CN1585776A

CN1585776A - 肠道细菌的检测和识别

Info

Publication number: CN1585776A
Application number: CNA028223225A
Authority: CN
Inventors: S·奎尔克
Original assignee: Kimberly Clark Worldwide Inc
Current assignee: Kimberly Clark Worldwide Inc; Kimberly Clark Corp
Priority date: 2001-11-21
Filing date: 2002-10-01
Publication date: 2005-02-23
Anticipated expiration: 2022-10-01
Also published as: AU2002341927A8; KR100938308B1; EP1446415A2; BR0213997A; AU2002341927A1; EP1446415A4; RU2004114259A; WO2003046201A3; US6696254B2; WO2003046201A2; CA2466615A1; KR20040054760A; US20040063139A1; US7179603B2; CN1289519C; MXPA04004221A; TW200300453A; US20030232330A1

Abstract

本发明提供了用于检测仅在肠杆菌科中发现的基因，三磷酸脱氧鸟苷三磷酸水解酶基因的探针、抗体和方法。在检测包括食品和水样品的试样是否被肠道细菌感染方面，这些探针和方法是有用的。

Description

肠道细菌的检测和识别

发明领域

本发明涉及肠杆菌科的检测和存在于试样中的肠杆菌属的识别。本发明尤其提供了用于检测仅在肠杆菌科中发现的核酸和所编码酶(三磷酸脱氧鸟苷三磷酸水解酶)的方法。由本发明提供的核酸和方法在检定食品、水和其它类型样品是否被肠道细菌污染方面是有用的。本发明的方法也可用于识别被污染样品中所存在的肠道细菌的类型。

发明背景

在美国，每年有数百万宗疾病和数千宗死亡是因为致肠病细菌所导致的食物中毒及其它由食物产生的疾病(1，2)。由病菌的急性吸收而产生的临床症状包括腹泻、呕吐和痢疾(3)。不过也可能发生其它更为严重的医学并发症，如肾及心脏紊乱、神经机能障碍、溶血性尿毒症和死亡(4)。非工业化国家的状况甚至更差，估计有超过百分之十的人口长期忍受着食物产生的疾病(5)。在美国公共健康组织不仅面临食物中毒病例的不断增加率，还面临着新出现的细菌性由食物产生的疾病(6，7)。除人类健康问题以外，通过降低经济生产力，以及消耗当地和国家公共健康组织的可利用资源，食物产生的疾病给社会还带来连续和沉重的经济税费(8)。

导致这些人类疾病的细菌来源自分类学肠杆菌科(9)。该家族中通过食物产生的疾病危害人类健康的四个主要的属为：埃希氏菌属、沙门氏菌属、志贺氏菌属和耶尔森氏菌属。所有的食品均可被这些细菌污染。这种污染的原始来源可能源于带有全身性感染的动物宿主(例如母牛、鸡或猪)，源于其它未污染食品的不恰当处理(例如不良的工人卫生)，或源于在受污染的水中洗涤的食品。

传统的食物和餐馆检查法依赖于对食品和食物准备区的视觉检查。不过，受致肠病细菌污染的食品常常看起来、闻起来和尝起来都是正常的。这些病原体中的大部分也可在烹饪过程中存活(10，11)。进行细菌培养时，必须将样品返回化验室以进行微生物检验。这种检验常常需要数周进行。同时延续了潜在的健康风险。

由Quirk和Bessman进行的研究表明仅在属于肠杆菌科的细菌中检测到dGTP酶。不过该文献未提供可检测肠杆菌科细菌，并可区分不同类型肠杆菌科细菌的核酸探针和抗体。

因此迫切需要开发出更快速和更为可靠的检测方法，该方法具有充分的灵敏性和特异性，不仅可识别存在于食物和水样中的致肠病细菌污染，还可识别存在的致肠病细菌污染的类型。

发明概述

根据本发明，仅在肠杆菌科细菌中发现了三磷酸脱氧鸟苷三磷酸水解酶(dGTP酶；E.C.3.1.5.1)，且检测到该酶便特异性地指示试样中存有肠杆菌科病菌。本发明提供了识别受污染样品中何种肠杆菌科细菌的存在的方法，以及检测肠杆菌科细菌dGTP酶所用的抗体和核酸。这些方法可能包括免疫的、酶的、杂交、核酸扩增以及检测并识别肠杆菌科细菌的相关步骤。

本发明提供了包括SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQ IDNO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：17，或SEQ ID NO：18分离的核酸。这种核酸选择性地与肠杆菌科细菌来源的DNA杂交。

本发明也提供了包括SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9，或SEQ ID NO：10分离的核酸。即使存在肠杆菌科其它细菌物种中的至少一种，如克雷白氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌和耶尔森氏菌的DNA，这些核酸仍选择性地与大肠杆菌来源的DNA杂交。

本发明进一步提供了包括SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12，SEQ IDNO：13，或SEQ ID NO：14分离的核酸。在克雷白氏菌或埃希氏菌来源的DNA存在下，这些核酸选择性地与鼠伤寒沙门氏菌来源的DNA杂交。

本发明也提供了包括SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：17，或SEQ ID NO：18分离的核酸。在沙门氏菌或埃希氏菌来源的DNA存在下，这些核酸选择性地与产酸克雷白氏菌来源的DNA杂交。

本发明进一步提供了含有固体支持物和包括SEQ ID NO：2，SEQ IDNO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ IDNO：12，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：17，或SEQ ID NO：18的核酸的生物传感器芯片。

本发明也提供了检测试样中肠道细菌的存在的方法，该方法包括在严格杂交条件下使试样与探针接触，和检测探针与试样中核酸之间的杂交。这种探针可包含一个核酸，该核酸包括，例如，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：17，或SEQ ID NO：18。这种肠道细菌属于肠杆菌科。该方法可进一步包括DNA扩增，例如，聚合酶链反应。

本发明进一步提供了检测试样中任何肠道细菌物种的存在的方法，该方法包括在严格杂交条件下使试样与探针接触，和检测探针与试样中核酸之间的杂交。该方法中有用的探针包括含有SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，或SEQ ID NO：6的核酸。该方法可进一步包括DNA扩增，例如，聚合酶链反应。

本发明也提供了检测试样中埃希氏菌的存在的方法，该方法包括在严格杂交条件下使试样与探针接触，和检测探针与试样中核酸之间的杂交。这种探针可以是包括SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9，或SEQ ID NO：10分离的核酸。在克雷白氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌或耶尔森氏菌来源的DNA存在下，这些探针选择性地与大肠杆菌来源的DNA杂交。该方法可进一步包括DNA扩增，例如，聚合酶链反应。

本发明进一步提供了检测试样中沙门氏菌的存在的方法，该方法包括在严格杂交条件下使试样与探针接触，和检测探针与试样中核酸之间的杂交。这种探针可以是包括SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13，或SEQ ID NO：14分离的核酸。在克雷白氏菌或埃希氏菌来源的DNA存在下，这些探针选择性地与鼠伤寒沙门氏菌来源的DNA杂交。该方法可进一步包括DNA扩增，例如，聚合酶链反应。

本发明也提供了检测试样中克雷白氏菌的存在的方法，该方法包括在严格杂交条件下使试样与探针接触，和检测探针与试样中核酸之间的杂交。这种探针可以是包括SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16，SEQID NO：17，或SEQ ID NO：18分离的核酸。在沙门氏菌或埃希氏菌来源的DNA存在下，这些探针选择性地与产酸克雷白氏菌来源的DNA杂交。该方法可进一步包括DNA扩增，例如，聚合酶链反应。

本发明也提供了检测试样中肠道细菌的方法，该方法包括使试样与生物传感器芯片接触，该生物传感器含有固体支持物和可与肠杆菌科细菌来源dGTP酶结合的抗体，和检测dGTP酶是否与该生物传感器芯片结合。本发明也提供了包含固体支持物和选择性地与肠杆菌科细菌来源dGTP酶结合的抗体的生物传感器芯片。

可与肠杆菌科细菌来源dGTP酶结合的抗体包括，例如，针对具有SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：23，SEQID NO：24，SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：27，SEQ IDNO：28，SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：30，SEQ ID NO：31，SEQ ID NO：32，SEQ ID NO：33，SEQ ID NO：34，SEQ ID NO：35，或SEQ ID NO：36的肽的抗体。

附图简述

图1说明若干肠杆菌科物种来源酶制备物的酶活性随着抗-dGTP酶多克隆抗体(pAb)量的增加而损失。该抗-dGTP酶多克隆抗体针对分离自大肠杆菌的dGTP酶。如图显示了抗-dGTP酶pAb对分离自小肠结肠炎耶尔森氏菌(空心圆)、产气肠杆菌(实心三角形)、普通变形杆菌(空心菱形)、产酸克雷白氏菌(空心三角形)、鼠伤寒沙门氏菌(空心方形)、鲍氏志贺氏菌(实心圆)，及戴氏西地西菌(实心方形)的抑制。

图2说明若干肠杆菌科物种来源酶制备物的酶活性随着抗-dGTP酶多克隆抗体(pAb)量的增加而损失。该抗-dGTP酶多克隆抗体针对分离自粘质沙雷氏菌的dGTP酶。如图显示了抗-dGTP酶pAb对分离自鼠伤寒沙门氏菌(空心方形)、产酸克雷白氏菌(空心三角形)、鲍氏志贺氏菌(实心圆)、普通变形杆菌(空心菱形)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(空心圆)、蜂房哈夫尼亚菌(实心菱形)、产气肠杆菌(实心三角形)，及粘质沙雷氏菌(实心方形)的抑制。

图3提供了对抗-大肠杆菌dGTP酶pAb与大肠杆菌0157(实心圆)、鲍氏志贺氏菌(空心圆)、鼠伤寒沙门氏菌(实心方形)、产酸克雷白氏菌(实心三角形)、产气肠杆菌(实心菱形)、戴氏西地西菌(空心方形)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(空心菱形)，及弗氏柠檬酸杆菌(空心三角形)来源的1mg吸附组分III酶制备物之间交叉反应性的ELISA分析结果。

图4提供了对抗-粘质沙雷氏菌dGTP酶pAb与鼠伤寒沙门氏菌(实心三角形)、大肠杆菌(空心三角形)、蜂房哈夫尼亚菌(空心方形)、产气肠杆菌(实心圆)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(空心圆)，及普通变形杆菌(实心方形)来源的1mg吸附组分III酶制备物之间交叉反应性的ELISA分析结果。

图5A提供了对采用抗-埃希氏菌dGTP酶pAb(泳道2-5)或抗-沙雷氏菌dGTP酶pAb(泳道6-9)的免疫亲和柱层析柱分离的若干肠道细菌物种来源dGTP酶的SDS PAGE分析结果。泳道1，分子量标记(从上至下为65kDa，45kDa，24kDa)；泳道2，沙门氏菌；泳道3，志贺氏菌；泳道4，克雷白氏菌；泳道5，西地西菌；泳道6，耶尔森氏菌；泳道7，变形杆菌；泳道8，肠杆菌；泳道9，哈夫尼亚菌。

图5B提供了采用针对不同菌群dGTP酶的抗体进行的蛋白质印迹分析结果。抗-大肠杆菌dGTP酶pAb被用于检测粘质沙雷氏菌蛋白粗提物(泳道1)和大肠杆菌蛋白粗提物(泳道2)中的dGTP酶。抗-粘质沙雷氏菌dGTP酶pAb被用于检测粘质沙雷氏菌蛋白粗提物(泳道3)和大肠杆菌蛋白粗提物(泳道4)中的dGTP酶。

图6提供了显示针对不同细菌来源dGTP酶的束缚的(tethered)pAbs的反应性的表面等离子共振(SPR)传感图结果。随着抗-大肠杆菌dGTP酶pAbs与大肠杆菌(Ec)、鲍氏志贺氏菌(Sb)、戴氏西地西菌(Cd)、产酸克雷白氏菌(Ko)、鼠伤寒沙门氏菌(St)、弗氏柠檬酸杆菌(Cf)、产气肠杆菌(Ea)、及金黄色葡萄球菌(Sa)(非肠道细菌对照)的细菌粗提物反应的时间变化标绘相对SPR信号强度。经过传感器表面的流速为每分钟50μl。

图7提供了显示针对不同细菌来源dGTP酶的束缚的pAbs的反应性的SPR传感图结果。随着抗-粘质沙雷氏菌dGTP酶pAbs与粘质沙雷氏菌(Sm)、产气肠杆菌(Ea)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Ye)、普通变形杆菌(Pv)、大肠杆菌(Ec)、及鼠伤寒沙门氏菌(St)的细菌粗提物反应的时间变化标绘相对SPR信号强度。经过传感器表面的流速为每分钟50μl。

图8提供了说明由已纯化dGTP酶滴定SPR生物传感器的曲线图。该曲线表示在400秒时与表面反应的特定量酶所对应的SPR信号强度(结合完成之后，见图6)。在样品点之间，为除去已结合dGTP酶，采用2M硫氰酸钾洗涤芯片，继而进行10分钟的缓冲液洗涤，再进行随后的dGTP酶浓缩。抗大肠杆菌pAb表面(空心圆)与大肠杆菌dGTP酶反应，抗粘质沙雷氏菌pAb表面(实心圆)与粘质沙雷氏菌dGTP酶反应。横坐标刻度范围为0-100ng。

图9提供了大肠杆菌dgt基因的DNA序列。

图10说明本发明方法可检测试样中的少至100个肠杆菌科细菌(该情况中为大肠杆菌)。采用引物对1以扩增来源自大约1000个大肠杆菌(泳道1)、100个细菌(泳道2)、及10个细菌(泳道3)的184bp片段。进行三十个循环的PCR反应。在最初的凝胶中泳道3的条带仅为可见。该凝胶含1.2％琼脂糖，且由溴化乙锭染色。

图11说明本发明提供的核酸探针的特异性。该试验中，从不同肠杆菌科物种的大约200cfu中获得DNA。采用仅特异性扩增大肠杆菌dgt核酸的引物对5对这些分离的DNA进行PCR扩增，以生成213bp片段。于1.2％琼脂糖凝胶上分离扩增产物，并由溴化乙锭染色。每一泳道均含有不同物种底物DNA来源的扩增产物：泳道1-克雷白氏菌；泳道2-沙门氏菌；泳道3-志贺氏菌；泳道4-耶尔森氏菌；泳道5-埃希氏菌。仅于大肠杆菌泳道正确扩增了213bp片段。

图12进一步说明在试样中存有不同类型细菌，并可能竞争引物结合和扩增的条件下，本发明提供的核酸探针的特异性。该试验中，从不同肠杆菌科物种的大约200cfu中获得DNA，将其混合在一起。扩增后，于1.2％琼脂糖凝胶上分离该扩增产物，并由溴化乙锭染色。试样中所存在的细菌DNA种类，以及测试扩增特异性所用引物提供如下。

泳道	细菌	引物对	条带大小(bp)
泳道	细菌	引物对	条带大小(bp)	1	埃希氏菌+克雷白氏菌	7和11	82(埃希氏菌)+213(克雷白氏菌)
2	埃希氏菌+沙门氏菌	7和8	82(埃希氏菌)+213(沙门氏菌)	1	埃希氏菌+克雷白氏菌	7和11	82(埃希氏菌)+213(克雷白氏菌)
2	埃希氏菌+沙门氏菌	7和8	82(埃希氏菌)+213(沙门氏菌)	3	沙门氏菌+克雷白氏菌	8和13	213(沙门氏菌)+82(克雷白氏菌)
4	克雷白氏菌+埃希氏菌	6	251(埃希氏菌)	3	沙门氏菌+克雷白氏菌	8和13	213(沙门氏菌)+82(克雷白氏菌)
4	克雷白氏菌+埃希氏菌	6	251(埃希氏菌)	5	沙门氏菌+埃希氏菌	6	251(埃希氏菌)

引物对5、6和7被设计为特异于埃希氏菌。引物对8、9和10被设计为特异于沙门氏菌。引物对11、12和13被设计为特异于克雷白氏菌。实际应用的每一引物对均合成了特定细菌物种的预计大小的DNA片段。因此本发明方法可区分相应肠杆菌科细菌来源的DNA，并可正确识别混合细菌培养物中存有的细菌物种。

图13说明本发明方法可检测和识别现实中肉样品(鸡)中的肠杆菌科细菌。在采用下列引物对的PCR反应中应用到10μl鸡体液(血液)：

泳道编号	引物组	设计的细菌类型引物以检测	观测的条带(与预计一致)
泳道编号	引物组	设计的细菌类型引物以检测	观测的条带(与预计一致)	1	2	任何肠道细菌	213
2	5	仅限埃希氏菌	213	1	2	任何肠道细菌	213
2	5	仅限埃希氏菌	213	3	11	仅限克雷白氏菌	无
4	8	仅限沙门氏菌	213	3	11	仅限克雷白氏菌	无
4	8	仅限沙门氏菌	213	5	8(2×)	仅限沙门氏菌	213
6	5+7	仅限埃希氏菌	251+83	5	8(2×)	仅限沙门氏菌	213
6	5+7	仅限埃希氏菌	251+83	7	1	任何肠道细菌	213

泳道5与泳道4对应的反应中采用两倍量的引物对8。泳道6和7中的条带模糊但明显存在。这些结果表明该鸡样品被沙门氏菌和埃希氏菌所污染，而非克雷白氏菌。

发明详述

三磷酸脱氧鸟苷三磷酸水解酶(dGTP酶)是唯一已确定的特异性出现于肠杆菌科细菌中的一种酶。在真核细胞提取物，包括大鼠和鸡肝脏、鸡和果蝇胚胎，及酵母细胞的提取物中均未检测到dGTP酶活性。该酶在所有致病的主要肠杆菌科物种中均有表达，而在欧文氏菌种中则无表达。令人惊讶的是该酶在非常接近的弧菌属中也无表达。此外，dGTP酶多肽在表达水平上显示出很少的种间变异。可利用dGTP酶的这种狭窄分类学分布识别各种试样中的致肠病细菌。

三磷酸脱氧鸟苷三磷酸水解酶是Kornberg等人(15)在纯化DNA聚合酶I过程中发现的杂质。该酶是被部分纯化的，并且发现该酶可催化三磷酸脱氧鸟苷水解为脱氧鸟苷和无机三聚磷酸盐：

dGTP→dGuo+PPPi

在所有已知的核苷三磷酸酶中，该反应是唯一的，且形成了终产物原焦磷酸盐或焦磷酸盐。迄今，dGTP酶是唯一已知的三磷酸水解酶。dGTP酶是热稳定的四聚体蛋白质(13，14)，且致免疫(12)。其它肠道细菌来源dGTP酶的酶学和结构特性与从埃希氏菌分离的dGTP酶相似。

定义

术语“氨基酸序列”指肽、多肽或蛋白质分子中氨基酸的位置排列和同一性。术语“氨基酸序列”的使用并不意味限制该氨基酸序列为肽、多肽或蛋白质的完整、天然氨基酸序列。

术语“编码区域”指编码为感兴趣的蛋白质或编码到感兴趣的功能RNA，如反义RNA或非翻译RNA的核苷酸序列。通过编码启动子蛋氨酸的核苷酸三联体“ATG”将蛋白质的编码区域结合在5’端，通过特定终止密码子的三个三联体(即TAA、TAG、TGA)之一将其结合在3’端。该编码区域可以cDNA、基因组DNA或RNA形式出现。

“互补”或“互补性”被用于定义核酸之间碱基配对或杂交的程度。例如，如本领域技术人员所知，腺嘌呤(A)可与胸腺嘧啶(T)形成氢键或碱基对，鸟嘌呤(G)可与胞嘧啶(C)形成氢键或碱基对。因此A是T的补体，G是C的补体。当双链核酸中所有碱基均为成对碱基时，互补性可能是完全的。可选地，根据碱基配对原则，核酸中仅有部分碱基匹配时，互补性可能是“部分的”。核酸链之间的互补性程度对核酸链之间杂交的效率与强度有影响。

“对照序列”或“调节序列”是特定宿主机体中表达可操作连接的编码序列所必需的DNA序列。对照序列适用于原核细胞，包括例如启动子、任意的操纵子序列，及核糖体结合位点。

“表达”指机体中内源或外源基因的转录和/或翻译。表达通常指mRNA的转录和稳定累积。表达也可指蛋白质的生成。

术语“基因”被广泛地用于指具有生物学功能的任何核酸片段。术语“基因”包括蛋白质、多肽、肽或结构RNA的编码区域。术语“基因”也包括编码区域的任一端长达2kb的序列。这些序列被称为“外侧”序列或区域(这些外侧序列位于mRNA转录产物上所存在的非翻译序列的5’或3’)。5’外侧区域可以包含对照或调节序列，如启动子和增强子，或可控制或影响基因转录的蛋白质的其它识别或结合序列。3’外侧区域可以包含指引转录末端、后转录裂解和多聚腺苷酰作用的序列，以及其它蛋白质的识别序列。基因中编码的蛋白质或多肽可能是全长或其任意部分，所以保留了所有的活性或功能特性，或仅保留全长蛋白质或多肽的选择活性(如酶活性、配体连接、信号转导等)。该蛋白质或多肽可以包括生成前蛋白或前体多肽所必需的任何序列。术语“基因”包括编码区域的cDNA和基因组两种形式。编码区域的基因组构成可以被术语为“内含子”的非编码序列间断。术语“天然基因”指自然存在于未转化细胞基因组中的基因。

“基因组”指自然存在于机体中的完整遗传物质，并从一代被传至下一代。

术语“异种核酸”或“外源核酸”指来自外源进入特定宿主细胞的核酸，如果来源相同，即从其原始形式改良而得的核酸。因此，宿主细胞中的异种基因包括特定宿主细胞内生，但已通过例如利用DNA改组被改良的基因。该术语也包括自然发生核酸的非自然发生的多重拷贝。因此，该术语指与该细胞相异或异源的核酸片段，或者通常在细胞内发现，但在细胞或基因组内不经常被发现的位置被发现的核酸片段。

术语“同源性”指核酸与基准核酸之间，或多肽与基准多肽之间的相似性程度。同源性可以是部分的或完全的。完全同源性表示该核酸或氨基酸序列是一致的。而部分同源的核酸或氨基酸序列则与基准核酸或氨基酸序列不一致。因此，相对于比较的核酸而言，部分同源的核酸在其序列上具有一个或多个核苷酸差异。同源性程度可通过序列对照确定。可选地，如本领域技术人员所熟知，在不同杂交条件下，DNA-DNA或DNA-RNA杂交可提供核酸之间同源性程度的一个估计量(见如Haines and Higgins(eds.)，Nucleic Acid Hybridization，IRLPress，Oxford，U.K.)。

“杂交”指通过在互补核酸链上的核苷酸碱基之间形成氢键，以退火互补核酸链的过程。杂交，及核酸之间的联合强度，是受杂交核酸之间互补程度、相关条件严格性、所形成杂化物的Tm、杂交核酸长度以及这些核酸的G∶C比例等因素影响的。

“起始位点”是第一个核苷酸位置周围的区域，即转录序列的一部分，被定义为+1位。根据转录序列的第一个核苷酸对起始位点中基因的所有核苷酸位置进行编号。下游序列(即3’方向的序列)被定为正，而上游序列(即5’方向的序列)被定为负。

“分离的”或“已纯化”核酸或“分离的”或“已纯化”多肽指通过人为离开其自然环境存在，并因此非天然产物的核酸或多肽。分离的核酸或多肽可以部分纯化或基本纯化的形式存在。分离的核酸或多肽也可存在于非自然环境中，如转基因宿主细胞。

术语“标记”指可提供可检测(优选的可定量)信号，并可与核酸或蛋白质附着的任何原子或分子。标记可提供通过荧光、放射、比色、重量分析、X线衍射或吸收、磁性、酶活性等方法可检测的信号。

术语“核酸”指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其单链或双链形式的聚合体，由含糖、磷酸盐及嘌呤或嘧啶的单体(核苷酸)组成。除非特定限制，该术语包括含有天然核苷酸已知类似物，具有与基准核酸相似的结合特性，并以与自然发生的核苷酸相似的方式代谢的核酸。除非其它说明，特定核酸序列也无疑包括被保守修饰的其变体(如简并密码子替代)和互补序列，以及明确指明的基准序列。

此处所用术语“寡核苷酸”被定义为由两个或以上脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸组成的分子，优选的超过三个，通常超过十个。对寡核苷酸大小无确切的上限。不过通常寡核苷酸短于大约250个核苷酸，更为优选的寡核苷酸短于大约200个核苷酸，还要更为优选的寡核苷酸短于大约100个核苷酸。最为优选的寡核苷酸短于大约50个核苷酸。该确切大小将取决于许多因素，依次取决于寡核苷酸的最终功能或用途。可通过任何方式生成该寡核苷酸，包括化学合成、DNA复制、逆转录，或这些方法的组合。

术语“开放读码框架”及“ORF”指在编码序列的翻译起始和终止密码子之间编码的氨基酸序列。术语“起始密码子”和“终止密码子”指编码序列中三个邻近核苷酸为一个单位(‘密码子’)，分别表示蛋白质合成(mRNA翻译)的起始和链末端。

“可操作连接”意思是使两个或以上核酸处于彼此的功能关系中。例如编码前序列或分泌性前导区的核酸可以被可操作地连接至编码多肽的核酸上，并作为参与蛋白质分泌的前蛋白被表达；启动子或增强子可以被可操作地连接至编码序列，并影响该序列的转录；或核糖体结合位点可以被可操作地连接至编码序列，并被定位以便于翻译。通常“可操作连接”指被连接的DNA序列是相邻的，以及在编码多肽序列的情况中，DNA序列位于阅读区并且通常是相邻的。。不过，增强子不是必须相邻。

术语“蛋白质”、“肽”和“多肽”在此处可交替使用。

此处所用术语“严格性”被用于定义温度、离子强度，及存在其它化合物，如有机溶剂的条件，在该条件下，可进行核酸杂交。采用“高严格性”条件，仅在具有高频互补碱基序列的核酸之间才可发生核酸碱基配对。采用“弱”或“低”严格性条件，互补序列频率通常较小，所以可检测并/或分离含不同序列的核酸。

术语“基本相似”与“基本同源”指表现出相当于本发明序列功能的核苷酸和氨基酸序列。例如，简单地反映出遗传密码的简并，但仍编码了与本发明氨基酸序列一致的氨基酸序列的已更改核苷酸序列与本发明序列基本相似。另外，与本发明序列基本相似的氨基酸序列的全部氨基酸同一性足以提供活性、热稳定dGTP酶。例如，相对于本发明的氨基酸序列，与本发明序列基本相似的氨基酸序列的全部氨基酸同一性为80％或更高，优选的90％或更高，更为优选的95％或更高。

“热稳定”指在超过约37℃到42℃的温度下，酶仍然保留最佳活性温度。优选的聚合酶具有的最佳活性温度在约50℃和75℃之间，更为优选的酶具有的最佳活性温度在55℃和70℃之间，最为优选的酶具有的最佳活性温度在60℃和65℃之间。

核酸、蛋白质、多肽或肽的“变体”指与基准核酸、蛋白质、多肽或肽分别相关但具有不同序列的变异核酸、蛋白质、多肽或肽。变异核酸在核苷酸序列上与基准核酸不同，而变异核酸、蛋白质、多肽或肽则在氨基酸序列上分别与基准核酸、蛋白质、多肽或肽不同。通过可能在任何化合物中出现的一个或多个替代、插入、添加、缺失、融合和平截，变体与基准核酸、蛋白质、多肽或肽可能在序列上有不同。差异可能较小(如一个核苷酸或氨基酸的差异)或更为基本。不过，变体序列与基准之间的差异并没有大到使任何一个本领域技术人员都不能识别在结构与/或功能上相关的变体和基准。通常，差异是有限的，所以大体上基准与变体极为相似，并在许多区域上是一致的。

术语“载体”指可将核酸片段从一个细胞转移至另一个细胞的核酸。“载体”包括，尤其是可或不可自传递或移动，并可通过整合进入细胞基因组或染色体外，从而转化原核或真核生物宿主的任何质粒、粘粒、噬菌体或者双链或单链直线或环状形式的核酸(如具有复制起点的自复制质粒)。细菌系统所用的载体通常含有复制起点，所以该载体可进行与细菌染色体无关的复制。术语“表达载体”指含有表达组件的载体。

术语“野生型”指从自然发生源分离时，具有该基因或基因产物特征的基因或基因产物。野生型基因是最常见于群体，并因此被任意称为基因的“正常”或“野生型”形式的基因。相反，术语“改良”或“突变体”指与野生型基因或基因产物相比，表现出改良的序列和/或功能特性(即更改特性)的基因或基因产物。自然发生的突变体是可分离的；是通过与野生型基因或基因产物相比具有不同特性的事实进行识别的。

肠杆菌科细菌dGTP酶核酸

本发明针对的是来源自肠杆菌科中任意细菌物种，并编码了三磷酸脱氧鸟苷三磷酸水解酶的核酸。本发明也设想了编码活性三磷酸脱氧鸟苷三磷酸水解酶的变异核酸。核酸的任意片段也被包括在本发明中，只要其可特异性地与来源自肠杆菌科中任意细菌物种，并编码三磷酸脱氧鸟苷三磷酸水解酶的核酸杂交即可。本发明的核酸是已分离或已基本纯化的核酸。尤其是本发明的分离核酸不是编码了蛋白质，并自然地位于获得该核酸的机体基因组DNA中该核酸两侧的核酸。本发明的核酸可被用于检测肠杆菌科中的任何细菌物种。通过本领域技术人员已知的任何操作，例如，任何可应用的杂交、扩增或相关操作均可进行检测。

例如，本发明针对的是编码了西地西菌、柠檬酸菌、肠产气杆菌、埃希氏菌、哈夫尼菌、克雷白氏菌、变形菌、沙门氏菌、沙雷氏菌、志贺氏杆菌或耶尔森氏菌来源的全部或部分三磷酸脱氧鸟苷三磷酸水解酶的核酸。一种实施方案中，该核酸为编码大肠杆菌三磷酸脱氧鸟苷三磷酸水解酶的全部或部分核酸，该核酸具有如下序列(SEQ ID NO：1)：

ATGGCACAGATTGATTTCCGAAAAAAAATAAACTGGCATCGTCGTTACCGTT

CACCGCAGGGCGTTAAAACCGAACATGAGATCCTGCGGATCTTCGAGAGCG

ATCGCGGGCGTATCATCAACTCTCCGGCAATTCGTCGTCTGCAACAAAAGA

CCCAGGTTTTTCCACTGGAGCGCAATGCCGCCGTGCGCACGCGTCTTACCCA

CTCGATGGAAGTCCAGCAGGTGGGGCGCTACATCGCCAAAGAAATTTTAAG

CCGTCTGAAAGAGCTTAAATTACTGGAAGCATACGGCCTGGATGAACTGACC

GGTCCCTTTGAAAGCATTGTTGAGATGTCATGCCTGATGCACGATATCGGCAA

TCCGCCGTTTGGTCATTTTGGCGAAGCGGCGATAAATGACTGGTTTCGCCAAC

GTTTGCACCCGGAAGATGCCGAAAGCCAGCCTCTGACTGACGATCGCTGCAG

CGTGGCGGCACTACGTTTACGGGACGGGGAAGAACCGCTTAACGAGCTGCGG

CGCAAGATTCGTCAGGACTTATGTCATTTTGAGGGGAATGCACAAGGCATTC

GCCTGGTGCATACATTGATGCGGATGAATCTCACCTGGGCACAGGTTGGCGG

TATTTTAAAATATACCCGTCCGGCGTGGTGGCGTGGCGAAACGCCTGAGACA

CATCACTATTTAATGAAAAAGCCGGGTTATTATCTTTCTGAAGAAGCCTATA

TTGCCCGGTTGCGTAAAGAACTTAATTTGGCGCTTTACAGTCGTTTTCCATTA

ACGTGGATTATGGAAGCTGCCGACGACATCTCCTATTGTGTGGCAGACCTTG

AAGATGCGGTAGAGAAAAGAATATTTACCGTTGAGCAGCTTTATCATCATTT

GCACGAAGCGTGGGGCCAGCATGAGAAAGGTTCGCTCTTTTCGCTGGTGGTT

GAAAATGCCTGGGAAAAATCACGCTCAAATAGTTTAAGCCGCAGTACGGAA

GATCAGTTTTTTATGTATTTACGGGTAAACACCCTAAATAAACTGGTACCCTA

CGCGGCACAACGATTTATTGATAATCTGCCTGCGATTTTCGCCGGAACGTTTA

ATCATGCATTATTGGAAGATGCCAGCGAATGCAGCGATCTTCTTAAGCTATA

TAAAAATGTCGCTGTAAAACATGTGTTTAGCCATCCAGATGTCGAGCGGCTT

GAATTGCAGGGCTATCGGGTCATTAGCGGATTATTAGAGATTTATCGTCCTT

TATTAAGCCTGTCGTTATCAGACTTTACTGAACTGGTAGAAAAAGAACGGGT

GAAACGTTTCCCTATTGAATCGCGCTTATTCCACAAACTCTCGACGCCGCAT

CGGCTGGCCTATGTCGAGGCTGTCAGTAAATTACCGTCAGATTCTCCTGAGT

TTCCGCTATGGGAATATTATTACCGTTGCCGCCTGCTGCAGGATTATATCAG

CGGTATGACCGACCTCTATGCGTGGGATGAATACCGACGTCTGATGGCCGTA

GAACAATAA

此处所提供三磷酸脱氧鸟苷三磷酸水解酶核酸的片段和变异核酸也被包括在本发明中。本发明所包括的核酸“片段”为两种普通类型。首先，未编码全长dGTP酶，而编码了具有dGTP酶活性的多肽的片段核酸在本发明范畴内。其次，此处所确定被用作杂交探针或引物，但通常没有编码dGTP酶活性的核酸片段也被包括在本发明中。

采用大肠杆菌dGTP酶核酸序列(SEQ ID NO：1)，或肠杆菌科其它肠道细菌物种来源dGTP酶核酸序列可获得或产生片段。在Genebank序列库中可发现其它dGTP酶核酸序列。当引物序列选自肠道细菌物种之间序列一致或保留区域时，作为引物应用的片段可被设计成可扩增任何肠道细菌dGTP酶核酸。另一方面，通过选择只有特定属或物种特有的序列，可将引物序列设计为对该特定属或肠杆菌科物种具有选择性。任何本领域技术人员均可轻易地设计这种引物序列。

因此，本发明片段可能的变动范围为至少约9个核苷酸、约12个核苷酸、约15个核苷酸、约17个核苷酸、约18个核苷酸、约20个核苷酸、约50个核苷酸、约100个核苷酸或更多。通常，本发明的片段核酸可具有任何尺寸上限，只要其在序列上与本发明核酸相关即可，但不是全长。

本发明的核酸片段可被用作，例如检测或识别dGTP酶核酸所用的杂交探针，或dGTP酶核酸的DNA合成、DNA测序或DNA扩增所用的引物。许多片段可获得自SEQ ID NO：1。本发明的核酸片段实例包括SEQID NO：1-18中的任何一个。

“变体”指基本相似或基本同源的序列。对核苷酸序列而言，变体包括那些由于遗传密码简并而编码了天然dGTP酶蛋白质的相同氨基酸序列的序列。自然发生的等位变体包括此处未逐一列出的任何肠杆菌科细菌dGTP酶核酸，且被包括在本发明中。利用已知分子生物学技术，例如聚合酶链反应(PCR)和杂交技术可识别变异核酸。变异核酸也包括那些编码了特定多肽的核酸，其中该特定多肽不含与天然dGTP酶蛋白质一致的氨基酸序列，但仍编码了活性dGTP酶。

如本领域任何一位技术人员所知，遗传密码是“简并的”指一些三核苷酸密码子可编码相同的氨基酸。这种简并在表1中是显而易见的。

表1

第二位

第一位	T	C	A	G	第三位
第一位	T	C	A	G	第三位	T	TTT＝Phe	TCT＝Ser	TAT＝Tyr	TGT＝Cys	T
T	TTC＝Phe	TCC＝Ser	TAC＝Tyr	TGC＝Cys	C	T	TTT＝Phe	TCT＝Ser	TAT＝Tyr	TGT＝Cys	T
T	TTC＝Phe	TCC＝Ser	TAC＝Tyr	TGC＝Cys	C	T	TTA＝Leu	TCA＝Ser	TAA＝Stop	TGA＝Stop	A
T	TTG＝Leu	TCG＝Ser	TAG＝Stop	TGG＝Trp	G	T	TTA＝Leu	TCA＝Ser	TAA＝Stop	TGA＝Stop	A
T	TTG＝Leu	TCG＝Ser	TAG＝Stop	TGG＝Trp	G	C	CTT＝Leu	CCT＝Pro	CAT＝His	CGT＝Arg	T
C	CTC＝Leu	CCC＝Pro	CAC＝His	CGC＝Arg	C	C	CTT＝Leu	CCT＝Pro	CAT＝His	CGT＝Arg	T
C	CTC＝Leu	CCC＝Pro	CAC＝His	CGC＝Arg	C	C	CTA＝Leu	CCA＝Pro	CAA＝Gln	CGA＝Arg	A
C	CTG＝Leu	CCG＝Pro	CAG＝Gln	CGG＝Arg	G	C	CTA＝Leu	CCA＝Pro	CAA＝Gln	CGA＝Arg	A
C	CTG＝Leu	CCG＝Pro	CAG＝Gln	CGG＝Arg	G	A	ATT＝Ile	ACT＝Thr	AAT＝Asn	AGT＝Ser	T
A	ATC＝Ile	ACC＝Thr	AAC＝Asn	AGC＝Ser	C	A	ATT＝Ile	ACT＝Thr	AAT＝Asn	AGT＝Ser	T
A	ATC＝Ile	ACC＝Thr	AAC＝Asn	AGC＝Ser	C	A	ATA＝Ile	ACA＝Thr	AAA＝Lys	AGA＝Arg	A
A	ATG＝Met	ACG＝Thr	AAG＝Lys	AGG＝Arg	G	A	ATA＝Ile	ACA＝Thr	AAA＝Lys	AGA＝Arg	A
A	ATG＝Met	ACG＝Thr	AAG＝Lys	AGG＝Arg	G	G	GTT＝Val	GCT＝Ala	GAT＝Asp	GGT＝Gly	T
G	GTC＝Val	GCC＝Ala	GAC＝Asp	GGC＝Gly	C	G	GTT＝Val	GCT＝Ala	GAT＝Asp	GGT＝Gly	T
G	GTC＝Val	GCC＝Ala	GAC＝Asp	GGC＝Gly	C	G	GTA＝Val	GCA＝Ala	GAA＝Gln	GGA＝Gly	A
G	GTG＝Val	GCG＝Ala	GAG＝Gln	GGG＝Gly	G	G	GTA＝Val	GCA＝Ala	GAA＝Gln	GGA＝Gly	A

因此，变体的核苷酸序列中，许多变化可能是沉默的，并且可能不改变由核酸编码的氨基酸序列。当核酸序列变化为沉默时，变异核酸将编码含有与基准核酸相同的氨基酸序列的多肽。

本发明的核酸序列也包括具有简并密码子替代的变体，及其互补序列，以及由SEQ ID NO明确说明的序列。特定地，通过生成特定序列，可实现简并密码子替代，该特定序列中基准密码子被基准密码子所确定的氨基酸的任意密码子替代。通常，一个或多个选定密码子的第三位可以被如Batzer et al.，Nucleic Acid Res.，19，5081(1991)和/或Ohtsuka et al.，J.Biol.Chem.，260，2605(1985)；Rossolini etal.，Mol.Cell.Probes，8，91(1994)公开的混合碱基和/或脱氧肌苷残基替代。

不过，本发明没有限制该核苷酸序列中的沉默变化，但也包括了改变本发明多肽的氨基酸序列的变异核酸序列。根据本发明，通过可能出现在任何化合物中的一个或多个替代、添加、插入、缺失、融合和平截，本发明的变体和基准核酸可能在编码的氨基酸序列上有差异，只要其活性dGTP酶由变异核酸编码即可。这种变异核酸不会恰恰编码与基准核酸相同的氨基酸序列，在此处被描述为具有“非沉默”序列变化。

通过基准核酸的同源程度定义和表征具有沉默和非沉默变化的变异核酸。优选的变异核酸是与本发明基准核酸“基本同源的”。如本领域任何一位技术人员所知，可在严格条件下使这种基本相似的核酸与此处SEQ ID NO序列所确定的基准核酸杂交。本发明包括了这些类型的基本同源核酸。

通常，本发明的核酸变体具有至少50、60到70％的序列与此处定义的基准核苷酸序列一致。本发明的优选核酸变体具有至少71％、72％、7 3％、74％、75％、76％、77％、78％到79％的序列与此处定义的基准核苷酸序列一致。本发明更为优选的核酸变体具有至少80％、81％、82％、83％或84％的序列与此处定义的基准核苷酸序列一致。本发明还要更为优选的核酸具有至少85％、86％、87％、88％或89％的序列与此处定义的基准核苷酸序列一致。本发明还要更为优选的核酸变体具有至少90％、91％、92％、93％或94％的序列与此处定义的基准核苷酸序列一致。本发明最为优选的核酸具有至少95％、96％、97％到98％的序列与此处定义的基准核苷酸序列一致。

通过标准杂交操作可检测并分离变异核酸。

通常在严格条件下进行杂交以检测或分离这种序列。在核酸杂交试验，如Southern和Northern杂交情况中的“严格杂交条件”和“严格杂交洗涤条件”是随序列而定的，且在不同环境参数下是不同的。较长序列于较高温度下特异地杂交。对核酸杂交的大量指导可见于Tijssen，Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecularbiology-Hybridization with Nucleic Acid Probes，第1页，第2章节“Overview of principles of hybridization and the strategyof nucleic acid probe assays”Elsevier，New York(1993)。也见J.Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Press，N.Y.，pp 9.31-9.58[1989]。

本发明也提供了编码dGTP酶活性的变异核酸的检测和分离方法。该方法包括使包含SEQ ID NOS：1-14的核酸的至少一部分与样品核酸杂交，从而形成杂交复合体；和检测该杂交复合体。该复合体的存在与变异dGTP酶核酸的存在有关。通常，杂交所用核酸部分至少有15个核苷酸长。杂交方法中所用核酸实例包括含有SEQ ID NOS：1-18的核酸。杂交是在足够严格以至可检测并分离同源核酸的杂交条件下进行。

一种可选实施方案中，采用选自SEQ ID NOS：2-18的引物寡核苷酸进行DNA，以检测样品中的核酸。这种扩增方法中的一种是下文更为详细描述的聚合酶链反应(PCR)。

而高度到中度严格杂交条件通常被用于检测和分离本发明的变异核酸，如果编码的多肽基本一致，则严格条件下不彼此杂交的核酸仍与该基准核酸基本一致。这可能发生在，如当采用由遗传密码引起的最大密码简并，以生成一个拷贝的核酸时。两个核酸序列基本一致的一个标志是，由第一个核酸编码的多肽与由第二个核酸编码的多肽免疫交叉反应。因此，如本领域任何一位技术人员所知，高度到中度的严格杂交条件可被用于检测和分离与基准核酸基本同源的核酸，但也可采用低严格杂交条件检测或分离这种基本同源的核酸。

通常，选择的高度严格杂交和洗涤条件应在定义的离子强度和pH下，比特定双链序列的热熔点(Tm)低约5℃。例如，“高度严格条件”或“高度严格杂交条件”下，核酸将与其补体杂交到一个可检测的程度，该程度高于核酸与其它序列杂交的程度(如超过至少2倍)。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可识别100％互补的核酸。

可选的，可调节严格条件，使得在序列中出现一些错配，以检测较低程度的相似性(异源探测)。典型的严格条件是pH7.0-8.3时，盐浓度低于约1.5M Na离子，典型地约0.01-1.0M Na离子浓度(或其它盐)，且对短探针(如10-50个核苷酸)而言，温度为至少约30℃，对长探针(如大于50个核苷酸)而言，温度为至少约60℃。添加去稳定剂，如甲酰胺也可实现严格条件。

低严格条件实例包括在37℃，采用含30-35％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲溶液进行杂交，并在50-55℃，采用1X-2X SSC(20X SSC＝3.0M NaCl和0.3M柠檬酸三钠)进行洗涤。中度严格条件实例包括在37℃，采用含40-45％甲酰胺、1.0M NaCl、1％SDS的缓冲溶液进行杂交，且在55-60℃，采用0.5X-1X SSC进行洗涤。高度严格条件实例包括在37℃，采用含50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS的缓冲溶液进行杂交，且在60-65℃，采用0.1X SSC中进行洗涤。

杂交期间获得的杂合体的互补性或同源性程度典型地随后杂交洗涤而变，关键因素为最终洗涤溶液的离子强度和温度。杂交核酸的类型和长度也影响杂交是否可以发生，以及在特定杂交和洗涤条件下形成的杂化物是否稳定。对DNA-DNA杂化物而言，可从Meinkoth和WahlAnal. Biochem.138：267-284(1984)等式估计出T_m：

T_m＝81.5℃+16.6(log M)+0.41(％GC)-0.61(％form)-500/L

其中M为单价阳离子摩尔浓度，％CC为DNA中鸟苷与胞嘧啶核苷酸的百分比，％form为杂交溶液中甲酰胺的百分比，L为碱基对中杂化物的长度。Tm为50％互补目标序列与完全匹配探针杂交时的温度(定义的离子强度和pH下)。选择的非常严格条件与特定探针的Tm相等。

严格杂交条件的一个实例是在DNA或RNA印迹中的滤膜上具有超过100个互补残基的互补核酸的杂交中，在42℃采用含1mg肝素的50％甲酰胺进行杂交过夜。高度严格条件的一个实例是72℃，0.15M NaCl，进行杂交约15分钟。严格洗涤条件的一个实例是65℃，0.2x SSC洗涤15分钟(也见Sambrook，infra)。常常是在高度严格洗涤之前进行低严格洗涤，以除去背景探针信号。对超过100个核苷酸的双链而言，中度严格条件的一个实例是，如采用1x SSC在45℃进行洗涤15分钟。对超过100个核苷酸的双链而言，低严格洗涤条件的一个实例是采用4-6x SSC在40℃进行洗涤15分钟。对短探针(如约10-50个核苷酸)而言，严格条件典型地包括低于约1.0M Na离子的盐浓度，典型地pH7.0-8.3时，约0.01-1.0M Na离子浓度(或其它盐)，且温度典型地至少约为30℃。

添加去稳定剂如甲酰胺也可实现严格条件。通常，在特定杂交试验中，获得的信号与噪音比例约为观测无关探针所得信号与噪音比例的2倍(或更高)时，表明检测到特异杂交。如果编码的蛋白质基本一致，则严格条件下没有彼此杂交的核酸仍然基本一致。这发生在，如当采用由遗传密码引起的最大密码简并以生成一个拷贝的核酸时。

下文是可被用于检测并分离与本发明基准核酸基本一致的同源核酸的几组杂交/洗涤条件实例：基准核苷酸序列优选地于50℃，与基准核苷酸序列在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO₄、1mM EDTA中进行杂交，并于50℃在2x SSC、0.1％SDS中进行洗涤，更为优选的是于50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO₄、1mM EDTA中进行杂交，并于50℃在1x SSC、0.1％SDS中进行洗涤，更为优选的仍然是于50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO₄、1mM EDTA中进行杂交，并于50℃在0.5x SSC、0.1％SDS中进行洗涤，优选的于50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO₄、1mM EDTA中进行杂交，并于50℃在0.1x SSC、0.1％SDS中进行洗涤，更为优选的是于50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO₄、1mM EDTA中进行杂交，并于65℃在0.1xSSC、0.1％SDS中进行洗涤。

通常，Tm是根据每1％错配约降低1℃的原则降低。因此，可调整Tm、杂交和/或洗涤条件，以杂交到预期序列同一性的序列。例如，如果目标序列具有＞90％同一性，可降低Tm 10℃。通常，选择的严格条件应在定义的离子强度和pH下，比特定序列及其补体的热熔点(Tm)低5℃或更低。不过高度严格条件可采用低于热熔点(Tm)1、2、3或4℃的温度进行杂交和/或洗涤；中度严格条件可采用低于热熔点(Tm)6、7、8、9或10℃的温度进行杂交和/或洗涤；低严格条件可采用低于热熔点(Tm)11、12、13、14、15或20℃的温度进行杂交和/或洗涤。

如果预期错配程度导致Tm低于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)，优选的是增加SSC浓度以利用较高温度。对核酸杂交的大量指导可见于Tijssen(1993)Laboratory Techniques in Biochemistryand Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes，Part 1，Chapter 2(Elsevier，New Yotk)；及Ausubel et al.，eds.(1995)Current Protocols in Molecular Biology，Chapter 2(GreenePublishing and Wiley-Interscience，New York)。也见Sambrook etal.(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(2d ed.，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Plainview，New York)。普通技术人员利用这些涉及Tm、错配、杂交及洗涤条件之间关系的文献及学说，便可获得该dGTP酶核酸的变体。

也可利用计算机分析对比序列以确定序列同一性。这种分析包括但不仅限于：PC/Gene程序中的CLUSTAL(可获得自Intelligenetics，Mountain View，California)； Wisconsin Genetics Software Package，Version 8中的ALIGN程序(Version 2.0)及GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA(可获得自Genetics Computer Group(GCG)，575Science Drive，Madison，Wisconsin，USA)。采用默认参数运行这些程序可进行序列比对。Higgins et al.Gene 73：237 244(1988)；Higginset al.CABIOS 5：151-153(1989)；Corpet et al.Nucleic Acids Res.16：10881-90(1988)；Huang et al.CABIOS 8：155-65(1992)；及Pearsonet al.Meth.Mol.Biol.24：307-331(1994)描述了CLUSTAL程序。

Altschul et al.，J.Mol.Biol.215：403(1990)描述了BLAST程序。为获得用于对比用途的带空位比对，可利用如Altschul et al.NucleicAcids Res.25：3389(1997)描述的Gapped BLAST(BLAST 2.0中)。可选的，可利用PSI-BLAST(BLAST 2.0中)进行检测分子间远源关系的重复研究。见上述Altschul等人的文献。当利用BLAST，GappedBLAST，PSI-BLAST时，可利用相应程序(如核苷酸序列所用的BLASTN，蛋白质所用的BLASTX)的默认参数。BLASTN程序(用于核苷酸序列)默认字长(W)为11，期望值(E)为10，截断值为100，M＝5，N＝-4，以及双链的对照。对氨基酸序列而言，BLASTP程序默认字长(W)为3，期望值(E)为10，以及BLOSUM62评分矩阵(见Henikoff & Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89，10915(1989))。见http：//www.ncbi.nlm.nih.gov。通过目测也可进行人工序列对照。

对本发明目的而言，采用具有默认参数的BlastN程序(版本1.4.7或较近版本)或任何相当程序可优选地获得核苷酸序列的比对，从而确定与此处公开的dGTP酶序列一致的序列百分比。“相当程序”指对研究中的任意两个序列而言，当与预期程序生成的相应比对比较时，可生成具有一致核苷酸或氨基酸残基匹配，和一致百分比序列同一性的比对的任何序列对比程序。

肠杆菌科细菌dGTP酶蛋白质

本发明提供了任意肠杆菌科物种来源分离的dGTP酶多肽，及其片段和保留dGTP酶活性的变异dGTP酶多肽。一种实施方案中，本发明提供了序列为SEQ ID NO：19的多肽，该多肽为野生型大肠杆菌dGTP酶多肽：

1 MAQIDFRKKI NWHRRYRSPQ GVKTEHEILR IFESDRGRII NSPAIRRLQQ

51 KTQVFPLERN AAVRTRLTHS MEVQQVGRYI AKEILSRLKS LNTELTGPFE

101 SIVEYACLMH DIAIRRLVIL AKRTINDWFG QRLHPEDAES QPLTDRCSVA

151 ALRLRTGKNR LTSCGARFVR TYVILRGMHK HSPGAYIDAD ESHLGTGWRY

201 FKIYPSGVVA CETPETHHYL MKKPGYYLSE EAYIARLRKE LNLALYSRFP

251 LTWIMEAADD ISYCVADLED AVEKRIFTVE QLYHHLHEAW GQHEKGSLFS

301 LVVENAWEKS RSNSLSRSTE DQFFMYLRVN TLNKLVPYAA QRFIDNLPAI

351 FAGRFNHALL EDASECSDLL KLYKNVAVKH VFSHPDVERL ELQGYRVISG

401 LLEIYRPLLS LSLSDFTELV EKERVKRFPI ESRLFHKLST PHRLAYVEAV

451 SKLPSDSPEF PLWEYYYRCR LLQDYISGMT DLYAWDEYRR LMAVEQ

另一种实施方案中，本发明提供了序列为SEQ ID NO：20的多肽，该多肽为野生型鼠伤寒沙门氏菌dGTP酶多肽：

1 MASIDFRNKI NWHRRYRSPQ GVKTEHEILR IFESDRGRLI NSPAIRRLQQ

51 KTQVFPLERN AAVRTRLTHS MEVQQVGRYI AKEILSRLKE QDRLEEYGLD

101 ALTGPFESIV EMACLMHDIG NPPFGHFGEA AINDWFRQRL HPEDAESQPL

151 THDRCVVFSL RLQKYVRDIC HLKACTREFV CTIRSCGGIL TWAAVRPNFK

201 NIPVPACWPR GRSRIPIRYL MKKPRYYLSE EKYIARLRKE LQLRPYSRFP

251 LTWIMEAADD ISYCVADLED AVEKRIFSVE QLYHHLYHAW CHHEKDSLFE

301 LVVGNAWEKS RANTLSRSTE DQFFMYLRVN TLNKLVPYAQ RFIDNLPQIF

351 AGTFNQALLE DASGFSRLLE LYKNVAVEHV FSHPDVEQLE LQGYRVISGL

401 LDIYQPLLSL SLNDFRELVE KERLKRFPIE SRLFQKLSTR HRLAYVEVVS

451 KLPTDSAEYP VLEYYYRCRL IQDYISGMTD LYAWDEYRRL MAVEQ

另一种实施方案中，本发明提供了序列为SEQ ID NO：21的多肽，该多肽为野生型产酸克雷白氏菌dGTP酶多肽：

1 MAKIDFRNKI NWRRRFRSPP RVETERDILR IFESDRGRIV NSPAIRRLQQ

51 KTQVFPLERN GRVRTRLTHS LEVQQVGRYI AKEVLSRLKE LRLLEEYGLE

101 ELTGPFESVV EMACLMHDIG NPPFGHFGEA AINDWFRQRL APGDALGQPL

151 TDDRCEVQAL RLHDGETSLN ALRRKVRQDL CSFEGNAQGI RLVHTLMRMN

201 LTWAQVGCIL KYTRPAWWSE ETPASHSYLM KKPGYYLAEE EYVARLRKEL

251 DLAPYNRFPL TWIMEAADDI SYCVADLEDA VEKRIFSAEQ LYQHLYDAWG

301 SHVKRSRYSQ VVENAWEKSR ANYLKQSAED QF

本发明进一步提供了仅在某些肠杆菌科细菌物种中发现的肽。下表2列出了这些肽。

表2

物种	位置	序列	SEQ ID NO：
物种	位置	序列	SEQ ID NO：	沙门氏菌	141-147	HPDEAES	22
埃希氏菌	141-147	HPDEAES	22	沙门氏菌	141-147	HPDEAES	22
埃希氏菌	141-147	HPDEAES	22	克雷白氏菌	141-147	APGDALG	23
耶尔森氏菌	141-147	DPNGGGA	24	克雷白氏菌	141-147	APGDALG	23
耶尔森氏菌	141-147	DPNGGGA	24	沙门氏菌	156-159	VVFS	25
埃希氏菌	156-159	SVAA	26	沙门氏菌	156-159	VVFS	25
埃希氏菌	156-159	SVAA	26	克雷白氏菌	156-159	EVQA	27
耶尔森氏菌	156-159	LVNT	28	克雷白氏菌	156-159	EVQA	27
耶尔森氏菌	156-159	LVNT	28	沙门氏菌	163-171	QEGEENLND	29
埃希氏菌	163-171	RDGEEPLNE	30	沙门氏菌	163-171	QEGEENLND	29
埃希氏菌	163-171	RDGEEPLNE	30	克雷白氏菌	163-171	HDGETSLNA	31
耶尔森氏菌	163-171	REGETELNI	32	克雷白氏菌	163-171	HDGETSLNA	31
耶尔森氏菌	163-171	REGETELNI	32	沙门氏菌	221-227	RSRIPIR	33
埃希氏菌	221-227	ETPETHH	34	沙门氏菌	221-227	RSRIPIR	33
埃希氏菌	221-227	ETPETHH	34	克雷白氏菌	221-227	ETPASHS	35
耶尔森氏菌	221-227	DIPTSHN	36	克雷白氏菌	221-227	ETPASHS	35

本发明的多肽和肽为分离的或基本纯化的多肽。特别是本发明分离的多肽基本不是通常存在于肠杆菌科细菌中的那些蛋白质。该多肽的制备物和组合物基本上不是微孔材料。例如，这种制备物和组合物含有少于约30％、20％、10％或5％(干重)的杂蛋白质。

“变异”多肽指除大肠杆菌外的肠杆菌科细菌物种来源的多肽，或任何肠杆菌科细菌dGTP酶来源，通过在该dGTP酶多肽的N末端和/或C末端缺失或添加一个或多个氨基酸；在dGTP酶多肽的一个或多个位点缺失或添加一个或多个氨基酸；或在dGTP酶多肽的一个或多个位点替代一个或多个氨基酸而获得的多肽。因此，本发明的多肽可通过多种不同方式包括氨基酸替代、缺失、平截和插入而改变。

这种变异多肽可能是由于，例如，遗传多态现象或人工操作造成的。这种人工操作方法通常是本领域已知的。例如，通过DNA中的变异可制备多肽的氨基酸序列变体。诱变和改变核苷酸序列的方法是本领域已知的。见例如，Kunkel，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82，488(1985)；Kunkel et al.，methods in Enzymol.，154，367(1987)；U.S.Patent No.4,873,192；Walker and Gaastra，eds.，Techniques inMolecular biology，MacMillan Publishing Company，New York(1983)及此处所引用的文献。在Dayhoff et al.，Atlas of Protein Sequenceand Structure，Natl.Biomed.Res.Found.，Washington，C.D.(1978)的模型中可发现对不影响感兴趣蛋白质的生物学活性的正确氨基酸替代的指导，文献在此引入作为参考。

本发明分离的多肽的变体与SEQ ID NO：19-36中至少约60％的氨基酸位置一致。一种优选实施方案中，多肽变体与SEQ ID NO：19-36中至少约70％的氨基酸位置一致。更为优选的多肽变体与SEQ ID NO：19-36中至少约80％的氨基酸位置一致。还要更为优选的多肽变体与SEQID NO：19-36中至少约90％的氨基酸位置一致。最为优选的多肽变体与SEQ ID NO：19-36中至少约95％的氨基酸位置一致。尤其优选的变异多肽变体与SEQ ID NO：20-36中至少约95％的氨基酸位置一致。这种变体具有dGTP酶活性，并/或可与针对该dGTP酶多肽和肽的抗体进行免疫反应。

独立多肽和多肽变体的氨基酸残基可能是遗传编码的L-氨基酸、自然发生非遗传编码的L-氨基酸、合成的L-氨基酸或上述氨基酸中任意一种的D-异构体。此处表示二十个遗传编码的L-氨基酸和常见非编码氨基酸的氨基酸符号是常规的，且如表3所示。

表3

氨基酸	单字母符号	通用缩写
氨基酸	单字母符号	通用缩写	丙氨酸	A	Ala
精氨酸	R	Arg	丙氨酸	A	Ala
精氨酸	R	Arg	天门冬酰胺	N	Asn
天门冬氨酸	D	Asp	天门冬酰胺	N	Asn
天门冬氨酸	D	Asp	半胱氨酸	C	Cys
谷氨酰胺	Q	Gln	半胱氨酸	C	Cys
谷氨酰胺	Q	Gln	谷氨酸	G	Glu
甘氨酸	H	Gly	谷氨酸	G	Glu
甘氨酸	H	Gly	组氨酸	I	His
异亮氨酸	L	Ile	组氨酸	I	His

亮氨酸	K	Leu
亮氨酸	K	Leu	赖氨酸	M	Lys
蛋氨酸	F	Met	赖氨酸	M	Lys
蛋氨酸	F	Met	苯丙氨酸	P	Phe
脯氨酸	S	Pro	苯丙氨酸	P	Phe
脯氨酸	S	Pro	丝氨酸	T	Ser
苏氨酸	W	Thr	丝氨酸	T	Ser
苏氨酸	W	Thr	色氨酸	Y	Trp
酪氨酸	V	Tyr	色氨酸	Y	Trp
酪氨酸	V	Tyr	缬氨酸		Val
β-丙氨酸		bAla	缬氨酸		Val
β-丙氨酸		bAla	2，3-二氨基丙酸		Dpr
α-氨基异丁酸		Aib	2，3-二氨基丙酸		Dpr
α-氨基异丁酸		Aib	甲基甘氨酸(肌氨酸)		MeGly
鸟氨酸		Orn	甲基甘氨酸(肌氨酸)		MeGly
鸟氨酸		Orn	瓜氨酸		Cit
叔丁基丙氨酸		t-BuA	瓜氨酸		Cit
叔丁基丙氨酸		t-BuA	叔丁基甘氨酸		t-BuG
N-甲基异亮氨酸		MeIle	叔丁基甘氨酸		t-BuG
N-甲基异亮氨酸		MeIle	苯基甘氨酸		Phg
环己基丙氨酸		Cha	苯基甘氨酸		Phg
环己基丙氨酸		Cha	正亮氨酸		Nle
萘基丙氨酸		Nal	正亮氨酸		Nle
萘基丙氨酸		Nal	吡啶基丙氨酸		缩写？
3-4苯噻嗯基丙氨酸		缩写？	吡啶基丙氨酸		缩写？
3-4苯噻嗯基丙氨酸		缩写？	4-氯苯基丙氨酸		Phe(4-Cl)
2-氟苯基丙氨酸		Phe(2-F)	4-氯苯基丙氨酸		Phe(4-Cl)
2-氟苯基丙氨酸		Phe(2-F)	3-氟苯基丙氨酸		Phe(3-F)
4-氟苯基丙氨酸		Phe(4-F)	3-氟苯基丙氨酸		Phe(3-F)
4-氟苯基丙氨酸		Phe(4-F)	青霉胺		Phe
1，2，3，4-四氢-异喹啉-3-		Tic	青霉胺		Phe

羧酸
羧酸		β-2-噻吩基丙氨酸	MSO
蛋氨酸亚砜	hArg	β-2-噻吩基丙氨酸	MSO
蛋氨酸亚砜	hArg	高精氨酸	AcLys
N-乙酰赖氨酸	Dbu	高精氨酸	AcLys
N-乙酰赖氨酸	Dbu	2，4-二氨基丁酸	Phe(pNH2)
ρ-氨苯基丙氨酸	MeVal	2，4-二氨基丁酸	Phe(pNH2)
ρ-氨苯基丙氨酸	MeVal	N-甲基缬氨酸	hCys
高半胱氨酸	hSer	N-甲基缬氨酸	hCys
高半胱氨酸	hSer	ε-氨基己酸	Aha
δ-氨基戊酸	Ava	ε-氨基己酸	Aha
δ-氨基戊酸	Ava	2，3-二氨基丁酸	Dab

本发明范畴包括的多肽变体可以有一个或多个氨基酸被具有相似化学和/或物理属性的氨基酸替代，只要这些变异多肽保留dGTP酶活性并/或仍然可与针对具有SEQ ID NO：19-36序列的dGTP酶多肽的抗体进行免疫反应即可。

可彼此替代的氨基酸通常属于相似种类或亚类。如本领域任何一位技术人员所知，主要根据氨基酸侧链的特性可将氨基酸分为三个主要种类：亲水氨基酸、疏水氨基酸和类似半胱氨酸的氨基酸。这些主要种类可被进一步划分成。亲水氨基酸包括含有酸性、碱性或极性侧链的氨基酸，疏水氨基酸包括含有芳香或非极性侧链的氨基酸。非极性氨基酸可被进一步细分为包括，其中，脂肪族氨基酸。此处所用氨基酸种类定义如下：

“疏水氨基酸”指侧链在生理pH时无电负荷，且被水溶液排斥的氨基酸。遗传编码的疏水氨基酸实例包括Ile、Leu和Val。非遗传编码的疏水氨基酸实例包括t-BuA。

“芳香氨基酸”指侧链含有至少一个具有共价π-电子体系的环(芳基)的疏水氨基酸。该芳基可被进一步地被取代基，如烷基、烯基、炔基、羟基、磺酰基、硝基和氨基以及其它基团取代。遗传编码的芳香氨基酸实例包括苯基丙氨酸、酪氨酸、色氨酸。常见非遗传编码芳香氨基酸包括苯基甘氨酸、2-萘基丙氨酸、β-2-噻吩基丙氨酸、1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸、4-氯苯基丙氨酸、2-氟苯基丙氨酸、3-氟苯基丙氨酸和4-氟苯基丙氨酸。

“非极性氨基酸”指侧链在生理pH时通常无电负荷，且无极性的疏水氨基酸。遗传编码的非极性氨基酸实例包括甘氨酸、脯氨酸和蛋氨酸。非编码的非极性氨基酸实例包括Cha。

“脂肪族氨基酸”指含有饱和或不饱和直链、分支或环状烃侧链的非极性氨基酸。遗传编码的脂肪族氨基酸实例包括Ala、Leu、Val和Ile。非编码的脂肪族氨基酸实例包括Nle。

“亲水氨基酸”指侧链受水溶液吸引的氨基酸。遗传编码的亲水氨基酸实例包括Ser和Lys。非编码的亲水氨基酸实例包括Cit和hCys。

“酸性氨基酸”指侧链pK值小于7的亲水氨基酸。由于缺乏氢离子，酸性氨基酸典型地具有在生理pH下带负电荷的侧链。遗传编码的酸性氨基酸实例包括天门冬氨酸(天冬氨酸盐)和谷氨酸(谷氨酸盐)。

“碱性氨基酸”指侧链pK值大于7的亲水氨基酸。由于水合氢离子的关系，碱性氨基酸典型地具有在生理pH下带正电荷的侧链。遗传编码的碱性氨基酸实例包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。非遗传编码的碱性氨基酸实例包括非环状氨基酸鸟氨酸、2，3-二氨基丙酸、2，4-二氨基丁酸和高精氨酸。

“极性氨基酸”指侧链在生理pH下无电负荷的亲水氨基酸，但侧链所含的一个键中，由两个原子共享的一对电子更接近两个原子中的其中一个。遗传编码的极性氨基酸实例包括天门冬酰胺和谷氨酰胺。非遗传编码的极性氨基酸实例包括瓜氨酸、N-乙酰基赖氨酸和蛋氨酸亚砜。

“类似半胱氨酸氨基酸”指侧链可与另一个氨基酸残基形成共价键，如二硫键的氨基酸。典型地，类似半胱氨酸氨基酸通常具有的侧链中含有至少一个硫醇基(SH)。遗传编码的类似半胱氨酸氨基酸实例包括半胱氨酸。非遗传编码的类似半胱氨酸氨基酸实例包括高半胱氨酸和青霉胺。

如本领域技术人员所理解的，上述分类并非绝对。若干氨基酸表现出超过一种的特有属性，因此可被包括在多个类别中。例如，酪氨酸具有芳环和极性羟基。因此酪氨酸具有双重属性，并可被包括在芳香和极性类别中。类似地，除了可形成二硫键外，半胱氨酸还具有非极性特征。因此，虽然没有被严格地分为疏水或非极性氨基酸，在许多情况中可利用半胱氨酸使肽具有疏水性。

未被遗传编码，且可在本发明的变异多肽中出现或可替代氨基酸的某些常见氨基酸包括，但不仅限于β-丙氨酸(b-Ala)及其它ω-氨基酸，如3-丙氨酸(Dap)、2，3-二氨基丙酸(Dpr)、4-氨基丁酸等等；α-氨基异丁酸(Aib)；ε-氨基己酸(Aha)；δ-氨基戊酸(Ava)；N-甲基甘氨酸(MeGly)；鸟氨酸(Orn)；瓜氨酸(Cit)；叔丁基丙氨酸(t-BuA)；叔丁基甘氨酸(t-BuG)；N-甲基异亮氨酸(MeIle)；苯基甘氨酸(Phg)；环己基丙氨酸(Cha)；正亮氨酸(Nle)；2-萘基丙氨酸(2-Nal)；4-氯苯基丙氨酸(Phe(4-Cl))；2-氟苯基丙氨酸(Phe(2-F))；3-氟苯基丙氨酸(Phe(3-F))；4-氟苯基丙氨酸(Phe(4-F))；青霉胺(Pen)；1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸(Tic)；β-2-噻吩丙氨酸(Thi)；蛋氨酸亚砜(MSO)；高精氨酸(hArg)；N-乙酰基赖氨酸(AcLys)；2，3-二氨基丁酸(Dab)；2，3-二氨基丁酸(Dbu)；p-氨苯基丙氨酸(Phe(pNH2))；N-甲基缬氨酸(MeVal)；高半胱氨酸(hCys)和高丝氨酸(hSer)。这些氨基酸也属于上述定义的分类。

下表4中概括了上述遗传编码和非编码氨基酸的分类。应当理解的是表4仅起说明作用，并不意味完全列举了可能包含此处所描述变异多肽的氨基酸残基。用于形成此处所描述肽和肽类似物的其它氨基酸残基可见于，例如，Fasman，1989，CRC Practical Handbook ofBiochemistry and Molecular Biology，CRC Press，Inc.，该文献被引用在此文中。与特异识别的氨基酸相比，可基于已知性状和/或特有化学和/或物理属性将此处未特别提及的氨基酸方便地分为上述种类。

表4

分类	遗传编码	遗传非编码
分类	遗传编码	遗传非编码	疏水	F，L，I，V
芳香	F，Y，W	Phg，Nal，Thi，Tic，Phe(4-Cl)，Phe(2-F)，Phe(3-F)，Phe(4-F)，吡啶基Ala，苯并噻吩基Ala	疏水	F，L，I，V
芳香	F，Y，W		非极性	M，G，P
脂肪族	A，V，L，I	t-BuA，t-BuG，MeIle，Nle，MeVal，Cha，bAla，MeGly，Aib	非极性	M，G，P
脂肪族	A，V，L，I	t-BuA，t-BuG，MeIle，Nle，MeVal，Cha，bAla，MeGly，Aib	亲水	S，K	Cit，hCys
酸性	D，E		亲水	S，K	Cit，hCys
酸性	D，E		碱性	H，K，R	Dpr，Orn，hArg，Phe(p-NH2)，DBU，A2 BU
极性	Q，N，S，T，Y	Cit，AcLys，MSO，hSer	碱性	H，K，R	Dpr，Orn，hArg，Phe(p-NH2)，DBU，A2 BU
极性	Q，N，S，T，Y	Cit，AcLys，MSO，hSer	半胱氨酸样	C	Pen，hCys，β-甲基Cys

本发明的多肽中，任何氨基酸均可被任何类似分类的氨基酸所替代，从而产生变异肽，只要该肽变体保留dGTP酶活性并/或可与针对含有SEQ ID NO：19-36中任意一种序列的dGTP酶多肽的抗体免疫反应即可。

因此，本发明的多肽包括自然发生的蛋白质，及其变种和改良形式。这种变体仍然具有预期活性。此处所包括的多肽序列的缺失、插入和替代并不被希望会在该多肽特性上产生根本变化。通过常规筛选试验，本领域技术人员可轻易地评估出本发明的多肽和变异多肽的热稳定性和dGTP酶活性。

根据本领域任何一位技术人员所知的任何操作均可评估出dGTP酶及变异dGTP酶多肽的活性。例如，可利用Seto et al.(13)描述的方法，该方法包括对dGTP水解为PPPi的测定。通常，以dGTP、MgCl2和待测试dGTP酶多肽制备混合物。于37℃温育后，终止反应，离心该混合物，酸化并煮沸一份上清液。酸化和煮沸过程将三聚磷酸盐水解为正磷酸盐。继而通过任何可应用方法可测定总正磷酸盐浓度。例如，通过添加可使产物在780nm处被检测出的抗坏血酸盐-钼酸盐溶液，可比色法检测正磷酸盐。

dGTP酶多肽的制备

本领域技术人员可容易地利用这些方法构建含本发明核酸的表达组件和载体，其中本发明核酸编码了带有合适转录/翻译控制信号的dGTP酶多肽。例如，可利用体外重组DNA技术、合成技术和体内重组/遗传技术制获得表达组件和载体。见例如Sambrook et al.，MolecularCloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor LaboratoryPress(2d ed.)(1989)和Sambrook et al.，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press(3ded.)(2001)描述的技术。

通常，表达组件的形式是嵌合DNA，该嵌合DNA可以是包含质粒DNA和编码了感兴趣的一(几)个多肽的核酸的部分表达载体，并且有可促进或终止编码多肽的DNA片段表达的控制序列在其外侧。除了充当适用于dGTP酶多肽的表达组件的核酸以外，表达载体的一部分可能是不被转录的，且发挥了调节、复制或结构功能。表达载体的附加转录部分可以包括可选择的标记、载体-特异复制功能等。在宿主细胞中发挥作用的其它要素，如增强子、聚腺苷酰作用序列等，也可作为表达载体的一部分。通过影响转录、mRNA稳定性或其它影响在宿主细胞中表达载体效果的因素，这种元件可提高dGTP酶核酸的表达。

因此，根据所利用的宿主/载体体系，诸多合适的转录和翻译元件，包括组成型和诱导型启动子、转录增强子元件、转录终止子等中的任何一种均可被用在表达载体中(见如Bitter et al.，1987；WO 97/11761和WO 96/06167)。例如，当在细菌体系中克隆化时，可利用诱导型启动子，如噬菌体λ的pL；plac、ptrup、ptac(ptrp-lac杂交启动子)等。也可利用由重组DNA或合成技术制得的启动子，以使插入编码序列的转录是受控且高水平的。

表达组件可编码其它肽。例如，包含本发明分离的核酸的表达组件可与编码肽、多肽或蛋白质的其它核酸融合形成框架，并作为含有dGTP酶多肽至少一个片段的融合蛋白被表达出来。该实施方案中，分离的核酸包括编码一个致免疫dGTP酶肽的第一个DNA片段和编码载体蛋白的第二个DNA片段。该载体蛋白可帮助相应融合多肽的纯化，并/或可以帮助激活T辅助细胞。该载体蛋白优选地具有低的免疫反应性。

应被导入细胞的表达组件也可含有可选择的标记基因或报告基因，或二者均含有，从而帮助从待转化细胞群体中识别和选择出已转化细胞。可选地，该可选择的标记可被携带在单段DNA上，并被用在共同转化操作中。可选择的标记和报告基因均可有适当调节序列在其外侧，从而实现在宿主细胞中的表达。本领域所熟知的有用可选择标记包括，例如，抗生素抗性基因。

报告基因被用于识别已转化细胞，和评估调节序列的功能性。优选的报告基因编码有可方便鉴定的多肽。本领域已知许多这种报告基因。通常，报告基因是在受体生物体或组织中不出现或不被表达的基因，且该基因编码有可根据一些容易检测的属性，如酶活而说明其表达的多肽。优选基因包括大肠杆菌Tn9来源的氯霉素乙酰基转移酶基因(cat)、大肠杆菌uidA位点的β-葡糖醛酸酶基因(gus)、萤火虫Photinus pyralis来源的荧光素酶基因(luc)。该报告基因的表达是在DNA被导入受体细胞之后的适当时间点检测的。

通过任何适用于导入特定细胞的操作，如磷酸钙沉淀、脂质体转染、显微注射等操作，经过表达组件的转染，可容易地将表达载体导入宿主细胞，如哺乳动物、植物、细菌、酵母或昆虫细胞中，以获得重组细胞，并从而通过宿主细胞表达本发明的肽，如融合蛋白。

本领域技术人员可利用从宿主细胞分离并纯化重组表达蛋白的一般方法。例如，可离心培养基或溶解产物以除去微小的细胞碎片。继而分离出不溶和可溶的多肽成分。然后从可溶成分或不可溶成分中纯化获得本发明的肽，即折射体(见例如，U.S.Patent No.4,518,526，该文献公开内容在此引入作为参考)。根据本领域的标准操作，包括硫酸铵沉淀、亲和层析柱、柱色谱法、凝胶电泳等操作(通常见于Scopes，1982；Deutscher 1990)可纯化该肽。具有至少约90-95％均一性基本纯的组成是优选的，具有98-99％或更高均一性的组成是更为优选的。重组多肽和蛋白质的分离和纯化实例在上文所引Sambrook等人的文献中有所描述。

例如，通过离心，可从肠道或重组细菌细胞中制备获得本发明的dGTP酶多肽。在缓冲溶液中洗涤后，可通过超声处理破坏细胞，并离心澄清超声产物。由于本发明的dGTP酶是热稳定的，超声步骤获得的上清液可在约60℃加热，并通过离心除去沉淀的蛋白质。利用DEAE琼脂糖柱，并采用KCl梯度洗脱可进一步纯化含有dGTP酶多肽的上清液。利用单链DNA纤维素柱可实现进一步的纯化。制备不完全纯化的dGTP酶，并由KCl溶液洗脱杂质之后，采用较高浓度的KCl可从柱中洗脱获得活性dGTP酶。经过加压过滤并透析进必需的新缓冲液中，也可浓缩该dGTP酶。

通过本领域任何一位技术人员所知的任何操作均可评估出dGTP酶的活性。例如，可利用Seto等人(13)所描述的包括对dGTP水解为PPPi进行测定的方法。通常将dGTP、MgCl₂与待检测dGTP酶混合，制备混合物。于37℃温育后，终止反应，离心该混合物，酸化并煮沸一份上清液。酸化和煮沸处理将三聚磷酸盐水解为正磷酸盐。继而通过任何有用的方法均可测定正磷酸盐的总浓度。例如，通过添加可使产物在780nm处被检出的抗坏血酸盐-钼酸盐溶液，可比色地检测正磷酸盐。

抗体

本发明也提供了针对含有例如SEQ ID NO：19-36中任意一个序列的任何肠杆菌科细菌dGTP酶的抗体。更为优选的抗体制剂针对具有SEQID NO：20-36中任意一个序列的肽或多肽。该抗体的免疫活性片段也在本发明范畴内，如F(ab)片段。

通过若干本领域普通技术人员已知的任何技术均可制备获得抗体。见例如，Harlow and Lane，Antibodies：A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory，1988。在一种这样的技术中，将包含有完整dGTP酶多肽或dGTP酶多肽抗原部分的免疫原注射进广泛多种的哺乳动物(如鸟、小鼠、大鼠、兔、绵羊和山羊)中。利用生物学适用的乳化剂，如弗氏不完全佐剂，可使该免疫原结合到载体肽上，并/或将其乳化。将该免疫原注射进动物宿主中，优选地根据预定时间表进行一次或多次加强免疫。

免疫接种后，对该动物定期采血，除去血细胞，以血清(抗血清)为多克隆抗体来源。通过，例如亲和层析法，利用与合适固体支持物联结的多肽，可从这种抗血清中纯化获得多克隆抗体。

通过，例如利用Kohler and Milstein，Eur.J.Immunol.6：511-519，1976的技术及由该技术改进获得的改良技术，可制备特异于感兴趣的抗原多肽的单克隆抗体。简言之，这些方法包括制备能够产生具有预期特异性(即与感兴趣的多肽的反应性)的抗体的永久细胞系。这种细胞系可从，例如上述经免疫动物获得的脾细胞中制得。继而利用本领域熟知的诸多技术中的一种，通过与骨髓瘤细胞融合伴侣融合可永久化该脾细胞，优选的骨髓瘤细胞融合伴侣与经免疫动物同源。

单克隆抗体可从相应的杂交瘤克隆的上清液中分离获得。另外，可应用多种技术以提高产率，如将该杂交瘤细胞系注射进合适的脊椎动物宿主，如小鼠的腹腔。继而可从该宿主的腹水或血液中收获单克隆抗体。

与多克隆抗体相比，单克隆抗体呈现了某些优点。尤其是单克隆抗体具有高度特异和灵敏性，和相对“纯”的免疫化学性。单克隆抗体也适用于重组DNA技术，以制得保留了原始单克隆抗体特异性的其它衍生抗体、人源化或嵌合分子或抗体片段。这种技术可以包括将单克隆抗体的编码有免疫球蛋白可变区或互补决定区(CDRs)的DNA与不同免疫球蛋白的编码有恒定区或恒定区外加框架区的DNA结合，例如，将小鼠来源的单克隆抗体转化为具有大量人类免疫球蛋白特性的单克隆抗体(见例如，EP 184187A和EP 2188638A，在此引入作为参考)。

生物传感器

本发明的抗体或核酸可被吸收或附着到固体支持物或底物上，以便于肠杆菌科细菌的检测。这种环节对识别试样中存在何种细菌是有用的。固体支持物或底物可以是生物传感器或试纸。一定量的抗体和核酸以可与dGTP酶多肽或互补核酸结合的方式结合到固体支持物上。相对于特定底物所用抗体和核酸的量取决于所用特定抗体或核酸、特定底物和抗体-多肽结合或核酸杂交的效率。

本发明的抗体和核酸可以任何合适的方式被结合到底物上。可利用共价、非共价或离子结合方式。通过直接或经由连接部分，将抗体或核酸附着至底物，可实现共价结合。

固体支持物可以是任何可结合抗体或核酸，并可被方便地使用在本发明分析中的不可溶材料。生物传感器或固体支持物可由刚性支柱构成。可选地，抗体或核酸可被结合至任何多孔或液体可渗透材料，如含纤维(纸、毡、硝化纤维素等)条或片，或屏或网状物，或本领域任何一位技术人员可在肠杆菌科细菌鉴定中方便使用的任何复合材料。这种固体支持物包括可渗透和半渗透膜、石英、玻璃珠、塑料珠、乳胶珠、塑料微量滴定孔或试管、琼脂糖或葡聚糖微粒、琼脂糖凝胶和硅藻土。该固体支持物的底物可以是功能化玻璃、石英、Si、Ge、GaAs、GaP、SiO₂、SiN₄、改良硅或广泛多种凝胶或聚合物中的任何一种，如(聚)四氟乙烯、(聚)亚乙烯基二氟化物、聚苯乙烯、聚碳酸酯或其化合物。本领域技术人员参考该公开内容便可容易地发现其它底物材料。优选实施方案中的底物为石英、平板玻璃、硅石或硅片。

固体底物或芯片的表面可由其它材料包被，例如，聚合物、塑料、树脂、多糖、羧甲基葡聚糖、硅石或硅石基础的材料、碳、金属、无机玻璃、膜或上列底物材料中的任何一种。一种实施方案中该底物或芯片是先被一种或多种金属包被，继而被多糖包被的硅片。例如，该底物或芯片可被金、银、铬和/或金属组合或金属层，如铬和金包被。通过电镀、利用喷镀装置或在降低的气压下利用低温泵蒸发器，可进行金属沉积。继而该金属涂层可被多糖，如羧甲基葡聚糖包被。

抗体和核酸的独特类型按可编址行和列可以被排列在底物或芯片上。利用一些操作和装置从这种排列的行和列中读取信息。对简易和/或自动化检测而言，分离的抗体或核酸位点的尺寸是统一的。例如，每一位点可以是正方形、矩形或其它面积为1平方微米到约500平方微米的简单几何形状。该位点的尺寸是随着被吸附或被固定抗体的特异性和亲和力、特定位点抗体的密度，以及检测方法的信号强度或灵敏度而变化的。类似地，位点尺寸是随着核酸探针和目标之间的互补性程度、底物上探针分子的密度以及检测方法的灵敏度而变化的。

通过本领域任何一位技术人员所知可利用的任何方法，可使抗体和核酸探针被吸附、附着或固定在底物或芯片上。通过吸附或共价附着，选择的抗体或探针可被固定在底物、支持物或芯片上。如果选择共价偶联，可应用广泛多种的已知方法，包括以下列功能性基团所衍生的支持物：苯甲酰叠氮、溴乙酰胺、叠氮芳基、醛、异硫氰酸盐、重氮盐、酰基氯、活性酯、亚氨基碳酸盐、酰肼、环氧化物和胺。

一种优选实施方案中，通过表面等离子共振(SPR)检测附着有核酸或抗-dGTP酶抗体的生物传感器。选择的抗体或核酸被偶联至由金包被的石英底物的表面。采用可能含有dGTP酶多肽或核酸的试样，并使其流经生物传感器的表面。漂洗该生物传感器表面后，通过测定生成的表面等离子，确定已结合的dGTP酶多肽或核酸。

尽管本发明方法可与任何检测方法结合使用，包括，例如，横流分析；PCR、ELISA和酶检测，但表面等离子共振技术表现出比其它任何检测方法更高的检测灵敏度和速度(32-34)。生物传感器-表面等离子共振技术可检测纳克级dGTP酶。这种检测灵敏度的数量级超过已公布的PCR基础的检测方法，且在约一半的时间内即可获得结果(29-31)。

一种实施方案中，采用获得自BiaCore.Inc.的CM5未改良生物传感器芯片。该芯片是由薄金层包被，面积约为1平方厘米的石英晶体。附着于金层的是一定范围的羧甲基葡聚糖。为生成适于蛋白质或核酸偶联的反应基团，可容易地改良羧甲基葡聚糖的终端羧基。例如，该芯片表面可与含有100mM N-乙基-N’(二甲基氨丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC)和50mM N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的25mM碳酸氢钠溶液(pH8.5)反应5分钟，继而采用100mM硼酸盐(pH8.5)进行短暂的漂洗。可获得活化的CM5芯片。然后在含有80mM 2-(2-嘧啶二硫基)乙胺(PDEA)和0.1M硼酸盐(pH8.5)溶液中温育该活化芯片4分钟，继而采用0.1M硼酸盐(pH8.5)进行短暂的漂洗。然后使该芯片与已纯化的抗体或核酸溶液接触。最后，钝化所有起反应的二硫化物，通过在含盐(如NaCl)半胱氨酸溶液中浸泡该芯片表面，以除去非共价结合的蛋白质或核酸。

因此，本发明提供了一种生物传感器，该生物传感器包括吸附或共价附着有抗体或核酸的固体底物。该生物传感器的固体底物可以含有某种模式或排列的不同抗体或核酸探针类型。该生物传感器表面也可吸附或共价附着不同浓度的抗体或核酸探针。这种排列密度为每平方厘米至少约10个抗体或核酸探针位点，直到每平方厘米约一百万个抗体或核酸探针位点。

任何表面等离子共振装置均可被用于检测已结合抗原或核酸。一种实施方案中，Texas Instruments portable SPR设备(TISPR-1)是优选的，因为根据检查者或消费者的需要，即使是相对未经培训的人员采用含不同抗-dGTP酶抗体或核酸的多种传感器芯片也可进行领域内的全部检测操作。

dGTP酶检测方法

本发明的dGTP酶核酸和/或dGTP酶可作为检测肠杆菌科细菌方法和便于执行该方法的诊断装置所用的关键基础。通常，本领域任何一位技术人员已知的检测核酸或蛋白质所用的任何操作均可被用于检测此处所描述的dGTP酶多肽和核酸。例如，可利用任何分子生物学技术，包括免疫检测法、杂交或PCR操作。生物物理学检测操作可与诸如表面等离子共振、荧光、横流分析联合应用，或如本领域任何一位技术人员要求分别应用。这些操作提供了检测和识别试样中肠道细菌污染的一种强化且有用的方式。

一种实施方案中，本发明提供了检测试样中肠杆菌科细菌的方法，该方法包括使抗体与试样接触，该抗体可与分离自肠杆菌科细菌的dGTP酶多肽结合，检测试样中dGTP酶多肽是否与抗体结合。这种检测方法是在足以进行抗原-抗体相互作用的温度和条件下进行。

另一种实施方案中，本发明提供了检测试样中肠杆菌科细菌的方法，该方法包括在严格杂交条件下使核酸探针与试样接触，检测核酸探针是否与试样中dGTP酶核酸杂交。可作为适用于肠杆菌科细菌的探针的核酸包括本发明提供的任何核酸，例如，具有SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ IDNO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：18的核酸。

一种实施方案中，本发明提供了可检测试样中任何肠道细菌物种(肠杆菌科细菌)的存在的探针，例如，SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6。不过本发明也提供了检测肠杆菌科中一种或多种选择的细菌物种所用的探针和方法。这种探针和方法在识别试样中所存在的肠杆菌科细菌方面是有用的。因此例如，由含有SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9或SEQID NO：10的核酸制得的探针可在克雷白氏菌、沙门氏菌、志贺杆菌、耶尔森氏菌来源DNA存在下，选择性地与大肠杆菌来源DNA杂交。由含有SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14的核酸制得的探针可在克雷白氏菌或埃希氏菌来源DNA存在下，选择性地与鼠伤寒沙门氏菌来源DNA杂交。由含有SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：18的核酸制得的探针可在沙门氏菌或埃希氏菌来源DNA存在下，选择性地与产酸克雷白氏菌来源DNA杂交。

本发明的检测方法不但不限制杂交和PCR方法，而且还包括了本领域技术人员改进以适用于本发明抗体和dGTP酶多肽的任何免疫学或免疫测定方法。例如，本发明包括检测试样中肠道细菌的方法，该方法包括使试样与包含固体支持物和抗体的生物传感器芯片接触，其中该抗体可与肠杆菌科细菌来源dGTP酶结合；检测dGTP酶是否与该生物传感器芯片结合。

可应用在目前的杂交、免疫学和PCR操作中的试样包括，例如，获自人类或动物的生理性液体和样品、食物样品、水、土壤，以及取自工作区域、柜台、搭架、保存食物或动物的区域、禽类围栏的样品，或取自动物皮肤、毛发或表面的样品。

在诊断试验中可利用抗体，通过其与dGTP酶抗原结合，检测肠杆菌科细菌及其物种的存在。本领域技术人员已知的任何抗体-抗原操作均可被改动，以适用于本发明抗体和dGTP酶多肽。本发明设想的免疫测定优选地包括利用该生物传感器，也可利用其它抗体制备物和操作，如涉及放射免疫测定、ELISA或免疫荧光检验法的抗体制备物和操作。因此，例如，适用于检测抗原，如本发明dGTP酶多肽的免疫测定包括美国专利Nos.3,791,932；3,817,837；3,839,153；3,850,752；3,850,578；3,853,987；3,867,517；3,879,262；3,901,654；3,935,074；3,984,533；3,996,345；4,034,074；和4,098,876中所描述的方法。

一种实施方案中，本发明提供了检测肠杆菌科细菌的方法，该方法是在足以使抗体结合至dGTP酶多肽的条件下，使本发明抗体与试样接触一段时间，以在至少部分抗体和部分dGTP酶多肽之间形成二元复合体。本领域技术人员可容易地确定时间、条件和反应介质。例如，为测定肠杆菌科细菌细胞的存在，可培养一部分样品，而将另一部分样品溶解以获得包含细胞蛋白质的提取物。继而采用该蛋白质提取物温育抗-dGTP酶抗体，如利用此处提供的生物传感器芯片或蛋白质印迹，或此处所提供可与肠杆菌科细菌dGTP酶形成可检测复合体的任何其它抗体制备物。然后测定或检测该复合体的存在或数量，如，通过标记的测定或检测。

任选的，如需要，可在添加抗体之前，或添加抗体至试样中时，或在将未结合抗体漂洗除去之后应用阻滞剂，以阻滞任何与蛋白质，如牛血清白蛋白非特异结合的位点。然后可添加第二种试剂，如与原发抗体Fc结合的抗体。第二次温育后，通过漂洗可除去任何未反应的抗体。从而抗原、一级抗体和二级抗体形成三重复合体。可标记第二种抗体，以便于该三重复合体的检测。这种标记可为，例如，荧光染料。可选的，一级或二级抗体均可结合可检测标记。

这种复合体形成的检测或测定也可以包括可与dGTP酶多肽和抗体，和/或标记、报告分子或其它可检测部分形成的复合体结合的试剂。这种试剂可以是本发明的抗体，或者是可与本发明抗体结合的抗体，或与可检测标记或报告分子结合的抗体。

使用全部、完整抗体对许多免疫测定而言并非必要。相反，可应用单独的抗原结合位点或单链重组抗体。这种抗体结合位点实例是本领域已知的，如本领域所熟知的，分别利用木瓜酶和胃蛋白酶进行蛋白质水解而制备的Fab和F(ab’)₂抗体部分。

一种实施方案中，在涉及DNA扩增的操作中用到本发明的dGTP酶核酸。任何这种DNA扩增操作均可被用在，例如，聚合酶链反应(PCR)试验、链取代扩增和其它扩增操作中。可利用如Walker et al(1992)Nucl.Acids Res.20，1691-1696所描述的链取代扩增。术语“聚合酶链反应”(“PCR”)指K.B.Mullis U.S.Pat. Nos.4,683,195；4,683,202；和4,965,188的方法，在此引入作为参考。Mullis的这些文献描述了无需克隆化或纯化即可提高基因组或其它DNA混合物中目标序列的片段浓度的方法。

扩增目标序列的PCR方法由下述步骤组成，即将大量且过量的两种寡核苷酸引物导入含有预期目标序列的DNA混合物中，继而在DNA聚合酶存在下进行准确顺序的热循环。这两种引物与其双链目标序列的相应链是互补的。为进行扩增，应使该混合物变性，将引物退火至目标分子中的互补序列上。退火后，由聚合酶延伸引物，以形成新的一对互补链。变性、引物退火和聚合酶延伸步骤被术语称为“循环”。可以有无数个循环，且扩增DNA产物的量是随着循环数增加而增加的。因此，为获得高浓度的扩增目标核酸，可进行多的循环。

下文中更为详细地描述了PCR核酸扩增方法中所包括的步骤。为方便讨论，将待扩增的核酸描述为双链的。不过，尽管最终产物通常为双链DNA，但对单链核酸扩增而言，该方法是同样有用的，如mRNA。单链核酸的扩增中，第一步包括采用，例如两种扩增引物中的一种，合成互补链。随后的步骤通常如下进行：

(a)使每条核酸链与四种不同的三磷酸脱氧核苷和适用于待扩增核酸链的一种寡核苷酸引物接触，其中选择的每一个引物与待扩增核酸链的一部分基本互补，因此可从引物合成延伸产物，当将其与其补体分离时，可充当另一个引物合成延伸产物的模板。为促进引物和待扩增核酸链的准确退火，采用可使每个引物与互补核酸链杂交的温度。

(b)引物退火后，采用DNA聚合酶进行引物延伸，即将三磷酸核苷整合进延伸中的核酸链中，该核酸链与被引物杂交的链互补。通常，在有效于提高酶活和合成“全长”互补核酸链的温度下和持续时间里，进行该引物的延伸反应，它通过完全的第二引物结合而延伸。不过，该温度并未高到可使每一延伸产物从其核酸模板链分离的程度。

(c)然后在足以使引物延伸产物与其互补模板分离的温度下，将(b)步骤中的混合物加热一段时间。所选择的温度并未高到可使混合物中存在的DNA聚合酶发生不可逆变性的程度。

(d)在有效于促进引物与(b)步骤中得到的每一个单链分子杂交的温度下，将(c)步骤中的混合物冷却一段时间。

(e)在足以促进由DNA聚合酶进行的引物延伸，以生成“全长”延伸产物的温度下和时间段保持(d)步骤的混合物。该温度未高到可使每一延伸产物与互补链模板分离的程度。重复步骤(c)-(e)，直到获得预期扩增水平为止。

本发明也包括了检测试样中存在的dGTP酶核酸或多肽所用的试剂和试剂盒。这种试剂或试剂盒可含有处于不会反作用于预期试验中抗体活性的液体，如盐溶液中的本发明纯化的抗体。另一种试剂或试剂盒可含有处于不会反作用于预期试验中核酸杂交的液体中的本发明分离的抗体。还有另一种试剂或试剂盒可含有处于不会反作用于预期试验中那些多肽活性的液体中的本发明分离的多肽。可选的，试剂或试剂盒可能含有如上所论述附着在底物上的纯化的抗体、多肽或核酸。优选的底物是不可溶的固体支持物，如此处所描述的生物传感器或微量滴定板的孔。

因此，一种实施方案中，本发明提供了一种试剂盒，该试剂盒包含附着有抗体的本发明的生物传感器或固体支持物，该抗体可与肠杆菌科细菌dGTP酶结合。该试剂盒可含有对照样品。对照样品包括，例如肠杆菌科细菌dGTP酶的一个或多个样品。该试剂盒也可包含引导进行本发明方法的溶液，例如稀释试样、温育带有生物传感器或抗体-固体支持物的试样、洗涤任何未结合试样的溶液。该试剂盒也可含有在生物传感器与试样接触之前或期间与生物传感器接触的阻滞剂。优选的对照和其它溶液均为无菌，且不含有可能干扰已结合dGTP酶检测的物质。

另一种实施方案中，本发明提供了一种试剂盒，该试剂盒包含附着有抗体的本发明的生物传感器或固体支持物，该抗体可与可能含有一种或多种肠杆菌科细菌的试样中的dGTP酶核酸结合。该试剂盒可含有对照试样。对照试样包括，例如肠杆菌科细菌dGTP酶核酸的一个或多个样品。该试剂盒也可含有引导进行本发明方法的溶液，例如稀释试样、温育带有生物传感器或抗体-固体支持物的试样、洗涤任何未结合试样的溶液。优选的对照和其它溶液均为无菌，且不含有可能干扰dGTP酶核酸检测的物质。

本发明的任何一种试剂盒也可提供不干扰抗原-抗体或杂交复合体的标记或报告分子。这种标记或报告分子可与生物传感器、核酸或抗体分开包装。

体现本发明的一个方面，即有用于检测dGTP酶核酸的试剂盒形式的直观诊断体系，是至少一个含有本发明核酸探针的容器或小瓶，例如，具有SEQ ID NO：2-18序列中一个或多个序列的核酸。

标记核酸、多肽和抗体

本发明利用了标记抗体、标记核酸探针和标记dGTP酶多肽。可应用的标记包括放射性核素、荧光标记、化学发光标记、比色染料、酶、酶底物、酶辅因子、酶抑制剂、酶亚单位、金属离子、微粒等。通常作为报告分子或标记使用的放射性同位素包括³²P、¹²⁵I和¹³¹I。通常作为报告分子或标记使用的酶包括如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、β-D-半乳糖苷酶和葡萄糖氧化酶。通常采用的荧光报告分子或标记包括，例如，染料如异硫氰酸荧光素(FITC)、荧光素、若丹明、若丹明B异硫氰酸盐(RITC)、四甲基若丹明异硫氰酸盐(TRITC)、4，4’-二异氰硫基二苯乙烯-2，2’-二磺酸(DIDS)。见例如U.S.PatentNos.3,766,162；3,791,932；3,817,837；和4,233,402。其它通常采用的标记或报告分子类型包括德克萨斯红、藻红蛋白、伞形酮、鲁米诺、NADPH等。

根据标记特性可应用不同的技术以检测并定量存在的标记。对荧光标记而言，可利用大量不同的荧光计和荧光显微镜。对化学发光标记而言，可利用光度计或胶片。产生荧光、化学发光或有色产物的酶可通过荧光测定、光度测定、分光光度测定或目测的方法检测。这种标记可被应用在此处所描述的免疫测定和杂交试验中。

在例如Leary et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)(1983)80：4045；Renz and Kurz，Nucl.Acid Res.(1984)12：3435；Richardson and Gumport，Nucl.Acid Res.(1983)11：6167；Smithet al.，Nucl.Acid Res.(1985)13：2399；及Meinkoth and Wahl，Anal，Biochem.(1984)138：267中报告了提供与核酸结合的标记的不同途径。这些标记可与互补序列共价或非共价地结合。因此，例如通过羧基、巯基、胺、肼或其它功能性，可使不同标记附着到抗体、核酸或多肽上，并对这些实体的复杂结构或杂交无不利影响。

通过下列实施例将进一步描述本发明。

实施例1：材料和方法

大体步骤

所有细菌菌株均购自American Type Culture Collection(ATCC)。ATCC保存的若干菌株见表5所列。如Miller(18)所描述内容实现细菌生长条件及培养。根据以牛血清白蛋白(BSA)为标准的Bradford(19)方法，或采用计算的摩尔吸收系数为86,300M^-1cm^-1的分光光度测定的方法，测定蛋白质浓度。总蛋白质浓度为dGTP酶四聚体的浓度。

根据Siegel and Monty(21)，采用Sephacryl S-300进行分析凝胶过滤试验。按照Laemmli(22)制作、运行并加工蛋白质SDS PAGE凝胶。

根据Wurgler and Richardson(23)进行单链DNA结合试验。采用NewEngland Biolabs，Inc.的VENT热聚合酶，并根据生产商提供的说明进行DNA的聚合酶链反应(PCR)扩增。所有的PCR反应均于Techne，Inc.的ProGene热循环控制装置中进行。

酶试验操作

以与Seto et al.(13)描述内容相似的方式，通过测定dGTP水解为Norit不可吸附的PPPi，进行酶试验操作。温育的混合物体积为55μl，包括2.0mM dGTP；67mM甘氨酸，pH8.5；6.7mM MgCl₂；和0.02-0.2毫单位的酶。于37℃温育20分钟后，添加Norit A的酸性悬浮液以终止反应。离心该混合物，将一份上清液加入0.15N HCl中，沸腾15分钟。操作中的该步骤将使三聚磷酸盐水解为正磷酸盐。通过添加抗坏血酸盐-钼酸盐溶液可比色测定总正磷酸盐浓度。于45℃温育该混合物15分钟后在780nm处测定吸收。将结果与磷酸盐标准曲线对照。在这些条件下，一个单位的酶形成1μmol的三聚磷酸盐。通过在标准试验中添加50μg/mL m13mp18DNA可测定ssDNA的刺激效应。

大肠杆菌粗dGTP酶的纯化

以1％接种量接种至Luria培养基中，收获前使细胞在37℃生长10小时。典型地，每升获得4g细胞。10,000xg离心沉淀细胞10分钟后，在一体积10mM Tris-HCl，pH8.0溶液中重新悬浮细胞。再次如上离心细胞后，再次于两体积含有10mM Tris，pH8.0、1mM EDTA、1mM叠氮化钠的溶液(缓冲液I)中重新悬浮细胞。采用Branson超声仪在冰上超声破碎细胞。12,000xg离心20分钟以澄清提取物，将上清液称为级分I。所有随后的色谱分析步骤均于室温下进行。

于60℃水浴加热级分I，并伴以轻微震荡。在此阶段形成了大量沉淀。加热处理后，在冰浴中将蛋白质溶液立即冷却至4℃。通过两次各30分钟、15,000xg的连续离心澄清上清液。将第二次离心步骤所获澄清的上清液部分中的蛋白质称为级分II。

将级分II上样至4.9cm²×30cm、浸有缓冲液I的DEAE Sepharose(Sigma Chemical Co.)柱中。采用0-0.5M KCl的凹形梯度，流速为2.0mL/min洗脱酶。含有dGTP酶活性的主要峰是0.35M KCl洗脱获得的宽峰。收集该活性峰中心部位的90％，定为级分III。

将该级分立即上样至经缓冲液I平衡过的单链DNA纤维素柱

(4.9cm²×15cm)中。上样后，先以5个柱体积缓冲液I，继而以10个柱体积缓冲液I和1.0M KCl洗涤该柱。采用10个柱体积缓冲液I和3.0M KCl从柱中洗脱获得活性dGTP酶。加压过滤经过半透膜(Amicon YM3)以浓缩该均一酶，并透析进新缓冲组分中以备需要。

粘质沙雷氏菌粗dGTP酶的纯化

如上述将沙雷氏菌培养物来源的酶制备为级分III。由于该酶不能与ssDNA结合，所以采用可选纯化方案。将级分III上样至预填的MonoQ柱(BioRad Labs Inc.，柱体积为1.0mL)中，该柱已经由缓冲液I平衡过。以50mL 0-1.0M NaCl线性梯度，流速为3.0mL/min进行洗脱。大约在梯度洗脱中途，从柱中洗脱出活性dGTP酶。收集活性峰开始部分的90％，于4℃采用缓冲液I进行透析，构成级分IV。

将级分IV上样至预填的Mono S柱(BioRad Inc.，柱体积为1.0mL)中，该柱已经由缓冲液I平衡过。以50mL 0-2.0M KCl凹形梯度，流速为2.0mL/min从该柱中洗脱获得酶。在梯度的第一个四分之一期间从柱中洗脱出该酶。收集活性峰中心部位的95％，构成级分V。

最终纯化步骤由以下操作组成，将级分V dGTP酶(未预先透析)上样至浸在缓冲液I中，尺寸为90cm×4.9cm²的Sephacryl 200-HR尺寸排阻柱。收集完整的dGTP酶洗脱峰(可通过SDS-PAGE目测)，并定为均一的级分VI酶。加压过滤经过半透膜(Amicon YM3)浓缩酶，并将其透析进新的缓冲组分中，以备需要。所有随后的研究均采用级分VI蛋白进行。

重组酶表达

采用pET12d载体和获自Novagen Inc.的T7 RNA聚合酶过表达体系实现表达。以1％接种量，将含有表达质粒结构(对大肠杆菌而言是pEdgte，对粘质沙雷氏菌而言是pSdgte)的BL21(DE3)-pLysS细胞接种进补充有60mg/mL氨苄青霉素的Luria培养基中，于37℃生长。当细胞的A595值达到0.8时(约在接种后三个小时)，添加IPTG至终浓度为0.5mM。收获前使细胞继续生长5个小时。如上纯化该酶。

多克隆抗体的制备

制备针对埃希氏菌或沙雷氏菌dGTP酶的抗-dGTP酶多克隆抗体(pAb)。通过将均一的dGTP酶(300mg)与弗氏完全佐剂以1∶1的匀浆比例皮下注射进雌性新西兰白兔体内，以诱导中和抗dGTP酶抗体。以每周一次的间隔将辅以不完全佐剂的抗原(200mg)注射三次。最后一次注射后一周，经由耳部插管对这些兔子进行采血。通过14,000xg离心收集清澈的血浆，并于4℃保存直到使用。

多克隆抗体的纯化

通过在DEAE Affi-gel Blue上进行亲和层析将pAbs纯化至均一。应用BioRad Labs，Inc.兔多克隆抗体分离试剂盒，并根据所提供的说明，且有一些较小改动。方法如下：使清澈的兔血清(5mL)通过Econo-Pac 10DG脱盐柱。采用所提供的工作缓冲液(0.02M TrisHCl(pH8.0)，0.028M NaCl)将pAbs从柱中洗脱出来，并收集作为单一级分。采用Bradford试验测定蛋白质浓度。

将全部的血清样品(约25mL)分为5mL分批通过柱子。批与批之间，以40mL工作缓冲液(2个柱体积)洗涤该柱。收集单次柱运行获得的最终脱盐样品。将该收集样品一次上样至DEAE Affi-gel Blue上，以5个柱体积的工作缓冲液(50mLs)洗涤该柱，通过应用5个柱体积洗脱缓冲液(0.025M Tris HCl(pH8.0)，0.025M NaCl)可从该柱中洗脱获得pAb级分。将该洗脱物质收集为5mL级分。通过SDSPAGE估计该IgG级分的纯度。收集合适的级分，通过加压过滤浓缩为2mg/mL，并于-70℃保存直到需要。通过先采用含有2M NaCl、1.5M硫氰酸钠的工作缓冲液(10个柱体积)洗涤，继而通过在工作缓冲液中重新平衡，可更新该DEAE Affi-gel Blue柱。所有色谱分析步骤采用流速均保持在1.0mL/min。

ELISAs和蛋白质印迹分析

根据Kaiser and Pollard(24)，或根据Quirk et al.(25)描述方法进行ELISA试验。使10μg部分纯化的蛋白质提取物，或1μg纯化的dGTP酶被吸附到96孔微量滴定板(Immulon 2，Dynatech Labs)的表面。采用补充有10％脱脂干奶粉的磷酸盐缓冲溶液(PBS)将孔封闭后，将以不同稀释度稀释在封闭缓冲液中的多克隆抗体添加进孔内，并使其在室温与抗原反应1小时。随后在PBS中洗涤三次，通过与辣根过氧化物酶(Santa Cruz Biotechnology，Inc.)结合的山羊抗-兔二级抗体实现目测。以1∶2000稀释度将该二级抗体添加进封闭缓冲液中，并于室温温育1小时。在PBS中洗涤三次后，通过添加含有50mM柠檬酸钠、50mM柠檬酸、1mg/mL邻苯二胺和0.006％H₂O₂的溶液实现显色。适当显色后(典型地在室温温育5-10分钟)，添加50μL2M的硫酸，以终止反应并使产物稳定。采用自动ELISA读板仪(Molecular Dynamics，Inc.)在490nm处测定吸收。根据(26)完成蛋白质印迹，并用于分析抗体特异性和交叉反应性。

pAb库与CNBr活化琼脂糖的结合

室温下，在使用CNBr活化树脂(Sigma Chemical Co.)前立即将其置于大约200mL的0.001N HCl中预膨胀。该树脂的偶联能力为1g干树脂偶联10mg的蛋白质。在4℃采用偶联缓冲液(0.1M H₃BO₃、25mMNa₂B₄O₇、75mM NaCl，pH8.4)透析该纯化的pAb库过夜。将树脂倒入scintered玻璃漏斗中，并采用偶联缓冲液(每1mL树脂需要大约25mL缓冲液)进行粗略洗涤。从滤器移除树脂，并将其与pAb库混合。室温下温育该混合物4小时，并伴以稳定的轻微摇动，继而于4℃温育过夜。在玻璃滤器上收集树脂。为计算偶联收率(通常大于90％)，通过Bradford试验测定保留滤液中的蛋白质浓度。为封闭残余未反应的CNBr基团，从滤器移除免疫亲和树脂，并将其重新悬浮于15mL 1M乙醇胺(pH8.0)中。于室温温育2小时后(伴以稳定的轻微摇动)，收集玻璃滤器上的树脂，并先采用硼酸盐缓冲液(0.1M H₃BO₃、25mMNa₂B₄O₇、1M NaCl；pH8.4)，继而采用醋酸盐缓冲液(75mM NaCOOCH₃、1M NaCl)进行粗略洗涤(通常每次需要10个体积)。利用该洗涤步骤除去未共价结合的蛋白质。最后，采用偶联缓冲液洗涤该树脂(通常10体积)，并将其重新悬浮于过量体积的Tris缓冲溶液(TBS)，pH7.6中，于4℃保存直到使用。利用该免疫亲和树脂从其它肠杆菌科物种中纯化dGTP酶的方法如下所述。

通过免疫亲和层析分析分离肠道dGTP酶s

利用20mL免疫亲和树脂从2升过夜培养物(30℃于LB培养基中生长12小时)中纯化肠道细菌dGTP酶。如下从该树脂中制备粗蛋白提取物。为沉淀细菌细胞，于6,000xg离心培养物。将沉淀重新悬浮于40mL 30mM甘氨酸(pH7.5)中，并再次离心。将最终沉淀重新悬浮于10mL 30mM甘氨酸(pH7.5)中，并采用配有微小尖端的Branson超声仪对该悬浮液进行三个循环的超声处理。如无其它说明，所有操作均于4℃进行。10,000xg离心该超声产物20分钟，澄清该上清液并保存。

将该粗蛋白提取物加热至60℃，维持15分钟，并伴以轻微搅拌。该温育过程中形成了奶白色沉淀。通过10,000Xg离心20分钟以澄清该溶液。再次澄清上清液并保留。使该粗提取物与0.1体积5％的硫酸链霉素混合，于冰上温育60分钟，并12,000xg离心20分钟。采用2mL 30mM Kpi(pH7.5)边缓慢混合边搅拌地碾磨离心所得的沉淀，继而如前重新离心。采用30mM Kpi(pH7.5)于4℃透析最终的上清液过夜。然后将透析产物加热至60℃，维持15分钟，并伴以缓慢的搅拌，再将其10,000xg离心20分钟，将离心上清液澄清。继而使蛋白质级分与亲和树脂制备物结合，并在冰上温育8小时，并伴以偶尔的搅拌。将该浆状物倒入柱中。先采用50mL 20mM甘氨酸(pH7.5)，再采用20ml含有20mM甘氨酸(pH7.5)、3M硫氰酸钾的溶液洗涤该柱，流速为每小时10ml。收集洗脱蛋白，作为单一级分，并立即加压过滤通过半透膜(Amicon)将其浓缩到0.1mL体积。4℃下采用20mMKPi(pH7.5)对最终样品进行粗略透析。为获得足够的研究样品，需进行若干次这种纯化操作。

生物传感器芯片设计

从BiaCore，Inc.获得CM5未改良生物传感器芯片(27)。该芯片是面积为1平方厘米，由薄金层包被的石英晶体。附着金层的是一定范围的羧甲基葡聚糖。为生成蛋白质偶联所需的反应基团，可容易地将终端羧基改变。连接反应开始于芯片范围的活化。使该芯片与含有100mM N-乙基-N’(二甲基氨丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC)和50mM N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的25mM碳酸氢钠溶液(pH8.5)反应5分钟，继而采用100mM硼酸盐(pH8.5)进行短暂的漂洗。在含有80mM 2-(2-嘧啶二硫基)乙胺(PDEA)、0.1M硼酸盐(pH8.5)的溶液中温育该活化的CM5芯片4分钟，继而采用0.1M硼酸盐(pH8.5)进行短暂的漂洗。然后使该芯片与含有浓度为0.05mg/ml已纯化pAb的溶液(200μl)接触10分钟。最后，钝化所有起反应的二硫化物，通过将芯片表面浸润在含有50mM半胱氨酸、1M NaCl的200μl溶液中10分钟，以除去非共价结合的蛋白质。所有反应均在室温下进行。根据生产商提供的说明，在BiaCore表面等离子设备中使用最终的生物传感器。经过传感器表面的流速为每分钟50μl。

实施例2：

肠杆菌科细菌dGTP酶之间的免疫学关系

通过利用纯化的抗-dGTP酶多克隆抗体(pAbs)，并结合针对蛋白质的酶分析，验证若干肠杆菌科细菌物种之间dGTP酶的免疫学关系。该方法具有高度灵敏性，并对dGTP酶活性具有特异性。表5提供了如实施例1所描述被部分纯化的若干肠杆菌科物种来源dGTP酶(级分II和III)的比活性和广义抗体反应性。观察与两种分离的抗体制备物的免疫学反应性：抗-大肠杆菌dGTP酶和抗-粘质沙雷氏菌dGTP酶。

表5

细菌类型

比活性(单位/mg)

pAB反应性¹

细菌物种 ATCC No. 级分II 级分III 抗-E 抗-S

戴氏西地西菌 33431 1.4 20.0 ++ -

弗氏柠檬酸杆菌 8090 0.8 15.0 + -

产气肠杆菌 13048 0.6 11.0 - +++

大肠杆菌 25257 1.3 27.0 +++ -

大肠杆菌0157：H7 35150 1.2 25.0 +++ -

大肠杆菌0111 33780 1.3 26.0 +++ -

大肠杆菌0124：NM 43893 1.3 25.8 +++ -

费格森埃希氏菌 35469 1.2 26.2 +++ -

蜂房哈夫尼亚菌 29926 0.5 9.0 - ++

产酸克雷白氏菌 43165 2.3 20.6 + -

肺炎克雷白氏菌 13883 2.2 20.2 + -

奇异变形杆菌 7002 3.1 19.9 - +

普通变形杆菌 13315 2.8 18.6 - ++

肠炎沙门氏菌 13076 1.5 14.8 ++ -

鸡沙门氏菌 9184 1.7 14.2 ++ -

伤寒沙门氏菌 6539 1.2 14.3 ++ -

鼠伤寒沙门氏菌 14028 1.1 14.0 ++ -

粘质沙雷氏菌 8100 1.6 17.3 - +++

气味沙雷氏菌 33077 1.5 17.0 - +++

鲍氏志贺氏菌 9207 2.4 19.7 +++ -

痢疾志贺氏菌 13313 2.3 19.0 +++ -

小肠结肠炎耶尔森氏菌 23715 0.6 8.4 - +++

中间耶尔森氏菌 29909 0.8 9.1 - +++

¹通过随抗大肠杆菌(E)或抗粘质沙雷氏菌(S)dGTP酶多克隆抗体变化的酶活损失测定相应的反应性。+++为高度反应；++为中度反应；+为轻微反应；-为不反应。

可见酶比活性范围是从比大肠杆菌来源dGTP酶观测到的酶比活性稍低到比其稍高。贯穿部分纯化操作，所有肠道细菌dGTP酶均表现出相似的分离性状，说明不同dGTP酶的许多物理化学属性是相似的。不过，如表5所示，不同dGTP酶的免疫学反应性是不一致的。

此外，针对一种类型dGTP酶的抗体会抑制仅从肠杆菌科细菌物种的一个子集来源dGTP酶的酶活。测试针对大肠杆菌或粘质沙雷氏菌酶的多克隆抗体抑制不同细菌中dGTP酶活性的能力。如图1-4所示，抗体抑制dGTP酶活性的能力取决于产生抗体的抗原来源。抗体抑制作用对pAb浓度的依赖性也见图1-4所示。

图1显示的是抗-大肠杆菌dGTP酶多克隆抗体对分离自小肠结肠炎耶尔森氏菌(空心圆)、产气肠杆菌(实心三角形)、普通变形杆菌(空心菱形)、产酸克雷白氏菌(空心三角形)、鼠伤寒沙门氏菌(空心方形)、鲍氏志贺氏菌(实心圆)，及戴氏西地西菌的dGTP酶活性的影响。于25℃使酶(级分III)与不同量pAb一起温育15分钟，继而通过放射性分析三聚磷酸盐产量，以测定残留酶活(16)。将对照酶制备物(无添加pAb)的百分比活性任意设定为100％。沙门氏菌、志贺氏菌和西地西菌三种测试的肠道细菌受抗-埃希氏菌pAbs有效地抑制。变形杆菌、耶尔森氏菌和肠杆菌三种测试物种不受添加的pAb制备物的抑制。克雷白氏菌受添加的抗-埃希氏菌pAbs抑制，但效果仅为沙门氏菌、志贺氏菌和西地西菌的一半。

如上检定抗-粘质沙雷氏菌dGTP酶pAbs对这些dGTP酶活性的抑制能力，如图2所示。在抗粘质沙雷氏菌dGTP酶存在下，分离自鼠伤寒沙门氏菌(空心方形)、产酸克雷白氏菌(空心三角形)、鲍氏志贺氏菌(实心圆)、普通变形杆菌(空心菱形)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(空心圆)、蜂房哈夫尼亚菌(实心菱形)、产气肠杆菌(实心三角形)，及粘质沙雷氏菌(实心方形)的dGTP酶活性如图2所示。抗-粘质沙雷氏菌dGTP酶pAbs并不明显改变克雷白氏菌、沙门氏菌或志贺氏菌的酶活。不过这些抗体在抑制肠杆菌、耶尔森氏菌酶活方面是有效的，且对变形杆菌则是较低程度的抑制。所以在pAb存在下酶活的损失可被用于分析不同物种来源dGTP酶的功能性关系或交叉反应性。与ELISA分析相比，该方法也是灵敏且相对快速的分析方法。

通过ELISA分析进一步的免疫学交叉反应性，如图3所示。通过二级抗体与任意已结合pAb的反应，观测抗-埃希氏菌dGTP酶pAbs与大肠杆菌0157(实心圆)、鲍氏志贺氏菌(空心圆)、鼠伤寒沙门氏菌(实心方形)、产酸克雷白氏菌(实心三角形)、产气肠杆菌(实心菱形)、戴氏西地西菌(空心方形)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(空心菱形)，及弗氏柠檬酸杆菌(空心三角形)来源的未固定dGTP酶s的反应性。抗-埃希氏菌dGTP酶pAbs与志贺氏菌、西地西菌、沙门氏菌、克雷白氏菌来源的酶有效结合，与柠檬酸杆菌则是较低程度的结合。pAbs也与其它埃希氏菌种来源dGTP酶结合。ELISA分析显示对肠杆菌或耶尔森氏菌dGTP酶无反应性。

如图4所示，通过ELISA分析与不同dGTP酶结合的抗-沙雷氏菌dGTP酶pAbs。使鼠伤寒沙门氏菌(实心三角形)、大肠杆菌(空心三角形)、蜂房哈夫尼亚菌(空心方形)、产气肠杆菌(实心圆)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(空心圆)，及普通变形杆菌(实心方形)来源的级分III酶制备物被吸附在微量滴定板上，并采用二级抗体检测已结合抗-沙雷氏菌dGTP酶pAbs的量。抗-沙雷氏菌dGTP酶抗体制备物可有效地检测肠杆菌、耶尔森氏菌、变形杆菌和哈夫尼亚菌来源的抗原。采用这些抗-沙雷氏菌pAbs不能检测沙门氏菌和埃希氏菌来源dGTP酶。这些ELISA结果与图1和2所示的酶活损失结果完全一致，并概括于表5中。

显然，仅利用大肠杆菌和粘质沙雷氏菌来源的抗体制备物检测所有主要肠道细菌来源dGTP酶是可能的。此外，仅利用这两种抗体制备物，区分检测的细菌物种之间差异也是可能的。这种差异可以帮助识别试样中存在的细菌物种。

应用抗-沙雷氏菌或抗-埃希氏菌免疫亲和柱，以分离九种肠道细菌来源几乎同源的dGTP酶制备物。图5A提供了免疫亲和柱纯化酶的SDS PAGE分析结果。九种细菌来源免疫纯化的dGTP酶均可水解dGTP为脱氧鸟苷和三聚磷酸盐。且均为热稳定的。除沙雷氏菌dGTP酶外，所有分离的dGTP酶均可与单链DNA结合。不过，尽管大部分dGTP酶是四聚体，沙雷氏菌dGTP酶是二聚体。表6概括了这些结果。

表6

dGTP酶稳定性结构 ssDNA结合

细菌物种

Km kcat 65℃下的t1/2(μM) (s^-1) (min)

四级结构

Ka 刺激(M^-1×10⁶)(倍数)

戴氏西地西菌 7.9 3379 16.8 5.3 1.5

产气肠杆菌 5.6 3720 23.0 四聚体 5.6 1.5

大肠杆菌0157：H7 6.2 4032 21.5 四聚体 6.3 1.7

大肠杆菌 6.0 4020 22.0 四聚体 6.2 1.6

蜂房哈夫尼亚菌 9.1 3655 17.5 四聚体 4.7 1.4

肺炎克雷白氏菌 6.0 4002 23.0 四聚体 6.0 1.5

普通变形杆菌 3.7 4112 31.5 四聚体 7.1 1.9

肠炎沙门氏菌 6.2 3218 23.3 四聚体 6.1 1.6

粘质沙雷氏菌 3.0 3975 18.7 二聚体 nd* 1.0

小肠结肠炎耶尔森氏菌 5.8 3982 27.0 四聚体 7.0 1.8

*nd.无可检测的结合

图5B显示这些研究中所用到的抗-沙雷氏菌和抗-埃希氏菌dGTP酶抗体对dGTP酶检测具有特异性，且不与粗提物中其它细菌蛋白交叉反应。如图5B所示在蛋白质印迹中仅观测到单一条带，表明抗-沙雷氏菌pAbs仅可检测沙雷氏菌dGTP酶，抗-埃希氏菌pAbs仅可检测埃希氏菌dGTP酶。没有观测到交叉反应性。酶研究进一步证实该观测结果，其中抗-沙雷氏菌pAbs不能明显地与埃希氏菌dGTP酶结合，且不能抑制埃希氏菌相关物种来源dGTP酶的酶活，反之亦然。对肠道细菌污染的准确诊断测试构成而言，这种免疫特异性是高度优选的。

实施例3：肠杆菌科细菌检测所用的生物传感器芯片

为便于检测肠道细菌dGTP酶，制得并利用了生物传感器芯片。采用实施例1中描述的诱导硫醇偶联方法，通过附着抗-埃希氏菌或抗-沙雷氏菌dGTP酶pAbs改良CM5芯片的表面。在采用BiaCore 2000表面等离子共振(SPR)装置对肠道细菌dGTP酶进行的检测中应用到这些生物传感器。

这些试验结果如图6和7所示。图6提供了表面等离子共振(SPR)传感图结果，该结果显示了束缚的抗-大肠杆菌dGTP酶pAbs与大肠杆菌(Ec)、鲍氏志贺氏菌(Sb)、戴氏西地西菌(Cd)、产酸克雷白氏菌(Ko)、鼠伤寒沙门氏菌(St)、弗氏柠檬酸杆菌(Cf)和产气肠杆菌(Ea)来源细菌粗提物的反应性。如图6所示，抗-大肠杆菌dGTP酶pAbs与大肠杆菌(Ec)、鲍氏志贺氏菌(Sb)、鼠伤寒沙门氏菌(St)和戴氏西地西菌(Cd)的反应最为强烈。

图7提供了表面等离子共振(SPR)传感图结果，该结果显示了束缚的抗-粘质沙雷氏菌dGTP酶pAbs与粘质沙雷氏菌(Sm)、产气肠杆菌(Ea)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Ye)、普通变形杆菌(Pv)、大肠杆菌(Ec)、及鼠伤寒沙门氏菌(St)的细菌粗提物的反应性。如图7所示，抗-粘质沙雷氏菌dGTP酶pAbs与粘质沙雷氏菌(Sm)、产气肠杆菌(Ea)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Ye)和普通变形杆菌(Pv)的反应最为强烈。

图6和7中所示的传感图是高度可重现的，具有跨越结合等温线的标准偏差为±1％的信号强度。该生物传感器芯片可被重复使用达10次而没有SPR信号衰减。

两种生物传感器芯片皆具有检测细菌粗提物中dGTP酶的能力，并且可区分不同类型的dGTP酶。SPR体系中所观测到的结合相互反应亲和力反映了ELISA试验所观测到的结果。另外，如传感图结合等温线所示，生物传感器可差别检测细菌物种。如革兰氏阳性，非肠道细菌(金黄色葡萄球菌，图6中标为Sa)的几乎平直的结合等温线所证明的，几乎没有可检测的背景结合(即使采用蛋白粗提物)，

为确定体系中的检测范围，采用增加量的dGTP酶滴定上文所用到的芯片。试验结果如图8所示。带有抗-埃希氏菌pAbs的芯片可检测1pg纯化的大肠杆菌dGTP酶。当带有抗-沙雷氏菌pAbs的芯片与纯化的沙雷氏菌dGTP酶反应时，可观测到相似的检测限度。

因此，如此处描述所制备的多克隆抗体制备物可在其它细菌蛋白背景中特异地检测少量酶，并完全在400秒内完成。这种差别反应性说明在复杂试样中不仅可检测到肠杆菌科细菌，还可识别肠杆菌科细菌的类型。

实施例4：

肠杆菌科细菌的PCR检测和识别

本发明提供了可用于检测试样中所存在的肠杆菌科细菌，并可识别其物种的核酸。该实施例中，在一系列聚合酶链反应(PCR)扩增试验中用到该核酸，证实本检测和识别方法的特异性和灵敏性。

采用大肠杆菌基因的DNA序列(SEQ ID NO：1，图9)，识别并合成可扩增任何肠道细菌dgt基因的PCR引物(表7)。识别并合成分离的PCR引物，该引物可特异性扩增单一肠道细菌物种来源的dgt序列(表7a-7c)。成对使用该引物，并标为引物对1-13，如表6和7a-7c所示。

表7

扩增任何肠道细菌dgt基因序列的寡核苷酸引物对

引物对序列 SEQ ID SEQ ID NO：1 扩增的DNA

编号 NO：中的位置长度(bp)

1 CCACTGGAGCGCAATG 2 166-181 184

1 TGCATCAGGCATGACAT 3 334-350 184

2 CCACTGGAGCGCAATG 2 166-181 215

2 AAAATGACCAAACGGCGG 4 364-381 215

3 GGGCGCTACATCGC 5 229-242 121

3 TGCATCAGGCATGACAT 3 334-350 121

4 GGGCGCTACATCGC 5 229-242 152

4 AATGACCAAACGGCGG 6 364-381 152

表8a

特异扩增大肠杆菌dgt核酸的寡核苷酸引物对

引物对序列 SEQ ID SEQ ID NO：1 扩增的DNA

编号 NO：中的位置长度(bp)

5 GCTGCAGCGTGGCGGCA 7 461-477 213

5 CTCAGGCGTTTCGCCACG 8 656-673 213

6 CCCGGAAGATGCCGAAA 9 423-439 251

6 CTCAGGCGTTTCGCCACG 8 656-673 251

7 CCCGGAAGATGCCGAAA 9 423-439 82

7 CGGTTCTTCCCCGTCCC 10 488-504 82

表8b

特异扩增鼠伤寒沙门氏菌核酸的寡核苷酸引物对

引物对序列 SEQ ID SEQ ID NO：1 扩增的DNA

编号 NO：中的位置长度(bp)

8 GCTGTGTGGTTTCCTCG 11 461-477 213

8 AATCCGGCACCGGCCCTC 12 656-673 213

9 TCCGGAAGATGCGGAAA 13 423-439 251

9 AATCCGGCACCGGCCCTC 12 656-673 251

10 TCCGGAAGATGCGGAAA 13 423-439 82

10 ATTTTCTTCACCTTCCT 14 488-504 82

表8c

扩增产酸克雷白氏菌核酸的寡核苷酸引物对

引物对序列 SEQ ID SEQ ID NO：1 扩增的DNA

编号 NO：中的位置长度(bp)

11 GCTGCGAAGTGCAGGCC 15 461-477 213

11 TGGCCGGCGTCTCCTCAG 16 656-673 213

12 GCCCGGCGATGCGCTCG 17 423-439 251

12 TGGCCGGCGTCTCCTCAG 16 656-673 251

13 GCCCGGCGATGCGCTCG 17 423-439 82

13 CGATGTCTCTCCGTCAT 18 488-504 82

采用New England Biolabs，Inc.的VENT热聚合酶，并根据生产商提供的说明进行DNA的聚合酶链反应(PCR)扩增。所有PCR反应均于Techne，Inc.的ProGene热循环控制装置中进行。通常，在1.2％琼脂糖凝胶上进行尺寸分离后，通过溴化乙锭染色便可目测到扩增产物。

图10说明本发明方法可检测试样中少到10-100个肠杆菌科细菌。采用引物对1以扩增泳道1中大约1000个大肠杆菌、泳道2中大约100个细菌、及泳道3中大约10个大肠杆菌细菌来源的184bp片段。仅进行三十个循环的PCR反应。在最初的凝胶中泳道3的条带仅为可见，其上仅出现模板DNA的约10个拷贝。

表7a-7c提供的引物对指定物种的肠杆菌科细菌具有特异性。图11说明被设计为特异于埃希氏菌的引物对5仅扩增分离自埃希氏菌的DNA。当模板DNA来源自克雷白氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌或耶尔森氏菌时，没有观测到DNA扩增。

此外，即使扩增反应中存在DNA混合物和超过一组引物，表7a-7c提供的引物仍然可区分DNA底物。如图12和13所说明的，设计物种特异引物对，以使由其扩增的不同长度的条带成为一种便于识别混合培养物中特定细菌类型的方式。

图12显示了在不同引物存在且可能竞争引物结合和扩增的条件下，本发明提供的物种特异引物可区分不同类型肠杆菌科细菌DNA。扩增从大约200cfu的两种肠杆菌科细菌获得的DNA混合物。于1.2％琼脂糖凝胶上分离该扩增产物，并由溴化乙锭染色。试样中所存在的细菌DNA种类，以及测试扩增特异性所用引物提供如下。

泳道细菌引物对条带大小(bp)

1 埃希氏菌+克雷白氏菌 7和11 82(埃希氏菌)+213(克雷白氏菌)

2 埃希氏菌+沙门氏菌 7和8 82(埃希氏菌)+213(沙门氏菌)

3 沙门氏菌+克雷白氏菌 8和13 213(沙门氏菌)+82(克雷白氏菌)

4 克雷白氏菌+埃希氏菌 6 251(埃希氏菌)

5 沙门氏菌+埃希氏菌 6 251(埃希氏菌)

如表7a-7c所示，将引物对5、6和7设计为特异于埃希氏菌；引物对8、9和10设计为特异于沙门氏菌；引物对11、12和13设计为特异于克雷白氏菌。实际应用的每一引物对均合成了特定细菌物种的预计大小的DNA片段。因此本发明方法可区分相应肠杆菌科细菌来源的DNA，并可正确识别混合细菌培养物中存有的细菌物种。图12显示可结合使用引物对，以扩增混合培养物中细菌来源的dgt序列。

当目测到多个条带时(如图12中所示，例如泳道1)，便可直接进行识别。最后，可采用PCR为基础的测试，以扩增样品中的dgt遗传物质。图13显示了采用多重引物进行系列扩增的结果。样品为商业鸡只的密封包装底部发现的液体。结果清楚地表明该液体含有相当量的肠道细菌(泳道1和7)，为埃希氏菌(泳道2和6)，不是克雷白氏菌(泳道3)，沙门氏菌(泳道4和5)。该结果也表明如单独泳道中缺乏多余条带所证实的那样，以PCR为基础的测试不能扩增伪造的材料，并且该测试不受血清或液体中其它组分抑制。

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Claims

1.分离的核酸，该核酸包括SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ IDNO：17、或SEQ ID NO：18。

2.分离的核酸，该核酸包括SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ IDNO：17、或SEQ ID NO：18，并且该核酸选择性地与肠杆菌科细菌来源的DNA杂交。

3.分离的核酸，该核酸包括SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQ IDNO：9，或SEQ ID NO：10，并且选择性地与大肠杆菌来源的DNA杂交。

4.权利要求3的分离的核酸，其中该核酸在肠杆菌科中至少一种其它细菌物种来源的DNA存在下，选择性地与大肠杆菌来源的DNA杂交。

5.权利要求3的分离的核酸，其中该核酸在克雷白氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌或耶尔森氏菌来源的DNA存在下，选择性地与大肠杆菌来源的DNA杂交。

6.分离的核酸，该核酸包括SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12，SEQ IDNO：13，或SEQ ID NO：14，并且选择性地与鼠伤寒沙门氏菌来源的DNA杂交。

7.权利要求6的分离的核酸，其中该核酸在肠杆菌科中至少一种其它细菌物种来源的DNA存在下，选择性地与鼠伤寒沙门氏菌来源的DNA杂交。

8.权利要求3的分离的核酸，其中该核酸在克雷白氏菌或埃希氏菌来源的DNA存在下，选择性地与鼠伤寒沙门氏菌来源的DNA杂交。

9.分离的核酸，该核酸包括SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16，SEQ IDNO：17，或SEQ ID NO：18，并且选择性地与产酸克雷白氏菌来源的DNA杂交。

10.权利要求9的分离的核酸，其中该核酸在肠杆菌科中至少一种其它细菌物种来源的DNA存在下，选择性地与产酸克雷白氏菌来源的DNA杂交。

11.权利要求9的分离的核酸，其中该核酸在沙门氏菌或埃希氏菌来源的DNA存在下，选择性地与产酸克雷白氏菌来源的DNA杂交。

12.生物传感器芯片，该芯片含有包括SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQID NO：8，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：17，或SEQ ID NO：18的核酸。

13.一种检测试样中肠道细菌的存在的方法，该方法包括在严格杂交条件下使试样与探针接触，和检测探针与试样中核酸之间的杂交，其中该探针包括SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ IDNO：5，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13，SEQID NO：14，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：17，或SEQID NO：18。

14.权利要求13的方法，其中该肠道细菌属于肠杆菌科。

15.权利要求13的方法，该方法进一步包括DNA扩增。

16.权利要求15的方法，其中DNA扩增是通过聚合酶链反应进行的。

17.一种检测试样中任何肠道细菌物种的存在的方法，该方法包括在严格杂交条件下使试样与探针接触，和检测探针与试样中核酸之间的杂交，其中该探针包括SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，或SEQ ID NO：6。

18.权利要求17的方法，其中该肠道细菌属于肠杆菌科。

19.权利要求17的方法，该方法进一步包括DNA扩增。

20.权利要求19的方法，其中DNA扩增是通过聚合酶链反应进行的。

21.一种检测试样中埃希氏菌的存在的方法，该方法包括在严格杂交条件下使试样与探针接触，和检测探针与试样中核酸之间的杂交，其中该探针含有包括SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9，或SEQ ID NO：10的分离的核酸。

22.权利要求21的方法，其中该探针在克雷白氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌或耶尔森氏菌来源的DNA存在下，选择性地与大肠杆菌来源的DNA杂交。

23.权利要求21的方法，该方法进一步包括DNA扩增。

24.权利要求23的方法，其中DNA扩增是通过聚合酶链反应进行的。

25.一种检测试样中沙门氏菌的存在的方法，该方法包括在严格杂交条件下使试样与探针接触，和检测探针与试样中核酸之间的杂交，其中该探针含有包括SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13，或SEQ ID NO：14的分离的核酸。

26.权利要求25的方法，其中该探针在克雷白氏菌或埃希氏菌来源的DNA存在下，选择性地与鼠伤寒沙门氏菌来源的DNA杂交。

27.权利要求25的方法，该方法进一步包括DNA扩增。

28.权利要求27的方法，其中DNA扩增是通过聚合酶链反应进行的。

29.一种检测试样中克雷白氏菌的存在的方法，该方法包括在严格杂交条件下使试样与探针接触，和检测探针与试样中核酸之间的杂交，其中该探针含有包括SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：17，或SEQ ID NO：18分离的核酸。

30.权利要求29的方法，其中该探针在沙门氏菌或埃希氏菌来源的DNA存在下，选择性地与产酸克雷白氏菌来源的DNA杂交。

31.权利要求29的方法，该方法进一步包括DNA扩增。

32.权利要求31的方法，其中DNA扩增是通过聚合酶链反应进行的。

33.一种检测试样中肠道细菌的方法，该方法包括使试样与生物传感器芯片接触，该生物传感器具有固体支持物和可结合至肠杆菌科细菌来源的dGTP酶的抗体；和检测dGTP酶是否与该生物传感器芯片结合；其中该抗体针对具有SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：23，SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：30，SEQID NO：31，SEQ ID NO：32，SEQ ID NO：33，SEQ ID NO：34，SEQ IDNO：35，或SEQ ID NO：36的肽。

34.分离的抗体，该抗体选择性地与肠杆菌科细菌来源dGTP酶结合，其中该抗体针对具有SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：23，SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：30，SEQID NO：31，SEQ ID NO：32，SEQ ID NO：33，SEQ ID NO：34，SEQ IDNO：35，或SEQ ID NO：36的多肽。

35.一种检测试样中肠杆菌科细菌的方法，该方法包括在足以使抗体结合至dGTP酶多肽的条件下，使权利要求34的分离的抗体与试样接触一段时间，以在至少部分抗体和部分dGTP酶多肽之间形成二元复合体，并检测该二元复合体。

36.一种从肠杆菌科细菌分离dGTP酶多肽的方法，该方法包括使可能含有肠杆菌科细菌来源dGTP酶的试样与被附着到固体支持物上的权利要求34的抗体接触，洗涤该固体支持物，并洗脱肠杆菌科细菌来源dGTP酶多肽。

37.生物传感器芯片，该芯片包括固体支持物和可与肠杆菌科细菌来源的dGTP酶选择性地结合的抗体。

38.权利要求36的生物传感器芯片，其中该抗体针对具有SEQ IDNO：20，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：23，SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：30，SEQ IINO：31，SEQ ID NO：32，SEQID NO：33，SEQ ID NO：34，SEQ ID NO：35，或SEQ ID NO：36的多肽。

39.生物传感器芯片，该芯片包括固体支持物和可与编码肠杆菌科细菌来源dGTP酶的核酸选择性地杂交的核酸探针。

40.权利要求38的生物传感器芯片，其中该探针为包含SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：17，或SEQ ID NO：18的核酸。