CN1636592A - 稳定化的含多肽的液体药物组合物 - Google Patents

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Abstract

提供了稳定化的含多肽液体药物组合物。组合物都含有氨基酸碱，作为多肽的主要稳定剂，和为了多肽的稳定性，一种酸和/或其盐形式来将溶液缓冲于可接受的pH范围内。组合物接近等渗。还提供了提高液体药物组合物中多肽的稳定性，和提高这些药物组合物储藏稳定性的方法。

Description

稳定化的含多肽的液体药物组合物
本申请是2000年10月3日提交的申请号为00816328.6，名为稳定化的含多肽的液体药物组合物发明专利申请的分案申请。
发明领域
本发明一般涉及药物组合物，更具体涉及通常在液体药物组合物中不稳定的含有多肽的药物组合物。
发明背景
基因工程技术开发中的最近进展提供了大量足以用作药物的各种各样的生物活性多肽。然而多肽由于物理不稳定性(包括变性，形成可溶和不溶的聚集物)以及各种化学不稳定性(例如水解，氧化和脱氨基作用)会丧失活性。pH、离子强度、温度、冻融的重复循环和机械剪切力作用(如在加工中发生的)等因素都可影响液体药物制剂中多肽的稳定性。还可能由于物理性搅动和在储藏小瓶中和在溶液中液气界面的各多肽分子相互作用，也可发生聚集物形成和生物活性丧失。由于运输过程中的振荡作用等在各种界面上的压缩-伸展过程中吸附在气液和固液界面上的多肽还可能进一步发生的构形变化。这些振荡作用可导致蛋白质缠卷、聚集、形成颗粒和最终与其它吸附的蛋白质一起沉淀。关于蛋白质药物稳定性的综述，参见例如Manning等(1989)Pharm.Res.6：903-918和Wang和Hanson(1988)J.Parenteral Sci.Tech.42：S14。
含多肽的液体药物制剂的不稳定性促使将这些制剂与合适的液体介质一起以冻干形式包装，在使用时再重新配制。虽然冻干改善了组合物的储藏稳定性，但许多多肽显示不论在干燥状态下储藏(Pikal(1990)Biopharm.27：26-30)或由于作为液体制剂重建后聚集形成或丧失催化活性(见例如，Carpenter等(1991)Develop.Biol.Standard 74：225-239；Broadhead等(1992)Drug Devel.Ind.Pharm.18：1169-1206；Mumenthaler等(1994)Pharm.Res.11：12-20；Carpenter和Crowe(1988)Cryobiology 25：459-470；和Roser(1991)Biopharm.4：47-53)，导致活性下降。虽然用添加剂改善了干燥蛋白质的稳定性，但是许多重新水合的制剂仍然具有在数量上不可接受的或不适当的无活性的聚集蛋白质(见例如Townsend和DcLuca(1983)J.Pharm.Sci.80：63-66；Hora等，(1992)Pharm.Res.9：33-36；Yoshiaka等(1993)Pharm.Res.10：687-691)。另外，需要重新配制是一件麻烦事，还有可能无法准确掌握剂量。
虽然已配制了许多液体药物组合物来稳定其中所含多肽的生物活性，但是液体制剂中多肽的降解仍然为医务工作者带来各种问题。因此，需要含有能够促进多肽成分稳定性的在生理学上有兼容性的稳定剂的另一类药物组合物，以维持其疗效。
发明简述
提供了含有作为治疗活性成分的多肽的各种组合物，以及用于制备它们的方法。这些组合物是稳定化的液体药物组合物，它包括多肽，其作为治疗活性成分的效力通常在液体制剂储藏中由于多肽聚集而受损。本发明的稳定化液体药物组合物除了在液体制剂内在储藏过程中显示形成聚集物的多肽外，还含有其量足够减少储藏过程中多肽聚集的氨基酸碱，其中氨基酸碱是一种氨基酸或一组氨基酸，任何给定的氨基酸以其游离碱形式或其盐形式存在。这类组合物还含有缓冲剂，以将液体组合物的pH维持在多肽稳定性可接受的范围内，其缓冲剂是一种基本上不含其盐形式的酸、一种作为盐形式的酸或一种酸及其盐形式的混合物。
氨基酸碱起到了稳定多肽，防止液体药物组合物储藏过程中聚集物形成的作用，同时使用一种基本不含其盐形式的酸、一种以其盐形式存在的酸或一种酸及其盐形式的混合物作为缓冲剂，得到克分子渗透压浓度接近等渗的液体组合物。液体药物组合物还可以掺入其它稳定剂，尤其是用甲硫氨酸，非离子型表面活性剂例如聚山梨酸酯80和EDTA，来进一步提高多肽的稳定性。这种液体药物组合物被认为具有稳定性，因为加入氨基酸碱与一种基本不含其盐形式的酸，一种以盐形式存在的酸或一种酸及其盐形式的混合物，导致组合物的储藏稳定性相对于不存在这两种成分的情况下配制的液体药物组合物有所提高。
还提供了提高液体药物组合物中多肽的稳定性和提高这种药物组合物的储藏稳定性的方法。方法包括在液体药物组合物中掺入其量足够减少组合物储藏过程中多肽聚集物形成的氨基酸碱，和一种缓冲剂，该缓冲剂是基本不含其盐形式的酸，一种作为盐形式存在的酸或一种酸及其盐形式的混合物。这类方法可用于制备本发明的液体药物组合物。
附图简述
图1显示了用RP-HPLC分析，在40℃储藏时稳定样品中可溶性IL-2的剩余百分数。制剂含有0.2毫克/毫升IL-2、10mM pH6的琥珀酸钠和270mM山梨糖醇或蔗糖或甘露醇。
图2显示了用RP-HPLC分析，50℃储藏时稳定样品中可溶性IL-2的剩余百分数。制剂含有0.1毫克/毫升IL-2、10mMpH6的琥珀酸钠和150mM如图所示的各种氨基酸。
图3显示了用RP-HPLC分析，40℃储藏时稳定样品中可溶性IL-2的剩余百分数。制剂含有0.2毫克/毫升IL-2、10mMpH6的琥珀酸钠和50、100或270mM的山梨糖醇。
图4显示了用RP-HPLC分析，50℃储藏时稳定样品中可溶性IL-2的剩余百分数。制剂含有0.2毫克/毫升IL-2、10mMpH6的琥珀酸钠和50、100或150mM精氨酸。
图5显示了用RP-HPLC分析，在50℃作为pH函数的剩余可溶性IL-2的半衰期(t1/2，天)。制剂含有0.2毫克/毫升IL-2、10mM缓冲液(甘氨酸、乙酸钠、柠檬酸钠、琥珀酸钠、磷酸钠、硼酸钠)和150mMNaCl、270mM山梨糖醇或150mM精氨酸。
图6显示了半衰期(t1/2)对储藏在50℃的稳定样品的初始蛋白质浓度的Ln-Ln曲线图。制剂含有0.1、0.2或0.5毫克/毫升IL-2和10mMpH6的琥珀酸钠，以及150mM L-精氨酸。
图7显示了在用从-70℃到环境温度经1、3和5轮冻融处理的样品中用RP-HPLC分析的可溶性IL-2的剩余百分数。制剂含有0.2毫克/毫升IL-2、10mMpH6的琥珀酸钠、150mM精氨酸和0-0.1％聚山梨醇酯80。
图8显示了通过在冰上从Emeryville，California运到St.Louis，Missouri和从St.Louis运回Emeryville的处理样本，用RP-HPLC分析的可溶性IL-2的剩余百分数。用了两种含不同量的聚山梨醇酯80的制剂：精氨酸制剂，含0.2毫克/毫升IL-2的10mM pH6.5的琥珀酸钠和150mM精氨酸；NaCl制剂，含0.2毫克/毫升IL-2的10mM柠檬酸钠(pH6.5)溶液和200mM NaCl。
图9显示了50℃下，作为精氨酸浓度函数，用IEX-HPLC分析的在4种制剂中剩余可溶性TFPI的半衰期(t1/2，天)。所有制剂含有0.15毫克/毫升TFPI和L-精氨酸碱或L-精氨酸HCl，用柠檬酸或10mM柠檬酸和柠檬酸钠缓冲到pH5.5。具体TFPI制剂含有：(a)20-150mM L-精氨酸HCl，10mM柠檬酸和柠檬酸钠作为缓冲剂，(b)20-150mM L-精氨酸碱，用柠檬酸滴定；(c)100-300mM L-精氨酸HCl，10mM柠檬酸和柠檬酸钠作为缓冲剂；(d)100-300mM用柠檬酸滴定的L-精氨酸碱。
图10显示了50℃下，作为精氨酸浓度函数，用IEX-HPLC分析的在4种制剂中剩余可溶性TFPI的半衰期(t1/2，天)。所有制剂含有0.15毫克/毫升TFPI和L-精氨酸碱或L-精氨酸HCl，用琥珀酸或10mM琥珀酸和琥珀酸钠缓冲到pH5.5。具体TFPI制剂含有：(a)20-150mM L-精氨酸HCl，10mM琥珀酸和琥珀酸钠作为缓冲剂，(b)20-150mM L-精氨酸碱，用琥珀酸滴定；(c)100-300mM L-精氨酸HCl，10mM琥珀酸和琥珀酸钠作为缓冲液；(d)100-300mM用琥珀酸滴定的L-精氨酸碱。
图11显示50℃下，作为精氨酸浓度函数，用IEX-HPLC分析的在4种制剂中剩余可溶性TFPI的半衰期(t1/2，天)。所有制剂含有0.15毫克/毫升TFPI和L-精氨酸碱，用琥珀酸或柠檬酸滴定到pH5.5。具体TFPI制剂含有：(a)20-150mM L-精氨酸碱，用柠檬酸滴定，(b)20-150mM L-精氨酸碱，用琥珀酸滴定；(c)100-300mML-精氨酸碱，用柠檬酸滴定；(d)100-300mM用琥珀酸滴定的L-精氨酸碱。
发明详述
本发明针对含有多肽作为治疗活性成分的液体药物组合物，及其制备的方法。为了本发明的目的，关于药物组合物或制剂的术语“液体”指包括术语“水相”。本文所用的术语“多肽”包括天然存在的(天然的)、合成的和重组多肽和蛋白质，及其生物活性变体，如本文中另行限定的。“治疗活性成分”指多肽特异性的掺入组合物，当药物组合物被施给个体时，对治疗、预防或诊断个体内的疾病或病况带来理想的治疗反应。
更具体的，本发明的组合物是稳定化的液体药物组合物，其治疗活性成分包括一种多肽，它通常在液体药物组合物储藏过程中显示聚集物形成。“聚集形成”指多肽分子之间的物理作用，导致形成寡聚物，它保持可溶状态，或从溶液中沉淀出来的大的可见聚集物。“储藏过程”指液体药物组合物或制剂一旦制备后，未立即施用于个体。而是在制备后以液体形式、冷冻状态或干燥形式包装，用于以后重新配制成液体形式，或适用于施给病人的其它形式。“干燥形式”指用冷冻干燥(即冻干；见例如Williams和Polli(1984)J.Parenteral Sci.Technol.38：48-59)，喷雾干燥(见Masters(1991)Spray-Drying Handbook(第5版；Longman Scientific and Technical，Essez，U.K.)，491-676页；Broadhead等(1992)Drug Devel.Ind.Pharm.18：1169-1206和Mumenthaler等(1994)Pharm.Res.11：12-20)或风干(Carpenter和Crowe(1988)Cryobiology 25：459-470；和Roser(1991)Biopharm.4：47-53)等方式进行干燥处理的液体药物组合物或制剂。液体药物组合物储藏过程中多肽形成的聚集物可以对该多肽的生物活性造成不良影响，导致该药物组合物的疗效丧失。另外，聚集形成可以导致其它问题，例如当在输液系统施用含有多肽的药物组合物时，可使管道、膜或泵堵塞。
本发明的稳定化液体药物组合物还含有其量足够减少组合物储藏过程中多肽聚集物形成的氨基酸碱。“氨基酸碱”指一种氨基酸或多种氨基酸的组合，其中任何给定的氨基酸以其游离碱形式或其盐形式存在。当使用氨基酸组合时，所有各种氨基酸可以以其游离碱形式存在，也都可以以其盐形式存在，或一部分可以以其游离碱形式存在，而另一部分可以以其盐形式存在。用于制备本发明的组合物的优选氨基酸是带有带电侧链的氨基酸，例如精氨酸、赖氨酸、天冬氨酸和谷氨酸。在本发明的药物组合物中可存在特定氨基酸的任何立体异构体(即L、D或DL异构体)或这些立体异构体的组合，只要特定的氨基酸以其游离碱形式或其盐形式存在。优选使用L-立体异构体。本发明的组合物还可以用这些优选氨基酸的类似物配制。“氨基酸类似物”指天然存在的氨基酸的衍生物，它带来在本发明的液体药物组合物储藏过程中减少聚集物形成的理想作用。合适的精氨酸类似物包括例如：氨基胍和L-精氨酸N-一乙酯。与优选氨基酸一样，氨基酸类似物以游离碱形式或其盐形式掺入组合物。
联合本文定义的氨基酸碱，本发明的稳定化液体药物组合物还含有基本不含其盐形式的酸，以其盐形式存在的酸或酸及其盐形式的混合物，来维持溶液pH。优选用氨基酸碱和基本不含其盐形式的酸联合维持pH。这种组合使溶液克分子渗透压浓度比如果用酸及其盐形式作为缓冲剂与氨基酸联合，来配制稳定化的药物组合物更低。这种组合的优点是可以在药物组合物中掺入更高浓度的氨基酸碱稳定剂，而不超过溶液的等渗性。“基本不含其盐形式的酸”指在液体药物组合物中作为缓冲剂的酸在没有任何其盐形式的条件下存在。通常用于液体药物组合物的含有酸的缓冲剂用该酸的盐或酸与其盐形式的组合制备。因此例如用酸与其抗衡离子，如钠、钾、铵、钙或镁制备缓冲液。这样琥珀酸缓冲液通常含有琥珀酸的盐，例如琥珀酸钠或琥珀酸和琥珀酸钠的混合物。虽然在本发明的稳定化的液体药物组合物中用作缓冲剂的酸可以是酸的盐形式或酸与其盐形式的混合物，优选作为缓冲剂的酸应完全是其酸形式。适合用于配制本发明的稳定化的含多肽的液体药物组合物的酸包括但不限于琥珀酸、柠檬酸、磷酸、谷氨酸、马来酸、苹果酸、乙酸、酒石酸和天冬氨酸，更优选的是琥珀酸和柠檬酸，最优选的是琥珀酸。
本发明的含多肽的液体药物组合物是“稳定化的”组合物。“稳定化的”指如本文公开的，液体组合物具有与不存在氨基酸碱和缓冲剂相混合制备的组合物相比，具有提高的储藏稳定性。在该液体制剂中观察到这种储藏稳定性增加，不论是直接以该形式储藏以备后用，还是以冷冻状态储藏，在使用前融化，还是以干燥状态制备，如冻干、风干或喷雾干燥形式，随后在使用前重建成液体形式或其它形式。优选本发明的组合物直接以液体形式储藏，来充分利用液体形式储藏稳定性提高的优点，不需重新配制就可以方便施用，如果制剂与制菌剂兼容，还能提供预填充的，即用型针筒制剂或作为多剂型制备物。
本发明的组合物涉及发现加入游离碱形式或盐形式的精氨酸、赖氨酸、天冬氨酸或谷氨酸等氨基酸，联合基本不含其盐形式的酸、盐形式的酸或酸及其盐形式的混合物，可得到含有多肽的液体药物组合物，它相对于不用这两种成分组合制备的含多肽的液体药物组合物，具有提高的储藏稳定性。组合物提高的储藏稳定性是通过氨基酸对治疗活性肽的稳定性的影响实现的，更具体是通过在液体制剂储藏过程对其中的多肽聚集过程的影响实现的。另外，如本文所定义的，在含多肽的液体制剂中掺入氨基酸碱和基本不含其盐形式的酸得到接近等渗，而不需要另外加入其它等渗剂，如氯化钠的液体药物组合物。“接近等渗”指液体组合物具有约240-360毫摩尔/千克，优选240-340毫摩尔/千克，更优选约250-330毫摩尔/千克，甚至更优选约260-320毫摩尔/千克，最优选约270-310毫摩尔/千克的克分子渗透压浓度。
掺入本发明的稳定化的液体药物组合物的氨基酸碱保护治疗活性多肽不聚集，从而提高了多肽在组合物储藏过程中的稳定性。“提高稳定性”指液体药物组合物储藏过程中多肽聚集物形成比不存在该特殊稳定剂时多肽聚集物形成少。加入氨基酸碱使得聚集物形成减少具有浓度依赖关系。即当不存在氨基酸碱时，液体制剂储藏过程中通常显示多肽聚集物形成时，氨基酸碱浓度的增加导致液体药物组合物中多肽稳定性提高。确定在液体药物组合物中加入特定氨基酸碱的量，以减少聚集物形成，从而提高多肽稳定性，并因此提高组合物的储藏稳定性，可以轻易的对任何特定感兴趣的多肽进行，而不需要用本领域技术人员已知的常规方法进行不必要的实验。
因此例如，可通过测量溶液中可溶性多肽随时间的改变轻易的确定特定氨基酸碱在液体组合物储藏过程中对多肽聚集的作用。可用适合检测感兴趣的多肽的测定法定量溶液中的可溶性多肽量。这些测定法包括例如反相(RP)-HPLC、尺寸排阻(SEC)-HPLC和紫外吸收法，如下文实施例所述。当感兴趣的多肽同时在液体制剂储藏过程中形成可溶和不可溶的聚集物时，可用RP-HPLC和SEC-HPLC的组合分辨作为可溶性聚集物存在的可溶性多肽部分，和作为非聚集物存在的生物活性分子形式的可溶性多肽部分，如下文实施例1所述。
就聚集物形成而言，在含多肽的液体药物组合物掺入有效量的氨基酸碱，以获得稳定化的药物组合物可视为导致聚集物形成随时间减少，从而更好的将溶液中的可溶性多肽维持在其非聚集的生物活性分子形式的量。因此例如，当多肽是单体蛋白，如下文实施例所述的白细胞介素-2(IL-2)或组织因子通道抑制蛋白(TFPI)时，用于制备本发明的稳定化组合物的稳定剂的有效量是导致IL-2或TFPI更多保留在其单体分子形式的量。
本发明的稳定化的含多肽的液体药物组合物储藏稳定性的提高还可以与氨基酸碱对储藏过程中治疗活性多肽内谷氨酰胺和/或天冬酰胺残基的脱氨基作用产生抑制作用有关。可随时间监测以脱氨基形式存在的多肽量轻易的确定液体组合物储藏过程中特定氨基酸碱对这些残基的脱氨基作用。测定存在于溶液相中的特定多肽的分子种类，即天然或脱氨基形式是本领域一般已知的。这些方法包括层析分离分子种类并用多肽分子量标准鉴定，如下文实施例所述的RP-HPLC。
使用用基本不含其盐形式的酸缓冲氨基酸碱的新颖组合方法，为提高本发明的稳定化含多肽的液体药物组合物中多肽的稳定性，提供了比例如用琥珀酸/琥珀酸钠缓冲系统中的氨基酸更好的优点。该新颖组合能够制备比使用酸及其盐形式的混合物缓冲系统得到的接近等渗的制剂稳定化的氨基酸浓度更高的制剂。更高浓度的稳定氨基酸能够更好的提高多肽稳定性，从而提高制剂的储藏稳定性。
例如，当用琥珀酸缓冲加在含有蛋白质白细胞介素-2(IL-2)和具有蛋白质最佳pH(pH5.8)的液体制剂中的精氨酸碱时，精氨酸浓度可以提高到230mM，而仍然保持制剂的等渗性。这导致作为蛋白质稳定性量度的50℃下IL-2的储藏期增加了一倍。虽然可用相同的精氨酸浓度和用琥珀酸/琥珀酸钠作为缓冲剂实现相似的IL-2储藏期，但是必须加入酸形式的精氨酸来实现类似的pH，得到的制剂是高渗的(见实施例1，表1)。
类似的，当用柠檬酸缓冲加入含有蛋白质组织因子通道抑制蛋白(TFPI)的液体制剂的，并仅具有适合该蛋白质的pH(pH5.5)的精氨酸残基时，精氨酸浓度可提高到300mM，而仍然维持制剂的等渗性。这导致50℃时TFPI的储藏期几乎增加了50％。虽然可用同样的精氨酸浓度和柠檬酸/柠檬酸钠作为缓冲剂实现类似的TFPI储藏期，仍然必须以其酸形式加入精氨酸实现类似的pH，而得到的制剂仍是高渗的(见实施例8，表18)。用更高浓度的氨基酸作为主要稳定剂避免了使用传统的多肽稳定剂，如牛血清白蛋白或人血清白蛋白的需要，它们较不利于作为稳定剂，因为可能会有病毒污染。
另外，液体药物组合物的等渗性是良好的，因为它导致给药后疼痛减少，并大大减少因使用高渗或低渗组合物而可能引起的溶血作用。因此，与使用其它更常规的由酸和酸的盐形式构成的缓冲系统的制剂相比，本发明的稳定化组合物不仅具有提高的储藏稳定性，还具有给药时疼痛大大减轻的优点。例如，在本发明的一个实施例中，当稳定化的液体药物组合物与注射生理盐水相比，注射后引起的类似烧灼和蜇叮感的疼痛减轻(见实施例7)。
认识到用氨基酸碱作为主要稳定剂和基本不含其盐形式的酸作为缓冲剂来制备本发明的液体药物组合物的优点，本领域技术人员能够不必进行不必要的实验就可确定上述各种成份掺入含有感兴趣的治疗活性的多肽(该多肽如本文所示显示聚集物形成)的液体药物组合物的优选浓度，来提高组合物储藏过程中多肽的稳定性。根据公开的方法，例如下文实施例1，技术人员可以评估用于本文所述的液体药物组合物的一定范围浓度的氨基酸碱和各种缓冲用酸。优选掺入组合物的氨基酸碱量在约100-400mM范围内，优选约130-375mM，更优选约150-350mM，甚至更优选约175-325mM，仍然更优选约180-300mM，甚至更优选约190-280mM，最优选约200-260mM，视存在于组合物中的蛋白质而定。鉴于本文所公开的有利理由，虽然缓冲剂可以是盐形式的酸，或酸及其盐形式的混合物，优选缓冲剂是基本不含其盐形式的酸。用作缓冲剂的酸优选以约40-250mM，约50-240mM，约60-230mM，约70-220mM，更优选约80-210mM，最优选约90-200mM的范围内加入，视用作缓冲剂的酸和用于对抗聚集物形成稳定化多肽的最佳pH而定。
在一个实施例中，氨基酸碱是浓度约230mM的精氨酸碱，而用作缓冲剂的酸是浓度约128mM的琥珀酸。这能够制备具有接近等渗的克分子渗透压浓度和约5.8pH的含多肽的液体药物组合物。在另一个实施例中，氨基酸碱是浓度约300mM的精氨酸碱，用作缓冲剂的酸是浓度约120mM的柠檬酸。这能够制备具有接近等渗的克分子渗透压浓度和约5.5pH的含多肽的液体药物组合物。在另一个实施例中，氨基酸碱是浓度约200-300mM的精氨酸碱，用作缓冲剂的酸是浓度约120-180mM的琥珀酸。这能够制备克分子渗透压浓度约256-363毫摩尔/千克和约5.5pH的含多肽的液体药物组合物。
因此在本发明的另一个实施例中，稳定化的液体药物组合物含有作为多肽的IL-2或其变体，浓度约150-350mM的精氨酸碱和浓度约80-190mM的琥珀酸。在一个优选例中，存在于IL-2液体药物组合物中的精氨酸碱浓度约230mM，琥珀酸浓度约128mM。该优选的IL-2组合物具有约5.8的pH和约250-330毫摩尔/千克的克分子渗透压浓度。这些组合物中IL-2或其变体的浓度是约0.01-2.0毫克/毫升，优选约0.02-1.0毫克/毫升，更优选约0.03-0.8毫克/毫升，最优选约0.03-0.5毫克/毫升。
在本发明的另一个实施例中，稳定化的液体药物组合物中含有作为多肽的TFPI或其变体，浓度约100-400mM的精氨酸碱，和浓度约80-190mM的琥珀酸。在一个优选例中，存在于TFPI中的精氨酸碱浓度是约200-300mM，琥珀酸浓度约120-180mM。该优选的TFPI组合物具有约5.5的pH和约240-360毫摩尔/千克的克分子渗透压浓度。这些组合物中TFPI或其变体的浓度是约0.01-5.0毫克/毫升，优选0.05-2.0毫克/毫升，更优选约0.10-1.0毫克/毫升，最优选约0.10-0.60毫克/毫升。
在本发明的另一个实施例中，稳定化的液体药物组合物含有TFPI或其变体作为多肽，浓度为约175-400mM的精氨酸碱，或浓度约40-200mM的柠檬酸。在一个优选例中，精氨酸碱以约250-350mM的浓度存在于TFPI液体药物组合物中，柠檬酸的浓度约100-150mM。该优选的TFPI组合物具有约5.0-6.5的pH和约240-360mmol/kg的克分子渗透压浓度。在另一个实施例中，精氨酸碱的浓度是约300mM，柠檬酸浓度约120mM。该TFPI组合物具有约5.5的pH和约240-360mmol/kg的克分子渗透压浓度。这些组合物中TFPI或其变体的浓度是约0.01-5.0毫克/毫升，优选约0.05-2.0毫克/毫升，更优选约0.10-1.0毫克/毫升，最优选约0.10-0.60毫克/毫升。
如下文实施例所示，含多肽的液体药物制剂主要通过它对多肽聚集物形成的作用，影响其中所含的多肽的稳定性。因此存在于本发明的药物组合物中的缓冲酸量将视感兴趣的具体多肽稳定性的最佳pH而定。可用本领域一般可得的方法确定该最佳pH，在本文的实施例中进一步说明。本发明组合物的优选pH范围是约4.0-9.0，更具体是pH5.0-6.5，视多肽性质而定。例如在一个实施例中，pH是约5.8，更特别是当多肽是IL-2或其变体。在另一个实施例中，pH是约5.5，更特别当多肽是TFPI或其变体。
稳定化的药物组合物(含有基本不含其盐形式的酸、酸的盐形式或酸及其盐形式的混合物缓冲的氨基酸碱)还可含有其它稳定剂，它进一步增强其中治疗活性多肽的稳定性。本发明特别感兴趣的稳定剂包括但不限于甲硫氨酸和EDTA，它保护多肽对抗甲硫氨酸的氧化作用；和非离子型表面活性剂，它保护多肽不由于冻融或机械剪切而产生聚集。
因此，当作为治疗剂的多肽是一种含有至少一个对这种氧化作用敏感的甲硫氨酸残基的多肽时，可加入甲硫氨酸来抑制甲硫氨酸残基氧化成甲硫氨酸亚砜。“抑制”指随时间使甲硫氨酸氧化的产物积聚尽量减少。抑制甲硫氨酸氧化导致多肽更好的保留在其原有的分子形式。可使用甲硫氨酸的任何立体异构体(L、D或DL异构体)或其组合。加入的量应当足以抑制甲硫氨酸残基的氧化过程，使甲硫氨酸亚砜量可被管理部门接受。通常这意味着组合物含有不超过约10％-30％的甲硫氨酸亚砜。通常这可以通过加入甲硫氨酸来实现，加入的甲硫氨酸与甲硫氨酸残基比例范围是约1∶1-1000∶1，最优选10∶1-100∶1。
加入甲硫氨酸的优选量可轻易的通过制备含有感兴趣的多肽和不同浓度的甲硫氨酸的组合物，并按实施例2所述用例如层析(如用RP-HPLC)分离不同分子，并用多肽分子量标准进行鉴定，测定氧化物形成对多肽的相对作用，凭经验确定要加入甲硫氨酸的优选量。可最大限度抑制甲硫氨酸残基的氧化，而对与氨基酸相关的多肽聚集作用没有不良作用的甲硫氨酸浓度，将代表要加入组合物，进一步改善多肽稳定性的甲硫氨酸的优选量。
可通过在本发明的含多肽的液体药物组合物中掺入表面活性剂，降低液气界面的表面张力，在本发明的液体组合物的加工过程中抑制由于冻融或机械剪切的作用引起的多肽降解。使用的典型表面活性剂是非离子型表面活性剂，包括聚氧乙烯山梨醇酯，如聚山梨醇酯80(Tween80)和聚山梨醇酯20(Tween20)；聚氧丙烯-聚氧乙烯酯，例如Pluronic F68；聚氧乙烯醇，如Brij 35；二甲基硅油；聚乙二醇，例如PEG-400；溶血磷酯酰胆碱；和聚氧乙烯-p-t-辛烷基苯酚，例如TritonX-100。描述了表面活性剂或乳化剂对药物的典型稳定化作用，例如在Levine等(1991)J.Parenteral Sci.Technol.45(3)：160-165，在此引入以供参考。本发明实施中使用的优选表面活性剂是聚山梨醇酯80。
除了上述公开的试剂，还可加入其它稳定剂，如白蛋白，乙二胺四乙酸(EDTA)或它的一种盐，如EDTA二钠盐，来进一步增强液体药物组合物的稳定性。可以约1.0％w/V或以下的浓度加入白蛋白。EDTA作为已知催化多种氧化反应的金属离子净化剂，从而提供了另一种稳定剂。
在本发明的一个实施例中，稳定化的液体药物组合物含有IL-2或其变体作为多肽，浓度约150-350mM的精氨酸碱，浓度约80-190mM的琥珀酸，浓度约0.5-10mM的甲硫氨酸，约0.1-5.0mM EDTA和约0.001％-0.2％的聚山梨醇酯80。在一个优选例中，精氨酸碱以约230mM的浓度存在，和琥珀酸以约128mM的浓度存在于IL-2液体药物组合物中。优选IL-2组合物具有约5.8的pH和约250-330mmol/kg的克分子渗透压浓度。这些组合物中IL-2的浓度或其变体是约0.01-2.0毫克/毫升，优选约0.02-1.0毫克/毫升，更优选约0.03-0.8毫克/毫升，最优选约0.03-0.5毫克/毫升。
当需要时，可在本发明的稳定化的含多肽的液体药物组合物中包含糖或糖醇。可使用任何糖，例如单糖、二糖或多糖，或水溶性葡聚糖，包括例如果糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖、木糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、右旋糖酐、支链淀粉、糊精、环糊精、可溶性淀粉、羟乙基淀粉和羧甲基纤维素钠。蔗糖是最优选的糖添加剂。糖醇定义成具有-OH基团的C4-C8烃类，包括例如甘露醇、山梨糖醇、肌醇、半乳糖醇、卫茅醇、木糖醇和阿拉伯糖醇，甘露醇是最优选的糖醇添加剂。上述糖或糖醇可单独或组合使用。用量无固定的限制，只要糖或糖醇可溶于液体制剂，对用本发明的方法实现的稳定化作用不产生不良影响。优选糖或糖醇浓度在约1.0-15.0w/v％之间，更优选在约2.0-10.0w/v％之间。
本发明的稳定化的含多肽的液体药物组合物可含有其它化合物，可提高或促进作为治疗活性成分的感兴趣的多肽的效果或所需品质，只要氨基酸碱实现的初始稳定作用不受不良影响。该组合物选择的给药途径必须是安全的，必须是无菌的，必须保持其所需的治疗活性。
本发明的组合物的制备优选通过预先混合稳定剂和缓冲剂以及其它赋形剂，然后掺入感兴趣的多肽。为了进一步稳定本发明的组合物可加入的任何其它赋形剂必须对初始稳定剂(即氨基酸碱)与缓冲剂(即基本不含其盐形式的酸、酸的盐形式或酸及其盐形式的混合物)结合的稳定作用没有不良影响，如用于获得本文公开的新颖组合物。加入优选量的氨基酸碱实现感兴趣的多肽聚集形成减少后，用缓冲剂调节液体组合物的pH，优选在本发明公开的范围内，更优选到感兴趣的多肽最佳的pH。虽然可在将感兴趣的多肽加到组合物中后调节pH，优选在加入该多肽前调节，因为这可以减少多肽变性的危险。然后用合适的机械装置实现组分的充分混合。
虽然本发明的特别实施例针对稳定化的组合物，它们含白细胞介素-2(IL-2)或其变体、或组织因子通道抑制蛋白(TFPI)或其变体，是特别容易通过聚集物形成降解的蛋白质的例子，本发明的实用性可普遍扩大到任何含多肽或其变体，在液体制剂储藏过程中显示聚集物形成的药物组合物。因此适合用于本发明实施的多肽包括例如：白细胞介素(如IL-2)、干扰素包括β-干扰素(IFN-β)及其突变蛋白，如IFN-βser17(如欧洲专利申请号18549B1和美国专利号4,588,585，在此引入以供参考)，组织因子通道抑制蛋白(TFPI)，人生长激素(hGH)，胰岛素和其它类似的显示在液体制剂中聚集物形成的多肽，及其任何生物活性变体。
存在于本发明的稳定化的液体药物组合物中的多肽可以是天然的或以重组技术获得的，并可以来自任何来源，包括哺乳动物来源，如小鼠、大鼠、家兔、灵长类、猪和人，条件是它们符合本文所述的标准，即它们能在液体制剂储藏过程中形成聚集物。优选这些多肽衍生自人类来源，更优选是重组的来自微生物宿主的人蛋白。
本文所用的术语“多肽”还包括作为本发明药物组合物中治疗活性成分的感兴趣的多肽的生物活性变体。这些变体应保留天然多肽的所需生物活性，即当施给病人时，含有变体多肽的药物组合物与含有天然多肽的药物组合物具有相同的疗效。即变体多肽将在药物组合物中作为治疗活性成分，其方式与天然多肽表现的情况相似。本领域已有能测定变体多肽能否维持所需的生物活性，从而在药物组合物中发挥其治疗活性成分的方法。可用专门设计的试验方法用于测量天然多肽或蛋白质活性，包括本发明所描述的试验方法以测量生物活性。另外，可对有生物活性的天然多肽所引发产生的抗体测试其与变体多肽结合的能力，其有效结合是多肽具有与天然多肽相似构型的指标。
天然或天然存在的感兴趣的多肽的合适生物活性变体可以是片段、类似物和该多肽的衍生物。“片段”指仅具有完整多肽序列或结构一部分的多肽，可以是天然多肽的C-末端缺失物或N-末端缺失物。“类似物”指天然多肽或天然多肽的片段的类似物，其中具有一个或多个氨基酸被取代、插入或缺失的天然多肽序列和结构。本文所述的“突变蛋白”和具有一个或多个类肽(肽模拟物)的肽也包括在术语“类似物”中(见国际出版号WO 91/04282)。“衍生”指感兴趣的天然多肽、天然多肽的片段或其各类似物的修饰，如糖基化，磷酸化或加入其它外源基团，只要能保留该天然多肽的所需生物活性。制备多肽片段、类似物和衍生物的方法是本领域一般可得的。
例如，可通过在编码感兴趣的天然多肽的克隆DNA序列中产生突变，来制备多肽的氨基酸序列变体。诱变和核苷酸序列改变的方法是本领域熟知的，见例如Walker和Gaastra编(1983)Techniques in Molecular Biology(MacMillianPublishing Company，New York)；Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA82：488-492；Kunkel等(1987)Methods Enzymol.154：367-382；Sambrook等(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor，NewYork)；美国专利号4,873,192；及其中的参考文献；在此引入以供参考。可在Dayhoff等(1978)于Atlas of Protein Sequence and Structure(Natl.Biomed.Res.Found.Washington，D.C.)的模型中找到不影响感兴趣的多肽的生物活性的合适氨基酸取代物的指标，在此引入以供参考。可能优选的是保守取代，例如用另一个具有相似特性的氨基酸取代另一个。保守取代的例子包括但不限于GlyAla，ValIlcLeu，ASpGlu，LysArg，AsnGln和PheTrpTyr。
在构建感兴趣的多肽的变体时，可进行修饰，使变体继续保留其所需的活性。明显任何在编码变体多肽的DNA中制造的突变体都必须不可使其序列超出阅读框外，优选不产生可形成二级mRNA结构的互补区域。见欧洲专利申请公开号75,444。
感兴趣的多肽的生物活性变体将与作为比较基础的参比多肽分子的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％-95％或更多，和最优选约98％或以上的氨基酸序列相同性。任何感兴趣的天然多肽的生物活性变体可以和天然多肽有至少1-15个氨基酸，至少1-10，例如6-10，至少5，至少4、3、2甚至1个氨基酸残基的差异。“序列相同性”指当将变体的氨基酸的特定连续区段并与参比分子的氨基酸序列排列比较时，在变体多肽和作为参比的多肽分子中发现相同的氨基酸残基。通过确定存在于两条序列中的相同氨基酸残基的位置数得到匹配位置数，将匹配位置数除以与参比分子比较的区段位置总数，并乘以100，得到序列相同性百分数。
为了两条序列的最佳排列，变体氨基酸序列的连续区段相对于参比分子的氨基酸序列可以附加一些氨基酸残基或缺失一些氨基酸残基。用于与参比氨基酸序列比较的连续区段将含有至少20个连续氨基酸残基，可能有30、40、50、100或更多残基。可通过确定缺口数来增加与变体的氨基酸序列中的缺口相同的序列进行校正。对于氨基酸序列和编码氨基酸序列的核苷酸序列的序列排列方法是本领域熟知的。
因此，可以用数学算法确定任何两条序列之间的相同性百分数。一个可用于序列比较的数学算法的优选的非限制性例子是Myers和Miller(1988)CABIOS4：11-17的算法。这种算法用于ALIGN程序(2.0版)，它是GCG序列排列软件包的一部分。当比较氨基酸序列时，可与ALGN程序一起使用缺口长度损失为12和缺口损失为4的PAM120重量剩余表。用于比较两条序列的另一个数学算法的优选非限制性例子是Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264的算法，在Karlin和Altsuchul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5877中作了改良。这种算法包括在Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403的NBLAST和XBLAST程序中。BLAST核苷酸检索可用NBLAST程序进行，评分＝100，词长＝12，获得与编码感兴趣的多肽的核苷酸序列类似的核苷酸序列。BLAST蛋白质检索可用XBLAST程序进行，评分＝50，词长＝3，以获得与感兴趣的多肽同类的氨基酸序列。为了获得可供比较的带缺口的排列，可如Altschul等(1997)Nucleic Acids Res25：3389所述利用检索缺口BLAST。另外，可用PSI-Blast进行重复检索，检测分子之间的遥远关系。见Altschul等(1997)，见上。当利用BLAST、检索缺口的BLAST和PSI-BLAST程序时，可用各程序的缺省参数(如XBLAST和NBLAST)。见http://www.ncbi.blm.nib.gov。另见ALIGN程序(Dayhoff(1978)于Atlas ofProtein Sequence and Structure5：Suppl.3)(National Biomedical ResearchFoundation，Washington，D.C.)和Wisconsin序列分析包，8版(从GeneticsComputer Group，Madison，Wisconsin)中的程序，例如GAP程序，其中利用程序的缺省参数。
当考虑氨基酸序列相同性百分数时，一些氨基酸残基位置由于保守氨基酸取代可以不同，不影响蛋白质功能的特性。在这些例子中，可上调序列相同性百分数，至与保守取代的氨基酸相同的程度。这样的调节是本领域熟知的。见例如Myers和Miller(1988)Computer Applic.Biol.Sci.4：11-17。
多肽的精确化学结构依赖于许多因素。由于可离子化的氨基和羧基存在于分子中，可获得作为酸性或碱性盐式，或中性的多肽。所有这些制备物在合适的环境条件下时，就可保持其生物活性。这些特性都包含在本文所引用的多肽类定义中。另外，多肽的初级氨基酸序列可用糖基团(糖基化)或其它补充分子，如脂类、磷酸、乙酰基等诱导而扩大，还可以与糖类结合而扩大。这些扩大作用的一些方面是通过产生这类作用的宿主的翻译后加工系统来完成的；其它修饰可体外引入。无论如何，这些修饰都包含在本文所引用的多肽定义中，只要多肽的活性未曾破坏。预期这种修饰可以通过在各种试验中增强或减少多肽的活性而定量或定性的影响其活性。另外，链上的各氨基酸残基可以通过氧化、还原或其它衍生修饰，可切割多肽获得保持其活性的片段。这种不破坏活性的改变不会将多肽序列排除在本文所用的感兴趣的多肽的定义之外。
本领域提供了关于制备和使用多肽变体的基本方针。在制备多肽变体中，本领域技术人员可轻易的确定对天然蛋白质核苷酸或氨基酸序列的哪种修饰将得到适合用于本发明药物组合物的治疗活性组分的变体，而且如本文所述，其聚集物形成可在氨基酸碱、基本不含其盐形式的酸、酸的盐形式、酸与其盐形式的混合物存在下减少。
在本发明的一个实施例中，在本发明的液体药物组合物中作为治疗活性组分存在的多肽是白细胞介素-2(IL-2)或其变体，优选重组IL-2。白细胞介素-2是一种正常外周血淋巴细胞产生的淋巴因子，以低浓度存在于身体内。它诱导抗原或促分裂素刺激的T-细胞在接触植物凝血素、抗原或其它刺激后增殖。Morgan等(1976)Science 193：1007-1008首先描述了IL-2，最初被称为T-细胞生长因子，因为它能诱导受刺激的T淋巴细胞增殖。它是一种据报道分子量在13,000-17,000范围内的蛋白质(Gillis和Watson(1980)J.Exp.Med.159：1709)，具有范围在6-8.5的等电点。现在认识到除了它的生长因子特性，它调节免疫系统的各种体外和体内功能。IL-2是几种淋巴细胞产生的介导细胞相互作用和功能的信使-调节分子之一。已显示这种天然存在的淋巴因子单独或与淋巴因子激活的杀伤(LAK)细胞或肿瘤浸润淋巴细胞组合，具有对抗许多恶性肿瘤的抗肿瘤活性(见例如，Rosenberg等(1987)N.Engl.J.Med.316：889-897；Rosenberg(1988)Ann.Surg.208：121-135；Topalian等，(1988)J.Clin.Oncol.6：839-853；Rosenberg等(1988)N.Engl.J.Med.319：1676-1680；和Weber等(1992)J.Clin.Oncol.10：33-40)。虽然在专利中已经描述了IL-2对转移性黑素瘤和肾细胞癌的抗肿瘤活性，但是其它疾病，特别是淋巴瘤看来也对IL-2治疗有反应。
“重组IL-2”指与天然序列的IL-2具有相当的生物活性的白细胞介素-2，是通过如Taniguchi等(1983)Nature 302：305-310和Devos(1983)Nucleic AcidsResearch 11：4307-4323所述的重组DNA技术来制备的或如Wang等(1984)Science224：1431-1433所述的经突变而改变的IL-2。通常，克隆编码IL-2的基因，然后在转化的生物，优选微生物，最优选大肠杆菌中如本文所述表达。宿主生物在表达条件下表达外源基因来产生IL-2。合成的重组IL-2还可以在真核细胞中制备，如酵母或人细胞。从细胞生长、收集、破碎或抽提IL-2的方法基本在例如美国专利号4,604,377；4,738,927；4,656,132；4,569,790；4,748,234；4,530,787；4,572,298和4,931,543中所述，在此引入以供参考。
对于变体IL-2蛋白的例子，见欧洲专利申请号136,489；1983年2月3日提交的欧洲专利申请号83101035.0(1983年10月19日以出版号91539出版)；1982年12月22日提交的欧洲专利申请号82307036.2(1983年9月14日以88195出版)；1983年10月13日提交的欧洲专利申请号83306221.9(1984年5月30日以109748出版)所述的重组IL-2突变蛋白，它相当于比利时专利号893,016，具有美国专利号4,518,584；美国专利号4,752,585和WO99/60128所述的突变蛋白；和用于本文例子和美国专利号4,931,543的IL-2突变蛋白质；所有这些都在此引入以供参考。另外，可用聚乙二醇修饰IL-2，提供增强的可溶性和改变的药物动力学性质(见美国专利号4,766,106，全部在此引入以供参考)。
在本发明的另一个实施例中，在本发明的液体药物组合物中作为治疗活性成分存在的多肽是一种干扰素，更具体是纤维上皮β-干扰素(IFN-β)或其变体，优选用本领域描述的重组DNA技术制备的重组IFN-β。干扰素是哺乳动物细胞响应接触各种诱导物，例如分裂素、多肽、病毒等产生的。这些相对较小，物种特异性的单链多肽显示免疫调节、抗病毒和抗增殖性质。干扰索作为治疗抗病毒疾病和癌症防治的治疗剂受到关注。
编码人IFN-β基因的DNA序列是本领域可得的(见Goedel等(1980)NucleicAcids Res.8：4057和Tanguchi等(1979)Proc.Japan.Acad.Sci.855：464)，基因在大肠杆菌(Tanguchi等(1980)Gene 10：11-15)和中国仓鼠卵巢细胞(见例如美国专利号4,966,843和5,376,567)中表达。IFN-β的变体在欧洲专利申请号18549B1中所述，美国专利号4,518,584、4,588,585和4,737,462描述了变体蛋白，例如大肠杆菌中表达的IFN-βser17，所有在此引入以供参考。
在另一个实施例中，在本发明的液体药物组合物中作为治疗活性成分存在的多肽是组织因子通道抑制蛋白(TFPI)或其变体，优选重组TFPI。该多肽是凝血级联的抑制蛋白，还称为脂蛋白关联的凝血抑制蛋白(LACI)、组织因子抑制蛋白(TFI)和外源性途径抑制蛋白(EPI)。TFPI首次从人肝细胞瘤细胞HepG2中(Broze和Miletich(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：1886-1890)，随后从人血浆(Novotny等(1989)J.Biol.Chem.264：18832-18837)；和Chang肝和SK肝细胞瘤细胞(Wun等，(1990)J.Biol.Chem.265：16096-16101)中纯化出来的。已从胎盘和内皮cDNA文库中分离了TFPI cDNA(Wun等(1988)J.Biol.Chem.263：6001-6004；Girard等(1989)Thromb.Res.55：37-50)。对于综述，见Rapaport(1989)Blood 73：359-365(1989)；Broze等(1990)Biochemistry29：7539-7546。美国专利号4,966,852中进一步描述了编码TFPI的276个氨基酸残基蛋白的TFPI cDNA的克隆方法；另见美国专利号5,773,251和5,849,875；在此引入以供参考。
TFPI的变体是本领域已知的，见例如美国专利号5,212,091，其中已从大肠杆菌产生并分离了一种非糖基化的重组TFPI形式；美国专利号5,106,833，其中公开了同类物和片段；和美国专利号5,378,614，其中描述了在酵母中产生TFPI同类物；所有在此引入以供参考。
将药物学有效量的本发明的稳定化、含多肽的液体药物组合物施给个体。“药物学有效量”指可有效治疗，预防或诊断疾病或病况的量。典型的给药途径包括但不限于口腔给药和胃肠外给药，包括静脉内、肌肉内、皮下、动脉内和腹膜内注射或输液。在一个这样的实施例中，给药通过注射，优选皮下注射。本发明组合物的可注射形式包括但不限于溶液、悬液和乳液。
含有感兴趣的多肽的稳定化液体药物组合物可配制成单剂，还可配制成可注射或可输液形式，例如溶液、悬液或乳液。另外，它可冷冻储藏或制备成干燥形式，例如冻干粉末，它可再重新配制成液体溶液、悬液或乳液，用各种方法任一，包括口腔或胃肠外途径给药。优选采用液体制剂储藏，利用下文描述的本发明的各种方法以提高其储藏稳定性。优选用膜渗滤灭菌稳定化的药物组合物，以单剂或多剂容器，例如密封指管或安瓿储藏。可用其它配制本领域已知的药物组合物的方法进一步提高本文公开的液体药物组合物的储藏稳定性，只要它们对本发明的方法公开的优选稳定剂和缓冲剂的益处没有不良影响。可在Remington’sPharmaceutical Sciences(1990)(第18版，Mack Pub.Co.，Eaton，Pennsylvania)找到有关药物学上可接受的载体的配制和选择的全面讨论，在此引入以供参考。
“个体”指任何动物。优选个体是哺乳动物，最优选个体是人类。除了人以外特别重要的哺乳动物包括但不限于犬、猫、牛、马、羊和猪。
当为了治疗给药时，给药可以是为了预防或治疗目的。当预防性给药时，药物应在任何症状出现之前提供。预防性给药可防止或减轻任何随后的症状。当为了治疗给药时，药物应在出现症状时或其后立即提供。治疗给药可减轻任何急性症状。
因此例如，为了治疗、预防和诊断许多对该多肽的治疗有反应的临床适应征，可用含有有效量的天然序列IL-2或其变体的本发明药物组合物的制剂。可以天然序列的IL-2的相同方式配制和使用天然序列的IL-2的生物活性变体，例如保持IL-2活性的IL-2突变蛋白，特别是突变蛋白IL-2.sub.ser125和其它位置125的半胱氨酸被另一种氨基酸取代的其它突变蛋白。因此，本发明含有天然序列的IL-2或其变体的制剂可用于诊断、预防和治疗(局部或全身)细菌、病毒、寄生虫、原生动物和真菌感染；增强细胞介导的细胞毒性；刺激淋巴因子激活的杀伤(LAK)细胞活性；介导淋巴细胞免疫功能的恢复；增强同种抗原的应答性；有利于在获得性免疫缺陷状态下的免疫功能恢复；在老龄人类和动物中重建正常的免疫功能；开发各种诊断试验，例如酶扩增法、放射性标记法、放射性显影法和其它本领域已知的监测疾病状态下IL-2水平的方法；促进在体外用于治疗和诊断目的的T-细胞生长；封闭淋巴因子的受体位点；以及各种其它治疗、诊断和研究用途。已调查研究了人IL-2或其变体，例如IL-2的突变蛋白的各种治疗和诊断应用，并在Rosenberg等(1987)N.Engl.J.Med.316：889-897；Rosenberg等(1988)Ann.Surg.208：121-135；Topalian等(1988)J.Clin.Oncol.6：839-853；Rosenberg等(1988)N.Engl.J.Med.319：1676-1680；Weber等(1992)J.Clin.Oncol.10：33-40；Grimm等(1982)Cell Immunol.70(2)：248-259；Mazumder(1997)Cancer J.Sci.Am.3(Suppl.1)：S37-42；Mazumder和Rosenberg(1984)J.Exp.Med.159(2)：495-507；和Mazumder等(1983)Cancer Immunol.Immunother15(1)：1-10中报道。本发明含有IL-2或其变体的制剂可用作唯一的治疗活性剂，或与其它免疫相关B或T细胞或其它治疗剂联用。相关细胞的例子是B或T细胞、天然杀伤细胞、LAK细胞等，可用于联合IL-2或其变体的示范性的治疗剂是各种干扰素，尤其是γ干扰素、B-细胞生长因子、IL-1和抗体，例如抗-HER2或抗-CD20抗体。本发明含IL-2或其变体的制剂可由医师认可，通过口腔、腹膜内、肌肉内、皮下、静脉内、鼻内、或肺部等途径施给人或动物。施用的IL-2(天然序列或其保持IL-2生物活性的变体，例如本文公开的突变蛋白)量范围可以在约0.1-15mlU/m2之间。对于肾细胞癌和转移性黑素瘤这样的适应征，IL-2或其生物活性变体可以高剂量的静脉内浓缩药用剂以300,000-800,000IU/kg/8小时施用。
本发明含有有效量的含有天然序列组织因子通道抑制蛋白(TFPI)或其变体的药物组合物制剂可用于诊断、预防和治疗(局部和全身)对该多肽起反应的临床适应征。这些临床适应征包括例如：与嗜中性粒细胞弹性蛋白酶的合成增加和释放有关的适应征，例如炎症，包括严重急性胰腺炎、肺气肿、类风湿性关节炎、多器官功能衰竭、囊性纤维变性、成人呼吸窘迫综合征(ARDS)和脓毒症；以及诊断和治疗与IL-8的合成提高和释放有关的疾病，例如炎症疾病如ARDS、回灌注损伤(包括肺回灌性损伤)、脓毒症和关节炎。见WO 96/40224，在此引入以供参考。对人或动物施用IFN-β或其突变蛋白可通过口腔、腹膜内、肌肉内、皮下、静脉内、鼻内，或任何医师认为合适的肺部输送。
本发明含有有效量的含有β-干扰素(IFN-β)或其变体，例如IFN-βser17的药物组合物制剂用于诊断、预防和治疗(局部和全身)对该多肽起反应的临床适应征。这些临床适应征包括例如：中枢神经系统(CNS)、大脑和/或脊髓有关的异常和疾病，包括阿尔茨海默病、帕金森症、Lewy体痴呆、多发性硬化、癫痫、小脑性共济失调、进行性核上性麻痹、肌萎缩性脊髓侧索硬化、情感性精神病，焦虑性精神障碍、强迫观念行为障碍、人格障碍、注意力缺陷性障碍、注意力不缺陷性亢奋、图雷特综合征、泰-萨二氏病、尼曼-匹克病和精神分裂症；脑血管疾病(如脑和脊髓中风)，总数神经系统感染(包括脑膜炎和HIV)，脑和脊髓肿瘤或朊病毒疾病的神经损伤；自身免疫疾病，包括获得性免疫缺陷、类风湿性关节炎、牛皮癣、克罗恩氏病、斯耶格仑综合征、肌萎缩性侧索硬化、和狼疮；和癌症，包括乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、肾癌和结肠癌。对人或动物施用IFN-β或其突变蛋白可通过口腔、腹膜内、肌肉内、皮下、静脉内、鼻内、或任何医师认为合适的肺部传递。
本发明还提供了提高液体药物组合物中多肽的稳定性的方法，其中多肽作为治疗活性成分，在液体制剂中储藏过程中显示聚集物形成。方法包括在液体药物组合物中掺入其量足够减少多肽在液体组合物储藏过程中聚集物形成的氨基酸碱和基本不含其盐形式的酸、盐形式的酸或酸及其盐形式的混合物，其中酸作为将液体组合物的pH维持在可接受的范围内的缓冲剂，如本文之前所述。
掺入一种氨基酸碱，或一种氨基酸碱加上一种或多种本文所述的其它稳定剂，联合本文公开的缓冲剂，即基本不含其盐形式的酸、酸的盐形式、或酸及其盐形式的混合物，就可提高含多肽的液体药物组合物在储藏中的稳定性。因此，本发明还提供了一种当组合物含有在液体制剂储藏中形成聚集物的多肽时，提高液体药物组合物储藏稳定性的方法。“提高储藏稳定性”指药物组合物在储藏过程中显示将多肽或其变体更好的保持在准确、非聚集的生物活性构型，因此在没有氨基酸碱或氨基酸碱加一种或多种其它本文所述的附加稳定剂，联合本文公开的稳定剂存在下制备的液体药物组合物相比，其疗效很少下降。
根据本发明的方法产生的含多肽的药物组合物的稳定性，可以用本领域已知的标准方法评估。通常用稳定性分布图评估这些组合物的储藏稳定性。这类分布图可通过监测以非聚集的生物活性分子形式存在的多肽量的变化，及其随时间对感兴趣的变量，如pH浓度、稳定剂、稳定剂浓度等反应的能力而获得，如下文实施例中所述。可在几个代表可能储藏条件的温度，如冷冻温度、冷藏温度、室温或升高温度，例如40-50℃下产生这些稳定性分布图。然后通过测定例如感兴趣的多肽的非聚集的生物学活性形式的半衰期比较其分布情况之间的储藏稳定性。“半衰期”指感兴趣的多肽非聚集的生物活性分子形式减少50％所需的时间。根据本发明的方法制备的含有精氨酸碱和基本不含其盐形式的酸的组合物，与在无氨基酸碱，或氨基酸碱加上一种或多种本文所述的其它稳定剂，联合基本不含其盐形式的酸，酸的盐形式或酸及其盐形式的混合物的情况下制备的液体组合物相比较，其半衰期高至少约2-10倍，优选至少约3-10倍，更优选至少4-10倍，最优选至少约5-10倍。为了本发明，根据本发明制备得到的具有提高的储藏稳定性的药物组合物被视为“稳定化”的药物组合物。这些稳定化的组合物当储藏在2-8℃时，优选具有至少约18个月，更优选至少约20个月，更优选至少约22个月，最优选至少约24个月的储藏寿命。
提供下列实施例是为了说明而不是为了限制。
实验
IL-2是一种刺激T细胞增殖的强有丝分裂原。它作为癌症转移的治疗方法，作为癌症治疗的佐剂，作为感染性疾病的联合药物，有着广泛的治疗用途。
随着使用IL-2治疗的各种临床试验的进展，已认识到该蛋白质的稳定液态制剂的开发是非常需要的。这种制剂比传统的冻干制剂用途更多，因为它可以根据各种给药方案提供不同强度的剂型。液体制剂对于给药者更便利，因为不需要重建。如果能实现与抑菌剂相容，可以提供预填充的现成针筒，或作为多剂量制剂提供。
已报道IL-2在液体制剂中的储藏过程中至少通过三种途径降解：聚集、甲硫氨酸氧化和脱氨基作用(Kunitani等(1986)J.Chromatography 359：391-401；Kenney等(1986)Lymphokine Res.5：523-527)。另外，IL-2容易受到冷冻和机械剪切力作用而急剧破坏。因此，IL-2制剂的开发需要同时克服急剧破坏和慢性降解。
因此，已开发了一种新的稳定的单体rhIL-2制剂。在该制剂中，蛋白质分子以其单体形式而不是聚集形式存在于溶液中。因此，不存在rhIL-2的共价或疏水的寡聚物或聚集物。该制剂含有几种稳定剂，最重要的是精氨酸和甲硫氨酸，来稳定蛋白质抵抗长期储藏过程中的物理和化学性破坏作用，例如聚集、甲硫氨酸氧化和脱氨基。另外，在制剂中包含了一种非离子型表面活性剂聚山梨醇酯80，来防止蛋白质受到冻融或机械剪切力导致的急剧破坏。如下面的各实施例所示，在rhIL-2制剂中加入本发明的稳定剂可提高其储藏稳定性。
这些实施例中使用的IL-2分子是重组人IL-2突变蛋白aldesleukin，其半胱氨酸125被丝氨酸取代(去-丙氨酰基-1，丝氨酸-125人白细胞介素-2)。如美国专利号4,931,543所述，它在大肠杆菌中表达，随后通过渗滤和阳离子交换层析纯化。用于开发使用的纯化部分是约3毫克/毫升IL-2，以10mM pH6的柠檬酸钠，200-250mM NaCl(CM组合缓冲液)或在含有10mM pH6的琥珀酸钠和150mM L-精氨酸的缓冲液配制。
组织因子通道抑制蛋白(TFPI)是另一种显示在液体药物制剂的储藏过程中通过聚集而降解的蛋白质(Chen等(1999)J.Pharm.Sci.88：881-888)。下文实施例8针对液体制剂，它显示用游离碱形式的酸减少聚集物形成和用基本不含其盐形式的酸提供的缓冲系统的效力。
用下列方法在实施例中证明具体的稳定剂对IL-2或TFPI降解过程的作用，从而证明在液体制剂的储藏过程中对该蛋白的稳定性。
紫外吸光测定
用Hewlett Packard Diode Array分光光度计(8452型)测量了蛋白质溶液的紫外吸光度。用合适的制剂缓冲液作为该仪器的空白对照。用1.0厘米光通路长度的石英比色杯记录280纳米处的吸光度。用0.70(毫克/毫升)-1cm-1消光系数将吸光度数据转化成毫克/毫升的IL-2浓度。
RP-HPLC(反相高效液相层析)
在装有717自动取样机的Waters 626 LC系统(Water Corporation，Milford，Maine)上用Vydac 214BTP54C4柱和Vydac 214GCC54预柱(Seperation Group，Hesparia，California)进行RP-HPLC操作。各层析柱先用流动相A(10％乙腈，0.1％TFA)预先平衡。然后加入20微克IL-2样品，通过以1.0ml/min的流速在50分钟内加入0-100％的流动相B(100％乙腈，0.1％TFA)洗脱蛋白质。在约32分钟时洗脱出主要的可溶性IL-2组分，用Waters486检测仪在UV214纳米检测。在Perkins-Elmer Turbochrom系统(PE Nelson，Cupertino，Califpornia)上进行数据采集和加工。
该RP-HPLC法检测了作为峰B的主要单体IL-2，作为峰A的甲硫氨酸氧化物(大部分是氧化的Met104)，作为峰B’的脱酰胺组分(可能是Asn88)和其它在这些峰前后洗脱出的未知组分。
SEC-HPLC(尺寸排阻高效液相层析)
在TOSOHAAS G2000Wxl柱和TSK SWxl保护(guard)柱(TOSOHAAS，Montgomeryville，Pennsylvania)上进行尺寸排阻HPLC。以1.0ml/min的流速提供了含有10mM pH7的磷酸钠和200mM硫酸铵的单一流动相。在约14分钟时洗脱出单体IL-2，用Waters 486检测仪在214纳米处检测。在Perkin-Elmer Turbochrom系统上进行数据采集和加工。
用特别为监测IL-2开发的天然SEC-HPLC方法，rhIL-2主要作为单一物质(单体形式相似)洗脱出来，由于加入聚集物分离剂，如SDS、脲和DTT，不影响该组分的洗脱。
IEX-HPLC(离子交换高效液相层析)
在Pharmacia Mono-S HR 5/5玻璃柱上用Waters 626 LC系统和717加热器/冷却机自动采样器进行离子交换(IEX)-HPLC，如Chen等(1999)J.Pharm.Sci.88：881-888所述。用80％流动相A(70∶30v/v，20mM pH5.4的乙酸钠∶乙腈)和20％流动相B(70∶30v/v，20mM乙酸钠和1M pH5.4氯化铵∶乙腈)平衡柱。注入后，在21分钟内以0.7ml/min的流速将流动相B提高到85％，洗脱重组人(rh)TFPI。在约16.5分钟时作为单峰洗脱rhTFPI，并用Waters 486型吸光度检测仪在280纳米处通过紫外吸光度检测。在Perkin-Elmer Turbochrom系统上进行数据采集和加工。通过整合峰面积并和已知浓度样品产生的标准曲线比较，估计蛋白质浓度。
SDS-PAGE
根据Laemmli方案进行SDS-PAGE。将约5微克IL-2加到预制的18％NorvexTris-甘氨酸凝胶的各泳道中，在100伏特进行电泳。用考马斯蓝染料对蛋白质条带进行染色，通过装有Imagequan T系统的Molecular Dynamics密度计(MolecularDynamics，Sunnyvale，California)分析。
IL-2生物活性的HT-2细胞增殖和MTT染色
通过使用HT-2细胞增殖和MTT染色(Gillis等(1978)J.Immunology120：2027-2032；Watson(1979)J.Exp.Med.150(6)：1510)的体外生物试验测定IL-2的效力。简单说，将依赖IL-2生长的1×104小鼠HT-2细胞加到含有标准、对照或样品的组织培养板的孔中。37℃培育22-26小时后，在孔中加入MTT染料，继续37℃培养3-4小时。然后加入20％SDS脱色，在室温下过夜。在570纳米段读取各孔的吸光度，并根据WHO的国际标准换算成IL-2的生物活性。
pH和克分子渗透压浓度测量
用Orion的pH计(611型，Orion Research Incorporated Laboratory ProductsGroup，Boston，Massachusetts)测量各种制剂溶液的pH。用厂商建议的双缓冲液标定法，用pH4的标准(Fisher Scientific，目录号SB101-500)和pH7的标准(Fisher Scientific，目录号SB107-500)标定pH计。
用Wescor的蒸汽压渗透压计(5500型，Wescor Inc.，Logan，Utah)测量这些制剂的溶液克分子渗透压浓度。用厂商提供的两种标准：290mmol/kg的标准(Wescor，记录器号OA-010)和1,000mmol/kg的标准(Wescor，记录器号OA-029)标定渗透压计。
用这些方法定量各种稳定剂对rhIL-2通过蛋白质聚集、甲硫氨酸氧化和脱氨基的降解。
实施例1：各种增溶剂对rhIL-2的蛋白质聚集和储藏稳定性的影响
蛋白质聚集是rhIL-2在弱酸性到碱性pH条件范围内的液体介质中主要的降解途径。当在升温条件下储藏时，这些pH条件下配制的溶液中的rhIL-2迅速发生蛋白质聚集，产生可见的沉淀。滤过0.2微米滤膜除去沉淀的蛋白质。可用许多分析试验，如RP-HPLC、SEC-HPLC和紫外吸光度定量溶液中剩余的可溶性蛋白质。聚集还导致生物活性下降，可通过本文所述的体外生物试验测定。
用本文所述的分析程序，通过监测可溶性rhIL-2以在升温条件下培养时间的函数发生的数量变化，跟踪rhIL-2在几种条件下的储藏稳定性。
1.A.糖和氨基酸的作用
检测了山梨糖醇、蔗糖和甘露醇在含有0.2毫克/毫升rhIL-2、10mM pH6的琥珀酸钠和270mM这些糖之一的制剂中，糖对rhIL-2储藏稳定性的作用。将稳定性样品中剩余的可溶性rhIL-2的量，如图1所示对培养时间作图。彼此叠加的蔗糖和甘露醇曲线表明，它们对IL-2储藏稳定性的作用是相似的。山梨糖醇曲线比其它两种糖稍高，提示山梨糖醇比另两种糖具有稍高的稳定作用。
图2显示了氨基酸对储藏稳定性的作用。各制剂含有0.1毫克/毫升的IL-2，10mM pH6的琥珀酸钠和150mM的9种所选的氨基酸之一。如图2所示，稳定性级别是Arg＞Asp＞Lys＞Met＞Asn＞Leu＝Ser＝Pro＝Gly。
在进一步的研究中肯定了山梨糖醇和精氨酸的稳定性作用，显示rhIL-2的储藏稳定性以浓度依赖性方式而受到影响。rhIL-2储藏稳定性随着山梨糖醇浓度从50mM增加到150mM，最终增加到270mM而逐步增强的(图3)。类似的，rhIL-2储藏稳定性随着制剂中的精氨酸浓度增加而提高(图4)。
1.B.制剂pH的作用
检测了在含有NaCl、山梨糖醇和精氨酸的制剂中rhIL-2的pH储藏稳定性情况。图5显示在50℃下剩余的可溶性IL-2的半衰期对pH的曲线图。半衰期(t1/2)在本文中定义为在稳定性样品中的可溶性蛋白质50％减少所需的时间。半衰期越长表明储藏稳定性越好。
如图5所示，防治稳定性rhIL-2发生蛋白质聚集的最佳pH，由溶液中存在的稳定剂决定。在pH4的条件下，rhIL-2在NaCl中可达到最大的储藏稳定性，其中rhIL-2在50℃具有约23天的半衰期。在山梨糖醇制剂中的rhIL-2显示随pH下降而稳定性增加，最大稳定性出现在pH5，50℃时的半衰期是约26天。用精氨酸作为稳定剂时，在pH约6.0的制剂中可获得最大稳定性(即最长半衰期)，其中蛋白质在50℃的半衰期是约32天。这些结果提示相对于山梨糖醇或NaCl精氨酸是一种优选的稳定剂，因为蛋白质的稳定性的最佳pH在生理学上更可接受的pH水平。
1.C.缓冲系统的作用
在制剂中为提供准确的pH并维持一定量的缓冲能力，使用10mM的缓冲系统是十分常用的。例如，用10mM琥珀酸及其盐形式，例如琥珀酸钠的混合物，可使制剂维持pH5.8。如果选择了这样的缓冲系统，可用150mM精氨酸HCl(但不用150mM精氨酸碱)作为制剂中的主要稳定剂，因为150mM精氨酸碱可抑制10mM缓冲液将pH调低到5.8。
然而精氨酸HCl可比精氨酸碱达到更高的克分子渗透压浓度。因此，含有150mM精氨酸HCl和10mM琥珀酸和琥珀酸钠缓冲液的调节到pH5.8的制剂已经接近等渗，具有约253mmol/kg的克分子渗透压浓度和50℃时约8天的半衰期(表1)。但是制剂中更高浓度的精氨酸也是理想的，因为储藏稳定性随着该稳定剂的增加而增加。当精氨酸的浓度通过加入精氨酸HCl增加到230mM，用10mM琥珀酸和琥珀酸钠缓冲液将pH调节到5.8时，50℃时的半衰期加倍(约17天)，但溶液是高渗的，具有约372mmol/kg的克分子渗透压浓度。
当用琥珀酸作为缓冲系统，将溶液pH调至5.8，而精氨酸作为精氨酸碱存在时，精氨酸碱浓度增加到230mM，同样可使50℃的半衰期加倍，即增加到约16天。然而，该储藏稳定性的增加是要同时保持溶液接近等渗而实现的，制剂具有约271mmol/kg的克分子渗透压浓度(见表1)。以这种方式，可在制剂中使用230mM精氨酸碱，增加rhIL-2的储藏稳定性，而不超过制剂的等渗点。
表1：rhIL-2制剂的溶液克分子渗透压浓度和储藏稳定性。储藏稳定性表示成50℃储藏后用RP-HPLC测定的剩余可溶性rhIL-2的半衰期(t1/2)。精氨酸HCl制剂含有0.5毫克/毫升rhIL-2，1mM EDTA和150mM或230mM L-精氨酸HCl和10mM的琥珀酸和琥珀酸钠调节到pH5.8。精氨酸碱制剂含有0.5毫克/毫升rhIL-2、1mMEDTA和150mM或230mM L-精氨酸碱和用81mM或128mM琥珀酸将pH调节到5.8。
制剂 克分子渗透压浓度 50℃的t1/2
(都含有1mMEDTA，pH5.8) (mol/kg) (天)
150mM ArgHCl，10mM琥珀酸钠/琥珀酸 253 8.0
150mM ArgBase，81mM琥珀酸 192 9.9
230mM ArgHCl，10mM琥珀酸钠/琥珀酸 372 16.9
230mM ArgBase，128mM琥珀酸 271 16.0
用其它缓冲系统检测了这两种pH调节法(表2)。当在制剂中使用150mM精氨酸HCl，并用10mM酸及其钠盐将pH调至5.8时，所有的制剂在等渗以下，约290mmol/kg。rhIL-2在这些制剂中50℃时的半衰期范围是约15-20天。当在制剂中使用230mM精氨酸碱，并用基本不含其盐形式的酸作为缓冲系统将pH调至5.8时，用柠檬酸或琥珀酸调节pH的制剂仍显示低渗，虽然其它制剂或稍高于等渗，例如用磷酸时；或高渗，例如用谷氨酸或乙酸时。然而，所有的制剂的在50℃时的半衰期延长到30天以上。因此，使用基本无盐形式的柠檬酸或琥珀酸作为缓冲系统时，用精氨酸碱可将精氨酸浓度提高到230mM，导致rhIL-2的储藏稳定性增加。
表2：rhIL-2制剂的溶液等渗性和储藏稳定性。储藏稳定性表示成50℃储藏后用RP-HPLC测定的剩余可溶性rhIL-2的半衰期(t1/2)。所有制剂含有0.2毫克/毫升rhIL-2，5mM甲硫氨酸、1mMEDTA二钠盐、0.1％聚山梨醇酯80和150mM L-精氨酸HCl，用10mM酸及其钠盐调节pH至5.8；或230mM L-精氨酸碱并用基本不含其盐形式的酸滴定调节到pH5.8。
制剂 克分子渗透压浓度(毫摩尔/千克) t1/2(天)
150mM ArgHCl，10mM柠檬酸钠/柠檬酸 248 20.5
230mM ArgBase，86mM柠檬酸 228 36.1
150mM ArgHCl，10mM琥珀酸钠/琥珀酸 257 19.1
230mM ArgBase，128mM琥珀酸 285 29.2
150mM ArgHCl，10mM磷酸钠/磷酸 260 15.6
230mM ArgBase，193mM磷酸 329 29.9
150mM ArgHCl，10mM谷氨酸钠/谷氨酸 264 14.6
230mM ArgBase，225mM谷氨酸 407 47.5
150mM ArgHCl，10mM乙酸钠/乙酸 259 20.8
230mM ArgBase，250mM乙酸 408 31.9
1.D.蛋白质浓度的影响
在含有10mM pH6的琥珀酸钠和150mM精氨酸的制剂中检测蛋白质浓度对储藏稳定性的影响。如图6所示，其中用可溶性rhIL-2在50℃的半衰期对初始的蛋白质浓度作图，rhIL-2储藏稳定性随蛋白质浓度下降而增加。该发现与实验观察结果一致，即聚集是rhIL-2在液体制剂中的主要降解途径。
1.E.非离子型表面活性剂聚山梨醇酯80的作用
在含有0.5毫克/毫升IL-2、230mM精氨酸碱、128mM琥珀酸调节到pH5.8，1mM EDTA和0、0.02和0.1％聚山梨醇酯80的制剂中测试聚山梨醇酯80(Tween80或Tw80)对rhIL-2储藏稳定性的影响。如表3所示，两种含有聚山梨醇酯80的制剂显示50℃时可溶性IL-2半衰期的减少，如RP-HPLC测量的从16天减少到9天。因此，在制剂中包含聚山梨醇酯80，单看其对蛋白质聚集的作用就可认为并不合适。然而，该添加剂对于由冻融和机械剪切作用引起的急剧蛋白质破坏具有稳定作用，在含该蛋白的液体制剂加工过程中是有益的，如下文实施例所公开的。
还检测了两种基于山梨糖醇制剂的储藏稳定性。虽然RP-HPLC检测其半衰期和生物活性与精氨酸制剂相当，但是据SEC-HPLC估计的半衰期则小得多，提示在这些制剂中的rhIL-2蛋白可能有大部分以可溶性聚集物形式存在。
表3：RP-HPLC、SEC-HPLC和体外生物试验对在50℃储藏的rhIL-2中测量得到的半衰期(t1/2)或剩余的可溶性rhIL-2(峰B)
制剂(全部在pH5.8，1mM EDTA)       在50℃的t1/2(天)
 RP  SEC  生物活性
230mM ArgBase，128mM琥珀酸，pH5.8  16.0  21.3  25.6
230mM ArgBase，128mM琥珀酸，0.02％Tw80，pH5.8  9.7  12.4  未验
230mM ArgBase，128mM琥珀酸，0.1％Tw80，pH5.8  9.1  12.2  24.5
270mM山梨糖醇，10mM琥珀酸钠，0.％Tw80，pH4.5  31.7  3.6  未验
270mM山梨糖醇，10mM琥珀酸钠，0.1％Tw80，pH5.0  14.4  2.4  21.3
在表3中，用RP-HPLC测定的含精氨酸碱-琥珀酸rhIL-2制剂的半衰期，比用SEC-HPLC法测定的略小，比用体外生物测定法测定的更小得多。还评估了主要rhIL-2成分在SEC-HPLC中的洗脱量，来进一步检测这些差异。用或不用SDS、尿素和DTT处理的样品，在主要成分的洗脱时间方面没有变化，表明这些制剂中rhIL-2以单体组分存在。然而，SEC-HPLC方案可能无法判别其它单体成分，例如峰A甲硫氨酸氧化物与峰B的完整的主要单体成分的差别。因此，希望有办法能确定半衰期的小差异。
用0.1％SDS在试验稀释剂中进行的体外试验确定了表3所示数据中的生物活性。因此，用含有0.1％SDS的试验稀释剂稀释样品，然后将样品加到组织培养板中与小鼠HT-2细胞接触。可能用SDS稀释会使这些样品中的一些rhIL-2聚集物分离还原成原来的单体形式，导致该制剂的生物活性估计过高。因此，用添加(+S)和不添加(-S)SDS的试验稀释剂来评估稳定性样品。样品还用(+F)或不用(-F)0.2微米过滤处理的方法进行测定，因为过滤能除去可目测判断的大团蛋白质聚集物。表4中显示了经过这些处理的样品测量的生物活性值，与用RP-HPLC法获得的储藏稳定性结果进行了比较。以在-70℃储藏的同类样品所获得的生物活性值的百分数表示其数值。
总的说，在与HT-2细胞接触前，用SDS稀释，而未过滤的制剂，显示比在试验稀释剂中没有SDS并在进行测定前经过过滤的制剂具有更高的生物活性值。在这些生物活性结果中，用过滤和不用SDS稀释而获得的生物活性数值与RP-HPLC的结果十分相近。因此，推荐该方法用于对单体rhIL-2进行准确的生物活性测定。
表4：可溶性rhIL-2的RP-HPLC分析和在40℃或50℃储藏2周的稳定性样品的体外生物活性分析结果之间的比较。全部结果表示成各自的-70℃样品获得的百分数。制剂含0.5毫克/毫升rhIL-2、230mM L-精氨酸碱、128mM pH5.8的琥珀酸和1mM EDTA，含(#1)和不含(#2)0.1％的聚山梨醇酯80。在用含或不含0.1％SDS的稀释剂稀释之前用和不用0.22微米过滤处理生物测定的样品。
样品HPLC ％生物活性(-70℃样品的百分数) ％RP(-70℃样品的百分数)
-F+Sa +F+Sa -F-Sa +F-Sab
40℃的#1 106 100 104 100 101
50℃的#1 92 79 60 53 58
40℃的#2 101 69 106 112 98
50℃的#2 60 38 62 47 42
a“-F”是未过滤的，“+F”是过滤的。“-S”是不用SDS稀释的，“+S”是用SDS稀释的。
b这是对单体IL-2的推荐方法。
1.F.防腐剂适用性
由于需要开发多剂量的制剂，调查了防腐剂适用性。在两项速成研究中评估了各种防腐剂对IL-2稳定性的影响。研究1在含有0.2毫克/毫升IL-2、10mM pH6的琥珀酸钠和160mM精氨酸的制剂中筛选了苯甲醇、m-甲苯酚和苯酚。研究2在含有0.2毫克/毫升IL-2、230mM L-精氨酸碱、128mM pH5.8的琥珀酸、1mM EDTA二钠盐的制剂中筛选苄索氯铵、苯扎氯铵、对羟苯甲酸甲酯/对羟苯甲酸丙酯和氯丁醇。表5中列出了储藏在40℃的这些制剂用RP-HPLC测定的可溶性rhIL-2的半衰期。
所有测试的防腐剂在升温条件下降低了rhIL-2的稳定性。在研究1中，不含任何防腐剂的可溶性rhIL-2在40℃时的半衰期是约74天。加入苯甲醇或m-甲苯酚或苯酚将该半衰期显著减少5-10倍。在研究2中，防腐剂的作用小得多。可溶性rhIL-2的半衰期由于苄索氯铵下降不到一半，而其它防腐剂下降了2倍以上。总的说，苄索氯铵在测试的防腐剂中减少rhIL-2稳定性最少。
表5：对于含有防腐剂的制剂在40℃下可溶性rhIL-2的半衰期(t1/2)。研究1：制剂含有0.2毫克/毫升rhIL-2、10mM pH6的琥珀酸钠、150mM L-精氨酸和防腐剂。研究2：制剂含有0.2毫克/毫升rhIL-2、230mM L-精氨酸碱、128mM pH5.8的琥珀酸碱、1mM EDTA二钠、0.1％聚山梨醇酯80和防腐剂。
防腐剂 40℃的t1/2(天)
研究1
无防腐剂 74.0
0.9％(w/v)苄索氯铵 16.0
0.25％(w/v)m-甲苯酚 7.5
0.5％(w/v)苯酚 11.0
研究2
无防腐剂 261.0
0.01％(w/v)苄索氯铵 185.0
0.01％(w/v)苯扎氯铵 67.0
0.18％(w/v)羟苯甲酸甲酯和0.02％(w/v)羟苯甲酸丙酯 113.0
0.5％(w/v)氯丁醇 84.0
虽然防腐剂对rhIL-2在升温条件下具有显著的去稳定作用，还检测到它们对rhIL-2在4℃或25℃下的短期储藏稳定性的影响。进行了新的研究，来检测在含有0.2毫克/毫升rhIL-2、230mM L-精氨酸碱、128mM琥珀酸、1mM EDTA、5mM甲硫氨酸和0.1％pH5.8的聚山梨醇酯80的制剂中的6种防腐剂的作用。表6报道了储藏1年后保留的可溶性rhIL-2量的结果。当与对照比较时，所有制剂用RP-HPLC和体外生物试验两种方法测定都不显示显著的可溶性rhIL-2水平丧失，除了含有0.25％m-甲苯酚的制剂，它显示可检测的丧失。
表6.在4℃或25℃含防腐剂的制剂经1年储藏的稳定性用RP-HPLC整合峰面积和体外生物活性测定的剩余总可溶性rhIL-2的百分数表示。对照制剂含有0.2毫克/毫升IL-2、230mM L-精氨酸碱、128mM琥珀酸、1mM EDTA、5mM甲硫氨酸和0.1％pH5.8的聚山梨醇酯80。
防腐剂 RP-HPLC测定的初始IL-2百分数  体外生物活性(×10°IU/毫升)
4℃  25℃  t＝0  1年/4℃  1年/25℃
对照 102  93  3.8  3.3  2.5
0.9％苯甲醇 100  88  4.8  4.0  5.0
0.25％m-甲苯酚 98  60  5.8  2.6  2.5
0.5％苯酚 99  87  4.7  3.9  3.2
0.01％苯扎氯铵 102  93  5.5  3.9  4.4
0.01％苄索氯铵 98  89  5.4  3.2  4.7
0.5％氯丁醇 99  91  5.1  3.6  4.5
实施例2：各种因素对rhIL-2的甲硫氨酸氧化作用和储藏稳定性的影响之前已确定了IL-2中甲硫氨酸氧化的特征(Kunitani等(1986)J.Chromatography 359：391-402；Sasaoki等(1989)Chem.Pharm.Bull.37(8)：2160-2164)。IL-2在多肽链上的残基位置23、39、36和104处具有4个甲硫氨酸残基。在这些中，Met104在蛋白质表面，最容易氧化。该甲硫氨酸氧化物可作为比主要的IL-2成分(峰B)从RP-HPLC层析中更早洗脱的成分(峰A)而分离出来。Met23和Met29都较难以氧化，只有在极限氧化条件下发生，可能是由于其存在于蛋白质分子的内部。这些MET残基的氧化物在RP-HPLC上比Met104早洗脱。Met45深埋在蛋白质分子内部，不易于氧化，除非蛋白质完全展开。
对IL-2中甲硫氨酸氧化的调查着重于Met104的氧化，而且它是最容易氧化的甲硫氨酸残基，防止它氧化也抑制了其它甲硫氨酸残基氧化。
2.A.pH的作用
在3-9的pH范围内，含有0.2毫克/毫升IL-2、150mM NaCl和10mM各种缓冲物质的制剂中，研究了甲硫氨酸的氧化作用。通过在t＝0和t＝3个月时以百分率定量IL-2样品中峰A成分(即Met104氧化的成分)，检测这些制剂中的甲硫氨酸氧化作用。如表7所报道的，pH的影响，除了用柠檬酸盐在pH6缓冲的样品，在t＝0时并不明显。与其它具有5％峰A成分的样品比较，柠檬酸盐样品显示峰A水平提高到6％。
在t＝3个月时，在更高的pH条件下峰A的水平提高，提示对于Met104的甲硫氨酸氧化作用具有碱催化机制。在pH6时，在使甲硫氨酸氧化最少化方面琥珀酸盐是比柠檬酸盐更好的缓冲液，因为在琥珀酸制剂中观察到更低的峰A值。
表7：甲硫氨酸氧化作用的RP-HPLC法分析，以t＝0和3个月时pH3-9的制剂样品中作为甲硫氨酸氧化的峰A成分存在的可溶性IL-2(峰A+峰B)总量的百分数表达。制剂含有0.2毫克/毫升IL-2、150mM NaCl和用各10mM缓冲成分调节的pH。
缓冲剂和pH ％总可溶性IL-2的峰A
 t＝0               t＝3个月
 -70℃  4℃  25℃  40℃
10mM甘氨酸，pH3  5  4  5  6  7
10mM乙酸盐，pH4  5  5  6  7  6
10mM乙酸盐，pH5  NA  7  8  9  9
10mM柠檬酸盐，pH6  6  6  8  12  14
10mM琥珀酸盐，pH6  5  6  7  4  9
10mM磷酸盐，pH7  5  7  8  11  5
10mM硼酸盐，pH9 5 11 15 14 NA
2.B.EDTA、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80和MgCl2的影响
表8报道了一种金属螯合剂、两种非离子型表面活性剂、和一种二价金属离子对甲硫氨酸氧化的影响。制剂中聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80的存在在t＝0和t＝1个月时同时提高了甲硫氨酸氧化物的水平。相反，EDTA和MgCl2在40℃和50℃储藏1个月后降低甲硫氨酸氧化物的水平。
表8：在t＝0和t＝1个月时IL-2样品中存在的甲硫氨酸氧化的峰A成分(％峰A)占可溶性IL-2(峰A+峰B)总量的百分数。对照样品含有0.2毫克/毫升IL-2、10mM pH6的琥珀酸钠和150mM的精氨酸。
制剂 ％峰A(甲硫氨酸氧化)
t＝0              t＝1个月
-70℃ 4℃ 40℃ 50℃
对照 2.8 3.5 5.1 19.7 36.3
1mM EDTA 2.5 3.5 5.0 9.5 14.0
0.1％聚山梨醇酯80 5.8 4.3 6.9 21.5 41.4
1mM EDTA+0.1％聚山梨醇酯80 5.9 4.2 6.9 12.1 19.2
0.1％聚山梨醇酯20 4.1 5.4 9.6 25.3 42.8
5mM MgCl2 3.9 4.8 6.9 9.7 12.1
2.C.甲硫氨酸的影响
调查了在制剂中加入甲硫氨酸防止IL-2的甲硫氨酸氧化作用。表9报道了含有不同量的甲硫氨酸的制剂在50℃储藏2周后峰A和可溶性IL-2(峰A+峰B)总量的变化。制剂中甲硫氨酸浓度的提高可在t＝0和2周时显著降低峰A的水平，但是在储藏2周以后不影响保留的可溶性IL-2量。在5mM甲硫氨酸调节下，在t＝2周时峰A值可下降3倍。因此，加入甲硫氨酸导致蛋白质的甲硫氨酸氧化显著减少，对IL-2聚集几乎没有影响。
表9：50℃下t＝0和t＝2周的IL-2样品中峰A和总可溶性蛋白的变化。制剂含有0.2毫克/毫升IL-2、230mM精氨酸、128mM pH5.8的琥珀酸、1mM EDTA、0.1％聚山梨醇酯80和0-10mM的甲硫氨酸。
制剂 ％峰A(甲硫氨酸氧化) ％IL-2剩余
t＝0 50℃t＝2周 50℃t＝2周
无甲硫氨酸 2.1 6.3 76
1mM甲硫氨酸 1.4 2.7 77
5mM甲硫氨酸 1.2 2.1 77
10mM甲硫氨酸 1.2 1.9 76
除了高温结果，还记录了含或不含5mM甲硫氨酸的制剂在4℃和25℃储藏3个月后甲硫氨酸的氧化水平。如表10所示，制剂中5mM甲硫氨酸的存在导致4℃和25℃下峰A水平都下降3倍。因此，加入5mM甲硫氨酸可有效防止Met104氧化。
表10：甲硫氨酸氧化水平，以甲硫氨酸氧化的峰A成分(总可溶性IL-2的％峰A)在可溶性IL-2(峰A+峰B)总量的百分数表示和4℃或25℃储藏3个月后样品中剩余的可溶性IL-2的百分数。制剂含有0.2毫克/毫升IL-2、230mM精氨酸、128mM pH5.8的琥珀酸、1mM EDTA、0.1％聚山梨醇酯80和0或5mM甲硫氨酸。
制剂 总可溶性IL-2的％峰A ％剩余的IL-2(主峰)
4℃ 25℃ 4℃ 25℃
0mM 2.7 4.1 101 97
5mM 0.8 1.4 101 100
2.D.氮气通气和脱气的去氧作用
测试了在IL-2样品小管中进行除氧试验，以最大限度减少甲硫氨酸氧化作用。气对含有1毫升IL-2样品的3-cc指管顶部空间充入氮气驱除空气。以真空脱气除去溶解的分子氧。表11显示了这些样品在50℃储藏1周后峰A和可溶性IL-2总量(峰A+峰B)的变化。单独通入氮气可将甲硫氨酸氧化物的百分数稍微从6.7％减少到6.2％。溶液脱气与氮气顶部通气法相结合可进一步减少峰A的水平约1个百分点。另一方面，用氮气通气或脱气可溶性IL-2总量百分数都保持不变。
表11：可溶性IL-2总量(峰A+峰B)百分数的变化，以甲硫氨酸氧化的峰A成分(％峰A)的百分数和50℃时t＝0和t＝1周样品中剩余的可溶性IL-2的百分数用氮气通气或脱气。制剂含有0.3毫克/毫升IL-2、230mM精氨酸、128mM琥珀酸、1mM EDTA和0.1％聚山梨醇酯80。
制剂 ％峰A(甲硫氨酸氧化) ％剩余的IL-2
t＝0 50℃，t＝1周 50℃，t＝1周
对照 3.1 6.7 81
氮通气 3.1 6.2 82
脱气/氮气通气 3.0 5.8 81
2.E.防腐剂的作用
检测了防腐剂对甲硫氨酸氧化的作用。表12显示4℃和25℃储藏6和12个月后含或不含6种防腐剂之一的制剂样品峰A的改变。所有含防腐剂的制剂显示峰A水平与对照类似，表明防腐剂对甲硫氨酸氧化没有可感知的作用，除了在含有0.25％的m-甲苯酚的制剂中，它显示峰A水平显著增加。
表12：可溶性IL-2总量的百分数(峰A+峰B)，以4℃和25℃储藏6个月和12个月的含各种防腐剂的制剂中甲硫氨酸氧化的峰A成分(％峰A)表示。对照制剂含0.2毫克/毫升IL-2、230mM L-精氨酸碱、128mM琥珀酸、1mM EDTA、5mM甲硫氨酸、0.1％聚山梨醇酯80，pH5.8。
防腐剂 ％峰A(甲硫氨酸氧化)
t＝0      6个月     12个月
4℃ 25℃ 4℃ 25℃
对照 1.5 1.6 1.9 1.8 2.6
0.9％苯甲醇 1.6 1.7 2.3 1.9 3.3
0.25％m-甲苯酚 1.6 1.8 6.7 2.1 3.5
0.5％苯酚 1.6 1.7 2.4 1.8 3.6
0.01％苯扎氯铵 1.5 1.6 2.0 1.0 3.0
0.01％苄索氯铵 1.5 1.7 2.0 1.8 2.8
0.5％氯丁醇 1.5 1.6 2.0 1.8 3.2
实施例3：各种因素对IL-2脱氨基的影响
之前已报道了IL-2脱氨基(Kunitani等(1986)J.Chromatography 359：391-402)。已发现Asp88是IL-2中脱氨基的主要位点(Sasaoki等(1992)Chem.Pharm.Bull.40(4)：976-980)。可用RP-HPLC检测作为主要成分(峰B)的后侧峰(峰B’)的脱氨基物。在含有精氨酸、NaCl和山梨糖醇的制剂中研究IL-2脱氨基。表13显示在升温条件下保温2周后，脱氨基物仅可在含山梨糖醇和NaCl的制剂中检测出来，而在含有精氨酸的制剂中未能检测出来。可是，以精氨酸稳定化的IL-2不会通过脱氨基作用而降解。
表13：在含有0.2毫克/毫升IL-2、10mM pH6的琥珀酸钠和150mM精氨酸、150mM NaCl或270mM山梨糖醇的制剂中峰B’用RP-HPLC检测的脱氨基作用
制剂 t＝0和2周时％峰B’(脱氨基)
t＝0 -70℃ 40℃ 50℃
10mM琥珀酸钠，150mM Arg，pH6  0  0  0  0
10mM琥珀酸钠，150mM NaCl，pH6  0  0  0  3
10mM琥珀酸钠，270mM山梨糖醇，pH6  0  0  2  2
实施例4：冻融对IL-2稳定性的影响
冷冻引起的蛋白质破坏通常由于三种机制造成：(1)蛋白质在低温构型不稳定(冷变性)；(2)蛋白质在冰-水界面容易变性；(3)蛋白质由于冷冻后盐浓度的改变或pH改变而破坏。
对IL-2而言，在冻融过程中的蛋白质损失，可能是由于冰水界面上的变性和聚集引起的，因为非离子型表面活性剂聚山梨醇酯80有效保护IL-2免受冻融作用的破坏。如图7所示，在含有0.2毫克/毫升IL-2、10mM pH6的琥珀酸钠和150mM精氨酸的制剂中可溶性IL-2量在每一轮冻融后的减少情况。在制剂中加入聚山梨醇酯80可提高IL-2对多次冻融处理的稳定性。当聚山梨醇酯80的浓度达到0.05％或以上时，IL-2完全被保护不受冻融作用的破坏。
实施例5：机械剪切力对IL-2稳定性的影响
5.1.聚山梨醇酯80、EDTA、蛋白质浓度和填充物体积的影响
进行了研究来检测剪切力引起的可溶性IL-2损失。评估了两种剪切力：在轨道式摇床(VWR Scientific，目录号57018-754)振摇和在搅拌器(FisherScientific，Genie 2型，速度定为4)上搅拌。在3毫升指管中填充1毫升的各种IL-2制剂。这些制剂保存在冷藏室(对照样品)，置于实验工作台过夜(静态样品)、200RPM振摇过夜(振摇样品)，或搅拌1分钟(搅拌样品)。表14显示了这些样品中可溶性IL-2量的改变结果。
与冷藏的对照样品比较，静态样品和振摇样品显示IL-2不损失。因此，在环境温度下IL-2是稳定的，而且对于振摇处理是稳定的。另一方面，当这些制剂进行1分钟搅拌，检测到不同量的损失。含有0.1-0.5毫克/毫升IL-2或1和5mMEDTA或低浓度的聚山梨醇酯80(0.005-0.05％)的制剂都显示损失了25-50％的可溶性IL-2 。因此，1分钟搅拌比振摇过夜对于IL-2分子更有害。在制剂中将聚山梨醇酯80的浓度提高到等于或大于0.1％，就可防止IL-2损失。另外，在顶部没有留下空气的完全填充的指管经1分钟搅拌后也极少有可溶性IL-2损失，表明气-液界面是导致破坏的主要因素。
表14：在环境温度下储藏过夜(静态)、200RPM振摇过夜(振摇)和搅拌1分钟(搅拌)的样品可溶性IL-2量与储藏在4℃的样品相比的改变情况。对照制剂含有0.2毫克/毫升IL-2、10mM pH6的琥珀酸钠和150mM精氨酸。制剂以1毫升装入3毫升玻璃指管中，以完全填充到3毫升指管顶部不留空气作为对照样品。用RP-HPLC定量可溶性IL-2。
样品(3毫升指管中装入1毫升) 可溶性IL-2的％剩余
静态过夜 振摇过夜 搅拌1分钟
0.2毫克/毫升IL-2(对照) 99.6 100.8 74.7
0.1毫克/毫升IL-2 100.3 102.7 72.0
0.5毫克/毫升IL-2 99.7 101.0 68.6
1mM EDTA 97.6 101.2 59.6
5mM EDTA 99.3 102.7 72.2
0.005％聚山梨醇酯80 100.6 100.0 46.5
0.01％聚山梨醇酯80 99.7 100.4 66.1
0.05％聚山梨醇酯80 99.3 100.3 93.9
0.1％聚山梨醇酯80 99.2 100.0 89.0
0.2％聚山梨醇酯80 99.3 99.2 99.8
0.5％聚山梨醇酯80 99.1 98.4 99.7
1mM EDTA，0.1％聚山梨醇酯80 99.6 100.1 99.8
完全装满的指管 99.4 100.1 96.5
5.2.精氨酸的影响
表15报道了精氨酸在防止对IL-2的稳定性搅拌破坏作用的影响。将精氨酸浓度从150mM提高到230mM可使可溶性IL-2的量在1分钟搅拌后从65％到69％提高3％。因此，精氨酸对IL-2抵抗剪切力破坏有微小的影响，虽然之前显示它对于IL-2抵抗由于聚集物形成的降解有很大的稳定作用。
对聚山梨醇酯80在230mM精氨酸制剂中的作用进行了试验。加入低浓度的聚山梨醇酯80(0.02％)可消除，而加入高浓度的聚山梨醇酯80(0.1％)则可提高IL-2对搅拌破坏作用的稳定性。
表15：RP-HPLC分析1分钟搅拌后各种制剂中剩余的可溶性IL-2的百分数
 制剂(全部含有0.5毫克/毫升IL-2，除了另外指出)  ％剩余的IL-2
 150mM精氨酸，10mM琥珀酸钠，1mM EDTA，pH5.8  65.5
 150mM精氨酸，81mM琥珀酸，1mM EDTA，pH5.8  65.3
 230mM精氨酸，10mM琥珀酸钠，1mM EDTA，pH5.8  69.0
 230mM精氨酸，128mM琥珀酸，1mM EDTA，pH5.8  68.9
 230mM精氨酸，128mM琥珀酸，1mM EDTA，0.02％Tw80，pH5.8  55.1
 230mM精氨酸，128mM琥珀酸，1mM EDTA，0.1％Tw80，pH5.8  99.5
5.3.运输研究
在实际运输研究中调查了产品运输过程中对IL-2的剪切力破坏作用。制备了精氨酸制剂和NaCl制剂的IL-2，都具有不同量的聚山梨醇酯80。这些IL-2样品在冰上从Emeryville，California空运到St.Louis，Missouri，和从St.Louis运回Emeryville。图8显示了这些样品中可溶性IL-2量的RP-HPLC分析。在制剂中不存在聚山梨醇酯80的情况下，在精氨酸和NaCl配制的样品中观察到约10％的IL-2丧失。精氨酸制剂和NaCl制剂之间的稳定性差异是可忽略的，约1％。在制剂中存在聚山梨醇酯80的情况下，IL-2损失减少。在0.1％聚山梨醇酯80时，观察不到损失，表明IL-2在该表面活性剂浓度被完全保护。因此，0.1％聚山梨醇酯80在制剂中有效防止IL-2在运输过程中受到急剧剪切力的破坏。
总的说，精氨酸可在长期储藏过程中作为液体IL-2药物制剂的主要稳定剂，来减少IL-2的聚集作用和脱氨基作用。为了进一步提高制剂中的精氨酸浓度，从而实现更高的IL-2稳定性而仍然保持溶液等渗性，优选用琥珀酸将精氨酸碱滴定到pH5.8。另外，可在制剂中包含甲硫氨酸和EDTA来防止蛋白质的甲硫氨酸氧化。最后，可在制剂中包含非离子型表面活性剂，例如聚山梨醇酯80，来防止IL-2受到冻融和机械剪切力的破坏。
实施例6：防腐剂效果试验
对几种含有抗微生物防腐剂的制剂按美国药典(USP)进行了防腐剂效力测试。表6列出了结果。不含防腐剂的对照样品未能通过测试，而所有含防腐剂的制剂都通过了测试。
表16：rhIL-2各制剂的USP防腐剂效力试验。对照制剂含有0.1毫克/毫升rhIL-2、230mM L-精氨酸碱、128mM琥珀酸、1mM EDTA、5mM甲硫氨酸、0.1％聚山梨醇酯80，pH5.8。
防腐剂 USP试验
对照 未通过
0.9％苯甲醇 通过
1.3％苯甲醇 通过
1.7％苯甲醇 通过
0.5％氯丁醇 通过
0.5％苯酚 通过
实施例7：测试疼痛的性质
用University of Florida，College of Dentistry，OMSDS神经科学部的大鼠模型评估产生疼痛的性质，更具体的是制剂产生的灼痛和刺痛。该模型是基于对携带疼痛信息的感觉细胞中引起电流的试验。为了进行该试验，分离感觉细胞(脊根神经节)分别置于标记的容器。从根据感受伤害(产生疼痛)的标准预选的各细胞作出记录。对于测试的制剂记录计算灼痛、刺痛和标准化的疼痛评分。灼痛评分定义为对测试制剂相对于辣椒辣素(500nM)的的反应。辣椒辣素广为人知能在人体内产生强烈灼痛(Cooper等(1986)Pain 24：93-116)。刺痛评分是测试制剂产生的电流与缓冲到pH5.0的溶液产生的电流之比。标准化疼痛评分是评价制剂产生的电流相对于已知产生刺痛感的生理盐水(0.9％NaCl，未缓冲处理)，这种医院中常用的非经胃肠用药产生的电流之比。
一种液体L-精氨酸碱-琥珀酸制剂通过该模型进行了疼痛分析。表17显示了这两种测试溶液的结果。基于灼痛、刺痛和标准化疼痛评分计算的分数，L-精氨酸-琥珀酸制剂与生理盐水比较，显示卓越的性质。还观察到施用制剂过程中测试的电流减小(时间依赖性的下降)，而用生理盐水则不消失。这证明如本试验评估的，该制剂比盐水具有更好的耐受性。
表17：液体制剂和0.9％NaCl的灼痛、刺痛和标准化疼痛评分。液体制剂含有230mM L-精氨酸碱、128mM琥珀酸、1mM EDTA、5mM甲硫氨酸、0.1％聚山梨醇酯80，pH5.8。
制剂 灼痛 刺痛 标准化疼痛评分
0.9％NaCl 0.084±0.006 2.44±0.62 1.73±0.73
RhIL-2液体制剂 0.044±0.019 0.65±0.23 0.16±0.05
实施例8：对TFPI的稳定性研究
对各种制剂中的TFPI进行的稳定性和可溶性研究已证明，L-精氨酸碱是TFPI的稳定剂(数据未显示)，而带电缓冲成分(例如柠檬酸盐离子)具有更突出的增溶作用。在该研究中，检测了各种制剂中L-精氨酸浓度和缓冲系统对TFPI稳定性的影响。特别是如前所述对于IL-2制剂在前述实施例中测试的用基本不含其盐形式的酸形式的缓冲系统与用酸及其盐形式的混合物的缓冲系统相比较的影响。
材料和方法
用20mM柠檬酸钠和300mM L-精氨酸(pH5.5)配制了0.6毫克/毫升的THPI溶液。用Spectral Por#7滤膜(MWCO 3，500，ID# 132-110)在4℃进行透析，将该溶剂缓冲交换到各种用柠檬酸或琥珀酸系统缓冲到pH6.5的L-精氨酸制剂中。在透析后，用UV/Vis分光光度计测量各溶液的TFPI浓度。然后用合适的缓冲液将各溶液稀释到0.15毫克/毫升。然后将制备的溶液等分到(各1毫升)3-毫升指管中，稳定储藏。在该时间点(T＝0)放置足够的指管。将剩余的指管置于50℃的温箱内，进行促进稳定性研究。取时间点3、7、14和30天。为了各时间点的分析，将各指管的内含物转移到1.7毫升微量离心管中，然后在10K rpm离心约2分钟。从该试管中取出离心上清液，用从先前的研究已知是稳定性指示试验的IEX-HPLC(所需描述)分析样品离心后上清液。
结果和讨论
将TFPI配制成0.15毫克/毫升最终浓度的含L-精氨酸碱或L-精氨酸HCl的制剂。用10mM柠檬酸或琥珀酸及与其各自的钠盐相结合，将L-精氨酸HCl制剂缓冲到pH5.5。用柠檬酸或琥珀酸将L-精氨酸碱制剂滴定到pH5.5。如下进行了总共8次研究：
1)20-150mM用10mM柠檬酸和柠檬酸钠缓冲到pH5.5的L-精氨酸HCl；
2)20-150mM用柠檬酸缓冲到pH5.5的L-精氨酸碱；
3)100-300mM用10mM柠檬酸和柠檬酸钠缓冲到pH5.5的L-精氨酸HCl；
4)100-300mM用柠檬酸缓冲到pH5.5的L-精氨酸碱；
5)20-150mM用10mM琥珀酸和琥珀酸钠缓冲到pH5.5的L-精氨酸HCl；
6)20-150mM用琥珀酸缓冲到pH5.5的L-精氨酸碱；
7)100-300mM用10mM琥珀酸和琥珀酸钠缓冲到pH5.5的L-精氨酸HCl；和
8)100-300mM用琥珀酸缓冲到pH5.5的L-精氨酸碱；
先前确定TFPI的主要降解途径是蛋白质聚集/沉淀(Chen等(1999)J.Pharm.Sci.88：881-888)。可监测稳定性样品中的剩余可溶性蛋白质跟踪TFPI的降解过程。将配成不同L-精氨酸浓度的TFPI溶液储藏在50℃，进行加速稳定性的研究。在预定的时间间隔取样。从聚集/沉淀的蛋白质中通过在微量离心管中离心分离样品中的可溶性蛋白。用IEX-HPLC法确定可溶性蛋白质量(Chen等(1999)J.Pharm.Sci 88：881-888)。然后通过单指数动态等式(Y＝YoEXP(-klt))将数据拟合成储藏时间的函数，用KaleidaGraph图形软件(Synergy Software，Reading Pennsylvania)来计算剩余可溶性蛋白质的半衰期。
加入柠檬酸或柠檬酸钠缓冲的制剂的剩余可溶性TFPI的半衰期(t1/2)值如表18所示。表19显示了用琥珀酸或琥珀酸钠缓冲的制剂中的剩余可溶性TFPI的t1/2值。这些数据显示半衰期随着这些制剂中L-精氨酸的浓度增加而提高。这些数据也分别对于柠檬酸盐和琥珀酸盐缓冲系统绘出曲线图，如图9和图10。半衰期值绘成抛物线，并按精氨酸浓度的函数而增加。这确定了L-精氨酸是对于TFPI的稳定剂。
在两种缓冲系统之间，TFPI稳定性的差异可忽略不计。虽然柠檬酸缓冲系统看来更可行(图9)，对于琥珀酸盐缓冲系统的两条半衰期对精氨酸浓度的曲线基本上是可叠加的(图10)。TFPI在相似的L-精氨酸浓度达到相似的稳定性，不论-使用何种缓冲系统调节pH。图11还比较了琥珀酸缓冲系统和柠檬酸缓冲系统之间的半衰期对精氨酸浓度的曲线。该图显示在TFPI稳定性中没有重大差异，只要精氨酸浓度在制剂中保持相同。这些数据证明稳定性作用主要归功于精氨酸。
然而，用琥珀酸或柠檬酸滴定可在制剂中提高精氨酸浓度(因此提高了稳定性)而同时维持等渗。因此例如，表18中的制剂3-3和4-3在制剂中都含有300mML-精氨酸，它们的半衰期是相似的。然而，3-3制剂用10mM柠檬酸和柠檬酸钠将300mM L-精氨酸HCl缓冲到pH5.5，具有497mOsm/kg的溶液克分子渗透压浓度。这是高渗制剂，不是可注射制剂优选的。另一方面，4-3制剂使用121mM柠檬酸联合300mM L-精氨酸碱将pH调节到5.5，并具有295mOsm/kg的溶液克分子渗透压浓度。该制剂非常接近等渗溶液(290mOsm/kg)，因此是更优选的可注射制剂。如果使用常规的pH调节方法，例如用10mM柠檬酸和柠檬酸钠，就只能在制剂中加入150mM多一点的L-精氨酸，不超过等渗。150mM L-精氨酸制剂(编号1-6)的半衰期是16天，而相对300mM L-精氨酸制剂(编号4-3)是23天。因此，用酸碱(即精氨酸-碱)作为稳定剂和基本不含其盐形式的酸(即琥珀酸)的缓冲剂配制TFPI，可提供更有效的条件以加入更多稳定剂(即精氨酸)，来使对TFPI的作用达到最大限度。
结论
该实施例证明L-精氨酸通过延长其储藏期稳定TFPI。通过使用酸滴定，可在制剂中加入更多精氨酸以最大程度提高储藏效果，而不超过等渗，这是可注射制剂优选的。
表18：TFPI精氨酸-柠檬酸pH5.5制剂的稳定性数据。
用单指数动力学方程拟合50℃时的稳定性数据获得半衰期(t1/2)。
 编码 制剂 克分子渗透压浓度(mmol/kg) t1/2(天)
 1-1 20mM L-Arg HCl，10mM柠檬酸/柠檬酸钠 66 9.4
 1-2 40mM L-Arg HCl，10mM柠檬酸/柠檬酸钠 81 12.6
 1-3 60mM L-Arg HCl，10mM柠檬酸/柠檬酸钠 91 10.7
 1-4 80mM L-Arg HCl，10mM柠檬酸/柠檬酸钠 106 10.9
 1-5 100mM L-Arg HCl，10mM柠檬酸/柠檬酸钠 190 12.5
 1-6 150mM L-Arg HCl，10mM柠檬酸/柠檬酸钠 276 16.0
 2-1 用8.9mM柠檬酸滴定的20mM L-Arg碱 67 5.7
 2-2 用17.8mM柠檬酸滴定的40mM L-Arg碱 84 15.0
 2-3 用26.6mM柠檬酸滴定的60mM L-Arg碱 95 17.0
 2-4 用34.2mM柠檬酸滴定的80mM L-Arg碱 109 14.6
 2-5 用42.6mM柠檬酸滴定的100mM L-Arg碱  119   18.2
 2-6 用62.4mM琥珀酸滴定的100mM L-Arg碱  147   20.4
 3-1 100mM L-ArgHCl，10mM柠檬酸/柠檬酸钠  239   14.8
 3-2 200mM L-ArgHCl，10mM柠檬酸/柠檬酸钠  358   19.6
 3-3 300mM L-ArgHCl，10mM柠檬酸/柠檬酸钠  497   21.7
 4-1 用42.2mM柠檬酸滴定的100mM L-Arg碱  155   16.7
 4-2 用81.8mM柠檬酸滴定的200mM L-Arg碱  224   22.5
 4-3 用121mM柠檬酸滴定的300mM L-Arg碱  295   23.3
表19：TFPI精氨酸-琥珀酸pH5.5制剂的稳定性数据。
用单指数动力学方程拟合50℃时的稳定性数据获得半衰期(t1/2)。
 编码 制剂 克分子渗透压浓度(mmol/kg) t1/2(天)
 1-1 20mM L-Arg HCl，10mM琥珀酸/琥珀酸钠 66 9.9
 1-2 40mM L-Arg HCl，10mM琥珀酸/琥珀酸钠 97 11.5
 1-3 60mM L-Arg HCl，10mM琥珀酸/琥珀酸钠 129 15.3
 1-4 80mM L-Arg HCl，10mM琥珀酸/琥珀酸钠 163 16.7
 1-5 100mM L-Arg HCl，10mM琥珀酸/琥珀酸钠 197 20.5
 1-6 150mM L-Arg HCl，10mM琥珀酸/琥珀酸钠 282 21.9
 2-1 用12.5mM琥珀酸滴定的20mM L-Arg碱 40 6.7
 2-2 用25.2mM琥珀酸滴定的40mM L-Arg碱 62 12.6
 2-3 用37.5mM琥珀酸滴定的60mM L-Arg碱 85 16.4
 2-4 用49.9mM琥珀酸滴定的80mM L-Arg碱 107 19.6
 2-5 用62.4mM琥珀酸滴定的100mM L-Arg碱 129 20.9
 2-6 用91.4mM琥珀酸滴定的150mM L-Arg碱 192 23.1
 3-1 100mM L-ArgHCl，10mM琥珀酸/琥珀酸钠 207 16.5
 3-2 200mM L-ArgHCl，10mM琥珀酸/琥珀酸钠 353 21.6
 3-3 300mM L-ArgHCl，10mM琥珀酸/琥珀酸钠 515   21.7
 4-1 用61.3mM琥珀酸滴定的100mM L-Arg碱 127   17.0
 4-2 用122mM琥珀酸滴定的200mM L-Arg碱 256   21.4
 4-3 用180mM琥珀酸滴定的300mM L-Arg碱 363   22.5
本说明书中提到的所有出版物和专利申请指明了本发明涉及的领域中技术人员的水平。所有出版物和专利申请在此以相同的程度引入以供参考，如同特别和唯一指定各出版物或专利申请是在此引入以供参考。
虽然为了明白理解已通过说明和实施例详细描述了本发明，明显可在权利要求范围内进行某些变化和修改。

Claims (27)

1.一种制备液体药物组合物的方法，该组合物含有多肽或其生物学上活性的变体，其特征在于，所述方法包括：
将所述多肽或其变体与至少一种氨基酸和缓冲剂混合，所述缓冲剂是基本不含其盐形式的酸、或盐形式的酸，其中
当所述缓冲剂是基本不含其盐形式的酸，所述多肽是白细胞介素-2，所述氨基酸是至少一种氨基酸，选自游离碱形式的精氨酸和游离碱形式的赖氨酸；
其中所述组合物具有pH4.0-9.0之间的pH，所述其变体用ALIGN程序以PAM120重量剩余表、缺口长度损失为12和缺口损失为4计算，与所述多肽具有70％的序列相同性。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述氨基酸是氨基酸游离碱形式的精氨酸和游离碱形式的赖氨酸中的至少一种，其中所述缓冲剂是基本不含其盐形式的酸。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述酸选自乙酸、天冬氨酸、琥珀酸、柠檬酸、磷酸和谷氨酸。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述酸是琥珀酸，所述氨基酸是游离碱形式的精氨酸。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，将所述多肽或其变体与约100mM-400mM的游离碱形式的精氨酸、80-190mM的琥珀酸混合。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述多肽是白细胞介素-2或其变体，将约150-350mM的游离碱形式的精氨酸与所述白细胞介素-2或其变体以及所述琥珀酸混合。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述230mM游离碱形式的精氨酸与所述白细胞介素-2或其变体以及所述琥珀酸混合，组合物具有约5.0-6.5的pH，组合物接近等渗。
8.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述酸是柠檬酸，所述氨基酸是游离碱形式的精氨酸。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，将约175mM-400mM的游离碱形式的精氨酸和40mM-200mM柠檬酸与所述多肽或其变体混合。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述组合物还含有其量足够抑制在所述组合物储藏过程中，所述多肽或其变体至少一个甲硫氨酸残基氧化的甲硫氨酸。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述组合物还含有足量的非离子型表面活性剂，来抑制所述多肽或其变体在所述组合物储藏过程中对冻融或机械剪切力发生反应而产生聚集。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述非离子型表面活性剂是聚山梨醇酯80。
13.一种制备液体药物组合物的方法，该组合物含有白细胞介素-2或其生物学上活性变体，其特征在于，所述方法包括将所述白细胞介素-2或其变体与游离碱形式的精氨酸以及基本不含其盐形式的琥珀酸混合，其中将150mM-350mM游离碱形式的精氨酸和80mM-190mM的琥珀酸与所述白细胞介素-2或其变体混合，所述变体用ALIGN程序以PAM 120重量剩余表、缺口长度损失为12和缺口损失为4计算，与所述白细胞介素-2具有70％的序列相同性。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，将约230mM游离碱形式的精氨酸与所述白细胞介素-2或其变体，以及所述琥珀酸混合，所述组合物具有约5.0-6.5的pH，组合物接近等渗。
15.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述白细胞介素-2或其变体具有约9-29天的半衰期，所述半衰期是当组合物储藏在约50℃时，所述组合物中的可溶性白细胞介素-2或其变体量达到50％减少的时间，其中用反相高效液相层析测定所述组合物内所述可溶性白细胞介素-2或其变体的量。
16.如权利要求13所述的方法，其特征在于，当储藏在2-8℃时，所述组合物具有至少约18个月的储藏寿命。
17.如权利要求13所述的方法，其特征在于，当储藏在2-8℃时，所述组合物具有至少约20个月的储藏寿命。
18.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述组合物还含有甲硫氨酸，它以约0.5mM-10mM的浓度存在于所述组合物中。
19.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述组合物还含有聚山梨醇酯80，它以约0.001％-0.2％的浓度存在于所述组合物中。
20.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述组合物还含有约0.1-5.0mM的乙二胺四乙酸或乙二胺四乙酸二钠。
21.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述白细胞介素-2或其所述变体以约0.01-2.0mg/ml的浓度存在于所述组合物中。
22.如权利要求1、6、7和13任一所述的方法，其特征在于，所述白细胞介素-2是重组人白细胞介素-2或其生物学上活性的、与人白细胞介素-2具有至少70％序列相同性的变体。
23.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述其变体与人白细胞介素-2具有至少80％的序列相同性。
24.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述其变体与人白细胞介素-2具有至少90％的序列相同性。
25.如权利要求24所述的方法，其特征在于，所述其变体与人白细胞介素-2具有至少95％的序列相同性。
26.如权利要求25所述的方法，其特征在于，所述变体是去-丙氨酰基-1，丝氨酸-125人白细胞介素-2。
27.根据权利要求13所述的方法制备的药物组合物。
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