CN1617922A - 与cd20特异结合的抗体组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种特异结合于CD20，包含抗体分子的抗体组合物，其中抗体分子有结合于Fc区域的N－糖苷键合的复合糖链，产生抗体组合物的方法，和包含抗体组合物的药剂。

Description

与CD20特异结合的抗体组合物
技术领域
本发明涉及一种用于治疗与CD20阳性细胞相关的疾病如B细胞淋巴瘤等的抗体组合物，生产抗体组合物的细胞，以及应用细胞生产抗体组合物的方法。
背景技术
因为在血液中抗体具有较高的结合活性，结合特异性以及高的稳定性，所以已经尝试抗体应用于诊断，预防和治疗不同的人类疾病[Monoclonal Antibodies：Principles and Applications(单克隆抗体：原理与应用)(单克隆抗体：原理和应用)，Wiley-Liss，Inc.，第2.1章(1995)]。同时，用基因重组技术尝试生产人源化抗体例如人嵌合抗体或者来自于非人动物抗体的人互补决定区(以下称为“CDR”)-移植抗体。人嵌合抗体是一种抗体，其抗体可变区域(以下称为“V区域”)是来自于非人动物的抗体，而其恒定区(以下称为“C区”)是来自于人的抗体。人CDR-移植的抗体是一种抗体，其中人抗体的CDR被来自于非人动物的抗体的CDR替换。
已经发现来自于哺乳动物的抗体存在五类，即是IgM，IgD，IgG，IgA和lgE。由于它们具有如在血液中半衰期长，不同的效应功能等等的功能特性，人的IgG类抗体主要用于诊断，预防和治疗不同的人类疾病[Monoclonal Antibodies：Principles and Applications(单克隆抗体：原理和应用)，Wiley-Liss，Inc.，第2.1章(1995)]。人IgG类抗体进一步分为以下4个亚类：IgG1，IgG2，IgG3，和IgG4。作为IgG类抗体的效应功能，对抗体依赖性细胞介导的细胞毒活性(以下称为“ADCC活性”)，和补体依赖性细胞毒活性(以下称为“CDC活性”)已经进行了大量的研究，而且已经报导在人IgG类抗体中，IgG1亚类具有最高的ADCC活性和CDC活性[Chemical Immunology(化学免疫学)， 65，88(1997)]。实际上，已经报导，尽管发现在猴中施用IgG1亚类的抗-CD20-嵌合抗体时，耗损了CD20阳性B细胞，但是当使用IgG4类抗体时检测不到该耗损。基于以上的观点，在用于治疗的商业化抗体中，绝大多数需要高效应功能表达其效应的抗肿瘤人源化抗体是人IgG1亚类抗体。
CD20，也称作Bp35，是大约35kDa的多肽，而且通过单克隆抗体确定为人B淋巴细胞特异性的抗原B1[J.Immunol.(免疫学杂志)，125，1678(1980)]。认为CD20是一个四次跨膜的分子，功能为钙通道，并且与B细胞的活化，增殖和分化有关[Immunology Today (今日免疫学)， 15，450(1994)]。CD20的表达限制在前体B细胞到成熟的B细胞的阶段，而且CD20在未分化的细胞和浆细胞中不表达。并且，因为CD20具有在90％或更多的B细胞非-何杰金淋巴瘤中表达，并且甚至当抗体结合时也并不内化进入细胞的特性，所以长期以来尝试通过抗-CD20抗体治疗B细胞淋巴瘤[Blood(血液)， 69，584(1987)]。然而，因为早期阶段使用鼠的单克隆抗体，在人体中导入人抗鼠抗体(HAMA，人抗鼠抗体)，其缺乏效应功能，因此限制了其治疗效应。相应的，应用基因重组技术尝试用人IgG1亚类来制备鼠抗体的嵌合抗体[J.Immunol.(免疫学杂志)， 139，352 1(1987)，WO 88/04936]。此外，通过用猴子进行的测试已经确定一种嵌合抗体IDEC-C2B8，使用鼠单克隆抗体2B8制备的人IgG亚类，具有甚至在活体中耗尽CD20-阳性细胞的活性[Blood(血液)， 83，435(1994)，WO 94/11026]，而且该抗体经过临床测试在美国于1997年11月投放市场命名为RituxanTM(由IDEC/Genentech生产，也称为Rituximab，以下称为“RituxanTM”)。
通过对低复发性的和滤泡性的淋巴瘤的166个病例给于375毫克/m2/周的剂量4周，美国对RituxanTM已经进行了三期研究，有效率为48％(完全康复6％，部分好转42％)[J.Clin.Oncol.， 16，2825(1998)]。对于RituxanTM的作用机理，认为除了它的ADCC活性和CDC活性之外，它还具有通过交联CD20在细胞中诱导凋亡的活性。[CurrentOpinion in immunology(免疫学新观点)， 11，541(1999)]。关于CDC活性，由于敏感性依赖于目标B淋巴瘤细胞而不同，已经讨论了相对于其对照，通过抑制补体抑制分子CD55和CD59的功能来增加RituxanTM治疗作用的可能性[Current Opinion in immunology(免疫学新观点)， 11，541(1999)]。然而也有报道在病人肿瘤细胞中这些抑制分子的表达和CDC活性的体外敏感性并不总是与临床结果相关[Blood(血液)，98，1352(2001)]。此外，使用人B淋巴瘤细胞系Raji细胞移植的模型鼠实验表明，经由抗体受体的ADCC活性(在下文中，抗体受体称作FcγR)对于抗肿瘤效应是重要的[Nature Medicine(天然药物)，6，443(2000)]。
已经实验了RituxanTM和化学疗法(CHOP，环磷酰胺，盐酸阿霉素，长春新碱，强的松)的联合使用，而且报导II期研究中，在低复发性的和滤泡性的淋巴瘤的40个病例中效率为95％(完全康复55％，部分缓解45％)，但是具有CHOP引起的副作用[J Clin.Oncol.， 17，268(1999)]。此外，放射性同位素标记的抗体例如Zevalin(由IDEC生产)和Bexxar(由Corixa生产)已经开发为用于治疗的其它的抗-CD20抗体，但是由于它们都是鼠抗体以及在其中使用了放射性同位素，所以由于它们强毒性可能会引发副作用。
人IgG1亚类抗体ADCC活性和CDC活性的表达需要抗体的Fc区域与效应器细胞，例如杀伤细胞，天然杀伤细胞，活化的巨噬细胞等表面存在的抗体受体及不同的补体成分结合。关于结合，已经表明抗体铰链区的几个氨基酸残基和C区域的第二个结构域(以下称为“Cγ2结构域”)是重要的[Eur.j.Immunol.(欧洲免疫学杂志)， 23，1098(1993)；Immunology(免疫学)， 86，319(1995)，Chemical Immunology(化学免疫学)， 65，88(1997)；Chemical Immunology (化学免疫学)， 65，88(1997)]。关于RituxanTM，使用Cγ2结构域的某个氨基酸被取代的抗体研究的结果，已经确定了对CDC活性非常重要的是氨基酸[JImmunol.(免疫学杂志)， 164，4178(2000)；JImmunol.(免疫学杂志)，166，2571(2001)]。
此外，表明结合于Cγ2结构域的糖链是重要的[J.Immunology(免疫学杂志)， 65，88(1997)]。关于糖链，Boyd等人已经用各种糖水解酶处理过的中国仓鼠卵巢细胞(以下称为“CHO细胞”)或者鼠骨髓瘤NS0细胞(以下称为“NS0细胞”)产生的人CDR-移植抗体CAMPATH-1H(人IgG1亚类)，检测糖链对ADDC活性和CDC活性的影响，报导了去除非-还原性末端的唾液酸并不影响这两种活性，但是进一步去除半乳糖糖基，单独的CDC活性受到影响而且活性下降50％，完全去除糖链导致两种活性消失[Molecular Immunol.(分子免疫学)， 32，1311(1995)]。同时，Lifely等人分析结合于人CDR-移植抗体CAMPATH-1H(人IgG1亚类)的糖链，CAMPATH-1H由CHO细胞，NS0细胞或者大鼠骨髓瘤YO细胞产生，测定其ADCC活性，报导来自YO细胞的CANDATH-IH表现出最高的ADCC活性，表明在对开位置的N-乙酰葡糖胺(以下称为“GlcNAc”)对于活性是重要的[Glycobiology(糖生物学)， 5，813(1995)；WO 99/54342]。这些报导表明糖链的结构在IgG1亚类的人抗体的效应功能中起重要作用，而且有可能通过改变糖链的结构来制备具有更高效应功能的抗体。然而，实际上，糖链的结构是多变且复杂的，不能说已经确定了对于效应功能的实际重要结构。
作为通过把有关糖链修饰的酶的基因导入宿主细胞，对产物的糖链结构进行修饰的例子，已经报导了一种蛋白，其中唾液酸大量加入到糖链的非-还原性末端，这种蛋白可以通过把大鼠的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶导入CHO细胞产生[J.Biol.Chem.(生物化学杂志)， 261，13848(1989)]。
同时，岩藻糖(以下称为“Fuc”)结合于糖链(Fucα1-2Galβ1-)的非还原性末端的H抗原的表达已经通过把人β-半乳糖苷-2-α-岩藻糖基转移酶导入小鼠L细胞得到了证实[Science(科学)， 252，668(1991)]。此外，N-糖苷键合的糖链的对分N-乙酰葡糖胺的结合对于抗体的ADCC活性是重要的，基于此知识，Umana等人已经制备了表达β-1，4-N-乙酰葡糖胺转移酶III(GnTIII)的CHO细胞，而且与亲本细胞株进行了比较。在亲本CHO细胞中没有观察到GnIII的表达[J.Biol.Chem.(生物化学杂志)， 259，13370(1984)]，并且已经确证使用制备的表达GnTIII的CHO细胞表达的抗体比亲本细胞中表达的抗体具有更高的ADCC活性[Nature(自然)，Biotechnol.(生物技术)， 17，176(1999)；WO 99/54342]。在此情况下，Umana等也制备了把β-1，4-N-乙酰葡糖胺转移酶V(GnTV)基因导入的CHO细胞，而且报导GnTIII或者GnTV的过度表达对于CHO细胞有毒性。关于RituxanTM，已经有报道使用GnTIII导入的CHO细胞制备的抗体表现出比亲本细胞中表达的抗体更高的ADCC活性，而且活性的差异大约为10到20倍[Biotechnol.Bioeng.(生物技术与生物科学)， 74，288(2001)]。
发明内容
因为效应功能增加的抗CD20抗体表现出增强的治疗效果，所以可以通过其降低的剂量使患者的负担减轻。此外，其它作用例如副作用的降低也可以预计，因为与化学治疗，放射性同位素等等结合使用就变得不必要了。本发明的一个目的是提供产生效应功能增强的抗-CD20抗体的细胞，生产抗体组合物的方法，包括抗体组合物的药剂等。
本发明涉及以下(1)到(48)。
(1)一种产生抗体组合物的细胞，所述抗体组合物包含与CD20特异结合，并具有与Fc区域结合的N-糖苷键合的复合糖链的抗体分子，其中组合物中总的结合于Fc区域的N-糖苷键合的复合糖链中，岩藻糖不与糖链还原性末端的N-乙酰葡萄糖胺结合的比率是20％或更多。
(2)根据(1)所述的细胞，其中岩藻糖不与N-糖苷键合的复合糖链结合的糖链中岩藻糖的1位不与还原性末端的N-乙酰氨基葡萄糖的6位通过α键结合。
(3)根据(1)或(2)所述的细胞，其中与细胞内糖核苷酸、GDP-岩藻糖合成相关的酶活性，和/或与岩藻糖的1位通过α键结合于N-糖苷键合的复合糖链还原性末端的N-乙酰葡糖胺的6位的糖链修饰有关的酶活性降低或消失。
(4)根据(3)所述的细胞，其中与细胞内糖核苷酸、GDP-岩藻糖合成相关的酶是选自以下(a)、(b)和(c)中的酶：
(a)GMD(GDP-甘露糖4，6-脱水酶)；
(b)Fx(GDP-酮-6-脱氧甘露糖3，5-差向异构酶，4-还原酶)；
(c)GFPP(GDP-β-L-岩藻糖焦磷酸化酶)。
(5)根据(4)所述的细胞，其中GMD是以下(a)或(b)中的DNA编码的蛋白质：
(a)包括由SEQ ID NO：41代表的核苷酸序列的DNA；
(b)与包括由SEQ ID NO：41代表的核苷酸序列的DNA在严谨条件下杂交，编码有GMD活性的蛋白质的DNA。
(6)根据(4)所述的细胞，其中GMD是选自以下(a)、(b)和(c)中的蛋白质：
(a)包括由SEQ ID NO：61代表的氨基酸序列的蛋白质；
(b)包括由SEQ ID NO：61代表的氨基酸序列，其中至少一个氨基酸被删除、取代、插入和/或添加，有GMD活性的蛋白质；
(c)包括与由SEQ ID NO：61代表的氨基酸序列具有至少80％同源性的氨基酸序列，有GMD活性的蛋白质。
(7)根据(4)所述的细胞，其中FX是以下(a)或(b)中的DNA编码的蛋白质：
(a)包括由SEQ ID NO：48代表的核苷酸序列的DNA；
(b)与包括由SEQ ID NO：48代表的核苷酸序列的DNA在严谨条件下杂交，编码有FX活性的蛋白质的DNA。
(8)根据(4)所述的细胞，其中FX是选自以下(a)、(b)和(c)中的蛋白质：
(a)包括由SEQ ID NO：62代表的氨基酸序列的蛋白质；
(b)包括由SEQ ID NO：62代表的氨基酸序列，其中至少一个氨基酸被删除、取代、插入和/或添加，有FX活性的蛋白质；
(c)包括与由SEQ ID NO：62代表的氨基酸序列具有至少80％同源性的氨基酸序列，有Fx活性的蛋白质。
(9)根据(4)所述的细胞，其中GFPP是以下(a)或(b)中的DNA编码的蛋白质：
(a)包括由SEQ ID NO：51代表的核苷酸序列的DNA；
(b)与包括由SEQ ID NO：51代表的核苷酸序列的DNA在严谨条件下杂交，编码有GFPP活性的蛋白质的DNA。
(10)根据(4)所述的细胞，其中GFPP是选自以下(a)、(b)和(c)中的蛋白质：
(a)包括由SEQ ID NO：63代表的氨基酸序列的蛋白质；
(b)包括由SEQ ID NO：63代表的氨基酸序列，其中至少一个氨基酸被删除、取代、插入和/或添加，有GFPP活性的蛋白质；
(c)包括与由SEQ ID NO：63代表的氨基酸序列具有至少80％同源性的氨基酸序列，有GFPP活性的蛋白质。
(11)根据(3)所述的细胞，其中与岩藻糖的1位通过α键结合于N-糖苷键合的复合糖链还原性末端的N-乙酰葡糖胺的6位的糖链修饰有关的酶是α1，6-岩藻糖转移酶。
(12)根据(11)所述的细胞，其中α1，6-岩藻糖转移酶是选自以下(a)、(b)、(c)和(d)中的的DNA编码的蛋白质：
(a)包括由SEQ ID NO：1代表的核苷酸序列的DNA；
(b)包括由SEQ ID NO：2代表的核苷酸序列的DNA；
(c)包括与由SEQ ID NO：1代表的核苷酸序列的DNA在严谨条件下杂交，编码有α1，6-岩藻糖转移酶活性的蛋白质的DNA；
(d)包括与由SEQ ID NO：2代表的核苷酸序列的DNA在严谨条件下杂交，编码有α1，6-岩藻糖转移酶活性的蛋白质的DNA。
(13)根据(11)所述的细胞，其中α1，6-岩藻糖转移酶是选自以下(a)、(b)、(c)、(d)、(e)和(f)中的蛋白质：
(a)包括由SEQ ID NO：23代表的氨基酸序列的蛋白质；
(b)包括由SEQ ID NO：24代表的氨基酸序列的蛋白质；
(c)包括由SEQ ID NO：23代表的氨基酸序列，其中至少一个氨基酸被删除、取代、插入和/或增加，具有α1，6-岩藻糖转移酶活性的蛋白质；
(d)包括由SEQ ID NO：24代表的氨基酸序列，其中至少一个氨基酸被删除、取代、插入和/或增加，具有α1，6-岩藻糖转移酶活性的蛋白质；
(e)包括与由SEQ ID NO：23代表的氨基酸序列具有至少80％同源性的氨基酸序列，具有α1，6-岩藻糖转移酶活性的蛋白质；
(f)包括与由SEQ ID NO：24代表的氨基酸序列具有至少80％同源性的氨基酸序列，具有α1，6-岩藻糖转移酶活性的蛋白质。
(14)根据(3)到(13)中任何一项所述的细胞，其中通过选自以下(a)、(b)、(c)、(d)和(e)中的技术使酶活性降低或消除：
(a)以编码酶的基因为目标的基因断裂技术；
(b)导入编码酶的基因的显性失活突变体的技术；
(c)酶中导入突变的技术；
(d)抑制编码酶的基因转录或翻译的技术；
(e)选择对识别糖链的凝集素有抗性的细胞系的技术，所述凝集素识别岩藻糖的1位通过α键与N-糖苷键合的复合糖链还原性末端的N-乙酰氨基葡萄糖的6位结合。
(15).根据(1)到(14)中任何一项所述的细胞，其中所述细胞是至少对一种凝集素有抗性的细胞，其中凝集素识别岩藻糖的1位通过α键与N-糖苷键合的复合糖链还原性末端的N-乙酰氨基葡萄糖的6位结合。
(16)根据(1)到(15)中任何一项所述的细胞，其中所述细胞选自以下(a)到(j)：
(a)来自中国仓鼠卵巢组织的CHO细胞；
(b)大鼠骨髓瘤细胞细胞系，YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20细胞；
(c)小鼠骨髓瘤细胞细胞系，NS0细胞；
(d)小鼠骨髓瘤细胞细胞系，SP2/0-Ag14细胞；
(e)来源于叙利亚仓鼠肾组织的BHK细胞；
(f)猴COS细胞；
(g)产生抗体的杂交瘤细胞；
(h)人白血病细胞系，Namalwa细胞；
(i)胚胎干细胞；
(j)受精卵细胞。
(17)一种转基因非人动物或植物或它们的后代，其中导入与CD20特异结合，与Fc区域结合的N-糖苷键合的复合糖链的抗体分子，转基因非人动物或植物或它们的后代产生包括抗体分子的抗体组合物，其中组合物中总的结合于Fc区域的N-糖苷键合的复合糖链中，岩藻糖不与糖链还原性末端的N-乙酰葡萄糖胺结合的比率是20％或更多。
(18)根据(17)所述的转基因非人动物或植物或它们的后代，其中岩藻糖不与N-乙酰葡萄糖胺连接的糖链是岩藻糖的1位不与N-糖苷键合的糖链还原性末端的N-乙酰葡萄糖胺的6位通过α键连接的糖链。
(19)根据(17)或(18)所述的转基因非人动物或植物或它们的后代，其中基因组被修饰，这样与细胞内糖核苷酸、GDP-岩藻糖合成相关的酶活性，和/或在岩藻糖的1位通过α键结合于N-糖苷键合的糖链N-乙酰葡糖胺还原性末端的6位的糖链修饰有关的酶活性降低。
(20)根据(17)或(18)所述的转基因非人动物或植物或它们的后代，其中编码与细胞内糖核苷酸、GDP-岩藻糖合成相关的酶，和/或岩藻糖的1位通过α键结合于N-糖苷键合的复合糖链还原性末端的N-乙酰葡糖胺6位的糖链修饰相关的酶的基因被敲除。
(21)根据(19)或(20)所述的转基因非人动物或植物或它们的后代，其中与细胞内糖核苷酸、GDP-岩藻糖合成相关的酶，是选自以下(a)、(b)或(c)中的酶：
(a)GMD(GDP-甘露糖4，6-脱水酶)；
(b)Fx(GDP-酮-6-脱氧甘露糖3，5-差向异构酶，4-还原酶)；
(c)GFPP(GDP-β-L-岩藻糖焦磷酸化酶)。
(22)根据(21)所述的转基因非人动物或植物或它们的后代，其中GMD是由以下(a)或(b)的DNA编码的蛋白质：
(a)包括由SEQ ID NO：41代表的核苷酸序列的DNA；
(b)包括与由SEQ ID NO：41代表的核苷酸序列的DNA在严谨条件下杂交，编码有GMD活性的蛋白质的DNA。
(23)根据(21)所述的转基因非人动物或植物或它们的后代，其中Fx是由以下(a)或(b)的DNA编码的蛋白质：
(a)包括由SEQ ID NO：48代表的核苷酸序列的DNA；
(b)包括与由SEQ ID NO：48代表的核苷酸序列的DNA在严谨条件下杂交，编码有FX活性的蛋白质的DNA。
(24)根据(21)所述的转基因非人动物或植物或它们的后代，其中GFPP是由以下(a)或(b)的DNA编码的蛋白质：
(a)包括由SEQ ID NO：51代表的核苷酸序列的DNA；
(b)包括与由SEQ ID NO：51代表的核苷酸序列的DNA在严谨条件下杂交，编码有GFPP活性的蛋白质的DNA。
(25)根据(19)或(20)所述的转基因非人动物或植物或它们的后代，其中岩藻糖的1位通过α键与N-糖苷键合的糖链还原性末端的N-乙酰葡萄糖胺的6位连接的糖链修饰相关的酶是α1，6-岩藻糖转移酶。
(26)根据(25)所述的转基因非人动物或植物或它们的后代，其中α1，6-岩藻糖转移酶是由选自以下(a)、(b)、(c)和(d)中的的DNA编码的蛋白质：
(a)包括由SEQ ID NO：1代表的核苷酸序列的DNA；
(b)包括由SEQ ID NO：2代表的核苷酸序列的DNA；
(c)包括与由SEQ ID NO：1代表的核苷酸序列的DNA在严谨条件下杂交，编码有α1，6-岩藻糖转移酶活性的蛋白质的DNA；
(d)包括与由SEQ ID NO：2代表的核苷酸序列的DNA在严谨条件下杂交，编码有α1，6-岩藻糖转移酶活性的蛋白质的DNA。
(27)根据(17)到(26)中任何一项所述的转基因非人动物或植物或它们的后代，其中转基因非人动物是从牛、绵羊、山羊、猪、马、小鼠、大鼠、鸡、猴和兔中选择的动物。
(28)根据(1)到(16)中任何一项所述的细胞，其中抗体分子是选自(a)、(b)、(c)和(d)中的分子：
(a)人抗体；
(b)人源化抗体；
(c)包括(a)或(b)的Fc区域的抗体片段；
(d)包括(a)或(b)的Fc区域的融合蛋白。
(29)根据(1)到(16)和(28)中任何一项所述的细胞，其中抗体分子属于IgG类。
(30)根据(1)到(16)、(28)和(29)中任何一项所述细胞，其中抗体分子包括抗体轻链可变区的互补决定区1、2和3，和/或抗体重链的互补决定区1、2和3，所述轻链可变区的互补决定区1、2和3包括分别由SEQ ID NO：5、6和7代表的氨基酸序列，所述抗体重链的互补决定区1、2和3包括分别由SEQ ID NO：8、9和10代表的氨基酸序列。
(31)根据(1)到(16)、(28)，(29)和(30)中任何一项所述细胞，其中抗体分子包括抗体轻链可变区和/或重链可变区，所述轻链可变区包括由SEQ ID NO：12代表的氨基酸序列，所述重链可变区包括由SEQ ID NO：14代表的氨基酸序列。
(32)根据(17)到(27)中任何一项所述的转基因非人动物或植物或它们的后代，其中抗体分子是选自(a)、(b)、(c)和(d)中的分子：
(a)人抗体；
(b)人源化抗体；
(c)包括(a)或(b)的Fc区域的抗体片段；
(d)包括(a)或(b)的Fc区域的融合蛋白。
(33)根据(17)到(27)和(32)中任何一项所述的转基因非人动物或植物或它们的后代，其中抗体分子属于IgG类。
(34)根据(17)到(27)，(32)和(33)中任何一项所述的转基因非人动物或植物或它们的后代，其中抗体分子包括抗体轻链可变区的互补决定区1、2和3和/或重链的互补决定区1、2和3，所述轻链可变区的互补决定区1、2和3包括分别由SEQ ID NO：5、6和7代表的氨基酸序列，所述重链的互补决定区1、2和3包括分别由SEQID NO：8、9和10代表的氨基酸序列。
(35)根据(17)到(27)、(32)、(33)和(34)中任何一项所述的转基因非人动物或植物或它们的后代，其中抗体分子包括抗体轻链可变区和/或重链可变区，所述轻链可变区包括由SEQ ID NO：12代表的氨基酸序列，所述重链可变区包括由SEQ ID NO：14代表的氨基酸序列。
(36)一种抗体组合物，所述抗体组合物是根据(1)到(16)和(28)到(31)中任何一项所述的细胞产生的。
(37)一种抗体组合物，所述抗体组合物通过饲养根据(17)到(27)和(32)到(35)中任何一项所述的转基因非人动物或植物或它们的后代获得的。
(38)一种包含与CD20特异结合，具有与Fc区域结合的N-糖苷键合的复合糖链的抗体分子的抗体组合物，其中组合物中总的结合于Fc区域的N-糖苷键合的复合糖链中，岩藻糖不与糖链还原性末端的N-乙酰葡萄糖胺结合的比率是20％或更多
(39)根据(38)所述的抗体组合物，其中不与岩藻糖结合的糖链是岩藻糖的1位不与N-糖苷键合的复合糖链还原性末端的N-乙酰氨基葡萄糖的6位通过α键相连的糖链。
(40)根据(38)所述抗体组合物，其中抗体分子是选自(a)、(b)、(c)和(d)中的分子：
(a)人抗体；
(b)人源化抗体；
(c)包括(a)或(b)的Fc区域的抗体片段；
(d)包括(a)或(b)的Fc区域的融合蛋白。
(41)根据(38)到(40)中任何一项所述的抗体组合物，其中抗体分子属于IgG类。
(42)根据(38)到(41)中任何一项所述的抗体组合物，其中抗体分子包括抗体轻链可变区的互补决定区1、2和3，和抗体重链的互补决定区1、2和3，所述抗体轻链可变区的互补决定区1、2和3分别包括由SEQ ID NO：5、6和7代表的氨基酸序列，所述抗体重链的互补决定区1、2和3分别包括由SEQ ID NO：8、9和10代表的氨基酸序列。
(43)根据(38)到(42)中任何一项所述的抗体组合物，其中抗体分子包括抗体轻链可变区和/或重链可变区，所述轻链可变区包括由SEQ IDNO：12代表的氨基酸序列，所述重链可变区包括由SEQ ID NO：14代表的氨基酸序列。
(44)一种产生根据(36)、(38)到(43)中任何一项所述的抗体组合物的方法，所述方法包括培养(1)到(16)和(28)到(31)中任何一项所述的细胞，在培养基中形成和积累抗体组合物，从培养基中回收抗体组合物。
(45)一种产生根据(36)、(38)到(43)中任何一项所述的抗体组合物的方法，所述方法其中包括饲养(17)到(27)和(32)到(35)中任何一项所述的转基因非人动物或植物或它们的后代，从饲养的动物或植物中分离出组织或体液，和从分离的组织或体液中回收抗体组合物。
(46)一种根据(36)到(43)中任何一项所述的抗体组合物作为活性成分的药物。
(47)一种治疗与CD20相关疾病的制剂，所述制剂包含根据(36)到(43)中任何一项所述的抗体组合物作为活性成分。
(48)根据(47)所述的试剂，其中与CD20相关的疾病是癌症或免疫疾病。
本发明的细胞可以是任何细胞，只要细胞产生与CD20特异结合，而且具有结合于Fc区域的N-糖苷键合的复合糖链的抗体分子的抗体组合物，其中组分中总的结合于Fc区域的N-糖苷键合的复合糖链中，岩藻糖不与N-乙酰葡糖胺还原性末端结合的糖链的比率是20％或更多。
在本发明中，CD20是一个大约35kDa的细胞表面膜蛋白，也称B1或者Bp35，CD20包括由SEQ ID No：4代表的氨基酸序列的蛋白质，和包括由SEQ ID NO：4代表的氨基酸序列中一个或几个氨基酸被取代，去除，插入和/或增加的氨基酸序列的蛋白质，而且具有与CD20实质上相似的特性。
例如，使用例如Molecular Cloning，A Labooratory Manual(分子克隆，实验手册)，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press(冷泉港实验室出版)(1989)(以下称为“Molecular Cloning(分子克隆)，第二版”)；Current Protocols in Molecular Biology(现代分子生物学指南)，John Wiley & Sons，1987-1997(以下称为“Current Protocols inMolecular Biology(现代分子生物学指南)”)；Nucleic Acids Research(核酸研究)， 10，6487(1982)；Proc.Natl.Acad.Sci.(美国科学院院报)USA， 79，6409(1982)；Gene(基因)， 34，315(1985)，Nucleic AcidsResearch(核酸研究)， 13，4431(1985)，Proc.Natl.Acad.Sci.(美国科学院院报)USA， 82，488(1985)等中描述的定点突变法，通过往编码具有由SEQ ID NO：4代表的氨基酸序列的蛋白质的DNA中导入定点突变，获得包括由SEQ ID NO：4代表的氨基酸序列，其中一个或者几个氨基酸被取代，去除，插入和/或增加的蛋白质，而且这种蛋白质具有与CD20实质上相似的活性。被删除的，替换，插入，和/或增加氨基酸数目是一个或多个，数目并不是特别限定的，但是通过已知的技术如定点突变技术可以进行删除，替换，和/或增加的数目是1到几十，优选的是1到20，更优选的是1到10，最优选的是1到5。
同时，本发明中为了保持使用的蛋白的CD20活性，使用分析软件如BLAST [J Mol.Biol.(分子生物学杂志)， 215，403(1990)]，FASTA[Methods in Enzymology(酶学方法)， 183，63(1990)]等计算时，与由SEQ ID NO：4代表的氨基酸序列的同源性为80％或者更多，优选的是85％或者更多，较优选的是90％或者更多，更优选的是95％或者更多，进一步更优选的是97％或者更多，最优选的是99％或者更多。
在本发明中，作为结合于抗体分子Fc区域的糖链，被提及的是N-糖苷键合的糖链。作为N-糖苷键合的糖链，被提到的是复合型的糖链，其中核心结构的非还原性末端具有一个或多个平行的半乳糖-N-乙酰葡糖胺(以下称为“Gal-GlcNAc”)分枝而且Gal-GlcNAc的非还原性末端具有如唾液酸，对分的N-乙酰葡糖胺等结构。
在抗体中，如下所述，Fc区域具有两个N-糖苷键合的糖链中每个都与之结合的位置。相应地，每个抗体分子结合两个糖链。由于结合于抗体的N-糖苷键合的糖链包括以下结构式(I)代表的任何糖链，所以结合于抗体的N-糖苷键连接的两个糖链有很多种糖链的组合。相应地，物质的确认可以通过结合于Fc区域的糖链结构的观点来判断。
在本发明中，组合物包括Fc区域中具有N-糖苷键合的复合糖链的抗体分子(以下称为“本发明的抗体组合物”)，可以包括具有相同糖链结构的抗体或者具有不同糖链结构的抗体，只要从组合物中得到本发明的效果。
在本发明中，“在抗体组合物中，糖链中岩藻糖并不结合于糖链N-乙酰葡糖胺还原性末端的占总的结合于Fc区域的N-糖苷键合的复合糖链的比例”是指在糖链中岩藻糖并不结合于糖链N-乙酰葡糖胺还原性末端的占组分所含有的结合于Fc区域的N-糖苷键合的复合糖链总数量的比率。
在本发明中，“岩藻糖并不结合于N-糖苷键合的复合糖链还原性末端的N-乙酰葡糖胺糖链”是指岩藻糖的1位并不通过α键结合于N-糖苷键合的复合糖链还原性末端的N-乙酰葡糖胺的糖链。例子包括N-糖苷键合的复合糖链，其中岩藻糖的1位并不通过α键结合于N-乙酰葡糖胺的6位。
本发明的抗体组合物中，糖链中岩藻糖并不结合于糖链N-乙酰葡糖胺还原性末端的占总的结合于Fc区域的N-糖苷键合的复合糖链的比例优选是20％或更多，较优选的是25％或更多，更优选的是30％或更多，进一步优选的是40％或更多，最优选的是50％或更多。含有这样比例糖链的抗体组合物具有高的ADCC活性。
当抗体浓度降低时，ADCC活性相应的降低。然而，即使抗体浓度低时仍然可以获得高的ADCC活性，只要糖链中岩藻糖并不结合于糖链N-乙酰葡糖胺还原性末端的比例是20％或更多。
在包括FC区域中含有N-糖苷键合的复合糖链的抗体分子的组成中，岩藻糖并不结合于糖链N-乙酰葡糖胺还原性末端的比例，可以通过应用已知方法如肼解作用，酶消化等方法[BiochemicalExperimentation Methods 23-Method for Studying Glycoprotein SugarChain(生物化学实验方法，研究糖蛋白的糖链结构的方法23)(JapanScientific Societies Press(日本科学学会出版))，Reiko Takahashi编著(1989)]从抗体分子中释放糖链来测定，对于释放的糖链进行荧光标记或者放射性标记，然后通过层析方法分离标记的糖链。可选择的，释放的糖链也可以用HPAED-PAD方法分析来确定，[J Liq Chromatogr.， 6，1577(1983)]。
更进一步，本发明的细胞包括产生本发明组合物的细胞，其中与细胞内糖核苷酸、GDP-岩藻糖合成相关的酶的活性，和/或与糖链修饰相关的酶活性降低或消失，此糖链中岩藻糖的1位与N-糖苷键合的复合糖链还原性末端的N-乙酰葡糖胺的6位通过α键结合。
在本发明中，与细胞内糖核苷酸、GDP-岩藻糖合成相关的酶可以是任何酶，只要这种酶是与细胞内糖核苷酸、GDP-岩藻糖合成相关的酶，只要它可以为糖链提供岩藻糖的来源。与细胞内糖核苷酸、GDP-岩藻糖合成相关的酶包括对细胞内糖核苷酸、GDP-岩藻糖合成有影响的酶。
对细胞内糖核苷酸、GDP-岩藻糖合成有影响的酶，包括对细胞内糖核苷酸、GDP-岩藻糖合成相关的酶的活性有影响的酶，和对作为酶底物的物质的结构有影响作用的酶。
细胞内的糖核苷酸，GDP-岩藻糖是通过从头合成途径或者补救合成途径来提供的。因此与这些合成途径有关的所有酶都包括在与细胞内糖核苷酸、GDP-岩藻糖合成相关的酶之中。
与细胞内糖核苷酸，GDP-岩藻糖从头合成途径相关的酶，包括GDP-甘露糖4，6-脱水酶(以下称为“GMD”)，GDP-酮-6-脱氧甘露糖3，5-差向异构酶4，6-还原酶(以下称为“Fx”)等。
与细胞内糖核苷酸，GDP-岩藻糖补救合成途径相关的酶，包括GDP-β-L-岩藻糖焦磷酸化酶(以下称为“GFPP”)，岩藻糖激酶等。
在本发明中，GMD包括：
以下(a)或(b)的DNA编码的蛋白：
(a)包括SEQ ID NO：41代表的核苷酸序列的DNA；
(b)可以与包括SEQ ID NO：41代表的核苷酸序列的DNA在严谨条件下杂交，并且编码具有GMD活性的蛋白质的DNA；
(c)包括由SEQ ID NO：61代表的氨基酸序列的蛋白质；
(d)包括由SEQ ID NO：61代表的氨基酸序列，其中氨基酸序列中至少一个氨基酸缺失，替换，插入和/或者增加，并且具有GMD活性的蛋白质，和
(e)包含与由SEQ ID NO：61代表的氨基酸序列具有至少80％的同源性的氨基酸序列，并且具有GMD活性的蛋白质。
同时，编码GMD的氨基酸序列的DNA包括SEQ ID NO：41代表的核苷酸序列的DNA和与包括SEQ ID NO：41代表的核苷酸序列的DNA在严谨条件下杂交，并且编码具有GMD活性的氨基酸序列的DNA。
在本发明中，Fx包括：
以下(a)或者(b)的DNA编码的蛋白：
(a)包括SEQ ID NO：48代表的核苷酸序列的DNA；
(b)与包括SEQ ID NO：48代表的核苷酸序列的DNA在严谨条件下杂交，并且编码具有Fx活性的蛋白质的DNA，
(c)包括由SEQ ID NO：62代表的氨基酸序列的蛋白质，
(d)包括由SEQ ID NO：62代表的氨基酸序列，其中氨基酸序列中至少一个氨基酸缺失，替换，插入和/或者增加，并且具有Fx活性的蛋白质，和
(e)包含与由SEQ ID NO：62代表的氨基酸序列具有至少80％的同源性的氨基酸序列，并且具有Fx活性的蛋白质。
同时，编码Fx的氨基酸序列的DNA包括包含由SEQ ID NO：48代表的核苷酸序列的DNA和可以与包括SEQ ID NO：48代表的核苷酸序列的DNA在严谨条件下杂交的，并且编码具有Fx活性的氨基酸序列的DNA。
在本发明中，GFPP包括：
以下(a)或者(b)的DNA编码的蛋白：
(a)包括SEQ ID NO：51代表的核苷酸序列的DNA；
(b)与包括SEQ ID NO：51代表的核苷酸序列的DNA在严谨条件下杂交的，并且编码具有GFPP活性的蛋白质的DNA，
(c)包括由SEQ ID NO：63代表的氨基酸序列的蛋白质，
(d)包括由SEQ ID NO：63代表的氨基酸序列，其中氨基酸序列中至少一个氨基酸缺失，替换，插入和/或者增加，并且具有GFPP活性的蛋白质，和
(e)包含与由SEQ ID NO：63代表的氨基酸序列具有至少80％的同源性的氨基酸序列，并且具有GFPP活性的蛋白质。
同时，编码GFPP的氨基酸序列的DNA包括由SEQ ID NO：51代表的核苷酸序列的DNA，和与包括SEQ ID NO：51代表的核苷酸序列的DNA在严谨条件下杂交，并且编码具有Fx活性的氨基酸序列的DNA。
在本发明中，与糖链修饰有关的酶可以包括任何酶，此糖链中岩藻糖的1位与N-糖苷键合的复合糖链还原性末端的N-乙酰葡糖胺的6位通过α键连接，只要它是岩藻糖的1位与N-糖苷键合的复合糖链还原性末端的N-乙酰葡糖胺的6位通过α键连接反应有关的酶。
“岩藻糖的1位与N-糖苷键合的复合糖链还原性末端的N-乙酰葡糖胺的6位通过α键连接反应有关的酶”是指对岩藻糖的1位与N-糖苷键合的复合糖链还原性末端的N-乙酰葡糖胺的6位通过α键连接反应有影响的酶。
岩藻糖的1位与N-糖苷键合的复合糖链还原性末端的N-乙酰葡糖胺的6位通过α键连接反应有关的酶包括α1，6-岩藻糖基转移酶和α-L-岩藻糖苷酶。
同时，例子包括对岩藻糖的1位与N-糖苷键合的复合糖链还原性末端的N-乙酰葡糖胺的6位通过α键连接反应有关的酶的活性有影响的酶，和对酶底物的物质结构有影响的酶。
在本发明中，α1，6-岩藻糖基转移酶包括：
以下(a)、(b)，(c)或(d)的DNA编码的蛋白质：
(a)包括SEQ ID NO：1代表的核苷酸序列的DNA；
(b)包括SEQ ID NO：2代表的核苷酸序列的DNA；
(c)可以与包括SEQ ID NO：1代表的核苷酸序列的DNA在严谨条件下杂交，并且编码具有α1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质的DNA。
(d)可以与包括SEQ ID NO：2代表的核苷酸序列的DNA在严谨条件下杂交的，并且编码具有α1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质的DNA。
(e)包括由SEQ ID NO：23代表的氨基酸序列的蛋白质；
(f)包括由SEQ ID NO：24代表的氨基酸序列的蛋白质；
(g)包括SEQ ID NO：23代表的氨基酸序列，在氨基酸序列中至少一个氨基酸缺失，替换，插入和/或者加入，并且具有α1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质；
(h)包括一SEQ ID NO：24代表的氨基酸序列，在氨基酸序列中至少一个氨基酸缺失，替换，插入和/或者加入，并且具有α1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质；
(i)包括与SEQ ID NO：23代表的氨基酸序列具有至少80％同源性的氨基酸序列并且具有α1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质；
(j)包括与SEQ ID NO：24代表的氨基酸序列具有至少80％同源性的氨基酸序列，并且具有α1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质；
同时，编码α1，6-岩藻糖基转移酶的氨基酸序列的DNA包括具有SEQ ID NO：1或者2代表的核苷酸序列的DNA，和可以和具有SEQ IDNO：1或者2代表的核苷酸序列在严谨条件下杂交，并且编码具有α1，6-岩藻糖基转移酶活性的氨基酸序列的DNA。
在本发明中，“可以在严谨条件下杂交的DNA”是指，用例如SEQID NO：1、2，48，51或者41或者它们的部分片段代表的核苷酸序列的DNA作为探针，通过如菌落杂交，噬菌斑杂交或者Southem印迹杂交的方法获得的DNA。具体指的是可以在65℃，0.7到1.0M的氯化钠存在的条件下，使用对菌落或者噬菌斑来源的DNA片段进行了固定的滤膜进行杂交，然后在65℃下用0.1到2×SSC溶液(1×SSC溶液的组成包括150mM的氯化钠和15mM的柠檬酸钠)漂洗滤膜确定的DNA。杂交可以按照如Molecular Cloning，A Labooratory Manual(分子克隆，实验手册)，第二版.，Cold Spring Harbor Laboratory Press(冷泉港实验室出版)(1989)(以下称为“Molecular Cloning(分子克隆)，第二版”)，Current Protocols in Molecular Biology(现代分子生物学指南)，JohnWiley & Sons，1987-1997(以下称为“Current Protocols in MolecularBiology(现代分子生物学指南)”)；DNA Cloning 1：Core Techniques，APractical Approach，第二版，Oxford University(牛津大学)(1995)等中描述的方法进行。可杂交的DNA的例子包括与SEQ ID NO：1，2，48，51或者41代表的核苷酸序列同源性至少为60％或者更多，优选地70％或者更多，较优选地80％或者更多，进一步更优选地为90％或者更多，更优选地为95％或者更多，最优选的98％或者更多的DNA。
在本发明中，包括分别由SEQ ID NO：23，24，61，62和63代表的氨基酸序列，其中缺失，替换，插入和/或者加入至少一个氨基酸，具有α1，6-岩藻糖基转移酶活性，GMD活性，Fx活性和GFPP活性的蛋白质，是通过分别在编码具有SEQ ID NO：1、2，41，48和51代表的氨基酸序列的DNA中导入定点突变，这种定点突变在例如Molecular Cloning (分子克隆)，第二版；Current Protocols in MolecularBiology(现代分子生物学指南)，Nucleic Acids Research(核酸研究)， 10，6487(1982)；Proc.Natl.Acad.Sci.(美国科学院院报)USA， 79，6409(1982)，Gene(基因)， 34，315(1985)，Nucleic Acids Research (核酸研究)， 13，4431(1985)，Proc.Natl.Acad.Sci(美国科学院院报).USA， 82，488(1985)等中有描述。缺失，替换，插入和/或者加入的氨基酸的数目是一个或者更多，数目并不特别限定，但是通过已知的技术如定点突变可以去除，替换，或者加入氨基酸的数目是，例如1到几十个，优选地1到20，较优选地1到10，并且最优选的是1到5。
而且，在本发明中使用的每一种蛋白用例如BLAST[J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)， 215，403(1990)]，FASTA[Methods in Enzymology(酶学方法)， 183，63(1990)]等分析软件等计算时，分别与SEQ ID NO：23，24，61，62和63代表的氨基酸序列具有至少80％或者更多，优选地85％或者更多，较优选的是90％，更优选的是95％或者更多，进一步优选的是97％或者更多，最优选的是99％或者更多的同源性，这样它分别可以保持α1，6-岩藻糖基转移酶活性，GMD活性，Fx活性和GFPP活性。
更进一步，作为获得本发明的细胞的方法，即细胞中与细胞内的糖核苷酸，GDP-岩藻糖合成相关的酶的活性，和/或者与糖链修饰相关的酶的活性下降或者去除，该糖链中岩藻糖的1位通过α键结合于N-糖苷键连接的复合糖链N-乙酰葡糖胺的6位。可以应用任何技术，只要可以减少目的酶的活性。用于减少或者去除酶活性的技术包括：
(a)以编码酶的基因为目标的基因断裂技术；
(b)导入编码酶的基因的显性失活突变体的技术；
(c)酶中导入突变的技术；
(d)抑制编码酶的基因转录或翻译的技术；和
(e)选择对识别糖链的凝集素有抗性的细胞系的技术，凝集素识别的糖链中岩藻糖的1位与N-糖苷键合的复合糖链还原性末端的N-乙酰氨基葡萄糖的6位通过α键结合。
由于凝集素识别糖链结构，其中的岩藻糖的1位与N-糖苷键合的复合糖链还原性末端的N-乙酰葡糖胺的6位通过α键连接，所以可以使用能识别糖链结构的任何凝集素。例子包括Lens culinaris凝集素LCA(源于Lens culinaris的扁豆凝集素)，豌豆凝集素PSA(来源于Pisum sativum的豌豆凝集素)，蚕豆凝集素VFA(来源于Vicia faba的凝集素)，Aleuria aurantia凝集素AAL(源于Aleuria aurantia的凝集素)。
用于产生本发明抗体组合物的宿主细胞可以是任何宿主，只要其可以表达抗-CD20的抗体分子，例如，转染了编码抗-CD20抗体分子的基因的宿主细胞。例子包括酵母，动物细胞，昆虫细胞，植物细胞等等。细胞的具体例子包括在以下的条目1中描述的那些细胞。在动物细胞中优选的是来源于中国仓鼠卵巢组织的CHO细胞，大鼠骨髓瘤细胞系YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20细胞，小鼠骨髓瘤细胞系NS0细胞，小鼠骨髓瘤SP2/0-Ag14细胞，来源于叙利亚仓鼠肾组织的BHK细胞，产生抗体的杂交瘤细胞，人白血病细胞系Namalwa细胞，胚胎干细胞，受精卵细胞等等。例子包括用本发明的抗-CD20抗体的基因转染的大鼠骨髓瘤细胞系YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20细胞的转化克隆KM3065(FERM BP-7834)。
对于转基因的非人动物或者植物以及其后代并没有限制，只要它是可以产生抗体组合物的转基因非人动物或者植物以及其后代，往其中导入编码抗体分子的基因，此抗体组合物包括抗体分子，抗体分子可以特异性结合CD20并且结合于Fc区域的复合糖链，其中在组和物中，连接到Fc区域的总的N-糖苷键合的复合糖链中，岩藻糖不结合于糖链N-乙酰葡糖胺还原性末端的比率是20％或者更多。产生抗体的转基因动物可以通过把编码特异结合于CD20的抗体的基因导入小鼠的ES细胞，移植ES细胞到其它小鼠的早期阶段胚胎中，然后进行发育来制备。转基因动物也可以通过把编码特异结合于CD20的抗体的基因导入受精卵中，并进行发育来制备。
转基因的非人动物包括牛，羊，山羊，猪，马，鼠，大鼠，鸡，猴，兔等等类似物。
在本发明中，抗体分子包括任何的分子，只要其包含抗体的Fc区域。例子包括抗体，抗体片段，包括Fc区域的融合蛋白等。
抗体是外源抗原的刺激的结果，是活体免疫应答产生的蛋白，具有特异结合抗原的活性。作为抗体，从用抗原免疫的动物的脾脏细胞中制备的杂交瘤细胞分泌的抗体；由重组DNA技术制备的抗体，如，用提及的把插入抗体基因的抗体表达载体导入宿主细胞中得到的抗体等。例子包括由杂交瘤产生的抗体，人源化的抗体，人抗体等等。
作为杂交瘤细胞，提及的是通过用抗原免疫除人之外的哺乳动物得到的B细胞和来源于鼠等的骨髓瘤细胞之间细胞融合获得，可以产生有所需的抗原特异性的单克隆抗体的细胞。
对于人源化的抗体，提及的是人嵌合抗体，人互补决定区域(以下称为“CDR”)-移植的抗体等等。
人嵌合抗体是包括非人抗体的重链可变区(以下称为“HV”或者“VH”，可变链和重链分别为“V区域”和“H链”)和非人抗体轻链的可变区(以下称为“LV”或者“VL”)，人抗体重链恒定区(在此后也称作为“CH”)和人抗体轻链恒定区(在此后也称作为“CL”)的抗体。对于非人动物，任何动物例如小鼠，大鼠，仓鼠，兔等都可以使用，只要可以从中制备杂交瘤。
通过从产生单克隆抗体的杂交瘤中制备编码VH和VL的cDNA，把它们插入用于宿主细胞的表达载体中，宿主细胞具有编码人抗体CH和人抗体CL的基因，构建表达人嵌合抗体的载体，然后把载体导入用于表达载体的宿主细胞，产生人嵌合抗体。
对于人嵌合抗体的CH，可以应用任何CH，只要其属于人的免疫球蛋白(以下称为“hIg”)。那些属于hIgG的类别是优选的，也可以使用任何属于hIgG类的亚类，如hIgG1，hIgG2，hIgG3和hIgG4。同样地，对于人嵌合抗体的CL，可以使用任何CL，只要其属于hIg类，并且也可以使用那些属于κ或者λ类的CL。
人CDR-移植抗体是其中非人动物抗体的VH和VL的CDR的氨基酸序列移植到人抗体的VH和VL的合适位置的抗体。
人CDR-移植抗体可通过构建编码V区域的cDNA制备，其中来源于非人动物的抗体VH和VL的CDR移植到人抗体的VH和VL的CDR区域，将它们插入到用于宿主细胞的表达载体中，该宿主细胞含有编码人抗体CH和人抗体CL的基因，由此构建了用于人-CDR移植抗体的表达的载体，然后将表达载体导入到宿主细胞来表达人CDR-移植抗体。
对于人CDR-移植抗体的CH，可以使用任何CH，只要它属于hIg类，但hIgG是优选的，任何属于hIgG类的亚类，如hIgG1，hIgG2，hIgG3和hIgG4也可以使用。同样地，对于人CDR-移植抗体的CL，可以应用任何CL，只要其属于hIg类，并且也可以使用那些属于κ或者λ类的CL。
人抗体起初是人体中自然存在的抗体，但是也包括从人抗体噬菌体库，产生人抗体的转基因动物和产生人抗体的转基因植物中得到的抗体。产生人抗体的转基因动物和产生人抗体的转基因植物是以基因工程，细胞过程和发育工程技术的最新进展为基础制备的。
通过分离人外周血淋巴细胞，用EB病毒等感染使其永生化，把它克隆获得能够产生抗体的淋巴细胞，培养该淋巴细胞，从培养基中分离和纯化抗体而获得人体中存在的抗体。
人抗体噬菌体库是一种文库，其中通过把从人B细胞中制备的编码抗体的基因插入噬菌体基因，抗体片段如Fab(抗原结合片段)，单链抗体等表达于噬菌体的表面。表达具有所需要的抗原结合活性的抗体片段的噬菌体，可以使用它结合于固定化抗原的底物的活性，作为标记从文库中回收。抗体片段可以进一步通过重组DNA技术转化为包括两个全长H链和全长L链的人抗体分子。
抗体片段是包括抗体Fc区域的片段。对于抗体片段，可以提及的是H链单体，H链二体等等。
包括Fc区域的融合蛋白，包括一种组合物，其中的抗体包括抗体或者抗体片段的Fc区域，该抗体与如酶，细胞因子等蛋白质融合。
本发明的抗体分子可以是任何抗体分子，只要其特异性地结合于CD20。抗体分子优选的是特异结合于CD20，并且包括分别由SEQ IDNO：5、6和7所代表的氨基酸序列的抗体轻链可变区的互补决定区域1、2和3，和/或分别由SEQ ID NO：8、9和10所代表的氨基酸序列的抗体重链的抗体分子，较优选的是特异结合于CD20，并且包括由SEQ ID NO：12所代表的轻链可变区，和/或由SEQ ID NO：14所代表的重链可变区的抗体分子。
本发明的药剂包括一种药物，其中包括一种活性成分，本发明的抗体组合物，例如包括抗-CD20的抗体分子的组合物。
与CD20有关的疾病包括例如B细胞淋巴瘤的癌症，炎症性疾病，自身免疫病等等。
在本发明中，ADCC活性是一种细胞毒活性，其中与活体中的肿瘤细胞等细胞表面的抗原结合的抗体，通过存在于抗体Fc区域中的和效应器细胞表面的Fc受体来活化效应器细胞，藉此妨碍肿瘤细胞等[Monoclonal Antibodies：Principles and Applications(单克隆抗体：原理与应用)，Wiley-Liss，Inc.，2.1章节(1955)]。作为效应器细胞，可能提及的是杀伤细胞，天然杀伤细胞，活化的巨噬细胞等等。
以下是本发明的详细描述。
1.制备产生本发明抗体组合物的细胞
按照以下技术制备用于产生本发明的抗体组合物的宿主细胞，按照以下的条目3所描述的方法用编码抗-CD20抗体的基因转染宿主细胞，从而制备本发明的细胞。
(1)以编码酶的基因为目标的基因断裂技术
用于生产本发明细胞的宿主细胞可以通过以编码与细胞内的糖核苷酸，GDP-岩藻糖合成相关的酶的基因为目标，或者以编码与岩藻糖的1位通过α键结合于N-糖苷键合的复合糖链还原性末端的N-乙酰葡糖胺6位的糖链修饰有关的酶的基因为目标的基因断裂技术制备，作为与细胞内糖核苷酸、GDP-岩藻糖合成相关的酶，可以提及的是GMD，Fx，GFPP，岩藻糖激酶等等。作为与岩藻糖的1位通过α键结合于N-糖苷键合的复合糖链还原性末端的N-乙酰葡糖胺6位的糖链修饰有关的酶，可以提及的是α1，6-岩藻糖基转移酶，α-L-岩藻糖苷酶等等。
在此使用的基因包括DNA和RNA。
作为基因断裂的方法，可以包括任何方法，只要其可以使靶酶的基因断裂。作为例子，可以提及的是反义方法，核酶方法，同源重组方法，RNA-DNA寡聚核苷酸方法(以下称为“RDO方法”)，RNA干涉方法(以下称为“RNAi方法”)，用逆转录病毒的方法，用转座子的方法等。方法具体地描述如下。
(a)通过使用反义方法或者核酶方法制备用于制备本发明细胞的宿主细胞
制备本发明细胞的宿主细胞可以使用Cell Technology(细胞技术)，12，239(1993)；BIO/TECHNOLOGY(生物/技术)， 17，1097(1999)，Hum.Mol Genet.， 5，1083(1995)，Cell Technology (细胞技术)， 13，255(1994)，Proc.Natl.Acad.Sci.(美国科学院院报)USA， 96 1886(1999)等中描述的反义方法或者核酶方法制备，例如，以下的方式中，以编码与细胞内的糖核苷酸，GDP-岩藻糖合成相关的酶的基因为目标，或者以编码与岩藻糖的1位通过α键结合于N-糖苷键合的复合糖链还原性末端的N-乙酰葡糖胺6位的糖链修饰有关的酶的基因为目标。
制备编码与细胞内的糖核苷酸，GDP-岩藻糖合成相关的酶或者编码与岩藻糖的1位通过α键结合于N-糖苷键合的复合糖链还原性末端的N-乙酰葡糖胺6位的糖链修饰有关的酶的cDNA或基因组DNA。
确定制备的cDNA或者基因组DNA的核苷酸序列。
以确定的DNA序列为基础，设计适当长度的反义基因或者核酶构建物，其包括编码与细胞内的糖核苷酸，GDP-岩藻糖合成相关的酶的基因，和/或者编码与岩藻糖的1位通过α键结合于N-糖苷键合的复合糖链还原性末端的N-乙酰葡糖胺6位的糖链修饰有关的酶的DNA的一部分。  设计的构建物可以进一步包括部分非翻译区域或者内含子。
为了在细胞中表达反义基因或者核酶，通过在合适的表达载体的启动子的下游插入制备DNA的片段或者全长来制备重组载体。
通过在适于载体表达的宿主细胞中导入重组质粒来得到转化体。
本发明的细胞可以通过选择转化体来得到，使用与细胞内糖核苷酸、GDP-岩藻糖合成相关的酶活性，和/或在岩藻糖的1位通过α键结合于N-糖苷键合的复合糖链还原性末端的N-乙酰葡糖胺6位的糖链修饰有关的酶的活性作为标记。用于制备本发明细胞的宿主细胞也可以通过细胞膜上糖蛋白的糖链结构，或者产生的抗体分子的糖链结构为基础来选择转化体而得到。
用于制备本发明细胞的宿主细胞，可以使用任何细胞如酵母，动物细胞，昆虫细胞或者植物细胞，只要其具有编码与细胞内糖核苷酸、GDP-岩藻糖合成相关的目标酶的基因，和/或编码与岩藻糖的1位通过α键结合于N-糖苷键合的复合糖链还原性末端的N-乙酰葡糖胺的6位的糖链修饰有关的酶的基因。包括宿主细胞的例子在以下的条目3中有说明。
作为表达载体，可以使用能够在宿主细胞中可以自主复制，或者可以整合到染色体中，并且在该启动子的位置设计的反义基因或者核酶就可以转入。表达载体包括的例子在以下的条目3中描述。
关于把基因导入不同的宿主细胞的方法，可以使用把适于不同宿主细胞的重组载体导入的方法，此方法在以下的条目3中描述。
以下的方法可以作为选择转化体的方法的例子，使用与细胞内糖核苷酸、GDP-岩藻糖合成相关的酶活性，和/或岩藻糖的1位通过α键结合于N-糖苷键合的复合糖链还原性末端的N-乙酰葡糖胺6位的糖链修饰有关的酶的活性作为标记。
选择转化体的方法：
细胞内与糖核苷酸，GDP-岩藻糖合成相关的酶的活性，和/或与岩藻糖的1位通过α键结合于N-糖苷键合的复合糖链还原性末端的N-乙酰葡糖胺6位的糖链修饰相关的酶的活性下降，选择这种细胞的方法包括在New Biochemical Experimentation Series(新生物化学实验从书)3-Saccharides I，Glycoprotein(Tokyo Kagaku Dojin)，日本生物化学学会编辑(1988)；Cell Engineering(细胞工程)，Supplement(增刊)，Experimental Protocol Series(实验方法从书)，GlycobiologyExperimental Protocol(糖生物学实验手册)，Glycoprotein，Glycolipidand Proteoglycan(Shujun-sha)，Naoyuki Taniguchi，Akemi Suzuki，Kiyoshi Furukawa和Kazuyuki Sugawara编辑(1996)，MolecularCloning(分子克隆)，第二版；Current Protocols in Molecular Biology(现代分子生物学指南)等中描述的生物化学方法或者基因工程技术。生物化学方法包括使用酶特异性的底物，测定酶活性的方法等。基因工程技术包括Northern分析，RT-PCR等等，其中测定编码酶的基因的mRNA的量。
基于细胞膜上的糖蛋白的糖链结构来选择转化体的方法包括以下条目1(5)中所描述的方法。基于一种产生的抗体分子的糖链结构来选择转化体的方法包括以下条目4和5中所说明的方法。
对于制备编码与细胞内糖核苷酸、GDP-岩藻糖合成相关的酶，和/或编码岩藻糖的1位通过α键结合于N-糖苷键合的复合糖链还原性末端的N-乙酰葡糖胺6位的糖链修饰相关的酶的cDNA的方法，以下面的方法为例子。
DNA的制备方法：
从组织中和不同种类的宿主细胞中制备总RNA或者mRNA。
从制备的总RNA或者mRNA中制备cDNA文库。
基于细胞内糖核苷酸、GDP-岩藻糖合成相关的酶，和/或岩藻糖的1位通过α键结合于N-糖苷键合的复合糖链还原性末端的N-乙酰葡糖胺6位的糖链修饰相关的酶的氨基酸序列，和使用制备的cDNA文库作为模板，应用PCR得到编码细胞内糖核苷酸、GDP-岩藻糖合成相关的酶，和/或与岩藻糖的1位通过α键结合于N-糖苷键合的复合糖链还原性末端的N-乙酰葡糖胺的6位的糖链修饰有关的酶的基因片段为基础制备简并引物。
编码细胞内糖核苷酸、GDP-岩藻糖合成相关的酶，和/或岩藻糖的1位通过α键结合于N-糖苷键合的复合糖链还原性末端的N-乙酰葡糖胺的6位的糖链修饰有关的酶的DNA可以通过使用获得的基因片段为探针筛查cDNA文库得到。
关于人或者非人类的组织或者细胞的mRNA，可以应用商业上可以购买到的产品(如，由Clontech制造)，或者用以下方式从人或者非人动物的组织和细胞中制备。从人或者非人动物的组织或者细胞中制备总RNA的方法的例子包括硫代氰酸铯胍三氟乙酸方法[Methods inEnzymology(酶学方法)， 154，3(1987)]，酸性硫氰酸胍苯酚氯仿(AGPC)方法[Analytical Biochemistry(分析生物化学)， 162，156(1987)；Experimental Medicine(实验药物)， 9，1937(1991)]等。
同样地，从总RNA中制备mRNA作为poly(A)+RNA的方法包括寡聚(dT)-固定的纤维素柱方法(Molecular Cloning(分子克隆)，第二版)等等。
此外，使用试剂盒如Fast Track mRNA分离试剂盒(Invitrogen生产)，Quick Prep mRNA纯化试剂盒(Pharmacia生产)等等制备mRNA。
从人或者非人动物的组织和细胞中制备的mRNA制备cDNA文库，制备cDNA文库的方法包括在Molecular Cloning(分子克隆)，第二版中，Current Protocols in Molecular.Biology(现代分子生物学实验方法)；A Laboratory Manual(实验手册)，第二版(1989)等等中描述的方法，或者使用商业上可以买到的试剂盒如SuperScript Plasmid System用于cDNA合成和质粒的克隆(由Life Technologies制造)，ZAP-cDNA合成试剂盒(由STRATAGENE制造)等等。
作为制备cDNA文库的克隆载体，可以使用任何载体如噬菌体载体，质粒载体等等，只要载体可以在大肠杆菌K12中自主复制。载体例子包括ZAP Express[由STRATAGENE制造，Strategies， 5，58(1992)]，pBluescript II SK(+)[Nucleic Acids Research(核酸研究) 17，9494(1989)]，Lambda ZAP II(由STRATAGENE制造)，λgt10和λgt11[DNA Cloning，A Practical Approach， 1，49(1985)]，λTriplEx(由Clontech制造)，λExCell(Pharmacia生产)，PT7T318U(Pharmacia生产)，pcD2[Mol.Cell Biol.， 3，280(1983)]，pUC18[Gene， 33，103(1985)]等等。
可以使用任何微生物作为宿主微生物，优选使用大肠杆菌，例子包括大肠杆菌XL1-Blue MRF′[由STRATAGENE制造，Strategies，5，81(1992)]，大肠杆菌C600[Genetics(遗传学)， 39，440(1954)]，大肠杆菌Y1088[Science(科学)， 222，778(1983)]，大肠杆菌Y1090[Science(科学)， 222，778(1983)]，大肠杆菌NM522[J.Mol.Biol.， 166，1(1983)]，大肠杆菌K802[J Mol.Biol. 16，118(1966)]，大肠杆菌JM105[Gene(基因)， 38，275(1985)]等等。
cDNA文库可以用于以下分析，而且降低非全长cDNA的比率通过尽可能有效地得到全长的cDNA，可以在以下的分析中使用Sugano等人研发的[Gene(基因)， 138，171(1994)，Gene(基因)， 200，149(1997)，Protein，Nucleic Acid and Enzyme(蛋白质，核酸和酶)， 41，603(1996)，Experimental Medicine(实验药物)， 11，2491(1993)，cDNA Cloning(cDNA克隆)(Yodo-sha)(1996)，Methods for Preparing Gene Libraries(基因文库制备方法)(Yodo-sha)(1994)]寡聚cap方法制备cDNA文库。
推定编码氨基酸序列的核苷酸序列的5′-端和3′-端核苷酸序列的特异的简并引物的制备，是根据与细胞内糖核苷酸、GDP-岩藻糖合成相关的酶，和/或岩藻糖的1位通过α键结合于N-糖苷键合的复合糖链还原性末端的N-乙酰葡糖胺的6位的糖链修饰有关的酶的氨基酸序列，而且以制备的cDNA文库为模板用PCR进行DNA扩增[PCRprotocols(PCR实验方法)Academic Press(美国学术出版社)(1990)]，得到编码与细胞内糖核苷酸、GDP-岩藻糖合成相关的酶，和/或编码岩藻糖的1位通过α键结合于N-糖苷键合的复合糖链还原性末端的N-乙酰葡糖胺6位的糖链修饰有关的酶的基因片段。
通过常用的核酸测序的方法如Sanger等人的双脱氧法[Proc.Natl.Acad.Sci.(美国科学院院报)USA， 74，5463(1977)]，核苷酸序列分析仪如ABI PRISM 377 DNA测序仪(Applied Biosystems制造)等可以确定，得到的基因片段是编码与细胞内糖核苷酸、GDP-岩藻糖合成相关的酶，和/或编码与岩藻糖的1位通过α键结合于N-糖苷键合的复合糖链还原性末端的N-乙酰葡糖胺6位的糖链修饰有关的酶的DNA。
编码与细胞内糖核苷酸、GDP-岩藻糖合成相关的酶的DNA，和/或编码与岩藻糖的1位通过α键结合于N-糖苷键合的复合糖链还原性末端的N-乙酰葡糖胺6位的糖链修饰有关的酶的DNA可以通过人或者非人动物的组织和细胞中含有的mRNA合成的cDNA或者cDNA库，使用基因片段作为DNA探针，进行菌落或者噬菌斑杂交的方法得到(Molecular Cloning (分子克隆)，第二版)。
同样地，编码与细胞内糖核苷酸、GDP-岩藻糖合成相关的酶的DNA，和/或编码与岩藻糖的1位通过α键结合于N-糖苷键合的复合糖链还原性末端的N-乙酰葡糖胺6位的糖链修饰有关的酶的DNA可以通过使用用于获得的编码与细胞内糖核苷酸、GDP-岩藻糖合成相关的酶，和/或编码与岩藻糖的1位通过α键结合于N-糖苷键合的复合糖链还原性末端的N-乙酰葡糖胺的6位的糖链修饰有关的酶的基因片段为引物，以人或者非人动物的组织和细胞中含有的mRNA合成的cDNA或者cDNA库为模板，进行PCR筛查得到。
编码与细胞内糖核苷酸、GDP-岩藻糖合成相关的酶的DNA，和/或编码与岩藻糖的1位通过α键结合于N-糖苷键合的复合糖链还原性末端的N-乙酰葡糖胺6位的糖链修饰有关的酶的DNA的核酸序列通过常用的测序的方法如Sanger等人的双脱氧法[Proc.Natl.Acad.Sci.(美国科学院院报)USA， 74，5463(1977)]，核苷酸序列分析仪如ABI PRISM377 DNA测序仪(Applied Biosystems制造)等等，从其末端进行核酸测序分析来确定。
编码与在细胞内糖核苷酸、GDP-岩藻糖合成相关的酶的基因，和/或编码与岩藻糖的1位通过α键结合于N-糖苷键合的复合糖链还原性末端的N-乙酰葡糖胺的6位的糖链修饰有关的酶的基因也可以通过基于确定的cDNA核苷酸序列，使用同源性搜索程序如BLAST搜索例如GenBank，EMBL，DDBJ等核苷酸序列数据库的数据来确定。
通过该方法得到的编码与细胞内糖核苷酸、GDP-岩藻糖合成相关的酶的基因的核苷酸序列包括由SEQ ID NO：48，51或者41代表的核苷酸序列。编码与岩藻糖的1位通过α键结合于N-糖苷键合的复合糖链还原性末端的N-乙酰葡糖胺的6位的糖链修饰有关的酶的基因的核苷酸序列包括SEQ ID NO：1或者2所代表的核苷酸序列。
编码与细胞内糖核苷酸、GDP-岩藻糖合成相关的酶，和/或编码与岩藻糖的1位通过α键结合于N-糖苷键合的复合糖链还原性末端的N-乙酰葡糖胺6位的糖链修饰有关的酶的cDNA也可以通过基于确定的DNA核苷酸序列，用DNA合成仪例如由Perkin Elmer制造的DNA合成仪型号392等，使用亚磷酰胺方法化学合成得到。
作为制备编码与细胞内糖核苷酸、GDP-岩藻糖合成相关的酶，和/或编码与岩藻糖的1位通过α键结合于N-糖苷键合的复合糖链还原性末端的N-乙酰葡糖胺6位的糖链修饰有关的酶的基因组DNA的方法的例子，该方法在以下示例性描述。
基因组DNA的制备方法：
作为制备基因组DNA的方法，可以提及在Molecular Cloning(分子克隆)，第二版，Current Protocols in Molecular Biology(现代分子生物学指南)等中描述的已知方法。此外，编码与细胞内糖核苷酸、GDP-岩藻糖合成相关的酶，和/或编码与岩藻糖的1位通过α键结合于N-糖苷键合的复合糖链还原性末端的N-乙酰葡糖胺6位的糖链修饰有关的酶的基因组DNA也可以使用试剂盒例如基因组DNA文库筛查系统试剂盒(由Genome Systems制造)，Universal GenomeWalkerTM试剂盒(由CLONTECH制造)等来进行分离。
通过以上方法获得的编码与细胞内糖核苷酸、GDP-岩藻糖合成相关的酶的基因的核苷酸序列的基因组DNA的核苷酸序列包括由SEQID NO：57或者60代表的核苷酸序列。编码与岩藻糖的1位通过α键结合于N-糖苷键合的复合糖链还原性末端的N-乙酰葡糖胺6位的糖链修饰有关的酶的核苷酸序列包括SEQ ID NO：3所代表的核苷酸序列。
此外，也可以不使用表达载体，而直接导入反义寡聚核苷酸或者核酶到宿主细胞中获得本发明的宿主细胞，反义寡聚核苷酸或者核酶的设计基于编码与细胞内糖核苷酸、GDP-岩藻糖合成相关的酶，和/或编码与岩藻糖的1位通过α键结合于N-糖苷键合的复合糖链还原性末端的N-乙酰葡糖胺6位的糖链修饰有关的酶的基因序列。
反义寡聚核苷酸或者核酶可以使用常用的方法或者DNA合成仪来进行制备。具体的，以编码与细胞内糖核苷酸、GDP-岩藻糖合成相关的酶，和/或编码与岩藻糖的1位通过α键结合于N-糖苷键合的复合糖链还原性末端的N-乙酰葡糖胺6位的糖链修饰有关的酶的cDNA和基因组DNA的核苷酸序列中的连续的5到150个碱基，优选的5到60个碱基，而且更优选的10到40个碱基的相应序列的寡聚核苷酸的序列信息为基础，通过合成相对应的寡聚核苷酸序列互补的寡聚核苷酸(反义寡聚核苷酸)或者包括该寡聚核苷酸序列的核酶，制备反义寡聚核苷酸或者核酶。
寡聚核苷酸包括寡聚RNA以及寡聚核苷酸的衍生物(以下称为“寡聚核苷酸衍生物”)。
作为寡聚核苷酸衍生物，可以提及的是，其中寡聚核苷酸中磷酸二酯键转变为磷酸硫酯键的寡聚核苷酸衍生物，其中寡聚核苷酸中磷酸二酯键转变为N3’-P5’磷酸酰胺键的寡聚核苷酸衍生物，其中寡聚核苷酸中核糖和磷酸二酯键转变成肽-核酸键的寡聚核苷酸衍生物，其中寡聚核苷酸中尿嘧啶由C-5丙炔基尿嘧啶取代的寡聚核苷酸衍生物，其中寡聚核苷酸中尿嘧啶由C-5噻唑基尿嘧啶取代的寡聚核苷酸衍生物，其中寡聚核苷酸中的胞嘧啶由C-5丙炔基胞嘧啶取代的寡聚核苷酸衍生物，其中寡聚核苷酸中的胞嘧啶由吩噁嗪-修饰的胞嘧啶取代的寡聚核苷酸衍生物，其中寡聚核苷酸中的核糖由2′-O-丙基核糖取代的寡聚核苷酸衍生物，其中寡聚核苷酸中的核糖由2′-甲氧乙氧核糖取代的寡聚核苷酸衍生物[Cell Technology(细胞技术)， 16，1463(1997)]等等。
(b)通过同源重组制备用于制备本发明细胞的宿主细胞
制备本发明细胞的宿主细胞可以通过使用编码与细胞内糖核苷酸、GDP-岩藻糖合成相关的酶的基因，和/或编码与岩藻糖的1位通过α键结合于N-糖苷键合的复合糖链还原性末端的N-乙酰葡糖胺6位的糖链修饰有关的酶的基因作为靶基因，通过同源重组技术在染色体上对靶基因进行修饰来产生。
染色体上的靶基因的修饰可以使用在Manipulating the MouseEmbryo，A Laboratory Manual(小鼠胚胎的操作：实验手册)，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press(冷泉港实验室出版)(1994)(以下称为“Manipulating the Mouse Embryo，A Laboratory Manual(小鼠胚胎的操作：实验手册)”)，Gene Targeting，A Practical Approach(靶向基因：实践方法)(靶向基因：实践方法)，IRL Press at Oxford University Press(牛津大学出版)(1993)；Biomanual Series 8(生物手册；8)，GeneTargeting，Preparation of Mutant Mice using ES Cells(靶向基因：使用ES细胞制备突变小鼠)，Yodo-sha(1995)(以下称为“Preparation ofMutant Mice using ES Cells(使用ES细胞制备突变小鼠)”)等中描述的方法，例如，如下。
制备编码与细胞内糖核苷酸、GDP-岩藻糖合成相关的酶，和/或编码与岩藻糖的1位通过α键结合于N-糖苷键合的复合糖链还原性末端的N-乙酰葡糖胺6位的糖链修饰有关的酶的基因组DNA。
以基因组DNA的核苷酸序列为基础，制备用于待修饰的靶基因同源重组的靶载体(如，编码与细胞内糖核苷酸、GDP-岩藻糖合成相关的酶，和/或编码与岩藻糖的1位通过α键结合于N-糖苷键合的复合糖链还原性末端的N-乙酰葡糖胺6位的糖链修饰有关的酶的结构基因，或者启动子基因)。
用于制备本发明细胞的宿主细胞，可以通过把制备好的靶载体导入宿主细胞中，并且选择在靶基因和靶载体之间发生同源重组的细胞来产生。
作为宿主细胞可以使用任何细胞如酵母，动物细胞，昆虫细胞，或者植物细胞，只要其具有编码与细胞内糖核苷酸、GDP-岩藻糖合成相关的酶，和/或编码与岩藻糖的1位通过α键结合于N-糖苷键合的复合糖链还原性末端的N-乙酰葡糖胺6位的糖链修饰有关的酶的基因。例子包括在以下的条目3中描述的宿主细胞。
制备编码与细胞内糖核苷酸、GDP-岩藻糖合成相关的酶，和/或编码与岩藻糖的1位通过α键结合于N-糖苷键合的复合糖链还原性末端的N-乙酰葡糖胺6位的糖链修饰有关的酶的基因组DNA的方法包括条目1(1)(a)中描述的制备基因组DNA的方法。
编码与细胞内糖核苷酸、GDP-岩藻糖合成相关的酶包括由SEQ IDNO：57或者60代表的核苷酸序列。编码与岩藻糖的1位通过α键结合于N-糖苷键合的复合糖链还原性末端的N-乙酰葡糖胺6位的糖链修饰有关的酶的基因组DNA的核苷酸序列包括由SEQ ID NO：3所代表的核苷酸序列。
用于靶基因同源重组的靶载体可以按照与Gene Targeting，APractical Approach(靶向基因：实践方法)，IRL Press at OxfordUniversity Press(牛津大学出版)(1993)；Biomanual Series 8(生物手册：8)，Gene Targeting，Preparation of Mutant Mice using ES Cells(靶向基因：使用ES细胞制备突变小鼠)，Yodo-sha(1995)，等中描述相一致的方法制备。靶载体既可以是作为置换型或者插入型使用。
为了将靶载体导入到不同的宿主细胞中，可以使用在以下的条目3中描述的把适于不同宿主细胞的重组载体导入的方法。
有效的筛选同源重组子的方法包括Gene Targeting A PracticalApproach(靶向基因：实践方法)，IRL Press at Oxford University Press(牛津大学出版)(1993)；Biomanual Series 8，(生物手册：8)，GeneTargeting，Preparation of Mutant Mice using ES Cells(靶向基因：使用ES细胞制备突变小鼠)，Yodo-sha(1995)等中描述的方法，例如阳性选择，启动子选择，负选择或者多聚A选择。在选择的细胞系中选择目的同源重组子的方法包括基因组DNA的Southern杂交方法(MolecularCloning(分子克隆)，第二版)，PCR[PCR protocols(PCR实验方法)Academic Press(美国学术出版社)(1990)]等。
(c)通过RDO方法制备用于制备本发明细胞的宿主细胞
用于制备本发明细胞的宿主细胞可以通过RDO(RNA-DNA寡聚核苷酸)的方法，通过以编码与细胞内糖核苷酸、GDP-岩藻糖合成相关的酶，和/或编码与岩藻糖的1位通过α键结合于N-糖苷键合的复合糖链还原性末端的N-乙酰葡糖胺6位的糖链修饰有关的酶的基因为目标制备，例如，如下。
制备编码与细胞内糖核苷酸、GDP-岩藻糖合成相关的酶，和/或编码与岩藻糖的1位通过α键结合于N-糖苷键合的复合糖链还原性末端的N-乙酰葡糖胺6位的糖链修饰有关的酶的cDNA或者基因组。
确定制备的cDNA或者基因组DNA的核苷酸序列。
以确定的DNA序列为基础，设计包括编码与细胞内糖核苷酸、GDP-岩藻糖合成相关的酶，和/或编码与岩藻糖的1位通过α键结合于N-糖苷键合的复合糖链还原性末端的N-乙酰葡糖胺6位的糖链修饰有关的酶的DNA的适当长度的RDO构建物。设计的RDO构建物可能进一步包括非翻译区的一部分或者一个内含子的一部分。
本发明的宿主细胞可以通过在宿主细胞中导入合成的RDO，然后通过选择在靶酶中发生突变的转化体得到，即，与细胞内糖核苷酸、GDP-岩藻糖合成相关的酶，和/或与岩藻糖的1位通过α键结合于N-糖苷键合的复合糖链还原性末端的N-乙酰葡糖胺6位的糖链修饰有关的酶。
对于宿主细胞，可以使用任何细胞例如酵母，动物细胞，昆虫细胞或者植物细胞，只要它具有编码与细胞内糖核苷酸、GDP-岩藻糖合成相关的靶酶和/或与岩藻糖的1位通过α键结合于N-糖苷键合的复合糖链还原性末端的N-乙酰葡糖胺6位的糖链修饰有关的靶酶的基因。例子包括在以下的条目3中描述的宿主细胞。
把RDO导入不同宿主细胞的方法包括在以下的条目3中描述的不同的宿主细胞中导入适当的重组载体的方法。
制备编码与细胞内糖核苷酸、GDP-岩藻糖合成相关的酶，和/或编码与岩藻糖的1位通过α键结合于N-糖苷键合的复合糖链还原性末端的N-乙酰葡糖胺6位的糖链修饰有关的酶的cDNA的方法包括在条目1(1)(a)等中描述的DNA制备方法。
制备编码与在细胞内糖核苷酸、GDP-岩藻糖合成相关的酶，和/或编码与岩藻糖的1位通过α键结合于N-糖苷键合的复合糖链还原性末端的N-乙酰葡糖胺的6位的糖链修饰有关的酶的基因组DNA的方法包括在条目1(1)(a)等中描述的基因组DNA的制备方法。
此DNA的核苷酸序列可以通过用合适的限制性内切酶消化，克隆该DNA片段到如pBluescript SK(-)(由Stratagene制备)等质粒中，对于该克隆进行一般作为分析核苷酸序列方法的反应，例如Sanger等的双脱氧法[Proc.Natl.Acad.Sci.(美国科学院院报).USA， 74，5463(1977)]等。然后用自动的核苷酸序列分析仪，如A.L.F.DNA测序仪(Pharmacia制造)等分析此克隆。
RDO也可以使用通常方法或者使用DNA合成仪制备。
通过把RDO导入宿主细胞中，导入编码与细胞内糖核苷酸、GDP-岩藻糖合成相关的酶的基因，和/或编码与岩藻糖的1位通过α键结合于N-糖苷键合的复合糖链还原性末端的N-乙酰葡糖胺6位的糖链修饰有关的酶的基因中，选择发生突变的细胞的方法包括在MolecularCloning(分子克隆)第二版中，Current Protocols in Molecular Biology(现代分子生物学指南)等等中描述的直接检测染色体基因中突变的方法。
同样地，作为方法，可以使用在条目1(1)(a)中描述的，通过测定导入的与细胞内糖核苷酸、GDP-岩藻糖合成相关的酶，和/或编码与岩藻糖的1位通过α键结合于N-糖苷键合的复合糖链还原性末端的N-乙酰葡糖胺6位的糖链修饰有关的酶的活性来选择转化体的方法；将在条目1(5)中描述的以细胞膜上的糖蛋白的糖链结构为基础，选择转化体的方法；将在条目4或者5中进行描述的以产生的抗体分子的糖链结构为基础，选择转化体的方法等。
RDO构建物可以按照Science(科学)， 273 1386(1996)，NatureMedicine(天然药物)， 4，285(1998)，Hepatology(肝脏病学)， 25，1462(1997)，Gene Therapy(基因治疗)， 5，1960(1999)，；J Mol.Med.(分子药物杂志).， 75，829(1997)，Proc.Natl.Acad.Sci.(美国科学院院报)USA，96，8774(1999)，Proc.Natl.Acad.Sci.(美国科学院院报)USA， 96，8768(1999)，Nuc.Acids Res(核酸研究).， 27，1323(1999)，Invest.Dematol.， 111，1172(1998)，Nature Biotech.(自然生物技术)， 16，1343(1998)；NatureBiotech.(自然生物技术)， 18，43(2000)；Nature Biotech.(自然生物技术)， 18，555(2000)等中描述的方法设计。
(d)通过RNAi的方法制备用于制备本发明细胞的宿主细胞
用于制备本发明细胞的宿主细胞可以通过RNAi(RNA干涉)的方法，以编码与在细胞内糖核苷酸、GDP-岩藻糖合成相关的酶的基因，和/或编码与岩藻糖的1位通过α键结合于N-糖苷键合的复合糖链还原性末端的N-乙酰葡糖胺的6位的糖链修饰有关的酶的基因为目标制备，例如，如下。
制备编码与细胞内糖核苷酸、GDP-岩藻糖合成相关的酶，和/或编码与岩藻糖的1位通过α键结合于N-糖苷键合的复合糖链还原性末端的N-乙酰葡糖胺6位的糖链修饰有关的酶的cDNA。
确定制备的cDNA的核苷酸序列。
以确定的DNA序列为基础，设计包括编码与细胞内糖核苷酸、GDP-岩藻糖合成相关的酶，和/或编码与岩藻糖的1位通过α键结合于N-糖苷键合的复合糖链还原性末端的N-乙酰葡糖胺6位的糖链修饰有关的酶的部分DNA的适当长度的RNAi构建物。设计的构建物可能进一步包括非翻译区的一部分。
为了在细胞中表达RNAi基因，通过插入制备的DNA片段或全长到合适的表达质粒的启动子的下游来制备重组载体。
通过把重组载体导入适于表达载体的宿主细胞中得到转化体。
用于制备本发明细胞的宿主细胞可以通过选择转化体获得，转化体的选择是基于与细胞内糖核苷酸、GDP-岩藻糖合成相关的酶，和/或与岩藻糖的1位通过α键结合于N-糖苷键合的复合糖链还原性末端的N-乙酰葡糖胺6位的糖链修饰有关的酶的活性，或者基于以细胞膜上糖蛋白或者产生的抗体分子的糖链的结构。
作为宿主细胞，可以使用任何细胞例如酵母，动物细胞，昆虫细胞或者植物细胞，只要它具有编码与细胞内糖核苷酸、GDP-岩藻糖合成相关的靶酶和/或与岩藻糖的1位通过α键结合于N-糖苷键合的复合糖链还原性末端的N-乙酰葡糖胺6位的糖链修饰有关的靶酶的基因。例子包括在以下的条目3中描述的宿主细胞。
作为表达载体，可以使用在宿主细胞中可以自主复制，或者可以整合到染色体中，并且包括设计的RNAi可以导入的启动子的载体。此位置可以转入的载体，例子包括在以下的条目3中描述的表达载体。
作为把基因导入不同的宿主细胞的方法，可以使用将在以下的条目3中描述的把适于不同宿主细胞的重组载体导入的方法。
基于与细胞内糖核苷酸、GDP-岩藻糖合成相关的酶，和/或与岩藻糖的1位通过α键结合于N-糖苷键合的复合糖链还原性末端的N-乙酰葡糖胺6位的糖链修饰有关的酶的活性来选择转化体的方法包括在条目1(1)(a)中描述的方法。
基于以细胞膜上糖蛋白的糖链的结构选择转化体的方法包括将在条目1(5)中描述的方法。基于产生的抗体分子的糖链结构选择转化体的方法包括将在条目4或者5中描述的方法。
制备编码与细胞内糖核苷酸、GDP-岩藻糖合成相关的酶或编码与岩藻糖的1位通过α键结合于N-糖苷键合的复合糖链还原性末端的N-乙酰葡糖胺6位的糖链修饰有关的酶的cDNA的方法包括在条目1(1)(a)等中描述的DNA制备方法。
此外，制备本发明细胞的宿主细胞也可以不使用表达载体，而直接导入基于编码与细胞内糖核苷酸、GDP-岩藻糖合成相关的酶，和/或编码与岩藻糖的1位通过α键结合于N-糖苷键合的复合糖链还原性末端的N-乙酰葡糖胺6位的糖链修饰有关的酶的核苷酸序列设计的RNAi基因获得。
RNAi基因可以使用通常方法或者DNA合成仪来制备。
RNAi基因构建物可以按照在Nature(自然)， 391，806(1998)；Proc.Natl.Acad.Sci.(美国科学院院报)，USA， 95，15502(1998)，Nature(自然)，395，854(1998)；Proc.Natl.Acad.Sci.(美国科学院院报)USA， 96，5049(1999)，Cell， 95，1017(1998)；Proc.Natl.Acad.Sci.(美国科学院院报)USA， 96，1451(1999)；Proc.Natl.Acad.Sci.(美国科学院院报)USA，95，13959(1998)，Nature Cell Biol(自然细胞生物学). 2，70(2000)等描述的方法设计。
(e)通过使用转座子的方法制备用于制备本发明细胞的宿主细胞
制备本发明细胞的宿主细胞可以通过使用在Nature Genet.(自然遗传学)， 25，35(2000)等中描述的转座子系统导入突变，然后基于与细胞内糖核苷酸、GDP-岩藻糖合成相关的酶，和/或与岩藻糖的1位通过α键结合于N-糖苷键合的复合糖链还原性末端的N-乙酰葡糖胺6位的糖链修饰有关的酶的活性选择突变体，或者基于产生的抗体分子的糖链结构或者细胞膜上的糖蛋白的糖链结构选择突变体来制备。
转座子系统是通过在染色体中随机插入外源基因诱发突变的系统，其中插入在转座子之间的外源基因一般用作诱发突变的载体，并且同时向细胞中导入用于在染色体中随机插入基因的转位酶表达载体。
可以使用任何转位酶，只要其适合于使用的转座子的序列。
作为外源基因，可以使用任何基因，只要它可以在宿主细胞的DNA中诱发突变。
作为宿主细胞，可以使用任何细胞例如酵母，动物细胞，昆虫细胞或者植物细胞，只要它具有编码与细胞内糖核苷酸、GDP-岩藻糖合成相关的靶酶和/或与岩藻糖的1位通过α键结合于N-糖苷键合的复合糖链还原性末端的N-乙酰葡糖胺6位的糖链修饰有关的靶酶的基因。例子包括在以下的条目3中描述的宿主细胞。
基于与细胞内糖核苷酸、GDP-岩藻糖合成相关的酶，和/或与岩藻糖的1位通过α键结合于N-糖苷键合的复合糖链还原性末端的N-乙酰葡糖胺6位的糖链修饰有关的酶的活性选择突变的方法包括条目1(1)(a)中描述的方法。
基于在细胞膜上糖蛋白的糖链的结构选择突变的方法包括在下面的条目1(5)中描述的方法，基于产生的抗体分子的糖链结构选择转化体的方法包括将在条目4或者5中描述的方法。
(2)导入编码酶的基因的显性负突变体的方法
制备本发明细胞的宿主细胞可以通过靶向编码与细胞内糖核苷酸、GDP-岩藻糖合成相关的酶，和/或编码与岩藻糖的1位通过α键结合于N-糖苷键合的复合糖链还原性末端的N-乙酰葡糖胺6位的糖链修饰有关的酶的基因，并且使用导入酶的显性负突变体的技术来制备。与细胞内糖核苷酸、GDP-岩藻糖合成相关的酶包括GMD，Fx，GFPP，岩藻糖激酶等等。与岩藻糖的1位通过α键结合于N-糖苷键合的复合糖链还原性末端的N-乙酰葡糖胺6位的糖链修饰有关的酶包括α1，6-岩藻糖基转移酶，α-L-岩藻糖苷酶等。
酶催化具有底物特异性的特异反应，编码酶的基因的显性负突变体可以通过断裂酶的活性中心来制备，该酶催化具有底物特异性的催化活性。制备显性负突变体的方法如下参照在靶酶中的GMD有具体的描述。
作为大肠杆菌来源的GMD的三维结构分析的结果，发现4个氨基酸(133位的苏氨酸，135位的谷氨酸，157位的酪氨酸和161位的赖氨酸)对于酶活性有重要作用(Structure(结构)， 8，2，2000)。即，当基于三维结构的信息，用其它不同的氨基酸替换的4个氨基酸制备突变体，所有突变体的酶的活性显著下降。另一方面，几乎不能观察到突变体GMD结合于GMD辅酶NADP或者其底物GDP-甘露糖的活性的变化。相应的，通过替换控制GMD酶活性的4个氨基酸可以制备显性负突变体。例如，来源于CHO细胞的GMD(SEQ ID NO：41)，通过比较同源性，使用基于大肠杆菌来源的GMD的结果的氨基酸序列信息预测三维结构，显性负突变体可以通过用其它的氨基酸替换155位的苏氨酸，157位的谷氨酸，179位的酪氨酸，和183位的赖氨酸来制备。这样导入氨基酸取代的基因的导入可以使用Molecular Cloning(分子克隆)第二版，Current Protocols in Molecular Biology(现代分子生物学指南)等中描述的定点突变的方法制备。
用于制备本发明细胞的宿主细胞可以按照Molecular Cloning(分子克隆)第二版，Current Protocols in Molecular Biology(现代分子生物学指南)等中描述的方法制备，使用制备的靶酶的显性负突变体基因，例如，如下。
制备编码与细胞内糖核苷酸、GDP-岩藻糖合成相关的酶，和/或编码与岩藻糖的1位通过α键结合于N-糖苷键合的复合糖链还原性末端的N-乙酰葡糖胺6位的糖链修饰有关的酶的显性负突变体的基因(以下称为“显性负突变体基因”)。
如果必要，基于制备的显性负突变体基因的全长DNA，制备含有编码蛋白质的部分的相应长度的DNA片段。
通过插入DNA片段或者DNA全长至合适的表达载体的启动子的下游来产生重组载体。
通过在适于表达载体的宿主细胞中导入重组载体得到转化体。
用于制备本发明细胞的宿主细胞，可以通过基于与细胞内糖核苷酸、GDP-岩藻糖合成相关，和/或与岩藻糖的1位通过α键结合于N-糖苷键合的复合糖链还原性末端的N-乙酰葡糖胺6位的糖链修饰有关的酶活性，或者基于产生的抗体分子或者细胞膜上糖蛋白的糖链的结构选择转化体来制备。
作为宿主细胞，可以使用任何细胞例如酵母，动物细胞，昆虫细胞或者植物细胞，只要其具有编码与细胞内糖核苷酸、GDP-岩藻糖合成相关的靶酶，和/或与岩藻糖的1位通过α键结合于N-糖苷键合的复合糖链还原性末端的N-乙酰葡糖胺6位的糖链修饰有关的靶酶的基因。例子包括将在以下的条目3中描述的宿主细胞。
作为表达载体，可以使用在宿主细胞中可以自主复制，或者可以整合到染色体中，而且包括编码目的显性负突变体的DNA可以有效地进行转录的启动子的载体。例子包括在以下的条目3中描述的表达载体。
对于把基因导入不同宿主细胞，可以使用把适于不同宿主细胞的重组载体导入的方法，其在以下的条目3中有说明。
基于与细胞内糖核苷酸、GDP-岩藻糖合成相关的酶，和/或与岩藻糖的1位通过α键结合于N-糖苷键合的复合糖链还原性末端的N-乙酰葡糖胺6位的糖链修饰有关的酶的活性选择转化体的方法包括在条目1(1)(a)中描述的方法。
基于细胞膜上糖蛋白的糖链结构选择转化体的方法包括在条目1(5)中描述的方法，基于产生的抗体分子的糖链结构选择转化体的方法包括在以下条目4或者5中描述的方法。
(3)在酶中导入突变的方法
用于制备本发明细胞的宿主细胞，可以通过把突变导入编码与细胞内糖核苷酸、GDP-岩藻糖合成相关的酶的基因中，和/或编码与岩藻糖的1位通过α键结合于N-糖苷键合的复合糖链还原性末端的N-乙酰葡糖胺6位的糖链修饰有关的酶的基因中，然后选择在酶中发生了突变的目的细胞系而制备。
与细胞内糖核苷酸、GDP-岩藻糖合成相关的酶包括GMD，Fx，GFPP，岩藻糖激酶等等。与岩藻糖的1位通过α键结合于N-糖苷键合的复合糖链还原性末端的N-乙酰葡糖胺的6位的糖链修饰有关的酶包括α1，6-岩藻糖基转移酶，α-L-岩藻糖苷酶等等。
方法包括1)基于与细胞内糖核苷酸、GDP-岩藻糖合成相关的酶，和/或与岩藻糖的1位通过α键结合于N-糖苷键合的复合糖链还原性末端的N-乙酰葡糖胺6位的糖链修饰有关的酶的活性，从对亲代细胞系用诱变剂进行突变诱导处理得到的突变体以及自发产生的突变体中选择所需细胞系的方法。2)基于产生的抗体分子的糖链的结构，从对亲代细胞系用诱变剂进行突变诱导处理得到的突变体以及自发产生的突变体中选择所需细胞系的方法。3)基于细胞膜上糖蛋白的糖链结构，从对亲代细胞系用诱变剂进行突变诱导处理得到的突变体以及自发产生的突变体中选择所需细胞系的方法。
作为诱发突变的处理，可以使用任何的处理手段，只要其可以在亲代细胞系细胞的DNA中诱发点突变或者缺失或者移码突变。
例子包括用乙基亚硝基脲，亚硝基胍，苯并芘或者一种吖啶色素以及用辐射处理。并且，可以使用不同的烷化剂以及致癌剂作为诱变剂。允许诱变剂作用于细胞的方法包括在Tissue culture(组织培养)Techniques，第三版(Asakura Shoten)，日本组织培养协会编著(1996)，Nature Genet.(自然遗传学)， 24，314(2000)等等中描述的方法。
自发产生的突变包括在一般的细胞培养条件下，不用使用特定的突变诱发处理，通过连续传代而自发形成的突变。
测定在细胞内糖核苷酸、GDP-岩藻糖合成相关的酶，和/或与岩藻糖的1位通过α键结合于N-糖苷键合的复合糖链还原性末端的N-乙酰葡糖胺6位的糖链修饰有关的酶的活性的方法包括在条目1(1)(a)中描述的方法。辨别制备的抗体分子的糖链结构的方法包括在以下的条目4或者5中描述方法。辨别细胞膜上糖蛋白的糖链结构的方法包括在条目1(5)中描述的方法。
(4)抑制编码酶的基因的转录和/或翻译的方法
本发明的宿主细胞可以使用例如反义RNA/DNA技术[Biioscienceand Industry(生物科学和工业)， 50，322(1992)；Chemistry(化学)， 46681(1991)，Biotechnology(生物技术)， 9，358(1992)，Trends inBiotechnology(生物技术进展)， 10，87(1992)，Trends in Biotechnology(生物技术进展)， 10，152(1992)；Cell Engineering(细胞工程)， 16，1463(1997)]，三股螺旋技术[Trends in Biotechnology(生物技术进展)， 10，132(1992)]等等，使用编码细胞内糖核苷酸、GDP-岩藻糖合成相关的酶的基因，和/或编码与岩藻糖的1位通过α键结合于N-糖苷键合的复合糖链还原性末端的N-乙酰葡糖胺6位的糖链修饰有关的酶的基因作为靶基因，抑制靶基因的转录和/或翻译而制备。
与细胞内糖核苷酸、GDP-岩藻糖合成相关的酶包括GMD，Fx，GFPP，岩藻糖激酶等等。岩藻糖的1位通过α键结合于N-糖苷键合的复合糖链还原性末端的N-乙酰葡糖胺6位的糖链修饰相关的酶包括α1，6-岩藻糖基转移酶，α-L-岩藻糖苷酶等等。
(5)选择对可以识别岩藻糖的1位通过α键结合于N-糖苷键合的复合糖链还原性末端的N-乙酰葡糖胺6位的糖链结构的凝集素有抗性的细胞系的方法。
制备本发明细胞的宿主细胞，可以通过使用选择对可以识别岩藻糖的1位通过α键结合于N-糖苷键合的复合糖链还原性末端的N-乙酰葡糖胺6位的糖链结构的凝集素有抗性的细胞系的方法制备。
选择对可以识别岩藻糖的1位通过α键结合于N-糖苷键合的复合糖链还原性末端的N-乙酰葡糖胺6位的糖链结构的凝集素有抗性的细胞系的方法包括在Somatic Cell Mol.Genet(体细胞分子遗传学).， 12，51(1986)等中描述的方法使用凝集素的方法。
作为凝集素，可以使用任何凝集素，只要它是可以识别岩藻糖的1位通过α键结合于N-糖苷键合的复合糖链还原性末端的N-乙酰葡糖胺6位的糖链的凝集素。例子包括Lens culinaris凝集素LCA(来源于Lensculinaris的扁豆凝集素)，豌豆凝集素PSA(来源于Pisum sativum的豌豆凝集素)，一种蚕豆凝集素VFA(来源于Viciafaba的凝集素)，Aleuria aurantia凝集素AAL(来源于Aleuria aurantia的凝集素)等等。
具体的，本发明的对可以识别岩藻糖的1位通过α键结合于N-糖苷键合的复合糖链还原性末端的N-乙酰葡糖胺6位的糖链结构的凝集素有抗性的细胞系，可以通过培养细胞1天到2周，优选的从1天到1周，使用含有凝集素的培养基，其终浓度为1微克/毫升到1毫克/毫升，存活的细胞传代培养或者挑出一个单克隆并且转移至培养皿中，随后在含有凝集素的培养基中连续培养而选择。
2.制备本发明的转基因非人动物或者植物或者它们的后代
转基因非人动物或者植物或者它们的后代，可以从本发明的胚胎干细胞，受精卵细胞，或者植物愈伤组织细胞来制备，其中以抗体分子糖链修饰相关的酶的活性控制了的方式修饰了它们的基因组基因，这些细胞通过以上的条目1，使用编码与细胞内糖核苷酸、GDP-岩藻糖合成相关的酶的基因，和/或编码与岩藻糖的1位通过α键结合于N-糖苷键合的复合糖链还原性末端的N-乙酰葡糖胺6位的糖链修饰有关的酶的基因作为靶基因制备，例如，如下。
在转基因的非人动物中，通过如条目1描述的方法，本发明的胚胎干细胞中细胞内糖核苷酸、GDP-岩藻糖合成相关的酶活性，和/或与岩藻糖的1位通过α键结合于N-糖苷键合的复合糖链还原性末端的N-乙酰葡糖胺6位的糖链修饰有关的酶活性得到控制，使其制备成目的非人动物如牛，羊，山羊，猪，马，小鼠，大鼠，鸡，猴，兔等的胚胎干细胞。
具体的，通过已知的同源重组技术[如，Nature(自然)， 326，6110，295(1987)，Cell(细胞)，51，3，503(1987)，等等]，制备编码与细胞内糖核苷酸、GDP-岩藻糖合成相关的酶，和/或编码与岩藻糖的1位通过α键结合于N-糖苷键合的复合糖链还原性末端的N-乙酰葡糖胺的6位的糖链修饰有关的酶的基因失效或者用任何序列取代的突变克隆。使用制备好的胚胎干细胞(如，突变的克隆)，包括胚胎干细胞克隆和正常细胞的嵌合个体可以通过在一种动物受精卵的胚囊中注射嵌合体的方法或者通过一种嵌合体集簇(aggregation chimera)的方法制备。嵌合个体与正常个体杂交，以便能够得到全部体细胞中与在细胞内糖核苷酸、GDP-岩藻糖合成相关的酶活性，和/或与岩藻糖的1位通过α键结合于N-糖苷键合的复合糖链还原性末端的N-乙酰葡糖胺的6位的糖链修饰有关的酶的活性下降或者缺失的转基因非人动物。
同样的，通过使用与条目1类似的方法，制备本发明受精卵细胞，其中与细胞内糖核苷酸、GDP-岩藻糖合成相关的酶活性，和/或与岩藻糖的1位通过α键结合于N-糖苷键合的复合糖链还原性末端的N-乙酰葡糖胺6位的糖链修饰有关的酶的活性下降或者缺失，使受精卵成为目的非人动物如牛，羊，山羊，猪，马，小鼠，大鼠，鸡，猴，兔，或者等等的受精卵细胞。
使用Manipulating Mouse Embryo(小鼠胚胎操作)，第二版等等描述的胚胎移植的方法，移植制备的受精卵细胞至假孕雌性动物的输卵管或者子宫中，随后动物分娩来制备转基因的非人动物，其中与细胞内糖核苷酸、GDP-岩藻糖合成相关的酶活性，和/或与岩藻糖的1位通过α键结合于N-糖苷键合的复合糖链还原性末端的N-乙酰葡糖胺6位的糖链修饰有关的酶的活性下降。
在转基因植物中，使用与条目1类似的方法，制备本发明的愈伤组织，其中与细胞内糖核苷酸、GDP-岩藻糖合成相关的酶活性，和/或与岩藻糖的1位通过α键结合于N-糖苷键合的复合糖链还原性末端的N-乙酰葡糖胺6位的糖链修饰有关的酶的活性的下降或者缺失，成为目的植物的愈伤组织或者植物细胞。
转基因植物，其中细胞内糖核苷酸、GDP-岩藻糖合成相关的酶活性，和/或与岩藻糖的1位通过α键结合于N-糖苷键合的复合糖链还原性末端的N-乙酰葡糖胺6位的糖链修饰有关的酶的活性的下降，可以按照已知的方法[Tissue culture(组织培养) 20(1994)；Tissue culture(组织培养) 21(1995)；Trends in Biotechnology(生物技术进展)， 15，45(1997)]，使用包括植物生长素和细胞分裂素的培养基培养制备的植物愈伤组织，使其重分化来制备。
3.生产抗体组合物的方法
通过用Molecular Cloning(分子克隆)，第二版，Currenl Protocols inMolecular Biology，Antibodies，A Laboralory Manual(现代分子生物学实验方法，抗体)，Cold Spring Harbor Laboratory(冷泉港实验室)，1988(以下也称为“抗体”)，Monoclonal Antibodies：Prmciple and Practice(单克隆抗体：原理与实践)，第三版，Acad.Press(美国学术出版社)，1993(以下也称为“单克隆抗体”)和Antibody Engineering(抗体工程)，APractical Approach，IRL Press Oxford University(牛津大学出版)(以下也称为“Antibody Engineering(抗体工程)”)中描述的方法在宿主细胞中表达得到抗体组合物，例如，如下。
制备本发明的编码抗CD20的抗体分子的全长cDNA，制备包括编码抗体分子的区域的合适长度的DNA片段。
通过插入DNA片段或cDNA全长至合适的表达载体的启动子下游来制备重组载体。
产生抗体分子的转化体可以通过在适于表达载体的宿主细胞中导入重组载体制备。
作为宿主细胞，可以使用任何的酵母，动物细胞，昆虫细胞，植物细胞等等，只要它可以表达目的基因。
作为宿主细胞，可以使用其中与修饰结合于抗体分子的Fc区域的N-糖苷键合的糖链相关的酶，例如，与细胞内糖核苷酸、GDP-岩藻糖合成相关的酶，和/或与岩藻糖的1位通过α键结合于N-糖苷键合的复合糖链还原性末端的N-乙酰葡糖胺6位的糖链修饰有关的酶活性的下降或者缺失的细胞，或者通过在条目1中描述的不同的人工技术得到的细胞。
作为表达载体，可以使用在宿主细胞中可以自主复制，或者可以整合到染色体中，并且包括编码目的抗体分子的DNA可以导入的启动子的载体。
使用根据条目1(1)(a)中描述的DNA制备方法，例如目的抗体分子特异的探针引物，从人或者非人类组织或者细胞中制备cDNA。
当使用酵母细胞作为宿主细胞，表达载体包括YEP13(ATCC37115)，YEp24(ATCC 37051)，YCp50(ATCC 37419)等等。
可以使用任何启动子，只要它可以在酵母中起作用。例子包括糖酵解途径基因的启动子，例如己糖激酶的基因启动子，PH05启动子，PGK启动子，GAP启动子，ADH启动子，gal 1启动子，gal 10启动子，热休克蛋白启动子，MFα1启动子，CUP 1启动子等等。
宿主细胞包括属于酵母属，裂殖酵母属，克鲁维酵母属，卵形丝孢酵母属，Schwanniomyces属等的微生物，如酿酒酵母，裂殖酵母，乳酸克鲁维酵母，Trichosporon pullulans和Schwanniomyces alluvius。
作为导入重组载体的方法，可以使用任何方法，只要可以在酵母中导入DNA。例子包括电穿孔[Methods in Enzymology(酶学方法)， 194，182(1990)]，原生质体方法[Proc.Natl.Acad.Sci.(美国科学院院报)USA，83，1929(1978)]，乙酸锂方法{J Bacteriol， 153，163(1983)]，在Proc.Natl.Acad.Sci.(美国科学院院报)USA， 75，1929(1978)等中描述的方法。
当动物细胞用作宿主，表达载体包括pcDNAI，pcDM8(在Funakoshi可以购到)，pAGE107[日本公开的审查的专利申请22979/91号；Cytotechnology(电穿孔)， 3，133(1990)]，pAS3-3(日本公开的审查的专利申请号227075/90)，pCDM8[Nature(自然)， 329，840(1987)]，pcDNAI/Amp(Invitrogen生产)，pREP4(Invitrogen生产)，pAGE 103[J.Biochemistry(生物化学杂志)， 101，1307(1987)]，pAGE210等等。
可以使用任何启动子，只要其可以在动物细胞中起作用。例子包括巨细胞病毒(CMV)的IE基因的启动子(超早期)，SV40的早期启动子，反转录病毒启动子，金属硫蛋白启动子，热休克启动子，SRα启动子等等。同时也可以与启动子一齐使用人CMV的IE基因的增强子。
宿主细胞包括人细胞如Namalwa细胞，猴细胞如COS细胞，中国仓鼠细胞如CHO细胞或者HBT5637(日本公开的审查的专利申请299/88号)，大鼠骨髓瘤细胞，小鼠骨髓瘤细胞，来源于叙利亚仓鼠肾的细胞，胚胎干细胞，受精卵细胞等等。
作为导入重组载体的方法，可以使用任何方法，只要该方法可以在动物细胞中导入DNA。例子包括电击转化[Cytotechnology(电穿孔)，3，133(1990)]，磷酸钙方法(日本公开的审查的专利申请227075/90号)，脂质体感染方法[Proc.Natl.Acad.Sci.(美国科学院院报)USA， 84，7413(1987)]，注射方法[Manipulating the Mouse Embryo，A LaboratoryManual(小鼠胚胎的操作：实验手册)]，使用基因枪的方法(基因枪)(日本专利2606856号，日本专利2517813号)，DEAE-dextran方法[Biomanual Series 4-Gene Transfer and Expression Analysis(生物手册4-基因转移和表达分析)(Yodo-sha)，由Takashi Yokota和Kenichi Arai编辑(1994)]，病毒载体方法[Manipulating Mouse Embryo(小鼠胚胎操作)，第二版]等等。
当用昆虫细胞作为宿主时，可以用Current Protocols in MolecularBiology(现代分子生物学指南)，Baculovirus expression Vectors，ALaboratory Manual(实验手册)，W.H.Freeman and Company，New York(1992)，Bio/Technology(生物/技术)， 6，47(1988)等中描述的方法表达蛋白。
即，通过将重组基因导入载体和杆状病毒，再导入昆虫细胞，在昆虫细胞培养基的上清中得到重组病毒，然后用重组病毒感染昆虫细胞来表达此蛋白。
在此方法中使用的基因导入载体包括pVL1392，pVL1393，pBlueBacIII(均Invitrogen生产)等等。
杆状病毒包括感染昆虫Barathra家族的苜蓿丫纹夜蛾(Autographacalifornia0核型多角体病毒。
此昆虫细胞包括Spodoptera frugiperda卵巢Sf9和Sf21[CurrentProtocols in Molecular Biology(现代分子生物学指南)，BaculovirusExpression Vectors，A Laboratory Manual(实验手册)，W.H.Freeman andCompany，New York(1992)]，Trichoplusia ni ovarian High 5(Invitrogen生产)等等。
同时导入重组基因导入载体和杆状病毒用于制备重组病毒的方法包括磷酸钙方法[日本公开的审查的专利申请227075/90号]，脂质体感染方法[Proc.Natl.Acad.Sci.(美国科学院院报)USA， 84 7413(1987)]等等。
当植物细胞用作宿主细胞时，表达载体包括Ti质粒，番茄花叶病毒等等。
作为启动子，可以使用任何启动子，只要其可以作用于植物细胞。例子包括花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子，水稻肌动蛋白1启动子等等。
宿主细胞包括烟草，马铃薯，番茄，胡萝卜，大豆，油菜，苜蓿，水稻，小麦，大麦等的植物细胞。
作为导入重组载体的方法，可以使用任何方法，只要其可以把DNA导入植物细胞中。例子包括使用Aprobacterium的方法(日本公开的审查的专利申请140885/84号，日本公开的审查的专利申请70080/85号，WO 94/00977)，电穿孔(日本公开的审查的专利申请251887/85号)，使用基因枪的方法(基因枪)(日本专利2606856号，日本专利2517813号)等。
作为表达基因，分泌产物，表达Fc区域与其它蛋白的融合蛋白的方法，除了直接表达外，可以根据Molecular Cloning(分子克隆)第二版等描述的方法进行。
当用细菌，酵母，动物细胞，昆虫细胞或者植物细胞进行基因表达时，导入与合成糖链有关基因，通过导入的基因获得加入糖或者糖链的抗体。
通过在培养基中培养得到的转化体，在培养基中形成和积累抗体分子，然后从培养基中回收抗体组合物来得到抗体组合物。根据用于培养宿主细胞的一般方法，使用培养基，进行培养转化体。
对于使用一种原核细胞如大肠杆菌或者真核细胞如酵母来作为宿主，培养得到的转化体的培养基既可以是天然培养基，也可以是合成的培养基，只要其包括如碳源，氮源，无机盐等等物质，这些物质可以被生物同化作用利用，而且也可以有效地进行转化体的培养。
作为碳源，可以使用那些能被生物体同化的物质。例子包括糖类，如葡萄糖，岩藻糖，蔗糖，以及含有它们的糖蜜，淀粉，和淀粉水解产物，有机酸如醋酸和丙酸；醇类如乙醇和丙醇；以及类似物。
氮源包括氨，无机酸的铵盐或者有机酸如氯化铵，硫酸铵，醋酸铵和磷酸铵；其它的含氮化合物；蛋白胨；肉膏；酵母提取物；玉米浸出液；酪蛋白水解物；粗大豆粉；粗大豆粉水解物；各种发酵的细胞及其水解物等。
无机矿物质包括磷酸二氢钾，磷酸氢二钾。磷酸镁，硫酸镁，氯化钠，硫酸铁，硫酸锰，硫酸铜，碳酸钙等。
培养一般是在有氧气的条件下进行如振荡培养或者在水中进行通气搅拌培养。培养温度优选为15到40℃，而且培养时间一般为16小时到7天。在培养中，pH保持在3.0到9.0。用无机酸或者有机酸，碱性溶液，尿素，碳酸钙，氨等调节pH值。
同时，如果有必要可以在培养过程中在培养基中加入抗生素，如氨苄青霉素或者四环素等。
当培养使用诱导型启动子作为启动子，得到的重组载体转化的微生物时，如果有必要，可以在培养基中加入诱导物。例如，当培养使用lac启动子得到的重组质粒转化的微生物时，可以在培养基中加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，并且当培养使用trp启动子得到的重组质粒转化的微生物时，可以将indoleacrylic acid加入到培养基中。
当培养用动物细胞作为宿主细胞得到的转化体时，培养基的例子包括一般常用的RPMI1640培养基[The Journal of the AmericanMedical Association(美国医学协会杂志)， 199，519(1967)]，Eagle’s MEM培养基[Science(科学)， 122，501(1952)]，Dulbecco′s修饰的MEM培养基[Virology(病毒学)， 8，396(1959)]，199培养基[Proceeding of theSociety for ihe Biological Medicine(生物医学协会进展)， 73，1(1950)]和Whitten′s培养基[Developmental Engineering ExperimentationManual-Preparation of Transgenic Mice(工程实验进展手册-制备转基因小鼠)(Kodan-sha)，M.Katshuki编著(1987)]，其中培养基加入了胎牛血清。
培养一般在pH6到8，30到40℃，有5％的CO2下培养1到7天。
如果有必要，可以在培养过程中在培养基中加入抗生素，如卡那霉素或者青霉素。
培养昆虫细胞作为宿主细胞得到的转化体的培养基，一般使用TNM-FH培养基(Pharmingen制造)，Sf900 II SFM培养基(LifeTechnologies制造)，ExCell 400和ExCell 405(两者均由JRHBiosciences制造)，Grace′s昆虫培养基[Nature(自然)，195，788(1962)]等。
培养一般在pH6到7，25到30℃下培养1到5天。
如果有必要，在培养过程中可以在培养基中加入抗生素，如庆大霉素。
用植物细胞作为宿主细胞的转化体可作为细胞培养，或者通过使其分化成为植物细胞或者植物器官。用于培养转化体的培养基包括一般常用的Murashige和Skoog(MS)培养基和White培养基，其中的培养基加入植物激素如植物生长素或者细胞分裂素。
培养一般在pH5到9，20到40℃下培养3到60天。
如果有必要，培养过程中可以在培养基中加入抗生素，如卡那霉素，潮霉素等。
这样，通过培养转化体可以生产抗体组合物，转化体来源于微生物，动物细胞或者植物细胞，这些细胞包含有重组载体，其中插入了编码抗体分子的DNA片段，按照一般的培养方法，在其中形成和积累抗体组合物，然后从培养基中回收抗体组合物。
除了直接表达，对于表达基因，分泌产物，表达融合蛋白等的方法可以按照在Molecular Cloning(分子克隆)第二版等说明的方法进行。
用于生产抗体组合物的方法包括在宿主细胞的细胞内表达的方法，宿主细胞的细胞外分泌的方法，以及在宿主细胞的膜的外侧产生的方法。可以通过改变使用的宿主细胞或者生产的抗体组合物的结构来选择方法。
当本发明的抗体组合物在宿主细胞中产生或者在宿主细胞膜的外层产生，按照Paulson等人[J.Biol.Chem.(生物化学杂志)， 264，17619(1989)]的方法，Lowe等人[Proc.Natl.Acad.Sci.(美国科学院院报)USA， 86，8227(1989)，Genes Develop.(基因进展)， 4，1288(1990)]的方法，在日本公开的审查的专利申请336963/93号和在日本公开的审查的专利申请823021/94号等描述的方法可以直接将产物分泌到细胞外。
即，通过使用重组DNA技术，在表达载体中插入编码抗体分子的DNA和适于表达抗体分子的编码信号肽的DNA，将表达载体导入到宿主细胞中，随后表达抗体分子，目的抗体分子直接从宿主细胞分泌到胞外。
同样地，可以按照日本公开的审查的专利申请No.227075/90号所述的方法，使用的基因扩增系统(用二氢叶酸还原酶的基因)增加其产量。
此外，抗体组合物也可以通过使用转基因动物个体(转基因非人动物)或者转基因植物个体(转基因植物)产生，它们是通过将导入了基因的动物细胞或者植物细胞重分化来构建的。
当转化体是动物个体或者植物个体，可以按照一般的方法，通过饲养或者培养其来形成和积累抗体组合物，然后从动物个体或者植物个体中回收抗体组合物来产生抗体组合物。
使用动物个体生产抗体组合物的方法，包括根据已知方法[American Journal of Clinical Nutrition(美国临床营养学杂志)， 63，639S(1996)；American Journal of Clinical Nutrition(美国临床营养学杂志)，63，627S(1996)；Bio/Technology(生物/技术)， 9，830(1991)]，通过导入基因构建的动物中来生产目的抗体组合物的方法。
在一个动物个体的例子中，可以通过饲养其中导入编码抗体分子的DNA的转基因的非人动物，使其在动物中形成和积累抗体组合物，然后从动物中回收抗体组合物来产生抗体组合物。在动物身体上生产和积累抗体组合物的部位包括乳汁(日本公开的审查的专利申请号309192/88)和动物的卵。在这种情况下使用的启动子，可以使用任何启动子，只要其在动物中有作用。优选的例子包括哺乳动物乳腺细胞特异的启动子，如α酪蛋白启动子，β酪蛋白启动子，β乳球蛋白启动子和乳清酸蛋白启动子。
使用植物个体生产抗体组合物的方法包括根据已知方法[Tissueculture(组织培养)， 20(1994)，Tissue culture(组织培养)， 21(1995)，Trends in Biotechnology(生物技术进展)， 15，45(1997)]，通过培养导入编码抗体分子的DNA的转基因植物，产生抗体组合物，在植物中形成和积累抗体组合物，然后从植物中回收这些抗体组合物的方法。
关于纯化导入编码抗体分子的基因的转化体产生的抗体组合物，例如，当抗体分子在细胞内以不溶的形式表达，在培养后，通过离心回收细胞，悬浮于缓冲水溶液中，然后用超声波仪，French press，MantonGaulin匀浆器，dynomill等破碎细胞，得到无细胞的提取物。使用一般的酶分离纯化技术，如溶剂抽提；硫酸铵盐析等；脱盐；用有机溶剂沉淀；使用如二乙基氨基乙基(DEAE)-琼脂糖或者DIAION HPA-75(Mitsubishi Chemical生产)树脂的阴离子交换层析；使用S-琼脂糖FF(Pharmacia生产)树脂的阳离子交换层析；用如丁基-琼脂糖或者苯基-琼脂糖树脂的疏水层析；使用分子筛的凝胶过滤；亲和层析；色谱聚焦；电泳如，等电聚焦等方法(这些方法可以单独使用或者组合使用)，从通过离心无细胞提取物而得到的上清液中，可以得到纯化的抗体组合物产物。
同样地，当抗体组合物在细胞内表达，形成包涵体时，回收细胞，以同样的方式破细胞并且离心，抗体组合物的包涵体以沉淀部分的形式回收。回收的抗体组合物包涵体通过使用蛋白变性剂溶解。抗体组合物溶通过稀释或者透析解的溶液，变为正常的三维结构，通过同样的分离纯化方法得到抗体组合物的纯化产物。
当细胞外分泌抗体组合物时，抗体组合物或其衍生物可以从培养基上清中回收。即，培养基用例如离心的技术处理，获得可溶成分，抗体组合物的纯化制剂可以用同样的分离提纯方法从可溶成分中获得。
如此得到的抗体组合物包括抗体，抗体的片段，和包括抗体Fc区域的融合蛋白。
作为获得抗体组合物的例子，产生人源化抗体组合物的方法在以下详细描述，但是别的抗体组合物也可以用相似的方法获得。
(1)构建表达人源化抗体的载体
表达人源化抗体的载体是动物细胞的表达载体，其中插入了编码人抗体的重链(H链)和轻链(L链)的C区的基因，表达人源化抗体的载体可以通过把编码人抗体H链和L链的C区的基因克隆进入动物细胞的表达载体而构建。
人抗体的C区可以是任何人抗体的H链和L链的C区。例子包括属于人抗体H链中的IgG1亚类的C区(以下称为“hCγ1”)，属于人抗体L链中的κ类的C区(以下称为“hCκ”)等。
作为编码人抗体H链和L链的C区的基因，可以使用包含外显子和内含子的基因组DNA，也可以使用cDNA。
作为动物细胞的表达载体，可以使用任何载体，只要编码人抗体的C区的基因可以插入并且可以在此表达。例子包括pAGE107[Cytotechnology(电穿孔)， 3，133(1990)]，pAGE103[J.Biochem.(生物化学杂志)， 101，1307(1987)]，pHSG274[Gene(基因)， 27，223(1984)]，pKCR[Proc.Natl.Acad.Sci.(美国科学院院报)USA， 78，1527(1981)，pSG1βd2-4[Cytotechnology(电穿孔)， 4，173(1990)]等等。动物细胞表达载体中的启动子和增强子的例子包括SV40早期启动子和增强子[J.Biochem.(生物化学杂志)， 101，1307(1987)]，莫洛尼鼠白血病病毒LTR启动子[Biochem.Biophys.Res.Commun.(生物化学与生物物理研究通讯).， 149，960(1987)]，免疫球蛋白H链启动子[Cel(细胞)l， 41，479(1985)]和增强子[Cel，(细胞) 33，717(1983)]等。
表达人源化抗体的载体可以是任何类型，其中编码抗体H链和L链的基因存在于不同载体上或者存在于同一载体上(以下称为“串联式”)。考虑构建表达人源化抗体的载体的容易性，导入动物细胞和动物细胞中抗体H链的容易性和L链表达量的平衡，优选表达人源化抗体的串联式载体[J.Immunol Methods(免疫学方法杂志)， 167，271(1994)]。表达人源化抗体的串联式载体包括pKANTEX93[Mol.Immunol(分子免疫学)， 37，1035(2000)]，pEE18[Hybridoma(杂交瘤)， 17，559(1998)]等等。
构建的表达人源化抗体的载体可以用于在动物细胞中表达人嵌合抗体和人CDR-移植抗体。
(2)制备编码来源于非人动物的抗体的V区的cDNA
编码来源于非人动物的抗体，例如鼠抗体的H链和L链的V区的cDNA可以用以下方法获得。
从产生目的鼠抗体的杂交瘤细胞中提取mRNA，由mRNA合成cDNA。合成的cDNA克隆进入载体，例如噬菌体或质粒，获得cDNA文库。每个含有编码H链V区的cDNA的重组噬菌体或重组质粒，和每个含有编码L链V区的cDNA的重组噬菌体或重组质粒通过用现有的鼠抗体的C区部分或V区部分作为探针从文库中分离出来。确定重组噬菌体或重组质粒中目的鼠抗体的H链和L链的V区的核苷酸全序列，从核苷酸序列推导出H链和L链的V区的氨基酸全序列。
作为非人动物，可以使用任何动物例如小鼠，大鼠，仓鼠，兔等，只要可以从中产生出杂交瘤细胞。
从杂交瘤细胞中制备总DNA的方法包括硫代氰酸胍-三氟乙酸铯法[Methods in Enzymology(酶学方法)， 154，3(1987)]等。从总DNA中制备mRNA的方法包括oligo(dT)-固定的纤维素柱方法(MolecularCloning：A Laboratory Manual(分子克隆：实验手册)，Cold Spring HarborLab.Press(冷泉港实验室出版)New york，1989)等。另外，从杂交瘤细胞中制备mRNA的试剂盒包括Fast Track mRNA分离试剂盒(Invitrogen生产)，快速制备mRNA纯化试剂盒(Pharmacia生产)等。
合成cDNA和制备cDNA文库的方法包括常规方法(MolecularCloning：A Laboratory Manual(分子克隆：实验手册)，Cold Spring HarborLab.Press(冷泉港实验室出版)New York 1989，Current Protocols inMolecular.Biology(现代分子生物学实验方法)，增刊1-34)；使用商业上可获得的试剂盒的方法，例如用于cDNA合成和质粒克隆的SuperScriptTM质粒系统(GIBCO BRL生产)，和ZAP-cDNA合成试剂盒(Stratagene生产)等。
在制备cDNA文库中，载体，其中杂交瘤细胞中提取的mRNA作为模板合成的cDNA插入到载体中，可以是任何载体，只要cDNA可以插入。例子包括ZAP Express[Strategies， 5，58(1992)]，pBluescript IISK(+)[Nucleic Acids Research(核酸研究)， 17，9494(1989)]，λzapII(Stratagene生产)，λgt10和λgt11[DNA Cloning，A Practical Approach，I，49(1985)]，Lambda BlueMid(CLONTECH生产)，λExCell和PT7T318U(Pharmacia生产)，pcD2[Mol Cell Biol.， 3，280(1983)]，pUC18[Gene(基因)， 33，103(1985)]等。
作为噬菌体或质粒载体构建的cDNA文库导入的大肠杆菌，可以使用任何的大肠杆菌，只要cDNA文库可以导入，表达和维持。例子包括XL1-Blue MRF[Strategies， 5，58(1992)]，C600[Genetics(遗传学)，39，440(1954)]，Y1088和Y1090[Science(科学)，222， 778(1983)]，NM522[J Mol.Biol.(分子生物学杂志)， 166，1(1983)]，K802[J Mol.Biol.(分子生物学杂志)， 16 118(1966)]，JM105[Gene (基因)， 38，275(1985)]等。
作为从cDNA文库中选择编码来源于非人动物的抗体的H链和L链V区的cDNA克隆的方法，可以使用利用同位素或荧光标记探针的克隆杂交或噬菌斑杂交(Molecular Cloning(分子克隆)，第二版，ColdSpring Harbor Lab.Press(冷泉港实验室出版)New York，1989)。可以通过制备引物和进行聚合酶链式反应(以下称为“PCR”，MolecularCloning(分子克隆)，第二版，Cold Spring Harbor Lab.Press(冷泉港实验室出版)New York，1989，Current Protocols in Molecular.Biology(现代分子生物学实验方法)，增刊1-34)，使用由mRNA合成的cDNA或cDNA文库作为模板，制备编码H链和L链的cDNA。
cDNA的核苷酸序列可以通过用合适的限制性内切酶消化所选的cDNA，然后把片段克隆进入质粒例如pBluescript SK(-)(Stratagene生产)，进行常用的核苷酸序列分析方法，例如Sanger等人的双脱氧法[Proc.Natl.Acad.Sci.(美国科学院院报)USA， 74，5463(1977)的反应，然后使用自动核苷酸序列分析仪例如A.L.F.DNA测序仪(Pharmacia生产)分析克隆。
获得的cDNA是否编码含有分泌信号序列的抗体H链和L链V区的全长氨基酸序列，可以从确定的核苷酸序列推导出H链和L链的V区的全长氨基酸序列，并且与已知抗体的H链和L链的V区的全长氨基酸序列[Sequences of proteins of Immunological Interest，US Dep.Health and Human Services(具有免疫学重要性的蛋白质的序列，美国，健康与人类服务进展)(1991)]比较加以确定。
而且，当抗体可变区的氨基酸序列或编码可变区的DNA的核苷酸序列是已知时，可以根据以下方法制备cDNA。
当氨基酸序列已知时，氨基酸序列基于密码子选择的频率转化为DNA序列[Sequences of proteins of Immunological Interest，US Dep.Health and Human Services(1991)(具有免疫学重要性的蛋白质的序列，美国，健康与人类服务进展)]，基于设计的DNA序列合成几种长度约100个碱基的DNA，使用此DNA进行PCR，制备cDNA。当核苷酸序列已知时，基于设计的DNA序列合成几种长度约100个碱基的DNA，使用DNA进行PCR，制备cDNA。
(3)来源于非人动物的抗体的V区的氨基酸序列分析
关于包括分泌信号序列的抗体的H链和L链的V区的全长氨基酸序列，分泌信号序列和N-端氨基酸序列的长度可以推导出来，通过把它们与已知抗体的H链和L链的V区的全长氨基酸序列[Sequences ofproteins of Immunological Interest，US Dep.Health and Human Services(具有免疫学重要性的蛋白质的序列，美国，健康与人类服务进展)(1991)]加以比较，可以发现它们所属的亚群。另外，可以通过把它们与已知抗体的H链和L链的V区的氨基酸序列[Sequences of proteins ofImmunological Interest，US Dep.Health and Human Services(具有免疫学重要性的蛋白质的序列，美国，健康与人类服务进展)(1991)]加以比较，也可发现H链和L链的V区的每个CDR的氨基酸序列。
(4)表达人嵌合抗体的载体的构建
表达人嵌合抗体的载体的构建，如条目3(1)中描述的，通过在人源化抗体表达的载体中，把编码来源于非人动物的抗体的H链和L链的V区的cDNA克隆进入编码人抗体的H链和L链的C区的基因的上游。例如，表达人嵌合抗体的载体可以通过把编码来源于人类动物的抗体的H链和L链的V区的每个cDNA，与合成的DNA加以连接构建，此处合成的DNA包括来源于非人动物的抗体的H链和L链的V区的3’-末端核苷酸序列，人抗体的H链和L链的C区的5’-末端核苷酸序列，并且在两个末端都有合适的限制性内切酶识别位点，和把它们克隆到载体中含有的编码人抗体的H链和L链的C区的基因的上游，此载体是如条目3(1)所描述构建的适合表达的人源化抗体的表达载体。
(5)编码人CDR-移植抗体V区的cDNA的构建
编码人CDR-移植抗体H链和L链的V区的cDNA可以如以下获得。首先，选择用于移植来源于非人动物的抗体的H链和L链的V区的CDR的人抗体的H链和L链的V区的框架(以下称为“FR”)的氨基酸。作为人抗体H链和L链V区FR的氨基酸序列，任何氨基酸都可以使用，只要它们来源于人抗体。例子包括数据库，例如蛋白质数据库中登记的人抗体H链和L链V区FR的氨基酸序列，通常人抗体H链和L链V区FR的每个亚群的氨基酸序列[Sequences of proteins ofImmunological Interest，US Dep.Health and Human Services(具有免疫学重要性的蛋白质的序列，美国，健康与人类服务进展)(1991)]等。为了制备有效活性的人CDR-移植抗体，优选的选择与来源于非人动物的目的抗体的H链和L链的V区的氨基酸序列同源性尽可能高的氨基酸序列(至少60％或更多)。
然后，来源于非人动物的目的抗体的H链和L链的V区的CDR氨基酸序列，移植到选择的人抗体的H链和L链的V区的FR氨基酸序列，设计人CDR-移植抗体H链和L链V区的氨基酸序列。考虑抗体基因核苷酸序列中发现的密码子选择的频率，把设计的氨基酸序列转变为DNA序列[Sequences of proteins of Immunological Interest，USDep.Health and Human Services(具有免疫学重要性的蛋白质的序列，美国，健康与人类服务进展)(1991)]，设计编码人CDR-移植抗体H链和L链V区氨基酸序列的DNA序列。以设计的DNA序列为基础，合成几种长度约100个碱基的合成DNA，使用它们进行PCR。在此情况下，考虑到PCR的反应效率和可以合成的DNA的长度，每种H链和L链优选设计4到6种合成DNA。
而且，通过把合适的限制性内切酶的识别位点导入存在于合成DNA的两个末端的5’-端，合成DNA可以容易的克隆进入在条目3(1)中构建的，用于人源化抗体表达的载体中。PCR后，扩增的产物克隆进入质粒例如pBluescript SK(-)(Stratagene生产)或相似的质粒，通过条目3(2)中的方法确定核苷酸序列，获得含有编码需要的人CDR-移植抗体的H链和L链的V区的氨基酸序列的DNA序列的质粒。
(6)构建用于人CDR-移植抗体表达的载体
通过把编码条目3(5)中构建的人CDR-移植抗体H链和L链的V区的cDNA克隆进入编码条目3(1)中描述的用于人源化抗体表达的载体中的人抗体的H链和L链的C区基因的上游，构建用于人CDR-移植抗体表达的载体。例如，通过在条目3(5)中进行PCR构建H链和L链的V区时，把合适的限制性内切酶识别序列导入所用的合成的DNA片段两个末端的5’-末端中，这样人CDR-移植抗体H链和L链的V区cDNA可以克隆进入如条目3(1)中描述的用于人源化抗体表达的载体中编码人抗体的H链和L链的C区的基因的上游，以这样的方式它们可以以合适的方式表达。
(7)稳定产生人源化抗体
通过把条目3(4)或(6)中描述的表达人源化抗体的载体导入合适的动物细胞，能获得稳定产生人嵌合抗体和人CDR-移植抗体(在下文中两者都称为“人源化抗体”)的转化体。
把表达人源化抗体的载体导入细胞的方法包括电穿孔[日本公开的审查的专利申请257891/90号，Cytotechnology(电穿孔)， 3，133(1990)]等。
作为表达人源化抗体的载体导入的动物细胞，可以使用任何细胞，只要是可以产生人源化抗体的动物细胞。
例子包括小鼠骨髓瘤细胞，例如NS0细胞和SP2/0细胞，中国仓鼠卵巢细胞，例如CHO/dhfr-细胞和CHO/DG44细胞；大鼠骨髓瘤细胞，例如YB2/0细胞和IR983F细胞；来源于叙利亚仓鼠肾的BHK细胞；人骨髓瘤细胞例如Namalwa细胞等。优选中国仓鼠卵巢细胞CHO/DG44细胞和大鼠骨髓瘤细胞YB2/0细胞。
导入表达人源化抗体的载体后，根据日本公开的审查的专利申请号257891/90中公开的方法，使用用于动物细胞培养的含有例如G418硫酸盐(以下称为“G418”，由SIGMA制备)的培养基，选择能够稳定产生人源化抗体的转化体。作为动物细胞培养的培养基，可以提及的是RPMI 1640培养基(Nissui Pharmaceutical生产)，GIT培养基(NihonPharmaceutical生产)，EX-CELL 302培养基(JRH生产)，IMDM培养基(GIBCO BRL生产)，Hybridoma-SFM培养基(GIBCO BRL生产)，往这些培养基中加入多种添加剂例如胎牛血清(以下称为“FCS”)获得的培养基等。通过在培养基中培养获得的转化体，在培养基中产生和积累人源化抗体。培养基中人源化抗体的产生和抗原结合活性可以用例如酶联免疫吸附试验[以下称为“ELISA”，Antibodies：A LaboratoryManual(实验手册)，Cold Spring Harbor Laboratory，第14章(1998)，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，Academic Press(美国学术出版社)Limited(1996)]等方法测定。而且，根据日本公开的审查的专利申请257891/90号中公开的方法，使用DHFR基因扩增系统，可以使通过转化体产生人源化抗体的产量增加。，
使用蛋白A柱[Antibodies：A Laboratory Manual(抗体：实验手册)Cold Spring Harbor Laboratory(冷泉港实验室)，第8章(1988)，Monoclonal Antibodies Principles and Practice(单克隆抗体：原理于实践)，Academic Press(美国学术出版社)Limited(1996)]，从转化体的培养基上清中纯化人源化抗体。另外，也可以使用一般用于纯化蛋白质的纯化方法。例如，通过凝胶过滤，离子交换层析，超滤相结合进行提纯。能够分别测定纯化的人源化抗体的H链，L链和整体抗体分子的分子量，例如，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳[以下称为“SDS-PAGE”，Nature (自然)， 227，680(1970)]，免疫印迹法[Antibodies A LaboratoryManual(抗体：实验手册)，Cold Spring Harbor Laboratory(冷泉港实验室)，第12章(1988)，Monoclonal Antibodies：Principles and practice(单克隆抗体；原理于实践)，Academic Press(美国学术出版社)Limited(1996)]等。
所以，使用动物细胞作为宿主制备抗体组合物的方法已有描述，但是，如以上所描述，抗体组合物也可以通过用如动物细胞的相同方法，用酵母，昆虫细胞，植物细胞，动物个体或植物个体制备。
当宿主细胞有表达抗体分子的能力时，本发明的抗体组合物可以通过用条目1中描述的方法制备表达抗体分子的细胞，培养细胞，然后从所得培养基中纯化目的抗体组合物制备。
4.抗体组合物的活性测定
作为测定纯化的抗体组合物的蛋白质的量，纯化抗体组合物与抗原结合的活性和效应子功能的方法，可以使用Monoclonal Antibodies，Antibody Engineering(单克隆抗体：原理于实践)等中描述的已知方法等。
例如，当抗体组合物是人源化抗体时，与抗原结合的活性和与抗原-阳性培养细胞系结合的活性可以用例如ELISA和免疫荧光方法[， 36，373(1993)]测定。对抗原-阳性细胞系的细胞毒活性可以通过测定CDC活性，ADCC活性[Cancer Immunol Immunother.(癌症免疫治疗)， 36，373(1993)]等进行测定。
而且，抗体组合物在人中的安全性和治疗效果可以使用合适的与人近似的动物种类模型，例如食蟹猴评价。
5.抗体组合物中糖链的分析
在各种细胞中表达的抗体分子的糖链结构可以根据糖蛋白的糖链结构的一般分析进行分析。例如，结合于IgG分子的糖链包括中性糖链例如半乳糖，甘露糖或岩藻糖，氨基糖例如N-乙酰氨基葡萄糖，酸性糖例如唾液酸，可以通过例如使用糖组合物分析糖链结构，二维糖链图谱等方法分析。
(1)中性糖和氨基糖成分的分析
抗体组合物的糖链可以通过把糖链用酸例如三氟乙酸酸解，释放出中性糖和氨基糖，测定组合物比率来分析。
例子包括使用由Dionex生产的糖组合物分析仪(BioLC)的方法。BioLC是一种用HPAEC-PAD(高效阴离子交换色谱法脉冲电流测定)[J Liq.Chromatogr.(液相色谱杂志)， 6，1577(1983)]分析糖组合物的仪器。
组合物的比率也可以用使用2-氨基吡啶的荧光标记法分析。具体的，把酸解过的样品用2-氨基吡啶化的荧光标记，然后HPLC分析组合物，组合物的比率可以根据已知方法[Agric.Biol Chem.(农业生物化学)， 55(1)，283-284(1991)]计算，
(2)糖链结构的分析
抗体分子的糖链结构可以用二维糖链图谱法分析[Anal Biochem.(农业生物化学)， 171，73(1988)，Biochemical Experimentation Methods23-Methods for.Studying Glycoprotein Sugar Chains(生物化学实验方法23-研究糖蛋白糖链的方法)(Japan Scientific Societies Press(日本科学学会出版))由Reiko Takahashi编辑(1989)]。二维糖链图谱法是通过，例如，分别用反相色谱法得到的糖链的滞留时间或洗脱位置作为X轴，正相色谱法得到的糖链的滞留时间或洗脱位置作为y轴，把它们与已知糖链的结果相比较，从而推导糖链结构的方法。
具体的，把抗体肼解，糖链从抗体释放出来，释放的糖链用2-氨基吡啶(以下称为“PA”)荧光标记[J.Biocbcni.， 95，197(1984)]，然后糖链通过凝胶过滤，和反相色谱，从过量PA-处理试剂中分离出来。然后，分离的糖链的每个峰经正相色谱法分离。通过把得到的结果标绘在二维糖链图谱上，把它们与糖链标准点(由Takara Slluzo绘制)或文献[Anal Biochem.， 171，73(1988)]比较推导出糖链结构。
通过二维糖链图谱方法推导出的结构可以进一步用质谱法，例如每个糖链的MALDI-TOF-MS确证。
6.识别抗体分子糖链结构的免疫测定法
抗体组合物包括不同的抗体分子，其中结合于抗体Fc区的糖链在结构上是不同的。在本发明的抗体组合物中，在总的与抗体组合物Fc区结合的N-糖苷键合的复合糖链中，岩藻糖不与糖链中的N-乙酰氨基葡萄糖还原性末端结合的糖链的比率是20％或更多，抗体组合物有有效的ADCC活性。抗体组合物可以用条目5中描述的分析抗体分子的糖链结构的方法鉴定。抗体组合物也可以用利用凝集素的免疫测定法鉴定。
根据已知的免疫测定方法，例如Monoclonal Antibodies：Principlesand Applications(单克隆抗体：原理与应用)，Wiley-Liss，Inc.(1995)，Immunoassay，第三版.，Igakushoin(1 987)，Enzyme Antibody Method(酶抗体方法)，修订版，Gakusai Kikaku(1985)中描述的Western染色法，IRA(放射免疫测定)，VIA(病毒免疫测定)，EIA(酶免疫测定)，FIA(荧光免疫测定)和MIA(金属免疫分析)等方法，抗体分子的糖链结构可以用使用凝集素的免疫测定法鉴定。
标记识别抗体组合物中包含的抗体分子的糖链结构的凝集素，标记的凝集素与抗体组合物反应作为样本。然后，测定标记的凝集素与抗体分子的复合物的量。
鉴定抗体分子的糖链结构的凝集素包括WGA(来源于百里香属(T.vulgaris)的麦胚凝集素)、ConA(来源于矮生刀豆(C.ensiformis)的cocanavalin A)、RIC(来源于R.communis的毒素)、L-PHA(来源于白花夏枯草(P.vulgaris)的白细胞凝集素)、LCA(来源于小扁豆(L.culinaris)的扁豆凝集素)、PSA(来源于豌豆(P.sativum)的豌豆凝集素)、AAL(橙黄网胞盘菌(Aleuria aurantia)凝集素)、ACL(苋属caudatus凝集素)、BPL(红花羊蹄甲(Bauhinia purpurea)凝集素)、DSL(曼陀罗属曼陀草凝集素)、DBA(扁豆属biflorus凝集素)、EBL(接骨木果balk凝集素)、ECL(刺桐属cristagalli凝集素)、EEL(卫矛属eoropaeus凝集素)、GNL(雪花莲属雪花莲胺凝集素)、GSL(Griffoonia simplicifolia凝集素)、HPA(盖罩大蜗牛(Helix pomatia)凝集素)、HHL(星花属hybrid凝集素)、Jacalin、LTL(百脉根属tetragonolobus凝集素)、LEL(番茄属esculentum凝集素)、MAL(Maackia amurensis凝集素)、MPL(桑橙(Maclura pomifera)凝集素)、NPL(喇叭水仙.(Narcissus pseudonarcissus).凝集素)、PNA(花生凝集素)、E-PHA(云豆(Phaseolus vulgaris)erythroagglutinin)、PTL(Psophocarpus tetragonolobus凝集素)、RCA(蓖麻(Ricinus communis)凝集素凝集素)、STL(马铃薯(Solanum tuberosum)凝集素)、SJA(槐属山茶(Sophora japonica)凝集素)、SBA(大豆凝集素)、UEA(荆豆(Ulex europaees)凝集素)、VVL(蚕豆(Vicia villosa)凝集素)和WFA(Wisteria floiybunda凝集素)。
优选的使用特异性识别岩藻糖与N-糖苷键合的复合糖链还原性末端的N-乙酰氨基葡萄糖结合的糖链结构的凝集素。例子包括Lensculinaris凝集素LCA(来源于Lens culinaris的扁豆凝集素)，豌豆凝集素PSA(来源于Pisum sativum的豌豆凝集素)，蚕豆凝集素VFA(来源于Vicia faba的凝集素)和橙黄网胞盘菌凝集素AAL(来源于Aleuriaaurantia的凝集素)。
7.本发明的抗体分子的应用
因为本发明的抗体组合物与CD20特异性结合，有有效的抗体依赖性细胞介导的细胞毒活性，所以可用于预防和治疗不同的与CD20-表达细胞相关的疾病，例如癌症。
关于癌症，即恶性肿瘤，癌细胞生长例如，特别是B细胞淋巴瘤中B细胞异常生长。一般的抗肿瘤试剂抑止癌细胞的生长。相反的，抗体有有效的抗体依赖性细胞介导的细胞毒活性，通过它的细胞杀伤作用，杀死癌细胞而治愈癌症，所以，抗体作为表达antingen的治疗试剂比一般的抗肿瘤试剂有效。特别的，在癌症治疗试剂中，单独的抗体药剂的抗肿瘤效果目前还是不足的，所以，进行与化疗结合的治疗[Science(科学)， 280，1197(1998)]。假如单独通过本发明的抗体组合物发现更有效的抗肿瘤效果，对化疗的依赖性将会降低，副作用会减少。
本发明的抗体组合物可以作为单独的治疗试剂给药。通常，优选的是抗体组合物与至少一种药学可接受的载体混合，把它作为药学配方，用制备药学的技术领域中已知的合适方法制备。
优选的是选择治疗中最有效的给药途径。例子包括口服、非肠道给药，例如口腔的、气管的、直肠的、皮下的、肌肉的、静脉内的施用。在抗体制备中，静脉内施用是优选的。
剂形包括喷雾、胶囊、片剂、颗粒、糖浆、乳剂、栓剂、注射剂、软膏剂、粘膏剂等。
合适于口服的药学制剂的例子包括乳剂、糖浆、胶囊、片剂、粉末、颗粒等等。
液体制剂，例如乳剂和糖浆，可以用如添加剂、水；糖例如蔗糖、山梨醇和果糖；二元醇例如聚乙二醇和丙二醇；油例如芝麻油、橄榄油和豆油；防腐剂例如p-对羟基苯甲酸酯；香料例如草莓香料和薄荷等制备。
胶、片剂、粉末、颗粒等可以用添加剂，赋形剂例如乳糖、葡萄糖、蔗糖和甘露醇；分解剂例如淀粉和精氨酸钠；润滑剂例如硬脂酸镁和滑石；粘合剂例如聚乙烯醇、羟丙纤维素和明胶，表面活性剂例如脂肪酸酯，可塑剂例如丙三醇制备。
适合非肠道给药的药学制剂包括注射剂、栓剂、喷雾剂等等。
注射剂可以使用载体例如盐溶液、葡萄糖溶液或它们的混合物等等。粉末注射剂可以用常规方法制备的冷冻干燥的抗体组合物，往其中加入氯化钠制备。
栓剂可以使用载体，例如可可脂、氢化脂或羧酸制备。
喷雾也可以使用这样的抗体组合物或使用不刺激患者口腔或气管粘膜，并且通过把它分散成细颗粒而促进抗体组合物吸收的载体制备。
载体包括乳糖、甘油等。根据抗体组合物和载体的性质，可以制备药学制剂例如喷雾剂和干粉。另外，作为口服制剂的添加剂例子的成分也可以添加到非肠道的制剂中。
虽然临床剂量或施用频率根据目的治疗效果、施用方法、治疗周期、年龄、体重等等不同，但是一般是10微克/千克到20微克/千克/天/人。
而且，作为检验抗体组合物对不同肿瘤细胞的抗肿瘤作用的方法，体外检验包括CDC活性检测方法、ADCC活性检测方法等；体内检验包括在实验动物例如小鼠中使用肿瘤系统的抗肿瘤实验等。
CDC活性和ADCC活性测定和抗肿瘤实验可以根据cancerImmunology Immunotherapy， 36，373(1993)；Cancer Research， 54，1511(1944)等中描述的方法进行。
本发明将根据实验例详细描述如下；然而，实验仅仅是本发明的简单说明，本发明的范围不受此限制。
附图简要说明
图1表示质粒pBS-2B8L的构建步骤。
图2表示质粒pBS-2B8Hm的构建步骤。
图3表示质粒pKANTEX2B8P的构建步骤。
图4表示使用免疫荧光方法，改变抗体浓度，纯化的抗-CD20嵌合抗体KM3065和RituxanTM与人CD20表达细胞，Raji细胞结合的活性测定结果。纵座标和横座标分别表示每个浓度的相对荧光强度和抗体浓度。“■”和“○”分别表示RituxanTM和KM3065的活性。
图5表示使用免疫荧光方法，纯化的抗-CD20嵌合抗体KM3065和RituxanTM与人CD20-阴性细胞，CCRF-CEM细胞结合的活性的测定结果。
图6表示纯化的抗-CD20嵌合抗体KM3065和RituxanTM对人CD20表达细胞的ADCC活性。在图6A，6B和6C中，使用Raji细胞，Ramos细胞和WIL2-S作为靶细胞。纵座标和横座标表示细胞毒活性和抗体浓度。“■”和“○”分别表示RituxanTM和KM3065的活性。
图7表示通过从纯化的抗-CD20嵌合抗体KM3065和RituxanTM制备PA-修饰的糖链，然后反相HPLC分析，获得的洗脱模式。纵座标和横座标分别表示相对荧光强度和洗脱时间。
图8表示质粒CHfFUT8-pCR2.1的构建。
图9表示质粒ploxPPuro的构建
图10表示质粒pKOFUT8gE2-1的构建。
图11表示质粒pKOFUT8gE2-2的构建。
图12表示质粒pscFUT8gE2-3的构建。
图13表示质粒pKOFUT8gE2-3的构建。
图14表示质粒pKOFUT8gE2-4的构建。
图15表示质粒pKOFUT8gE2-5的构建。
图16表示质粒pKOFUT8Puro的构建。
图17表示使用免疫荧光方法，改变抗体浓度，由凝集素抗性CHO/DG44细胞产生的抗-CD20嵌合抗体R92-3-1的结合活性测定结果。纵座标和横座标分别表示每个浓度的相对荧光强度和抗体浓度。“■”和“○”分别表示RituxanTM和R92-3-1的活性。
图18表示使用Raji细胞作为靶细胞，由凝集素抗性CHO/DG44细胞产生的抗-CD20嵌合抗体R92-3-1的ADCC活性测定结果。纵座标和横座标分别表示对靶细胞的细胞毒活性和抗体浓度。“■”和“○”分别表示RituxanTM和R92-3-1的活性。
图19表示由凝集素抗性CHO/DG44细胞产生的抗-CD20嵌合抗体R92-3-1制备的PA修饰的糖链，经过反相HPLC分析，获得的洗脱模式。纵座标和横座标分别表示相对荧光强度和洗脱时间。用例子3中的相同方式进行反相HPLC条件分析，鉴定糖链结构和计算不与α1，6-岩藻糖结合的糖链的比率。
图20表示通过把克隆34-2的5’-端导入来源于CHO细胞的GMDcDNA克隆22-8的5’-端而制备的质粒CHO-GMD的构建步骤。
图21表示对从三个抗-CD20嵌合抗体制备的PA修饰的糖链进行反相HPLC分析得到的洗脱模式。纵座标和横座标分别表示相对荧光强度和洗脱时间。用例子3中的相同方式进行反相HPLC条件分析，鉴定糖链结构和计算不与α1，6-岩藻糖结合的糖链的比率。
图22表示使用免疫荧光方法，改变抗体浓度时，CD20表达细胞对五种抗-CD20嵌合抗体的结合活性的测定结果，五种抗-CD20嵌合抗体有不同的与无α1，6-岩藻糖的糖链结合的比率。纵座标和横座标分别表示与CD20的结合活性和抗体浓度。“□”，“■”，“△”，“▲”和“○”分别表示抗-CD20嵌合抗体(96％)，抗-CD20嵌合抗体(44％)，抗-CD20嵌合抗体(35％)，抗-CD20嵌合抗体(26％)和抗-CD20嵌合抗体(6％)的活性。
图23表示有不同抗体分子比率的抗-CD20嵌合抗体的ADCC活性的测定结果，其中所述抗体分子的无α1，6-岩藻糖的糖链结合于WIL2-S细胞。表明使用供体A的效应细胞，用51Cr方法的测定结果。纵座标和横座标分别表示细胞毒活性和抗体浓度。“□”，“■”，“△”，“▲”和“○”分别表示抗-CD20嵌合抗体(96％)，抗-CD20嵌合抗体(44％)，抗-CD20嵌合抗体(35％)，抗-CD20嵌合抗体(26％)和抗-CD20嵌合抗体(6％)的活性。
图24表示有不同抗体分子比率的抗-CD20嵌合抗体的ADCC活性的测定结果，其中所述的抗体分子的无α1，6-岩藻糖的糖链结合于Raji细胞，。表明使用供体B的效应细胞，用LDH方法的测定结果。纵座标和横座标分别表示细胞毒活性和抗体浓度。“□”，“■”，“△”，“▲”和“○”分别表示抗-CD20嵌合抗体(96％)，抗-CD20嵌合抗体(44％)，抗-CD20嵌合抗体(35％)，抗-CD20嵌合抗体(26％)和抗-CD20嵌合抗体(6％)的活性。
图25表示用固定了含有bisecting GlcNAc的糖链有亲和力的凝集素的柱子，分离抗-CD20嵌合抗体KM3065，得到的洗脱模式。纵座标和横座标分别表示280nm时的吸光度和洗脱时间。①到④表示成分①到④的洗脱位置。
图26表示分离前，使用固定了对含有bisecting GlcNAc的糖链，和从抗-CD20嵌合抗体KM3065中制备的PA修饰的糖链有亲和力的凝集素的柱子，分离均通过反相HPLC分析获得的成分①到④得到的洗脱模式。左上方的图，右上方的图，左中的图，右中的图，左下的图分别表示分离前的KM3065，成分①，成分②，成分③，成分④的洗脱模式。纵座标和横座标分别表示相对荧光强度和洗脱时间。图中，用黑色打出的峰表示来源于抗体的PA修饰的糖链，“*”表示含有bisectingGlcNAc的PA修饰的糖链。
图27表示分离前，用固定了含有bisecting GlcNAc的糖链有亲和力的凝集素，和抗-CD20嵌合抗体KM3065的柱子分离的成分①到④，对Raji细胞的ADCC活性。表明使用来源于健康供体的效应细胞，用LDH方法测定的结果。纵座标和横座标分别表示细胞毒活性和抗体浓度。“●”，“○”，“△”，“◇”，“◆”，“□”和“×”表示分离前的KM3065，成分①，成分②，成分③，成分④，RituxanTM和不加抗体情况下的活性。
本发明的实施方式
实施例1
制备抗-CD20人嵌合抗体
1、制备表达人嵌合抗体的抗-CD20载体
(1)构建编码抗-CD20鼠单克隆抗体的L链V区的cDNA
编码WO 94/11026中描述的抗-CD20鼠单克隆抗体2B8的L链V区(以下称为“VL”)的氨基酸序列的cDNA(由SEQ ID NO：11代表)，如以下使用PCR构建。
首先，PCR时用于扩增的引物核苷酸序列和用于克隆进入人源化抗体表达载体的限制性内切酶识别序列结合，加到WO 94/11026中描述的VL的核苷酸序列的5’-端和3’-端。设计的核苷酸序列从5’-端分为总共6个核苷酸序列，每个有大约100个碱基(设计相邻的核苷酸序列，这样它们的末端有大约20个碱基的重叠)，6个合成的DNA片段，现在用SEQ ID NO：15，16，17，18，19和20来代表，用有义链和反义链交替制备这6个DNA片段(委托给GENSET)。
每种寡核苷酸加入到50微升反应混合物中[KOD DNA聚合酶-连接的PCR缓冲液#1(TOYOBO生产)，0.2毫摩尔dNTP，1毫摩尔氯化镁，0.5微摩尔M13引物M4(Takara Shuzo生产)和0.5微摩尔M13引物RV(Takara Shuzo生产)]，最终浓度为0.1微摩尔，使用DNA热循环仪GeneAmp PCR系统9600(Perkin Elmer生产)，94℃加热3分钟进行反应，往反应混合物中加入2.5单位KOD DNA聚合酶(TOYOBO生产)，然后进行25个循环，每循环为94℃加热30秒，55℃加热30秒，74℃1分钟。然后72℃加热10分钟。25微升反应混合物琼脂糖凝胶电泳后，使用QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGN生产)回收大约0.44kb的VL的PCR产物。
接着，用限制性内切酶SmaI(Takara Shuzo生产)消化质粒pBluescript II SK(-)(Stratagene生产)，获得大约0.1微克的DNA产物，以上获得的大约0.1微克的PCR产物加到无菌水中，调节总体积到7.5微升，然后加入7.5微升TAKARA连接试剂盒ver.2(TakaraShuzo生产)的溶液I，和0.3微升限制性内切酶SmaI(Takara Shuzo生产)，22℃反应2小时。使用用这种方式获得的重组质粒DNA溶液转化E.coli DH5α(TOYOBO生产)。从转化体克隆中制备出每种质粒DNA，，使用BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction试剂盒v2.0(Applied Biosystems生产)，根据所附的指导进行反应，然后用同一公司生产的DNA测序仪ABI PR1SM 377分析核苷酸序列。用这种方式，获得图1中所示的有目的核苷酸序列的质粒PBS-2B8L。
(2)构建编码抗-CD20鼠单克隆抗体的H链V区的cDNA
编码WO 94/11026中描述的抗-CD20鼠单克隆抗体2B8的H链V区(以下称为“VH”)的氨基酸序列的cDNA(由SEQ ID NO：13代表)，如以下使用PCR构建。
首先，PCR时用于扩增的引物核苷酸序列和用于克隆进入人源化抗体表达载体的限制性内切酶识别序列结合，加到WO 94/11026中描述的VH的核苷酸序列的5’-端和3’-端。设计的核苷酸序列从5’-端分为总共6个核苷酸序列，每个有大约100个碱基(设计相邻的核苷酸序列，这样它们的末端有大约20个碱基的重叠)，6个合成的DNA片段，现在用SEQ ID NO：25，26，27，28，29和30来代表，用有义链和反义链交替制备这6个DNA片段(委托给GENSET)。
每种寡核苷酸加入到50微升反应混合物中[KOD DNA聚合酶-PCR缓冲液#1(TOYOBO生产)，0.2毫摩尔dNTP，1微摩尔氯化镁，0.5毫摩尔M13引物M4(Takara Shuzo生产)和0.5微摩尔M13引物RV(Takara Shuzo生产)]，最终浓度为0.1微摩尔，使用DNA热循环仪GeneAmp PCR系统9600(Perkin Elmer生产)，94℃加热3分钟进行反应，往反应混合物中加入2.5单位KOD DNA聚合酶(TOYOBO生产)，然后进行25个循环，每循环为94℃加热30秒，55℃加热30秒，74℃1分钟。然后72℃加热10分钟。25微升反应混合物琼脂糖凝胶电泳后，使用QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGN生产)回收大约0.49kb的VH的PCR产物。
接着，用限制性内切酶SmaI(Takara Shuzo生产)消化质粒pBluescript II SK(-)(Stratagene生产)，获得大约0.1微克的DNA片段，以上获得的大约0.1微克的PCR产物加到无菌水中，调节总体积到7.5微升，然后加入7.5微升TAKARA连接试剂盒ver.2(TakaraShuzo生产)的溶液I，和0.3微升限制性内切酶SmaI(Takara Shuzo生产)，然后22℃反应过夜。
使用用这种方式获得的重组质粒DNA溶液转化E.coli DH5α(TOYOBO生产)。从转化体克隆中制备出每种质粒DNA，使用BigDyeTerminator Cycle Sequencing Ready Reaction试剂盒v2.0(AppliedBiosystems生产)，根据所附的产品说明进行反应，然后用同一公司生产的DNA测序仪ABI PR1SM 377分析核苷酸序列。用这种方式，获得图2中所示的有目的核苷酸序列的质粒PBS-2B8H。
然后，为了把位置14的氨基酸由Ala取代为Pro，设计如SEQ IDNO：31所示的合成的DNA。使用如下的对于pBluescript 11(TakaraShuzo生产)的LA PCR体外诱变引物组，通过PCR进行碱基取代。制备50微升含有1纳克质粒PBS-2B8H的反应混合物[LA PCR缓冲液II(Takara Shuzo生产)，2.5单位TaKaRa LA Taq，0.4毫摩尔dNTP，2.5毫摩尔氯化镁，50纳摩尔T3 BcaBEST测序引物(Takara Shuzo生产)和50纳摩尔诱变引物(SEQ ID NO：31，GENSET生产)]后，使用DNA热循环仪GeneAmp PCR系统9600(Perkin Elmer生产)进行25个循环的PCR，每个循环为94℃加热30秒，55℃2分钟，74℃1.5分钟。30微升反应混合物琼脂糖凝胶电泳后，使用QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGN生产)回收大约0.44kb的PCR产物，制成30微升的水混合物。用同样方式，用50微升含有1纳克质粒PBS-2B8H的反应混合物[LA PCR缓冲液II(Takara Shuzo生产)，2.5单位TaKaRa LATaq，0.4毫摩尔dNTP，2.5毫摩尔氯化镁，50纳摩尔T3 BcaBEST测序引物(Takara Shuzo生产)和50纳摩尔MUT B1引物(由Talcara Shuzo制备)进行PCR。30微升反应混合物琼脂糖凝胶电泳后，使用QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGN生产)回收大约0.63kb的PCR产物，制成30微升的水溶液。然后，这样获得的0.44kb PCR产物和0.63kb PCR产物各0.5微升加入到47.5微升反应混合物中[LA PCR缓冲液II(Takara Shuzo生产)，0.4毫摩尔dNTP，和2.5毫摩尔氯化镁]，使用DNA热循环仪GeneAmp PCR系统9600(Perkin Elmer生产)，通过把反应混合物90℃加热10分钟，冷却到37℃60分钟，然后保持在37℃15分钟退火此DNA。加入2.5单位TaKaRa LA Taq(Takara Shuzo生产)72℃反应3分钟后，往其中加入每种T3 BcaBEST测序引物(Takara Shuzo生产)和T7 BcaBEST测序引物(Takara Shuzo生产)10皮摩尔，使反应混合物的体积到50微升，进行10个循环，每个循环为94℃加热30秒，55℃2分钟，75℃1.5分钟。25微升反应混合物使用QIAquick PCR纯化试剂盒(由QIAGEN制备)纯化后，它的一半体积使用10个单位的限制性内切酶KpnI(Takara Shuzo生产)和10个单位的限制性内切酶SacI(Takara Shuzo生产)37℃反应1小时。反应混合物使用琼脂糖凝胶电泳分离，回收大约0.59kb的Kpnl-Sacl片段。
然后，1微克pBluescript II SK(-)  (Stratagene生产)用10个单位的限制性内切酶KpnI(Takara Shuzo生产)和10个单位的限制性内切酶SacI(Takara Shuzo生产)37℃反应1小时，然后反应混合物琼脂糖凝胶电泳，回收大约2.9kb的KpnI-SacI片段。
这样获得的来源于PCR产物的KpnI-SacIl片段和来源于质粒pBluescript II SK(-)的KpnI-SacI片段，使用DNA连接试剂盒Ver.2(Takara Shuzo生产)的溶液1，根据所附产品说明进行连接。使用用这种方式获得的重组质粒DNA溶液转化E.coli DH5α(TOYOBO生产)。从转化体克隆中制备每种质粒DNA，使用BigDye Terminator CycleSequencing Ready Reaction试剂盒v2.0(Applied Biosystems生产)，根据产品说明进行反应，然后用同一公司生产的DNA测序仪ABIPRlSM 377分析核苷酸序列。
用这种方式，获得图2中所示的含有目的核苷酸序列的质粒PBS-2B8Hm。
(3)构建表达人嵌合抗体的抗-CD20载体
通过使用表达人源化抗体的载体pKANTEX93(Mol Immunol.， 37，1035，2000)和实施例1的条目1(1)和(2)中获得的质粒pBS-2B8L和pBS-2B8Hm，如下构建抗-CD20人嵌合抗体(以下称为“抗-CD20嵌合抗体”)表达载体pKANTEX2B8P。
2微克在实施例1的条目1(1)中获得的质粒pBS-2B8L使用10个单位的限制性内切酶BsiwI(New England Biolabs生产)55℃反应1小时后，使用10个单位的限制性内切酶EcoRI(Takara Shuzo生产)37℃反应1小时。反应混合物使用琼脂糖凝胶电泳分离，回收大约0.41kb的BsiWI-EcoRI片段。
然后，2微克表达人源化抗体的载体pKANTEX93，使用10个单位的限制性内切酶BsiwI(New England Biolabs生产)55℃反应1小时后，使用10个单位的限制性内切酶EcoRI(Takara Shuzo生产)37℃反应1小时。反应混合物使用琼脂糖凝胶电泳分离，回收大约12.75kb的BsiWI-EcoRI片段。
然后，获得的来源于质粒pBS-2B8L的BsiWI-EcoRI片段和来源于质粒pKANTEX93的BsiWI-EcoRI片段使用DNA连接试剂盒Ver.2(Takara Shuzo生产)的溶液1，根据产品说明反应进行连接。使用用这种方式获得的重组质粒DNA溶液转化E.coli DH5α(TOYOBO生产)，获得如图3所示的质粒pKANTEX2B8-L。
然后，2微克在实施例1的条目1(2)中获得的质粒pBS-2B8Hm使用10个单位的限制性内切酶ApaI(Takara Shuzo生产)37℃反应1小时，然后使用10个单位的限制性内切酶NotI(Takara Shuzo生产)37℃反应1小时。反应混合物使用琼脂糖凝胶电泳分离，回收大约0.45kb的ApaI-NotI片段。
然后，3微克质粒pKANTEX2B8-L使用10个单位的限制性内切酶ApaI(Takara Shuzo生产)37℃反应1小时，然后使用10个单位的限制性内切酶NotI(Takara Shuzo生产)37℃反应1小时。反应混合物使用琼脂糖凝胶电泳分离，回收大约13.16kb的ApaI-NotI片段。
然后，获得的来源于质粒pBS-2B8Hm的ApaI-NotI片段和来源于pKANTEX2B8-L的ApaI-NotI片段使用DNA连接试剂盒Ver.2(Takara Shuzo生产)的溶液1，根据产品说明进行连接。使用用这种方式获得的重组质粒DNA溶液转化Ecoli DH5α(TOYOBO生产)，从转化克隆中制备每种质粒DNA。
获得质粒的核苷酸序列用BigDye Terminator Cycle SequencingReady Reaction试剂盒v2.0(Applied Biosystems生产)和同一公司的DNA测序仪377分析，确认获得在图3中所示的克隆有目的DNA的质粒pKANTEX2B8P。
2.使用动物细胞稳定表达抗-CD20嵌合抗体
(1)使用大鼠骨髓瘤YB2/0细胞制备生产细胞
使用抗-CD20嵌合抗体表达载体，实施例1的条目1(3)中获得的pKANTEX2B8P，在动物细胞中如下的表达抗-CD20嵌合抗体。
10微克质粒pKANTEX2B8P通过电穿孔[Cytotechnology(电穿孔)，3，133(1990)]导入4×106大鼠骨髓瘤细胞系YB2/0细胞(ATCC CRL1662)后，细胞悬浮在40毫升H-SFM培养基(GIBCO-BRL生产，添加了5％胎牛血清(FCS)中，200微升/孔分配在96孔微量滴定板(Sumitomo Bakelite生产)中。5％CO2培养箱中37℃培养24小时后，加入G418至终浓度为1毫克/毫升，然后培养1到2周。从转化体克隆表现出G418抗性，转化体变得汇合的孔中回收培养基上清，用实施例1中的条目2(2)描述的ELISA测定培养基上清中产生的人IgG抗体的量。
关于在培养基上清中发现人IgG抗体表达的孔中的转化体，为了增加抗体表达水平，使用dhfr基因扩增系统，转化体悬浮于含有1毫克/毫升G418和50纳摩尔作为dhfr基因产物二氢叶酸还原酶(以下称为“DHFR”)的抑制剂的氨甲蝶呤(以下称为“MTX”，由SIGMA制备)的H-SFM培养基中，密度为1到2×105细胞/毫升，悬浮液在24孔板(由Greiner)中每孔分配1毫升。5％CO2培养箱中37℃培养1到2周，诱导表现50纳摩尔MTX抗性的转化体。当转化体在孔中汇合时，用实施例1中的条目2(2)描述的ELISA测定培养基上清中产生的人IgG抗体的量。关于在培养基上清中发现人IgG抗体表达的孔中的转化体，MTX浓度增加到100纳摩尔，然后增加到200纳摩尔，用同样方法最后获得能在含1毫克/毫升G418和200纳摩尔MTX的H-SFM中生长，同时也可以高效表达抗-CD20嵌合抗体的转化体。得到的转化体通过有限稀释进行克隆，由此可以获得表达抗-CD20嵌合抗体的克隆KM3065。同样，使用WO 00/61739的实施例8中描述的α1，6-岩藻糖基转移酶的基因的转录产物的确定方法，选择产生相对低水平转录产物的细胞系，使用此细胞系作为合适的细胞系。
获得的产生抗-CD20嵌合抗体的转化体克隆KM3065已经在2001年12月21日保藏，作为国际专利生物保藏中心，独立行政法人产业技术综合研究所(AIST Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-ChomeTsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan)的FERN 7834。
(2)培养基上清中IgG抗体浓度的测定(ELISA)
羊抗人IgG(H&L)抗体(American Qualex生产)用磷酸缓冲剂生理盐水稀释(以下称为“PBS”)到浓度为1微克/毫升，50微升/孔分配到96孔ELISA板(Greiner生产)中，4℃吸附过夜。用PBS漂洗后，以100微升/孔加入含1％牛血清白蛋白(以下称为“BSA”，AMPC生产)的PBS(以下称为“1％BSA-PBS”)的，室温反应1小时，封闭剩余的活性基团。弃去1％BSA-PBS后，转化体的培养基上清和纯化的人嵌合抗体的不同稀释溶液以50微升/孔加入孔中，室温反应2小时。反应后，每孔用含0.05％Tween 20的PBS(以下称为“Tween-PBS”)漂洗，然后，往其中以50微升/孔加入过氧化酶标记的用1％BSA-PBS稀释3000倍的羊抗人IgG(H&L)抗体溶液(American Qualex生产)，作为二抗溶液，室温反应1小时。反应后，用Tween-PBS漂洗，ABTS底物溶液(把0.55克2，2’-azino-顺(3-乙基苯并二氢噻唑-6-磺酸)胺溶于1升0.1摩尔柠檬酸缓冲液(pH4.2)中，使用前加入1微升/毫升过氧化氢)以50微升/孔分配，用于显色，在415nm测定吸光度(以下称为“OD415”)。
3.从培养基上清中纯化抗-CD20嵌合抗体
在实施例1的条目2(1)中获得的能表达抗-CD20嵌合抗体的转化体细胞克隆KM3065悬浮于含有200纳摩尔MTX和5％of Daigo′sGF21(Wako Pure Chemical industries生产)的H-SFM(GIBCO-BRL生产)中，密度为1×105细胞/毫升，在182cm2的瓶(Greiner生产)中分装50毫升。细胞在5％CO2培养箱中37℃培养7天，当细胞汇合时回收培养基上清。使用Prosep-A(Millipore生产)柱，根据所附产品说明，从培养基上清中纯化抗-CD20嵌合抗体KM3065。根据已知方法[Nature(自然)， 227，680(1970)]，大约3微克获得的抗-CD20嵌合抗体KM3065经电泳检测其分子量和纯化程度。结果，纯化的抗-CD20嵌合抗体KM3065在非还原条件下大约为150千道尔顿(以下称为“Kd”)，在还原条件下观察到两条大约为50Kd和大约25Kd的带。蛋白质的大小与报道的相符，即IgG抗体在非还原条件下分子量大约为150Kd，在还原条件下由于切断分子间二硫键(以下称为“S-S键”)，形成分子量为50Kd的H链和分子量为25Kd的L链[Antibodies：A LaboratoryManual(实验手册)，Cold Spring Harbor Laboratory，第14章(1988)，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice(单克隆抗体：原理与应用)，Academic Press(美国学术出版社)Limited(1996)]，也几乎与RituxanTM的电泳形式相同，相应的，这证实抗-CD20嵌合抗体KM3065表达成正确结构的抗体分子。
实施例2
测定抗-CD20嵌合抗体活性：
1.抗-CD20嵌合抗体对表达CD20的细胞的结合活性(免疫荧光方法)
实施例1的条目3中获得的纯化的CD20嵌合抗体的结合活性，使用流式细胞分析仪用免疫荧光方法测定。人淋巴瘤细胞系，Raji细胞(JCRB 9012)，作为CD20-阳性细胞在96孔U型板(Falcon生产)中每孔分配2×105细胞。把抗-CD20嵌合抗体用FACS缓冲液(1％BSA-PBS，0.02％EDTA，0.05％NaN3)稀释，制成抗体溶液(浓度为0.039到40微克/毫升)，以50微升/孔加入96孔U型板，冰上反应30分钟。用200微升/孔FACS缓冲液漂洗两次后，把用FACS缓冲液稀释100倍制备的PE-标记的抗人IgG抗体(由Coulter制备)溶液以50微升/孔加入96孔U型板中，冰上避光反应30分钟，然后以200微升/孔漂洗三次，细胞最后悬浮于500微升混合液中，使用流式细胞分析仪测定荧光强度。结果在图4中表示。在KM3065和RituxanTM中都观察到抗体浓度依赖的荧光强度增强，这证实它们都表现出相同的结合活性。而且，通过调节抗体浓度到40微克/毫升，用同样的方式，观察到它们结合于CD20-阴性细胞，人CCRF-CEM细胞(ATCC CCL 119)的活性。结果在图5中表示。因为KM3065和RituxanTM都没有被结合，所以意味着KM3065特异性的结合CD20。
2.抗-CD20嵌合抗体体外细胞毒活性(ADCC活性)
为了测定实施例1的条目3中获得的纯化的CD20嵌合抗体的体外细胞毒活性，根据以下方法测定ADCC活性。
(1)制备靶细胞溶液
培养于RPMI1640-FCS(10)培养基(RPMI1640培养基(由GIBCOBRL制备)，含有10％FCS)中的人B淋巴细胞培养细胞系WIL2-S细胞(ATCC CRL8885)，Ramos细胞(ATCC CRL1596)或Raji细胞(JCRB9012)，用RPMI1640-FCS(5)培养基(RPMI1640培养基(GIBCOBRL生产)，含有5％FCS)通过离心和悬浮进行漂洗，然后通过加入RPMI1640-FCS(5)培养基调节到2×105细胞/毫升，作为靶细胞溶液。
(2)制备效应细胞溶液
从健康人中收集50毫升静脉血，加入0.5毫升肝素钠(ShimizuPharmaceutical生产)，轻轻混合。根据产品说明(800×g，20分钟)，使用Lymphoprep(AXIS SHIELD生产)，混合物离心分离出单核细胞层。用RPMI1640-FCS(5)培养基离心漂洗三次后，得到的沉淀用相同培养基重悬，得到密度为4×106细胞/毫升，作为效应细胞溶液。
(3)测定ADCC活性
往96孔U型底板的每一孔中分配50微升以上(1)中制备的靶细胞溶液(1×104细胞/孔)。然后，加入50微升以上(2)中制备的效应细胞溶液(2×105细胞/孔)，效应细胞与靶细胞比率为20∶1)。随后，往其中加入每种抗-CD20嵌合抗体，最终浓度从0.3到3000纳克/毫升，总体积达到150微升，然后37℃反应4小时。反应后，离心板，根据产品说明，使用CytoTox96非放射性细胞毒活性测定(Promega生产)，测定上清中的乳酸脱氢酶(LDH)活性，获得吸光度数据。除了分别单独使用培养基取代效应细胞与抗体溶液，单独使用培养基取代靶细胞溶液和抗体溶液之外，用以上相同方式，获得自发释放靶细胞的吸光度数据和自发释放效应细胞的吸光度数据。使用培养基取代抗体溶液和效应细胞溶液，在反应结束前45分钟，往培养基中加入15微升9％Triton X-100溶液，用以上相同方式，通过测定LDH活性，获得全部释放的靶细胞的吸光度数据。通过以下方程测定ADCC活性。
图6表示3种细胞系作为靶细胞的结果。图6A，6B和6C分别表示使用Raji细胞(JCRB90 12)，Ramos细胞(ATCC CRL 1596)和WIL2-S细胞(ATCC CRL8885)的结果。如图6所示，和RituxanTM相比，KM3065表现出更高的ADCC活性(在所有抗体浓度)和更高的最大细胞毒活性。
实施例3
抗-CD20嵌合抗体的糖链分析
分析实施例1的条目3中纯化的抗-CD20嵌合抗体的糖链。把KM3065和RituxanTM经肼解作用[Method of Enzymology， 83，263(1982)]使糖链从蛋白质上分开。在减压条件下通过蒸发除去肼。通过加入含醋酸铵水溶液和乙酸酐进行N-乙酰化作用。冻干后，用2-氨基吡啶进行荧光标记[Journal of Biochemistry， 95，197(1984)]。使用SuperdexPeptide HR10/30柱(Pharmacia生产)把荧光标记的糖链基团(以下称为“′PA-处理过的糖链基团”)从过量试剂中分离出来。糖链成分使用离心浓缩仪干燥，作为纯化的PA处理过的糖链基团使用。然后，纯化的PA处理过的糖链基团使用CLC-ODS柱(Shimadzu生产)经反相HPLC分析。
图7表示每个从抗-CD20嵌合抗体中制备的PA处理过的糖链通过反相HPLC分析，获得的洗脱模式。图7A和7B分别表示KM3065和RituxanTM的洗脱模式。纵座标和横座标分别表示荧光强度和洗脱时间。使用10毫摩尔磷酸钠缓冲液(pH3.8)作为缓冲液A，10毫摩尔磷酸钠缓冲液(pH3.8)+0.5％1-丁醇作为缓冲液B，用以下梯度进行分析。
                     表1
  时间
        0    80    90    90.1    120
(分钟)
  缓冲
        0    60    60    0       0
液B(％)
图7中的峰①到⑩分别表示以下结构(1)到(10)。
Figure A0282757000881
GlcNAc，Gal，Man，Fuc和PA分别代表N-乙酰葡糖胺，半乳糖，甘露糖，岩藻糖和吡啶基氨基。在图7中，岩藻糖的1位并不通过α键(以下称为“无α1，6-岩藻糖的糖链基团”或“α1，6-岩藻糖-不结合的糖链基团”)结合于N-糖苷键合的复合糖链还原性末端中6位的N-乙酰葡萄糖胺，其比率可以通过峰①到⑩所占的面积中峰①到④，⑨和⑩所占的面积计算。而且，岩藻糖的1位通过α键(以下称为“α1，6-岩藻糖-连接的糖链基团”)与N-糖苷键合的复合糖链还原性末端中6位的N-乙酰氨基葡萄糖结合，其比率可以通过峰①到⑩所占的面积中峰⑤和⑧所占的面积计算。
结果，在RituxanTM中，α1，6-岩藻糖-不结合的糖链的比率是6％，反之，α1，6-岩藻糖-结合的糖链比率是94％。在KM3065中，α1，6-岩藻糖-不结合的糖链的比率是96％，反之，α1，6-岩藻糖-结合的糖链比率是4％。结果表明，KM3065的α1，6-岩藻糖-不结合的糖链比率比RituxanTM高。
实施例4
制备来源于CHO细胞的α1，6-岩藻糖基转移酶(FUT8)
(1)从CHO细胞中制备α1，6-岩藻糖基转移酶(FUT8)cDNA序列
在WO00/61739的实施例8(1)中，CHO/DG44细胞培养第两天时，从CHO/DG44细胞中制备单链cDNA，通过以下程序获得中国仓鼠FUT8 cDNA(图8)。
首先，从小鼠FUT8 cDNA序列(GenBank，AB025198)中设计对5’-端非翻译区特异的正向引物(在SEQ ID NO：21中表示)和3’-端非翻译区特异性的反向引物(在SEQ ID NO：22中表示)。
然后，制备含有1微升来源于CHO/DG44细胞的cDNA的25微升反应混合物[ExTaq缓冲液(Takara Shuzo生产)，0.2毫摩尔/升dNTP，4％DMSO和0.5微摩尔/升特异引物(SEQ ID NO：21和22)]，使用DNA聚合酶ExTaq(Takara Shuzo生产)进行PCR。PCR是94℃加热1分钟，随后进行30个循环，每个循环是94℃加热30秒，55℃加热30秒，72℃加热2分钟，30个循环后，72℃加热10分钟。
PCR后，反应混合物经过0.8％琼脂糖凝胶电泳，纯化出大约2Kb的特异扩增片段。根据附加在TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen生产)的产品说明，往质粒pCR2.1中导入4微升DNA片段，E.coli DH5α用此反应混合物转化。根据已知方法，在获得的卡那霉素抗性克隆中，从cDNA插入的8个克隆中分离出质粒DNA。
用DNA测序仪377(Applied Biosystems生产)和BigDye TerminatorCycle Sequencing FS Ready Reaction试剂盒(Applied Biosystems生产)，根据产品说明的方法，确定每个插入质粒的cDNA的核苷酸序列。用此方法证实，所有插入的cDNA编码含有CHO细胞FUT8的全长ORF的序列。通过PCR，从它们中间选择序列中绝对不含有碱基阅读错误的质粒DNA。于此，此质粒称为“CHfFUT8-pCR2.1”。确定的CHOFUT8的cDNA核苷酸序列用SEQ ID NO：1代表。在SEQ ID NO：1中翻译区(开放阅读框架：ORF)是100-1827位的核苷酸，除了终止密码子外，100到1824位的核苷酸相对应的氨基酸序列用SEQ IDNO：23代表。
(2)从CHO细胞中制备α1，6-岩藻糖基转移酶(FUT8)基因组序列
使用条目(1)中获得的CHO细胞FUT8的ORF全长eDNA片段作为探针，根据例如Molecular Cloning(分子克隆)，第二版，CurrentProtocols in Molecular Biology(现代分子生物学指南)，A LaborctoryManual(实验手册)，第二版(1989)中描述的已知基因组筛选方法，从来源于CHO-K1细胞的λ-噬菌体基因组文库(Strategene生产)中获得CHO细胞FUT8基因组克隆。然后，用不同限制性内切酶消化获得的基因组克隆后，使用含CHO细胞FUT8 cDNA的起始密码子的AfaI-Sau3AI片段(大约280bp)作为探针进行Southern杂交，然后从表现阳性反应的限制性内切酶片段中选择XbaI-XbaI片段(大约2.5Kb)和SacI-SacI片段(大约6.5Kb)，分别插入pBluescript 11 KS(+)(Stratagene生产)。
使用DNA测序仪377(Applied Biosystems生产)和BigDyeTerminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction试剂盒由(ParkinElmer生产)，根据产品说明的方法确定每个获得的基因组片段的核苷酸序列，证实XbaI-XbaI片段编码含有CHO细胞FUT8的外显子2，大约2.5Kb的上游内含子序列，SacI-SacI片段编码含有CHO细胞FUT8的外显子2的大约6.5Kb的下游内含子序列。于此，含有XbaI-XbaI片段的质粒和含有SacI-SacI片段的质粒分别称为pFUT8fgE2-2和pFUT8fgE2-4。确定的含有CHO细胞FUT8的外显子2的基因组区域的核苷酸序列(大约9.0Kb)在SEQ ID NO：3中表示。
实施例5
制备α1，6-岩藻糖基转移酶的基因被断裂的CHO细胞：
制备包含来源于CHO细胞的α1，6-岩藻糖基转移酶(FUT8)基因的外显子2的基因组区域被删除的CHO细胞，测定细胞产生的抗体的ADCC活性。
1.构建以中国仓鼠α1，6-岩藻糖基转移酶(FUT8)基因外显子2为目标的载体质粒pKOFUT8Puro
(1)构建质粒ploxPPuro
通过以下程序(图9)构建质粒ploxPPuro
在35微升NE缓冲液4(New England Biolabs生产)中溶解1.0微克质粒pKOSelectPuro(由Lexicon制备)，加入20个单位的限制性内切酶AscI(New England Biolabs生产)，然后37℃进行消化反应2小时。消化反应后，混合物用0.8％(w/v)琼脂糖凝胶电泳，纯化出有嘌呤霉素抗性基因表达单位的大约1.5Kb的DNA片段。
1.0微克日本公开的审查的专利申请314512/99号中描述的质粒ploxP独立溶于35微升NE缓冲液4(New England Biolabs生产)，加入20个单位的限制性内切酶AscI(New England Biolabs生产)，然后37℃进行消化反应2小时。消化反应后，混合物用0.8％(w/v)琼脂糖凝胶电泳，纯化出大约2.0Kb的DNA片段。
得到的来源于质粒pKOSelectPuro的AscI-AscI片段(4.5微升，大约1.5Kb)，0.5微升来源于质粒ploxP的AscI-AscI片段(大约2.0Kb)与5.0微升Ligation High(TOYOBO生产)混合，然后16℃进行连接反应30分钟。用反应混合物转化E.coli DH5α，根据已知方法，在获得的氨苄青霉素抗性克隆中，分离出质粒DNA。于此，此质粒称ploxPPuro。
(2)构建质粒pKOFUT8gE2-1
使用实施例4(2)中获得的含有包括中国仓鼠FUT8的外显子2的基因组区域的质粒pFUT8fgE2-2，用以下步骤构建质粒pKOFUT8gE2-1(图10)。
35微升含有100微克/毫升BSA(New England Biolabs生产)的NE缓冲液1(New England Biolabs生产)中溶解2.0微克质粒pFUT8fgE2-2，加入20个单位的限制性内切酶SacI(New EnglandBiolabs生产)，然后37℃进行消化反应2小时。用乙醇沉淀从反应混合物中回收DNA片段，溶于35微升含有100微克/毫升BSA(由NewEngland Biolabs制备)的NE缓冲液2(New England Biolabs生产)中，加入20个单位限制性内切酶EcoRV(New England Biolabs生产)，然后37℃进行消化反应2小时。消化反应后，混合物用0.8％(w/v)琼脂糖凝胶电泳，纯化出大约1.5Kb的DNA片段。
1.0微克质粒LITMUS28(New England Biolabs生产)单独溶于35微升含有100微克/毫升BSA(New England Biolabs生产)的NE缓冲液1(New England Biolabs生产)中，加入20个单位的限制性内切酶SacI(New England Biolabs生产)，然后37℃进行消化反应2小时。用乙醇沉淀从反应混合物中回收DNA片段，溶于35微升含有100微克/毫升BSA(由New England Biolabs制备)的NE缓冲液2(NewEngland Biolabs生产)中，加入20个单位限制性内切酶EcoRV(NewEngland Biolabs生产)，然后37℃进行消化反应2小时。消化反应后，混合物用0.8％(w/v)琼脂糖凝胶电泳，纯化出大约2.8Kb的DNA片段。
得到的来源于质粒pFUT8fgE2-2的EcoRV-Sacl片段(4.5微升，大约1.5Kb)，0.5微升来源于质粒LITMUS28的EcoRV-Sacl片段(大约2.8Kb)和5.0微升Ligation High(TOYOBO生产)混合，然后16℃进行连接反应30分钟。反应混合物转化E.coli DH5α，根据已知方法，在获得的氨苄青霉素抗性克隆中，分离出质粒DNA。于此，质粒称pKOFUT8gE2-1。
(3)构建质粒pKOFUT8gE2-2
使用条目(2)(图1.1)中获得的质粒pKOFUT8gE2-1，用以下步骤构建质粒pKOFUT8gE2-2。
30微升含有100微克/毫升BSA(New England Biolabs生产)的NE缓冲液2(New England Biolabs生产)中溶解2.0微克质粒pFUT8fgE2-1，加入20个单位的限制性内切酶EcoRV(New EnglandBiolabs生产)，然后37℃进行消化反应2小时。用乙醇沉淀从反应混合物中回收DNA片段，溶于30微升含有100微克/毫升BSA(由NewEngland Biolabs制备)的NE缓冲液1(New England Biolabs生产)中，加入20个单位限制性内切酶KpnI(New England Biolabs生产)，然后37℃进行消化反应2小时。消化反应后，混合物0.8％(w/v)琼脂糖凝胶电泳，纯化出大约1.5Kb的DNA片段。
1.0微克质粒ploxPPuro(New England Biolabs生产)独立溶于30微升NE缓冲液4(New England Biolabs生产)中，加入20个单位的限制性内切酶HpaI(New England Biolabs生产)，然后37℃进行消化反应2小时。用乙醇沉淀从反应混合物中回收DNA片段，溶于30微升含有100微克/毫升BSA(由New England Biolabs制备)的NE缓冲液1(New England Biolabs生产)中，加入20个单位限制性内切酶KpnI(New England Biolabs生产)，然后37℃进行消化反应2小时。消化反应后，混合物用0.8％(w/v)琼脂糖凝胶电泳，纯化出大约3.5Kb的DNA片段。
得到的来源于质粒pKOFUT8gE2-1的EcoRV-KpnI片段(4.0微升，大约1.5Kb)，1.0微升来源于质粒ploxPPuro的HpaI-kpnI片段(大约3.5Kb)和5.0微升Ligation High(TOYOBO生产)混合，然后16℃进行连接反应30分钟。此反应混合物转化Ecoli DH5α，根据已知方法，在获得的氨苄青霉素抗性克隆中，分离出质粒DNA。于此，质粒称pKOFUT8gE2-2。
(4)构建质粒pscFUT8gE2-3
使用实施例4(2)中获得的含有包括中国仓鼠FUT8的外显子2的基因组区域的质粒pFUT8fgE2-4，用以下步骤构建质粒pscFUT8gE2-3(图12)。
35微升NE缓冲液1(New England Biolabs生产)中溶解2.0微克质粒pFUT8fgE2-4，加入20个单位的限制性内切酶HpaII(New EnglandBiolabs生产)，然后37℃进行消化反应2小时。用乙醇沉淀从反应混合物中回收DNA片段，根据产品说明，使用Blunting High(Toyobo生产)，把此DNA末端变成平末端。此DNA片段通过酚/氯仿抽提和乙醇沉淀回收，溶于35微升NE缓冲液2(New England Biolabs生产)中，加入20个单位限制性内切酶HindIII(New England Biolabs生产)，然后37℃进行消化反应2小时。消化反应后，混合物用0.8％(w/v)琼脂糖凝胶电泳，纯化出大约3.5Kb的DNA片段。
1.0微克质粒LITMUS39(New England Biolabs生产)独立溶于35微升NE缓冲液2(New England Biolabs生产)中，混合物与20个单位的限制性内切酶EcoRV(New England Biolabs生产)和20个单位的限制性内切酶HindIII(New England Biolabs生产)混合，然后37℃进行消化反应2小时。消化反应后，混合物用0.8％(w/v)琼脂糖凝胶电泳，纯化出大约2.8Kb的DNA片段。
得到的来源于质粒pFUT8fgE2-4的HpaII-HindIII片段(4.0微升，大约3.5Kb)，1.0微升来源于质粒LITMUS39的EcoRV-HindIII片段(大约2.8Kb)和5.0微升Ligation High(TOYOBO生产)混合，然后16℃进行连接反应30分钟。此反应混合物转化Ecoli DH5α，根据已知方法，在获得的氨苄青霉素抗性克隆中，分离出质粒DNA。于此，质粒称pscFUT8gE2-3。
(5)构建质粒pKOFUT8gE2-3
使用实施例4(2)中获得的，包括中国仓鼠FUT8的外显子2的基因组区域的质粒pFUT8fgE2-4，用以下步骤构建质粒pKOFUT8gE2-3(图13)。
质粒pFUT8fgE2-4溶于35微升用于EcoRI的NE缓冲液(NewEngland Biolabs生产)中，加入20个单位的限制性内切酶EcoRI(NewEngland Biolabs生产)和20个单位的限制性内切酶HindIII(NewEngland Biolabs生产)，然后37℃进行消化反应2小时。消化反应后，混合物用0.8％(w/v)琼脂糖凝胶电泳，纯化出大约1.8Kb的DNA片段。
1.0微克质粒pBluescript II KS(+)(New England Biolabs生产)独立溶于35微升用于EcoRI的NE缓冲液(New England Biolabs生产)中，然后加入20个单位的限制性内切酶EcoRI(New England Biolabs生产)和20个单位的限制性内切酶HindIII(New England Biolabs生产)，接下来37℃进行消化反应2小时。消化反应后，混合物用0.8％(w/v)琼脂糖凝胶电泳，纯化出大约3.0Kb的DNA片段。
得到的来源于质粒pFUT8fgE2-4的HindIII-EcoRI片段(4.0微升，大约1.8Kb)，1.0微升来源于质粒pBluescript 11KS(+)的HindIII-EcoRI片段(大约3.0Kb)和5.0微升Ligation High(TOYOBO生产)混合，然后16℃进行连接反应30分钟。此反应混合物转化Ecoli DH5α，根据已知方法，在获得的氨苄青霉素抗性克隆中，分离出质粒DNA。于此，质粒称pKOFUT8gE2-3。
(6)构建质粒pKOFUT8gE2-4
使用条目(4)和(5)中获得的质粒pscFUT8gE2-3和pKOFUT8gE2-3，用以下步骤构建质粒pKOFUT8gE2-4(图13)。
1.0微克质粒pscFUT8gE2-3溶于35微升用于SalI，含有100微克/毫升BSA(New England Biolabs生产)的NE缓冲液(New EnglandBiolabs生产)，加入20个单位的限制性内切酶SalI(New EnglandBiolabs生产)，然后37℃进行消化反应2小时。用乙醇沉淀从反应混合物中回收DNA片段，溶于30微升含有100微克/毫升BSA(由NewEngland Biolabs制备)的NE缓冲液2(New England Biolabs生产)中，加入20个单位限制性内切酶HindIII(New England Biolabs生产)，然后37℃进行消化反应2小时。消化反应后，混合物用0.8％(w/v)琼脂糖凝胶电泳，纯化出大约3.6Kb的DNA片段。
1.0微克质粒pKOFUT8gE2-3独立溶于35微升用于SalI，含有100微克/毫升BSA(New England Biolabs生产)的NE缓冲液(New EnglandBiolabs生产)中，加入20个单位的限制性内切酶SalI(New EnglandBiolabs生产)，然后37℃进行消化反应2小时。用乙醇沉淀从反应混合物中回收DNA片段，溶于35微升NE缓冲液2(New England Biolabs生产)中，加入20个单位限制性内切酶HindIII(New England Biolabs生产)，然后37℃进行消化反应2小时。消化反应后，加入35微升1摩尔/升的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)和3.5微升Ecoli C15衍生的碱性磷酸酶(Takara Shuzo生产)，然后65℃反应30分钟，使DNA末端脱磷酸化。脱磷酸化处理后，DNA片段通过酚/氯仿抽提和乙醇沉淀回收，溶于10微升无菌水中。
得到的来源于质粒pscFUT8gE2-3的SalI-HindIII片段(4.0微升，大约3.1Kb)，1.0微升来源于质粒pKOFUT8gE2-3的SalI-HindIII片段(大约4.8Kb)和5.0微升Ligation High(TOYOBO生产)混合，然后16℃进行连接反应30分钟。此反应混合物转化Ecoli DH5α，根据已知方法，在获得的氨苄青霉素抗性克隆中，分离出质粒DNA。于此，质粒称pKOFUT8gE2-4。
(7)构建质粒pKOFUT8gE2-5
使用条目(3)和(6)中获得的质粒pKOFUT8gE2-2和pKOFUT8gE2-4，用以下步骤构建质粒pKOFUT8gE2-5(图15)。
1.0微克质粒pKOFUT8gE2-2溶于30微升NE缓冲液4(NewEngland Biolabs生产)，加入20个单位的限制性内切酶SmaI(NewEngland Biolabs生产)，然后25℃消化反应2小时。用乙醇沉淀从反应混合物中回收DNA片段，溶于30微升NE缓冲液2(New EnglandBiolabs生产)中，加入20个单位限制性内切酶BamHI(New EnglandBiolabs生产)，然后37℃进行消化反应2小时。消化反应后，加入30微升1摩尔/升的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)和3.0微升Ecoli C15来源的碱性磷酸酶(Takara Shuzo生产)，然后65℃反应30分钟使DNA末端脱磷酸化。脱磷酸化处理后，DNA片段通过酚/氯仿抽提和乙醇沉淀回收，溶于10微升无菌水。
1.0微克质粒pKOFUT8gE2-4(New England Biolabs生产)独立溶于30微升NE缓冲液4(New England Biolabs生产)中，加入20个单位的限制性内切酶SmaI(New England Biolabs生产)，然后25℃消化反应2小时。用乙醇沉淀从反应混合物中回收DNA片段，溶于30微升NE缓冲液2(New England Biolabs生产)中，加入20个单位限制性内切酶BamHI(New England Biolabs生产)，然后37℃进行消化反应2小时。消化反应后，混合物用0.8％(w/v)琼脂糖凝胶电泳，纯化出大约5.2Kb的DNA片段。
得到的来源于质粒pKOFUT8gE2-2的SmaI-BamHI片段(0.5微升，大约5.0Kb)，4.5微升来源于质粒pKOFUT8gE2-4的SmaI-BamHI片段(大约5.2Kb)和5.0微升Ligation High(TOYOBO生产)混合，然后16℃连接反应15小时。此反应混合物转化Ecoli DH5α，根据已知方法，在获得的氨苄青霉素抗性克隆中，分离出质粒DNA。于此，质粒称pKOFUT8gE2-5。
(8)构建质粒pKOFUT8Puro
使用条目(7)中获得的质粒pKOFUT8gE2-5，用以下步骤构建质粒pKOFUT8Puro(图16)。
1.0微克质粒pKOSelectDT(Lexicon生产)溶于50微升NE缓冲液4(New England Biolabs生产)，加入16个单位的限制性内切酶RsrII(New England Biolabs生产)，然后37℃进行消化反应2小时。消化反应后，混合物0.8％(w/v)琼脂糖凝胶电泳，纯化出大约1.2Kb，包含白喉毒素表达单位的DNA片段。
1.0微克质粒pKOFUT8gE2-5独立溶于50微升NE缓冲液4(NewEngland Biolabs生产)中，加入16个单位的限制性内切酶RsrII(NewEngland Biolabs生产)，然后37℃进行消化反应2小时，消化反应后，加入30微升1摩尔/升的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)和3.0微升来源于Ecoli C15的碱性磷酸酶(Takara Shuzo生产)，然后65℃反应1小时进行DNA末端脱磷酸化。脱磷酸化处理后，DNA片段通过酚/氯仿抽提和乙醇沉淀回收，溶于10微升无菌水。
1.0微克得到的来源于质粒pKOSelectDT的RsrII-RsrII片段(大约1.2Kb)，1.0微升来源于质粒pKOFUT8gE2-5的RsrII-RsrII片段(大约10.4Kb)，3.0微升无菌水和5.0微升Ligation High(TOYOBO生产)混合，然后16℃进行连接反应30分钟。此反应混合物转化Ecoli DH5α，根据已知方法，在获得的氨苄青霉素抗性克隆中，分离出质粒DNA。于此，质粒称pKOFUT8Puro。质粒作为靶载体，用于构建CHO细胞来源的FUT8基因敲除的细胞。
实施例6
制备凝集素抗性CHO/DG44细胞及使用细胞产生抗体
1.制备凝集素抗性CHO/DG44
使用IMDM-FBS(10)培养基[IMDM培养基含有10％胎牛血清(FBS)和1×浓度的HT添加物(GIBCO BRL生产)]，CHO/DG44细胞在75cm3瓶(Greiner生产)中贴壁培养，生长直到汇合前阶段。细胞用5毫升Dulbecco′s PBS(Invitrogen生产)漂洗后，加入1.5毫升用Dulbecco′s PBS稀释的0.05％胰蛋白酶(Invitrogen生产)，37℃处理5分钟，使细胞从瓶底解离下来。解离细胞通过一般用于细胞培养的离心操作收集，悬浮在IMDM-FBS(10)培养基中，密度为1×l05细胞/毫升。然后，假如需要的话，往细胞悬浮液中加入0.1微克/毫升烷化剂N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(以下称为“MNNG”，Sigma生产)。CO2培养箱(由TABAI制备)中37℃培养3天后，弃去培养基上清，细胞再次用同样的操作漂洗，解离和收集，悬浮于IMDM-FBS(10)培养基中，然后接种于组织培养96孔板(IWAKI Glass制备)，密度为1,000细胞/孔。往每孔中，作为培养基中的最终浓度，加入1毫克/毫升Lens culinaris凝集素(以下称为“LCA”，Vector生产)，1毫克/毫升Aleuria aurantia凝集素(Aleuria aurantia凝集素，以下称为“AAL”，Vector生产)或1毫克/毫升云豆凝集素(Phaseolus vulgaris白细胞凝集素，以下称为“L-PHA”，Vector生产)。CO2培养箱中37℃培养2周后，出现的克隆是获得的凝集素抗性CHO/DG44。关于获得的凝集素抗性CHO/DG44，LCA-抗性细胞系，AAL-抗性细胞系和L-PHA-抗性细胞系分别被命名为CHO-LCA.，CHO-AAL和CHO-PHA。当检测这些细胞系对多种凝集素的抗性时，发现CHO-LCA对AAL也有抗性，CHO-AAL对LCA也有抗性。另外，CHO-LCA和CHO-AAL也对识别与LCA和AAL识别的糖链结构相同的糖链结构的凝集素表现抗性，即，，此凝集素识别1-岩藻糖与N-糖苷键合的糖链还原性末端N-乙酰氨基葡萄糖的6位通过α键相连的糖链结构。具体的，发现甚至在添加了最终浓度达到1毫克/毫升的豌豆凝集素(Pisum sativum凝集素，以下称为“PSA”，Vector生产)的培养基中，CHO-LCA和CHO-AAL仍可以表现抗性和存活。另外，即使当烷化试剂MNNG不加入时，也可以通过增加处理的细胞的数目，得到凝集素抗性细胞。在下文中，这些细胞系被用于分析。
2.制备产生抗-CD20人嵌合抗体的细胞系
以上条目1获得的1.6×106个凝集素-抗性细胞系CHO/DGG44细胞中，通过电穿孔导入4微克用于表达人嵌合抗体pKANTEX2B8P的抗-CD20载体[Cytotechnology(电穿孔)， 3，133(1990)]。细胞悬浮于10毫升IMDM-dFBS(10)-HT(1)[含有10％dFBS(Invitrogen生产)和1×浓度的HT添加剂(Invitrogen生产)的IMDM培养基(Invitrogen生产)]，培养基以100微升/孔分配于96孔培养板(由lwaki Glass制备)。细胞在5％CO2培养箱中37℃培养24小时。然后培养基换成IMDM-dFBS(10)(含10％透析的FBS的IMDM培养基)，然后培养1到2周。因为观察到表现HT-不依赖生长的转化体克隆，所以观察有转化体生长的孔中的转化体经DHFR基因扩增，抗体产生的量增加。具体的，细胞以密度1到2×105细胞/毫升悬浮于含有50纳摩尔MTX的IMDM-dFBS(10)培养基中，悬浮液以0.5毫升/孔分配于24孔板(由Iwaki Glass制备)中。细胞在5％CO2培养箱中37℃培养1到2周，进行诱导转化子表现50纳摩尔MTX抗性。关于观察到细胞生长的孔中的转化体，培养基的MTX浓度增加到200纳摩尔，然后用如上描述的相同方式最终获得能在含有200纳摩尔MTX的IMDM-dFBS(10)培养基中生长，并能大量产生抗-CD20人嵌合抗体的转化体。
3.培养抗体表达细胞系和纯化抗体
以上条目2中获得的能大量产生抗-CD20人嵌合抗体的LCA凝集素-抗性CHO/DG44转化细胞命名为R92-3-1。R92-3-1作为FERMBP-7976在国际专利生物保藏中心，独立行政法人产业技术综合研究所(AIST Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-Chome Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan)，2002年3月26日保藏。
R92-3-1培养于含有200纳摩尔MTX的IMDM-dFBS(10)中，直到细胞开始汇合，用Dulbecco’s PBS(Invitrogen生产)漂洗，然后培养基换成EX-CELL301(由JKH制备)。细胞在5％CO2培养箱中37℃培养7天，收集培养基上清。用Prosep-A柱(Millipore生产)从培养基上清中纯化抗-CD20嵌合抗体，命名为R92-3-1抗体。
实施例7
纯化凝集素-抗性CHO/DG44细胞产生的抗-CD20嵌合抗体并测定其活性。
1.测定来源于凝集素-抗性CHO/DG44细胞产生的抗体的结合活性(免疫荧光法)
以上实施例6的条目3获得的R92-3-1抗体与表达CD20的Raji细胞系的结合活性根据以上实施例2的条目1描述的免疫荧光方法检测，并且与来源于普通CHO细胞的商业上可购得的抗体RituxanTM比较。如图17所示，荧光强度增加依赖于R92-3-1抗体和RituxanTM浓度，证实它们有相似的结合活性。
2.测定来源于凝集素-抗性CHO/DG44细胞的抗体的体外细胞毒活性(ADCC活性)
为了测定实施例6的条目3中获得的R92-3-1抗体的体外ADCC活性，根据以上实施例2的条目2描述的方法测定ADCC活性。效应细胞与靶细胞，Raji细胞的比率是25∶1，最终抗体浓度是0.001到10微克/毫升，反应总体积是200微升，结果在图18中表示。
结果表明来源于凝集素-抗性CHO/DG44细胞的R92-3-1抗体的ADCC活性比RituxanTM高。
3.源于凝集素-抗性CHO/DG44细胞的抗体的糖链分析
以上实施例6的条目3获得的R92-3-1抗体的糖链分析，根据以上实施例3中描述的方法进行。结果在图19中显示。图19中峰①到⑧的糖链结构分别与图7的峰①到⑧相同。
图19中，无α1，6-岩藻糖的糖链基团的比率从峰①到⑩中峰①到④，⑨和⑩所占的面积计算。同时，α1，6-岩藻糖结合的糖链基团的比率从峰①到⑩中峰⑤到⑧所占的面积计算。
结果，在R92-3-1抗体中，α1，6-岩藻糖不结合的糖链基团的比率是33％，反之，α1，6-岩藻糖结合的糖链基团的比率是67％。当与实施例3中进行的RituxanTM糖链分析相比较时，由LCA凝集素-抗性CHO/DG44细胞产生的抗体，其α1，6-岩藻糖非结合的糖链的比率更高。
实施例8
制备CHO细胞来源的GMD基因
1.测定CHO细胞来源的GMD基因的cDNA序列
(1)制备CHO细胞来源的GMD基因的cDNA(制备除5’-和3’-末端序列之外的cDNA部分)
使用在GenBank登记的人来源的GMD(GenBank登记号AF042377)的cDNA序列作为查询，在公共数据库中搜索啮齿动物来源的cDNA，得到三种小鼠的EST序列(GenBank登记号是BE986856，BF158988和BE284785)。通过把这些EST序列加以连接，确定推导出的小鼠GMD的cDNA序列。
在小鼠来源的GMD的cDNA序列的基础上，制备具有由SEQ IDNO：32代表的序列的28聚体的引物，具有由SEQ ID NO：33代表的序列的27聚体的引物，具有由SEQ ID NO：34代表的序列的25聚体的引物，具有由SEQ ID NO：35代表的序列的24聚体的引物，具有由SEQ ID NO：36代表的序列的25聚体的引物。
然后，5％CO2培养箱中，37℃，CHO/DG44细胞传代培养，然后培养。培养后，使用RNeasy Protect Mini试剂盒(QIAGN生产)，根据产品说明，从每个细胞系的1×107细胞中制备总RNA。使用RT-PCR(GIBCO BRL生产)，根据产品说明，从20微升反应混合物中的5微克每种RNA合成单链cDNA。
然后，为了扩增CHO细胞来源的cDNA，通过以下方法进行PCR。具体的，制备20微升的反应混合物，其中含有0.5微升CHO-来源的单链cDNA作为模板，[1×Ex Taq缓冲液(Takara Shuzo生产)，0.2毫摩尔dNTP，0.5单位Ex Taq聚合酶(Takara Shuzo生产)和0.5μM的两种合成的DNA引物]。在此情况下，SEQ ID NO：32与SEQ ID NO：33组合，SEQ ID NO：34与SEQ ID NO：33组合，SEQ ID NO：32与SEQ ID NO：35组合，SEQ ID NO：32与SEQ IDNO：36组合作为DNA的合成引物。使用DNA Thermal Cycler 480(Perkin Elmer生产)进行反应，94℃加热5分钟，然后进行30个循环，每个循环为94℃加热1分钟，68℃加热2分钟。
PCR反应混合物经过琼脂糖电泳分离，发现当使用SEQ ID NO：32和33的合成DNA引物时，大约1.2kbp的DNA片段在PCR产物中扩增，当使用SEQ ID NO：33和34的合成DNA引物时，大约1.1kbp的DNA片段在PCR产物中扩增，当使用SEQ ID NO：32和35的合成DNA引物时，大约350bp的DNA片段在PCR产物中扩增，当使用SEQ ID NO：32和36的合成DNA引物时，大约1kbp的DNA片段在PCR产物中扩增。使用Gene Clean II试剂盒(BIO101生产)，根据产品说明，回收DNA片段。使用DNA Ligation试剂盒(Takara Shuzo生产)，回收的DNA片段连接到pT7Blue(R)载体(Novagen生产)。使用得到的重组质粒DNA样品转化E.coli DH(TOYOBO生产)，得到质粒22-8(由SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：33的合成DNA引物扩增的大约1.2kbp的DNA片段)，质粒23-3(由SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：33的合成DNA引物扩增的大约1.1kbp的DNA片段)，质粒31-5(由SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：35的合成DNA引物扩增的大约350bp的DNA片段)和质粒34-2(由SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：36的合成DNA引物扩增的大约1kbp的DNA片段)。使用DNA测序仪ABI PR1SM 377(Perkin Elmer生产)，使用常规方法，确定在这些质粒中含有的CHO细胞来源的GMD的cDNA序列(因为5′-末端的起始密码子甲硫氨酸的下游的28个碱基的序列和3′-末端的终止子上游的27个碱基的序列是开始于合成的寡聚DNA序列，它们是小鼠GMD cDNA序列)。
另外，为了制备其中质粒22-8和质粒34-2中所含的CHO细胞来源的GMD的cDNA片段合并的质粒，进行以下步骤。1微克质粒22-8与限制性内切酶EcoRI(Takara Shuzo生产)37℃反应16小时后，消化产物经过琼脂糖电泳，然后使用Gene Clean II试剂盒(BIO101生产)，根据产品说明，回收大约4kbp的DNA片段。2微克质粒34-2与限制性内切酶EcoRI(Takara Shuzo生产)37℃反应16小时后，消化产物经过琼脂糖电泳，然后使用Gene Clean II试剂盒(BIO101生产)，根据产品说明，回收大约150bp的DNA片段。回收的DNA片段分别使用小牛肠碱性磷酸酯酶(Takara Shuzo生产)进行末端去磷酸化，然后使用DNA Ligation试剂盒(Takara Shuzo生产)进行连接，使用得到的重组质粒DNA转化E.coli DH5a(TOYOBO生产)，得到质粒CHO-GMD(图20)。
(2)测定CHO细胞来源的GMD cDNA的5’-末端序列
有从CHO细胞来源的GMD cDNA的5’-末端非编码区域的核苷酸序列制备的由SEQ IDNO：37代表的核苷酸序列的24聚体的引物，从CHO细胞来源的GMD cDNA制备的由SEQ ID NO：38代表的核苷酸序列的32聚体的引物。为了扩增cDNA，通过以下方法进行PCR。然后，制备20微升含有0.5微升CHO细胞来源的单链cDNA作为模板的反应混合物[1×Ex Taq缓冲液(Takara Shuzo生产)，0.2毫摩尔dNTP，0.5单位Ex Taq聚合酶(Takara Shuzo生产)和0.5微摩尔SEQID NO：37和SEQ ID NO：38的合成DNA引物]，使用DNA ThermalCycler 480(Perkin Elmer生产)进行反应，94℃加热5分钟，然后20个循环，每个循环为94℃加热1分钟，55℃加热1分钟和72℃加热2分钟。然后18个循环，每个循环为94℃加热1分钟，68℃加热2分钟。PCR反应产物经过琼脂糖电泳分离，然后使用Gene Clean II试剂盒(BIO101生产)，根据产品说明，回收大约300bp的DNA片段。使用DNA Ligation试剂盒(Takara Shuzo生产)，回收的DNA片段连接到pT7Blue(R)载体(Novagen生产)。使用得到的重组质粒DNA样品转化E.coli DH5α(TOYOBO生产)，得到质粒5’GMD。使用DNA测序仪377(Applied Biosystems生产)，测定质粒中含有的CHO细胞来源的GMD cDNA的起始甲硫氨酸上游的28个碱基的核苷酸序列。
(3)测定CHO细胞来源的GMD cDNA的3’-末端序列
为了获得CHO细胞来源的GMD 3’-末端cDNA序列，通过以下方法进行RACE方法。使用SMARTTM RACE cDNA扩增试剂盒(CLONTECH生产)，根据产品说明，从CHO细胞来源的RNA制备用于3′RACE的单链cDNA。在此情况下，使用PowerScriptTM反转录酶(CLONTECH生产)作为反转录酶。制备后得到的单链cDNA用试剂盒所带的Tricin-EDTA缓冲液稀释10倍，用作PCR的模板。
然后，制备20微升含有1微升作为模板的3’RACE的cDNA反应混合物[Ex Taq缓冲液(Takara Shuzo生产)，0.2毫摩尔dNTP，0.5单位Ex Taq聚合酶(Takara Shuzo生产)，0.5微摩尔在SEQ ID NO：39中所示的24聚体合成DNA引物[在条目(1)测定的CHO细胞来源的GMD的cDNA序列基础之上制备]，和l×浓度的通用引物混合物(附加于SMARTTM RACE cDNA扩增试剂盒，CLONTECH生产]，使用DNA Thermal Cycler 480(Perkin Elmer生产)进行PCR，PCR是94℃加热5分钟，然后进行30个循环，每个循环为94℃加热1分钟，68℃加热2分钟。
反应完成后，1微升PCR反应混合物用Tricin-EDTA缓冲液(CLONTECH生产)稀释20倍。然后20微升反应混合物[Ex Taq缓冲液(Takara Shuzo生产)，0.2毫摩尔dNTP，0.5单位EX Taq聚合酶(Takara Shuzo生产)，0.5微摩尔在SEQ ID NO：40中所示的25聚体的合成DNA引物[在条目(1)测定的CHO细胞来源的GMD的cDNA序列基础之上制备]和0.5微摩尔含有1微升稀释20倍的作为模板的水溶液嵌套通用引物(附加于SMARTTM RACE cDNA扩增试剂盒，CLONTECH生产]，使用DNA Thermal Cycler 480(Perkin Elmer生产)进行反应，94℃加热5分钟，然后进行30个循环，每个循环为94℃加热1分钟，68℃加热2分钟。
反应完成后，PCR反应产物经过琼脂糖电泳分离，然后使用GeneClean II试剂盒(BIO101生产)，根据产品说明，回收大约700bp的DNA片段。使用DNA Ligation试剂盒(Takara Shuzo生产)，回收的DNA片段连接到pT7Blue(R)载体(Novagen生产)，使用得到的重组质粒DNA转化E.coli DHα(TOYOBO生产)，得到质粒3’GMD。使用DNA测序仪377(Applied Biosystems生产)，测定质粒中含有的CHO细胞来源的GMD cDNA的终止密码子上游的27个碱基和3’-末端中的非编码区域415个碱基的核苷酸序列。
条目(1)，(2)和(3)中测定的CHO-来源的GMD基因的全长cDNA序列和相应的氨基酸序列分别在SEQ ID NO：41和61中显示。
2.测定含有CHO/DG44细胞来源的GMD基因的基因组序列
有由SEQ IDNO：56代表的核苷酸序列的25聚体的引物在实施例8的条目1中测定的鼠GMD cDNA序列的基础上制备。然后，通过以下方法获得CHO细胞来源的基因组DNA。CHO/DG44细胞悬浮于IMDM-dFBS(10)-HT(1)培养基中[IMDM-dFBS(10)培养基包括1×浓度的HT添加物(Invitrogen生产)]，密度为3×105细胞/毫升，悬浮液以2毫升/孔分配于用于贴壁细胞的6孔平底组织培养板。细胞在5％CO2培养箱中37℃培养，直到细胞在培养板中汇合，通过已知方法[Nucleic Acids Reseαrch(核酸研究)， 3，2303(1976)]从培养板的细胞中制备基因组DNA，在150微升TE-RNase缓冲液(pH8.0)(10毫摩尔/升Tris-HCI，1毫摩尔/升EDTA，200微克/毫升RNase A)中溶解过夜。
然后，制备100纳克获得的CHO/DG44细胞来源的基因组DNA和20微升反应混合物[1×ExTaq缓冲液(Takara Shuzo生产)，0.2毫摩尔dNTP，0.5单位EX Taq聚合酶(Takara Shuzo生产)，0.5微摩尔SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：56的合成DNA引物]，使用DNAThermalCycler 480(Perkin Elmer生产)进行PCR，PCR是94℃加热5分钟，然后进行30个循环，每个循环为94℃加热1分钟，68℃加热2分钟。反应完成后，PCR反应产物经过琼脂糖电泳分离，然后使用Gene CleanII试剂盒(BIO101生产)，根据产品说明，回收大约100bp的DNA片段。使用DNALigation试剂盒(Takara Shuzo生产)，回收的DNA片段连接到pT7Blue(R)载体(Novagen生产)，使用得到的重组质粒DNA转化E.coli DH5α(TOYOBO生产)，得到质粒ex3。使用DNA测序仪377(Applied Biosystems生产)，测定质粒中含有的CHO细胞来源的基因组DNA的核苷酸序列。测定的核苷酸序列在SEQ ID NO：57中表示。
然后，在实施例8的条目1中测定的鼠CHO细胞来源的GMDcDNA序列的基础上，制备由SEQ ID NO：58代表的核苷酸序列的25聚体的引物和有由SEQ ID NO：59代表的核苷酸序列的25聚体的引物。然后，制备100纳克CHO/DG44-来源的基因组DNA和20微升反应混合物[1×ExTaq缓冲液(Takara Shuzo生产)，0.2毫摩尔dNTP，0.5单位EX Taq聚合酶(Takara Shuzo生产)，0.5微摩尔SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：59的合成DNA引物]，使用DNA Thermal Cycler 480(Perkin Elmer生产)进行PCR，PCR是94℃加热5分钟，然后进行30个循环，每个循环为94℃加热1分钟，68℃加热2分钟。
反应完成后，PCR反应产物经过琼脂糖电泳分离，然后使用GeneClean II试剂盒(BIO101生产)，根据产品说明，回收大约200bp的DNA片段。使用DNA Ligation试剂盒(Takara Shuzo生产)，回收的DNA片段连接到pT7Blue(R)载体(Novagen生产)，使用得到的重组质粒DNA转化E.coli DHα(TOYOBO生产)，得到质粒ex4。使用DNA测序仪377(Applied Biosystems生产)，测定获得的质粒中含有的CHO细胞来源的基因组DNA的核苷酸序列。测定的核苷酸序列在SEQ ID NO：60中表示。
实施例9
制备编码各种关于糖链合成的酶的CHO细胞来源的基因：
1.测定CHO细胞来源的FX cDNA序列
(1)从CHO/DG44细胞中提取总RNA
CHO/DG44细胞悬浮于含有10％胎牛血清(Life Technologies生产)和1×浓度HT添加物(Life Technologies生产)的IMDM培养基中，15毫升悬浮液接种于用于贴壁细胞培养的T75组织培养瓶(Greiner生产)中，密度为2×105细胞/毫升。在5％CO2培养箱中37℃培养后的第二天，收集1×107细胞，使用RNAeasy(由QIAGEN制备)，根据产品说明，从中提取总RNA。
(2)制备CHO/DG44细胞来源的单链cDNA
条目(1)中制备的总RNA溶解于45微升无菌水中，加入1微升RQ1无RNase的DNase(Promega生产)，5微升所附的10×DNase缓冲液和0.5微升RNasin核糖核酸酶抑制剂(Promega生产)，然后37℃反应30分钟，降解样品中污染的基因组DNA。反应后，使用RNAeasy(由QIAGEN制备)再次纯化总RNA，溶解于50微升无菌水中。
使用寡聚o(dT)作为引物的20微升反应混合物中，通过第一条链cDNA合成的SUPERSCRIPT预扩增系统(Life Technologies生产)，根据产品说明进行反转录反应，从3微克得到的总RNA样品中合成单链cDNA。稀释50倍的反应混合物的水溶液用于GFPP和FX克隆。使用前储存于-80℃。
(3)制备中国仓鼠-来源的FX的部分cDNA片段
通过以下步骤制备来源于中国仓鼠-来源的FX的部分cDNA片段。首先，设计人FX cDNA(Genebank登记号U58766)和鼠FX cDNA(Genebank登记号M30127)共同的核苷酸序列的特异引物(在SEQ IDNO：42和43中所示)。
然后，制备25微升含有1微升在条目(2)中制备的CHO/DG44-来源的单链cDNA的反应混合物[ExTaq缓冲液(Takara Shuzo生产)，0.2纳摩尔dNTP和0.5微摩尔/升基因特异性引物(SEQ ID NO：42和43)]，使用DNA聚合酶ExTaq(Takara Shuzo生产)进行聚合酶链反应(PCR)。PCR是94℃加热5分钟，随后进行30个循环，每个循环是94℃加热1分钟，58℃加热2分钟，72℃加热3分钟。最后72℃加热10分钟。
PCR后，反应混合物经过2％琼脂糖电泳分离，然后使用QiaexIIGel Extraction试剂盒(QIAGN产生)，纯化301bp的特异性扩增片段，用20微升无菌水洗涤(在下文中此方法用于从琼脂糖凝胶中纯化DNA片段)。通过TOPO TA Cloning试剂盒Invitrogen生产)根据所附的产品说明，在质粒PCR2.1中插入4微升扩增片段。使用反应混合物，用Cohen等人的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.(美国科学院院报)USA， 69，2110(1972)](在下文中，此方法用于转化E.coli)转化E.coli DH5a。根据已知方法[Nucleic Acids Research(核酸研究)， 7，1513(1979)]从获得的几种卡那霉素-抗性克隆中分离质粒DNA(在下文中，此方法用于分离质粒)，得到2个FX cDNA部分片段分别插入的克隆。它们称pCRFX克隆8和pCRFX克隆12。
使用DNA测序仪377(Applied Biosystems生产)和BigDyeTerminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction试剂盒(AppliedBiosystems生产)，根据产品说明的方法，测定插入到每个FX克隆8和FX克隆12的cDNA核苷酸序列。确定每个插入的序列被测定的cDNA编码中国仓鼠-来源的FX的开放阅读框架(ORF)的部分序列。
(4)合成用于RACE的单链cDNA
使用SMARTTM RACE cDNA扩增试剂盒(CLONTECH生产)，根据产品说明，从条目(1)提取的CHO/DG44总RNA中制备5′RACE和3′RACE单链cDNA样品。反转录中使用PowerScriptTM反转录酶(CLONTECH生产)。每个制备的单链cDNA用试剂盒所附的Tricin-EDTA缓冲液稀释10倍，用作PCR模板。
以条目(3)中测定的中国仓鼠来源的FX的部分序列为基础，设计中国仓鼠FX-特异的5′RACE引物FXGSP1-1(SEQ ID NO：44)和FXGSP 1-2(SEQ ID NO：45)，中国仓鼠FX-特异的3′RACE引物FXGSP2-1(SEQ ID NO：46)和FXGSP2-2(SEQ ID NO：47)。
然后，制备50微升含有条目(4)中制备的1微升用于RACE的CHO/DG44来源的单链的cDNA的反应混合物[Advantage2 PCR缓冲液(CLONTECH生产)，0.2毫摩尔dNTP，0.2微摩尔/升用于RACE的中国仓鼠FX-特异性的引物和1×浓度的共同引物(CLONTECH生产)]，使用Advantage2 PCR试剂盒(CLONTECH生产)进行聚合酶链反应(PCR)。PCR反应进行20个重复循环，每个循环是94℃加热5秒，68℃加热10秒，72℃加热2分钟。
反应完成后，1微升反应混合物用Tricin-EDTA缓冲液稀释50倍，1微升稀释的溶液作为模板，再次制备反应混合物，在相同体积下进行PCR。在第一次和第二次PCR中联合使用的引物和PCR扩增的DNA片段的长度在表2中表示。
                      表2
中国仓鼠-来源的FX cDNA RACE PCR中联合使用的引物和PCR
                   产物大小
5’RACE    FX-特异性    共同引物      PCR扩增
        引物                        产物大小
第一次     FXGSP1-1     UPM(通用
                     引物混合物)
第二次     FXGSP1-2     NUP(嵌套       300bp
                     通用引物)
3’RACE    FX-特异性    共同引物       PCR扩增
        引物                        产物大小
第一次    FXGSP2-1    UPM(通用
                    引物混合物)
第二次    FXGSP2-2    NUP(嵌套    1,100bp
                    通用引物)
PCR后，反应混合物经过1％琼脂糖电泳分离，然后使用QiaexIIGel Extraction试剂盒(QIAGN产生)纯化目的特异性扩增片段，用20微升无菌水洗涤。根据附加于TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen生产)的产品说明，在质粒PCR2.1中插入4微升扩增片段，用反应混合物转化E.coli DH5α。
从出现的几个卡那霉素-抗性克隆中分离质粒DNA，得到6个含有中国仓鼠FX 5’区域的cDNA克隆。它们称FX5’克隆25，FX5’克隆26，FX5’克隆27，FX5’克隆28，FX5’克隆31和FX5’克隆32。
以同样方式获得5个含有中国仓鼠FX3’区域的cDNA克隆。这些FX3’称FX3’克隆1，FX3’3，FX3，克隆6，FX3，克隆8和FX3，克隆9。
使用DNA测序仪377(Applied Biosystems生产)，根据产品说明中描述的方法，通过5’和3’RACE测定获得的每个克隆cDNA组成的核苷酸序列。通过把用此方法测定的cDNA核苷酸序列加以比较，排除PCR中核苷酸阅读错误，确定中国仓鼠-来源的FX cDNA的全长核苷酸序列。测定的序列用SEQ ID NO：48的SEQ ID NO48 ORF代表，相应于95到1060位的核苷酸，除去终止密码子外，相应于95到1057位的核苷酸的氨基酸序列用SEQ ID NO：62表示。
2.测定CHO细胞GFPP cDNA序列
(1)制备中国仓鼠-来源的GFPP的部分cDNA片段
通过以下步骤制备中国仓鼠GFPP的部分cDNA片段。
首先，比较公共数据库中登记的人来源GFPP cDNA的核苷酸序列(Genebank登记号AF017445)，与此核苷酸序列有高度同源性的小鼠EST序列(Genebank登记号AI467195，AA422658，BE304325和AI466474)和大鼠EST序列(Genebank登记号BF546372，AI058400和AW144783)，以这三种中高度保守区域为基础设计对大鼠GFPP的特异引物GFPP FW9和GFPP RV9(SEQ ID NO：49和50)。
然后，制备25微升含有1微升在条目1(2)中制备的CHO/DG44-来源的单链cDNA的反应混合物[ExTaq缓冲液(Takara Shuzo生产)，0.2毫摩尔dNTP和0.5微摩尔/升GFPP特异性引物GFPP FW9和GFPP RV9(SEQ ID NO：49和50)]，使用DNA聚合酶ExTaq(TakaraShuzo生产)进行聚合酶链反应(PCR)。PCR是94℃加热5分钟，随后进行30个循环，每个循环是94℃加热1分钟，58℃加热2分钟，72℃加热3分钟。最后72℃加热10分钟。
PCR后，反应混合物经过2％琼脂糖电泳分离，然后使用QiaexIIGel Extraction试剂盒(QIAGN产生)纯化1.4Kbp的特异性扩增片段，用20微升无菌水洗涤。根据TOPO TA Cloning试剂盒(Invitrogen生产)所附的产品说明，在质粒pCR2.1中插入4微升扩增片段。使用反应混合物，转化E.coli DH5α。
从出现的几种卡那霉素-抗性克隆中分离质粒DNA，得到3个用GFPP部分cDNA片段转染的克隆。它们称为GFPP克隆8，GFPP克隆11，和GFPP克隆12。
使用DNA测序仪377(Applied Biosystems生产)和BigDyeTerminator Cycle Sequencing F S Ready Reaction试剂盒(AppliedBiosystems生产)，根据产品说明描述的方法，测定插入到GFPP克隆8，GFPP克隆11，和GFPP克隆12的cDNA核苷酸序列。证实序列确定的插入cDNA编码中国仓鼠来源的GFPP的部分开放阅读框架(ORF)序列。
(2)用RACE法测定中国仓鼠-来源的GFPP全长cDNA序列
以条目2(1)中确定的中国仓鼠FX部分序列为基础，设计中国仓鼠FX-特异的5’RACE的引物GFPP GSP1-1(SEQ ID NO：52)和GFPPGSP1-2(SEQ ID NO：53)，和中国仓鼠GFPP-特异的3’RACE的引物GFPP GSP2-1(SEQ ID NO：54)和GFPP GSP2-2(SEQ ID NO：55)。
然后，制备50微升含有条目(4)中制备的1微升用于RACE的CHO/DG44来源的单链cDNA的反应混合物[Advantage2 PCR缓冲液(CLONTECH生产)，0.2毫摩尔dNTP，0.2微摩尔/升用于RACE的中国仓鼠GFPP-特异性引物和1×浓度的共同引物(CLONTECH生产)]，进行PCR反应。
PCR反应进行20个重复循环，每个循环是94℃加热5秒，68℃加热10秒，72℃加热2分钟。
反应完成后，1微升反应混合物用Tricin-EDTA缓冲液稀释50倍。用1微升稀释的溶液作为模板，再次制备反应混合物，在相同体积下进行PCR。在第一次和第二次PCR中联合使用的引物和PCR扩增的DNA片段的大小在表3中表示。
                        表3
中国仓鼠-衍生的GFPP cDNARACE PCR中联合使用的引物和
                   PCR产物的大小
5’RACE      GFPP-特异       共同引物        PCR扩增
         性引物                          产物的大小
第一次       GFPPGSP1-1       UPM(通用
                         引物混合物)
第二次       GFPPGSP1-2       NUP(嵌套       1,100bp
                         通用引物)
3’RACE      GFPP-特异        共同引物       PCR扩增
         性引物                          产物的大小
第一次       GFPPGSP2-1       UPM(通用
                         引物混合物)
第二次       GFPPGSP2-2       NUP(嵌套       1,400bp
                         通用引物)
PCR后，反应混合物经过1％琼脂糖电泳分离，然后使用QiaexIIGel Extraction试剂盒(QIAGN产生)纯化目的特异性扩增片段，用20微升无菌水洗涤。根据附加于TOPO TA Cloning试剂盒(Invitrogen生产)的产品说明，在质粒PCR2.1中插入4微升扩增片段，用反应混合物转化E.coli DH5α。
从出现的几个卡那霉素-抗性克隆中分离质粒DNA，得到4个含有中国仓鼠GFPP5’区域的cDNA克隆。它们称GFPP5’克隆1，GFPP5’克隆2，GFPP5’克隆3，GFPP5’克隆4。
以同样方式获得3个含有中国仓鼠GFPP3’区域的cDNA的克隆。它们称为GFPP3’克隆10，GFPP3’克隆16，GFPP3’克隆20。
使用DNA测序仪377(Applied Biosystems生产)，根据产品说明中描述的方法，测定通过5’和3’RACE获得的每个克隆的cDNA的核苷酸序列。测定核苷酸序列后，把核苷酸序列加以比较，排除PCR中碱基的阅读错误，确定中国仓鼠-来源的GFPP cDNA的全长核苷酸序列。确定的序列用SEQ ID NO：51的SEQ ID NO51 ORF代表，相应于27到1799位的核苷酸，除去终止密码子外，相应于27到1796位的核苷酸的氨基酸序列用SEQ ID NO：63表示。
实施例10
测定具有不同比率的无α1，6-岩藻糖的糖链与之结合的抗体分子的抗-CD20嵌合抗体活性
1.制备具有不同比率的无α1，6-岩藻糖的糖链与之结合的抗体分子的抗-CD20嵌合抗体
实施例1的条目3中纯化的KM3065与CHO产生的RituxanTM以KM3065∶RituxanTM＝24∶66，34∶56或44∶46的比率混合。这些样品根据实施例3的方法进行糖链分析。无α1，6-岩藻糖的糖链与之结合的抗体分子比率分别是26％，35％，44％。在下文中，这些样品叫做抗-CD20嵌合抗体(26％)，抗-CD20嵌合抗体(35％)，抗-CD20嵌合抗体(44％)。每个样品的糖链分析结果如图21中所示。
2.测定表达CD20的细胞系结合活性(免疫荧光法)
总共5种抗体，包括实施例10的条目1中制备的3种具有不同的无α1，6-岩藻糖的糖链与抗体分子结合的糖链比率的抗-CD20嵌合抗体，和在实施例3中进行了糖链分析的KM3065和RituxanTM(分别称“抗-CD20嵌合抗体(96％)和抗-CD20嵌合抗体(6％)”)，通过实施例2的条目1描述的免疫荧光法检测这五种抗体的结合活性。如图22所示，所有这些抗体在抗体浓度为0.016到2微克/毫升的情况下，对CD20-阳性Raii细胞(JCRB 9012)几乎表现相同的结合活性。发现无α1，6-岩藻糖的糖链与抗体分子结合的抗体分子，其糖链的比率不影响抗体的抗原结合活性。
3.测定CD20表达细胞系的细胞毒活性(51Cr释放方法)
使用从健康供体A收集的效应细胞，如下测定对CD20-阳性人B淋巴细胞系WIL2-S(ATCC CRL 8885)的ADCC活性
(1)制备靶细胞悬液
制备2×106WIL2-S细胞后，加入3.7MBq当量的放射性物质Na2 51CrO4，37℃反应1小时标记细胞。反应后，细胞重复悬浮于PRMI1640-FCS(10)培养基中，然后离心，这样把细胞漂洗三次。细胞再悬浮于培养基中，4℃置于冰上30分钟，自发的分解放射性物质。离心后，通过加入10毫升培养基，细胞调节到2×105细胞/毫升，作为靶向细胞悬液。
(2)制备人效应细胞悬液
从健康人收集50毫升外周血后，加入0.5毫升肝素钠(ShimizuPharmaceutical生产)，然后轻轻混合。使用Lymphoprep(AXIS SHIELD生产)，根据所附的产品说明，离心混合物(800×g，20分钟)，分离出单核白细胞层。用培养基离心漂洗(1,400rpm，5分钟)三次后，细胞使用培养基重悬，密度达到2×106细胞/毫升，作为人效应细胞悬液。
(3)ADCC活性测定
(1)中制备的靶细胞悬液(50微升)分配于96孔U型底板(Falcon生产)中(1×104细胞/孔)。然后分配(2)中制备的100微升人效应细胞悬液(2×105细胞/孔，人效应细胞与靶向细胞的比率是20∶1)。随后，加入不同的有不同的无α1，6-岩藻糖的糖链结合比率的抗-CD20嵌合抗体，得到终浓度浓度分别为0.001到1微克/毫升，然后37℃反应4小时。反应后，板离心，悬液中51Cr的量用γ-计数器测量。单独使用培养基取代人效应细胞悬液和抗体溶液，用相同程序测量上清中51Cr的量，计算自发释放的51Cr量。使用1摩尔/升盐酸溶液取代抗体溶液和人效应细胞悬液，用相同程序测量材料上清中51Cr的量，计算总释放51Cr的量。细胞毒活性(％)的计算基于以下方程。
Figure A0282757001141
图23表示使用健康供体A的效应细胞，以不同浓度(从0.001到1微克/毫升)的有不同无α1，6-岩藻糖的糖链基团的抗体分子比率的抗-CD20嵌合抗体，得到的ADCC活性测量结果。如图23所示，当无α1，6-岩藻糖的糖链与之结合的抗体分子比率增加时，抗-CD20嵌合抗体的ADCC活性表现出随着每种抗体浓度增加而增加的趋势。当抗体浓度低时，ADCC活性降低。抗体浓度为0.01微克/毫升时，有着26％，35％，44％和96％的无a1，6-岩藻糖的糖链的抗体表现出几乎同样高的ADCC活性，但是有着6％的无a1，6-岩藻糖的糖链的抗体表现出低的ADCC活性。
4.测定CD20表达细胞系的ADCC活性(LDH法)
对Raji细胞的ADCC活性通过实施例2的条目2中描述的LDH(乳酸脱氢酶)活性测量方法，使用从健康供体B中收集的效应细胞测定。效应细胞与靶向细胞的比率是20∶1，最终抗体浓度是0.0001到1微克/毫升。反应是总体积为200微升，37℃进行4小时，然后根据实施例2的条目2进行测量。图24表示使用健康供体B的效应细胞，以不同浓度(从0.001到1微克/毫升)的有不同比率的无α1，6-岩藻糖的糖链结合的抗体分子的抗-CD20嵌合抗体，得到的ADCC活性测量结果。如图24所示，当无α1，6-岩藻糖的糖链结合的抗体分子比率增加时，抗-CD20嵌合抗体的ADCC活性表现出随着每种抗体浓度增加而增加的趋势。当抗体浓度低时，ADCC活性降低。抗体浓度为0.01微克/毫升时，有着26％，35％，44％和96％的无a1，6-岩藻糖的糖链结合的抗体表现出高的ADCC活性，但是有着6％的无a1，6-岩藻糖的糖链结合的抗体表现出低的ADCC活性。
图23和图24的结果表明随着无α1，6-岩藻糖的糖链结合的抗体分子比率增加，ADCC活性增加。无α1，6-岩藻糖的糖链结合的抗体分子比率大约20％或更多时，ADCC活性足够的高。当改变人效应细胞供体和靶细胞时，可以获得相同的结果。
实施例11
测定有不同比率bisecting GlcNAc的糖链结合的抗体分子的抗-CD20嵌合抗体活性
(1)通过凝集素层析法分离抗-CD20嵌合抗体
使用对有bisecting GlcNAc的糖链有亲和力的凝集素固定柱子，分离实施例1的条目3中纯化的抗-CD20嵌合抗体KM3065。
含有纯化的抗-CD20嵌合抗体KM3065的溶液用于凝集素柱子(LA-PHA-E4，4.6×150毫米，Hohnen Corp生产)。使用Shimadzu生产的LC-6A作为HPLC系统，以0.5毫升/分钟的流速和室温作为柱温进行凝集素层析。柱子用50毫摩尔Tris-硫酸缓冲液(pH8.0)平衡，然后注入含有纯化的KM3065的溶液，用50毫摩尔Tris-硫酸缓冲液(pH8.0)的0M到58毫摩尔四硼酸钾(K2B4O7，由Nakalai Tesque制备)线性梯度洗脱(35分钟)。其后，四硼酸钾浓度保持在100毫摩尔5分钟，然后50毫摩尔Tris-硫酸缓冲液(pH8.0)进一步通过柱子20分钟，这样把抗-CD20嵌合抗体KM3065分成4个成分(成分①到④)，4个成分为9到14分钟期间，14到17分钟期间，17到22分钟期间和22到34分钟期间洗脱的。(图25)
(2)糖链分析
这样分离的4个成分(成分①到④)和分离前的抗-CD20嵌合抗体KM3065使用实施例3中描述的方法进行糖链分析。在15分钟到45分钟期间PA修饰的糖链被洗脱。基于每个PA修饰的糖链的峰面积的总和，计算有bisecting GlcNAc的糖链的比率时，分离前抗-CD20嵌合抗体KM3065的糖链比率是20％，然而在成分①中糖链比率是0％，在成分②中糖链比率是8％，在成分③中糖链比率是33％，在成分④中糖链比率是45％(图26)。无α1，6-岩藻糖的糖链结合的抗体分子的比率在抗D20嵌合抗体KM3065分离前是96％，在成分①中是93％，在成分②中是94％，在成分③中是92％，在成分④中是90％。基于这些结果为基础，证实使用对有bisecting GlcNAc的糖链有亲和力的凝集素固定柱子计算时，无α1，6-岩藻糖的糖链结合的抗体分子的比率几乎是恒定的。制备了有不同抗体分子比率的抗-CD20嵌合抗体，其中抗体分子是bisecting GlcNAc的糖链结合的。
(3)测量体外细胞毒活性(ADCC活性)
用实施例2的条目2描述的方法，测定用凝集素层析法分离的4个成分(成分①到④)和分离前的抗-CD20嵌合抗体KM3065的体外细胞毒活性(ADCC活性)(图27)。结果，用凝集素层析法分离的4个成分表现出与分离前的抗-CD20嵌合抗体KM3065几乎相同强度的ADCC活性。因此根据以上结果，无α1，6-岩藻糖的糖链结合的抗体分子几乎有90％到96％的相同比率，认为无α1，6-岩藻糖糖的链基团结合的抗体分子对ADCC活性的影响几乎是相同的。当高比率的无α1，6-岩藻糖的糖链结合的抗体分子的抗体中bisecting GlcNAc进一步增加时，ADCC活性并不增加，同时也有着高ADCC活性。即，发现高无α1，6-岩藻糖的糖链结合比率的抗体，其ADCC活性比高α1，6-岩藻糖的糖链结合比率的抗体高，这与bisecting GlcNAc的存在与否无关。
工业实用性
本发明提供包含特异性的与CD20结合的，有与Fc区域结合的N-糖苷键合的复合糖链的抗体分子的抗体组合物，产生这种抗体组合物的细胞或转基因非人动物或植物，这种抗体组合物的制备方法，和包含抗体组合物的药物。
                       序列表
<110>协和发酵工业株式会社(KYOWA HAKKO KOGYO CO.LTD.)
<120>与CD20特异结合的抗体组合物
<130>CPJPL41616
<150>日本2001-392753
<151>2001-12-25
<150>日本2002-106948
<151>2001-04-09
<150>日本2002-319975
<151>2001-11-01
<160>63
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>2008
<212>DNA
<213>中国地鼠
<400>1
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<210>2
<211>1728
<212>DNA
<213>小鼠
<400>2
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<210>3
<211>9196
<212>DNA
<213>中国地鼠
<400>3
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tttcaaattt aggctagttc actagttgtg tgtaaggtta tggctgcaaa catctttgac 5820
tcttggttag ggaatccagg atgatttacg tgtttggcca aaatcttgtt ccattctggg 5880
tttcttctct atctaggtag ctagcacaag ttaaaggtgt ggtagtattg gaaggctctc 5940
aggtatatat ttctatattc tgtatttttt tcctctgtca tatatttgct ttctgtttta 6000
ttgatttcta ctgttagttt gatacttact ttcttacact ttctttggga tttattttgc 6060
tgttctaaga tttcttagca agttcatatc actgatttta acagttgctt cttttgtaat 6120
atagactgaa tgccccttat ttgaaatgct tgggatcaga aactcagatt tgaacttttc 6180
ttttttaata tttccatcaa gtttaccagc tgaatgtcct gatccaagaa tatgaaatct 6240
gaaatgcttt gaaatctgaa acttttagag tgataaagct tccctttaaa ttaatttgtg 6300
ttctatattt tttgacaatg tcaacctttc attgttatcc aatgagtgaa catattttca 6360
atttttttgt ttgatctgtt atattttgat ctgaccatat ttataaaatt ttatttaatt 6420
tgaatgttgt gctgttactt atctttatta ttatttttgc ttattttcta gccaaatgaa 6480
attatattct gtattatttt agtttgaatt ttactttgtg gcttagtaac tgccttttgt 6540
tggtgaatgc ttaagaaaaa cgtgtggtct actgatattg gttctaatct tatatagcat 6600
gttgtttgtt aggtagttga ttatgctggt cagattgtct tgagtttatg caaatgtaaa 6660
atatttagat gcttgttttg ttgtctaaga acaaagtatg cttgctgtct cctatcggtt 6720
ctggtttttc cattcatctc ttcaagctgt tttgtgtgtt gaatactaac tccgtactat 6780
cttgttttct gtgaattaac cccttttcaa aggtttcttt tctttttttt tttaagggac 6840
aacaagttta ttcagattac attttaagct gataatgtat gattgcaagg ttatcaacat 6900
ggcagaaatg tgaagaagct aggcacatta catccacatg gagtcaagag cagagagcag 6960
tgaattaatg catgcattcc tgtggtcagc tcacttttcc tattcttaga tagtctagga 7020
tcataaacct ggggaatagt gctaccacaa tgggcatatc cacttacttc agttcatgca 7080
atcaaccaag gcacatccac aggaaaaact gatttagaca acctctcatt gagactcttc 7140
ccagatgatt agactgtgtc aagttgacaa ttaaaactat cacacctgaa gccatcacta 7200
gtaaatataa tgaaaatgtt gattatcacc ataattcatc tgtatccctt tgttattgta 7260
gattttgtga agttcctatt caagtccctg ttccttcctt aaaaacctgt tttttagtta 7320
aataggtttt ttagtgttcc tgtctgtaaa tactttttta aagttagata ttattttcaa 7380
gtatgttctc ccagtctttg gcttgtattt tcatcccttc aatacatata tttttgtaat 7440
ttattttttt tatttaaatt agaaacaaag ctgcttttac atgtcagtct cagttccctc 7500
tccctcccct cctcccctgc tccccaccta agccccaatt ccaactcctt tcttctcccc 7560
aggaagggtg aggccctcca tgggggaaat cttcaatgtc tgtcatatca tttggagcag 7620
ggcctagacc ctccccagtg tgtctaggct gagagagtat ccctctatgt ggagagggct 7680
cccaaagttc atttgtgtac taggggtaaa tactgatcca ctatcagtgg ccccatagat 7740
tgtccggacc tccaaactga cttcctcctt cagggagtct ggaacagttc tatgctggtt 7800
tcccagatat cagtctgggg tccatgagca accccttgtt caggtcagtt gtttctgtag 7860
gtttccccag cccggtcttg acccctttgc tcatcacttc tccctctctg caactggatt 7920
ccagagttca gctcagtgtt tagctgtggg tgtctgcatc tgcttccatc agctactgga 7980
tgagggctct aggatggcat ataaggtagt catcagtctc attatcagag aagggctttt 8040
aaggtagcct cttgattatt gcttagattg ttagttgggg tcaaccttgt aggtctctgg 8100
acagtgacag aattctcttt aaacctataa tggctccctc tgtggtggta tcccttttct 8160
tgctctcatc cgttcctccc ctgactagat cttcctgctc cctcatgtcc tcctctcccc 8220
tccccttctc cccttctctt tcttctaact ccctctcccc tccacccacg atccccatta 8280
gcttatgaga tcttgtcctt attttagcaa aacctttttg gctataaaat taattaattt 8340
aatatgctta tatcaggttt attttggcta gtatttgtat gtgtttggtt agtgttttta 8400
accttaattg acatgtatcc ttatatttag acacagattt aaatatttga agtttttttt 8460
tttttttttt ttaaagattt atttattttt tatgtcttct gcctgcatgc cagaagaggg 8520
caccagatct cattcaaggt ggttgtgagc caccatgtgg ttgctgggaa ttgaactcag 8580
gacctctgga agaacagtca gtgctcttaa ccgctgagcc atctctccag cccctgaagt 8640
gtttctttta aagaggatag cagtgcatca tttttccctt tgaccaatga ctcctacctt 8700
actgaattgt tttagccatt tatatgtaat gctgttacca ggtttacatt ttcttttatc 8760
ttgctaaatt tcttccctgt ttgtctcatc tcttattttt gtctgttgga ttatataggc 8820
ttttattttt ctgtttttac agtaagttat atcaaattaa aattatttta tggaatgggt 8880
gtgttgacta catgtatgtc tgtgcaccat gtgctgacct ggtcttggcc agaagaaggt 8940
gtcatattct ctgaaactgg tattgtggat gttacgaact gccatagggt gctaggaatc 9000
aaaccccagc tcctctggaa aagcagccac tgctctgagc cactgagtcc tctcttcaag 9060
caggtgatgc caacttttaa tggttaccag tggataagag tgcttgtatc tctagcaccc 9120
atgaaaattt atgcattgct atatgggctt gtcacttcag cattgtgtga cagagacagg 9180
aggatcccaa gagctc                                               9196
<210>4
<211>297
<212>PRT
<213>人类
<400>4
Met Thr Thr Pro Arg Asn Ser Val Asn Gly Thr Phe Pro Ala Glu Pro
  1               5                  10                  15
Met Lys Gly Pro Ile Ala Met Gln Ser Gly Pro Lys Pro Leu Phe Arg
             20                  25                  30
Arg Met Ser Ser Leu Val Gly Pro Thr Gln Ser Phe Phe Met Arg Glu
         35                  40                  45
Ser Lys Thr Leu Gly Ala Val Gln Ile Met Asn Gly Leu Phe His Ile
     50                  55                  60
Ala Leu Gly Gly Leu Leu Met Ile Pro Ala Gly Ile Tyr Ala Pro Ile
 65                  70                  75                  80
Cys Val Thr Val Trp Tyr Pro Leu Trp Gly Gly Ile Met Tyr Ile Ile
                 85                  90                  95
Ser Gly Ser Leu Leu Ala Ala Thr Glu Lys Asn Ser Arg Lys Cys Leu
            100                 105                 110
Val Lys Gly Lys Met Ile Met Asn Ser Leu Ser Leu Phe Ala Ala Ile
        115                 120                 125
Ser Gly Met Ile Leu Ser Ile Met Asp Ile Leu Asn Ile Lys Ile Ser
    130                 135                 140
His Phe Leu Lys Met Glu Ser Leu Asn Phe Ile Arg Ala His Thr Pro
145                 150                 155                 160
Tyr Ile Asn Ile Tyr Asn Cys Glu Pro Ala Asn Pro Ser Glu Lys Asn
                165                 170                 175
Ser Pro Ser Thr Gln Tyr Cys Tyr Ser Ile Gln Ser Leu Phe Leu Gly
            180                 185                 190
Ile Leu Ser Val Met Leu Ile Phe Ala Phe Phe Gln Glu Leu Val Ile
        195                 200                 205
Ala Gly Ile Val Glu Asn Glu Trp Lys Arg Thr Cys Ser Arg Pro Lys
    210                 215                 220
Ser Asn Ile Val Leu Leu Ser Ala Glu Glu Lys Lys Glu Gln Thr Ile
225                 230                 235                 240
Glu Ile Lys Glu Glu Val Val Gly Leu Thr Glu Thr Ser Ser Gln Pro
                245                 250                 255
Lys Asn Glu Glu Asp Ile Glu Ile Ile Pro Ile Gln Glu Glu Glu Glu
            260                 265                 270
Glu Glu Thr Glu Thr Asn Phe Pro Glu Pro Pro Gln Asp Gln Glu Ser
        275                 280                 285
Ser Pro Ile Glu Asn Asp Ser Ser Pro
    290                 295
<210>5
<211>10
<212>PRT
<213>小鼠
<400>5
Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile His
  1               5
<210>6
<211>7
<212>PRT
<213>小鼠
<400>6
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser
  1               5
<210>7
<211>9
<212>PRT
<213>小鼠
<400>7
Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr
 1                5
<210>8
<211>5
<212>PRT
<213>小鼠
<400>8
Ser Tyr Asn Met His
  1
<210>9
<211>17
<212>PRT
<213>小鼠
<400>9
Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
  1               5                  10                  15
Gly
<210>10
<211>12
<212>PRT
<213>小鼠
<400>10
Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val
  1               5                  10
<210>11
<211>384
<212>DNA
<213>小鼠
<400>11
atg gat ttt cag gtg cag att atc agc ttc ctg cta atc agt gct tca    48
Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Ile Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser
  1               5                  10                  15
gtc ata atg tcc aga gga caa att gtt ctc tcc cag tct cca gca atc    96
Val Ile Met Ser Arg Gly Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile
             20                  25                  30
ctg tct gca tct cca ggg gag aag gtc aca atg act tgc agg gcc agc    144
Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser
         35                  40                  45
tca agt gta agt tac atc cac tgg ttc cag cag aag cca gga tcc tcc    192
Ser Ser Val Ser Tyr Ile His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser
     50                  55                  60
ccc aaa ccc tgg att tat gcc aca tcc aac ctg gct tct gga gtc cct    240
Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
  65                 70                  75                  80
gtt cgc ttc agt ggc agt ggg tct ggg act tct tac tct ctc acc atc    288
Val Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile
                 85                  90                  95
agc aga gtg gag gct gaa gat gct gcc act tat tac tgc cag cag tgg    336
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp
            100                 105                 110
act agt aac cca ccc acg ttc gga ggg ggg acc aag ctg gaa atc aaa    384
Thr Ser Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
        115                 120                 125
<210>12
<211>128
<212>PRT
<213>小鼠
<400>12
Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Ile Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser
  1               5                  10                  15
Val Ile Met Ser Arg Gly Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile
             20                  25                  30
Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser
         35                  40                  45
Ser Ser Val Ser Tyr Ile His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser
     50                  55                  60
Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
 65                  70                  75                  80
Val Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile
                 85                  90                  95
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp
            100                 105                 110
Thr Ser Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
        115                 120                 125
<210>13
<211>420
<212>DNA
<213>小鼠
<400>13
atg ggt tgg agc ctc atc ttg ctc ttc ctt gtc gct gtt gct acg cgt    48
Met Gly Trp Ser Leu Ile Leu Leu Phe Leu Val Ala Val Ala Thr Arg
  1               5                  10                  15
gtc ctg tcc cag gta caa ctg cag cag cct ggg gct gag ctg gtg aag    96
Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys
             20                  25                  30
cct ggg gcc tca gtg aag atg tcc tgc aag gct tct ggc tac aca ttt    144
Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
         35                  40                  45
acc agt tac aat atg cac tgg gta aaa cag aca cct ggt cgg ggc ctg    192
Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu
     50                  55                  60
gaa tgg att gga gct att tat ccc gga aat ggt gat act tcc tac aat    240
Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn
 65                  70                  75                  80
cag gag ttc aaa ggc aag gcc aca ttg act gca gac aaa tcc tcc agc    288
Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser
                 85                  90                  95
aca gcc tac atg cag ctc agc agc ctg aca tct gag gac tct gcg gtc    336
Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
            100                 105                 110
tat tac tgt gca aga tcg act tac tac ggc ggt gac tgg tac ttc aat    384
Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn
        115                 120                 125
gtc tgg ggc gca ggg acc acg gtc acc gtc tct gca                    420
Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala
    130                 135                 140
<210>14
<211>140
<212>PRT
<213>小鼠
<400>14
Met Gly Trp Ser Leu Ile Leu Leu Phe Leu Val Ala Val Ala Thr Arg
  1               5                  10                  15
Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys
             20                  25                  30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
         35                  40                  45
Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu
     50                  55                  60
Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn
 65                  70              75                      80
Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser
                 85              90                      95
Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
            100             105                     110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn
        115             120                     125
Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala
    130             135
<210>15
<211>91
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：合成DNA
<400>15
caggaaacag ctatgacgaa ttcgcctcct caaaatggat tttcaggtgc agattatcag  60
cttcctgcta atcagtgctt cagtcataat g                                 91
<210>16
<211>91
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：合成DNA
<400>16
gtgaccttct cccctggaga tgcagacagg attgctggag actgggagag aacaatttgt  60
cctctggaca ttatgactga agcactgatt a                                 91
<210>17
<211>90
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：合成DNA
<400>17
ctccagggga gaaggtcaca atgacttgca gggccagctc aagtgtaagt tacatccact  60
ggttccagca gaagccagga tcctccccca                                   90
<210>18
<211>89
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：合成DNA
<400>18
ccagacccac tgccactgaa gcgaacaggg actccagaag ccaggttgga tgtggcataa 60
atccagggtt tgggggagga tcctggctt                                   89
<210>19
<211>91
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：合成DNA
<400>19
tcagtggcag tgggtctggg acttcttact ctctcaccat cagcagagtg gaggctgaag 60
atgctgccac ttattactgc cagcagtgga c                                91
<210>20
<211>90
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：合成DNA
<400>20
gttttcccag tcacgaccgt acgtttgatt tccagcttgg tcccccctcc gaacgtgggt 60
gggttactag tccactgctg gcagtaataa                                  90
<210>21
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：合成DNA
<400>21
gtctgaagca ttatgtgttg aagc                                      24
<210>22
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：合成DNA
<400>22
gtgagtacat tcattgtact gtg                                       23
<210>23
<211>575
<212>PRT
<213>中国地鼠
<400>23
Met Arg Ala Trp Thr Gly Ser Trp Arg Trp Ile Met Leu Ile Leu Phe
  1               5                  10                  15
Ala Trp Gly Thr Leu Leu Phe Tyr Ile Gly Gly His Leu Val Arg Asp
             20                  25                  30
Asn Asp His Pro Asp His Ser Ser Arg Glu Leu Ser Lys Ile Leu Ala
         35                  40                  45
Lys Leu Glu Arg Leu Lys Gln Gln Asn Glu Asp Leu Arg Arg Met Ala
     50                  55                  60
Glu Ser Leu Arg Ile Pro Glu Gly Pro Ile Asp Gln Gly Thr Ala Thr
 65                  70                  75                  80
Gly Arg Val Arg Val Leu Glu Glu Gln Leu Val Lys Ala Lys Glu Gln
                 85                  90                  95
Ile Glu Asn Tyr Lys Lys Gln Ala Arg Asn Asp Leu Gly Lys Asp His
            100                 105                 110
Glu Ile Leu Arg Arg Arg Ile Glu Asn Gly Ala Lys Glu Leu Trp Phe
        115                 120                 125
Phe Leu Gln Ser Glu Leu Lys Lys Leu Lys Lys Leu Glu Gly Asn Glu
    130                 135                 140
Leu Gln Arg His Ala Asp Glu Ile Leu Leu Asp Leu Gly His His Glu
145                 150                 155                 160
Arg Ser Ile Met Thr Asp Leu Tyr Tyr Leu Ser Gln Thr Asp Gly Ala
                165                 170                 175
Gly Glu Trp Arg Glu Lys Glu Ala Lys Asp Leu Thr Glu Leu Val Gln
            180                 185                 190
Arg Arg Ile Thr Tyr Leu Gln Asn Pro Lys Asp Cys Ser Lys Ala Arg
        195                 200                 205
Lys Leu Val Cys Asn Ile Asn Lys Gly Cys Gly Tyr Gly Cys Gln Leu
    210                 215                 220
His His Val Val Tyr Cys Phe Met Ile Ala Tyr Gly Thr Gln Arg Thr
225                 230                 235                 240
Leu Ile Leu Glu Ser Gln Asn Trp Arg Tyr Ala Thr Gly Gly Trp Glu
                245                 250                 255
Thr Val Phe Arg Pro Val Ser Glu Thr Cys Thr Asp Arg Ser Gly Leu
            260                 265                 270
Ser Thr Gly His Trp Ser Gly Glu Val Lys Asp Lys Asn Val Gln Val
        275                 280                 285
Val Glu Leu Pro Ile Val Asp Ser Leu His Pro Arg Pro Pro Tyr Leu
    290                 295                 300
Pro Leu Ala Val Pro Glu Asp Leu Ala Asp Arg Leu Leu Arg Val His
305                 310                 315                 320
Gly Asp Pro Ala Val Trp Trp Val Ser Gln Phe Val Lys Tyr Leu Ile
                325                 330                 335
Arg Pro Gln Pro Trp Leu Glu Arg Glu Ile Glu Glu Thr Thr Lys Lys
            340                 345                 350
Leu Gly Phe Lys His Pro Val Ile Gly Val His Val Arg Arg Thr Asp
        355                 360                 365
Lys Val Gly Thr Glu Ala Ala Phe His Pro Ile Glu Glu Tyr Met Val
    370                 375                 380
His Val Glu Glu His Phe Gln Leu Leu Glu Arg Arg Met Lys Val Asp
385                 390                 395                 400
Lys Lys Arg Val Tyr Leu Ala Thr Asp Asp Pro Ser Leu Leu Lys Glu
                405                 410                 415
Ala Lys Thr Lys Tyr Ser Asn Tyr Glu Phe Ile Ser Asp Asn Ser Ile
            420                 425                 430
Ser Trp Ser Ala Gly Leu His Asn Arg Tyr Thr Glu Asn Ser Leu Arg
        435                 440                 445
Gly Val Ile Leu Asp Ile His Phe Leu Ser Gln Ala Asp Phe Leu Val
    450                 455                 460
Cys Thr Phe Ser Ser Gln Val Cys Arg Val Ala Tyr Glu Ile Met Gln
465                 470                 475                 480
Thr Leu His Pro Asp Ala Ser Ala Asn Phe His Ser Leu Asp Asp Ile
                485                 490                 495
Tyr Tyr Phe Gly Gly Gln Asn Ala His Asn Gln Ile Ala Val Tyr Pro
            500                 505                 510
His Gln Pro Arg Thr Lys Glu Glu Ile Pro Met Glu Pro Gly Asp Ile
        515                 520                 525
Ile Gly Val Ala Gly Asn His Trp Asn Gly Tyr Ser Lys Gly Val Asn
    530                 535                 540
Arg Lys Leu Gly Lys Thr Gly Leu Tyr Pro Ser Tyr Lys Val Arg Glu
545                 550                 555                 560
Lys Ile Glu Thr Val Lys Tyr Pro Thr Tyr Pro Glu Ala Glu Lys
                565                 570                 575
<210>24
<211>575
<212>PRT
<213>小鼠
<400>24
Met Arg Ala Trp Thr Gly Ser Trp Arg Trp Ile Met Leu Ile Leu Phe
  1               5                  10                  15
Ala Trp Gly Thr Leu Leu Phe Tyr Ile Gly Gly His Leu Val Arg Asp
             20                  25                 30
Asn Asp His Pro Asp His Ser Ser Arg Glu Leu Ser Lys Ile Leu Ala
         35                  40                  45
Lys Leu Glu Arg Leu Lys Gln Gln Asn Glu Asp Leu Arg Arg Met Ala
     50                  55                  60
Glu Ser Leu Arg Ile Pro Glu Gly Pro Ile Asp Gln Gly Thr Ala Thr
 65                  70                  75                  80
Gly Arg Val Arg Val Leu Glu Glu Gln Leu Val Lys Ala Lys Glu Gln
                 85                  90                  95
Ile Glu Asn Tyr Lys Lys Gln Ala Arg Asn Gly Leu Gly Lys Asp His
            100                 105                 110
Glu Ile Leu Arg Arg Arg Ile Glu Asn Gly Ala Lys Glu Leu Trp Phe
        115                 120                 125
Phe Leu Gln Ser Glu Leu Lys Lys Leu Lys His Leu Glu Gly Asn Glu
    130                 135                 140
Leu Gln Arg His Ala Asp Glu Ile Leu Leu Asp Leu Gly His His Glu
145                 150                 155                 160
Arg Ser Ile Met Thr Asp Leu Tyr Tyr Leu Ser Gln Thr Asp Gly Ala
                165                 170                 175
Gly Asp Trp Arg Glu Lys Glu Ala Lys Asp Leu Thr Glu Leu Val Gln
            180                 185                 190
Arg Arg Ile Thr Tyr Leu Gln Asn Pro Lys Asp Cys Ser Lys Ala Arg
        195                 200                 205
Lys Leu Val Cys Asn Ile Asn Lys Gly Cys Gly Tyr Gly Cys Gln Leu
    210                 215                 220
His His Val Val Tyr Cys Phe Met Ile Ala Tyr Gly Thr Gln Arg Thr
225                 230                 235                 240
Leu Ile Leu Glu Ser Gln Asn Trp Arg Tyr Ala Thr Gly Gly Trp Glu
                245                 250                 255
Thr Val Phe Arg Pro Val Ser Glu Thr Cys Thr Asp Arg Ser Gly Leu
            260                 265                 270
Ser Thr Gly His Trp Ser Gly Glu Val Asn Asp Lys Asn Ile Gln Val
        275                 280                 285
Val Glu Leu Pro Ile Val Asp Ser Leu His Pro Arg Pro Pro Tyr Leu
    290                 295                 300
Pro Leu Ala Val Pro Glu Asp Leu Ala Asp Arg Leu Leu Arg Val His
305                 310                 315                 320
Gly Asp Pro Ala Val Trp Trp Val Ser Gln Phe Val Lys Tyr Leu Ile
                325                 330                 335
Arg Pro Gln Pro Trp Leu Glu Lys Glu Ile Glu Glu Ala Thr Lys Lys
            340                 345                 350
Leu Gly Phe Lys His Pro Val Ile Gly Val His Val Arg Arg Thr Asp
        355                 360                 365
Lys Val Gly Thr Glu Ala Ala Phe His Pro Ile Glu Glu Tyr Met Val
    370                 375                 380
His Val Glu Glu His Phe Gln Leu Leu Ala Arg Arg Met Gln Val Asp
385                 390                 395                 400
Lys Lys Arg Val Tyr Leu Ala Thr Asp Asp Pro Thr Leu Leu Lys Glu
                405                 410                 415
Ala Lys Thr Lys Tyr Ser Asn Tyr Glu Phe Ile Ser Asp Asn Ser Ile
            420                 425                 430
Ser Trp Ser Ala Gly Leu His Asn Arg Tyr Thr Glu Asn Ser Leu Arg
        435                 440                 445
Gly Val Ile Leu Asp Ile His Phe Leu Ser Gln Ala Asp Phe Leu Val
    450                 455                 460
Cys Thr Phe Ser Ser Gln Val Cys Arg Val Ala Tyr Glu Ile Met Gln
465                 470                 475                 480
Thr Leu His Pro Asp Ala Ser Ala Asn Phe His Ser Leu Asp Asp Ile
                485                 490                 495
Tyr Tyr Phe Gly Gly Gln Asn Ala His Asn Gln Ile Ala Val Tyr Pro
            500                 505                 510
His Lys Pro Arg Thr Glu Glu Glu Ile Pro Met Glu Pro Gly Asp Ile
        515                 520                 525
Ile Gly Val Ala Gly Ash His Trp Asp Gly Tyr Ser Lys Gly Ile Asn
    530                 535                 540
Arg Lys Leu Gly Lys Thr Gly Leu Tyr Pro Ser Tyr Lys Val Arg Glu
545                 550                 555                 560
Lys Ile Glu Thr Val Lys Tyr Pro Thr Tyr Pro Glu Ala Glu Lys
                565                 570                 575
<210>25
<211>99
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：合成DNA
<400>25
caggaaacag ctatgacgcg gccgcgaccc ctcaccatgg gttggagcct catcttgctc      60
ttccttgtcg ctgttgctac gcgtgtcctg tcccaggta                             99
<210>26
<211>98
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：合成DNA
<400>26
atgtgtagcc agaagccttg caggacatct tcactgaggc cccagccttc accagctcag      60
ccccaggctg ctgcagttgt acctgggaca ggacacgc                              98
<210>27
<211>97
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：合成DNA
<400>27
caaggcttct ggctacacat ttaccagtta caatatgcac tgggtaaaac agacacctgg      60
tcggggcctg gaatggattg gagctattta tcccgga                               97
<210>28
<211>99
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：合成DNA
<400>28
gtaggctgtg ctggaggatt tgtctgcagt caatgtggcc ttgcctttga acttctgatt      60
gtaggaagta tcaccatttc cgggataaat agctccaat                             99
<210>29
<211>99
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：合成DNA
<400>29
aatcctccag cacagcctac atgcagctca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct      60
attactgtgc aagatcgact tactacggcg gtgactggt                             99
<210>30
<211>98
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：合成DNA
<400>30
gttttcccag tcacgacggg cccttggtgg aggctgcaga gacggtgacc gtggtccctg      60
cgccccagac attgaagtac cagtcaccgc cgtagtaa                              98
<210>31
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：合成DNA
<400>31
gagctggtga agcctggggc ctcag                                            25
<210>32
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：合成DNA
<400>32
atggctcaag ctcccgctaa gtgcccga                                         28
<210>33
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：合成DNA
<400>33
tcaagcgttt gggttggtcc tcatgag                                          27
<210>34
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：合成DNA
<400>34
tccggggatg gcgagatggg caagc                                            25
<210>35
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：合成DNA
<400>35
cttgacatgg ctctgggctc caag                                             24
<210>36
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：合成DNA
<400>36
ccacttcagt cggtcggtag tattt                                            25
<210>37
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：合成DNA
<400>37
cgctcacccg cctgaggcga catg                                             24
<210>38
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：合成DNA
<400>38
ggcaggtgct gtcggtgagg tcaccatagt gc                                    32
<210>39
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：合成DNA
<400>39
ggggccatgc caaggactat gtcg                                             24
<210>40
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：合成DNA
<400>40
atgtggctga tgttacaaaa tgatg                                            25
<210>41
<211>1504
<212>DNA
<213>中国地鼠
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1119)
<400>41
atg gct cac gct ccc gct agc tgc ccg agc tcc agg aac tct ggg gac        48
Met Ala His Ala Pro Ala Ser Cys Pro Ser Ser Arg Asn Ser Gly Asp
  1               5                  10                  15
ggc gat aag ggc aag ccc agg aag gtg gcg ctc atc acg ggc atc acc    96
Gly Asp Lys Gly Lys Pro Arg Lys Val Ala Leu Ile Thr Gly Ile Thr
             20                  25                  30
ggc cag gat ggc tca tac ttg gca gaa ttc ctg ctg gag aaa gga tac    144
Gly Gln Asp Gly Ser Tyr Leu Ala Glu Phe Leu Leu Glu Lys Gly Tyr
         35                  40                  45
gag gtt cat gga att gta cgg cga tcc agt tca ttt aat aca ggt cga    192
Glu Val His Gly Ile Val Arg Arg Ser Ser Ser Phe Asn Thr Gly Arg
     50                  55                  60
att gaa cat tta tat aag aat cca cag gct cat att gaa gga aac atg    240
Ile Glu His Leu Tyr Lys Asn Pro Gln Ala His Ile Glu Gly Asn Met
 65                  70                  75                  80
aag ttg cac tat ggt gac ctc acc gac agc acc tgc cta gta aaa atc    288
Lys Leu His Tyr Gly Asp Leu Thr Asp Ser Thr Cys Leu Val Lys Ile
                 85                  90                  95
atc aat gaa gtc aaa cct aca gag atc tac aat ctt ggt gcc cag agc    336
Ile Asn Glu Val Lys Pro Thr Glu Ile Tyr Asn Leu Gly Ala Gln Ser
            100                 105                 110
cat gtc aag att tcc ttt gac tta gca gag tac act gca gat gtt gat    384
His Val Lys Ile Ser Phe Asp Leu Ala Glu Tyr Thr Ala Asp Val Asp
        115                 120                 125
gga gtt ggc acc ttg cgg ctt ctg gat gca att aag act tgt ggc ctt    432
Gly Val Gly Thr Leu Arg Leu Leu Asp Ala Ile Lys Thr Cys Gly Leu
    130                 135                 140
ata aat tct gtg aag ttc tac cag gcc tca act agt gaa ctg tat gga    480
Ile Asn Ser Val Lys Phe Tyr Gln Ala Ser Thr Ser Glu Leu Tyr Gly
145                 150                 155                 160
aaa gtg caa gaa ata ccc cag aaa gag acc acc cct ttc tat cca agg    528
Lys Val Gln Glu Ile Pro Gln Lys Glu Thr Thr Pro Phe Tyr Pro Arg
                165                 170                 175
tcg ccc tat gga gca gcc aaa ctt tat gcc tat tgg att gta gtg aac    576
Ser Pro Tyr Gly Ala Ala Lys Leu Tyr Ala Tyr Trp Ile Val Val Asn
            180                 185                 190
ttt cga gag gct tat aat ctc ttt gcg gtg aac ggc att ctc ttc aat    624
Phe Arg Glu Ala Tyr Asn Leu Phe Ala Val Asn Gly Ile Leu Phe Asn
        195                 200                 205
cat gag agt cct aga aga gga gct aat ttt gtt act cga aaa att agc    672
His Glu Ser Pro Arg Arg Gly Ala Asn Phe Val Thr Arg Lys Ile Ser
    210                 215                 220
cgg tca gta gct aag att tac ctt gga caa ctg gaa tgt ttc agt ttg    720
Arg Ser Val Ala Lys Ile Tyr Leu Gly Gln Leu Glu Cys Phe Ser Leu
225                 230                 235                 240
gga aat ctg gac gcc aaa cga gac tgg ggc cat gcc aag gac tat gtc    768
Gly Asn Leu Asp Ala Lys Arg Asp Trp Gly His Ala Lys Asp Tyr Val
                245                 250                 255
gag gct atg tgg ctg atg tta caa aat gat gaa cca gag gac ttt gtc    816
Glu Ala Met Trp Leu Met Leu Gln Asn Asp Glu Pro Glu Asp Phe Val
            260                 265                 270
ata gct act ggg gaa gtt cat agt gtc cgt gaa ttt gtt gag aaa tca    864
Ile Ala Thr Gly Glu Val His Ser Val Arg Glu Phe Val Glu Lys Ser
        275                 280                 285
ttc atg cac att gga aag acc att gtg tgg gaa gga aag aat gaa aat    912
Phe Met His Ile Gly Lys Thr Ile Val Trp Glu Gly Lys Asn Glu Asn
    290                 295                 300
gaa gtg ggc aga tgt aaa gag acc ggc aaa att cat gtg act gtg gat   960
Glu Val Gly Arg Cys Lys Glu Thr Gly Lys Ile His Val Thr Val Asp
305                 310                 315                 320
ctg aaa tac tac cga cca act gaa gtg gac ttc ctg cag gga gac tgc   1008
Leu Lys Tyr Tyr Arg Pro Thr Glu Val Asp Phe Leu Gln Gly Asp Cys
                325                 330                 335
tcc aag gcg cag cag aaa ctg aac tgg aag ccc cgc gtt gcc ttt gac   1056
Ser Lys Ala Gln Gln Lys Leu Asn Trp Lys Pro Arg Val Ala Phe Asp
            340                 345                 350
gag ctg gtg agg gag atg gtg caa gcc gat gtg gag ctc atg aga acc   1104
Glu Leu Val Arg Glu Met Val Gln Ala Asp Val Glu Leu Met Arg Thr
        355                 360                 365
aac ccc aac gcc tga gcacctctac aaaaaaattc gcgagacatg gactatggtg   1159
Asn Pro Asn Ala
    370
cagagccagc caaccagagt ccagccactc ctgagaccat cgaccataaa ccctcgactg 1219
cctgtgtcgt ccccacagct aagagctggg ccacaggttt gtgggcacca ggacggggac 1279
actccagagc taaggccact tcgcttttgt caaaggctcc tctcaatgat tttgggaaat 1339
caagaagttt aaaatcacat actcatttta cttgaaatta tgtcactaga caacttaaat 1399
ttttgagtct tgagattgtt tttctctttt cttattaaat gatctttcta tgacccagca 1459
aaaaaaaaaa aaaaaaggga tataaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa                 1504
<210>42
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：合成DNA
<400>42
gccatccaga aggtggt                                                     17
<210>43
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：合成DNA
<400>43
gtcttgtcag ggaagat                                                     17
<210>44
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：合成DNA
<400>44
ggcaggagac caccttgcga gtgcccac                                         28
<210>45
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：合成DNA
<400>45
gggtgggctg taccttctgg aacagggc                                         28
<210>46
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：合成DNA
<400>46
ggcgctggct tacccggaga ggaatggg                                         28
<210>47
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：合成DNA
<400>47
ggaatgggtg tttgtctcctc caaagatgc                                       28
<210>48
<211>1316
<212>DNA
<213>中国地鼠
<400>48
gccccgcccc ctccacctgg accgagagta gctggagaat tgtgcaccgg aagtagctct      60
tggactggtg gaaccctgcg caggtgcagc aacaatgggt gagccccagg gatccaggag 120
gatcctagtg acagggggct ctggactggt gggcagagct atccagaagg tggtcgcaga 180
tggcgctggc ttacccggag aggaatgggt gtttgtctcc tccaaagatg cagatctgac 240
ggatgcagca caaacccaag ccctgttcca gaaggtacag cccacccatg tcatccatct 300
tgctgcaatg gtaggaggcc ttttccggaa tatcaaatac aacttggatt tctggaggaa 360
gaatgtgcac atcaatgaca acgtcctgca ctcagctttc gaggtgggca ctcgcaaggt 420
ggtctcctgc ctgtccacct gtatcttccc tgacaagacc acctatccta ttgatgaaac 480
aatgatccac aatggtccac cccacagcag caattttggg tactcgtatg ccaagaggat 540
gattgacgtg cagaacaggg cctacttcca gcagcatggc tgcaccttca ctgctgtcat 600
ccctaccaat gtctttggac ctcatgacaa cttcaacatt gaagatggcc atgtgctgcc 660
tggcctcatc cataaggtgc atctggccaa gagtaatggt tcagccttga ctgtttgggg 720
tacagggaaa ccacggaggc agttcatcta ctcactggac ctagcccggc tcttcatctg 780
ggtcctgcgg gagtacaatg aagttgagcc catcatcctc tcagtgggcg aggaagatga 840
agtctccatt aaggaggcag ctgaggctgt agtggaggcc atggacttct gtggggaagt 900
cacttttgat tcaacaaagt cagatgggca gtataagaag acagccagca atggcaagct 960
tcgggcctac ttgcctgatt tccgtttcac acccttcaag caggctgtga aggagacctg 1020
tgcctggttc accgacaact atgagcaggc ccggaagtga agcatgggac aagcgggtgc 1080
tcagctggca atgcccagtc agtaggctgc agtctcatca tttgcttgtc aagaactgag 1140
gacagtatcc agcaacctga gccacatgct ggtctctctg ccagggggct tcatgcagcc 1200
atccagtagg gcccatgttt gtccatcctc gggggaaggc cagaccaaca ccttgtttgt 1260
ctgcttctgc cccaacctca gtgcatccat gctggtcctg ctgtcccttg tctaga     1316
<210>49
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：合成DNA
<400>49
gatcctgctg ggaccaaaat tgg                                              23
<210>50
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：合成DNA
<400>50
cttaacatcc caagggatgc tg                                               22
<210>51
<211>1965
<212>DNA
<213>中国地鼠
<400>51
acggggggct cccggaagcg gggaccatgg cgtctctgcg cgaagcgagc ctgcggaagc 60
tgcggcgctt ttccgagatg agaggcaaac ctgtggcaac tgggaaattc tgggatgtag 120
ttgtaataac agcagctgac gaaaagcagg agcttgctta caagcaacag ttgtcggaga 180
agctgaagag aaaggaattg ccccttggag ttaactacca tgttttcact gatcctcctg 240
gaaccaaaat tggaaatgga ggatcaacac tttgttctct tcagtgcctg gaaagcctct 300
atggagacaa gtggaattcc ttcacagtcc tgttaattca ctctggtggc tacagtcaac 360
gacttcccaa tgcaagcgct ttaggaaaaa tcttcacggc tttaccactt ggtgagccca 420
tttatcagat gttggactta aaactagcca tgtacatgga tttcccctca cgcatgaagc 480
ctggagtttt ggtcacctgt gcagatgata ttgaactata cagcattggg gactctgagt 540
ccattgcatt tgagcagcct ggctttactg ccctagccca tccatctagt ctggctgtag 600
gcaccacaca tggagtattt gtattggact ctgccggttc tttgcaacat ggtgacctag 660
agtacaggca atgccaccgt ttcctccata agcccagcat tgaaaacatg caccacttta 720
atgccgtgca tagactagga agctttggtc aacaggactt gagtgggggt gacaccacct 780
gtcatccatt gcactctgag tatgtctaca cagatagcct attttacatg gatcataaat 840
cagccaaaaa gctacttgat ttctatgaaa gtgtaggccc actgaactgt gaaatagatg 900
cctatggtga ctttctgcag gcactgggac ctggagcaac tgcagagtac accaagaaca 960
cctcacacgt cactaaagag gaatcacact tgttggacat gaggcagaaa atattccacc 1020
tcctcaaggg aacacccctg aatgttgttg tccttaataa ctccaggttt tatcacattg 1080
gaacaacgga ggagtatctg ctacatttca cttccaatgg ttcgttacag gcagagctgg 1140
gcttgcaatc catagctttc agtgtctttc caaatgtgcc tgaagactcc catgagaaac 1200
cctgtgtcat tcacagcatc ctgaattcag gatgctgtgt ggcccctggc tcagtggtag 1260
aatattccag attaggacct gaggtgtcca tctcggaaaa ctgcattatc agcggttctg 1320
tcatagaaaa agctgttctg cccccatgtt ctttcgtgtg ctctttaagt gtggagataa 1380
atggacactt agaatattca actatggtgt ttggcatgga agacaacttg aagaacagtg 1440
ttaaaaccat atcagatata aagatgcttc agttctttgg agtctgtttc ctgacttgtt 1500
tagatatttg gaaccttaaa gctatggaag aactattttc aggaagtaag acgcagctga 1560
gcctgtggac tgctcgaatt ttccctgtct gttcttctct gagtgagtcg gttgcagcat 1620
cccttgggat gttaaatgcc attcgaaacc attcgccatt cagcctgagc aacttcaagc 1680
tgctgtccat ccaggaaatg cttctctgca aagatgtagg agacatgctt gcttacaggg 1740
agcaactctt tctagaaatc agttcaaaga gaaaacagtc tgattcggag aaatcttaaa 1800
tacaatggat tttgcctgga aacaggattg caaatgcagg catattctat agatctctgg 1860
gttcttcttt ctttctcccc tctctccttt cctttccctt tgatgtaatg acaaaggtaa 1920
aaatggccac ttctgatgga aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa                 1965
<210>52
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：合成DNA
<400>52
caggggtgtt cccttgagga ggtggaa                                          27
<210>53
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：合成DNA
<400>53
cactgagcca ggggccacac agcatcc                                          27
<210>54
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：合成DNA
<400>54
cccctcacgc atgaagcctg gag                                              23
<210>55
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：合成DNA
<400>55
tgccaccgtt tcctccataa gcccagc                                          27
<210>56
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：合成DNA
<400>56
atgaagttgc actatggtga cctca                                            25
<210>57
<211>59
<212>DNA
<213>中国地鼠
<400>57
ccgacagcac ctgcctagta aaaatcatca atgaagtcaa acctacagag atctacaat       59
<210>58
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：合成DNA
<400>58
gacttagcag agtacactgc agatg                                            25
<210>59
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：合成DNA
<400>59
accttggata gaaaggggtg gtctc                                            25
<210>60
<211>125
<212>DNA
<213>中国地鼠
<400>60
ttgatggagt tggcaccttg cggcttctgg atgcaattaa gacttgtggc cttataaatt  60
ctgtgaagtt ctaccaggcc tcaactagtg aactgtatgg aaaagtgcaa gaaatacccc  120
agaaa                                                              125
<210>61
<211>372
<212>PRT
<213>中国地鼠
<400>61
Met Ala His Ala Pro Ala Ser Cys Pro Ser Ser Arg Asn Ser Gly Asp
  1               5                  10                  15
Gly Asp Lys Gly Lys Pro Arg Lys Val Ala Leu Ile Thr Gly Ile Thr
             20                  25                  30
Gly Gln Asp Gly Ser Tyr Leu Ala Glu Phe Leu Leu Glu Lys Gly Tyr
         35                  40                  45
Glu Val His Gly Ile Val Arg Arg Ser Ser Ser Phe Asn Thr Gly Arg
     50                  55                  60
Ile Glu His Leu Tyr Lys Asn Pro Gln Ala His Ile Glu Gly Asn Met
 65                  70                  75                  80
Lys Leu His Tyr Gly Asp Leu Thr Asp Ser Thr Cys Leu Val Lys Ile
                 85                  90                  95
Ile Asn Glu Val Lys Pro Thr Glu Ile Tyr Asn Leu Gly Ala Gln Ser
            100                 105                 110
His Val Lys Ile Ser Phe Asp Leu Ala Glu Tyr Thr Ala Asp Val Asp
        115                 120                 125
Gly Val Gly Thr Leu Arg Leu Leu Asp Ala Ile Lys Thr Cys Gly Leu
    130                 135                 140
Ile Asn Ser Val Lys Phe Tyr Gln Ala Ser Thr Ser Glu Leu Tyr Gly
145                 150                 155                 160
Lys Val Gln Glu Ile Pro Gln Lys Glu Thr Thr Pro Phe Tyr Pro Arg
                165                 170                 175
Ser Pro Tyr Gly Ala Ala Lys Leu Tyr Ala Tyr Trp Ile Val Val Asn
            180                 185                 190
Phe Arg Glu Ala Tyr Asn Leu Phe Ala Val Asn Gly Ile Leu Phe Asn
        195                 200                 205
His Glu Ser Pro Arg Arg Gly Ala Asn Phe Val Thr Arg Lys Ile Ser
    210                 215                 220
Arg Ser Val Ala Lys Ile Tyr Leu Gly Gln Leu Glu Cys Phe Ser Leu
225                 230                 235                 240
Gly Asn Leu Asp Ala Lys Arg Asp Trp Gly His Ala Lys Asp Tyr Val
                245                 250                 255
Glu Ala Met Trp Leu Met Leu Gln Asn Asp Glu Pro Glu Asp Phe Val
            260                 265                 270
Ile Ala Thr Gly Glu Val His Ser Val Arg Glu Phe Val Glu Lys Ser
        275                 280                 285
Phe Met His Ile Gly Lys Thr Ile Val Trp Glu Gly Lys Asn Glu Asn
    290                 295                 300
Glu Val Gly Arg Cys Lys Glu Thr Gly Lys Ile His Val Thr Val Asp
305                 310                 315                 320
Leu Lys Tyr Tyr Arg Pro Thr Glu Val Asp Phe Leu Gln Gly Asp Cys
                325                 330                 335
Ser Lys Ala Gln Gln Lys Leu Asn Trp Lys Pro Arg Val Ala Phe Asp
            340                 345                 350
Glu Leu Val Arg Glu Met Val Gln Ala Asp Val Glu Leu Met Arg Thr
        355                 360                 365
Asn Pro Asn Ala
    370
<210>62
<211>321
<212>PRT
<213>中国地鼠
<400>62
Met Gly Glu Pro Gln Gly Ser Arg Arg Ile Leu Val Thr Gly Gly Ser
 1               5                   10                  15
Gly Leu Val Gly Arg Ala Ile Gln Lys Val Val Ala Asp Gly Ala Gly
             20                  25                  30
Leu Pro Gly Glu Glu Trp Val Phe Val Ser Ser Lys Asp Ala Asp Leu
         35                  40                  45
Thr Asp Ala Ala Gln Thr Gln Ala Leu Phe Gln Lys Val Gln Pro Thr
     50                  55                  60
His Val Ile His Leu Ala Ala Met Val Gly Gly Leu Phe Arg Asn Ile
 65                  70                  75                  80
Lys Tyr Asn Leu Asp Phe Trp Arg Lys Asn Val His Ile Asn Asp Asn
                 85                  90                  95
Val Leu His Ser Ala Phe Glu Val Gly Thr Arg Lys Val Val Ser Cys
            100                 105                 110
Leu Ser Thr Cys Ile Phe Pro Asp Lys Thr Thr Tyr Pro Ile Asp Glu
        115                 120                 125
Thr Met Ile His Asn Gly Pro Pro His Ser Ser Asn Phe Gly Tyr Ser
    130                 135                 140
Tyr Ala Lys Arg Met Ile Asp Val Gln Asn Arg Ala Tyr Phe Gln Gln
145                 150                 155                 160
His Gly Cys Thr Phe Thr Ala Val Ile Pro Thr Asn Val Phe Gly Pro
                165                 170                 175
His Asp Asn Phe Asn Ile Glu Asp Gly His Val Leu Pro Gly Leu Ile
            180                 185                 190
His Lys Val His Leu Ala Lys Ser Asn Gly Ser Ala Leu Thr Val Trp
        195                 200                 205
Gly Thr Gly Lys Pro Arg Arg Gln Phe Ile Tyr Ser Leu Asp Leu Ala
    210                 215                 220
Arg Leu Phe Ile Trp Val Leu Arg Glu Tyr Asn Glu Val Glu Pro Ile
225                 230                 235                 240
Ile Leu Ser Val Gly Glu Glu Asp Glu Val Ser Ile Lys Glu Ala Ala
                245                 250             255
Glu Ala Val Val Glu Ala Met Asp Phe Cys Gly Glu Val Thr Phe Asp
            260                 265             270
Ser Thr Lys Ser Asp Gly Gln Tyr Lys Lys Thr Ala Ser Asn Gly Lys
        275                 280             285
Leu Arg Ala Tyr Leu Pro Asp Phe Arg Phe Thr Pro Phe Lys Gln Ala
    290                 295             300
Val Lys Glu Thr Cys Ala Trp Phe Thr Asp Asn Tyr Glu Gln Ala Arg
305                 310             315                     320
Lys
<210>63
<211>590
<212>PRT
<213>中国地鼠
<400>63
Met Ala Ser Leu Arg Glu Ala Ser Leu Arg Lys Leu Arg Arg Phe Ser
 1               5                   10                  15
Glu Met Arg Gly Lys Pro Val Ala Thr Gly Lys Phe Trp Asp Val Val
             20                  25                  30
Val Ile Thr Ala Ala Asp Glu Lys Gln Glu Leu Ala Tyr Lys Gln Gln
         35                  40                  45
Leu Ser Glu Lys Leu Lys Arg Lys Glu Leu Pro Leu Gly Val Asn Tyr
     50                  55                  60
His Val Phe Thr Asp Pro Pro Gly Thr Lys Ile Gly Asn Gly Gly Ser
 65                  70                  75                  80
Thr Leu Cys Ser Leu Gln Cys Leu Glu Ser Leu Tyr Gly Asp Lys Trp
                85                  90                  95
Asn Ser Phe Thr Val Leu Leu Ile His Ser Gly Gly Tyr Ser Gln Arg
            100                 105                 110
Leu Pro Asn Ala Ser Ala Leu Gly Lys Ile Phe Thr Ala Leu Pro Leu
        115                 120                 125
Gly Glu Pro Ile Tyr Gln Met Leu Asp Leu Lys Leu Ala Met Tyr Met
    130                 135                 140
Asp Phe Pro Ser Arg Met Lys Pro Gly Val Leu Val Thr Cys Ala Asp
145                 150                 155                 160
Asp Ile Glu Leu Tyr Ser Ile Gly Asp Ser Glu Ser Ile Ala Phe Glu
                165                 170                 175
Gln Pro Gly Phe Thr Ala Leu Ala His Pro Ser Ser Leu Ala Val Gly
            180                 185                 190
Thr Thr His Gly Val Phe Val Leu Asp Ser Ala Gly Ser Leu Gln His
        195                 200                 205
Gly Asp Leu Glu Tyr Arg Gln Cys His Arg Phe Leu His Lys Pro Ser
    210                 215                 220
Ile Glu Asn Met His His Phe Asn Ala Val His Arg Leu Gly Ser Phe
225                 230                 235                 240
Gly Gln Gln Asp Leu Ser Gly Gly Asp Thr Thr Cys His Pro Leu His
                245                 250                 255
Ser Glu Tyr Val Tyr Thr Asp Ser Leu Phe Tyr Met Asp His Lys Ser
            260                 265                 270
Ala Lys Lys Leu Leu Asp Phe Tyr Glu Ser Val Gly Pro Leu Asn Cys
        275                 280                 285
Glu Ile Asp Ala Tyr Gly Asp Phe Leu Gln Ala Leu Gly Pro Gly Ala
    290                 295                 300
Thr Ala Glu Tyr Thr Lys Asn Thr Ser His Val Thr Lys Glu Glu Ser
305                 310                 315                 320
His Leu Leu Asp Met Arg Gln Lys Ile Phe His Leu Leu Lys Gly Thr
                325                 330                 335
Pro Leu Asn Val Val Val Leu Asn Asn Ser Arg Phe Tyr His Ile Gly
            340                 345                 350
Thr Thr Glu Glu Tyr Leu Leu His Phe Thr Ser Asn Gly Ser Leu Gln
        355                 360                 365
Ala Glu Leu Gly Leu Gln Ser Ile Ala Phe Ser Val Phe Pro Asn Val
    370                 375                 380
Pro Glu Asp Ser His Glu Lys Pro Cys Val Ile His Ser Ile Leu Asn
385                 390                 395                 400
Ser Gly Cys Cys Val Ala Pro Gly Ser Val Val Glu Tyr Ser Arg Leu
                405                 410                 415
Gly Pro Glu Val Ser Ile Ser Glu Asn Cys Ile Ile Ser Gly Ser Val
            420                 425                 430
Ile Glu Lys Ala Val Leu Pro Pro Cys Ser Phe Val Cys Ser Leu Ser
        435                 440                 445
Val Glu Ile Asn Gly His Leu Glu Tyr Ser Thr Met Val Phe Gly Met
    450                 455                 460
Glu Asp Asn Leu Lys Asn Ser Val Lys Thr Ile Ser Asp Ile Lys Met
465                 470                 475                 480
Leu Gln Phe Phe Gly Val Cys Phe Leu Thr Cys Leu Asp Ile Trp Asn
                485                 490                 495
Leu Lys Ala Met Glu Glu Leu Phe Ser Gly Ser Lys Thr Gln Leu Ser
            500                 505                 510
Leu Trp Thr Ala Arg Ile Phe Pro Val Cys Ser Ser Leu Ser Glu Ser
        515                 520                 525
Val Ala Ala Ser Leu Gly Met Leu Asn Ala Ile Arg Asn His Ser Pro
    530                 535                 540
Phe Ser Leu Ser Asn Phe Lys Leu Leu Ser Ile Gln Glu Met Leu Leu
545                 550                 555                 560
Cys Lys Asp Val Gly Asp Met Leu Ala Tyr Arg Glu Gln Leu Phe Leu
                565                 570                 575
Glu Ile Ser Ser Lys Arg Lys Gln Ser Asp Ser Glu Lys Ser
            580                 585                 590

Claims (48)

1.一种产生抗体组合物的细胞，所述抗体组合物包含与CD20特异结合，并具有与Fc区域结合的N-糖苷键合的复合糖链的抗体分子，其中组合物中总的结合于Fc区域的N-糖苷键合的复合糖链中，岩藻糖不与糖链还原性末端的N-乙酰葡萄糖胺结合的比率是20％或更多。
2.根据权利要求1所述的细胞，其中岩藻糖不与N-糖苷键合的复合糖链结合的糖链中岩藻糖的1位不与还原性末端的N-乙酰氨基葡萄糖的6位通过α键结合。
3.根据权利要求1或2所述的细胞，其中与细胞内糖核苷酸、GDP-岩藻糖合成相关的酶活性，和/或与岩藻糖的1位通过α键结合于N-糖苷键合的复合糖链还原性末端的N-乙酰葡糖胺的6位的糖链修饰有关的酶活性降低或消失。
4.根据权利要求3所述的细胞，其中与细胞内糖核苷酸、GDP-岩藻糖合成相关的酶是选自以下(a)、(b)和(c)中的酶：
(a)GMD(GDP-甘露糖4，6-脱水酶)；
(b)Fx(GDP-酮-6-脱氧甘露糖3，5-差向异构酶，4-还原酶)；
(c)GFPP(GDP-β-L-岩藻糖焦磷酸化酶)。
5.根据权利要求4所述的细胞，其中GMD是以下(a)或(b)中的DNA编码的蛋白质：
(a)包括由SEQ ID NO：41代表的核苷酸序列的DNA；
(b)与包括由SEQ ID NO：41代表的核苷酸序列的DNA在严谨条件下杂交，编码有GMD活性的蛋白质的DNA。
6.根据权利要求4所述的细胞，其中GMD是选自以下(a)、(b)和(c)中的蛋白质：
(a)包括由SEQ ID NO：61代表的氨基酸序列的蛋白质；
(b)包括由SEQ ID NO：61代表的氨基酸序列，其中至少一个氨基酸被删除、取代、插入和/或添加，有GMD活性的蛋白质；
(c)包括与由SEQ ID NO：61代表的氨基酸序列具有至少80％同源性的氨基酸序列，有GMD活性的蛋白质。
7.根据权利要求4所述的细胞，其中FX是以下(a)或(b)中的DNA编码的蛋白质：
(a)包括由SEQ ID NO：48代表的核苷酸序列的DNA；
(b)与包括由SEQ ID NO：48代表的核苷酸序列的DNA在严谨条件下杂交，编码有FX活性的蛋白质的DNA。
8.根据权利要求4所述的细胞，其中FX是选自以下(a)、(b)和(c)中的蛋白质：
(a)包括由SEQ ID NO：62代表的氨基酸序列的蛋白质；
(b)包括由SEQ ID NO：62代表的氨基酸序列，其中至少一个氨基酸被删除、取代、插入和/或添加，有FX活性的蛋白质；
(c)包括与由SEQ ID NO：62代表的氨基酸序列具有至少80％同源性的氨基酸序列，有FX活性的蛋白质。
9.根据权利要求4所述的细胞，其中GFPP是以下(a)或(b)中的DNA编码的蛋白质：
(a)包括由SEQ ID NO：51代表的核苷酸序列的DNA；
(b)与包括由SEQ ID NO：51代表的核苷酸序列的DNA在严谨条件下杂交，编码有GFPP活性的蛋白质的DNA。
10.根据权利要求4所述的细胞，其中GFPP是选自以下(a)、(b)和(c)中的蛋白质：
(a)包括由SEQ ID NO：63代表的氨基酸序列的蛋白质；
(b)包括由SEQ ID NO：63代表的氨基酸序列，其中至少一个氨基酸被删除、取代、插入和/或添加，有GFPP活性的蛋白质；
(c)包括与由SEQ ID NO：63代表的氨基酸序列具有至少80％同源性的氨基酸序列，有GFPP活性的蛋白质。
11.根据权利要求3所述的细胞，其中与岩藻糖的1位通过α键结合于N-糖苷键合的复合糖链还原性末端的N-乙酰葡糖胺的6位的糖链修饰有关的酶是α1，6-岩藻糖转移酶。
12.根据权利要求11所述的细胞，其中α1，6-岩藻糖转移酶是选自以下(a)、(b)、(c)和(d)中的的DNA编码的蛋白质：
(a)包括由SEQ ID NO：1代表的核苷酸序列的DNA；
(b)包括由SEQ ID NO：2代表的核苷酸序列的DNA；
(c)包括与由SEQ ID NO：1代表的核苷酸序列的DNA在严谨条件下杂交，编码有α1，6-岩藻糖转移酶活性的蛋白质的DNA；
(d)包括与由SEQ ID NO：2代表的核苷酸序列的DNA在严谨条件下杂交，编码有α1，6-岩藻糖转移酶活性的蛋白质的DNA。
13根据权利要求11所述的细胞，其中α1，6-岩藻糖转移酶是选自以下(a)、(b)、(c)、(d)、(e)和(f)中的蛋白质：
(a)包括由SEQ ID NO：23代表的氨基酸序列的蛋白质；
(b)包括由SEQ ID NO：24代表的氨基酸序列的蛋白质；
(c)包括由SEQ ID NO：23代表的氨基酸序列，其中至少一个氨基酸被删除、取代、插入和/或增加，具有α1，6-岩藻糖转移酶活性的蛋白质；
(d)包括由SEQ ID NO：24代表的氨基酸序列，其中至少一个氨基酸被删除、取代、插入和/或增加，具有α1，6-岩藻糖转移酶活性的蛋白质；
(e)包括与由SEQ ID NO：23代表的氨基酸序列具有至少80％同源性的氨基酸序列，具有α1，6-岩藻糖转移酶活性的蛋白质；
(f)包括与由SEQ ID NO：24代表的氨基酸序列具有至少80％同源性的氨基酸序列，具有α1，6-岩藻糖转移酶活性的蛋白质。
14.根据权利要求3到13中任何一项所述的细胞，其中通过选自以下(a)、(b)、(c)、(d)和(e)中的技术使酶活性降低或消除：
(a)以编码酶的基因为目标的基因断裂技术；
(b)导入编码酶的基因的显性失活突变体的技术；
(c)酶中导入突变的技术；
(d)抑制编码酶的基因转录或翻译的技术；
(e)选择对识别糖链的凝集素有抗性的细胞系的技术，所述凝集素识别岩藻糖的1位通过α键与N-糖苷键合的复合糖链还原性末端的N-乙酰氨基葡萄糖的6位结合。
15.根据权利要求1到14中任何一项所述的细胞，其中所述细胞是至少对一种凝集素有抗性的细胞，其中凝集素识别岩藻糖的1位通过α键与N-糖苷键合的复合糖链还原性末端的N-乙酰氨基葡萄糖的6位结合。
16.根据权利要求1到15中任何一项所述的细胞，其中所述细胞选自以下(a)到(j)：
(a)来自中国仓鼠卵巢组织的CHO细胞；
(b)大鼠骨髓瘤细胞细胞系，YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20细胞；
(c)小鼠骨髓瘤细胞细胞系，NSO细胞；
(d)小鼠骨髓瘤细胞细胞系，SP2/0-Ag14细胞；
(e)来源于叙利亚仓鼠肾组织的BHK细胞；
(f)猴COS细胞；
(g)产生抗体的杂交瘤细胞；
(h)人白血病细胞系，Namalwa细胞；
(i)胚胎干细胞；
(j)受精卵细胞。
17.一种转基因非人动物或植物或它们的后代，其中导入与CD20特异结合，与Fc区域结合的N-糖苷键合的复合糖链的抗体分子，转基因非人动物或植物或它们的后代产生包括抗体分子的抗体组合物，其中组合物中总的结合于Fc区域的N-糖苷键合的复合糖链中，岩藻糖不与糖链还原性末端的N-乙酰葡萄糖胺结合的比率是20％或更多。
18.根据权利要求17所述的转基因非人动物或植物或它们的后代，其中岩藻糖不与N-乙酰葡萄糖胺连接的糖链是岩藻糖的1位不与N-糖苷键合的糖链还原性末端的N-乙酰葡萄糖胺的6位通过α键连接的糖链。
19.根据权利要求17或18所述的转基因非人动物或植物或它们的后代，其中基因组被修饰，这样与细胞内糖核苷酸、GDP-岩藻糖合成相关的酶活性，和/或在岩藻糖的1位通过α键结合于N-糖苷键合的糖链N-乙酰葡糖胺还原性末端的6位的糖链修饰有关的酶活性降低。
20.根据权利要求17或18所述的转基因非人动物或植物或它们的后代，其中编码与细胞内糖核苷酸、GDP-岩藻糖合成相关的酶，和/或岩藻糖的1位通过α键结合于N-糖苷键合的复合糖链还原性末端的N-乙酰葡糖胺6位的糖链修饰相关的酶的基因被敲除。
21.根据权利要求19或20所述的转基因非人动物或植物或它们的后代，其中与细胞内糖核苷酸、GDP-岩藻糖合成相关的酶，是选自以下(a)、(b)或(c)中的酶：
(a)GMD(GDP-甘露糖4，6-脱水酶)；
(b)Fx(GDP-酮-6-脱氧甘露糖3，5-差向异构酶，4-还原酶)；
(c)GFPP(GDP-β-L-岩藻糖焦磷酸化酶)。
22.根据权利要求21所述的转基因非人动物或植物或它们的后代，其中GMD是由以下(a)或(b)的DNA编码的蛋白质：
(a)包括由SEQ ID NO：41代表的核苷酸序列的DNA；
(b)包括与由SEQ ID NO：41代表的核苷酸序列的DNA在严谨条件下杂交，编码有GMD活性的蛋白质的DNA。
23.根据权利要求21所述的转基因非人动物或植物或它们的后代，其中Fx是由以下(a)或(b)的DNA编码的蛋白质：
(a)包括由SEQ ID NO：48代表的核苷酸序列的DNA；
(b)包括与由SEQ ID NO：48代表的核苷酸序列的DNA在严谨条件下杂交，编码有FX活性的蛋白质的DNA。
24.根据权利要求21所述的转基因非人动物或植物或它们的后代，其中GFPP是由以下(a)或(b)的DNA编码的蛋白质：
(a)包括由SEQ ID NO：51代表的核苷酸序列的DNA；
(b)包括与由SEQ ID NO：51代表的核苷酸序列的DNA在严谨条件下杂交，编码有GFPP活性的蛋白质的DNA。
25.根据权利要求19或20所述的转基因非人动物或植物或它们的后代，其中岩藻糖的1位通过α键与N-糖苷键合的糖链还原性末端的N-乙酰葡萄糖胺的6位连接的糖链修饰相关的酶是α1，6-岩藻糖转移酶。
26.根据权利要求25所述的转基因非人动物或植物或它们的后代，其中α1，6-岩藻糖转移酶是由选自以下(a)、(b)、(c)和(d)中的的DNA编码的蛋白质：
(a)包括由SEQ ID NO：1代表的核苷酸序列的DNA；
(b)包括由SEQ ID NO：2代表的核苷酸序列的DNA；
(c)包括与由SEQ ID NO：1代表的核苷酸序列的DNA在严谨条件下杂交，编码有α1，6-岩藻糖转移酶活性的蛋白质的DNA；
(d)包括与由SEQ ID NO：2代表的核苷酸序列的DNA在严谨条件下杂交，编码有α1，6-岩藻糖转移酶活性的蛋白质的DNA。
27.根据权利要求17到26中任何一项所述的转基因非人动物或植物或它们的后代，其中转基因非人动物是从牛、绵羊、山羊、猪、马、小鼠、大鼠、鸡、猴和兔中选择的动物。
28.根据权利要求1到16中任何一项所述的细胞，其中抗体分子是选自(a)、(b)、(c)和(d)中的分子：
(a)人抗体；
(b)人源化抗体；
(c)包括(a)或(b)的Fc区域的抗体片段；
(d)包括(a)或(b)的Fc区域的融合蛋白。
29.根据权利要求1到16和28中任何一项所述的细胞，其中抗体分子属于IgG类。
30.根据权利要求1到16，28和29中任何一项所述细胞，其中抗体分子包括抗体轻链可变区的互补决定区1、2和3，和/或抗体重链的互补决定区1、2和3，所述轻链可变区的互补决定区1、2和3包括分别由SEQ ID NO：5、6和7代表的氨基酸序列，所述抗体重链的互补决定区1、2和3包括分别由SEQ ID NO：8、9和10代表的氨基酸序列。
31.根据权利要求1到16、28、29和30中任何一项所述细胞，其中抗体分子包括抗体轻链可变区和/或重链可变区，所述轻链可变区包括由SEQ ID NO：12代表的氨基酸序列，所述重链可变区包括由SEQID NO：14代表的氨基酸序列。
32.根据权利要求17到27中任何一项所述的转基因非人动物或植物或它们的后代，其中抗体分子是选自(a)、(b)、(c)和(d)中的分子：
(a)人抗体；
(b)人源化抗体；
(c)包括(a)或(b)的Fc区域的抗体片段；
(d)包括(a)或(b)的Fc区域的融合蛋白。
33.根据权利要求17到27和32中任何一项所述的转基因非人动物或植物或它们的后代，其中抗体分子属于IgG类。
34.根据权利要求17到27、32和33中任何一项所述的转基因非人动物或植物或它们的后代，其中抗体分子包括抗体轻链可变区的互补决定区1、2和3和/或重链的互补决定区1、2和3，所述轻链可变区的互补决定区1、2和3包括分别由SEQ ID NO：5、6和7代表的氨基酸序列，所述重链的互补决定区1、2和3包括分别由SEQ ID NO：8、9和10代表的氨基酸序列。
35.根据权利要求17到27，32，33和34中任何一项所述的转基因非人动物或植物或它们的后代，其中抗体分子包括抗体轻链可变区和/或重链可变区，所述轻链可变区包括由SEQ ID NO：12代表的氨基酸序列，所述重链可变区包括由SEQ ID NO：14代表的氨基酸序列。
36.一种抗体组合物，所述抗体组合物是根据权利要求1到16和28到31中任何一项所述的细胞产生的。
37.一种抗体组合物，所述抗体组合物通过饲养根据权利要求17到27和32到35中任何一项所述的转基因非人动物或植物或它们的后代获得的。
38.一种包含与CD20特异结合，具有与Fc区域结合的N-糖苷键合的复合糖链的抗体分子的抗体组合物，其中组合物中总的结合于Fc区域的N-糖苷键合的复合糖链中，岩藻糖不与糖链还原性末端的N-乙酰葡萄糖胺结合的比率是20％或更多
39.根据权利要求38所述的抗体组合物，其中不与岩藻糖结合的糖链是岩藻糖的1位不与N-糖苷键合的复合糖链还原性末端的N-乙酰氨基葡萄糖的6位通过α键相连的糖链。
40.根据权利要求38所述抗体组合物，其中抗体分子是选自(a)、(b)、(c)和(d)中的分子：
(a)人抗体；
(b)人源化抗体；
(c)包括(a)或(b)的Fc区域的抗体片段；
(d)包括(a)或(b)的Fc区域的融合蛋白。
41.根据权利要求38到40中任何一项所述的抗体组合物，其中抗体分子属于IgG类。
42.根据权利要求38到41中任何一项所述的抗体组合物，其中抗体分子包括抗体轻链可变区的互补决定区1、2和3，和抗体重链的互补决定区1、2和3，所述抗体轻链可变区的互补决定区1、2和3分别包括由SEQ ID NO：5、6和7代表的氨基酸序列，所述抗体重链的互补决定区1、2和3分别包括由SEQ ID NO：8、9和10代表的氨基酸序列。
43.根据权利要求38到42中任何一项所述的抗体组合物，其中抗体分子包括抗体轻链可变区和/或重链可变区，所述轻链可变区包括由SEQ ID NO：12代表的氨基酸序列，所述重链可变区包括由SEQ IDNO：14代表的氨基酸序列。
44.一种产生根据权利要求36、38到43中任何一项所述的抗体组合物的方法，所述方法包括培养权利要求1到16和28到31中任何一项所述的细胞，在培养基中形成和积累抗体组合物，从培养基中回收抗体组合物。
45.一种产生根据权利要求36、38到43中任何一项所述的抗体组合物的方法，所述方法其中包括饲养权利要求17到27和32到35中任何一项所述的转基因非人动物或植物或它们的后代，从饲养的动物或植物中分离出组织或体液，和从分离的组织或体液中回收抗体组合物。
46.一种根据权利要求36到43中任何一项所述的抗体组合物作为活性成分的药物。
47.一种治疗与CD20相关疾病的制剂，所述制剂包含根据权利要求36到43中任何一项所述的抗体组合物作为活性成分。
48.根据权利要求47所述的试剂，其中与CD20相关的疾病是癌症或免疫疾病。
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