用于降低动物肥料中肌醇六磷酸水平的方法，其中给动物喂养一种含有本发明的有效量的肌醇六磷酸酶的食物助剂。正如在本申请开头申明的，其一个重要效果是降低磷酸的环境污染。
在另一个实施方案中，食物助剂是磁性载体。例如，含有一种酶(例如肌醇六磷酸酶)的磁性载体，该酶分别于其中、其上或贯穿于载体(例如多孔磁珠)中，该磁性载体可以被分布在一个含有肌醇六磷酸较高的区域中，一段时间后用磁铁收集磁珠。这种分布和珠子的再收集降低了进一步的污染，并且允许对珠子进行再利用。而且，这种磁珠的体内利用允许将食物助剂定位在消化道的某一点上，例如，肌醇六磷酸酶活性可以发挥的地方。例如，本发明的含有消化酶(例如，肌醇六磷酸酶)的食物助剂可以被定位到动物的砂囊中，通过在动物消费了磁性载体的食物助剂之后，将一个磁铁并置于靠近动物砂囊的地方而实现。一段时间之后可以移去磁铁，使食物助剂通过消化道排泄出。而且，在宰杀之后，磁性载体适合于从生物体中去除或者辅助收集。
当食物助剂使多孔颗粒时，这种颗粒一般用一种物质浸渍，凭借这种物质期望缓慢释放以形成一种缓慢释放颗粒。不仅可以通过用期望释放的物质浸渍多孔颗粒，而且可以通过首先将期望物质溶解在第一种分散相中来制备这样的缓慢释放颗粒。在这种情况下，用这种方法制备大的缓慢释放颗粒也在本发明的范围和精神之内，其中在所述方法中被释放的物质首先被溶解在第一种分散相中。多孔中空颗粒可以，例如被缓慢释放物质如药物、农药或酶浸渍。特别是，当被酶浸渍的多孔中空颗粒是由生物可降解聚合物构成时，这些颗粒本身可以被用作农药或肥料，并且它们对环境没有不利影响。在一个实施方案中，多孔颗粒是有磁性的。
多孔中空颗粒可以被用作生物反应器的支持物，特别是酶载体。因此，用缓慢释放方法制备食物助剂是有优点的，例如通过将酶制剂包入微胶囊中，如脂质体，药物是在一个长达几天的时间区段内从微胶囊中释放出来，优选大约3～20天。可选择地，试剂(例如，一种酶)可以被配成制剂，以便于缓慢释放，如掺入一种缓慢释放聚合物中，试剂(例如酶)的剂量可以在一个长达几天的时间区段内释放出来，例如从2～30天，并且可以直达动物的整个生命期。
正如本领域已知的，脂质体通常衍生于磷脂或其它脂类物质。脂质体可以用单层或多层水合液晶来形成，这些水合液晶分散在含水介质中。可以使用任何能够形成脂质体的无毒的、生理上可接受的和可代谢的脂类。脂质体形式的本发明的组合物可以含有稳定剂、防腐剂、赋形剂和加入到该试剂中的等等物质。优选的脂质体是天然和合成的磷脂和磷脂酰胆碱(卵磷脂)。形成脂质体的方法在本领域是已知的。例如参考Prescott，Ed.Methods in Cell Biology，第XIV卷，AcademicPress，New York，N.Y.(1976)，第33页以及下列等等。
在制备食品或饲料制剂或添加剂中使用本发明的肌醇六磷酸酶也在本发明的范围内，即肌醇六磷酸酶仅在制造过程中发挥其肌醇六磷酸酶活性，在最终食品或饲料产品中是无活性的。例如，这一方面在面团的加工和烘焙中有关。另外，肌醇六磷酸酶或表达肌醇六磷酸酶的重组酵母可以被浸渍于磁性载体之中、之上或贯穿于之中，分布于面团或食品介质之中，并且可以通过磁铁收回。
可以将本发明的食物助剂生物相溶性(例如，生物可降解或非生物可降解)载体中单独用于动物或组合其它消化添加剂应用于动物。本发明所述的食物助剂可以被用作顶敷料，或者将它们直接混合到动物饲料中或与饲料分开提供，通过分开的口服剂，通过注射或者通过经皮方式或者与其它生长相关可食化合物组合使用，组合物中的每种这样的化合物的比例取决于特定生物或者要解决的问题和期望的响应程度。应该理解的是在任何给定的情况下使用的特定食物剂量将根据下述因素调整：所使用的特定的化合物，所要处理的问题，主体的条件和其它相关的事实，它们可以改变有效成分的活性或者主体的反应，正如本领域的技术人员所熟知的那样。一般地，正如本技术领域的技术人员所熟知的那样，可以使用单一的日剂量或者分开的日剂量。
如果使用时是与动物的饲料分开，那么食物助剂的形式可以通过将它们与非毒性的药物学上可以接受的可食的载体组合而制备，以便制备立即释放或者缓慢释放的制剂，这一点也是本领域已知的。这种可食的载体可以是固体或者液体，例如，举例而言，玉米淀粉、乳糖、蔗糖、大豆片、花生油、橄榄油、芝麻油和丙二醇。如果使用了固体载体，那么该化合物的剂量形式可以是片剂、胶囊、粉剂、锭剂或者糖锭或者顶敷料作为微分散形式。如果使用了液体载体，那么软凝胶胶囊、或者糖浆或者液体悬浮液、乳状液或者溶液可以是剂量形式。剂量形式也可以包括辅助剂，例如防腐、稳定、湿润或者乳化剂，溶液促进剂，等等。它们也可以含有其它具有治疗价值的物质。
所以，本发明的显著优点在于，例如，1)易于荷载活性成分的生物相溶性组合物；2)有关聚合物的种类和/或可以使用的活性成分具有普遍性；3)较高的产量和较高的荷载效率；4)提供了持续释放制剂，其可以在体内释放活性的、完整的活性试剂，从而提供了在延长的一段时间内一种活性试剂的控制型释放。并且，另外一个优点在于可以使试剂在生物的消化道内(例如，砂囊)局部释放。在这里所用的短语“其中含有”是指一种将试剂配入组合物中的方法，将其用于该试剂在延长的一段时间里的控制型释放。
在本发明的组合物的持续释放或者缓慢释放中，使用了一种试剂的有效量(例如，酶或者抗生素)。在这里所用，持续释放或者缓慢释放是指一种试剂在一段延长的时间内从生物相溶性材料中的逐渐释放。持续释放可以是连续的或是不连续的，线性的或者非线性的，并且，这一点可以通过使用一种或者多种生物可降解或者非生物可降解组合物、药物填料、赋形剂的选择、或者其它修饰。但是，已经认识到提供一种“快速”释放组合物也是需要的，一旦被生物消费，这种组合物提供了迅速的释放。也应该理解到通过“释放”并不必定意味着这种试剂是从生物相溶性载体中释放出来。而在一个实施方案中，缓慢释放包括存在于所述生物相溶性组合物中的试剂的缓慢激活或者持续激活。例如，肌醇六磷酸不必从生物相溶性组合物中释放出来才是有效的。在这个实施方案中，肌醇六磷酸酶是固定在这种生物相溶性组合物上。
动物饲料可以是任何含有蛋白质的有机膳食，通常用于满足动物的食物需要。这些含有蛋白质的膳食中的许多一般是主要包括玉米、大豆粗粉或者玉米/大豆粗粉混合物。例如，一般的商业通路可以得到的用来饲喂家禽的产品包括Egg MakerComplete，这是一种由Land O’Lakes AG Services提供的家禽饲料产品；以及Country Game & Turkey Grower，这是一种Agwa，Inc.公司提供的产品。(也可以参考由Phillip Minnaar和Maria Minnaar所著的The Emu Farmer’s Handbook)。这两种商业通路可以获得的产品是动物饲料的典型实例，本发明中的食物助剂和/或这种酶即肌醇六磷酸酶可以被掺入以便减少或者消除在这种组合物中需要加入的磷、锌、锰和铁的补充量。
本发明可用于无数动物的食物，在此定义，其包括哺乳动物(包括人)，禽类和鱼类。特别地，该食物可以被用于具有商业意义的哺乳动物，例如猪、牛、绵羊、山羊、实验室里的啮齿动物(大鼠、小鼠、豚鼠和沙鼠)、被毛动物如貂和狐狸、和动物园动物例如猴子和猿，以及家养动物例如猫和狗。典型的具有商业价值的鸟类种类包括鸡、火鸡、鸭子、鹅、雉、鸸鹋、鸵鸟、潜鸟、几维、鸽子、鹦鹉、澳洲鹦鹉、美冠鹦鹉、金丝雀、企鹅、火烈鸟和鹑。商业上饲养的鱼类诸如鲑鱼也将可以从此处公开的食物助剂中获得益处。能获得益处的其它鱼类包括，例如，鱼(特别是在鱼缸或者水产养殖环境中，例如热带鱼)、金鱼或者其它观赏鲤鱼、鲶鱼、鲑鱼、大麻哈鱼、鲨鱼、鳐、比目鱼、鲽鱼、罗非鱼、鳉、虹鳉、帆鳍鲈、新月鱼、swordtail、斑马鱼和泥鳅。
除非有相反的申明，转化是以Sambrook，Fritsch和Maniatus，1989所述的方法的描述而进行。下述实施例是用于说明本发明，而不是限制本发明。实施例中所述的方法是可以用于实施本发明一定方面的方法中的代表，其它本领域技术人员所知的方法也可以被使用。
                             实施例1
                     分离、细菌表达和纯化肌醇六磷酸酶
大肠杆菌B的基因组DNA是从Sigma(Catalog #D-2001)，St.Louis，New Jersey获得的。
下述引物用于PCR扩增直接来自基因组DNA的该基因。
5’引物
gtttctgaattcaaggaggaatttaaATGAAAGCGATCTTAATCCCATT(SEQ ID NO：3)；和
3’引物
gtttctggatcc TTACAAACTGCACGCCGGTAT(SEQ ID NO：4)；
用于PCR反应的Pfu聚合酶，以及扩增是根据生产商提供的方法进行(Stratagene Cloning Systems，Inc.，La Jolla，CA)。
PCR产品被纯化，将纯化产品和pQE60载体(Qiagen)都用EcoR I和Bgl II限制内切酶(New England Biolabs)根据生产商提供的方法消化。使用标准方法进行过夜连接产生pQE60。
将扩增序列与编码RBS的序列插入阅读框。然后用连接混合物通过电穿孔来转化大肠杆菌菌株M15/pEP4(Qiagen，Inc.)。M15/pEP4含有质粒pEP4的多个拷贝，其表达lacI阻遏物并且也具有卡拉霉素抗性(Kanr)。质粒DNA进行分离，并且用限制酶切分析来确认。将含有期望构建体的克隆在LB培养基中进行液体过夜培养(O/N)，其中LB培养基同时补充了Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)。用O/N培养物作为接种物，以1∶100～1∶250的比率接种到大的培养基中。将细胞生长到600纳米的波长(O.D.600)的光学密度在0.4～0.6之间。然后将IPTG(“异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷”)加入培养物中，使最终浓度达到1mM。IPTG通过使lacI阻遏子失活进行诱导，清除P/O导致基因表达增加。将细胞再培养3～4小时。然后通过离心方法收获细胞。
通过上述的杂交技术，上述列出的引物序列也可以被用于从沉淀物质中分离靶基因。
参考上边的教导，本发明的无数修饰和改变是可能的，因此也百所附权利要求的范围之内，本发明可以用与这些详细描述不同的方式进行实施。应该理解到，虽然已经参考上边的详细描述对本发明进行了描述，但上述描述意在说明，而不是限定本发明的范围。本发明的其它方面、优点和修饰也在下述权利要求范围之内。将所有的出版物、专利申请、专利和其它本文提及的参考资料完整引用于此作为参考。
本发明也提供了分离和使用肌醇六磷酸酶分子(核酸及其编码的肌醇六磷酸酶)的方法，其中肌醇六磷酸酶分子来自大肠杆菌(毒性或非毒性的，包括K12、W、C)的所有其它菌株，以及所有细菌。这些包括所有属于下述的种类和菌株：
Thermotogale
绿非硫细菌
蓝细菌&叶绿体
低G+C含量的革兰氏阳性细菌
梭细菌
高G+C含量的革兰氏阳性细菌
嗜纤维菌属/屈挠细菌/类菌体组
成纤维细菌
Spriochaete
浮霉状菌属/衣原体组
紫色细菌(蛋白细菌)，包括下述亚门：
δ&ε，包括：
乙酸氧化脱硫单胞菌
可变脱硫八叠球菌
斯托氏蛭弧菌
侵蚀侏囊菌
橙色标桩菌
黄色粘球菌
脱硫脱硫弧菌
卵硫菌种
空肠弯曲杆菌空肠亚种
产琥珀酸沃林氏菌
幽门螺旋杆菌
α，包括：
Methylobacterium extorquens
印度拜叶林克氏菌
普通生丝微菌
万尼氏红微菌
根癌农杆菌
流产布鲁氏菌
文氏巴尔通氏体
海红菌亚种Agilis
Zea mays-mitochondrion
立氏立克次氏体
里氏埃里希氏体
尖音库蚊沃尔巴克氏体
边缘无形体
长赤细菌
需盐红螺菌
荚膜红细菌
生脂固氮螺菌
γ，包括：
沙氏外硫红螺菌
酒色着色菌
甲烷甲基单胞菌成都变种
人心杆菌
Xanthomonas maltophilia
伯氏考克斯氏体
嗜肺军团菌嗜肺亚种
线形海洋螺菌
乙酸钙不动杆菌
绿脓杆菌
流感杆菌
副溶血弧菌
普通变形菌
胡萝卜软腐欧文氏菌
大肠杆菌，包括：
β，包括：
啮嗜艾肯氏菌
淋病奈瑟氏球菌
粪透明颤菌
紫色色杆菌
粪产碱菌
胶状红长命菌
睾丸酮丝毛单胞菌
欧洲亚硝化单胞菌
迂回螺菌
可以用已知的方法从这些细菌分离这样的肌醇六磷酸酶分子，这些方法包括文库筛选方法，例如表达筛选，杂交方法，PCR(如参考Sammbrook，1989)。
                          实施例1
                          耐热性试验
将来自大肠杆菌(菌株K12)的野生型appA和称作819PH59的诱变形式(SEQID NO：9和10)在大肠杆菌中进行表达，并且纯化到同质性。在耐热性试验中，将100μL的溶解在100mM MOPS/pH7.0中的0.01mg/mL的蛋白质加热到表明的温育温度，在RJ研究用热循环仪中保持5分钟。一旦完成了在该温度下保持5分钟，将样品冷却到4℃，并且在冰块上温育。在37℃的温度下，用40μl的溶解在1.5mL的100mM NaOAc/4mM肌醇六磷酸/pH4.5中的该酶溶液进行活性分析。以2分钟的间隔从中取出60μl等量溶液，并将其加入60μl用于TNO分析的显色剂/终止溶液中。显然，含有8个氨基酸变化的被修饰的酶，SEQ ID NO：10，比野生型酶能承受更高的温度。(参见图3)。
                           实施例2
              在模拟消化性条件下肌醇六磷酸酶的稳定性
体外消化的大肠杆菌K12和非糖基化819pH59肌醇六磷酸酶的残余活性百分比(基于初始反应速率)对时间作图。按照所述，制备含有2mg/ml NaCl、6M HCl和3.2mg/mL胃蛋白酶的标准浓度的模拟胃液。溶液的pH值大约是1.4，没有对pH值进行调节。按照1∶4(体积∶体积)比例将肌醇六磷酸酶加入消化溶液，并在37℃的温度下直接温育来开始消化反应，从而进行体外消化性分析。在多个时间间隔里从消化反应混合物中取出等量溶液，用TNO分析法分析残余的肌醇六磷酸酶活性。每一种分析至少进行两次。本数据符合按照y＝Ae-kt方程式的指数曲线。用方程式t1/2＝ln2/k来确定蛋白的半衰期。大肠杆菌K12肌醇六磷酸酶的半衰期仅仅为2.7±0.2分钟，而非糖基化819pH59肌醇六磷酸酶的半衰期为8.4±1.1分钟。因此，野生型大肠杆菌K12肌醇六磷酸酶中的突变增加了模拟体外消化条件下的该酶的稳定性。
参看图4。
                             实施例3
                          表达宿主的比较
将来自819pH59的GSSM DNA构建体插入大肠杆菌、P.pastoris和S.pombe中进行表达。将表达的蛋白纯化至同质性。在耐热试验中，将溶解在100mM MOPS，pH为7.0的0.01mg/mL的蛋白质100μl加热到表明的温育温度，在RJ研究用热循环仪中保持5分钟。一旦完成了在该温度下保持5分钟，将样品冷却到4℃，并且在冰块上温育。在37℃的温度下，用40μl的溶解在1.46mL的100mM NaOAc/4mM肌醇六磷酸/pH4.5中的该酶溶液进行活性分析。以2分钟的间隔从中取出60μl等量溶液，并将其加入60μl用于TNO分析的显色剂/终止溶液中。(参见图5)。
                             实施例4
在不同表达宿主细胞中表达的819pH59肌醇六磷酸酶的体外消化的残余活性百分比(基于初始反应速率)对时间作图。819pH59肌醇六磷酸酶在大肠杆菌(非糖基化)中进行了表达，也在S.pombe和P.pastoris中进行表达(糖基化)。按照S.O.P中的描述，制备含有2mg/ml NaCl、6M HCl和3.2mg/mL胃蛋白酶的标准浓度的模拟胃液。溶液的pH值大约是1.4，没有对pH值进行调节。按照1∶4(体积∶体积)比例将肌醇六磷酸酶加入消化溶液，并在37℃的温度下直接温育来开始消化反应，从而进行体外消化性分析。在多个时间间隔里从消化反应混合物中取出等量溶液，用TNO分析法分析残余的肌醇六磷酸酶活性。每一种分析至少重复三次。本数据符合按照y＝Ae-kt方程式的指数曲线。用方程式t1/2＝ln2/k来确定蛋白的半衰期。表达在大肠杆菌中的非糖基化819pH59肌醇六磷酸酶的半衰期为8.4±1.1分钟，而表达在S.pombe中的糖基化819pH59肌醇六磷酸酶的半衰期为10.4±0.9分钟，表达在P.pastoris中的相同肌醇六磷酸酶的半衰期为29.2±6.7分钟。因此，819pH59肌醇六磷酸酶的糖基化增加了模拟体外消化条件下的该酶的稳定性。(参见图6)。
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(除非另外说明，在本发明中引用的所有参考文献的教导被完整引用于此作为参考。)
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Claims (90)

1.一种提高含有肌醇六磷酸的食品的营养价值的方法，该方法包括：
将所述含有肌醇六磷酸的食品与具有SEQ ID NO：2中的氨基酸序列的基本上纯化的肌醇六磷酸酶接触，以使所述基本上纯化的肌醇六磷酸酶在所述含有肌醇六磷酸的食品中催化无机磷酸从肌醇六磷酸的释放。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述基本上纯化的肌醇六磷酸酶是通过重组表达系统产生的，该系统包括一个具有选自如下核苷酸序列的编码肌醇六磷酸酶的核酸：
a)SEQ ID NO：1，和
b)SEQ ID NO：1，其中T也可以是U；
其中编码肌醇六磷酸酶的核酸的表达导致了所述基本上纯化的肌醇六磷酸酶的产生。
3.如权利要求1所述的方法，其中在所述含有肌醇六磷酸的食品中无机磷酸从肌醇六磷酸的释放发生在所述含有肌醇六磷酸的食品被受体生物体摄取之前。
4.如权利要求1所述的方法，其中在所述含有肌醇六磷酸的食品中无机磷酸从肌醇六磷酸的释放发生在所述含有肌醇六磷酸的食品被受体生物体摄取之后。
5.如权利要求1所述的方法，其中在所述含有肌醇六磷酸的食品中无机磷酸从肌醇六磷酸的释放部分发生在所述含有肌醇六磷酸的食品被受体生物体摄取之前，部分发生在所述含有肌醇六磷酸的食品被受体生物体摄取之后。
6.一种用于权利要求2所述方法中的重组表达系统，其中所述重组表达系统包括在宿主细胞中，并且表达编码肌醇六磷酸酶的核苷酸序列，其中肌醇六磷酸酶具有表示于SEQ ID NO：2中的氨基酸序列，并且其中编码所述酶的核苷酸序列被可操作地连接到所述宿主细胞中的转录控制序列上。
7.一种包括如权利要求6所述表达系统的载体。
8.如权利要求6所述的表达系统，其中所述控制序列包括一个组成型启动子。
9.如权利要求6所述的表达系统，其中所述控制序列包括一个组织特异性启动子。
10.如权利要求6所述的表达系统，其中所述宿主细胞是原核细胞。
11.如权利要求6所述的表达系统，其中所述宿主细胞是真核细胞。
12.如权利要求6所述的表达系统，其中所述宿主细胞是植物细胞。
13.如权利要求6所述的表达系统，其中在所述核苷酸序列之前存在编码可操作地连接到所述核苷酸序列上的信号肽的多核苷酸序列。
14.如权利要求13所述的表达系统，其中所述信号肽是来自烟草的PR蛋白质PR-S信号肽。
15.一种被修饰含有权利要求6所述表达系统的原核细胞。
16.一种被修饰含有权利要求6所述表达系统的真核细胞。
17.一种被修饰含有权利要求6所述表达系统的植物细胞、植物部分或植物。
18.一种产生含有微生物肌醇六磷酸酶的动物饲料的方法，该方法包括：
a)在其中所述核苷酸序列是被表达的条件下培养权利要求17所述的植物细胞、植物部分或植物；和
b)将所述的植物细胞、植物部分或植物转化进适合于动物饲料的组合物中。
19.一种用于动物的饲料组合物，其中包括与含有肌醇六磷酸的食品混合为混合物的权利要求17所述的植物细胞、植物部分或植物。
20.一种处理人类或动物、使其能够从消化性外源性肌醇六磷酸酶活性增强中获得益处的方法，其中该方法包括给所述人类或动物使用一定量的转基因植物的植物种子、植物细胞、植物部分或植物，其中所述转基因植物被修饰含有一种表达编码肌醇六磷酸酶的核苷酸序列的表达系统，其表达量是在所述人类或动物的消化道中提供了肌醇六磷酸酶活性的有效量。
21.一种非人类转基因生物体，其基因组包括一个编码具有肌醇六磷酸酶活性的多肽的异源核酸序列，其中所述转基因导致了肌醇六磷酸酶多肽的表达。
22.一种产生变体的方法，其包括：
获得含有表示于SEQ ID NO：1中的序列、与该序列基本上相同的序列、与该序列互补的序列、含有该序列的至少30个连续核苷酸的片断和包括与SEQ IDNO：1互补的序列中至少30个连续核苷酸的片断的核酸；和
修饰所述序列中的一个或多个核苷酸成为另一个核苷酸，在所述序列中删除一个或多个核苷酸或给所述序列添加一个或多个核苷酸。
23.如权利要求22所述的方法，其中通过选自下述的方法进行修饰：易错PCR、改组、寡核苷酸定向诱变、装配PCR、有性PCR诱变、体内诱变、盒式诱变、递推集团诱变、指数集团诱变、位点特异性诱变、连接重装配、GSSM及其任意组合。
24.如权利要求22所述的方法，其中所述的修饰是通过易错PCR介导的。
25.如权利要求22所述的方法，其中所述的修饰是通过改组介导的。
26.如权利要求22所述的方法，其中所述的修饰是通过寡核苷酸定向诱变介导的。
27.如权利要求22所述的方法，其中所述的修饰是通过装配PCR介导的。
28.如权利要求22所述的方法，其中所述的修饰是通过有性PCR诱变介导的。
29.如权利要求22所述的方法，其中所述的修饰是通过体内诱变介导的。
30.如权利要求22所述的方法，其中所述的修饰是通过盒式诱变介导的。
31.如权利要求22所述的方法，其中所述的修饰是通过递推集团诱变介导的。
32.如权利要求22所述的方法，其中所述的修饰是通过指数集团诱变介导的。
33.如权利要求22所述的方法，其中所述的修饰是通过位点特异性诱变介导的。
34.一种计算机可阅读的媒介物，在其上已经存储了SEQ ID NO：1中所示的核酸序列以及与该序列序列基本上相同的序列，或SEQ ID NO：2中所示的多肽序列，以及与该多肽序列基本上相同的序列。
35.一种包括一个处理器和一个数据存储装置的计算机系统，其中已经在所述数据存储装置上存储了SEQ ID NO：1中所示的核酸序列，以及与该核酸序列基本上相同的序列，或SEQ ID NO：2中所示的多肽序列，以及与该多肽序列基本上相同的序列。
36.如权利要求35所述的计算机系统，该系统进一步包括一个序列比较算法和一个数据存储装置，其中在所述数据存储装置上已经存储了至少一个参考序列。
37.如权利要求36所述的计算机系统，其中所述的序列比较算法包括一个表明了多态性的计算机程序。
38.如权利要求35所述的计算机系统，该系统进一步包括在所述序列中识别特性的标识符。
39.一种将第一种序列与参考序列或序列数据库进行比较的方法，其中所述第一种序列是SEQ ID NO：1中所示的核酸序列，和与该核酸序列基本上相同的序列，或一个SEQ ID NO：2中所示的多肽序列，和与该多肽序列基本上相同的序列，该方法包括：
通过使用比较这些序列的计算机程序来阅读第一种序列和参考序列或序列数据库；和
用计算机程序确定第一种序列和参考序列或序列数据库之间的差别。
40.如权利要求39所述的方法，其中所述的确定第一个序列和参考序列之间的差别包括识别多态性。
41.一种编码肌醇六磷酸酶的分离的多核苷酸，所述肌醇六磷酸酶具有一个SEQ ID NO：8中所示的氨基酸序列，和一个或多个选自W68E、Q84W、A95P、K97C、S168E、R180Y、N226C、Y277D或其任意组合的氨基酸修饰。
42.一种分离的多核苷酸或其寡核苷酸部分，其包括一个与SEQ ID NO：7的核苷酸序列或与其互补的核苷酸序列至少大约10个核苷酸基本上相同的邻接序列，该邻接核苷酸序列包括如下核苷酸变化，其中至少核苷酸390为G；391为A；核苷酸438为T；439为G；440为G；471为C；473为T；477为T；448为G；449为T；690为G；691为A；692为G；729为T；730为A；731为T；864为T；865为G；1017为G或其任意组合。
43.如权利要求41所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸与SEQ ID NO：9中所示序列有90％同源性的核苷酸序列。
44.如权利要求41所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸的多核苷酸序列如SEQ ID NO：9中所示。
45.一种分离的多核苷酸，其包括与SEQ ID NO：7基本上相同的核苷酸序列，并且其中核苷酸390为G；391为A；核苷酸438为T；439为G；440为G；471为C；473为T；477为T；448为G；449为T；690为G；691为A；692为G；729为T；730为A；731为T；864为T；865为G；1017为G或其任意组合。
46.如权利要求45所述的多核苷酸，其包括与SEQ ID NO：7基本上相同的核苷酸序列，并且具有一个选自核苷酸390为G和391为A；核苷酸438为T、439为G和440为G；471为C和473为T；477为T、448为G和449为T；690为G、691为A和692为G；729为T、730为A和731为T；864为T和865为G；1017为G或其任意组合的被修饰的核苷酸序列。
47.一种表达载体，其含有权利要求41、44或46中任一项所述的多核苷酸。
48.如权利要求47所述的载体，其中所述载体是病毒载体。
49.如权利要求47所述的载体，其中所述载体是细菌载体。
50.一种宿主细胞，其含有权利要求47所述的载体。
51.如权利要求50所述的宿主细胞，其中所述细胞是原核细胞。
52.如权利要求51所述的宿主细胞，其中所述细胞是大肠杆菌、P.pastoris或S.pombe。
53.如权利要求50所述的宿主细胞，其中所述细胞是真核细胞。
54.一种基本上纯化的多肽，其具有与SEQ ID NO：8基本上相同的氨基酸序列，并且具有一个或多个选自W68E、Q84W、A95P、K97C、S168E、R180Y、N226C、Y277D或其任意组合的氨基酸修饰，其中所述多肽具有肌醇六磷酸酶活性。
55.如权利要求54的多肽，其中所述多肽活性可以耐受至少60℃的温度。
56.如权利要求54的多肽，其中所述多肽活性可以耐受至少70℃的温度。
57.如权利要求54的多肽，其中所述多肽活性可以耐受至少80℃的温度。
58.如权利要求54的多肽，其中所述多肽在胃液中的半衰期比相应野生型多肽大至少大约2倍。
59.一种基本上纯化的多肽，其具有SEQ ID NO：10中所示的氨基酸序列。
60.一种提高含有肌醇六磷酸的食品的营养价值的方法，所述方法包括：
将含有肌醇六磷酸的食品与基本上纯化的具有如权利要求15所述的多肽的氨基酸序列的肌醇六磷酸酶接触，以使所述基本上纯化的肌醇六磷酸酶在所述含有肌醇六磷酸的食品中催化无机磷酸从肌醇六磷酸的释放。
61.如权利要求60所述的方法，其中所述基本上纯化的肌醇六磷酸酶是通过重组表达系统产生的，该系统含有具有选自如下核苷酸序列的编码肌醇六磷酸的核酸：
a)SEQ ID NO：9；
b)SEQ ID NO：9，其中T也可以是U；
其中编码肌醇六磷酸酶的核酸的表达导致了所述基本上纯化的肌醇六磷酸酶的产生；和
c)SEQ ID NO：7，其中390为G；391为A；核苷酸438为T；439为G；440为G；471为C；473为T；477为T；448为G；449为T；690为G；691为A；692为G；729为T；730为A；731为T；864为T；865为G；1017为G或其任意组合。
62.如权利要求60所述的方法，其中在所述含有肌醇六磷酸的食品中无机磷酸从肌醇六磷酸中的释放发生在所述含有肌醇六磷酸的食品被受体生物体摄取之前。
63.如权利要求60所述的方法，其中在所述含有肌醇六磷酸的食品中无机磷酸从肌醇六磷酸中的释放发生在所述含有肌醇六磷酸的食品被受体生物体摄取之后。
64.如权利要求60所述的方法，其中在所述含有肌醇六磷酸的食品中无机磷酸从肌醇六磷酸中的释放部分发生在所述含有肌醇六磷酸的食品被受体生物体摄取之前，部分发生在所述含有肌醇六磷酸的食品被受体生物体摄取之后。
65.一种用于权利要求61所述的方法中的重组表达系统，其中所述重组表达系统被包括在一个宿主细胞中，并且表达编码具有如SEQ ID NO：9中所示的氨基酸序列的肌醇六磷酸酶的核苷酸序列，并且其中编码所述酶的核苷酸序列被可操作地连接到在所述宿主细胞中可操作的转录控制序列上。
66.一种载体，其包括如权利要求65所述的表达系统。
67.如权利要求65所述的表达系统，其中所述的控制序列包括一个组成型启动子。
68.如权利要求65所述的表达系统，其中所述的控制序列包括一个组织专一性启动子。
69.如权利要求65所述的表达系统，其中所述宿主细胞是原核细胞。
70.如权利要求65所述的表达系统，其中所述宿主细胞是真核细胞。
71.如权利要求65所述的表达系统，其中所述宿主细胞是植物细胞。
72.如权利要求65所述的表达系统，其中在所述核苷酸序列之前有一个编码信号肽的多核苷酸序列，其中信号肽被可操作地连接到所述核苷酸序列上。
73.如权利要求72所述的表达系统，其中所述信号肽是来自烟草的PR蛋白质PR-S信号肽。
74.一种被修饰含有权利要求65所述的表达系统的原核细胞。
75.一种被修饰含有权利要求65所述的表达系统的真核细胞。
76.一种被修饰含有权利要求65所述的表达系统的植物细胞、植物部分或植物。
77.一种产生含有微生物肌醇六磷酸酶的动物饲料的方法，其包括：
a)在所述核苷酸序列被表达的条件下培养权利要求76所述植物细胞、植物部分或植物；和
b)将所述植物细胞、植物部分或植物转化进一种适合于动物饲料的组合物中。
78.一种用于动物的饲料组合物，其包括与含有肌醇六磷酸的食品混合成混合物的权利要求76的植物种子、植物细胞、植物部分或植物。
79.一种产生变体的方法，其包括：
获得一种含有表示于SEQ ID NO：9中的序列，与该序列基本上相同的序列，与该序列互补的序列，含有该序列的至少30个连续的核苷酸的片断，和包括与SEQID NO：9互补的序列的至少30个连续的核苷酸的片断的核酸；和
将所述序列中的一个或多个核苷酸修饰成为另一个核苷酸，在所述序列中删除一个或多个核苷酸，或在所述序列中添加一个或多个核苷酸。
80.如权利要求79所述的方法，其中通过选自下述的方法进行修饰：易错PCR、改组、寡核苷酸定向诱变、装配PCR、有性PCR诱变、体内诱变、盒式诱变、递推集团诱变、指数集团诱变、位点特异性诱变、连接重装配、GSSM及其任意组合。
81.如权利要求79所述的方法，其中所述的修饰是通过易错PCR介导的。
82.如权利要求79所述的方法，其中所述的修饰是通过改组介导的。
83.如权利要求79所述的方法，其中所述的修饰是通过寡核苷酸定向诱变介导的。
84.如权利要求79所述的方法，其中所述的修饰是通过装配PCR介导的。
85.如权利要求79所述的方法，其中所述的修饰是通过有性PCR诱变介导的。
86.如权利要求79所述的方法，其中所述的修饰是通过体内诱变介导的。
87.如权利要求79所述的方法，其中所述的修饰是通过盒式诱变介导的。
88.如权利要求79所述的方法，其中所述的修饰是通过递推集团诱变介导的。
89.如权利要求79所述的方法，其中所述的修饰是通过指数集团诱变介导的。
90.如权利要求79所述的方法，其中所述的修饰是通过位点特异性诱变介导的。
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