CN1639193A - 抗成纤维细胞生长因子23的抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的是提供抗成纤维细胞生长因子－23的抗体。即，具有控制磷酸盐代谢或维生素D代谢的活性的抗体，和相应于(a)，(b)，(c)中的抗体，该抗体是通过利用包含一种如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的多肽或包含一种从SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列中通过缺失、替代或添加一个至多个氨基酸而衍生得到的一段氨基酸序列，并且具有成纤维生长因子23活性的多肽免疫动物得到的。(a)一种识别如SEQ ID NO：1所示氨基酸序列中的介于第180至第194位或第237至第251位之间的氨基酸序列的抗体。(b)一种由保藏号为FERM BP－7838，FERM BP－7839，FERM BP－7840，或FERM BP－8268的杂交瘤所产生的抗体。(c)一种可与保藏号为FERM BP－7838，FERM BP－7839，FERM BP－7840，或FERM BP－8268的杂交瘤所产生的抗体竞争的抗体。

Description

抗成纤维细胞生长因子23的抗体
技术领域
本发明涉及抗成纤维细胞生长因子-23(FGF-23)的抗体。
更具体地说，本发明涉及一些抗体，它们提供通过适当地检测和测定FGF-23而诊断FGF-23蛋白在体内积累或降低所伴随的疾病或病理状态的方法，所述方法能够通过阻遏FGF-23而改善或治疗由FGF-23过量的作用导致的疾病的症状或病理状态，本发明同时涉及制备抗体的方法和利用抗体的方法。
背景技术
成纤维细胞生长因子是首次作为刺激成纤维细胞系NIH3T3的物质从小牛的垂体纯化的。然后，在各种组织中鉴定了类似的蛋白，一组这些物质形成了多肽家族(FGF家族)。至今，属于FGF家族的22个类型的蛋白已经在脊椎动物中鉴定。关于这些类型的蛋白的生物学活性，不仅成纤维细胞生长刺激活性而且大范围的作用也是已知的，如发育期间中胚层和神经外胚层的生长，血管发生，肢芽的形成。FGF家族成员是关于基因的表达位点和表达时间而变更的。在发育时期或成人中经常只在特定的位点表达其基因。作为编码FGF受体的基因，至少有4个类型是已知的：FGFR1，FGFR2，FGFR3和FGFR4。另外，已知在FGFR1，FGFR2和FGFR3中，由于拼接的不同，在受体蛋白的细胞外的结构域中的差异是独立存在的。另外，已知肝素和类肝素(heparan)硫酸糖蛋白与FGF和FGF受体反应，以便调节其作用。另外，有许多蛋白由于其结构上的相似性属于FGF家族，但它们的生物活性，它们的受体结合能力等等仍然几乎是未知的。FGF家族的表征已经如综述所述完成(Ornitz，D.M.和Itoh N.，成纤维细胞生长因子，基因组生物学2：3005.1-3005.12，2001)。
FGF-23首先是通过数据库检索，利用它与FGF-15的同源性和PCR方法，从小鼠中克隆的，然后，利用它与小鼠FGF-23的序列同源性来克隆人FGF-23(Yamashita T.，Yoshioka M.，和Itoh N.，新成纤维细胞生长因子FGF-23的鉴定，其在脑的腹侧丘脑核中优先表达，Biochem.Biophy.Res.Commun.，277：494-498，2000)。随后，根据对常染色体显性的低磷酸盐血症性(hypophosphatemic)佝偻病/骨软化症(下文中称为ADHR)的研究，在ADHR患者的FGF-23基因中特征性地发现错义突变，同时使ADHR患者中突变基因的区域变窄并且鉴定了致病基因(ADHR协会，常染色体显性低磷酸盐血症性佝偻病是与FGF-23的突变相关的，Nature Genet.26：345-348，2000)。这一发现明显地表明了体内FGF-23的生理重要性。但是，FGF-23的生物学活性仍然是未知的。同时，通过对肿瘤诱导的骨软化症的研究已经确定了FGF-23的生物活性。可以认为，在这一疾病中，与疾病有关的肿瘤产生了并且分泌了诱导疾病的体液因子，并且通过这一因子的作用，发生了疾病，如低磷酸盐血症(hypophosphatemia)或软骨病。
在寻找这样的致病肿瘤产生的疾病诱导因子中，FGF-23已经作为肿瘤中高水平表达的基因来克隆。另外，已经显示，通过施用这一因子，再现了(reproduced)低磷酸盐血症和骨软化症(Shimada T.，Mizutani S.，Muto T.，Yoneya T.，Hino R.，Takeda S，Takeuchi Y.，FujitaT.，Fukumoto S和Yamashita T.，作为肿瘤诱导的骨软化症的成因因子的FGF-23的克隆和表征，美国国家科学院院刊98：6500-6505，2001)。这一研究显示了FGF-23参与了与磷和钙有关的体内代谢控制，并且表明，FGF-23作为系统性因子表现其作用，同时在体内循环。但是，表现FGF-23作用所需要的体内浓度和代谢并未被显示，FGF-23的生理作用仍然大部分未知。另外，作为呈现临床发现有类似症状的疾病，与性连遗传型(X-linked)低磷酸盐血症性佝偻病是已知的。但是，还没有发现发病过程中FGF-23的参与。除了ADHR和肿瘤诱导的骨软化症，还没有已知的疾病被证明是与FGF-23相关的。
通过显示异常低水平的血磷和1α，25-二羟基维生素D(下文中称为1，25D)以及肿瘤的发生可以表征上面的肿瘤诱导的骨软化症。该病症伴随肌肉力量降低或骨软化症，可以导致步行障碍或起立困难。在大多数情况中，导致(responsible)这一疾病的肿瘤是从间充质细胞(mesenchymal cells)派生的良性肿瘤。大多数致病肿瘤生长能力较弱，并且在随访中很少观察到明显的增大。另外，虽然观察到了发病(morbidity)的进展，通常需要详细的检测如全身MRI扫描检测来发现致病(responsible)肿瘤。因此，对于没有给出明确诊断，或者作出由未知原因导致低磷酸盐血症的一些情况，怀疑它们是肿瘤诱导的骨软化症。目前，对肿瘤诱导的骨软化症的唯一经证实的诊断方法是证明通过肿瘤切除术(tumorectomy)从疾病症状中恢复。这是因为还没有通过临床实验检测肿瘤发生与疾病症状的成因和效果关系的方法。在一些情况中，进行了完全与疾病症状无关的非致病性肿瘤的去除。为了改进这些情况，人们期望开发临床实验的方法，从而可以进行肿瘤诱导的骨软化症的差异(differential)诊断。
已经发现了FGF-23在体内具有控制磷代谢作用。已知具有控制磷代谢作用的甲状旁腺激素和1，25D在钙代谢而不是磷代谢的控制中起更重要的作用。主要控制磷代谢的分子还没有发现，而FGF-23可以期望具有这样的活性。同时，磷代谢和钙代谢之间的密切关系在临床上是已知的。特别是，关于骨组织的钙化和病理异位钙化，将两者分开考虑是困难的。基于FGF-23在过量状态时可诱导骨软化症和其具有降低1，25D作用的事实，FGF-23不仅可能与磷的代谢有关，而且还可能广泛地与控制钙化和骨代谢有关。此外，在主要包括肠道、肾和骨组织的控制矿物质代谢的器官中的异常性疾病可能与FGF-23的过量积累和缺乏有关。人们期望发展一种测定体内FGF-23浓度的方法以利于了解上述疾病，以及对该疾病进行精确的治疗。
从由过量FGF-23诱导的发病体中抑制或除掉FGF-23可以成为治疗该疾病的一种方法。一种可能的方法是利用FGF-23的受体的拮抗物或者可结合FGF-23的物质来抑制配体-受体的相互作用，另外一种可能的方法是利用一种可结合FGF-23的物质除去FGF-23。然而，利用上述方法有选择性地抑制或除去FGF-23的物质还未发现。
发明概述
本发明的一个目的是提供可识别FGF-23的抗体，诊断方法，有效的治疗方法，和利用所述抗体抵抗由FGF-23引发的疾病的预防方法。
为了达到上述目标，我们进行了大量的研究，目前该发明已经得到了一种抗体，该抗体可特异性识别并与FGF-23蛋白的部分结构相结合，并且我们发现利用该抗体可检测FGF-23。
本发明如下：
(1)通过利用多肽免疫动物而得到的抗体，所述多肽包含如SEQID NO：1所示的氨基酸序列，或包含从SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列中通过缺失、替代或添加一个或几个氨基酸而衍生得到的氨基酸序列，并且所述抗体具有成纤维细胞生长因子-23的活性，具有控制磷酸盐代谢或维生素D代谢的活性，并且如以下(a)、(b)或(c)所示：
(a)识别如SEQ ID NO：1所示的介于第180位和第194位，或第237位和第251位氨基酸残基之间的一段氨基酸序列的抗体；
(b)由保藏号为FERM BP-7838，FERM BP-7839，FERM BP-7840，或FERM BP-8268的杂交瘤所产生的抗体；或
(c)通过结合由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列所组成的多肽，与保藏号为FERM BP-7838，FERM BP-7839，FERM BP-7840，或FERMBP-8268的杂交瘤所产生的抗体竞争的抗体。
(2)一种药物组合物，其包含上述抗体作为活性成分。
本发明的药物组合物包含一种可识别如SEQ ID NO：1所示的介于第180位和第194位氨基酸残基之间的氨基酸序列的抗体。本发明的药物组合物可有效地抵抗至少一种下述的疾病：肿瘤诱导骨软化症，ADHR，XLH，肾性骨营养不良，透析性骨病，骨质疏松症，低磷酸盐血症，佝偻病，骨软化症，肾小管机能障碍，骨量减少，低钙血症，骨延长障碍，骨钙化障碍，甲状旁腺功能亢进症，异位钙化，搔痒，骨硬化，佩吉特氏病，高钙血特发性综合症，甲状旁腺功能减退症，骨痛，肌力下降，骨骼畸形，发育不良，和低1，25D疾病(血液中1，25D低于某一水平的疾病)，并且能用于治疗或预防这些疾病。
该药物组合物包含一种药剂，该药剂利用上述抗体作为活性组分可促进骨的生成。
(3)一种检测成纤维细胞生长因子-23的方法，包括使识别如SEQ ID NO：1所示的介于第25位和第179位氨基酸残基之间的部分氨基酸序列的抗体，和一种可识别如SEQ ID NO：1所示的介于第180位和第251位氨基酸残基之间的部分氨基酸序列的抗体，与测试样品发生反应。
用于上述检测方法中的识别如SEQ ID NO：1所示的介于第180位和第251位氨基酸残基之间的部分氨基酸序列的抗体是一种识别如SEQ ID NO：1所示的介于第180和第196位氨基酸残基之间的氨基酸序列的抗体。此外，本发明的检测方法中也使用了一种凝血酶抑制剂。
(4)一种检测成纤维细胞生长因子-23的试剂盒，它包含识别如SEQ ID NO：1所示介于第25位和第179位氨基酸残基之间的部分氨基酸序列的抗体，和识别如SEQ ID NO：1所示介于第180位和第251位氨基酸残基之间的部分氨基酸序列的抗体。
本发明的试剂盒包含识别如SEQ ID NO：1所示氨基酸残基中的介于第180位和第196位之间的氨基酸序列的抗体，作为识别如SEQ IDNO：1所示氨基酸残基中的介于第180位和第251位之间的部分氨基酸序列的抗体。
(5)一种抗成纤维细胞生长因子-23抗体的结合物质，该物质至少结合一种选自上面的抗体。
(6)一种医疗器具，装备有上述结合物质。本发明提供的这种医疗器具能用于除去血液中的成纤维细胞生长因子-23。
(7)一种药物组合物，该药物组合物包含至少2种如上所述的可识别不同位点的抗体作为活性成分。
本发明的详细介绍如下：
已知FGF-23在致病肿瘤诱导的骨软化症的肿瘤中可高水平地表达。当分泌FGF-23的细胞被实验性地转移进裸鼠的体内时，低磷酸盐血症或者是骨软化症就发生了，它们都是肿瘤诱导的骨软化症的特征疾病。因此，FGF-23被认为是肿瘤诱导骨软化症的一种诱导剂。对产生常染色体显性低磷酸盐血症性佝偻病(ADHR)的基因的单独探索和研究已经展开，ADHR是遗传性低磷酸盐血症的一种模式。因此，FGF-23被认为是其突变可在ADHR病人体内特别观察到的基因。这些结果表明FGF-23是造成低磷酸盐血症的一种致病因素。对FGF-23的生物学活性，在一种对小鼠施用重组体FGF-23的实验中，证明了FGF-23可诱导低磷酸盐血症。基于这些结果，可以假定FGF-23在体内起到了控制磷代谢和骨代谢的体液因子的作用。因此，定量的和定性地评价体内的FGF-23对理解和诊断疾病具有非常重要的意义。而且，期望控制FGF-23的生物学活性不仅能够治愈低磷酸盐血症(上面的描述已经说明了FGF-23与低磷酸盐血症有关)，而且能够控制磷的代谢和骨的代谢，还能够应用到矿物质代谢异常、代谢性骨病等的治疗上。
通过对本发明中的一些术语的说明来对本发明进行详细描述。
在本发明的说明书和附图中的单字母符号通常用于表示氨基酸，其表述如下：(G)甘氨酸，(A)丙氨酸，(V)缬氨酸，(L)亮氨酸，(I)异亮氨酸，(S)丝氨酸，(T)苏氨酸，(D)天门冬氨酸，(E)谷氨酸，(N)天门冬酰胺，(Q)谷氨酰胺，(K)赖氨酸，(R)精氨酸，(C)半胱氨酸，(M)甲硫氨酸，(F)苯基丙氨酸，(Y)酪氨酸，(W)色氨酸，(H)组氨酸，和(P)脯氨酸。另外，单字母符号的意义通常也用于表示DNA的构成物，表述如下：(A)腺嘌呤，(C)胞嘧啶，(G)鸟嘌呤，和(T)胸腺嘧啶。
活性控制磷酸盐(activity controlling phosphate)指的是血液中活性控制磷酸盐浓度。
活性控制维生素D代谢(activity controlling vitamin D metabolism)的是指存在于体内的维生素D和在体内利用维生素D合成的代谢物的绝对水平的变化，或者是指控制维生素D存在率变化的潜能。
1.抗体识别FGF-23
在本发明中所用的人类FGF-23是一种具有如下面描述的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)，并且具有上面所述的特性(活性)的多肽。此外，本发明中的FGF-23和它的一部分包含一种人类FGF-23的衍生物(该衍生物在一级结构方面与天然类型的FGF-23具有基本上相同的氨基酸序列)，和人类FGF-23的衍生物的一部分，只要是在本发明中后面所描述的抗体具有反应活性。
这里，“具有基本上相同氨基酸序列的人类FGF-23衍生物”这一术语指的是一种具有通过替代，缺失和/或修饰一个或几个氨基酸而衍生得到的氨基酸序列的蛋白，条件是该蛋白具有与天然类型的人类FGF-23基本上相同的特性(活性)。而且，多个替代、缺失、修饰和添加可结合使用。人类FGF-23的活性指的是能够诱导类似于上述情况的低磷酸盐血症或骨软化症的活性。
本发明的人类FGF-23可以用本领域已知的方法适当地制备，比如，除基因重组技术外，有化学合成方法，细胞培养方法，或这些方法的改进方法。而且，人类FGF-23的一部分序列也能够利用基因重组技术，或按照如下描述的技术领域中一种已知的方法，如化学合成的方法，或这些方法的改进方法来制备，或者可利用蛋白水解酶适当地切割通过细胞培养方法分离的人类FGF-23的方法来制备。
本发明中的抗体是一种对上面所定义的人类FGF-23或其一部分具有反应活性的抗体，或是这种抗体的一部分。本发明的抗体包括单克隆抗体，该单克隆抗体包含重链和/或轻链，其氨基酸序列通过一个或几个氨基酸的缺失、替代或添加衍生于组成抗体的每一条重链和/或轻链的氨基酸序列，并且可与FGF-23相结合。上面描述的氨基酸的部分变化(缺失，替代，插入和添加)能通过部分改变编码氨基酸序列的核苷酸序列被引入到人类FGF-23的氨基酸序列或本发明的抗体中。用于这些变化的技术对本领域技术人员是已知，并且可使用用于引入突变等的商业化试剂盒。
(1)能特异性识别并能与FGF-23蛋白部分结构结合的抗体
为了获得一种用于测定FGF-23和控制FGF-23的生物学活性的抗体，获得可识别FGF-23结构特征的抗体，对FGF-23有高度的亲和力的抗体，能中和生物活性的抗体等等是有效的。由于FGF-23的结构和抗原性是未知的，所以合成了相应于FGF-23部分序列的许多肽，并且得到了针对每一种肽的抗体。利用这些抗体通过Western印迹法测定了由表达细胞分泌的FGF-23，揭示了表达细胞培养物上清液中除成熟的FGF-23蛋白外，包含大量低分子量的肽，这些肽是由FGF-23蛋白衍生得到的。而且，所获得的抗体表现出了抵抗成熟的FGF-23和由成熟的FGF-23切割产生的肽的各种结合特异性。
此外，利用免疫沉淀方法发现了该抗体在液相中的结合活性。而且，联合使用这些位点特异性抗体使得对从FGF-23中衍生得到的各种各样的肽中检测出具有特定序列区域的肽成为可能。关于FGF-23的修饰和代谢的细节仍然未知。我们通过利用本发明的各种抗体进行检测实验，证明了当FGF-23在CHO细胞中表达时，不仅存在没有信号序列的全长蛋白，而且存在由于第179位精氨酸残基和第180位丝氨酸残基之间切割产生的代谢产物。除此以外，通过采集血浆的血样和含有FGF-23的血清的血样，和检测代谢物的实验，以及将纯化后的重组体与血清混合的实验，我们还揭示了虽然FGF-23在血浆中以全长形式存在，在血清中，FGF-23的第196位精氨酸残基和第197位丙氨酸残基之间会发生切割。这可能是由于凝血酶的原因，切割也在第198位精氨酸和第199位甲硫氨酸之间发生。
(2)抗体的产生
作为例子，通过下面的生产方法可以产生本发明的抗体。具体地说，例如，对一种非人类的哺乳动物，例如产生人抗体的转基因小鼠，利用结合上面定义的人FGF-23或其一部分的产物，或它们与适当的物质(例如，小牛血清白蛋白)的结合复合物进行免疫，来增强抗原以及佐剂(如果需要的话，例如费氏佐剂)的抗原性。或者，通过施用其中掺入了FGF-23的表达载体进行免疫。从免疫动物得到的血清可以得到多克隆抗体。此外，单克隆抗体能够通过下述过程产生：从由被免疫的动物获得的产生抗体的细胞，和不能自身产生抗体的骨髓瘤细胞制备杂交瘤，克隆这些杂交瘤，并且筛选产生对免疫所用抗原有特异亲和性的单克隆抗体的克隆。
更具体地说，单克隆抗体可利用下面描述的方法来进行生产。分泌的单克隆抗体的杂交瘤可通过并按照Khler和Milstein等人的方法(Nature，1975，256卷，495-497)来制备。具体地说，杂交瘤是通过融合如上所述被免疫的动物的脾脏、淋巴结、骨髓、扁桃体，优选淋巴结或脾脏中包含的抗体产生细胞，和不能生产优选来源于哺乳动物，如小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、兔子或者人的抗体的骨髓瘤细胞来制备。筛选产生单克隆抗体的杂交瘤克隆可通过例如在微量滴定平板里培养杂交瘤，在培养物的上清液里检测其对免疫原的反应活性，其中利用酶免疫测定方法，比如酶联免疫特异性测定(ELISA)观察到其生长。
单克隆抗体能从杂交瘤中产生，方法是体外培养杂交瘤并且从培养上清中分离抗体，或体内培养杂交瘤，例如在小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠或者兔子的腹水中进行培养，然后从腹水中分离抗体。
另外，重组抗体可以通过以下方法制备：从一种抗体生产细胞，比如杂交瘤中克隆编码人类单克隆抗体的基因，将该基因整合到合适的载体上，再将载体引入到宿主(例如，哺乳动物细胞系，大肠杆菌，酵母细胞，昆虫细胞和植物细胞)中，然后利用基因重组技术生成抗体(P.J.Delves，抗体生产基本技术，1997 WILEY；P Shepherd和CDean，单克隆抗体，2000年，牛津大学出版社，J.W.Goding，单克隆抗体，原理和应用，1993学术出版社)。而且，利用转基因动物生产技术将一靶抗体基因整合到内源基因上，从而产生转基因牛，山羊，绵羊或猪，然后可由转基因动物的乳汁中大量获得抗体基因衍生出的单克隆抗体。当在体外培养杂交瘤时，可以依照各种各样的条件进行培养，这些条件包括待培养细胞类型的特性，实验和研究的目的，培养方法等等，可以利用已知类型的营养培养基生长、维持和贮藏杂交瘤，所述营养培养基可以用于在培养物上清液中产生单克隆抗体，或是从已知的基本培养基中诱导和制备的任何类型的营养培养基。
关于本发明的多克隆抗体，如实施例5所示，将一种化学合成的FGF-23的部分肽与一种牛甲状腺球蛋白(载体蛋白)相结合，再利用该产物对兔子免疫。然后利用亲和层析柱对这种抗体(该抗体通过免疫接种已诱导其抵抗各种肽的作用)进行纯化，用于免疫接种的肽已经被固定化在层析柱上。这样得到的抗体的特性通过Western印迹法和ELISA方法进行了检测，可以清楚地得到其抵抗FGF-23蛋白的反应活性。
关于制备本发明的单克隆抗体，可以通过两种方法进行免疫接种，如实施例3所示。对这样获得的杂交瘤产生出的单克隆抗体的特性，即，抵抗固定化的FGF-23部分肽的反应活性(如实施例9所示)，在免疫沉淀实验中抵抗FGF-23蛋白的反应活性(如实施例10所示)，进行了测定，以便揭示每一种抗体同FGF-23的结合特性和识别位点的专一性。
2.检测FGF-23的方法
(1)从生物学样品中定量检测和鉴别FGF-23与其代谢产物
在临床试验中，必须对生物学样品中的FGF-23的活性进行精确测定。然而，由FGF-23生成的FGF-23蛋白的切割或由血样制备的FGF-23蛋白的切割产生的片段化产物(这些我们已经观察到)，可能是妨碍FGF-23的测定的因素。具体地说，我们的试验已表明，如SEQ ID NO：1所示的介于第179位和第180位氨基酸残基之间的切割导致了活性的丧失。因此，为了检测在生物学样品中具有活性的FGF-23，利用一种可识别如SEQ ID NO：1所示的介于第25位和第179位氨基酸残基之间的部分氨基酸序列的抗体和一种可识别如SEQ IDNO：1所示的介于第180位和第251位氨基酸残基之间的氨基酸序列的抗体的组合的夹心式(sandwich)ELISA方法是有效的。这种检测方法能够通过将2C3B抗体或2C5L抗体(我们已经得到了这种N-末端识别抗体)与3C1E抗体或1D6A抗体(C-末端识别抗体)相结合来进行(见图5)。而且，当利用血清样品制备血样时，存在于血中的全长FGF-23在介于第196位和第197位氨基酸残基之间或介于第198位和第199位氨基酸残基之间的位置可能发生切割。在这一情况下，当使用一种可识别位于C-末端上的第197位和该位置后的氨基酸残基部分的抗体时，利用这种方法不能对反映存在于血液中的这种蛋白的原始量进行测定。由于即使使用了血清样品，在血浆中也不能观察到这种切割(见实施例26)，而如利用我们所得到的可以识别处于第180位和第196位氨基酸残基之间的一个位点的3C1E抗体，作为识别C-末端的抗体，可以使得测定反映存在于血液中的蛋白的原始量的方法成为可能。
另外，在制备一个血清样品时，凝血酶被证明是一种可以切割FGF-23的酶(见实施例17)。因此，在制备血清样品时，通过加入凝血酶抑制剂，可避免检测中的FGF-23的切割产生的效果，使得抑制伴随血清样品的制备的FGF-23的大部分切割是可能的。凝血酶抑制剂可以是任何不妨碍FGF-23检测的物质，并且优选是水蛭素。
而且，本申请涉及检测FGF-23的试剂盒，该试剂盒含有一种可识别如SEQ ID NO：1所示的介于第25位和第179位氨基酸残基之间的氨基酸序列的一部分的抗体和一种可识别如SEQ ID NO：1所示的介于第180位和第251位氨基酸残基之间的氨基酸序列的一部分的抗体。本申请中检测FGF-23的试剂盒中除了包括抗FGF-23抗体之外，如有必要的话，还可包括稳定剂、pH调节剂等。
(2)高灵敏度检测FGF-23的方法
阐明FGF-23的体内作用和发病率之间的关系在临床上是有意义的，并且对肿瘤诱导骨软化症的差异诊断和遗传性低磷酸盐血症佝偻病(ADHR，XLH：性连遗传型低磷酸盐血症佝偻病)的诊断也是有意义的。低磷酸盐血症，佝偻病，和骨软化症，对已证实没有营养不良和家族病史的病人来说，是不能够确定病因的疾病，因此对该疾病的诊断在目前很困难。只有检测到上述患者血液中FGF-23的浓度升高时，才有可能基于基因突变的确认，通过遗传性疾病的差异诊断，或者利用一种检测肿瘤的详细方法来发现肿瘤，使拟定治疗肿瘤诱导的骨软化症的治疗方案成为可能。而且，由于FGF-23作为一种控制磷代谢的因子和/或控制维生素D代谢的因子可能与生物功能紧密相关，因此认为血液浓度在矿物质代谢异常，肾功能障碍，骨代谢疾病等的病症中是波动的。因此，将健康的成年人血液中FGF-23浓度的平均值同患有上述疾病的患者体内血液中FGF-23浓度的平均值相比，对于我们了解发病原因，选择治疗方法，和确定治疗方案是有意义的。为了构建这样一种FGF-23的测定系统，需要能够对血液中FGF-23浓度进行检测的检测灵敏度。我们已经利用夹心式ELISA方法检测了我们所得到的各种各样的抗体组合，使得我们能够定量测定健康的人体血液中和患有上述疾病的患者的血液中的FGF-23的浓度。
利用抗体检测能够被抗体识别的物质(指的是一种抗原分子)的方法的实例，包括利用抗体与抗原分子相结合来采集达到可检测数量的底物的方法，通过检测与待测抗原分子特异性结合的抗体来检测抗原分子存在的方法，和通过检测待测抗原分子与已知数量的底物和抗体特异性结合之间的竞争来测定抗原分子的存在的方法。利用Western印迹方法，免疫沉淀方法，和免疫染色法可进行定性测定。而且，已知的定量检测方法的实例包括放射免疫法，ELISA法，荧光激活细胞分类法(FACS)等。当被修饰或切割时，被抗体识别的抗原可以为多种形式。作为一种包括使其中的一部分形式专一化的检测方法，将可识别靶物质不同位点的抗体进行组合是有效的。这种方法的代表性例子是夹心式ELISA法。
基于本发明检测FGF-23的方法的完成，在图1A中明确地表示了由于FGF-23蛋白的切割而导致产生许多分子物种(species)。尤其是，实施例16所示表明，FGF-23在血液中以全长蛋白的形式存在，而在血清中被切割。正因为如此，考虑到这种切割，为了在体内定量和精确地检测FGF-23，有必要发展一种检测系统。为达到这一目的，组合使用可识别FGF-23蛋白部分序列的上述抗体被证明非常有用。关于利用多克隆抗体的ELISA技术，如实施例7所示，表明FGF-23蛋白和其已切割的片段是可以选择性地测定的。另外，关于实施例3和实施例4中得到的抗FGF-23的单克隆抗体，其对FGF-23蛋白上的识别位点的专一性被分析了，证明了其与FGF-23结合的特性可应用于夹心式ELISA技术。实验揭示了在获得的抗体中，1D6A抗体，2C3B抗体，和3C1E抗体均可独立作为固定化的抗体，并也能被当作检测用的抗体。另一方面，2A2B抗体不适于任何这样的用途。而且，实验表明，在体内和在制备血清时FGF-23蛋白均可被切割。通过组合使用可分别识别如SEQ ID NO：1所示的FGF-23蛋白中的介于第25位和第179位氨基酸之间的一段序列的抗体，识别介于第180位和第196位氨基酸之间的一段序列的抗体，和识别介于第197位和第251位氨基酸之间的一段序列的抗体，可以实现FGF-23蛋白的代谢物的检测和测定。在本发明的抗体中，2C3B抗体可识别如SEQ IDNO：1所示的FGF-23蛋白中的介于第25位和第179位氨基酸之间的一段序列，3C1E抗体可识别如SEQ ID NO：1所示的介于第180位和第196位氨基酸之间的一段序列。1D6A抗体可识别如SEQ ID NO：1所示的介于第237位和第251位氨基酸之间的一段序列。需要特别指出的是，为了临床实验等目的而检测具有活性的FGF-23蛋白，根据制备血清时出现的切割现象，最好使用可识别介于第25位和第179位氨基酸之间的一段序列的抗体和可识别介于第180位和第196位氨基酸之间的一段序列的抗体的组合。特别地，利用2C3B抗体或者2C5L抗体作为固定化抗体，用3C1E作为检测抗体，可以实现高灵敏度的检测系统。而且，为了检测全长FGF-23蛋白，最好使用可识别介于第25位和第179位氨基酸之间的一段序列的抗体和可识别介于第237位和第251位氨基酸之间的一段序列的抗体的组合。尤其是，利用2C3B抗体作为固定化抗体，1D6A抗体作为检测抗体，可实现高灵敏度的检测系统。
3.低磷酸盐血症，佝偻病和骨软化症的诊断方法
已有人提出，在ADHR病人中，FGF-23基因的错义突变参与了低磷酸盐血症的诱导(ADHR协会，常染色体显性的低磷酸盐血症佝偻病与FGF23突变有关，Nature Genet.26：345-348，2000)。另外，我们已经鉴定FGF-23是一种疾病诱导因子，从而在肿瘤诱导的骨软化症中会产生肿瘤(Shimada T，Mizutani S，Muto T，Yoneya T，Hino R，Takeda S，Takeuchi Y，Fujita T，Fukumoto S，和Yamashita T.，对作为肿瘤诱导的骨软化症的致病因子的FGF23的克隆与表征，美国国家科学院院刊，98：6500-6505，2001)。这些研究表明FGF-23可能参与了低磷酸盐血症、佝偻病和骨软化症伴随的疾病。但是，尚未有在活的生物体中定量分析FGF-23的方法。在本发明中，我们已经建立了如上所述的特异性FGF-23检测系统。如实施例19中所示利用这种系统，可以定量测定肿瘤切除之前和肿瘤切除后从患有肿瘤诱导的骨软化症的患者中采集到的血样中所含的FGF-23。如图14B所显示的，虽然手术前表现出明显高的血液FGF-23水平，但是肿瘤切除之后，血液中FGF-23的浓度降低至近检测极限值。在肿瘤诱导的骨软化症中，肿瘤一般较小，虽然诸如低磷酸盐血症，肌力下降，骨痛，或者骨软化症的病症显现出来，但是没有发现致病性肿瘤。除此之外，当肿瘤被观察到时，不可能确定肿瘤是否产生FGF-23，以至于区分肿瘤诱导的骨软化症和表现出相似症状的其它血磷酸盐过少疾病的诊断是非常困难的。本发明中的测定方法使得从肿瘤诱导的骨软化症患者的血液中检测出FGF-23的增长值成为可能，因此就能够对一些用传统方法检测不出来的疾病进行诊断。
XLH，一种在遗传性低磷酸盐血症患者中发病率最高的疾病，据说每两万人中就有大约1例。造成XLH疾病的基因被鉴定为PHEX基因。该基因包含22个外显子，基因区跨越220个kb，使得目前分析导致这种遗传性低磷酸盐血症的突变来用于诊断的目的还不可能。该疾病发生突然，并且以在成人中发病为特征的类型已经有过报道。迄今为止，PHEX基因和FGF-23的关系尚未澄清。一种Hyp小鼠是已知的，它是一种自发性突变的小鼠，可作为XLH的模型动物。在这种小鼠中，已证实PHEX基因的3’区缺失，并且已知该小鼠会发展成低磷酸盐血症，佝偻病或骨软化症。利用本发明中的测定系统，如实施例23所示，我们测定了Hyp小鼠中FGF-23的血液浓度，发现其中FGF-23的浓度非常高。
相应于此，本发明的抗体，和利用该抗体的检测方法或测定方法使得能够诊断肿瘤诱导的骨软化症和XLH。另外，应该考虑本发明中的测定方法也可用于ADHR，该疾病是低磷酸盐血症的另一种形式，可能是由于FGF-23中的变异引起。
FGF-23具有降低血液中的磷浓度和1，25D浓度的活性。但是，其生理作用尚未得到很好的解释。通过后面所述的中和FGF-23活性的实验，我们发现，即使是在正常的情况下，FGF-23在维持磷或1，25D的代谢平衡中发挥了重要的作用。因此，FGF-23可能参与了磷代谢，并参与了肾脏疾病、肠道疾病、矿物质代谢紊乱和维生素D代谢异常的疾病的发生，这些疾病与磷代谢密切相关。而且，给病人施用1，25D或它的一种衍生物，FGF-23的波动可能影响发病和治疗效果。本发明中的测定系统被认为可以加深人们对于这些疾病发病的理解并完成了更为精确的医疗实践。
4.以抑制FGF-23活性为特征的疾病治疗方法
已知，在肿瘤诱导的骨软化症和ADHR中，FGF-23的过度作用诱导了这些疾病。另外，在本发明中，我们也揭示了在XLH疾病中，血液中具有高水平的FGF-23。人们认为抑制FGF-23可改善低磷酸盐血症，佝偻病和骨软化症。根据FGF-23作用于肾脏的近端小管的上皮细胞的事实，抑制FGF-23可能对治疗肾小管功能紊乱有意义。另外，根据FGF-23在控制磷代谢和维生素D代谢中的作用，FGF-23在与磷代谢异常有关的疾病，与钙代谢异常有关的疾病，与骨代谢异常有关的疾病，伴随肾功能下降的代谢异常疾病，伴随着给肾衰竭病人进行血液透析时的代谢异常疾病，和伴随肾移植过程的疾病中可能发挥了不利的作用。与此类似，有报道说低磷酸盐血症在肾移植后有高发病率，该疾病伴随着骨量减少的症状，表明FGF-23也在其中发挥了作用。在这些病例中，不但要将FGF-23从异常提高的水平恢复至正常水平，还需要进一步降低正常值的FGF-23作为药理治疗手段。我们认为实施例27和实施例28中所显示能够中和或者是修饰FGF-23活性的抗体对治疗各种疾病是具有重要意义的。如实施例25所示，我们发现由于肾功能的下降而出现高磷酸盐血症的动物具有明显高的FGF-23水平。据认为伴随着肾功能下降的维生素D代谢异常疾病至少一部分是由于FGF-23水平升高引起的。另外我们也认为伴随FGF-23水平异常升高的疾病能够利用本发明的抗体通过中和或除去FGF-23的活性来治疗。需要指出的是，由于磷的代谢，钙的代谢，和维生素D的代谢通过利用本发明的抗体进行了改善，这些抗体在抵抗伴随着矿物质代谢异常的疾病，例如低血钙症，甲状旁腺功能亢进，异位钙化，和搔痒，或者是伴随着肾功能下降的骨代谢异常疾病，例如肾性骨营养不良，和透析性骨病方面可能是有疗效的。而且，利用本发明的抗体在治疗伴随着钙化的心血管机能减退疾病(该疾病是困扰血液透析病人的疾病)方面也可能是有疗效的。此外，如实施例27所示，揭示了即使在正常的代谢条件下，FGF-23在矿物质代谢和维生素D代谢中也发挥了非常重要的作用。考虑到FGF-23不仅可诱导高磷酸盐血症的事实，而且考虑到FGF-23可以快速的降低1，25D和通过1，25D可快速诱导FGF-23的事实，本发明的能中和或修饰FGF-23活性的抗体在抵抗矿物质代谢异常的疾病方面可能得到广泛的应用。这是因为该抗体通过抑制FGF-23的作用不仅控制磷的代谢，维生素D的代谢和钙的代谢，而且间接地控制用于钙代谢的激素，例如甲状旁腺激素和降血钙素。尤其是，本发明的抗体有望在治疗有与矿物质代谢和代谢转换平衡有关各种各样的发病形式的骨质疏松症、骨量减少症、骨硬化症或佩吉特氏病中发挥作用。正如上面所描述的那样，本发明的抗体可抵抗上面所述的一种或多种疾病。
5.中和FGF-23生物学活性的抗体
如上面所描述的那样，FGF-23被认为具有控制活体代谢的重要作用。控制这样的因子的生物学活性的方法对于治疗和预防各种疾病是有意义的。抗体的特征在于可与抗原分子特异性结合，并已知依赖于其识别位点，其对抗原分子结构和功能有影响。因此，我们以分离和鉴定一种可控制FGF-23功能，特别是，能够抑制FGF-23的生物学活性的抗体为目标。如实施例27和实施例28所示，我们已经发现将一种可识别FGF-23的抗体进行给药后导致了血清中磷的浓度和血清中1，25D浓度的升高。特别是，在这些实施例中使用的本发明的抗体导致人类FGF-23的降低血清磷和1，25D的活性完全消失，所述人类FGF-23是在小鼠体内实验性地产生的。另外，在还没有产生人类FGF-23的对照小鼠中，证实了血清中的磷和维生素D的水平升高。这一现象与施用FGF-23时观察到的变化完全相反。因此，本发明的这种抗体也被认为能抑制小鼠的内源性FGF-23。另外，这一现象表明，FGF-23作为控制磷代谢和维生素D代谢的因子，不仅在致病状态中，而且在正常状态中可以起作用。本发明的具有能导致FGF-23的生物学活性消失或弱化的抗体能控制生理学状况和病理学病症，这些病症是FGF-23生物学活性的反应。本发明的抗体能够控制的FGF-23生物学活性的范围不仅仅局限于磷代谢和维生素D的代谢。该抗体能控制FGF-23的每一种生物学活性和生理学活性。
此外，如实施例31所示，可利用识别FGF-23不同位点的两种或多种类型的抗体，即不同的抗原决定部位。在这一情况下，抗体的中和活性被提高了，这样抗体的作用时间也能够维持一段较长的时间。两种或多种类型抗体组合的实例，包括可识别如SEQ ID NO：1所示的介于第180位和第194位或介于第237位和第251位氨基酸残基之间的氨基酸序列的抗体，和通过杂交瘤产生的抗体，所述杂交瘤的保藏号是FERM BP-7838，FERM BP-7839，FERM BP-7840，或FERMBP-8268。
6.包含抗FGF-23抗体的药物组合物
本发明的抗体或者是药物组合物能应用于由FGF-23在体内产生的或涉及细胞表达FGF-23的各种疾病或症状的治疗或预防上。本发明的抗体能用于抵抗肿瘤诱导的骨软化症、ADHR和XLH的药物组合物，并且可望在改善一般在低磷酸盐血症，骨钙化功能障碍，骨痛，肌力下降，骨骼畸形，发育不良，和低1，25D症(血液中1，25D水平低)等疾病中观察到的病症方面起作用。正如上面所描述的，FGF-23在生理状况方面发挥了重要的作用。本发明的抗体能作为一种用于治疗和预防由矿物质或维生素D代谢异常引起的疾病(例如骨质疏松症，佝偻病，高钙血特发性综合症，低钙血症，异位钙化，骨硬化，骨生长障碍，骨钙化机能障碍，佩吉特氏病，甲状旁腺功能亢进症，甲状旁腺功能减退症，和搔痒)的药物组合物，所述治疗和预防是通过控制FGF-23的磷代谢控制作用，或由FGF-23控制的由维生素D的代谢介导的钙代谢控制作用而实现的。而且，对患有肾功能衰竭的患者来说，其血液中FGF-23的浓度升高是明确的。因此，本发明的抗体能作为药物组合物用于治疗和预防肾功能衰竭或血液透析的并发症，该并发症表现为肾性骨营养不良、透析性骨病、肾小管机能障碍等。
另外，本发明的抗体结合一种治疗剂后能用作药物组合物。在肿瘤诱导的骨软化症中，已知由于肿瘤过多地产生FGF-23，诱发病症。目前，唯一的治疗方法包括除掉致病肿瘤。然而，致病肿瘤通常很小。已经有许多研究报道了致病肿瘤最终被高能磁共振成像(MRI)搜索发现的实例。除此以外，还可能有许多因为没有发现肿瘤，而未知致病原因的低磷酸盐血症或骨软化症的诊断实例。本发明的抗体被认为能在这样的疾病中在产生FGF-23的肿瘤中积累，这是由于与FGF-23的亲和性。作为一种利用上述特性来退变(degenerating)肿瘤的方法，将治疗剂同本发明的抗体相结合是有效的。能与抗体结合的治疗剂的示例有(1)放射性同位素，例如碘(131碘：131I；125碘：125I)，钇(90钇：90Y)，铟(111铟：111In)，和锝(99m锝：99mTc)(J.W.Goding，单克隆抗体：原理和应用，1993学术出版社)，(2)细菌毒素，例如假单胞菌毒素(假单胞菌外毒素)、白喉毒素和蓖麻毒素，和(3)化学治疗剂，例如氨甲蝶呤、丝裂霉素和加利车霉素(calicheamicin)(D.J.King，单克隆抗体应用和工程化，1998 T.J.International Ltd，M.L.Grossbard.，基于单克隆抗体治疗癌症，1998 Marcel Dekker Inc)。更优选地，药物前体，例如美登木素生物碱是比较好的选择(Chari et al.，Cancer Res.，1992 52卷，Liu等，美国国家科学院院刊，1996，193卷：8681)。
此外，本发明的范围也包括一种药物制剂，其包含抗人类FGF-23抗体的纯化产物。这样的药物制剂除了包含抗体外，优选包含生理学相容的稀释剂或载体，并且可以是混合了其它抗体或者是其它药物(例如抗菌素)的产品。合适载体的例子包括，但不局限于，生理盐水，磷酸盐缓冲盐水，磷酸盐缓冲盐水葡萄糖溶液，和缓冲生理盐水。抗体可以冷冻并干燥(冷冻干燥)，如果需要，上述的缓冲含水溶液可以加到抗体中，这样可以重建和利用该抗体。服药的方法可以是口服或者是非肠道吸收给药方法，包括静脉、肌肉、皮下和腹膜注射或者是药物递送。
当利用本发明的药物组合物对病人进行给药时，每次给药的有效剂量可以选自每千克体重施用介于20ng和200mg之间的剂量。或者，每位病人按体重施用剂量介于0.001到10000mg之间，优选0.005到2000mg之间，更优选0.01至1000mg之间。然而，本发明的药物组合物的剂量并不局限于上述剂量。
7.包含抗FGF-23抗体的医疗器具(medical appliance)
在血液透析、血浆交换和细胞采集这样的医疗技术中，将活体中的物质从一部分采集到的体液或参与体外循环的体液中除掉、交换、采集。在这样的医疗技术中，可利用本发明的抗体特异性结合FGF-23分子的特性，选择性地除掉活体中的FGF-23分子并选择性地采集表达FGF-23的细胞。在血液透析和血浆交换中，有潜力的治疗方法包括将本发明的抗体固定到与体液接触的部分物质上。作为透析膜的材料，除了纤维素膜以外，合成的聚合物膜，例如聚丙烯腈膜，聚甲基丙烯酸甲酯膜，聚乙烯-乙烯醇膜，聚砜膜，聚酰胺膜，聚醚砜/聚多芳基化合物膜等都可作为血液透析膜使用。对于这样的膜，将抗体通过共价键固定在膜上后，可用于血液透析。而且，可以用填充有结合了抗体的珠子(例如琼脂糖凝胶珠)的柱子分离体液。此外，另一种可能的方法包括将抗体固定在磁性珠上，将该抗体和抗体结合分子混合以提高其结合力，然后利用磁铁收集抗体和靶物质的复合物。利用这样的方法收集到了细胞并且可用于治疗。如上面描述的那样，结合在基物上的本发明的抗体(所述基物适于作为医疗装置)可作为医疗器具。
8.控制FGF-23分子结构和生物学活性的方法
在体内保持蛋白的生物学活性的重要一点是允许该蛋白在体内维持其三维结构。在生物学因子当中，正像实施例中针对胰岛素样生长因子(IGF)或者是转化生长因子β(TGF-β)观察到的那样，有许多这样的例子：一种生物学因子在体内与另一种蛋白相结合以控制生物学活性。对FGF-23来说，没有已知的结合蛋白。本发明抗体的实例包括2C3B抗体，如实施例9所示，该抗体被认为不用与部分肽结合，就可强烈识别FGF-23的结构。因此可以设想能够通过创造一种这些抗体或抗体的一部分结合到FGF-23上的状态，来控制体内FGF-23的生物学活性。
9.有效除去FGF-23的方法
肾功能显著下降要求从体内除去尿毒症物质。对于除掉低分子量的尿毒症物质，在临床上是利用透析膜来进行血液透析。然而，除掉高分子量的蛋白在临床上仍是一个问题。本发明的抗体能够用于专一性的除去FGF-23。和做血液透析一样，将体外循环的血液与一种材料接触，所述材料已固定了本发明的抗体，这样FGF-23就能被选择性的除掉。将该抗体作为一种用于治疗FGF-23过量存在的疾病的工具是可行的。如实施例25所示，基于当肾功能衰竭时FGF-23呈现高水平的事实，FGF-23可能是一种诱导透析性并发症的因素。需要特别指出的是，由于FGF-23具有降低1，25D的作用，这样FGF-23就非常有可能是诱导1，25D随肾功能下降而降低的因子。因此，利用本发明的抗体去除透析病人的FGF-23的方法可用于透析性并发症的治疗。
如上面描述的那样，我们通过获得不仅能识别FGF-23，而且能控制涉及FGF-23的生理学作用、药理学作用和病理学作用的抗体而完成了本发明，并且所述抗体能用于治疗，预防，和诊断疾病。
10.竞争性抗体的说明
在结合FGF-23方面，可识别与本发明的抗体所识别的位点相同的位点，或者与该位点非常接近的位点的抗体被认为显示与本文所示特性等同的特性。这样一种基本上等同的抗体能通过进行与竞争性相关的试验来和其它的抗体相区别。当允许2种或多种抗体共存时，显示与抗原的结合时相互专一结合的特性的抗体被定义为竞争性抗体。为了明确本发明的竞争性抗体，在被标记的本发明的抗体与FGF-23蛋白结合的条件下，使未作标记的抗体过量存在，这样就能进行测定。当加入的抗体显著地降低了本发明的抗体与FGF-23蛋白的结合时，就能够确定加入的抗体同本发明的抗体竞争。
本说明书包括了日本专利申请第2001-401689号和第2002-262020号的说明书和/或附图中公开的部分或全部内容，上述两项申请是本申请的优先权文本。
附图简述
图1A表明了利用抗FGF-23的多克隆抗体通过Western印迹法对重组体FGF-23蛋白和其代谢产物的测定结果，该多克隆抗体利用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)经过分离CHO-FGF23H细胞培养物的上清液得到。在培养物的上清液中，提供了由在SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列中的介于第179位和第180位氨基酸残基之间的切割产生的全长FGF-23H蛋白，和N-末端片段和C-末端片段。利用hFGF23-48抗体和hFGF23-148抗体对全长FGF-23H蛋白和N-末端片段肽进行了识别。对于N-末端片段，观察到了小片段肽的存在。对全长蛋白和N-末端片段利用抗6组氨酸标记的抗体(anti-His6-tag抗体)进行了测定。(实施例2)
图1B表明了从CHO-FGF-23细胞培养物的上清液中纯化出的全长FGF-23蛋白，N-末端片段和C-末端片段，CHO-FGF-23的细胞培养物上清液利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后通过考马斯亮蓝(CBB)染色后所得到的测定结果。
图1C表明了利用一种抗FGF 23-148抗体通过Western印迹法对一种重组体FGF-23蛋白，一种重组体FGF-23RQ蛋白，和其代谢产物的测定结果，这种抗FGF 23-148抗体是先通过分离CHO-FGF-23H细胞和CHO-FGF-23RQ细胞的培养物上清液，然后再利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离细胞得到的。(实施例5)
图2表明了利用一种hFGF23-25抗体作为固定化抗体，和一种hFGF23-237作为检测抗体(这种检测抗体是抗FGF-23的多克隆抗体)通过夹心式ELISA法对FGF-23H蛋白进行测定后所得的结果。
(实施例7)
图3表明了利用抗FGF-23的单克隆抗体免疫沉淀FGF-23H蛋白后，利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离该蛋白，然后利用2A2B抗体和1C3H抗体对该蛋白进行检测的结果。(实施例10)
图4表明了利用抗FGF-23单克隆抗体作为固定化抗体和抗FGF-23多克隆抗体作为检测抗体通过夹心式ELISA法对纯化后的FGF-23H全长蛋白，N-末端多肽片段和C-末端多肽片段的测定结果。(实施例11)
图5概略性的表明了全长FGF-23蛋白和其切割点，和抗FGF-23的单克隆抗体的识别位点。(实施例12)
图6表明了利用2C3B抗体作为一种固定化的抗体和1C3H，1D6A，和3C1E抗体作为检测抗体通过ELISA系统对纯化后的FGF-23蛋白进行定量检测得到的结果。(实施例13)
图7表示了用固定了1C3H，1D6A，和2C3B抗体的树脂将CHO-FGF23H细胞转移至裸鼠体中，从该裸鼠中采集血清，通过免疫沉淀方法从血清中采集了FGF-23H蛋白，然后通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离该蛋白，最后利用2A2B和1C3H抗体对蛋白进行检测的结果。(实施例15)
图8表明了向20ng纯化后的FGF-23蛋白中加入大鼠的血清，获得了最终浓度为50％的混合溶液，混合该溶液，然后利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离经过0，0.5，1，2，4，8，或24小时培育后的代谢产物，利用2A2B抗体对该代谢产物进行Western印迹法测定的结果。(实施例16)
图9表明了向20ng纯化后的FGF-23蛋白中加入人类的血清或人类的血浆，获得了最终浓度为50％的混合溶液，将该混合溶液在37℃的环境中培育3小时，然后利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离培养物，利用2A2B抗体对该分离物进行Western印迹法测定的结果。
(实施例16)
图10表明了向20ng纯化后的FGF-23蛋白中加入凝血酶，获得了最终浓度为1单位/毫升的混合溶液，将该混合溶液在37℃的环境中培育3小时，然后利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳对培育物进行分离，利用2A2B抗体对该分离物进行Western印迹法测定的结果。(实施例17)
图11表明了向20ng纯化后的FGF-23蛋白中在添加有或未添加水蛭素(一种凝血酶选择性抑制剂)的条件下加入大鼠的血清，获得了一种最终浓度为50％的混合溶液，将该混合溶液培育4小时，然后利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳对培育物进行分离，利用2A2B抗体对该分离物进行Western印迹法测定的结果。(实施例17)
图12表明了将10μg纯化后的FGF-23蛋白和大鼠血清混合24小时以产生22kDa(一种分子量单位，为千道尔顿)的多肽，利用抗2A2B抗体柱纯化这种22kDa多肽，然后利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳对纯化后的产物进行分离，再通过CBB染色法进行鉴别的结果。(实施例18)
图13表明了利用ELISA系统(该系统利用2C3B抗体作为固定化抗体，和3C1E抗体或者是1D6A抗体作为检测抗体来进行检测)测定的血液样品中FGF-23蛋白的测定结果，该蛋白采集自患有肿瘤性骨软化症的病人体内中的致病性肿瘤提取前和提取后的血样。(实施例19)
图14表明了对血液样品中FGF-23蛋白的定量测定结果，该蛋白采集自患有肿瘤性骨软化症的病人体内中的致病性肿瘤提取前和提取后的血样。(实施例19)
图15表明了利用免疫组织学染色法测定的肿瘤组织中在FGF-23蛋白存在时的结果，该肿瘤组织采集自患有肿瘤性骨软化症的患者。
(实施例20)
图16A表明了利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离纯化后的小鼠FGF-23RQ蛋白，然后利用3C1E抗体(该抗体是一种抗人类FGF-23的单克隆抗体)通过Western印迹法对小鼠的FGF-23RQ蛋白进行了测定的结果。(实施例22)
图16B表明了利用2C3B抗体作为一种固定化抗体和3C1E抗体作为一种检测抗体来测定纯化后的小鼠FGF-23蛋白经连续稀释后的溶液的结果。(实施例22)
图17表明了利用2C3B抗体作为一种固定化抗体，和3C1E抗体作为一种检测抗体通过ELISA系统对血清中内生性FGF-23蛋白进行测定的结果，该血清采集自27周至30周大的Hyp小鼠和对照小鼠。
(实施例23)
图18A表明了给6个6周大的BALB/c雄性小鼠进行给药，剂量为每只小鼠5μg经纯化后的FGF-23蛋白，然后分别采集给药1，4，和9小时后的血清，图18A表明了对血清中1，25D浓度的测定结果。
(实施例24)
图18B表明了给6个6周大的BALB/c雄性小鼠通过腹腔进行给药，剂量为每只小鼠0.025μg的1，25D，然后采集给药8小时后的血样，图18B表明了对血清中FGF-23的定量测定结果。(实施例24)
图19A表明了给7周大的的威斯塔氏小鼠服用以0.75％的一种比例混合了腺嘌呤的CE-2(日本CLEA公司)，这样可在威斯塔氏小鼠体中产生一种肾功能衰竭性高磷酸盐血症模式，给一对照组威斯塔氏小鼠只服用CE-2(未混合腺嘌呤)。在给小鼠服用混合了腺嘌呤的药剂3周之后，采集小鼠血样后的血清中磷酸盐浓度的测定结果。(实施例25)
图19B表明了给7周大的威斯塔氏小鼠服用以0.75％的一种比例混合了腺嘌呤的CE-2(日本CLEA公司)，这样可在威斯塔氏小鼠体中产生一种肾功能衰竭性高磷酸盐血症模式，给一对照组威斯塔氏小鼠只服用CE-2(未混合腺嘌呤)。在给小鼠服用混合了腺嘌呤的药剂3周之后，采集血样和尿样(血样采集完后，将小鼠饲养在代谢性的笼子中，采集尿样进行24小时)，图19B表明了对血清中和尿中脲肌酸酐浓度的测定结果。(实施例25)
图19C表明了给7周大的威斯塔氏小鼠服用以0.75％的一种比例混合了腺嘌呤的CE-2(日本CLEA公司)，这样可在威斯塔氏小鼠体中产生一种肾功能衰竭性高磷酸盐血症模式，给一对照组威斯塔氏小鼠只服用CE-2。在给小鼠服用混合了腺嘌呤的药剂3周之后，采集小鼠血样，然后利用2C3B抗体作为一种固定化抗体，和3C1E抗体作为一种检测抗体通过ELISA系统对血清中的FGF-23浓度进行了测定的结果。(实施例25)
图20表明了利用免疫沉淀方法对FGF-23蛋白的测定结果，该蛋白存在于患有肿瘤性骨软化症的病人体内的血浆中。(实施例26)
图21A表明了在接种各种单克隆抗体和一种载体24小时后，对血清中磷酸盐，钙，和1α，25-二羟基维生素D的浓度进行测定的结果。(实施例27)
图21B表明了在接种3C1E单克隆抗体和一种载体8小时后，对血清中1α，25-二羟基维生素D的浓度进行测定的结果。(实施例28)
图22A表明了在一组服用混合腺嘌呤(腺嘌呤组)的药剂和一组服用一般的药剂(对照组)之后第7天对血清中1α，25-二羟基维生素D的浓度进行测定的结果。测定结果利用平均值+/-标准偏差来表示。“*”和“**”分别表示p＜0.05和p＜0.01，上述内容均为通过Student-t(一种统计学方法)进行显著性测定的结果。(实施例29)
图22B表明了在一组服用混合腺嘌呤(腺嘌呤组)的药剂和一组服用一般的药剂(对照组)之后第7天对血清中FGF-23的浓度进行测定的结果。测定结果利用平均值+/-标准偏差来表示。“*”和“**”分别表示p＜0.05和p＜0.01，上述内容均为通过Student-t进行显著性测定的结果。(实施例29)
图22C是两种浓度的关系图，两种浓度分别为服用混合了已给出的腺嘌呤(腺嘌呤组)药剂之后第7天测定的血清中FGF-23的浓度和1α，25-二羟基维生素D的浓度，该图是通过个体小鼠的测定数据得到的。(实施例29)
图22D表明在一组服用混合腺嘌呤(腺嘌呤组)的药剂和一组服用一般的药剂(对照组)之后第7天，在接种3C1E抗体或一种载体，12小时之后测得的血清中1α，25-二羟基维生素D的浓度变化情况。测定结果利用平均值+/-标准偏差来表示。“*”和“**”分别表示p＜0.05和p＜0.01，上述内容均为通过Student-t进行显著性测定的结果。(实施例29)
图23显示了患有性连遗传型低磷酸盐血症的6位病人的性别，已鉴定的phex基因的突变位点，被采集患者的年龄，和血清的FGF-23的浓度。(实施例30)
图24显示给正常小鼠接种2种抗体(2C3B抗体和3C1E抗体)的混合物或一种载体(PBS)之后第1天和第2天对血清中的磷酸盐浓度。测定值用平均值+/-标准偏差来表示。“*”和“**”分别表示p＜0.05和p＜0.01，上述内容均为通过Student-t进行显著性测定的结果，上述结果与只给服用载体的组的测定结果进行了比较。“a”和“b”分别表示p＜0.05和p＜0.01，上述内容为通过Student-t进行显著性测定的结果。(实施例31)
图25A显示的是给野生型小鼠(WT)和Hyp小鼠(Hyp)重复接种包含有2C3B抗体和3C1E抗体的抗体(Ab)的混合物，或一种载体(PBS)后的第1天和第7天对血液中磷酸盐浓度，1α，25-二羟基维生素D的浓度，和碱性磷酸酶总活性。血液中磷的浓度和碱性磷酸酶的活性值测定结果用平均值+/-标准偏差来表示。“*”和“**”分别表示p＜0.01和p＜0.001，上述内容为通过Student-t进行显著性测定的结果。血液中1α，25-二羟基维生素D的浓度通过混合体积相同的从每一组小鼠中采集的血浆样品而制得的血浆进行测定。(实施例32)
图25B显示的是给野生型小鼠(WT)和Hyp小鼠(Hyp)用包含有2C3B抗体和3C1E抗体的混合物的抗体(Ab)，或一种载体(PBS)进行一次接种后的第4天对血液中磷酸盐浓度和1α，25-二羟基维生素D的浓度进行测定的结果。测定结果用平均值+/-标准偏差来表示。“*”和“**”分别表示p＜0.01和p＜0.001，上述内容为通过Student-t进行显著性测定的结果。(实施例32)
图25C显示的是用Wester印迹法分析从肾脏中制得的肾近位细管刷状缘膜囊(BBMV)中的NaPi2a蛋白的表达量的结果(上面)，和给野生型小鼠(WT)和Hyp小鼠(Hyp)用包含有2C3B抗体和3C1E抗体的混和抗体(Ab)，或一种载体(PBS)进行一次接种之后的第4天对磷酸盐转移活性测定的结果(下面)。利用测试来校正BBMV的蛋白水平，用于Western印迹法CBB染色，染色后β-肌动蛋白的影像同时显示出来。每个实例中磷酸盐转移活性的测定结果用平均值+/-标准偏差和n＝3来表示。(实施例32)
图25D：给野生型小鼠(WT)和Hyp小鼠(Hyp)用包含有2C3B抗体和3C1E抗体的混和抗体，或一种载体(PBS)进行一次接种之后的第4天，从小鼠肾脏中制备RNA，利用Northern(RNA转移)吸印技术分析一个1αOH基因的表达变化，图25D显示了该基因的表达变化情况。(实施例32)
图26显示了给正常的大鼠接种3C1E抗体或一种载体时，血液中骨钙素浓度随时间的变化情况。测定结果用平均值+/-标准偏差来表示。“*”和“**”分别表示p＜0.01和p＜0.001，上述内容为通过Student-t进行显著性测定的结果。(实施例33)
图27显示了给野生型小鼠(WT)和Hyp小鼠(Hyp)接种包含有2C3B抗体和3C1E抗体的混和抗体(Ab)，或一种载体(PBS)之后，从小鼠中所提取的股骨，胫骨和肋骨的放大的X-射线影像。(实施例32)
图28显示的是两种影像的比较，一种影像是给Hyp小鼠(Hyp/抗体)重复接种含有2C3B抗体和3C1E抗体的混和抗体后，其胫骨近端和股骨远端的骨组织影像，另一种影像是给Hyp小鼠(Hyp/载体)和野生型小鼠(WT/载体)服用载体后，其相应位置的组织影像。提取的胫骨和股骨用Villanueva Bone染色。将它们植入树脂中，然后制备成一种大约5μm厚的非脱钙切片。这些样品被染成不同的颜色：类骨质染成紫色，钙化骨染成亮橙色，低钙化骨染成亮棕色，包埋进树脂中的细胞在可见光下呈亮紫色。(实施例32)图29A显示下组进行卵巢切除：一组小鼠(假切除/PBS)是假切除，施用载体(PBS)，一组小鼠(卵巢切除/混合抗体)卵巢切除，施用含有2C3B抗体和3C1E抗体的混和抗体，或一组小鼠(卵巢切除/PBS)后给其接种载体(PBS)后2星期时的血液中骨钙素浓度(IRMA试剂盒，Immutopics，Inc.)。血液中骨钙素浓度利用平均值+/-标准偏差来表示。“*”和“**”分别表示p＜0.01和p＜0.001，上述内容为通过Student-t进行显著性测定的结果。(实施例34)
图29B显示了下组进行卵巢切除：一组小鼠(假切除/PBS)是假切除，施用载体(PBS)，一组小鼠(卵巢切除/混合抗体)进行卵巢切除，施用接种含有2C3B抗体和3C1E抗体的混和抗体，或一组小鼠(卵巢切除/PBS)进行卵巢切除，施用载体(PBS)后4星期时血液中骨钙素浓度(IRMA试剂盒，Immutopics，Inc.)。血液中骨钙素浓度利用平均值+/-标准偏差来表示。“*”和“**”分别表示p＜0.01和p＜0.001，上述内容为通过Student-t进行显著性测定的结果。(实施例34)
图30A显示了对如下组进行卵巢切除：一组小鼠(假切除/PBS)是假切除，给其接种载体(PBS)，一组小鼠(卵巢切除/混合抗体)进行卵巢切除，给其接种含有2C3B抗体和3C1E抗体的混和抗体，或一组小鼠(卵巢切除/PBS)进行卵巢切除，给其接种载体(PBS)后4星期的股骨中的骨盐数量。股骨中的骨盐数量和骨密度利用平均值+/-标准偏差来表示。“*”和“**”分别表示p＜0.05和p＜0.01，上述内容为通过Student-t进行显著性测定的结果。(实施例34)
图30B显示了对下组进行卵巢切除：一组小鼠(假切除/PBS)是假切除，给其接种载体(PBS)，一组小鼠(卵巢切除/混合抗体)进行卵巢切除，给其接种含有2C3B抗体和3C1E抗体的混和抗体，或一组小鼠(卵巢切除/PBS)进行卵巢切除，给其接种载体(PBS)。后4星期时的骨密度(骨密度计，DCS-600型，日本阿洛卡公司)。股骨中的骨盐数量和骨密度利用平均值+/-标准偏差来表示。“*”和“**”分别表示p＜0.05和p＜0.01，上述内容为通过Student-t进行显著性测定的结果。(实施例34)
图31A显示了在对Hyp小鼠(Hyp/载体)重复皮下给药(一星期一次)载体，含有2C3B抗体和3C1E抗体，量为4mg/kg的Hyp小鼠(Hyp/抗体低剂量)，16mg/kg的相同的混合物对Hyp小鼠(Hyp/低剂量的抗体，16mg/kg的相同的混合物对Hyp小鼠(Hyp/高剂量的抗体)后定期测量尾椎骨的全长的结果。这些结果利用平均值+/-标准偏差来表示。“**”表示p＜0.01，其为当测量结果与接种载体的Hyp组结果相比较时，通过Student-t进行显著性测定而得到的。
(实施例35)
图31B同样显示了共分四组的实验，一组Hyp小鼠(Hyp/载体)通过皮下注射重复接种载体；一组Hyp小鼠(Hyp/低剂量抗体)按4毫克/千克的剂量通过皮下注射重复接种含有2C3B抗体和3C1E抗体的混和抗体；相同的混合抗体按16mg/千克的剂量通过皮下注射重复接种另一组Hyp小鼠(Hyp/高剂量抗体)；或一组野生型小鼠(WT/载体)通过皮下注射重复接种载体，之后定期(每周一次)测量这些小鼠的胫骨全长的结果。这些结果利用平均值+/-标准偏差来表示。“**”表示p＜0.01，其为当测量结果与接种载体的Hyp组结果相比较时，通过Student-t进行显著性测定而得到的。(实施例35)
图31C显示了共分四组的实验，一组Hyp小鼠(Hyp/载体)通过皮下注射重复接种载体；一组Hyp小鼠(Hyp/低剂量抗体)按4毫克/千克的剂量通过皮下注射重复接种含有2C3B抗体和3C1E抗体的混和抗体；相同的混合抗体按16mg/千克的剂量通过皮下注射重复接种另一组Hyp小鼠(Hyp/高剂量抗体)；或一组野生型小鼠(WT/载体)通过皮下注射重复接种载体，之后定期(每周一次)测量这些小鼠的体重变化的结果。这些结果用平均值+/-标准偏差来表示。*”和“**”分别表示p＜0.05和p＜0.01，其为当测量结果与接种载体的Hyp组结果相比较时，通过Student-t进行显著性测定而得到的。
(实施例35)
图32显示了在对Hyp(载体)皮下重复给药(一星期一次)，含有2C3B抗体和3C1E抗体的抗体混合物，量4mg/kg的Hyp小鼠(Hyp/低剂量抗体)；或对Hyp小鼠16mg/kg的相同的混合物抗体(Hyp/高剂量抗体)，和对野生型小鼠(野生型/载体)的载体后提取股骨并且焚烧31天后的干骨重中骨灰重的比例。这些结果利用平均值+/-标准偏差来表示。*”表示p＜0.001，其为当测量结果与施用载体的Hyp组结果相比较时，通过Student-t进行显著性测定而得到的。
图33显示了利用以2C3B或2C5L抗体作为固定抗体，3C1E作为检测抗体的ELISA系统对纯化的FGF-23蛋白进行了定量测定的结果。(实施例36)
图34显示了在给药之前和对未处理的正常小鼠的组(未处理/载体)施用一种载体，和载体(FGF-23/PBS)，2C5L抗体(FGF-23/2C5L)，或对已经用等渗泵连续施用人重组FGF-23的各组施用2C3B抗体(FGF-23/2C3B)后24小时时的血液磷酸的浓度。这些结果利用平均值+/-标准偏差来表示。*”表示p＜0.001，该结果为每一组在抗体接种前，其测量结果与服用载体的组结果相比较时，通过Student-t进行显著性测定而得到的。“#”和“##”分别表示p＜0.01和p＜0.001，其为通过Student-t对每一组在接种抗体前和接种抗体后第24小时进行测定的结果。“+”，“++“和“+++”分别表示p＜0.05，p＜0.01和p＜0.001，其为当接种抗体的每一组与接种FGF-23/PBS 24小时后的组相比较时，通过Student-t进行显著性测定而得到的。(实施例38)。
序列表内容
SEQ ID NOs：2-8：合成DNA
SEQ ID NOs：9-24：合成肽
SEQ ID NOs：25-36：合成DNA
完成本发明的最佳模式
参照以下实施例，本发明将可解释的更加明确，但本发明并不限于这些实施例所描述的实施方案及技术范畴。
实施例1重组体FGF-23表达型载体的构建
(1)FGF-23H蛋白表达型载体的制备
编码FGF-23的cDNA在96℃的条件下保持1分钟后，进行35个PCR循环，每一个循环包括96℃，30秒；55℃，30秒；和72℃，30秒。PCR反应的模板为肿瘤性骨软化症的肿瘤中的cDNA文库，引物为F1EcoRI(见SEQ ID NO：2)和LHisNot(见SEQ ID NO：3)，酶为LA-TaqDNA聚合酶。F1EcoRI引物对与编码FGF-23的5’端远上游核苷酸序列进行退火反应，使得在编码FGF-23 5’端的扩增片段上增加一个EcoRI限制性酶切位点。LHisNot引物包含一段在编码FGF-23的序列的5’端终止密码子序列处退火的序列，和编码一个6组氨酸标记序列(His-His-His-His-His-His)的一段序列，还包括终止密码子和一个Not I限制性酶切序列。因此，扩增片段编码FGF-23蛋白的一段序列，该序列在C-末端增加有6个组氨酸，在6个组氨酸序列的下游还有一个Not I限制性酶切位点。该扩增片段用EcoR I和Not I消化，然后连接到pcDNA3.1 Zeo载体上(美国，Invitrogen公司)，该载体为一种动物细胞的表达载体，具有与EcoR I和Not I消化方式相类似的消化特征。克隆制备的该表达载体，测定其核苷酸序列，以保证其编码的靶FGF-23蛋白具有6个组氨酸序列。该载体指的是pcDNA FGF-23H。
F1EcoRI：
CCGGAATTCAGCCACTCAGAGCAGGGCACG(见SEQ ID NO：2)
LHisNot：
ATAAGAATGCGGCCGCTCAATGGTGATGGTGATGATGGATGAACTTGGCGAA(见SEQ ID NO：3)
(2)FGF-23蛋白表达载体的构建
在94℃的条件下保持1分钟，然后进行25个PCR循环，每一个循环的条件是利用pcDNA/FGF-23H作为模板，并且利用F1EcoRI和LNoT(见SEQ ID NO：4)作为引物，和LA-Taq DNA聚合酶，94℃，30秒；55℃，30秒；和72℃，1分钟。经过反应以后，利用T4 DNA聚合酶(瑞士罗氏公司)处理PCR产物使其具有粘性末端制备一种编码FGF-23的cDNA片段，和利用多核苷酸激酶(瑞士罗氏公司)使DNA末端磷酸化。一种pCAGGS表达载体(Niwa H等，基因，1991，108：193-199)利用EcoR I进行消化，用Klenow片段(瑞士罗氏公司)使其末端粘性化，然后利用牛的小肠碱性磷酸酶(日本宝酒造公司)脱磷酸。这样制备的编码FGF-23的cDNA片段结合到一种pCAGGS载体上。对如此制备的表达载体进行克隆并且对核苷酸序列进行测定，这样确保一种编码FGF-23蛋白的靶序列能精确的插入到载体中。这里的载体指的是pCAGGS/FGF-23。
上述编码FGF-23的片段利用F1EcoRI引物和LNot引物进行扩增，然后用EcoR I和Not I消化，最后对其进行纯化。纯化的产物通过插入到一种已经通过将分子内的核糖体进入序列(IRES)和增强类型的绿荧光蛋白(EGFP)连接到pEAK表达载体(Edge生物系统，美国)而制备的pEAK8/IRES/EGFP载体的EcoR I和Not I的限制性酶切位点中得以克隆。对获得的质体核苷酸序列进行测定，证明该序列编码FGF-23蛋白。这个载体指的是pEAK8/IRES/EGFP/FCG-23。
LNot：ATAAGAATGCGGCCGCTCAGATGAACTTGGCGAA(见SEQ ID NO：4)
pCAGGS/FGF-23用EcoR I消化后，变得线性化，然后用Klenow片段(瑞士罗氏公司)使其具有粘性末端。用BamH I进一步消化。一段含有FGF-23的cDNA的DNA片段被分离得到并用琼脂糖电泳进行纯化。而且，一个INPEP4表达载体用Bgl II消化，用Klenow片段(瑞士罗氏公司)使其具有粘性末端，用BamH I消化，然后进行琼脂糖电泳，纯化载体。含有FGF-23 cDNA的片段与载体相连。克隆制备出来的表达载体，测定其核苷酸序列，证实准确插入了编码FGF-23的蛋白的靶序列。该载体指的是INPEP4/FGF-23。
(3)FGF-23RQH表达载体的构建
已经发现FGF-23蛋白在第179位精氨酸和第180位丝氨酸之间易于切割。切割位点的N-末端氨基酸序列是精氨酸(第176位)-组氨酸(第177位)-苏氨酸(第178位)-精氨酸(第179位)  (见SEQID NO：31)，与精氨酸-X-X-精氨酸序列相同，该序列为一种蛋白转化酶的识别序列。而且，已知ADHR中的错义突变是第176位或第179位的精氨酸残基的替代突变。因此，为了制备一个突变的FGF-23蛋白(这里指FGF-23RQH)作为突变的FGF-23在ADHR中可进行识别的模型，我们构建了一个载体，该载体通过蛋白转化成的酶而表现出对切割具有抗性，其在C-末端具有6组氨酸标记，和因替代第176位和第179位的精氨酸残基而具有谷氨酰胺残基。在该制备方法中，合成了两条引物，一条是RQF正向引物(见SEQ ID NO：5)，另一条是RQR反向引物(见SEQ ID NO：6)，它们包含有核苷酸替代序列，并可用谷氨酰胺代替精氨酸。而且，为了扩增5’端和3’端突变引入位点的FGF-23序列，与这些核苷酸替代引物一起，还制备了另外两条引物：ME1(见SEQ ID NO：7)和HNt(见SEQ ID NO：8)。ME1是一个正向引物，含有由FGF-23 cDNA编码的起始密码子，并具有EcoR I限制性酶识别序列。HNt是一个反向引物，能在由FGF-23 cDNA编码的起始密码子前插入一个编码6组氨酸标记序列的密码子，并增加一个Not I限制性酶识别序列。
RQF：ATACCACGGCAGCACACCCAGAGCGCCGAG    (见SEQID NO：5)
RQR：CTCGGCGCTCTGGGTGTGCTGCCGTGGTAT    (见SEQID NO：6)
ME1：ATGAATTCCACCATGTTGGGGGCCCGCCTCAGG    (见SEQ ID NO：7)
HNt：ATGCGGCCGCCTA ATGATGATGATGATGATGGATGAACTTGGCGAAGGG  (见SEQ ID NO：8)
PCR反应体系包括：10ng pGAGGS/FGF-23作为模板，RQF和HNt的结合引物，ME1和RQR的结合引物(每个引物200nM)。反应所用的酶为pfu DNA聚合酶(美国普洛麦格公司)。在94℃的条件下保持1分钟，然后进行25个PCR循环，每一个循环包括：94℃，30秒；55℃，30秒；和72℃，1分钟。得到的两种类型的反应溶液均稀释10倍。将反应溶液混合(每种1μl)，制成模板。ME1和HNt以终浓度为200nM加到模板中，制备成50μl的PCR反应溶液。在94℃的条件下保持1分钟，然后进行25个PCR循环，每一个循环包括：94℃，30秒；55℃，30秒；和72℃，1分钟。反应中用的酶为LA TaqDNA聚合酶(日本宝酒造公司)。得到的长约800bp(碱基对)的扩增产物用EcoR I和Not I消化，然后纯化，产物中包含有插入的DNA序列。它是通过插入到pEAK8/IRES/EGFP载体的EcoR I和Not I限制酶位点中得以克隆的，pEAK8/IRES/EGFP载体通过在pEAK8表达载体(Edge生物系统公司，美国)上连接分子内核糖体进入序列(IRES)和加强型绿色荧光蛋白(RGFP)而得。测定得到的质体的核苷酸序列，证实第176位和第179位的精氨酸残基如期转换成谷氨酰胺残基，并且编码加于C-末端含有6个组氨酸标记的突变FGF-23蛋白。该载体指的是pEAK8/IRES/EGFP/FGF-23RQH。
实施例2重组体FGF-23蛋白和重组体突变FGF-23蛋白的表达
(1)FGF-23H表达细胞的获得
通过在载体中的抗氨苄青霉素基因内的Fsp I限制酶位点处切割使大约20μg的pcDNAFGF-23H线性化，然后被纯化。纯化的产物溶于10μl纯水中，与1×107CHO Ras克隆-1细胞(Shirahata S.等，生物科学、技术与生物化学，59：345-347，1995)混合，利用Gene PulserII(Bio Rad，美国)通过电穿孔法将该基因引入到细胞中。这些培育细胞在含有10％胎牛血清(FCS)的MEMα培育溶液(Gibco BRL，美国)中培育24小时后，Zeocin(美国英杰生命技术公司)以终浓度为0.5mg/ml加到溶液中，混合溶液，培育1周。粘着的和生长的细胞用胰蛋白酶培育，然后在Zeocin最终浓度为0.3mg/ml时用限制稀释法对其进行克隆，由此得到了35种类型的克隆细胞。所有细胞中表达FGF-23H蛋白的细胞通过下面的Western印迹法以最高水平得以鉴定。收集每一种克隆细胞的培养物上清液，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。然后得到的蛋白转移至一种聚偏氟乙烯膜(美国Millipore公司)上，利用抗组氨酸标记(C-末端)的抗体(美国英杰生命技术公司)和ECL发光系统(美国Amersham Pharmacia Biotech公司)对FGF-23H蛋白上的信号分子序列(约32KDa)进行检测。检测的结果，表达量最高的#20克隆命名为CHO-OST311，然后利用与2000年8月11日(编号为FERM BP-7273)的申请相同的方法保存在日本现代产业科学和技术国家研究所的国际专利生物体保藏中心(Tsukuba Central 6，1-1-1 Higashi，Tsukuba，Ibaraki，日本)。这里的CHO-OST311指的就是CHO-FGF23H。
(2)表达FGF-23和表达FGF-23RQH的细胞的获得
利用膜融合脂，通过基因转移方法将pEAK8/IRES/EGFP/FGF-23和pEAK8/IRES/EGFP/FGF-23RQH载体转入到CHO Ras克隆-1细胞中。CHO Ras克隆-1细胞培育至细胞覆盖6孔板的底面约60％的程度。然后，将培育溶液转移，加入1ml不含血清的MEMα培育液。2.5μg的载体和10μl的Transfectam(商标)(美国普洛麦格公司)各自与50μl的不合血清的MEMα培育液相混合。然后这两种混合溶液再混合，培育10分钟，混合，然后再加到原来的6孔板中。培育2小时之后，含有DNA的培育溶液被转移，由含有10％FCS的培养液代替，然后培养液培育过夜。次日，加入最终浓度为5μg/ml的嘌罗霉素(美国Sigma公司)，以选择抗药性细胞。以这种方式获得的抗药性细胞通过类似于上述获得FGF-23H表达细胞的限制稀释法进行克隆。而且，通过Western印迹法选择最高水平表达靶蛋白的细胞线。这些细胞分别指CHO-FGF23和CHO-FGF23RQ。
(3)重组蛋白的纯化
当利用抗6组氨酸标记序列的抗体通过Western印迹法从CHO-FGF23H的培养物上清液中检测出重组体时，一条约32kDa的带和一条约10kDa的带被识别，见图1A。当把两条带从凝胶中切下来，测定N-末端的氨基酸序列时，从大分子量的带中检测出一个起始于SEQID NO：1中的第25位氨基酸残基的一段氨基酸序列，表明信号分子序列在从FGF-23蛋白分泌的过程中被除去。另一方面，已确定小分子量的带含有的一段氨基酸序列始于SEQ ID NO：1中的第180位氨基酸残基，表明该片段是从第179位和第180位切割处产生的。通过利用识别FGF-23的N-末端的多克隆抗体进行检测，证明存在一段至第179位的序列。
1000ml CHO-FGF23H细胞的培养物上清液在4℃，16,200g离心15分钟，以除去悬浮的细胞。然后上清液通过一个充满SP-琼脂糖凝胶FF(商标)(美国Amersham Pharmacia生物技术有限公司)的柱子(内径为30mm×200mm长)，以使相应于SEQ ID NO：1中的第180位至第251位氨基酸残基的肽和具有6组氨酸标记序列的肽通过柱子而不被吸收，而相应于SEQ ID NO：1(从这里开始，该段可能也指全长FGF-23蛋白)中的具有6组氨酸标记序列的第25位至第251位氨基酸残基的肽被吸附在柱子上。当柱子上吸附的物质用氯化钠浓度梯度溶液(用50mM的磷酸钠缓冲液配制成从0至0.7M的氯化钠溶液，pH 6.7)洗脱时，发现用约0.3M的氯化钠溶液可将一部分含有6组氨酸标记的全长FGF-23蛋白洗脱掉，从SEQ ID NO：1的第179位氨基酸残基至N-末端的序列可用约0.4M的氯化钠溶液洗脱掉。用SP-琼脂糖凝胶柱以这种方式分离得到的片段可进一步将它们通过Talon Superflow(商标)(Clontech公司，美国)金属亲和柱进行分离。由于从第179位氨基酸残基至N-末端范围的序列也与金属柱有亲和性，这对于提高纯化效果是有效的。为了全长FGF-23蛋白通过CBB染色可得到单一条带，利用SP-琼脂糖凝胶柱进一步纯化。结果见图1B。
FGF-23蛋白也可用一种相似的方法进行纯化。CHO-FGF23的培养物上清液通过一个孔径为0.2μm的SuperCap(商标)(Pall Gelman实验室，美国)膜过滤，然后过滤后的溶液加到SP-琼脂糖凝胶FF(美国Amersham Pharmacia生物技术有限公司)。和柱子亲和力弱的物质用50mM的磷酸钠缓冲液(pH 6.7)洗涤下来。当滞留在柱子中的蛋白用0至0.7M的氯化钠浓度梯度溶液洗脱时，发现全长FGF-23蛋白被洗脱进了0.3MnaCl的组分中。蛋白被吸附于Talon Superflow(商标)(克隆技术公司(Clontech)，美国)金属亲和柱上，用50mM的磷酸钠缓冲液(pH 6.7)洗脱，然后向柱内加入各种浓度的咪唑，洗脱和纯化蛋白。而且，进一步将含有靶蛋白的级分吸附于一种SP-琼脂糖凝胶FF柱上进行洗脱，然后纯化。利用类似方法，全长FGF-23RQ蛋白从CHO-FGF23RQ的上清液中纯化出来。
实施例3产生抗人类FGF-23的小鼠单克隆抗体的杂交瘤的获得
根据“单克隆抗体实验方案的介绍”等中叙述的一般方法，在本实施例中制备了单克隆抗体(Tamie Ando，等，Tan-kurokh KoutaiJikken Sosa Nyumon，KODANSHA，1991)。用于免疫的动物是Balb/c小鼠。人类FGF-23免疫是根据免疫原的差异，在2个类型的方法后进行的。
(1)利用载体的给药和重组蛋白的给药的结合来免疫
初始时对Balb/c小鼠进行免疫是通过引入实施例1中制备的INPEP4/FGF-23载体(10或50μg/小鼠)利用Trans IT(商标)体内基因多样性系统试剂(日本宝酒造公司)  进行静脉注射。助促进免疫反应是通过初始免疫后每周一次引进相同载体来进行的。将实施例2中制备的FGF-23RQH蛋白(20-30μg/小鼠)悬浮于含有三十碳六烯，吐温80(聚山梨醇酯80)，单磷酰脂A和海藻糖霉菌酸酯的RIBI佐剂(Corixa，美国)中。加强免疫是通过腹膜注射乳液4或5次来进行的。随后，在得到下面描述的脾细胞之前第4天时，小鼠用尾静脉注射实施例2中制备的FGF-23H蛋白(18μg/小鼠)的方法进行免疫。
(2)用人类FGF-23进行免疫
初始免疫利用Balb/c小鼠通过腹膜注射一种悬浮液，该悬浮液是通过在上述RIBI佐剂中悬浮实施例2中制备的FGF-23(22μg/小鼠)而制得的。加强免疫是通过腹膜注射同一种蛋白，每周一次，持续4周以上。在得到下面描述的脾细胞之前第3天时，通过尾静脉给小鼠注射实施例2中制备的FGF-23H蛋白(10μg/鼠)的方法进行免疫。
(3)杂交瘤的制备和选择
切除小鼠的脾脏，按照上述方法进行免疫。从脾脏中采集到的脾细胞与小鼠的骨髓瘤SP2/0(ATCC∶CRL 1581)以5∶1的比例混合，然后细胞用聚氧乙烯1500(日本罗氏诊断产品有限公司)作为一种融合剂进行融合，制备杂交瘤。杂交瘤通过在含有HAT，含有10％胎牛血清(FCS)，次黄嘌呤(H)，氨基喋呤(A)和胞嘧啶(T)的DMEM培氧基(Gibco BRL，美国)上培育细胞而进行选择。克隆是利用含有HT的DMEM(达尔伯克氏必需基本培养基)培养基通过限制稀释法而进行。因此，最终获得从单个细胞衍生而来的克隆杂交瘤。
(4)产生抗FGF-23抗体的克隆杂交瘤的选择
产生专一性识别FGF-23蛋白抗体的杂交瘤通过检测由杂交瘤产生的抗体和FGF-23蛋白的结合来选择。根据第一种免疫方法获得的杂交瘤以下面的方法来进行选择。向用于ELISA(Maxisorp(商标)，Nunc，美国)实验的一个96孔微量培养板中加入50μl在50mM碳酸氢纳溶液中稀释至1μg/ml的FGF-23H蛋白溶液。在37℃培育30分钟或4℃培育10小时，使得FGF-23H蛋白吸附在微量培养板上。接下来，除去该溶液，一种阻滞剂(SuperBlock(商标)Blocking Buffer，PIERCE，美国)加到每个孔中，然后在室温培育30分钟。每个孔用含有0.1％吐温20(包含500mM氯化钠的TRIZMA预置晶体(商标)，美国Sigma公司)(T-TBS，为三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水)的Tris(三羟甲基氨基甲烷缓冲液)缓冲盐溶液洗涤两次。取每种类型的杂交瘤培养物上清液50μl加入到已被上述的FGF-23H蛋白包被的微量培养板的每个孔中。反应30分钟后，每个孔用T-TBS(Tris缓冲盐溶液)洗涤两次。接下来，向每个孔中加入50μl稀释3000倍的过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体(Zymed实验室，美国)，在室温培育30分钟。利用T-TBS(三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水，下同)洗涤每个孔3次后，向孔中加入50μl含有N-四甲联苯胺(丹麦，DAKO)的底物缓冲液，在室温培育15分钟。随后，向每个孔中加入50μl 0.5M的硫酸，以停止反应。450nm波长下的吸收值通过一个微量培养板阅读器(MTP-300，CORONA ELECTRIC CO.，LTD.，日本)参照570nm波长的吸收值进行测定。选择吸收值明显增加的杂交瘤，利用FGF-23蛋白做相同实验，再次确保选择的是与FGF-23结合的克隆。因此，得到了9种类型的作为产生识别FGF-23蛋白的抗体的杂交瘤克隆。
在这些克隆中，包括下述的1C3H，1D6A，2A2B，2C3B和2C5L。
通过二次免疫方法获得的杂交瘤按照下列步骤进行选择。向用于ELISA(Maxisorp(商标)，Nunc，美国)实验的96孔微量培养板的每个孔中加入50μl在50mM的碳酸氢钠溶液中稀释至1μg/ml的FGF-23蛋白溶液。在4℃培育10小时，以使FGF-23蛋白吸附在微量培养板上。随后，除去溶液，一种阻滞剂(SuperBlock(商标)BlockingBuffer，PIERCE，美国)加到每个孔中，然后在室温培育30分钟。每个孔用含有0.1％吐温20的Tris缓冲溶液(T-TBS)洗涤两次。取每种类型的杂交瘤的培养物上清液50μl加入到已被上述的FGF-23H蛋白包被的微量培养板的每个孔中。反应30分钟后，每个孔用含有0.1％吐温20的T-TBS(Tris缓冲盐溶液)洗涤两次。接下来，向每个孔中加入50μl稀释3000倍的过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体(Zymed实验室，美国)，在室温培育30分钟。每个孔用T-TBS溶液洗涤3次，向每个孔中加入50μl含有四基甲联苯胺(丹麦，DAKO)的底物缓冲液，在室温培育15分钟。随后，向每个孔中加入50μl的0.5M的硫酸，以停止反应。450nm波长下的吸收值通过一个微量培养板阅读器(MTP-300，CORONA ELECTRIC CO.，LTD.，日本)参照570nm波长的吸收值进行测定。选择吸收值明显增加的杂交瘤。因此，得到了9种类型的作为产生识别FGF-23蛋白的抗体的杂交瘤克隆。在这些克隆中，包括3C1E。
这样得到的专一性识别FGF-23蛋白的抗体的亚类利用一种IsoStrip小鼠单克隆抗体isotyping试剂盒(Roche公司，美国)进行鉴定。结果如表1所示。
                   表1
             抗人类FGF-23的抗体
    杂交瘤克隆     亚类 ELISA 450nm-570nm
    1C3H     IgG1(κ)     3.39
    1D6A     IgG1(κ)     3.21
    2A2B     IgG1(κ)     2.67
    2C3B     IgG1(κ)     1.21
    3C1E     IgG1(κ)     3.5或更多
    2C5L     IgG1(κ)     1.38
在上述的杂交瘤克隆中，有3个杂交瘤克隆(2C3B，3C1E，和1D6A)利用与2001年12月26日的申请相同的方法被国际性的保存在布达佩斯协议认可的日本现代产业科学技术国家研究院的国际生物体储藏处(Tsukuba Central 6，1-1-1 Higashi，Tsukuba，Ibaraki，日本)。而且，2C5L杂交瘤克隆利用与2003年1月6日的申请相同的方法被国际性地保存在布达佩斯条约认可的日本现代科学技术研究所的国际专利生物体保藏处(Tsukuba Central 6，1-1-1 Higashi，Tsukuba，Ibaraki，日本)。这些克隆的保藏号如下所示：
2C3B：FERM BP-7838
3C1E：FERM BP-7839
1D6A：FERM BP-7840
2C5L：FERM BP-8268
实施例4单克隆抗体的制备
(1)包含有抗FGF-23抗体的培养物上清液的制备
产生抗FGF-23抗体的杂交瘤在eRDF培养基(KYOKUTOPHARMACEUTICAL INDUSTRIAL CO.，LTD.日本)中进行驯化，培养基包含有10μg/ml的牛胰岛素(美国Sigma公司)，5.5μg/ml的人转铁蛋白(美国Sigma公司)，0.01mM的乙醇胺溶液(美国Sigma公司)，和5ng/ml的亚硒酸钠溶液(美国Sigma公司)。用于制备抗体的杂交瘤在旋转式烧瓶中进行培养。培养后的溶液利用孔径为0.2μm的滤纸(Pall Gelman实验室，美国)进行过滤以除去如杂交瘤这样的废物，然后收集包含抗体的培养物上清液。
(2)利用G蛋白纯化单克隆抗体
包含有抗FGF-23抗体的培养物上清液通过一种G蛋白琼脂糖亲和柱(美国Amersham Pharmacia生物技术有限公司)进行分离，这样抗体被吸附在了亲和柱上。然后利用一种0.1M的甘氨酸缓冲液(pH值为2.8)进行淋洗。1M的Tris-HCL溶液加入进洗脱部分的溶液中以调节pH值为7.2。对这样制备的抗体溶液利用一种透析膜(Spectrum实验室，美国)用PBS(-)进行透析和取代，该透析膜的最大分子量为10000，并且利用一种孔径为0.22μm的滤纸膜(美国Millipore公司)进行过滤灭菌，这样得到纯化后的抗FGF-23抗体。通过在280nm波长处的吸收值来计算纯化抗体的浓度，然后通过利用1mg/ml作为1.35OD的标准进行计算。
(3)利用A蛋白纯化单克隆抗体
抗体利用一种A蛋白载体亲和柱(IBL Co.，Ltd.，日本)，一种甘氨酸缓冲溶液(pH值为8.9)作为吸附缓冲溶液，一种柠檬酸缓冲液(pH值为4.0)作为洗脱缓冲溶液来亲和性纯化包含有抗FGF-23抗体的培养物上清液。1M的Tris-HCL溶液加入进包含有该抗体的洗脱部分溶液中以调节pH值为7.2。然后，对包含有抗体的溶液利用PBS(-)溶液通过一种透析膜和一种孔径为0.22μm，已灭菌的滤纸膜进行透析和取代。通过在280nm波长处的吸收值来计算纯化抗体的浓度，然后通过利用1mg/ml作为1.35OD的标准进行计算。
这样获得的每一种纯化后的单克隆抗体利用产生这种抗体的杂交瘤的名称来命名。例如，由1D6A杂交瘤产生的抗体命名为1D6A抗体。
实施例5抗FGF-23部分肽的多克隆抗体的制备
(1)对应FGF-23部分序列的肽的合成
SEQ ID NO：1多肽的疏水性程度通过利用版本为6.5.1的MacVector计算函数来预测，然后对制备的肽抗体的合适的位点进行预测。在去除了具有高度亲水性，并经过糖链改性或磷酸化位点之后，适于制备抗体的部分序列被提取出来。因此，一种从SEQ ID NO：1的第25位酪氨酸(残基号为：25)开始的包含有15个氨基酸残基和C-末端上加有一个半胱氨酸残基的hFGF23-25的肽(SEQ ID NO：9)；一种从第48位精氨酸开始的包含有20个氨基酸残基和C-末端上加有一个半胱氨酸残基的hFGF23-48的肽(SEQ ID NO：10)；一种从第114位精氨酸开始的包含有15个氨基酸残基和C-末端上加有一个半胱氨酸残基的hFGF23-114的肽(SEQ ID NO：11)；一种从第148位甘氨酸开始的包含有16个氨基酸残基和C-末端上加有一个半胱氨酸残基的hFGF23-148的肽(SEQ ID NO：12)；一种从第170位天门冬酰胺开始的包含有20个氨基酸残基和N-末端上加有一个半胱氨酸残基的hFGF23-170肽(SEQ ID NO：13)；一种从第174位脯氨酸开始的包含有14个氨基酸残基和C-末端上加有一个半胱氨酸残基的hFGF23-174肽(SEQ ID NO：14)；一种从第180位丝氨酸开始的包含有15个氨基酸残基和C-末端上加有一个半胱氨酸残基的hFGF23-180肽(SEQ IDNO：15)；一种从第210位亮氨酸开始的包含有13个氨基酸残基和C-末端上加有一个半胱氨酸残基的hFGF23-210肽(SEQ ID NO：16)；一种从第237位甘氨酸开始的包含有15个氨基酸残基的hFGF23-237肽(SEQ ID NO：17)被选择作为抗原，并且通过化学方法进行了合成。
hFGF23-25：YPNASPLLGSSWGGLC  (SEQ ID NO：9)
hFGF23-48：RNSYHLQIHKNGHVDGAPHQC  (SEQ ID NO：10)
hFGF23-114：RFQHQTLENGYDVYHSPQYHC  (SEQ ID NO：11)
hFGF23-148：GMNPPPYSQFLSRRNEC  (SEQ ID NO：12)
hFGF23-170：CNTPIPRRHTR  (SEQ ID NO：13)
hFGF23-174：PRRHTRSAEDDSERC(SEQ ID NO：14)
hFGF23-180：SAEDDSERDPLNVLKC  (SEQ ID NO：15)
hFGF23-210：LPSAEDNSPMASDC  (SEQ ID NO：16)
hFGF23-237：GGTGPEGCRPFAKFI  (SEQ ID NO：17)
(2)抗FGF-23部分肽的多克隆抗体的制备
所有上述制备的肽通过它们自己的半胱氨酸残基结合到牛的甲状腺球蛋白上(载体蛋白)，然后用于免疫接种。对于免疫接种，每一种抗原肽用3只兔子。第一次接种利用结合到载体蛋白(利用弗罗德氏完全佐剂作为载体蛋白)上的肽作为乳液(100μg/兔子)，然后将该乳液通过真皮或皮下接种的方式给兔子进行接种。第一次接种1周以后，利用结合到载体蛋白(利用弗罗德氏不完全佐剂作为载体蛋白)上的肽作为乳液，以100μg/兔子的剂量进行类似的给药。以2周的间隔进行同样的给药6次，最后一次给药完成后1周，对兔子进行放血，采集抗血清。
为了制备用于从兔子的血清中纯化抗部分肽抗体的一种亲和性层析柱，用于免疫的每一种肽利用SulfoLink试剂盒(PIERCE，美国)固定在了凝胶上。抗血清加入进利用PBS(-)溶液作为吸附缓冲溶液的亲和柱中，这样可在亲和柱中滞留结合到用于免疫接种的肽上的抗体。接下来，利用0.1M的甘氨酸缓冲溶液(pH值为2.5至3.3)作为洗脱缓冲溶液对结合到亲和柱上的抗体进行洗脱，然后收集洗脱部分溶液。1M的Tris-HCL溶液加入进洗脱溶液中以调节pH值为7.2左右。将这样制备的抗体溶液加入到一种NAP25凝胶过滤亲和柱(美国Amersham Pharmacia生物技术有限公司)中，这样缓冲溶液就被PBS(-)取代了。利用一种孔径为0.22μm，型号为MILLEX-GV的滤纸膜(美国Millipore公司)进行消毒过滤，这样可得到抗每一种肽的抗体。通过在280nm波长处的吸收峰来计算纯化抗体的浓度，然后通过用1mg/ml作为1.35OD的标准进行计算。这样获得的每一种纯化后的抗体用一种用于免疫接种的肽的名称来命名。例如，一种通过SEQ ID NO：9的hFGF23-25肽进行免疫接种所得到的抗体命名为一种hFGF23-25抗体。
(3)利用抗FGF-23部分肽抗体识别FGF-23蛋白和其代谢产物
利用Western印迹法(该印迹法利用由上述方法得到的h FGF23-48和hFGF23-148抗体)对CHO-FGF23H-表达细胞培养物上清液中的FGF-23H蛋白和其代谢产物进行了分析。如图1所示，利用这两种抗体对大约为32kDa的全长FGF-23H蛋白进行了测定。而且，观察到了一种大小约为18或小于18kDa的代谢产物，并且它们被认为是由FGF-23蛋白(该蛋白介于如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列中的第179位和第180位之间的氨基酸残基)的切割所导致的N-末端片段衍生出来的。hFGF23-48抗体可识别小片段的代谢产物。CHO-FGF23RQ培养物上清液中的FGF-23RQ蛋白和其代谢物，由于产生了变异蛋白从而避免了介于第179位和第180位之间的氨基酸残基的切割，利用hFGF23-148对FGF-23RQ蛋白和其代谢物进行了检测。如图1C所示，在FGF-23H例子中已被识别的片段的肽未被检测出来。基于上述结果，通常认为在FGF-23蛋白切割的代谢中，介于第179位和第180位氨基酸残基之间的切割产生的N-末端片段进一步断裂成小片段，但是这样的小片段是经过介于第179位和第180位氨基酸残基之间的切割之后产生的。因此，当考虑FGF-23蛋白的代谢作用时，检测介于第179位和第180位氨基酸残基之间的切割与否非常重要。
实施例6生物素化抗体的制备
利用上述9种类型经纯化后的抗FGF-23部分肽的多克隆抗体和13种类型的抗FGF-23的单克隆抗体进行生物素化(biotinylated)。将Biotin-AC5-Osu(DOJINDO实验室，日本)溶解到N，N-二甲基甲酰胺中，得到浓度为1.82mg/ml的溶液，取10μl加入到一种抗体溶液(该抗体溶液已经利用一种浓度为50mM的碳酸氢纳溶液稀释到了1mg/ml)中，然后将生成物在4℃通过上下摇荡的方式混合2小时。接下来，将反应溶液加入到一种NAP10亲和柱(美国AmershamPharmcia生物技术有限公司)中，除去未反应的Biotin-AC5-Osu，并且溶剂被PBS(-)取代了。这样，获得了9种类型的生物素标记的抗FGF-23部分肽的多克隆抗体和5种类型的生物素标记的抗FGF-23的单克隆抗体(1C3H抗体，1D6A抗体，2A2B抗体，2C3B抗体，和3C1E抗体)。
实施例7利用识别FGF-23专一性位点的多克隆抗体的夹心式ELISA法
(1)夹心式ELISA系统的构建
从上述9种类型的抗FGF-23部分肽序列的多克隆抗体中通过结合其中8种类型的抗体(hFGF23-25抗体，hFGF23-48抗体，hFGF23-114抗体，hFGF23-148抗体，hFGF23-170抗体，hFGF23-180抗体，hFGF23-210抗体，和hFGF23-237抗体)作为固定化抗体和检测抗体对一种夹心式ELISA系统的构建进行了检测。
为了固定抗体，用50mM的碳酸氢纳溶液稀释8种类型的抗FGF-23部分肽的多克隆抗体(hFGF23-25抗体，hFGF23-48抗体，hFGF23-114抗体，hFGF23-148抗体，hFGF23-170抗体，hFGF23-180抗体，hFGF23-210抗体，和hFGF23-237抗体)至30μg/ml。向进行ELISA系统(Maxisorp(商标)，Nunc，美国)实验的96孔板的每一个孔中加入50μl的这种溶液，然后将该溶液在37℃培育1.5小时。接下来，除去反应溶液，向每孔中加入50μl的Superblock(商标)(PIERCE，美国)，室温培育60分钟，以阻滞反应的进行。在溶液除掉以后，向每一个孔中加入50μl浓度为1μg/ml的FGF-23H蛋白溶液，并且在室温培育1小时，以将该蛋白结合到固定化的抗体上。经过抗体反应，利用T-TBS溶液洗涤孔3次。利用含量为10％Blockace(日本制药公司)的T-TBS溶液稀释上述8种类型的生物素标记的抗FGF-23部分肽的抗体(hFGF23-25抗体，hFGF23-48抗体，hFGF23-114抗体，hFGF23-148抗体，hFGF23-170抗体，hFGF23-180抗体，hFGF23-210抗体，和hFGF23-237抗体)到10μg/ml。这些抗体和作为对照的一种含量为10％Blockace的T-TBS溶液以50μl/孔的量加入到每一个孔中。每一种溶液在室温培育30min，以进行次级反应。利用T-TBS溶液将每一孔洗涤3次后，利用含Blockace量为10％的T-TBS溶液稀释标记的抗生物素蛋白链菌素(DAKO，丹麦)溶液到5000倍，取50μl稀释后的溶液加入到每一个孔中。用T-TBS溶液洗涤每一孔4次，将50μl的N-四甲联苯胺(是一种过氧化物生色底物)加入到每孔中，室温作用15分钟，以使其发生颜色反应。50μl浓度为0.5M的硫酸溶液加入到每孔中以停止反应。利用MTP-300(用于吸收峰测定的系统)对该96孔板(CORONA ELECTRIC CO.，LTD.，日本)进行测定，测量值为450nm处的光吸收值减去570nm处的光吸收值(见表2)。对于未加生物素标记的抗体的对照组，从450nm-570nm范围内获得的所有测定值都是0.06或低于0.06。然而，如表2所示，由于固定化抗体和检测用抗体的多重结合，致使450nm-570nm的光吸收值明显升高。如图1所示，由于通过FGF-23蛋白的切割产生多肽的事实在目前来说是已知的，那么在同一样品中就可能产生由FGF-23衍生得到的不同分子类型的多肽。基于这里的抗体可识别FGF-23的特异性位点这一事实，根据抗体的重组体可缩减所要测定的分子类型。比如，当使用一种重组体时，hFGF23-170抗体被固定化，hFGF23-25抗体作为检测抗体，因为两种抗体的抗原位点均包含在如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列中的介于第25位和第179位残基之间的N-末端部分多肽片断，那么就不仅能预测SEQ ID NO：1所示的介于第25位和第251位残基之间的多肽的全长，而且能利用这种重组体通过夹心式ELISA对N-末端部分多肽片段进行测定。另一方面，当hFGF23-180抗体被固定化，并且利用hFGF23-237抗体进行测定时，不仅能预测N-末端部分多肽片断，而且能测定一种相当于如SEQ ID NO：1所示的FGF-23蛋白中的第180位至第251位残基之间的C-末端部分多肽片段。而且，举例来说，当hFGF23-237抗体被固定化，hFGF23-25抗体作为检测抗体时，据估计只有全长FGF-23蛋白可被检测出(未能检测出切割后产生的N-末端和C-末端部分多肽)。因此，利用这些重组体的复合物能够对分析物(如生物样品)中的FGF-23全长多肽和部分多肽进行绝对量的测定，也使得我们能够区分这些多肽的存在比例。
                                     表2
利用抗FGF-23的多克隆抗体结合夹心式ELISA系统测定FGF-23蛋白(450nm-570nm的光吸收值)
                                        固定化抗体
 hFGF23-25  hFGF23-48  hFGF23-114   hFGF23-148  hFGF23-170  hFGF23-180  hFGF23-210  hFGF23-237     无
                                        生物素化的抗体
 hFGF23-25     0.517     0.046     0.040     0.050     1.543     1.938     0.686     1.808     0.048
 hFGF23-48     0.037     0.050     0.028     0.028     0.030     0.033     0.031     0.034     0.037
 hFGF23-114     0.033     0.026     0.029     0.026     0.027     0.029     0.026     0.029     0.036
 hFGF23-148     0.091     0.070     0.046     0.140     0.157     0.102     0.083     0.104     0.047
 hFGF23-170     0.444     0.035     0.033     0.068     0.112     0.054     0.041     0.057     0.042
 hFGF23-180     0.370     0.036     0.034     0.042     0.045     0.193     0.286     0.652     0.038
 hFGF23-210     0.309     0.034     0.033     0.036     0.043     0.563     0.065     0.383     0.035
 hFGF23-237     1.096     0.061     0.047     0.081     0.113     2.143     0.407     0.442     0.057
固定化抗体的种类列在了表2中顶部的水平线之上，检测抗体的种类如表2中的最左一列所示。表中的数字是利用每一种重组体测定得到的。
(2)利用夹心式ELISA法定量测定FGF-23蛋白
根据以上描述的制备夹心式ELISA系统的方法，利用hFGF23-25抗体做固定化抗体，hFGF23-237抗体做检测抗体对测定物质，浓度分别为1，0.33，0.1，0.033，0.01，0.0033，和0.001μg/ml的FGF-23H蛋白溶液进行了测定。测定结果如Figure2所示。在0.1-1μg/ml的浓度范围之内，观察到了由450nm-570nm处测定所得值的浓度依赖性增加，表明了至少在该浓度范围内，FGF-23H蛋白能以一种浓度依赖型的方式进行测定。
实施例8FGF-23部分肽的制备
除了如实施例5中所制备的对应FGF-23部分序列的肽以外，还通过化学方法合成了具有下述FGF23的部分序列的肽：
一种从SEQ ID NO：1的残基号38(甘氨酸)开始的13个氨基酸残基和具有在肽的C末端加入半胱氨酸残基的hFGF23-38肽(SEQID NO：18)；一种从SEQ ID NO：1中的残基号为68(苏氨酸)开始的包含有28个氨基酸残基的hFGF23-68肽(SEQ ID NO：19)；一种从SEQID NO：1中的残基号为96(甲硫氨酸)开始的包含有18个氨基酸残基的hFGF23-96肽(SEQ ID NO：20)；一种从SEQ ID NO：1中的残基号为129(丝氨酸)开始的包含有22个氨基酸残基和肽的C-末端上加有一个半胱氨酸残基的hFGF23-129肽(SEQ ID NO：21)；一种从SEQID NO：1中的残基号为161(精氨酸)开始的包含有13个氨基酸残基和肽的C-末端上加有一个半胱氨酸残基的hFGF23-161肽(SEQ IDNO：22)；一种从SEQ ID NO：1中的残基号为197(丙氨酸)开始的包含有16个氨基酸残基的hFGF23-197肽(SEQ ID NO：23)；和一种从SEQID NO：1中的残基号为220(丝氨酸)开始的包含有24个氨基酸残基的hFGF23-220肽(SEQ ID NO：24)。
hFGF23-38：GLIHLYTATARNSC  (SEQ ID NO：18)
hFGF23-96：TIYSALMIRSEDAGFVVITGVMSRRYLC  (SEQ IDNO：19)
hFGF23-96：MDFRGNIFGSHYFDPENC  (SEQ ID NO：20)
hFGF23-96：SPQYHFLVSLGRAKRAFLPGMNC  (SEQ ID NO：21)
hFGF23-96：RNEIPLIHFNTPIC  (SEQ ID NO：22)
hFGF23-96：ARMTPAPASCSQELPS  (SEQ ID NO：23)
hFGF23-96：SDPLGVVRGGRVNTHAGGTGPEGC  (SEQ ID NO：24)
实施例9对单克隆抗体中FGF-23识别区域的检测
通过检测含有人类FGF-23的部分序列的肽的反应活性对包含能够被抗FGF-23单克隆抗体所识别的氨基酸序列的区域进行测定。
(1)实验1：与固定的肽相结合
利用50mM的碳酸氢纳溶液将实施例5中合成的肽(SEQ ID NOS：7-17)稀释到浓度为1μg/ml的溶液。50μl的这种溶液加入到ELISA系统(Maxisorp(商标)，Nunc，美国)中的96孔板中，然后将该溶液在37℃培育1小时，以固定FGF-23部分肽。接下来，除去反应溶液，向每孔中加入50μl的一种阻滞溶液(Superblock(商标)，PIERCE，美国)，然后室温培育60分钟，以阻滞反应的进行。在溶液除掉以后，向每一个孔中加入50μl实施例3制备的杂交瘤的培养物上清液或一种作为对照的包含有DMEM介质的HT溶液，然后将该溶液在室温培育1小时以结合FGF-23部分肽。在抗体结合反应的后期，利用T-TBS溶液洗涤孔3次。利用一种含10％封闭溶液(Blockace(商标)，(日本制药公司)的T-TBS溶液稀释HRP标记的羊抗鼠IgG(H+L)-F(ab’)2片段至3000倍，取50μl稀释后的溶液加入进每一孔中，然后将该溶液在室温培育30分钟以结合次级抗体。利用T-TBS溶液洗涤每个孔3次，将50μl的N-四甲联苯胺(是一种过氧化物生色底物，丹麦，DAKO)加入到每孔中，室温作用3分钟，以使其发生颜色反应。下一步，50μl浓度为0.5M的硫酸溶液加入到每孔中以停止反应。利用一种吸收峰测定系统(MTP-300，CORONA ELECTRIC CO.，LTD.，日本)对该96孔板进行测定，获得的测定值为450nm处的光吸收值减去570nm处的光吸收值。对于对照组(仅加有包含DMEM基质的HT溶液)，从450nm-570nm范围内获得的所有测定值都是0.06或低于0.06。然而，在该实例中(已经加入了杂交瘤培养物的上清液和固定了专一性的肽)，观察到了光吸收值的明显增加。这些结果如表3所示。2A2B抗体结合在了SEQ ID NO：12的一种hFGF23-96肽上。1D6A表明可与SEQ ID NO：17的hFGF23-148肽相结合。因此，可得出如下结论：2A2B杂交瘤产生的抗体与SEQ ID NO：1所示的FGF-23中的介于第148位和第163位氨基酸残基之间的区域或部分区域相结合。而且，1C3H结合在了SEQ ID NO：1所示的FGF-23中的介于第180位和第194位氨基酸残基之间的区域或部分区域，1D6A结合在了SEQ ID NO：1所示的FGF-23中的介于第237位和第251位氨基酸残基之间的区域或部分区域。
                                    表3
具有FGF-23部分序列的固定化肽与由产生单克隆抗体的杂交瘤培养物上清液中的抗体的反应活性
                                     固定化抗体
            hFGF23-25  hFGF23-48 hFGF23-   hFGF23-  hFGF23-  hFGF23-    hFGF23-  hFGF23-114       148      170      180        210      237
 培养物上清液1C3H       0.053      0.043     0.043     0.041    0.037    0.240      0.039    0.0361D6A       0.056      0.051     0.049     0.045    0.044    0.040      0.038    2.0582A2B       0.052      0.048     0.043     0.321    0.040    0.037      0.036    0.0402C3B       0.056      0.046     0.043     0.038    0.039    0.038      0.041    0.041对照组     0.059      0.047     0.048     0.051    0.043    0.044      0.045    0.043
(2)实验2：与固定化的肽相结合
对于FGF-23，观察到切割发生在SEQ ID NO：1所示的第179位和第180位氨基酸残基之间。为了详细检测识别切割位点至C-末端的区域的抗体，利用含有相应部分区域的序列的合成肽进行了结合实验。利用50mM的碳酸氢纳溶液将实施例5中合成的肽(SEQ ID NOS：14，15，16和17)和实施例8中合成的肽(SEQ ID NOS：23和24)稀释到1μg/ml。50μl的这种溶液加入到ELISA系统(Maxisorp(商标)，Nunc，美国)中的96孔板中，然后将该溶液在4℃培育12小时以使其固定在平板上。接下来，除去反应溶液，向每孔中加入50μl的封闭溶液(Superblock(商标)，PIERCE，美国)，然后室温培育60分钟，以停止反应的进行。在溶液除掉以后，向每一个孔中加入50μl用含有10％封闭溶液(SuperBlock(商标)，PIERCE，美国)的T-TBS溶液稀释实施例3和实施例4中纯化得到的1D6A和3C1E抗体至其浓度为10μl/ml。作为对照，向一孔中加入50μl含有10％封闭溶液(Blockace(商标)，日本制药公司)的T-TBS溶液。将该溶液在室温培育1小时，这样固定化的肽可与抗体进行反应。在抗体反应的后期，利用T-TBS溶液洗涤孔4次，取50μl稀释后(稀释方法为：利用一种含10％阻滞溶液(Blockace(商标)，日本制药公司)的T-TBS溶液稀释HRP标记的羊抗鼠IgG(H+L)-F(ab’)2片段至3000倍)的溶液加入进每一孔中。将该溶液在室温培育60分钟以同次级抗体发生反应。经过T-TBS溶液洗涤每孔4次以后，向每个孔中加入50μl的N-四甲联苯胺(DAKO，丹麦)，是一种过氧化物生色底物，室温作用20分钟，以使其发生颜色反应。然后，向每一孔中加入50μl浓度为0.5M的硫酸溶液以停止反应。利用一种用于96孔板的吸收峰测定系统(MTP-300，CORONA ELECTRIC CO.，LTD.，日本)对溶液进行测定，获得的测定值为450nm处的光吸收值减去570nm处的光吸收值。结果表示在Table4。对于对照组孔板(仅加有稀释溶液)，从450nm-570nm范围内获得的所有测定值均小于或等于0.05。与其相反，3C1E抗体与hFGF23-180肽(SEQ ID NO：15)相结合，1D6A抗体与hFGF23-237肽(SEQ ID NO：17)相结合。
                         表4
具有FGF-23的部分序列的固定化肽与纯化后单克隆抗体的反应活性
                                             固定化抗体
           hFGF23-170  hFGF23-174  hFGF23-180  hFGF23-197  hFGF23-210  hFG23-220  hFGF23-237   对照组
  纯化后的抗体1D6A     0.041       0.051       0.047       0.050       0.055       0.054      3.4 12        0.0603C1E     0.037       0.043       0.203       0.041       0.040       0.051      0.042         0.045对照组   0.038       0.041       0.035       0.036       0.042       0.048      0.043         0.048
实施例10利用免疫沉淀法检测FGF-23蛋白和从FGF-23蛋白衍生出的多肽
应用免疫沉淀法的目的在于：为了揭示获得的单克隆抗体与FGF-23和从FGF-23衍生出的多肽在液相中(与固定化的肽相比，更接近生理条件)进行反应的活性，沉淀的蛋白可以利用Western印迹法进行检测。
实施例2中制备的表达FGF-23H的CHO-FGF23细胞在CHO-S-SFM II介质(Gibco BRL，美国)中培育4天，这样可得到包含有FGF-23蛋白，N-末端多肽片段，和C-末端多肽片段的培养物上清液。每400μl的上清液中分别加入0.5μg实施例3和实施例4中制备的抗FGF-23单克隆抗体5种类型中的1种，以制备溶液。一组仅添加缓冲溶液的样作为对照溶液。利用上下摇荡的方式将这些溶液在4℃混合1.5小时以确保抗体同培养物上清液中的蛋白发生反应。接下来，30μl的G蛋白4FF琼脂糖(凝胶)(美国Amersham Pharmacia生物技术有限公司)加入到反应液中，利用上下摇荡的方式将该溶液在4℃混合3小时，然后利用PBS溶液洗涤树脂3次，这样未结合到树脂上的物质就被洗涤掉了。取一半洗涤后的树脂，向其中加入30μl的20mM的含有DDT的缓冲溶液和20mM的不含DDT样品的缓冲溶液(50mM的Tris-Cl溶液，pH为6.8，1％的SDS溶液，10％的甘油溶液，0.001％的溴酚蓝溶液，2mM的乙二胺四乙酸(EDTA)溶液)。将该溶液在95℃加热5分钟后进行离心分离，收集分离后的上清液。对这样采集到的免疫沉淀物利用浓度为10％-20％的浓度梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离。利用一种半干印迹转移槽(Owl Separation Systems，美国)将凝胶中的蛋白转移到一种固定化的聚偏氟乙稀膜(美国Millipore公司)上。利用一种阻滞溶液(Blockace(商标)，日本制药公司)阻滞PVDF膜以后，在一种生物素标记的2A2B抗体或1C3E抗体(这两种抗体均溶解在T-TBS溶液中，将抗体稀释到1μg/ml)溶液中在4℃培育12小时。而且，HRP标记的抗生物素蛋白链菌素(DAKO，丹麦)同生成物进行反应。经过洗涤之后，将生成物利用一种ECL Plus发光系统(一种电化学发光脉冲系统，美国AmershamPhamacia生物技术有限公司)曝光到一张胶片上1小时，然后胶片用自动处理器进行处理(日本富士胶片公司)。其结果如图3所示。用于Western印迹实验的2A2B抗体识别的位点相当于SEQ ID NO：1中的长为148至163位的氨基酸序列。而且，该实验所用的1C3H抗体表明可识别一个相当于SEQ ID NO：1中的长为180至194的氨基酸序列的位点。利用这两种抗体，可区分并识别由介于第179位和第180位氨基酸残基之间的切割所产生的多肽片段与其它的多肽。本实验的一个结果，单克隆抗体被分为下面的3种类型。具体地说，即为：(1)两种类型的抗体(2C3B抗体和2C5L抗体)在相应于SEQ ID NO：1中的第25位和第179位之间的氨基酸序列的N-末端多肽内有一个识别序列，或者与N-末端多肽片段和FGF-23全长蛋白形成免疫复合体；(2)两种类型的抗体(1D6A抗体和3C1E抗体)在相应于SEQ IDNO：1中的第180位和第251位之间的氨基酸序列的C-末端多肽内有一个识别序列，并与C-末端多肽片段和FGF-23全长蛋白形成免疫复合体；(3)一种抗体(2A2B抗体)未检测到免疫沉淀物。
实施例11利用抗FGF-23的单克隆抗体和抗FGF-23的多克隆抗体通过ELISA测定FGF-23蛋白
2种类型的单克隆抗体(1D6A抗体和2C3B抗体)分别固定化，然后利用5种类型的多克隆抗体(hFGF23-25抗体，hFGF23-170抗体，hFGF23-180抗体，hFGF23-210抗体，和hFGF23-237抗体。这5种类型的多克隆抗体在实施例7中表明其作为检测抗体是有效的)中的一种通过夹心式ELISA系统对纯化后FGF-23蛋白进行了测定。
利用50mM的碳酸氢纳溶液稀释上述经由一种G蛋白亲和层析柱纯化过的两种类型的单克隆抗体，使稀释后单克隆抗体的浓度为10μl/ml。50μl的这种溶液加入到ELISA系统(Maxisorp(商标)，Nunc，美国)的96孔板中，然后将该溶液在37℃培育1小时以进行固定化。接下来，除去反应溶液，向每孔中加入50μl的阻滞溶液(Superblock(商标)，PIERCE，美国)，然后在室温培育30分钟，以阻滞反应的进行。在溶液除掉以后，利用含吐温20为0.05％的PBS(T-PBS)溶液洗涤每个孔3次。每个孔中加入50μl浓度均为0.1μg/ml的下列溶液之一：纯化后的FGF-23H蛋白，纯化后的N-末端多肽片段，和纯化后的具有6组氨基酸标记的C-末端多肽片段。将该溶液在室温培育2小时以使其和固定化抗体进行反应。抗体经过反应后，利用T-TBS溶液洗涤孔3次。5种类型的生物素标记的抗FGF-23部分肽的多克隆抗体(hFGF23-25抗体，hFGF23-170抗体，hFGF23-180抗体，hFGF23-210抗体，和hFGF23-237抗体)  利用含阻滞溶液为0.05％的T-TBS溶液稀释到2.5μg/ml，将该溶液在室温培育30分钟以进行次级抗体反应。利用T-TBS溶液洗涤每个孔3次之后，利用含阻滞溶液为10％的(Blockace(商标)，日本制药公司)T-TBS溶液稀释HRP标记的抗生物素蛋白链菌素(DAKO，丹麦)溶液至5000倍，取50μl稀释后的溶液加入进每个孔中，将该溶液在室温培育30分钟以使抗生物素蛋白链菌素与生物素标记的抗体相结合。利用T-TBS溶液洗涤每一个孔4次之后，将50μl的N-四甲联苯胺(是一种过氧化物生色底物，DAKO，丹麦)加入到每一个孔中，接下来在室温进行培育。7分钟之后，50μl浓度为0.5M的硫酸溶液加入到每一孔中以停止反应。利用一种测定96孔板的光吸收值的系统(MTP-300，CORONAELECTRIC CO.，LTD.，日本)进行测定，获得的测定值为450nm处的光吸收减去570nm处的光吸收。结果如图4所示。对于没有加抗体的对照组，从450nm-570nm范围内获得的所有测定值均小于0.015或低于0.015。然而，倚赖于固定化抗体和检测用抗体的结合，反应对于FGF-23全长蛋白(图4A)，N-末端多肽片段(图4B)，和C-末端多肽片段(图4C)而言是特异性的。基于在反应活性上的差别，能够证实抗FGF-23单克隆抗体的识别位点。尤其是，利用2C3B抗体的重组体作为一种固定化抗体，3种类型的生物素化了的多克隆抗体(hFGF23-180抗体，hFGF23-210抗体，和hFGF23-237抗体)之一作为检测抗体，对全长FGF-23蛋白进行了检测。但是，既没有检测到N-末端多肽片段，也没有检测到C-末端多肽片段。另一方面，利用生物素标记的可识别N-末端多肽片段的多克隆抗体(hFGF23-25抗体和hFGF23-170抗体)检测到了全长FGF-23蛋白和N-末端多肽片段，但没有检测到C-末端多肽片段。
因此，这就证实了2C3B抗体能够识别N-末端多肽片段。当1D6A抗体被固定时，利用多克隆抗体作为识别N-末端多肽片段的检测抗体，检测全长蛋白。但是，未检测到N-末端多肽片段和C-末端多肽片段。另一方面，当利用多克隆抗体作为识别C-末端多肽片段的检测抗体，检测全长蛋白和C-末端多肽片段时，利用1D6A抗体与hFGF23-180结合的检测方法是可行的。这些结果表明1D6A抗体可与hFGF23-237多克隆抗体竞争，这样就证实了可识别SEQ ID NO：1中的介于第237位和第251位氨基酸残基之间的一段区域。
实施例12利用组合的抗FGF-23的单克隆抗体通过夹心式ELISA法检测FGF-23蛋白
纯化后的FGF-23蛋白利用实施例3和实施例4中获得的4种固定类型的抗FGF-23的单克隆抗体通过夹心式ELISA法进行检测，这4种类型的生物素标记的抗FGF-23的单克隆抗体为实施例6中作为检测抗体而制得的。
利用50mM的碳酸氢纳溶液稀释4种类型的FGF-23单克隆抗体(1D6A抗体，2A2B抗体，2C3B抗体，和3C1E抗体)至浓度为10μg/ml。50μl的这种溶液加入到ELISA系统(Maxisorp(商标)，Nunc，美国)的96孔板中，然后在4℃培育12小时以进行固定化。接下来，除去反应溶液，向每孔中加入50μl的阻滞溶液(Superblock(商标)，PIERCE，美国)。生成物在室温培育20分钟，以阻滞反应的进行。在溶液除掉以后，利用含吐温20为0.1％的TBS(T-TBS)溶液洗涤每个孔3次。每个孔中加入50μl浓度均为0.1μg/ml的纯化后的FGF-23蛋白溶液。将该溶液在室温培育1小时以使其和固定化抗体进行反应。抗体经过反应后，利用T-TBS溶液洗涤孔4次。3种类型的生物素标记的抗FGF-23单克隆抗体(1D6A抗体，2C3B抗体，和3C1E抗体)利用含阻滞溶液为10％的T-TBS溶液稀释到10μg/ml，取这样的溶液加入每一孔板中。将该溶液在室温培育1小时以进行次级抗体反应。利用T-TBS溶液洗涤每一个孔4次之后，利用含阻滞溶液为10％的(Blockace(商标)，(日本制药公司)T-TBS溶液稀释HRP标记的抗生物素蛋白链菌素(DAKO，丹麦)溶液至5000倍，取50μl稀释后的溶液加入进每一孔中，将该溶液在室温培育20分钟以使抗生物素蛋白链菌素与生物素标记的抗体相结合。利用T-TBS溶液洗涤每个孔4次并且将50μl的N-四甲联苯胺(是一种过氧化物生色底物，DAKO，丹麦)加入到每一个孔中，接下来在室温进行培育。30分钟之后，50μl浓度为0.5M的硫酸溶液加入到每一孔中以停止反应。测定通过利用一种测量96孔板的光吸收值的系统(MTP-300，CORONA ELECTRIC CO.，LTD.，日本)而进行，测量值为450nm下的光吸收值减去570nm下的光吸收值。结果如表6所示。对于没有加固定化抗体或检测抗体的对照组，从450nm-570nm范围内获得的所有测定值均小于0.033或等于0.033。然而，倚赖于固定化抗体和检测用抗体的结合，观察到光吸收值有增加的现象。举例来说，当进行夹心式ELISA实验时，利用2C3B抗体作为固定化抗体(在SEQ IDNO：1所示的FGF-23蛋白的氨基酸序列中的介于第25位和第179位氨基酸残基之间的区域内具有一个识别位点)，生物素标记的1D6A和3C1E抗体作为检测用抗体(在SEQ ID NO：1所示的FGF-23蛋白的氨基酸序列中的介于第180位和第251位氨基酸残基之间的区域内具有识别位点)，得到的所有450nm-570nm的光吸收值均高达2.9或更高。由SEQ ID NO：1所示的FGF-23蛋白的氨基酸序列中的介于第179位精氨酸和第180位丝氨酸之间的切割所得到的多肽片段以该种方式通过夹心式ELISA实验从被测定的序列中去除掉了。因此，利用这样一种抗体的重组体，不用识别N-末端多肽片段或C-末端多肽片段就能够将未切割的FGF-23蛋白高灵敏度地检测出来。当将实施例2中制备的全长FGF-23H蛋白，N-末端多肽片段，和C-末端多肽片段以与以前报道相似的方式接种小鼠时，仅在全长FGF-23H蛋白的病例中出现了血清中磷的量诱导降低的现象。因此，如SEQ IDNO：1所示的FGF-23蛋白的氨基酸序列中的介于第179位精氨酸和第180位丝氨酸之间的切割极大的改变了FGF-23蛋白的活性。利用这里所示的方法(包括去除切割的多肽的同时，选择性检测未切割的FGF-23H蛋白)，可以更加精确地检测和测定样品中具有活性的FGF-23。另一方面，当如SEQ ID NO：1所示的FGF-23蛋白的氨基酸序列中的介于第180位和第251位氨基酸残基之间的区域内具有识别位点的1D6A抗体和3C1E抗体被作为固定化抗体，并且生物素标记的1D6A抗体和3C1E抗体也被用于检测用抗体时，通过抗体间的竞争相似地表明了具有可识别如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列中的介于第180位和第194位氨基酸残基之间的区域的3C1E抗体组其识别位点与具有可识别如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列中的介于第237位和第251位氨基酸残基之间的区域的1D6A抗体的识别位点不同。而且，实验还表明结合使用这些抗体可以建立一种测定方法，利用该测定方法可除去位于SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列中的介于第25位和第179位氨基酸残基之间的多肽片段，并且可以高灵敏度检测出第180位至第251位残基之间的C-末端多肽片段。
表5
结合利用抗FGF-23的单克隆抗体(作为固定化抗体)和生物素化的抗体(作为检测抗体)通过夹心式ELISA法检测FGF-23蛋白获得的光吸收值。
                固定化抗体
         1D6A     2C3B     3C1E     无
 检测抗体
 1D6A    0.038    3.469    3.131    0.015
 2C3B    1.287    0.466    ＞3.5    0.015
 3C1E    1.549    ＞3.5    0.058    0.033
 无      0.020    0.024    0.023    0.022
实施例13利用抗FGF-23的单克隆抗体通过夹心式ELISA法定量测定FGF-23蛋白
利用50mM的碳酸氢纳溶液稀释2C3B抗体至浓度为10μg/ml。50μl的这种溶液加入到ELISA系统(Maxisorp(商标)，Nunc，美国)的96孔板中，然后在4℃培育12小时以进行固定化。接下来，除去反应溶液，向每孔中加入250μl的阻滞溶液(Superblock(商标)，PIERCE，美国)，然后生成物在室温培育20分钟，以阻滞反应的进行。在溶液除掉以后，利用含吐温20为0.1％的TBS(T-TBS)溶液洗涤每一个孔2次。利用含阻滞溶液(SuperBlock(商标)，PIERCE，美国)为10％的T-TBS溶液稀释实施例2中纯化后得到的FGF-23蛋白，得到一组浓度分别为10，3，1，0.3，0.1，0.03，0.01，或0.003ng/ml的FGF-23蛋白溶液。每种溶液取50μl加入到每个孔中。将该溶液在室温培育1小时以使其和固定化抗体进行反应。抗体经过反应后，利用T-TBS溶液洗涤孔4次，2种类型的生物素标记的抗FGF-23单克隆抗体(1D6A抗体和3C1E抗体)利用含封闭溶液(Blockace(商标)，(日本制药公司)为10％的T-TBS溶液稀释到10μg/ml，取这样的溶液加入每一孔板中。将该溶液在室温培育30分钟以进行次级抗体反应。利用T-TBS溶液洗涤每一个孔4次之后，利用含阻滞溶液为10％的(Blockace(商标)，(日本制药公司)T-TBS溶液稀释HRP标记的抗生物素蛋白链菌素(DAKO，丹麦)的溶液至5000倍，取50μl稀释后的溶液加入进每一孔中。将该溶液在室温培育30分钟以使抗生物素蛋白链菌素与生物素标记的抗体相结合。利用T-TBS溶液洗涤每个孔4次后，将50μl的N-四甲联苯胺(是一种过氧化物生色底物，DAKO，丹麦)加入到每个孔中，接下来在室温进行培育。25分钟之后，50μl浓度为0.5M的硫酸溶液加入到每一孔中以停止反应。测定通过利用一种测量96孔板的光吸收值的系统(MTP-300，CORONA ELECTRIC CO.，LTD.，日本)而进行，测量值为450nm下的光吸收值减去570nm下的光吸收值。结果如图6所示。由于FGF-23蛋白(浓度至少为0.03ng/ml)的存在，观察到了测定值的显著增大，并且在0.03-大约3ng/ml的浓度范围之内，获得了在450nm-570nm范围内所有测定值具有浓度倚赖性增加的结果，表明在该浓度范围之内可测定FGF-23蛋白。
实施例14抗FGF-23单克隆抗体固定层析柱的制备
利用一种商业化的固定试剂(SulfoLink(商标)，PIERCE，美国)制备了一种固定化的抗FGF-23抗体的层析柱，该层析柱通过免疫沉淀方法在收集FGF-23蛋白或纯化FGF-23蛋白方面是有效的。将1C3H抗体，1D6A抗体，和2C3B抗体在pH值为6.0，浓度为0.1M的磷酸盐缓冲液(含5mM的乙二胺四乙酸)中进行稀释，分别制得浓度为1mg/ml，1mg/ml，和0.4mg/ml的溶液。向1ml的这种抗体溶液中加入6mg的2-巯基乙醇胺，所得溶液在37℃以上下摇荡的方式混合1小时，然后，抗体内的二硫键通过约简反应被切割。当缓冲液利用1.5ml的一种结合缓冲溶液(50mM的Tris/HCl溶液，pH值为8.5，5mM的EDTA)在NAP 10层析柱(美国Amersham Pharmacia生物技术有限公司)中进行交换时，除掉2-巯基乙醇胺以停止约简反应。这些抗体溶液加入到已利用结合缓冲溶液洗涤过的1ml的SulfoLink(商标)结合凝胶(PIERCE，美国)中。该溶液在室温以上下摇荡的方式混合30分钟以进行结合反应。经过离心过滤后，利用一种结合缓冲液对树脂进行洗涤。为了阻滞未反应的硫醇基，加入1ml浓度为0.05mM的左旋半胱氨酸-盐酸溶液，然后将该溶液在室温以上下摇荡的方式混合30分钟。接下来，利用1M的氯化钠溶液洗涤树脂以除去未反应的抗体和左旋半胱氨酸。
实施例15利用免疫沉淀法对存在于CHO-FGF23H细胞转导小鼠中的FGF-23蛋白进行检测
为了检测FGF-23蛋白在血液中的存在状态，表达FGF-23H的细胞被转移至裸鼠中，然后，由这些细胞分泌到血液中的FGF-23H蛋白利用免疫沉淀法检测到了。2×107的CHO-FGF23H细胞，或CHO ras克隆1细胞作为对照以皮下转导方式转导至每一只Balb/c裸鼠中。转导后的第32天，从细胞已成功粘附形成肿瘤的小鼠中采集血清。将从5只CHO ras克隆1转导小鼠中采集到的血清和从6只CHO-FGF23H转导的小鼠中采集到的相同量的血清以相同的体积各自独立地混合。向150μl各自混匀的血清中分别加入下列物质：10μl实施例14中制备的已固定上1D6A抗体的树脂，10μl实施例14中制备的已固定上2C3B抗体的树脂，和10μl未固定抗体的树脂。将生成物在4℃以上下摇荡的方式混合1小时。以利于抗体和FGF-23进行反应。利用PBS溶液洗涤该树脂3次以除去未反应的产物。向每一种树脂中加入一种50μl的缓冲液(50mM的Tris-Cl溶液，pH值为6.8，1％的SDS溶液，10％的甘油溶液，0.001％溴酚蓝溶液，2mM的EDTA溶液，和20mM的DDT溶液)。生成物在95℃加热5min，然后进行离心分离。收集这样得到的上清液。利用浓度为10％-20％的梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳对上清液进行分离，通过一种半干印迹转移槽(Owl Separation Systems，美国)将凝胶中的蛋白转移到一种聚偏氟乙烯膜(美国Millipore公司)上。聚偏氟乙烯膜在经由(Blockace(商标)，日本制药公司)稀释至0.5μg/ml的一种生物素标记的2A2B或1C3H抗体溶液中在4℃条件下培育12小时。而且，HRP标记的抗生物素蛋白链菌素(DAKO，丹麦)同生成物进行反应。利用一种ECL Plus发光系统(美国Amersham Pharmacia Biotech公司)将混合溶液暴露于胶片上1小时，然后用自动处理器(日本富士胶片公司)进行处理。结果如图7所示。对于没有固定化抗体的树脂，根本就没有检测到信号分子。然而，当利用1C3H抗体进行免疫沉淀，利用2A2B抗体作检测之用时，检测到了一种22kDa的信号分子。当利用1C3H抗体进行检测之用时，检测到了22kDa和10kDa的信号分子。此外，当利用1D6A抗体进行免疫沉淀，利用2A2B抗体作检测之用时，未检测到22kDa的信号分子，当1C3H抗体作为检测之用时，仅检测到了一种10kDa的信号分子。而且，当利用2C3B抗体进行免疫沉淀和利用2A2B抗体作检测之用时，检测到了22kDa和16kDa的信号分子，当利用1C3H抗体进行检测时，仅检测到了一种22kDa的信号分子。表明2A2B抗体可识别SEQ ID NO：1中的介于第148位和第163位氨基酸残基之间的区域，1C3H抗体可识别SEQ ID NO：1中的介于第180位和第194位氨基酸残基之间的区域。而且，通过Western印迹法实验表明2A2B抗体可识别N-末端多肽片段(该片段相当于SEQ ID NO：1所示的介于第25位和第179位氨基酸残基之间一段序列)，通过电泳检测信号分子的分子量为16kDa。已经表明1C3H抗体可识别如SEQ ID NO：1所示的介于第180位和第251位氨基酸残基之间的C-末端多肽片段，检测到的信号分子的分子量为16kDa。因此，这就清楚的表明了该实验中测定到的16kDa的信号分子是N-末端多肽片段，10kDa的信号分子表明是C-末端多肽片段。此外，从小鼠血清中采集到的分子量为22kDa的多肽能够被下列抗体所识别：能识别第25位至第179位氨基酸残基之间的N-末端区域的2C3B抗体；能识别第148位至第163位氨基酸残基之间区域的2A2B抗体，和由1C3H产生的能识别介于第180位和第194位氨基酸残基之间的抗体，但该多肽不能被1D6A抗体所识别(该抗体能识别如SEQ IDNO：1所示的介于第237位和第251位氨基酸残基之间的区域)。本实验中观察到的分子量大约为22kDa的信号分子可能由FGF-23蛋白的切割产生，切割位点位于1C3H抗体识别区域的C-末端。在对血清进行测定的实验中观察到了与发生于SEQ ID NO：1所示的第179位精氨酸和第180位丝氨酸之间的切割不同的切割和由切割产生的片段，对此我们予以了注意。
实施例16血清中FGF-23蛋白的切割
(1)大鼠血清和纯化后的FGF-23蛋白的混合实验
通过混合纯化后的FGF-23蛋白和大鼠血清对血清中FGF-23蛋白的切割进行了检测。大鼠血清加入到20ng纯化后的FGF-23蛋白中，得到最终浓度为50％。将两种溶液混合并进行培养0，0.5，1，2，4，8，和24小时。通过聚丙烯酰胺电泳分离溶液，然后通过一种半干印迹转移槽(Owl Separation Systems，美国)将凝胶中的蛋白转移到一种聚偏氟乙烯(美国Millipore公司)膜上。利用2A2B抗体通过Western印迹法进行测定，可测定由纯化后的FGF-23蛋白衍生得到的代谢物。其结果如图8所示。和血清混合以后，存在于溶液中的全长FGF-23蛋白的数量随培育时间的增加而降低，并且观察到了分子量为22kDa的新片段的出现及增加。
(2)人的血清或血浆与纯化后的FGF-23蛋白的混合实验
将人的血清或人血浆以最后50％的浓度加入到20ng的纯化的FGF-23蛋白，接着在37℃温育3小时。将溶液通过聚丙烯酰胺凝胶分离，然后将凝胶上的蛋白利用半干印迹系统(Owl分离系统，美国)转移到PVDF膜上(Millipore美国)。利用2A2B抗体通过Western印迹法进行测定，可测定由纯化后的FGF-23蛋白衍生得到的代谢物。其结果如图9所示。当人的血清与FGF-23蛋白混合时，出现了一条分子量为22kDa的条带。但是，当人的血浆与FGF-23蛋白混合时，未出现一条分子量为22kDa的条带。因此，推断该22kDa的条带来源于存在于血清中的蛋白切割酶。
实施例17切割FGF-23蛋白的酶的鉴定
(1)凝血酶作用下的FGF-23的切割
凝血酶(美国Sigma公司)加入到20ng纯化后的FGF-23蛋白中，得到最终浓度为1单位/ml的溶液，接下来培育3小时。将培育后的溶液利用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，然后通过一种半干印迹转移槽(Owl Separation Systems，美国)将凝胶中的蛋白转移到一种PVDF膜(美国Millipore公司)上。利用2A2B抗体通过Western印迹法进行测定，可测定由纯化后的FGF-23蛋白衍生得到的代谢物。其结果如图10所示。全长FGF-23蛋白消失，并且其带转换成22kDa的带。
(2)水蛭素对血清中FGF-23蛋白切割的抑制作用
为了检测血清中凝血酶对FGF-23切割的作用，对水蛭素(已知其为一种凝血酶选择性抑制剂)的效果进行了检测。以最后浓度为50％，在20ng的纯化的FGF-23蛋白中加入大鼠血清，接着温育4小时。而且，加入大鼠血清的同时，加入了浓度为1.0单位/ml的水蛭素，接下来进行类似的温育。将该溶液利用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，然后将凝胶中的蛋白利用一种半干印迹转移槽(Owl SeparationSystems，美国)转移到一种PVDF膜(美国Millipore公司)上。利用2A2B抗体通过Western印迹法进行测定，可测定由纯化后的FGF-23蛋白衍生得到的代谢物。其结果如图11所示。对于加入大鼠血清的溶液，一些FGF-23蛋白转化成了22kDa的多肽，并且由于水蛭素的存在，抑制了22kDa条带的出现。所以，实验表明血清中产生的FGF蛋白的切割是由于凝血酶或与其类似的酶。
实施例18血清中FGF-23蛋白切割位点的鉴定
为了鉴定血清中FGF-23的切割位点，10μg纯化后的FGF-23蛋白和大鼠血清混合24小时，由此产生22kDa的多肽。该溶液中22kDa的多肽被吸附于实施例14中制备的抗1C3H的抗体柱上，洗脱，并纯化。用于此处的抗体柱通过在500μl固定链霉抗生素的树脂(美国Amersham Pharmacia生物技术有限公司)上吸附200μg生物素化的1C3H抗体而制得。衍生得到的FGF-23蛋白利用0.1M的甘氨酸溶液(pH值为2.7)从抗体柱上洗脱。这样纯化的多肽通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，用CBB进行染色，以致可以如图12中所示鉴定纯化的22kDa多肽。切出这条带，进行MALDI-TOF MS分析。基于从该分析中得到的分子量，表明这种22kDa的多肽具有如SEQ IDNO：1所示的氨基酸序列中的从第25位酪氨酸至第196位精氨酸之间的一段序列。
这些结果显示：在血清中，FGF-23蛋白被血清中的凝血酶在SEQID NO：1所示的氨基酸序列中的从第196位精氨酸之后的位置进行切割，然后，转换成SEQ ID NO：1中的介于第25位和第196位氨基酸残基之间的一段序列所示的多肽。如上所述，测定血液中具有活性的FGF-23蛋白需要检测SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列中的介于第179位和第180位氨基酸残基之间未进行切割的多肽。实验表明具有活性的全长FGF-23蛋白在制备血清样品过程中在第196位和第197位氨基酸残基之间发生了部分切割，识别C-末端的抗FGF-23单克隆抗体不能识别由其本身产生的代谢物。尤其是，当利用可识别SEQ ID NO：1所示氨基酸序列中的介于第25位和第179位氨基酸残基之间的区域的一种抗体，和可识别SEQ ID NO：1所示氨基酸序列中的介于第180位和第196位氨基酸残基之间的区域的一种抗体结合进行夹心式ELISA实验时，血清制备过程中所导致的切割效应可以忽略不计。然而，当利用一种可识别SEQ ID NO：1所示氨基酸序列中的介于第25位和第179位氨基酸残基之间的区域的抗体，和一种可识别SEQ IDNO：1所示氨基酸序列中的介于第197位和第251位氨基酸残基之间的区域的抗体时，与血浆相比，血清中的测定值可能下降。在得到的抗FGF-23的单克隆抗体中，1C3H抗体和3C1E抗体可识别SEQ IDNO：1所示氨基酸序列中的介于第180位和第194位氨基酸残基之间的区域。因此，血清中FGF-23的切割得到的22kDa的蛋白(对应于SEQ ID NO：1所示氨基酸序列中的第25位和第196位氨基酸残基之间的一段序列)可被识别，其与在SEQ ID NO：1所示氨基酸序列中的介于第179位和第180位氨基酸残基之间的切割产生的多肽片段具有明显差异。因此，表明这些抗体在建立测定血清样品的方法中是非常有用。
实施例19对患有肿瘤诱导骨软化症病人中血清和血浆中FGF-23蛋白浓度的定量分析
已有报道表明在肿瘤诱导的骨软化症中，FGF-23在肿瘤中过量的生成，已知该疾病可通过除去病原性肿瘤而治愈。但是，肿瘤诱导的骨软化症中的病原性肿瘤由于生长力弱，一般较小，经常很难辨别。因此，肿瘤诱导的骨软化症和低磷酸盐血症很难辨别诊断。因此，如果证明血液中FGF-23的浓度能够作为诊断肿瘤诱导的骨软化症的指示剂，就可发展一种定量测定血液中FGF-23浓度的方法，这样的方法在临床上非常有用的。
从肿瘤诱导的骨软化症病人中获得血清和血浆样品，利用抗FGF-23的单克隆抗体通过夹心式ELISA系统对分析物中的FGF-23进行定量分析。上述方法利用了抗FGF-23单克隆抗体和ELISA系统。2C3B抗体用作固定化抗体，生物素标记的3C1E或1D6A抗体用于检测用抗体。纯化的2C3B抗体用50mM的碳酸氢钠溶液稀释至10μg/ml。向ELISA(Maxisorp(商标)，Nunc，美国)实验用的96孔板中的每个孔加入50μl得到的溶液，然后在4℃温育12小时固定。随后，除去反应溶液，每孔中加入250μl的阻滞溶液(SuperBlock(商标)，PIERCE，美国)，得到的溶液在室温培育30分钟，由此进行封闭。溶液被除去之后，每一个孔用含有0.1％吐温20的TBS(T-TBS)溶液洗涤2次。为了避免与小鼠抗体发生非特异性反应，肿瘤诱导骨软化症病人的血清和血浆样品利用含有小鼠IgG1的T-TBS溶液稀释2倍，浓度为80μg/ml的小鼠IgG1作为同型对照。而且，为了确保与FGF-23蛋白发生特异性反应，样品均用含有过量体积(80μg/ml)的用于固定化的2C3B抗体的T-TBS溶液稀释2倍。产生标准曲线的标准溶液为通过向正常受试者的血清或血浆中添加纯化的FGF-23蛋白，用类似含有同型对照抗体的溶液进行稀释，最终形成浓度分别为0.5，0.25，0.125，0.061，0.031，和0.015ng/ml的溶液。加50μl各样品至微量滴定盘的每孔中，然后溶液在室温培育1小时，以使分析物中的FGF-23蛋白与固定化的抗体发生反应。抗体反应完成之后，每一个孔用T-TBS溶液洗涤4次，然后向孔中加入两种类型用生物素标记的含有10％阻滞剂(Blockace(商标)，日本制药公司)的T-TBS溶液稀释至10μg/ml的抗FGF-23的单克隆抗体的溶液(含有1D6A抗体和3C1E抗体)。该溶液在室温培育30分钟，以进行次级抗体反应。用T-TBS溶液将孔洗涤4次后，每孔加入50μl用含有10％封闭液(Blockace(商标)，日本制药公司)的T-TBS溶液稀释5000倍的HRP(辣根过氧化物酶)标记的抗生物素蛋白链菌素(DAKO，丹麦)。该溶液在室温培育30分钟，以使抗生物素蛋白链菌素与生物素标记的抗体相结合。每个孔用T-TBS溶液将孔洗涤4次，然后向每孔加入50μl的N-四甲联苯胺溶液(是一种过氧化物酶生色底物，DAKO，丹麦)，室温培育。30分钟后，每孔加入50μl 0.5M的硫酸溶液，以停止反应。利用一个测定96孔板(MTP-300，CORONAELECTRIC CO.，LTD.，日本)的光吸收的系统进行测定，其值为450nm的吸收值减去570nm的吸收值。一个代表FGF-23特异性反应的吸收值为存在过量同型对照抗体时所测得的450nm的吸收值减去570nm的吸收值。结果见图13。当1D6A抗体用作检测抗体时，血浆和血清样品的测量值分别为0.033和0.008。测得的血清样品的吸收值明显低于血浆。另一方面，当3C1E用作检测抗体时，血清和血浆中样品的吸收值几乎完全相同。这些结果表明，如实施例18描述的在血清中切割那样，FGF-23蛋白可能在样品中部分切割。因此，结果表明临床样品的测量值随上述检测用的抗体的不同而存在差异。因此，利用3C1E抗体作为一种检测抗体的夹心式ELISA系统也能够对血清中产生的切割产物进行测定，然后对肿瘤切除前后采集的血浆中FGF-23的浓度进行了测定。利用通过向正常受试者的血浆样品中加入不同浓度的纯化后的FGF-23蛋白而制得的标准溶液，基于纯化的蛋白量的增加光吸收值也增加的事实制得一条标准曲线。由此得到的标准曲线见图14A。由此得到的标准曲线也能被用于在稀释了2倍的人的血清或血浆样品中利用检测变化范围介于30pg/ml和至少约500pg/ml(该值在标准曲线中是一个明显增加的浓度值)之间定量分析FGF-23蛋白。在这样的条件下，从肿瘤诱导的骨软化症病人肿瘤切除之前的一天和肿瘤切除之后的一个月或更长时间对血浆样品中的FGF-23浓度进行了定量测定，测定结果见图14B。肿瘤切除之前血浆样品中的FGF-23蛋白浓度约为270pg/ml。但是，在肿瘤切除之后的样品中，FGF-23蛋白浓度降至检测阈值(30pg/ml)或更少。因此，清楚表明在肿瘤诱导的骨软化症中，由于病原肿瘤的存在，血液中FGF-23以可检测到的浓度存在，肿瘤切除之后FGF-23蛋白的浓度显著降低。利用抗FGF-23单克隆抗体的ELISA法在诊断肿瘤诱导的骨软化症中非常有用，利用具有特异识别位点的抗体(将血清中FGF-23的切割效应也考虑进来)，使定量测定成为可能。
实施例20用抗FGF-23单克隆抗体进行免疫组织学染色
肿瘤诱导的骨软化症中的病原肿瘤用一个抗FGF-23的单克隆抗体进行染色。将切除的一个肿瘤浸泡在一种包埋性溶液中，为冷冻做好准备，冷冻剂使用液氮冷却的丙酮，由此制得冷冻的肿瘤结块。除此以外，将从肿瘤组织周缘确定为正常组织的部分切取一块作为对照，冷冻成结块。用低温保持器(CMI1900，LEICA，德国)将冷冻的结块切成厚度为4μm的薄片。该切片被粘附到MAS包被的载玻片上(MATSUNAMI GLAS IND.，LTD.，日本)，进行冷冻和干燥。由此制得的切片在零下20℃下保藏。粘附上冷冻切片的载玻片在丙酮中于室温培育5分钟，以使组织固定在载玻片上。用磷酸盐缓冲液洗涤之后，在含有1％过氧化氢和0.1％叠氮化钠的磷酸盐缓冲液中，室温培养30分钟，以使内生性过氧化物酶失活。随后，混合溶液用含有0.1％吐温20的磷酸盐缓冲液洗涤，然后在含有4％脱脂乳的磷酸盐缓冲液中室温培养30分钟，进行封闭反应。随后，在含有10μg/ml的生物素标记的1C3H和2C3B抗体的磷酸盐缓冲液中室温培养1小时，使组织中的FGF-23与加入的单克隆抗体发生反应。用含有0.1％吐温20的磷酸盐缓冲液洗涤之后，用一个过氧化物酶试剂盒(Vectastain Elite ABC(商标)，VECTOR实验室，美国)将山葵过氧化物酶与和组织特异性结合的生物素标记的单克隆抗体相结合。用含有0.1％吐温20的磷酸盐缓冲液洗涤之后，进行过氧化物酶与底物(DAKO液相DAB底物显色系统(商标)，DAKO，丹麦)的反应，然后用磷酸盐缓冲液中止反应。用离子交换水洗涤之后，在用离子交换水稀释5倍的苏木精染色液(Merck & Co.，美国)中室温培养30秒，然后用活水洗涤。接下来，用乙醇进行脱水，用二甲苯进行渗透，然后混合溶液用封装液封面。结果见图15。认为与肿瘤组织中的FGF-23发生反应的位点被染成褐色。可是，没有在肿瘤周缘组织中观察到染色的影像。因此，确定在肿瘤诱导的骨软化症的病原性肿瘤中存在高浓度的FGF-23。
实施例21小鼠FGF-23蛋白的表达与纯化
小鼠FGF-23的序列已经有过报道(Yamashita，T.等，生物化学与生物物理研究通讯，277：494-498，2000)。小鼠FGF-23的序列信息能通过搜索NCBI基因序列数据库而获得。基于由此得到的序列信息，利用嵌套PCR以获得编码小鼠FGF-23蛋白的cDNA。扩增反应第一阶段使用的引物为：一个mF5引物(见SEQ ID NO：25)和一个mF3引物(见SEQ ID NO：26)(5’端和3’端不翻译的区域分别互补)，小鼠FGF-23蛋白的cDNA序列被合成。94℃保持1分钟后，以从小鼠肺部取得的cDNA(克隆技术公司，美国)为模板，进行30个PCR循环。使用的酶为LA-Taq DNA聚合酶(日本宝酒造公司)，每个循环包括：94℃，30秒；55℃，30秒；72℃，45秒。接下来，反应的第二阶段利用如下两个引物：一个含有SEQ ID NO：27所示的从初始密码子至翻译区域的mF23F引物，和一个含有SEQ ID NO：28所示的从翻译区域至终止密码子的mF23R引物。在mF23F引物中，引入了一个克隆用的EcoR I限制酶识别序列和一个Kozak序列。同时，在mF23R引物中，在终止密码子后面引入了一个Not I限制酶识别序列。98℃保持1分钟后，以第一阶段反应的反应溶液作为模板，进行35个PCR循环。使用的酶为PyroBest DNA聚合酶(日本宝酒造公司)，每个循环包括：98℃，10秒；58℃，10秒；72℃，60秒。因此，编码小鼠FGF-23蛋白的cDNA序列得以扩增。该cDNA被克隆至一个pEAK8载体(EdgeBiosystem，美国)的EcoR I位点和Not I位点。该载体即pEAK8mFGF-23。而且，根据实施例1中制备FGF-23RQH的方法，构建小鼠的FGF-23RQ，其中引入一个突变，即在小鼠的FGF-23切割酶识别位点以一个谷氨酸残基代替一个精氨酸残基。该突变的引入方法参见实施例1(3)中所描述的方法。为了引入该突变，合成了两个引物：一个是正向引物mRQF(见SEQ ID NO：29)，另一个是反向引物mRQR(见SEQ ID NO：30)。首先，利用pEAK8mFGF-23为模板，一个mF23F引物和mRQR引物的重组体，和一个mF23R引物和mRQF引物的重组体，进行PCR反应，由此获得每种样品的PCR片段。接下来，利用两种产物的混合物作为模板，位于小鼠FGF-23cDNA两个末端的一个mF23F和一个mF23R引物，进行PCR反应，由此扩增了引入突变的FGF-23 cDNA的片段。产物被克隆至一个pEAK8/IRES/EGFP质粒的EcoR I限制酶位点和Not I限制酶位点。混合溶液被纯化，然后测定其核苷酸序列，确保引入了靶突变的小鼠FGF-23 cDNA被成功克隆。命名其为pEAK8/IRES/EGFP/mFGF-23RQ。该质粒还被引入到CHO ras克隆1细胞中，加入5μg/ml的嘌呤霉素(美国Sigma公司)，然后选择具有抗药性的细胞。克隆完后，获得了小鼠表达FGF-23的细胞。这样的细胞命名为CHO-mFGF23RQ。这样的CHO-mFGF23RQ细胞在辊式瓶中培养，由此获得了约12升的培养物上清液。根据实施例2(3)中描述的纯化FGF-23蛋白的方法对该溶液进行纯化，由此获得了纯化的FGF-23RQ。
本实验所用引物的序列如下：
mF5：ATTAGCCACTCGTGCTGTGCAATG  (SEQ ID NO：25)
mF3：GCAGCCTGGCCTGGGGACCTA  (SEQ ID NO：26)
mF23F：GGAATTCCACCATGCTAGGGACCTGCCTTAGACTC(SEQ ID NO：27)
mF23R：ATAGTTTAGCGGCCGCCTAGACGAACCTGGGAAAGGGGCGACA(SEQ ID NO：28)
mRQF：TTCGCCCACGGCAACACACGCAAAGCGCCGAGGAC(SEQ ID NO：29)
mRQR：GTCCTCGGCGCTTTGCGTGTGTTGCCGTGGGCGAA(SEQ ID NO：30)
实施例22抗人FGF-23的单克隆抗体和FGF-23的交叉反应活性
利用聚丙烯酰胺凝胶电泳对纯化后的小鼠FGF-23RQ蛋白进行分离，转移到一种聚偏氟乙稀膜(美国Millipore公司)上，然后利用3C1E抗体进行Western印迹法测定。因此，得到了一条分子量大约为32.5kDa的条带，如图16A所示。纯化后的小鼠FGF-23RQ蛋白溶液被系列稀释，然后通过利用抗人FGF-23的单克隆抗体的夹心式ELISA方法对其进行尝试性测定。这里所用的纯化后小鼠FGF-23RQ蛋白溶液的浓度未能精确的获得。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离条带，并进行测定，与纯化的已知浓度的人FGF-23蛋白进行比对，并用CBB染色。实验人员认为当以图16B所示的相对值为10进行表达时，小鼠FGF-23RQ蛋白溶液的浓度范围在1至5μg/ml之间。利用2C3B抗体作为固定化抗体，3C1E抗体作为检测抗体对稀释后的小鼠FGF-23RQ蛋白溶液进行了测定。测定结果如图16B所示。由于所得到的450nm-570nm范围内的测定值随纯化后的小鼠FGF-23RQ蛋白溶液的浓度增加而增大，那么小鼠的FGF-23蛋白就能够以一种浓度依赖方式利用抗人FGF-23单克隆抗体通过ELISA法进行检测了。而且，可证明抗人FGF-23的单克隆抗体能够识别小鼠的FGF-23蛋白，表明实施例27和28中所观察到的抗人FGF-23单克隆抗体通过结合小鼠的内生性FGF-23能中和或修饰其活性。
实施例23对患有遗传性血磷酸盐过少疾病的小鼠血液中的FGF-23蛋白进行检测
FGF-23已知是一种诱导肿瘤诱导的骨软化症的因子，因为在ADHR的FGF-23基因中发现了错义突变，所以已知其也参与诱导ADHR。然而，遗传性血磷酸盐过少疾病的另一种形式，XLH，尽管已阐明其对应的基因，但目前对引发该疾病的机理还没有完全弄清。此外，该疾病和FGF-23的关系也是未知的。为了检测该疾病中FGF-23的参与情况，所以对Hyp小鼠(患有XLH疾病)血液中的FGF-23的浓度进行了尝试性测定。
ELISA方法中利用2C3B抗体作为固定化抗体，生物素标记的3C1E抗体作为检测抗体进行测定。利用一种50mM的碳酸氢纳溶液稀释纯化后的2C3B抗体至浓度为10μl/ml。50μl的生成物溶液加入到ELISA系统(Maxisorp(商标)，Nunc，美国)中的96孔板中，然后将该溶液在4℃培育12小时以进行固定化。接下来，除去反应溶液，向每孔中加入250μl的阻滞溶液(Superblock(商标)，PIERCE，美国)，然后在室温培育30分钟，以阻滞反应的进行。除掉溶液以后，每个孔用含有0.1％吐温20的TBS(T-PBS)溶液洗涤两次。从27-30周大小的同一窝出生的Hyp小鼠和正常的对照组小鼠眼眶中采集血样，然后制得血清样品。血清样品用含有2C3B抗体或一个小鼠IgG1抗体(作为同型对照)的T-TBS溶液稀释2倍，浓度为40μg/ml。每一种血清样取50μl加入进微量滴定盘的每个孔中，然后在室温培育1小时，这样可使分析物中的FGF-23蛋白与固定化抗体进行反应。经过抗体反应后，利用T-TBS溶液洗涤孔4次，然后向每个孔中加入稀释后的浓度为2μl/ml的2C3B抗体溶液(稀释方法为利用一种含10％阻滞溶液(Blockace(商标)，日本制药公司)的T-TBS溶液稀释2C3B抗体至2μl/ml)。将该溶液在室温培育30分钟以同次级抗体进行反应。经过T-TBS溶液洗涤每一个孔4次以后，取50μl稀释后(稀释方法为：利用一种含10％阻滞溶液(Blockace(商标)，日本制药公司)的T-TBS溶液稀释HRP标记的抗生物素蛋白链菌素(DAKO，丹麦)至5000倍)的溶液加入进每一孔中。该溶液在室温培育30分钟以使抗生物素蛋白链菌素和生物素标记的抗体相结合。利用T-TBS溶液洗涤每个孔4次，然后向每个孔中加入50μl的N-四甲联苯胺(DAKO，丹麦)，是一种过氧化物生色底物，在室温进行培育。30分钟后，向每一孔中加入50μl浓度为0.5M的硫酸溶液以停止反应。利用测量96孔板(MTP-300，CORONA ELECTRIC CO.，LTD.，日本)的光吸收值的系统进行测定，得到的值(A450-A570)为450nm下的光吸收值减去570nm下的光吸收值。一个表明FGF-23特异性反应的光吸收值是通过如下方法获得的：在反应中加入同型对照获得的A450-A570值减去在反应中加入2C3B抗体作为吸收抗体获得的A450-A570值。结果如图17所示。图17清楚的表明了Hyp小鼠血液中FGF-23浓度的显著升高。由于Hyp小鼠患低磷酸盐血症是由于PHEX的基因缺陷，并且XLH，人类的低磷酸盐血症，是由于PHEX基因的变异或缺陷所引起的，因此Hyp小鼠被认为是XLH模型小鼠。该结果有力的表明了血液中FGF-23浓度的升高可作为XLH中诱导低磷酸盐血症的一个因素。
实施例24 FGF-23和1，25D的相互控制作用
(1)接种FGF-23H引起1，25D下降
纯化后的FGF-23H蛋白通过臀静脉给6只6周大的BALN/c雄性小鼠以每只小鼠5μg的剂量进行接种。接种1，4，和9小时后，采集血样，并且对血液中1，25D的浓度进行了测定。结果如图18A所示。接种FGF-23H后3小时，观察到了血液中1，25D的浓度有了显著的下降，并且接种9小时后，其浓度进一步的降低。
(2)接种1，25D诱导产生FGF-23
给小鼠接种1，25D，并且检测了血中FGF-23的浓度变化。6只7周大的雄性小鼠构成一组。一组接种0.025μg溶于含有0.05％吐温的磷酸盐缓冲液中的1，25D，对照组接种含有0.05％吐温的磷酸盐缓冲液。通过腹腔进行接种。接种后8小时，在麻醉状态下从小鼠的心脏中采集血样，然后制得了血清样品。利用如实施例23相同的方法通过ELISA对这些血清样品进行检测，然后血液中的FGF-23的数量利用由人FGF-23蛋白标准溶液获得的标准曲线进行测定。这些结果如图18B所示。接种1，25D后8小时，观测到了血中FGF-23浓度的显著升高。
所以，结果表明FGF-23与1，25D具有密切的相互作用关系。
实施例25患有肾功能衰竭性高磷酸盐血症的病人血液中的FGF-23浓度
给七周大小的威斯塔氏小鼠服用CE-2(日本CLEA公司，该CE-2已经以0.75％的一种比例混合了腺嘌呤)，这样可在威斯塔氏小鼠体中产生一种肾功能衰竭性高磷酸盐血症模式。作为一对照组，同样给威斯塔氏小鼠服用CE-2(未混合腺嘌呤)。服用混合药剂3周后，从臀动脉中采集血样，收集血清。采集血样后，兔子饲养在代谢性笼舍中并采集尿样24小时。对血清中的磷酸盐浓度进行测定。结果如图19A所示。血清和尿中的肌酸酐利用一种商业化的试剂盒(CRE-Ag Kainos(商标)，KAINOS实验室，INC.，日本)通过一种酶法进行测定。结果如图19B所示。而且，利用2C3B抗体作为一种固定化抗体和3C1E抗体作为一种检测抗体通过ELISA系统对血清中FGF-23的浓度进行了测定。结果如图19C所示。
在这种肾功能障碍的疾病中病情发展情况通过尿中肌氨酸酐浓度下降和血清中肌氨酸酐浓度升高而得以清楚体现。随着病情发展，演变成了血磷酸盐过高疾病。在该病例中，血液中FGF-23蛋白的浓度在一个显著的高水平值。这种病例被认为反映了肾功能衰竭的一种模式，表明了FGF-23可能是一种诱导肾功能下降和血液透析病人的某些并发症的因素。
实施例26利用免疫沉淀法检测存在于肿瘤诱导的骨软化症病人血浆中的FGF-23蛋白
为了检测FGF-23蛋白在血液中的存在状态，对正常受试者的血浆或肿瘤诱导的骨软化症病人的血浆通过免疫沉淀方法进行了检测。向400μl混合血浆样品中加入20μl已固定2C3B抗体的树脂(实施例14中制备)，或加入20μl未固定抗体的树脂。利用上下摇荡的方式将该溶液在4℃混合1小时以确保抗体同FGF-23进行反应。接下来，利用PBS溶液洗涤树脂4次，这样可除掉未反应的产物。50μl样品缓冲液(50mM的Tris-Cl溶液，pH为6.8，1％的SDS溶液，10％的甘油溶液，0.001％的溴酚蓝溶液，2mM的乙二胺四乙酸(EDTA)溶液，和20mM的DTT溶液)加入进每一种类型的树脂中。将该溶液在95℃加热5分钟后进行离心分离，收集分离后的上清液。上清液利用浓度为10％-20％的浓度梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，然后利用一种半干印迹转移槽(Owl Separation Systems，美国)将凝胶中的蛋白转移到一种聚偏氟乙稀膜(美国Millipore公司)上。然后，PVDF膜在室温下用T-TBS(美国Sigma公司)溶液稀释后的生物素标记的3C1E抗体溶液(稀释后的浓度为0.5μg/ml)中培育2小时。而且，将HRP标记的抗生物素蛋白链菌素(DAKO，丹麦)同生成物进行反应。利用一种ECL Plus发光系统(美国AmershamPharmacia Biotech公司)将混合溶液暴露于胶片上1小时，然后胶片用一个自动处理器(日本富士胶片公司)进行处理。结果见图20。在未固定抗体的树脂中，仅观察到了血浆产生的非特异性信号分子。然而，利用2C3B抗体进行免疫沉淀得到的产物中，检测到了一条分子量为32kDa的带，怀疑其代表了肿瘤诱导的骨软化症病人血浆中的全长FGF-23。而且，在用凝血酶切割的产物中未检测到22kDa的条带。同时，在正常受试者中，22kDa的带和32kDa的带均未检测到。从这些结果中可以表明：肿瘤诱导的骨软化症中高水平表达的FGF-23以未经切割的全长形式存在于血液中。
实施例27正常小鼠接种抗人FGF-23的单克隆抗体实验
为了检测抗人FGF-23的单克隆抗体对正常小鼠的影响，进行了下列实验。正常小鼠(BALB/c，雄性，12周大)被随机分成5组，每组由4只小鼠组成。如图21A所示，0.15ml磷酸盐缓冲液作为载体通过臀静脉单一接种组1中的每只小鼠，0.67mg/ml抗人FGF-23的单克隆抗体(1D6A抗体，2C3B抗体，和3C1E抗体)通过臀静脉分别单一接种组2，3和4中的每只小鼠，0.67mg/ml抗TPO的单克隆抗体作为对照通过臀静脉单一接种组5中的每只小鼠。接种24小时后，在乙醚麻醉的状态下从小鼠的心脏中采集血样，然后利用一种微量采血管(美国Becton Dickinson公司)分离出血清。按照附件中的方法利用一种磷-测试Wako(日本和光纯药工业公司)，钙-测试Wako(日本和光纯药工业公司)，和1，25(OH)2D RIA试剂盒TFB(TFB，美国)对这样采集到的血清中的磷酸盐浓度，钙浓度和1，25D的浓度分别进行了测定。在接种至血样采集期间，每组小鼠均被关在一只塑料笼中，包含有1％的磷和1％的钙的CE-2固体饲料(日本CLEA公司)和自来水采取任意采食的方式进行饲喂。
测定结果如图21A所示。每组的测定值利用平均值+/-标准偏差来表示。标记有一个“*”号的组表明当通过Student-t法进行显著性测试时，接种载体(磷酸盐缓冲液)的组和接种抗TPO抗体的组其p值均小于0.01。
实施例28
实施例27中，在接种3C1E抗体的实验中尽管观察到了血清中磷浓度的升高，但是同时也观察到了血清中1，25D浓度的降低。然而，已知血液中1，25D的浓度是快速变化的，1，25D的这样一种特性，使得当观察到其浓度暂时增大的时候，稍后也能观察到其浓度的降低。因此，重做一次接种3C1E抗体的实验。3C1E抗体以400μg/只的剂量通过静脉接种的方式给6只正常小鼠接种。接种8小时以后，对血清中1，25D的浓度进行检测。作为一对照组，对通过相似的接种方式接种PBS的小鼠血清中的1，25D浓度也进行了检测。结果如图21B所示。在该实验中，观察到了由于接种3C1E抗体而引起了小鼠血清中1，25D浓度明显升高的现象。
实施例29抗FGF-23的抗体(3C1E抗体)在患有腺嘌呤诱导的肾功能障碍的大鼠中恢复1，25(OH)2D水平的作用
如实施例25所描述的那样，产生这种疾病(腺嘌呤诱导的肾功能障碍)的第3周，在大鼠的血清中观察到了磷浓度和血液中FGF-23浓度的显著升高。而且，在这种疾病中，在接种腺嘌呤之后第七天，观察到了血液中1，25D浓度的下降(肾功能也是下降的)(见图22A)。因此，为了比较和检测肾功能紊乱早期时血液中FGF-23的浓度，按如下的方式对其进行了定量检测。
在ELISA化验中，2C3B抗体作为一种固定化抗体，生物素标记的3C1E抗体作为检测抗体。首先，利用50mM的碳酸氢纳溶液稀释纯化后的2C3B抗体至50μg/ml。50μl的生成物溶液加入到ELISA系统(Maxisorp(商标)，Nunc，美国)中的96孔板中，然后将该溶液在4℃培育12小时以使其固定在平板上。接下来，除去反应溶液，向每孔中加入250μl的阻滞溶液(Superblock(商标)，PIERCE，美国)，然后在室温培育30分钟，以阻滞反应的进行。除掉溶液以后，每个孔用含有0.1％吐温20的TBS(T-PBS)溶液洗涤两次。血清样被制得，并利用T-TBS溶液稀释2倍。除此之外，标准产物用实施例14中制备的已经应用于固定抗2C3B抗体的树脂实验中的大鼠血清进行稀释，目的是除去内生性FGF-23，然后再用T-TBS溶液稀释2倍。每一种样品取50μl加入进微量滴定盘的每个孔中，然后在室温培育1小时，这样可使分析物中的FGF-23蛋白与固定化抗体进行反应。经过抗体反应后，利用T-TBS溶液洗涤孔4次，然后向每个孔中加入稀释后的浓度为1.5μg/ml的3C1E抗体溶液(稀释方法为利用一种含10％阻滞溶液(Blockace(商标)，日本制药公司)的T-TBS溶液稀释3C1E抗体至1.5μg/ml)。将该溶液在室温培育30分钟，以使同生物素标记的抗体相结合。利用T-TBS溶液洗涤每个孔4次，然后向每个孔中加入50μl的N-四甲联苯胺(DAKO，丹麦)，是一种过氧化物生色底物，在室温进行培育。30分钟后，向每一孔中加入5μl浓度为0.5M的硫酸溶液以停止反应。利用测量96孔板的光吸收值的一种系统进行测定，得到的值(A450-A570)为450nm下的光吸收值减去570nm下的光吸收值。基于标准曲线，通过将获得的测定值转换为纯化后的人抗FGF-23蛋白的重组体的产物的指示浓度值对浓度进行测定。
结果如图22B所示，在喂养混合了腺嘌呤的组中观察到了血液中FGF-23浓度的明显升高。如实施例25所示，给正常小鼠接种FGF-23后能导致血液中1，25D浓度的快速下降，表明当肾功能下降时，血液中1，25D浓度的下降和血液中FGF-23浓度的增加之间存在某些联系。为了证实这种可能性，将喂养混合了腺嘌呤的大鼠血液中的1，25D浓度和FGF-23浓度对单个大鼠作图。因此，从图中可见二者之间有一明显的负的线性相关性(图22C)。这些结果表明：通过控制血液中FGF-23的浓度来校正1，25D浓度下降的方法具有可行性。因此，按下述的方式进行了一个给这种模式的受试者接种中和抗FGF-23抗体的实验。
12只7周大的雄性威斯塔氏鼠用适于啮齿动物的并混合了腺嘌呤[(6-氨基嘌呤，美国Sigma公司)，腺嘌呤的最终浓度为0.75％]的CE-2商业粉状饲料(日本CLEA公司)饲喂7天，饲喂方式为任意采食的方式，产生了肾功能下降疾病。给一对照组的12只小鼠只饲喂CE-2(未混合腺嘌呤)。为了使在病发第七天肾功能紊乱的程度与使用一种血液肌氨酸水平相当，每组用混合有腺嘌呤的饲料喂养的鼠与对照组中的鼠均应分别被分成2组(6只/组)，然后通过臀静脉用3C1E抗体或磷酸盐缓冲液以1mg/kg的剂量单一接种。接种12小时后，从臀动脉采集部分血样，然后将血样进行离心分离，这样获得血清。利用一种1，25(OH)2D RIA Kit TFB(TFB，美国)对这样获得的血清中的1，25D浓度进行检测，并且利用CRE-EN Kainos((商标)，KAINOS实验室，Inc.，日本)对这样获得的血清中的肌酸酐浓度也进行了检测。
检测结果如图22D所示，与只喂养载体(PBS)的每一组相比，在所有的对照组和喂养混合了腺嘌呤的组中观察到了1，25D浓度的明显升高。上述结果表明FGF-23参与产生维生素D低下(一种血液中低水平的1，25D疾病)疾病，并伴随肾功能下降，此时抑制FGF-23的作用能够改善维生素D低下的状况。
实施例30对患有性连遗传型低磷酸盐血症佝偻病(XLH)的病人血液中FGF-23蛋白的测定
XLH是一种低磷酸盐血症佝偻病的形式，显示一种性连遗传型的遗传特性，而且其发病率与肿瘤诱导的骨软化症具有许多相同点。近年来，属于金属内肽酶家族的phex基因被认为是产生这种疾病的致病性基因，并且一种假定的底物表明是诱导成病的一种因子。同时，如实施例23所示，在Hyp小鼠的血液中FGF-23的浓度极高，这种小鼠是在phex基因中有一个基因发生变异(同XLH中的基因变异相同)的遗传性低磷酸盐血症的模式小鼠。这些现象表明对于患有XLH的病人的低磷酸盐血症，同肿瘤诱导的骨软化症相似，是由于血液中FGF-23浓度升高所导致的。因此，首先，为了检测FGF-23在该疾病中所起的作用，对正常受试者和患有XLH的病人的血清中的FGF-23浓度进行了测定。除此之外，在获得充足的phex基因突变之前的正常受试者和被证实在phex基因中有变异基因的XLH病人之后，用于测定的血清才能大量提供。病人的年龄，性别，和phex基因中的变异点如图23所示。
在ELISA化验中，2C3B抗体被作为一种固定化抗体，生物素标记的3C1E抗体被作为一种检测抗体。首先，利用50mM的碳酸氢纳溶液稀释纯化后的2C3B抗体至10μg/ml。50μl的生成物溶液加入到ELISA系统(Maxisorp(商标)，Nunc，美国)中的96孔板中，然后将该溶液在4℃培育12小时以使其固定在平板上。接下来，除去反应溶液，向每孔中加入250μl的阻滞溶液(Superblock(商标)，PIERCE，美国)，然后在室温培育30分钟，以阻滞反应的进行。除掉溶液以后，每个孔用含有0.1％吐温20的TBS(T-PBS)溶液洗涤两次。从XLH病人中采集的血清被制备成测试样，用含有一种在100μg/ml的浓度时不与FGF-23结合的包含有小鼠IgG1抗体的T-TBS溶液稀释2倍。此外，利用正常受试者的血清(该血清利用一种在100μg/ml的浓度时不与FGF-23结合的包含有小鼠IgG1抗体的T-TBS溶液稀释了2倍)对标准产物进行稀释(利用向实施例14中制备的固定了抗2C3B抗体的树脂中加入血清除去内生性FGF-23)。每一种样品取50μl加入进微量滴定盘的每个孔中，然后在室温培育1小时，这样可使分析物中的FGF-23蛋白与固定化抗体进行反应。经过抗体反应后，利用T-TBS溶液洗涤孔4次，然后向每个孔中加入稀释后的浓度为1.5μg/ml的3C1E抗体溶液(稀释方法为利用一种含10％阻滞溶液(Blockace(商标)，日本制药公司)的T-TBS溶液稀释3C1E抗体至1.5μg/ml)。将该溶液在室温培育30分钟，以进行次级抗体反应。利用T-TBS溶液洗涤每个孔4次后，利用一种含10％阻滞溶液(Blockace(商标)，日本制药公司)的T-TBS溶液稀释HRP标记的抗生物素蛋白链菌素(DAKO，丹麦)至5000倍，取50μl稀释后的溶液加入进每一孔中。该溶液在室温培育30分钟，以使抗生物素蛋白链菌素同生物素标记的抗体相结合。利用T-TBS溶液洗涤每个孔4次，然后向每个孔中加入50μl的N-四甲联苯胺(DAKO，丹麦)，是一种过氧化物生色底物，在室温进行培育。30分钟后，向每一孔中加入50μl浓度为0.5M的硫酸溶液以停止反应。利用测量96孔板的光吸收值的一种系统进行测定，得到的值(A450-A595)为450nm下的光吸收值减去595nm下的光吸收值。
结果，在104位正常成人中(30男性和74位女性)中，血液中的FGF-23浓度聚集在8.2-54.3ng/l的范围内，并且平均值和标准偏差是28.9+/-1.1ng/l。同时，如图23所示，所有患有XLH疾病的病人血清中的FGF-23浓度值均高于正常受试者的平均值。而且，即使是患有XLH疾病的病人血清中FGF-23的平均浓度值也明显高于正常受试者的平均浓度值(p＜0.0001，利用Student-t计算得到的)。这些结果强烈地暗示XLH患者血清中高浓度的FGF-23作为诱发疾病的因子的可能性。
实施例31两种不同的中和抗体混合时增强中和活性的作用
当识别不同位点的中和抗体混合时，利用正常小鼠对其生理活性的变化进行了检测。
8周大的C57BL/6雄性小鼠被随机分成4组，每组由6只小鼠组成。PBS溶液作为载体通过臀静脉单一接种组1中的每只小鼠，100μg的2C3B抗体通过臀静脉分别单一接种组2中的每只小鼠，100μg的3C1E抗体通过臀静脉分别单一接种组3中的每只小鼠，100μg的抗体混合物(50μg的2C3B抗体和50μg的3C1E抗体)通过臀静脉分别单一接种组4中的每只小鼠。接种后的第1天和第二天，在乙醚麻醉的状态下从眼眶中采集血样，利用一种微量采血管(美国BectonDickinson公司)分离出血清。然后按照附件中的方法利用一种磷测试Wako(日本和光纯药工业公司)对这样采集到的血清中的磷酸盐浓度进行了测定。在接种至血样采集期间，每组小鼠均被关在一只塑料笼中，CE-2(日本CLEA公司)和自来水采取任意采食的方式进行饲喂。
所得结果如图24所示。单独的100μg 2C3B抗体或100μg 3C1E抗体在接种后第一天就导致血清中磷浓度的显著增加。另一方面，在接种抗体混合物的组中，虽然每种抗体的剂量均减半，但还是显示了血清中磷浓度的显著增加，而且与任何只接种一种抗体的组相比其血清中的磷浓度都非常高。而且，在接种后的第二天，接种2C3B抗体或3C1E抗体的组中，提高血清中磷浓度的作用消失了，而接种抗体混合物的组中血清中磷浓度仍然急剧增加。上述结果表明与只接种一种类型的抗体病例相比，识别不同位点的2种类型的抗体混合物能够进一步增强中和活性，并更长时间地维持这种作用。
实施例32给患有遗传性低血磷酸盐病的小鼠接种FGF-23中和抗体实验
如实施例23和实施例30所示，在XLH和Hyp小鼠中观察到了血液中FGF-23浓度的升高，表明FGF-23是一种对应低血磷酸盐病(维生素D代谢异常，或骨钙化障碍都是这种疾病的发病原因)的因子。因此，给Hyp小鼠接种抗FGF-23中和单克隆抗体，然后对该抗体是否能改善上述病症进行了检测。
(1)重复接种抗FGF-23中和抗体实验
利用4-7周大的C57BL/6-Hyp雄性小鼠和同一窝出生的野生型C57BL/6雄性小鼠，给Hyp小鼠重复接种中和抗体后对血液中磷浓度和1，25D浓度的影响进行了检测。本实验中的四组包括：一组接种载体的野生型小鼠，一组接种抗体的野生型小鼠，一组接种载体的Hyp小鼠，和一组接种抗体的Hyp小鼠。每组包括4只小鼠。在接种抗体的小鼠组实例中，具体的说，3C1E抗体和2C3B抗体混合，它们的终浓度均为1.7mg/ml，然后生成物(混合溶液)以17mg/kg的剂量通过皮下至脊背区间接种每只小鼠。在接种抗体的小鼠组中，具体的说，PBS以10mg/kg，同接种抗体的组相同体积的剂量接种该组中的每只小鼠。经过最初接种后的第2，第4和第6天，截取小鼠的尾部末端，然后在乙醚麻醉的状态下采集部分血样。然后利用一种磷测试Wako(商标，日本和光纯药工业公司)，钙-测试Wako(商标，日本和光纯药工业公司)，1，25(OH)2D RIA Kit TFB(TFB，美国)和碱磷B-测试Wako(商标，日本和光纯药工业公司)对这样采集到的血液中的磷酸盐浓度，钙浓度，1，25D浓度和总碱性磷酸酶活性分别进行了测定。
结果如图25A所示。在接种抗体的野生型小鼠组中，在接种后的1至7天观察到了血清中的磷酸盐浓度明显的升高了。同接种载体的Hyp小鼠组，在接种后的1至7天观察到的血清中的磷酸盐浓度相比，观察到了接种抗体的Hyp小鼠组血清中的磷酸盐浓度明显的升高了。这些增高值在接种后的第7天变得更加明显，表明浓度可达到与接种野生型小鼠抗体相同程度的浓度值。而且，通过接种中和抗体，在接种后的第1天，在野生型小鼠和Hyp小鼠组中都观察到了血液中1，25D浓度的显著升高。同时，在Hyp小鼠或患有低磷酸盐血症佝偻病(例如XLH)的病人中，其血液中总碱磷酸酶活性异常增高的现象已经有过报道。表明从接种后24小时开始，给Hyp小鼠接种的中和抗体逐渐减弱，血液中总的碱性磷酸酶活性水平比正常小鼠的活性水平异常的高，并且进一步导致了活性显著降低至与野生型小鼠初始接种后第七天时的程度相当的水平。
利用4-7周大的雄性C57BL/6J-Hyp小鼠组和同一窝出生的雄性野生型C57BL/6J小鼠组和正常小鼠作为对照组，给Hyp小鼠重复接种抗FGF-23中和抗体后对骨组织的影响进行了检测。本实验中的四组包括：一组接种载体的野生型小鼠，一组接种抗体的野生型小鼠，一组接种载体的Hyp小鼠，和一组接种抗体的Hyp小鼠。每组包括4只小鼠。在接种抗体的小鼠组实例中，具体的说，3C1E抗体和2C3B抗体混合，它们的终浓度均为1.7mg/ml，然后生成物(混合溶液)以17mg/kg的剂量通过皮下至脊背区间接种每只小鼠。在接种载体的组中，具体的说，PBS以10mg/kg的剂量通过皮下至脊背区间接种该组中的每只小鼠。最初接种的时间被定为是第0天，那么在第2天，第4天，第6天，第8天，第21天和第40天时，进行相同的接种。在最初接种后的第49天，在乙醚麻醉的状态下从心脏中采集部分血样，和右股骨样，右胫骨样，和肋样。利用一种μF FX-1000微焦X-射线放大影像系统(日本富士胶片公司)在电流为100μA，电压为25kV的输出条件下辐射5秒，然后利用一种BAS影像分析仪(日本富士胶片公司)数字化后，得到所截取的股骨，胫骨和肋骨的放大的X-射线影像。
这样所获得的提取后的股骨，胫骨，和肋骨的放大X-射线影像如图27所示。在Hyp小鼠或像低磷酸盐血症佝偻病(例如XLH疾病)这样的病例中，对于钙化紊乱，长骨的干骨后端或助肋的软骨关节处的增大现象相关联的软骨细胞增加的现象已有过报道。作为X射线影像分析的结果，在存在干骨后端增长现象的Hyp小鼠组中，发现接种抗体后病情得到缓解，而在接种载体的组中发现骨密度下降，腿节和胫骨的皮质骨变薄。而且，在接种抗体的Hyp小鼠组中发现病情得到缓和，而在接种载体的Hyp小鼠组中发现腿节和胫骨不能纵向增长。接种载体的的Hyp小鼠组中肋脉关节和肋的软骨增大，而这些现象在接种抗体的Hyp小鼠组中消失。表明给Hyp小鼠重复接种抗FGF-23的中和抗体可改善骨延伸紊乱和骨钙化紊乱。
而且，为了详细检测抗FGF-23抗体对骨组织的作用，从进行本实验的动物中制得了骨组织样品。实验后的动物经宰杀后，左胫骨和右股骨被提取出来，将其加入进70％的乙醇中，进行VillanuevaBone(Villanueva Bone Stain Powder，MARUTO INSTRUMENT CO.，LTD.，日本)染色，利用浓度连续升高的乙醇溶液对骨进行脱水，然后包埋进Technovit 7100(德国Kulzer公司)中。生成物切成大约5μm厚的薄片，然后将胫骨的近端部分和股骨的远端部分在显微镜下进行观察。骨组织样品的影像如图28所示。在野生型小鼠中观察到了软骨细胞中的生长片以有序的方式进行排列(图28A和D)，在Hpy小鼠的骨组织中，观察到了有一被干扰的柱结构区域，其特征为具有生长片的扩大区域和软骨细胞的不规则序列(图28B和E)。相反，对于进行重复接种抗FGF-23中和抗体的Hyp小鼠中，观察到了生长片宽度的增加得到了抑制和软骨细胞的不规则序列消失的现象(图28C和F)。
(2)单一接种抗FGF-23中和抗体的实验
利用12-20周大的雄性C57BL/6-Hyp小鼠和同一窝出生的野生型雄性C57BL/6J小鼠，给Hyp小鼠单一接种抗FGF-23中和抗体后对血液中磷酸盐浓度和1,25D浓度的影响进行了检测。本实验中的四组包括：一组接种载体的野生型小鼠(n＝4)，一组接种抗体的野生型小鼠(n＝5)，一组接种载体的Hyp小鼠(n＝3)，和一组接种抗体的Hyp小鼠(n＝3)。在接种抗体的小鼠组实例中，具体的说，3C1E抗体和2C3B抗体混合，它们的终浓度均为1.7mg/ml，然后生成物(混合溶液)以17mg/kg的剂量通过皮下至脊背区间接种每只小鼠。在接种载体的小鼠组中，具体的说，PBS以10mg/kg的剂量接种该组中的每只小鼠。接种后的第4天，在乙醚麻醉的状态下从小鼠中提取出来的心脏和肾脏中采集血样。
对这样获得的血清中的磷酸盐和1，25D的浓度进行测定，结果如图25B所示。通过给野生型小鼠单一接种这种抗体，血清中磷酸盐浓度和1，25D的浓度在接种后的第4天均表现了明显的升高。在Hyp小鼠中也观察到了浓度升高的这种效应。通过接种抗体，血清中磷酸盐的浓度被从低水平值校正到了高水平值，并且1,25D的浓度显著增大。
(3)抗FGF-23中和抗体控制NaPi2a和1αOHase的表述的作用
利用倚赖钠的磷酸盐协同运输效应(NaPi2a该效应主要出现在肾小管中)通过重吸收率对血清中磷酸盐浓度进行了测定。而且，已经有过对重吸收率被倚赖NaPi2a自身的表达水平或NaPi2a蛋白的定位率所控制的报道。因此，对抗FGF-23中和抗体是否有通过NaPi2a的调控来提高血清中磷酸盐浓度的效应进行了检测。
利用一种冻融的肾脏，按照Katai等人在生物化学杂志(1999年，274卷，28845-28848页)上报道的一种钙沉淀方法制备了固定有NaPi2a的肾近位尿细管刷状缘膜囊(BBMV)。按照实施例16中描述的Western印迹法对每一种的得到的BBMV膜20μg进行测定。利用从抗血清[利用和实例5相似的方法通过免疫兔子而得到抗血清，该抗血清具有小鼠的NaPi2a蛋白中的C-末端肽片段(SEQ ID NO：32)]中纯化得到的抗鼠NaPi2a的兔多克隆抗体对NaPi2a蛋白进行了测定。结果如图25C所示。已经有过报道表明NaPi2a蛋白水平在Hyp小鼠的BBMV中被显著降低了。然而，通过接种抗FGF-23中和抗体，NaPi2a的表达被显著提高了。
在野生型小鼠中，也进一步观察到了NaPi2a蛋白浓度的升高。而且，利用上述的BBMV对NaPi2a蛋白调控的磷酸盐转移活性进行了检测。利用从每一个体制备的每一种BBMV 0.1mg，通过一种快速过滤方法对60秒内的倚赖钠的磷酸盐摄取活性进行了检测。反应物和反应条件按照Katai等人在生物化学杂志(1999年，274卷，28845-28848页)上的报道进行
结果如图25C所示，对野生型小鼠和Hyp小鼠，由于接种了抗FGF-23中和抗体，导致了磷酸盐转移活性的升高。这些结果表明：通过给野生型小鼠和Hyp小鼠接种抗FGF-23中和抗体后血清中磷酸盐浓度升高的效应是由于存在于肾小管中的NaPi2a蛋白的水平值生高所导致的。
mNpt2C：LALPAHHNATRLC(SEQ ID NO：32)
下一步，为了阐明提高血清中1，25D浓度的作用机理，对肾25-羟维生素D-羟化酶(1αOHase)的表达模式进行了分析。利用一种ISOGEN试剂(NIPPON GENE CO.，LTD.，日本)从一冷冻的肾中将总RNA提取出来。取20μg所得到的每一种RNA按照标准方法利用北方印迹法对其进行了检测。一种PerfectHyb试剂(日本Toyobo公司)用于进行杂交，杂交点的反应和洗涤按照附件中所述的方法进行。通过PCR方法扩增小鼠的1αOHase部分cDNA而制得这里所用的探针，该PCR反应利用从小鼠肾脏中制备的cDNA文库作为模板，SEQID NOS：33和34所示的寡核苷酸作为引物，或者通过PCR扩增一个3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)的部分cDNA作为一种内部标准，利用SEQ ID NOS：35和36所示的寡核苷酸作为引物，通过一种MeagaprimeDNA标记系统(美国Amersham Pharmacia Biotech公司)利用32P标记cDNA。利用一种BAS影像分析仪(日本富士胶片公司)对信号进行了检测。结果如图25D所示。证实了在野生型小鼠和Hyp小鼠中通过接种中和抗体，1αOHase的表达显著提高了。这些结果表明：抗FGF-23中和抗体在提高野生型小鼠和Hyp小鼠血清中1,25D浓度的作用是由于存在于肾中的1αOHase的基因表达水平值的提高。
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上述结果表明FGF-23在降低Hyp小鼠血液中的磷酸盐浓度和1，25D浓度中发挥了非常重要的作用，换句话说，对于患有XLH的病人，通过接种抗FGF-23中和抗体可以抑制FGF-23作用的发挥，因此就能改善发病症状。而且，伴随着骨增长障碍和骨钙化障碍的Hyp小鼠血液中总碱磷活性异常高的水平值这一现象，通过接种FGF-23中和抗体也能使其值正常化。因此，该方法对治愈骨软化症并使骨重塑过程正常化是有疗效的。
实施例33抗FGF-23抗体(3C1E)对骨重塑的作用
如实施例32(1)所描述的那样，表明了抗FGF-23抗体在骨重塑过程中的作用。为了进一步检测该结果，对经过接种抗FGF-23抗体后血清中骨钙素浓度随时间的变化进行了分析。该实验按如下程序进行：
3C1E抗体以3mg/kg的剂量，或者是载体(PBS溶液)以1.1mg/kg的剂量通过臀静脉给7周大的雄性S.D.大鼠进行单一接种。在接种后的4，12，24，48，和72小时，从臀动脉中采集部分血样，然后制得血清样。利用一种骨钙素ELISA试剂盒(日本Amersham生物科学公司)对血清中骨钙素的浓度进行了检测。结果如图26所示。在接种抗体后的12，24，48小时后，观察到了血清中骨钙素浓度的显著升高。这些结果表明该种可能性，即接种的抗FGF-23抗体在骨重塑过程中有一种直接的或间接的影响。
实施例34抗FGF-23中和抗体(2C3B抗体和3C1E抗体的混合物)对骨质疏松症小鼠的作用
为了进一步检测如实施例33中所描述的抗FGF-23中和抗体在骨代谢过程中的作用，在绝经后的骨质疏松症受试者中对抗FGF-23抗体在卵巢切除后骨量降低模型小鼠(被认为其可反映骨量减少)中的作用进行了检测。将8周大的ddy小鼠中的卵巢提取出来后，将小鼠分成2组：一组接种载体，另一组接种抗FGF-23抗体。此外，作为一手术对照组，对一组小鼠进行了假切除手术。对于接种抗体的组(n＝10)，接种在手术后3天开始，抗体通过混合两种体积相同的2C3B抗体和3C1E抗体(2C3B抗体和3C1E抗体的接种剂量同为1.5mg/kg，接种总剂量为3mg/kg)而制得，将该混合抗体通过皮下至脊背区域给小鼠进行接种，一周3次，连续接种4周。而且，对于接种载体的组(n＝9)和进行了假切除的对照组(n＝10)，将载体溶液以和抗体溶液相同的剂量(10ml/kg)给小鼠进行接种。卵巢切除的第2周，在乙醚麻醉的状态下从小鼠眼眶中采集血样，卵巢切除的第4周，在乙醚麻醉的状态下从小鼠心脏中采集血样。通过离心分离(在8000转/分钟的转速下离心分离10分钟)从采集的血样中制得血清，然后对血清中骨钙素的浓度(IRMA试剂盒，Immutopics，日本)进行测定。卵巢切除后的第四周，从由于采集血样而宰杀掉的小鼠中提取股骨，然后对骨中矿物质含量和骨密度(骨密度计，DCS-600型，ALOKA CO.，LTD.)进行了测定。
如图29A和B所示，同接种载体的组相比，卵巢切除后的第2周和第4周在接种抗FGF-23抗体(2C3B抗体和3C1E抗体的混合物)的组中都观察到了血清中骨钙素水平的明显升高。骨钙素是由造骨细胞特定产生的一种蛋白。由于体内血清中骨钙素的水平升高被认为是骨生成的一种指示剂，因此表明了该种可能性，即通过接种抗FGF-23抗体可促进骨的生成。
而且，如图30A和B所示，同进行了卵巢假切除并接种了载体的组相比，进行了卵巢切除并接种了载体的组表现出了骨量的显著减少。通过与卵巢切除后骨矿物质含量和骨矿物质密度明显下降相对比，实行了卵巢切除并接种了抗FGF-23抗体的组表现出了异常高的骨矿物质含量和骨矿物质密度的水平值。基于这些结果，我们认为接种抗FGF-23抗体可抑制由于卵巢切除后所导致的骨量减少。
实施例35给患有遗传性低磷酸盐血症佝偻病的小鼠接种抗FGF-23中和抗体(2C3B抗体和3C1E抗体的混合物)实验
如实施例32所示，表明了抗FGF-23的中和抗体可改善Hyp小鼠的骨增增长紊乱和骨钙化紊乱。因此，利用4周大的雄性C57BL/6-Hyp小鼠和同一窝出生的野生型C57BL/6小鼠(该野生型小鼠比例32中所用的小鼠在周年龄上小，这样生长更明显)对抗FGF-23中和抗体在改善Hyp小鼠的骨增长紊乱和骨钙化紊乱疾病中所起的作用进行了详细检测。本实验中的四组包括：一组接种载体(PBS)的野生型小鼠，一组接种载体(PBS)的Hyp小鼠，一组接种低剂量抗体的Hyp小鼠，和一组接种高剂量抗体的Hyp小鼠。每组包括6-7只小鼠。中和抗体是由相同浓度的2C3B抗体和3C1E抗体相互混合而制得的。对低剂量组，这样制得的中和抗体溶液中两种类型抗体的总量为4mg/kg，对高剂量组，这样制得的中和抗体溶液中两种类型抗体的总量为16mg/kg。中和抗体或载体以10ml/kg的剂量通过皮下至脊背区域接种每只小鼠，将最初接种的时间定为第0天，那么在第7天，第14天，第21天，和第28天时，对小鼠进行重复接种。第7天，第14天，第21天，和第28天进行重复接种时对小鼠的体重，尾巴的长度，和胫骨的thel长度进行了测量。而且，最初接种后的第31天，在乙醚麻醉的状态下从小鼠心脏中采集血样，小鼠也被宰杀，然后提取左右的股骨和胫骨。
(1)抗FGF-23中和抗体对增长尾巴长度，胫骨长度和增大体重的作用
Hyp小鼠的骨头提供了佝偻病骨的表型(伴随着骨发育不全的特征，例如长骨在径向方向的增长障碍)。对于单个的小鼠，同野生型的小鼠相比，Hyp小鼠在体长方面明显小，体重方面明显轻。为了检测抗FGF-23中和抗体对Hyp小鼠中像骨发育不全这样的疾病的作用，进行了对本实验中所用Hyp小鼠的尾部长度，胫骨长度和体重变化的测定。结果如图31A，B和C所示。也在本实验中，同正常小鼠相比，Hyp小鼠尾巴和胫骨的增长程度明显低，体重明显轻。而且，同接种载体的Hyp小鼠组相比，接种了中和抗体的Hyp小鼠，中和抗体尽其最大作用使Hyp小鼠的尾部长度和胫骨长度得到了最大程度的增长，并且在增加体重方面是一种倚赖接种剂量的方式。
(2)抗FGF-23中和抗体对骨钙化的作用
同正常的小鼠相比，已知Hyp小鼠的骨组织中未钙化和低钙化骨的比例是高的，但是在矿物质含量方面是低的。因此，对抗FGF-23中和抗体能否提高Hyp小鼠股骨中矿物质的含量进行了测定。在该实验中，提取后的左股骨在100℃的干燥器中干燥12小时，然后称重，得到干燥后骨的重量。接下来，将干燥后的骨在600℃的马弗炉中焚烧12小时。对生成物称重以得到骨灰的重量。结果如图32所示。同野生型小鼠相比，在Hyp小鼠中，骨灰重量在干骨重量中所占的比例非常低。在接种了抗体的Hyp小鼠组中，骨灰重量在干骨重量中所占的比例表现出了明显增加(以一种随重复接种的中和抗体的剂量增加而增加的方式)。尤其是，在接种了高剂量抗体的组中，其骨灰重量在干骨重量中所占的比例表现出了同野生型小鼠组所示的同一水平值。
这些结果表明通过接种抗FGF-23中和抗体可抑制FGF-23的作用，因此能够改善如Hyp小鼠所示的骨增长障碍和骨钙化疾病。
实施例36利用2C5L抗体通过夹心式ELISA方法定量测定人的FGF-23蛋白
按照实施例3中的方法得到2C5L克隆杂交瘤，按照实施例4中的纯化方法对其进行纯化后得到2C5L抗体。通过实施例10中所述的方法对其识别位点的分析表明：同2C3B抗体的形式一样，2C5L抗体在N-末端多肽片段(该多肽片段相当于SEQ ID NO：1的介于第25位和第179位氨基酸残基之间的一段区域)内有一个识别位点，并且和N-末端多肽片段和一种全长FGF-23蛋白形成了一种免疫复合体。而且，如实施例12所描述的一种方法，对一种利用2C5L抗体和2C3B抗体的一种重组体的夹心式ELISA方法的建立做了尝试。利用每一种抗体都可和FGF-23蛋白相结合的事实，表明这两种抗体之间并不存在彼此竞争性抑制的现象。根据这一结论，2C5L抗体在N-末端多肽片段(该多肽片段相当于SEQ ID NO：1的介于第25位和第179位氨基酸之间的一段区域)内有一个识别位点，但该识别位点不同于2C3B抗体的也位于N-末端多肽片段内的识别位点。这表明利用一种两种类型抗体作为重组体的ELISA方法是可行的。接下来，当生物素标记的3C1E抗体作为检测抗体，并且2C3B抗体或2C5L抗体作为固定化抗体时，对利用实施例13中所描述的方法测定FGF-23蛋白的能力进行了检测。结果如图33所示。证实了2C5L抗体，在10pg/ml至10ng/ml的浓度范围内，以一种浓度倚赖型的方式可识别纯化后的人类FGF-23蛋白的重组体。
实施例37 2C5L抗体和小鼠FGF-23的交叉反应活性
如实施例22和23所示的利用2C3B抗体和3C1E抗体的一种重组体的夹心式ELISA系统中，同人的FGF-23相似，小鼠的FGF-23也能被识别出来。因此，对2C5L抗体是否能够识别小鼠的FGF-23做了检测。同实施例24类似，在血液中具有高水平值的FGF-23的小鼠血清制得后，利用2C3B抗体和生物素标记的3C1E抗体的一种重组体对其进行了检测，因此得到了一种浓度值显示为大约600pg/ml的一种样品。对于该样品，利用2C3B抗体和生物素标记的3C1E抗体的一种重组体通过夹心式ELISA系统对其进行了检测。然而，没有观察到反应活性。该结果表明2C5L抗体与人的FGF-23有强的结合能力，但是与小鼠的FGF-23有非常弱的结合能力或根本就没有结合能力。
实施例38 2C5L抗体对人的FGF-23中和活性的能力测定
实施例37的结果表明：由于同2C3B抗体或3C1E抗体与小鼠的FGF-23的结合能力相比，2C5L抗体的结合能力显得非常低，因此2C5L抗体对小鼠内生性FGF-23的中和活性的能力也将不明显。然而，根据实施例36所示的结果，由于2C5L抗体与人的FGF-23有强的结合能力，2C5L抗体对于人的内生性FGF-23可能有中和活性的能力。为了证实该能力，按照如下程序利用动物通过一种检测系统对2C5L抗体中和人的FGF-23的活性做了测定，然后利用该系统对2C5L抗体对人的内生性FGF-23的中和活性做了检测。
一种被调节后的以1.2μg/天的剂量逐渐释放人的FGF-23重组体的微型渗透泵(alzet微型渗透泵型号1007D，加拿大)通过皮下至脊背区域移植进7周大的雄性C57BL/6小鼠体内，这样就构建了一种人的FGF-23重组体能连续接种的模式。在移植泵后的第3天，给小鼠通过腹腔接种一种包含2C5L抗体的抗FGF-23中和抗体或一种载体，然后对连续存在的人的FGF-23重组体降低血清中磷酸盐浓度的作用是否被接种后的抗体抑制而进行了检测。本实验中的四组包括：一组(未处理/载体)接种载体的未处理过的小鼠，一组(FGF-23/载体)接种载体的人类FGF-23重组体连续接种模式的小鼠，一组(FGF-23/2C5L)接种2C5L抗体的人类FGF-23重组体连续接种模式的小鼠，和一组(FGF-23/2C3B)接种2C5L抗体的人类FGF-23重组体连续接种模式的小鼠。PBS作为载体并用于稀释抗体。抗FGF-23中和抗体以一种20mg/kg的剂量进行接种。载体和中和抗体以每10g体重接种0.1mL的剂量进行接种。在抗体接种前和抗体接种后，在乙醚麻醉的状态下从小鼠眼眶中采集血样以获得血清样。利用一种磷测试Wako(商标)，日本和光纯药工业公司)对血清中磷酸盐浓度进行检测。
结果如下。利用该微型渗透泵通过连续接种人的FGF-23重组体，在移植进泵后的第3天，同接种载体的未处理过的小鼠组相比，血液中磷酸盐的浓度出现了明显升高(图34，左)。同FGF-23/载体接种组或抗体接种前相比，当给一组人类FGF-23重组体连续接种模式的小鼠组(FGF-23/2C5L)接种2C5L抗体时，24小时后，重组体降低血清中磷酸盐浓度的作用被抗体明显抑制了。血清中磷酸盐的浓度被提高到了同未处理过的/载体接种组相同的程度(图34，右)。根据上述结果和实施例37中的结论，清楚的表明：2C5L抗体具有抵抗倚赖连续的接种人类FGF-23重组体而导致血液中磷酸盐浓度下降的作用的中和活性。另一方面，对于接种2C3B抗体的组，24小时后，血清中磷的浓度比未处理过的/载体接种组的磷浓度值明显高。该结果可能由于以下事实：具有与小鼠的FGF-23有强的结合能力的2C3B抗体不但对接种人的FGF-23重组体有中和活性，而且对内生性的小鼠FGF-23也有中和活性。
工业应用
依照本发明，提供了抗FGF-23的抗体。本发明中的抗体在通过适当地在体内进行测定和检测FGF-23而诊断伴随FGF-23蛋白的累积或下降的疾病或病理状况中非常有效。而且，本发明的抗体具有中和FGF-23作用的活性，因此能够通过抑制FGF-23的作用治疗或改善由FGF-23的过量作用所导致的疾病或病理状况。
将这里引用的出版物，专利和专利申请引入本申请作为参考。未背离本发明技术精神或范畴的一些改变和变化对本领域的专业人员来说显而易见。本发明包含这样的变化和修正。
                             序列表
<110>KIRIN BEER KABUSHIKI KAISHA
<120>抗FGF-23抗体
<130>PH-1707-PCT
<140>
<141>
<150>JP2001/401689
<151>2001-12-28
<150>JP2002/262020
<151>2002-09-06
<160>36
<170>Patentln Ver.2.0
<210>1
<211>251
<212>PRT
<213>人
<400>1
Met Leu Gly Ala Arg Leu Arg Leu Trp Val Cys Ala Leu Cys Ser Val
  1               5                  10                  15
Cys Ser Met Ser Val Leu Arg Ala Tyr Pro Asn Ala Ser Pro Leu Leu
             20                  25                  30
Gly Ser Ser Trp Gly Gly Leu Ile His Leu Tyr Thr Ala Thr Ala Arg
         35                  40                  45
Asn Ser Tyr His Leu Gln Ile His Lys Asn Gly His Val Asp Gly Ala
     50                  55                  60
Pro His Gln Thr Ile Tyr Ser Ala Leu Met Ile Arg Ser Glu Asp Ala
 65                  70                  75                  80
Gly Phe Val Val Ile Thr Gly Val Met Ser Arg Arg Tyr Leu Cys Met
                 85                  90                  95
Asp Phe Arg Gly Asn Ile Phe Gly Ser His Tyr Phe Asp Pro Glu Asn
            100                 105                 110
Cys Arg Phe Gln His Gln Thr Leu Glu Asn Gly Tyr Asp Val Tyr His
        115                 120                 125
Ser Pro Gln Tyr His Phe Leu Val Ser Leu Gly Arg Ala Lys Arg Ala
    130                 135                 140
Phe Leu Pro Gly Met Asn Pro Pro Pro Tyr Ser Gln Phe Leu Ser Arg
145                 150                 155                 160
Arg Asn Glu Ile Pro Leu Ile His Phe Asn Thr Pro Ile Pro Arg Arg
                165                 170                 175
His Thr Arg Ser Ala Glu Asp Asp Ser Glu Arg Asp Pro Leu Asn Val
            180                 185                 190
Leu Lys Pro Arg Ala Arg Met Thr Pro Ala Pro Ala Ser Cys Ser Gln
        195                 200                 205
Glu Leu Pro Ser Ala Glu Asp Asn Ser Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu
    210                 215                 220
Gly Val Val Arg Gly Gly Arg Val Asn Thr His Ala Gly Gly Thr Gly
225                 230                 235                 240
Pro Glu Gly Cys Arg Pro Phe Ala Lys Phe Ile
                245                 250
<210>2
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成DNA
<400>2
ccggaattca gccactcaga gcagggcacg                           30
<210>3
<211>52
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成DNA
<400>3
ataagaatgc ggccgctcaa tggtgatggt gatgatggat gaacttggcg aa    52
<210>4
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成DNA
<400>4
ataagaatgc ggccgctcag atgaacttgg cgaa                        34
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成DNA
<400>5
ataccacggc agcacaccca  gagcgccgag                            30
<210>6
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成DNA
<400>6
ctcggcgctc tgggtgtgct gccgtggtat                            30
<210>7
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成DNA
<400>7
atgaattcca ccatgttggg ggcccgcctc agg                       33
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成DNA
<400>8
atgcggccgc ctaatgatga tgatgatgat ggatgaactt ggcgaaggg        49
<210>9
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成肽
<400>9
Tyr Pro Asn Ala Ser Pro Leu Leu Gly Ser Ser Trp Gly Gly Leu Cys
  1               5                  10                  15
<210>10
<211>21
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成肽
<400>10
Arg Asn Ser Tyr His Leu Gln Ile His Lys Asn Gly His Val Asp Gly
  1               5                  10                  15
Ala Pro His Gln Cys
                20
<210>11
<211>21
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成肽
<400>11
Arg Phe Gln His Gln Thr Leu Glu Asn Gly Tyr Asp Val Tyr His Ser
  1               5                  10                  15
Pro Gln Tyr His Cys
             20
<210>12
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成肽
<400>12
Gly Met Asn Pro Pro Pro Tyr Ser Gln Phe Leu Ser Arg Arg Asn Glu
  1                   5              10                  15
Cys
<210>13
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成肽
<400>13
Cys Asn Thr Pro Ile Pro Arg Arg His Thr Arg
  1               5                  10
<210>14
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成肽
<400>14
Pro Arg Arg His Thr Arg Ser Ala Glu Asp Asp Ser Glu Arg Cys
  1               5                  10                  15
<210>15
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成肽
<400>15
Ser Ala Glu Asp Asp Ser Glu Arg Asp Pro Leu Asn Val Leu Lys Cys
  1               5                  10                  15
<210>16
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成肽
<400>16
Leu Pro Ser Ala Glu Asp Asn Ser Pro Met Ala Ser Asp Cys
  1               5                  10
<210>17
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成肽
<400>17
Gly Gly Thr Gly Pro Glu Gly Cys Arg Pro Phe Ala Lys Phe Ile
  1               5                  10                  15
<210>18
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成肽
<400>18
Gly Leu Ile His Leu Tyr Thr Ala Thr Ala Arg Asn Ser Cys
  1               5                  10
<210>19
<211>28
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成肽
<400>19
Thr Ile Tyr Ser Ala Leu Met Ile Arg Ser Glu Asp Ala Gly Phe Val
  1               5                  10                  15
Val Ile Thr Gly Val Met Ser Arg Arg Tyr Leu Cys
             20                  25
<210>20
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成肽
<400>20
Met Asp Phe Arg Gly Asn Ile Phe Gly Ser His Tyr Phe Asp Pro Glu
  1               5                  10                  15
Asn Cys
<210>21
<211>23
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成肽
<400>21
Ser Pro Gln Tyr His Phe Leu Val Ser Leu Gly Arg Ala Lys Arg Ala
  1               5                  10                  15
Phe Leu Pro Gly Met Asn Cys
             20
<210>22
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成肽
<400>22
Arg Asn Glu Ile Pro Leu Ile His Phe Asn Thr Pro Ile Cys
  1               5                  10
<210>23
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成肽
<400>23
Ala Arg Met Thr Pro Ala Pro Ala Ser Cys Ser Gln Glu Leu Pro Ser
  1               5                  10                  15
<210>24
<211>24
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成肽
<400>24
Ser Asp Pro Leu Gly Val Val Arg Gly Gly Arg Val Asn Thr His Ala
  1               5                  10                  15
Gly Gly Thr Gly Pro Glu Gly Cys
             20
<210>25
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成DNA
<400>25
attagccact cagtgctgtg caatg                                  25
<210>26
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成DNA
<400>26
gcagcctggc ctggggacct a                                      21
<210>27
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成DNA
<400>27
ggaattccac catgctaggg acctgcctta gactc                       35
<210>28
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成DNA
<400>28
atagtttagc ggccgcctag acgaacctgg gaaaggggcg aca              43
<210>29
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成DNA
<400>29
ttcgcccacg gcaacacacg caaagcgccg aggac                       35
<210>30
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成DNA
<400>30
gtcctcggcg ctttgcgtgt gttgccgtgg gcgaa                       35
<210>31
<211>4
<212>PRT
<213>人
<400>31
Arg His Thr Arg
  1
<210>32
<211>13
<212>PRT
<213>小家鼠
<400>32
Leu Ala Leu Pro Ala His His Asn Ala Thr Arg Leu Cys
  1               5                  10
<210>33
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成DNA
<400>33
cagacagaga catccgtgta g                               21
<210>34
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成DNA
<400>34
ccacatggtc caggttcagt c                              21
<210>35
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成DNA
<400>35
accacagtcc atgccatcac                                20
<210>36
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成DNA
<400>36
tccaccaccc tgttgctgta                               20

Claims (19)

1.通过利用多肽免疫动物而得到的抗体，所述多肽包含如SEQ IDNO：1所示的氨基酸序列，或包含从SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列中通过缺失、替代或添加一个或几个氨基酸而衍生得到的氨基酸序列，并且所述抗体具有成纤维细胞生长因子-23的活性，具有控制磷酸盐代谢或维生素D代谢的活性，并且如以下(a)、(b)或(c)所示：
(a)识别如SEQ ID NO：1所示的介于第180位和第194位，或第237位和第251位氨基酸残基之间的一段氨基酸序列的抗体；
(b)由保藏号为FERM BP-7838，FERM BP-7839，FERM BP-7840，或FERM BP-8268的杂交瘤所产生的抗体；或
(c)通过结合由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列所组成的多肽，与保藏号为FERM BP-7838，FERM BP-7839，FERM BP-7840，或FERMBP-8268的杂交瘤所产生的抗体竞争的抗体。
2.权利要求1所述的抗体，该抗体是单克隆抗体。
3.权利要求1或2所述的抗体，该抗体是由保藏号为FERM BP-7838，FERM BP-7839，FERM BP-7840，或FERM BP-8268的杂交瘤所产生的抗体。
4.一种药物组合物，其包含权利要求1至3任一项所述的抗体作为活性成分。
5.权利要求4所述的药物组合物，它可有效抵抗至少一种下述疾病：肿瘤诱导的骨软化症，ADHR，XLH，肾性骨营养不良，透析骨病，骨质疏松症，低磷酸盐血症，佝偻病，骨软化症，肾小管机能障碍，骨量减少，低钙血症，骨生长障碍，骨钙化机能障碍，甲状旁腺功能亢进症，异位钙化，搔痒，骨硬化，佩吉特氏病，高钙血特发性综合症，甲状旁腺功能减退症，骨痛，肌力下降，骨骼畸形，发育不良和维生素D缺乏症。
6.权利要求5所述的药物组合物，它可有效抵抗至少一种下述的疾病：肿瘤诱导的骨软化症，XLH，低磷酸盐血症，骨质疏松症，骨生长障碍，骨钙化机能障碍和骨软化症。
7.一种促进骨生成的药剂，其包含权利要求1至3任一项所述的抗体作为活性成分。
8.权利要求4至6中任一项的药物组合物，其包含至少2种可识别不同位点的如权利要求1所述的抗体。
9.根据权利要求4所述的药物组合物，其中的抗体可识别如SEQID NO：1所示的介于第180位和第194位氨基酸残基之间的一段氨基酸序列。
10.一种检测成纤维细胞生长因子-23的方法，该方法包括使识别如SEQ ID NO：1所示的介于第25位和第179位氨基酸残基之间的部分氨基酸序列的抗体，和一种识别如SEQ ID NO：1所示的介于第180位和第251位氨基酸残基之间的部分氨基酸序列的抗体，与测试样品发生反应。
11.权利要求10所述的检测方法，其中识别如SEQ ID NO：1所示的介于第180位和第251位氨基酸残基之间的部分氨基酸序列的抗体是一种识别如SEQ ID NO：1所示的介于第180位和第196位氨基酸残基之间的氨基酸序列的抗体。
12.根据权利要求10所述的检测方法，该方法利用了凝血酶抑制剂。
13.根据权利要求10或11所述的检测方法，其中的抗体是由保藏号为FERM BP-7838，FERM BP-7839，FERM BP-7840，或FERMBP-8268的杂交瘤所产生的。
14.一种检测成纤维细胞生长因子-23的试剂盒，该试剂盒包含识别如SEQ ID NO：1所示的介于第25位和第179位氨基酸残基之间的部分氨基酸序列的抗体，和识别如SEQ ID NO：1所示的介于第180位和第251位氨基酸残基之间的部分氨基酸序列的抗体。
15.权利要求14所述的试剂盒，其中识别如SEQ ID NO：1所示的介于第180位和第251位氨基酸残基之间的部分氨基酸序列的抗体是识别如SEQ ID NO：1所示的介于第180位和第196位氨基酸残基之间的氨基酸序列的抗体。
16.权利要求14或15所述的试剂盒，其中的抗体是由保藏号为FERM BP-7838，FERM BP-7839，FERM BP-7840，或FERM BP-8268的杂交瘤所产生的。
17.一种抗成纤维细胞生长因子-23的抗体结合物质，该物质可结合至少一种选自权利要求1至3的抗体。
18.一种医疗器具，其装备有权利要求17中所述的结合物质。
19.根据权利要求18中所述的医疗器具，该器具被用于除去血液中的成纤维细胞生长因子-23。
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