CN1665790A - 用于检测和分离磷酸化分子的组合物及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及磷酸根结合化合物，其可用于结合、检测和分离磷酸化靶分子，包括随后鉴别与磷酸化靶分子相互作用的靶分子或能够被磷酸化的分子。本发明提供一种结合液，其包含一种磷酸根结合化合物、一种酸和一种金属离子，其中该金属离子同时与靶分子上暴露的磷酸根基团和磷酸根结合化合物的金属螯合部分相互作用，在该磷酸根结合化合物与一磷酸化靶分子之间形成一桥键，由此形成一三元络合物。本发明的结合液可用于结合及检测固定的与溶解的磷酸化靶分子，以及用于从复杂混合物中分离磷酸化靶分子，并有助于进行其中可鉴别激酶、磷酸酶底物及酶的蛋白质组学分析。

Description

用于检测和分离磷酸化分子的组合物及方法
关于联邦政府赞助研究的声明
本发明部分由政府资助完成，该项研究的编号为1 R33 CA093292-01，由美国国家癌症研究所授予。美国政府可以拥有本发明的一定权利。
技术领域
本发明涉及用于检测和分离磷酸化靶分子的金属螯合组合物及方法。本发明已应用于蛋白质组学、分子生物学、高通量筛选和诊断学等领域。
背景技术
磷酸化和去磷酸化是将磷酸根基团加成到靶分子及将磷酸根基团从靶分子上去除的过程，其中靶分子通常为蛋白质。可逆磷酸化过程是细胞调控的主要特征，包括信号转导、基因表达、细胞周期调控、细胞骨架调控和细胞凋亡，参见(例如)PROTEINPHOSPHORYLATION(Marks F.ed.，1996)；Hunter之“Signaling-2000 and beyond，”(Cell100：113-127(2000))。主要有两类酶(激酶和磷酸酶)用来调节可逆蛋白质磷酸化，分别将磷酸根基团加成到分子上及从分子上去除磷酸根基团。磷酸化反应是蛋白质功能的主要特征，因此，如果完全明了蛋白质组，则应该能鉴别磷酸化蛋白质。但是，迄今还没有可对涉及细胞和组织调控线路的大量蛋白质的磷酸化状态进行系统平行性分析的实践方法，参见Wilkins等人之Genetic Eng.Rev.13：19(1995)。
信号转导是涉及对细胞调控至关重要的蛋白质磷酸化过程的一个实例。当细胞外刺激因子与其细胞表面识别受体结合后，通常由一组特定的细胞蛋白激酶启动信号转导。这些激酶随后磷酸化靶分子，引起活性变化和对该信号的连续细胞应答，参见(例如)Nishizuka之“Studies and perspectives of protein kinase C”(Science233：305-312(1986))。对于研究人员来说，仅仅鉴别一蛋白质是否为磷酸化蛋白质还不够。鉴别蛋白质上的磷酸化位点和确定磷酸化的化学计量比已成为研究人员的另一研究要点。在真核细胞中，丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸的氨基酸残基是最常见的磷酸化位点。参见(例如)Guy等人之“Analysis of Cellular Phosphoproteins by Two-DemensionalGel Electrophoresis：Applications for Cell Signaling in Normal and Cancer Cells”(Electrophoresis 15：417-440(1994))。因此，在了解蛋白质磷酸化现象方面，研究人员关注两个层次。第一分析层次需要确定一种蛋白质是否为磷蛋白，包括鉴别引起磷酸化的分子；第二分析层次需要鉴别哪一种氨基酸被磷酸化及多少氨基酸被磷酸化。本发明提供了用于所述两个分析层次的材料和方法。本发明还提供了用于分析一些其它含磷酸根和硫代磷酸根的物质(包括糖酯、核苷酸和脂类)的材料和方法。
目前，最常用的磷蛋白检测方法是将32P或33P掺入到培养细胞中或通过蛋白激酶掺入到亚细胞部分中后进行放射自显影，参见(例如)Yan等人之“ProteinPhosphorylation：Technologies for the Identification of Phosphoamino Acids，”(J.Chromatogr.A.808：23-41(1998))；Guy，G.，Phillip，R.和Tan，Y.之Electrophoresis15：417-440(1994)。这些方法受到有限的生物材料范围的制约，例如，组织培养样品和临床样品分析要求对患者进行体内标记，这是不可行的。在过去几年内已经提出了放射标记的若干种替代项。
磷蛋白也可通过免疫印迹和免疫沉淀来检测，参见(例如)Soskic等人之“Functional Proteomics Analysis of Signal Transduction Pathwasys of the Platelet-DerivedGrowth Factor Beta Receptor”(Biochemistry.38：1757-1764(1999))；Watty等人之“TheIn Vitro and In Vivo Phosphotyrosine Map of Activated MuSK”(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.97：4585-4590(2000))。免疫印迹最好是在用蛋白质溶液封闭了固相载体上的未占用位点后进行，因为这些位点会干扰微量化学分析。去除抗体和染色需要较为苛刻的处理(即，加热至65℃，用0.1％SDS和1mM DTT培育)。这也会导致随后使用蛋白质定序和质谱分析发生问题。对于免疫沉淀而言，仅抗磷酸酪氨酸抗体显示出足够紧密以允许有效分离的结合。虽然抗磷酸酪氨酸的优质抗体可购买到，但能够特异性识别磷酸丝氨酸残基和磷酸苏氨酸残基的抗体存在更多问题，它们通常对相邻的氨基酸序列很敏感。由于这些抗体和磷蛋白相互作用时存在潜在的空间位阻，因此这些抗体的可靠性受到质疑。另外，当用抗体检测前没有对磷蛋白进行富集时，不相关蛋白与目标蛋白共迁移现象的存在会导致假阳性信号。因此，用免疫印迹和免疫沉淀技术鉴别磷酸化蛋白质实际上限于含有磷酸化酪氨酸残基的蛋白质，参见上述McLachlin & Chait之文献。
作为选择，磷酸化蛋白质可通过发色染料来鉴别，但成功率有限。阳离子羰花青染料“全染色料(Stains-All)”(溴化1-乙基-2-[3-(3-乙基萘并[1，2d]噻唑啉-2-亚基)2-甲基丙烯基]-萘并[1，2d]噻唑鎓)可将DNA、RNA、磷蛋白和钙结合蛋白质染成蓝色，而将非磷酸化蛋白质染成红色，参见(例如)Green等人之“DifferentialStaining of Phosphoproteins on Polyacrylamide Gels with a Cationic Carbocyanine Dye”(Anal.biochem.56：43-51(1973))；Hegenauer等人之“Staining Acidic Phosphoproteins(Phosvitin)in Electrophoretic Gels”(Anal.Biochem.78：308-311(1977))；Debruyne之“Staining of Alkali-Labile Phosphoproteins and Alkaline Phosphatases on PolyacrylamideGels”(Anal.Biochem.133：110-115(1983))；“Staining of Phosphoproteins in Polyacrylamidegels with acridine orange”(Seikagaku 45：327-35(1973))。全染色料因为特异性差和灵敏度低而通常不用于磷蛋白检测。全染色料的灵敏度至少比常用的蛋白质染色剂考马斯亮蓝(Coomassie Brilliant Blue)低10倍，而与32P放射自显影或本专利所述技术相比则其灵敏度低几个数量级。另一种发色方法，即GelCodeTM磷蛋白检测试剂盒(PierceChemical公司，Rockfod，IL)，设计用于在凝胶中检测磷蛋白；但这种方法有许多局限性。根据这种方法，磷蛋白在凝胶中通过碱水解丝氨酸或苏氨酸的磷酸酯，用钙离子沉淀释放的无机磷酸根，形成一种不溶的磷钼酸盐络合物，然后用诸如甲基绿、孔雀绿或罗丹明B(Rhodamine B)[如Cutting and Roth(1973)所述]等染料对其进行染色来观察。该染色方法的检测灵敏度显著低于考马斯亮蓝染色法(80到160纳克含有大约100个磷酸丝氨酸残基的卵黄高磷蛋白可用该市售试剂盒检测出来)。该方法的染色步骤相当复杂(涉及七种不同的试剂)，并且碱水解要求将凝胶加热至65℃，这会引起凝胶基质较大程度的水解和膨胀。由于磷酸酪氨酸残基不能通过碱处理来水解，因此，在这一氨基酸残基位点磷酸化的蛋白质就逃过了该方法的检测。磷酸根选择性荧光标记染料(其中BODIPY染料共价结合于咪唑反应基)已被开发用于检测胃蛋白酶的磷酸化，参见美国专利第5,512,486号；Wang及Giese之“Phosphate-SpecificFluorescence Lableling of Pepsin by BO-IMI”(Anal.Biochem.230：329-332(1995))。
除了检测磷蛋白外，还存在两种通过对磷酸肽进行化学衍生和富集而使磷酸肽从复杂混合物中分离出来的方法，参见(例如)Goshe等人之“PhosphoproteinIsotope-Coded Affinity Tag Approach For Isolating and Quantitating Phosphopeptides inProteome-Wide Analyses”(Anal.chem.73：2578-2586(2001))。第一种方法涉及以下步骤：用过甲酸来氧化半胱氨酸残基，通过碱水解来诱导来自磷酸丝氨酸和磷酸苏氨酸残基的磷酸根基团的β-消去反应，乙二硫醇加成反应，用生物素来偶联所产生的游离巯基残基，通过亲和素亲和色谱来纯化磷蛋白，对洗脱的磷蛋白进行蛋白质水解消化，进行第二轮亲和纯化，然后进行质谱分析(Oda，Y.，Nagasu，T.及Chait，B.NatureBiotechnol.19：379(2001))。第一种方法使用β-消去反应去除磷酸根基团，用一标记来取代此等基团，以生物素化硫醇基团为例，其中多肽可随后通过亲和素树脂色谱进行分离。另一替代方法要求对样品进行蛋白质水解消化，还原和烷基化半胱氨酸残基，保护多肽N-末端和C-末端，通过碳二酰亚胺与胱胺缩合在磷酸化残基部位形成磷酰胺化加成物，用与碘乙酸偶联的玻璃珠捕获磷酸肽，用三氟乙酸洗脱，并用质谱分析来评估结果(Zhou等人之“A Systematic Approach to the Analysis of ProteinPhosphorylation”，Nat.Biotechnol.19：375-378(2001))。这些方法费时且需要纯化磷酸肽，且能被分离的物质很有限。两种方法都可从试验蛋白质β-酪蛋白中鉴别单磷酸化胰蛋白酶肽片断，但两种方法均不能检测出四磷酸化肽片断。
作为选择，出现了一种将化学修饰同亲和纯化联合的方法来定性蛋白质中的丝氨酸和苏氨酸磷酸肽，其基于通过β-消去反应/1，2-乙二硫醇加成反应并随后对经修饰的蛋白质进行可逆生物素化而将磷酸丝氨酸和磷酸苏氨酸残基转换为S-(2-巯基乙基)半胱氨酰基或β-甲基-S-(2-巯基乙基)半胱氨酰基残基。经胰蛋白酶消化后，经生物素化的肽被亲和分离和富集，接着用液相色谱/串联质谱分析(LC/MS/MS)对其进行随后的结构鉴定，参见Adamczyk等人之“Selective Analysis of Phosphopeptides Within aProtein Mixture by Chemical Modification，Reversible Biotinylation and MassSpectrometry”(Rapid.Commun.Mass Spectrom.15：1481-1488(2001))。
荧光检测方法的出现为蛋白质组学中球蛋白的定量分析提供了最好的解决方法。然而，目前还没有令人满意的方法来对复杂样品中经凝胶分离的磷蛋白进行特异性和可逆的荧光检测。通过用碘乙酸或过甲酸封闭游离巯基、磷酸根残基的碱性β-消去反应、乙二硫醇加成反应以及使所产生的游离巯基与6-碘乙酰胺荧光剂发生反应来对磷酸丝氨酸残基进行衍生和荧光团标记之方法已在毛细管电泳中使用激光激发荧光检测得到了验证，且在蛋白质微量测序膜中也进行了相似的反应。但是，没有一种方法表明可适于直接在凝胶中检测磷蛋白。该方法存在的一个问题是，必须打破碱和乙二硫醇之间的微妙平衡，以此达成从丝氨酸残基中消除磷酸根基团并将乙二硫醇加成到所得的脱氢丙氨酸残基上而不需水解肽骨架。
还可使用几种基于仪器的方法来测定蛋白质磷酸化以及蛋白质测序，例如31P-NMR、质谱分析[参见例如：Resing及Ahn之″Protein Phosphorylation Analysis byElectrospray lonization-Mass Spectrometery″，Methods Enzymol.283：29-44(1997)；Aebersold和Goodlett之″Mass Spectrometry in Proteomics，″Chem.Rev.101：269-295(2001).Affolter，M.，Watts，J.，Krebs，D.，和Aebersold，R.Anal.Biochem.223：74(1994)；Liao，P.，Leykam，J.，Andrews，P.，Gage，D.及Allison，J.Anal.Biochem.219：9(1994)；Oda，Y.，Huang，K.，Cross，F.，Cowburn，D.和Chait，B.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96：6591(1999)]。质谱分析已用于通过比较非磷酸化蛋白质与磷酸化蛋白质的分子质量来提供完整的磷酸化蛋白质的分子质量，参见(例如)McLachlin及Chait之″Analysis ofPhosphorylated Proteins and Peptides by Mass Spectrometry″(Current Opin.Chem.Biol.5：591-602(2001))。这一方法的局限性在于研究人员必须纯化一定量的两种蛋白质。虽然这些方法可精确定性蛋白质和肽的磷酸化状态，但其不适合用于高通量筛选磷酸化底物。这些技术通常是在用放射自显影或用抗磷酸酪氨酸抗体免疫印迹鉴别磷蛋白后使用。尽管最近引入了多种方法通过对在富含14N和15N的培养基中培养不同的细胞群进行质谱分析来直接定量两种不同样品中磷蛋白相对丰度，但已清楚地证明，这些方法的线性动态范围仅为10倍范围。伴随质谱分析的离子抑制现象会妨碍使用这些技术对不同磷蛋白进行化学计量比较。
为了分析分子上的磷酸化位点，需要对磷酸根结合位点和化学计量进行更详尽的分析，而此详尽分析通常需要检测目标磷蛋白的肽片段。这些片段通常是由蛋白酶例如胰蛋白酶消化磷蛋白而产生的。然而，蛋白质的蛋白酶解消化质谱分析很少能全面覆盖蛋白质序列，且通常检测不到目标区域。另外，蛋白质磷酸化通常具有亚化学计量比(sub-stoichiometric)，因此，磷蛋白的丰度低于来自目标蛋白质的其它肽。因此，在质谱分析之前通过高度选择性磷酸肽富集方法会极大改善对磷蛋白的鉴别和定性。此特别适用于使用不改变磷蛋白的化学结构和质量的试剂来检测磷蛋白。
目前，从复杂混合物中选择性富集磷酸肽采用的是固定金属亲和色谱法，又称为IMAC。使用该技术时，金属离子如Fe3+或Ga+3会在加入肽或蛋白质复杂混合物之前先结合到螯合载体上，参见(例如)Posewitz及Tempst之″Immobilized Gallium(lll)Affinity Chromatography of Phosphopeptides″(Anal.Biochem.71：2883-2892(1999))。结合到管柱上的磷酸肽可使用高pH或磷酸盐缓冲液释放，但后者步骤中通常在质谱分析之前需要一进一步脱盐步骤。含有亚胺基二乙酸螯合剂和氨三乙酸螯合剂的树脂已为大家所熟知并有市售，参见(例如)Neville等人之″Evidence for Phosphorylation ofSerine 753 in CFTR Using a Novel Metal-Ion Affinity Resin and Matrix-Assisted LaserDesorption Mass Spectrometry″(Protein Sci.6：2436-2445(1997))。但是，使用当前技术时存在几个难题，包括未与管柱结合的磷酸肽(低亲和力)的损失、随后洗脱磷酸化肽的困难以及对固定金属离子有亲和性的非磷酸化肽本底(低特异性)。
已经证实，可用基于质谱分析的方法来检测分离的肽，且可用介质辅助的激光解吸/离子化(MALDI)技术来直接分析结合到IMAC载体上的磷酸肽，参见Zhou等人之″Detection and Sequencing of Phosphopeptides Affinity Bound to Immobilized Metal IonBeads by Matrix-Assisted Laser Desorption/ionization Mass Spectrometry″(J.Am.Soc.Mass.Spectrom.11：273-283(2000))。为了检测和分析磷酸肽，IMAC亦可直接与质谱分析仪器在线连接，或与替代分离技术例如HPLC和毛细管电泳(CE)联合。
本发明通过使用一阳离子过渡金属和一包含金属螯合部分及一化学部分的化合物来检测磷蛋白和磷酸肽而克服当前方法的局限性，其中该化学部分通常为一反应基团或标记(例如荧光团)或其一组合。有多种螯合部分皆使用聚羧酸根结合位点来选择性结合单价和二价金属阳离子，且其通常用于荧光钙离子指示剂中。这些指示剂的实例为：quin-2(喹因-2)、fura-2(呋喃-2)、indo-1(吲哚-1)(美国专利第4,603,209号)；fluo-3和rhod-2(罗丹-2)(美国专利第5,049,673号)以及FURA REDTM(美国专利第4,849,362号)。对钙离子具有选择性且以BAPTA为主的一族指示剂阐述于HAUGLAND之HANDBOOK OF FLUORESCENT PROBES AND RESEARCHCHEMICALS(第九版，CD-ROM，2002年9月)中。以BAPTA为主的金属螯合剂的实例在美国专利第5,773,227号、第5,453,517号、第5,516,911号、第5,501,980号、第6,162,931号和第5,459,276号中也有描述。
任意钙浓度的指示剂皆基于钙与荧光染料的选择性结合。尽管已知BAPTA化合物可作为常用EGTA螯合剂的类似物结合某些二价阳离子例如钙离子，但亦知BAPTA化合物可结合几乎所有的无机多价阳离子，且其亲和力可高于或低于此化合物对钙离子的亲和力。它们对测量生物细胞中的钙具有选择性和有效性是因为生物系统中这些其它多价阳离子全部缺失或丰度很低。以BAPTA为主的指示剂对多价阳离子(包括镓和对本发明有用的类似金属)的亲和力和选择性可以通过改变pH、溶剂组成、离子强度和其它实验变量来改进。这种对阳离子的选择性和亲和力的改变对本发明所揭示的各方面来说都是至关重要的，包括检测和分离磷酸化靶分子两方面。
本发明克服了当前揭示的一些用于鉴别、分离、分析和定量磷酸化蛋白质的方法的局限性和缺点，因此提供了若干方法、化合物和组合物以缓解人们长期以来对快速高效的高通量检测及为进一步分析而分离磷蛋白的需要。本发明能精确鉴别包含少至一个磷酸根基团的磷酸肽和磷蛋白，且所用方法简单，不需要多个步骤和对样品进行预处理。重要的是，已知本发明方法第一个提供了精确鉴别磷酸化蛋白质组的手段，且允许定量识别增加的蛋白质磷酸化。本发明是一种重要的用于鉴别蛋白质组中的新颖磷酸化蛋白质的工具。该技术具有最佳的定量分析特点，尤其当与总蛋白检测试剂联合使用时。另外，如下所述，本发明的材料和方法并不限于检测及/或分离磷酸化蛋白质。
发明内容
本发明提供用于特异性检测、分离及/或定量磷酸化靶分子的磷酸根结合化合物和方法。在一温和的酸性环境中且存在合适的金属离子时，这些化合物将选择性结合磷酸化靶分子上的磷酸根基团以形成三元络合物，这些靶分子可固定在例如凝胶中或吸附于固态或半固态基质上，或者溶解或悬浮于几乎水性的溶液中。
磷酸根结合化合物的通式为(A)m(L)n(B)，其中A为一化学部分，L为一连接体，B为一金属螯合部分，m为一从1到4的整数，n为一从0到4的整数。不受理论的约束，看来这些特定的磷酸根结合化合物的金属螯合部分在反应中同时会与三价金属离子和靶分子上的磷酸根基团结合形成三元络合物。在这一方式中，金属离子在磷酸根基团和金属螯合部分之间起桥梁作用，其中化学部分A通过离子作用有效结合于磷酸化靶分子上。因此，本发明的一必要条件是，金属螯合部分在合适条件下与一种同时对磷酸化靶分子有亲和力的金属离子结合。
本发明组合物和方法的效用主要是化学部分A通过一连接体共价连接到金属螯合部分以形成本发明磷酸根结合化合物的结果。化学部分A通常是一种标记物或一反应基团。
倘若为了达到检测目的，A通常是一种可检测的标记物，其可为染料(包括着色剂、发色团和荧光团)、半抗原、酶或放射性同位素，当然属于本发明范围的更广泛类别的其它可检测标记物已为大家所熟知。倘若为了达到分离含磷酸根的靶分子之目的，A通常是一种标记物或反应基团，其可与聚合物(例如琼脂糖)、一表面、磁性颗粒或微球体结合。与金属螯合部分及金属离子结合在一起的聚合物被选择用于与磷酸化靶分子结合形成可溶或不溶的三元络合物。此等三元络合物尤其可用于从复合混合物中选择性分离磷酸化靶分子，或作为各种检测方案的组成成分。在本发明的另一方面中，A是一种可改变三元络合物溶解性的化学部分，或者可包含一胺-反应基团，以与含胺分子(包括聚合物及磷酸化靶分子)形成一共价键。
本发明的“结合液”(我们定义其包括真正的溶液、悬浮液、乳液、分散液和其固定化变型)包含一种其式为(A)m(L)n(B)的磷酸根结合化合物、一种包含选定金属离子的盐及一种酸。较佳的盐和金属离子组成以及结合液或悬浮液的浓度在某种程度上要依化合物的金属螯合部分而定。一种特别有用的结合液是磷酸根结合化合物中以BAPTA为主的螯合部分与镓盐的组合。意外地，我们已确定三价镓离子仅在温和的酸性环境存在时以有效的亲和力同时结合BAPTA部分及磷酸化靶分子形成三元络合物。但是，我们同时也证明了其它金属螯合部分例如DTPA、IDA和菲咯啉(phenanthroline)可同时结合三价镓离子和磷酸根基团。因此，结合液的一个必要条件是存在一种酸，其中结合液的pH值较佳为大约3到大约6，此pH值通常为大约3到大约4。用来得到此pH值的酸的性质看来似乎无关紧要；但不应该用磷酸、膦酸或多磷酸来得到此pH值，因为它们会降低三元络合物的稳定性。磷酸根结合化合物在结合液或悬浮液中通常是游离的；但亦可将磷酸根结合化合物固定在一固态或半固态基质上，以便当加入金属离子及酸时可形成结合液，且如果样品中存在磷酸化靶分子则随后可形成本发明的三元络合物。
本发明的方法包含用含有磷酸根结合化合物、金属离子和酸的结合液来接触样品，将样品及结合液培育足够的时间以使结合液中的化合物与所述磷酸化靶分子结合，由此所述磷酸化靶分子形成一种三元络合物。
为检测目的，通常照射得到的包含该化合物的三元络合物来测量化学部分A的可检测光学性质，由此可检测到磷酸化靶分子是否存在。磷酸化靶分子可在溶液中或当固定在固态或半固态基质上时进行检测。本发明的组合物和方法可用于检测含磷酸化和非磷酸化靶分子的复合样品中的磷酸化靶分子，或用于检测靶分子上磷酸根基团数目的变化。磷酸化程度的差异可由生物聚合物磷酸化程度的内在差异(其可引起蛋白质折叠差异)所致，或由体内过程(例如疾病状态)或其与用来鉴别特异性激酶和磷酸酶的体外分析共同所致。
作为选择，当使用本发明方法从溶液中选择性分离磷酸化靶分子时，可不必观察络合物。为分离磷酸化靶分子，可将三元络合物沉淀、固定、通过色谱或电泳技术或通过磁场分离或仍保留在溶液中。在某些情况下，可使用有机萃取法将金属螯合部分从磷酸化靶分子中分离出来。当将三元络合物沉淀或以其它方式固定时，磷酸化靶分子可通过亲和色谱与样品中的非磷酸化靶分子及其它组份分离，例如通过用水性洗液或有机洗液或水性/有机混合洗液简单地进行洗涤。在某些情况下，当萃取的磷酸化靶分子仍然固定在基质上时有利于进行进一步分析。磷酸化靶分子的分离有利于对该等靶分子进行进一步分析，此分析例如可通过液相色谱/质谱法、电泳分离技术、通过检测结合抗体的靶分子(该抗体可以与靶分子的任何部分结合)、或通过各种其它技术来进行。具体而言，由于磷酸化靶分子的分离可去除原始样品中的干扰组份，故可简化对样品的后续分析。
附图说明
图1所示为用包含氯化镓及化合物2的结合液在聚丙烯酰胺凝胶中对磷酸化靶分子(卵白蛋白)(1A)进行选择性检测的结果，与同样的凝胶用总蛋白染色剂(1B)(SYPRORuby蛋白凝胶染色剂)染色后的结果比较(见实例2)。蛋白质混合物以约500微克上样，共含有9种蛋白质，其中之一为含有两个磷酸根基团的磷蛋白(卵白蛋白)。本图证明对照一由8种已知为非磷酸化蛋白质构成的经非常低或未经染色的本底可选择性检测出卵白蛋白。
图2所示为用包含氯化镓及化合物1的结合液在PVDF薄膜上对磷酸化靶分子(卵白蛋白)(2A)进行选择性检测的结果与同样的薄膜用总蛋白染色剂(2B)(SYPRORuby蛋白印迹染色剂)染色后的结果比较(见实例8)。本图证明对照一含有5种非磷酸化蛋白质的经非常低或未经染色的本底可选择性检测出卵白蛋白。
图3所示为用包含氯化镓及化合物2的结合液在凝胶中检测磷酸化蛋白质的灵敏度和线性动态范围(见实例2)；图(3A)是具有不同磷酸根基团比率的5种蛋白质的比较，图(3B)是胃蛋白酶和牛血清白蛋白(BSA)的比较。蛋白质以2倍稀释系列自2纳克至1000纳克上样于SDS聚丙烯酰胺微型凝胶；在四个相同的凝胶中对每一蛋白质样品系列进行操作。磷蛋白为α-酪蛋白(7或8个磷酸根基团)、去磷酸化α-酪蛋白(1或2个磷酸根)、β-酪蛋白(5个磷酸根)、卵白蛋白(2个磷酸根)及胃蛋白酶(1个磷酸根)。BSA不含磷酸根，用作阴性对照。结果证明本发明的方法及结合液能检测出低至1到2纳克的五磷酸化蛋白质(β-酪蛋白)及8纳克的单磷酸化蛋白质(胃蛋白酶)。
图4所示为蛋白质磷酸酶活性的检测，其中α-酪蛋白和胃蛋白酶用作磷酸酶底物。将凝胶与包含氯化镓及化合物2的结合液一起培育，结果证明在底物和蛋白质磷酸酶一起培育后磷酸根基团比对照减少，见实例6。
图5所示为当将肽溶液与包含氯化镓及化合物5的结合液一起培育时磷酸肽(pT/pY及RII，分子量为1670和2193)(B图和C图)自含有非磷酸化肽(血管紧张素I和II，分子量为1297和1046)(A图)的溶液中分离的结果。将混合物培育1小时并离心5分钟。用MALDI-TOF质谱法分析所得上清液(各图中的下部图谱)和块状沉淀物(各图中的上部图谱)。A图所示为上清液中唯一存在的的非磷酸化肽，B和C图所示为沉淀中纯度大于95％的两种磷酸肽。
图6所示为从亲和色谱基质管柱上洗脱的磷酸化肽(α-酪蛋白)的分析，该基质管柱包含具有镓离子的化合物13或化合物14。图A所示为纯化的α-酪蛋白磷酸丝氨酸肽在去磷酸化(左侧的一对峰)并接着用甲胺衍生后(右侧的一对峰)的MALDI-TOFMS分析结果差异。结果显示所有三种肽都是添加甲胺后产生的磷酸丝氨酸衍生物。图A中的A及B受到单磷酸化(+31amu，甲胺)而C受到三磷酸化(+93amu，3个甲胺)。图B所示为从BAPTA-琼脂糖(化合物13或化合物14)管柱洗脱的磷酸肽与市售金属亲和色谱管柱(Pierce Chemical公司)洗脱的磷酸肽的MALDI-TOF MS图。在所用条件下，BAPTA-琼脂糖管柱显示可以从复杂肽混合物中纯化所有预期的磷酸肽(箭头)。图C所示为用强碱(-98amu)和甲胺处理后带有一个磷酸苏氨酸和一个磷酸酪氨酸残基的对照肽(分子量＝1870)。结果证明在没有随后添加甲胺(+32amu)时只消除了一个单磷酸根(-98amu，来自苏氨酸)，确证了单一的磷酸苏氨酸残基。磷酸酪氨酸在这些消除条件下因未受到修饰因而可测定出来。
图7所示为水凝胶微阵列(Perkin Elmer，Foster City，CA)上磷蛋白(β-酪蛋白)的检测，其时该微阵列与包含化合物2及氯化镓的结合液一起培育，见实例18。蛋白质以2倍稀释系列自166皮克至0.324皮克上样于此微阵列上。结果证明可在水凝胶微阵列上检测到0.65皮克的五磷酸化蛋白质。
图8所示为水凝胶微阵列(Perkin Elmer)上磷酸肽(pDISP)的检测，其时该微阵列与包含化合物2及氯化镓的结合液一起培育，见实例19。肽以2倍稀释系列自12皮克至0.18皮克上样于此微阵列上。结果证明可在水凝胶微阵列上检测到少至300飞克的单磷酸化肽。
图9所示为蛋白质激酶活性(9A：CaMPKII及9B：AbI酪氨酸激酶)的检测，其通过检测在水凝胶微阵列(Perkin Elmer)上磷酸化的肽来进行，其时该微阵列与包含化合物2及氯化镓的结合液一起培育，见实例20和实例21。检测肽糖原合成酶1-10以证明CaMPKII激酶的活性，检测肽AbI以证明AbI酪氨酸激酶的活性。
图10所示为通过比较偏振值来检测磷蛋白(10A)和磷酸肽(10B)，其通过单独用结合液及使用含磷酸化及非磷酸化蛋白质或肽、卵白蛋白及δ睡眠诱导肽的结合液来进行，见实例14。结果证明单独使用结合液和使用含非磷酸化蛋白质或肽的结合液时其荧光偏振和各向异性都很相似。但当结合液中存在磷蛋白或磷酸肽时荧光偏振值显著增加。这一结果证明磷蛋白和磷酸肽在溶液中可选择性地与化合物2-Ga3+络合物结合，而不是与非磷酸化蛋白质或肽结合。
图11所示为用本发明结合液和SYPRORuby蛋白凝胶染色剂标记的蛋白质的参比分析，证明了非特异性染色和低丰度磷蛋白可与非磷酸化蛋白质区分，见实例22。用聚丙烯酰胺凝胶分离含有磷酸化和非磷酸化蛋白质的混合物，磷蛋白用包含化合物2及氯化镓的结合液检测。当用SYPRORuby蛋白凝胶染色剂染色后可检测到所有蛋白质。图11A)所示为磷酸化蛋白质的三元络合物与总蛋白的荧光强度比率。图11B)所示为磷酸化蛋白质络合物及总蛋白的荧光强度对蛋白质浓度所绘制的曲线，得到一恒定的Y截距值。图11C)所示为当对蛋白质浓度作图时Y截距值的比率，得到的磷蛋白比率值较非磷酸化蛋白质的比率值要大50到100倍。
具体实施方式
I.定义
在详细阐述本发明之前，应理解的是，本发明并不局限于具体的组合物或方法步骤，而是可改变的。应注意的是，本说明书和随附权利要求中所用的单数形式“一”、“一个”和“该”亦包括复数指代物，除非上下文另有明确规定。因此，例如，提及“一种磷酸化蛋白质”包括多种蛋白质，提及“一种化合物”包括多种化合物，如此等等。
除非另外定义，否则，本文所用的所有技术和科学术语与熟习本项技术者通常理解的意义相同。下列术语是为阐释本发明的目的而定义的。
本文所用术语“亲和力”指两分子间结合作用的强度，例如金属螯合物和金属离子之间。
本文所用术语“烷基”指含1到20个碳原子的直链、支链或环状烃链，其通常含约1到约10个碳原子(例如，甲基、乙基、正丙基、异丙基、环丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、环丁基、金刚烷基、降金刚烷基(noradamantyl)等等)，此等烃链通过碳原子连接到化合物上。具有8个或更少碳原子的直链、支链或环状烃链在本文中亦称为“低烷基”。这些烃链可以是饱和的或者包括一或多个不饱和键，即具有一或多个双键或三键。
本文所用术语“氨基”或“胺基”指基团-NR′R″(或NRR′R″)，其中R、R′及R″各独立选自由氢、烷基、取代烷基、芳基、取代芳基、芳烷基、取代芳烷基、杂芳基和取代杂芳基组成之群。取代胺是胺基，其中R′或R″不为氢。在伯胺基中，R′和R″两者都是氢，而在仲胺基中R′或R″中只有一个(而不是两个)是氢。另外，术语“胺”及“氨基”可包括氮的质子化和季铵化形式，其包含基团-NRR′R″及其生物学上相容的阴离子反荷离子。
本文所用术语“芳基”指具有20或更少碳原子的芳香环碳链，例如，苯基、萘基、联苯基和蒽基。芳基中的一或多个碳原子亦可被例如烷基、芳基、杂芳基、卤素、硝基、氰基、羟基、烷氧基或芳氧基等取代。
本文所用术语“水性溶液”指其中主要是水并保持水的溶液特性的一种溶液。倘使水性溶液中含有除水之外的溶剂，则通常水是主要溶剂。
本文所用术语“BAPTA”指一种金属螯合化合物，其为1，2-二(2-胺基苯氧基)乙烷-N，N，N′，N′-四乙酸或其类似物、衍生物、稠环变体和共轭体及其所有的金属或非金属盐、亚盐及其水合物，包括美国专利第4,603,209号、第4,849,362号、第5,049,673号、第5,453,517号、第5,459,276号、第5,516,911号、第5,501,980号、第6,162,931号及第5,773,227号(如上述)中揭示的任何相应化合物。一般在使用时，“BAPTA”指通过以氧原子为终止的C1到C3烃键桥连接的两个苯环，这些桥基包括亚甲基二氧基(-OCH2O-)、亚乙基二氧基(-OCH2CH2O-)或亚丙基二氧基(-OCH2CH2CH2O-)，其中的每个苯环视需要可经一或多个取代基取代，以调整该化合物的金属离子结合亲和力、溶解性、化学反应性、光谱特性或其它物理特性。在本发明一较佳实施例中，“BAPTA”共价连接于一化学部分A上，该化学部分A与一合适的三价金属离子和一种酸结合后可对作为三元络合物的磷酸化靶分子进行检测和分离。BAPTA衍生物还包括其中BAPTA结构中的苯环被其它芳香环或杂芳环取代或与其它芳香环或杂芳环形成稠环的化合物。
本文所用术语“生物素”指任何生物素衍生物，包括但不限于经取代和未经取代的生物素、及其类似物和衍生物，以及己酰胺生物素、生物胞素、脱硫生物素、脱硫生物胞素、亚胺基生物素和磺化生物素的经取代和未经取代衍生物。
本文所用术语“生物素结合蛋白质”指任何选择性结合生物素的蛋白质，包括但不限于生物素抗体、经取代或未经取代的亲和素、及其类似物和衍生物、以及抗体、链霉亲和素、铁蛋白亲和素、硝化亲和素、硝化链霉亲和素及NeutravidinTM亲和素(一种等电点接近中性的脱糖化修饰亲和素)的经取代和未经取代衍生物及其经染料、酶或聚合物修饰的变型和生物素结合蛋白质的固定化形式。
本文所用术语“缓冲液”指一种其作用为将因添加或减少化学物质而引起的溶液酸碱度的变化减小到最低程度的体系。
本文所用术语“羰基”指官能团-(C＝O)-。但是要认识到该基团可以被其它熟知的与羰基具有相似电子及/或空间特性的基团取代，如硫代羰基(-(C＝S)-)、亚磺酰基(-S(O)-)、磺酰基(-SO2)-)、膦酰基(-PO2-)。
本文所用术语“羧基”(″carboxy″或″carboxyl″)指基团-R′(COOR13)，其中R′为烷基、取代烷基、芳基、取代芳基、芳烷基、取代芳烷基、杂芳基或取代杂芳基。R13为氢或一种盐。
本文所用术语“化学部分A”或“化学部分”指一共价连接于具有式(A)m(L)n(B)的金属螯合化合物上以形成本发明之磷酸根结合化合物的部分。“化学部分A”包括一种如下定义的标记物，即一种便于检测和分离磷酸化靶分子的可检测部分。术语“化学部分A”为一种天然或合成部分，其通常是一种标记物，但也可以(并不限于)是一种反应基团，其通常为胺反应基，如琥珀酸亚胺酯，该基团的功能是通过共价键使一种聚合物(包括琼脂糖)、丙烯酰胺、微粒子、蛋白质(例如抗体或抗原)、磷酸化靶分子及配体以及那些熟习此项技术者所熟知的物质与本发明之磷酸根结合化合物结合。另外，化学部分A也可以是本发明的一金属螯合部分，通常，一金属螯合部分将通过一反应基团连接到本发明的磷酸根结合化合物上(共轭反应)，但是，当未使用其中的反应基团时，该金属螯合部分可通过一连接体共价结合于本发明的磷酸根结合化合物上。
本文所用术语“络合物”指两或多个分子与(例如)金属离子螯合剂及络合有(即非共价键结合)蛋白质的金属离子的结合体，或者指(例如)抗体与抗原、酶与酶底物、配体与受体(例如生物素与亲和素)、核酸与其互补链、一种蛋白质与另外一种蛋白质或与对此第一种蛋白质有亲和力的核酸、及诸如此类的结合体，其通常皆通过非共价键结合。
本文所用术语“可检测响应”指一可通过观察或者仪器直接或间接检测到的信号发生或变化。可检测响应通常是一种光学响应，其会导致波长分布形式或者吸收或荧光强度发生变化，或者会导致光散射、荧光寿命、荧光偏振或这些参数之组合发生变化。或者，可检测响应是一信号的发生，其中染料本身可发出荧光且当染料与金属离子或磷酸化靶分子结合时不会产生信号变化。或者，可检测响应是一种因形成本发明三元络合物(包含磷酸化靶分子)而使可检测标记物空间定位于一样品集合物(例如在凝胶中、印迹上或阵列上、在微孔板孔内、在微流室内或在微粒上)所产生的信号结果(例如颜色、荧光、放射性或另一物理特性)。
本文所用术语“可直接检测”指可检测标记物或自可检测标记物产生的信号的存在可通过观察、仪器或胶片立即检测到，而不需要化学修饰或添加物质。例如，荧光团即会产生可直接检测的响应。
本文所用术语“DTPA”指一金属螯合部分二亚乙基三胺五乙酸或其衍生物及美国专利第4,978,763号和第4,647,447号揭示的任何相应部分。DTPA以式(CH2CO2R13)ZN[(CH2)3N(CH2CO2R13)T(CH2)SN(CH2CO2R13)Z来表示，其中连接体连接至次甲基碳原子或氮原子上，Z为1或2，S为1到5，T为0到4，R13为氢或一种盐。
本文所用术语“染料”指一类可发光以产生可观察的可检测信号的化合物。“染料”包括荧光和非荧光化合物，其包括但不限于着色剂、荧光团、化学发光化合物、发光化合物和发色团。本文所用术语“荧光团”指一类其本身可发出荧光或在结合到生物化合物或金属离子上或通过酶代谢时显示荧光变化(即可发出荧光)的组成。荧光团可经取代，以改变荧光团的溶解性、光谱特性或物理特性。本发明之荧光团未经磺化。大量荧光团已为熟习此项技术者所熟知，其包括但不限于苯并呋喃、喹啉、喹唑啉酮、吲哚、苯并吡咯、硼聚吖吲得辛(borapolyazaindacenes)及呫噸，后者还包括荧光素、罗丹明、对甲氨基酚及RICHARD P.HAUGLAND之MOLECULAR PROBESHANDBOOK OF FLUORESCENT PROBES AND RESEARCH CHEMICALS(第九版，包括CD-ROM，2002年9月)中阐述的其它荧光团。
本文所用术语“酶”指由活有机体产生或通过天然蛋白质分子的化学修饰产生的蛋白质分子，其可催化其它物质的化学反应而本身在反应完成后不会受到破坏或发生改变。其它物质的实例包括但不限于化学发光物质、发色物质和荧光物质或以蛋白质为主的底物。
本文所用术语“卤素”指取代基氟、溴、氯和碘及含有这些卤素组合及多个任一种卤素的化合物。
本文所用术语“杂芳基”指如上定义的芳基中一或多个碳原子被一非碳原子(特别是被氮、氧或硫)取代的基团。
本文所用术语“IDA”指式为-N(CH2CO2R13)2的亚胺基二乙酸金属螯合部分，其中R13是氢或一种盐，连接体连接到氮原子上，前提是连接体不是连接到荧光团芳香环上的共价单键。
本文提及标题物肽、蛋白质和蛋白质络合物时所用术语“分离”指肽、蛋白质或者蛋白质三元络合物制备过程，使其基本上不含杂质非磷酸化肽、蛋白质或其他相关靶分子，而这些杂质非磷酸化肽、蛋白质或其他相关靶分子在(例如)含有内源性蛋白质或络合物的细胞混合物或环境中通常会与肽、蛋白质或络合物共同存在。另外，在某些实施例中，“分离”也指与本发明中用于从细胞混合物中分离肽、蛋白质或络合物的试剂进一步分离。因此，分离蛋白质或蛋白质络合物可以是与样品的其它部分分离，且视需要也可以是与本发明的磷酸根结合化合物(包括聚合物基质)分离，这些组份或化全物通常会“污染”或干扰(例如)通过质谱法对分离络合物进行研究或进一步处理。术语“已分离”亦可指彼此通过(例如)在凝胶或阵列上的不同物理位置或通过在经由诸如管柱或毛细管之类的检测器时的不同经过时间而从空间或时间上分开的磷酸化靶分子。
本文所用术语“试剂盒”是指相关组份(通常是一或多种化合物或组合物)的成套封装，视需要可包含缓冲液、分离介质、标准样品、软件或其它组份。
本文所用术语“标记物”是指一种可检测部分，其可便于检测和分离与本发明的金属螯合部分组合的磷酸化靶分子。例示性标记物包括可直接观察或测量的标记物，可或间接观察或测量的标记物，例如，荧光团、放射性标记物、酶报道基因标记物(Patton，W.等人，J.Chromatography B：Biomedical Applications(2002)771：3-31；Patton，W.等人，Electrophoresis(2000)21：1123-1144)。此等标记物包括但不限于，可用辐射计数装置测量的放射性标记物；可用肉眼观察或用分光光度计测量的着色剂、染料或其它发色染剂；可用自旋标记分析仪测量的自旋标记物；可通过以光(此光可被染料吸收)激发来观察或可用标准荧光检测仪或成像系统测量的荧光标记物(荧光团)(其中输出信号由一种合适的分子加成物激发产生)，或者例如为可利用其光学或光散射特性来检测的金属粒子，例如金或银粒子或金属条形码。标记物可以是化学发光物质，其中输出信号可通过信号化合物的化学修饰产生；含金属的物质；或酶，其中会产生酶依赖性二级信号，例如自一无色底物形成有色产物。术语“标记物”也可指一种“标记”、半抗原或其它配体，其可选择性结合在被标记的分子上，以便当随后添加被标记分子时可使用该分子产生可检测信号。例如，人们可用生物素作为标记，然后将亲和素或辣根过氧化物酶(HRP)的链霉亲和素共轭体结合到该标记上，接着用一种发色底物(例如，四甲基联苯胺)或一种荧光底物来检测HRP的存在。大量的标记物和标记及其选择性检测方法已为通晓此项技术者所熟知，其包括但不限于粒子、荧光团、半抗原、酶及其发色底物、荧光底物和化学发光底物以及其它阐述于上述《分子探针手册(MOLECULAR PROBES HANDBOOK)》中的标记物。
本文所用术语“连接体”或“L”指将标记物共价连接于标记化合物的金属螯合部分上的共价单键或一系列稳定共价键，其中结合有1到30个选自由C、N、O和P原子组成之群的非氢原子。
本文所用术语“金属螯合剂”或“金属螯合部分”指一可与金属离子组合以形成螯合环状结构的化学部分。为达到本发明的目的，同金属螯合剂有亲和力的金属离子在温和的酸性环境中同时对该金属螯合剂和磷酸化靶分子具有亲和力。金属螯合部分的实例有BAPTA、IDA、DTPA和菲咯啉。假如金属螯合剂不被磺化，则该金属螯合剂视需要可被那些可调节化合物的离子结合亲和力、可溶性、光谱特性或其它物理特性的取代基所取代。
本文所用术语“金属离子”是指在pH为3到6时同时与靶分子的磷酸根基团和本发明的金属螯合化合物具有亲和力的任何三价金属离子，可用于形成磷酸根结合化合物和磷酸化靶分子的三元络合物。此等金属离子包括但不限于AL3+、Fe3+及Ga3+。为达到本发明的目的，金属离子必须同时对金属螯合部分和靶分子的磷酸根基团两者都具有亲和力，并由此将亲和力赋予用于靶分子磷酸根基团的金属螯合部分，其中此亲和力在金属离子不存在时将不会存在。
本文所用术语“磷酸根结合化合物”或“结合化合物”指其式为(A)m(L)n(B)n的化合物，其中A为一化学部分，L为一连接体，B为一金属螯合部分，m为一从1到4的整数，n为一从0到4的整数。当金属螯合部分间接结合到靶分子上的磷酸根基团时，这些化合物可有效地但非共价连接标记物到磷酸化靶分子上。
本文所用术语“磷酸化靶分子”或“磷酸根靶分子”指具有一或多个磷酸根或磷酸根类似部分的分子，其中每一个磷酸根或磷酸根类似部分都通过单酯键或无机磷酸根结合于此分子上。磷酸盐类似物包括但不限于硫代硫酸盐、磷酸硼、膦酰胺、H-膦酸盐、膦酸烷基酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯及氟磷酸。磷酸化靶分子包括但不限于磷蛋白、磷酸肽、磷酯、磷酸聚糖、磷酸碳水化合物、磷酸氨基酸、焦磷酸盐及无机磷酸盐和其硫代磷酸盐类似物。大部分已知的磷酸盐化合物和由其获得的磷酸化靶分子可为下述三类中的一类：1)单独的磷酸根基团(例如，无机磷酸根或蛋白质或肽上的磷酸根基团(PO3))；2)多连结磷酸根基团(例如，焦磷酸盐；或核苷酸，例如ATP)；3)桥联磷酸根基团(即核酸)。为达到本发明的目的，磷酸化靶分子不包括上述第三类分子，例如DNA或RNA。磷蛋白和磷酸肽通常在酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸的氨基酸残基上进行翻译后磷酸化。肽和蛋白质中的其它磷酸化氨基酸残基包括1-磷酸组氨酸、3-磷酸组氨酸、磷酸-天冬氨酸、磷酸-谷氨酸和较不常见的Nε-磷酸-赖氨酸、Nω-磷酸-精氨酸及磷酸-半胱氨酸(Kaufmann等人，(2001)Proteomics1：194-199；Yan等人，(1998)J.Chromatograph.A 808：23-41)。因此，磷酸化蛋白质或肽通常包含至少一种这样的氨基酸残基。磷酸化靶分子也包括纳入了其他非肽区例如脂类或糖类的磷酸化蛋白质，例如，脂蛋白、脂多糖。另外，蛋白质上的脂类或糖类残基亦可经磷酸化或与蛋白质及肽上的酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸残基组合，例如经磷酸甘露糖修饰的蛋白质或经N-乙酰谷氨酸-1-磷酸盐修饰的蛋白质。其它修饰包括吡哆醛磷酸根在赖氨酸的ε-氨基上形成西夫碱(Schiff base)，丝氨酸残基的O-泛酰巯基乙胺磷酸化。使用本发明的方法亦可检测三磷酸核苷酸的γ位磷酸根，通过该方法可检测经光学标记的蛋白质及肽。为达到本发明的目的，磷酸化靶分子包括磷酸化脂类和糖类。
本文所用术语“蛋白质”和“多肽”在一般意义上包括任何长度的氨基酸残基聚合物。本文所用术语“肽”指含有少于100个氨基酸残基的多肽，通常含有少于15个氨基酸残基。这些术语适用于其中一或多个氨基酸残基是一相应天然氨基酸的人造化学类似物的氨基酸聚合物，也适用于天然存在的氨基酸聚合物。肽或蛋白质可进一步与其它部分结合或络合，例如可与染料、半抗原、放射性同位素、天然或合成聚合物(包括微球体)、玻璃、金属和金属粒子、蛋白质和核酸结合或络合。
本文所用术语“样品”指可含有磷酸化靶分子的任何上述天然或合成物质，或者其中可含有可直接与磷酸根或磷酸化靶分子相互作用的组份，例如酶。样品通常包含纯化的或半纯化的磷酸化靶分子和内源性宿主细胞蛋白质。磷酸化靶分子可以纯化或半纯化形式通过人工合成制得，或从细胞(真核细胞或原核细胞不限)、细胞提取物、细胞匀浆、亚细胞组份得到天然或重组分子。或者，磷酸化靶分子可通过组织匀浆、体液和其它生物液或合成蛋白质得到，其在本发明中皆可构成一样品。样品可以存在于水性溶液中或几乎呈水性的溶液中、适当的细胞培养基中或固定于固态或半固态表面，例如聚合物凝胶、膜、微粒、光纤或微阵列上。另外，本文所用术语“样品”也指激酶或磷酸酶或结合磷酸化靶分子(其可经磷酸化或可不经磷酸化)的分子的底物。因此，“样品”包含与磷酸盐及磷酸化靶分子相互作用的组份，尤其包括针对磷酸化靶分子或靶分子其它区域的抗体，或(例如)经生物素化的靶分子与亲和素衍生物形成的络合物。
本文所用术语“三元络合物”指一种其同时包含磷酸根结合化合物、本发明的三价金属离子和磷酸化靶分子的组合物，其中金属离子同时对该化合物的金属螯合部分和分子上的磷酸根基团两者都具有亲和力，且其中此金属离子在两分子间形成桥键。除非上下文中对术语“结合”和“络合物形成”的使用加以限制，否则，在本发明中该等术语皆意味着该三元络合物的形成过程。
II.组合物及其使用方法
本发明提供了磷酸根结合化合物、磷酸盐结合液及用于选择性检测及/或分离磷酸化靶分子的方法。当本发明的磷酸根结合化合物存在于结合液中时会选择性地结合至磷酸化靶分子上并且可对靶分子进行检测及/或分离。结合液包含三种用来结合磷酸化靶分子的关键组份：1)其式为(A)m(L)n(B)n的磷酸根结合化合物，其中A为一化学部分，L为一连接体，B为一金属螯合部分，m为一从1到4的整数，n为一从0到4的整数；2)一种包含一金属离子的盐；及3)一种酸。结合液通常包括一种缓冲剂以保持酸性pH值，该值为大约pH 3至大约pH 6较为理想，结合液中还包括一种有机溶剂，其中用法和溶剂依具体应用而定，并将在下文进行讨论。包含磷酸根结合化合物、金属离子和磷酸化靶分子的三元络合物在酸性环境中很稳定，但当pH接近中性(pH 7)或碱性(pH＞7.0)时，此络合物会变得越来越不稳定。
结合液用于将本发明的化学部分A或当A是一反应基团时将本发明的一天然或合成物质非共价连结到磷酸化靶分子上暴露的磷酸根基团上，其中化学部分A可构成本发明的磷酸根结合化合物。这些被结合的靶分子随后可用本文所述的检测方法之一进行检测，或通过下面描述的大量方法加以分离。在酸性环境中，结合液中的金属离子同时对磷酸根基团和本发明的磷酸根结合化合物之金属螯合部分两者都具有亲和力。
因此，本发明通过磷酸根结合化合物来结合磷酸化靶分子的方法包含以下步骤：
i)用结合液接触样品，及；
ii)将样品和结合液培育足够时间，以使所述化合物与所述磷酸化靶分子结合，由此结合所述磷酸化靶分子。
假如样品和结合液之间有充分的接触，则本发明方法的使用不受分析形式的限制。因此，该方法意欲涵盖任何形式的无限制数量的分析，其中不管分析意图是什么，本发明的结合液皆与靶分子上的暴露磷酸根基团接触。因此，本发明的方法涵盖但不限于以直接或间接方式对磷酸化靶分子的鉴别、对去磷酸化分子的鉴别、对可导致磷酸化和去磷酸化的酶的鉴别、对可与磷酸化靶分子互相作用的分子进行鉴别及对磷酸化靶分子的分离。检测包括—适用时—用适当的标准样品及对照样品对磷酸化靶分子进行定量分析、甄别及随后的分析和鉴别。
总之，为了便于理解本发明，首先将详细说明结合液的组份，接着阐述磷酸根结合化合物和金属离子的多种不同的使用方法，随后阐述某些特别适用于本发明方法的新颖化合物的例示性合成和使用方法。
A.磷酸根结合化合物的组份
本发明中的磷酸根结合化合物具有式(A)m(L)n(B)，其中A是一化学部分，L一是共价连结化学部分和金属螯合部分(B)的连接体。化学部分通常是一反应基团或一包括染料、半抗原或酶在内的标记物。金属螯合部分取决于对磷酸根及磷酸根类似基团有亲和力的金属离子；这样的离子包括Ca3+、Fe3+及Al3+。我们发现为达到本发明的目的，在温和的酸性环境中，例如在大约pH 3到大约pH 6之间的酸性环境中，三价镓离子对靶分子上的磷酸根基团和某些螯合基团例如BAPTA、IDA、DTPA和菲咯啉皆具有亲和力；其中以BAPTA螯合部分最佳。
1.磷酸根结合化合物的化学部分A
A.标记物
磷酸根结合化合物的标记物可以是熟习此项技术者所知的任何标记物，当标记物或者共价连接到金属螯合部分或者构成其中不存在连接体的金属螯合部分的一部分时，可形成本发明的磷酸根结合化合物。标记物包括但不限于发色团、荧光团、荧光蛋白质、磷光染料、串联染料(能量转移对)、微粒子、聚合物、半抗原、酶和放射性同位素。较佳的标记物包括染料、荧光蛋白质、半抗原和酶。共价连结可为共价单键或稳定化学键的组合。将标记物和金属螯合部分结合在一起的共价连结通常是共价单键，但也可为包括1到30个非氢原子的取代烷基链，或为选自由C、N、O、S及P组成之群的取代环烷基。
本发明中的染料是最大吸光值大于280纳米的任何化学部分，其当磷酸根结合化合物的一部分保留其独特的光谱特性时可提供一可检测信号。较佳的染料是荧光团或化学发光前体，其可直接检测到或者在加入一附加试剂或多种试剂后产生荧光或化学发光现象而可检测到。
本发明中的染料包括但不限于嵌二萘、蒽、萘、吖啶、芪、吲哚或苯并吲哚、噁唑或苯并噁唑、噻唑或苯并噻唑、4-胺基-7-硝基苯-2-氧杂-1，3-二唑(NBD)、花青(包括在美国专利第09/968,401和第09/969,853以及美国专利第6,403,807号和第6,348,599号中的任何相应化合物)、羰花青(包括美国专利第09/557,275号和美国专利第5,486,616号、第5,268,486号、第5,569,587号、第5,569,766号、第5,627,027号和第6,048,982号中的任何相应化合物)、喹诺酮、卟啉、水杨酸盐、邻胺基苯甲酸盐、甘菊环、苝、吡啶、喹啉、硼聚吖吲得辛(包括美国专利第4,774,339号、第5,187,288号、第5,248,782号、第5,274,113号和第5,433,896号中揭示的任何相应化合物，如上述)、呫噸(包括美国专利第6,162,931号、第6,130,101号、第6,229,055号、第6,339,392号、第5,451,343号、第6,221,606号、第6,358,684号、第6,008,379号、第6,111,116号、第6,184,379号、第6,017,712号、第6,080,852号、第5,847,162号以及美国专利第09/922,333中揭示的任何相应化合物)、噁嗪或苯并噁嗪、咔嗪(包括美国专利第4,810,636号中揭示的任何相应化合物)、phenalenone、香豆素(包括美国专利第5,696,157号、第5,459,276号、第5,501,980号和第5,830,912号中揭示的相应化合物)、苯并呋喃(包括美国专利第4,603,209号和第4,849,362号中揭示的任何相应化合物)和benzphenalenone(包括美国专利第4,812,409号中揭示的任何相应化合物)及其衍生物。本文所用噁嗪包括试卤灵(包括美国专利第5,242,805号中揭示的任何相应化合物)、胺基噁嗪酮、二胺基噁嗪及其苯并基取代类似物。
当染料为呫噸时，此染料视需要也可以是荧光素、对甲氨基酚(包括美国专利第5,227,487号和第5,442,045号中揭示的任何相应化合物)、罗丹明(包括美国专利第5,798,276号和第5,846,737号中的任何相应化合物)。本文所用罗丹明和对甲氨基酚染料除包括其它衍生物外还包括含有呫噸(带饱和或不饱和“久洛尼定(julolidine)”环)的化合物。本文所用荧光素包括苯并-或二苯并荧光素、半萘并荧光素或萘并荧光素。同样，本文所用的对甲氨基酚包括半萘并罗丹氟(seminaphthorhodafluors)(包括美国专利第4,945,171号中揭示的任何相应化合物)。
本发明之较佳染料包括苯并呋喃、喹啉、喹唑啉酮、呫噸、吲哚、苯并吲哚和硼聚吖吲得辛。较佳的呫噸包括含有久洛尼定的呫噸及荧光素、对甲氨基酚、罗丹明和蔷薇苯胺。本发明中的蔷薇苯胺包含在呫噸中心环的碳原子上经取代及未经取代的两种化合物，取代基是在以呫噸为主的染料中常见的取代基，例如苯基及取代苯基部分。较佳的荧光染料皆未经磺化，这是本发明的一个重要方面。
可供选择的染料是一种在呫噸第9位通过共价单键L结合的呫噸。较佳的呫噸包括在第9位连结的3H-呫噸-6-醇-3-酮衍生物、在第9位连结的6-胺基-3H-呫噸-3-酮衍生物或在第9位连结的6-胺基-3H-呫噸-3-亚胺衍生物。
染料通常包含一或多个芳香环或杂芳环，该等环视需要可经各种取代基取代一次或多次，取代基包括但不限于卤素、硝基、氰基、烷基、全氟烷基、烷氧基、烯基、炔基、环烷基、芳烷基、酰基、芳基或杂芳基环系统、苯基或者其它在此项技术中常见的染料上的取代基。
在本发明的一方面，染料的最大吸光值大于480纳米。在一特别有用的实施例中，染料的吸收波长在或者接近488纳米到514纳米(尤其适合通过氩离子激光源输出来激发)或者接近546纳米(尤其适合通过汞弧光灯来激发)。像许多染料一样，此等染料既能作为发色团又能作为荧光团，因而使化合物可同时作为磷酸化靶分子的色度标记物及荧光标记物。因此，所述荧光染料也是本发明中较佳的发色团。
除染料外，发现酶也可用作其式为(A)m(L)n(B)的磷酸根结合化合物的标记物。酶是令人满意的标记物，因为其可使可检测信号获得放大，因而可使分析敏感度提高。酶本身不产生可检测响应，但当其与合适的底物接触时能够分解底物，从而使经转化的底物产生一荧光信号、发色信号或发光信号。酶能够放大可检测信号，因为标记化合物上的一个酶可以导致多个底物分子转化为可检测信号。这在样品中含有少量磷酸化靶分子时或当可产生与酶相当或较酶更强的信号的荧光团不存在时是很有利的。其中以荧光团为最佳，因为其不需要额外的分析步骤，因而可避免产生一不稳定的三元络合物。为产生较佳的可测量结果，例如颜色、荧光或化学发光，需对酶底物加以选择。这样的底物广泛应用于此项技术中，其中有许多阐述于MOLECULAR PROBESHANDBOOK(如上述)中。
在发色或荧光底物与酶的较佳组合中使用氧化还原酶，例如辣根过氧化物酶(HRP)与底物如3，3′-二胺基联苯胺(DAB)或3-胺基-9-乙基咔唑(AEC)，其会产生可区分的颜色(分别为棕色和红色)。其它能够产生可检测结果的发色氧化还原酶底物包括但不限于：2，2-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)、邻苯二胺(OPD)、3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)、邻联二茴香胺、5-对胺基水杨酸和4-氯代-1-萘酚。荧光底物包括但不限于高香草酸或4-羟基-3-甲氧基苯乙酸、还原的吩噁嗪及还原的苯并噻嗪，包括Amplex红试剂及其变型产品(美国专利第4,384,042号)和还原的二氢呫噸，包括二氢荧光素(美国专利第6,162,931号)和二氢罗丹明，包括二氢罗丹明123。酪酰胺类过氧化酶底物(美国专利第5,196,306号、第5,583,001号和第5,731,158号)代表着一类独特的过氧化酶底物，其独特之处在于可在酶发挥作用前就检测到其本身特征，但其在被描述为酪酰胺信号放大(TSA)的过程中通过过氧化物酶作用而被“固定于某一位置”。这些底物广泛地用于标记细胞、组织或阵列样品中的目的物，以便于随后通过显微镜、流式细胞仪、光学扫描和荧光计对其进行检测。
在发色底物(在某些情况下是荧光底物)与酶的另一较佳组合中使用磷酸酶，例如酸性磷酸酶或此类磷酸酶的重组型式与发色底物例如5-溴-4-氯-3-磷酸吲哚(BCIP)、6-氯-3-磷酸吲哚、5-溴-6-氯-3-磷酸吲哚、对硝基苯基磷酸盐或邻硝基苯基磷酸盐的组合，或与荧光底物例如4-甲基伞形基磷酸盐、6，8-二氟-7-羟基-4-甲基香豆素基磷酸盐(DiFMUP，美国专利第5,830,912号)、荧光素二磷酸盐、3-O-甲基荧光素磷酸盐、试卤灵磷酸盐、9H-(1，3-二氯-9，9-二甲基吖啶-2-酮-7-基)磷酸盐(DDAO磷酸盐)或ELF97、ELF39或相关磷酸盐(美国专利第5,316,906号和第5,443,986号)。
糖苷酶，特别是β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酸酶和β-葡糖苷酶，亦是合适的酶。合适的发色底物包括但不限于5-溴-4-氯-3-吲哚基β-D-吡喃半乳糖苷(X-gal)和相似的吲哚基半乳糖苷、葡糖苷和葡糖苷酸，邻硝基苯基β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)和间硝基苯基β-D-吡喃半乳糖苷。较佳的荧光底物包括试卤灵β-D-吡喃半乳糖苷、荧光素二半乳糖苷(FDG)、荧光素二葡糖苷酸及其结构变体(美国专利第5,208,148号、第5,242,805号、第5,362,628号、第5,576,424号和第5,773,236号)、4-甲基伞形烷β-D-吡喃半乳糖苷、羧基伞形烷β-d-吡喃半乳糖苷和氟酸香豆素β-D-吡喃半乳糖苷(美国专利第5,830,912号)。
其它酶包括但不限于，水解酶(例如胆碱酯酶及肽酶)、氧化酶(例如葡萄糖氧化酶及细胞色素氧化酶)及还原酶，这些酶的合适底物已为众人所熟知。
对于某些分析来说，较佳使用酶及其可产生化学发光的合适底物。这些包括但不限于荧光素酶及发光蛋白的天然和重组形式。可产生化学发光的磷酸酶底物、糖苷酶底物及氧化酶底物(例如那些含有稳定二氧丁环(dioxetanes)、胺基苯二酰肼、异胺基苯二酰肼及吖啶鎓酯的底物)特别有用。磷酸酶的几种化学发光底物已为众人所熟知，包括BOLD APB化学发光底物(Molecular Probes公司)。
除酶之外，半抗原如生物素、地高辛(digoxigenin)和2，4-二硝基苯基也是较佳的标记物。生物素之所以有用是因为其在酶系统中能起进一步放大可检测信号的作用，并且在进行分离时它能作为标记用于亲和色谱。进行检测时，可使用对生物素有亲合力的酶共轭体，如亲和素-HRP。随后，加入过氧化酶底物以产生可检测信号。进行分离时，可将一蛋白质(例如对生物素有亲合力的亲和素)与琼脂糖珠共轭结合。经生物素标记的金属螯合部分与磷酸化靶分子接触后，与管柱上的或结合到磁性粒子上的或溶液中的亲和素珠粒一起培育，以分离及/或浓缩磷酸化靶分子。生物素的较佳形式是脱硫生物素类似物，其可以很容易地被以亲和素为主的亲和基质吸收或释放。对于某些应用而言，亲和素的较佳形式是CaptAvidin生物素-结合蛋白质(MolecularProbes)，其允许生物素化的化合物轻松释放。
除其它衍生物之外，半抗原还包括激素、天然和合成的药物、污染物质、过敏原、效应器分子、生长因子、趋化因子、细胞因子、淋巴因子、氨基酸、肽、化学中间体、核苷酸及诸如此类。荧光或发光蛋白质亦可用作本发明中的磷酸根结合化合物的标记物。荧光蛋白质的例子包括绿-荧光蛋白质(GFP)、发光蛋白(acquorin)和藻胆蛋白及其衍生物。荧光蛋白质，尤其是藻胆蛋白，对形成经串联染料标记的标记试剂或对间接检测经半抗原标记的标记化合物或固定在基质(例如微粒或阵列)上的磷酸化靶分子是特别有用的。这些串联染料包含一荧光蛋白质及一荧光团，以获得斯托克司频移(Stokes shift)，其中发射光谱较远地偏离荧光蛋白质的吸收光谱波长。这种特性对检测样品中少量的靶分子特别有利，其中发出的荧光获得了最大程度的最佳化；换句话说，发出的光很少甚至没有一点被荧光蛋白质重吸收。为了做到这一点，荧光蛋白质和荧光团起能量转移对的作用，其中荧光蛋白质在受体荧光团吸收波长处发光，然后荧光团在一远离荧光蛋白质波长(远于仅以荧光蛋白质所能获得的波长)处发射光。或者，荧光团起能量给体的作用，荧光蛋白质作为能量受体。特别有用的荧光蛋白质是在美国专利第4,520,110号、第4,859,582号、第5,055,556号中揭示的藻胆蛋白及在美国专利第4,542,104号中揭示的荧光团胆汁三烯蛋白质组合物。或者，两种或多种荧光团染料可起能量转移对的作用，其中一个荧光团为给体染料而另一个为受体染料(包括在美国专利第6,358,684号、第5,863,727号、第6,372,445号和第5,656,554号中揭示的任何染料化合物)。
B.反应基团
本发明也涵盖那些并非起必不可少的作用的其它物质的连结，如熟习此项技术者所理解，标记物就是此类物质，但却可以用于本发明。此类物质包括固态或半固态基质如聚合物粒子(特别是直径小于约16微米的聚苯乙烯微球体)、磁性粒子、聚合物膜和玻璃。当进行一其中对磷酸根结合化合物进行固定的分析(例如为了达到分离目的)时，或当直接对一固定的磷酸化靶分子进行进一步的分析时，这些物质特别有用，如本发明所述。
另外，任何生物组份可通过反应基团共价连结到磷酸根结合化合物上；这些组份包括但不限于，蛋白质、肽、糖类和多糖类、核酸(包括核苷酸和核苷)、氨基酸、细胞器、细胞和细胞提取组份。
因此，本发明中的磷酸根结合化合物亦可包含反应基团例如胺反应基团，其用于将磷酸根结合化合物共价连结到基质、微粒、磷酸化靶分子上或直接结合到一生物组份上。因此，当形成包含磷酸根结合化合物、金属离子和磷酸化靶分子的三元络合物时，该等反应基团可与磷酸化靶分子形成一额外的共价键。这将有效提高络合物的稳定性并可对磷酸化靶分子进行更严格的分离和分析，包括在超过温和酸性pH范围的情况下也能保持络合物的完整性。
磷酸根结合化合物与分子的共价连结通常是亲电子基团与亲核基团两者间化学反应的结果。但是，当使用光活化反应基团时，此共价连结可在结合液受到光照时发生。这对于保证只有磷酸化靶分子与本发明的结合化合物形成共价连结尤其有利。
熟习此项技术者已熟知用于将其它分子与本发明之磷酸根结合化合物共价连结在一起的大量亲电子和亲核反应基团。这些其它分子包括但不限于标记物、生物组份(蛋白质、核酸)、微粒、塑料如微孔板孔、聚合物如PVDF、硝酸纤维素、多聚糖尤其是琼脂糖、葡聚糖和纤维素，包括美国专利第5,453,517号揭示的任何化合物。
2.连接体
如上所述，本发明的化学部分A是磷酸根结合化合物的一部分，其中它们或者通过一连接体共价连结到金属螯合部分上以形成本发明的化合物，或者标记物与金属螯合部分共用一芳香环，例如苯并呋喃和BAPTA。因此，当化学部分与金属螯合部分共用一芳香环时不存在连接体，式(A)m(L)n(B)中的n为0。一较佳实施例是其中不存在连接体的标记化合物；但连接体作为共价单键亦较佳。
当存在连接体时，连接体通常包含有1到30个选自由C、N、O、S和P组成之群的非氢原子。连接体通常为取代烷基或取代环烷基。作为选择，荧光团可直接与金属螯合部分连结(此处连接体为单键)，或烷基连接体可含有苯环或经苯环技术中所熟知的取代基取代的苯环。当连接体不是共价单键时，连接体可以是稳定化学键的任意组合，视需要可包括单键、双键、三键或芳香碳-碳键及碳-氮键、氮-氮键、碳-氧键、硫-硫键、碳-硫键、磷-氧键、磷-氮键和氮-铂键。较佳地，连接体含有少于20个非氢原子，且由醚、硫醚、硫脲、胺、酯、甲酰胺、磺酰胺、酰肼键和芳香或杂环芳香键的任意组合构成。连接体通常为碳-碳单键和甲酰胺、磺酰胺、醚或硫醚键的一组合。连接体键通常产生下列可存在于连接体中的部分：醚、硫醚、甲酰胺、硫脲、磺酰胺、尿素、胺基甲酸酯、肼、烷基、芳基、杂芳基、烷氧基、环烷基和胺部分。所选标记化合物的实例可结合下列三种(I、II和III)通式的连接体：
式(I)-(CH2)eC(X)NH(CH2)e(NHC(X)(CH2)e)d-，及
式(II)-((C6R″4)O)d(CH2)e(C(X)NH(CH2)e)g(NH)dC(X)NH(C6R″4)(CH2)e-，及
式(III)-(NHC(X)(NH)d(CH2)e(NH)dC(X)(NH)d(CH2)e(NHC(X)(CH2)e)d)-，其中X是O或S，d为0到1，e为0到6，g为1到4，R”各自为H、卤素、烷氧基或烷基。应理解，在一个连接体内X、d、e和g皆可独立选择。
如此，本发明的一选定实施例是具有下式(VII、VIII、IX、X和XI)的磷酸根结合化合物：
式(VII)(A)(B)，没有连接体；
式(VIII)(A)-(n)(B)，连接体为共价单键；
式(IX)(A)-[(CH2)eC(X)NH(CH2)e(NHC(X)(CH2)e)d]-(B)；
式                                                                 (X)
(A)-[(C6R″4)O]d(CH2)e(C(X}NH(CH2)e)g(NH)dC(X)NH(C6R″4)(CH2)e)-(B)及式(XI)(A)-[NHC(X)(NH)d(CH2)e(NH)dC(X)(NH)d(CH2)e(NHC(X)(CH2)e)d]-(B)，其中A为一化学部分，B为一金属螯合部分。
任何连接体的组合都可用来将化学部分和金属螯合部分连结在一起。另外，一种金属螯合部分可具有一个以上的连接体用于连结另一标记物(例如能量转移对)或一种附加物质例如琼脂糖、一种微粒或一种将此连接体和此附加物质或磷酸化靶分子连结在一起的反应基团。一较佳实施例包括一金属螯合部分，其通过或不通过连接体连接到一标记物上，且亦连接到一附加物质上。连接体也可经取代以改变标记化合物的物理性质，例如金属螯合部分的结合亲合力及染料的光谱特性，或以胺基或硫醇反应基团取代。
连接体的另一重要特征是在化学部分A和螯合部分B之间提供足够的空间，以防止化学部分对金属离子至金属螯合部分结合区的结合及对金属离子至磷酸化靶分子的结合产生空间位阻。应了解，并不是所有的化学部分都会产生空间位阻，作为本发明一较佳实施例就是包含一种不含连接体的染料的金属螯合部分。但是，某些标记物例如生物素通常通过连接体连结到金属螯合部分上。因此，本发明中磷酸根结合化合物的连接体对以下几方面很重要：(1)连结化学部分A到金属螯合部分上；(2)在化学部分和金属螯合部分之间提供足够的距离，以免在空间上阻碍金属螯合部分与靶分子上的磷酸根基团的亲和力；及(3)可通过选择连接体中的原子或者间接通过将取代基加成到连接体上来改变金属螯合部分对磷酸化靶分子的亲和力。
但是，应了解，连接体并不是磷酸根结合化合物中必不可少的组份，某些较佳化合物并不包含连接体。
3.金属螯合部分
金属螯合部分是可同时结合金属离子且对靶分子上暴露的磷酸根基团有亲和力的部分，其中在金属螯合部分、金属离子和磷酸化靶分子之间形成三元络合物。已发现可结合磷酸根基团的金属离子包括三价镓离子、铁离子和铝离子。在一定条件下可结合这些离子的金属螯合部分包括BAPTA、IDA、DTPA和菲咯啉类。因此，金属螯合部分必须1)结合对磷酸根基团具有亲和力的金属离子；2)不影响金属离子对磷酸根基团的结合；及3)维持一稳定的三元络合物。符合这三条标准的金属螯合部分包括BAPTA、IDA、DTPA及菲咯啉类。
本文所用BAPTA指金属螯合部分(1，2-二(2-胺基苯氧基)乙烷-N，N，N′，N′-四乙酸)的类似物，包括其荧光和非荧光衍生物及其盐，其中包括在美国专利第4,603,209号、第4,849,362号、第5,049,673号、第5,453,517号、第5,459,276号、第5,516,911号、第5,501,980号和第5,773,227号中揭示的任何相应化合物。这些以BAPTA为主的金属螯合部分已为熟习此项技术者所熟知，由于其在生理条件下能够结合二价钙离子而主要作为钙指示剂使用，生理条件即指pH大约为7且游离钙浓度接近微摩尔级和亚微摩尔级范围。但是，我们发现，用这些指示剂来实施本发明方法对本发明所述磷酸化靶分子进行检测时，钙是完全无效的金属离子。
为明晰起见，而非意欲作为限制，下面的结构代表本发明的较佳BAPTA金属螯合部分，其具有式IV：
Figure A0381568400351
较佳地，A环和B环的两个氧原子之间通过碳氢桥键连接，其中p为0、1或2，环取代基(R1到R8)各自独立选自由氢、卤素、羟基、烷氧基、脂环、杂脂环、烷基、芳基、胺基、醛、羧基、硝基、氰基、硫醚、亚磺酰基和连接体(L)组成之群。或者，两个相邻的环取代基联合构成一环取代基，其可为环烷基、杂环烷基、芳基、稠环芳基、杂芳基或稠环杂芳基。较佳地，BAPTA金属螯合部分至少有两个取代基不是氢；最佳地，BAPTA金属螯合部分用氟原子作为取代基之一来取代，且最佳在R5或R3位置取代(例如化合物1、化合物2、化合物5、化合物7、化合物8和化合物12)。连接体通常在R3或R6位置将化学部分连结至BAPTA。同样较佳的是包含羰基作为取代基(较佳在R7位置)的BAPTA金属螯合部分，例如化合物9和化合物12。不受特定理论的束缚，看来吸电子基团例如氟或羰基在R3、R4、R6或R7位置经取代后产生特别有利于螯合三价镓离子的BAPTA金属螯合部分，然后螯合的镓离子同时也可与磷酸化靶分子上暴露的磷酸根基团相互作用，形成稳定的三元络合物。
桥取代基R9、R10、R11和R12各独立选自由氢、低烷基组成之群，或相邻取代基R9和R10以联合方式构成5元或6元脂环或杂环。R15、R16、R17和R18各独立为氢或低烷基；较佳地，R15、R16、R17及R18均为氢。R13及R14各独立为氢或一种盐。
应理解，本发明的化学部分通过连接体在任何位置或R1到R12位置连结到BAPTA金属螯合部分上，或当其中没有连接体存在时通过包含该等金属螯合部分中的一个芳香环的染料标记物连接。因此，当R1到R12中两个相邻的取代基彼此联合时可与其所结合的芳香环构成荧光团或发色团标记物。然而，一个磷酸根结合化合物可具有一个以上的连接体，因而可使一染料标记物不以连接体连结，而存在于金属螯合化合物上的其它四个连接体可连结其它标记物或反应基团。在本发明的一方面中，两个相邻的环取代基(R1-R4或R5-R8)以联合方式可形成染料标记物，其为稠环苯并呋喃或x杂芳基-或羧基杂芳基-取代的苯并呋喃荧光团。当染料标记物与本发明的化合物形成稠环时，较佳在R2和R3或R6和R7之间形成稠环。
呫噸衍生物染料是本发明中特别有用的染料，其中BAPTA或经取代的BAPTA金属螯合化合物苯环之一或两者都通过一化学单键(例如在常用的Ca2+指示剂fluo-3、fluo-4和rhod-2中(美国专利第5,049,673号，如上述))或通过苯基或取代苯基间隔区的媒介作用(例如在Oregon GreenBAPTA指示剂中(美国专利第6,162,931号，如上述)而结合到呫噸环上。呫噸环通常是在与BAPTA的氮官能基的对位结合到BAPTA上。尤佳的是含有呫噸且其荧光团为罗丹明或卤代荧光素的BAPTA衍生物。特别佳的是BAPTA螯合剂的5-位被F(包括rhod-5F和fluo-5F)取代后形成的荧光BAPTA衍生物。
本文所用DTPA指二亚乙基三胺五乙酸螯合部分及其衍生物，包括美国专利第4,978,763号和第4,647,447号中揭示的任何相应化合物。DTPA金属螯合部分可用包含(CH2C02R13)zN[(CH2)sN(CH2CO2R13)]T(CH2)sN(CH2CO2R13)z的式V来表示，其中一连接体连结到次甲基碳或氮原子上，Z为1或2，S为1到5，T为0到4，R13独立为氢或一种盐。
本文所用IDA指亚胺基二乙酸化合物及其衍生物，以包含-(L)-N(CH2CO2R13)2的式VI来表示，其中假如所述连接体不是共价单键，则R13独立为氢或一种盐。IDA金属螯合部分必须通过连接体与化学部分连结，其中所述连接体包含至少一个非氢原子。不需受理论的束缚，看来连接体可提高三元络合物的稳定性并可调节金属螯合部分对本发明金属离子的亲和力。
除上述具体金属螯合部分外，我们也发现以菲咯啉为主的螯合剂在温和酸性环境中也可与金属离子和磷酸根靶分子形成三元络合物。本文所用菲咯啉指1，10-菲咯啉化合物及其衍生物，以下列结构式表示：
Figure A0381568400361
任何芳香碳原子均可由熟习此项技术者所熟知的取代基所取代，包括上述美国专利第6,316,267号中揭示的那些取代基。作为选择，连接体可连结到任一芳香碳原子上，以将化学部分A共价连结到菲咯啉部分上，形成本发明的磷酸根结合化合物。
B.磷酸根结合化合物
可在三元络合物形成后提供最佳信号的磷酸根结合化合物的合成策略涉及对化学部分A和金属螯合部分之间的适宜化学连接的选择，也涉及对金属螯合部分上适宜取代基的选择。这些选择应能使所得磷酸根结合化合物对金属离子及金属离子对磷酸化靶分子两者同时保持最佳的结合亲和力，且保持足够的溶解性以促进三元络合物持久存在。不适当的选择所产生的磷酸根结合化合物没有足够的结合亲和力并且不会产生持久存在的三元络合物。不适当的选择也会导致磷酸根结合化合物与除磷酸化靶化合物以外的分析物形成过多的非选择性结合，造成高本底并由此获得低信号噪声比。适用于本发明的化合物最好用实例1D中的方法进行筛选。
我们发现BAPTA衍生物尤其适用于本发明的各个方面。本发明之新颖磷酸根结合化合物的合成和用途在实例中进行了阐述，该等化合物包括带有喹唑啉酮荧光染料的BAPTA螯合部分(化合物6、化合物7和化合物23)；带有硼聚吖吲得辛荧光染料的BAPTA螯合部分(化合物8、化合物24和化合物27a-f)；带有以呫噸为主的染料的BAPTA螯合部分(化合物11、化合物19、化合物26和化合物25)；带有生物素标记物的BAPTA螯合部分，其中生物素通过连接体连结(化合物9、化合物12、化合物15和化合物18)；带有苯并噻唑标记物的金属螯合部分(化合物17)；与琼脂糖共价连结的金属螯合部分(化合物13和化合物14)；包含苯胺(其通过连接体连接到BAPTA化合物上)的BAPTA化合物(化合物10)。新颖化合物还包括通过连接体连结到DTPA螯合部分的硼聚吖吲得辛荧光团标记物(化合物20、化合物21和化合物22)。这些新颖的磷酸根结合化合物可用于检测及分离磷酸化靶分子。这些化合物的合成在实例30到48中举例说明。
本发明的磷酸根结合化合物展示出对镓(III)-磷酸化靶分子络合物的充分的非共价结合亲和力，足以使过量试剂从持久存在的三元络合物中冲洗掉。另外，发现某些磷酸根结合化合物在三元络合物形成后可提供最佳信号，因此对环境更加敏感。该信号的强弱似乎随磷酸根结合化合物-镓(III)-磷酸化靶分子络合物的经适当调节的疏水性而变化。因此，当希望得到可检测响应(例如对溶液中的磷酸化靶分子进行标记)且此可检测响应为荧光响应时，其通常是荧光方面的变化，例如荧光强度、荧光激发或发射波长的分布、荧光寿命、荧光偏振或其组合等方面的变化。在较佳地，当镓离子及磷酸化靶分子结合到螯合剂上时，可检测光响应是一增加了大约2倍的荧光强度的变化。
然而，在其中磷酸化靶分子或磷酸根结合化合物被固定—产生固定的三元结构的实际应用中，因金属螯合部分的螯合及随后三元络合物的形成所引起的可检测荧光响应的增强可能是不必要的。这是由于该三元络合物较稳定，因而允许通过冲洗去掉未结合的磷酸根结合化合物，其中来自磷酸根结合化合物的荧光响应足以用来观察磷酸化靶分子。因此，在这种情况下一较佳实施例是磷酸根结合化合物在结合本发明中的金属离子和磷酸化靶分子时仅发生少许或不发生荧光变化。
金属螯合部分和标记物的组合可产生对环境敏感(即，在同时结合金属离子和磷酸化靶分子形成三元络合物时产生荧光变化)或不敏感(即，荧光信号不发生变化)的磷酸根结合化合物。可产生强烈的可检测信号且有利于形成三元络合物的本发明之最佳荧光染料包括苯并呋喃、喹啉、喹唑酮、呫噸、苯并吡咯及硼聚吖吲得辛化合物，包括其各种衍生物。当染料构成金属螯合部分时，这些荧光染料会产生强烈的可检测信号。本发明的一个重要方面是较佳的荧光染料皆未经磺化。
Figure A0381568400391
Figure A0381568400401
Figure A0381568400411
Figure A0381568400431
Figure A0381568400461
C.结合液
本发明的结合液包含下列组份：
a)一种式为(A)m(L)n(B)的磷酸根结合化合物，其中A为一化学部分，L为一连接体，B为一金属螯合部分，m为一从1到4的整数，n为一从0到4的整数；
b)一种包含金属离子的盐；及，
c)一种酸。
如下所述，结合液可用多种方式制备，此取决于所用方法及含有样品的培养基。具体地说，结合液包含式为(A)m(L)n(B)的磷酸根结合化合物、一种包含金属离子的盐和一种酸于一水性溶液中，其中酸足以将结合液的pH调节在3到6之间；视需要结合液还可包含一种有机溶剂或有机溶剂与额外的离子或非离子组份(例如氯化钠)的混合物。结合液的任一组份可一起加入或分别加入且没有特别的先后次序，如下所述，磷酸根结合化合物可以固定在一固态或半固态基质上，其中基质中添加有金属离子或酸以形成本发明的结合液。因此，磷酸根结合化合物不必游离于结合液中以形成此溶液，而是可以固定在一固态或半固态基质表面。我们发现金属离子和磷酸根结合化合物的浓度需要根据检测或分离方法作相应调节。
可溶性磷酸根结合化合物可通过溶解在一种溶剂(例如水、DMSO、DMF或甲醇)中来制备，通常最终浓度约为0.1μM到10μM；较佳地，磷酸根结合化合物在结合液中的浓度为大约0.5μM到5μM，此浓度大约为1.0μM最佳。但是，当结合液用于沉淀溶液中磷酸化靶分子时，需要结合液中有较高浓度的磷酸根结合化合物—较佳为约0.05mM到1mM较佳。尽管为沉淀目的增加了浓度，但磷酸根结合化合物对金属离子的比率与用于检测目的结合液中的比率相当。
含有金属离子的盐较佳包含三价镓离子，例如从氯化镓中得到的镓离子，但也可以是熟习本技术人员所熟知的任何镓盐。作为选择，铁和铝离子也可用于本发明的结合液中。可用于本发明的镓盐包括但不限于乙酰丙酮化物、砷化物、溴化物、氯化物、氟化物、碘化物、硝酸盐、氮化物、高氯酸盐、硫酸盐和硫化物。存在于结合液中的镓盐浓度通常为约10nM到约1mM；镓盐浓度为约0.5μM到10μM较佳。但是，倘使为了达到沉淀目的，则镓盐浓度较佳略高一些，为约0.1mM到约0.5mM。
在不同的pH值下评价分析磷酸根结合化合物对镓离子及镓离子对磷酸化靶分子之间的稳定性和特异性(实例1)。根据这些结果，可以确定较佳的结合液包含一种可为结合反应提供温和酸性环境的酸。事实上，本发明的一重要且意料不到的方面是金属螯合基团在一温和的酸性环境中结合三价阳离子如镓，因而随着pH水平增加到接近中性pH时可滴定荧光信号。酸性环境被定义为溶液的pH低于6.9。典型的适当酸性组份包括但不限于乙酸、三氯乙酸、三氟乙酸、高氯酸或硫酸。酸性组份的浓度通常为1％到20％，并通过碱缓冲到合适的pH。结合液的pH较佳为约pH 3到6，最佳为约pH 4。当pH为4或接近4时使用乙酸较佳。根据所用化合物的不同，每一种所用化合物的最佳pH可以稍有变化；对化合物2来说，pH 4.0较佳。
结合液的pH视需要可以通过加入除酸性组份之外的缓冲剂来修正。具体而言，我们已证明缓冲剂的存在可出人意料地改良固定在电泳凝胶上的磷酸化靶分子的结合，条件是该配方中还包括一种醇。任何能维持酸环境并且能与样品中磷酸化靶分子相容的缓冲剂均适合加入到结合液中。
可用的缓冲剂包括甲酸盐、乙酸盐、2-(N-吗啉基)乙磺酸、咪唑、N-(2-羟乙基)哌嗪基乙磺酸、三(羟甲基)胺基甲烷乙酸盐或三(羟甲基)胺基甲烷、盐酸，其中这些缓冲剂不螯合镓离子。一种例示性缓冲剂是乙酸钠。缓冲剂在结合液中的浓度通常约为20mM到500mM，较佳约为50mM到200mM。
当结合液含有pH缓冲剂及一盐时，建议向结合液中加入一种水混溶性有机溶剂，通常是一种醇。尽管允许使用高极性的有机溶剂例如甲酰胺，但通常极性有机溶剂是一种含1到6个碳原子的醇，或一种含2到6个碳原子的二元醇或三元醇。一种较佳的醇是1，2-丙二醇。当存在极性有机溶剂时，其在结合液中的浓度通常是5％到50％。当结合经十二烷基磺酸钠(SDS)包被的蛋白质时，存在极性有机溶剂尤其有利，如当结合已通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电印迹的磷酸化蛋白质或肽时通常就是这种情况。在较佳的程序中，通常应在加入结合液之前通过固定和洗涤将SDS从凝胶或印迹上去掉；然而，可能会残留部分SDS，并会干扰本发明的结合方法。不希望受任何理论束缚，看来一种醇的存在可通过去除任何未能通过洗涤和固定样品而去除的SDS来改善磷酸化蛋白质或肽的发光标记物。但是，高浓度醇(例如大于约20％)可以损坏硝酸纤维素膜，因此，在选择溶剂浓度时应注意不要损坏其上固定有磷酸化蛋白质或肽的膜。
D.使用方法
1. 方法
本发明的磷酸根结合化合物可以不受限制地用于分析和监测磷酸化靶分子。以此方式，可以不受限制的分析形式来检测磷酸化靶分子，以提供关于靶分子上磷酸根基团数量方面的信息、对磷酸化作用中涉及的酶进行鉴别、分析这些靶分子在蛋白质组中的作用及——通过进一步分析——确定磷酸根基团在靶分子上的连结位点。在本发明化合物用于选择性检测及/或分离磷酸化靶分子后还可以进行进一步的分析。
本发明方法可以在固定样品上实施，也可在其中固定有磷酸根结合化合物的样品上或样品和标记化合物两者都存于溶液中的情况下实施。结合液与样品的组合方式应能促进磷酸根结合化合物、三价金属离子和样品中的任何磷酸化靶分子之间的接触，其中三元络合物的形成可有效地将化学部分A与存在的磷酸化靶分子结合在一起。当样品固定到固态或半固态载体上时，结合液与样品通常在可最大限度接触的条件下培育，如温和混合或轻摇。
用于检测固定在凝胶上的磷酸化靶分子的本发明方法通常包含以下步骤：
i)将样品固定于凝胶上；
ii)视需要用固定液接触步骤i)的凝胶；iii)用本发明结合液接触步骤ii)的凝胶；
iv)将步骤iii)的凝胶与结合液培育足够时间以使所述化合物与所述磷酸化靶分子结合；
v)观察磷酸根结合化合物，由此检测出所述磷酸化靶分子；及，
vi)视需要将第二种(或第三种)染色剂加到该凝胶上以检测总蛋白或另一类蛋白质例如糖蛋白，或者检测二者。
将样品固定在凝胶上通常包含电泳分离样品。用于将靶分子彼此分离的凝胶不受限制地包括任何为熟习此项技术者所熟知的凝胶，包括以聚合物为主的凝胶例如琼脂糖和聚丙烯酰胺，其中当电流通过时，凝胶和靶分子根据电荷和分子大小来迁移。因此，凝胶(还原型和天然型)也包括单向和双向这两种凝胶及等电聚焦凝胶。采用毛细管电泳时，也可使用凝胶、含有聚合物的溶液或仅使用溶液。
视需要，通过凝胶分离的样品可以使用熟习此项技术者所熟知的技术转移到聚合物膜上，其中该膜接着同本发明的结合液接触以选择性检测出磷酸化靶分子。用于检测固定在膜上的磷酸化靶分子的本发明方法通常包含以下步骤：
i)通过凝胶对样品进行电泳分离；
ii)将已分离的样品转移到一膜上；
iii)视需要用一固定液接触步骤ii)的膜；
iv)用一结合液接触步骤iii)的膜；
v)将步骤iv)的膜和结合液培育足够时间以使化合物与磷酸化靶分子结合；及，
vi)观察该化合物，由此检测出所述磷酸化靶分子；
vii)视需要将第二种(及/或第三种)染色剂加到膜上以检测总蛋白或另一类蛋白质，例如糖蛋白。
通常使用SDS作为一种样品制备组份或电泳缓冲液组份来进行蛋白质凝胶电泳。但是，SDS会干扰本发明的结合液，因此必须在添加结合液之前将其从凝胶或膜上去除。凝胶及膜经固定及洗涤后即可从凝胶或膜上去除大部分或全部SDS。凝胶和膜的较佳固定液包括甲醇和乙酸；视需要固定液还可包含戊二醛。甲醇的浓度大约为35％到50％，乙酸的浓度大约为0到15％，戊二醛的浓度大约为0到2％。通常，固定后用100％水来洗涤凝胶及膜。
然而，为达到本发明的目的，结合液也能用于检测已通过天然或非还原型凝胶分离的磷酸化靶分子。因此，对于使用这些不含SDS的凝胶的方法而言，固定液步骤就不必要了。
当样品已通过凝胶分离或转移到聚合物膜上并视需要经固定和洗涤后，将凝胶或印迹与结合液一起培育(实例2到9)。应将磷酸化蛋白质或肽与结合液培育足够时间，以使磷酸根结合化合物/金属离子络合物结合到所存在的磷酸化蛋白质或肽上。较佳地，这一时间不超过24小时；更佳地，这一时间少于8小时；最佳地，培育时间少于2小时，但不能少于5分钟。当与结合液一起培育后，通常用一混合液来洗涤凝胶或膜，该混合液较佳包含酸性缓冲剂及乙腈；用于本发明中的有用缓冲剂包括但不限于NaOAc、甲酸盐及2-(N-吗啉基)乙磺酸。洗涤液中缓冲剂的浓度通常约为25mM到约100mM。此外，已发现视需要加入洗涤液中的乙腈通常可还原非特异性标记物。较佳地，乙腈浓度从1％到7％，更佳者为3％到4％更佳。一种可供选择的洗涤液由10％到20％的1，2-丙二醇构成。
如此，在磷酸根结合化合物经结合和洗涤后，当磷酸根结合络合物包含如上所述的荧光团或发色团标记物时，可以直接照射三元络合物，以观察磷酸化靶分子。作为选择，可使用针对标记物的抗体来检测印迹上是否存在磷酸化靶分子及其位置，这些抗体例如可为抗BAPTA抗体、抗荧光团抗体、抗半抗原的抗体或亲和素(当标记物是生物素衍生物时)，然后用西方印迹检测蛋白质的标准方法来加以检测，例如通过荧光、化学发光或放射性来显示磷酸化靶分子的标记物。
结合液中的磷酸根结合化合物依据其在不同介质中结合磷酸化靶分子的能力来选择。因此，用于结合凝胶中的磷酸化靶分子的较佳磷酸根结合化合物包括本发明的化合物1到化合物4及化合物7到化合物11。用于结合膜上的磷酸化靶分子的较佳化合物包括本发明的化合物1、化合物4及化合物7。
通过双向凝胶来鉴别磷酸化蛋白质或肽的一个特别优势是其能够准确鉴别磷蛋白质组，并能定量分析蛋白质的翻译后修饰以便增减磷酸根基团。具体而言，标记磷酸化蛋白质或肽的同时或随后进行总蛋白染色可鉴别磷酸化蛋白质组，而信号强度当与总蛋白染色相比较时可与磷酸化水平相关联(见实例6、实例7和实例13)。任何对总蛋白具有特异性的荧光染料都可用于对凝胶中的总蛋白质进行染色；对于凝胶来说较佳的染料是SYPRORuby染料或美国专利第6,316,276 B1号中揭示的任何一种染料。其它的荧光染料例如MDPF和CBQCA也可以用于膜上检测。由于在用本发明的染色混合液染色之前将洗掉SDS，因此，总蛋白染色剂例如SYPRORuby染料较佳，因为SDS对它们的染色作用不是很关键。然而，当使用一种由于染色敏感性而需要SDS的染剂时，例如SYPROOrange染料、SYPRORed染料及SYPROTangerine染料，可通过在总蛋白染色步骤前将SDS加回到凝胶上并在总蛋白染色剂的染色液中添加SDS而改变方案(Malone等人，Electrophoresis(2001)22(5)：919-32)。使SDS返回到凝胶中的较佳混合液为2％的酸/0.0005％的SDS及视需要40％的乙醇，其中凝胶至少培育1小时。作为选择，总蛋白可以在本发明的磷酸化靶分子染色之前进行染色；因此，在这种情况下，就不必将SDS加回到凝胶中，而只需在磷酸化靶分子染色步骤前简单地将SDS去除，如同本发明涵盖的一样。因此，可供选择的用于凝胶的较佳总蛋白染色剂包括但不限于SYPROOrange染料、SYPRORed染料及SYPROTangerine染料或者美国专利第5,616,502号或美国专利第09/632,927中揭示的任何一种染料。可供选择但较不佳的是，用于凝胶的总蛋白染色剂包括考马斯亮蓝或银染色剂，其使用的染色技术已为熟习此项技术者所熟知。用于印迹染色的可供选择的总蛋白染色剂有SYPRORose Plus染料及DyeChromeTM染料或美国专利第6,329,205 B1号及美国专利第10/005,050号中揭示的任何一种染料溶液。
当在双向凝胶内标记磷酸化靶分子时，另一个非常重要的优点是其中包括一糖蛋白染色剂，其中可以完成蛋白质组的三维分析(Steinberg等人，Proteomics1：841-855(2001))。一较佳的糖蛋白染色剂是Pro-QTM Emerald 300染料或Pro-QTMEmerald 488染料、Pro-QTM Fuchsia染料或美国专利第09/970,215号中揭示的任何一种其它染料。另外，如果样品中包含带寡聚组氨酸亲和肽的融合蛋白质时，Pro-QTMSapphire 365或488染料同时可用于检测这些蛋白质或肽。
因此，对蛋白质表达水平和蛋白质的功能特征两者进行平行检测特别有利，例如蛋白质磷酸化可以用本发明在双向凝胶电泳实验中完成。可以用影像分析软件来完成分析，例如Compugen’s Z3程序或Phoretix Progenesis软件。任何两个影像都可重新显示，以通过目测观察影像之间的区别，且定量分析信息可易于以表格形式检索且其中已计算出不同的表达数据。
作为选择，单向聚丙烯酰胺和相应的印迹可以同时或相继用上述染色技术及染料进行总蛋白或糖蛋白染色。用本发明方法对已标记的凝胶或印迹进行复染的一个特别优点是能将非特异性标记和带有少量磷酸根基团的磷酸化靶分子的标记物区别开。这对于准确地鉴别其磷酸化程度已发生较小变化的磷酸化靶分子很重要。
用总蛋白染色剂例如SYPRORuby对印迹或凝胶进行复染可以对本发明染料产生的荧光信号与总蛋白染色剂产生的荧光信号进行参比分析(见图11和实例22)。这种参比分析也允许确定磷酸化靶分子相对于分子总体磷酸化状态的化学计量比以及增减磷酸根基团。
对通过聚丙烯酰胺凝胶分离的磷酸化蛋白质或肽进行染色的另一突出优点是可通过将使用本发明化合物的斑点检测与质谱分析技术联合起来以进一步分析目标蛋白质。例如，因为磷蛋白可在凝胶中共迁移，因此，可能必需或期望进行进一步的分析以便特异性鉴别和分析目标磷蛋白。该进一步分析可以通过测量一系列衍生自蛋白质的肽的质量来进行，即用质谱法(MS)分析肽谱图，或者通过从单独的肽得到氨基酸序列信息，即通过MS/MS或通过Edman降解法进行蛋白质定序。如此，使用本发明组合物及方法鉴别一蛋白质带或斑点后，就可在凝胶上进行操作、漂洗、视需要还原和S-烷基化，然后通过序列特异性蛋白酶例如胰蛋白酶并采用标准程序在凝胶中原位消化，参见Shevchenko等人在Anal.Chem.63：850-58(1996)中的描述。如此产生的肽混合物可从凝胶中提取并使用标准程序进行MS分析。用介质辅助的激光解吸/离子化(MALDI)质谱分析肽谱图通常是最灵敏的。蛋白质的凝胶内消化方法阐述于Jensen等人之PROTEINS：Structure，Function，and Genetics Suppl.2：74-89(1998)中。
本发明亦可设计用于各种各样的微阵列形式中，包括但不限于美国专利申请案第2002/0076727号、美国专利申请案第2002/0106785号、美国专利申请案第2002/0055186号、WO 99/39210、WO 00/63701、WO 02/25288、WO 01/18545、WO 00/04380及美国专利第6,403,368号、第6,475,809号、第6,365,418号、第6,409,921号、第5,595,915号、第6,461,807号、第6,399,299号所揭示的方法和阵列。固定于微阵列(例如经水凝胶包被的载片，包括那些在美国专利第6,372,813号、第6,391,937号、第6,387,631号、第6,413,722号所揭示的微阵列及那些由Perkin Elmer公司制造的微阵列)上的磷酸化靶分子亦可用本发明的方法和组合物来检测(实例18和19)。作为选择，磷酸根结合化合物亦可固定于这些阵列上。
用于检测阵列上的磷酸化靶分子的本发明方法通常包含以下步骤：
i)将所述样品固定在一阵列上；
ii)用结合液接触步骤i)的所述阵列；
iii)将步骤ii)的所述阵列和结合液一起培育足够时间以使所述化合物与所述磷酸化靶分子间接结合；及，
iv)用合适的光源照射所述化合物，由此检出所述磷酸化靶分子。
用熟习此项技术者所熟知的技术将样品固定于阵列上，包括但不限于，使用压电阵列打印机或其它阵列打印技术；固定磷酸化靶分子；结合分子例如抗体；然后加入样品以将磷酸化靶分子非共价结合到阵列上。阵列通常包含共价连结样品的分子或能选择性结合样品的蛋白质，例如胺反应基。
将阵列与结合液培育足够时间以在磷酸根结合化合物、金属离子(通常为镓)及磷酸化靶分子之间形成三元络合物。作为选择，此阵列可包含络合有金属离子(其固定在阵列表面上)的磷酸根结合化合物，其中将样品与阵列一起培育，且当靶分子结合金属离子/磷酸根结合络合物且通常照射时，未结合的样品被洗除，磷酸化靶分子就可被检测出来。以此方式，可使用合适的肽或蛋白质底物进行磷酸酶或激酶的检测分析，产生的磷酸化或去磷酸化肽或蛋白质可点样或合成于阵列上，其中肽上的磷酸根基团结合阵列上的磷酸根结合化合物/金属离子络合物。或者，将激酶及/或磷酸酶底物点样或合成于阵列上，然后将酶(激酶(和ATP)或磷酸酶)添加到阵列上。在去除酶后，阵列和结合液接触。以此方式，可使用阵列来检测及/或分离磷酸化靶分子、鉴别负责向靶分子上添加及/或自靶分子上去除磷酸根基团的酶及其工作效率。
磷酸酶及激酶的肽底物通常用标准程序通过点样或合成固定到阵列上，添加磷酸酶或激酶(其或可构成一未知样品或者是已分离的酶)并随后用本发明的结合液来检测磷酸根基团的存在。如此，本发明的方法和结合液可用于例如含有各种蛋白质激酶的蛋白质底物的阵列上(例如，肌球蛋白轻链、MARCKS、髓鞘碱性蛋白、酪蛋白、受src抑制的C激酶底物、胰岛素受体底物1、核因子90、Rap1、转录因子stat5a)。将包含磷酸酶或激酶的样品与包含酶底物的阵列一起培育；在适宜条件下培育并加入适宜的酶反应添加剂后，可用本发明的结合液来检测磷酸化产物。例如，当可检测标记物是一荧光团时，荧光信号的坐标可提供流体中存在激酶的数量及其针对阵列上各种酶底物(蛋白质或肽)的活性的读数。用阵列检测磷酸化靶分子可提供多种可能性，上文所述并非意欲限制本发明与阵列技术联合应用的方式。
本发明的激酶和磷酸酶分析也可用来筛选例如酪氨酸激酶的激活剂和抑制剂，另外，还可用来监测及纯化磷酸酶和激酶。而且，对阵列上酶底物的检测使得本发明的方法比任何已知基于溶液的激酶和磷酸酶分析方法都要敏感得多，且使用荧光或化学发光进行阵列上检测比放射化学检测允许更高的标记密度。
如上所述，激酶底物可共价或非共价连结于一表面、固态或半固态基质(包括微孔板)、聚合物珠粒或阵列(例如水凝胶阵列载片)上，且其分析允许以不连续的异相方式进行。激酶底物包含一个激酶合意的磷酸化位点，以肽或不规聚合物为佳(聚(谷氨酸:酪氨酸)、聚(谷氨酸:丙氨酸:酪氨酸))。激酶底物视需要可包含荧光团。一可能含有激酶的样品和ATP一起与激酶底物结合，其中活性激酶就能将磷酸根加成到激酶底物上。去除激酶溶液并充分洗涤后，就可测量出加成的磷酸根基团，其中如上所述结合液被加到激酶底物上。磷酸根结合化合物通常包含荧光团，激酶活性通过照射荧光团来测量。或者，磷酸根结合化合物包含一种酶，如过氧化物酶，其中激酶活性在加入适宜酶底物并用荧光计或用来测定颜色或化学发光的仪器进行检测后就可测量出来。另外，在分析中使用选定激酶或磷酸酶的抑制剂(例如使用原钒酸钠)可以增强激酶的特异性。而且，本发明的分析方法可用于筛选激酶及/或磷酸酶的激活剂或抑制剂。作为选择，此分析方法还可很容易地应用于测量磷酸酶的活性，其中磷酸酶底物、磷酸化肽或蛋白质将结合到固态或半固态基质例如微孔板、聚合物粒子或水凝胶上。
通过采用基于FRET的分析方法，本发明的材料和方法也可用于检测及/或定量分析激酶或磷酸酶。例如，用荧光团标记的肽能与磷酸根结合化合物/金属离子(通常为镓)与藻红素产生的络合物结合。当肽被磷酸化时，肽结合藻红素，分析过程中发射光产生最大频移。例如，通过在肽上采用以铕为主的螯合剂及磷酸根结合化合物/金属离子与别藻蓝蛋白产生的络合物，可达成时间解析荧光分析。在这一实例中，给体荧光团可在335纳米处被激发，发射光从620纳米频移到665纳米，显示肽与金属螯合剂及镓络合物间的互相作用。
因此，在本发明的一个方面，众多酶(包括固氮酶、磷酸核糖基-焦磷酸盐合成酶、焦磷酸十一碳二烯酯合成酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶、法尼基转移酶、三磷酸核苷焦磷酸脱水酶、焦磷酸盐6-磷酸果糖1-磷酸转移酶(PFPPT)、硫酸腺苷转移酶、UTP-葡萄糖-1-磷酸尿苷转移酶(UGPP)、天冬酰胺合成酶和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶)皆涉及无机焦磷酸盐的代谢，因此是本发明的定量分析方法的潜在目标。
另外，本发明的方法及材料也可用于研究涉及配体覆盖方法学的功能蛋白质组学。例如，阵列化蛋白质在与磷脂酰肌醇4，5-二磷酸(PIP2)胶粒一起培育后接着与结合液一起培育即可被检测出来。标记物的差异将会突出重要的磷脂酰肌醇苷结合蛋白质类别。蛋白质例如SWI/SNF类BAF、一种染色质重构建络合物及cofilin/ADF、一种普遍存在的肌动蛋白结合蛋白质亦可能用本发明的方法来鉴别(Rando等人，ProcNatl Acad Sci USA 99(5)：2824-9(2002)；Ojala等人，Biochemistry 40(51)：15562-9(2001))。另一配体覆盖分析的实例是GTP结合蛋白质，其中少量的GTP结合蛋白质可用高分辨率的双向凝胶电泳分离，并随后在复性条件下转移到硝酸纤维素或PVDF膜上用GTP来探测。于是结合的GTP随后将与本发明的结合液结合，因而可鉴别GTP结合蛋白质。使用本发明的结合液可进行各种其它的膜覆盖核苷结合分析，其中任何配体及结合蛋白质(其中至少该对中的一个含有磷酸根基团)皆存在可用于鉴别新颖结合蛋白质的潜在可能性(Gromov等人，Electrophoresis(1994)3-4：478-81)。
与将磷酸化靶分子或磷酸根结合化合物固定相比，本发明的组合物和方法也可用于结合、检测及分离那些游离存在于溶液中的磷酸化靶分子。将一可能含有磷酸化靶分子的样品与包含经荧光染料标记的磷酸根结合化合物的结合液一起培育，其中磷酸化靶分子通过荧光偏振来检测(实例14)))。荧光偏振基于发现了荧光团发出的光可以通过转动散射而去偏振或基于分子在溶液中的碰撞速率，参见J.Phys.Rad.1：390-401(1926)。因此，当检测溶液中的磷酸化靶分子时，本发明的化合物及方法涵盖利用荧光偏振，如美国专利第6,207,397号所述。当经荧光染料标记的磷酸根结合化合物的分子量由于结合磷酸化靶分子而发生变化时，例如磷蛋白，可根据是否观察到偏振发生变化来检测磷酸化靶分子，如图10所示。
出人意料地，当将较高浓度的疏水性较强的磷酸根结合化合物(例如化合物5)用于含有基本上等摩尔浓度的金属离子的温和酸性环境中时，磷酸化靶分子(通常是肽)亦可利用三元络合物不溶特性而从络合物溶液中分离出来。
用于将磷酸化靶分子自溶液中分离出来的本发明方法包含以下步骤：
i)用本发明的结合液接触样品；
ii)将步骤i)的样品与结合液一起培育足够时间以使所述化合物与磷酸化靶分子结合形成三元络合物；及，
iii)从所述样品中分离所述络合物，由此分离出所述磷酸化靶分子。
当本发明的疏水性磷酸根结合化合物在结合液中的浓度较检测用结合液高出一百倍时，形成的三元络合物通常为不溶团聚物。某些疏水性磷酸根结合化合物的这一特性可用于开发分离磷酸肽的方法。因此，当以一种可促进三元络合物形成的方式将一包含某些疏水性磷酸根结合化合物的结合液与样品一起培育时，该络合物可通过离心从溶液中沉淀出来(实例13)。因此，以涡旋方式或以熟习此项技术者所熟知的方式混合该结合混合物及样品溶液通常可同时促进结合(形成团聚物)和防止三元络合物沉淀。当络合物形成后，对溶液进行适当处理以分离沉淀络合物，其中较佳的方法是离心。所得沉淀物中包含磷酸化靶分子，可用诸如MS等方法进一步分析。这种方法利用了络合物溶液中磷酸肽或磷蛋白的亲和力“下降”(例如细胞提取物蛋白质消化)，由此，在一酸性pH下磷酸根结合化合物可络合金属(通常为镓)离子及磷酸肽或磷蛋白以形成沉淀。另外，对于从溶液中沉淀磷酸化靶分子的方法来说，亦可使用铝离子和包含铁离子的氯化铁来形成三元络合物。
本发明亦涵盖在形成团聚物后对磷酸化靶分子的进一步分离，其中磷酸根结合化合物自磷酸化靶化合物中去除，因而溶液中不含磷酸根结合化合物。此当磷酸根结合化合物视需要包含一标记物例如半抗原时亦可实施，其中标记物起把柄的作用，通过其可将磷酸根结合化合物从磷酸化靶分子中拉出来。较佳标记物是生物素，其中含有生物素-结合蛋白的基质可用作从磷酸化靶分子中分离磷酸根结合化合物的介质。具体而言，将所得沉淀物重悬于溶剂中以使金属离子、磷酸根结合化合物及磷酸化靶分子络合物解离，例如在一碱性溶液中(大约pH 7到10)或通过使用螯合剂例如EDTA或EGTA。然后将溶液加入到基质中，例如含结合有生物素-结合蛋白的琼脂糖凝胶(Sepharose)珠粒的管柱，其中含有生物素的磷酸根结合化合物结合到该等珠粒上，磷酸化靶分子流过管柱。得到的洗脱物含有磷酸化靶分子而没有磷酸根结合化合物，这对于某些应用来说也许是期望的。或者，将磷酸根结合化合物、金属离子及磷酸化靶分子的解离混合物与含有生物素-结合蛋白的浆状珠粒一起培育，其中珠粒通过重力去除，例如通过大小排除或离心，可得到不含磷酸根结合化合物的磷酸化靶分子溶液。用于形成可沉淀三元络合物的较佳化合物包括化合物2、化合物5、化合物9、化合物12、化合物20、化合物21及化合物22。
在某些情况下，磷酸根结合化合物不需要亲和纯化即可与磷酸化靶分子上去除。以此方式，三元络合物团聚物与有机提取缓冲液接触(实例27)。将沉淀物与有机溶剂例如乙腈、氯仿及水混合可使磷酸化肽进入水相，而磷酸根结合化合物溶于有机相中。
已分离的磷酸化靶分子可通过多种方法来分析，包括但不限于，凝胶电泳、MALDI-TOF MS、或LC-MS/MS。另外，如下所述，磷酸肽可通过β-消去作用得到，并随后加入亲核剂以帮助鉴别磷酸化位点。
除了从溶液中的复合样品中分离磷酸化靶分子外，本发明也涵盖通过用固定的磷酸根结合化合物捕获磷酸化靶分子来分离靶分子(实例15、实例25及实例26)。这可以用多种方式进行，例示性方法包括例如使用亲和管柱、铁磁流体珠粒及膜；但是，所阐述的这些方法并非意欲限制该方法。
通过用固定磷酸根结合化合物来磷酸化靶分子自溶液中分离出来的本发明方法通常包含以下步骤：
i)将一种包含金属离子的盐添加于包含固定磷酸根结合化合物的基质中，其中金属螯合物部分包含式IV；
ii)用温和酸性结合缓冲液平衡此基质；
iii)将样品加入基质中，其中磷酸化靶分子结合到步骤ii)的基质上；及
iv)从基质中洗脱磷酸化靶分子，由此分离所述磷酸化靶分子。
基质可以是熟习此项技术者所知的任何基质，包括聚合物膜、聚合物粒子例如琼脂糖、乳胶、磁性珠粒或琼脂糖珠粒、及玻璃例如载片、珠粒或光纤。这些珠粒可以浆液形式存在或作为填充管柱，当样品通过此管柱时膜将会捕获磷酸化靶分子。此类管柱的一个实例是包含结合到琼脂糖上的磷酸根结合化合物的亲和基质(例如，化合物13和化合物14)或树脂(固定亲和管柱(IMAC))。可用于此方法的其它化合物还包括化合物15、化合物20、化合物21及化合物22。
与沉淀法(其中亲和管柱或有机提取缓冲液可用于从已分离的磷酸化靶分子中去除磷酸根结合化合物)不同，该方法中的基质视需要可只包含磷酸根结合化合物的金属螯合部分组份，其于金属盐加入后可随后结合金属离子(镓较佳)。但是，用式(A)m(L)n(B)表示的磷酸根结合化合物会形成基质，其中A是用于通过L将B连结到基质材料上的反应基。因此，应在加入样品之前将金属离子添加于基质中。然后用温和的酸性结合缓冲液来平衡基质；作为选择，金属离子和酸性结合缓冲液可存在于同一溶液中。酸性结合缓冲液通常与结合液使用相同的组份。然后将酸性结合缓冲液中的样品加入到混合液中，此时磷酸化靶分子将结合络合于金属螯合部分上的金属离子。磷酸化靶分子的分离通过加入一溶液来完成，该溶液可解离磷酸根结合化合物(金属螯合部分)、金属离子及磷酸化靶分子所形成的三元络合物。较佳地，洗脱液包含一碱及一碱性pH缓冲剂。可用的碱包括但不限于氢氧化钡、氢氧化钠及氢氧化铵。作为选择，碱性氨水溶液也用作洗脱剂。任何一种可与样品及金属离子磷酸化靶分子络合物相容并能解离该络合物的碱皆较佳。另外，有机溶剂例如乙腈可用于从磷酸根结合化合物基质中洗脱磷酸化靶分子，而且可能是一较佳的溶剂，这要根据随后对磷酸化靶分子进行的分析方法而定，例如用MS。
由于许多磷酸化靶分子通常仅以低丰度存在，因此，本发明分离方法对纯化和富集此等磷酸化靶分子而言特别有用。这些方法可用于从肽的粗品混合物中纯化磷酸化肽，这对随后通过MALDI、MS或奈电喷雾串联质谱分析(MS/MS)来分析肽所用的方法而言非常有利。本发明涵盖可使用各种各样的方法来制备通过亲和基质纯化及/或富集的样品或从复合溶液中分离的样品。例如，干燥的已分离磷酸肽可重新悬浮于水中以进行LC-MS分析。
本发明中的IMAC法也易于适应微流体应用，例如由Gyros AB(Uppsula，瑞典)开发的CD技术，其中可对样品进行高通量筛选以进行蛋白质组学分析，例如用MALDI-TOF获得肽谱图。简单地说，Gyros AB技术包含一带有数百个微结构(管柱)的CD微试验室，其中样品以离心速度通过管柱且洗脱样品在CD上分析，使得从蛋白消化到MS分析的整个过程都在CD上进行。管柱中可充填有包含BAPTA化合物(化合物13或化合物14)的微粒；然后样品可流过管柱，并通过荧光或化学光信号来分析磷酸化肽的浓度或施加于CD上的基质上进行MALDI-TOF分析。因此，本发明方法适用于可对样品进行高通量筛选的微流体应用，这有利于蛋白质组学研究。
因此，本发明提供了可与基于质谱分析的方法一同使用的分析试剂和方法，以便对混合物中的磷蛋白或磷酸肽进行快速及定量分析。该等试剂和方法可用于检测和鉴别蛋白质样品混合物中的蛋白质，其中以此方法分离出肽可表征混合物中存在蛋白质。分离出的肽或蛋白质可通过质谱(MS)技术及通过应用序列数据库搜索技术(用于鉴别产生已测序肽的蛋白质)来定性。
下列引文是质谱技术用于鉴别蛋白质的实例，可与本发明的材料及方法一起应用：Ideker等人，Science 292：929-934(2001)；Gygi及Aebersold，Curr.Opin.Biotechnol.11：396-401(2000)；Goodlett等人，Anal.Chem.72：1112-8(2000)；Goodlett等人.，Rapid.Commun.Mass.Spectrom.14：344-8(2000)；McLachlin及Chalt，Current Opin.Chem.Biol.5：591-602(2001)；Aebersold及Goodlett，Chem.Rev.101：269-295(2001)；Vener等人，J.Biol.Chem.276：6959-66(2001)；Zhou等人，Nature Biotechnol.19：375-8(2001)。熟习此项技术者将认识到，这些目前可用的质谱方法与本发明的原料及方法相容。然而，本发明亦涵盖，本发明的材料及方法可与将来可用且能够获得相同或相似结果的质谱分析技术一起应用。另外，本发明涵盖，在检测之前可使磷酸肽通过反相、正相或离子交换管柱，以从磷酸肽样品中去除不期望的材料。
本发明亦涵盖替代的检测、纯化及/或富集的方法。例如，本发明的材料及方法可与Luminex技术一起应用，此Luminex技术涉及用两种荧光团来标记乳胶微珠(美国专利第5,981,180号和美国专利第6,268,222号)。使用两种荧光团的精确比率可以根据两种染料比率产生的色码来制造多组不同的珠粒，每一组都独一无二且可用激光束区分开。本发明的金属螯合剂，即磷酸根结合化合物及金属离子络合物或可结合经生物素标记的磷酸根结合化合物的生物素结合蛋白质，可用于代替针对联结到特定组珠粒上的特定分子的捕获抗体。然而，可使用结合样品的抗体，且磷酸化靶分子可用本发明的结合液检测。例如，当分析物与珠粒上的金属-螯合剂络合物结合后，一联结到藻红素上的探测抗体可用作报道分子。最后结果是在经颜色标记的微珠上进行抗体/金属螯合剂夹层分析。当珠粒和报道分子通过一流动单元时，可以通过使用双激光系统的Luminex 100仪器来读取其读数。一束激光用于检测珠粒，另一束激光用于检测报道信号。因此，本发明涵盖，金属螯合络合物可用以代替探测抗体与珠粒检测一起用于磷酸化靶分子的分离及检测。
或者，用于自动化珠粒及微粒捕获系统的磁性珠粒分离(例如，通过Dexter磁性技术或捕获铁磁流体(Molecular Probes公司)的LifeSep磁性珠粒)也可使用本发明的材料和方法(美国专利第6,413,420号、美国专利申请案第08/868,598号、美国专利申请第20020117451号、美国专利第4,339,337号及美国专利第5,834,121号)或铁磁流体珠粒(实例27)。磁性分离通过连结到微小磁性珠粒上的特定亲和涂层(例如磷酸根结合化合物)来运作。珠粒与含有磷酸化靶分子的样品混合，以便磷酸化靶分子有机会牢固地与珠粒上的金属离子/磷酸根结合化合物相结合。当其连结后，珠粒与三元络合物就可通过强磁场分离。根据所用方法的不同，可以使磷酸化靶分子仍然与珠粒相结合或通过在合适溶剂或碱性缓冲液中冲洗而将其释放。因此，可进行有效和快速的分离。因此，本发明涵盖，磷酸根结合化合物/金属离子络合物可与众所周知的磁性珠粒分离法一起应用。
因此，本发明提供了各种各样的材料及方法用于分离、提纯及富集磷酸化靶分子，包括一种固定亲和基质的新颖用途。
本发明提供了可对磷酸化丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸进行示差分离及鉴别的化合物及方法。当缺乏质谱或其它相似技术时，上述用于标记及分离磷酸化靶分子的材料及方法一般可用于检测蛋白质的磷酸化，但不能给出磷酸根在蛋白质或肽上的特定位点的信息。本发明涵盖，可对通过上述固定亲和基质或沉淀方法分离的磷酸化蛋白质或肽进行进一步分析，以便示差鉴别磷酸化肽。分离的磷酸化蛋白质经蛋白水解消化后，接着进行酸水解或碱水解，然后进行分析。
碱(例如氢氧化钡或氢氧化钠)可催化肽的去磷酸化作用，形成活性脱氢丙氨酸衍生物，该等衍生物易受胺或含硫醇化合物的攻击，因而可形成原始磷酸肽的稳定衍生物。这些衍生物更具疏水性，因此更易于通过HPLC、质谱或Edman测序法进行鉴别。在所用条件下，磷酸丝氨酸残基经历消去及加成反应，磷酸苏氨酸残基经历消去反应但未经历加成反应，磷酸酪氨酸残基在处理中无变化。因此，基于此了解可完成示差鉴别。在Edman降解中，在酸或碱传递过程中，磷酸根被β-消去反应消除，得到的脱水氨基酸迅速形成二硫苏糖醇(DTT)加合物，参见Meyer等人在FASEB J.7：776(1993)中的描述。相反，丝氨酸及苏氨酸上的O-Hex-N-Ac在Edman降解中很稳定，参见Gooley及Williams在Nature 358：557(1997)中的描述。因此，本发明可用于区分丝氨酸或苏氨酸之间的磷酸化和糖基化作用。
因此，在β-消去反应和衍生反应之后进行Edman降解是一种有效的丝氨酸和苏氨酸定量分析方法，参见Yan等人在J.Chromatogr.808：23-41(1998)中的描述。这些修饰后的产物亦可耐受酸水解，且可通过反相HPLC分析来进行定量分析，参见例如Meyer等人在J.Chromatogr.397.113(1987)中及Holmes在FEBS Lett.215：21(1987)中的描述。用同样的方法，通过毛细管区带电泳及激光诱导的荧光进行定性亦已用于定量分析肽和蛋白质中的磷酸丝氨酸含量，参见Fadden及Haystead在Anal.Biochem.225：81(1995)中的描述。
使用奈电喷雾MS/MS方法对磷酸肽进行定序可准确确定磷酸化位点，参见Stensballe等人在Proteomics 1：207-222(2001)中的描述。如Shevchenko等人在Anal.Chem.68：850-58(1996)中及Jensen等人在Meth.Mol.Biol.112：513-30(1998)中所述，可在凝胶内进行消化。本发明亦涵盖，本发明的原料和方法可用于将来可用且能够达到相同效果的质谱技术。
将串联质谱分析和计算机辅助的数据库搜索程序联合起来可以进行磷酸肽序列测定及磷酸化位点鉴定，例如一种此联合为SEQUEST(商标，University of Washington，Seattle WA)(McCormack等人，Anal.Chem.69：767-776(1996)；Eng等人，J.Amer.Soc.Mass.Spectrom.5：976-989(1994)；美国专利第5,538,897号)。尽管可使用各种MS方法且其可用于这些方法中，但通常采用MALDI/MS及电喷雾电离MS(ESI/MS)方法。
2. 样品制备
样品被定义为包括任何可能含有磷酸化靶分子的材料、与激酶及磷酸酶相互作用的底物和与激酶及磷酸酶底物相互作用的物质以及任何可结合磷酸化靶分子的物质。样品通常来源于生物，包含组织、单细胞或细胞群、细胞提取物、细胞匀浆、纯化或重建蛋白质、重组蛋白、融合蛋白、体液或其他生物流体、病毒或病毒粒子、朊病毒、亚细胞组份或合成肽或蛋白质。用于制备本发明样品的可能细胞材料来源包括但不限于植物、动物、真菌、细菌、古生菌或源自这些生物的细胞系。样品可以是一种生物流体，例如全血、血浆、血清、鼻粘液、痰液、唾液、尿液、汗液、经皮渗出液、脑脊髓液或诸如此类。或者，样品可以是来自动物的整个器官、组织或细胞。此等样品来源的实例包括肌肉、眼睛、皮肤、生殖腺、淋巴结、心脏、脑、肺脏、肝脏、肾脏、脾脏、实体瘤、巨噬细胞、间皮及诸如此类。
在与本发明的结合液结合之前，样品应通过适当方法处理，以使样品中的磷酸化靶分子或酶底物易于接近磷酸根结合化合物。作为选择，样品可以包含与磷酸化靶分子相互作用的酶或结合蛋白。本发明中使用的样品通常包括组织、细胞、细胞提取物、细胞匀浆、纯化或重建蛋白质、肽、重组蛋白、生物流体、脂类、氨基酸、核酸以及碳水化合物或合成蛋白质。但是，由于存在其它单独生物组份，因此在加入结合液之前可能需要对预期目标(包含暴露磷酸根基团的靶分子)进行纯化或分离。在使用本发明方法的过程中，预期的磷酸化靶分子和其它单独生物组份视需要可以根据迁移率(例如电泳凝胶或毛细管)、根据大小(例如离心、沉淀或密度梯度)或根据结合亲和力(例如对滤膜或亲和树脂的亲和力)彼此分离或与样品中的其他组份分离。例如，当用SDS-聚丙烯酰胺凝胶分离样品时，样品应首先在适当的缓冲液中平衡，如含有Tris、甘油、DTT、SDS及溴酚蓝的SDS-样品缓冲液。对本发明的某些方面来说，在分析前不分离磷酸化靶分子较佳。
若开始时使用不适于分离的样品来源，例如全细胞或组织匀浆，则样品需要首先用熟习此项技术者所熟知的技术进行处理。样品的制备将根据样品中含有磷酸化靶分子情况的不同而不同(参见例如：Current Protocols in Molecular Biology；Herbert，Electrophoresis 20：660-663(1999))。
样品中的磷酸化肽和蛋白质通常具有大于约500道尔顿的分子量。更佳地，磷酸化肽和蛋白质的分子量大于800道尔顿。在本发明的一方面，磷酸化蛋白质构成一具有不同分子量(该等分子量处于一分子量范围内)的磷酸化蛋白质的混合物，其中以这些磷酸化蛋白质作为分子量标准品，以便精确分析经标记的磷酸化蛋白质或肽。包含适用于本发明方法的磷酸化肽的样品可以由天然或合成样品产生，且可以是磷酸化蛋白质样品经化学、物理或酶消化后的结果。蛋白质可以用任何合适的酶促方法消化，如胰蛋白酶消化。在消化中较佳可将肽的大小消化到便于用串联质谱方法来进行肽定序，肽的长度范围通常为大约10到约50个氨基酸。或者，这些肽亦可在本发明方法中作为磷酸酶底物，以鉴别此等酶并测量其数量及/或酶活性。
与含有磷蛋白的样品相比，包含磷脂的样品(其中磷脂为靶分子)因其疏水性而需要在加到固态或半固态基质之前通过修饰作用来制备。大部分样品通常需要在结合到本发明组合物上和实施本发明方法之前进行某种提取处理。当目标磷酸化靶分子来源于组织样品或来源于具有细胞壁的生物体样品时，可能需要进行机械或化学破碎。合适的方法已为熟习此项技术者所熟知，其包括但不限于，使用组织匀浆机或法式细胞破碎机与例如有机溶剂萃取联合。细胞破碎及分级方法阐述于Ausubel等人之CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(John Wiley及Sons 1997)中。样品可使用具有各种疏水性的溶剂萃取，最佳溶剂应根据目标磷酸化靶分子的性质而定。本发明涵盖那些可使样品适合检测的此项技术中常用的萃取方法。
磷酸化靶分子(蛋白质、肽、碳水化合物或脂类)通常存在于一种固态或半固态基质之上或之内。在本发明的一个方面，这种基质包含电泳介质，如聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、线型聚丙烯酰胺溶液、聚乙烯醇凝胶或一种水凝胶。这种固态或半固态基质也可以包含一种膜，如过滤膜、硝酸纤维素膜、聚(偏二氟乙烯)(PVDF)膜或尼龙膜，其中磷酸化靶分子可通过印迹、点布、电印迹(半干印迹转移槽)、毛细管印迹或熟习此项技术者所熟知的其它应用方法固定于此膜上。根据本发明，固态或半固态基质还包括载玻片、塑料基质(例如多孔板或点样针)、玻璃珠粒或聚合物珠粒或光纤或半导体材料。磷酸化靶分子可以按照一规则图案或随机排列于载体上。本发明之一较佳阵列是水凝胶载玻片载体，其中样品中的磷酸化靶分子是按照一规则图案进行排列的。本发明涵盖，磷酸化靶分子可在固定于基质材料上后磷酸化，其中固定一种酶底物，并将合适的酶及磷酸盐与固定的底物一同培育。对本发明的某些方面而言，较佳地，磷酸化靶分子不存在于固态或半固态基质上，即不经固定而是作为溶解分子存在于水性溶液中。
3. 照射
在典型的检测方法中，在样品与本发明的磷酸根结合化合物结合后或结合期间的任何时间均能观察到样品，由此可检测出磷酸化靶分子。观察可包括不同方法，且视共价连结到磷酸根结合化合物的金属螯合部分上的化学部分A而定。当化学部分A是一标记物时，观察通常包含在能激发试剂的光波长下进行照射以产生上文定义的可检测光响应，并通过一能够检测出该光响应的仪器来观察。用于照射本发明的磷酸根结合化合物的设备包括但不限于手持式紫外灯、汞弧灯、氙灯、激光和激光二极管。这些光源视需要可整合于激光扫描仪、荧光小平板读数计、标准或微量荧光计或色谱检测仪中。与标准或预期的响应相比较后所得的结合程度及/或位置可表明该样品是否具有一给定特征即磷酸化靶分子以及所具有的程度。
光响应视情况可通过目测或通过使用CCD照相机、录像机、照相胶片、激光扫描装置、荧光计、光电二极管、量子计数器、落谢荧光显微镜、扫描显微镜、荧光小平板读数计中的任一种装置来检测或者通过放大信号的方法(例如光电倍增管)来检测。
对可检测光响应可进行定量分析且其可用于测量样品混合物中磷酸化靶分子的磷酸化程度。定量分析通常通过将此光响应与一已制备好的标准样品或标定曲线相比较来进行。所测量的光响应通常与电泳凝胶中、水凝胶中或一膜上已知浓度的磷酸化靶分子经标准稀释后得到的光响应进行比较。一般来说，当期望得到精确的测量结果时应绘制一条标准曲线。作为选择，标准曲线可通过用已标准化的参照染料或染色粒子与期望的试剂-靶反应物共轭物相比较而产生。
或者，可使用经染色的电泳凝胶来分析复合样品混合物的组成及测定样品中特定磷酸化靶分子的相对量。这可以通过(例如)结合分子上磷酸根基团与总蛋白染色剂的确定来完成，其中此总蛋白染色剂用于区分蛋白质数量的增加与特定蛋白质或肽上磷酸根基团的增加。
经感应耦合的电浆质谱仪(ICP-MS)对于环境样品、生物样品以及药物样品的痕量元素分析而言是一种有用的技术。最近，用激光烧蚀ICP-MS技术直接测量自β-酪蛋白释放的m/z为31的磷信号的可行性已在电印迹膜上得到证实(Marshall，P.等人，Analyst 127：459-461(2002))。虽然可在印迹上检测出16皮摩尔的五磷酸化蛋白质，但由于本底信号非常高，故这一技术不能在聚丙烯酰胺凝胶中进行。这无疑是由于同质异位物质的存在及产生于聚丙烯酰胺凝胶基质的相邻物质和电泳缓冲液成份的重叠所致。低浓度磷检测对ICP-MS提出若干分析方面的挑战，因为低浓度磷在氩ICP中的离子化很差，而且在质量为31(15N16O及14N16O1H)时存在对多原子物质的直接干扰及在质量为32(16O2及32S)时存在对对多原子物质的间接干扰。ICP-MS可用于检测用本发明方法染色的磷蛋白。检测程序预期包括以下步骤：首先，固定经凝胶电泳分离的蛋白质以去除SDS。一种典型的固定液为40％甲醇/10％乙酸。其次，用本发明方法对凝胶磷蛋白进行染色。接着，洗去凝胶上过多的染色剂。这时较为主要的磷蛋白就可通过荧光成像观察到，而本底染色可通过检查及适当调节洗涤次数而减到最低。然后完全干燥凝胶，并用类似于Marshall等人(2002)所述的方法以激光烧蚀ICP-MS来处理该凝胶。取样可经单点或多点分析、直线扫描或光栅分析完成。倘若采用光栅分析，则可使用如LooRR等人(Anal Chem.73：4063-70(2001))所述获得的数据来构建虚拟凝胶。使用含有钌的SYPRORuby染料染色技术可对来自磷蛋白染色剂的镓(铝或铁)信号及来自总蛋白染色剂的钌信号独立进行定量分析。
因此，本发明涵盖可使用各种各样的仪器来检测磷酸化靶分子，例如，电喷雾离子化(ESI)串联质谱分析(MS/MS)技术。一系列不同的技术，包括自动化高效液相色谱(HPLC)-MS/MS、毛细管-HPLC-MS/MS以及固相提取(SPE)-毛细管区带电泳(CZE)-MS/MS，皆在Figeys等人的文章(Electrophoresis 19：1811-1818(1998))中有描述。
当测量荧光偏振时，有多种自动化测量方式可供选用且其已为熟习此项技术者所熟知。作为一实例，任何一台为偏振试验或测量而配备的标准荧光计皆可用于实施本发明的该实施例，以照射混合物并测量偏振。如上所述，适合于激发荧光团的波长取决于荧光团的特性。通常，人们用截止滤波器来确定波长范围，其通过荧光团的激发及发射波长来决定。例如，对经荧光素标记的肽，人们通常使用485纳米的激发截止过滤器。可使用标准荧光计，或例如使用荧光平板读数计。因而，熟习自动化技术者还可根据本发明的材料和方法使用其它各种仪器来测量荧光偏振。
使用本发明所述的1，2-双(2-胺基-5，6-二氟苯氧基)乙烷基-N，N，N′，N′-四乙酸(TF-BAPTA)或任何含氟的磷酸根结合分子及镓来结合磷酸化靶分子可使用19F-NMR谱检测出来(Doughty DA，Tomutsa L Magn Reson Imaging 1996；14(7-8)：869-73)。此外，放射性镓-67(半衰期：78小时)、镓-68(半衰期：1.13小时)或镓-72(半衰期：14.1小时)均可与本发明的任何磷酸根结合化合物一起使用，以产生可通过放射自显影或闪烁扫描法检测的信号。
如上所述，尽管本发明可使用多种多样的检测方法，但一较佳的方法包括使用荧光。来自同时结合磷酸化靶分子的磷酸根结合化合物金属离子(镓离子较佳)络合物的荧光可用多种成像技术观察到，包括普通光学显微镜和荧光显微镜。
III.本发明的试剂盒
用于标记、分离及鉴别与磷酸化靶分子相互作用的酶的适当试剂盒也构成本发明的一部分。这样的试剂盒可用易于得到的材料及试剂来制备，且可以多种实施例形式出现。试剂盒的组成视分析方案的设计或检测或测量用试剂而定。所有的试剂盒将根据需要包括说明书、适宜试剂和磷酸根结合化合物、分离介质和固相载体。说明书通常包括对试剂浓度或至少一分析方法参数(例如，试剂和样品一起加入的相对量)、试剂/样品混合物的保存时期、温度、缓冲条件及诸如此类的明确描述，以便于使用者可使用上述任一种方法或制剂。
用于结合磷酸化靶分子的试剂盒包含一通常制备于溶液中的结合试剂，其中结合液与上文所描述的相同。视需要，试剂盒可包含下列中的任一种：磷酸化及非磷酸化靶分子的分子量标准品、总蛋白染色剂和糖蛋白染色液。当试剂盒用于检测凝胶中或印迹上的磷酸化蛋白质或肽时，试剂盒中通常含有分子量标准品。或者，当试剂盒用于对溶液中或阵列上的磷酸化靶分子进行染色时，试剂盒中通常不含有分子量标准品。
本发明中的另一种试剂盒可用于鉴别激酶或磷酸酶或测定它们的活性及/或评估抑制剂和激活剂对这些酶的效应。这种试剂盒通常包含固定在基质材料上的适宜底物、结合液和适宜对照。或者，磷酸根结合化合物可固定在基质上而最终使用者将提供底物及酶。这种试剂盒可包含一种含有金属离子盐及酸或合适缓冲液的溶液，当将其加入到固定的磷酸根结合化合物中时会形成本发明的结合液。
本发明的另一种试剂盒可用于从复合样品混合物中分离出磷酸化蛋白质或磷酸化肽，其中三元络合物可从溶液中分离出来。该试剂盒视需要可包含结合液、洗脱缓冲液及视情况一蛋白质或半抗原-结合载体，其中该载体可以是多孔板、琼脂糖树脂、聚合物微珠粒或磁性珠粒并含有一种适合的亲和试剂，例如生物素-或半抗原-结合蛋白、抗体、凝集素、结合蛋白的核酸或其它共价连结到此载体上的生物聚合物。该试剂盒视需要可进一步含有一或多个离心管柱、标准肽混合物及亲核衍生化合物。
本发明的另一种用于从复合样品混合物中分离出磷酸化蛋白质或肽的试剂盒包含通常为管柱形式的基质，该基质含有共价连结于其上的磷酸根结合化合物。除了固定在此基质上的磷酸根结合化合物外，该试剂盒通常还可包含金属盐、洗涤缓冲液、温和酸性结合缓冲液及洗脱缓冲液。此金属盐较佳为氯化镓，此洗脱缓冲液较佳包含氢氧化钡。
熟习此项技术者应了解，根据试剂盒的使用意图及使用者的特殊需要，可按照本发明制备各种各样的其它试剂盒及试剂盒组份。
本文所述的应用仅提供用于阐述本发明的多种潜在用途，而非意欲限制本发明的范围。上文提供了对本发明的详细说明，下面给出的实例旨在阐释本发明，而不应该解释为对本发明或权利要求范围的限制。
                               实例
一般来说，本文所用术语及下述在细胞培养、分子遗传学和蛋白质化学等方面的试验程序在此项技术中均为人们熟知且常用。一般来说，酶促反应和纯化步骤按生产商说明书进行。单位、前缀和符号可以SI接受的形式表示。数字范围包括界定范围的数字在内并包括所界定范围内的每一个整数。
实例1：BAPTA对镓及镓离子对磷酸化靶分子选择性的测定和磷酸根结合化合物的筛选方法
(A)结合有三价镓离子的BAPTA选择性检测磷蛋白
对金属螯合物进行全面搜寻，以鉴别出具有以下特性的荧光试剂：当其与镓盐(氯化镓)结合时能从磷酸化与非磷酸化靶分子混合物中选择性地检测磷酸化靶分子(尤其是磷酸肽和磷蛋白)。用荧光分光光度计测试该些化合物结合镓(III)离子及选择性地检测磷蛋白卵白蛋白的能力。对镓(III)离子的结合是通过同一化合物在75mMNaOAc(pH 4.0)及140mM NaCl溶液中在存在高达5uM氯化镓时的荧光增加来测定。卵白蛋白的检测也是由荧光增加来判定；但该些化合物放置于含有75mM NaOAc(pH4.0)、140mM NaCl、1至4μM卵白蛋白及0.5μM氯化镓的溶液中。磷蛋白检测的选择性由在不含氯化镓的相同溶液的情况下荧光增加实际上消除来评价。
用化合物1对包括铁及镓在内的多种金属离子进行筛选，以确定哪一种离子最适合磷蛋白检测。通过监测75μM NaOAc(pH 4.0)、140mM NaCl、0.5至5μM金属离子、含或不含4μM卵白蛋白或1μM溶菌酶的溶液在530纳米处的荧光增加来对金属离子在对化合物1的结合、磷蛋白检测及总蛋白染色方面进行分析。只有结合到化合物1上的三价阳离子能导致530纳米处荧光增加，只有镓(III)离子当结合了化合物1后能够选择性指示磷蛋白。因此，镓(III)离子是用于磷蛋白检测的最佳金属离子。这一套方法外推用于鉴别其它用不同的染料连接金属螯合部分的化合物。
(B)化合物1对磷酸根化合物的不同结合亲和力
络合有镓(III)离子的化合物1对在75μM NaOAc(pH 4.0)和140mM NaCl溶液中的不同磷酸根底物有不同的亲和力。某些所研究的含有磷酸根的化合物为无机磷酸盐、连接到蛋白质、肽或氨基酸的磷酸盐、焦磷酸盐、ATP及DNA。这些以磷酸根为主的底物对化合物1/镓(III)离子试剂的亲和力测定为：无机磷酸盐及连结至蛋白质、肽或氨基酸的磷酸盐为～50μM，焦磷酸盐和ATP为～200μM，对于DNA未检测到结合。将这些值与化合物1对镓(III)离子的亲和力进行比较，化合物1对镓(III)离子的亲和力为2.5μM。大部分已知磷酸根化合物依其与BAPTA镓(III)离子结合的方式可属于以下这三类中的一种：1)单独的磷酸根基团(即无机磷酸盐或蛋白质上的磷酸盐)，2)多连接磷酸根基团(即焦磷酸盐或ATP)或3)桥联磷酸根基团(即核酸)。
(C)化合物4同时结合镓(III)离子和磷酸根时表现出双发射波长
在75μM NaOAc(pH 4.0)、140mM NaCl溶液中的浓度为0.1到1.0μM的化合物4表现出集中在410纳米(激发光350纳米)的单发射峰。当加入10nM至1mM氯化镓后，410纳米处发射减弱，伴随着490纳米处发射增强，等吸光点为475纳米。该从蓝到绿状态转换的发射半最大反应大约在氯化镓浓度为1.8μM时发生。因此0.1μM化合物4加入1.7μM氯化镓在75μM NaOAC(pH 4.0)、140mM NaCl溶液中同时表现出410纳米和490纳米发射峰。加入磷酸盐能改变两个发射峰之间的平衡，有利于长波长490纳米峰。
(D)筛选同时结合镓及固定的磷酸化靶分子的磷酸根结合化合物
将一组测试蛋白质上样到变性SDS聚丙烯酰胺凝胶上，电泳分离，用45％甲醇、5％乙酸固定凝胶。测试凝胶通常含有500纳克到600纳克以下物质中的每一种：肌球蛋白、β-半乳糖苷酶、磷酸化酶b、卵白蛋白(2磷酸根)、碳酸酐酶、大豆胰蛋白酶抑制剂、溶菌酶、抑肽酶、α2-巨球蛋白、磷酸化酶b、葡萄糖氧化酶、牛血清白蛋白、α1酸糖蛋白、碳酸酐酶、亲和素和溶菌酶。该些凝胶也含有4倍稀释系列的α-酪蛋白(8磷酸根)，加样量为500纳克至2纳克。因此该些凝胶含有一系列具不同物理化学特性的蛋白质，如具疏水结合袋的蛋白质(例如BSA)、糖基化蛋白质(例如α2-巨球蛋白、葡萄糖氧化酶和亲和素)、酸性蛋白质(例如大豆胰蛋白酶抑制剂)、碱性蛋白质(例如溶菌酶和抑肽酶)及两种不同的磷蛋白(卵白蛋白、α-酪蛋白)。由α-酪蛋白的稀释系列可估计磷蛋白染色敏感度。包含不同染料标记物和不同螯合部分的磷酸根结合化合物的最初筛选在pH 3.0至7.0的最少结合缓冲液中进行，该些缓冲液可以含或不含金属离子，且可含各种金属离子。染料和金属离子浓度范围为从0.1至10μM，通常为0.3至3μM，最常用为1.0μM。磷蛋白较佳的染色结合条件通常为：pH为3.0至5.5之间，且有某些三价金属离子存在。在这些条件下，最佳的磷蛋白染色可用特定染料标记物和结合等摩尔浓度Ga3+的BAPTA螯合部分得到。对结果良好的染料的进一步评价显示最佳pH为4.0，加入盐(例如250至750mM NaCl)后将提高染色特异性，这主要是因为降低了非磷酸蛋白染色的强度。用1μM候选染料、含1μM Ga3+的50mM乙酸钠(pH 4.0)、500mM氯化钠对染料进行广泛地筛选。
(E)结合液配方
结合液包含摩尔比为1∶2至2∶1的磷酸根结合化合物与金属离子和大约pH 3.0至6.0的缓冲液。通常，结合液包含pH 3.0至5.5的缓冲液(50至100mM)、盐(例如100至1000mM NaCl或100至300mM MgCl2)及等摩尔浓度的Ga3+与磷酸根结合化合物(例如化合物2)，对于检测而言，Ga3+与磷酸根结合化合物的浓度通常为1至10μM。用于分离目的的金属离子和磷酸根结合化合物的浓度通常至少是以检测为目的的结合液中的浓度的100倍(见实例13)。凝胶染色的最佳结合液按以下方法配制：将500微克化合物2溶解于873微升水中配成1mM的储备溶液。将5克氯化镓溶于28.4毫升水中配成1M溶液，取其1毫升加9毫升水配成0.1M溶液，从0.1M溶液中取10微升加入到990微升水中配成1mM储备溶液。将136克三水乙酸钠溶解于约800毫升水中，加入23.5毫升12M HCl调pH到4.0，定容至1升，这样1升1M乙酸钠、pH4.0储备溶液就制备完成。通过向约800毫升水中溶解233.8 NaCl然后用水定容至1升来制备1升4M氯化钠贮存液。将乙酸钠和氯化钠储备溶液用0.45微米滤膜过滤。为配制100毫升结合液，将5毫升pH 4.0的1M乙酸钠、12.5毫升的4M氯化钠和20毫升的1，2丙二醇与水混合至终体积为100毫升，边搅拌边向其中加入100微升的1mM GaCl3和100微升的1mM化合物2，得到pH 4.0的含有1μM化合物2、1μM Ga3+、20％1，2-丙二醇、500mM NaCl、50mM乙酸钠的最终结合液。
实例2：在SDS-聚丙烯酰胺凝胶中磷蛋白的检测
按标准程序用含4％T、2.6％C且pH 6.8的积层凝胶及含13％T、2.6％C且pH 8.8的分离凝胶进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离磷蛋白。％T是以克/100毫升表示的总单体浓度(丙稀酰胺+交联剂)，％C是交联剂百分数(如N，N’-亚甲基-双-丙稀酰胺、N，N′-二丙烯酰哌嗪或其它合适试剂)。分离胶宽8厘米、高5厘米且厚度为0.75厘米。电泳后，将凝胶浸入含45％甲醇、5％乙酸的100毫升固定液中固定90分钟。用水洗涤凝胶两次共30分钟。然后将凝胶加入本发明的结合液(实例1E)中，通常以50rpm轻轻回旋振荡，室温培育120分钟。结合缓冲液含有50mM NaOAc(pH 4.0)、250mM氯化钠、20％v/v 1，2-丙二醇、1μM氯化镓。为配制结合液，将120微升1mM化合物2储备溶液和120微升1mM氯化镓储备溶液加入到1080微升水中。然后将这一混合物加入到59毫升的结合缓冲液中得到结合液。或者，该磷酸根结合化合物和氯化镓可分别直接加入到60毫升的结合稀释液中。可制备利用本发明其它磷酸根结合化合物的结合液，并可以类似方式就凝胶染色方面进行测试。在结合液中培育后，用75毫升50mM NaOAc(pH 4.0)洗涤凝胶，进行两次洗涤，每次30分钟。
对可在532纳米处激发的化合物2和其它染料，可通过Fajifilm FLA3000激光扫描仪用532纳米激发和580纳米带通发射滤波器获得图像。对在紫外区或在低于532纳米的可见波长下有吸收的荧光磷酸根结合化合物，用300纳米进行激发通过RocheLumi-imager检测，或用473纳米激发和580纳米带通发射通过Fujifilm FLA 3000激光扫描仪检测。数据用图像计量分析(Image Gauge Analysis)软件显示。磷蛋白图像以暗带显示。不含磷酸根的蛋白质不被标记或相对于磷蛋白染色很浅。当凝胶如上标记但结合液中缺少氯化镓时，磷蛋白不能被选择性染色，不能与本底区分或仅有非常浅的非特异性染色。凝胶用50mM NaOAc(pH 4.0)过夜洗涤，按以上方法获得图像。与磷蛋白染色相比本底和非特异性染色进一步减弱。对于所测试的所有指示剂，用其它镓盐代替氯化镓产生类似结果；然而用其它包括Fe3+及Al3+在内的金属代替氯化镓用于磷蛋白染色，结果通常比原来的差。
凝胶可在甲醇/乙酸中过夜固定，或者凝胶能在固定剂中放置数天。可用其它盐代替氯化钠，包括氯化镁、硫酸镁和硫酸铵。氯化钠浓度在100mM至1000mM之间较佳。如果结合液不含盐，则非磷酸蛋白的非特异性染色会增加。用大量约50mM NaOAc(pH 4.0)洗涤会将非特异性染色降到低水平。除了NaOAc外可用其它缓冲液，包括甲酸盐和2-(N-吗啉基)乙磺酸。如果缺少1，2-丙二醇，则凝胶的本底染色将会增加，但磷蛋白仍可被选择性染色。酸性缓冲液的最佳pH范围为3.0至6.0。
实例3：在SDS聚丙烯酰胺凝胶中磷蛋白和总蛋白的系列两色性检测
按实例2方法检测完磷蛋白后，将凝胶用60毫升SYPRORuby蛋白凝胶染色剂(Molecular Probes，Eugene，Oregon)培育过夜，轻轻回旋振荡，通常50rpm。然后将凝胶在7％乙酸、10％甲醇中也以50rpm培育30分钟。通过标准CCD相机成像系统用300纳米UV光激发及600纳米带通滤波器收集磷酸化和非磷酸化蛋白的桔黄色信号。
实例4：在聚丙烯酰胺凝胶中磷酸肽的检测
将胰蛋白酶消化牛奶β-酪蛋白产生的肽用NovexTricine凝胶(16％聚丙烯酰胺，InvitrogenTM life technologies)电泳分离。电泳后将凝胶在100毫升含40％甲醇、10％乙酸的溶液中固定1小时，然后在100毫升含40％甲醇、0.82M NaOAc、0.5％戊二醛的溶液中固定1小时。将凝胶换水洗涤三次，然后在30毫升含有50mM NaOAc(pH4.0)、500mM氯化钠、1μM化合物2、1μM氯化镓的染色液中培育100分钟。然后将凝胶在75分钟内换50mM NaOAc溶液洗涤三次。通过Fujifilm FLA 3000激光扫描仪用532纳米激发及580纳米带通发射滤波器得到图像，用图像计量分析软件显示数据。用胰蛋白酶消化β-酪蛋白产生的两个已知的磷酸肽在凝胶上呈现显著的条带。然后将凝胶用60毫升SYPRORuby蛋白凝胶染色剂通过在染色剂中培育凝胶过夜来染色，然后将凝胶在7％乙酸、10％甲醇中培育30分钟。
实例5：在等电聚焦凝胶中磷蛋白的检测
等电聚焦(IEF)可用多种利用不同的化学原理产生pH梯度的预制凝胶及实验室制备凝胶来进行。在这种情况下，按照制造者的说明书，将两性电介质(Ampholine)PAG板用Multiphor II电泳装置(Amersham-Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)以1500伏-小时进行水平电泳。将凝胶在100毫升45％甲醇、5％乙酸溶液中过夜固定。然后将凝胶用相同体积的水换洗数次，在50毫升含有50mM 2-(N-吗啉基)乙磺酸(pH 3.0)、1000mM NaCl、1μM化合物2及1μM氯化镓的染色液中培育130分钟。凝胶用50毫升50mM 2-(N-吗啉基)乙磺酸(pH 3.0)、1M NaCl洗涤两次，每次洗30分钟，然后置于50mM 2-(N-吗啉基)乙磺酸(pH 3.0)中。按实施例2所述得到图像。
实例6：在双向凝胶中磷蛋白的检测
人MRC-5肺纤维母细胞裂解蛋白质混合物(150微克)在尿素缓冲液(7M尿素、2 M硫脲、2％CHAPS、1％Zwittergent 3-10、0.8％载体两性电解质(3-10)、65mM DTT)中稀释，上样于第一向IPG胶条(3-10非线性，18厘米)。经过过夜再水合后，以矿物油覆盖胶条，在总75000伏电压下聚焦蛋白质。然后将IPG胶条置于1毫米厚、20厘米×20厘米、12.5％T、2.6％C的聚丙烯酰胺凝胶顶部，该凝胶含有375mM Tris碱，pH 8.8；按标准程序进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，不同的是阴极缓冲液含50mMTris、384mM甘氨酸、4％SDS且pH 8.8，而阳极缓冲液含25mM Tris、192mM甘氨酸、2％SDS且pH 8.8。第二向电泳后，将凝胶在750毫升45％甲醇、5％乙酸溶液中固定20小时。将凝胶用水洗涤两次，每次75分钟，然后加入到500毫升染色液中。染色液含有50mM NaOAc(pH 4.0)、250mM氯化钠、20％v/v 1，2-丙二醇、1μM化合物2、1uM氯化镓。将500微升1mM化合物2储备溶液和500微升1mM氯化镓储备溶液加入到9毫升水中。该混合物然后加入到490毫升的染色缓冲液中。凝胶在结合液中培育8小时，将溶液轻轻倒掉，用800毫升50mM NaOAc且pH4.0的溶液换洗凝胶三次，每次洗30至40分钟，然后在1升50mM NaOAc且pH4.0的溶液中洗涤过夜。通过Fujifilm FLA 3000激光扫描仪用532纳米激发光及590纳米带通滤波器获得图像，用图像计量分析软件显示数据。磷蛋白图像显示为黑色斑点。不含磷酸根的蛋白质不被染色或相对于磷蛋白仅有很浅的染色。当凝胶如上染色但染色液中缺少GaCl3时，磷蛋白不能被选择性染色，不能与本底或浅的非特异性染色区分开。另外，磷蛋白染色出现点拖尾，这与同一蛋白质的不同磷酸化程度有关，即蛋白质具有相同的分子量但由于加入或去除一个磷酸根基团而使电荷不同。因此，用本发明的方法进行2-D凝胶分析对鉴定磷蛋白十分有效，可以鉴定单一蛋白质磷酸化程度的变化。
实例7：在2-D凝胶中磷蛋白和总蛋白的系列两色性检测
电泳和磷蛋白的检测同实例6。磷蛋白检测后，将凝胶用500毫升SYPRORuby蛋白凝胶染色剂通过在染色剂中培育凝胶过夜来染色，然后将凝胶在7％乙酸、10％甲醇的溶液中换洗两次，每次洗30分钟。按实例2方法得到图像。或者，通过标准CCD相机成像系统用300纳米UV激发光及600纳米带通滤波器收集磷酸化和非磷酸化蛋白的桔黄色信号。
实例8：电印迹到PVDF或硝酸纤维素膜上的磷蛋白的检测
将目的蛋白质用SDS-聚丙烯酰胺电泳分离，并按标准程序转移到PVDF膜，让膜在空气中晾干。将PVDF膜迅速浸入100％甲醇中，用40％甲醇、5％乙酸的溶液洗涤15分钟，换两次水洗涤，每次15分钟。然后将印迹加入到结合液中，室温轻轻回旋振荡培育80分钟。结合液中含有50mM NaOAc、pH 4.0、500mM氯化钠、1μM化合物1或化合物4和1μM氯化镓。通常将60微升1mM磷酸根结合化合物储备溶液和60微升1mM氯化镓储备溶液加入到540微升水中。该混合物然后加入到29.5毫升的染色缓冲液中。或者，磷酸根结合化合物和氯化镓可分别直接加入到30毫升的染色稀释液中。在染色溶液中培育后，将凝胶用50毫升50mM NaOAc且pH4.0的溶液洗涤，每次洗涤30至50分钟，洗两次。
通过标准CCD相机成像系统(BioRad FluorS Max)用300纳米UV反射光源及465纳米带通发射滤波器得到化合物4的图像。不含磷酸根的蛋白质未被标记，或相对于磷蛋白来说染色非常浅。当印迹如上染色但染色液中缺少GaCl3时，磷蛋白不能被选择性染色，不能与本底或浅的非特异性染色分开。为了得到化合物1的图像，湿斑点面朝下放在配有473纳米激发激光和520纳米带通滤波器的Fujifilm FLA3000激光扫描仪上，数据由图像计量分析软件显示。
实例9：电印迹到PVDF膜上的磷蛋白和总蛋白的两色性检测
PVDF膜上的磷蛋白和总蛋白的系列两色性检测通过以下完成：如实例8(上文)将印迹标记及成像来检测磷蛋白，然后将该印迹用SYPRORuby蛋白印迹染色剂进行后染色来检测总蛋白。将印迹面朝下漂浮在10％甲醇、7％乙酸溶液中15分钟，随后用SYPRORuby染色剂表面染色15分钟。印迹面朝下用水洗涤，10分钟内换三次水。让膜在空气中晾干。通过配300纳米UV反射光源和610纳米长通滤波器的标准CCD相机成像系统(BioRad FluorS Max)得到总蛋白荧光信号。
如实例8通过标准CD相机成像系统(BioRad FluorS Max)用反射300纳米UV光源和465纳米带通滤波器获得图像来完成两色性染色。用化合物4/Ga(III)染色的磷蛋白的信号可以与用SYPRORuby染色的总蛋白的信号区分开，但不能用465纳米带通滤波器检测。
对于化合物1，上述SYPRORuby染色及获取图像揭示总蛋白的荧光信号，当将SYPRORuby图像与上文实例6获得的荧光图像比较时，揭示磷蛋白为子集。
实例10：磷酸酶活性的检测
将磷蛋白和非磷酸化蛋白用市售小牛肠碱性磷酸酶在37℃于标准条件下培育30分钟。同样条件下不加酶作对照消化。合适的测试蛋白质包括牛α-酪蛋白、卵白蛋白、胃蛋白酶等磷蛋白和牛血清白蛋白、鸡卵白溶菌酶和大豆胰蛋白酶抑制剂等非磷酸化蛋白。按实例2方法电泳，用对照(未消化的)和磷酸酶处理的样品成对上样，每泳道1250纳克蛋白。磷蛋白检测按上文实例2进行，标记后90分钟获取图像，再于过夜洗涤后获取图像。另一块凝胶按实例2标记但结合液中没有氯化镓。对于用完整结合液标记的凝胶，同对照组比较，根据软件显示未消化的样品蛋白质显示磷蛋白呈暗带，非磷酸蛋白不被标记或仅有非常微弱的的染色。对于缺少氯化镓的调配物标记的凝胶，磷蛋白与非磷酸蛋白表现同样程度的无标记或仅有极微弱的染色，且这一信号水平与用包含氯化镓的全调配物标记的凝胶中的非磷酸蛋白相同。通过比较全标记凝胶中的成对磷蛋白，显示用碱性磷酸酶处理的样品的信号显著弱于未经消化的对照样品的信号。非磷酸蛋白十分微弱的信号，如果能检测到的话，事实上与对照样品和经过酶处理的样品相同。
检测完磷蛋白后，将凝胶用SYPRORuby蛋白凝胶染色剂按实例2方法染色以染色总蛋白，按实例3和实例7的方法得到SYPRORuby蛋白染色图像。对于两种凝胶，成对的对照样品和经消化处理样品的总蛋白染色信号相似，表明碱性磷酸酶处理过的磷蛋白样品信号的减弱不是由蛋白质降解造成。
实例11：检测激酶活性
按照厂家的说明书，加入100mM三磷酸腺苷(ATP)及所提供的缓冲组份，牛肌球蛋白轻链与市售克隆的钙调素依赖性蛋白激酶II(New England BioLabs)培育。不加酶进行平行对照培育。每种反应混合物的样品加到相邻的泳道，同实例2一样进行电泳分析。凝胶在100毫升45％甲醇、5％乙酸的溶液中固定60分钟，然后换水洗涤数次。一块凝胶置于30毫升含有50mM 2-(N-吗啉基)乙磺酸(pH3.0)、1000mM NaCl、1μM化合物2、1μM氯化稼的结合液中，培育110分钟。另一块凝胶培育在相同但减掉氯化镓的结合液中培育。凝胶用50毫升50mM 2-(N-吗啉基)乙磺酸(pH3.0)、1000mM NaCl溶液洗涤2次，每次洗30分钟，然后置于50mM 2-(N-吗啉基)乙磺酸(pH3.0)的溶液中。磷蛋白检测用的图象按照实例2的方法获得，磷蛋白和总蛋白的系列两色性检测按照实例3的方法进行。
总蛋白染色揭示在两个泳道中都有3个完全相同的主要条带图形。磷蛋白染色揭示两条泳道都有一个主要的条带，来自对应于含酶反应物的泳道的信号的强度是无酶对照的3.4倍。
实例12：TRAIL/Apo2L检测
用涉及2-D凝胶电泳和质谱分析的蛋白质组研究方法测定与TRAIL/Apo2L介导的细胞凋亡有关的细胞信号转导因子。这种方法涉及将用可溶性TRAIL/Apo2L片段(氨基酸114至281)处理几秒钟到几小时不等时间后的结肠癌细胞(Colo205)与不加该片段处理的同样细胞做2-D凝胶电泳进行比较。为了帮助进行2-D凝胶比较，一起使用结合镓离子的化合物7及SYPRORuby总蛋白染色剂。由于细胞信号转导通常涉及蛋白质磷酸化作用，使用化合物7能突出很可能与死亡受体信号转导或者细胞凋亡信号转导有关的斑点。将经过TRAIL/Apo2L处理和不经过TRAIL/Apo2L处理的Colo205细胞间具显著差别的蛋白质斑点随后用质谱分析进行鉴别。
实例13：磷酸肽沉淀
两种非磷酸化肽(血管紧张素I和II)和两种磷酸化肽(pT/pY和Rll)混合物(每种5微升)在含有100mM NaOAc(pH4.0)、0.2mM GaCl3和0.1mM化合物9的终体积为100微升的溶液中结合。混合液在室温下剧烈旋涡振荡1小时，然后用微量离心机全速离心5分钟。移出上清液并保存。沉淀物通过微量吸管的尖头捣散重新悬浮在100微升洗涤缓冲液中(100mM NaOAc，pH4.0，0.2mM GaCl3)。样品再离心5分钟，将上清液洗出组份存起来用于分析。将沉淀物溶解于100微升50％乙腈、0.1％TFA的溶液中，用于进一步的HPLC或者MALDI质谱分析。也可将沉淀物溶于多种不同的理想碱性溶液中。
如果离心之后须除去磷酸根结合化合物，则可以用氯仿提取。同样，沉淀程序中也可使用任何生物素标记的磷酸根结合化合物，如化合物9。用有机或碱处理将沉淀物即磷酸化肽自使用磷酸根结合化合物/镓络合物的分离后，磷酸根结合化合物可以用固定的链霉亲和素载体(例如，链霉亲和素-琼脂糖或链霉亲和素磁珠)除去。
实例14：用化合物2-Ga3+通过荧光偏振检测溶液中的磷酸肽
为了证明化合物2-Ga3+对磷蛋白及磷酸肽的络合作用，对游离染料的荧光偏振进行检查并在存在磷酸化和非磷酸化蛋白质及肽的情况下与络合物(化合物2-Ga3+)进行比较。
首先，用(1)磷蛋白(卵白蛋白)和(2)对照非磷酸化蛋白(溶菌酶)来进行分析。在室温下将改良的含有1.0μM化合物2的结合液在50mM 2-(N-吗啉基)乙磺酸(pH3.0至3.5)、500mM NaCl溶液中培育，同时对另外含有(a)1μM氯化镓、(b)100μM溶菌酶加1μM氯化镓或(c)100μM卵白蛋白加1μM氯化镓的溶液进行培育。通过荧光分光光度计用530纳米激发光及545至700纳米发射光测定所得溶液的荧光偏振。整合的偏振发射光谱产生各向异性“r值”：r＝0.10+/-0.003+/-0.02(化合物2加镓)；r＝0.10+/-0.002(化合物2加溶菌素非磷酸化对照)；r＝0.34+/-0.002(化合物加镓加卵白蛋白)，表明化合物2对该磷蛋白的磷酸化依赖性结合(见图10A)。
其次，用(1)磷酸肽、(2)非磷酸化肽和(3)无肽的对照来进行分析。磷酸化的和非磷酸化的δ睡眠诱导肽DSIP(Typ-Ala-Gly-Gly-Asp-Ala-Ser(PO3)-Gly-Glu)购自SynPep公司(Dublin，CA)，卵白蛋白(Cat.A-7641)和溶菌酶(Cat.A-7651)购自SigmaChemical公司(St.Louis，MO)。为了进行分析，100μM的每种肽和无肽对照溶解于结合液(50mM NaOAc(pH4.0)、500mM NaCl、1.0μM化合物2和1μM GaCl3)中，室温培育30分钟。使用Aminco-Bowman系列-2分光光度计(SpectronicInstruments公司，Rochester，NY)，将激发光波长设定为555±4纳米，发射光波长设定为580±4纳米，测量荧光偏振及各向异性。或者，用Wallac1420 Multilabel Counter(多标记计数器)(PerkinElmer Life Sciences)测定荧光，将激发光波长设定为535±17.5纳米，发射光波长设定为590±17.5纳米。单独的结合液与存在非磷酸化肽的结合液，其荧光偏振和各向异性被证明为非常类似。但是，当存在磷酸肽时，荧光偏振和各向异性值显著增加。这一结果表明，磷酸肽和化合物2-Ga3+络合物在溶液中可以特异性结合，但是非磷酸化肽不行。见图10B。
该分析也提供了一种筛选与三价镓离子和标记磷酸化肽结合的化合物的方法，及基于溶液的激酶分析方法。
实例15：使用一固定在基质上的磷酸根结合化合物对复杂蛋白质消化物的磷酸肽进行分离和定性
向磷酸根结合化合物-琼脂糖管柱(化合物13或化合物14)(通常200微升基质)加入0.1M GaCl3，用去离子水洗涤直到穿过基质的材料的pH值接近7.0。然后用5倍柱体积的结合缓冲液(100mM NaOAc缓冲液(pH3.0))平衡该柱。将磷酸肽混合物在SpeedVac(Savant)或类似装置中真空干燥，然后用结合缓冲液溶解。如果肽混合物的最终pH值不是3.0，那么可以用1至10M乙酸适当调节。施加1倍柱体积或者更少(但不少于柱体积的一半)的蛋白质消化物(1至5毫克/毫升)，接着施加2倍柱体积的结合缓冲液。合并流出(FT)溶出份并保存用于进一步的分析。管柱用2倍柱体积的100mM NaOAc(pH 7.0)、500mM NaCl、10％乙腈溶液冲洗，接着用1倍柱体积的NaOAc(pH 7.0)溶液冲洗。合并FT溶出份并保存用于进一步的分析。所结合的肽用3份等柱体积的饱和Ba(OH)2分别洗脱，收集于一个试管中。最终的洗脱溶出份pH值大于pH 11.0，如果达不到，则立即用饱和Ba(OH)2调节。洗脱溶出份在30℃培育90分钟。培育后，样品分成两等份，其中之一用冰乙酸将pH值中和至pH 5.0-7.0后冻存。另一份加入一半体积的去离子水，接着加入浓缩的亲核性硫醇或胺(甲胺、胱胺或β-半胱胺)，使其终浓度达0.1至0.5M并且体积不超过最初样品/H2O体积的1/6。将反应混合物在30℃另外培育60分钟，然后用冰乙酸中和到pH 5.0至7.0。为了进行MALDI-TOF质谱分析，按照标准方案用C18 Zip Tips(Millipore)将肽从样品中纯化出来，用SpeedVac干燥机将其真空干燥，然后溶解于50％乙腈和0.1％TFA溶液中。在同样溶剂中加入等体积的10毫克/毫升MALDI基质(α-氰基-5-羟基肉桂酸)。将溶液充分混匀，点1微升在MALDI靶上。
两种肽溶出份的示差质量分析可以确定肽上磷酸化位点的数量，以及磷酸氨基酸的种类。在所用条件下，只有磷酸丝氨酸残基经受消去和亲核加成(磷酸损失-98amu，+亲核加成试剂分子量)。磷酸苏氨酸残基只经受消去(仅磷酸损失-98amu)，磷酸酪氨酸保持不变，因为磷酸酪氨酸在强碱中很稳定。
实例16：定量卵白蛋白上的磷酸根数量
将1μM和4μM的卵白蛋白在75mM NaOAc(PH 4.0)、140mM NaCl、0.1μM化合物4和1.7μM GaCl3的溶液中于室温培育5至10分钟。用荧光分光光度计测定最终溶液在410纳米处的荧光强度，与标准磷酸盐标定曲线进行比较以确定卵白蛋白上磷酸根的数量。标准磷酸标定曲线通过以下产生：将已知浓度(1μM、2μM、4μM、6μM、8μM和10μM)的含有磷酸丝氨酸的19个氨基酸的肽在75mM NaOAc(pH4.0)、140mM NaCl、0.1μM化合物4及1.7μM氯化镓的溶液中平衡，测定该溶液在410纳米处的荧光强度。接下来绘制荧光强度对磷酸肽的已知浓度的曲线图。含有卵白蛋白的溶液的荧光强度与标准曲线比较揭示其含有～2μM至～8μM的磷酸根。最后，根据蛋白质的浓度，确定每个卵白蛋白分子中含有两个磷酸根基团。
实例17：磷脂的检测
为了测试本发明对磷脂的检测，将不同的磷脂点样到硝酸纤维素膜上。磷脂来自Echelon Research Labs，以被称为PIP ArrayTM的形式存在，其含有7种不同浓度的8种不同的磷酸肌醇(Ptdlns)。PIP ArrayTM用于imj定本发明检测磷脂的敏感度限度。
                         PIP ArrayTM
1.Ptdlns 100 50 25 12.5 6.3 3.2 1.6皮摩尔
2.Ptdlns(3)P
3.Ptdlns(4)P
4.Ptdlns(5)P
5.Ptdlns(3，5)P2
6.Ptdlns(4，5)P2
7.Ptdlns(3，4)P2
8.Ptdlns(3，4，5)P3
将一份PIP ArrayTM用50mM NaOAc(pH4.0)洗涤15分钟。洗涤后PIP ArrayTM在50mM NaOAc(pH4.0)、20％1，2-丙二醇、500mM NaCl、1μM化合物1及1μM GaCl3中培育1小时，培育时ArrayTM在回旋式振荡器上以100至150RPM振荡。培育后PIP ArrayTM用50mM NaOAc(pH4.0)溶液在回旋式振荡器上以100至150RPM洗涤3次，每次15分钟，以除去未结合染料，减弱本底荧光。用激光扫描仪(Fuji FLA3000)通过473纳米的激发波长和520纳米的发射滤波器形成PIP ArrayTM的图像。在8种磷酸肌醇中，4种给出强阳性信号。这些包括磷脂酸、磷酸肌醇(4、5)P2、磷酸肌醇(3、4)P2和磷酸肌醇(3、4、5)P3。最强信号通过磷酸肌醇(3、4)P2得到，接着是磷酸肌醇(4、5)P2，然后是磷酸肌醇(3、4、5)P3。
实例18：微阵列上磷蛋白检测
将包括β-酪蛋白、卵白蛋白、胃蛋白酶和牛血清白蛋白在内的四种特异性纯化蛋白质从水溶液浓度为0.975微克/毫升至0.5毫克/毫升的源板(384孔板)用BioChip PIPArrayTM(Packard Instrument公司，Meriden，CT)排列到水凝胶(HydroGel)包被的载片(Perkin Elmer)上。BioChip ArrayerTM使用由4个玻璃毛细管组成的PiezoTipTM分样器。将蛋白质从PiezoTipTM中以333皮升体积的小滴分发，产生直径为170微米的阵列点，水平和垂直点距为500微米(点距＝点中心到点中心的间距)。将蛋白质重复排列成四排，十个稀释点，产生一160点阵列。得到的阵列浓度范围是166.5皮克/点至0.325皮克/点。为检测磷蛋白，将载片在1μM化合物2中在旋转器上培育1小时，其缓冲液含有0.5M NaCl、20％1，2-丙二醇、1μM GaCl3和0.05M NaOAc(pH4.0)。然后将载片在0.05M NaOAc(pH4.0)并含10％甲醇的溶液中在旋转器上洗涤1小时，接着用水洗涤15分钟。然后将载片在附加有带载片固定器的转子的微阵列高速离心机(Telechem)中以～6000rpm短暂旋转，以除去多余液体。载片干燥后，将阵列通过ScanArray5000 XL微阵列分析系统(Packard Instrument公司，Meriden，CT)用543.5纳米激光和或者570纳米或者592纳米的发射滤波器成像。每种蛋白质中磷酸根含量确定如下：β-酪蛋白，5个磷酸根；卵白蛋白，2个磷酸根；胃蛋白酶，1个磷酸根；牛血清白蛋白，不含磷酸根。
实例19：在微阵列上磷酸肽的检测
两种肽，Kemptide和pDSIP，从水溶液浓度为0.03125到2毫克/毫升肽的起源板(384孔板)排列到水凝胶包被的载片(Perkin Elmer)上。Kemptide的氨基酸序列是Leu-Arg-Arg-Ala-Ser-Leu-Gly(MW 771.9)。pDSIP的氨基酸序列是Trp-Ala-Gly-Gly-Asp-Ala-Ser(PO3H)-Gly-Glu(MW 929.5)。阵列用安装有4排8点样针(共32个)的手动玻璃载片阵列点样器(V&P Scientific，San Diego，CA)点样，每个点直径～500微米，水平点距1125微米，垂直点距750微米(点距＝点中心到点中心的间距)。手动阵列点样器从起源板取6纳升肽通过直接接触转移～6纳升到阵列表面。得到的肽浓度为0.18至12纳克/点。将肽重复排列6次，产生一84点阵列。对于特异性检测磷酸肽pDSIP，将载片在1μM化合物2染料中在旋转器上培育1小时，其缓冲液含有0.5M NaCl、20％1，2-丙二醇、1μM GaCl3及0.05M NaOAc(PH4.0)。然后将载片在0.05M NaOAc(pH4.0)、10％甲醇溶液中于旋转器上洗涤1小时，接着用水洗涤15分钟。然后将载片在附加有带载片固定器的转子的微阵列高速离心机(Telechem)中以～6000rpm短暂旋转，以除去多余液体。载片干燥后，将阵列用ScanArray5000 XL微阵列分析系统(Packard Instrument公司，Meriden，CT)通过543.5纳米激光和或者570纳米或者592纳米的发射滤波器成像。
实例20：微阵列形式固定的激酶底物的检测；糖原合成酶1-10的选择性检测
将两种特异性肽，Ab1肽和糖原合成酶1-10，从水溶液浓度为0.03到2毫克/毫升的起源板(384孔板)排列到水凝胶包被的载片(Perkin Elmer)上。Ab1肽(New EnglandBiolabs)是Ab1酪氨酸激酶的底物，其氨基酸序列是E-A-I-Y-A-A-P-F-A-K-K-K(MW1336)，糖原合成酶1-10(Calbiochem)是钙-钙调素依赖性蛋白激酶II的底物，其氨基酸序列是P-L-S-R-T-L-S-V-S-S(MW 1045.2)。阵列用安装有4排8点样针(共32个)的手动玻璃载片阵列点样器(V & P Scientific，San Diego，CA)点样，每个点直径～500微米，水平点距1.125微米，垂直点距750微米(点距＝点中心到点中心的间距)。手动阵列点样器从起源板取6纳升肽通过直接接触转移～6纳升到水凝胶包被的阵列表面。得到的肽浓度为0.18到12纳克/点。每个肽重复排列6次，产生一96点阵列(其中有12个点为0纳克/点)。载片于排列后置湿室内过夜。然后将载片在100mM HEPES、1％BSA中封阻1小时，同时振荡(Barnstead/Thermolyne Labquake电烤箱)。封阻后将载片在附加有带载片固定器的转子的小型微阵列高速(最大速度～6000rpm)离心机(Telechem)中短暂旋转，以去掉多余液体。接下来，将Grace Biolabs HybriwellTM杂交密封系统(40×22×0.25毫米)附到水凝胶包被的载片上以密封含有水凝胶聚丙烯酰胺垫的区域，进行激酶反应。反应用供给有酶的缓冲液、CaCl2、钙调素及ATP在80微升反应体积中进行，其含有20,000U/毫升或者1600单位酶(钙调素依赖性蛋白激酶II，NEB)。1×CamKII缓冲液包括50mM Tris-HCl、10mM MgCl2、2mM二硫苏糖醇、0.1mM Na2EDTA，pH 7.5。CaCl2、钙调素和ATP的工作浓度是2mM、1.2μM和0.10mM。带酶的反应液通过封盖上的2个开口中的1个用移液管吸到HybriWellTM中。然后用封胶封口，置于CMT-杂交室内(VWR Scientific)，在37℃培育器内于章动器(Clay Adams)上培育。激酶反应进行3小时。培育后，将载片从杂交室取出，用10％SDS洗涤两次，5分钟，接着用水洗涤5到7次，5分钟，同时振荡。然后将载片立即转移到结合液中45分钟，同时振荡，该结合液在0.05M NaOAc(pH4.0)、500mMNaCl、20％1，2-丙二醇、1μM GaCl3中包含1μM化合物2。载片然后用50mMNaOAc(pH4.0)、10％甲醇溶液洗涤3次，每次15分钟，接着水洗15分钟。然后干燥载片，通过ScanArray5000 XL微阵列分析系统(Packard Instrument公司，Meriden，CT)用543.5纳米激光和或者570纳米或者592纳米发射滤波器成像。钙调素依赖性激酶II特异性地磷酸化糖原合成酶1-10肽。用543.5纳米激发光和570纳米发射滤波器，糖原合成酶肽是阵列上唯一发荧光的标记肽。激酶反应后检测的敏感度至少为0.375纳克或0.35皮摩尔。
实例21：阵列形式的固定化激酶底物的检测；Ab1肽底物的特异性检测
以下试验基本按实施例20所述的方法进行，但有以下差别。两种特异性肽，Ab1肽和Kemptide，从水溶液浓度为0.03到2毫克/毫升的起源板(384孔板)排列到水凝胶包被的载片(Perkin Elmer)上。Kemptide(New England Biolabs)是cAMP依赖性蛋白激酶(PAK)催化亚单位的底物，其氨基酸序列是L-R-R-A-S-L-G(MW 771)。阵列点样同实施例20所述，激酶反应按前述方法进行。反应用供给有酶的缓冲液和ATP在80微升体积中进行，其含有3,750U/毫升或者300单位酶(Ab1蛋白酪氨酸激酶，NEB)。1×Ab1缓冲液包括50mM Tris-HCl、10mM MgCl2、1mM EGTA、2mM二硫苏糖醇、0.01％Brii35，pH 7.5。载片的标记和成像按前述方法进行。用543.5纳米激发光和570纳米发射滤波，Ab1肽底物是唯一在阵列上荧光标记的肽。激酶反应后检测的敏感度至少为0.18纳克或0.14皮摩尔。
实例22：用本发明结合液和总蛋白染色剂SYPRORuby凝胶染色剂对磷酸化靶分子进行参比分析
将系列稀释的磷酸化蛋白和非磷酸蛋白上样到SDS-聚丙烯酰胺凝胶上，凝胶染色如实例2所述方法。对于每种蛋白质浓度和每种染色(磷蛋白和总蛋白)，照射凝胶并进行荧光信号定量(强度)。然后将磷蛋白和总蛋白的荧光强度比率对孔中蛋白上样量(纳克)绘成曲线。接下来将每种染色剂的荧光强度对蛋白质浓度作图，该曲线图可计算两种染色剂中每一种的常量Y-截距值。然后将荧光强度值减去Y-截距值，得到的比率(磷蛋白比总蛋白)再对蛋白浓度作出曲线。在这次得到的曲线生成的数据中，染色的磷蛋白比率值是非磷酸化蛋白的50到100倍，因此非特异性染色和低丰度磷蛋白能与非磷酸化蛋白区别开来。见图10。
实例23：于微阵列上固定化肽磷酸化期间结合ATP-γ-S及随后用本发明的结合液检测硫代磷酸酯
包括Ab1肽、Kemptide和糖原合成酶1-10在内的三种特异性肽从水溶液浓度为0.03微克/毫升到0.5毫克/毫升的源板(384孔板)排列到水凝胶包被的载片(PerkinElmer)上。蛋白质点样用BioChip ArrayTM(Packard Instrument公司，Meriden，CT)，其使用由4个玻璃毛细管组成的PiezoTipTM分样器。蛋白质从PiezoTipTM中以333皮升体积的小滴分发，产生直径为175微米的阵列点，水平和垂直点距500微米(点距＝点中心到点中心的间距)。每种肽自由15个稀释点组成的2倍系列稀释重复排列4次，产生一240点阵列(包括60个水点＝0皮克/点蛋白质)。得到的肽浓度从0.01皮克/点到166.5皮克/点。排成阵列后载片在湿室内过夜。然后，用含有100mM HEPES、1％BSA(pH7.5)的溶液封阻1小时，同时振荡(Barnstead/Thermolyne Labquake电烤箱)。封阻后将载片在附加有带载片固定器的转子的小型微阵列高速(最大速度～6000rpm)离心机(Telechem)中短暂旋转，以去掉多余液体。接着，将Grace BiolabsHybriwellTM杂交密封系统(40×22×0.25毫米)附到水凝胶包被的载片上以封闭含有水凝胶聚丙烯酰胺垫的区域，进行激酶反应。反应用供给有酶的缓冲液在80微升反应体积中进行，其含有3750U/毫升或者300单位酶(Ab1蛋白质酪氨酸激酶，NEB)。1×Ab1缓冲液包括50mM Tris-HCl、10mM MgCl2、1mM EGTA、2mM二硫苏糖醇、0.01％Brij 35，pH 7.5。用ATP-γ-S(Sigma Chemical公司)代替ATP，其工作浓度是0.10mM。同时，在提供有酶的情况下，仅用ATP在第二块载片上进行对照反应，其工作浓度为0.10mM。含酶的反应液通过封盖上的两个开口中的一个用移液管吸到HybriWellTM中。然后用封胶封口，置于CMT-杂交室(VWR Scientific)内，在37℃培育器内于章动器(Clay Adams)上培育。激酶反应进行3小时。培育后，载片从杂交室取出，用10％SDS洗涤两次，5分钟，接着用水洗涤7次，5分钟，同时振荡。载片然后立即转移到含1μM化合物2的50mM NaOAc(pH4.0)、500mM NaCl、20％1，2-丙二醇、1μM GaCl3溶液中45分钟，同时振荡。载片然后用50mM NaOAc(pH4.0)、4％乙腈洗涤3次，每次15分钟，接着水洗15分钟。载片干燥后，通过ScanArray5000XL微阵列分析系统(Packard Instrument公司，Meriden，CT)用543.5纳米激光和或者570纳米或者592纳米发射滤波器成像。Ab1蛋白质酪氨酸激酶用硫代磷酸酯(或如对照用磷酸盐)磷酸化Ab1肽底物的酪氨酸残基。用543.5纳米激发光和570纳米发射滤波器，Ab1肽是阵列上唯一荧光标记的肽。激酶反应后检测的敏感度是2.6皮克用ATP-γ-S标记的肽。相反，在使用ATP的对照反应中，0.325皮克Ab1肽用含有化合物2的结合液标记和检测。
实例24：通过膜上的固定化链霉亲和素或磷酸根结合化合物分离磷酸肽
将购自Pall的Immunodyne膜通过加入足量的5到10毫克/毫升的链霉亲和素或者BAPTA-胺浸润该膜来标记(大约15微升/厘米2)。空气干燥15到30分钟后，用50％的乙腈/0.1％的TFA洗涤三次5分钟，然后用水冲洗两次5分钟。用六毫米直径的圆膜进行试验。链霉亲和素标记的膜通过在200微升40uM化合物9/250uM GaCl3中浸渍来填充，BAPTA标记的膜通过在200微升250uM GaCl3中浸渍来填充。用10％乙腈/400mM NaCl、100mM NaOAc(pH 4)洗涤一次后，用水冲洗两次，将膜在100微升含有2非磷酸肽和3磷酸肽各2微克(大约6纳摩尔总肽)的肽混合液中浸渍15分钟。该膜用10％乙腈/400mM NaCl/100mM NaOAc(pH 4)洗涤一次后，用100mM NaOAc(pH 4)洗涤两次，每次5分钟。最后将该膜用100微升50％乙腈/0.1％TFA洗脱。洗脱液和肽上清液(膜培育后的肽溶液)准备用于MALDI分析。
实例25：用铁磁流体珠粒上的固定化链霉亲和素分离磷酸肽
A.使用BAPTA-生物素染料和链霉亲和素铁磁流体磁粒分离磷酸肽
链霉亲和素铁磁流体磁粒与BAPTA-生物素化合物一起使用以将磷酸肽从复杂混合物中分离。生物素和链霉亲和素之间的结合作用使磁粒标记有化合物9和两种罗丹明(rhodamine)-生物素染料(化合物15和化合物25)。洗掉磷酸根结合化合物后，将磁粒用0.1M GaCl3填充，然后用0.1M NaOAc(pH 4.0)洗涤。将50微升磁粒浆液(4毫克/毫升)加入到磷酸肽混合液中，总体积为100微升。磁粒轻微旋振20分钟培育，用磁性分离器分离磁粒。除去上清液，将珠粒用100微升100mM NaOAc(pH4.0)洗涤2次。磷酸肽用100微升50％乙腈、0.1％TFA洗脱。分离出的肽用MALDI分析，结果显示只有磷酸化肽被分离出来。
B.利用链霉亲和素铁磁流体颗粒的磷酸肽的定量结合
用标记后的铁磁流体颗粒完成磷酸肽的定量结合。用化合物9标记链霉亲和素铁磁流体颗粒，直到饱和。洗掉未结合的染料后，将颗粒用0.1M的GaCl3填充，然后用0.1M NaOAc(pH 4.0)冲洗。在100微升磁粒(4毫克/毫升)中加入含有550皮摩尔磷酸肽的标准肽混合物。混合物在轻微旋振下培育20分钟。用磁性分离器分离颗粒，除去得到的上清液。珠粒用100微升100mM NaOAc(pH 4.0)洗涤2次，磷酸肽用0.15M氢氧化铵洗脱。95％以上的肽(550皮摩尔)被分离出来。
C.与碱消去/加成联合的磷酸肽的铁磁流体颗粒分离
化合物9标记的链霉亲和素铁磁流体(StFF)颗粒联合碱消去/加成用于分离磷酸肽。将磷酸肽分离于StFF上，用50微升0.15M Ba(OH)2洗脱该些磷酸肽。随后将3微升甲胺加入到洗脱物中，将肽在37℃培育1小时。反应物用冰乙酸中和到pH 4.0，用ZipTips将洗脱的肽脱盐。使用链霉亲和素标记的铁磁流体珠粒可使亲和素与生物素之间产生强相互作用，促进较大的磷酸化靶分子的分离。
实例26：用DTPA化合物沉淀磷酸肽
将包含DTPA的磷酸根结合化合物(化合物20、化合物21和化合物22)用于沉淀反应中以从复杂溶液中分离磷酸肽。沉淀反应物含有100uM的化合物20、化合物21或化合物22、200uM GaCl3、100mM NaOAc(pH 4)及5微升8-肽混合物(各250纳克/微升)。将样品剧烈旋振20分钟，然后14,000rpm离心5分钟。移走上清液并保存起来，通过用吸管尖端重新悬浮并再离心，将沉淀物在100mM NaOAc(pH 4)中洗涤两次。最终沉淀物用100微升50％乙腈、0.1％TFA溶解。上清液和沉淀物部分用50％乙腈、0.1％TFA作1∶100稀释，然后与MALDI基质1∶1混合，然后点到MALDI靶上。MALDI分析证明磷酸化肽被选择性分离。
实例27：用本发明的结合液系列检测总磷酸肽的含量，接着用磷酸酪氨酸特异性单克隆抗体及(A)Alexa Fluor647山羊抗小鼠或(B)ZenonTM One Alexa Fluor647小鼠IgG标记试剂来特异性检测肽中的磷酸酪氨酸残基，两者均以微阵列形式进行
(A)将磷酸化和非磷酸化形式的Kemptide、pp60 c-src和DSIP这三对肽，从水溶液浓度为0.95纳克/毫升到0.5毫克/毫升肽的起源板(384孔板)排列到水凝胶包被的载片(Perkin Elmer)上，这如实例20所使用BioChip ArrayerTM(Perkin Elmer)进行。为特异性检测阵列上的磷酸肽，将载片在包含1μM化合物2的结合液中在电烤箱上培育1小时，其缓冲液含有0.5M NaCl、20％1，2-丙二醇、1μM GaCl3及0.05M乙酸钠(pH 4.0)。然后将载片在含4％乙腈的0.05M乙酸钠(pH 4.0)中在电烤箱上洗涤1小时，接着用水洗涤15分钟。载片然后在附加有带载片固定器的转子的微阵列高速离心机(Telechem)中以～6000rpm短暂旋转，以去掉多余液体。载片干燥后，阵列通过ScanArray5000 XL微阵列分析系统(Packard Instrument公司，Meriden，CT)用543.5纳米激光和570纳米发射滤波器成像。结合液特异性标记1.3到2.6皮克pDSIP、2.6到5.2皮克pKemptide和10.4到20.8皮克pp60 c-src(pY)。在磷酸肽检测后，将载片立即置于含有50mM Tris(pH 7.5)、150mM NaCI、0.2％Tween-20、0.25％MOWIOL-488、0.5％BSA的封阻缓冲液中，培育同时振荡3到5小时。载片然后转入含1∶1000(终浓度为1.5微克/毫升)稀释的磷酸酪氨酸单克隆抗体(供给浓度为1.5毫克/毫升，P-Tyr-100，Cell Signaling Tech.)的封阻缓冲液(上述)中，在4℃过夜培育，同时振荡。将载片用一级抗体过夜培育后，用封阻缓冲液洗涤三次十分钟，然后在含有1∶5000稀释(终浓度为0.4微克/毫升)的Alexa Fluor647山羊抗小鼠抗体(供给浓度为2毫克/毫升)的封阻冲液中培育45分钟，同时振荡。最后，载片用封阻缓冲液洗两次十分钟，接着用50mM tris(pH 7.5)、150mM NaCl进行两个5分钟洗涤，用微阵列高速离心机短暂旋转。载片干燥后，阵列通过ScanArray5000 XL微阵列分析系统(Packard Instrument公司，Meriden，CT)用543.5纳米激光/570纳米发射滤波器套组和632.8纳米激光/670纳米发射滤波器套组这两种方案成像。用543.5纳米激发光和570纳米发射滤波器，未检测到信号。用632.8纳米激发光和670纳米发射滤波器，特异性地检测到pp60 c-src(pY)，敏感度为5.2皮克。
(B)载片用一级抗体过夜培育后，用封阻缓冲液冲洗三次十分钟，然后在含有1∶5000稀释(终浓度为2微克/毫升)的ZenonTM One Alexa Fluor647小鼠IgG标记试剂(供给浓度为200微克/毫升)的封阻缓冲液中培育45分钟，同时振荡。最后，载片用封阻缓冲液洗涤一次，5分钟，接着用50mM tris(pH 7.5)、150mM NaCl再次洗涤5分钟，用微阵列高速离心机短暂旋转。载片干燥后，阵列通过ScanArray5000 XL微阵列分析系统(Packard Instrument公司，Meriden，CT)用543.5纳米激光/570纳米发射滤波器套组和632.8纳米激光/670纳米发射滤波器套组这两种方案成像。用543.5纳米激发光和570纳米发射滤波器，未检测到信号。用632.8纳米激发光和670纳米发射滤波器，特异性地检测到pp60 c-src(pY)，敏感度为0.65皮克。
实例28：用本发明的结合液对磷酸肽进行大小排除管柱(SEC)及反相(RP)HPLC分析
含有2到60uM磷酸肽(或者100uM非磷酸肽对照)、20uM化合物2、40uMGaCl3、100mM乙酸钠(pH 4)及0到20％乙醇或异丙醇的样品10到40微升注射到大小排除管柱上(Superdex 30、10×300毫米或者Superdex Peptide 3.2×300毫米)。流动相是50mM乙酸钠(pH 4)、500mM NaCl加20％乙醇或异丙醇。运行时间为45分钟。分别监测214纳米紫外光信号和555ex/580em荧光信号。
SEC结果表明，与非磷酸肽相比，在存在本发明的结合液和磷酸肽的情况下荧光信号强。
也通过反相HPLC用Vydac 238TP52、2.1×250毫米C18管柱对同一样品进行分析。溶剂A＝100mM乙酸钠(pH 4)、0到20％乙醇。溶剂B＝100mM乙酸钠(pH4)、20％乙醇、60％甲醇。然后进行梯度分离，0到55％的溶剂B以0.2毫升/分钟流速洗脱30分钟。监测UV(214纳米)和荧光(ex 555/em 580)信号。
RP结果表明，在存在本发明结合液和不含氯化镓的溶液的情况下，荧光信号增强。分析含有一含单磷酸酪氨酸、单磷酸苏氨酸和单磷酸丝氨酸的肽的样品，可得到相似的结果。
实例29：用本发明的结合液检测链霉亲和素-聚苯乙烯珠粒上的磷酸肽
链霉亲和素-聚苯乙烯珠粒(4.0到4.9uM)用两种生物素化合成肽之一、磷酸肽或者非磷酸肽填充。磷酸肽的分子量为1812克/摩尔，其氨基酸序列为生物素基-ε-胺基己酰基-Glu-Pro-Gln-Tyr(PO3H2)-Glu-Glu-Ile-Pro-Ile-Tyr-Leu-OH。非磷酸肽的分子量为2342.55克/摩尔，其氨基酸序列为生物素基-Glu-Gly-Pro-Trp-Leu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Tyr-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH2。用100mM tris、100mM NaCl(pH 7.5)填充珠粒，紧接着填充在染色前用相同缓冲液洗涤几次。两套珠粒均用1uM化合物2在包含0.05M乙酸钠(pH 4,0)、1uM GaCl3、0.5M NaCl和20％1，2丙二醇的缓冲液中染色45分钟。染色后，用0.05M乙酸钠(pH4.0)、4％乙腈洗涤，按不同比率将磷酸肽填充珠粒与非磷酸肽填充珠粒混合。所有步骤均用振荡、严格的超声处理及旋涡振荡进行。然后混合珠体通过Nikon Eclipse 800Epi-荧光显微镜用Omega Optical公司滤波器套组XF102-2(Exciter：560AF55；Dichroic：595DRLP；Emitter：645AF75)成像。发现磷酸肽填充珠粒的荧光信号的强度平均为非磷酸肽填充珠粒的6倍。
实例30：用本发明的结合液检测结合到链霉亲和素-聚苯乙烯颗粒上的多底物的激酶调节磷酸化
链霉亲和素-聚苯乙烯珠粒(4.0到4.9μM)用称为crosstide的生物素化合成肽填充。Crosstide是丝氨酸/苏氨酸激酶Akt/蛋白激酶B的肽底物，其为一1808克/摩尔的肽，具有以下氨基酸序列：Gly-Ary-Pro-Arg-Thr-Ser-Ser-Phe-Ala-Glu-Gly。用100mM tris、100mM NaCl(pH 7.5)填充珠粒，紧接着填充在染色前用相同缓冲液洗涤数次。然后将链霉亲和素-聚苯乙烯颗粒上的crosstide用500纳克的Akt/PKB激酶在补充有200uM ATP的40微升15mM MOPS(pH 7.2)、18.75mMβ-磷酸甘油、3.75mM EDTA、0.75mM原钒酸钠、0.75mM DTT中进行磷酸化。对照反应在一除了激酶以外所有反应组份(包括ATP)均加有的条件下进行。磷酸化反应在持续振荡的条件下30℃反应60分钟，通过100℃培育珠粒和激酶5分钟来中止反应。然后通过在100mM tris、100mM NaCl(pH 7.5)中培育再次洗涤珠粒，接着用1uM的化合物2在含0.05M乙酸钠(pH 4.0)、1uM GaCl3、0.5M NaCl和20％1，2丙二醇的缓冲液中染色45分钟。染色后，用0.05M乙酸钠(pH 4.0)、4％乙腈洗涤珠粒，通过Nikon Eclipse 800 Epi-荧光显微镜用Omega Optical公司滤波器套组XF102-2(Exciter：560AF55；Dichroic：595DRLP；Emitter：645AF75)成像。发现暴露给Akt/PKB激酶的肽填充珠粒的荧光信号的强度是未暴露给Akt/PKB激酶的对照肽填充珠粒的2.2倍(在标准偏差中无交叠)。
实例31：化合物2的合成
将溶于20毫升丙酸中的3-二甲胺基酚(0.47克、3.5毫摩尔)及5-氟-5′-甲酰基BAPTA四甲基酯(1.00克、1.7毫摩尔)溶液在110℃加热2小时，冷却，倒入到120毫升NaOAc水溶液中。用水冲洗得到的紫色胶状体，将其溶于乙酸中，蒸发，得到1.20克二氢-罗丹-5F四甲基酯，其为红色泡沫。
将四氯苯醌(0.51克、2.0毫摩尔)加入到溶于1∶1氯仿/甲醇(40毫升)的二氢-罗丹-5F四甲基酯(1.2克、1.5毫摩尔)的溶液中。将溶液在室温下搅拌过夜，然后蒸发。残留物通过快速色谱用氯仿/甲醇/乙酸(50∶5∶1)作为洗脱液纯化，得到0.54克罗丹-5F四甲基酯，其为红色泡沫。
将1M KOH(4.4毫升、4.4毫摩尔)加入到溶于二氧杂环己烷(25毫升)的罗丹-5F四甲基酯(0.48克、0.55毫摩尔)溶液中。将溶液搅拌过夜，然后蒸发。残留物溶于10毫升水中，再加入50毫升5％HCl。过滤沉淀物，干燥，得到275毫克罗丹-5F游离酸，其为红色粉末。这一产物用KOH水溶液转化为钾盐，接着通过柱色谱在SephadexLH-20上用水洗脱，得到三钾盐化合物2，其为红色粉末。
实例32：化合物5(罗丹明BAPTA化合物)的合成
溶于20毫升丙酸溶液中的8-羟基久洛尼定(8-hydroxyjulolidine)(0.76克、4.1毫摩尔)、5-氟-5′-甲酰基BAPTA四甲基酯(1.16克、2.0毫摩尔)和p-TsOH(20毫克)在60℃加热过夜，然后冷却，倒入到150毫升3M NaOAc水溶液中。过滤收集紫色粉末，用水冲洗，干燥，得到2.15克二氢-X-罗丹-5F四甲基酯，其为紫色粉末。
将四氯苯醌(1.45克、5.9毫摩尔)加入到溶于1∶1氯仿/甲醇(80毫升)的二氢-X-罗丹-5F四甲基酯(2.1克、2.4毫摩尔)溶液中。将溶液在室温下搅拌4小时，然后蒸发。残留物通过快速色谱用氯仿/甲醇/乙酸(50∶5∶1)纯化，得到3.0克X-罗丹-5F四甲基酯，其为红色泡沫。
将1M KOH(30毫升、30毫摩尔)加入到溶于二氧杂环己烷(25毫升)和甲醇(25毫升)的X-罗丹-5F四甲基酯(3.0克、2.9毫摩尔)溶液中。将溶液搅拌过夜，然后蒸发。将残留物溶于10毫升水中，加至50毫升5％HCl。过滤沉淀物，干燥，得到500毫克化合物5游离酸，其为紫色粉末。将100毫克该游离酸用KOH水溶液转化为钾盐，接着通过色谱在Sephadex LH-20上用水洗脱，得到40毫克化合物5的钾盐，其为紫色粉末。
实例33：喹唑啉酮标记的BAPTA(Q-BAPTA)化合物(化合物7和化合物23)的合成
5-氟-Q-BAPTA(化合物7)的制备：将催化量的对甲基苯磺酸(TsOH)加入到溶于10毫升二氯乙烷/5毫升乙醇的氨基苯酰氨(29毫克、0.21毫摩尔)和5′-氟-5-甲酰基-4-羟基-BAPTA四甲基酯(128毫克、0.21毫摩尔)溶液中。将该溶液回流过夜后，冷却。加入四氯苯醌(57毫克、0.23毫摩尔)。两个小时后，将溶液蒸发，残留物通过快速色谱用5％甲醇/氯仿纯化，得到50毫克化合物7的四甲基酯，其为淡琥珀色的不可流动的油状体；M/Z为711(用分子式C34H34N4O12F计算为710)。
将1M KOH水溶液(0.56毫升、0.56毫摩尔)加入到溶于1∶1二氧杂环己烷∶甲醇(5毫升)中的化合物7的四甲基酯(50毫克、0.07毫摩尔)的绿色溶液中。将黄色溶液搅拌过夜然后蒸发。残留物在Sephadex LH-20上用水纯化，得到53毫克化合物7的钾盐，其为黄色粉末；M/z(阳性模式)为655(用分子式C30H23N4O12F计算为651)。
5.6-二氟-Q-BAPTA(化合物23)的制备：将5，6-二氟-4′-羟基-5-甲酰基-5′-BAPTA四甲基酯(0.100克、0.163毫摩尔)及氨基苯酰氨(0.022克、0.162毫摩尔)溶于二氯甲烷(10毫升)与乙醇(5毫升)的混合物中。加入TsOH(5毫克)，将反应混合物回流3小时。将四氯苯醌(0.044克、0.18毫摩尔)加到该溶液中。将混合物再回流两个小时，然后蒸发。粗产物通过制备型TLC用2∶1氯仿∶乙酸乙酯作为洗脱液纯化。将主要组份(Rf＝0.5)用乙酸乙酯分离，蒸发溶液后得到5，6-二氟-Q-BAPTA四甲基酯(0.029克、24％)，其为无色粉末。
将5，6-二氟Q-BAPTA四甲基酯(0.027克、0.037毫摩尔)溶解到1毫升甲醇与1毫升二氧杂环己烷混合物中。将1M KOH(1毫升)加到该溶液中，反应混合物在室温下过夜。蒸发掉挥发性物质，将粗产物再溶于水，在Sephadex LH-20管柱上纯化，用水洗脱。产物冻干后得到0.021克5，6-二氟-Q-BAPTA钾盐(化合物23)(R＝CH2CO2K)，其为黄色粉末。
化合物23
实例34：(硼聚吖吲得辛BAPTA)化合物(化合物8和化合物24)的合成
BODIPY FL染料BAPTA-5F(化合物8)的制备：将70％的硝酸(0.15毫升、2.3毫摩尔)加入到溶于9毫升乙酸酐的5-氟BAPTA四甲基酯(1.00克、1.82毫摩尔)冷溶液中。10分钟后，将反应溶液倒入30毫升NaOAc水溶液中，然后加入饱和的碳酸氢钠水溶液。将混合物用氯仿(2×30毫升)提取。提取物用盐水洗涤，用硫酸钠干燥，浓缩成琥珀色残留物。然后将残留物通过快速色谱用乙酸乙酯/乙烷纯化，得到0.43克5-硝基-5′-氟-BAPTA四甲基酯，其为黄色粉末。
将1M KOH(5.8毫升、5.8毫摩尔)加入到溶于1∶1的甲醇/二氧杂环己烷(10毫升)的5-硝基-5′-氟-BAPTA四甲基酯(0.43克、0.72毫摩尔)溶液中。将溶液搅拌过夜，然后蒸发。将残留物溶于10毫升水中，然后用HCl水溶液调低pH值到2。收集沉淀物，干燥，得到0.31克5-硝基-5′-氟-BAPTA游离酸，其为黄色粉末。
将溶于30毫升甲醇中的5-硝基-5′-氟-BAPTA游离酸(0.31克、0.58毫摩尔)溶液在10％钯/炭(Pd/carbon)(0.15克)上在38psi的氢气环境下振荡6小时，然后过滤，蒸发，得到0.26克5-氨基-5′-氟-BAPTA游离酸，其为无色粉末。
将溶于5毫升无水THF中的BODIPY FL染料(Molecular Probes，公司D-2183，27毫克、0.09毫摩尔)用草酰氯(0.20毫摩尔)和二异丙基乙胺(DIEA，0.20毫摩尔)在氩气环境下处理。15分钟后，将溶液蒸发。将残留物溶于3毫升无水二氧杂环己烷，然后将该溶液缓慢加入到已用碳酸钠调pH到pH＝9.5的5-氨基-5′-氟-BAPTA游离酸(50毫克、0.1毫摩尔)溶于水(5毫升)中的溶液中该溶液。将该溶液搅拌过夜，然后蒸发浓缩到将干状态。用水在Sephadex LH-20上洗脱纯化该溶液，得到41毫克BODIYP FL染料DBAPTA-5F(化合物8)钠盐，为桔红色粉末。
BODIPY FL染料-EDA-BAPTA(化合物24)的制备：将溶于3毫升水的BODIYPFL盐酸乙二胺盐(15毫克、0.04毫摩尔，Molecular Probes)溶液的pH通过滴加碳酸氢钠水溶液提高到7.6。添加溶解到2毫升二氧杂环己烷中的5-异硫氰酸根基-BAPTA游离酸(22毫克、0.04毫摩尔)溶液。用碳酸钠水溶液将pH调高到9.5，将该橙黄色溶液在室温下搅拌过夜。将溶液蒸发到2毫升，通过Sephadex LH-20用水洗脱纯化，得到17毫克BODIPY FL-EDA-BAPTA钠盐(化合物24)，冻干后其为微细橙黄色粉末(R＝CH2CO2Na)。
化合物24
实例35：生物素化BAPTA化合物(化合物9、化合物12及化合物18)的合成生物素-BAPTA-5F(化合物12)的制备：
将5-硝基-5′-氟-BAPTA四甲基酯的溶液通过溶于乙酸乙酯中的10％Pd/C的催化加氢作用还原。得到的5-胺基-5′-氟-BAPTA四甲基酯(0.10克、0.18毫摩尔)溶于无水二氯甲烷/THF(4∶1，5毫升)中，加入戊二酐(40毫克、0.36毫摩尔)及催化剂DMAP。将溶液搅拌过夜然后蒸发。残留物通过快速色谱用10％的甲醇/氯仿纯化，得到0.13克油状5-胺基-5′-氟-BAPTA四甲基酯戊二酰胺。
将四氟硼酸N-羟基琥珀酰亚胺盐(108毫克、0.36毫摩尔)加入到溶于5毫升无水THF及5毫升无水乙腈中的5-胺基-5′-氟-BAPTA四甲基酯戊二酰胺(0.18毫摩尔)中。两小时后，加入溶于2毫升无水DMF中的生物素氢溴酸乙二胺(66毫克、0.18毫摩尔，Molecular Probes)及DIEA(0.05毫升)。搅拌过夜后，将挥发物蒸发。残留物用水(15毫升)粉碎，收集所得沉淀物，水洗，干燥得到0.10克生物素-BAPTA-5F四甲基酯，其为灰色粉末。
将1M KOH(1.0毫升、1.0毫摩尔)加入到溶于1∶1甲醇/二氧杂环己烷(4毫升)中的生物素-BAPTA-5F四甲基酯(0.10克、0.11毫摩尔)溶液中。将溶液搅拌过夜，然后蒸发。残留物通过Sephadex LH-20用水纯化，得到生物素-BAPTA-5F(化合物12)钾盐，冻干后为无色粉末。
罗丹-生物胞素(化合物18)的制备：
将1.1当量的N-t-BOC-乙二胺及1.1当量的DIEA加入到溶于无水THF中的0.5M4-(琥珀酰亚胺基氧基羰基)-罗丹-四甲基酯溶液中。将得到的溶液搅拌30分钟，然后蒸发。残留物通过快速色谱用氯仿/甲醇/乙酸纯化。将纯化后的碳酸盐溶于二氯甲烷中，用三氟乙酸(20当量)处理。将该溶液搅拌30分钟，然后蒸发，干燥，得到4-羧基-罗丹四甲基酯乙二胺甲酰胺。
将N-t-BOC-生物胞素琥珀酰亚胺酯(1.5当量，在Wilbur等人，BioconjugateChemistry，11：584-98(2000)中有描述)及DIEA(1.5当量)加入到溶解于DMF的0.5M的4-羧基-罗丹四甲基酯乙二胺甲酰胺溶液中。得到的溶液在室温下搅拌直到TLC显示荧光起始物质消耗尽。将挥发物真空除去，残留物通过快速色谱用氯仿/甲醇/乙酸纯化，得到N-t-BOC-罗丹-生物胞素四甲基酯。
用12当量的1M KOH处理溶于1∶1甲醇/二氧杂环己环的0.5M N-t-BOC-罗丹-生物胞素四甲基酯溶液。将得到的溶液室温搅拌过夜，然后蒸发到干燥。残留物通过Sephadex LH-20用水纯化，得到化合物18，冻干后为红色粉末(R＝CH2CO2K)。
化合物18
Figure A0381568400821
罗丹-4-生物素-BAPTA(化合物9)的制备
(2′-硝基苯氧基)-2-氯乙烷(20.15克、0.10摩尔)、(4-羟基-3-硝基)苯甲酸甲酯(21.67克、0.11摩尔)和k2CO3(27.60克、0.20摩尔)的悬浮液在130℃搅拌16小时，冷却至室温，倒入冰水(1.2升)中。过滤沉淀物，水洗，干燥，得到32.00克(4′-甲氧羰基-2′-硝基苯氧基)-2-(2″-硝基苯氧基)乙烷，其为黄色固体。将(4′-甲氧羰基-2′-硝基苯氧基)-2-(2″-硝基苯氧基)乙烷(20.克、55.2毫摩尔)在DMF(300毫升)中的10％的Pd/C(3.0克)中于40psi下氢化5小时。将混合物通过硅藻土与催化剂过滤分开。将滤出物蒸发，加入乙醚(100毫升)。将产物过滤，用乙醚(2×25毫升)洗涤，得到13.2克1′-胺基-4′-甲氧羰基苯氧基)-2-(2″-胺基苯氧基)乙烷，其为米色固体。
将(2′-胺基-4′-甲氧羰基苯氧基)-2-(2″-胺基苯氧基)乙烷(13.20克、44毫摩尔)、甲醇(50毫升)、二氧杂环己环(50毫升)及1M KOH(100毫升、100毫摩尔)的混合物在65℃搅拌5小时，然后室温过夜。将混合物蒸发，并将残留物悬浮于H2O(500毫升)中。加入1M HCl水溶液至pH 5.0。过滤沉淀产物，用H2O洗涤，在滤器上干燥4小时，然后用乙醚洗涤(3×25毫升)，得到12.5克2′-胺基-4′-羧基-1′-苯氧基)-2-(2″-胺基苯氧基)乙烷，其为米色固体。
将二苯甲酮腙(benzphenone hydrazone)(6.66克、34毫摩尔)和黄色HgO(17.60克、80毫摩尔)在己烷(200毫升)中剧烈搅拌3小时，以制备二苯基重氮甲烷。将混合物过滤与无机物分开，蒸发，残留物溶于丙酮(50毫升)中。将该溶液加到丙酮中的2′-胺基-4-羧基-1′-苯氧基)-2-(2″-胺基苯氧基)乙烷的悬浮液中。混合物在35℃搅拌16小时，然后经2小时用AcOH(2毫升)分解过量的二苯基重氮甲烷。将混合物蒸发，粗产物通过快速色谱在SiO2上用CHCl3作为洗脱液纯化，得到6.80克2′-胺基-(4′-联苯基甲氧基羰基苯氧基)-2-(2″-胺基苯氧基)乙烷，其为米色固体。
将MeCN(400毫升)中的2′-胺基-4′-联苯基甲氧基羰基苯氧基-2-(2″-胺基苯氧基)乙烷(8.28克、18.24毫摩尔)、DIEA(16.3毫升、94毫摩尔)、溴乙酸甲酯(35.3毫升、376毫摩尔)及NaI(1.50克、10毫摩尔)混合物回流搅拌70小时，冷却至室温，蒸发。残留物溶于CHCl3(500毫升)，用1％AcOH(3×200毫升)、H2O(200毫升)、饱和NaCl(200毫升)洗涤，过滤，蒸发。残留物通过快速色谱在SiO2上用溶于己烷的30％到40％的EtoAC梯度液作为洗脱液纯化，得到10.01克4-联苯基甲氧基羰基-BAPTA四甲基酯，其为白色固体。
将溶于DMF(15毫升)的4-联苯基甲氧基羰基-BAPTA四甲基酯(3.71克、5毫摩尔)溶液加入到溶于DMF(35毫升)的由POCl3(5毫升、50毫摩尔)制成的Vilsmeier试剂溶液中。将混合物于40℃搅拌24小时，然后加入另一部分Vilsmeier试剂(25毫摩尔)，将该混合物于40℃搅拌70小时。将混合物冷却至室温，迅速倒入冰-饱和K2CO3混合(1200毫升)中。1小时后，过滤沉淀物，用H2O洗涤，干燥，得到3.78克4-联苯基甲氧基羰基-5′-甲醯基-BAPTA四甲基酯，其为无色固体。
将在丙酸(40毫升)中的4-联苯基甲氧基羰基-5′-甲酰基-BAPTA四甲基酯(2.90克、3.8毫摩尔)、m-二甲胺基酚(1.21克、8.8毫摩尔)和TsOH(100毫克)混合物在68℃搅拌20小时，然后冷却至室温并倒入3M NaOAc(600毫升)中。1小时后，过滤沉淀物，用水洗涤，干燥，得到3.70克4-联苯基甲氧基羰基-二氢罗丹四甲基酯，其为紫红色固体。
将在CHCl3及MeOH(每种40毫升)中的4-联苯基甲氧基羰基-二氢罗丹四甲基酯(2.050克、2.0毫摩尔)和粉状四氯苯醌(0.492克、2.0毫摩尔)的混合液搅拌2小时，过滤，蒸发。残留物通过快速色谱在SiO2上用溶于CHCl3的5到6.5％MeOH/1％AcOH作为洗脱液纯化，得到粗产品，将其重溶于CHCl3中，与SiO2过滤分开，蒸发，得到0.533克4-联苯基甲氧基羰基-罗丹四甲基酯，其为深紫色固体。
向溶于二氧杂环己烷(2毫升)及MeOH(1毫升)的4-联苯基甲氧基羰基-罗丹四甲基酯(51毫克、0.05毫摩尔)中加入1M KOH至pH 12.0。将该混合液搅拌20小时，然后用0.1M HCl调pH至9.0。将混合液蒸发，残留物在Sephadex LH-20上用H2O作为洗脱液纯化。冻干产物，得到26毫克4-羧基-罗丹四钾盐，其为红紫色固体。
将TFA(10毫升)加入到溶于CHCl3(10毫升)的4-联苯基甲氧基羰基-罗丹四甲基酯(102毫克、0.1毫摩尔)中，将得到的混合液搅拌1小时，然后蒸发，加入CHCl3(3×10毫升)共蒸发。加入乙醚(10毫升)，过滤沉淀物，用乙醚(3×10毫升)洗涤，得到82毫克4-羧基-罗丹四甲基酯，其为深紫色固体。
将DIEA(0.35毫升、2毫摩尔)及干燥的O-三氟乙酰基-N-羟基琥珀酰亚胺(TFA-SE，225毫克、1毫摩尔)加入到溶于DMF(2毫升)的4-羧基-罗丹四甲基酯(80毫克、0.093毫摩尔)中。将混合液搅拌2小时，然后加入更多的TFA-SE(113毫克、0.5毫摩尔)，将混合液再搅拌16小时。混合液用CHCl3(50毫升)稀释，用1％AcOH(3×20毫升)、H2O(25毫升)、饱和NaCl(50毫升)洗涤，过滤，蒸发。加入乙醚(25毫升)，过滤沉淀产物，用乙醚洗涤，得到86毫克4-琥珀酰亚胺基氧基羰基-罗丹四甲基酯，其为深紫色固体。
将4-(琥珀酰亚胺基氧基羰基)-罗丹四甲基酯(36毫克、0.038毫摩尔)溶液加入到溶于DMF(1毫升)及DIEA(0.055毫升、0.40毫摩尔)的生物素尸胺(34毫克、0.077毫摩尔)中。将混合物搅拌3小时，用CHCl3(200毫升)稀释，用1％AcOH(3×150毫升)、H2O(100毫升)、饱和NaCl(200毫升)洗涤，过滤，蒸发。残留物在两个制备型TLC SiO2板上用溶于CHCl3的12％MeOH和2.5％AcOH溶液作为洗脱液纯化，得到38毫克4-(N-(5″-生物素基胺基戊基)胺基羰基)-罗丹四甲基酯。
向溶于MeOH(2毫升)和H2O(1毫升)的4-(N-(5″-生物素基胺基戊基)胺基羰基)-罗丹四甲基酯(30毫克、0.025毫摩尔)中加入1M KOH至pH12.0。将混合液搅拌20小时，然后用0.1M HCl调pH到pH 8.5。将混合液蒸发，残留物在Sephadex LH-20上用H2O作为洗脱液纯化。冻干产品，得到30毫克化合物9(4-N-5″-生物素基胺基戊基)胺基羰基)-罗丹四钾盐)，其为橙红色固体。
实例36：4-(4′-胺基苯基-2-乙胺基)羧甲基罗丹三钾盐(化合物10)的合成
将(2′-硝基苯氧基)-2-氯乙烷(5.87克、29毫摩尔)、4-羟基-3-硝基苯基乙酸甲酯(6.15克、29毫摩尔)和K2CO3(8.28克、60毫摩尔)悬浮液在120℃搅拌16小时，冷却至室温，倒进冰水(0.6升)中。过滤沉淀物，用H2O洗涤，干燥，得到4.49克(4′-甲氧基羰基甲基-2′-硝基苯氧基)-2-(2″-硝基苯氧基)乙烷，其为黄色固体。
将(4′-甲氧基羰基甲基-2′-硝基苯氧基)-2-(2″-硝基苯氧基)乙烷(9.6克、25.5毫摩尔)在40psi下用溶于DMF(250毫升)的10％Pd/C氢化16小时。将混合物通过硅藻土过滤与催化剂分开。将滤液蒸发浓缩，残留物通过快速色谱在SiO2上用溶于己烷的25到35％EtOAc梯度液纯化，得到5.53克(2′-胺基-4′-甲氧基羰基甲基苯氧基)-2-(2″-胺基苯氧基)乙烷，其为米色固体。
将(2′-胺基-4′-甲氧基羰基甲基苯氧基)-2-(2″-胺基苯氧基)乙烷(5.50克17.4毫摩尔)、甲醇(40毫升)、二氧杂环己烷(40毫升)及1M KOH(35毫升、35毫摩尔)的混合物在45℃搅拌1小时，然后室温过夜。蒸发混合物，将残留物悬浮在H2O(100毫升)。加1M HCl水溶液到pH 3.0。过滤沉淀产物，用H2O洗涤，干燥，得到4.59克(2′-胺基-4′-羧甲基-1′-苯氧基)-2-(2″-胺基苯氧基)乙烷，其为米色固体。
将二苯甲酮腙(2.94克、15毫摩尔)和黄色HgO(8.80克、40毫摩尔)在己烷(70毫升)中剧烈搅拌5小时，得到二苯基重氮甲烷。将混合物过滤，与无机物分开，蒸发浓缩滤液，残留物重溶于丙酮(20毫升)。将该溶液加入到溶于丙酮(120毫升)的2′-胺基-4′-羧甲基-1′-苯氧基)-2-(2″-胺基苯氧基)乙烷(3.02克、10毫摩尔)中。将得到的混合物在35℃搅拌16小时，然后用AcOH(0.5毫升)经2小时分解过量的二苯基重氮甲烷。蒸发混合物，粗产物通过快速色谱在SiO2上用溶于CHCl3的1％的MeOH作为洗脱液纯化，得到4.44克(2′-胺基-4′-联苯基甲氧基羰基甲基苯氧基)-2-(2″-胺基苯氧基)乙烷，其为米色固体。
将溶于MeCN(90毫升)的2′-胺基-4′-联苯基甲氧基羰基甲基苯氧基)-2-(2″-胺基苯氧基)乙烷(2.12克、4.5毫摩尔)、DIEA(4.0毫升、23.5毫摩尔)、溴乙酸甲酯(8.8毫升、94毫摩尔)及NaI(0.50克、4.7毫摩尔)混合物回流70小时，冷却至室温，蒸发。残留物溶于CHCl3(500毫升)，用1％的AcOH(3×200毫升)、H2O(200毫升)、饱和NaCl(200毫升)洗涤，过滤，蒸发。将残留物通过快速色谱在SiO2管柱上用溶于己烷的30到40％的EtOAC梯度液作为洗脱液纯化，得到2.82克4-联苯基甲氧基羰基甲基-BAPTA四甲基酯，其为无色固体。
将溶于DMF(5毫升)的4-(联苯基甲氧基羰基甲基)-BAPTA四甲基酯(3.78克、5毫摩尔)溶液加入到溶于DMF(10毫升)的由POCl3(1.5毫升，30毫摩尔)制备的Vilsmeier试剂溶液中。将混合物搅拌24小时，然后快速倒入到冰-饱和K2CO3混合液(500毫升)中。将混合液用CHCl3提取，用MgSO4干燥，蒸发。产物混合物在SiO2上用溶于己烷的30到40％EtOAc梯度液纯化，得到1.65克醛基4-(联苯基甲氧基羰基甲基)-5′-甲醯基-BAPTA四甲基酯，其为无色固体。
将丙酸(10毫升)中的4-(联苯基甲氧基羰基甲基)-5′-甲酰基-BAPTA四甲基酯(784毫克、1.0毫摩尔)、m-二甲胺基酚(301毫克、2.2毫摩尔)及TsOH(20毫克，催化剂)的混合物在65℃搅拌20小时，然后冷却到室温，倒入到3M NaOAc(150毫升)中。1小时后，过滤沉淀物，用水洗涤，干燥，得到450毫克4-(联苯基甲氧基羰基甲基)-二氢罗丹四甲基酯，其为紫红色固体。
将CHCl3和MeOH(每种20毫升)中的4-(联苯基甲氧基羰基甲基)-二氢罗丹四甲基酯(420毫克、0.43毫摩尔)和粉状四氯苯醌(122毫克、0.5毫摩尔)的混合物搅拌3小时，过滤，蒸发。残留物通过快速色谱在SiO2上用溶于CHCl3的5到7％MeOH/0.5％AcOH梯度液作为洗脱液纯化，得到粗产品，其重溶于CHCl3，过滤与SiO2分开，蒸发，得到275毫克4-(联苯基甲氧基羰基甲基-5′-四甲基)-罗丹四甲基酯，其为深紫色固体。
将TFA(20毫升)加入到溶于CHCl3(20毫升)的4-(联苯基甲氧基羰基甲基-5′-四甲基)-罗丹四甲基酯(250毫克、0.25毫摩尔)溶液中，并将得到的混合物搅拌1小时，然后蒸发，与CHCl3(3×30毫升)共蒸发。将乙醚(30毫升)加到残留物中，过滤沉淀物，用乙醚(3×10毫升)洗涤，得到200毫克4-羧甲基-罗丹四甲基酯，其为深紫色固体。
将干燥的TFA-SE(338毫克、1.5毫摩尔)加入到溶于DMF(5毫升)及DIEA(0.40毫升、2.2毫摩尔)的4-羧甲基-罗丹四甲基酯(128毫克、0.15毫摩尔)中。将混合物搅拌16小时，然后加入4-胺基苯乙胺(0.4毫升、4毫摩尔)及DIEA(0.4毫升、2.2毫摩尔)溶液。将混合物搅拌2小时，用CHCl3(500毫升)稀释，用1％AcOH(3×100毫升)、饱和NaCl(2×200毫升)洗涤，过滤，蒸发。将乙醚(25毫升)加到残留物中，过滤沉淀产物，用乙醚洗涤，得到126毫克4-(4′-(胺基苯基)-2-乙胺基)羰基甲基-罗丹四甲基酯，其为深红色固体。
向溶于二氧杂环己烷(2毫升)、MeOH(2毫升)及H2O(1毫升)的4-(4′-(胺基苯基)-2-乙胺基)羰基甲基-罗丹四甲基酯(100毫克、0.1毫摩尔)溶液中加入1M KOH至pH 12.0。将混合物搅拌50小时，然后用0.1M HCl调pH到9.0。将混合物蒸发，残留物在Sephadex LH-20上用H2O作为洗脱液纯化，产物冻干得到21毫克化合物10，其为橙红色固体。
实例37：BAPTA-琼脂糖化合物(化合物13及化合物14)的合成
BAPTA-琼脂糖化合物(化合物13)的制备
将溶于3毫升无水DMF的5-异硫氰酸根基-BAPTA游离酸(65毫克、0.12毫摩尔，美国专利第5,453,517号)的溶液加入到用15毫升DMF稀释的胺基琼脂糖浆液(50％水性浆液，16微摩尔胺/毫升，6毫升，96微摩尔胺，Pierce)中。用DIEA(1.5毫升)将pH提高到10。将得到的淡棕色混合物在室温搅拌48小时，然后离心。将BAPTA-琼脂糖(化合物13)沉淀小块用丙酮(2x)及水(2x)漂洗，然后悬浮于水中。
BAPTA-5F-琼脂糖(化合物14)的制备
将溶于12毫升HCl水溶液中的5-胺基-5’-氟-BAPTA游离酸(0.26克、0.51毫摩尔)溶液用12毫升氯仿稀释，然后用二氯硫化碳(3毫升)处理。将该橙黄色混合物在室温搅拌过夜，然后蒸发。将混合物离心，得到棕色胶状物，干燥，然后溶于2毫升无水THF中。加入20毫升乙酸乙酯得到沉淀物，将沉淀物通过离心分离，得到5-氟-5’-异硫氰酸根基-BAPTA游离酸，其为淡灰棕色粉末。
将溶于1毫升无水DMF的5-氟-5’-异硫氰酸根基-BAPTA游离酸(25毫克、0.05毫摩尔)加入到用5毫升DMF稀释的2毫升50％胺基琼脂糖水性浆液中。用几滴DIEA将pH提高到10。将该淡棕色混合物在室温下搅拌48小时，然后离心。将BAPTA-5F-琼脂糖(化合物14)沉淀小块用丙酮(2x)及水(2x)漂洗，然后悬浮于水中。
实例38：化合物15(TAMRA-生物素BAPTA化合物)的合成
将溶于5毫升二氧杂环己烷的BAPTA-4-异硫氰酸根基(18毫克、0.033毫摩尔)溶液加入到溶于4毫升水中的5-(和-6)-四甲基罗丹明生物胞素(Molecular Probes公司，29毫克、0.033毫摩尔)溶液中。得到的pH(3.5)用碳酸钠水溶液提高到10。将得到的红色溶液在环境温度下搅拌过夜，真空浓缩。残留物通过柱色谱在SephadexLH-20上用水作为洗脱液纯化。产物冻干，得到26毫克TAMRA-生物素-BAPTA，其为红色粉末。LCMS m/2 726(按分子式C73H84N11O17S2计算为1452)。
实例39：化合物16(罗丹明BAPTA化合物)的合成
将溶于5毫升丙酸的5-甲酰基-5’-硝基-BAPTA四甲基酯(200毫克、0.33毫摩尔)及8-羟基久洛尼定(125毫克、0.66毫摩尔)在70℃氮气条件下加热1小时，冷却到室温，倒入到30毫升浓缩的乙酸钾溶液中。将混合物用氯仿提取，然后用盐水洗涤，用硫酸钠干燥，蒸发，得到红色油状体，将其通过快速色谱用乙酸乙酯/己烷纯化，得到0.225克二氢-X-罗丹-5N四甲基酯，其为黄色泡沫。
将四氯苯醌(40毫克、0.16毫摩尔)加入到溶于1∶1氯仿/甲醇(5毫升)的二氢-X-罗丹-5N四甲基酯(0.12克、0.12毫摩尔)中。将溶液搅拌过夜，用50毫升氯仿稀释，用盐水洗涤，用硫酸钠干燥，蒸发。残留物通过快速色谱用15％甲醇/氯仿纯化，得到63毫克X-罗丹-5N四甲基酯，其为紫色粉末。
将2M KOH(0.6毫升，1.2毫摩尔)加入到溶于5毫升甲醇的X-罗丹-5N四甲基酯(0.11克、0.11毫摩尔)中。将溶液在室温搅拌过夜，然后蒸发。将残留物溶解于水(5毫升)中，用2M HCl将pH降低到2。通过离心收集沉淀物，将其溶解于新鲜KOH水溶液中，用HCl水溶液沉淀。将这一程序重复五次，得到90毫克化合物16游离酸，其为紫色粉末。
实例40：4-羟基-5-苯并噻唑基-BAPTA(化合物17)的合成
将溶于DMSO(5毫升)的4-羟基-5-甲酰基-5’-甲基BAPTA四甲基酯(0.40克、0.68毫摩尔)及2-胺基苯硫酚(75毫克、0.70毫摩尔)的溶液加热回流15分钟。冷却后将该黄色溶液用50毫升水稀释。过滤黄色沉淀物，将其干燥，然后通过快速色谱用乙酸乙酯/己烷纯化，得到0.22克4-羟基-5-苯并噻唑基-BAPTA四甲基酯，其为黄色泡沫。
将1M KOH(3.0毫升、3.0毫摩尔)加入到溶于1∶1甲醇/二氧杂环己烷(10毫升)的4-羟基-5-苯并噻唑基-BAPTA四甲基酯(0.21克、0.30毫摩尔)中。将溶液搅拌3小时，然后蒸发。残留物在Sephadex LH-20上用水作为洗脱液纯化，得到0.13克化合物17，其为黄绿色粉末(R＝CH2CO2K)。
化合物17
实例41：4′-羧甲基-4-甲氧基-罗丹钾盐(化合物19)的合成
将(4′-甲氧基-2′-硝基苯氧基)-2-氯乙烷(11.29克、48.7毫摩尔)、4-羟基-3-硝基苯基乙酸甲酯(10.80克、51.2毫摩尔)及K2CO3(13.80克、100毫摩尔)的悬浮液在130℃搅拌4小时，冷却至室温，倒入到冰水(0.8升)中，让其凝结2天。过滤沉淀物，将其用H2O洗涤，干燥，得到15.1克(4′-甲氧基羰基甲基-2′-硝基苯氧基)-2-(4″-甲氧基-2″-硝基苯氧基)乙烷，其为黄色固体。
将(4′-甲氧基羰基甲基-2′-硝基苯氧基)-2-(4″-甲氧基-2″-硝基苯氧基)乙烷(15.0克、43.3毫摩尔)用溶于CH2Cl2(250毫升)的10％Pd/C(2.0克)在45psi下氢化16小时。将混合物通过硅藻土过滤。将滤液蒸发，残留物用乙醚(200毫升)处理。过滤沉淀物，将其用乙醚(3×25毫升)洗涤，得到11.21克(2′-胺基-4′-甲氧基羰基甲基苯氧基)-2-(2″-胺基-4″-甲氧基苯氧基)乙烷，其为米色固体。
将(2′-胺基-4′-甲氧基羰基甲基苯氧基)-2-(2″-胺基-4″-甲氧基苯氧基)乙烷(8.65克、25毫摩尔)、甲醇(80毫升)、二氧杂环己烷(80毫升)及1M KOH(50毫升、50毫摩尔)的混合物在60℃搅拌1小时，然后在室温过夜。将混合物蒸发，残留物悬浮于H2O(300毫升)中。加1M HCl水溶液到pH 4.0。过滤沉淀物，将其用H2O洗涤，干燥，得到6.84克(2′-胺基-4′-羧甲基-1′-苯氧基)-2-(2″-胺基-4″-甲氧基苯氧基)乙烷，其为米色固体。
通过剧烈搅拌己烷(150毫升)中的二苯甲酮腙(5.88克、30毫摩尔)及黄色HgO(17.60克、80毫摩尔)6小时，制备二苯基重氮甲烷。将混合物过滤与无机物分开，将滤液蒸发浓缩，残留物重溶于丙酮(40毫升)中。将该溶液加入到溶于丙酮(200毫升)的(2′-胺基-4′-羧甲基-1′-苯氧基)-2-(2″-胺基-4″-甲氧基苯氧基)乙烷酸(6.64克、20毫摩尔)的溶液中。将得到的混合物在35℃搅拌48小时，蒸发，将残留物悬浮于CHCl3中。向悬浮液中加入AcOH(4毫升)以分解过量的试剂，将该混合物搅拌2小时，然后蒸发，粗产物通过快速色谱在SiO2上用溶于CHCl3中的0.5％MeOH作为洗脱液纯化，得到7.81克(78％)(2′-胺基-4′-二苯甲氧基羰基甲基苯氧基)-2-(2″-胺基-4″-甲氧基苯氧基)乙烷，其为米色固体。将溶于MeCN(150毫升)的二胺(2′-胺基-4′-联苯基甲氧基羰基甲基苯氧基)-2-(2″-胺基-4″-甲氧基苯氧基)乙烷(4.62克、9.3毫摩尔)、DIEA(52毫升、300毫摩尔)、溴乙酸甲酯(19毫升、200毫摩尔)及NaI(0.75克、5毫摩尔)的混合物在搅拌条件下回流70小时，冷却到室温，蒸发。将残留物溶于CHCl3(400毫升)，用1％AcOH(3×200毫升)、H2O(200毫升)、饱和NaCl(2×200毫升)洗涤，过滤，蒸发。将残留物通过快速色谱在SiO2上用溶于己烷的25到40％EtOAc梯度液作为洗脱液纯化，得到3.01克4-联苯基甲氧基羰基甲基-4′-甲氧基-BAPTA四甲基酯，其为无色固体。
将溶于DMF(2毫升)的4-联苯基甲氧基羰基甲基-4′-甲氧基-BAPTA四甲基酯(762毫克、1毫摩尔)的溶液加入到溶于DMF(2毫升)的由POCl3(0.28毫升、3毫摩尔)制成的Vilsmeier试剂溶液中。将混合物搅拌2小时，然后快速倒入到冰-饱和K2CO3混合液(50毫升)中。将该混合物用CHCl3(7×20毫升)提取，用MgSO4干燥，蒸发。产物混合物通过柱色谱在SiO2(4×35厘米床体)上用溶于己烷的30到45％EtOAo梯度液分离，得到760毫克4-联苯基甲氧基羰基甲基-5’-甲酰基-4′-甲氧基-BAPTA四甲基酯，其为无色固体。
将溶于丙酸(20毫升)的4-联苯基甲氧基羰基甲基-5’-甲酰基-4′-甲氧基-BAPTA四甲基酯(1.58克、2.0毫摩尔)、m-二甲胺基酚(602毫克、4.4毫摩尔)及TsOH(50毫克，催化剂)的混合物在65℃搅拌20小时，然后冷却到室温，倒入到3M NaOAc(300毫升)中。1小时后，过滤沉淀产物，用水洗涤，干燥，得到2.00克4-联苯基甲氧基羰基甲基-5’二氢罗丹四甲基酯，其为紫红色固体。
将在CHCl3及MeOH(各50毫升)中的化合物4-联苯基甲氧基羰基甲基-4′-甲氧基-5’-二氢罗丹四甲基酯(2.00克、1.9毫摩尔)及粉状四氯苯醌(0.50克、2毫摩尔)混合物搅拌4小时，过滤，蒸发。残留物通过快速色谱在SiO2上用溶于CHCl3的5到7％MeOH/0.5％AcOH梯度液纯化，得到粗产物，将其重溶于CHCl3，过滤与SiO2分开，蒸发，得到480毫克4-(联苯基甲氧基羰基甲基)-4′-甲氧基-罗丹四甲基酯，其为深紫色固体。
向溶于二氧杂环己烷(1毫升)、MeOH(2毫升)及H2O(2毫升)的4-(联苯基甲氧基羰基甲基)-4′-甲氧基-罗丹四甲基酯(45毫克、0.04毫摩尔)的溶液中加入1M KOH到pH 12.0。将混合物搅拌50小时，然后用0.1M HCl调pH到9.0。将混合物蒸发，残留物在Sephadex LH-20管柱上(2.6×90厘米床体)用H2O作为洗脱液纯化，冻干，得到12毫克化合物19，其为红色固体(R＝CH2CO2K)。
化合物19
Figure A0381568400891
实例42：含有DTPA金属螯合部分的化合物20的合成
将BODIPYTR尸胺分子探针D-6251(10毫克、0.019毫摩尔)溶解到在2毫升水中的(S)-1-p-异硫氰酰苯甲基二亚乙基三胺五乙酸(DTPA异硫氰酸酯，分子探针，1-24221，10毫克，0.019毫摩尔)混合物中。用碳酸钠水溶液将pH提高到10。将得到的蓝色溶液在室温搅拌两天，然后真空浓缩。残留物通过柱色谱在SephadexLH-20上用纯水作为洗脱液纯化，得到2毫克化合物20，其为紫色粉末。
实例43：含有DTPA金属螯合部分的化合物21的合成
为合成胺基甲酸盐21a，向溶于20毫升二氯甲烷的1-(S)-(p-胺基苯基)-二亚乙基三胺五乙酸五-t-丁基酯(按照Donald T.Corson & Claude F.Meares.Bloconjugate Chen，11(2)：292-299(2000)出版的程序制备，0.800克、1.03毫摩尔)溶液中加入1毫升吡啶，接着加入溶于5毫升二氯甲烷的N-CBZ-6-胺基己酸酸性氯化物(0.290克、1.02毫摩尔)溶液。将反应混合物在室温搅拌过夜，真空浓缩。残留物溶于100毫升乙酸乙酯，得到的溶液用10％HCl(2×30毫升)、水(30毫升)、盐水(30毫升)洗涤，用硫酸钠干燥。浓缩溶液，放在硅胶管柱上(用乙酸乙酯充填)。用乙酸乙酯洗脱管柱，去掉杂质，然后用10∶1氯仿-甲醇洗脱预期产物。合并纯化的溶出份，蒸发掉溶剂，得到酰胺21a(0.54克、54％)，其为粘性油。
为合成氨基酸21b，将胺基甲酸盐21a(0.700克、0.683毫摩尔)溶解于10毫升TFA中。将反应混合物在室温下保持3天。将挥发物蒸发，残留物用甲苯重蒸发浓缩两次，剩下粘性油。将该油用乙酸乙酯搅拌直到其固体化。将得到的固体过滤，干燥，得到氨基酸21b(0.400克、96％)。
为合成化合物21，将氨基酸21b(0.090克、0.147毫摩尔)悬浮于10毫升水中。用1M KOH调pH到～8。将得到的溶液加入到溶于5毫升DMF的BODIPYTMR-X，SE，分子探针D-6117(0.03克、0.049毫摩尔)的溶液中。将反应混合物在室温下搅拌过夜。监测pH，并在开始2小时期间调到～8。将溶液蒸发，残留物重溶于水，在Sephadex LH-20上用水洗脱纯化。  合并产物溶出份，浓缩到～3毫升，然后冻干，得到0.061克化合物21，其为红色粉末。
Figure A0381568400911
                                                      化合物21
实例44：含有DTPA金属螯合部分的化合物22的合成
7毫克0.019毫摩尔的BODIPYFL EDA分子探针D-2390溶解于10毫克0.019毫摩尔DTPA异硫氰酸酯分子探针I-24221在2毫升水中的混合物中。加碳酸钠水溶液调pH至10。将得到的橙黄色的溶液在室温下搅拌3.5小时，然后蒸发。残留物在Sephadex LH-20上用水作为洗脱液纯化，得到29毫克化合物22，其为橙黄色粉末。
实例45：化合物25-一BAPTA-生物素的合成
将2滴饱和碳酸钠溶液加入到溶于2毫升水的生物素-尸胺(21毫克、0.047毫摩尔，分子探针)溶液中。再加入溶于3毫升二氧杂环己烷的5-异硫氰酸根基-BAPTA游离酸(25毫克、0.047毫摩尔)的溶液。反应物用更多的碳酸钠溶液将pH提高到9.5，将溶液在环境温度下搅拌过夜。挥发物真空除去，残留物通过色谱在Sephadex LH-20上用水作为洗脱液纯化，得到化合物25，其为40毫克淡棕色粉末(R＝CH2CO2Na)。
                             化合物25
实例46：化合物26-一罗丹-BAPTA-BAPTA的合成
将溶于1∶1水∶二氧杂环己烷(8毫升)的5-异硫氰酸根基-BAPTA游离酸(24毫克、0.044毫摩尔)的溶液加入到溶于1∶1水∶二氧杂环己烷(5毫升)的4-羧基-罗丹明四甲基酯的乙二胺甲酰胺(如实例34，0.04毫摩尔)的溶液中。通过加入碳酸氢钠水溶液将pH提高到8.5。将得到的红色溶液在环境温度下搅拌过夜，然后真空浓缩，通过柱色谱在Sephadex LH-20上用水作为洗脱液纯化，得到中间体四羧酸四甲基酯，其为11毫克红色粉末。将1M KOH(0.07毫摩尔)加入到溶于1.4毫升水中的该中间体的溶液中。3小时后，用乙酸将pH(13)降低到9，接着真空浓缩。将得到的残留物通过柱色谱在Sephadex LH-20上用水作为洗脱液纯化，得到化合物26，其为红色粉末(R＝CH2CO2K)。
                             化合物26
实例47：化合物27a-i的合成
化合物27a的合成用于举例说明制造化合物27a-27f所用的合成方法。将草酰氯(18微升、0.20毫摩尔)加入到溶于5毫升无水THF的4，4-二氟-5，7-二甲基-4-硼-3a，4a-吖-s-吲得辛-3-丙酸(分子探针B-2183，50毫克、0.17毫摩尔)的溶液中，接着加入二异丙基乙胺(DIEA，35微升、0.20毫摩尔)。将得到的溶液在室温下搅拌15分钟，接着真空浓缩。将得到的酸性氯化物溶解于3毫升干燥的二氧杂环己烷中。将该溶液逐滴加入5毫升27′(83毫克、0.17毫摩尔，X＝H)溶液中同时进行搅拌；用碳酸钠将pH保持在9。将得到的混浊橙黄色混合物搅拌1小时，在硅胶上进行TLC分析显示形成了27a(Rf0.40，二氧杂环己烷-丙醇-水-氢氧化铵15∶58∶13∶14)。挥发物真空除去，残留物通过柱色谱在Sephadex LH-20上用水作为洗脱液纯化。收集纯产物溶出份，冻干，得到27a，其为99毫克蓬松的橙黄色粉末(68％产率)：1H NMR(D2O)δ7.34(s，1H)，6.98-6.68(m，8H)，6.33(d，J＝4.0Hz，1H)，6.19(s，1H)，4.18(m，4H)，3.66(s，8H)，3.18(t，7.6Hz，2H)，2.72(t，7.6Hz，2H)，2.41(s，3H)，2.13(s，3H)；LCMS(m/z)765(按分子式C36H38N5O11BF2计算为765)。
Figure A0381568400931
R20        R21              X28a     CH3       CH3             H27b     Ph         Ph                H27c     H          -CH＝CH-Ph        H27d     H          -(CH＝CH)2-Ph    H27e     H          2-pyrrolyl        H27f     H          -CH2CH2CO2Na  H8       CH3       CH3             F
实例48：化合物28(丹酰基BAPTA)的合成
溶于3毫升二氧杂环己烷中的丹酰氯(22毫克、0.081毫摩尔)的溶液加入到溶于1∶1二氧杂环己烷/水(10毫升)的5-胺基-BAPTA(40毫克、0.081毫摩尔)溶液中，保持pH 9(用碳酸钠维持)。将得到的溶液在室温下搅拌1小时，然后真空浓缩。残留物通过柱层析在Sephadex LH-20上用水作为洗脱液纯化，得到化合物28，其为40毫克浅黄色粉末。
Figure A0381568400933
       R＝CH2CO2Na
化合物28
实例49：以质谱分析为基础由2-D凝胶鉴别磷蛋白
按标准方案进行2-D凝胶电泳。所有步骤均在50rpm旋转振摇器上用500毫升/凝胶的量来进行。为除去SDS，用50％MeOH、7％HAc过夜固定2-D凝胶，1小时后更换一次。第二天，用dH2O洗涤凝胶4×15分钟，然后用本发明的结合液染色2.5到3小时。为除去非特异性染色及降低本底，用50mM乙酸钠(pH 4.0)、4％乙腈溶液洗涤3次，每次1小时。接着用50mM NaAc、15+％1，2-丙二醇(pH 4.0)再洗涤1小时，然后用532纳米激光激发和580纳米发射滤波器成像。洗涤继续过夜，于第二天重复成像。
进行磷蛋白染色，接着用SYPRORuby进行蛋白质凝胶过夜染色，在再次成像前用10％MeOH、7％HAc脱色2到3小时。将凝胶用473纳米激光激发和580纳米发射滤波器扫描，切下斑点。为了脱色，将斑点置于1.5毫升离心管中用100微升50％MeOH、5％HAc脱色30分钟，用100微升0.1％TFA脱色30分钟，用100微升50％MeOH/5％HOAc脱色30分钟，最后用100微升100％乙腈(ACN)脱水10分钟。在还原和烷基化之前，将斑块完全晾干。如果蛋白质在2-D凝胶电泳前已还原并烷基化，则下一步骤可省略。
为了烷基化和还原半胱氨酸，加足够量的溶于0.1M NH4HCO3的20mM二硫苏糖醇(DTT)以便完全盖住干凝胶块(～50ul)。可能需要加更多DTT，因为凝胶可重新膨胀。在56℃培育1小时。除去DTT溶液，加等体积(50微升)的溶于50mM NH4HCO3的100mM碘乙酰胺(IAAm)。在室温下暗处培育30分钟，弃掉上清液，用100微升0.1M NH4HCO3将凝胶块洗涤2次，15分钟，不时进行振摇以除去过量的反应物。为从凝胶块提取任何过量的反应物，用100微升0.1M NH4HCO3/50％ACN洗涤15分钟，并不时振荡。弃掉上清液，完全干燥凝胶块(晾干)。
为用胰蛋白酶进行凝胶内消化，配制溶于50mM NH4HCO3/10％ACN中的0.05毫克/毫升经修饰胰蛋白酶(Promega)的新鲜溶液。如果不立即使用，则放在冰上保存。在进行下一步骤前，加10微升新鲜胰蛋白酶溶液以让凝胶块在胰蛋白酶溶液中浸泡，即10分钟。通过加入20微升50mM NH4HCO3/10％ACN(VTOT＝30微升)并在37℃过夜培育让凝胶块完全膨胀。
为提取肽，通过加入1微升10％TFA来终止消化；10分钟/RT。旋涡振荡、旋转，取出上清液并置于0.5毫升eppendorf管中。加50微升0.1％TFA到小块中培育30分钟。振荡、旋转，将这次的上清液和第一次的合并。加50微升60％ACN/0.1％TFA作用30分钟，振荡、旋转，和管中的第一次的上清液合并。用Speed-Vac干燥肽，将其再次溶解于10微升10％ACN/0.1％TFA中。
将肽混合物脱盐，用Millipore的C18 ZipTip管柱浓缩，或按样品浓度直接点样。将0.5微升基质(溶于50％乙腈、0.1％TFA的5毫克/毫升α-氰基4-羟基肉桂酸)及0.5微升样品在靶上混合。干燥斑点，用质谱仪进行分析。
上述实例中用到的试剂均能购得或可利用市售仪器和方法来配制，或是在本项技术中已为人所知的试剂，或其制备方法在这些实例中已有描述。从上文的描述及结果中显然可知，对于在生物样品上标记磷酸化靶分子，本发明极大地优于目前能得到的方法，因为其能检测出500到1000倍浓度范围的磷酸化靶分子，这没有前例。本发明克服了当前所用方法的缺点，使得可以用简单程序标记和分离磷酸化靶分子，而且提高了敏感度。应了解，本发明的方法可对溶液中或固定的磷酸化靶分子进行标记，磷酸根结合化合物可以是固定的或者是在溶液中，由此可以鉴别将这些靶分子磷酸化的酶。这些实例并非意欲详尽说明本发明的多种不同实施例。因此，尽管为了清晰理解的目的，用图示及实例的方式对本发明进行了详细描述，但所属领域的技术人员将很容易认识到，在不背离随附权利要求书的精神或范围的情况下可以对其进行很多改变及修改。
本说明书中提到的所有出版物及专利申请案均以引用的方式并入本文中，其并入程度如同明确地及单独地指出将每一个别出版物或专利申请案以引文方式并入。

Claims (74)

1、一种结合液，其包括：
a)一BAPTA金属螯合部分；
b)一包括三价金属离子的盐；及，
c)一酸。
2、一种结合液，其包括：
a)一化学式为(A)m(L)n(B)的磷酸根结合化合物，其中A为一化学部分，L为一连接体，B为一金属螯合部分，m为一从1到4的整数，n为一从0到4的整数；
b)一包括三价金属离子的盐；及，
c)一酸。
3、如权利要求2所述的结合液，其中所述结合液具有一约3到约pH6的pH。
4、如权利要求3所述的结合液，其中所述金属离子选自由Ga3+、Fe3+和Al3+组成的组群。
5、如权利要求4所述的结合液，其中所述盐为氯化镓。
6、如权利要求5所述的结合液，其中所述化学部分为一标记物，所述标记物为一染料、一酶或一半抗原，但须所述染料未经磺化，或所述化学部分为一反应基团。
7、如权利要求6所述的结合液，其中所述半抗原为生物素。
8、如权利要求6所述的结合液，其中所述染料选自由苯并呋喃、喹唑啉酮、呫噸、吲哚、苯并吡咯和硼聚吖吲得辛组成的组群。
9、如权利要求6所述的结合液，其中所述金属螯合部分是BAPTA。
10、如权利要求所述9的结合液，其中所述化合物的化学式为(A)m(L)n(B)，其中A是一化学部分，其为一染料或一反应基团，L为一连接体，m为一从1到4的整数，n为一从0到4的整数，B为一种具有所述化学式IV的金属螯合部分；
Figure A038156840002C1
化学式IV
其中所述染料或反应基团通过一连接体连接到R1到R12中的至少一个上，或R1到R8中的至少一个与A环或B环联合形成一染料；
R1到R8不是一染料或反应基团，其各独立选自由氢、卤素、烷氧基、烷基、芳基、胺基、羧基、硝基、氰基、硫醚、羟基、亚磺酰基和连接体组成的组群；
R9、R10、R11和R12各独立选自由氢、连接体和低烷基组成的组群，或相邻取代基R9和R10联合组成一五元或六元的脂环或杂环；
R15、R16、R17和R18各独立为氢、低烷基或烷基，其中烷基或低烷基视需要可被羧基或烷氧基取代；
p为1或2；及，
R13和R14各自独立为氢或一盐。
11、如权利要求10所述的结合液，其中所述R1到R4中的至少一个独立为染料或反应基基，R5到R8各独立选自由H、NO2、F、CF3、低烷基和连接体组成的组群，其中所述连接体视需要可以连接到一生物素、一反应基团或一染料上。
12、如权利要求11所述的结合液，其中所述染料各独立为R3、R2或R3、R2的联合。
13、如权利要求11所述的结合液，其中所述R6或R7为一连接体且所述连接体视需要可以连接到一生物素、一反应基团或一染料上。
14、如权利要求11所述的结合液，其中所述R6和R5独立为氟。
15、如权利要求11所述的结合液，其中所述R6为NO2。
16、如权利要求10所述的结合液，其中具所述化学式(A)m(L)n(B)的所述磷酸根结合化合物选自由化合物1、化合物2、化合物3、化合物4、化合物5、化合物6、化合物7、化合物8、化合物9、化合物10、化合物11和化合物12组成的组群。
17、如权利要求2所述的结合液，其中所述结合液进一步包括一有机溶剂和一缓冲剂。
18、如权利要求17所述的结合液，其中所述有机溶剂为乙腈。
19、如权利要求9或10所述的结合液，其中所述磷酸根结合化合物溶于溶液中或固定在一固态或半固态基质上。
20、一种结合一样品中的磷酸化靶分子的方法，所述方法包括以下步骤：
i)用如权利要求1到19任一项所述的结合液接触所述样品；及，
ii)将所述样品和所述结合液培育足够时间，以使所述磷酸根结合化合物与所述磷酸化靶分子结合，由此结合所述磷酸化靶分子。
21、如权利要求20所述的方法，其中所述方法进一步包含用一合适光源照射所述磷酸根结合化合物，由此检测所述经标记磷酸化靶分子。
22、如权利要求20所述的方法，其中所述磷酸化靶分子选自由蛋白质、肽、核苷酸、糖类、磷酸酶底物、激酶底物、脂类以及无机磷酸盐组成的组群。
23、如权利要求22所述的方法，其中所述磷酸化靶分子固定于一固态或半固态基质上或溶解于溶液中。
24、如权利要求23所述的方法，其中所述固态或半固态基质为一凝胶、一膜、一聚合物粒子或一阵列。
25、一种检测一固定在膜上的样品中的磷酸化靶分子的方法，所述方法包括以下步骤：
i)视需要将所述样品在凝胶上进行电泳分离；
ii)将所述样品固定于一膜上；
iii)视需要用一固定液接触步骤ii)中的所述膜；
iv)用如权利要求2到19任一项所述的结合液接触步骤iii)中的所述膜，其中所述结合液包括：
a)一化学式为(A)m(L)n(B)的磷酸根结合化合物，其中A为一化学部分，L为一连接体，B为一金属螯合部分，m为一从1到4的整数，n为一从0到4的整数；
b)一包括金属离子的盐；及，
c)一酸；
v)将步骤IV)的所述膜和所述结合液培育足够时间，以使所述磷酸根结合化合物与所述磷酸化靶分子结合；及，
vi)观察所述化合物，由此检测所述磷酸化靶分子。
26、如权利要求25所述的方法，其中步骤iii)进一步包括用所述固定液接触所述膜之后接着用一洗液接触所述膜。
27、如权利要求26所述的方法，其中所述磷酸化靶分子选自由蛋白质、肽及核苷酸组成组群。
28、如权利要求27所述的方法，其中所述磷酸根结合化合物具有所述化学式(A)m(L)n(B)，其中B包括化学式IV，所述磷酸根结合化合物选自由化合物1、化合物2、化合物3、化合物4、化合物5、化合物9、化合物10、化合物11和化合物12组成的组群。
29、如权利要求28所述的方法，其中所述步骤v)进一步包括用所述结合液接触所述膜之后接着用一洗液接触所述膜。
30、如权利要求29所述的方法，其进一步包括将一附加检测试剂加到所述膜上。
31、如权利要求30所述的方法，其中所述附加检测试剂为一针对总蛋白的染色液、一针对糖蛋白的染色液或一抗体。
32、一种检测一固定在凝胶上的样品中的磷酸化靶分子的方法，所述方法包括以下步骤：
i)将所述样品固定于凝胶上；
ii)视需要用一固定液接触步骤i)的所述凝胶；
iii)用如权利要求2到19任一项所述的结合液接触步骤iii)中的所述凝胶，其中所述结合液包含：
a)一化学式为(A)m(L)n(B)的磷酸根结合化合物，其中A为一化学部分，L为一连接体，B为一金属螯合部分，m为一从1到4的整数，n为一从0到4的整数；
b)一包括金属离子的盐；及，
c)一酸；
iv)将步骤iii)中的所述凝胶和所述结合液培育足够时间，以使所述磷酸根结合化合物与所述磷酸化靶分子结合；及，
vi)观察所述化合物，由此检测所述磷酸化靶分子。
33、如权利要求32所述的方法，其中所述磷酸化靶分子选自由蛋白质、肽及核苷酸组成的组群。
34、如权利要求33所述的方法，其中所述磷酸根结合化合物具有所述化学式(A)m(L)n(B)，其中B包括化学式IV，所述磷酸根结合化合物选自由化合物1、化合物2、化合物3、化合物4、化合物5、化合物9、化合物10、化合物11和化合物12组成的组群。
35、如权利要求34所述的方法，其进一步包含将一附加检测试剂加到所述凝胶上。
36、如权利要求35所述的方法，其中所述附加检测试剂为一针对总蛋白的染色液或一针对糖蛋白的染色液。
37、如权利要求34所述的方法，其中步骤ii)进一步包括用所述固定液接触所述膜之后接着用一洗液接触所述膜。
38、如权利要求34所述的方法，其中所述方法进一步包括在步骤i)之前首先对所述样品进行电聚焦。
39、如权利要求34所述的方法，其中所述方法中的所述步骤i)进一步包括电泳分离所述样品。
40、如权利要求34所述的方法，其中所述步骤v)进一步包括用所述结合液接触所述凝胶之后接着用一洗液接触所述凝胶。
41、一种检测一固定在一基质上的样品中的磷酸化靶分子的方法，所述方法包括以下步骤：
i)将所述样品固定于一基质上；
ii)用如权利要求2到19任一项所述的结合液接触步骤i)中的所述基质接触，其中所述结合液包括：
a)一化学式为(A)m(L)n(B)的磷酸根结合化合物，其中A为一化学部分，L为一连接体，B为一金属螯合部分，m为一从1到4的整数，n为一从0到4的整数；
b)一包括金属离子的盐；及，
c)一酸；
iii)将步骤ii)中的所述基质与所述结合液培育足够时间，以使所述化合物与所述磷酸化靶分子结合；及，
iv)观察所述化合物，由此检测所述磷酸化靶分子。
42、如权利要求41所述的方法，其中所述样品选自由蛋白质、肽、核苷酸、脂类、激酶底物、磷酸酶底物、磷酸根结合蛋白质及糖类组成的组群。
43、如权利要求42所述的方法，其中所述基质为一聚合物凝胶、玻璃、聚合物膜、塑料、聚合物微粒。
44、如权利要求43所述的方法，其中所述磷酸根结合化合物具有所述化学式(A)m(L)n(B)，其中B包括化学式IV，所述磷酸根结合化合物选自由化合物1、化合物2、化合物3、化合物4、化合物5、化合物9、化合物10、化合物11和化合物12组成的组群。
45、如权利要求44所述的方法，其中所述步骤v)进一步包括用所述结合液接触所述基质之后接着用一洗液接触所述基质。
46、如权利要求45所述的方法，其进一步包括将一附加检测试剂加到所述基质上。
47、如权利要求45所述的方法，其中所述附加检测试剂为一针对总蛋白的染色液、一针对糖蛋白的染色液或一抗体。
48、一种从一样品中分离磷酸化靶分子的方法，所述方法包括以下步骤：
i)用一如权利要求1到19任一项所述的结合液接触所述样品；及，
ii)将步骤i)中的所述样品和所述结合液培育足够时间，以使所述化合物与所述磷酸化靶分子结合，形成一三元络合物；及，
iii)从所述样品中分离所述络合物，由此分离所述磷酸化靶分子。
49、如权利要求48所述的方法，其中所述结合液进一步包括乙腈。
50、如权利要求49所述的方法，其中所述分离进一步包括沉淀所述络合物。
51、如权利要求50所述的方法，其中所述分离进一步包括将一碱液加入到所述沉淀络合物中，其中所述络合物被离解，由此通过亲和层析分离所述靶分子。
52、如权利要求50或51所述的方法，其中所述分离视需要进一步包括向如权利要求50或51所述的络合物中加入一有机提取液，由此将所述磷酸化靶分子从所述磷酸根结合化合物中分离。
53、如权利要求52所述的方法，其中所述磷酸化靶分子选自由蛋白质、肽及核苷酸组成的组群。
54、如权利要求53所述的方法，其中所述磷酸根结合化合物具有所述化学式(A)m(L)n(B)，其中B包括化学式IV，所述磷酸根结合化合物选自由化合物1、化合物2、化合物3、化合物4、化合物5、化合物9、化合物10、化合物11和化合物12组成的组群。
55、一种从一样品中分离磷酸化靶分子的方法，所述方法包括以下步骤：
i)用一包括三价金属离子的盐装填一基质，所述基质包括一选自由化学式IV组成的组群的金属螯合部分；
ii)用一酸性结合缓冲液平衡所述基质；
iii)将所述样品加入所述基质中，其中所述磷酸化靶分子结合到步骤ii)的所述基质上；
iv)用一碱液从所述基质中洗脱所述磷酸化靶分子，由此所述磷酸化靶分子得到分离。
56、如权利要求55所述的方法，其中所述基质选自由聚合物粒子、聚合物膜、玻璃及塑料组成的组群。
57、如权利要求56所述的方法，其中所述磷酸化靶分子为蛋白质、肽或核苷酸。
58、如权利要求57所述的方法，其中所述酸性结合缓冲液具有一约3到约6的pH。
59、如权利要求58所述的结合液，其中所述三价金属离子选自由Ga3+、Fe3+和Al3+组成的组群。
60、如权利要求59所述的方法，其中所述盐为氯化镓。
61、如权利要求59所述的方法，其中所述基质包括化合物2、化合物5、化合物13、化合物14、化合物15以及化合物16。
62、一种用于结合一样品中的磷酸化靶分子的试剂盒，所述试剂盒包括：
i)如权利要求1到19任一项所述的结合液；及，
ii)其中所述试剂盒视需要包含分子量标准品，所述分子量标准品包含磷酸化和非磷酸化的多肽。
63、如权利要求62所述的试剂盒，其中所述试剂盒可独立地进一步包括一固定液、附加检测试剂、标准样品或一洗液。
64、如权利要求63所述的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包括一基质。
65、如权利要求64所述的试剂盒，其中所述基质进一步包括一磷酸酶或激酶底物。
66、如权利要求63所述的试剂盒，其中所述附加检测试剂为一针对总蛋白的染色液、一针对糖蛋白的染色液或抗体。
67、如权利要求62所述的试剂盒，其中具有所述化学式(A)m(L)n(B)的所述磷酸根结合化合物选自由化合物1、化合物2、化合物3、化合物4、化合物5、化合物6、化合物7、化合物8、化合物9、化合物10、化合物11、化合物12、化合物15和化合物16组成的组群。
68、一种包括一固定的化学式(A)m(L)n(B)磷酸根结合化合物的基质，其中A为一化学部分，L为一连接体，B为一化学式IV的金属螯合部分，m为一从1到4的整数，n为一从0到4的整数。
69.一种化学式为(A)m(L)n(B)的化合物，其中A为一标记物，L为一连接体，m为一从1到4的整数，n为一从0到4的整数，B为一由化学式IV构成的金属螯合部分，其中所述化合物选自由下列化合物组成的组群，
化合物6
Figure A038156840008C2
化合物7
化合物9
化合物10
Figure A038156840009C1
化合物11
Figure A038156840009C2
化合物12
Figure A038156840009C3
化合物15
化合物17
Figure A038156840010C1
化合物18
Figure A038156840010C2
化合物19
Figure A038156840010C3
化合物23
化合物24
Figure A038156840010C5
化合物25
化合物26及
Figure A038156840011C2
化合物29
其中R19为-(CH2CO2R13)2，R13独立为氢或一盐。
70.一种包括一化学式IV的金属螯合部分的化合物，即：
Figure A038156840011C3
化合物14或
Figure A038156840011C4
化合物13
其中R19为-(CH2CO2R13)2，R13独立为氢或一盐。
71、一种包括化学式IV的金属螯合部分的化合物
Figure A038156840011C5
其中X为H或F；R20为H、甲基或苯基；R21为CH3、Ph、-CH＝CH-Ph、-(CH＝CH)2-Ph、2-吡咯基或-CH2CH2CO2Na；
R19为-(CH2CO2R13)2，R13独立为氢或一盐。
72、一种包括一三价镓离子、一磷酸化靶分子和化学式(A)m(L)n(B)的磷酸根结合化合物的三元络合物，其中A为一化学组份，L为一连接体，B为一金属螯合部分，m为一从1到4的整数，n为一从0到4的整数。
73、一种包括一BAPTA螯合部分、一三价镓离子及一磷酸化靶分子的三元络合物。
74、一种通过将一包括磷酸化靶分子的样品与如权利要求1到19任一项所述的结合液结合来测定的磷酸化靶分子。
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