CN1610510A - 含有肌醇六磷酸酶的动物食物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了通过和在酵母中表达的肌醇六磷酸酶联合喂以食品而提高含有肌醇六磷酸盐的食品的营养价值的方法。该方法包括和在酵母中表达的肌醇六磷酸酶联合对动物喂以食品的步骤，其中肌醇六磷酸酶选自AppA1，AppA2，和AppA的定点突变体，本发明还能减小饲料与增重之比和提高动物的骨质量和矿物质含量。还描述了含有AppA2或AppA的定点突变体的食品和饲料添加剂。

Description

含有肌醇六磷酸酶的动物食物和方法
发明领域
本发明涉及一种改善食品的营养价值的方法和改进的食品。更特别地，本发明涉及一种通过和在酵母中表达的肌醇六磷酸酶联合对动物喂以食品而改善含有肌醇六磷酸盐的食品的营养价值的方法。
发明背景和概述
肌醇六磷酸酶是肌醇六磷酸盐磷酸水解酶，它催化无机正磷酸盐从肌醇六磷酸盐(肌醇六磷酸盐)一步步去除。肌醇六磷酸盐是磷酸盐在植物饲料包括谷类和豆类中的主要贮存形式。因为单胃动物例如猪，家禽，和人在他们的胃肠道中几乎没有肌醇六磷酸酶，几乎所有摄取的肌醇六磷酸盐是不消化的。因此，这些动物需要在它们的饮食中补充肌醇六磷酸酶或无机磷酸盐。相反，反刍动物在瘤胃中有微生物，其产生肌醇六磷酸酶，这些动物不需要在它们的饮食中补充肌醇六磷酸酶。
在单胃动物中没有被利用的肌醇六磷酸盐产生另外的问题。没有被利用的肌醇六磷酸盐被排泄在粪肥中并且污染环境。此外，单胃动物中，肌醇六磷酸盐通过上胃肠道经过大量保持完整，在那里它们螯合必需矿物质(例如，钙和锌)，结合氨基酸和蛋白质，并且抑制酶活性。因此，在单胃动物的饮食中补充肌醇六磷酸酶不只是降低了补充无机磷酸盐的要求，而且还减小了肌醇六磷酸盐引起的环境污染，减小肌醇六磷酸盐的抗营养作用，并且提高了饲料的营养价值。
有两种类型的肌醇六磷酸酶，包括3-肌醇六磷酸酶(EC.3.1.3.8)，其去除肌醇环的1和3位的磷酸盐基团，和6-肌醇六磷酸酶(EC.3.1.3.6)，其首先游离肌醇环的6位的磷酸盐。植物通常含有6-肌醇六磷酸酶和广泛范围的微生物，包括细菌，有丝真菌，和酵母，产生3-肌醇六磷酸酶。已经对来自黑曲霉(Aspergillus niger)的两种肌醇六磷酸酶，phyA和phyB进行了克隆和测序。PhyA在黑曲霉中表达，并且可商购重组酶用于补充动物饮食。
从土曲霉(Aspergillus terreus)，Myceliophthorathermophila，烟曲霉(Aspergillus fumigatus)，Emericellanidulans，Talaromyces thermophilus，大肠杆菌(appA)，和玉米中也已经分离出了肌醇六磷酸酶基因。另外，从芽孢杆菌属，肠杆菌属，Klebsiella terrigena，和无花果曲霉(Aspergillus ficum)已经分离和/或纯化出肌醇六磷酸酶。
肌醇六磷酸酶生产的高成本限制了肌醇六磷酸酶在家畜业中的应用，因为肌醇六磷酸酶添加物一般比比较不环保的无机磷添加物更昂贵。通过提高生产效率和/或制备具有优越活性的酶能降低肌醇六磷酸酶的成本。
能使用酵母表达系统有效生产酶，部分因为酵母在简单的便宜的培养基中生长。另外，具有合适的信号序列，表达的酶可以被分离到培养基中用于常规分离和纯化。这样的酵母表达系统在食品工业也被接受为对于食品生产是安全的，不象真菌表达系统，真菌表达系统在某些情况下是不安全的，例如，对于人用食品生产。
因此，本发明的一方面是通过对食品补充以具有卓越的从食品中的肌醇六磷酸酶释放磷酸盐的能力的酵母表达的肌醇六磷酸酶而改善食品的营养价值的方法。本发明还涉及含有酵母表达的肌醇六磷酸酶的具有改善的营养价值的食品。能有效而廉价地生产肌醇六磷酸酶，因为本发明的酵母表达的肌醇六磷酸酶适合在最低限度加工的饲料和食物工业中商业化应用。
在一个实施方案中，提供了一种通过提高来自肌醇六磷酸盐的磷酸盐的生物可利用率而改善单胃动物消耗的食品的营养价值的方法，其中所述食品含有肌醇六磷酸盐。该方法包括与每千克食品少于1200单位的在酵母中表达的肌醇六磷酸酶联合对动物施用食品的步骤，其中肌醇六磷酸酶是大肠杆菌-生产的AppA2，并且与通过与相同单位的在非酵母宿主细胞中表达的肌醇六磷酸酶联合喂养食品而获得的来自肌醇六磷酸盐的磷酸盐的生物可利用率相比，其中来自肌醇六磷酸盐的磷酸盐的生物可利用率被提高至少2-倍。
在另一个实施方案中，提供了一种通过对动物供给含有肌醇六磷酸盐的食品而降低单胃动物饲料与增重的比例的方法。该方法包括与在酵母中表达的肌醇六磷酸酶联合对动物供给食品的步骤，其中肌醇六磷酸酶选自大肠杆菌-生产的AppA2和大肠杆菌-生产的AppA的定点突变体，并且其中动物的饲料与增重的比例被降低。
在另一个实施方案中，提供了一种通过提高动物的骨质量和矿物质含量而改善单胃动物消费的食品的营养价值的方法，其中所述食品含有肌醇六磷酸盐。该方法包括与在酵母中表达的肌醇六磷酸酶联合对动物供给食品的步骤，其中肌醇六磷酸酶选自大肠杆菌-生产的AppA2和大肠杆菌-生产的AppA的定点突变体，并且其中动物的骨质量和矿物质含量被提高。
在另一个实施方案中，提供了用于对动物饲料添加的饲料添加组合物。所述饲料添加组合物含有酵母表达的肌醇六磷酸酶和用于肌醇六磷酸酶的载体，其中饲料添加组合物中肌醇六磷酸酶的浓度大于最终饲料混合物中肌醇六磷酸酶的浓度。
在另一个实施方案中，提供了食品。所述食品含有上述饲料添加组合物，其中最终饲料混合物中肌醇六磷酸酶的浓度小于每千克最终饲料混合物1200单位的肌醇六磷酸酶。
在另一个实施方案中，提供了改善单胃动物消耗的食品的营养价值的方法，其中所述食品含有肌醇六磷酸盐。该方法包括将选自大肠杆菌-生产的AppA2和大肠杆菌-生产的AppA的定点突变体的肌醇六磷酸酶喷雾干燥，将肌醇六磷酸酶与肌醇六磷酸酶的载体混合，任选地，和产生用于对食品补充肌醇六磷酸酶的饲料添加组合物的其他成分混合，将饲料添加组合物与食品混合，及对动物供给补充有饲料添加组合物的食品的步骤。
在另一个实施方案中，提供了一种通过提高来自肌醇六磷酸盐的磷酸盐的生物可利用率而改善鸟类消费的食品的营养价值的方法，其中所述食品含有肌醇六磷酸盐。该方法包括与每千克食品少于1200单位的在酵母中表达的肌醇六磷酸酶联合对鸟类提供食品的步骤，其中与通过与在酵母中表达的肌醇六磷酸酶联合对非鸟类喂养而获得的来自肌醇六磷酸盐的磷酸盐的生物可利用率相比，来自肌醇六磷酸盐(phytate)的磷酸盐的生物可利用率被提高至少1.5-倍。
在另一个实施方案中，提供了一种通过对鸟类供给含有肌醇六磷酸盐的食品而降低鸟类饲料与增重的比例的方法。该方法包括与在酵母中表达的肌醇六磷酸酶联合对鸟类供给食品的步骤，其中动物的饲料与增重的比例被降低。
在另一个实施方案中，提供了一种通过提高鸟类的骨质量和矿物质含量而改善鸟类消费的食品的营养价值的方法，其中所述食品含有肌醇六磷酸盐。该方法包括与在酵母中表达的肌醇六磷酸酶联合对鸟类供给食品的步骤，其中鸟类的骨质量和矿物质含量被提高。
在另一个实施方案中，提供了一种改善鸟类消费的食品的营养价值的方法，其中所述食品含有肌醇六磷酸盐。该方法包括与在酵母中表达的肌醇六磷酸酶联合对鸟类供给食品的步骤，其中鸟类产生卵的数目与产生的卵的重量提高。
附图的简要描述
图1说明AppA2的氨基酸和核苷酸序列。
图2说明突变体U的氨基酸和核苷酸序列。
图3说明用补充有Natuphos，突变体U，AppA或AppA2的动物饲料喂养的小鸡体内生物可利用磷酸盐增加百分比。
本发明的详细描述
本发明提供一种改善动物消费的食品的营养价值的方法，其中所述食品含有肌醇六磷酸盐，本发明肌醇六磷酸酶的底物。该方法包括与在酵母中表达的肌醇六磷酸酶联合对动物提供食品的步骤，其中来自肌醇六磷酸盐的磷酸盐的生物可利用率提高，饲料与增重之比减小，动物的骨质量和矿物质含量增加，或者，对于鸟类，另外地，产卵的卵重或数目增加。肌醇六磷酸酶可以选自大肠杆菌-产生的AppA2和大肠杆菌-产生的AppA2的定点突变体。在另一个实施方案中，对于鸟类，肌醇六磷酸酶可以是任何肌醇六磷酸酶，包括选自大肠杆菌-产生的AppA，大肠杆菌-产生的AppA2和大肠杆菌-产生的AppA的定点突变体的肌醇六磷酸酶。在一些实施方案中，与非酵母宿主细胞中表达的相同重量百分比的肌醇六磷酸酶联合提供食品而获得的营养值的改善相比，例如对于鸟类，例如家禽，来自肌醇六磷酸盐的磷酸盐的生物可利用率，饲料与增重之比，骨质量和矿物质含量均被改善至少2-倍。与非酵母宿主细胞中表达的相同重量百分比的肌醇六磷酸酶联合提供食品而获得的营养值的改善相比，对于猪，来自肌醇六磷酸盐的磷酸盐的生物可利用率也被提高至少1.5-倍。另外，和与酵母中表达的肌醇六磷酸酶联合对非鸟类提供食品而获得的来自肌醇六磷酸盐的磷酸盐的生物可利用率和骨质量和矿物质含量相比，与酵母表达的肌醇六磷酸酶联合对鸟类提供食品而获得的来自肌醇六磷酸盐的磷酸盐的生物可利用率和骨质量和矿物质含量提高至少1.5-倍。
这里使用的″改善营养值″或″提高营养值″意思是通过提高对动物提供的食品中来自肌醇六磷酸盐的磷酸盐的生物可利用率，降低饲料与增重之比，提高骨质量和矿物质含量，提高来自肌醇六磷酸盐的肌醇的生物可利用率，提高对动物提供的食品中来自肌醇六磷酸盐的矿物质例如镁，锰，钙，铁和锌的生物可利用率，或者对于对鸟类提供的食品来说提高产卵的卵重或数目(例如，对于产蛋母鸡第一次或后来的产蛋)而反映的食品的营养价值的提高。
这里使用的″来自肌醇六磷酸盐的磷酸盐的生物可利用率″的提高意思是通过增重或骨灰重量的增加反映的来自肌醇六磷酸盐的磷酸盐的生物可利用率的提高。
这里使用的术语″非酵母宿主细胞″包括真菌细胞。
如这里使用的，术语″肌醇六磷酸酶″意思是能催化无机磷酸盐从肌醇六磷酸盐去除的酶。
如这里使用的，术语″肌醇六磷酸盐″意思是含有肌醇六磷酸盐的组合物。
根据本发明，通过增重除以饲料摄取计算饲料与增重之比。胫骨或腓骨干重的增加或者灰分重量的增加反映骨质量或矿物质含量的增加。
多种肌醇六磷酸酶基因可以被表达产生用于本发明的肌醇六磷酸酶。根据本发明能使用的基因的例子是来自细菌，丝状真菌，植物，和酵母的肌醇六磷酸酶基因，例如来自大肠杆菌(E.coli)的appA(Gene Bank登记号M58708)和appA2(Gene Bank登记号250016)基因和来自真菌黑曲霉的phyA和phyB基因，或者保留或者具有改进的肌醇六磷酸盐磷酸水解酶活性的这些基因的任何定点突变体。
肌醇六磷酸酶基因可以从分离的微生物例如细菌，真菌或酵母获得，它们表现出特别高的肌醇六磷酸酶活性。如下所述，从这样一种大肠杆菌分离物克隆appA2基因，它是这样一种肌醇六磷酸酶基因的例子。
表达的肌醇六磷酸酶基因可以是异源基因，或者可以是同源基因。异源基因在这里定义为从表达该基因物种之外的不同物种来源的基因。例如，在异源肌醇六磷酸酶基因表达的情况下，来自大肠杆菌或另一种细菌的肌醇六磷酸酶基因可以在酵母物种例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或巴斯德氏毕赤氏酵母(Pichiapastoris)中表达。这里描述的同源基因是来源于用于该基因表达的相同物种的基因。在表达同源肌醇六磷酸酶基因的情况下，可以在例如相同的酵母物种中表达来自酿酒酵母的肌醇六磷酸酶基因。
根据本发明使用的产生肌醇六磷酸酶中使用的举例的基因是appA，appA2，和appA或appA2的定点诱变基因。其中得到的表达的肌醇六磷酸酶或者其片段基本上保持和这里具体例示的肌醇六磷酸酶相同的肌醇六磷酸酶活性的取代，缺失，和截短的肌醇六磷酸酶基因被认为是例示的肌醇六磷酸酶基因的等同物，并且在本发明的范围内。
appA基因是从大肠杆菌中分离的(参见美国专利No.6,451,572，这里引作参考)。appA2基因是从杂种Hampshire-Yorkshire-Duroc猪结肠内含物获得的表现出特别高的肌醇六磷酸酶活性的细菌菌落分离的(参见美国专利申请No.09/540,149，这里引作参考)。AppA2蛋白质产物表现出大约2.5和大约3.5之间的pH最佳值。SEQ ID Nos.：2，3，和10中给出AppA2的氨基酸序列。图1说明AppA2的氨基酸序列和核苷酸序列。小写字母指示没有翻译的区。下划线序列是用来扩增appA2(Pf1：1-22，和K2：1468-1490)，appA2(E2：243-252，和K2：1468-1490)的引物。框中是可能的N-糖基化位点。appA2的序列已经传送给Genebank数据库，登记号是250016。SEQ ID No.：1所示是AppA2的核苷酸序列。
有人分离出了几种appA的定点突变体(参见PCT公开No.WO01/36607 A1(美国专利申请No.60/166,179，这里引作参考))。设计这些突变体强化AppA酶的糖基化作用。突变体包括A131N/V134N/D207N/S211N，C200N/D207N/S211N(突变体U)，和A131N/V134N/C200N/D207N/S211N(参见Rodriguez等，Arch.ofBiochem.and Biophys.382：105-112(2000)，这里引作参考)。突变体U具有比AppA高的特异活性，并且，和AppA2一样，具有大约2.5和大约3.5之间的pH最佳值。突变体U中的C200N突变在缺口区并且C200与AppA中形成独特的二硫键中的C210有关。图2显示突变体U的氨基酸序列和核苷酸序列。SEQ ID No.：5中给出突变体U的氨基酸序列，SEQ ID No.：4中给出突变体U的核苷酸序列。
根据本发明可以使用本领域技术人员公知的任何酵母表达系统或其他真核表达系统。例如，各种酵母表达系统描述于美国专利申请No.09/104,769(现在是美国专利No.6,451,572)，美国专利申请No.09/540,149，和美国专利申请No.60/166,179(PCT公开No.WO01/36607 A1)，所有的在此引作参考。可以使用这些酵母表达系统的任何种。或者，可以使用其他真核表达系统，例如昆虫细胞表达系统(例如，Sf9细胞)，真菌细胞表达系统(例如，木霉菌属)，或者哺乳动物细胞表达系统。
能使用酵母表达系统来制备足够量的从酵母细胞分泌的肌醇六磷酸酶，这样能方便地分离肌醇六磷酸酶并且从培养基中纯化。能指导酵母细胞表达肌醇六磷酸酶的信号肽(例如phyA信号肽或酵母α-因子信号肽)控制向培养基中的分泌。适合有利于从酵母细胞分泌肌醇六磷酸酶的其他信号肽对于本领域技术人员是公知的。一般在分泌之后从肌醇六磷酸酶裂解信号肽。
如果使用酵母表达系统，可以使用任何适合肌醇六磷酸酶基因表达的酵母属种，这样的酵母属种是例如糖酵母属(例如，酿酒酵母)，克鲁维氏酵母属，Torulaspora species，裂殖酵母属，和甲基营养酵母属例如毕赤氏酵母属(Pichia species)(例如，巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris))，汉逊氏酵母属(Hansenula species)，球拟酵母属(Torulopsis species)，假丝酵母属(Candida species)，和Karwinskia species。在一个实施方案中，肌醇六磷酸酶基因在甲基营养酵母巴斯德毕赤氏酵母中表达。甲基营养酵母能利用甲醇作为产生保持细胞功能所必须的能源的唯一碳源，并且包含用于甲醇使用的醇氧化酶的基因。
可以使用技术人员公知的并且与酵母或其他真核细胞表达系统相容的任何宿主载体系统(例如其中载体自主复制或者整合到宿主基因组中的系统)。在一个实施方案中，载体具有用于插入DNA片段的限制性内切核酸酶切割位点，和用于选择转化体的遗传标记。例如，在酵母中，肌醇六磷酸酶基因能与能指导肌醇六磷酸酶表达的启动子功能连接，在一个实施方案中，肌醇六磷酸酶基因读框内与转录增强元件剪接并且具有用于转录中止的终止子序列(例如，HSP150终止于)。启动子可以是组成型的(constitutive)(例如，3-磷酸-甘油酯激酶启动子或α-因子启动子)或者可诱导启动子(例如，ADH2，GAL-1-10，GAL7，PH05，T7，或金属硫蛋白(metallothionine)启动子)。各种宿主-载体系统描述于美国专利申请No.09/104,769(现在的美国专利No.6,451,572)，美国专利申请No.09/540,149，和美国专利申请No.60/166,179(PCT公开No.WO 01/36607 A1)，所有的文献在此引作参考。
应用本领域技术人员公知的方法用包括与酵母表达系统操作连接的肌醇六磷酸酶基因的基因-载体构建体转化酵母细胞。这样的转化方案包括电穿孔和原生质体转化。
利用各种各样的技术培养转化的酵母细胞，包括在液体培养基中或者在半固体培养基上间歇式和连续式发酵。用于酵母细胞的培养基是本领域公知的，并且一般补充有碳源(例如，葡萄糖)。30℃下在控制的pH环境(pH大约6)有氧培养转化的酵母细胞，碳源(例如，葡萄糖)持续保持在已知支持酵母细胞特定时间范围内生长至期望的密度的预计水平。
根据本发明使用的酵母表达的肌醇六磷酸酶可以通过常规技术制备成纯化形式(例如，至少大约60％纯，或者至少大约70-80％纯)。典型地，肌醇六磷酸酶分泌到酵母培养基中并且从培养基收集。关于从培养基纯化肌醇六磷酸酶，可以例如进行硫酸铵沉淀，接着进行DEAE-琼脂糖凝胶柱色谱法。可以使用本领域技术人员公知的其他常规技术，例如凝胶过滤，离子交换色谱法，DEAE-琼脂糖凝胶柱色谱法，亲和层析法，溶剂-溶剂提取，超滤，和HPLC。或者，不需要纯化步骤，因为肌醇六磷酸酶可以以这样的高浓度在培养基中存在，肌醇六磷酸酶在培养基中基本上是纯的(例如，70-80％纯)。
在肌醇六磷酸酶不分泌到培养基中的情况下，酵母细胞能够被溶解，例如，通过超声处理，加热，或者化学处理，并且匀浆离心去除细胞碎屑。然后对上清液进行硫酸铵沉淀，根据需要进行另外的分级分离技术，例如凝胶过滤，离子交换色谱法，DEAE-琼脂糖凝胶柱色谱法，亲和层析法，溶剂-溶剂提取，超滤，和HPLC，以纯化肌醇六磷酸酶。应该明白上述从培养基或者从酵母细胞纯化肌醇六磷酸酶的纯化方法是非限制性的，并且可以利用本领域技术人员公知的任何纯化技术来纯化酵母表达的肌醇六磷酸酶，如果要求这样的技术来获得基本上纯的肌醇六磷酸酶的话。
在一个实施方案中，通过将酵母培养物冷却(例如至大约8℃)并且利用如离心，微过滤，和旋转真空过滤这样的技术去除酵母细胞而从培养基回收肌醇六磷酸酶，没有进一步的纯化步骤。通过如例如超滤和切线流过滤这样的技术能将没有细胞的培养基中的肌醇六磷酸酶浓缩。
可以制备纯化的肌醇六磷酸酶制剂的各种配方。通过加入其他蛋白质(例如明胶和脱脂奶粉)，化学试剂(例如，甘油，聚乙二醇，EDTA，山梨酸钾，苯甲酸钠，和还原剂和醛)，多糖，单糖，脂类(氢化植物油)，肌醇六磷酸钠，和其他含有肌醇六磷酸的化合物，等，能稳定肌醇六磷酸酶。也可以将肌醇六磷酸酶悬浮液干燥(例如，喷雾干燥，转鼓干燥，和冻干)，并且通过已知的方法配制成粉末，颗粒，丸，矿物质块，液体，和凝胶。可以使用凝胶剂例如明胶，藻酸盐，胶原，琼脂，果胶和角叉菜聚糖。本发明还涉及含有冻干非病原性酵母的饲料接种制剂，当对动物饲喂该制剂时，它能在动物的胃肠道内表达本发明的肌醇六磷酸酶。
在一个实施方案中，例如通过超滤并且将超滤残余物喷雾干燥而将没有细胞的培养基中的肌醇六磷酸酶浓缩。经喷雾干燥的粉末可以直接与食品混合或与用作用于对食品补充肌醇六磷酸酶的饲料添加组合物的载体混合。在一个实施方案中，残余物中的肌醇六磷酸酶与载体和/或稳定剂一起被共同干燥。在另一个实施方案中，用帮助喷雾干燥的肌醇六磷酸酶与载体粘附的成分将肌醇六磷酸酶喷雾干燥，或者，肌醇六磷酸酶可以较弱地与载体连接。饲料添加组合物(即，肌醇六磷酸酶/载体组合物和，任选地，其他成分)可以用于与食品混合来实现肌醇六磷酸酶在食品中更均匀地分布。
举例的饲料添加组合物(即，肌醇六磷酸酶/载体组合物和，任选地，其他成分)可以含有600单位的肌醇六磷酸酶/克载体至5000单位的肌醇六磷酸酶/克载体。这些肌醇六磷酸酶/载体组合物可以含有另外的成分。例如，可以将组合物配成含有作为载体的稻壳或麦麸(25-80重量百分比)，肌醇六磷酸酶(0.5-20重量百分比)，碳酸钙(10-50重量百分比)，和油(1-3重量百分比)。另外，饲料添加组合物可以包括肌醇六磷酸酶和载体，并且没有附加的成分。饲料添加组合物可以与饲料混合，获得大约50单位肌醇六磷酸酶/千克饲料至大约2000单位肌醇六磷酸酶/千克饲料的最终饲料混合物。
因此，根据本发明还提供了含有肌醇六磷酸盐来源，酵母表达的肌醇六磷酸酶，和载体的食品。另外，提供了改进单胃动物消费的食品的营养价值的方法，其中提供所述食品含有肌醇六磷酸盐，其中所述方法包括喷雾干燥肌醇六磷酸酶，包括选自大肠杆菌-产生的AppA，大肠杆菌-产生的AppA2，和大肠杆菌-产生的AppA的定点突变体的肌醇六磷酸，将肌醇六磷酸酶与载体混合，和，任选地，混合其他成分，产生用于对于食品补加肌醇六磷酸酶的饲料添加组合物，将饲料添加组合物与食品混合，并且对动物提供补充有饲料添加组合物的食品的步骤。
在这些实施方案中，所述载体可以是适合制备饲料添加组合物的本领域公知的任何载体，包括但不限于稻壳，麦麸，多糖(例如，特定淀粉)，单糖，矿物油，植物脂肪，氢化脂类，碳酸钙，明胶，脱脂奶粉，肌醇六磷酸盐和其他含有肌醇六磷酸盐的化合物，基础混合物(base mix)，等等。一种基础混合物一般含有所述成分的大多数，包括最终饲料混合物的维生素和矿物质，除了饲料混合物(例如，麦片和大豆粉)。在饲料添加组合物中使用的肌醇六磷酸酶优选是大肠杆菌-产生的AppA，大肠杆菌-产生的AppA2，或大肠杆菌-产生的AppA的定点突变体。
将含有喷雾干燥的肌醇六磷酸酶和载体和，任选地，其他成分的饲料添加组合物与最终饲料混合物混合，获得具有预定数目肌醇六磷酸酶单位/千克饲料的饲料(例如，大约50至大约2000单位肌醇六磷酸酶/千克饲料)。在与载体混合之前，对喷雾干燥的肌醇六磷酸酶测定肌醇六磷酸酶活性以确定要与载体混合获得具有预定数目肌醇六磷酸酶单位/克载体的饲料添加组合物的待干燥粉末的量。然后将含有肌醇六磷酸酶的载体与最终饲料混合物混合，获得具有预定数目肌醇六磷酸酶单位/千克饲料的最终饲料混合物。因此，饲料添加组合物中肌醇六磷酸酶浓度大于最终饲料混合物中的肌醇六磷酸酶浓度。
根据本发明的一个实施方案，与酵母表达的肌醇六磷酸酶联合对任何单胃动物(即，具有单一隔室的胃的动物)喂以食品。与酵母表达的肌醇六磷酸酶联合喂以食品的单胃动物包括农业动物，例如猪(例如，阉公猪s(即，阉割的雄性猪)，小母猪(即，第一次交配之前的雌性猪)和任何其他类型的猪)，鸡，火鸡(幼禽(即，孵化后头几周的鸡)和老龄动物)，鸭子，和雉鸡，任何其他鸟类物种，海水或淡水水生物种，圈养的动物(例如，动物园动物)，或者家畜(例如，犬和猫)。
农业单胃动物一般被喂以含有植物产品的动物饲料组合物，其含有肌醇六磷酸盐(例如，含有肌醇六磷酸盐(肌醇六磷酸盐)的麦片和大豆粉)作为磷酸盐的主要贮存形式，因此，有利的是对饲料补充肌醇六磷酸酶。因此，可以补充根据本发明的肌醇六磷酸酶的食品包括用于农业动物例如猪饲养和家禽饲养的饲料，用于鸟类或海水或淡水水生物种(例如鱼食)的任何食品。另外，人可以食用含有与本发明的酵母表达的肌醇六磷酸酶混合的肌醇六磷酸盐的任何食品，例如谷类产品。
对单胃动物喂以饲料的情况下，根据本发明可以使用本领域公知的任何动物饲料混合物，例如油菜籽粉，棉籽粉，大豆粉，和麦片，但是大豆粉和麦片是特别优选的。动物饲料混合物补充有酵母表达的肌醇六磷酸酶，但是其他成分能任选地加给动物饲料混合物。动物饲料混合物的任选的成分包括糖和络合碳水化合物例如水溶性和水不溶性单糖，二糖和多糖。可以加给饲料混合物的任选的氨基酸成分是精氨酸，组氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，赖氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸，苏氨酸，色氨酸，缬氨酸，酪氨酸乙酯盐酸盐，丙氨酸，天冬氨酸，谷氨酸钠，甘氨酸，脯氨酸，丝氨酸，半胱氨酸乙酯盐酸盐，和其类似物，和其盐。任选加入的维生素是盐酸硫胺(thiamine HCl)，核黄素，维生素B6 HCl，烟酸，烟酰胺，肌醇，胆碱盐酸盐，泛酸钙，生物素，叶酸，抗坏血酸，和维生素A，B，K，D，E，等等。还可以加入矿物质，蛋白质成份，包括从肉末或鱼末获得的蛋白质，液体或粉末的鸡蛋，鱼可溶物质，乳清蛋白质浓缩物，油(例如豆油)，玉米淀粉，钙，无机磷酸盐，硫酸铜，盐，和石灰石。可以向动物饲料混合物加入本领域公知的任何药物成份例如抗生素。
饲料组合物还可以含有酵母表达的肌醇六磷酸酶之外的酶。这样的酶的例子是蛋白酶，纤维素酶，木聚糖酶，和酸磷酸酶。例如，单独的肌醇六磷酸酶可能不会实现肌醇六磷酸盐的完全脱磷酸作用，而加入酸磷酸酶可以导致另外的磷酸盐释放。可以加入蛋白酶(例如，胃蛋白酶)，例如，裂解酵母-表达的肌醇六磷酸酶来提高肌醇六磷酸酶的活性。与完整的酵母-表达的肌醇六磷酸酶相比，这样的蛋白酶-处理的肌醇六磷酸酶可以表现出提高的来自肌醇六磷酸盐的磷酸盐的生物可利用率，减小饲料与增重之比，增加动物的骨质量和矿物质含量，对于鸟类，增加产卵的卵重或数目的能力。另外，可以使用肌醇六磷酸酶的组合，例如可以协同作用提高来自肌醇六磷酸盐的磷酸盐的生物可利用率的任何组合，或者，可以使用肌醇六磷酸酶的蛋白水解片段或蛋白水解片段的组合。以此观点，在酵母中表达的肌醇六磷酸酶基因能用来产生直接在本发明的方法中使用的截短的产物。
可以向食品中加入抗氧化剂，例如动物饲料组合物，来防止用来补充食品的肌醇六磷酸酶蛋白质的氧化。通过向食品中加入天然存在的抗氧化剂或合成的抗氧化剂能防止氧化作用，所述天然存在的抗氧化剂是例如β-胡萝卜素，维生素E，维生素C，和生育酚，所述合成的抗氧化剂是例如丁基化羟基甲苯，丁基化羟基茴香醚，叔丁基醌，没食子酸丙酯或乙氧喹。还可以加入与抗氧化剂协同作用的化合物，例如抗坏血酸，柠檬酸，和磷酸。以这种方法加入的抗氧化剂的量取决于例如产物配方，转运条件，包装方法，和期望货架期这样的要求。
根据本发明的一种方法，对食品，例如动物饲料，补充足以提高食品的营养价值的量的酵母-表达的肌醇六磷酸酶。例如，在一个实施方案中，对于每千克(kg)食品补充少于2000单位(U)的酵母-表达的肌醇六磷酸酶。肌醇六磷酸酶的这个量相当于向1千克食品中加入大约34毫克的肌醇六磷酸酶(大约0.0034％w/w)。在另一个实施方案中，对于每千克食品补充少于1500U的酵母-表达的肌醇六磷酸酶。肌醇六磷酸酶的这个量相当于向1千克食品中加入大约26毫克的肌醇六磷酸酶(大约0.0026％w/w)。在另一个实施方案中，对于每千克食品补充少于1200U的酵母-表达的肌醇六磷酸酶。肌醇六磷酸酶的这个量相当于向1千克食品中加入大约17毫克的肌醇六磷酸酶(大约0.0017％w/w)。在另一个实施方案中，食品，例如动物饲料组合物，补充有大约50U/kg至大约1000U/kg的酵母-表达的肌醇六磷酸酶(即，大约0.7至大约14.3mg/kg或者大约0.00007％至大约0.0014％(w/w))。在另一个实施方案中，食品补充有大约50U/kg至大约700U/kg的酵母-表达的肌醇六磷酸酶(即，大约0.7至大约10mg/kg或者大约0.00007％至大约0.001％(w/w))。在另一个实施方案中，食品补充有大约50U/kg至大约500U/kg的酵母-表达的肌醇六磷酸酶(即，大约0.7至大约7mg/kg或者大约0.00007％至大约0.007％(w/w))。在另一个实施方案中，食品补充有大约50U/kg至大约200U/kg的酵母-表达的肌醇六磷酸酶(即，大约0.7至大约2.9mg/kg或者大约0.00007％至大约0.0003％(w/w))。要明白这些实施方案中的每一个中″kg″指食品的千克，例如在动物饲料混合物的情况下是最终饲料组合物(即，作为最终混合物的组合物中的饲料)。另外，肌醇六磷酸酶活性的一个单位(U)定义为37℃，pH5.5下每分钟从1.5毫摩尔/升L肌醇六磷酸钠产生1微摩尔无机磷酸盐需要的酶的量。
在对动物喂以食品之前，酵母-表达的肌醇六磷酸酶可以与食品例如动物饲料(即，作为最终混合物的饲料组合物)混合，或者，不用事先混合，对动物提供肌醇六磷酸酶和食品。例如，可以对没有处理的球团化的(peuetized)，或者加工的食品，例如动物饲料，直接加入肌醇六磷酸酶，或者与食品分开，在例如矿物质块，丸，凝胶制剂，液体制剂，或饮用水中提供肌醇六磷酸酶。根据本发明，与肌醇六磷酸酶“联合”对动物喂以食品意思是喂以与肌醇六磷酸酶混合的食品或者不用预先混合分别喂以食品和肌醇六磷酸酶。
酵母-表达的肌醇六磷酸酶可以不制成胶囊或者制成胶囊形式用于对动物提供或者用于与动物饲料混合物混合。胶囊化作用在动物消化之前保护肌醇六磷酸酶不分解和/或氧化(即，胶囊化作用提高蛋白质的稳定性)，并且提供干燥产品更容易对动物饲喂或者更容易与例如动物饲料混合物混合。以这种方式能保护酵母-表达的肌醇六磷酸酶，例如，通过用另一种蛋白质或者本领域公知是有效的胶囊剂的任何其他物质例如聚合物，蜡，脂肪，和氢化植物油包被肌醇六磷酸酶。例如，利用本领域公知技术能将肌醇六磷酸酶制成胶囊，例如Na2+-藻酸盐制胶囊技术，其中用Na2+-藻酸盐包覆肌醇六磷酸酶，接着在用于制胶囊的Ca2+离子存在下转化为Ca2+-藻酸盐。或者，利用本领域公知技术能将肌醇六磷酸酶制成胶囊，例如造粒(即，将熔化液体雾化并且冷却液滴形成小球)。例如，肌醇六磷酸酶可以在氢化棉籽片或者氢化大豆油中颗粒化产生干燥产品。肌醇六磷酸酶可以以完全没有制成胶囊的形式，完全制成胶囊的形式使用，或者，可以向食品例如动物饲料组合物中加入没有制成胶囊和制成胶囊的肌醇六磷酸酶的混合物，或者不用事先与食品混合而直接对动物喂以肌醇六磷酸酶。可以类似地处理根据本发明的方法使用的任何肌醇六磷酸酶。
根据本发明的方法，可以对动物口服施用在食品，例如动物饲料，或者矿物质团或饮用水中含有肌醇六磷酸酶的食品，但是也可以使用本领域技术人员公知的任何其他有效方法(例如，丸形式)。对动物施用含有酵母表达的肌醇六磷酸酶的食品的时间可以是有效提高动物来自肌醇六磷酸盐的磷酸盐的生物可利用率，减小饲料与增重之比，或增加动物的骨质量和矿物质含量的任何时间周期。例如，在对单胃动物喂以饲料组合物的情况下，可以在动物的-生中每天对动物喂以含有酵母表达的肌醇六磷酸酶的饲料组合物。或者，可以对动物喂以含有肌醇六磷酸酶的饲料组合物较短的时间周期。对动物提供含有肌醇六磷酸酶的食品的时间周期没有限制，应该是可以应用确定通过施用含有肌醇六磷酸酶的食品而有效提高动物营养的任何时间周期。
实施例1
动物饲料混合组合物
用于鸡和猪的动物饲料混合物(即，没有肌醇六磷酸酶的饲料组合物)的成分如下：
表1.在鸡和猪试验中使用的动物饲料混合物的成分
成分     鸡试验     猪试验
玉米淀粉     至100.0     至100.0
玉米     50.89     61.35
大豆粉，去壳     39.69     31.19
豆油     5.00     3.00
石灰石，研磨的     1.67     1.06
盐     0.40     --
鸡维生素混合物     0.20     --
猪维生素混合物     --     0.20
鸡痕量矿物质混合物     0.15     --
猪痕量维生素混合物     --     0.35
氯化胆碱(60％)     0.20     --
猪抗生素预混物(CSP)     --     0.50
杆菌肽预混物     0.05     --
硫酸铜     --     0.08
L-赖氨酸HCl，饲料级     --     0.17
DL-甲硫氨酸，饲料级     0.20     0.05
实施例2
肌醇六磷酸酶制备
用转化有AOX1-appA，pGAP-appA2的巴斯德氏毕赤氏酵母X33，或AOX1-突变体U在培养基中接种酵母菌种培养物。菌种培养物在30℃下生长大约24小时直到达到OD600是大约50。然后用该菌种培养物接种含有含5％葡萄糖的灭菌FM-22培养基的发酵罐(间歇式方法)。以大约1∶25至大约1∶50将24-小时菌种培养物稀释到FM-22培养基中。在30℃下pH控制在6.0(使用NH2OH)并且连续加入葡萄糖在需氧下培养酵母培养物，直到培养物达到OD600大约400(大约36小时)。
为了从培养基收集肌醇六磷酸酶，将酵母培养物快速冷却到8℃。通过离心和通过微过滤从培养基分离细胞。培养基中的肌醇六磷酸酶是70-80％纯，并被制备用于如下与作为饲料添加剂的载体混合。
通过超滤(10,000MW排除界线)将含有分泌的肌醇六磷酸酶的无细胞培养基浓缩。将超滤残余物(7-5％固体)转移到灭菌容器中用于喷雾干燥。利用本领域公知的标准技术对残余物喷雾干燥并且收集得到的粉末(4-6％含湿量)。
对粉末进行微生物学试验，对粉末测定肌醇六磷酸酶活性。利用粉末的肌醇六磷酸酶活性(肌醇六磷酸酶活性单位/毫克粉末)来确定要与小麦麦麸(即载体)混合的干燥粉末的量，获得具有预定数目肌醇六磷酸酶单位/克载体的肌醇六磷酸酶/载体混合物。干燥的肌醇六磷酸酶粉末与小麦麦麸混合并且包装在防湿容器中。根据需要将含有小麦麦麸的肌醇六磷酸酶与动物饲料混合物混合，获得具有预定数目肌醇六磷酸酶单位/千克饲料(大约400至大约1000U/kg)的最终饲料混合物。
实施例3
饲料添加组合物
下面的组合物是饲料添加组合物的例子，其可以与动物饲料混合物例如实施例1中描述的动物饲料混合物混合，获得具有例如大约50U肌醇六磷酸酶/千克最终饲料混合物至大约2000U肌醇六磷酸酶/千克饲料的最终饲料混合物。下述饲料添加组合物是非限制性的，应该明白可以使用确定对提高动物饲料的营养价值有效的任何含有肌醇六磷酸酶的饲料添加组合物。饲料添加组合物的例子是含有600单位肌醇六磷酸酶/克饲料添加组合物或5000单位肌醇六磷酸酶/克饲料添加组合物的饲料添加组合物。
          600单位肌醇六磷酸酶/克      5000单位肌醇六磷酸酶/克
              (重量百分比)                  (重量百分比)
稻壳              82.64                        76.35
碳酸钙            15.00                        15.00
油                1.5                          1.5
酶                0.86                         7.15
          600单位肌醇六磷酸酶/克      5000单位肌醇六磷酸酶/克
               (重量百分比)                (重量百分比)
小麦麦麸          82.64                        76.35
碳酸钙            15.00                        15.00
油                1.5                          1.5
酶                0.86                         7.15
实施例4
喂养方案
利用Biehl，等(J.Nutr.125：2407-2416(1995))描述的方案喂养鸡。简要地说，使用New Hampshire公鸡和Columbian母鸡交配得到的公鸡和母鸡进行试验，试验在24小时荧光照射的环境控制的实验室进行。孵化后第0至第7天，对鸡喂以23％粗蛋白基础饲料，上文实施例1中所述甲硫氨酸-加强玉米-大豆粉。第8天，将鸡称重，给翅膀带带并且随机进行试验处理。五个围栏中每栏各有三只或四只鸡，各自接受13天试验喂养期规定食物处理，鸡最初的平均体重是80-100克。
13天喂养期期间，将鸡限制在恒温控制的不锈钢鸡笼中，并且还使用不锈钢喂食器和喂水器。采取这些步骤以避免来自环境的矿物质污染。在喂养期期间自由供给饮食和蒸馏水去离子水。
在每项试验之前猪禁食12小时，喂以试验饮食23天，每项试验之后禁食12小时，完成试验。每个处理组使用十头猪，并且在试验开始时猪的平均体重是大约8-120kg。猪关养在各个围栏中，围栏中有不锈钢喂食器，不锈钢喂水器，和通电圆柱围栏。
对每个处理小组的所有的鸡和每个处理小组的五头中等重量的猪实施安乐死用于试验。测定体重增重并且收集胫骨(鸡)或腓骨(猪)骨头用于骨灰分分析，骨灰分分析是骨质量和矿物质含量的反映。
实施例5
无机磷酸盐和生物可利用磷酸盐的测定
根据AOAC(1984)，如Biehl等所述，一碱基磷酸钾(KH2PO4)作为标准物，比色法测定用来制备标准曲线的饲料样品中总的磷酸盐。通过测定补充有KH2PO4(X-轴)的基础饲料中无机磷酸盐水平，并且测定喂以补充有不同水平KH2PO4的基础饲料的动物的胫骨灰分重量(mg)或增重(g)(Y-轴)，制备标准曲线。然后通过将这些动物的胫骨灰重和增重与标准曲线相比较对喂以补充有肌醇六磷酸酶的基础饲料的动物测定来自肌醇六磷酸盐的磷酸盐的生物可利用率。
实施例6
骨灰分分析
在各项试验最后对鸡或猪实施安乐死，并且分别从鸡或猪定量取出右胫骨或腓骨。将复现家禽的骨头集中，并且在去除缔结组织之后在100℃下干燥24小时并且称重。称重之后，将骨头在灰解炉中在600℃下干燥灰解24小时。灰重表示为干燥骨重的百分比和每块骨头的灰分重量。
实施例7
酵母中肌醇六磷酸酶表达
根据本发明，任何肌醇六磷酸酶基因可以在酵母中表达，并且根据本领域技术人员公知的方法可以使用任何酵母表达系统。美国专利申请No.09/104,769(现在是美国专利No.6,451,572)，美国专利申请No.09/540,149，和美国专利申请No.60/166,179(PCT公开No.WO 01/36607 A1)，所有的在此引作参考，对于举例的肌醇六磷酸酶基因例如大肠杆菌-产生的appA和appA2基因，和对于大肠杆菌-产生的appA的定点突变体描述了酵母表达体系。下面简要描述用于表达AppA和AppA2酶以及AppA的定点突变体的举例的酵母表达体系。
appA基因在酿酒酵母中的表达
在连接有phyA基因(来自黑曲霉的肌醇六磷酸酶基因)的信号肽的酿酒酵母中表达appA基因。从ATCC，P.O.Box 1549，Manassas，VA20108获得appA基因，其依据布达佩斯条约进行保藏，ATCC保藏号87441。使用pappA1表达载体(Ostanin等，J.Biol.Chem.，267：22830-36(1992))将appA基因(1.3kb)转化到大肠杆菌菌株BL21中。为了制备appA-phyA信号肽构建体，利用聚合酶链式反应(PCR)。合成两个引物，并且5′引物长度是80个碱基对，并且包含phyA信号肽序列，KpnI限制酶切位点，和与如下模板互补的序列：
                                5’GGG GTA CCA TGG GCG TCTCTG CTG
TTC TAC TTC CTT TGT ATC TCC TGT CTG GAG TCA CCT CCG GAC AGA GTG
AGC CGG AG 3’(SEQ.ID No.：6)。
3′引物长度是24个碱基对并且包含EcoRI位点和与如下模板互补的序列：5’GGG AAT TCA TTA CAA ACT GCA GGC 3’(SEQ.ID No.：7)。PCR反应进行如下25次循环：95℃下变性1分钟，58℃下淬火1分钟，和72℃下链延伸1分钟。
一个1.3kb片段通过PCR扩增，用KpnI和EcoRI消化并且与pYES2连接，pYES2是用于酿酒酵母中表达的载体。通过醋酸锂方法将pYES2-appA-phyA信号肽构建体转化到酵母(INVScI，Invitrogen，San Diego，CA)中。
将选择的转化体接种到YEPD培养基中并且在达到OD600为2之后用半乳糖诱导表达。诱导之后收获细胞15-20小时。从培养上清液分离AppA肌醇六磷酸酶，并且是主要蛋白质，免除了冗长纯化的要求。
appA或appA2基因在巴斯德毕赤氏酵母中的表达
appA.用于PCR反应的模板如上所述。用于PCR反应的5′引物如下：5’GGA ATT CCA GAG TGA GCC GGA 3’(SEQ ID No.：8)。3′引物如下：5’GGG GTA CCT TAC AAA CTG CAC G3’(SEQ ID No.：9)。扩增反应包括94℃(3分钟)一次循环，94℃(0.8分钟)30次循环，54℃(1分钟)30次循环，72℃(2分钟)30次循环，和72℃(10分钟)一次循环。首先将产物插入到pGEM T-easy载体(Promega)中，并且使用大肠杆菌菌株TOP10F′作为扩增构建体的宿主。然后将构建体插入到酵母表达载体pPIcZαA(Invitrogen)的EcoRI位点，并且再次使用大肠杆菌菌株TOP10F′作为扩增构建体的宿主。
通过电穿孔将含有appA的PIcZα载体转化到巴斯德毕赤氏酵母X33中。转化细胞在YPD-Zeocin琼脂培养基上平板培养，并且在含有甘油(BMGY)的基本培养基中温育阳性菌落24小时。当OD600达到5时，将细胞离心并且重新悬浮于0.5％甲醇培养基(BMMY)用于诱导。每24小时加入甲醇(100％)将浓度保持在0.5-1％。诱导之后192小时时收集细胞，并且通过硫酸铵沉淀和DEAE-琼脂糖凝胶柱色谱法纯化AppA蛋白质。
appA2.从具有特别高的肌醇六磷酸酶活性从杂交Hampshire-Yorkshire-Duroc猪的结肠内含物获得的细菌菌落分离appA2基因(参见美国专利申请No.09/540,179)。为了分离具有高肌醇六磷酸酶活性的细菌菌落，将结肠内含物在厌氧瘤胃液葡萄糖培养基中稀释，剧烈振荡3分钟，并且系列稀释。稀释的样品在37℃下在含有不溶性肌醇六磷酸钙的修饰的瘤胃液-葡萄糖-纤维二糖-琼脂培养基中培养3天。使用肌醇六磷酸钠为底物对澄清带的菌落测定肌醇六磷酸酶活性。鉴定为产生最高肌醇六磷酸酶活性的菌落被鉴定为大肠杆菌菌株。因此，使用如上对于在巴斯德毕赤氏酵母中appA表达所述的引物分离appA2基因(SEQ.ID Nos.8和9)。将appA2基因克隆到PIcZα载体中，并且根据如上对于在巴斯德毕赤氏酵母中appA表达所述的，用PIcZα-appA2构建体转化巴斯德毕赤氏酵母菌株X33。根据如上对于AppA所述表达AppA2酶，并且从酵母培养上清液收集AppA2蛋白质。
AppA定点突变体
根据美国专利申请No.06/166,179(PCT公开No.WO 01/36607A1)所述，这里将其引作参考，制备appA的定点突变体。简要地说，利用大型引物定点诱变方法(Seraphin，B.等，Nucleic Acids Res.24：3276-77(1996)；Smith，A.M.等，Biotechniques 22：438-39(1997)，这里引作参考)构建大肠杆菌appA突变体。
从ATCC获得用于诱变的模板，并且使用pappA1表达载体(Ostanin等，J.Biol.Chem.，267：22830-36(1992))将基因(1.3kb)转化到大肠杆菌菌株BL21(No.87441)中。使用如上对于在巴斯德毕赤氏酵母中表达appA所用引物(SEQ.ID Nos.：8和9)如上对在巴斯德毕赤氏酵母中表达appA所述扩增模板。扩增反应包括94℃(3分钟)一次循环，94℃(0.5分钟)三十次循环，54℃(1分钟)三十次循环，72℃(1.5分钟)三十次循环，和72℃(10分钟)一次循环。
使用如下引物如上所述进行诱变PCR反应：
5’CTGGGTATGGTTGGTTATATTACAGTCAGGT3’  A131N
(SEQ ID No.：10)                       V134N
5’C AACTTGAACCTTAAACGTGAG3’          C200N
(SEQ ID No.：11)
5’CCTGCGTTAAGTTACAGCTTTCATTCTGTTT3’  D207N
(SEQ ID No.：12)                       S211N
诱变PCR反应插入合适的引物制备A131N/V134N/D207N/S211N，appA的C200N/D207N/S211N(突变体U)，和A131N/V134N/C200N/D207N/S211N突变体。如上所述进行第一次诱变PCR反应(100微升)，使用4微升完整appA PCR反应混合物和上面列出的合适的修饰的引物。所有的大型引物PCR产物分布在1.5％低熔点琼脂糖凝胶中。切下期望的片段并且用GENECLEAN II试剂盒洗脱。如上所述设置最后的诱变PCR反应(100微升)，使用4微升的appA PCR产物并且根据其大小改变纯化的大型引物的浓度(50ng至4μg)。设置94℃ 1分钟和70℃ 2分钟五次热循环。70℃时，加入1μmol的正向引物和2U的AmpliTaq DNA聚合酶并且与反应混合物小心混合，热循环继续94℃ 1分钟和70℃ 1.5分钟二十五次热循环。
根据如上对于appA2基因所述在巴斯德毕赤氏酵母中表达编码定点突变体的基因。根据如上对于AppA所述表达蛋白质产物，并且通过硫酸铵沉淀和DEAE-琼脂糖凝胶色谱法从酵母培养上清液纯化定点突变体。
实施例8
对鸡喂以酵母表达的肌醇六磷酸酶的体内作用
为了评价它们作为动物饲料补充的可能性，将酵母表达的肌醇六磷酸酶AppA和AppA2干燥，并且加给使用小麦麦麸为载体实施例1所述的动物饲料混合物(23％粗蛋白)。对鸡(每个围栏四只；开始时平均体重97克)喂以如上实施例4中所述补充有肌醇六磷酸酶的饲料组合物。处理组包括各种水平的KH2PO4，制备标准曲线，500U/kg的Natuphos，可商购的(Gist-Brocades)真菌黑曲霉中表达的肌醇六磷酸酶，500U/kg的巴斯德毕赤氏酵母或大肠杆菌中表达的AppA，和各种水平的AppA2/p(对于基因表达使用组成型pGAP启动子在巴斯德毕赤氏酵母中表达的AppA2)，如下：
处理组：
1.基础饮食(0.10％P，0.75％Ca)
2.和1相同+0.05％来自KH2PO4的P
3.和1相同+0.10％来自KH2PO4的P
4.和1相同+0.15％来自KH2PO4的P
5.和1相同+500U/kg AppA(酵母)
6.和1相同+500U/kg AppA(大肠杆菌)
7.和1相同+500U/kg AppA2/p
8.和1相同+1000U/kg AppA2/p
9.和1相同+1500U/kg AppA2/p
10.和1相同+500U/kg Natuphos
对于各个处理小组，测定了增重，饲料摄取，饲料与增重之比，无水胫骨重量，胫骨灰重，作为无水胫骨重量百分比的胫骨灰重，以胫骨灰重和增重为基础的生物可利用磷酸盐的百分比。下面结果表示为五个围栏(R1，R2，R3，R4，和R5)中的每一个四只鸡的平均值，也计算了五个围栏的平均值(在表中标记″平均″)。表中处理小组标记为T1-T10，并且″g/c/d ″表明增重或饲料摄取克数/鸡/天。
                                   增重(g/c)
 T1  T2  T3  T4  T5  T6  T7  T8  T9  T10
 R1  185  282  315  321  314  284  334  352  334  269
 R2  219  286  315  336  317  322  315  326  348  274
 R3  234  277  327  335  321  312  318  321  342  267
 R4  234  291  309  311  316  308  326  342  333  276
 R5  223  278  303  332  316  268  313  336  361  294
 平均值  219g  283ef  314cd  327bc  317c  299de  321bc  335ab  344a  276f
 g/c/d  16.8  21.8  24.2  25.2  24.4  23.0  24.7  25.8  26.5  21.2
总计SEM＝6
LSD＝16
                           13-d饲料摄取(g/c)
 T1  T2  T3  T4  T5  T6  T7  T8  T9  T10
 R1  303  392  434  434  426  389  450  474  465  397
 R2  330  462  448  454  429  430  425  449  472  396
 R3  336  391  445  458  446  425  428  445  464  397
 R4  350  416  432  424  432  420  441  464  449  386
 R5  335  388  421  467  425  389  453  461  483  420
 平均值  331f  410e  436c  447abc  432cd  411de  439bc  459ab  467a  399e
 g/c/d  25.5  31.5  33.5  34.4  33.2  31.6  33.8  35.3  35.9  30.7
总计SEM＝7
LSD＝21
                                        增重/饲料(g/kg)
 T1  T2  T3  T4  T5  T6  T7  T8  T9  T10
 R1  611  718  726  740  738  729  742  742  720  678
 R2  665  618  703  741  738  749  741  727  738  692
 R3  696  708  736  730  719  736  743  722  736  671
 R4  668  700  715  733  731  733  738  738  743  715
 R5  665  717  721  710  742  688  691  730  749  710
 平均值  661c  692b  720a  731a  734a  727a  731a  732a  737a  691b
总计SEM＝10
LSD＝28
                                  无水胫骨重量(mg/c)
 T1  T2  T3  T4  T5  T6  T7  T8  T9  T10
 R1  659  804  883  981  892  787  914  1059  1106  757
 R2  655  769  891  977  907  918  873  997  1083  759
 R3  713  751  878  1008  901  820  905  964  1065  726
 R4  740  742  931  925  823  809  923  1083  1096  729
 R5  714  714  866  942  841  809  931  1036  1132  764
平均值  698g  756f  890d  967c 873de  829e  909d  1028b  1096a 747f
总计SEM＝16
LSD＝45
                                            胫骨灰分(mg/c)
 T1  T2  T3  T4  T5  T6  T7 T8  T9  T10
 R1  232  307  406  492  434  345  439  590  617  278
 R2  215  315  415  507  445  435  420  546  600  305
 R3  259  300  406  520  435  382  451  523  604  284
 R4  237  297  442  462  392  372  454  590  616  267
 R5  242  277  396  471  432  373  471  548  642  316
 平均值  237h  299g  413e  490c  428de  381f  447d  559b  616a 290g
总计SEM＝10
LSD＝28
                  补充的P摄取(g)
 T1  T2  T3  T4
 R1  0  0.196  0.434  0.651
 R2  0  0.231  0.448  0.680
 R3  0  0.196  0.445  0.687
 R4  0  0.208  0.432  0.636
 R5  0  0.194  0.421  0.701
平均值 0d  0.205c  0.436b  0.671a
总计SEM＝0.007           LSD＝0.022
                                                          胫骨灰分(％)
    T1  T2  T3     T4     T5     T6     T7     T8     T9     T10
 R1     35.15  38.22  46.03     50.12     48.64     43.78     47.98     55.64     55.79     36.78
 R2     32.86  40.92  46.53     51.86     49.06     47.31     48.07     54.69     55.35     40.15
 R3     36.30  39.96  46.22     51.61     48.31     46.62     49.85     54.23     56.69     39.14
 R4     32.01  40.02  47.47     49.96     47.70     45.96     49.19     54.44     56.23     36.68
 R5     33.45  38.82  45.74     49.95     51.40     46.11     50.54     52.86     56.71     41.32
 平均值     33.95g  39.59f  46.40e     50.70c     49.02d     45.96e     49.13cd     54.37b     56.15a     38.81f
总计SEM＝0.57
LSD＝1.62
磷等值判断
胫骨灰重
KH2PO4标准曲线：Y＝胫骨灰分(mg)
                X＝补充或等值P摄取(g)
Y＝232.0+389.9X
r2＝0.97
对于500U/kg肌醇六磷酸酶活性
(实施例计算使用胫骨灰分处理平均值)
                                           ％生物可利用P
AppA(酵母)；
(428-232.0)/389.9＝0.503g来自432g FI的P＝        0.116％
AppA(大肠杆菌)：
(381-232.0)/389.9＝0.382g来自411g FI的P＝        0.093％
AppA2/p：
(447-232.0)/389.9＝0.551g来自439g FI的P＝        0.126％
Natuphos：
(290-232.0)/389.9＝0.149g来自399g FI的P＝        0.037％
**来自ANOVA的结果(对于每栏四只鸟进行计算；按照上一页图例说明处理)
                                 生物可利用P(％)
 T5  T6  T7  T8  T9  T10
 R1  0.122  0.075  0.118  0.194  0.212  0.030
 R2  0.127  0.121  0.113  0.179  0.200  0.047
 R3  0.117  0.091  0.131  0.168  0.206  0.034
 R4  0.095  0.085  0.129  0.198  0.219  0.023
 R5  0.121  0.093  0.135  0.176  0.218  0.051
 平均值  0.116c  0.093d  0.125c  0.183b  0.211a  0.037e
总计SEM＝0.005
LSD＝0.016
对照物                             统计学意义(P-值)
AppA(酵母)对AppA(大肠杆菌)              0.006
AppA2/p线性                             0.001
AppA2/p二次方程                         0.039
增重
KH2PO4标准曲线：X＝增重(g)
                   Y＝补充P摄取(g)
Y＝234.1+157.2X
r2＝0.84
来自ANOVA的结果(对于每栏四只鸟进行计算；按照上一页图例说明处理)
                                生物可利用P(％)
 T5  T6  T7  T8 T9  T10
 R1  0.119  0.082  0.141  0.158  0.137  0.056
 R2  0.123  0.130  0.121  0.130  0.154  0.064
 R3  0.124  0.117  0.125  0.124  0.148  0.053
 R4  0.121  0.112  0.133  0.148  0.140  0.069
 R5  0.123  0.055  0.111  0.141  0.167  0.091
 平均值  0.122b  0.099d  0.126b  0.140ab  0.149a  0.067d
总计SEM＝0.007
LSD＝0.021
对照物                               统计学意义(P-值)
AppA(酵母)对AppA(大肠杆菌)               0.038
AppA2/p线性                              0.036
AppA2/p二次方程                          0.768
对动物饲料混合物补充递增量的KH2PO4导致增重和胫骨灰分线性增加(p＜0.001)。对动物饲料混合物补充Natuphos导致增重，胫骨灰分和生物可利用磷酸盐％的线性增加(p＜0.001)。在测试的每一项体内反应的改进方面，包括饲料与增重之比，灰分重量，和生物可利用磷酸盐％，500U/kg酵母表达的酶(AppA和AppA2/p)比大肠杆菌-表达的AppA或Natuphos更有效。事实上，AppA和AppA2/p在提高和生物可利用磷酸盐水平方面比Natuphos更有效2-6倍，取决于是灰分重量还是增重被用来计算生物可利用磷酸盐百分比。
实施例9
对鸡喂以酵母表达的肌醇六磷酸酶的体内作用
该方法如实施例8所述，除了鸡在开始时的平均体重91克，处理组如下：
处理小组：
1.基础饮食(0.10％ P，0.75％ Ca)
2.和1相同+0.05％来自KH2PO4的P
3.和1相同+0.10％来自KH2PO4的P
4.和1相同+300U/kg Natuphos肌醇六磷酸酶
5.和1相同+500U/kg Natuphos肌醇六磷酸酶
6.和1相同+700U/kg Natuphos肌醇六磷酸酶
7.和1相同+900U/kg Natuphos肌醇六磷酸酶
8.和1相同+1100U/kg Natuphos肌醇六磷酸酶
9.和1相同+1300U/kg Natuphos肌醇六磷酸酶
10.和1相同+1500U/kg Natuphos肌醇六磷酸酶
11.和1相同+500U/kg Ronozyme肌醇六磷酸酶
12.和1相同+300U/kg突变体U肌醇六磷酸酶
13.和1相同+500U/kg突变体U肌醇六磷酸酶
14.和1相同+500U/kg AppA肌醇六磷酸酶
15.和1相同+500U/kg AppA2肌醇六磷酸酶
Ronozyme(Roche)肌醇六磷酸酶是真菌中表达的肌醇六磷酸酶。突变体U是如上所述AppA的定点突变体。表中的表示和实施例8相同。测定实施例8中所述肌醇六磷酸酶补充的体内作用，结果如下：
                                                                            增重(g/c)
  T1   T2   T3   T4   T5   T6   T7   T8   T9   T10   T11   T12   T13   T14   T15
  R1   287   295   318   269   295   271   301   305   304   317   256   324   340   319   343
  R2   271   291   342   288   297   282   313   295   323   327   231   289   349   325   342
  R3   268   302   326   286   278   267   298   309   308   327   274   332   337   348   336
  R4   256   282   317   255   304   280   294   295   289   310   287   310   338   324   330
  R5   215   279   310   292   270   290   302   270   295   306   284   316   329   319   331
  平均值   259   290   323   278   289   278   302   295   304   317   266   314   339   327   336
  g/c/d   18.5   20.7   23.1   19.9   20.6   19.9   21.6   21.1   21.7   22.6   19.0   22.4   24.2   23.4   24.0
总计SEM＝6
LSD＝18
                                                                     饲料摄取(g/c)
  T1   T2   T3   T4   T5   T6   T7   T8   T9   T10   T11   T12   T13   T14   T15
  R1   463   450   489  428   450   435   466   479   445   489   422   500   487   483   503
  R2   424   439   565   443   427   454   470   469   490   489   394   459   518   459   519
  R3   425   446   526   444   417   425   444   480   483   485   427   522   496   520   535
  R4   406   437   472   398   450   437   462   442   425   505   439   478   499   496   491
  R5   381   443   478   421   423   438   447   423   455   452   437   463   496   476   519
  平均值   420   443   506   427   433   438   458   459   460   484   424   484   499   487   513
  g/c/d   30.0   31.6   36.1   30.5   30.9   31.3   32.7   32.8   32.9   34.6   30.3   34.6   35.6   34.8   36.6
总计SEM＝10
LSD＝27
                                                            增重/饲料(g/kg)
  T1   T2   T3   T4   T5   T6   T7   T8   T9   T10   T11   T12   T13   T14   T15
  R1   620   656   650   627   655   623   645   636   683   648   605   648   699   661   681
  R2   639   662   606   651   696   621   665   629   659   668   587   629   672   709   659
  R3   630   677   619   644   666   628   671   644   637   673   641   635   680   669   629
  R4   631   645   671   641   675   642   636   668   679   614   654   649   678   652   671
  R5   564   630   649   694   639   662   675   639   648   678   649   683   663   669   638
  平均值   617   654   639   651   666   635   658   643   661   656   627   649   678   672   656
总计SEM＝10
LSD＝28
                                                                   无水胫骨重量(mg/c)
  1   2   3   4    5    6    7   8    9   10  11   12   13   14   15
 R1  970  1010  1146  952  1028  1011  1007  995  1027  1131  --  1150  1169  1160  1234
 R2  920  1029  1175  974  937  1047  1013  993  1077  1077  828  995  1251  1130  1209
 R3  1038  872  1147  981  932  917  1049  1072  1030  1137  1029  1151  1238  1178  1215
 R4  890  944  1125  957  1008  964  1073  1005  961  1100  919  1116  1273  1177  1128
 R5  882  970  1078  954  976  1004  961  963  1065  1101  937  1046  1172  1141  1145
 平均值  940  965  1134  964  976  989  1021  1006  1032  1109-  928  1092  1221  1157  1186
总计SEM＝22
LSD＝61
                    补充P摄取(g)
    1     2     3
    R1     0     0.225     0.489
    R2     0     0.220     0.565.
    R3     0     0.223     0.526
    R4     0     0.219     0.472
    R5     0     0.222     0.478
    平均值     0c     0.222b     0.506a
                                                                       胫骨灰分(mg/c)
    1     2     3     4     5     6     7     8     9     10     11     12     13     14     15
    R1     284     333     437     279     303     305     328     324     340     369     --     401     428     453     457
    R2     270     318     447     298     290     336     336     325     383     363     226     355     481     441     470
    R3     291     271     398     302     278     263     326     357     345     403     293     410     479     420     455
    R4     234     305     398     281     314     297     341     317     324     364     264     406     500     447     413
    R5     243     327     388     287     279     309     302     305     352     368     279     354     447     424     443
  平均值     264     311     414     289     293     302     327     326     349     373     266     385     467     437     448
总计SEM＝10
LSD＝28
                                                                                  胫骨灰分(％)
    1     2     3     4     5     6     7     8     9     10   11     12     13     14     15
R1   29.30   32.94   38.15   29.25   29.48   30.18   32.55  32.54   33.10   32.60   --   34.90   36.63   39.07   37.06
R2   29.29   30.97   38.03   30.61   30.99   32.06   33.21   32.73   35.51   33.67   27.33   35.66   38.48   39.04   38.89
R3   28.03   31.08   34.70   30.81   29.79   28.71   31.12   33.26   33.45   35.49   28.50   35.63   38.73   35.63   37.48
R4   26.30   32.33   35.34   29.35   31.17   30.80   31.73   31.55   33.71   33.11   28.74   36.38   39.29   38.00   36.63
R5   27.52   33.76   35.98   30.13   28.60   30.81   31.44   31.67   33.09   33.41   29.77   33.81   38.14   37.18   38.70
平均值   28.09   32.21   36.44   30.03   30.00   30.51   32.01   32.35   33.77   33.65   28.58   35.28   38.25   37.78   37.75
总计SEM＝0.49
LSD＝1.39
磷等值判断
胫骨灰重
KH2PO4标准曲线：Y＝胫骨灰分(mg)
                   X＝补充或等值P摄取(g)
Y＝257.1+299.0X
r2＝0.88
对于500U/kg肌醇六磷酸酶活性
(实施例计算使用胫骨灰分处理平均值)
                                           ％生物可利用P
Natuphos：
(293-257.1)/299.0＝0.120g来自433g FI的P＝        0.030％
Ronozyme：
(266-257.1)/299.0＝0.030g来自424g FI的P＝        0.007％
突变体U：
(467-257.1)/299.0＝0.702g来自499g FI的P＝        0.141％
AppA：
(437-257.1)/299.0＝0.602g来自487g FI的P＝        0.124％
AppA2：
(448-257.1)/299.0＝0.638g来自513g FI的P＝        0.124％
来自ANOVA的结果(对于每栏四只鸟进行计算；按照上一页图例说明处理)
                                                               生物可利用P(％)
  4   5   6   7   8   9   10   11   12   13   14   15
  R1   0.017   0.034   0.037   0.051   0.047   0.062   0.076   --   0.097   0.117   0.136   0.133
  R2   0.031   0.026   0.058   0.057   0.049   0.086   0.072   -0.026   0.071   0.145   0.134   0.137
  R3   0.034   0.017   0.005   0.052   0.069   0.061   0.101   0.028   0.098   0 150   0.105   0.124
  R4   0.020   0.043   0.030   0.060   0.045   0.053   0.071   0.006   0.104   0.163   0.128   0.106
  R5   0.024   0.018   0.040   0.034   0.038   0.071   0.082   0.017   0.070   0.128   0.117   0.120
  平均值   0.025   0.027   0.034   0.051   0.050   0.066   0.080   0.006   0.088   0.140   0.124   0.124
总计SEM＝0.006
LSD＝0.018
对照物                                               统计学意义(P-值)
对Natuphos的线性响应(处理小组5(trt)4-10)                0.001
对Natuphos的二次方程响应                                0.208
500U/kg Natuphos(trt 5)对
500U/kg酵母-表达的肌醇六磷酸酶(trt 13-15)                 0.001
500U/kg Natuphos(trt 5)对500U/kg Ronozyme(trt 11)     0.031
500U/kg Ronozyme(trt 11)对
500U/kg酵母-表达的肌醇六磷酸酶(trt 13-15)                 0.001
300U/kg突变体U(trt 12)对500U/kg突变体U(trt 13)            0.001
500U/kg突变体U(trt 12)对500U/kg AppA(trt 14)              0.074
500U/kg突变体U(trt 12)对500U/kg AppA2(trt 15)             0.074
   多线性回归：Y＝胫骨灰分(mg)
               X＝肌醇六磷酸酶摄入(U)
Y＝263.462+0.144(Natuphos)+0.014(Ronozyme)+0.823(突变体U)+0.711(AppA)+0.718(AppA2)
R2＝0.93
相对肌醇六磷酸酶活性    比例(％)相当于500U/kg Natuphos
Ronozyme：(0.014/0.144)*100＝10               50
突变体U：(0.823/0.144)*100＝572                 2860
AppA：(0.711/0.144)*100＝494                    2470
AppA2：(0.718/0.144)*100＝499                   2495
500U/kg时，在试验的改进体内响应方面，酵母-表达的酶(突变体U，AppA和AppA2)比Natuphos或Ronozyme更有效(两种酶在真菌表达系统中表达)。例如，突变体U，AppA和AppA2在释放磷酸盐方面比Natuphos有效四倍(参见图3)。
实施例10
对猪喂以酵母表达的肌醇六磷酸酶的体内作用
该方法如实施例8所述，除了对猪(在开始时的平均体重10千克)喂以肌醇六磷酸酶-补充饲料组合物，处理组如下：
处理小组：
1.基础饮食(0.75P，0.60％Ca)
2.和1相同+0.05％来自KH2PO4的P
3.和1相同+0.10％来自KH2PO4的P
4.和1相同+0.15％来自KH2PO4的P
5.和1相同+400U/kg来自Natuphos的肌醇六磷酸酶
6.和1相同+400U/kg来自突变体U肌醇六磷酸酶的肌醇六磷酸酶
7.和1相同+400U/kg AppA肌醇六磷酸酶
8.和1相同+400U/kg AppA 2肌醇六磷酸酶
对于各个处理小组，测定增重，饲料与增重之比，腓骨灰分重量，作为无水腓骨重量百分比的腓骨灰分重量，和以腓骨灰分重量为基础的生物可利用磷酸盐百分比，结果如下：
表3.猪试验a
腓骨成分
处理小组 增重，g/d  G:F，g/kg   灰分％  灰分mg  生物可利用P，％b
基础饮食 369  533  29.31  666
和1相同+0.05％来自KH2PO4的P 435  576  32.83  766
和1相同+0.10％来自KH2PO4的P 446  618  36.62  972
和1相同+0.15％来自KH2PO4的P 509  660  36.57  1123
和1相同+400U/kg Natuphos肌醇六磷酸酶 460  605  34.37  889  0.081
和1相同+400U/kg突变体U肌醇六磷酸酶 458  645  35.45  961  0.116
和1相同+400U/kg AppA肌醇六磷酸酶 458  606  35.97  1035  0.136
和1相同+400U/kg AppA2肌醇六磷酸酶 443  583  34.96  968  0.108
对照物 统计学意义(P-值)
Natuphos(处理小组(trt)5)对酵母表达的肌醇六磷酸酶(trt 6-8) NS  NS  NS  0.05  0.048
突变体U(trt 6)AppA对(trt 7)和AppA2(trt 8) 0.10  0.10  NS  0.001  0.239
a数据是23天时间间期各自圈养的猪的每种处理的10份重复的平均值；最初平均体重是8.4±0.2kg。
b生物可利用P百分比计算值是以KH2PO4标准曲线(处理1-4)为基础的等值P的计算值。以KH2PO4标准曲线为基础计算，其中Y＝腓骨骨灰(mg)和X＝补充或等值P摄入(g)：Y＝664.49+15.29X(r2＝0.87)。
400U/kg下，酵母表达的酶(突变体U，AppA和AppA2)在提高试验响应方面比Natuphos(在真菌中表达)更有效。
实施例11
对鸡喂以酵母表达的肌醇六磷酸酶的体内作用
该方法如实施例8所述，除了鸡在开始时的平均体重83克，处理组如下：
处理小组：
1.基础饮食(0.10％ P，0.75％ Ca)
2.和1相同+0.05％来自KH2PO4的P
3.和1相同+0.10％来自KH2PO4的P
4.和1相同+0.15％来自KH2PO4的P
5.和1相同+500U/kg Natuphos肌醇六磷酸酶(批量1)
6.和1相同+500U/kg Natuphos肌醇六磷酸酶(批量2)
7.和1相同+1000U/kg Natuphos肌醇六磷酸酶(批量2)
8.和1相同+500U/kg Ronozyme肌醇六磷酸酶(批量1)
9.和1相同+500U/kg Ronozyme肌醇六磷酸酶(批量2)
10.和1相同+1000U/kg Ronozyme肌醇六磷酸酶(批量2)
11.和1相同+500U/kg突变体U肌醇六磷酸酶
12.和1相同+500U/kg AppA肌醇六磷酸酶
13.和1相同+500U/kg AppA2肌醇六磷酸酶
14.和1相同+500U/kg AppA2+新启动子肌醇六磷酸酶(AppA2/p)
表中的表示和实施例8相同。测定实施例8中所述肌醇六磷酸酶补充的体内作用，结果如下：
                                                                     增重(g/c)
 T1  T2  T3  T4  T5  T6  T7  T8  T9  T10  T11  T12  T13  T14
 R1  152  252  295  299  215  235  241  223  256  254  325  308  322  314
 R2  199  238  290  332  206  210  256  237  212  243  312  316  309  306
 R3  163  257  297  347  235  254  250  215  218  246  324  309  313  335
 R4  176  262  288  330  242  250  288  228  195  223  329  318  310  317
 R5  190  257  295  356  193  230  288  218  214  259  306  307  314  317
 平均值  176  253  293  333  218  236  265  224  219  245  319  312  314  318
 g/c/d  12.6  18.1  20.9  23.8  15.6  16.9  18.9  16.0  15.6  17.5  22.8  22.3  22.4  22.7
总计SEM＝7
LSD＝19
                                                                    饲料摄取(g/c)
 T1  T2  T3 T4  T5  T6 T7  T8  T9  T10  T11  T12  T13  T14
 R1  279  373  431  424  347  386  352  359  284  321  435  429  447  424
 R2  335  352  407  441  333  340  375  363  325  368  395  441  427  465
 R3  291  374  419  472  369  400  381  330  348  367  439  459  440  472
 R4  292  386  400  457  366  370  405  358  328  356  451  473  421  441
 R5  344  374  427  483  341  370  450  336  344  394  425  420  449  445
 平均值  308  372  417  455  351  373  393  349  326  361  429  444  437  449
 g/c/d  22.0  26.6  29.8  32.5  25.1  26.6  28.1  24.9  23.3  25.8  30.6  31.7  31.2  32.1
总计SEM＝10
LSD＝28
                                                        增重/饲料(g/kg)
 T1  T2  T3  T4  T5  T6  T7  T8  T9  T10  T11  T12  T13  T14
 R1  544  674  684  705  618  608  684  621  676  793  747  718  719  742
 R2  593  676  713  752  617  616  682  653  651  659  790  716  722  657
 R3  558  686  709  736  636  635  656  650  626  671  737  673  713  708
 R4  601  680  720  723  662  677  711  637  594  627  729  673  737  719
 R5  551  685  690  737  565  622  641  649  624  658  721  732  700  712
 平均值  569  680  703  731  620  632  675  642  634  682  745  702  718  708
总计SEM＝13
LSD＝37
                                                         无水胫骨重量(mg/c)
  1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   11   12   13   14
  R1   671   886   1048   1002   919   840   912   825   891   831   1117   1041   1057   1091
  R2   815   ---   1003   1298   752   765   906   865   756   916   1113   1152   1041   1070
  R3   730   884   1036   1296   849   942   937   864   849   816   1154   1017   1130   1220
  R4   698   911   931   1232   802   901   918   837   807   872   1163   1165   1047   1078
  R5   773   929   1037   1266   793   845   867   768   825   962   1044   1054   1130   1140
  平均值   737   903   1011   1219   823   859   908   832   826   879   1118   1086   1081   1120
总计SEM＝27
LSD＝77
                      补充P摄取(g)
    1     2     3     4
  R1     0     0.187     0.431     0.636
  R2     0     0.176     0.407     0.661
  R3     0     0.187     0.419     0.708
  R4     0     0.193     0.400     0.685
  R5     0     0.187     0.427     0.724
  平均值     0d     0.186c     0.417b     0.683a
                                                                  胫骨灰分(mg/c)
  1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   11   12   13   14
  R1   174   255   381   367   254   230   246   239   253   224   415   385   404   411
  R2   197   279   343   483   199   198   244   242   200   249   395   425   357   353
  R3   185   279   361   486   238   261   276   230   228   231   410   370   389   454
  R4   175   287   315   459   220   262   282   222   210   244   416   455   371   396
  R5   183   261   335   481   211   229   264   202   222   262   383   380   406   431
  平均值   183   272   347   455   224   236   262   227   223   242   404   403   385   409
总计SEM＝12
LSD＝32
                                                                                     胫骨灰分(％)
    1     2     3     4     5     6     7     8     9     10     11     12     13     14
  R1   25.88   28.82   36.31   36.67   27.60   27.39   26.91   29.01   28.42   26.99   37.15   37.03   38.24   37.64
  R2   24.20   ---   34.21   37.18   26.51   25.89   26.86   27.97   26.44   27.16   35.49   36.90   34.33   32.98
  R3   25.43   31.61   34.87   37.53   28.06   27.75   29.52   26.65   26.85   28.35   35.54   36.34   34.40   37.22
  R4   25.04   31.53   33.85   37.22   27.42   29.15   30.73   26.46   26.03   27.97   35.76   39.09   35.43   36.71
  R5   23.72   28.11   32.27   38.02   26.61   27.17   30.41   26.26   26.88   27.22   36.67   36.02   35.99   37.80
  平均值   24.85   30.02   34.30   37.32   27.24   27.47   28.89   27.27   26.92   27.54   36.12   37.08   35.68   36.47
总计SEM＝0.57
LSD＝1.61
磷等值判断
KH2PO4标准曲线：Y＝胫骨灰分(mg)
                   X＝补充或等值P摄取(g)
Y＝187.9+393.4X
r2＝0.95
对于500U/kg肌醇六磷酸酶活性
(实施例计算使用胫骨灰分处理平均值)
                                        ％生物可利用P
Natuphos1：
(224-187.9)/393.4＝0.092g来自351g FI的P＝    0.026％
Natuphos2：
(236-187.9)/393.4＝0.122g来自373g FI的P＝    0.033％
Ronozyme1：
(227-187.9)/393.4＝0.099g来自349g FI的P＝    0.028％
Ronozyme2：
(223-187.9)/393.4＝0.089g来自326g FI的P＝    0.027％
突变体U：
(404-187.9)/393.4＝0.549g来自429g FI的P＝    0.128％
AppA：
(403-187.9)/393.4＝0.547g来自444g FI的P＝    0.123％
AppA2：
(385-187.9)/393.4＝0.501g来自437g FI的P＝    0.115％
AppA2/p：
(409-187.9)/393.4＝0.562g来自449g FI的P＝    0.125％
来自ANOVA的结果(对于每栏四只鸟进行计算；按照上一页图例说明处理)
                                                                       生物可利用P(％)
    5     6     7     8     9     10     11     12     13     14
  R1   0.048   0.028   0.042   0.036   0.058   0.029   0.133   0.117   0.123   0.138
  R2   0.008   0.008   0.038   0.038   0.009   0.042   0.133   0.137   0.101   0.090
  R3   0.035   0.047   0.059   0.032   0.029   0.030   0.129   0.101   0.116   0.143
  R4   0.022   0.051   0.059   0.024   0.017   0.040   0.129   0.144   0.111   0.120
  R5   0.017   0.028   0.043   0.011   0.025   0.048   0.117   0.116   0.123   0.139
  平均值   0.026c   0.032bc   0.048b   0.028c   0.028c   0.038bc   0.128a   0.123a   0.115a   0.125a
总计SEM＝0.006
LSD＝0.018
500U/kg时，酵母表达的酶(突变体U，AppA和AppA2/p)在测试的体内反应的改进方面，包括增重，饲料与增重之比，骨质量和矿物质含量，和生物可利用磷酸盐％，比Natuphos或Ronozyme更有效。在提高生物可利用磷酸盐水平方面，酵母表达的酶比真菌表达的酶更有效大约4倍。
实施例12
对换毛之后的下蛋母鸡喂以酵母表达的肌醇六磷酸酶的体内作用
该方法如实施例8所述，除了对换毛之后的下蛋母鸡进行试验，测定蛋产量和蛋重，处理小组和基本饮食如下：
处理：
1.P不足的玉米-大豆粗粉基础饮食(0.10％Pa；3.8％Ca；17％ CP)
2.和1相同+0.10％来自KH2PO4的Pi
3.和1相同+150U/kg r-AppA2肌醇六磷酸酶
4.和1相同+300U/kg r-AppA2肌醇六磷酸酶
5.和1相同+10,000U/kg r-AppA2肌醇六磷酸酶
基础饮食：成分     ％
玉米     63.65
大豆粉，去壳     25.65
石灰石，研磨的     9.80
盐     0.40
矿物质预混物     0.20
维生素预合物     0.15
DL-甲硫氨酸，饲料级     0.10
氯化胆碱     0.05
**注：4周之后由于蛋产量低于50％，终止处理1。
下面的表的标示和实施例8一样，并且测定和实施例8描述的一些相同的响应。结果表明AppA2对换毛之后的下蛋母鸡提高蛋产量和蛋重。
处理：
1.P不足的玉米-大豆粗粉基础饮食(0.10％pa；3.8％ Ca；17％ CP)
2.和1相同+0.10％来自KH2PO4的Pi
3.和1相同+150U/kg r-AppA2肌醇六磷酸酶
4.和1相同+300U/kg r-AppA2肌醇六磷酸酶
5.和1相同+10,000U/kg r-AppA2肌醇六磷酸酶
                 初始体重(g；12只母鸡的平均值)
    T1     T2     T3     T4     T5
    R1     1699     11792     1682     17190     1707
    R2     1785     1698     1734     1855     1694
    R3     1690     1665     1775     1724     11824
    R4     1688     1745     1739     1823     1760
  平均值     1716     1725     1733     1798     1746
总计SEM＝26
LSD＝78
               4-周体重(g，12只母鸡的平均值)
    T1     T2     T3     T4     T5
    R1     1566     18D2     1763     1769     1748
    R2     1558     1734     1816     11860     1723
    R3     1633     1707     1744     1769     1850
    R4     1615     1749     1762     1827     1757
  平均值     1593     1748     1771     1806     1770
总计SEM＝21
LSD＝64
             12-周体重(g，12只母鸡的平均值)
T1     T2     T3     T4     T5
    R1 --     1876     11831     1792     1781
    R2 --     1791     1775     1856     1791
    R3 --     1800     1765     1806     1933
    R4 --     1853     1814     1876     1815
    平均值 --     1830     1796     1833     1830
总计SEM＝24
LSD＝74
处理：
1.P不足的玉米-大豆粗粉基础饮食(0.10％ pa；3.8％ Ca；17％ CP)
2.和1相同+0.10％来自KH2PO4的Pi
3.和1相同+150U/kg r-AppA2肌醇六磷酸酶
4.和1相同+300U/kg r-AppA2肌醇六磷酸酶
5.和1相同+10,000U/kg r-AppA2肌醇六磷酸酶
                         饲料摄取(g/h/d)1
    T1     T2     T3     T4     T5
    R1     89     118     122     115     116
    R2     92     125     114     122     119
    R3     89     117     118     116     124
    R4     94     123     119     115     123
    平均值     91b     121a     118a     117a     121a
总计SEM＝2
LSD＝5
1平均值是对于处理1是第一个4周时间母鸡平均日饲料摄取量，对于处理2-5是整个12周时间的母鸡平均日饲料摄取量。
                                      蛋重(g)1
    T1     T2     T3     T4     T5
    R1     57.5     64.0     65.4     65.7     64.5
    R2     63.5     64.7     64.3     66.0     65.5
    R3     60.3     64.3     64.6     64.8     65.6
    R4     62.8     63.3     62.2     65.3     63.7
    平均值     61.0b     64.1a     64.1b     65.5a     64.8a
总计SEM＝0.7
LSD＝2.2
1平均值是对于处理1是第一个4周时间母鸡平均日饲料摄取量，对于处理2-5是整个12周时间的母鸡平均日饲料摄取量。
处理：
1.P不足的玉米-大豆粗粉基础饮食(0.10％ pa；3.8％ Ca；17％ CP)
2.和1相同+0.10％来自KH2PO4的Pi
3.和1相同+150U/kg r-AppA2肌醇六磷酸酶
4.和1相同+300U/kg r-AppA2肌醇六磷酸酶
5.和1相同+10,000U/kg r-AppA2肌醇六磷酸酶
                                           以周计的蛋产量(％)
  1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   11   12
  D1   75.3   55.7   36.0   22.9   --   --   --   --   --   --   --   --
  D2   88.4   90.8   88.1   87.8   88.4   85.4   86.0   81.8   80.4   79.8   80.7   78.3
  D3   84.5   85.1   83.3   85.1   83.3   82.1   83.6   79.2   77.4   77.4   79.5   76.5
  D4   86.6   86.3   83.9   82.4   82.1   84.5   81.5   77.4   78.0   74.7   73.8   72.0
  D5   82.4   83.3   83.6   84.8   80.7   81.3   82.7   78.6   80.1   78.9   76.8   72.6
  SEM   3.0   3.2   3.4   3.5   3.3   3.2   3.2   4.1   3.4   4.5   3.5   3.9
                                      蛋产量(％)1
    T1     T2     T3     T4     T5
R1     44.6     86.5     73.0     81.0     80.7
R2     60.1     85.7     78.1     81.7     74.7
R3     43.2     87.2     84.3     83.9     87.8
R4     42.0     80.9     90.8     74.6     85.3
平均值     47.5     85.1     81.6     80.3     82.1
最小平方分析平均值2     53.8b     81.21     80.71     77.82     82.92
总计SEM＝2.1
1平均值对于处理1是第一个4周时间母鸡平均蛋产量，对于处理2-5是整个12周时间的母鸡平均蛋产量。
2由于第一周蛋产量的变化(上文)，利用协方差分析总的蛋产量，利用最小平方分析表明协方差效果。
实施例13
对FINISHING猪喂以酵母表达的肌醇六磷酸酶的体内作用
该方法如实施例8所述，除了对finishing猪(即，小母猪和阉公猪)进行试验，处理小组和基本饮食如下：
处理：
1.P不足的玉米-大豆粗粉基础饮食
2.和1相同+0.10％来自KH2PO4的Pi
3.和1相同+250FTU/kg r-AppA2肌醇六磷酸酶
4.和1相同+500FTU/kg r-AppA2肌醇六磷酸酶
5.和1相同+1000FTU/kg r-AppA2肌醇六磷酸酶
6.和1相同+10,000FTU/kg r-AppA2肌醇六磷酸酶
基础饮食：
       成分                      重量范围(kg)
                             50-80         80-120
玉米淀粉                     至100         至100
玉米                         78.42         83.85
大豆粉，去壳                 18.08         12.65
石灰石，磨细                 1.06          1.07
磷酸二钙                     0.16          --
痕量矿物质预混物             0.35          0.35
维生素预混物                 0.10          0.10
L-赖氨酸-HCl，饲料级         0.16          0.11
L-苏氨酸，饲料级             0.02          --
抗生素预混物                 0.75          0.75
计算的成分(NRC，1998)
粗蛋白，％                   15.1          13.0
赖氨酸，总％                 0.88          0.69
钙，％                       0.50          0.45
磷，总％                     0.38          0.32
磷，估计的总生物可利用率％        0.09        0.05
ME，kcal/kg                       3293        3295
下面的表和实施例8中描述的一样标示并且测定实施例8中描述的一些响应。表明增长/饲料之比而不是饲料/增重之比。
结果表明在增加骨质量和矿物质含量方面，和在改善增重/饲料之比方面，AppA2和磷酸盐一样有效。
处理：
1.P不足的玉米-大豆粗粉基础饮食
2.和1相同+0.10％来自KH2PO4的Pi
3.和1相同+250FTU/kg r-AppA2肌醇六磷酸酶
4.和1相同+500FTU/kg r-AppA2肌醇六磷酸酶
5.和1相同+1000FTU/kg r-AppA2肌醇六磷酸酶
6.和1相同+10,000FTU/kg r-AppA2肌醇六磷酸酶
                          初始猪重量(kg)
                       阉公猪                          小母猪
  1   2   3   4   5   6   1   2   3   4   5   6
  R1   52.2   52.8   53.0   51.8   52.0   51.8   51.2   50.8   52.2   52.2   51.3   52.4
  R2   51.0   51.1   51.7   50.3   51.6   50.4   49.6   49.6   50.3   50.0   50.4   50.8
  R3   48.2   49.6   49.8   49.6   50.1   49.2   48.1   49.6   47.9   47.1   48.8   48.4
  R4   46.4   46.5   46.5   46.9   47.4   47.9   45.9   45.4   44.3   46.6   46.5   45.7
  R5   52.0   44.1   51.0   52.4   46.4   50.7   43.4   43.9   44.0   43.1   44.1   44.0
  平均值   50.0   48.8   50.4   50.2   49.5   50.0   47.6   47.9   47.7   47.8   48.2   48.3
总计SEM＝0.4
                             阶段性猪重量(kg)
                       阉公猪                                  小母猪
  1   2   3   4   5   6   1   2   3   4   5   6
  R1   78.8   83.0   85.0   76.0   79.6   79.2   79.7   80.1   88.6   84.1   83.1   89.6
  R2   76.8   80.6   86.9   79.9   82.2   83.8   80.0   83.5   87.7   84.5   87.3   83.5
  R3   73.7   79.8   77.1   79.1   79.0   75.9   77.1   77.6   81.3   79.9   82.6   82.4
  R4   82.3   82.5   79.2   79.1   84.4   84.5   74.7   78.1   73.9   84.6   78.9   79.1
  R5   84.5   78.5   84.7   83.2   85.3   85.2   83.3   80.5   84.4   87.2   81.7   82.5
  平均值   79.2   80.9   82.6   79.5   82.1   81.7   78.9   79.9   83.2   83.4   82.7   83.4
总计SEM＝0.8
                               最终猪重量(kg)
                                  阉公猪                               小母猪
  1   2   3   4   5   6   1   2   3   4   5   6
  R1   111.3   121.2   121.9   115.9   112.9   111.1   105.9   109.5   119.9   116.1   105.4   130.1
  R2   111.5   119.6   132.7   111.9   121.3   116.3   105.8   115.6   118.3   115.3   123.3   112.5
  R3   115.9   126.4   117.1   119.9   114.0   120.7   104.9   107.9   123.6   125.2   127.1   130.8
  R4   116.6   117.9   110.0   110.0   119.7   122.1   120.2   121.6   117.9   127.7   109.3   123.0
  R5   118.3   111.6   122.3   114.2   123.0   117.1   115.2   110.4   119.2   135.1   119.1   117.1
  平均值   114.7   119.3   120.8   114.4   118.2   117.5   110.3   113.0   119.8   123.9   116.8   122.7
总计SEM＝3.0(Sex x Diet，P＜0.10)
对照：性别 xPi(2)对肌醇六磷酸酶(3-6)，P＜0.05.
处理：
1.P不足的玉米-大豆粗粉基础饮食
2.和1相同+0.10％来自KH2PO4的Pi
3.和1相同+250FTU/kg r-AppA2肌醇六磷酸酶
4.和1相同+500FTU/kg r-AppA2肌醇六磷酸酶
5.和1相同+1000FTU/kg r-AppA2肌醇六磷酸酶
6.和1相同+10,000FTU/kg r-AppA2肌醇六磷酸酶
                                           增重，开始-转换(g/d)
                        阉公猪                  小母猪
  1   2   3   4   5   6   1   2   3   4   5   6
 R1  1024  1163  1233  931  1061  1055  816  836  1040  911  909  1063
 R2  993  1135  1353  1140  1178  1283  867  966  1068  986  1055  936
 R3  979  1162  1048  1131  1109  1028  829  801  955  935  965  971
 R4  1025  1028  936  921  1057  1046  822  936  847  1001  925  952
 R5  931  983  963  881  1109  984  950  870  962  1048  895  918
 平均值  990  1094  1107  1001  1103  1079  857  882  974  976  950  968
总计SEM＝0.24
对比：阉公猪(Ba)对小母猪(GI)，P＜0.01；1对2-6，P＜0.01
                             增重，转换-终结(g/d)
                        阉公猪                     小母猪
  1   2   3   4   5   6   1   2   3   4   5   6
  R1   832   979   945   1023   855   818   706   794   844   865   604   1095
  R2   890   1000   1174   822   1001   833   688   874   835   830   974   784
  R3   919   1013   870   889   762   974   545   593   829   888   871   949
  R4   927   971   832   833   954   1015   893   854   861   904   596   862
  R5   912   895   1018   836   1020   864   531   499   581   798   624   577
  平均值   896   972   968   881   918   901   673   723   790   857   734   853
总计SEM＝37
对照：Ba对GI，P＜0.05
                                                   增重，总计(g/d)
                        阉公猪                       小母猪
  1   2   3   4   5   6   1   2   3   4   5   6
  R1   909   1053   1060   986   937   913   760   814   940   887   752   1079
  R2   931   1054   1246   949   1072   1013   775   919   948   906   1013   858
  R3   941   1066   934   976   888   993   660   678   880   907   910   958
  R4   975   1006   882   876   1004   1030   864   887   855   944   730   898
  R5   922   938   992   858   1063   922   703   652   738   901   735   717
  平均值   935   1023   1023   929   993   974   752   790   872   909   828   902
总计SEM＝38(性别 x 饮食，P＜0.10)
对照：性别 xPi(2)对肌醇六磷酸酶(3-6)，P＜0.05
处理：
1.P不足的玉米-大豆粗粉基础饮食
2.和1相同+0.10％来自KH2PO4的Pi
3.和1相同+250FTU/kg r-AppA2肌醇六磷酸酶
4.和1相同+500FTU/kg r-AppA2肌醇六磷酸酶
5.和1相同+1000FTU/kg r-AppA2肌醇六磷酸酶
6.和1相同+10,000FTU/kg r-AppA2肌醇六磷酸酶
                                    饲料摄入，开始-转换(g/d)
                          阉公猪                              小母猪
  1   2   3   4   5   6   1   2   3   4   5   6
  R1   2670   2733   2947   2271   2516   2448   2152   2029   2437   2074   2211   2579
  R2   2541   2564   2940   2590   244   2899   2425   2068   2543   2326   2363   1979
  R3   2277   2499   2338   2385   2601   2066   2134   2020   2388   2168   2207   2093
  R4   2371   2370   2311   2206   2457   2077   2104   2230   1919   2139   2260   2215
  R5   2665   2312   2603   2308   2696   2366   2008   1289   2396   2237   1494   1866
  平均值   2505   2496   2628   2352   2551   2371   2165   1927   2337   2189   2107   2146
总计SEM＝67
对照：Ba对Gi，P＜0.01
                                       饲料摄入，转换-终结(g/d)
                                 阉公猪                         小母猪
  1   2   3   4   5   6   1   2   3   4   5   6
  R1   3181   3427   3559   3270   2962   2918   2443   2615   2890   2651   2094   3739
  R2   2922   3039   3833   3011   3141   3147   2481   2652   2936   2796   3316   2565
  R3   3087   3330   2847   2877   2904   2686   2241   2110   2849   2692   2820   2952
  R4   2978   2945   2872   2646   3104   2876   2935   2946   2373   2685   2481   2836
  R5   3244   2958   3549   3106   3517   3008   2307   1747   2728   2947   2224   2385
  平均值   3082   3140   3332   2982   3126   2926   2482   2414   2755   2754   2587   2895
总计SEM＝105
对照：Ba对Gi，P＜0.01
                                       饲料摄入，总计(g/d)
                      阉公猪                      小母猪
  1   2   3   4   5   6   1   2   3   4   5   6
  R1   2977   3149   3314   2870   2784   2726   2302   2330   2670   2370   2151   3175
  R2   2770   2849   3476   2842   2878   3048   2454   2368   2745   2568   2853   2280
  R3   2794   3030   2663   2699   2794   2462   2197   2073   2661   2479   2571   2603
  R4   2683   2632   2599   2432   2790   2488   2597   2655   2188   2463   2391   2583
  R5   2963   2644   3089   2718   3118   2696   2184   1559   2591   2654   1993   2171
  平均值   2837   2861   3028   2712   2873   2684   2347   2197   2571   2507   2378   2562
总计SEM＝81
对照：Ba对GI，P＜0.01
处理：
1.P不足的玉米-大豆粗粉基础饮食
2.和1相同+0.10％来自KH2PO4的Pi
3.和1相同+250FTU/kg r-AppA2肌醇六磷酸酶
4.和1相同+500FTU/kg r-AppA2肌醇六磷酸酶
5.和1相同+1000FTU/kg r-AppA2肌醇六磷酸酶
6.和1相同+10,000FTU/kg r-AppA2肌醇六磷酸酶
                       增重/饲料，开始-转换(g/d)
                    阉公猪                     小母猪
  1   2   3   4   5   6   1   2   3   4   5   6
  R1   383   425   418   410   421   431   379   412   427   439   411   412
  R2   391   443   460   440   474   442   357   467   420   424   447   473
  R3   430   465   448   474   427   498   388   396   400   431   437   464
  R4   432   434   405   418   430   504   390   420   441   468   409   430
  R5   349   425   370   382   411   416   473   675   402   469   599   492
  平均值   397   438   420   425   433   458   397   474   418   446   461   454
总计SEM＝12
对照：1对2-6，P＜0.01；3对4-6，P＜0.10
                            增重/饲料，转换-终结(g/d)
                  阉公猪                    小母猪
  1   2   3   4   5   6   1   2   3   4   5   6
  R1   262   286   265   313   289   281   289   304   292   326   289   293
  R2   305   329   306   273   319   265   277   329   285   297   294   306
  R3   298   304   307   309   262   363   243   281   291   330   309   321
  R4   311   329   290   315   307   353   304   290   363   337   240   304
  R5   281   303   287   269   290   287   230   285   213   271   281   242
  平均值   291   310   291   296   293   310   269   298   289   312   283   293
总计SEM＝8
                                      增重/饲料总计(g/d)
                阉公猪                 小母猪
  1   2   3   4   5   6   1   2   3   4   5   6
  R1   305   334   320   344   337   335   330   349   352   374   350   340
  R2   336   370   358   334   372   332   316   388   345   353   355   376
  R3   337   352   351   362   318   403   301   327   331   366   354   368
  R4   363   381   339   361   360   414   333   334   391   383   305   348
  R5   311   355   321   316   341   342   322   418   285   340   382   330
  平均值   331   358   338   343   346   365   320   363   341   363   349   352
总计SEM＝8
对照：1对2-6，P＜0.01
处理：
1.P不足的玉米-大豆粗粉基础饮食
2.和1相同+0.10％来自KH2PO4的Pi
3.和1相同+250FTU/kg r-AppA2肌醇六磷酸酶
4.和1相同+500FTU/kg r-AppA2肌醇六磷酸酶
5.和1相同+1000FTU/kg r-AppA2肌醇六磷酸酶
6.和1相同+10,000FTU/kg r-AppA2肌醇六磷酸酶
                                                           腓骨干重(g)
                        阉公猪                           小母猪
  1   2   3   4   5   6   1   2   3   4   5   6
  R1   8.18   10.90   11.45   12.11   10.08   12.08   7.54   10.95   9.92   9.42   9.87   11.29
  R2   8.84   11.74   8.66   10.98   11.21   11.66   7.96   8.81   9.33   11.41   10.70   12.73
  R3   8.54   11.29   9.81   11.90   10.10   12.77   8.62   10.25   9.94   10.50   11.86   12.46
  R4   9.82   10.69   9.06   10.22   11.05   12.40   8.26   11.61   9.67   10.92   10.91   10.49
  R5   7.88   8.88   10.33   10.51   12.01   11.26   7.68   9.51   11.16   11.48   10.10   11.44
  平均值   8.65   10.70   9.86   11.14   10.89   12.03   8.01   10.23   10.00   10.75   10.69   11.68
总计SEM＝0.27
对照：1对2-6，P＜0.01；3对4-6，P＜0.01
                                                   腓骨灰分重(g)
                     阉公猪                                   小母猪
  1   2   3   4   5   6   1   2   3   4   5   6
  R1   4.37   6.32   6.34   6.90   6.03   6.94   4.06   6.42   5.21   5.33   5.61   6.78
  R2   4.26   7.05   5.12   6.49   6.24   6.80   4.36   5.18   5.51   6.25   6.21   7.16
  R3   4.51   6.54   5.78   7.17   5.81   7.49   4.35   5.91   6.11   5.79   6.93   7.23
  R4   5.34   6.35   5.19   5.90   6.73   7.33   4.28   7.13   5.66   6.35   6.56   6.22
  R5   4.37   5.22   6.02   6.34   7.06   6.64   3.91   5.64   7.02   6.25   5.88   6.93
  平均值   4.57   6.30   5.69   6.56   6.37   7.04   4.19   6.06   5.90   5.99   6.24   6.86
总计SEM＝0.17
对照：Ba对GI，P＜0.10；1对2-6，P＜0.01；3对4-6，P＜0.01；4对5-6，P＜0.10；5对6，P＜0.01
                                                 腓骨灰分百分比(％)
                              阉公猪                              小母猪
  1   2   3   4   5   6   1   2   3   4   5   6
  R1   53.42   57.98   55.37   56.98   59.82   57.45   53.85   58.63   52.52   56.58   56.84   60.05
  R2   48.19   60.05   59.12   59.11   55.66   58.32   54.77   58.80   59.06   54.78   58.04   56.25
  R3   52.81   57.93   58.92   60.25   57.52   58.65   50.46   57.66   61.47   55.14   58.43   58.03
  R4   54.38   59.40   57.28   57.73   60.90   59.11   51.82   61.41   58.53   58.15   60.13   59.29
  R5   55.46   58.78   58.28   60.32   58.78   58.7   50.91   59.31   62.90   54.44   58.22   60.58
  平均值   52.85   58.83   57.79   58.88   58.54   58.50   52.36   59.16   58.90   55.82   58.33   58.84
总计SEM＝0.65
对照：1对2-6，P＜0.01
处理：
1.P不足的玉米-大豆粗粉基础饮食
2.和1相同+0.10％来自KH2PO4的Pi
3.和1相同+250FTU/kg r-AppA2肌醇六磷酸酶
4.和1相同+500FTU/kg r-AppA2肌醇六磷酸酶
5.和1相同+1000FTU/kg r-AppA2肌醇六磷酸酶
6.和1相同+10,000FTU/kg r-AppA2肌醇六磷酸酶
                                                            跖骨干重(g)
                            阉公猪                        小母猪
  1   2   3   4   5   6   1   2   3   4   5   6
  R1   11.42   14.03   15.84   15.36   14.43   13.85   11.77   15.90   16.00   15.48   12.65   15.05
  R2   11.89   14.52   13.27   14.26   13.73   15.06   11.66   13.74   14.14   14.19   13.75   14.87
  R3   14.01   14.45   13.20   13.99   14.91   17.43   10.52   12.20   11.95   16.31   17.53   17.13
  R4   12.25   14.38   12.54   15.99   15.26   17.01   11.68   13.49   13.16   14.20   12.77   14.23
  R5   12.55   13.30   14.30   14.36   17.79   14.29   11.26   12.76   12.47   16.93   12.78   13.10
  平均值   12.42   14.14   13.83   14.79   15.22   15.53   11.38   13.62   13.54   15.42   13.90   14.88
总计SEM＝0.44
对照：1对2-6，P＜0.01；3对4-6，P＜0.05
                                              跖骨灰分重量(g)
                    阉公猪     小母猪
  1   2 3  4 5 6  1  2  3  4  5  6
 R1 5.28  6.59  7.97  6.93  6.74  6.86  4.74  7.21  6.72  7.09  6.07  7.50
 R2 6.81  7.10  5.94  6.74  6.32  7.44  4.84  6.28  6.40  6.55  6.71  7.07
 R3 4.82  6.95  6.41  6.77  6.72  7.88  4.82  5.59  6.67  6.99  8.13  8.11
 R4 4.83  6.81  6.26  7.73  7.88  7.48  4.86  7.27  5.92  7.15  6.97  7.13
 R5 5.20  5.75  7.22  6.99  8.33  7.14  5.24  6.61  6.65  7.07  6.04  6.55
 平均值 5.39  6.64  6.76  7.03  7.20  7.36  4.90  6.59  6.47  6.97  6.78  7.27
总计SEM＝0.18
对照：1对2-6，P＜0.01；3对4-6，P＜0.05
                                                           跖骨灰分百分比(％)
                           阉公猪                       小母猪
  1   2   3   4   5   6   1   2   3   4   5   6
  R1   46.25   46.99   50.31   45.15   46.75   49.56   40.22   45.37   42.01   45.80   47.96   49.84
  R2   39.90   48.90   44.75   47.16   46.02   49.39   41.50   45.72   45.27   46.18   48.80   47.55
  R3   34.38   48.12   48.59   48.36   45.09   45.18   45.84   45.78   55.84   42.87   46.39   47.35
  R4   39.44   47.27   49.89   48.36   51.65   43.98   41.63    53.93   44.97   50.32   54.59   50.11
  R5   41.44   43.26   50.50   48.69   46.81   49.95   46.50    51.82   53.33   41.74   47.28   50.00
  平均值   40.28   46.91   48.81   47.54   47.26   47.61   43.14    48.52   48.28   45.38   49.00   48.97
总计SEM＝1.05
对照：1对2-6，P＜0.01
实施例14
对猪喂以酵母表达的肌醇六磷酸酶的体内作用
该方法如实施例8所述，除了处理小组如下：
28-天时间间期
1.基础-0.08％可获得磷
2.基础+0.05来自磷酸一钠的磷
3.基础+0.10来自磷酸一钠的磷
4.基础+0.15来自磷酸一钠的磷
5.基础+250FTU/kg实验肌醇六磷酸酯产物
6.基础+500FTU/kg实验肌醇六磷酸酯产物
7.基础+1,000FTU/kg实验肌醇六磷酸酯产物
8.基础+2,000FTU/kg实验肌醇六磷酸酯产物
9.基础+Natuphosg 500FTU/kg
下面的表中给出结果。结果表明AppA2和磷酸盐一样提高骨质量和矿物质含量并且改善增重/饲料之比。
                  肌醇六磷酸酶补充对猪生长表现和骨灰分的作用a
加入的NaH2PO4H2Oh 0.00    0.05     0.10      0.15
肌醇六磷酸酶单位/gc                                        250      500     1,000     2,000     500       S.E.
                                                                                        BASF
  每日增重kgij        0.35g  0.39fg  0.46de   0.49d   0.38g   0.42ef  0.47d    0.49d    0.42f    0.01
每日饲料摄入，kgj     0.75f  0.75f   0.81def  0.85d   0.77ef  0.79def  0.83def  0.85d    0.85de   0.07
     G:Fijk            0.48f  0.53de  0.57d   0.58d   0.50ef  0.54de   0.57d    0.57d    0.49ef   0.02
腓骨灰分，gij          0.57h  0.65gh  0.77f   0.88c   0.59h   0.72f   0.85e    0.97d    0.70fg   0.03
腓骨灰分，％ij         34.6h  36.0gh  37.8g   41.5de  33.9h   38.2fg   40.4ef   42.6d    38.5f    0.84
可利用率％  Pl         18.43g -----    -----    -----    22.56g  38.31f   53.56e   66.71d   34.47f   4.07
  aP摄入，g/dijl        0.58g  0.92g  1.45f   1.92c   0.68g   1.22f    1.81e    2.31d    1.17f    0.13
  补充aP摄入，           0.02h  0.34gh 0.84f   1.27e   0.12h   0.62fg    1.17e    1.64d    0.57fg   0.13
g/dijm
a情况数据对每栏两头猪重复试验六次；骨数据每栏两头猪重复试验六次，除了以500单位/克加入肌醇六磷酸酶处理重复五次。
b向基础饮食加入的来自磷酸一钠(NaH2PO4H2O)的磷。
c向基础饮食加入的补充肌醇六磷酸酶。
d，e，f，g，h没有共同上角注的行中的平均值是不同的(P＜0.05)。
i加入的来自磷酸一钠的磷的线性作用(P＜0.001)。
j补充肌醇六磷酸酶的线性作用(P＜0.001)。
kUF肌醇六磷酸酶对BASF肌醇六磷酸酶(P＜0.07)
l假设玉米，大豆粉，和磷酸一钠中的磷分别是11，25，和100％可利用。
m假设磷酸一钠中的磷是100％可利用。
实施例15
对鸡和猪喂以酵母表达的肌醇六磷酸酶的体内作用
下表中总结的用于研究的程序和实施例8所述一样。各表中给出处理小组并且下面的表(见下)中给出基础饮食组成。结果表明，在提高骨质量和矿物质含量并且改善增重/饲料之比方面，AppA2(ECP)和磷酸盐一样有效。结果还表明，在提高生物可利用磷酸盐方面，AppA2比Natuphos和Ronozyme更有效。此外，结果表明，AppA2和磷酸盐一样有效地提高蛋重和蛋产量。
                 饮食的组分百分比(以进食为基础)
                                         FINISHING  猪分析
                       鸡分析  小猪       50-80    80-120   下蛋母
    成分                       分析         kg       kg      鸡分析
玉米淀粉
                      至100   至100        至100     至100    -
玉米                  50.89   60.85        78.42     83.85    63.65
大豆粉，去壳          39.69   31.19        18.08     12.65    25.65
豆油                  5.00    3.00         -         -        -
石灰石，磨细          1.67    1.06         1.06      1.07     9.80
盐                    0.40    -            -         -        0.40
磷酸二钙              -       -            0.16      -        -
痕量矿物质预混物      0.15a  0.35b      0.35b    0.35b   0.20a
维生素预混物          0.20c  0.20d      0.10d    0.10d   0.15c
氯化胆碱(60％)        0.20    -            -         -        0.05
抗生素预混物          0.05e  1.00f      0.75g    0.75g   -
硫酸铜                -       0.08         -         -        -
L-赖氨酸HCl，饲料级   -       0.17         0.16      0.11     -
L-苏氨酸，饲料级      -       -            0.02      -        -
DL-甲硫氨酸，饲料级   0.20    0.05         -         -        0.10
化学成分
粗蛋白，％h          22.6    20.8         15.1      13.0     17.0
总的磷，％h          0.42    0.35         0.38      0.32     0.34
可利用磷，％i        0.10    0.075        0.09      0.05     0.07
钙，％i              0.75    0.60         0.50      0.45     3.8
ME，kcal/kgi         3123    3387         3293      3295     2758
a每公斤完全饮食补充如下：Fe，75mg(FeSO4H2O)；Zn，100mg(ZnO)；Mn，75mg(MnO)；Cu，8mg(CuSO4H2O)；I，0.35mg(CaI2)；Se，0.3mg(Na2SeO3)；NaCl，3g。
b每公斤完全饮食补充如下：Fe，90mg(FeSO4H2O)；Zn，100mg(ZnO)；Mn，20mg(MnO)；Cu，8mg(CuSO4H2O)；I，0.35mg(CaI2)；Se，.0.3mg(Na2SeO3)；NaCl，3g。
c每公斤完全饮食补充如下：乙酸视黄酯，1,514μg；维生素D-3，25μg；DL-α-生育酚乙酸盐，11mg；甲萘醌亚硫酸氢钠复合物，2.3mg；烟酸，22mg；D-Ca-泛酸盐，10mg；核黄素，4.4mg；维生素B12，11μg。
d每公斤完全饮食补充如下：乙酸视黄酯，2,273微克；维生素D-3，16.5微克；DL-α-生育酚乙酸盐，88mg；甲萘醌，4.4mg(甲萘醌亚硫酸氢钠复合物)；烟酸，33mg；D-Ca-泛酸盐，24.2mg；核黄素，8.8mg；维生素B12，35μg；氯化胆碱，319mg。
e每公斤完全饮食补充50mg肝菌肽。
f每公斤完全饮食补充55mg的mecadox。
g每公斤完全饮食补充38mg罗沙胂。
h分析的(AOAC，1999)。
i计算的(NRC，1994；NRC，1998)。
*对两种不同的酶对鸡的相对磷生物可利用率影响的评价(鸡分析1)a。
    饮食  增重，g 增重/饲料g/kg         胫骨灰分  生物可利用P，％
  ％   mg
1.基础饮食   259e   617d   28.1f 264f     -
2.和1相同  +0.05％Pi(KH2PO4)   290d   654c   32.2d 311e     -
3.和1相同  +0.10％Pi(KH2PO4)   323c   639cd   36.4c 414d     -
4.和1相同+500FTU/kg Natuphos)   289d   666c   30.0c 293e     0.027d
5.和1相同  +500FTU/kg ECP   346c   656c   37.8c 448c     0.124c
总计SEM   6   10     0.5 10     0.006
a值是孵化之后8-22天时间喂以实验饮食的五栏四只公鸡的平均值；开始的平均体重是91g。
b作为补充P摄入(g)函数的饮食1-3的胫骨灰分(mg)的线性回归是Y＝257.1±9.8+299.0±30.7X(r2＝0.88)；通过从标准曲线获得的等值生物可利用P摄入(g)除以饲料摄入(g)，再乘以100来计算，确定饮食4和5的生物可利用P浓度(等值P产率)。
c，d，e，f不同上角注栏中的平均值是不同的，P＜0.05。
*用两种不同的酶喂养的鸡的相对磷生物可利用率(鸡分析2)a。
    饮食   增重，g   增重/饲料g/kg          胫骨灰分  生物可利用P，％
  ％   mg
  1.基础饮食     176k     569k   24.9k   183k     -
  2.和1相同  +0.05％Pi(KH2PO4)     253hi     680h   30.0h   272h     -
  3.和1相同  +0.10％Pi(KH2PO4)     293g     703igh   34.3g   347g     -
  4.和1相同  +0.15％Pi(KH2PO4)     333f     731ef   37.3e   455e     -
  5.和1相同+500FTU/kg Natuphosc     218j     620j   27.2j   224j     0.026g
  6.和1相同+500FTU/kg Natuphosd     236ij     632j   27.5ij   236ij     0.032ig
  7.和1相同+1,000FTU/kg Natuphosd     265i     675gh   28.9hi   262hi     0.048i
  8.和1相同+500FTU/kg Ronozyme     219j     634j   26.9j   223j     0.028g
  9.和1相同+1,000FTU/kg Ronozyme     245i     682gh   27.5ij   242hij     0.038ig
  10.和1相同  +500FTU/kgECP     318ef     708igh   36.5ef   409f     0.125e
  总计SEM     7     10   0.6   12     0.006
a值是孵化之后8-22天时间喂以实验饮食的五栏四只公鸡的平均值；开始的平均体重是83g。
b作为补充P摄入(g)函数的饮食1-4的胫骨灰分(mg)的线性回归是Y＝187.9±8.7+393.4±21.2X(r2＝0.95)；通过从标准曲线获得的等值生物可利用P摄入(g)除以鸡饲料摄入(g)，再乘以100来计算，确定饮食4-11的生物可利用P浓度(等值P产率)。
c来自和鸡分析1使用的相同的批量的酶。
d来自和鸡分析1使用的不相同的批量的酶。
c，f，g，h，i，j，k不同上角注栏中的平均值是不同的，P＜0.05。
*大肠杆菌肌醇六磷酸酶对鸡的磷释放效率的活性水平的作用(鸡分析3)a。
    饮食   增重，g   增重/饲料g/kg 胫骨灰分 生物可利用P，％b
  mg
1.基础饮食   219h     661c   237i     -
2.和1相同+0.05％Pi(KH2PO4)   283ig     692d   299h     -
3.和1相同+0.10％Pi(KH2PO4)   314c     720c   413g     -
4.和1相同  +0.15％Pi(KH2PO4)   327dc     731c   490e     -
5.和1相同  +500 FTU/kgECP   321dc     731c   447i     0.125c
6.和1相同  +1,000FTU/kg ECP   335cd     732c   559d     0.183d
7.和1相同  +1,500FTU/kgECP   344c     737c   616c     0.211c
8.和1相同+500 FTU/kg Natuphos   276g     691d   290h     0.037i
总计SEM   6     10   12     0.005
a值是孵化之后8-22天时间喂以实验饮食的五栏四只公鸡的平均值；开始的平均体重是97g。
b作为补充P摄入(g)函数的饮食1-4的胫骨灰分(mg)的线性回归是Y＝232.0±6.9+389.9±16.7X(r2＝0.97)；通过从标准曲线获得的等值生物可利用P摄入(g)除以鸡饲料摄入(g)，再乘以100来计算，确定饮食5-8的生物可利用P浓度(等值P产率)。
c，d，e，f，g，h，i不同上角注栏中的平均值是不同的，P＜0.05。
联合的3-和6-肌醇六磷酸酶对喂以玉米-豆粉饮食的鸡的Pi释放不产生协同作用(鸡分析4)a。
饮食 增重，g 增重/饲料g/kg   胫骨灰分 生物可利用P，％b
  ％   mg
  1.基础饮食   137g   610g   25.4g   134h   -
  2.和1相同+0.05％Pi(KH2PO4)   191ef   678de   29.0f   198ig   -
  3.和1相同+0.10％Pi(KH2PO4)   225d   712d   32.8e   253e   -
  4.和1相同+0.15％Pi(KH2PO4)   276c   762c   36.3d   339d   -
  5.和1相同+500FTU/kg Natuphos   192ef   624fg   28.0f   187g   0.041g
  6.和1相同+500FTU/kg Ronozyme   182i   655cf   27.7f   188g   0.047ig
  7.和1相同+500FTU/kg ECP   272c   760c   37.0d   343d   0.153d
  8.和5相同+6   211de   693de   28.3f   212ig   0.064ef
  9.和5相同+7   282c   763c   37.8d   360d   0.162d
  10.和1相同+1,000FTU/kg Natuphos   217d   703d   29.0i   217i   0.067c
  11.和1相同+1,000FTU/kg Ronozyme   201def   666ef   27.9i   194ig   0.050efg
  12.和1相同+1,000FTU/kg ECP   292c   758c   41.1c   433c   0.206c
  总计SEM   9   15   0.6   10   0.007
a值是孵化之后8-22天时间喂以实验饮食的五栏四只公鸡的平均值；开始的平均体重是68g。
b作为补充P摄入(g)函数的饮食1-4的胫骨灰分(mg)的线性回归是Y＝138.6±4.9+371.3±14.7X(r2＝0.97)；通过从标准曲线获得的等值生物可利用P摄入(g)除以鸡饲料摄入(g)，再乘以100来计算，确定饮食5-8的生物可利用P浓度(等值P产率)。
c，d，e，f，g不同上角注栏中的平均值是不同的，P＜0.05。
 第1-4周大肠杆菌肌醇六磷酸酶对产蛋母鸡行为的影响a。
饮食   开始时母鸡重，g    4-周母鸡重，g   饲料摄取，g/d   蛋产量，％b   蛋重，g
 1.没有P的基础饮食     1716     1593     90     54.0     61.0
 2.和1相同+0.10％Pi     1725     1748     122     84.8     64.2
 3.和1相同+150FTU/kg ECP     1733     1771     119     83.7     63.8
 4.和1相同+300FTU/kg ECP     1798     1806     119     82.3     65.4
 5.和1相同+10,000FTU/kg ECP     1746     1770     123     85.9     65.1
 总计SEM     26     21c     2c     1.6c     0.7c
a数据是研究期间头四周12只母鸡重复四次的平均值。
b利用协方差分析蛋产量(％)；给出的数据是最小平方分析平均值。
cD饮食1对饮食2-5，P＜0.01。
第5-12周大肠杆菌肌醇六磷酸酶对产蛋母鸡行为的影响a。
                            4-周母鸡  饲料摄入， 蛋产量， 蛋重，
饮食
                              重，g      g/d       ％b    g
2.和1相同+0.10％ Pi           1830       120       80.5    64.0
3.和1相同+150FTU/kg ECP       1796       118       80.6    64.1
4.和1相同+300FTU/kg ECP       1833       116       77.2    65.5
5.和1相同+10,000FTU/kg ECP    1830       120       81.2    64.8
总计SEM                       24         2         2.5     0.5c
a数据是研究期间第5-12周12只母鸡重复四次的平均值。因为蛋产量不好，所以从研究中去除饮食1。
b利用协方差分析蛋产量(％)；给出的数据是最小平方分析平均值。
cD饮食3对饮食4和5，P＜0.01。
第1-12周大肠杆菌肌醇六磷酸酶对产蛋母鸡行为的影响a。
          母鸡重    饲料摄入，g/d   蛋产量，％b   蛋重，g
    饮食 开始 4-周 12-周
 1.没有P的基础饮食  1716  1593   -     90     53.8   61.0
 2和1相同+0.10％PI  1725  1748   1830     121     81.2   64.1
 3.和1相同+150FTU/kg ECP  1733  1771   1796     118     80.7   64.1
 4.和1相同+300FTU/kg ECP  1798  1806   1833     117     77.8   65.5
 5.和1相同+10,000FTU/kg ECP  1746  1770   1830     121     82.9   64.8
 总计SEM  26  21c   24     2c     2.1c   0.7c
a数据是12只母鸡重复四次的平均值。对于饮食1，数据是头四周的平均值，对于饮食2-5，数据是全部12周的平均值。
b利用协方差分析蛋产量(％)；给出的数据是最小平方分析平均值。
cD饮食1对饮食2-5，P＜0.01。
喂以不同phrase酶的小猪磷的相对生物可利用率(猪分析1)。
  饮食 增重，g/da 增重/饲料，g/kga        腓骨灰分   生物可利用P，％c
  ％   mg
1.基础饮食   369f   533i   29.3g 666i     -
2.和1相同+0.05％Pi(KH2PO4)   435e   576ef   32.8i 766hi     -
3.和1相同+0.10％Pi(KH2PO4)   476de   618de   36.6d 972ef     -
4.和1相同+0.15％Pi(KH2PO4)   509d   660d   36.6d 1123d     -
5.和1相同+400FTU/kg Natuphos   460c   605de   34.4def 889fg     0.081dc
6.和1相同+400FTU/kg Ronozyme   445e   565ef   33.5ef 805gh     0.043f
7.和1相同+400FTU/kgECP   443e   583ef   35.0def 968ef     0.108d
总计SEM   17   21   0.8 38     0.016
a数据是23天喂养期10只喂养的猪的平均值；开始的平均体重是8.4kg。
b数据是5只喂养的猪的平均值，选自在23天喂养期结束时的中间重量(median-weight blocks)
c作为补充P摄入(g)函数的饮食1-4的腓骨灰分(mg)的线性回归是Y＝664.5±25.5+15.3±1.4X(r2＝0.87)；通过从标准曲线获得的等值生物可利用P摄入(g)除以猪的饲料摄入(g)，再乘以100来计算，确定饮食5-7的生物可利用P浓度(等值P产率)。
d，e，g，h，i不同上角注栏中的平均值是不同的，P＜0.05。
           大肠杆菌肌醇六磷酸酶对finishing猪行为的影响(猪分析2)a
                                       饮食处理
                没有P的       和1相同+    和1相同+250    和1相同+500    和1相同+1,000   和1相同+10,000    总计
响应变数        基础饮食      0.10％Pi    FTU/kg ECP     FTU/kg ECP      FTU/kg ECP     FTU/kg ECP        SEM
每日增重，gb
阉公猪            935          1023        1023            929            993           974
小母猪            752          790         872             909            828           902
平均值            844          907         947             919            910           938               38
Daily feed，gc
阉公猪            2837         2861        3028            2712           2873          2684
小母猪            2347         2197        2571            2507           2378          2562
平均值            2592         2529        2800            2610           2625          2623              81
Gain/fed，g/kgd
阉公猪            331          358         338             343            346           365
小母猪            320          363         341             363            349           352
平均值            325          361         339             353            347           359               9
a数据是喂以实验饮食的体重48.9至117.6kg公母各五头喂养的猪的平均值。
b公母x饮食相互作用。P＜O.10；公母x Pi对肌醇六磷酸酶-补充的饮食，P＜0.05。
c阉公猪对小母猪，P＜0.01。
dP-不足对Pi-和肌醇六磷酸酶-补充饮食，P＜O.01。
大肠杆菌肌醇六磷酸酶对finishing猪骨特征的影响(猪分析2)a
                            饮食处理
                   P-不足    和1相同+    和1相同+250  和1相同+500    和1相同+1,000  和1相同+10,000     总计
响应变数
                  基础饮食    0.10％Pi    FTU/kg ECP   FTU/kg ECP     FTU/kg ECP      FTU/kg ECP       SEM
腓骨灰分，％gb
  阉公猪             52.9       58.8         57.8          58.9          58.5         58.5
  小母猪             52.4       59.2         58.9          55.8          58.3         58.8
  平均值             52.6       59.0         58.3          57.3          58.4         58.7             0.7
腓骨灰分，gbedef
  阉公猪             4.57       6.30         5.69          6.56          6.37         7.04
  小母猪             4.19       6.06         5.90          5.99          6.24         6.86
  平均值             4.38       6.18         5 80          6.28          6.31         6.95             0.17
  跖骨灰分，％b
  阉公猪             40.3       46.9         48.8          47.5          47.3         47.6
  小母猪             43.1       48.5         48.3          45.4          49.0         49.0
  平均值             41.7       47.7         48.5          46.5          48.1         48.3             1.1
跖骨灰分，gbd
  阉公猪             5.4        6.6          6.8           7.0           7.2          7.4
  小母猪             4.9        6.6          6.5           7.0           6.8          7.3
  平均值             5.1        6.6          6.6           7.0           7.0          7.3              0.2
a数据是喂以实验饮食的体重48.9至117.6kg公母各五头喂养的猪的平均值。
bP-不足对Pi-和肌醇六磷酸酶-补充饮食，P＜0.01。
c阉公猪对小母猪，P＜0.10。
d250U/kg对较高肌醇六磷酸酶活性水平，P＜0.01。
c500U/kg对1,000和10,000U/kg肌醇六磷酸酶，P＜0.10。
f1,000U/kg对10,000U/kg肌醇六磷酸酶，P＜0.01。
                                序列表
<110>Phytex.L.L.C.
      Webel，Douglas M.
      Orr，Donald E.
      Ruch，Frank E.
<120>含有肌醇六磷酸酶的动物食物和方法
<130>834460-71726
<150>US 60/335303
<151>2001-10-31
<160>14
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>1489
<212>DNA
<213>大肠杆菌(Escherichia coli)
<220>
<221>引物_结合
<222>(1)..(22)
<223>
<220>
<221>引物_结合
<222>(1468)..(1489)
<223>
<220>
<221>CDS
<222>(16)..(108)
<223>
<220>
<221>CDS
<222>(182)..(1480)
<223>
<400>1
taaggagcag aaaca atg tgg tat ttc ctt tgg ttc gtc ggc att ttg ttg    51
                 Met Trp Tyr Phe Leu Trp Phe Val Gly Ile Leu Leu
                 1               5                   10
atg tgt tcg ctc tcc acc ctt gtg ttg gta tgg ctg gac ccg cga ttg     99
Met Cys Ser Leu Ser Thr Leu Val Leu Val Trp Leu Asp Pro Arg Leu
        15                  20                  25
aaa agt taa cgaacgtaag cctgatccgg cgcattagcg tcgatcaggc             148
Lys Ser
    30
aataatatcg gatatcaaag cggaaacata tcg atg aaa gcg atc tta atc cca    202
                                     Met Lys Ala Ile Leu Ile Pro
                                                     35
ttt tta tct ctt ttg att ccg tta acc ccg caa tct gca ttc gct cag     250
Phe Leu Ser Leu Leu Ile Pro Leu Thr Pro Gln Ser Ala Phe Ala Gln
        40                  45                  50
agt gag ccg gag ctg aag ctg gaa agt gtg gtg att gtc agc cgt cat    298
Ser Glu Pro Glu Leu Lys Leu Glu Ser Val Val Ile Val Ser Arg His
    55                  60                  65
ggt gtg cgt gcc cca acc aag gcc acg caa ctg atg cag gat gtc acc    346
Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Ala Thr Gln Leu Met Gln Asp Val Thr
70                  75                  80                  85
cca gac gca tgg cca acc tgg ccg gta aaa ctg ggt tgg ctg aca cca    394
Pro Asp Ala Trp Pro Thr Trp Pro Val Lys Leu Gly Trp Leu Thr Pro
                90                  95                  100
cgc ggt ggt gag cta atc gcc tat ctc gga cat tac caa cgc cag cgt    442
Arg Gly Gly Glu Leu Ile Ala Tyr Leu Gly His Tyr Gln Arg Gln Arg
            105                 110                 115
ctg gtg gcc gac gga ttg ctg gcg aaa aag ggc tgc ccg cag cct ggt    490
Leu Val Ala Asp Gly Leu Leu Ala Lys Lys Gly Cys Pro Gln Pro Gly
        120                 125                 130
cag gtc gcg att att gct gat gtc gac gag cgt acc cgt aaa aca ggc    538
Gln Val Ala Ile Ile Ala Asp Val Asp Glu Arg Thr Arg Lys Thr Gly
    135                 140                 145
gaa gcc ttc gcc gcc ggg ctg gca cct gac tgt gca ata acc gta cat    586
Glu Ala Phe Ala Ala Gly Leu Ala Pro Asp Cys Ala Ile Thr Val His
150                 155                 160                 165
acc cag gca gat acg tcc agt ccc gat ccg tta ttt aat cct cta aaa    634
Thr Gln Ala Asp Thr Ser Ser Pro Asp Pro Leu Phe Asn Pro Leu Lys
                170                 175                 180
act ggc gtt tgc caa ctg gat aac gcg aac gtg act gac gcg atc ctc    682
Thr Gly Val Cys Gln Leu Asp Asn Ala Asn Val Thr Asp Ala Ile Leu
            185                 190                 195
agc agg gca gga ggg tca att gct gac ttt acc ggg cat cgg caa acg    730
Ser Arg Ala Gly Gly Ser Ile Ala Asp Phe Thr Gly His Arg Gln Thr
        200                 205                 210
gcg ttt cgc gaa ctg gaa cgg gtg ctt aat ttt tcc caa tta aac ttg    778
Ala Phe Arg Glu Leu Glu Arg Val Leu Asn Phe Ser Gln Leu Asn Leu
    215                 220                 225
tgc ctt aac cgt gag aaa cag gac gaa agc tgt tca tta acg cag gca    826
Cys Leu Asn Arg Glu Lys Gln Asp Glu Ser Cys Ser Leu Thr Gln Ala
230                 235                 240                 245
tta cca tcg gaa ctc aag gtg agc gcc gac aat gtt tca tta acc ggt    874
Leu Pro Ser Glu Leu Lys Val Ser Ala Asp Asn Val Ser Leu Thr Gly
                250                 255                 260
gcg gta agc ctc gca tca atg ctg acg gaa ata ttt ctc ctg caa caa    922
Ala Val Ser Leu Ala Ser Met Leu Thr Glu Ile Phe Leu Leu Gln Gln
            265                 270                 275
gca cag gga atg ccg gag ccg ggg tgg gga agg atc act gat tca cac    970
Ala Gln Gly Met Pro Glu Pro Gly Trp Gly Arg Ile Thr Asp Ser His
        280                 285                 290
cag tgg aac acc ttg cta agt ttg cat aac gcg caa ttt tat tta cta    1018
Gln Trp Asn Thr Leu Leu Ser Leu His Asn Ala Gln Phe Tyr Leu Leu
    295                 300                 305
caa cgc acg cca gag gtt gcc cgc agt cgc gcc acc ccg tta ttg gat    1066
Gln Arg Thr Pro Glu Val Ala Arg Ser Arg Ala Thr Pro Leu Leu Asp
310                 315                 320                 325
ttg atc atg gca gcg ttg acg ccc cat cca ccg caa aaa cag gcg tat    1114
Leu Ile Met Ala Ala Leu Thr Pro His Pro Pro Gln Lys Gln Ala Tyr
                330                 335                 340
ggt gtg aca tta ccc act tca gtg ctg ttt att gcc gga cac gat act    1162
Gly Val Thr Leu pro Thr Ser Val Leu Phe Ile Ala Gly His Asp Thr
            345                 350                 355
aat ctg gca aat ctc ggc ggc gca ctg gag ctc aac tgg acg ctt cca    1210
Asn Leu Ala Asn Leu Gly Gly Ala Leu Glu Leu Asn Trp Thr Leu Pro
        360                 365                 370
ggt cag ccg gat aac acg ccg cca ggt ggt gaa ctg gtg ttt gaa cgc    1258
Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Glu Leu Val Phe Glu Arg
    375                 380                 385
tgg cgt cgg cta agc gat aac agc cag tgg att cag gtt tcg ctg gtc    1306
Trp Arg Arg Leu Ser Asp Asn Ser Gln Trp Ile Gln Val Ser Leu Val
390                 395                 400                 405
ttc cag act tta cag cag atg cgt gat aaa acg ccg cta tca tta aat    1354
Phe Gln Thr Leu Gln Gln Met Arg Asp Lys Thr Pro Leu Ser Leu Asn
            410                     415                 420
acg ccg ccc gga gag gtg aaa ctg acc ctg gca gga tgt gaa gag cga    1402
Thr Pro Pro Gly Glu Val Lys Leu Thr Leu Ala Gly Cys Glu Glu Arg
        425                     430                 435
aat gcg cag ggc atg tgt tcg ttg gcc ggt ttt acg caa atc gtg aat    1450
Asn Ala Gln Gly Met Cys Ser Leu Ala Gly Phe Thr Gln Ile Val Asn
    440                     445                 450
gaa gcg cgc ata ccg gcg tgc agt ttg taa tggtacccc                  1489
Glu Ala Arg Ile Pro Ala Cys Ser Leu
    455                 460
<210>2
<211>30
<212>PRT
<213>大肠杆菌(Escherichia coli)
<400>2
Met Trp Tyr Phe Leu Trp Phe Val Gly Ile Leu Leu Met Cys Ser Leu
1               5                   10                  15
Ser Thr Leu Val Leu Val Trp Leu Asp Pro Arg Leu Lys Ser
            20                  25                  30
<210>3
<211>432
<212>PRT
<213>大肠杆菌(Escherichia coli)
<400>3
Met Lys Ala Ile Leu Ile Pro Phe Leu Ser Leu Leu Ile Pro Leu Thr
1               5                   10                  15
Pro Gln Ser Ala Phe Ala Gln Ser Glu Pro Glu Leu Lys Leu Glu Ser
            20                  25                  30
Val Val Ile Val Ser Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Ala Thr
        35                  40                  45
Gln Leu Met Gln Asp Val Thr Pro Asp Ala Trp Pro Thr Trp Pro Val
    50                  55                  60
Lys Leu Gly Trp Leu Thr Pro Arg Gly Gly Glu Leu Ile Ala Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gly His Tyr Gln Arg Gln Arg Leu Val Ala Asp Gly Leu Leu Ala Lys
                85                  90                  95
Lys Gly Cys Pro Gln Pro Gly Gln Val Ala Ile Ile Ala Asp Val Asp
            100                 105                 110
Glu Arg Thr Arg Lys Thr Gly Glu Ala Phe Ala Ala Gly Leu Ala Pro
        115                 120                 125
Asp Cys Ala Ile Thr Val His Thr Gln Ala Asp Thr Ser Ser Pro Asp
    130                 135                 140
Pro Leu Phe Asn Pro Leu Lys Thr Gly Val Cys Gln Leu Asp Asn Ala
145                 150                 155                 160
Asn Val Thr Asp Ala Ile Leu Ser Arg Ala Gly Gly Ser Ile Ala Asp
                165                 170                 175
Phe Thr Gly His Arg Gln Thr Ala Phe Arg Glu Leu Glu Arg Val Leu
            180                 185                 190
Asn Phe Ser Gln Leu Asn Leu Cys Leu Asn Arg Glu Lys Gln Asp Glu
        195                 200                 205
Ser Cys Ser Leu Thr Gln Ala Leu Pro Ser Glu Leu Lys Val Ser Ala
    210                 215                 220
Asp Asn Val Ser Leu Thr Gly Ala Val Ser Leu Ala Ser Met Leu Thr
225                 230                 235                 240
Glu Ile Phe Leu Leu Gln Gln Ala Gln Gly Met Pro Glu Pro Gly Trp
                245                 250                 255
Gly Arg Ile Thr Asp Ser His Gln Trp Asn Thr Leu Leu Ser Leu His
            260                 265                 270
Asn Ala Gln Phe Tyr Leu Leu Gln Arg Thr Pro Glu Val Ala Arg Ser
        275                 280                 285
Arg Ala Thr Pro Leu Leu Asp Leu Ile Met Ala Ala Leu Thr Pro His
    290                 295                 300
Pro Pro Gln Lys Gln Ala Tyr Gly Val Thr Leu Pro Thr Ser Val Leu
305                 310                 315                 320
Phe Ile Ala Gly His Asp Thr Asn Leu Ala Asn Leu Gly Gly Ala Leu
                325                 330                 335
Glu Leu Asn Trp Thr Leu Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly
            340                 345                 350
Gly Glu Leu Val Phe Glu Arg Trp Arg Arg Leu Ser Asp Asn Ser Gln
        355                 360                 365
Trp Ile Gln Val Ser Leu Val Phe Gln Thr Leu Gln Gln Met Arg Asp
    370                 375                 380
Lys Thr Pro Leu Ser Leu Asn Thr Pro Pro Gly Glu Val Lys Leu Thr
385                 390                 395                 400
Leu Ala Gly Cys Glu Glu Arg Asn Ala Gln Gly Met Cys Ser Leu Ala
                405                 410                 415
Gly Phe Thr Gln Ile Val Asn Glu Ala Arg Ile Pro Ala Cys Ser Leu
            420                 425                 430
<210>4
<211>1486
<212>DNA
<213>大肠杆菌(Escherichia coli)
<220>
<221>CDS
<222>(188)..(1483)
<223>
<400>4
taaggagcag aaacaatgtg gtatttactt tggttcgtcg gcattttgtt gatgtgttcg  60
ctctccaccc ttgtgttggt atggctggac ccgcgattga aaagttaacg aacgtaggcc  120
tgatgcggcg cattagcatc gcatcaggca atcaataatg tcagatatga aaagcggaaa  180
catatcg atg aaa gcg atc tta atc cca ttt tta tct ctt ctg att ccg    229
        Met Lys Ala Ile Leu Ile Pro Phe Leu Ser Leu Leu Ile Pro
        1               5                   10
tta acc ccg caa tct gca ttc gct cag agt gag ccg gag ctg aag ctg    277
Leu Thr Pro Gln Ser Ala Phe Ala Gln Ser Glu Pro Glu Leu Lys Leu
15                  20                  25                  30
gaa agt gtg gtg att gtc agc cgt cat ggt gtg cgt gcc cca acc aag    325
Glu Ser Val Val Ile Val Ser Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys
                35                  40                  45
gcc acg caa ctg atg cag gat gtc acc cca gac gca tgg cca acc tgg    373
Ala Thr Gln Leu Met Gln Asp Val Thr Pro Asp Ala Trp Pro Thr Trp
            50                  55                  60
ccg gta aaa ctg ggt tgg ctg aca cca cgc ggt ggt gag cta atc gcc    421
Pro Val Lys Leu Gly Trp Leu Thr Pro Arg Gly Gly Glu Leu Ile Ala
        65                  70                  75
tat ctc gga cat tac caa cgc cag cgt ctg gtg gcc gac gga ttg ctg    469
Tyr Leu Gly His Tyr Gln Arg Gln Arg Leu Val Ala Asp Gly Leu Leu
        80              85                  90
gcg aaa aag ggc tgc ccg cag cct ggt cag gtc gcg att att gtc gat    517
Ala Lys Lys Gly Cys Pro Gln Pro Gly Gln Val Ala Ile Ile Val Asp
95                  100                 105                 110
gtc gac gag cgt acc cgt aaa aca ggc gaa gcc ttc gcc gcc ggg ctg    565
Val Asp Glu Arg Thr Arg Lys Thr Gly Glu Ala Phe Ala Ala Gly Leu
                115                 120                 125
gca cct gac tgt gca ata acc gta cat acc cag gca gat acg tcc agt    613
Ala Pro Asp Cys Ala Ile Thr Val His Thr Gln Ala Asp Thr Ser Ser
            130                 135                 140
ccc gat ccg tta ttt att cct cta aaa act ggc gtt tgc caa ctg gat    661
Pro Asp Pro Leu Phe Ile Pro Leu Lys Thr Gly Val Cys Gln Leu Asp
        145                 150                 155
aac gcg aac gtg act gac gcg atc ctc agc agg gca gga ggg tca att    709
Asn Ala Asn Val Thr Asp Ala Ile Leu Ser Arg Ala Gly Gly Ser Ile
    160                 165                 170
gct gac ttt acc ggg cat cgg caa acg gcg ttt cgc gaa ctg gaa cgg    757
Ala Asp Phe Thr Gly His Arg Gln Thr Ala Phe Arg Glu Leu Glu Arg
175                 180                 185                 190
gtg ctt aat ttt ccg caa tca aac ttg aac ctt aaa cgt gag aaa cag    805
Val Leu Asn Phe Pro Gln Ser Asn Leu Asn Leu Lys Arg Glu Lys Gln
                195                 200                 205
aat gaa agc tgt aac tta acg cag gca tta cca tcg gaa ctc aag gtg    853
Asn Glu Ser Cys Asn Leu Thr Gln Ala Leu Pro Ser Glu Leu Lys Val
            210                 215                 220
agc gcc gac aat gtt tca tta acc ggt gcg gta agc ctc gca tca atg    901
Ser Ala Asp Asn Val Ser Leu Thr Gly Ala Val Ser Leu Ala Ser Met
        225                 230                 235
ctg acg gaa ata ttt ctc ctg caa caa gca cag gga atg ccg gag ccg    949
Leu Thr Glu Ile Phe Leu Leu Gln Gln Ala Gln Gly Met Pro Glu Pro
    240                 245                 250
ggg tgg gga agg atc act gat tca cac cag tgg aac acc ttg cta agt    997
Gly Trp Gly Arg Ile Thr Asp Ser His Gln Trp Asn Thr Leu Leu Ser
255                 260                 265                 270
ttg cat aac gcg caa ttt tat tta cta caa cgc acg cca gag gtt gcc    1045
Leu His Asn Ala Gln Phe Tyr Leu Leu Gln Arg Thr Pro Glu Val Ala
                275                 280                 285
cgc agt cgc gcc acc ccg tta ttg gat ttg atc aag aca gcg ttg acg    1093
Arg Ser Arg Ala Thr Pro Leu Leu Asp Leu Ile Lys Thr Ala Leu Thr
            290                 295                 300
ccc cat cca ccg caa aaa cag gcg tat ggt gtg aca tta ccc act tca    1141
Pro His Pro Pro Gln Lys Gln Ala Tyr Gly Val Thr Leu Pro Thr Ser
        305                 310                 315
gtg ctg ttt att gcc gga cac gat act aat ctg gca aat ctc ggc ggc    1189
Val Leu Phe Ile Ala Gly His Asp Thr Asn Leu Ala Asn Leu Gly Gly
    320                 325                 330
gca ctg gag ctc aac tgg acg ctt cca ggt cag ccg gat aac acg ccg    1237
Ala Leu Glu Leu Asn Trp Thr Leu Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro
335                 340                 345                 350
cca ggt ggt gaa ctg gtg ttt gaa cgc tgg cgt cgg cta agc gat aac    1285
Pro Gly Gly Glu Leu Val Phe Glu Arg Trp Arg Arg Leu Ser Asp Asn
                355                 360                 365
agc cag tgg att cag gtt tcg ctg gtc ttc cag act tta cag cag atg    1333
Ser Gln Trp Ile Gln Val Ser Leu Val Phe Gln Thr Leu Gln Gln Met
            370                 375                 380
cgt gat aaa acg ccg cta tca tta aat acg ccg ccc gga gag gtg aaa    1381
Arg Asp Lys Thr Pro Leu Ser Leu Asn Thr Pro Pro Gly Glu Val Lys
        385                 390                 395
ctg acc ctg gca gga tgt gaa gag cga aat gcg cag ggc atg tgt tcg    1429
Leu Thr Leu Ala Gly Cys Glu Glu Arg Asn Ala Gln Gly Met Cys Ser
    400                 405                 410
ttg gcc ggt ttt acg caa atc gtg aat gaa gcg cgc ata ccg gcg tgc    1477
Leu Ala Gly Phe Thr Gln Ile Val Asn Glu Ala Arg Ile Pro Ala Cys
415                 420                 425                 430
agt ttg taa                                                        1486
Ser Leu
<210>5
<211>432
<212>PRT
<213>大肠杆菌(Escherichia coli)
<400>5
Met Lys Ala Ile Leu Ile Pro Phe Leu Ser Leu Leu Ile Pro Leu Thr
1               5                   10                  15
Pro Gln Ser Ala Phe Ala Gln Ser Glu Pro Glu Leu Lys Leu Glu Ser
            20                  25                  30
Val Val Ile Val Ser Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Ala Thr
        35                  40                  45
Gln Leu Met Gln Asp Val Thr Pro Asp Ala Trp Pro Thr Trp Pro Val
    50                  55                  60
Lys Leu Gly Trp Leu Thr Pro Arg Gly Gly Glu Leu Ile Ala Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gly His Tyr Gln Arg Gln Arg Leu Val Ala Asp Gly Leu Leu Ala Lys
                85                  90                  95
Lys Gly Cys Pro Gln Pro Gly Gln Val Ala Ile Ile Val Asp Val Asp
            100                 105                 110
Glu Arg Thr Arg Lys Thr Gly Glu Ala Phe Ala Ala Gly Leu Ala Pro
        115                 120                 125
Asp Cys Ala Ile Thr Val His Thr Gln Ala Asp Thr Ser Ser Pro Asp
    130                 135                 140
Pro Leu Phe Ile Pro Leu Lys Thr Gly Val Cys Gln Leu Asp Asn Ala
145                 150                 l55                 160
Asn Val Thr Asp Ala Ile Leu Ser Arg Ala Gly Gly Ser Ile Ala Asp
                165                 170                 175
Phe Thr Gly His Arg Gln Thr Ala Phe Arg Glu Leu Glu Arg Val Leu
            180                 185                 190
Asn Phe Pro Gln Ser Asn Leu Asn Leu Lys Arg Glu Lys Gln Asn Glu
        195                 200                 205
Ser Cys Asn Leu Thr Gln Ala Leu Pro Ser Glu Leu Lys Val Ser Ala
    210                 215                 220
Asp Asn Val Ser Leu Thr Gly Ala Val Ser Leu Ala Ser Met Leu Thr
225                 230                 235                 240
Glu Ile Phe Leu Leu Gln Gln Ala Gln Gly Met Pro Glu Pro Gly Trp
                245                 250                 255
Gly Arg Ile Thr Asp Ser His Gln Trp Asn Thr Leu Leu Ser Leu His
            260                 265                 270
Asn Ala Gln Phe Tyr Leu Leu Gln Arg Thr Pro Glu Val Ala Arg Ser
        275                 280                 285
Arg Ala Thr Pro Leu Leu Asp Leu Ile Lys Thr Ala Leu Thr Pro His
    290                 295                 300
Pro Pro Gln Lys Gln Ala Tyr Gly Val Thr Leu Pro Thr Ser Val Leu
305                 310                 315                 320
Phe Ile Ala Gly His Asp Thr Asn Leu Ala Asn Leu Gly Gly Ala Leu
                325                 330                 335
Glu Leu Asn Trp Thr Leu Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly
            340                 345                 350
Gly Glu Leu Val Phe Glu Arg Trp Arg Arg Leu Ser Asp Asn Ser Gln
        355                 360                 365
Trp Ile Gln Val Ser Leu Val Phe Gln Thr Leu Gln Gln Met Arg Asp
    370                 375                 380
Lys Thr Pro Leu Ser Leu Asn Thr Pro Pro Gly Glu Val Lys Leu Thr
385                 390                 395                 400
Leu Ala Gly Cys Glu Glu Arg Asn Ala Gln Gly Met Cys Ser Leu Ala
                405                 410                 415
Gly Phe Thr Gln Ile Val Asn Glu Ala Arg Ile Pro Ala Cys Ser Leu
            420                 425                 430
<210>6
<211>80
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增appA基因的引物
<400>6
ggggtaccat gggcgtctct gctgttctac ttcctttgta tctcctgtct ggagtcacct     60
ccggacagag tgagccggag                                                 80
<210>7
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增appA基因的引物
<400>7
gggaattcat tacaaactgc aggc                                             24
<210>8
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增appA基因的引物
<400>8
ggaattccag agtgagccgg a                                                21
<210>9
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增appA基因的引物
<400>9
ggggtacctt acaaactgca cg                                               22
<210>10
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增appA诱变PCR扩增的引物
<400>10
ctgggtatgg ttggttatat tacagtcagg t                                     31
<210>11
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增appA诱变PCR扩增的引物
<400>11
caaacttgaa ccttaaacgt gag                                              23
<210>12
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增appA诱变PCR扩增的引物
<400>12
cctgcgttaa gttacagctt tcattctgtt t                                     31
<210>13
<211>30
<212>PRT
<213>大肠杆菌(Escherichia coli)
<400>13
Met Trp Tyr Phe Leu Trp Phe Val Gly Ile Leu Leu Met Cys Ser Leu
1               5                   10                  15
Ser Thr Leu Val Leu Val Trp Leu Asp Pro Arg Leu Lys Ser
            20                  25                  30
<210>14
<211>432
<212>PRT
<213>大肠杆菌(Escherichia coli)
<400>14
Met Lys Ala Ile Leu Ile Pro Phe Leu Ser Leu Leu Ile Pro Leu Thr
1               5                   10                  15
Pro Gln Ser Ala Phe Ala Gln Ser Glu Pro Glu Leu Lys Leu Glu Ser
            20                  25                  30
Val Val Ile Val Ser Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Ala Thr
        35                  40                  45
Gln Leu Met Gln Asp Val Thr Pro Asp Ala Trp Pro Thr Trp Pro Val
    50                  55                  60
Lys Leu Gly Trp Leu Thr Pro Arg Gly Gly Glu Leu Ile Ala Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gly His Tyr Gln Arg Gln Arg Leu Val Ala Asp Gly Leu Leu Ala Lys
                85                  90                  95
Lys Gly Cys Pro Gln Pro Gly Gln Val Ala Ile Ile Ala Asp Val Asp
            100                 105                 110
Glu Arg Thr Arg Lys Thr Gly Glu Ala Phe Ala Ala Gly Leu Ala Pro
        115                 120                 125
Asp Cys Ala Ile Thr Val His Thr Gln Ala Asp Thr Ser Ser Pro Asp
    130                 135                 140
Pro Leu Phe Asn Pro Leu Lys Thr Gly Val Cys Gln Leu Asp Asn Ala
145                 150                 155                 160
Asn Val Thr Asp Ala Ile Leu Ser Arg Ala Gly Gly Ser Ile Ala Asp
                165                 170                 175
Phe Thr Gly His Arg Gln Thr Ala Phe Arg Glu Leu Glu Arg Val Leu
            180                 185                 190
Asn Phe Ser Gln Leu Asn Leu Cys Leu Asn Arg Glu Lys Gln Asp Glu
        195                 200                 205
Ser Cys Ser Leu Thr Gln Ala Leu Pro Ser Glu Leu Lys Val Ser Ala
    210                 215                 220
Asp Asn Val Ser Leu Thr Gly Ala Val Ser Leu Ala Ser Met Leu Thr
225                 230                 235                 240
Glu Ile Phe Leu Leu Gln Gln Ala Gln Gly Met Pro Glu Pro Gly Trp
                245                 250                 255
Gly Arg Ile Thr Asp Ser His Gln Trp Asn Thr Leu Leu Ser Leu His
            260                 265                 270
Asn Ala Gln Phe Tyr Leu Leu Gln Arg Thr Pro Glu Val Ala Arg Ser
        275                 280                 285
Arg Ala Thr Pro Leu Leu Asp Leu Ile Met Ala Ala Leu Thr Pro His
    290                 295                 300
Pro Pro Gln Lys Gln Ala Tyr Gly Val Thr Leu Pro Thr Ser Val Leu
305                 310                 315                 320
Phe Ile Ala Gly His Asp Thr Asn Leu Ala Asn Leu Gly Gly Ala Leu
                325                 330                 335
Glu Leu Asn Trp Thr Leu Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly
            340                 345                 350
Gly Glu Leu Val Phe Glu Arg Trp Arg Arg Leu Ser Asp Asn Ser Gln
        355                 360                 365
Trp Ile Gln Val Ser Leu Val Phe Gln Thr Leu Gln Gln Met Arg Asp
    370                 375                 380
Lys Thr Pro Leu Ser Leu Asn Thr Pro Pro Gly Glu Val Lys Leu Thr
385                 390                 395                 400
Leu Ala Gly Cys Glu Glu Arg Asn Ala Gln Gly Met Cys Ser Leu Ala
                405                 410                 415
Gly Phe Thr Gln Ile Val Asn Glu Ala Arg Ile Pro Ala Cys Ser Leu
            420                 425                 430

Claims (96)

1.一种通过提高来自肌醇六磷酸盐的磷酸盐的生物可利用率而改善单胃动物消耗的食品的营养价值的方法，其中所述食品含有肌醇六磷酸盐，该方法包括与每千克食品少于1200单位的在酵母中表达的肌醇六磷酸酶联合对动物施用食品的步骤，
其中肌醇六磷酸酶是大肠杆菌-生产的AppA2，并且
其中与通过与相同单位的在非酵母宿主细胞中表达的肌醇六磷酸酶联合喂以食品而获得的来自肌醇六磷酸盐的磷酸盐的生物可利用率相比，其中来自肌醇六磷酸盐的磷酸盐的生物可利用率被提高至少2-倍。
2.权利要求1的方法，其中所述动物是鸟类。
3.权利要求2的方法，其中所述鸟类选自鸡，火鸡，鸭，和野鸡。
4.权利要求1的方法，其中所述动物是猪类。
5.权利要求1的方法，其中所述动物是海水或淡水水生动物类。
6.权利要求1的方法，其中所述动物是家畜。
7.权利要求6的方法，其中所述家畜是犬类。
8.权利要求6的方法，其中所述家畜是猫科动物类。
9.权利要求1的方法，其中所述动物是人。
10.权利要求4的方法，其中所述食品是猪饲料。
11.权利要求3的方法，其中所述食品是家禽饲料。
12.权利要求1的方法，其中所述酵母选自糖酵母属，毕赤氏酵母属，克鲁维氏酵母属，汉逊氏酵母属，和念珠菌属。
13.权利要求12的方法，其中所述酵母是酿酒酵母。
14.权利要求12的方法，其中所述酵母是巴斯德毕赤氏酵母。
15.权利要求1的方法，其中对于每公斤食品与大约50至大约1000单位的酵母中表达的肌醇六磷酸酶联合对动物喂以食品。
16.权利要求1的方法，其中对于每公斤食品与大约50至大约700单位的酵母中表达的肌醇六磷酸酶联合对动物喂以食品。
17.权利要求1的方法，其中对于每公斤食品与大约50至大约500单位的酵母表达的肌醇六磷酸酶联合对动物喂以食品。
18.权利要求1的方法，其中对于每公斤食品与大约50至大约200单位的酵母表达的肌醇六磷酸酶联合对动物喂以食品。
19.权利要求1的方法，其中所述肌醇六磷酸酶在小于大约4的pH下具有最佳活性。
20.权利要求1的方法，其中用蛋白酶裂解所述酵母中表达的肌醇六磷酸酶，与完整酵母表达的肌醇六磷酸酶相比，增强肌醇六磷酸酶提高来自肌醇六磷酸盐的磷酸盐的生物可利用率的能力。
21.一种通过对动物供给含有肌醇六磷酸盐的食品而降低单胃动物饲料与增重的比例的方法，该方法包括与在酵母中表达的肌醇六磷酸酶联合对动物供给食品的步骤，
其中肌醇六磷酸酶选自大肠杆菌-生产的AppA2和大肠杆菌-生产的AppA的定点突变体，并且
其中动物的饲料与增重的比例被降低。
22.权利要求21的方法，其中所述动物是鸟类。
23.权利要求22的方法，其中所述鸟类选自鸡，火鸡，鸭，和野鸡。
24.权利要求21的方法，其中所述动物是猪。
25.权利要求21的方法，其中所述动物是海水或淡水水生动物类。
26.权利要求21的方法，其中所述动物是家畜。
27.权利要求26的方法，其中所述家畜是犬类。
28.权利要求26的方法，其中所述家畜是猫科动物类。
29.权利要求21的方法，其中所述动物是人。
30权利要求24的方法，其中所述食品是猪饲料。
31.权利要求23的方法，其中所述食品是家禽饲料。
32.权利要求21的方法，其中所述酵母选自糖酵母属，毕赤氏酵母属，克鲁维氏酵母属，汉逊氏酵母属，和念珠菌属。
33.权利要求32的方法，其中所述酵母是酿酒酵母。
34.权利要求32的方法，其中所述酵母是巴斯德毕赤氏酵母。
35.权利要求21的方法，其中对于每公斤食品与小于1200单位的酵母中表达的肌醇六磷酸酶联合对动物喂以食品。
36.权利要求21的方法，其中对于每公斤食品与大约50至大约1000单位的酵母中表达的肌醇六磷酸酶联合对动物喂以食品。
37.权利要求21的方法，其中对于每公斤食品与大约50至大约700单位的酵母中表达的肌醇六磷酸酶联合对动物喂以食品。
38.权利要求21的方法，其中对于每公斤食品与大约50至大约500单位的酵母中表达的肌醇六磷酸酶联合对动物喂以食品。
39.权利要求21的方法，其中对于每公斤食品与大约50至大约200单位的酵母中表达的肌醇六磷酸酶联合对动物喂以食品。
40.权利要求21的方法，其中所述定点突变体具有SEQ ID No.：5具体给出的氨基酸序列。
41.权利要求40的方法，其中所述定点突变体与野生型AppA的不同之处在于至少一个氨基酸取代，其破坏100位和210位半胱氨酸残基之间二硫键形成。
42.权利要求21的方法，其中所述肌醇六磷酸酶在小于大约4的pH下具有最佳活性。
43.权利要求21的方法，其中用蛋白酶裂解所述酵母中表达的肌醇六磷酸酶，与完整酵母表达的肌醇六磷酸酶相比，增强肌醇六磷酸酶降低饲料与动物增重的比例的能力。
44.一种通过提高动物的骨质量和矿物质含量而改善单胃动物消耗的食品的营养价值的方法，其中所述食品含有肌醇六磷酸盐，该方法包括与在酵母中表达的肌醇六磷酸酶联合对动物供给食品的步骤，
其中肌醇六磷酸酶选自大肠杆菌-生产的AppA2和大肠杆菌-生产的AppA的定点突变体，并且
其中动物的骨质量和矿物质含量被提高。
45.权利要求44的方法，其中所述动物是鸟类。
46.权利要求45的方法，其中所述鸟类选自鸡，火鸡，鸭，和野鸡。
47.权利要求44的方法，其中所述动物是猪。
48.权利要求44的方法，其中所述动物是海水或淡水水生动物类。
49.权利要求44的方法，其中所述动物是家畜。
50.权利要求49的方法，其中所述家畜是犬类。
51.权利要求49的方法，其中所述家畜是猫科动物类。
52.权利要求44的方法，其中所述动物是人。
53.权利要求47的方法，其中所述食品是猪饲料。
54.权利要求46的方法，其中所述食品是家禽饲料。
55.权利要求44的方法，其中所述酵母选自糖酵母属，毕赤氏酵母属，克鲁维氏酵母属，汉逊氏酵母属，和念珠菌属。
56.权利要求55的方法，其中所述酵母是酿酒酵母。
57.权利要求55的方法，其中所述酵母是巴斯德毕赤氏酵母。
58.权利要求44的方法，其中对于每公斤食品与小于1200单位的酵母中表达的肌醇六磷酸酶联合对动物喂以食品。
59.权利要求44的方法，其中对于每公斤食品与大约50至大约1000单位的酵母表达的肌醇六磷酸酶联合对动物喂以食品。
60.权利要求44的方法，其中对于每公斤食品与大约50至大约700单位的酵母表达的肌醇六磷酸酶联合对动物喂以食品。
61.权利要求44的方法，其中对于每公斤食品与大约50至大约500单位的酵母表达的肌醇六磷酸酶联合对动物喂以食品。
62.权利要求44的方法，其中对于每公斤食品与大约50至大约200单位的酵母表达的肌醇六磷酸酶联合对动物喂以食品。
63.权利要求44的方法，其中所述定点突变体具有SEQ ID No.：5具体给出的氨基酸序列。
64.权利要求63的方法，其中所述定点突变体与野生型AppA的不同之处在于至少一个氨基酸取代，其破坏100位和210位半胱氨酸残基之间二硫键形成。
65.权利要求44的方法，其中所述肌醇六磷酸酶在小于大约4的pH下具有最佳活性。
66.权利要求44的方法，其中用蛋白酶裂解所述酵母中表达的肌醇六磷酸酶，与完整酵母表达的肌醇六磷酸酶相比，增强肌醇六磷酸酶提高动物的骨质量和矿物质含量的能力。
67.一种用于对动物饲料添加的饲料添加组合物，所述饲料添加组合物含有酵母表达的肌醇六磷酸酶和肌醇六磷酸酶的载体，其中饲料添加组合物中肌醇六磷酸酶的浓度大于最终饲料混合物中肌醇六磷酸酶的浓度。
68.权利要求67饲料添加组合物，其中肌醇六磷酸酶被喷雾干燥。
69.权利要求67饲料添加组合物，其中肌醇六磷酸酶选自大肠杆菌-产生的AppA2和大肠杆菌-产生的AppA的定点突变体。
70.权利要求67饲料添加组合物，其中所述载体选自稻壳，麦麸，植物脂肪，氢化脂质，多糖，单糖，矿物油，碳酸钙，明胶，脱脂奶粉，肌醇六磷酸盐和其他含有肌醇六磷酸盐的化合物，和基础混合物。
71.权利要求70饲料添加组合物，其中所述基础混合物含有维生素和矿物质。
72.含有权利要求67饲料添加组合物的食品，其中所述最终饲料混合物中肌醇六磷酸酶的浓度小于1200单位肌醇六磷酸酶每千克最终饲料混合物。
73.权利要求72的食品，其中所述最终饲料混合物对于每千克最终饲料混合物含有大约50至大约1000单位酵母中表达的肌醇六磷酸酶。
74.权利要求72的食品，其中所述最终饲料混合物对于每千克最终饲料混合物含有大约50至大约700单位酵母表达的肌醇六磷酸酶。
75.权利要求72的食品，其中所述最终饲料混合物对于每千克最终饲料混合物含有大约50至大约500单位酵母表达的肌醇六磷酸酶。
76.权利要求72的食品，其中所述最终饲料混合物对于每千克最终饲料混合物含有大约50至大约200单位酵母表达的肌醇六磷酸酶。
77.权利要求72的食品，其中所述最终饲料混合物进一步含有0.1％或更少的外部加入的无机磷酸盐。
78.权利要求72的食品，其中所述食品与含有相同单位的在非酵母宿主细胞中表达的肌醇六磷酸酶的食品的营养价值相比，表现出提高的营养价值。
79.改善单胃动物消耗的食品的营养价值的方法，其中所述食品含有肌醇六磷酸盐，该方法包括下面的步骤：
将选自大肠杆菌-生产的AppA2和大肠杆菌-生产的AppA的定点突变体的肌醇六磷酸酶喷雾干燥；
将肌醇六磷酸酶与肌醇六磷酸酶的载体混合，任选地，和产生用于对食品补充肌醇六磷酸酶的饲料添加组合物的其他成分混合；
将饲料添加组合物与食品混合；及
对动物供给补充有饲料添加组合物的食品。
80.一种通过提高来自肌醇六磷酸盐的磷酸盐的生物可利用率而改善鸟类消费的食品的营养价值的方法，其中所述食品含有肌醇六磷酸盐，该方法包括与每千克食品少于1200单位的在酵母中表达的肌醇六磷酸酶联合对鸟类提供食品的步骤，其中与通过与在酵母中表达的肌醇六磷酸酶联合对非鸟类喂以食品而获得的来自肌醇六磷酸盐的磷酸盐的生物可利用率相比，来自肌醇六磷酸盐的磷酸盐的生物可利用率被提高至少1.5-倍。
81.权利要求80的方法，其中所述鸟类选自鸡，火鸡，鸭，和野鸡。
82.权利要求80的方法，其中所述食品是家禽饲料。
83.权利要求80的方法，其中所述酵母选自糖酵母属，毕赤氏酵母属，克鲁维氏酵母属，汉逊氏酵母属，和念珠菌属。
84.权利要求80的方法，其中对于每公斤食品与2000单位或更少的酵母中表达的肌醇六磷酸酶联合对动物喂以食品。
85.权利要求80的方法，其中对于每公斤食品与1500单位或更少的酵母表达的肌醇六磷酸酶联合对动物喂以食品。
86.权利要求80的方法，其中所述肌醇六磷酸酶在小于大约4的pH下具有最佳活性。
87.权利要求80的方法，其中对于每公斤食品与大约50至大约1000单位的酵母中表达的肌醇六磷酸酶联合对动物喂以食品。
88.权利要求80的方法，其中对于每公斤食品与大约50至大约700单位的酵母中表达的肌醇六磷酸酶联合对动物喂以食品。
89.权利要求80的方法，其中对于每公斤食品与大约50至大约500单位的酵母中表达的肌醇六磷酸酶联合对动物喂以食品。
90.权利要求80的方法，其中对于每公斤食品与大约50至大约200单位的酵母表达的肌醇六磷酸酶联合对动物喂以食品。
91.权利要求80的方法，其中用蛋白酶裂解所述酵母中表达的肌醇六磷酸酶，与完整酵母表达的肌醇六磷酸酶相比，增强肌醇六磷酸酶提高来自肌醇六磷酸盐的磷酸盐的生物可利用率的能力。
92.权利要求80的方法，其中与通过与相同单位的在非酵母宿主细胞中表达的肌醇六磷酸酶联合喂以食品而获得的来自肌醇六磷酸盐的磷酸盐的生物可利用率相比，与酵母中表达的肌醇六磷酸酶联合喂以食品而获得的来自肌醇六磷酸盐的磷酸盐的生物可利用率被提高至少2-倍。
93.一种通过对鸟类喂以含有肌醇六磷酸盐的食品而减小鸟类的饲料与增重之比的方法，该方法包括与酵母中表达的肌醇六磷酸酯联合对鸟类喂以食品的步骤，其中动物的饲料与增重之比被减小。
94.一种通过提高鸟类骨质量和矿物质含量而改善鸟类消耗的食品的营养价值的方法，其中所述食品含有肌醇六磷酸盐，该方法包括与酵母表达的肌醇六磷酸酶联合对鸟类提供食品的步骤，其中鸟类骨质量和矿物质含量被提高。
95.权利要求94的方法，其中与在酵母中表达的肌醇六磷酸酶联合对非鸟类喂养而获得的骨质量和矿物质含量相比，与在酵母中表达的肌醇六磷酸酶联合对鸟类喂养而获得的鸟类的骨质量和矿物质含量被提高至少1.5-倍。
96.一种改善鸟类消费的食品的营养价值的方法，其中所述食品含有肌醇六磷酸盐，该方法包括与在酵母中表达的肌醇六磷酸酶联合对鸟类供给食品的步骤，其中鸟类产生卵的数目与产生的卵的重量提高。
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