CN1610758A

CN1610758A - 多重寡核苷酸添加和目标扩增

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Publication number: CN1610758A
Application number: CNA028265912A
Authority: CN
Inventors: M·法翰姆; 郑健标
Original assignee: Parallele Bioscience Inc
Current assignee: Affymetrix Inc
Priority date: 2001-11-19
Filing date: 2002-11-19
Publication date: 2005-04-27
Anticipated expiration: 2022-11-19
Also published as: US7754451B2; EP1453979B1; EP1456416B1; US7510829B2; US20030096291A1; CA2467460A1; EP1453979A4; DE60231543D1; EP1453979A2; WO2003044216A2; CN100396788C; WO2003044216A3; AU2002366099A1; EP1456416A4; WO2003044177A2; JP2005509440A; US20090004701A1; US20030104459A1; US7208295B2; CN1697882A

Abstract

描述了直接向核酸模板特别是向单链模板内部的限定位点添加寡核苷酸的方法。向不同序列的多个模板中的每一个添加第一个和第二个公共的引发位点使得随后能够对不同序列的多个模板进行化学计量的扩增。

Description

多重寡核苷酸添加和目标扩增

与相关申请的交叉引用

本申请要求于2001年11月19日提交的美国临时申请序列号60/331,693的利益，在此处将其公开内容整体引入作为参考。

发明背景

在过去的20年中，特定核酸的体外扩增已成为分子生物学家的基本工具。

最近，多重扩增已逐渐变得重要起来，其中在单个反应中扩增多个核酸序列，Chamberlain等人，Nucl.Acid Research 16(23)：11141-1156(1988)；美国专利5,582,989。例如，多重扩增特别是多重聚合酶链反应(PCR)已用于提供感染性疾病生物的遗传指纹。其他应用如多重SNP基因分型(genotyping)和变异扫描(如通过错配修复探测)也大大从多重PCR中获利。

在其最初的实施中，多重PCR反应包括针对每一个要扩增的座位的特定引物对。然而，这些方法已受到许多问题的困扰，包括一些模板(尤其是那些具有富含GC的序列的模板)的不均匀或失败的扩增、其他模板的优先扩增、差的灵敏性和特异性、差的重复性及假扩增产物的生成(Henegariu等人，BioTechniques 23(3)：504-511(1997)；Markoulatos等人，J.Clin.Lab.Anal.16：47-51(2002))。

在使这些问题最小化的努力中已发展了各种对最初方法的修饰。

在这些修饰中，有对反应条件的改变，包括引物浓度、MgCl₂和dNTP浓度的调节，PCR缓冲液浓度的改变，MgCl₂和dNTP浓度之间的平衡，模板DNA和Taq DNA聚合酶的量，延伸和退火时间和温度及辅助物的添加(Henegariu等人，BioTechniques 23(3)：504-511(1997)；Markoulatos等人，J.Clin.Lab.Anal.16：47-51(2002))。所用的其他策略包括在退火和延伸步骤中应用的在低于变性温度的高低温度之间的温度亚循环(subcycling)(美国专利6,355,422)和一种序列特异性引物和一种公共引物的应用(Broude等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98，206-211(2001))。

也已通过一种方法解决了多重PCR中富含GC的序列的难处理性，其中向多重PCR反应混合物中添加甜菜碱和二甲基亚砜(DMSO)使得能够从DNA分子的异源群体中进行更一致的扩增，其中许多该DNA分子是富含GC的(Baskaran等人，Genome Research 6：633-638(1996))。

其它方法改变引物。

在一种这样的努力中，将嵌合的寡核苷酸用作引物，该寡核苷酸包括与模板互补从而赋予模板特异性的3’结构域和与模板不互补的5’结构域；该5’结构域包括在第一轮循环后的PCR扩增循环中用于引物延伸的序列。

然而，在后一种方案中，第一轮循环后的扩增循环将扩增在第一轮循环中生成的任何产物，不管是正确的还是错误的。因而，尽管该技术使得能够进行更一致的扩增，但它不解决假产物的问题。

在设计用于克隆两个复杂样品中共有成分的类似方法中，Brookes等人(Human Molec.Genetics 3(11)：2011-2017(1994))将引物与通过限制片段消化生成的模板末端连接。

然而，上述方法均未完全解决与多重PCR相关的问题。

因而，在本领域中继续需要如下方法，该方法使得能够在单个反应中对多个核酸序列进行特异性的和一致的扩增，而不生成假产物。

发明概述

本发明通过提供如下方法解决了本领域中的这些和其他问题，该方法直接向单链核酸模板添加一个或多个寡核苷酸，一般(但不是不变地)在该模板内部的一个或多个限定位点。该寡核苷酸可设计为提供一个或多个引发邻近模板区域的随后扩增的位点。该方法易于进行多重化，从而使得在单个反应中可将寡核苷酸添加到多个模板上。在添加的寡核苷酸提供一个或多个公共引发位点的多重实施方案中，可用所有模板公共的引物对多个模板进行同时扩增。这种多重化的扩增反应提供了所有模板的高特异性和一致性扩增，从而解决了自从发明PCR以来一直困扰多重扩增反应的问题。

在第一个方面，本发明因而提供了将至少第一寡核苷酸直接添加到核酸模板上的方法。

该方法包含同时使模板和至少第一寡核苷酸与至少第一个探针进行退火。

该探针包括至少第一个模板互补性区域和至少第一个直接与其邻近的寡核苷酸定位区域(oligo positioning region)。探针中模板互补性区域的核苷酸和直接邻近的寡核苷酸定位区域的核苷酸限定了其间的第一个探针连接，并称为第一连接核苷酸。

该寡核苷酸包括与探针的第一个寡核苷酸定位区域互补的末端区域。在杂交反应中，末端寡核苷酸区域的末端核苷酸与探针第一个寡核苷酸定位区域的第一连接核苷酸退火。

在第二个步骤中，在与探针第一个模板互补性区域的连接核苷酸退火的模板核苷酸处生成了第一个可连接的游离末端。

在下一个步骤中，将第一寡核苷酸与模板的第一个游离末端连接。

在某些有用的实施方案中，该探针包括直接与第一个模板互补性区域邻近的第二个寡核苷酸定位区域，探针中模板互补性区域的核苷酸和直接邻近的第二个寡核苷酸定位区域的核苷酸是限定其间第二个探针连接的第二连接核苷酸。

在这些后面的实施方案中，可通过使第二寡核苷酸与第一个探针退火同时使模板与探针退火而将第二寡核苷酸有用地添加到模板上。第二寡核苷酸包括与探针的第二个寡核苷酸定位区域互补的末端区域，从而使末端寡核苷酸区域的末端核苷酸与探针的第二个寡核苷酸定位区域的连接核苷酸退火。

在随后的步骤中，在与探针第一个模板互补性区域的第二连接核苷酸退火的模板核苷酸生成了第二个可连接的游离末端；然后将第二寡核苷酸与模板的第二个游离末端连接。

可连接的游离末端可通过去除不与探针的第一个互补性区域互补的模板区域而生成，如通过核酸外切消化，如用Exonuclease VII或Exonuclease T和rec J_f组合的消化。可选择地，在一些实施方案中，不与探针互补的模板区域可通过用单链特异性内切核酸酶如绿豆核酸酶消化而去除。

有用地，本发明该方面的方法可进一步包含在连接后从探针和寡核苷酸中分离模板的步骤。

在一些实施方案中，该探针进一步包含从模板中分离探针的手段。

这种分离手段包括多个脱氧尿嘧啶残基的整合。在这些实施方案中，分离步骤包含在其脱氧尿嘧啶残基处将探针切割为多个探针片段，然后将模板从探针片段和从寡核苷酸片段中进行大小分离。

在其他实施方案中，分离手段可为一种或多种捕获部分，如生物素。

在从探针和寡核苷酸中分离模板之后，本方法可进一步包括扩增模板在添加的第一和第二寡核苷酸之间的区域的步骤。

在这种实施方案中，第一寡核苷酸一般具有第一个引发位点，而第二寡核苷酸具有第二个引发位点，且扩增步骤通过在第一个和第二个引发位点引发聚合作用而进行。一般地，这种扩增应用PCR进行。

模板可源自cDNA或基因组DNA，源自单个个体或源自多个个体。模板可为如源自真核生物如人的基因组DNA。

为了促进对扩增产物的特异性探测，第一和第二寡核苷酸的至少一个包括标签(bar code)序列。

本发明的方法易于进行多重化。

因而，在第二个方面，本发明提供了在单个反应中向多个不同序列的核酸模板的每一个直接添加至少第一寡核苷酸的方法。

该方法包含在单个反应混合物中同时使每一个模板和各自第一寡核苷酸与多个探针的各自一个进行退火。

每一个探针包括与各自一个模板互补的至少第一区域和直接与其邻近的至少第一个寡核苷酸定位区域。探针中模板互补性区域的核苷酸和直接邻近的寡核苷酸定位区域的核苷酸称为第一连接核苷酸，并限定了其间的第一个探针连接。

每一个第一寡核苷酸包括与各自探针的第一个寡核苷酸定位区域互补的末端区域，从而寡核苷酸区域的末端核苷酸与探针第一个寡核苷酸定位区域的第一连接核苷酸退火。

在杂交后，每一个模板中在与模板各自探针的第一个模板互补性区域的连接核苷酸退火的核苷酸处生成了第一个可连接的游离末端。

其后，将每一个第一寡核苷酸与其各自模板的第一个游离末端连接。

与本发明的单重(单重)方面相同，在额外的多重实施方案中，每一个探针可包括直接与第一个模板互补性区域邻近的第二个寡核苷酸定位区域，探针中模板互补性区域的核苷酸和直接邻近的第二寡核苷酸定位区域的核苷酸是限定其间第二个探针连接的第二连接核苷酸。

在这些后面的实施方案中，通过使各自第二寡核苷酸与每一个探针退火同时使模板与探针退火而将第二寡核苷酸添加到多个模板的每一个上。第二寡核苷酸包括与其各自探针的第二个寡核苷酸定位区域互补的末端区域，从而使末端寡核苷酸区域的末端寡核苷酸与探针的第二个寡核苷酸定位区域的连接核苷酸退火。

其后，每一个模板中在与各自探针第一个模板互补性区域的第二连接核苷酸退火的核苷酸处生成了第二个可连接的游离末端。然后将第二个寡核苷酸与模板的第二个游离末端连接。

有用地，第一和/或第二寡核苷酸的每一个包括其共有的引发序列。

在某些实施方案中，可连接的游离末端可通过去除不与探针的第一个互补性区域互补的模板区域而生成。在一些实施方案中，不与模板互补的区域通过核酸外切消化去除；在另一些中，通过核酸内切消化去除。

多重实施方案可进一步包括从其各自的探针和寡核苷酸中分离模板的步骤，且可进一步包括同时扩增每一个该模板区域的后续步骤。

在某些实施方案中，扩增可通过在第一个公共引发位点和第二个公共引发位点引发聚合作用而进行。在这种实施方案中，扩增一般通过聚合酶链反应(PCR)进行。

本发明的多重方法可包括至少10个不同序列的模板，至少100个不同序列的模板，至少1000个不同序列的模板或更多。有用地，第一和第二寡核苷酸的至少一个包括标签序列，从而使得能够同时探测所有扩增的模板。

在其他实施方案中，将标签序列独立于寡核苷酸而添加到模板上，其中该寡核苷酸向模板添加引发序列。

在这些实施方案中，探针的寡核苷酸定位区域的任一个或两者可包括第一个和第二个亚区。一个亚区在序列上与要添加的寡核苷酸互补；另一个亚区在序列上与包括标签的另外的寡核苷酸互补。

在模板中生成了可连接的游离末端，并在其上连接了标签寡核苷酸。在相同或随后的步骤中，将引发寡核苷酸与标签寡核苷酸连接。

附图简述

考虑到下面与附图结合的详细描述，本发明的上述和其他目的和优点将是显而易见的，其中全文中相似的特征指相似的部分，且其中：

图1是阐明根据本发明直接将第一寡核苷酸添加到单链核酸模板上的方法的示意图。在该图和所有的示意图中，在杂交的核酸链之间延伸的垂直虚线通常指碱基配对；该线的数目不反映任何特定的碱基对数目；

图2是阐明根据本发明直接将第一和第二寡核苷酸添加到单链核酸模板上的方法的示意图；

图3是阐明本方法的额外实施方案的示意图，该方法根据本发明直接将第一和第二寡核苷酸添加到单链核酸模板上；

图4是阐明方法的实施方案的示意图，该方法根据本发明直接将第一和第二寡核苷酸添加到单链核酸模板上，其中该模板具有与探针互补的不连续区域；

图5是阐明根据本发明将多个寡核苷酸顺次添加到模板的单个可切割的游离末端的实施方案的示意图；

图6是凝胶的显微照片，该凝胶显示寡核苷酸连接后少至30zmole模板的扩增；

图7A是在多重化的反应中从一系列探针和代表性模板预期的产物的示意图，且图7B是显示实际获得的产物的凝胶电泳实验的显微照片；

图8是根据本发明进行的凝胶电泳实验的显微照片，显示从复杂混合物中回收的产物；

图9是根据本发明进行的凝胶电泳实验的显微照片，显示从复杂混合物中回收的产物；和

图10是描绘标准等摩尔样品的杂交信号对实验样品的杂交信号的图。

发明详述

本发明提供了直接将一个或多个寡核苷酸添加到单链核酸模板上的方法，一般(但不是不变地)在模板内部一个或多个限定的位点上。该寡核苷酸可设计为提供一个或多个引发邻近模板区域的随后扩增的位点。该方法易于进行多重化，从而使得在单个反应中可将寡核苷酸添加到多个模板上。在添加的寡核苷酸提供一个或多个公共引发位点的多重实施方案中，然后可用所有模板公共的引物对多个模板进行同时扩增。这种多重化的扩增反应提供了所有模板的高特异性和一致性扩增，从而解决了自从发明PCR以来一直困扰多重扩增反应的问题。

在第一个方面，本发明提供了将至少第一寡核苷酸直接添加到核酸模板上的方法。

该方法可方便地参考图1中的说明性反应进行理解，其中将寡核苷酸20添加到模板10内部的不同位点。

在图1A中阐明的该方法第一个步骤中，使模板10和至少第一寡核苷酸20同时与第一个探针50退火。

探针50包括至少第一个模板互补性区域40和至少第一个直接与其邻近的寡核苷酸定位区域30：在退火步骤中，模板区域14与探针50的模板互补性区域40杂交，而同时寡核苷酸区域22与探针50的寡核苷酸定位区域30杂交。

探针50中模板互补性区域40的核苷酸和直接邻近的寡核苷酸定位区域30的核苷酸限定了探针50中的一个连接，并在下文中称为连接核苷酸。在本发明将两个寡核苷酸添加到模板10上的方法的实施方案中，如图2所示，第一个寡核苷酸定位区域30a直接在第一个探针连接处与模板互补性区域40邻接，而第二个寡核苷酸定位区域30b直接在第二个探针连接处与模板互补性区域40邻接。在这种实施方案中，邻接的核苷酸因而各自命名为第一连接核苷酸和第二连接核苷酸。

寡核苷酸20包括在序列上与探针50的寡核苷酸定位区域30互补的末端区域22。寡核苷酸20可任选地进一步包括区域24。寡核苷酸区域22的末端核苷酸(在图1所示的方向中为寡核苷酸20的5’末端核苷酸)与探针50的第一个寡核苷酸定位区域30的连接核苷酸退火。

寡核苷酸20一般设计为进一步包括至少一个寡核苷酸引物可以与之退火的序列(“引发位点”)。

在该方法的下一个步骤中，模板10中在与探针50的模板互补性区域40的连接核苷酸退火的模板核苷酸区域14生成了第一个可连接的游离末端。生成游离末端的模板核苷酸仍然在模板10中。

从该步骤中产生的产物表示于图1B中，该图阐明模板10新生成的可连接的游离末端和寡核苷酸20末端区域22的末端核苷酸分别通过同时与探针50的区域40和30杂交而在位置上相互直接邻近。

在最后的步骤中，使第一寡核苷酸20与模板10的第一个可连接的游离末端连接，结果如图1C所示。

在本发明的方法中，模板10是单链核酸，一般是DNA，且可通过使双链核酸变性获得。

模板10可源自如cDNA。模板10可直接源自单链cDNA，如通过从mRNA进行第一链合成而获得的，或者源自通过使双链cDNA变性而形成的单链cDNA，该双链cDNA直接在第二链cDNA合成后获得或从在前克隆的双链cDNA获得。

在其他的实施方案中，模板10可源自基因组DNA，即源自直接从细胞制备的基因组DNA制剂或源自在前克隆的基因组DNA。一般地，首先使基因组DNA变性(如通过加热或用碱处理)以提供单链模板10。

模板10可源自单个个体或源自多个个体的混合。源自单个个体的模板可用于如基因型或单倍型研究中，如在分子遗传诊断或预后中所实践的。混合的模板可用于SNP发现研究中，且可从至少10个个体、100个个体甚至1000个个体或更多个体汇集。

模板10可有用地源自从原核生物、真核生物或病毒获取的核酸。

原核生物包括古细菌和真细菌两者，包括革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌两者，且当模板10从病原性原核生物的核酸获取时，本发明的方法特别有用。

在真核生物中，模板10可有用地从原生动物、真菌、昆虫、植物和动物中获取，包括选自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、Ustillago maydis、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)和白假丝酵母(Candida albicans)的真菌；选自黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)和按蚊属(Anopheles)物种的昆虫；选自如下种类的植物，即实验模式植物如雷氏衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、展叶剑叶藓(Physcomitrellapatens)和鼠耳芥(拟南芥菜)(Arabidopsis thaliana)，作物植物如花椰菜(甘蓝(Brassica oleracea))、朝鲜蓟(洋蓟(Cynarascolymus))，水果如苹果(苹果属，如M alus domesticus)、芒果(芒果属，如芒果(Mangifera indica))、香蕉(芭蕉属，如小果野蕉(Musa acuminata))、浆果(如黑醋栗，茶藨子属，如红醋果(Ribesrubrum))、kiwifruit(弥猴桃属，如中华猕猴桃(Actinidiachinensis))、葡萄(葡萄属，如葡萄(Vitis vinifera))、柿子椒(辣椒属，如辣椒(Capsicum annuum))、樱桃(如甜樱桃，李属，如欧洲甜樱桃(Prunus avium))、黄瓜(香瓜属，如黄瓜(Cucumissativus))、瓜(香瓜属，如甜瓜(Cucumis melo))、坚果(如核桃，核桃属，如核桃(Juglans regia)；花生，落花生(Arachishypogeae))、橙(柑桔属，如Citrus maxima))、桃(李属，如桃(Prunus persica))、梨(Pyra属，如Pyra communis)、李(李属，如欧洲李(Prunus domestica))、草莓(草莓属，如野草莓(Fragariavesca)或Fragaria moschata)、西红柿(番茄属，如番茄(Lycopersiconesculentum))；叶子和草料植物，如紫花苜蓿(苜蓿属，如Medicagosativa或truncatula))、甘蓝(如甘蓝(Brassica oleracea))、菊苣(Cichoreum属，如Cichoreum endivia))、韭(葱属，如韭葱(Allium porrum))、莴苣(莴苣属，如莴苣(Lactuca sativa))、菠菜(菠菜属，如菠菜(Spinacia oleraceae))、烟草(烟草属，如烟草(Nicotiana tabacum))；根植物，如竹芋(竹芋属，如竹芋(Marantaarundinacea))、甜菜(甜菜属，如甜菜(Beta vulgaris))、胡萝卜(Daucus属，如Daucus carota)、木薯(Manihot属，如Manihotesculenta)、芜菁(芸苔属，如芜菁(Brassica rapa))、萝卜(萝卜属，如萝卜(Raphanus sativus))、薯蓣(薯蓣属，如甘薯(Dioscoreaesculenta))、甘薯(甘薯(Ipomoea batatas))；种子植物，包括油料种子，如豆(菜豆属，如菜豆(Phaseolus vulgaris))、豌豆(豌豆属，如豌豆(Pisum sativum))、大豆(大豆属，如大豆(Glycinemax))、豇豆(豇豆(vigna unguiculata))、mothbean(乌头叶豇豆(Vigna aconitifolia))、小麦(小麦属，如普通小麦(Triticumaestivum))、高粱属植物(蜀黍属，如两色蜀黍(Sorghum bicolor)、大麦(大麦属，如大麦(Hordeum vulgare))、玉米(玉蜀黍属，如玉蜀黍(Zea mays))、稻(稻属，如(Oryza sativa))、油菜籽(欧洲油菜(Brassica napus))、谷子(稷属物种)、向日葵(向日葵(Helianthus annuus))、燕麦(燕麦(Avena sativa))、鹰嘴豆(鹰嘴豆属，如鹰嘴豆(Cicer arietinum))；块茎植物，如大头菜(芸苔属，如甘蓝(Brassica oleraceae))、马铃薯(茄属，如马铃薯(Solanum tuberosum))等；纤维和木料植物，如亚麻(亚麻属，如亚麻(Linum usitatissimum))、棉花(棉属，如陆地棉(Gossypiumhirsutum))、松树(松属物种)、橡树(栎属物种)、桉树(桉属物种)等；以及观赏植物，如草坪草(黑麦草属，如瑞士黑麦草(Loliumrigidum))、矮牵牛花(碧冬茄属，如碧冬茄(Petunia hybrida))、风信子(风信子(Hyacinthus orientalis))、康乃馨(石竹属，如麝香石竹(Dianthus caryophyllus))、飞燕草(翠雀属，如飞燕草(Delphinium ajacis))、薏苡(薏苡(Coix lacryma-jobi))、金鱼草(金鱼草(Antirrhinum majus))、罂粟(罂粟属，如山罂粟(Papavernudicaule))、紫丁香(丁香属，如欧洲丁香(Syringa vulgaris))、八仙花(绣球属，如绣球(Hydrangea macrophylla))、蔷薇(包括法国蔷薇(Gallicas)、Albas、Damasks、Damask Perpetuals、Centifolias、Chinas、Teas和Hybrid Teas)和观赏秋麒麟草属植物(如一枝黄花属物种)；以及选自哺乳动物的动物，如灵长类动物，包括人、猴子和猿，小的实验动物，包括啮齿类动物如小鼠或大鼠、豚鼠，兔类动物如兔，牲畜如母牛、马、鸡、鹅、火鸡、山羊和绵羊，以及家养的宠物如狗和猫。

模板10也可有用地源自病毒核酸，包括选自双链DNA病毒的病毒，如疱疹病毒，包括1型和2型人疱疹病毒(HSV-1和HSV-2)、水痘带状疱疹病毒(varicella-zoster)(HSV-3)、巨细胞病毒(HCMV)、6、7、8型人疱疹病毒(HHV-6、HHV-7、HHV-8)和EB病毒(EBV)，反转录病毒，包括哺乳动物B型反转录病毒，如小鼠乳瘤病毒；哺乳动物C型反转录病毒，如鼠白血病病毒和网状内皮组织增殖病毒(T、A株系)；禽类C型反转录病毒如禽类白血病病毒；D型反转录病毒如Mason-Pfizer氏猴病毒；BLV-HTLV反转录病毒如牛白血病病毒；慢病毒属，如牛慢病毒，包括牛免疫缺陷病毒、猫免疫缺陷病毒、绵羊髓鞘脱落/呼吸困难病毒(visna/maedi virus)(1514株系)，及灵长类慢病毒，如1型人免疫缺陷病毒(HIV 1)、2型人免疫缺陷病毒(HIV 2)和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)，以及其他类型的病原性病毒。

模板10的长度一般至少为约40nt，通常至少为50、75、100、125或150nt，有时至少为约200nt、300nt、400nt或500nt或更长，且当源自基因组核酸时可为至少1000nt(1kb)、2kb、3kb、4kb、5kb、10kb、20kb、30kb、40kb或50kb。

探针50包括至少第一个模板互补性区域40。

探针50的模板互补性区域40设计为具有足够的长度且与模板10的区域具有足够的序列互补性，从而使得探针50和模板10在所需的严格性杂交条件下退火。将与探针的模板互补区40杂交的模板10的区域定义为模板区域14。

探针50的模板互补性区域40的长度一般为至少20nt，更一般地为至少35、40、45或50nt，经常为至少100nt、150nt，甚至为至少200nt、300nt、400nt或甚至至少500nt或更长。探针50的模板互补性区域40的长度一般不超过约1000nt，一般地不超过500nt，经常不超过400nt、300nt、200nt，甚至不超过100nt。

可对探针50的模板互补性区域40的长度进一步进行选择以使其与模板10的区域14杂交，该区域14包括整个预期进行扩增的模板部分。

将探针50的模板互补性区域40进一步设计为与模板区域14具有足够的序列互补性，从而使得探针50和模板10可在所需的严格性杂交条件下进行退火。

例如，探针50的模板互补性区域40在序列上可完全(即100％)与模板14互补。可选择地，模板互补性区域40在序列上可以与模板区域14仅具有至少95％的互补性、90％的互补性、85％的互补性、80％的互补性，甚至仅具有75％的互补性，该百分比互补性是为本发明的目的通过Tatiana等人(FEMS Microbiol.Lett.174：247-250(1999))的程序测量的，该程序由可在国家生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information)(NCBI)网站上获得的计算机软件BLAST2 SEQUENCES实现。

对于混合的模板，探针50的模板互补性区域40可同时与混合模板样品中各种模板区域14具有不同的序列互补性程度。

探针50进一步包括至少第一个寡核苷酸定位区域30。

探针50的第一个寡核苷酸定位区域30的长度一般为至少约10nt、11nt、12nt、13nt、14nt、15nt，甚至16、17、18、19或20nt，且可为至少25nt、30nt、40nt或甚至至少50nt或更长。探针50的第一个寡核苷酸定位区域30的长度一般不超过约50nt，甚至更一般地不超过约40nt，且可不超过35、30或甚至25nt。

在图1的说明中，第一个寡核苷酸定位区域30位于模板互补性区域40的5’。该方向不是必需的：第一个寡核苷酸定位区域30可位于模板互补性区域40的3’。

探针50可应用本领域中众所周知的固相程序进行化学合成，或通过连接较小的化学合成的片段而合成。

然而，探针50一般地通过首先将模板互补性区域克隆入复制型载体中然后在PCR反应中用侧翼的载体引物扩增该序列而生成。为使得能够在寡核苷酸连接后从探针中分离模板，可应用dUTP代替dTTP而有用地进行PCR反应；含有尿嘧啶的探针从模板中的去除进一步描述如下。

寡核苷酸20的长度一般为至少15、20或25nt，且可为至少30nt、35nt、40nt、甚至至少50nt。寡核苷酸20的长度一般不超过约50nt，且经常不超过40、30，甚至不超过25nt。

将寡核苷酸20的末端区域22设计为具有足够的长度且与探针区域30具有足够的序列互补性，从而使得寡核苷酸20和探针50可在所需的严格性杂交条件下进行退火。

寡核苷酸20的末端区域22的长度一般为至少约10nt、11nt、12nt、13nt、14nt、15nt、甚至16、17、18、19或20nt、且其长度可以是至少25nt、30nt、40nt、或甚至至少50nt或更长，且其长度通常不超过约50nt、更通常地不超过约40nt，可能不超过35、30或甚至25nt。

寡核苷酸20的末端区域22进一步设计为与探针区域30具有足够的序列互补性，从而允许寡核苷酸20和探针50在所需的严格性杂交条件下退火。

例如，寡核苷酸末端区域22在序列上可完全(即100％)与探针区域30互补。可选择地，寡核苷酸区域22在序列上可以与探针区域30仅具有至少95％的互补性、90％的互补性、85％的互补性、80％的互补性，甚至仅具有75％的互补性。

寡核苷酸20可任选地进一步包括在序列上与探针50不互补的区域24。例如，寡核苷酸20的这一额外区域24可有用地包括一个或多个限制位点以促进随后模板10部分的克隆，且此外或可选择地可包括噬菌体RNA聚合酶的启动子序列，如T3、T7和SP6聚合酶。

寡核苷酸20一般进一步设计为包括一种序列“引发位点”，寡核苷酸引物在随后的步骤中可以与该序列退火。

引发位点可以附加于末端区域22和任选区域24的任一个或两者上，或者可仅为其部分。引发位点序列的长度和序列基于本领域中众所周知的考虑进行选择，该考虑包括引发位点和引物之间预期的双链体的计算Tm、预期进行扩增的模板中引发位点序列或其反向互补序列不存在等。

对本发明方法的第一个步骤的退火条件进行选择，从而使得模板10和寡核苷酸20可同时与探针50退火。一般地，但不是不变地，寡核苷酸末端区域22将比模板区域14短，且退火条件因此将主要为了确保寡核苷酸20与探针50以预期的严格性进行杂交而进行选择。

在本方法的下一步中，模板10中在模板区域14的核苷酸处生成了可连接的游离末端，该核苷酸与探针50的模板互补性区域40的连接核苷酸退火。

在一系列实施方案中，该可连接的游离末端通过去除与探针区域40不互补的模板区域而生成，一般地通过用对单链底物具有活性的核酸酶进行处理。

有用地，可连接的游离末端是应用核酸外切消化生成的，该核酸酶的选择由模板核酸外切的预期方向确定。例如，与探针50不互补的模板区域可通过与Exo I(3’到5’的外切核酸酶)Exo T(3’到5’)、rec J_f(5’到3’)、Exo VII(3’到5’和5’到3’两种活性)或其组合反应而除去。

在只有与探针50不互补的模板区域处于模板区域14外部的实施方案中(如图1和2，与图4相反，在下文进一步描述)，可连接的游离末端也易于通过应用内切核酸酶如绿豆核酸酶而生成。

在游离末端在模板区域14的5’末端形成的实施方案中，可对模板的游离末端进行进一步的激酶处理以确保存在5’磷酸用于随后的连接。

然后应用DNA连接酶如T4连接酶或有用地应用热稳定性连接酶如Taq连接酶将第一寡核苷酸20与新生成的第一个可连接的游离末端连接。连接酶和连接条件的选择完全在本领域技术范围内。

可重复如图1中示意的及上述的将寡核苷酸直接添加到模板上的方法，从而实现第二个寡核苷酸向模板的添加。

图2显示了可选择的一系列实施方案，其中在单个反应中分别将第一和第二寡核苷酸20a和20b添加到模板10上。

在这些后面的实施方案中，探针50除第一个寡核苷酸定位区域30a之外进一步包括第二个寡核苷酸定位区域30b。第二个寡核苷酸定位区域30b直接与第一个模板互补性区域40邻近。探针50中模板互补性区域40的核苷酸和直接邻近的第二个寡核苷酸定位区域30b的核苷酸限定了探针50中的第二个连接，且在下文中称为第二连接核苷酸。

第二个寡核苷酸20b包括在序列上与探针50的第二个寡核苷酸定位区域30b互补的末端区域26。

与第一个寡核苷酸20a类似，第二个寡核苷酸20b任选地可进一步包括在序列上与探针50不互补的区域28。例如，寡核苷酸20的该额外区域28可有用地包括一个或多个限制位点以促进模板10的部分的随后克隆，且此外或可选择地，可包括噬菌体RNA聚合酶的启动子序列，如T3、T7和SP6聚合酶。

第二个寡核苷酸20b一般进一步设计为包括至少一个用于随后引发酶促聚合作用的位点。

引发位点可以附加于末端区域26和任选区域28的任一个或两者上，或者可仅为其部分。引发位点序列的长度和序列基于本领域中众所周知的考虑进行选择，该考虑包括引发位点和引物之间预期的双链体的计算Tm、预期进行扩增的模板中引发位点序列或其反向互补序列不存在等。

模板10、第一寡核苷酸20a和第二寡核苷酸20b同时与第一个探针50退火。

模板10和探针50通过模板区域14与探针区域40(即模板互补性区域)的杂交而进行退火。如在上述实施方案中，第一寡核苷酸20a的末端区域22与第一个寡核苷酸定位区域30a退火，而第二寡核苷酸20b的末端区域26与第二个寡核苷酸定位区域30b退火。第一个寡核苷酸末端区域22的末端核苷酸与探针的第一个寡核苷酸定位区域的连接核苷酸退火。第二个寡核苷酸末端区域26的末端核苷酸与探针的第二个寡核苷酸定位区域的连接核苷酸退火。

在下面步骤中，在模板10上生成了第一个和第二个可连接的游离末端。第一个可连接的游离末端在模板10上模板区域14的如下核苷酸生成，该核苷酸与探针50的模板互补性区域40的第一连接核苷酸退火。第二个可连接的游离末端在模板10上模板区域14的如下核苷酸生成，该核苷酸与探针50的模板互补性区域40的第二连接核苷酸退火。生成游离末端的模板核苷酸仍然在模板中。

其后，将第一和第二寡核苷酸两者与模板10进行连接：第一个寡核苷酸与模板10的第一个可连接的游离末端连接，第二寡核苷酸与模板10的第二个可连接的游离末端连接。

有用地，可连接的游离末端是用双向核酸外切消化生成的，即用单个双向外切核酸酶或用具有相反方向外切核酸酶活性的外切核酸酶组合。在只有与探针50不互补的模板区域处于模板区域14外部的实施方案中(如图1和2，与图4相反，在下文进一步描述)，可连接的游离末端也易于通过应用内切核酸酶如绿豆核酸酶而生成。

在另一系列的实施方案中，如图3所阐明的，在单个反应中应用两个探针(即第一个探针50a和第二个探针50b)将第一和第二寡核苷酸添加到模板10上。

第一个探针50a包括模板互补性区域40a和第一个寡核苷酸定位区域30a。第二个探针50b包括模板互补性区域40b和第二个寡核苷酸定位区域30b。模板10分别通过模板区域14a和14b与探针50a和50b进行杂交。

如图3所阐明的，在这些实施方案中，模板10中模板区域14a和14b是不连续的，这有用地使得要添加到模板10中的寡核苷酸独立于模板区域14a和14b之间间插的序列，从而使得寡核苷酸可以添加到模板10上，而不管在间插区域中可发生何种变异，如外显子插入或缺失。

在这种实施方案中，一般将外切核酸酶消化用于生成模板的第一个和第二个可连接的游离末端，而不是应用内切核酸酶消化。

图4阐明了进一步的实施方案，其中将单个探针50用于将第一和第二寡核苷酸添加到模板10上。与图2中阐明的实施方案相反，与探针不互补的一个区域使模板区域14中断。

在这种实施方案中，可将外切核酸酶用于在模板10中生成可连接的游离末端，结果如图4B所示意。这种实施方案有用地使得要添加到模板10中的寡核苷酸独立于使模板区域14中断的序列，从而使得寡核苷酸可以添加到模板10上，而不管在该区域中有如外显子插入或缺失等的变异。

在可选择地实施方案中，可将内切核酸酶消化如绿豆核酸酶用于生成第一个和第二个可连接的游离末端，结果如图4C所示意。在这些实施方案中，内切核酸酶额外地去除在模板10中间插的不互补的区域。

这些后面的实施方案使得完全与探针区域40匹配的模板能够与不完全与探针区域40匹配的模板区别，在这些实施方案中将内切核酸酶消化用于生成可连接的游离末端。特别地，当该方法之后伴随着双向扩增的步骤如PCR时，仅有那些完全与探针区域40匹配的模板将进行指数扩增；那些不完全匹配的模板将被切割(如在图4D中的)，且最多可进行单向扩增，因而是几何扩增。

在进一步的一系列实施方案中，引发位点可以不与寡核苷酸20连接而添加到模板10上。在这些实施方案中，需要在模板10中存在或生成游离的可连接的3’末端，引发位点可通过直接从模板10上进行DNA聚合酶延伸而添加到模板10上，而不是通过连接独立的寡核苷酸种类。在该反应中，探针50的寡核苷酸定位区域30充当指导模板10的酶促延伸的“模板”。

在这种实施方案中，进行第一个杂交步骤而不添加第一或第二寡核苷酸。在模板50与探针30杂交之后，添加DNA聚合酶如Taq聚合酶以延伸模板，从而添加引发位点和任选的分子标签(标签在下文中进一步进行描述)。一般地，如在上述的实施方案中，聚合作用之后伴随着添加寡核苷酸20的第二个杂交步骤，然后进行连接。

任何上述实施方案可包括从寡核苷酸20和探针50中分离模板10的进一步的步骤。

一般地，模板10易于基于大小而应用标准技术从寡核苷酸20分离，如凝胶电泳、凝胶过滤、透析或在具有大小选择性膜的旋转柱中的离心。

在一些实施方案中，模板10也可仅仅基于大小差异与探针50进行分离。然而，探针50更一般地包括用于从模板中分离探针的手段。

例如，探针50可包括脱氧尿苷残基以作为所有或部分胸苷残基的替代物。

在这种实施方案中，可在连接步骤后用尿嘧啶-DNA糖基化酶(“UDG”)处理探针50，该酶催化游离尿嘧啶从含有尿嘧啶的DNA中的释放，从而生成无嘌呤(“AP”)的位点。

然后AP位点可用AP内切核酸酶或在某些条件下用AP裂解酶进行酶促切割。

例如，AP位点可用Endo IV或Fpg(甲酰胺基嘧啶[fapy]-DNA糖基化酶；也已知为8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶)进行切割。Fpg可从3’和5’切割AP位点，从而去除AP位点并留下1个碱基的缺口。

可选择地，AP位点可进行化学切割，如通过用1，4二氨基丁烷和热进行处理。

在另外进一步的替代方案中，探针可包括模拟损伤的嘌呤的嘌呤，如8-氧代鸟嘌呤、8-氧代腺嘌呤、fapy-鸟嘌呤、甲基-fapy-鸟嘌呤、fapy-腺嘌呤、黑曲霉毒素B-fapy-鸟嘌呤、5-羟基-胞嘧啶和5-羟基-尿嘧啶。Fpg糖基化酶将从DNA中释放这些残基并去除结果所得的AP位点，从而留下1个核苷酸的缺口。

然后探针50的切割产物易于通过大小分离从模板10中分离，任选地先进行变性步骤。

探针50可替代性地或额外包括至少一个捕获部分。该捕获部分一般为特异性结合配对的一个成员。

“特异性结合”指同时存在于异源的(不同源的)样品中的两个分子种类比结合样品中其他分子种类优先地进行相互结合的能力。一般地，特异性结合相互作用将以至少2-倍与偶然的相互作用相区别，更一般地为以至少10-倍，且常为至少100-倍。一般地，特异性结合相互作用的亲和力或亲合力至少为约10⁷M^-1，应用至少10⁸M^-1到至少约10⁹M^-1，且常更高，包括高达10¹⁰M^-1到10¹²M^-1的亲和力和亲合力。

短语“特异性结合配对”指展示特异性结合的分子配对，一般地为生物分子的配对。

可用于捕获寡核苷酸的大量特异性结合配对成员是本领域中公知的。

在这其中的为通俗称为“半抗原”的捕获部分，而不考虑其抗原性。这种半抗原包括生物素、洋地黄毒苷和二硝基苯。生物素可用抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、captavidin、neutravidin或抗生物素抗体进行捕获。洋地黄毒苷和二硝基苯可用对各自半抗原特异性的抗体进行捕获。

连接后探针向固体支持体上的捕获使得能够从模板10和寡核苷酸20中分离探针50。

在另一系列实施方案中，寡核苷酸20可包括一种或多种捕获部分。在这种实施方案中，模板10一般首先通过大小分离从未连接的寡核苷酸中分离，然后模板10通过已成功地连接了寡核苷酸的模板分子的捕获从探针50中分离。

本发明的方法可包括在将寡核苷酸连接到模板上后扩增该模板的进一步步骤。一般地，连接的模板首先从探针和游离的寡核苷酸分离，然后进行扩增。

如在此处所用的，术语扩增包括由噬菌体启动子驱动的聚合作用进行的RNA转录物的产生。

然而，更一般地，扩增产物是通过用一种或多种寡核苷酸(“引物”)引发的聚合作用产生的DNA，该寡核苷酸能够与添加到模板上的一个或多个寡核苷酸中的一个或多个引发位点进行杂交。

例如，可将能够与存在于第一寡核苷酸中的第一个引发位点结合的第一个引物用于引发单向的扩增。可将能够与存在于第二寡核苷酸中的第二个引发位点的互补链结合的第二个引物用于引发双向的扩增。在第一个和第二个引发位点相互为反向互补链的实施方案中，第一个和第二个引物可为相同的。

扩增可为等温的或循环变温加热的。

用于本发明方法中的核酸扩增方法是本领域中众所周知的，且包括如聚合酶链反应(PCR)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、自维持序列识别(3SR)、连接酶链反应(LCR)、转录介导的扩增(TMA)、滚环扩增(RCA)和链置换扩增(SDA)。

一般地，双向扩增是用PCR实现的。

本发明的方法可易于进行多重化，从而使得在单个反应中将一个或多个寡核苷酸添加到多个不同序列的模板上。该模板可为分离的核酸分子或单个分子如染色体上分离的座位。在特别有用的多重化实施方案中，可将至少一个且一般地为两个公共引发位点添加到多个模板的每一个上。

因而，在另一方面，本发明提供了在单个反应中将至少第一寡核苷酸直接添加到不同序列的多个核酸模板上的方法。

在本发明的这种多重化实施方案中，可将至少1个寡核苷酸添加到至少2个不同序列的模板上，一般地为至少5个不同序列的模板，甚至为至少10、20、30、40或甚至至少50个不同序列的模板上，且可添加到100、500、1000、甚至5000或更多不同序列的模板上。

在第一步中，在单个反应混合物中使不同序列的多个模板中的每一个和各自第一寡核苷酸同时与多个探针的各自一个退火。

如在上述的单重实施方案中描述的，每一个探针包括至少第一个与模板的各自一个互补的区域和与其直接邻近的至少第一个寡核苷酸定位区域。同样如在上述的单重实施方案中描述的，探针中模板互补性区域的核苷酸和直接邻近的寡核苷酸定位区域的核苷酸称为限定其间第一个探针连接的第一连接核苷酸。

每一个第一寡核苷酸包括与各个探针的第一个寡核苷酸定位区域互补的末端区域。该寡核苷酸末端区域的末端核苷酸与探针的第一个寡核苷酸定位区域的第一连接核苷酸退火。

然后，在多个模板的每一个中与其各自探针的第一个模板互补性区域的连接核苷酸退火的核苷酸处生成了第一个可连接的游离末端。如在单重实施方案中的描述，可连接的游离末端可易于用外切核酸酶生成；在与探针互补的模板是连续的实施方案中，可连接的游离末端也可易于用单链特异性内切核酸酶生成。

在一些实施方案中，第一个寡核苷酸定位区域的序列在所有多个探针中均相同。在这种实施方案中，可应用单个种类的第一寡核苷酸，因而向多个模板中的每一个添加相同的寡核苷酸，并因而添加相同的引发位点。

在其他实施方案中，第一个寡核苷酸定位区域的序列在多个探针中是不同的，并将不同种类的第一寡核苷酸添加到不同序列的多个模板的每一个上。然而，即使在这种实施方案中，多个第一寡核苷酸可包括在它们之间相同的引发位点。在这种情形中，引发位点一般定位于任选的寡核苷酸区域24中。

如在本发明方法的单重实施方案中的描述，多重实施方案可进行重复以在一个或多个反应中将额外的寡核苷酸附着于不同序列的多个模板的每一个中。

在可选择的实施方案中，多个探针的每一个进一步包括直接与其模板互补性区域邻近的第二个寡核苷酸定位区域。模板、各自第一寡核苷酸和各自第二寡核苷酸同时与多个探针的各自一个进行退火，随后生成第一个和第二个可连接的游离末端，且随后进行连接。

每一个第一寡核苷酸可有用地包括在它们之间共有的第一个引发位点，且每一个第二寡核苷酸可有用地包括在它们之间共有的第二个引发位点。在这种实施方案中，不同序列的每一个模板的随后扩增可用公共的第一个和第二个引物实现。当第一个和第二个引发序列相互为反向互补链时，双向扩增可应用单个公共引物实现。

本发明的多重方法可包括进一步从多个探针和寡核苷酸中分离多个模板，然后在公共的反应中扩增多个模板的步骤。

在本发明方法的多重化实施方案中，第一和/或第二寡核苷酸可有用地包括基因型标记(“标签”)，该标记使得能够分别鉴定每一个唯一的模板和从其中扩增的产物。

标签是具有如下序列的短核酸，该序列根据算法设计为使在展示各自标签的互补体的微阵列上的辨别力最大化；标签序列和在其上添加的核酸之间的1∶1对应使得能够通过探测与其唯一结合的标签而鉴定每一个这种核酸。参见如Shoemaker等人，Nature Genet.14(4)：450-6(1996)；EP 0799897；Fan等人，Genome Res.10：853-60(2000)；和美国专利No.6,150,516，在此处将其公开内容整体引入作为参考。

在本发明的实施方案中，在第一寡核苷酸的每一个种类和/或第二寡核苷酸的每一个种类中可包括不同的标签序列。在这些实施方案中，每一个寡核苷酸种类的末端区域在序列上是不同的，且仅可以与单个探针种类进行退火。因而标签序列和添加于模板上的寡核苷酸之间的1∶1对应使得能够通过探测与其唯一结合的标签而鉴定每一个模板和从其中扩增的产物。

在其他实施方案中，标签可独立于寡核苷酸20而添加到模板10上。

图5示意性说明本发明的实施方案，其中多个寡核苷酸顺次地添加到模板10的单个可连接的游离末端上。

在这些实施方案中，探针50的第一个寡核苷酸定位区域30包含至少亚区34和32：寡核苷酸定位亚区32与寡核苷酸20的末端区域22互补；亚区34与寡核苷酸21互补。

在方法的第一步中，模板10和至少寡核苷酸21同时与探针50退火。一般地，寡核苷酸20也同时与探针退火。如果可连接的游离末端不存在，则在模板10上生成可连接的游离末端，然后使模板10与寡核苷酸21连接。寡核苷酸20在分开的反应中或在寡核苷酸21与模板10连接的同时与寡核苷酸21顺次连接。

尽管显示为添加到模板10的游离3’末端，但寡核苷酸21和20也可添加到模板10的游离5’末端。

在这些实施方案中，寡核苷酸21可包括标签，因而该标签独立于寡核苷酸20而添加到模板上，该寡核苷酸20任选地(但一般地)包括引发位点。

当标签添加到模板10的5’和3’游离末端的每一个上时，与每一个模板特异结合的两个标签可相互为反向互补链或在序列上相互不同。

直接将公共的第一个和第二个引发位点添加到不同序列的多个模板的每一个上——不预先对模板进行扩增——促进了随后对多种不同序列模板进行化学计量的扩增，消除了在许多多重PCR方法中观察到的不均匀扩增的问题。通过使得能够不依赖于对模板序列的考虑而从头设计引发位点，本发明的方法也使得能够用具有最适的杂交特征的引物进行扩增，从而降低了如引物二聚体形成的人为假象(artifact)。

下面的实施例仅以阐明的方式而不以限制的方式提供。

实施例1

寡核苷酸向游离模板末端的附着

通过从含有钙粘着蛋白基因的外显子14的克隆中扩增DNA而生成了单个探针，其中在PCR中应用dUTP而不是dTTP和与克隆侧翼的载体序列互补的引物。将由钙粘着蛋白基因的外显子14组成的PCR产物用作模板。寡核苷酸是化学合成的。

在应用30zmole-30fmole的模板连续稀释物的平行反应中，使模板和足够量的2个不同寡核苷酸种类同时与探针进行杂交。然后应用Taq连接酶进行连接以将公共的寡核苷酸添加到退火的模板上。

将UDG处理用于消除探针，并进行应用公共引物的PCR反应，其中一个引物与用于前述杂交和连接中的寡核苷酸相同，而另一个与用于杂交和连接中的寡核苷酸互补。

图6显示最终PCR反应的结果，其中泳道1为无模板的对照，泳道2显示30zmole模板的结果，泳道3显示3amole模板的结果，泳道4显示0.3fmole模板的结果，泳道5显示30fmole模板的结果。

如在图6的泳道2中所证明的，少至30zmole的初始模板PCR被探针指导的寡核苷酸连接“捕获”，并进行扩增，其中扩增产物以箭形标记显示。在杂交和连接中增加模板的量导致最终扩增的产物量的增加，如泳道3、4和5所证明的。

当初始的杂交和连接反应中不存在模板时，未探测到扩增产物，如在泳道1中所证明的。额外的对照(如省略杂交或探针)也导致不存在扩增产物(未显示)。

所用的实验条件总体上与那些在下面实施例7中详细描述的相似。

实施例2

扩增和探测多个模板

从10个不同的克隆中生成了10个探针。

应用9个独立的引物用本领域标准的多重PCR反应生成了9个模板。该模板中的6个完全与探针中的6个匹配；2个探针无匹配的模板；1个模板无匹配的探针；且2个模板虽与探针匹配，但该模板比各自的探针长几个核苷酸，从而排除了探针指导的寡核苷酸定位和寡核苷酸与模板的连接。

因此，在“捕获”(即探针指导的寡核苷酸向模板的附着)和扩增后仅预期有6个片段，如在图7A中阐明的：片段(ii)、(iv)、(v)、(vi)、(x)和(xi)在模板混合物和探针两者中；片段(i)和(iii)也存在于模板混合物和探针两者中，但模板包括额外的碱基；片段(vii)在模板中但不在探针中；而片段(viii)和(ix)在探针中但不在模板混合物中。

使混合的模板与探针和寡核苷酸混合物进行杂交，随后进行连接，进行UDG处理以消除探针，并应用公共引物进行PCR扩增。如在图7B中所示的回收了该6个预期片段，从而证明该方法的多重化和特异性。

所用的实验条件大体与那些在下面实施例7中详细描述的相似。

实施例3

模板动态范围(template dynamic range)的规一化

在这些实验中，我们预期各种模板以大大不同的量存在，这是由用于生成模板的本领域标准的多重PCR反应造成的。然而，通过利用有限量的探针，我们在此证明由公共引物扩增的最终产物的动态范围降低了。

用于前面实施例中的10个探针(在图7A中示意)以各自15amole的浓度用于本实验中。应用10个模板。该模板包括图7A中所示的9个模板以及图7A中的探针(viii)。无论模板为1.5amole还是150amole均获得了相似的结果，其中所有产物均良好扩增，如图8所证明的。

图8显示了在探针介导的寡核苷酸向每一个模板连接之后应用公共引物的PCR反应的结果。

在泳道1中，所有模板对于杂交和连接反应均为150amole。在泳道2中，所有模板均为1.5amole。在泳道3和4中，除由箭形标记显示的各自为150和1.5amole模板之外，所有模板均为15fmole。

因此，初始浓度中1.5amole和15fmole之间10,000倍的差异在获得的最终产物中减少到约10-倍的差异。不受理论限制，该规一化是因为应用有限量的探针(15amole)而发生的。

实施例4

复杂混合物中模板的探测

将135对引物用于生成复杂的PCR产物，该产物充当模板混合物。该模板包括在上述实施例2中生成的9个模板以及126个无关的模板。将与上述实施例2中描述的相同的10个探针用于“捕获”(即指导寡核苷酸添加)混合物中适当的模板，其中应用上述实施例1中所述的相同规程。所用的实验条件大体与那些在下面实施例7中详细描述的相似。

如图9所示，所有预期的6个片段均重新获得，其动态范围不超过一个数量级。

实施例5

复杂混合物中93个模板的探测

应用基本与如上所述相同的规程，将93个引物对用于生成模板混合物，并将相应的93个探针用于指导寡核苷酸的添加(“捕获”)。

每一个引物对在两个配对的引物中的一个上具有20聚体的标签序列，从而在寡核苷酸添加之前向每一个模板添加一个独特的标签。该标签序列可用于定量各个扩增子。

在探针指导的寡核苷酸添加(“模板捕获”)和应用公共引物的扩增之后，将扩增产物进行荧光标记并与一个阵列进行杂交，该阵列具有与标签序列互补的寡核苷酸探针。

应用该分析，所有93个标签均可探测到并指示与它们相关的模板扩增子。

尽管由于上述证明的程序的特异性，与标签连接的一些假产物不太可能在捕获和扩增后进行扩增，但标签追踪预期扩增子的严格性证明如下：将应用公共引物扩增的产物用作另一轮PCR的模板，该PCR在一侧应用标签引物而在另一侧应用公共引物。在检验的所有6种情形中，扩增了具有预期大小的单个条带，从而证明含有标签的假扩增产物不存在。

为了证明扩增的序列是模板的而不是探针的，将应用公共引物扩增的材料用作PCR反应的模板，以便扩增已知在模板和探针之间具有单个碱基的变异的特定片段。对扩增的产物进行双脱氧测序，且已证实在所有4个检验的情形中，扩增的产物源自模板。

每一个扩增子的量不能仅仅通过标签阵列上各个标签的信号强度来确定，这是因为在阵列上各种标签与其互补链的杂交是不同的。为了给这种不均匀的杂交设置对照，应用了双色的杂交。在一个通道中分析等摩尔量的每一种扩增子，而在第二个通道中分析特异性扩增的样品。对每一种扩增子两种信号比例的分析提供了扩增样品中每一种片段的量。

作为对量化精确性的测量，通过在两个通道中的杂交检验了等摩尔的样品。所有93个片段处于2-倍的范围内。几乎97％的扩增产物处于20倍的范围内，该范围至少与单独的单重PCR中发现的(图10)同样严紧。该严紧的动态范围可能是由于有限量探针(1-10amole)的应用，从而使得能够对模板中的巨大动态范围进行规一化。

图10显示对于各种标签获得的芯片杂交信号。y轴显示来自等摩尔样品的信号。x轴显示来自我们实验样品的信号，且信号中的差异反映标签的差异杂交和量。这些信号的比例确定了各种产物的量。

所用的实验条件一般与那些在下面实施例7中详细描述的相似。

实施例6

探针与模板和标签的独立杂交

标签可用于探测各种扩增中的不同扩增子。在上述实施例5中，所用的标签是初始模板生成中引物的一部分。然而，在一些应用中，不希望或不可能使模板预先与标签连接。例如由基因组DNA或cDNA充当模板且将具有引物位点的寡核苷酸添加到模板内部的位点上时，就是这样的。

在一个方法中，探针中的互补性区域指导模板和适当的标签两者的杂交。除额外的杂交事件外，额外的切口封闭是生成由公共引物扩增的模板所必需的。

应用69个带有预期的模板扩增子和标签的探针混合物。该模板应用30个引物对生成。将探针、模板、相应于69个标签的69个寡核苷酸的混合物和两个公共杂交寡核苷酸组合于杂交混合物中。在杂交、连接、UDG处理和应用公共引物扩增之后，应用与如上所述相同的程序(即双色杂交)确定扩增的片段的量。

具有相应的模板的36个标签以与当标签在模板生成中进行添加相同的效率进行了探测。在最终扩增的样品中未探测到缺失相应模板的33个标签的任何一个，从而证实了标签杂交的可靠性。

实施例7

在复杂混合物中探测超过1000个模板

应用1180个克隆，通过用载体引物扩增生成了1180个含有dUTP的探针。将这些探针混合并用于探测模板，其方法如上文简述的和在下文中详述的。

对于模板生成，将1250个引物对用于13个不同组中，每组96对。在1250个产物中，1180个显示具有相关的探针。以与上述实施例6中所述的相同的方式，将模板混合并与探针和1250个标签寡核苷酸进行杂交。连接之后为UDG处理和应用公共引物的PCR。

产物是应用如上所述的双色杂交在标签芯片上进行分析的。85％的产物处于20倍的动态范围内。绝大多数失败来自基因组特定的100Kb区域的重叠片段(位于人类染色体2的175兆碱基)(“MB175”)。除该区域之外，约94％的产物处于20倍的范围内。

MB175扩增子的扩增失败显示是由于模板生成中的失败，这是因为对单重(“单重”)PCR生成的产物混合物的“捕获”是成功的。这些扩增子如果在模板生成步骤保持为独立的组，则可证明其模板生成是更成功的。这可能是因为在模板生成过程中低扩增效率的片段竞争不过高扩增效率的片段。

通常，当模板生成为96-重或更高时，在1000-重或更高的探测和扩增后，独立生成显示低扩增效率的区域的模板是优选的。同样，将针对失败的扩增子的引物对混合在一起以在模板生成中得到更高的成功率。

在一系列这种96-重的实验中，如前文所述进行第一个杂交步骤，但不添加公共寡核苷酸。杂交后，应用探针作为模板添加Taq聚合酶以延伸模板，结果导致一个公共引发位点的合成。此后伴随着应用其他公共寡核苷酸的第二个杂交步骤、连接、UDG-处理以去除探针和应用如上所述的两个公共寡核苷酸的PCR。

如上所述通过芯片对产物进行分析。20倍范围内的片段百分比为77％，仅略低于双侧连接反应(80％)。与上述结果相比该96-重方法中较低的回收率的原因可能是该特定的实验组具有许多来自上述难以扩增的MB175区域的片段。

所用实验规程如下：

1.通过PCR生成含有尿嘧啶的探针

将含有插入物并用Qiagen试剂盒纯化和构建的质粒用作模板以通过PCR在30μl反应物中生成含有尿嘧啶的探针。将约3fmol/μl的质粒(通常为1-10fmol/μl)在TE中稀释100,000倍以获得30zmol/μl。在冰上配制PCR反应物，其中应用1.5μl稀释的质粒、各200μM的dATP、dCTP、dGTP(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)、400μM的dUTP(Applied Biosystems，Foster City，CA)、各0.5μM的含有尿嘧啶的公共正向引物(STF-U：5’-GAC UUU AAA GUA AAA CGA CGGCCA-3’(SEQ ID 1))、反向引物(STR-U：5’-AGA UCU CUC GAG UGAUCA CC-3’(SEQ ID 2))和1.5单位的Taq DNA聚合酶(NEB)。反应物在GeneAmp9700热循环仪(Applied Biosystems，Foster City，CA)上扩增，其中于94℃预变性3分钟，然后为94℃进行30秒、60℃进行1分钟及72℃进行1分钟的32个循环；最后延伸7分钟。将PCR产物用含有溴化乙锭的琼脂糖凝胶进行分析，并在用Kodak图象系统拍摄显微照片之后用ImageQuant5.2(Molecular Dynamics/AmershamBiosciences，Sunnyvale，CA)进行定量。通常，95％的反应得到了预期的单个产物条带。当没有扩增时，进行新的PCR或制备新的质粒然后再次进行PCR通常可导致成功的扩增。

将含有尿嘧啶的PCR产物以相同的量混合在一起以生成用于多重扩增的探针混合物(高达1180个探针)。该探针混合物用QiaquickPCR纯化试剂盒(Qiagen)进行纯化并在pH8.0的10mM Tris-HCl中洗脱。对于每一个后续的捕获/杂交反应，应用20或30μl的2-10amol/探针以确保在反应中探针少于每一种初始质粒。

2.正向引物和标签的磷酸化

将正向引物和寡核苷酸标签用T4多核苷酸激酶(T4 PNK，NEB)进行磷酸化。使混合的正向引物和寡核苷酸标签(每一个混合物含有96个寡核苷酸)在1×T4 DNA连接酶缓冲液(50mM pH7.5的Tris-Cl、10mM MgCl₂、10mM二硫苏糖醇、1mM ATP、25μg/ml牛血清白蛋白)和50单位100μl体积的T4 PNK中于37℃温育60分钟，该T4 PNK对于每一种寡核苷酸分别为200nM和100nM，然后于65℃加热20分钟以灭活PNK。

3.通过PCR多重化生成模板

同时将高达96个引物对(正向和相应的反向引物)用于扩增许多不同的座位以生成模板。应用具有高保真性的DNA聚合酶如Pfu(可校正的酶)与相应的缓冲液以确保扩增的低出错率。PCR反应在15μl体系中进行，该体系具有1×Pfu Turbo或PfuUltra^TM PCR缓冲液(Stratagene)、30ng人基因组DNA、50nM磷酸化的正向引物混合物(每一种引物)、50nM反向引物混合物、各200μM的dNTP、额外的0.01％纯化的BSA(NEB)和0.6单位的Pfu Turbo或PfuUltra^TM(Stratagene)。最终的Mg2+浓度为4.5mM-6.5mM。将PCR于95℃进行2分钟，随后为7个循环，每个循环中于95℃进行25秒、于64℃进行5分钟并在每个循环中降低1℃、和于72℃进行3分钟。其后伴随着另外18个循环，每个循环中于95℃进行25秒、于57℃进行5分钟和于72℃进行3分钟。产物最后于72℃延伸7分钟。

PCR后，混合相同基因组DNA但具有不同引物混合物的产物，如将13孔混合到1孔中以获得每孔超过1000个扩增子。将来自每一个混合的孔中的10μl等份试样在2％琼脂糖凝胶中进行电泳。

混合的模板(PCR产物)进一步根据生产商的说明书由QiaquickPCR纯化系统(Qiagen)或QuickStep^TM 2 PCR纯化系统(Edge Biosystems)进行纯化。将纯化的模板直接用于杂交或由Speedvac进行干燥，以使得在杂交/捕获反应中有更多的模板。

4.杂交/捕获

杂交是在20μl或30μl终体积中进行的。对于每一个30μl的反应，将各100fmol的两种公共侧翼寡核苷酸(LTF：5’-GAC TTT AAA GTAAAA CGA CGG CCA GTT CTT CCC-3’(SEQ ID 3)；和LTRrevP：5’-[磷酸]CGC GCC CCG CGG TGA TCA CTC GAG AGA TCT-3’(SEQ ID 4))、各10fmol的相应标签寡核苷酸、各5amol的相应含有尿嘧啶的探针和所需模板在最终13μl 0.3×SSPE中混合。将混合物加热到94℃持续2分钟并快速置于冰水中以进行冷却。然后加入17μl冰预冷的SSPE/聚乙二醇8000(7μl 20×SSPE+10μl 30％的PEG 8000的混合物)。将结果所得的杂交混合物置于已预热到超过80℃的加热块上。然后使混合物于95℃进行1分钟、70℃进行20分钟、65℃进行20分钟、60℃进行20分钟、55℃进行10分钟、50℃进行10分钟，然后保持于4℃。

杂交后，将混合物根据生产商的说明书由Edge Biosystems的QuickStep^TM 2 PCR纯化系统进行纯化，但是在最后的离心中以700×g进行2分钟。由于存在PEG 8000，所以可获得约初始样品的两倍体积。

5.连接

连接在40μl体积中于50℃进行30分钟，随后于55℃进行20分钟，该体系中具有35μl纯化的杂交混合物、1×Taq连接酶缓冲液(25℃时pH7.6的20mM Tris-HCl、25mM乙酸钾、10mM乙酸镁、10mMDTT、1mM NAD和0.1％Triton X-100)中的40单位Taq DNA连接酶。

6.尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)处理

向上述连接产物中加入1μl UDG(1单位，NEB)，并将混合物于37℃温育50分钟，94℃进行3分钟并置于4℃。结果所得的UDG-处理的连接产物可直接用于下一轮PCR中，并用连接缓冲液中的Mg2+进行适当调整。

7.用于模板探测和扩增的多重PCR

此处进行的PCR应用一对公共引物扩增了连接产物。仅有连接的产物被扩增了。UDG-处理可确保不扩增含有尿嘧啶的探针。

一般地，PCR在80μl体积中进行，该体系具有20μl UDG-处理的连接产物、各200μM的dNTP、各0.5μM的正向引物(STF2P，磷酸化的：5’-[磷酸]GAC TTT AAA GTA AAA CGA CGG CCA-3’(SEQ ID 5))和反向引物(STR：5’-AGA TCT CTC GAG TGA TCA CC-3’(SEQ ID 6))、0.01％或0.02％BSA、2mM Mg Mg2+、1×PfuUltra缓冲液中的3单位PfuUltra DNA聚合酶。将反应物在PE 9700中扩增25个循环(95℃进行2分钟，95℃进行30秒、60℃进行1分钟、72℃进行5分钟，最后于72℃延伸7分钟)。PCR产物用2％琼脂糖凝胶进行检查。

8.芯片标记

为了检查上述PCR多重化反应(高达1180-重)中产物的相对量，应用了Genflex^TM标签芯片(Affymetrix)。将双色标记与由生物素标记的等摩尔尿嘧啶探针和由羧基荧光素(FAM)标记的多重模板探测阶段(stage)(“第二个阶段”)的PCR产物一起应用。每一种产物扩增的程度从FAM信号对生物素信号(由链霉抗生物素-藻红蛋白荧光标记探测)的比例得出，这是因为在芯片上应用了等量探针。

为了制备芯片标记，将20μl第二个阶段的PCR产物首先在40μl体积中用50单位的DraI(NEB)(在标签和剩余的扩增子之间切割)、10单位的外切核酸酶I(ExoI，USB)于37℃处理60分钟，随后于80℃变性30分钟。将购自Applied Biosystems(Foster City)的具有Mg2+的10×PCR缓冲液用于将反应缓冲液调节为1×PCR缓冲液浓度。该步骤将生成含有标签序列的短于50bp的短DNA片段，同时消除了用于第二个阶段PCR反应中的单链短引物。

应用40μl来自第二个阶段PCR反应的DraI/ExoI-处理的PCR产物作为模板，用FAM-或生物素-标记的引物进行了线性扩增，该引物具有与邻近标签序列的公共寡核苷酸序列相同的序列(5’-A GTA AAACGA CGG CCA GTdU CdUT[FAM]CCC-3’(SEQ ID 7)或5’-A GTA AAACGA CGG CCA GTdU CdUT[生物素]CCC-3’(SEQ ID 8))。反应在含有终浓度为45μM的dNTP、1.7单位的AmpliTaq GoldDNA聚合酶(Applied Biosystems，Foster City)和1μM上述标记的引物之一的50μl体积中进行(95℃进行5分钟，然后为40个循环，每个循环中95℃进行30秒、58℃进行1分钟和72℃进行30秒，最后延伸2分钟)。

在取出5μl上述反应物以用于随后凝胶分析后，将3微升UDG(3单位)添加到剩余反应物中并进一步于37℃温育20分钟，随后于96℃进行10分钟以生成含有标签的24聚体标记产物。

将UDG处理之前和之后的5微升样品在10％预制的Ready Gel尿素-TBE PAGE凝胶(Bio-Rad)上进行分离，并应用单独的引物作为标准，对UDG处理后获得的DNA片段进行定量以确定总标记产物。

对于芯片杂交，制备110μl的溶液，该溶液含有1×MES缓冲液、1×Denhardt溶液、各1.1fmol的GenFlex^TM Tag对照、各1fmol来自探针的生物素标记产物和各5fmol来自PCR多重化的FAM标记产物。将混合物于95℃变性6分钟，并在室温加载于在1×MES缓冲液中预先平衡的GenFlex芯片上之前快速在冰水中放置2分钟。杂交在烘箱中于39℃在约19rpm的旋转中进行过夜(12-16小时)。

然后将芯片依次在室温用缓冲液A(6×SSPE、0.0025％Tween 20)、于42℃用缓冲液B(2.25×SSPE、0.0025％Tween 20)进行洗涤，并在洗涤平台上(Wash Station)再次用缓冲液A充满。用染色溶液(6×SSPE、1×Denhardt溶液、0.005％Tween 20和5μg/ml链霉抗生物素-藻红蛋白染料)于室温在25rpm的旋转中对其进行染色。将芯片再次进行洗涤并用缓冲液A充满。在GeneArray Scanner(AglientTechnology，Palo Alto，CA)中于两个通道(530nm和570nm)对芯片进行扫描。对数据进行分析、颜色分离以生成每一个通道的值。将FAM信号/生物素信号的比率用于以后的分析中。

在此处提及的所有专利、专利申请和其他发表的参考文献均整体引入作为参考，正如其每一种已单独和特定地在此处引入作为参考。尽管描述了本发明的优选示例性实施方案，但本领域技术人员将理解本发明可通过除上述实施方案之外的方式实施，该实施方案是仅为阐明的目的而不是为了限制提出的。本发明仅受下面的权利要求限制。

Claims

1.一种将至少第一寡核苷酸直接添加到核酸模板上的方法，该方法包含：

同时使模板和至少第一寡核苷酸与至少第一个探针进行退火，

其中该探针包括至少第一个模板互补性区域和至少第一个直接与其邻近的寡核苷酸定位区域，该探针中模板互补性区域的核苷酸和直接邻近的寡核苷酸定位区域的核苷酸成为第一连接核苷酸，其限定其间第一个探针连接，和

其中该寡核苷酸包括与该探针的第一个寡核苷酸定位区域互补的末端区域，该末端寡核苷酸区域的末端核苷酸与该探针第一个寡核苷酸定位区域的连接核苷酸退火；

在与探针第一个模板互补性区域的连接核苷酸退火的模板核苷酸处生成第一个可连接的游离末端；然后

将该第一寡核苷酸与该模板的第一个游离末端连接。

2.权利要求1的方法，其中该探针包括直接与第一个模板互补性区域邻近的第二个寡核苷酸定位区域，所述探针中模板互补性区域的核苷酸和直接邻近的第二个寡核苷酸定位区域的核苷酸成为第二连接核苷酸，其限定其间第二个探针连接。

3.权利要求2的方法，其中通过以下方法将第二寡核苷酸添加到该模板上：

在该模板与第一个探针退火的同时使第二寡核苷酸与该探针退火，

其中该第二寡核苷酸包括与该探针的第二个寡核苷酸定位区域互补的末端区域，该末端寡核苷酸区域的末端核苷酸与探针的第二个寡核苷酸定位区域的连接核苷酸退火；

在与探针第一个模板互补性区域的第二连接核苷酸退火的模板核苷酸处生成了第二个可连接的游离末端；然后

将该第二寡核苷酸与该模板的第二个游离末端连接。

4.权利要求3的方法，其中所述每一种可连接的游离末端通过去除不与该探针的第一个互补性区域互补的模板区域而生成。

5.权利要求4的方法，其中该模板非互补区域通过核酸外切消化去除。

6.权利要求5的方法，其中该模板非互补区域通过用ExonucleaseVII或Exonuclease T和rec Jf的组合而消化去除。

7.权利要求4的方法，其中该模板非互补区域通过用单链特异性内切核酸酶消化而去除。

8.权利要求7的方法，其中该内切核酸酶是绿豆核酸酶。

9.权利要求3的方法，该方法在连接后进一步包含如下步骤：

从该探针和该寡核苷酸中分离该模板。

10.权利要求9的方法，其中该探针进一步包含用于从该模板中分离该探针的手段。

11.权利要求10的方法，其中该分离手段是多个整合的脱氧尿嘧啶残基。

12.权利要求11的方法，其中该分离步骤包含在该脱氧尿嘧啶残基处将该探针切割为多个探针片段，然后将该模板与该探针片段和该寡核苷酸进行大小分离。

13.权利要求10的方法，其中该分离手段是一种或多种捕获部分。

14.权利要求9的方法，该方法在从该探针和该寡核苷酸中分离该模板之后，进一步包括扩增该模板在该添加的第一和第二寡核苷酸之间的区域的步骤。

15.权利要求14的方法，其中该第一寡核苷酸具有第一个引发位点，而该第二寡核苷酸具有第二个引发位点，且该扩增通过在该第一个引发位点和该第二个引发位点引发聚合作用而进行。

16.权利要求15的方法，其中该模板区域通过PCR扩增。

17.权利要求3的方法，其中该模板源自cDNA。

18.权利要求3的方法，其中该模板源自基因组DNA。

19.权利要求18的方法，其中该基因组DNA源自单个个体。

20.权利要求18的方法，其中该基因组DNA收集自多个个体。

21.权利要求18的方法，其中该基因组DNA源自真核生物。

22.权利要求14的方法，其中该第一和第二寡核苷酸的至少一个包括标签序列。

23.一种在单个反应中向多个不同序列的核酸模板的每一个直接添加至少第一寡核苷酸的方法，该方法包含：

在单个反应混合物中同时使每一个模板和各自第一寡核苷酸与多个探针的各自一个进行退火，

其中每一个探针包括至少第一个与各自一个模板互补的区域和至少第一个直接与其邻近的寡核苷酸定位区域，该探针中模板互补性区域的核苷酸和直接邻近的寡核苷酸定位区域的核苷酸成为第一连接核苷酸，其限定其间第一个探针连接，及

其中该第一寡核苷酸的每一个包括与各自探针的第一个寡核苷酸定位区域互补的末端区域，寡核苷酸区域的末端核苷酸与探针第一个寡核苷酸定位区域的第一连接核苷酸退火；

每一个模板中在与其各自探针的第一个模板互补性区域的连接核苷酸退火的核苷酸处生成了第一个可连接的游离末端；然后

将该第一寡核苷酸的每一个与其各自模板的第一个游离末端连接。

24.权利要求23的方法，其中每一个该探针包括直接与第一个模板互补性区域邻近的第二个寡核苷酸定位区域，探针中模板互补性区域的核苷酸和直接邻近的第二个寡核苷酸定位区域的核苷酸成为第二连接核苷酸，其限定其间第二个探针连接。

25.权利要求24的方法，其中第二寡核苷酸通过如下方法添加到不同序列的所述多个模板的每一个上：

在所述模板和所述探针退火的同时使各自第二寡核苷酸与每一个探针退火，

其中该第二寡核苷酸包括与其各自探针的第二个寡核苷酸定位区域互补的末端区域，该末端寡核苷酸区域的末端核苷酸与探针的第二个寡核苷酸定位区域的连接核苷酸退火；

将该第二寡核苷酸与该模板的第二个游离末端连接。

26.权利要求25的方法，其中每个所述第一寡核苷酸包括它们之间共有的引发序列。

27.权利要求26的方法，其中每个所述第二寡核苷酸包括它们之间共有的引发序列。

28.权利要求25的方法，其中每一个该可连接的游离末端通过去除不与该探针的第一个互补性区域互补的模板区域而生成。

29.权利要求28的方法，其中该模板非互补的区域通过核酸外切消化去除。

30.权利要求27的方法，该方法在连接后进一步包含从该探针和该寡核苷酸中分离该模板的步骤。

31.权利要求30的方法，该方法在从该探针和该寡核苷酸中分离该模板之后进一步包含如下步骤：

同时扩增每一个所述模板的区域。

32.权利要求31的方法，其中该扩增通过在该第一个公共引发位点和该第二个公共引发位点引发聚合作用而进行。

33.权利要求32的方法，其中该模板区域通过PCR进行扩增。

34.权利要求33的方法，其中该多个模板包括至少10个不同序列的模板。

35.权利要求34的方法，其中该多个模板包括至少100个不同序列的模板。

36.权利要求35的方法，其中该多个模板包括至少1000个不同序列的模板。

37.权利要求27的方法，其中该第一和第二寡核苷酸的至少一个包含标签序列。