CN1636069A

CN1636069A - 基于ercc1表达确定化疗方案的方法

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Publication number: CN1636069A
Application number: CNA018224423A
Authority: CN
Inventors: K·D·达南伯格
Original assignee: Response Genetics Inc
Current assignee: Response Genetics Inc
Priority date: 2000-12-01
Filing date: 2001-11-29
Publication date: 2005-07-06
Anticipated expiration: 2021-11-29
Also published as: CN1636069B; IL156272A; IL215130A0; US6602670B2; EP1364054A2; WO2002061128A2; US20040005621A1; CA2437044C; AU2002249768B2; AR031455A1; HK1078328A1; CA2437044A1; KR100966271B1; US20020086315A1; EP1364054B1; ES2439873T3; KR20030074639A; JP2004518429A; MXPA03004930A; NZ526710A

Abstract

本发明涉及用于医学，特别是癌症化疗中的预测方法。本发明目的是提供一种通过检测患者肿瘤细胞中ERCC1 mRNA的量，并把它预定阈表达水平进行比较，从而评价固定或固定且石蜡包埋的组织中ERCC1的表达水平，并确定基于铂的化疗的方法。更特别是，本发明提供寡核苷酸引物对ERCC1，及使用它们检测ERCC1 mRNA水平的方法。

Description

基于ERCC1表达确定化疗方案的方法

发明领域

本发明涉及有效用于医学，特别是癌症化疗中的预测方法。更特别是，本发明涉及评估患者中的肿瘤细胞的基因表达。通过检测人类中参与DNA修复的基因表达的mRNA，测定用靶定于DNA的化疗剂，特别是以铂制剂的方式破坏DNA的试剂治疗的患者的存活。

发明背景

当正常细胞经历致癌性转化并成为恶性细胞时癌症发生。转化的(恶性)细胞逃离可规定细胞表型并抑制细胞增殖的正常生理控制。个体机体中的转化细胞因此增殖，形成肿瘤。当发现肿瘤时，临床目标是选择性地破坏恶性细胞，同时减轻在个体进行治疗过程中对正常细胞的任何损害。

化疗方案是以对癌细胞具有选择毒性(细胞毒性)的药物的使用为基础的。人们已经研制出了很多类化疗药物，包括干扰核酸合成，蛋白合成，及其它重要代谢过程的药物。这些通常被称作抗代谢药物。其它类的化疗药物是损害细胞的DNA。这些类药物通常被称作是基因毒性的。然而，个体肿瘤对预期化疗药物或药物联合的敏感性常常只能在治疗的试验期之后才能准确地测定。在不成功试验期投入的时间会在临床处理侵入性恶性肿瘤时造成重大的危险。

对细胞DNA损伤的修复是由细胞的酶促DNA修复机制进行的一种重要生物过程。细胞基因组中的未修复病变可以阻碍DNA复制，损害新合成DNA的复制保真性和/或阻碍细胞存活所需基因的表达。因此，一般认为基因毒性药物对涉及DNA合成的活跃分裂的细胞比对静止、不分裂的细胞毒性更强。然而，许多机体组织的正常细胞更静止，并且不经常重新进入细胞周期和分裂。细胞分裂的各轮之间的时间更长，因此提供给由化疗基因毒性导致的正常细胞中DNA破坏的修复。因此，杀灭癌细胞达到了一定的选择性。许多治疗方案中尝试通过属于两种或更多这些类的化疗药的共同给药而改进选择性。

因为对实体瘤进行有效的化疗通常需要联合给药，而对每种单一药物的敏感性或抗性决定因素的鉴定和测量成为设计个体联合化疗的重要工具。

已经发现损害细胞DNA的广泛使用的两种基因毒性抗癌是顺铂(DDP)和卡铂。目前顺铂和/或卡铂用于治疗选定的、各种上皮和间质来源的肿瘤，包括呼吸道、胃肠道和生殖道、中枢神经系统的癌和肉瘤，以及头和颈的鳞状细胞癌。顺铂和其它试剂的联合目前优选用于睾丸癌的控制，在许多情况下产生持续的缓解(Loehrer等，1984，100 Ann.Int.Med.704)。顺铂(DDP)通过形成链内加合物而破坏DNA结构。DDP等铂制剂的抗性是由于对铂加合物的耐受、药物积聚减少、或DNA修复增加。尽管对DDP的抗性是多因素的，DNA修复机制的的改变可能起了重要作用。大的DNA加合物，如铂制剂形成的加合物的切除修复似乎由参与DNA破坏识别和切除的基因介导。Cleaver等，Carcinogenesis 11：875-882(1990)；Hoeijmaker s等，CancerCells 2：311-320(1990)；Shivji等，Cell 69：367-374(1992)。实际上，在酶促DNA修复机制的一个或多个元件中具有遗传缺陷的细胞对顺铂极为敏感。Fraval等(1978)，51 Mutat.Res.121，Beck和Brubaker(1973)，116 J.Bacteriol 1247。

切除修复交叉互补(ERCC1)基因在DNA加合物的修复中是关键的。已经克隆了人ERCC1。Westerveld等，Nature(London)310：425-428(1984)；Tanka等，Nature 348：73-76(1990)；(编号XM-009432，在此引入作为参考，SEO ID NO：10)。一些研究使用了该基因缺陷的突变人和仓鼠细胞系，并且人肿瘤组织的研究表明，由ERCC1编码的产物参与铂-DNA加合物的切除修复。Dabholkar等，J.Natl.Cancer Inst.84：1512-1517(1992)；Dijt等，Cancer Res.48：6058-6062(1998)；Hansson等，Nucleic Acids Res.18：35-40(1990)。

当转染到DNA修复缺陷的CHO细胞中时，ERCC1通过其修复铂-DNA加合物的能力赋予了对基于铂的化疗的细胞抗性。Hansson等，Nucleic Acids Res：18：35-40(1990)。目前接受的切除修复模型表明，破坏识别/切除是切除修复过程的限速步骤。

已经检测了接受基于铂的化疗的癌症患者的恶性细胞中ERCC1等切除修复基因表达的相对水平。Dabholkar等，J.Natl.Cancer Inst.84：1512-1517(1992)。已经报道，用顺铂(DDP)/氟尿嘧啶化疗方案治疗时，胃癌患者中ERCC1的过量表达对肿瘤反应和最终存活率具有负影响(Metzger等，J Clin Oncl 16：309，1998)。最近的证据表明，吉西他滨(Gem)可以调节ERCC 1核苷酸切除修复(NER)活性。因此，ERCC1表达的肿瘤内水平可以是确定DDP和GEM是否可以有效治疗癌症的主要预后因素。

绝大多数患者的病理样品都是按常规固定且用石蜡包埋的(FPE)，然后用于组织学分析及随后的存档。因此，绝大多数活检组织样品都不能用于基因表达的分析，这是因为这种研究需要高度完整的RNA，才能进行基因表达的准确测量。目前，基因表达水平只能通过免疫组织化学染色在这种固定且包埋的样品中定量监测，从而监测蛋白表达水平。

迄今为止，包括ERCC1和TS表达的定量基因表达研究都限于来自于新鲜和冷冻组织的RNA的逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)扩增。Reed等的美国专利5,705336公开了定量卵巢肿瘤组织中的ERCC1mRNA并确定该组织是否对基于铂的化疗敏感的方法。如Leichman等，Reed等的文章中所描述，定量冷冻肿瘤活检物的mRNA。

由健康护理专业人员使用冷冻组织具有相当大的不便。在设计任何一种基于RNA的定量遗传标记测定法时，迅速递送活检样品，以避免组织及后来的mRNA降解是首先要考虑的。进行活检的健康护理专业人员必须把组织样品迅速递送到所装备的设备上，从而在收到组织样品后立即进行RNA提取。如果没有这种设备，临床医师必须迅速将样品冷冻，从而防止mRNA降解。为了在组织和RNA降解之前使用诊断设备进行有效的RNA提取，组织样品必须保持冷冻，直到它到达诊断设备，但可以位于较远处。在转移过程中，可使用带有液氮和干冰的专用设备维持冷冻组织的完整性，但花费较高。

常规的活检样品通常含有基质和肿瘤组织的不均一混合物。与新鲜或冷冻组织不同，FPE活检组织样品可很容易地被显微解剖，分成基质和肿瘤组织，因此优于使用新鲜或冷冻组织。而RNA从固定组织，特别是固定且石蜡包埋组织中的分离会产生高度降解的RNA，这通常被认为不适于基因表达的研究。

现在有很多从生物样品中纯化RNA的技术，但还没有一种可靠的从FPE样品中分离RNA的方法。例如，Chomczynski(美国专利US5,346,994)描述了一种从组织中纯化RNA的方法，它是以液相分离为基础，使用苯酚和异硫氰酸胍进行的。在苯酚和异硫氰酸胍的水溶液中匀化生物样品，然后将匀浆与氯仿混合。离心后，匀浆分成有机相，中间相和水相。蛋白螯合在有机相中，DNA在中间相中，RNA在水相中。RNA可从水相中沉淀出来。不幸的是，该方法不适于固定且石蜡包埋的(FPE)组织样品。

分离RNA的其它已知技术通常是利用胍盐或苯酚提取，如Sambrook，J.等，(1989)pp.7.3-7.24，和Ausubel，F.M.等，(1994)pp.4.0.3-4.4.7中实施例所述。同样，在从石蜡包埋的组织样品中分离RNA方面，还没有一种已知方法能够提供可再现的测量结果。

因此，特别需要一种从石蜡包埋组织中分离RNA的技术，从而研究肿瘤组织中的基因表达，然后将某些受体或酶的表达水平用于测定特定疗法成功的可能性或适合性。

需要一种定量石蜡包埋的组织中ERCC1 mRNA的方法，以便提供基因毒性癌症治疗的早期预后。因此，本领域中还没有成功获得在固定和石蜡包埋(FPE)组织中定量ERCC1表达的方法。因此，本发明的目的是提供一种通过检测患者肿瘤细胞中的ERCC1 mRNA量并且将其与预定的域表达水平进行比较，从而评估固定并且石蜡包埋(FPE)组织中ERCC1水平，并且预测患者肿瘤对DNA破坏试剂的治疗的可能抗性，确立由DNA铂制剂引起的DNA损伤类型的方法。

发明概述

本发明一方面提供一种评估固定或固定且石蜡包埋(FPE)的肿瘤细胞中ERCC1 mRNA表达水平的方法。

本发明另一方面提供一种测量固定且石蜡包埋(FPE)的组织样品中相对于内部对照的ERCC1 mRNA表达量的方法。该方法包括分离所述样品的总mRNA，并测定相对于内部对照基因的mRNA量的ERCC1 mRNA的量。

在本发明这方面的其中一个实施方案中，提供具有ERCC1-504F(SEQ ID NO：1)或ERCC1-574R(SEQ ID NO：2)序列和具有基本上与其相同序列的寡核苷酸引物。本发明还提供这样一种寡核苷酸引物，其序列在严格条件下可与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2或它们的互补序列杂交。

本发明另一方面提供一种确定患者的化疗方案的方法，包括从固定且石蜡包埋(FPE)的肿瘤样品中分离RNA；测定样品中ERCC1的基因表达水平；把ERCC1基因表达水平与ERCC1基因的预定阈水平进行比较；根据ERCC1基因表达水平和预定阈水平的比较结果确定化疗方案。

本发明还涉及一种标准化组织样品中相对于内部对照基因的ERCC1的未校正基因表达(UGE)的方法，其中所述组织样品是使用TaqMan技术分析的，所述方法是通过利用pre-TaqMan技术，相对于样品的内部对照，对已知的ERCC1表达水平进行分析而进行的。

附图说明

图1表示接受顺铂/Gem治疗的患者的总体存活与NSCLC中校正的相对ERCC1表达。校正的相对ERCC1表达水平低于域值6.7×10^-3的患者具有显著更优的存活。而校正的相对ERCC1表达水平高于域值6.7×10^-3的患者具有显著更差的存活(P＝0.009，对数秩检验)。

图2是举例说明如何计算相对于内部对照基因的ERCC1表达的图表。所述图表包括用两种试验样品获得的数据，(未知1和2)，并举例说明如何测定未校正基因的表达数据(UGE)。该图表还举例说明了如何利用通过pre-TaqMan技术测定的已知相对ERCC1值，标准化TaqMan仪器所产生的UGE。这是通过用UGE乘以校正因子KERCC1完成的。图中的内部对照基因是β-肌动蛋白，校准RNA是人肝总RNA(Stratagene，目录号735017)。

图3是表示研究中的56名患者的肿瘤分期和细胞类型的人群统计详细内容。接受的治疗周期的中值数为3(范围1-6)。14名患者(25％)以前接受过化疗，大多数(9名)采用单独的紫杉烷治疗或与DDP或卡铂联合。56名患者中的3名接受放疗，5名患者进行原发肿瘤的外科切除。

图4表示校正的ERCC1表达水平低于域值的患者与校正的ERCC1表达水平高于域值的患者的20.4周(95％C.I.6.9，33.9周)相比，具有显著更长的中值存活，即61.6周(95％ C.I.42.4，80.7周)。对肿瘤周期进行校正后，低或高ERCC1表达和总体存活之间的关联的对数秩统计量为3.97，P值为0.046。图中显示了未校正的对数秩结果。也显示了在使用Kaplan Meier生存曲线和对数秩检验进行的单变量分析中与总体存活显著相关的因素。这些因素是预治疗体重减轻的存在和ECOG状态。患者年龄(P＝0.18)、性别(P＝0.87)、肿瘤分期(P＝0.99)、肿瘤细胞类型(P＝0.63)和胸膜渗出的存在(P＝0.71)不是总体存活的显著预后因素。校正的相对ERCC1表达水平、ECOG表现状态和体重减轻在Cox危险比回归模型多变量分析中仍然是存活的显著预后因素。对肿瘤分析进行分层的Cox回归模型的P值是0.038，体重减轻为0.017，ECOG表现状态为0.02(PS 0与1或2)。

发明详述

本发明部分依赖于肿瘤中ERCC1 mRNA的量与用DNA铂制剂治疗的患者的存活相关的发现。表达高水平ERCC1 mRNA的肿瘤被认为可能对基于铂的化疗具有抗性，具有更低的存活水平。相反，表达低水平ERCC1mRNA的那些肿瘤可能对基于铂的化疗敏感并具有更高水平的存活。患者肿瘤的ERCC1 mRNA相对表达是通过把它与预定的阈表达水平进行比较而确定的。

本发明提供一种测量固定且石蜡包埋(FPE)的组织中，ERCC1 mRNA相对于内部对照基因表达的表达量的方法。本发明人已经开发了可准确评估固定且包埋组织中的ERCC1表达的寡核苷酸引物。本发明的寡核苷酸引物，ERCC1-504F(SEQ ID NO：1)，ERCC1-574R(SEQ ID NO：2)，或基本上与其相同的寡核苷酸引物，优选与从固定且石蜡包埋(FPE)的肿瘤样品中提取出来的RNA一起使用。然后可将ERCC1基因表达的这种测量值用于预测基于铂的化疗。

本发明的该实施方案包括，第一，一种确实可靠的，从FPE样品中提取RNA的方法，第二，通过使用一对寡核苷酸引物，使用逆转录酶聚合酶链式反应测定样品中ERCC1 mRNA含量的方法，其中优选寡核苷酸引物对ERCC1-504F(SEQ ID NO：1)和ERCC1-574R(SEQ ID NO：2)，或基本上与其相同的寡核苷酸。RNA是通过1999年12月20日提交的美国专利申请09/469,338中描述的任意mRNA分离的方法从FPE细胞中提取的，该专利申请在此引用作为参考。

本发明的方法适用于患者的任意组织类型。对于检验肿瘤组织的抗性，优选检验肿瘤组织。在优选实施方案中，检验得到肿瘤组织的患者的一部分正常组织。然后可以用更高量的化疗组合物治疗那些预计正常组织对基于铂的化疗化合物具有抗性，即表现出高水平ERCC1基因表达，但预计肿瘤组织对所述化合物敏感，即表现出低水平ERCC1基因表达的患者。

可以用更高量的化疗组合物治疗ERCC1基因表达水平低于域水平的患者，因为预计他们比肿瘤表达高于域水平的ERCC1基因的患者具有更好的存活。或者，医生可以确定，肿瘤表达高于域水平的ERCC1基因的患者可能不会从化疗中得到任何显著优点，因为他们的预计存活很低。

本发明的方法适用于各种肿瘤类型。它可制备个体“肿瘤表达分布”，由此在个体患者的样品中测定ERCC1的表达水平，并预测对各种化疗的反应。优选，本发明的方法适用于实体瘤，最优选非小细胞肺癌(NSCLC)肿瘤。对于将本发明的一些实施方案用于特定的肿瘤类型，优选证明ERCC1基因表达水平与存活力之间的关系，这是通过编辑在特定ERCC1表达和对基于铂的化疗的临床抗性之间建立联系的数据组而进行的。

此处定义的ERCC1表达的“预定阈水平”是一种校正的ERCC1肿瘤表达相对水平，当高于此水平时，肿瘤可能对基于铂的化疗方案有抗性。表达水平低于该域值的肿瘤可能对基于铂的化疗方案敏感。表示为ERCC1：β-肌动蛋白之比的相对ERCC1表达在反应于基于铂的化疗方案的肿瘤中的范围为低于约6.7×10^-3。不反应于基于铂的化疗方案的肿瘤中表示为ERCC1：β-肌动蛋白之比的相对ERCC1表达范围为高于约6.7×10^-3。见实施例4。

“预定阈水平”进一步定义为肿瘤的校正的相对ERCC1表达水平，当高于此水平时，接受基于铂的化疗方案的患者可能存活率低。当接受基于铂的化疗方案的患者中肿瘤的校正的相对ERCC1表达水平低于此域水平时，与高患者存活率相关。表示为ERCC1：β-肌动蛋白之比的域校正相对ERCC1表达为约6.7×10^-3。图1，见实施例4。然而，本发明不限于用β-肌动蛋白作为内部对照。

在进行本发明该实施方案的方法时，优选分离患者的肿瘤细胞。实体或淋巴瘤或其一部分是通过手术从患者切除下来的，或通过常规的活检获得。从冷冻或新鲜肿瘤样品中分离出来的RNA是通过本领域任何一种典型的方法从细胞中提取出来的，例如Sambrook，Fischer和Maniatis，MolecularCloning，alaboratorymanual，(2^nded.)，ColdSpringHarborLaboratoryPress，NewYork，(1989)。优选在提取过程中，注意避免RNA降解。

然而，患者的组织在活检后常常被固定，例如，通常用福尔马林(甲醛)或gluteraldehyde固定，或用醇浸渍。通常是使固定的生物样品脱水，并将其包埋在石蜡或本领域那些技术人员已知的其它固体支持物中。见Plenat等，AnnPathol2001Jan；21(1)：29-47。没有包埋的固定组织及固定且包埋的组织都可用于本发明的方法中。将包埋固定组织的固体支持物设计为可用有机溶剂除去，随后使保存的组织再水合。

RNA是通过1999年12月20日提交的美国专利申请US09/469,338中描述的任何一种方法从FPE细胞中提取出来的，所述专利申请全部引入此处作为参考。此处所述固定且石蜡包埋(FPE)的组织是指可储存或存档的组织样品。RNA可从存档的病理样品或活检样品中分离出来，其首先脱石蜡。代表性的脱石蜡方法包括用有机溶剂，如二甲苯洗涤石蜡包埋的样品。脱石蜡样品还可用低级醇的水溶液再水合。适宜的低级醇包括，例如甲醇，乙醇，丙醇和丁醇。脱石蜡样品可用逐渐降低浓度的低级醇溶液连续洗涤而再水合。可选择地，样品可同时脱石蜡和再水合。然后提取样品中的RNA。

为了提取RNA，可利用机械，声波或其它匀化工具匀化固定或固定且脱石蜡的样品。再水合的样品可在含有离液剂，如硫氰酸胍(也可作为异硫氰酸胍销售)的溶液中匀化。将离液溶液中的匀化样品加热至约50-约100℃，所述离液溶液含有有效量的离液剂，如胍化合物。优选的离液剂是硫氰酸胍。

“有效浓度的离液剂”的选择是指从石蜡包埋的样品中纯化的RNA量比没有离液剂情况下分离出来的RNA量高大约10倍。离液剂包括，如，胍化合物，脲，甲酰胺，碘化钾，硫氰酸钾及类似的化合物。本发明方法的优选离液剂是胍化合物，如异硫氰酸胍(也作为硫氰酸胍销售)和盐酸胍。很多阴平衡离子都是有用的，本领域的技术人员可用这种适宜的阴离子制备多种胍盐。本发明所用胍溶液的有效浓度通常约为1-5M，优选约4M。如果RNA已存在于溶液中，那么胍溶液的浓度可以更高，这样，样品中获得的最终浓度约为1-5M。优选用适当的生化缓冲液，如Tris-HCl把胍溶液缓冲至pH约3-6，更优选约4。离液溶液还可含有还原剂，如二硫苏糖醇(DTT)和β-巯基乙醇(BME)。离液溶液还可含有RNA酶抑制剂。

将离液溶液中的匀化样品加热至约50-约100℃，所述离液溶液含有有效量的离液剂，如胍化合物。优选的离液剂是硫氰酸胍。

然后通过苯酚-氯仿萃取，离子交换色谱或大小排阻色谱回收离液溶液中的RNA。然后，利用提取，电泳，层析，沉淀技术或其它适宜技术进一步纯化RNA。

ERCC1 mRNA的定量优选使用本领域常用的逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)进行，其中所述ERCC1 mRNA来源于新鲜，冷冻，或固定组织的纯化总mRNA。定量ERCC1 mRNA的其它方法包括，例如，使用多重PCR中所用的分子指标和其它标记探针。此外，本发明还利用没有PCR的系统测量ERCC1的mRNA，其中没有PCR的系统使用的是与Invader测定(ThirdWave Technologies，Inc.)中使用的探针相似的荧光标记探针。最优选，ERCC1cDNA及内部对照或管家基因(例如，β-肌动蛋白)的定量是利用基于荧光的实时检测法(ABIPRISM7700或7900 Sequence Detection System[TaqMan]，AppliedBiosystems，FosterCity，CA.)或与Heid等(Genome Res 1996；6：986-994)和Gibson等(Genome Res 1996；6：995-1001)所述相似的系统进行的。ABI7700(TaqManInstrument)的输出量是以Ct’s或“循环阈”表示的。使用TaqMan系统，样品中具有较高数量靶分子的高水平表达基因产生一种信号，并且PCR循环(较低的Ct)比具有较少靶分子(较高的Ct)的低水平相对表达的基因要少。

此处所用“管家”基因或“内部对照”是任何一种组成型或全局型表达基因，它的存在可评估ERCC1 mRNA的水平。这种评估包括测定基因转录的总体组成型水平和RNA回收中变异的对照。“管家”基因或“内部对照”包括，但不限制于亲环蛋白基因，β-肌动蛋白基因，转铁蛋白受体基因，GAPDH基因等。最优选内部对照基因是β-肌动蛋白基因，如Eads等，Cancer Research 1999；59：2302-2306所述。

RNA回收中变异的对照需要使用“校准RNA”。“校准RNA”可以是任何一种可得到的精确预定量的对照RNA。优选使用人肝总RNA(Stratagene，目录号735017)。

此处所用“未校正基因表达(UGE)”是指由TaqMan仪器产生的相对于内部对照基因的ERCC1表达的数字输出。用于确定UGE的公式在实施例3中表示，并用图2样品计算结果举例说明。

本发明另一方面提供一种校准化未校正基因表达(UGE)值的方法，所述未校正基因表达(UGE)值是利用源于非-TaqMan技术的“已知相对基因表达”值，从TaqMan仪器获得的。优选，已知源于非-TaqMan的相对ERCC1：β-肌动蛋白表达值是用源于TaqMan的组织样品ERCC1 UGE值标准化的。

此处所用“校正的相对ERCC1表达”是指标准化的ERCC1表达，UGE乘以ERCC1特异性校正因子(K_ERCC1)得到一个值，该值可与ERCC1相对于内部对照基因的已知表达水平范围相比较。实施例3和图2详细说明了这些计算结果。这些数值可确定特定样品的“校正相对ERCC1表达”是高于还是低于“预定阈”水平。相对于β-肌动蛋白水平的校正的相对ERCC1表达的预定域水平为约6.7×10^-3。ERCC1，内部对照β-肌动蛋白和校准人肝总RNA(Stratagene，目录号735017)的特异性K_ERCC1为1.54×10^-3。

“已知的相对基因表达”值源于先前分析的组织样品，且它是以靶基因的RT-PCR信号与组成型表达的内部对照基因(例如，β-肌动蛋白，GAPDH等)的比值为基础的。优选这种组织样品是用福尔马林固定并用石蜡包埋(FPE)的样品，RNA是按照实施例1描述的方案从它们之中提取出来的。为了测量相对于内部对照的基因表达，使用了本领域已知的标准定量RT-PCR技术。Pre-TaqMan技术PCR反应进行固定的循环数(即，30次)，并报告每份样品的终点值。然后按照ERCC1表达与β-肌动蛋白表达的比值报道这些值。见Reed等的美国专利5,705,336。

除了β-肌动蛋白和/或不同于人肝总RNA(Stratagene，目录号735017)的校准RNA之外，还可测定其它内部对照基因的K_ERCC1。为此，人们必须校准内部对照基因和校准RNA，其中已经测定了相对于特定内部对照基因ERCC1的表达水平(即，“已知的相对基因表达”)。优选这种组织样品是福尔马林固定且石蜡包埋的(FPE)样品，RNA是按照实施例1和1999年12月20日提交的美国专利申请09/469,338描述的方案从它们之中提取出来的，该专利申请在此全文引入作为参考。这种测定可使用本领域熟知的标准pre-TaqMan定量RT-PCR技术进行。根据这种测定，这种样品具有ERCC1的“已知相对基因表达”水平，可用于测定对实施例3所述的新内部对照和/或校准RNA特异的新K_ERCC1。

本发明的方法可适于各种组织和肿瘤类型，可用于评估患者的临床治疗，并作为各种癌症，包括乳腺癌，头颈癌，肺癌，食管癌，结肠直肠癌等的诊断或预后工具。在优选实施方案中，本发明的方法适于非小细胞肺癌(NSCLC)的预后。

化疗前治疗肿瘤活检样品通常只对固定且石蜡包埋(FPE)的组织有效，这些组织通常只含有非常少量的不均一组织。这种FPE样品可很容易经过显微解剖，这样就可测定没有污染非恶性基质组织的肿瘤组织中的ERCC1基因表达。此外，比较还可在活检组织样品内的非恶性基质组织和肿瘤组织间进行，因为这种样品常常含有两种类型的组织。

通常，与ERCC1基因的一个区侧面连接的任何寡核苷酸对都可用于进行本发明的方法。在严格条件下与ERCC1基因的一个区杂交，用于本发明的引物可扩增20-1000个碱基对，优选50-100个碱基对，最优选少于100个碱基对的产物。

本发明提供特异性的寡核苷酸引物对和与其基本上相同的寡核苷酸引物，可利用FPE组织精确评估ERCC1表达。优选寡核苷酸引物，ERCC1-504F(SEQ ID NO：1)和ERCC1(SEQ ID NO：2)，(此处也称为寡核苷酸引物对ERCC1)和基本上与其相同的寡核苷酸引物。寡核苷酸引物ERCC1-504F(SEQ ID NO：1)和ERCC1(SEQ ID NO：2)显示出对测量ERCC1 mRNA的水平特别有效，所述测量是使用通过任何一种mRNA分离方法从FPE细胞中提取出来的RNA进行的，如实施例1和1999年12月20日提交的美国专利申请09/469,338所述，该专利申请在此引入作为参考。

“基本上相同”的核酸是指在严格条件下与靶杂交的核酸，及适当比对时，与具有适当核苷酸插入和缺失的核酸相比较时，至少约60％，优选至少约70％，更优选至少约80％，优选至少约90％，更优选至少约95-98％的核苷酸相同的核酸片段，或它们的互补链。当选择性高于特异性时，存在选择性杂交。见，Kanehisa，NucleicAcidsRes.，12：203-213(1984)。

本发明包括基本上相同的寡核苷酸，其在严格条件下(如此处所定义的)与ERCC1-504F(SEQ ID NO：1)，其互补序列，或ERCC1-574R(SEQ ID NO：2)，或其互补序列的核苷酸引物序列的全部或一部分杂交。

在严格的杂交条件下，只有高度互补的，即，与此处所定义的基本上相似的核酸序列才能进行杂交。优选，这种条件会阻碍20个连续核苷酸中有4个或更多错配，更优选20个连续核苷酸中有2个或更多错配，最优选20个相连核苷酸中有1个或更多错配的核酸进行杂交。

核酸的杂交部分通常至少约为10个(例如，15个)核苷酸长。核酸进行杂交的部分与寡核苷酸引物ERCC1-504F(SEQ ID NO：1)，其互补序列，或ERCC1-574R(SEQ ID NO：2)，或其互补序列的全部或一部分序列至少约80％，优选至少约95％，或最优选至少约98％相同。

寡核苷酸引物与核酸样品在严格条件下的杂交在下面规定。核酸双链体或杂交体的稳定性是以解链温度(Tm)表示的，它是探针从靶DNA解离下来的温度。解链温度可用于限定所需的严格条件。如果所要鉴定的序列与探针基本上相同，而不是相同，那么它可首先用于确定最低温度，在最低温度时，只有使用特殊浓度的盐(例如，SSC或SSPE)才能进行同源杂交。然后，假定1％错配导致Tm降低1℃，那么杂交反应的最终洗涤温度因此降低(例如，如果找到与探针的同一性＞95％的序列，那么最终的洗涤温度降低5℃)。实际上，Tm在0.5℃-1.5℃/1％错配之间变化。

严格条件包括约68℃时，在5xSSC/5xDenhart’s溶液/1.0％SDS中杂交，室温时，在0.2xSSC/0.1％SDS中洗涤。中度的严格条件包括约42℃时，在3xSSC中洗涤。改变盐浓度和温度参数，可在引物和靶核酸之间获得最佳的同一性水平。有关这种条件的其它指导可在本领域中很容易地得到，例如，Sambrook，Fischer和Maniatis，MolecularCloning，a laboratory manual，(2^nded.)，Cold Spring HarborLaboratory Press，NewYork，(1989)和F.M.Ausubel等编辑，CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley和Sons(1994)。

此处公开的寡核苷酸引物能够精确评估固定或固定且石蜡包埋的组织，及冷冻或新鲜组织中的ERCC1基因表达。FPE样品的RNA比新鲜或冷冻组织的RNA更破碎。因此，本发明的方法适用于测定所有组织中的ERCC1基因表达，而先前不存在利用固定组织测定ERCC1基因表达的方法。

根据在肿瘤中表达的ERCC1 mRNA量的测量结果，本领域技术人员可以进行关于肿瘤对特定基因毒素的临床抗性或接受特定基因毒素的患者的存活率的预后。基于铂的化疗或诱导相似类型的DNA破坏的化疗优选是基因毒素。

基于铂的化疗导致DNA的“大加合物”，其中主要的作用是扭曲双螺旋的三维构象。所述化合物可以单独给药，或与吉西他滨(Gem)或5-氟尿嘧啶(5-FU)联合给药。

基于铂的基因毒性化疗包括形成共价DNA加合物的重金属配位化合物。一般地，这些重金属与DNA共价结合，在恰当的部分形成顺-1，2-链内二核苷酸加合物。一般地，这一类的代表有顺-二氨合二氯铂(II)(顺铂)，并且包括顺-二氨合-(1，1-环丁烷二羧基)铂(II)(卡铂)，顺-二氨合-(1，2-环己基)二氯铂(II)，以及顺-(1，2-乙二胺)二氯铂(II)。铂制剂包括前述代表性化合物的类似物或衍生物。

目前可以用铂配位化合物控制的肿瘤包括睾丸、子宫内膜、宫颈、胃、鳞状细胞、肾上腺皮质和小细胞肺癌，以及成髓细胞瘤和成神经细胞瘤。

反-二氨合二氯铂(II)(反-DDP)在临床上是无用的，这是因为认为它的DNA加合物迅速修复。用反-DDP作为化疗剂可能将在未选择的细胞中提供低毒性，在选择的细胞中提供高相对毒性。在优选实施方案中，铂化合物是顺铂。

许多化合物通常与基于铂的化疗剂一起给药。例如，BEP(博莱霉素、依托泊苷产出、顺铂)用于睾丸癌，MVAC(氨甲喋呤、长春碱、阿霉素、顺铂)用于膀胱癌，MVP(丝裂霉素C、长春碱、顺铂)用于非小细胞肺癌治疗。许多研究记录了含有铂的制剂之间的相互作用。例如，报道了可能包含在基于铂的化疗中的许多药物的治疗药物协同性。对于该内容的最近的参考文献的很少的一些例子如下：Okamoto等，Urology 2001；57：188-192；Tanaka等，Anticancer Research2001；21：313-315；Slamon等，Seminars in Oncology2001；28：13-19；Lidor等，Journal of Clinical Investigation1993；92：2440-2447；Leopold等，NCI Monographs 1987；99-104；Ohta等，Cancer Letters 2001；162：39-48；van Moorsel等，BritishJornal of Cancer 1999；80：981-990。

其它基因毒性剂是形成持续基因组损伤的那些，优选用于癌症的临床控制中的化疗剂。基因毒素诱导的DNA破坏的细胞修复速度，以及通过细胞分裂周期进行的细胞生长影响了基因毒素治疗的结果。细胞基因组中未修复的损伤可以妨碍DNA复制，妨碍新合成的DNA的复制保真性或阻碍细胞存活所需基因的表达。因此，基因毒性剂的细胞毒性(导致细胞死亡的倾向)的一个决定因素是由其形成的基因组损伤对细胞修复的抗性。形成持续的基因组损伤，如保持在基因组中至少到细胞进行细胞周期的损伤的基因毒性剂，相对于形成瞬时的、容易修复的基因组损伤的试剂一般是更有效的细胞毒素。

一大类用于治疗许多癌症并且受ERCC1表达水平影响的基因毒性化合物是DNA烷基化试剂以及DNA嵌入剂。补骨脂素是已知用于皮肤病如牛皮癣、白癜风、真菌感染的光化疗中的基因毒性化合物。Harrison’s Principles of Internal Medicine，Part 2 CardinalManifestations of Disease，Ch.60(12^th ed.1991)。另一大类基因毒性化合物，包括合成和天然来源的抗生素，其成员可以烷基化或嵌入DNA。此处特别关注的是抗肿瘤性抗生素，包括但不限于由以下化合物代表的各类化合物：安沙可林；放线菌素A，C，D(也称作更生霉素)或F(或KS4)；氮丝氨酸；博莱霉素；卡美诺霉素(洋红霉素)；柔红霉素(红比霉素)或14-羟基柔红霉素(阿霉素或羟基红比霉素)；丝裂霉素A，B或C；米托恩醌；plicamycin(光辉霉素)等。

另一大类常用的基因毒性剂是烷基化DNA的试剂，包括卤代乙基亚硝基脲，特别是氯乙基亚硝基脲。该大类的代表性成员包括卡氮芥、氯脲菌素、福替目丁、罗氮芥、尼氮芥、雷尼氮芥和链脲霉素。卤代乙基亚硝基脲试剂也可以是上述任意代表性化合物的类似物或衍生物。

另一大类基因毒性剂包括硫和氮芥，其成员烷基化DNA。这些化合物主要通过在鸟嘌呤的N7氮形成共价加合物而破坏DNA。该大类的代表性成员包括Chlorambucil，环磷酰胺，异环磷酰胺，美法兰，methloroethamine，新氮芥，氯乙环磷酰胺等。如果需要选择一个或多个预定的基因组靶作为基因组损伤的位点，也可以使用与选定细胞的基因组中的特定序列共价或非共价相互作用的寡核苷酸或其类似物作为基因毒性剂。

另一类试剂包括氮丙啶和甲基蜜胺类，其成员烷基化DNA。这些类包括，例如六甲基蜜胺，三亚乙基磷酰胺(TEPA)，三乙基硫代磷酰胺(硫代TEPA)。

其它类的DNA烷基化试剂包括磺酸烷基酯，代表为白消安；azinidines，代表为苄替哌；以及其它，代表为，例如丙米腙，米托恩醌和甲基苄肼。这些类都包括代表性化合物的类似物和衍生物。

上面描述了本发明，本发明的实际操作是通过下面给出的实验性实施例举例说明的。技术人员应认识到说明实施例中使用的材料和方法可以各种方式进行改进。这种改进也被认为落在本发明的范围之内。

实施例

实施例1

从FPE组织中分离RNA

RNA是通过下列一般过程从石蜡包埋组织中提取出来的。

A.切片的脱石蜡和水合

(1)把约10μM的切片的一部分放在1.5mL塑料离心管中。

(2)加入600μL二甲苯，室温(约20-25℃)用力振摇混合物约10分钟。

(3)室温时，以台式离心机的最大速度(约10-20,000xg)将样品离心约7分钟。

(4)重复步骤2和3，直到绝大部分石蜡溶解。根据原始样品部分所含的石蜡量，通常需要重复2次或更多次。

(5)用低级醇，优选用100％乙醇(约600μL)用力振摇约3分钟，除去二甲苯溶液。

(6)按照步骤(3)将试管离心约7分钟。倾出并弃去上清液。颗粒状物变为白色。

(7)用更稀释的乙醇溶液：首先用约95％乙醇，然后用约80％乙醇，最后用约70％乙醇连续重复步骤5和6。

(8)按照步骤(3)，室温将样品离心7分钟。弃去上清液，室温干燥颗粒状物约5分钟。

B.用苯酚-氯仿分离RNA

(1)加入400μL含0.5％肌氨酸的异硫氰酸胍溶液和8μL二硫苏糖醇。

(2)然后用组织匀浆器(Ultra-Turrax，IKA-Works，Inc.，Wilmington，NC)匀化样品约2-3分钟，速度从低速(速度1)到高速(速度5)逐渐升高。

(3)然后将样品在大约95℃时加热约5-20分钟。优选在加热到95℃之前，用细针刺入含样品的试管的管帽。可选择地，管帽可用塑料夹子或实验用薄膜固定。

(4)然后用pH4.0的50μL 2M醋酸钠和600μL苯酚/氯仿/异戊醇(10∶1.93∶0.036)萃取样品，其中苯酚/氯仿/异戊醇(10∶1.93∶0.036)是用18mL苯酚和3.6mL 1∶49的异戊醇∶氯仿溶液新制备的。用力振摇溶液约10秒，然后在冰上冷却约15分钟。

(5)以最大速度将溶液离心约7分钟。将上层的(水)相转移到一个新的试管中。

(6)-20℃时，用约10μL糖原和400μL异丙醇沉淀RNA30分钟。

(7)通过在台式离心机中以最大速度离心约7分钟，而使RNA成为颗粒状物；倾出并弃去上清液；用大约500μL约70-75％的乙醇洗涤颗粒状物。

(8)以最大速度将样品再次离心7分钟。弃去上清液，并将颗粒状物风干。然后将颗粒状物溶解在适宜的缓冲液中，用于进一步的实验(例如，50pL 5mM Tris氯化物，pH8.0)。

实施例2

mRNA的逆转录和PCR

逆转录：如实施例1中举例说明和1999年12月20日提交的美国专利申请US09/469,338中的描述(全文引入此处作为参考)，RNA是从显微解剖或非-显微解剖的福尔马林固定的石蜡包埋(FPE)组织中分离出来的。用乙醇沉淀并离心后，将RNA颗粒状物溶解在50μL pH8.0的5mM Tris/Cl中。M-MLV逆转录酶可延伸一种寡核苷酸引物，其在脱氧核苷酸存在的情况下与单链RNA或DNA模板杂交，产生互补链。所得RNA是用来源于Life Technologies的M-MLV逆转录酶和随机的六聚体逆转录的。逆转录是通过把25μLRNA溶液与25.5μL“逆转录混合物”混合进行的(见下面)。将反应物放在热循环仪中，26℃时8分钟(用于使随机的六聚体与RNA结合)，42℃时45分钟(用于M-MLV逆转录酶促反应)，95℃时5分钟(用于DNA酶的热灭活)。

“逆转录混合物”由以下成分组成：10μl 5X缓冲液(250mMTris-HCl，pH8.3，375mM KCl，15mM MgCl₂)，0.5μl随机的六聚体(50O.D.溶解在550μl，pH7.5的10mM Tris-HCl中)，5μl 10mM dNTPs(dATP，dGTP，dCTP和dTTP)，5μl 0.1M DTT，1.25μl BSA(在pH7.5的10mM Tris-HCL中为3mg/ml)，1.25μl RNAGuard24，800U/ml(RNA酶抑制剂)(目录号27-0816，AmershamPharmacia)和2.5μl MMLV 200U/μl(Life Tech目录号28025-02)。

反应组分的最终浓度是：50mM Tris-HCl，pH8.3，75mM KCl，3mMMgCl₂，1.0mM dNTP，1.0mM DTT，0.00375mg/ml BSA，0.62U/μl RNAGuard和10U/μl MMLV。

mRNA表达的PCR定量。ERCC1 cDNA和内部对照或管家基因(例如β-肌动蛋白)cDNA的定量是使用Heid等，(Genome Res1996；6：986-994)；Gibson等，(Genome Res1996；6：995-1001)所述的基于荧光的实时检测法(ABI PRISM 7700或7900序列检测系统[TaqMan]，Applied Biosystems，FosterCity，CA.)进行的。简言之，该方法使用一种双重标记的产荧光TaqMan寡核苷酸探针，(ERCC1-530Tc(SEQ ID NO：3)，Tm＝70℃)，其特异性地在正向和反向引物内退火。含反应混合物的加盖孔内的激光刺激引起3’猝灭剂染料(TAMRA)发射，直到探针在PCR延伸过程中被DNA聚合酶的5’-3’核酸酶活性裂解，引起5’报道染料(6FAM)的释放。因此，扩增子的产生引起荧光信号的发射，这是通过TaqMan’sCCD(电荷耦合器件)检测照相机检测的，PCR反应纯指数相内，阈循环所产生的信号量可反映目标序列的起始拷贝数。目标序列起始拷贝数与内部对照基因起始拷贝数的比较可提供相对基因表达水平。TaqMan分析了产率的水平，它是以两个绝对测量值间的比值(目标基因/内部对照基因)表示的。

PCR反应混合物由以下成分组成：0.5μl含有如上制备的cDNA的逆转录反应物，600nM各寡核苷酸引物ERCC1-504F(SEQ ID NO：1，Tm＝59℃)和ERCC1-574R(SEQ ID NO：2，Tm＝58℃)，200nM TaqMan探针(SEQ ID NO：3)，5U AmpliTaq Gold聚合酶，200μM各dATP，dCTP，dGTP，400μM dTTP，5.5mMMgCl2，和含有参考染料的1xTaqman缓冲液A，最终的体积小于或等于25μl(所有试剂，AppliedBiosystems，FosterCity，CA)。循环条件是，95℃10分钟，然后是95℃15秒和60℃1分钟循环45次。用于定量内部对照基因β-肌动蛋白的寡核苷酸是β-肌动蛋白TaqMan探针(SEQ ID NO：4)，β-肌动蛋白-592F(SEQ ID NO：5)和β-肌动蛋白-651R(SEQ IDNO：6)。

用于上述反应的寡核苷酸引物ERCC1-504F(SEQ ID NO：1)和ERCC1-574R(SEQ ID NO：2)将扩增71bp的产物。

实施例3

测定ERCC1的未校正基因表达(UGE)

进行两对平行反应。“试验”反应和“校准”反应。图7。ERCC1扩增反应和β-肌动蛋白内部对照扩增反应是试验反应。单独的ERCC1和β-肌动蛋白扩增反应是在校准RNA模板上进行的，被称作校准反应。TaqMan仪器产生4个不同的循环阈(Ct)值：试验反应的Ct_ERCC1和Ct_{β-肌动蛋白}，和校准反应的Ct_ERCC1和Ct_{β-肌动蛋白}。两种反应的Ct差值是根据下列公式确定的：

ΔCt_试验＝Ct_ERCC1-Ct_{β-肌动蛋白}(“试验”反应)

ΔCt_校准＝Ct_ERCC1-Ct_{β-肌动蛋白}(“校准”反应)

下一步是按照下列公式计算2的负ΔCt次方。

2^-ΔCt试验(“试验”反应)

2^-ΔCt校准(“校准”反应)

为了从TaqMan仪器获得ERCC1的未校正基因表达，进行了下列计算：

ERCC1的未校基因表达(UGE)＝2^-ΔCt试验/2^-ΔCt校准

用已知的相对ERCC1表达水平标准化UGE

标准化的计算需要将UGE乘以对ERCC1和特定校准RNA特异的校正因子(K_ERCC1)。还可测定任何一种内部对照基因和任何一种精确预定量的校准RNA的校正因子K_ERCC1。优选，使用内部对照基因β-肌动蛋白和精确预定量的校准RNA，人肝总RNA(Stratagene，目录号735017)。已知这些试剂的校正因子K_ERCC1等于1.54×10^-3。

标准化是使用ΔCt方法的改进法进行的，所述ΔCt方法由Applied Biosystems，TaqMan制造商，在UserBulletin#2中和上文描述。为了进行该过程，使用上述TaqMan方法，分析了6个不同FPE试验组织的UGE的ERCC1表达。使用内部对照基因β-肌动蛋白和校准RNA，人肝总RNA(Stratagene，目录号735017)。

用各样品AG221，AG222，AG252，成人肺，PC3，AdCol的已知相对ERCC1表达水平除以其相应的源于TaqMan的UGE，得到不平均的校正因子K。

K_不平均的＝已知的值/UGE

接下来，求全部K值的平均值，从而确定对ERCC1，校准RNA即Stratagene人肝总RNA(Stratagene，目录号735017)和β-肌动蛋白特异的单一K_ERCC1校正因子。

因此，为了成规模地测定与pre-TaqManERCC1表达研究一致的，未知组织样品中的校正相对ERCC1表达，人们只需用源于TaqMan仪器的未校正基因表达数据(UGE)乘以K_ERCC1特异性校正因子，前提是使用相同的内部对照基因和校准RNA。

校正的相对ERCC1表达＝UGE×K_ERCC1

K_ERCC1可使用任何一种精确预定量的校准RNA或内部对照基因测定。未来来源的精确预定量RNA可按照上述方法，相对于样品用已知的相对ERCC1表达校准或可相对于先前已经校准过的校准RNA，如上述人肝总RNA(Stratagene，目录号735017)校准。

例如，如果随后测定不同的内部对照基因和/或不同的校准RNA的K_ERCC1，则人们必须相对于组织样品校准内部对照基因和校准RNA，其中已经测定了相对于特定内部对照基因的ERCC1表达水平。这种测定可使用本领域熟知的标准pre-TaqMan，定量RT-PCR技术进行。用这些样品的已知表达水平除以它们相应的UGE水平，可确定样品的K值。然后根据已知样品数，求K值的平均值，从而测定对不同内部对照基因和/或校准RNA特异的新K_ERCC1。

实施例4

所有患者参与前瞻性多中心三方案随机试验(GEPC/98-02，西班牙肺癌组III期顺铂/吉西他滨(CG)与顺铂/吉西他滨/长春瑞滨(CGV)与序贯双重吉西他滨/长春瑞滨，然后是异环磷酰胺/长春瑞滨(GV/IV)，在晚期NSCLC中进行)中的顺铂/吉西他滨方案。所有患者每3周的第1、8天接受Gem 1250mg/m²，第1天加CDDP 100mg/m²。GECP/98-02的入选标准是可测量的IV期(如果无症状，脑转移者可入选)或IIIB期(恶性胸膜和/或心包渗出和/或锁骨上腺体病变)NSCLC以及东方合作组(ECOG)表现评分0-2。所有患者在进入该研究前进行胸部X线检查和胸部及上腹部计算机体层摄影(CT)扫描，并且至少6周进行一次重复评估。根据WHO标准将肿瘤反应评估为完全反应、部分反应、稳定疾病和进展性疾病。用同样的成像方法建立基线肿瘤测量值。

总mRNA是从显微解剖的FPE预处理肿瘤样品中分离的，如实施例2和3的描述用定量RT-PCR测量校正的相对ERCC1表达。从样品分离mRNA的方法描述于实施例1中和1999年12月20日提交的美国专利申请US09/469,338中的描述，在此全文引入此处作为参考。

统计学分析

用Mann-Whitney U检验评估连续检验变量，校正的相对ERCC1表达和二分变量(患者性别、高于中值年龄和低于中值年龄的年龄、体重减轻的存在、胸膜渗出的存在、肿瘤分期)之间的显著关联。用Kruskal-Wailis检验方法检验多组内校正的相对ERCC1表达的显著差异(ECOG表现状态、组织病理学)。用Fisher精确检验分析分类的临床病理值，包括反应和二分的校正的相对ERCC1表达值。

所有患者进行第一研究治疗，直到死亡或直到检查数据。Kaplan-Meier存活曲线和对数秩检验用于分析存活和无疾病存活的单变量分布。Miller和Sigmund(Miller等，Biometrics 38：1011-1016，1982)的最大卡方方法适于确定最有利于将患者二分成预后差和预后好(是否可能存活)的亚组的表达值，对数秩检验作为用于测量分组强度的统计方法。为了测定P值，其中所述P值被解释为以最大卡方分析为基础的相关强度的测量值，用1000引导指令样刺激用于评估假设无关情况下的最大卡方统计量分布。(Biometrics 38：1017-1023，1982)。进行单变量分析中显著的因素的Cox危险比模型分析，用于鉴定哪些因素可能对存活具有显著影响。用SPSS 10.0.5版软件(SPSSInc.Chicago I11.)进行所有的统计分析。所有P值都是双侧的。

校正的相对ERCC1表达水平

ERCC1 mRNA表达在所有56个分析的样品中都是可检测的。相对于内部对照管家基因β-肌动蛋白的中值校正相对ERCC1表达为6.7×10^-3(范围0.8×10^-3-24.6×10^-3)。校正的相对ERCC1表达水平和以下任意因素：年龄(P＝0.66)、性别(P＝0.18)、随机化前6个月存在体重减轻(P＝0.74)、肿瘤分期(IIIB与IV，P＝0.39)、或胸膜渗出的存在(P＝0.25，均采用Mann-Whitney U检验)之间没有显著关联。在具有不同的表现状态分级(P＝0.48，Kruskal-Wallis检验)或不同的肿瘤类型(所有四种类型，P＝0.10，Kruskal-Wallis检验)的患者的校正的相对ERCC1表达水平之间没有显著差异，但SCC肿瘤的校正的相对ERCC1表达水平(中值8.6×10^-3)与腺癌相比明显更高(中值5.2×10^-3，P＝0.015，Mann-Whitney检验)。

对化疗的反应

47名可评价反应的患者的肿瘤反应如图3所示。总体反应率为44.7％。完全反应和部分反应，即“应答”肿瘤的校正的相对ERCC1表达水平(中值4.3×10^-3，范围1.2×10^-3-24.6×10^-3)与稳定疾病和进展疾病，即“无应答”肿瘤的水平(中值7.85×10^-3，范围0.8×10^-3-24.3×10^-3，P＝0.31，Mann-Whitney检验)无显著差异。校正的相对ERCC1表达值高于和低于任何ERCC1水平的应答和无应答肿瘤的比例之间没有显著差异(所有都是Fisher精确检验)。具有低于域值的校正的相对ERCC1表达的肿瘤(“低表达”，52％应答者)中的反应率高于具有高于域值的校正的相对ERCC1表达的肿瘤(“高表达”，36.4％应答者，Fisher精确检验，P＝0.38)。

患者总体存活与校正的相对ERCC1表达水平之间的关联

中值总体存活时间为36.6周(范围0-113.4周)，到进展的中值时间为24.4周(范围0-102.9周)。用对数秩检验和最大卡方统计鉴定将患者分为预后差和预后好亚组的域校正相对ERCC1表达水平表明，判别值包括中值，因此将其用作存活分析的域值。因此，确定NSCLC的域校正相对ERCC1表达值为6.7×10^-3。图1表示肿瘤内校正相对ERCC1表达水平高于和低于域校正相对ERCC1表达水平的患者的Kaplan-Meier存活曲线。如图4所示，具有低于域值的校正相对ERCC1表达水平的患者与具有高于域值的校正相对ERCC1表达水平的患者的20.4周(95％C.I.6.9，33.9周)相比，具有显著更长的61.6周的中值存活(95％C.I.42.4，80.7周)。对肿瘤分期进行校正后，低或高校正相对ERCC1表达和总体存活之间的关联的对数秩统计量为3.97，P值为0.046。未校正的对数秩结果如图4所示。

检验了5.8×10^-3的分离校正相对ERCC1表达域值，因为以前的研究表明，该值与胃癌患者的总体存活相关。(Metzger等，J Clin Oncol1998；16：309-316)。在该研究中，校正相对ERCC1水平低于5.8×10^-3的NSCLC患者组的总体存活显著低于ERCC1水平高于5.8×10^-3的患者(对数秩统计量6.37，P＝0.011)，但更高的6.7×10^-3的校正相对ERCC1表达域水平是更强的判别因素。

其它在使用Kaplan Meier存活曲线和对数秩检验进行的单变量分析中与总体存活显著相关的因素是治疗期体重减轻和ECOG表现状态(表2)。患者年龄(P＝0.18)、性别(P＝0.87)、肿瘤分期(P＝0.99)、肿瘤细胞类型(P＝0.63)和胸膜渗出的存在(P＝0.71)都不是总体存活的显著预后因素。校正的相对ERCC1表达水平、ECOG表现状态和体重减轻在Cox危险比回归模型多变量分析中仍然是存活的显著预后因素。对肿瘤分析进行分层的Cox回归模型的P值是0.038，体重减轻为0.017，ECOG表现状态为0.02(PS 0与1或2)。

该研究发现了用基于铂的化疗治疗癌症患者后低ERCC1 mRNA表达水平与改进的存活之间的关联。

序列表

<110>K.D.达南伯格等

<120>基于ERCC1和TS表达确定化疗方案的方法

<130>11220/145

<140>待定

<141>- -

<150>09/877,095

<151>2001-06-11

<150>09/796,491

<151>2001-03-02

<160>7

<170>FastSEQ for Windows Version 4.0

<210>1

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸引物

<400>1

gggaatttgg cgacgtaatt c 21

<210>2

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸引物

<400>2

gcggaggctg aggaacag 18

<210>3

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸引物

<400>3

cacaggtgct ctggcccagc acata 25

<210>4

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸引物

<400>4

accaccacgg ccgagcgg 18

<210>5

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸引物

<400>5

tgagcgcggc tacagctt 18

<210>6

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸引物

<400>6

tccttaatgt cacgcacgat 20

<210>7

<211>1097

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>7

aagtgctgcg agccctgggc cacgctggcc gtgctggcag tgggccgcct cgatccctct 60

gcagtctttc ccttgaggct ccaagaccag caggtgaggc ctcgcggcgc tgaaaccgtg 120

aggcccggac cacaggctcc agatggaccc tgggaaggac aaagaggggg tgccccagcc 180

ctcagggccg ccagcaagga agaaatttgt gatacccctc gacgaggatg aggtccctcc 240

tggagtggcc aagcccttat tccgatctac acagagcctt cccactgtgg acacctcggc 300

ccaggcggcc cctcagacct acgccgaata tgccatctca cagcctctgg aaggggctgg 360

ggccacgtgc cccacagggt cagagcccct ggcaggagag acgcccaacc aggccctgaa 420

acccggggca aaatccaaca gcatcattgt gagccctcgg cagaggggca atcccgtact 480

gaagttcgtg cgcaacgtgc cctgggaatt tggcgacgta attcccgact atgtggcggg 540

ccagagcacc tgtgccctgt tcctcagcct ccgctaccac aacctgcacc cagactacat 600

ccatgggcgg ctgcagagcc tggggaagaa cttcgccttg cgggtcctgc ttgtccaggt 660

ggatgtgaaa gatccccagc aggccctcaa ggagctggct aagatgtgta tcctggccga 720

ctgcacattg atcctcgcct ggagccccga ggaagctggg cggtacctgg agacctacaa 780

ggcctatgag cagaaaccag cggacctcct gatggagaag ctagagcagg acttcgtctc 840

ccgggtgact gaatgtctga ccaccgtgaa gtcagtcaac aaaacggaca gtcagaccct 900

cctgaccaca tttggatctc tggaacagct catcgscgca tcaagagaag atctggcctt 960

atgcccaggc ctgggccctc agaaagcccg gaggctgttt gatgtcctgc acgagccctt 1020

cttgaaagta ccctgatgac cccagctgcc aaggaaaccc ccagtgtaat aataaatcgt 1080

cctcccaggc caggctc 1097

Claims

1.一种确定用于治疗患者肿瘤的基于铂的化疗方案的方法，所述方法包括：

(a)获得肿瘤的组织样品并固定样品，以获得固定的肿瘤样品；

(b)从固定的肿瘤样品分离mRNA；

(c)使用在严格条件下与ERCC1基因的一个区杂交的寡核苷酸引物对扩增mRNA，获得扩增样品；

(d)测定扩增样品中的ERCC1 mRNA的量；

(e)比较步骤(d)的ERCC1 mRNA的量与内部对照基因的mRNA量；并且

(f)基于扩增样品中ERCC1 mRNA的量和ERCC1基因表达的预定域水平确定基于铂的化疗方案。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述寡核苷酸引物由寡核苷酸引物对ERCC1，或基本上与其相同的寡核苷酸引物对组成。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述肿瘤是非小细胞肺癌(NSCLC)肿瘤。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述ERCC1基因表达的阈水平是内部对照基因表达水平的约6.7×10^-3倍。

5.一种用基于铂的化疗方案治疗肿瘤的方法，包括：

(b)从固定的肿瘤样品分离mRNA；

(d)测定扩增样品中的ERCC1 mRNA的量；

(e)比较步骤(d)的ERCC1 mRNA的量与内部对照基因的mRNA量；并且

(f)当测定的ERCC1基因的基因表达水平低于预定域值时，提供包含基因毒性剂的基于铂的化疗方案。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述肿瘤是非小细胞肺癌(NSCLC)肿瘤。

7.根据权利要求5所述的方法，其中所述基因毒性剂是吉西他滨、顺铂或其联合。

8.一种测定固定且石蜡包埋的组织样品中ERCC1表达水平的方法，包括：

(a)将组织样品脱石蜡，获得脱石蜡的样品；

(b)在存在有效量离液剂的条件下，分离脱石蜡样品的mRNA；

(d)测定相对于内部对照基因mRNA量的ERCC1 mRNA量。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述寡核苷酸引物对由寡核苷酸引物对ERCC1或基本上与其相似的寡核苷酸引物对组成。

10.根据权利要求8所述的方法，其中所述内部对照基因是β-肌动蛋白。

11.根据权利要求8所述的方法，其中mRNA的分离是通过下列步骤进行的：

(a)将含有有效浓度离液化合物的溶液中的组织样品加热至大约75℃-100℃，加热约5-120分钟；并且

(b)回收离液溶液中的所述mRNA。

12.一种具有SEQ ID NO：1序列的寡核苷酸引物或基本上与其相同的寡核苷酸。

13.一种具有SEQ ID NO：2序列的寡核苷酸引物或基本上与其相同的寡核苷酸。

14.一种检测ERCC1基因表达的试剂盒，其含有寡核苷酸对ERCC1或基本上与其相同的寡核苷酸对。