CN1675249A - N－酰基－(表)k5－胺－o－硫酸盐衍生物及其产品的制备方法 - Google Patents

N－酰基－(表)k5－胺－o－硫酸盐衍生物及其产品的制备方法 Download PDF

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Abstract

描述了得到极高硫酸化度和(表)K5－胺－O－过硫酸盐的(表)K5－N－硫酸盐的过硫酸化新方法，转化这些中间体成为新的N－酰基－(表)K5－胺－O－过硫酸盐，它们基本上对凝血参数无活性，并可用在化妆品或制药领域。而且，还描述了含有作为它们活性成分之一的(表)K5－胺－O－过硫酸盐的药物组合物。

Description

N-酰基-(表)K5-胺-O-硫酸盐衍生物 及其产品的制备方法
发明的目标
本发明涉及高硫酸化度的K5多糖的新衍生及其制备方法，在它们合成中有用的新的高O-硫酸化的中间体，以及含所述K5多糖作为活性成分的、对凝血基本上没有活性的药物组合物。
尤其，本发明与从K5多糖开始得到的K5多糖衍生物有关，该K5多糖为预先N-脱乙酰的，N-硫酸化的，任选的解聚或任选至少20％C5-表异构化的和任选解聚的，通过在适当条件下O-过硫酸化，随后游离胺的N-酰基化而得到该K5多糖衍生物。
发明的背景
糖胺聚糖，比如肝素，硫酸乙酰肝素，硫酸皮肤素，硫酸软骨素和透明质酸，是从各种动物器官工业提取的生物高分子。
尤其，肝素，主要从猪的肠粘膜提取得到，或者从牛肺提取得到，是分子量分布约3000-30000的多分散共聚物，组成一个链混合物，基本上由糖醛酸(葡糖醛酸或艾杜糖醛酸)和通过键α-1→或β-1→4链接的氨基糖(葡糖胺)组成。在肝素中，糖醛酸单元可在2位O-硫酸化，葡糖胺单元是N-乙酰基化的或N-硫酸化的，葡糖胺单元中存在约0.5％6-O-硫酸化3-O-硫酸盐化。
Lindahl等人描述了哺乳动物中肝素的性质和天然生物合成1986 in Lane，D和Lindahl，U(编辑者)“肝素。化学和生物性质；临床应用”，Edward Arnold，伦敦，159-190页，Lindahl，U，Feingold D.S和Roden L，1986 TIBS，11，221-225和Conrad H.E.“肝素粘合蛋白质”，第二章：肝素类的结构AcademicPress，1998。肝素的生物合成从它的N-乙酰基heparosan前体开始，它由重复的葡糖醛酸基-β-1→4-N-乙酰基葡糖胺二糖单元构成。所述前体经酶催化修饰，部分水解N-乙酰基，用SO3 -基团取代它，表异构化葡糖醛酸单元部分5位的羧基，把它们转变成艾杜糖醛酸单元，并引入O-硫酸基团，得到一种产物，该产物在工业提取时，每个二糖单元具有约两倍于羧基的硫酸基团。这些酶催化的修饰导致键接到抗凝血酶III(AT III)的五糖区的形成，称为活性的五糖，它是肝素对AT III的高亲合力结合要结构，是肝素本身抗剂凝性和抗凝血活性的基础。该五糖，仅存在于形成肝素的一些链的内部，在3位上含有硫酸化的葡糖胺单元，在含艾杜糖醛酸的二糖之间隔着一个葡糖醛酸。
在自然界，活性五糖的形成，可通过葡糖醛酰基-C5-表异构酶(C5-表异构化)，将部分葡糖醛酸单元的羧基的表异构化反应形成艾杜糖醛酸单元，并通过适当的硫酸化，将硫酸基团引入到葡糖胺3位羟基上而实现。更具体的，在自然界，活性五糖的形成，是通过这样的事实：C5-表异构化一簇一簇地(即，在链的一部分上)广泛发生，导致形成含艾杜糖醛酸单元比葡糖醛酸单元多的产物。事实上，市售肝素含约70％艾杜糖醛酸单元和30％葡糖醛酸单元。
除了主要的抗凝和抗凝血活性外，肝素还具有抗血酯的、抗增生的、抗病毒的、抗肿瘤的和抗转移的活性，但作为药物使用，因引起出血的抗凝副作用而受阻。
现有技术
众所周知，从大肠杆菌分离的荚膜K5多糖，Vann W.F.等人在EuropeanJournal of Biochemistry，1981，116，359-364(“Vann 1981”)中有所描述，由重复的二糖单元葡糖醛酸基-β-1→4-N-乙酰基葡糖胺的链混合物组成，显示肝磷素N-乙酰基-heparosan前体的相同重复顺序(A)。
Figure A0381893300131
荚膜K5多糖，此后称为“K5多糖”或更简单“K5”，由Lormeau等人在US 5550116描述的，Casu等人在Carbohydrate Research，1994，263，271-284中描述的进行过化学修饰。具有抗肿瘤、抗转移、尤其抗-HIV活性的K5-O-S-硫酸盐，在EP 333243和WO 98/34958中描述。为了得到与从动物器官提取的肝素(提取的肝素)相同类型的、对凝血具有体外生物活性的产品，还对K5进行了化学和酶促的修饰。
具有与提取的肝素相同类型的抗凝血活性的产品是通过模仿自然出现的过程，并用D-葡糖醛酸基C5表异构酶的C5-表异构化的整个关键步骤而得到的。过程在IT 1230785，WO 92/17507，WO 96/14425和WO 97/43317中描述，用K5作为起始材料。对来源于发酵的K5进行N-脱乙酰，接着N-硫酸化，并对这样得到的K5-N-硫酸盐在溶液中用C5-异构化酶进行C5-表异构化，C5-异构化酶是通过色谱法，从小鼠肥大细胞瘤的微粒体酶的溶液(IT 1230 785)或牛的肝脏的微粒体酶(WO 92/17507，WO 96/14425和WO 97/43317)得到的。
Campbell，P.等人纯化了来自牛肝脏的D-葡糖醛酸基C5表异构化酶，在J.Biol.Chem.，1994，269/43，26953-26958(“Campbell 1994”)，他们还提供了它的氨基酸组成，并描述了它在溶液中把K5-N-硫酸盐转化为相应的30％表异构化产物，用HPLC方法，接着通过总亚硝酸解聚成二糖论证了艾杜糖醛酸的形成。
文件WO 98/48006描述了编码D-葡糖醛酸基C5表异构酶的DNA顺序，和重组的D-葡糖醛酸基C5表异构酶，后者是从含所述DNA的重组体表达载体得到，后来由Campbell等人纯化，如Jin-Ping L.等人在J.Biol Chem.2001，276，20069-20077(“Jin-Ping 2001”)中所示。
C5表异构酶的完整顺序由Crawford B.E.等人在J.Biol.Chem.，2001，276(24)，21538-21543(Crawford 2001)中描述。文件WO 01/72848描述了制备K5多糖的N-脱乙酰的N-硫酸衍生物的方法，就总糖醛酸来说，至少40％表异构化的艾杜糖醛酸，分子量2000-30000，含25％-50％对ATIII高亲合力的链，具有抗凝和抗凝血活性，表达为HCII/抗Xa比率1.5-4。所述文件描述40-60％表异构化的K5-N-硫酸盐的过硫酸化，并显示得到的产物，其13C-NMR表明，每个二糖单元具有的硫酸基团含量为2-3.5。在所述条件中重复所述过硫酸化，检查13C-RMN，确定得到的产物事实上是游离胺，它的6-O-硫酸含量是80-95％，氨基糖上3-O-硫酸是30％，但其硫酸化度是3.2。还确定，在WO01/72848中描述的过硫酸化条件下，没有得到大于3.2的硫酸化度。
专利申请MI2001/00397(WO 02/068477)，描述了K5-N，O-过硫酸化的，其硫酸化度大于3.2，从不含亲脂性物质的K5或它的分子量约5000的部分开始，通过(a)N-脱乙酰化/N-硫酸化，(b)O-过硫酸化，并任选地(c)N-再硫酸化得到。
上述文件没有一个描述低分子量-K5-N-硫酸盐，任选地40-60％表异构化的，其中NH2或乙酰基团实际上不存在。
为使了术语标准化，使文本更容易理解，在目前的描述中以单数或复数使用常规的术语或表达。尤其：
-“K5”或“K5多糖”意指：通过发酵得到的大肠杆菌的荚膜多糖，即，由如上所述在非还原端任选地含双键的二糖单元(A)组成的链混合物，在任何情况下，根据文献中所述的方法制备和纯化，尤其，根据Vann 1981，根据Manzoni M.等人，Journal of Bioactive Compatible Polymers，1996，11，301-311(“Manzoni 1996”)或根据WO 01/72848和WO 02/068447中描述的方法；很明显，对于本领域技术人员，此后所示可应用于N-乙酰基heparosan：
-“C5-表异构酶”意指D-葡糖醛酸基C-5表异构酶，提取的或重组的，在任何情况下制备，离析和纯化，尤其，如Campbell 1994，WO 98/48006，Jin-PingL.等人在J.Biol Chem.2001，276，20069-20077或Crawford 2001中描述的；
-K5-胺意指至少95％N-脱乙酰化的，但是其中的乙酰基团用目前的NMR装置是不可检测的；
-“K5-N-硫酸”意指如下述至少95％N-脱乙酰化，并N-硫酸化的K5，其乙酰基用通常的NMR仪器是不可检测的；
-“表K5”意指K5和它的衍生物，其中20-60％的葡糖醛酸单元被C5-表异构化为艾杜糖醛酸单元；
-“表K5-N-硫酸盐”意指20-60％的葡糖醛酸单元被C5-表异构化为WO92/17507或WO 01/72848中所述类型的艾杜糖醛酸单元的K5-N-硫酸盐。
-“表K5-胺-O-过硫酸盐”意指O-硫酸化的表K5-胺，硫酸化度至少为3.4：
-“N-酰基-表K5-胺-O-过硫酸盐”意指N-乙酰化的表K5-胺O-过硫酸盐，其硫酸化度至少为3.4；
-“K5-胺-O-过硫酸盐”意指O-硫酸化的K5-胺，其硫酸化度至少为2.2；
-“N-酰基-K5-胺-O-过硫酸盐”意指N-酰化的N-酰基-K5-胺-O-过硫酸盐，其硫酸化度至少为2.2；
另外：
-上面定义的常规术语和表达，把K5称作为发酵后离析的，一般分子量分布在约1500-50000，平均分子量10000-25000，优选15000-25000；
-除了分子量特殊的指定，这里定义的常规术语和表达，在用取首缩写“低分子量”(低分子量)时，例如低分子量-K5-N-硫酸盐时，低分子量-表K5-N-硫酸盐表示低分子量产物，具有平均分子量最高为12000；
-“衍生物”整体上表示来自天然K5的衍生物和低分子量衍生物；
-前缀“表”，在常规术语和表达中如这里定义的在“K5”的前面，整体上表示来自天然K5的产物和如上定义20-60％表异构化产物，即全由葡糖醛酸组成的链混合物，或葡糖醛酸和20-60％艾杜糖醛酸组成的链混合物，用符号“ζ”在分子式中表示。
-术语“约”涉及分子量时意指用粘度计，根据Johnson等人Carb.es.1976，51，119-127，用通过HPLC计算的分子量的样品作为标准，测量的分子量[±二糖单元的理论重量，包括钠的重量，在(表)K5-N-硫酸盐-衍生物的情况下计算为461]，；
-表述“优势体种类”意指化合物，其在含低分子量-(表)K5-N-硫酸盐、低分子量-(表)K5-胺-过硫酸盐或在低分子量-N-酰基-(表)K5-胺-O-过硫酸盐组成的混合物中，是最有代表性的类型，由HPLC测量分子量曲线的峰值确定；
-除非另行特别说明，“硫酸化度”意指SO3-/COO-的比，也可表示每个二糖单元的硫酸盐数目，用Casu B.等人在Carbohydrate Research，1975，39，168-176(Casu 1975)中描述的电导方法测量，它们也用于WO 01/72848中。
-“O-过硫酸化的条件”意指进行的极端的O-硫酸化，例如，根据Casu B.等人在Carbohydrate Research，1994，163，271-284(Casu 1994)中描述的方法进行；
-术语“烷基”意指线形或分支的烷基，但术语“四丁基铵”表示四-正丁基铵。
发明概述
现已发现：从表K5-N-硫酸盐开始，可得到比文献(例如在WO 01/72848)中描述的其它表K5-胺-O-硫酸盐具更高硫酸化度的表K5-胺-O-硫酸盐，用所述表K5-N-硫酸盐衍生物的叔或季有机碱制备该盐，注意让反应混合物静置30-60分钟，用相同的有机碱保持pH在约7，然后在O-过硫酸化的条件下，用O-硫酸化试剂处理得到的盐。而且，低分子量-表K5-胺-N-硫酸盐，在经过相同的成盐和O-过硫酸化的方法时，得到具有极高硫酸化度的低分子量-表K5-胺-O-硫酸盐。在这种表K5-胺-过硫酸盐-衍生物的情况下，硫酸化度大于3.2。
类似地发现，将上面所述O-过硫酸化条件应用于低分子量-K5-N-硫酸盐，可得到高硫酸度的低分子量-K5-胺-O-硫酸盐。而且，低分子量-K5-N-硫酸盐，在以同样方法进行盐化和O-过硫酸化时，给出高硫酸化度的K5-胺-O-硫酸盐。在这种K5-胺-过硫酸盐-衍生物的情况下，硫酸化度大于2.2。事实上，令人惊讶地发现，在上述条件下制备(表)K5-N-硫酸盐-衍生物的四叔丁基铵盐，成盐化变得完全，在随后的O-过硫酸化中，有利于硫酸基团从葡糖按的氮原子，完全取代为葡糖胺本身的氧原子，尤其是在3位的氧原子，由此产生高2位硫酸化度的、其中NH2基团完全游离的(表)K5-胺-O-硫酸盐-衍生物。衍生物表K5和K5硫酸化度的定量差别，取决于它们的有利于表异构化衍生物的硫酸化的构型。
还发现，使这样得到的(表)K5-胺-O-过硫酸盐-衍生物N-酰基化，得到的新N-酰基-(表)K5-胺-O-硫酸盐-衍生物对凝血无活性，对药物和化妆品组合物的制备是有用的。用这新的和通用的方法，以可重复的方式，制备表K5-O-硫酸盐-衍生物、它们的N-酰基类似物、具有精确硫酸化度的K5-O-硫酸盐，总之，它的低分子量衍生物及其N-酰基-类似物是可能的。
图的简要说明
图1显示硫酸/羧基比2.87的K5-NH2O-硫酸盐的NMR质子谱(根据实施例1得到)；
图2显示硫酸/羧基比4.26的表K5-N-乙酰化物，O-硫酸盐的NMR质子谱(根据实施例2得到)；
图3显示硫酸/羧基比2.87的K5-N-乙酰物，O-硫酸盐的NMR质子谱(根据
实施例3得到)；
详细说明
因此，根据它的一个方面，本发明提供N-酰基-(表)K5-胺-O-过硫酸盐-衍生物的制备方法，其特征在于：
(a)(表)K5-N-硫酸盐-衍生物，以酸的形式，用叔或季有机碱处理，让反应混合物静置30-60分钟，保持溶液的pH值约7，它的盐用所述有机碱离析；
(b)所述(表)K5-N-硫酸盐-衍生物的有机碱的所述盐，在O-过硫酸化的条件下，用O-过硫酸化试剂处理；
(c)这样得到的产物，用(C2-C4)羧酸的官能衍生物处理，离析这样得到的N-酰基-(表)K5-胺-O-过硫酸盐-衍生物。
通常，N-酰基-(表)K5-胺-O-过硫酸盐-衍生物是以钠盐的形式离析，所述钠盐任选转化成另一个化学或制制药学上可接受的盐。
在这文本中，术语“化学上可接受的”指化学合成中有用的阳离子，如离子钠，铵，(C1-C4)四烷基铵，或者，用于产品纯化，然而，“制药学上可接受的”是不需加以说明的。
有利的阳离子衍生自碱金属，碱土金属，铵，(C1-C4)四烷基铵，铝，和锌。优选的阳离子是钠、钙和四丁基铵离子。
根据优选的程序，步骤(a)是将(表)K5-N-硫酸盐-衍生物钠盐即K5多糖钠盐的溶液，(该衍生物是先前N-脱乙酰化的，N-硫酸盐化优选100％，优选20-60％C5表异构化和用亚硝酸任选解聚，具有平均分子量约1000-25000，优选约1500-25000)，通过酸离子交换树脂，例如IR-120H+型，收集包括树脂洗涤水的洗出液，用叔或季有机碱，优选用氢氧化四丁基铵的水溶液中和洗出液。让溶液静置1小时，通过加入相同的叔或季有机碱，保持其pH在约7(即，试图保持中性)，通过冷冻干燥回收得到的盐。
在步骤(b)中，用过量的O-硫酸化试剂，在温度20-70℃，在质子惰性的极性溶剂中处理24小时，进行O-过硫酸化。
有利地，按将步骤(a)离析的(表)K5-N-硫酸盐-衍生物即K5多糖，先前N-脱乙酰化的，N-硫酸化的，优先100％，任选20-60％C5-表异构化的，用亚硝酸任选解聚，具有平均分子量约1500-25000的叔或季有机碱盐，溶解在二甲基甲酰胺中，按每个游离的羟基用2-10摩尔的O-硫酸化试剂，在温度40-60℃处理10-20小时。作为O-硫酸化试剂，以2.5-5摩尔游离羟基/二糖的量使用吡啶。SO3加合物，优选2.5-4摩尔/游离羟基/二糖，反应在50-60℃进行，优选在55℃过夜。反应结束得到的产物，通过加入0.1-1体积的水并中和(优选用氢氧化钠)，用在丙酮中的饱和氯化钠溶液沉淀，过滤和可能的超滤而离析。
这样得到的产物通常是(表)K5-胺-O-过硫酸盐-衍生物的钠盐，具有如上所示葡糖醛酸和艾杜糖醛酸含量。当在叔或季碱的盐上优选在表K5-N-硫酸盐-衍生物的四丁基铵盐上，它具有平均分子量约1000-25000，优选约1500-25000，其中艾杜糖醛酸是总糖醛酸的20-60％，进行过硫酸化反应时，得到表-K5-胺-O-过硫酸盐-衍生物，具有平均分子量约3500-40000，优选约4500-40000，硫酸化度至少为3.4，有利地至少为3.5，更有利为3.55-4，优选3.55-3.8。当过硫酸化反应是在K5-N-硫酸衍生物的叔或季碱盐(优选四丁基铵盐)(其平均分子量约为1500～25000)上进行时，得到的K5-胺-O-过硫酸衍生物的平均分子量为3500-40000，优选4500-40000，硫酸化度为至少2.2-3或2.3-3，更有利地2.5-3，优选2.7-2.9。这样得到的产物来自低分子量K5-N-硫酸盐，优选低分子量-K5-胺-O-过硫酸化的钠盐，具有硫酸化度2.3-3。这产物的平均分子量约3500-11000。
这样得到的钠盐可转化成另一个盐。举例的方法，可用超滤膜，进行钙离子交换工作。在步骤(c)中，用文献中已知的方法，对具高硫酸化度的(表)K5-胺-O-过硫酸盐-衍生物进行N-酰基化。
使步骤(b)中产生的(表)K5-胺-O-过硫酸盐-衍生物，与含2-4个碳原子的单或二羧酸的官能衍生物，在温度约4℃水醇溶液中反应进行N-酰化。作为所述(C2-C4)羧酸的官能衍生物，优选乙酸，丙酸，丙二酸，或丁二酸或它们的单酯，尤其甲基的或乙基的酯，可使用酸酐，氯化物，混合酸酐或活性酯。得到的产物，N-(C2-C4)酰基-(表)K5-胺-O-过硫酸盐-衍生物，用碱中和，优选用氢氧化钠，然后，通过超滤和用丙酮中的饱和氯化钠溶液沉淀离析。N-酰基化的步骤任选重复直至得到完全取代或大于95％取代。这样得到的是N-酰基-(表)K5-胺-O-过硫酸盐，尤其是N-乙酰基-，N-(2-羧基)乙酰基-，N-(2-甲氧基羰基)乙酰基-，N-(2-乙氧基羰基)乙酰基-，N-丙酰基-，N-(3-羧基)丙酰基-，N-(3-甲氧基羰基)丙酰基-，N-(3-乙氧基羰基)丙酰基-(表)K5-胺-O-过硫酸盐。
这样得到的新N-酰基-(表)K5-胺-O-过硫酸盐-衍生物，一般为它们的钠盐形式。所述钠盐可转化成另一个化学上或制药学上可接受的盐。特别有利的盐是碱金属，碱土金属，铵，(C1-C4)四烷基铵，铝和锌的盐。优选钠，钙和四丁基铵的盐。
不像WO 98/34958中描述的方法，其中K5钠盐在非均相中硫酸化，得到K5-O-硫酸盐(根据这里使用的术语是“N-乙酰基-K5-胺-O-硫酸盐”)，硫酸化度为0.5-4，它必需采用氯磺酸，以未控制的方式得到低分子量衍生物，本发明的方法是极其通用的。事实上，它使每种类型的N-酰基-K5-胺-O-过硫酸盐，以非常高的收率，用容易控制的反应制备。尤其，本发明方法可制备用别的方法不可得到的N-酰基-K5-胺-O-过硫酸盐，如表异构化的C-5衍生物，具有与来自天然K5中存在的乙酰基不同的酰基的N-酰基化的衍生物，和低分子量的衍生物。除此之外，不像WO 98/34958中所述的方法，本发明的方法允许低分子量-K5-O-硫酸盐以控制的方式得到，以便得到要求的平均分子量，总之，确定的硫酸化度可在2.3-3的范围，但是，通常在2.7-2.9。最后，本发明方法的所有产物，尤其，游离中间体胺和N-酰基-K5-胺-O-过硫酸盐，是药物和化妆品组合物的有用活性成分。
步骤(a)的起始材料是文献中已知的(表)K5-N-硫酸盐-衍生物或它们的-部分，或相应(表)K5-硫酸盐的亚硝酸解聚制备的低分子量-(表)K5-N-硫酸盐。
起始(表)K5-N-硫酸盐-衍生物具有平均分子量约1000-25000，优选约1500-25000。作为起始材料优选使用具有平均分子量10000-25000的(表)K5-N-硫酸盐，或具有平均分子量约1500-12000，优选约1500-8000，更优选约1500-7500的低分子量-(表)K5-N-硫酸盐。
具艾杜糖醛酸单元含量约20％的低分子量表K-N-硫酸盐，通过具平均分子量5000的K5部分的N-脱乙酰化，N-硫酸化和C5-表异构化得到，在WO 92/17507中描述，但是这产物含有高百分率的乙酰基团。
特别有利作为起始材料的表K5-N-硫酸盐，是从特别纯的K5实际上不含乙酰基的K5-N-硫酸盐的表异构化得到，尤其不含亲脂物质制备的，在WO02/068477中描述。
具有较高艾杜糖醛酸单元含量(尤其40-60％，优选50-55％)的低分子量C5-表异构化的K5-N-硫酸盐，是特别有利的新产品，在制备本发明的N-取代的表K5-胺-O-过硫酸化的-衍生物中作为起始材料。
低分子量-表K5-N-硫酸盐也可由相应低分子量-表K5-N-硫酸盐的C5-表异构化得到，优选在它们的平均分子量大于4000时。实际上不含乙酰基团的低分子量-K5-N-硫酸盐，是通过不含乙酰基团的K5-N-硫酸盐的分级或，优选通过解聚而制备的所有新产物。K5-N-硫酸盐在文献中是众所周知的，并在上面提到的文件中描述，阐述工艺的状况。前面所述的起始材料不可变的由K5的N-脱乙酰化，随后这样得到的K5-胺的N-硫酸化得到。但是，可以确定：如果要制备它的K5特别纯，尤其，如果它不含亲脂物质，则对实际上不含乙酰基或NH2基团的K5-N-硫酸盐的制备是有帮助的，。所以，根据本发明，优选使用从纯化的K5制备的起始K5-N-硫酸盐，如WO 02/068477中描述的。所述K5-N-硫酸盐，它的13C-NMR光谱不显示痕量的N-乙酰基或NH2基团，也在WO 02/068477中描述。
如上所示的新低分子量-表K5-N-硫酸盐，由这样的方法制备，它的特征为K5-N-硫酸盐经(以任何一个次序)：
(1)用离析的、纯化的和在溶液中的或固定在固体支撑物上的D-葡糖醛酸基C5-表异构酶，在pH约7，温度约30℃，进行C5-表异构化，时间12-24小时，在至少一种两价离子的存在下，它们选自钙，镁，钡，锰；
(2)任选亚硝酸解聚，接着还原，通常用硼氢化钠。
表述“以任何次序”显示：方法可以(1)-(2)的方向进行，即，以上面所述方向，也可以(2)-(1)，以相反方向进行，使K5-N-硫酸盐首先进行亚硝酸解聚反应，接着进行硼氢化钠还原反应，此后在前述条件下进行C-表异构化。优选的次序是以方向(1)-(2)。次序(2)-(1)优选用平均分子量大于4000的低分子量-K5-N-硫酸盐开始，更优选约6000。例如，可以确定以1克表K5-N-硫酸盐开始的亚硝酸钠的量，得到分子量大于4000的低分子量-表K5-N-硫酸盐，尤其，至少6000，以便得到制备低分子量表K5-N，O-过硫酸盐的有用中间体。事实上，在这情况下，在步骤(2)中，得到最佳表异构化的百分率。
根据本发明的优选方面，C5-表异构酶固定在惰性的固体支撑物上。
根据Campbell 1994，WO 98/48006，Jin-Ping 2001或Crawford 2001离析和纯化的C5-表异构酶，优选重组体，在底物的存在下固定在惰性支撑物上，即在起始的K5-N-硫酸盐-衍生物的存在下，或在低分子量-K5-N-硫酸盐的存在下，有利的具有平均分子量大于4000，优选至少6000。固定根据传统的方法进行，例如，按WO 01/72848中描述。
循环20-1000毫升25Mm HEPES的pH约7、含0.001-10克底物(K5-N-硫酸盐或低分子量-K5-N-硫酸盐，优选分子量大于4000，尤其至少6000)的溶液，进行C5-表异构化反应，阳离子选自钙，镁，钡和锰，浓度在10-60mM，通过含1.2×107--3×1011cpm固定酶的柱，在约30℃保持pH约7，以30-220毫升/小时的流动保持12-24小时，最好15-24小时。
所述溶液优选在约200毫升/小时的流动，循环过夜(15-20小时)。得到产物根据已知方法纯化和分离，例如，通过超滤和用乙醇沉淀。这样得到产物包括表K5-N-硫酸盐(在这种情况下溶解在水中并进行解聚)或低分子量-表K5-N-硫酸盐(在这种情况下它组成最终产物)。表异构化的百分率，实际上是艾杜糖醛酸单元对葡糖醛酸单元的量，根据WO 96/4425中所述方法，用1H-RMN计算。
根据已知的方法，通过肝素的解聚，进行亚硝酸解聚反应，例如根据EP37319，WO 82/03627中描述的方法，或EP 544592中描述的K5-N-硫酸盐解聚的方法，但从K5-N-硫酸盐开始或含0到小于10％、优选小于5％乙酰基团的表K5-N-硫酸盐开始。优选用亚硝酸钠和盐酸，对实际上不含乙酰基团的表K5-N-硫酸盐上进行解聚，接着在原地用硼氢化钠还原。
实际上，用盐酸将表K5-N-硫酸盐冷的含水溶液调至酸性的pH(约2)，仍旧冷的，用保持在温度(约4℃)和pH(约2)恒定的亚硝酸钠处理，在解聚终止时(约15-30分钟)，用氢氧化钠中和，仍旧在约4℃，用硼氢化钠水溶液处理。还原反应终止时(约4小时)，过量的硼氢化钠用盐酸破坏，溶液用氢氧化钠中和，解聚(和还原)的产物根据已知的方法离析，例如用乙醇或丙酮直接沉淀。解聚终止时得到的产物，可以是低分子量-表K5-N-硫酸盐(在这情况下，它组成最终产物)或低分子量-K5-N-硫酸盐(在这情况下，如上面所示，直接进行C5-表异构化，离析后或仍在溶液中没有前面的离析)，尤其，在它具有平均分子量大于4000时，优选至少6000时，或用于制备具有抗血管形成或抗病毒活性的低分子量-K5-N，O-过硫酸化时。通过适当控制解聚反应，尤其用不同量的亚硝酸钠/盐酸，得到的低分子量-K5-N-硫酸盐或低分子量-表K5-N-硫酸盐具有平均分子量完全在约1500-12000的间隔中，优选约1500-10000，更优选约1500-7500，通过归因于2，5-脱水甘露糖醇的C2信号和多糖链内葡糖胺的异头碳信号的积分，用13C-RMN谱计算。
根据以1克K5-N-硫酸盐或表K5-N-硫酸盐起始的一般程序，起始产物溶解在100-200毫升去离子水中，并在4℃恒温。然后加入一定量的亚硝酸钠，以便得到要求的平均分子量，例如约2000-4000。所以，以具有分子量20000(用HPLC方法测量的，装备有BioRad BioSil 250柱和使用已知分子量的肝素标准)的表K5-N-硫酸盐开始，需要加入溶解在0.2％水溶液中的300-480毫克亚硝酸钠。含表K5-N-硫酸盐和亚硝酸钠的溶液，保持在4℃，通过加入0.1N冷却到4℃的HC1，使pH为2。在缓慢搅拌下反应20-40分钟，然后用0.1N氢氧化钠中和。得到的产物升至室温，用还原试剂，如硼氢化钠(250-500毫克溶解在50-100毫升的水中)处理，反应4-8小时。用0.1N盐酸调节pH为5-5.5，静置2-4小时去除过量的硼氢化钠，。最后，用0.1N氢氧化钠中和，减压蒸发浓缩产物，通过用丙酮或乙醇沉淀，回收产物。
类似地，可确定亚硝酸钠的量，它以1克K5-N-硫酸盐或表K5-N-硫酸盐开始，得到平均分子量约4000-7500，尤其6000-7500的低分子量-K5-N-硫酸盐或低分子量-表K5-N-硫酸盐。
这样得到的低分子量-K5-N-硫酸盐，其艾杜糖醛酸含量为20-60％，优选40-60％，更优选50-55％，实际上不含NH2和N-乙酰基团，具有平均分子量约1500-10000，优选1500-7500，它们的化学上或制药学上可接受盐，组成作为制备特别令人感兴趣低分子量-表K5-N，O-过硫酸盐中起始材料的有用新产物，而且，它们本身用为药学或化妆品组合物的活性成分，组成本发明的又一部分。
制备本发明N-酰基-(表)K5-胺-O-过硫酸盐-衍生物的起始材料优选是(表)K5-N-硫酸盐-衍生物，它由至少90％分子式I链的链混合物组成，
其中，葡糖醛酸单元/艾杜糖醛酸单元的比，从100/0到40/60，n是2-100的整数，优选3-100，相应的阳离子是化学上或制药学上可接受的。
尤其，所述起始的(表)K5-N-硫酸盐-衍生物由链混合物组成，其中至少90％的所述链具有上述分子式I，葡糖醛酸单元含量100-40％，优选葡糖醛酸含量100％，或者80-40％葡糖醛酸和20-60％艾杜糖醛酸，n是2-100的整数，优选3-100，相应的阳离子是化学上可接受的。优选地，葡糖醛酸含量是100％，或者，来自总糖醛酸的40-60％是葡糖醛酸，60-40％是艾杜糖醛酸。
优选的起始材料是链混合物组成的低分子量-(表)K5-N-硫酸盐，其中至少90％所述链具有分子式I，糖醛酸单元全由葡糖醛酸组成，或包括40-60％，优选50-55％的艾杜糖醛酸，n是2-20的整数，优选3-15，相应的阳离子是化学可接受的。表K5-N-硫酸盐，由K5-N-硫酸盐的C5-表异构化制备，是众所周知的，在文献中广泛描述。它们通过用D-葡糖醛酸基C5-表异构酶，K5-N-硫酸盐的葡糖醛酸单元的C5-表异构化制备，在这里引用的文件中描述，阐述工艺的状况，例如在WO 92/17507，WO 98/14425，WO 97/43317，WO 01/72848和US 2002/62019中。然而，根据优选程序的方式，通过表异构化，K5-N-硫酸盐用于从不含亲脂性物质的K5得到，如WO 02/068477中描述的，C5表异构化是用离析，纯化和固定化在固体支撑物上D-葡糖醛酸基C5-表异构酶进行，pH约7，温度约30℃，在至少一种两价离子的存在下进行12-24小时，离子选自钙，镁，钡和锰，如上面所示。而且K5-N-硫酸盐如上面所示。
低分子量的完全N-硫酸化的(表)K5-N-硫酸盐，尤其是那些糖醛酸单元全是以葡糖醛酸和那些具有艾杜糖醛酸单元含量40-60％，优选50-55％的硫酸盐，全是特别有利的新产品，作为制备本发明的N-酰基-(表)K5-胺-O-过硫酸盐-衍生物的起始材料。所述起始材料，是具有艾杜糖醛酸含量为0％或就总糖醛酸而言40-60％的低分子量-(表)K5-N-硫酸盐，平均分子量约1500-12000，优选约1500-7500，它们是化学上和制药学上可接受的盐。分布可在约1000-10000的范围。
所述低分子量-(表)K5-N-硫酸盐优选由链混合物组成，其中至少90％的所述链，具有分子式I’
Figure A0381893300241
其中，糖醛酸单元是100％葡糖醛酸组成，或者，60-40％葡糖醛酸和40-60％艾杜糖醛酸，q是2-20的整数，相应的阳离子是化学上或制药学上可接受的。
在这文本中，术语“化学上”涉及化学合成中可使用的阳离子，如离子钠，铵，(C1-C4)四烷基铵，或用于产物的纯化。
有利的阳离子是衍生自碱金属，碱土金属，铵，(C1-C4)四烷基铵，铝和锌的盐。优选的阳离子是钠，钙和四丁基铵离子。
优选的起始材料是链混合物组成的新低分子量-(表)K5-N-硫酸盐，其中优势体具有分子式I’a
Figure A0381893300242
其中，糖醛酸单元是100％葡糖醛酸组成，或者，60-40％葡糖醛酸和40-60％艾杜糖醛酸，p是4-8的整数。这些产物的平均分子量约2000-4000，相应的阳离子是化学上或制药学上可接受的。
尤其，新的低分子量-(表)K5-N-硫酸盐是有用的起始材料，它们由链混合物组成，其中至少90％所述链具有分子式I’，通过上面所示相应(表)K5-N-硫酸盐的亚硝酸解聚得到，随后用硼氢化钠还原。
这些源自亚硝酸解聚步骤的(表)K5-N-硫酸盐，在所述链混合物中链的还原端的大部分，存在2，5-脱水甘露糖单元，或在用硼氢化钠还原的情况下，存在结构(a)的2，5-脱水甘露糖醇
Figure A0381893300251
其中X代表甲酰基团或羟甲基基团。所以，链的还原端的大部分(60-70％)实际上由结构(b)表示
其中X如上面定义的。
结构(a)的存在，对(表)K5-N-硫酸盐及其衍生物的化学特性没有任何影响，因为硫酸化包括一个或两个硫酸盐基团的可能引入，它们不明显的改变O-硫酸化衍生物的硫酸化度。另外，结构(a)的存在不影响产物的生物活性，如stergaard P.B.等人在Thrombosis Research，1987，45，739-749(stergaard 1987)中对低分子量肝素所阐述的。
本发明特别有利的低分子量-(表)K5-N-硫酸盐由链混合物组成，混合物中优势体是分子式I’b的化合物
Figure A0381893300253
其中X是甲酰或羟甲基，m是4，5或6，相应的阳离子是一个化学上或制药学上可接受的离子，糖醛酸单元全是葡糖醛酸或葡糖醛酸和艾杜糖醛酸单元交替地存在，以葡糖醛酸或艾杜糖醛酸单元开始。在这种情况下，葡糖醛酸/艾杜糖醛酸的比从45/55到55/45，即约50/50。
上面所示的所有低分子量-(表)K5-N-硫酸盐，是构成本发明另一目标的新产品。
低分子量-(表)K5-N-硫酸盐，即上面所示的低分子量-K5-N-硫酸盐，不像其他表K5-N-硫酸盐，例如WO 92/17507中表示的，还有本发明的低分子量-表K5-N-硫酸盐，实际上不含N-乙酰基团，不具有抗凝固活性，具有抗自由基的令人感兴趣的活性。由于它们的低毒性，新的低分子量-K5-N-硫酸盐和低分子量-表K5-N-硫酸盐，是制备药学组合物的活性成分，它们可用作局部出血心脏病治疗或光化性皮炎治疗的辅助药物，或在化妆品中用作皮肤抗老化剂。
在上面所示低分子量-(表)K5-N-硫酸盐用作O-过硫酸化反应的起始材料时，在任何优选的情况下，在如上所述的亚硝酸解聚制备中，所述解聚后用硼氢化钠还原，得到以终端单元(a)为特征的低分子量-K5-N-硫酸盐，其中X是羟甲基，因为根据本发明的方法，所述低分子量-(表)K5-N-硫酸盐经硫酸化和酰化反应，它的影响，结构(a)的2，5-脱水甘露糖基团，在甲酰基团上是未知的，其中X表示甲酰。所述起始材料优选以钠盐的形式使用，除非已有按照上述步骤(a)制备的叔或季有机碱，优选四丁基铵盐。
根据本发明，起始的(表)K5-N-硫酸盐-衍生物，优选100％N-硫酸化的，经上面所述步骤(a)和(b)，终止时离析相应的新(表)K5-胺-O-过硫酸盐-衍生物，其中胺是不取代的，通常以钠盐的形式，它可转化成化学上或制药学上可接受的盐。
因此，根据它的另一方面，本发明涉及新的(表)K5-胺-O-过硫酸盐-衍生物和它们的化学上或制药学上可接受的盐，可从特性如下的方法得到：
(a)(表)K5-N-硫酸盐-衍生物，以酸的形式，用叔或季有机碱处理，让反应混合物静置30-60分钟，通过加入所述叔或季有机碱，保持溶液的pH值约7，它的盐用所述有机碱离析；
(b)所述(表)K5-N-硫酸盐-衍生物的有机碱的盐，在O-过硫酸化的条件下，用O-硫酸化试剂处理，离析(表)K5-胺-O-过硫酸盐-衍生物。
这样得到的衍生物通常是平均分子量约4500-40000的(表)K5-胺-O-过硫酸盐-衍生物，以钠盐的形式离析，它可转化成另一个化学上或制药学上可接受的盐。特别有利的盐是碱金属，碱土金属，铵，(C1-C4)四烷基铵，铝和锌的盐，它们中间，优选钠、钙和四丁基铵的盐。
如上面所示，由于K5-N-硫酸盐-衍生物的二糖链中的体积，如上面得到的(表)K5-胺-O-过硫酸盐-衍生物的硫酸化度，取决于起始的(表)K5-N-硫酸盐-衍生物的构型，其中，糖醛酸单元单独由葡糖醛酸组成，使过硫酸化比用(表)K5-N-硫酸盐-衍生物发生的少，尤其，如果后者的表异构化程度是40-60％的葡糖醛酸和60-40％艾杜糖醛酸。
事实上，可以确定，K5-N-硫酸盐-衍生物经上述步骤(a)和(b)，得到硫酸化度2.2-3的K5-胺-O-过硫酸盐-衍生物，优选2.5-3，更优选2.7-2.9。
表K5-N-硫酸盐-衍生物经上述步骤(a)和(b)，其中艾杜糖醛酸含量是总糖醛酸的20-60％，优选40-60％，得到表K5-胺-O-过硫酸盐-衍生物，具有硫酸化度至少为3.4，优选至少3.5，更优选3.55-4，最优选3.55-3.8。
这些(表)K5-胺-O-过硫酸盐-衍生物在制备它们的N-(C1-C4)酰化衍生物中，是作为中间体的有用的产品，作为基本上对凝固参数无活性的、但具有其他令人感兴趣的药理生物性质的活性成分，是制备药物组合物有用的。
对于本发明的(表)K5-胺-O-过硫酸盐-衍生物用作药物组合物的活性成分，它有利于制备低分子量衍生物，平均分子量约3000-11500，优选4500-8500，分子量分布在约2000和10000之间，以及制备高分子量衍生物，从未分级的K5开始，平均分子量约15000-45000，优选在约20000和45000之间，分子量分布从2000-70000。
因此，根据本它的另一方面，发明提供新的、由(表)K5-胺-O-过硫酸盐-衍生物组成的、药物组合物的活性成分，衍生物由至少90％具分子式II链的链混合物组成
Figure A0381893300271
其中，n是2-100的整数，优选3-100，R，R’，R”是氢或SO3 -，糖醛酸单元全部是葡糖醛酸，硫酸化度至少为2.2，优选2.2-3，或者从2.3-3，更优选从2.5-3，最优选2.7-2.9，或者20-60％由艾杜糖醛酸组成，硫酸化度至少为3.4，优选至少3.5，更优选3.55-4，最优选3.55-3.8，相应的阳离子是化学上或制药学上可接受的。
有利的、极其高硫酸化度的(表)K5-胺-O-过硫酸盐-衍生物，由至少90％具分子式II链的链混合物组成，其中糖醛酸单元由40-60％艾杜糖醛酸组成，n是2-100的整数，优选3-100，平均分子量约2000-40000，优选约4500-40000，R至少是40％，优选50-80％SO3 -，R’和R”都是SO3 -，或者一个是氢，另一个是葡糖醛酸单硫酸盐中的5-10％SO3 -和艾杜糖醛酸单硫酸盐中的10-15％SO3 -，硫酸化度大于3.4，相应的阳离子是化学上或制药学上可接受的。
非常高硫酸化度的优选(表)K5-胺-O-过硫酸盐-衍生物，是低分子量-(表)K5-胺-O-过硫酸盐-衍生物，由至少90％具分子式II’链的链混合物组成
其中q是2-20的整数，R，R’，R”是氢或SO3 -，糖醛酸单元由20-60％，优选40-60％的艾杜糖醛酸组成，硫酸化度为3.55-4，相应的阳离子是化学上或制药学上可接受的离子。
特别令人感兴趣的是II’的链混合物，其中糖醛酸单元由40-60％，优选50-55％艾杜糖醛酸组成，R是至少40％，优选50-80％，更优选约65％的SO3 -组成，R’和R”都是SO3 -，或者一个是氢，另一个是葡糖醛酸中的5-10％SO3 -和艾杜糖醛酸中的10-15％SO3 -，n是3-15的整数，平均分子量约4000-8000，相应的阳离子是化学上或制药学上可接受的。
这些低分子量-(表)K5-胺-O-过硫酸盐-衍生物中，优选分子式II’a优势体的链混合物组成的那些衍生物
其中p是4-8的整数，R，R’，R”如上面定义的，硫酸化度为3.55-4，相应的阳离子是化学上或制药学上可接受的离子。
源自低分子量-表K5-N-硫酸盐的新低分子量-表K5-胺-O-过硫酸盐，通过亚硝酸解聚和随后的还原得到，例如用硼氢化钠，包括所述链混合物中链主体的还原端，结构(a’)的硫酸化的2，5-脱水甘露糖醇单元的存在
其中R”代表氢或SO3 -。
因此，所述链混合物中链主体的还原端，由结构(b’)表示
Figure A0381893300291
其中糖醛酸单元可以是葡糖醛酸的或艾杜糖醛酸的。
上述新低分子量-表K5-胺-O-过硫酸盐，优选由这样的混合物组成，其中优势体是分子式IIb’化合物
Figure A0381893300292
其中R，R’和R”是氢或SO3 -，X”是OH或OSO3 -，m是4，5或6，糖醛酸单元由40-60％艾杜糖醛酸组成，硫酸化度3.55-4，艾杜糖醛酸单元交替出现，以葡糖醛酸或艾杜糖醛酸单元开始，相应的阳离子是化学上或制药学上可接受的离子。
根据它的另一方面，发明提供新的K5-胺-O-过硫酸盐-衍生物，它由至少90％分子式III链的链混合物组成
其中，n是2-100的整数，优选3-100，R，R’，R”是氢或SO3 -，硫酸化度至少为2.2，优选2.2-3，更优选从2.5-3，最优选2.7-2.9，相应的阳离子是化学上或制药学上可接受的。
优选的K5-胺-O-过硫酸盐是低分子量-K5-胺-O-过硫酸盐，它由至少90％分子式III’链的链混合物组成
Figure A0381893300294
其中q是2-20的整数，R，R’，R”代表氢或SO3 -，硫酸化度至少为2.2，优选2.2-3，更优选从2.5-3，最优选2.7-2.9，相应的阳离子是化学上或制药学上可接受的离子。
这些低分子量-K5-胺-O-过硫酸盐中，优选分子式III’a优势体的链混合物组成的那些衍生物
Figure A0381893300301
其中p是4-8的整数，R，R’，R”如上面定义的，硫酸化度至少为2.2，优选2.2-3或2.3-3，更优选从2.5-3，最优选2.7-2.9，相应的阳离子是化学上或制药学上可接受的。
源自低分子量-K5-N-硫酸盐的新低分子量-K5-胺-O-过硫酸盐，通过亚硝酸解聚和随后的还原得到，例如用硼氢化钠，包括所述链混合物中链主体的还原端，如上所示结构(a’)的硫酸化的2，5-脱水甘露糖醇单元的存在
其中R”代表氢或SO3 -。
因此，所述链混合物中链主体的还原端，由如上所示结构(b’)表示，其中糖醛酸单元仍然是葡糖醛酸。
上述新低分子量-K5-胺-O-过硫酸盐中，优选由这样的混合物组成，其中优势体是分子式IIIb’化合物
其中R，R’和R”是氢或SO3 -，X”是OH或OSO3 -，硫酸化度至少为2.2，优选2.2-3或2.3-3，更优选从2.5-3，最优选2.7-2.9，m是4，5或6，相应的阳离子是化学上或制药学上可接受的离子。
这些低分子量-K5-胺-O-过硫酸化的，在制备它们的N-硫酸化和N-酰化衍生物中，是作为中间体的有用的新产品，但它们本身具有其他令人感兴趣的药理生物性质，尤其作为抗自由基和杀微生物剂，这样，构成药物组合物的新活性成分，它构成本发明的另一个方面。
尤其，根据它的另一方面，本发明涉及用前面所述(表)K5-胺-O-过硫酸盐-衍生物，以高硫酸化度，制备新N-取代的表K5-胺-O-过硫酸盐-衍生物。
(表)K5-胺-O-过硫酸盐-衍生物经本发明方法的步骤(c)，得到本发明的N-酰基-(表)K5-胺-O-过硫酸盐-衍生物。
这样，根据它另外方面之一，本发明提供新的N-酰基(表)K5-胺-O-过硫酸盐-衍生物，其方法以此为特征：
(a)(表)K5-N-硫酸盐-衍生物，以酸的形式，用叔或季有机碱处理，让反应混合物静置30-60分钟，通过加入所述叔或季有机碱，保持溶液的pH值约7，它的盐用所述有机碱离析；
(b)所述(表)K5-N-硫酸盐-衍生物的有机碱的盐，在O-过硫酸化的条件下，用O-硫酸化试剂处理；
(c)这样得到的产物用(C2-C4)羧酸的官能衍生物处理，离析这样得到的N-酰基-(表)K5-胺-O-过硫酸盐-衍生物。通常N-酰基-(表)K5-胺-O-过硫酸盐-衍生物以钠盐形式离析，所述钠盐转化成另一个化学上或制药学上可接受的盐。
如(表)K5-胺-O-过硫酸盐-衍生物所发生的，如上得到的N-酰基-(表)K5-胺-O-过硫酸盐-衍生物的硫酸化度，也取决于起始的(表)K5-N-硫酸盐-衍生物的构型，由于K5-N-硫酸盐-衍生物的二糖链中的体积，其中，糖醛酸单元单独由葡糖醛酸组成，使过硫酸化比用(表)K5-N-硫酸盐-衍生物发生的少，尤其，如果后者的表异构化程度是40-60％的葡糖醛酸和60-40％艾杜糖醛酸。
事实上，可以确定，K5-N-硫酸盐-衍生物经上述步骤(a)-(c)，得到的N-酰基-K5-胺-O-过硫酸盐-衍生物的硫酸化度2.2-3，优选2.5-3，更优选2.7-2.9。
使表K5-N-硫酸盐-衍生物经上述步骤(a)，(b)和(c)，其中艾杜糖醛酸含量是总糖醛酸的20-60％，得到的N-酰基-(表)K5-胺-O-过硫酸盐-衍生物具有硫酸化度至少为3.4，优选至少3.5，更优选3.5-4，最优选3.55-3.8。
因此，根据它的一个方面，本发明提供酰基是(C2-C4)羧酸的新N-酰基-(表)K5-胺-O-过硫酸盐-衍生物，平均分子量约2000-45000，优选在约4500-40000之间，硫酸化度如上面所示，所述衍生物基本上对凝固参数是无活性的，但它是药物或化妆组合物的有用活性成分。
对于本发明的N-酰基-表K5-胺-O-过硫酸盐-衍生物用作药物或化妆组合物的活性成分，它有利于制备低分子量衍生物，平均分子量约3000-11500，优选4500-8500，分子量分布在约1000和15000之间，优选在约2000-10000，以及制备高分子量衍生物，从未分馏的K5开始，，平均分子量约15000-45000，优选在约20000和45000之间，分子量分布从2000-70000。
在本发明的N-酰基-表K5-胺-O-过硫酸盐-衍生物中，因为每个二糖单元上有4个游离的羟基被硫酸化，至少3.4，优选3.5-3.8，硫酸化程度非常高，而葡糖胺的氮，实际上100％被酰化。此外，N-酰基表-K5-胺-O-过硫酸盐-衍生物在它们的葡糖胺单元中，被100％6-O-硫酸化和50-80％3-O-硫酸化，在葡糖醛酸单元中5-10％3-O-单硫酸化，艾杜糖醛酸单元中10-15％O-单硫酸化，在留下的糖醛酸单元中2.3-二-O-硫酸化，认为硫酸化度至少为3.4。
如上所示，N-酰基-表K5-胺-O-过硫酸盐-衍生物具有硫酸化度2.2-3，并且至少90％6-O-硫酸化的。
根据它的另一方面，发明提供新的N-酰基-表K5-胺-O-过硫酸盐-衍生物，它由至少90％分子式IV链的链混合物组成
其中，糖醛酸单元由20-60％艾杜糖醛酸组成，n是2-100的整数，优选3-100，R，R’，R”是氢或SO3 -，Z是(C2-C4)酰基，硫酸化度至少为3.4，优选至少3.5，更优选从3.55-4，最优选3.55-3.8，相应的阳离子是化学上或制药学上可接受的。
有利的、极高硫酸化度的优选的N-酰基-表K5-胺-O-过硫酸盐，由至少90％具分子式IV链的链混合物组成，其中糖醛酸单元由40-60％艾杜糖醛酸组成，n是2-100的整数，优选3-100，平均分子量约2000-45000，优选约4500-45000，R至少是40％，优选50-80％SO3 -，R’和R”都是SO3 -，或者一个是氢，另一个是葡糖醛酸单硫酸盐中的5-10％SO3 -和艾杜糖醛酸单硫酸盐中的10-15％SO3 -，硫酸化度大于3.4，相应的阳离子是化学上或制药学上可接受的。
特别感兴趣的非常高硫酸化度的N-酰基-表K5-胺-O-过硫酸盐，是N-酰基-低分子量-表K5-胺-O-过硫酸盐，它由至少90％分子式IV’链的链混合物组成
Figure A0381893300331
其中q是2-20的整数，R，R’和R”代表氢或SO3 -基团，硫酸化度为3.55-4，Z是(C2-C4)酰基，相应的阳离子是化学上或制药学上可接受的离子。
分子式IV’的链混合物，其中糖醛酸单元由40-60％，优选50-55％的艾杜糖醛酸组成，R是至少40％，优选50-80％，更优选约65％的SO3 -，R’和R”都是SO3 -，或者一个是氢，另一个是葡糖醛酸中的5-10％SO3 -和艾杜糖醛酸中的10-15％SO3 -，q是3-15的整数，平均分子量约4500-9000，相应的阳离子是化学上或制药学上可接受的。
其他特别感兴趣的N-酰基-表K5-胺-O-过硫酸盐，是分子量非常低的那些，它们由链混合物组成，其中优势体是分子式IV’a的化合物
其中p是4-8的整数，R，R’，R”是氢或SO3 -，硫酸化度为3.55-4，Z是(C2-C4)酰基，相应的阳离子是化学上或制药学上可接受的离子。
源自低分子量-表K5-硫酸盐的新N-酰基-低分子量-K5-胺-O-过硫酸盐，通过亚硝酸解聚和随后的还原得到，例如用硼氢化钠，包括所述链混合物中链主体的还原端，如上定义的，结构(a’)的硫酸化的2，5-脱水甘露糖醇单元的存在，其中R”代表氢或SO3 -。
因此，所述链混合物中链主体的还原端，由结构(b”)表示，
其中Z表示(C2-C4)酰基，糖醛酸单元可以是葡糖醛酸的或艾杜糖醛酸的。
上述新N-酰基-低分子量-表K5-胺-O-过硫酸盐中，优选由这样的混合物组成，其中优势体是分子式IVb’的化合物
Figure A0381893300341
其中R，R’和R”是氢或SO3 -，Z是(C2-C4)酰基，X”是OH或OSO3 -，m是4，5或6，硫酸化度为3.55-4，糖醛酸单元交替出现，以葡糖醛酸单元或艾杜糖醛酸单元开始，相应的阳离子是化学上或制药学上可接受的离子。
所述阳离子特别有利的是碱金属，碱土金属，铵，(C1-C4)四烷基铵，铝和锌，它们中间，优选钠、钙和四丁基铵。
在如上所示的所有N-酰基-表K5-胺-O-过硫酸盐中，尤其分子式IV，IV’，IV’a，IV’b中，而且在结构b”中，酰基基团(z)优选(C2-C4)酰基，选自乙酰基，(2-羧基)乙酰基，(2-甲氧基羰基)乙酰基，(2-乙氧基羰基)乙酰基，丙酰基，(3-羧基)丙酰基，N-(3-甲氧基羰基)丙酰基和(3-乙氧基羰基)丙酰基。
根据它的另一方面，发明提供新的N-酰基-K5-胺-O-过硫酸盐-衍生物，它由至少90％分子式V链的链混合物组成
Figure A0381893300342
其中，n是2-100的整数，优选3-100，Z是(C2-C4)酰基，R，R’和R”是氢或SO3 -，硫酸化度至少为2.2，优选至少2.2-3或2.3-3，更优选从2.5-3，最优选2.7-2.9，相应的阳离子是化学上或制药学上可接受的。
特别感兴趣的是新的N-酰基-低分子量-K5-胺-O-过硫酸盐，由至少90％具分子式V’链的链混合物组成
Figure A0381893300343
其中q是2-20的整数，Z是(C2-C4)酰基，R，R’和R”代表氢或SO3 -，硫酸化度至少为2.2，优选至少2.2-3或2.3-3，更优选从2.5-3，最优选2.7-2.9，相应的阳离子是化学上或制药学上可接受的离子。
这些N-酰基-低分子量-K5-胺-O-过硫酸盐，由链混合物组成，其中优势体是分子式V’a的化合物
其中p是4-8的整数，Z是(C2-C4)酰基，R，R’，R”如上定义的，硫酸化度至少为2.2，优选2.2-3或2.3-3，更优选2.5-3，最优选2.7-2.9，相应的阳离子是化学上或制药学上可接受的。
源自低分子量-K5-硫酸盐的新N-酰基-低分子量-K5-胺-O-过硫酸盐，通过亚硝酸解聚和随后的还原得到，例如用硼氢化钠，包括所述链混合物中链主体的还原端，如上定义的，结构(a’)的硫酸化的2，5-脱水甘露糖醇单元的存在，其中R”代表氢或SO3 -。
因此，所述链混合物中链主体的还原端，由结构(b)表示，
Figure A0381893300352
其中Z，R，R’和R”如上面定义的。
上述新N-酰基-低分子量-K5-胺-O-过硫酸盐中，优选由这样的混合物组成，其中优势体是分子式Vb’的化合物
其中Z是(C2-C4)酰基，R，R’和R”是氢或SO3 -，X”是OH或OSO3 -，硫酸化度至少为2.2，优选2.2-3或2.3-3，更优选2.5-3，最优选2.7-2.9，m是4，5或6，相应的阳离子是化学上或制药学上可接受的离子。
在如上所示的所有N-酰基-K5-胺-O-过硫酸盐中，尤其在分子式V，V’，V’a，V’b中，而且在结构b中，酰基基团(Z)优选(C2-C4)酰基，选自乙酰基，(2-羧基)乙酰基，(2-甲氧基羰基)乙酰基，(2-乙氧基羰基)乙酰基，丙酰基，(3-羧基)丙酰基，N-(3-甲氧基羰基)丙酰基和(3-乙氧基羰基)丙酰基。
特别感兴趣的是上面所示的N-酰基-K5-胺-O-过硫酸盐，其中Z是与乙酰基不同的(C2-C4)酰基。而且，令人感兴趣和特别活泼的是如上所示的N-酰基-K5-胺O-过硫酸盐，其中Z是乙酰基，具有硫酸化度为2.7-2.9，优选约2.8。
新的N-酰基-(表)K5-胺-O-过硫酸盐-衍生物，尤其以它们盐的形式，是能捕获自由基的高阴离子产品。它们用在化妆品工业中作为抗脱发的助剂或制备“抗老化”面霜，但最重要的是用在制药工业中，作为治疗皮炎的药物和作为杀微生物剂。
因此，根据其另一方面，本发明提供制药组合物，作为活性成分之一，把药理上活性量的如上所示的N-酰基-(表)K5-胺-O-过硫酸盐-衍生物，或它的制药学上可接受的盐，包括在与典型制药赋形剂的混合物中。
在本发明的口服、皮下、静脉、透皮或局部给药的制药组合物中，活性成分优选以剂量单位的形式、在与典型药物赋形剂或媒介物的混合物中给药。
根据病人的年龄、体重和健康状况，剂量摄入可有很大变化。剂量摄入包括剂量1-1000毫克，优选10-750毫克，更优选250-500毫克，一日三次静脉、皮下、口服、透皮或局部给药。
本发明还提供化妆品组合物，将有效量的N-酰基-(表)K5-胺-O-过硫酸盐-衍生物或一个制药学上可接受盐与化妆品赋形剂一起包括在混合物中。
此外，本发明提供制药组合物，例如一个活性成分，将根据上面所述步骤(a)和(b)得到的(表)K5-胺-O-过硫酸盐-衍生物，或一个它的制药学上可接受的盐，与药物赋形剂，包括在混合物中。有利地，所述(表)K5-胺-O-过硫酸盐-衍生物由链混合物组成，其中至少90％所述链具有分子式II，II’，III或III’，或其中优势体是分子式IIa，II’a，III’a，或III’b。优选的活性成分是硫酸化度为2.2-3的低分子量-K5-胺-O-过硫酸盐-衍生物，优选平均分子量约3500-11000，更优选约3500-5200，基本上不含N-乙酰基和N-硫酸盐基团。
在本发明的口服、皮下、静脉、透皮或局部给药的制药组合物中，活性成分(表)K5-胺-O-过硫酸盐-衍生物优选以剂量单位的形式、在与典型药物赋形剂或媒介物的混合物中给药。根据病人的年龄、体重和健康状况，摄入剂量可有很大变化。这摄入剂量包括(表)K5-胺-O-过硫酸盐-衍生物剂量1-1000毫克，优选10-750毫克，更优选250-500毫克，一日三次静脉、皮下、口服、透皮或局部给药。
包括如上所示(表)K5-胺-O-个过硫酸盐-衍生物的药物组合物，以不同的给药方式，与典型的赋形剂一起配制。特别有利的是以面霜、药膏、擦剂、凝胶体、泡沫、香液、阴道栓剂、栓剂、溶液或悬浮液形式局部给药。
最后，本发明提供药物组合物，它包含，如一个它的活性成分，药理活性量的低分子量-(表)K5-胺-O-过硫酸盐-衍生物，即，如上所示的低分子量-K5-N-硫酸盐或低分子量-表K5-N-硫酸盐，或一个制药学上可接受的盐，与药物赋形剂的混合物。
在本发明的口服、皮下、静脉、透皮或局部给药的制药组合物中，活性成分优选以剂量单位的形式、在与典型药物赋形剂或媒介物的混合物中给药。
根据病人的年龄、体重和健康状况，剂量摄入可有很大变化。剂量摄入包括剂量1-1000毫克，优选10-750毫克，更优选250-500毫克，一日三次静脉、皮下、口服、透皮或局部给药。
根据它的另一方面，发明还提供化妆品组合物，作为一个活性成分，将有效量的低分子量-K5-N-硫酸盐或低分子量-(表)-N-硫酸盐，或者一个制药学上可接受盐与化妆品赋形剂一起包括在混合物中。
有利地，所述低分子量-(表)K5-N-硫酸盐-衍生物由链混合物组成，其中至少90％所述链具有分子式I或I’，或其中优势体是分子式Ia或I’b。优选的活性成分是低分子量-(表)K5-N-硫酸盐-衍生物，具有平均分子量约1000-12000，优选约1500-8000，更优选约1500-7500，并且基本上无N-不含酰基团。
组成盐的基团选自碱金属或碱土金属，铵，(C1-C4)四烷基铵，铝或锌，尤其钠、钾、钙、镁、铝或锌的盐，组成本发明组合物的有效活性成分。
下列实施例阐述而不限制发明。
制备I
低分子量-表K5-N-硫酸盐
a)K5-N-硫酸盐的表异构化
按WO 02/068477，步骤(i)和(ii)，实施例1所述得到的2克K5-N-硫酸盐，溶解在120毫升25mM HEPES缓冲剂中，pH7，含50mMCaCl2。得到的溶液，通过含固定化酶树脂的50毫升柱循环，酶如WO 96/14425中所述得到。在30℃操作，以200毫升/小时流速流动24小时。得到的产物通过1000D膜超滤，流经离子交换柱IR 120H+，用1N氢氧化钠中和流出液，进行纯化。用乙醇或丙酮通过沉淀回收样品。
以艾杜糖醛酸/葡糖醛酸比55/45，对起始产物的0/100的比，得到表异构化的产物。表异构化的百分率根据WO 96/14425中所述方法，用1H-NMR计算。以咔唑方法(Bitter and Muir Anal.Biochem.39，88-92-1971)，通过测量糖醛酸对标准的含量，计算的收率是90％。
b)表-K5-N-硫酸盐的解聚
1克在步骤(a)中得到的产物，通过用亚硝酸降解方法和随后形成醛的还原，进行解聚。具体情况下，继续溶解产物于25毫升蒸馏水中，并把它加到230毫克亚硝酸钠溶解在115毫升蒸馏水中的溶液中。溶液升至4℃，用0.1N HCl使pH升至2，保持30分钟。反应结束时，溶液升至室温，用0.1M氢氧化钠使pH升至7。然后加入450毫克NaBH4的溶液，反应4小时。用3体积的丙酮于4℃沉淀，用过滤漏斗过滤，在40℃的真空烤箱中干燥，回收产物。得到900毫克低分子量-表K5-N-硫酸盐，用HPLC方法测量的分子量分布1000-4000，葡糖醛酸单元含量45％，艾杜糖醛酸单元含量55％。
制备II
低分子量K5-N-硫酸盐
按WO 02/068477，步骤(i)和(ii)，实施例1所述得到的产物，通过用亚硝酸降解和随后形成醛的还原，进行解聚。继续将1克K5-N-硫酸盐溶解在200毫升蒸馏水中，并把它加入480毫升亚硝酸钠溶解在240毫升蒸馏水中的溶液中。溶液升至4℃，用0.1N HCl将pH升至2，保持30分钟。反应结束时，用0.1M氢氧化钠使溶液pH升至7，然后，温度升至室温，。然后加入450毫克NaBH4的溶液，反应4小时。过量的NaBH4用HCl消除，pH升至5-6。产物，用0.1M NaOH中和，用3体积4℃的丙酮沉淀，用过滤漏斗过滤，在40℃的真空烤箱中干燥，回收产物。得到900毫克低分子量-K5-N-硫酸盐，平均分子量约2000，由链混合物组成，其中优势体是分子式I’b，其中m是4，糖醛酸单元是葡糖醛酸单元。
制备III
(a)K5-N-硫酸盐的解聚
按WO 02/068477，步骤(i)和(ii)，实施例1所述得到的2克K5-N-硫酸盐，如制备III中所述，用100毫克亚硝酸钠和300毫克硼氢化钠解聚，得到1.8克低分子量-K5-N-硫酸盐，平均分子量5000。
(b)K5-N-硫酸盐的表异构化
1克在实施例1步骤(a)中得到的低分子量-K5-N-硫酸盐，按实施例1步骤(a)中所述处理。以艾杜糖醛酸/葡糖醛酸比44/56，对起始产物的0/100的比，得到表异构化的产物，分子量分布2000-10000，平均分子量5000D。以咔唑方法(Bitter and Muir Anal.Biochem.39，88-92-1971)，通过测量糖醛酸对标准的含量，计算的收率是90％。
制备IV
表K5-N-硫酸盐的制备
按WO 02/068477，步骤(i)和(ii)，实施例1所述得到的10克K5-N-硫酸盐，在600毫升25mM HEPES缓冲剂、pH7、在50mM浓度含CaCl2的溶液中，通过50毫升填充有Sepharose 4B树脂、含5克重组体C5-表异构酶(WO96/14425)、按WO 01/72848固定的柱上循环。反应在30℃，pH7，以200毫升/小时流动24小时进行。得到的产物通过超滤和用乙醇沉淀纯化。这样得到艾杜糖醛酸含量54％的表K5-N-硫酸盐。
制备V
低分子量-表K5-N-硫酸盐的制备
1克制备I中得到的产物，通过用亚硝酸的降解方法和随后形成醛的还原，进行解聚。在特殊的情况下，继续溶解产物在25毫升蒸馏水中，并把它加到230毫克亚硝酸钠溶解在115毫升蒸馏水中的溶液中。溶液升至4℃，用0.1N HCl使pH为2，保持30分钟。反应结束时，溶液升至室温，用0.1M氢氧化钠使pH调至7。然后加入450毫克NaBH4的溶液，反应4小时。用3体积4℃的丙酮沉淀，用过滤漏斗过滤，在40℃的真空烤箱中干燥，回收产物。得到900毫克低分子量-表K5-N-硫酸盐，用HPLC方法测量的分子量分布1000-4000。
实施例1
表K5-按-O-过硫酸盐
(a)表K5-N-硫酸盐的四丁基铵盐
400毫克在制备IV中得到的、艾杜糖醛酸含量54％的表K5-N-硫酸盐在40毫升水中的溶液，恒温于4℃，然后流经用4℃水预调的离子交换树脂IR 120H+。得到的流出液，由100毫升pH1.94的溶液组成，用15％氢氧化四丁基铵的溶液中和，在室温保留1小时，通过加入15％氢氧化四丁基铵保持pH为7，最后冻干。得到805毫克表K5-N-硫酸盐的四丁基铵盐。
(b)表-K5-胺-O-过硫酸盐
把30毫升二甲基甲酰胺(DMF)中含805毫克这样得到盐的溶液，调节到55℃，并用含2.26克吡啶.SO3加合物的30毫升DMF处理。在55℃反应过夜，然后在混合物中加入60毫升水。用1N氢氧化钠中和后，用3体积氯化钠饱和的丙酮沉淀，在4℃过夜。在guch G4上过滤，然后用1000D Millipore TFF系统超滤，回收沉淀物，并减压干燥。得到550毫克表-K5-胺-O-过硫酸盐，艾杜糖醛酸含量54％，葡糖胺-6-O-硫酸盐100％，葡糖胺3-O-硫酸盐60％，葡糖醛酸单硫酸盐10％，艾杜糖醛酸单硫酸盐15％，其余的糖醛酸单元被二硫酸化，根据Casu等人1975的电导测定方法测量的硫酸化度为3.55。
实施例2
N-乙酰基-表K5-胺-O-过硫酸盐
冷却到4℃的、250毫克实施例1中得到的表-K5-胺-O-过硫酸盐在75毫升水的溶液中，加入7.5毫升甲醇和3.75毫升乙酸酐。在4℃保持反应2小时，用5M氢氧化钠保持pH在7。在1000D膜上超滤后，加入3体积氯化钠饱和的丙酮，在5000转/分钟离心5’，回收沉淀物。这样得到249毫克N-乙酰基-表K5-胺-O-过硫酸盐，艾杜糖醛酸含量54％，葡糖胺-6-O-硫酸盐100％，N-乙酰基100％，葡糖胺3-O-硫酸盐60％，葡糖醛酸单硫酸盐10％，艾杜糖醛酸单硫酸盐15％，其余的糖醛酸胺单元被二硫酸化，根据Casu等人1975的电导测定方法测量的硫酸化度为3.5。
实施例3
N-乙酰基-K5-胺-O-过硫酸盐
1克WO/02068477的实施例2中得到的K5 N，O过硫酸盐，溶解在200毫升水中，用1N HCl调节溶液到pH2，恒温在50℃。在50℃保持反应3小时，然后冷却到室温，并用1N氢氧化钠中和。然后样品冷却到4℃，将20毫升MeOH和10毫升乙酸酐加入反应，保留在4℃2小时，pH保持恒定在7。在反应结束时，样品从盐纯化，通过用1000D膜超滤，然后减压干燥回收。得到100％N-乙酰化的产品，得到100％6-O硫酸盐，葡糖醛酸上30％单硫酸盐和70％二硫酸盐。

Claims (59)

1.制备N-酰基-(表)K5-胺-O-过硫酸盐-衍生物及其化学上或制药学上可接受盐的方法，特征在于：
(a)(表)K5-N-硫酸盐-衍生物，以酸的形式，用叔或季有机碱处理，让反应混合物静置30-60分钟，保持溶液的pH值约7，它的盐用所述有机碱离析；
(b)所述(表)K5-N-硫酸盐-衍生物的有机碱的所述盐，在O-过硫酸化的条件下，用O-硫酸化试剂处理；
(c)这样得到的(表)K5-N-过硫酸盐-衍生物，用(C2-C4)羧酸的官能衍生物处理，离析N-酰基-(表)K5-胺-O-过硫酸盐-衍生物。
2.如权利要求1中所述的方法，其特征在于：所述N-酰基-(表)K5-N，O-过硫酸盐-衍生物以钠盐的形式离析，并任选转化成另一个化学上或制药学上可接受的盐。
3.如权利要求1和2中的任何一项所述的方法，其特征在于：在步骤(a)中氢氧化四丁基铵用作有机碱。
4.如权利要求1-3中的任何一项所述的方法，其特征在于：在步骤(b)中，用2-4摩尔O-硫酸化试剂可用的/OH/二糖，温度40-60℃，在二甲基甲酰胺中进行O-过硫酸化15-20小时。
5.如权利要求1-4中任何一项所述的方法，其特征在于：作为起始材料，使用具有平均分子量约1000-25000的(表)K5-N-硫酸盐-衍生物。
6.如权利要求1-5中的任何一项所述的方法，其特征在于：所述起始材料是40-60％C5-表异构化的。
7.如权利要求1-6中的任何一项所述的方法，其特征在于：所述起始材料的平均分子量约为1500-25000。
8.如权利要求7中所述的方法，其特征在于：所述起始材料的平均分子量约为10000-25000。
9.如权利要求7中所述的方法，其特征在于：所述起始材料的平均分子量约为1500-12000。
10.如权利要求9中所述的方法，其特征在于：所述起始材料的平均分子量约为1500-8000。
11.如权利要求5中所述的方法，其特征在于：用作起始材料的(表)K5-N-硫酸盐-衍生物由链混合物组成，链混合物至少90％所述链具有分子式I
其中，葡糖醛酸单元/艾杜糖醛酸单元的比，从100/0-40/60，n是2-100的整数，相应的阳离子是化学上或制药学上可接受的。
12.如权利要求11中所述的方法，其特征在于：所述起始材料是由至少90％所述分子式I链的链混合物组成，其中，糖醛酸单元由40-60％艾杜糖醛酸组成。
13.如权利要求11中所述的方法，其特征在于：所述起始材料是由至少90％所述分子式I链的链混合物组成，其中，糖醛酸单元全部由葡糖醛酸构成或由40-60％艾杜糖醛酸组成，n是3-15的整数，相应阳离子是化学上可接受的。
14.如权利要求11中所述的方法，其特征在于：所述起始材料是由至少90％所述分子式I’链的链混合物组成的低分子量-(表)K5-N-硫酸盐，
Figure A038189330003C2
其中，糖醛酸单元由100％葡糖醛酸组成，或由60-40％葡糖醛酸和40-60％艾杜糖醛酸组成，q是2-20的整数，相应阳离子是化学上或制药学上可接受的。
15.如权利要求11中所述的方法，其特征在于：所述起始材料是由优势体为分子式I’a的链混合物组成的低分子量-(表)K5-N-硫酸盐，
其中，糖醛酸单元由100％葡糖醛酸组成，或由60-40％葡糖醛酸和40-60％艾杜糖醛酸组成，p是4-8的整数。
16.如权利要求5-15中的任何-项所述的方法，其特征在于：所述起始材料是相应(表)K5-N-硫酸盐经亚硝酸解聚和随后还原而得到的低分子量-(表)K5-N-硫酸盐。
17.如权利要求16中所述的方法，其特征在于：所述起始材料低分子量-(表)K5-N-硫酸盐，在所述链混合物的链的大部分还原端，含有结构(a)的2，5-脱水甘露糖单元，
Figure A038189330004C1
其中X代表羟甲基。
18.如权利要求16和17中的任一项所述的方法，其特征在于：用作所述起始材料低分子量-(表)K5-N-硫酸盐，由优势体为分子式I’b的链混合物组成
Figure A038189330004C2
其中，X是羟甲基，m是4，5或6，相应阳离子是化学上或制药学上可接受的离子，糖醛酸单元全部由葡糖醛酸组成，或葡糖醛酸和艾杜糖醛酸交替出现，以葡糖醛酸或艾杜糖醛酸单元开始。
19.如权利要求1-18中的任何一项所述的方法，其特征在于：所述起始材的(表)K5-N-硫酸盐-衍生物，以钠盐形式使用。
20.N-酰基-(表)K5-胺-O-过硫酸盐-衍生物，可根据权利要求1-19中所述的方法得到。
21.如权利要求20中所述的N-酰基-(表)K5-胺-O-过硫酸盐-衍生物，是以碱金属或碱土金属，铵，(C1-C4)四烷基铵，铝或锌盐的形式存在的。
22.N-酰基-(表)K5-胺-O-过硫酸盐-衍生物，其中酰基是(C2-C4)酰基，艾杜糖醛酸含量20-60％，平均分子量约2000-45000，硫酸化度至少为3.4，或它的化学上或制药学上可接受盐之一。
23.如权利要求22中所述的N-酰基-(表)K5-胺-O-过硫酸盐-衍生物，它的平均分子量约为15000-45000。
24.如权利要求22中所述的N-酰基-(表)K5-胺-O-过硫酸盐-衍生物，它的平均分子量约为4500-8500。
25.如权利要求22-24中的任何一项所述的N-酰基-(表)K5-胺-O-过硫酸盐-衍生物，其特征在于：所述硫酸化度为3.4-3.8。
26.N-酰基-表K5-N-硫酸盐-衍生物由链混合物组成，其中至少90％所述链具有分子式IV
其中，糖醛酸单元由20-60％艾杜糖醛酸组成，n是2-100整数，R，R’和R”是氢或SO3 -，Z是(C2-C4)酰基，硫酸化度至少为3.4，相应的阳离子是化学上或制药学上可接受的。
27.如权利要求26中所述的N-酰基-(表)K5-胺-O-过硫酸盐-衍生物，其特征在于：它由至少90％具有分子式IV所述链的链混合物组成，其中糖醛酸单元由40-60％艾杜糖醛酸组成，n是3-100整数，平均分子量约2000-45000，R至少40％是SO3 -，R’和R”都是氢或一个是氢，另一个是葡糖醛酸单硫酸盐中5-10％的SO3 -和艾杜糖醛酸单硫酸盐中10-15％的SO3 -，相应的阳离子是化学上或制药学上可接受的。
28.如权利要求26和27中的任何一项所述的N-酰基-(表)K5-胺-O-过硫酸盐-衍生物，其特征在于：它是低分子量-N-酰基-(表)K5-O-过硫酸盐，由至少90％具分子式IV’所述链的链混合物组成，
Figure A038189330005C2
其中q是2-20整数，R，R’和R”代表氢或SO3 -基团，硫酸化度为3.55-4，Z是(C2-C4)酰基，相应的阳离子是化学上或制药学上可接受的。
29.如权利要求28中所述的低分子量-N-酰基-(表)K5-O-过硫酸盐-衍生物，其特征在于：分子式(IV’)的所述链混合物中，羰醛酸单元由50-55％的艾杜糖醛酸组成，R至少40％是SO3 -，R’和R”都是氢或一个是氢，另一个是葡糖醛酸中5-10％的SO3 -和艾杜糖醛酸中10-15％的SO3 -，q是3-15的整数，平均分子量约4500-9000，相应的阳离子是化学上或制药学上可接受的。
30.如权利要求28和29中的任何一项所述的低分子量-N-酰基-(表)K5-O-过硫酸盐，其特征在于：它是由优势体为分子式IV’a化合物的链混合物组成
其中p是4-8的整数，R，R’和R”是氢或SO3 -基团，硫酸化度为3.55-4，Z是(C2-C4)酰基，相应的阳离子是化学上或制药学上可接受的。
31.如权利要求30中所述的低分子量-N-酰基-(表)K5-O-过硫酸盐，其特征在于：所述优势体为分子式IV’b的化合物
Figure A038189330006C2
其中R，R’和R”是氢或SO3 -基团，Z是(C2-C4)酰基，X”是OH或OSO3-，m是4，5或6，硫酸化度为3.55-4，糖醛酸单元交替出现，以葡糖醛酸或艾杜糖醛酸单元开始，相应的阳离子是化学上或制药学上可接受的。
32.如权利要求22-31中的任何一项所述的低分子量-N-酰基-(表)K5-O-过硫酸盐，其特征在于：取代基(C2-C4)酰基选自乙酰基，(2-羧基)乙酰基，(2-甲氧基羰基)乙酰基，(2-乙氧基羰基)乙酰基，丙酰基，(3-羧基)丙酰基，(3-甲氧基羰基)丙酰基，和(3-乙氧基羰基)丙酰基。
33.如权利要求22-32中的任何一项所述的N-酰基-(表)K5-胺-O-过硫酸盐，其特征在于：所述盐或相应的阳离子是碱金属或碱土金属，铵，(C1-C4)四烷基铵，铝或锌。
34.N-酰基-K5-胺-O-过硫酸盐-衍生物由链混合物组成，其中至少90％的所述链具有分子式V链
Figure A038189330006C3
其中，n是2-100整数，Z是(C2-C4)酰基，R，R’和R”是氢或SO3 -，硫酸化度至少为2.2，相应的阳离子是化学上或制药学上可接受的。
35.如权利要求34中所述的N-酰基-K5-胺-O-过硫酸盐-衍生物，其特征在于：它是低分子量-N-酰基-K5-胺-O-过硫酸盐，由至少90％具分子式V’所述链的链混合物组成，
Figure A038189330007C1
其中q是2-20整数，Z是(C2-C4)酰基，R，R’和R”代表氢或SO3 -基团，硫酸化度为2.2-3，相应的阳离子是化学上或制药学上可接受的。
36.如权利要求35中所述的低分子量-N-酰基-K5-胺-O-过硫酸盐，其特征在于：它是由优势体为分子式V’a化合物的链混合物组成，
Figure A038189330007C2
其中p是4-8的整数，Z是(C2-C4)酰基，R，R’和R”代表氢或SO3 -基团，硫酸化度为2.2-3，相应的阳离子是化学上或制药学上可接受的。
37.如权利要求36中所述的低分子量-N-酰基-K5-胺-O-过硫酸盐，其特征在于：所述优势体为分子式IV’b的化合物
Figure A038189330007C3
其中Z是(C2-C4)酰基，R，R’和R”是氢或SO3 -，X”是OH或OSO3 -，硫酸化度为2.2-3，m是4，5或6，相应的阳离子是化学上或制药学上可接受的离子。
38.如权利要求34-37中的任何一项所述的N-酰基-K5-胺-O-过硫酸盐-衍生物，其特征在于：所述硫酸化度是2.3-3。
39.如权利要求38中所述的N-酰基-K5-胺-O-过硫酸盐-衍生物，其特征在于：所述硫酸化度是2.5-3。
40.如权利要求39中所述的N-酰基-K5-胺-O-过硫酸盐-衍生物，其特征在于：所述硫酸化度是2.7-2.9。
41.如权利要求34-40中所述的N-酰基-K5-胺-O-过硫酸盐-衍生物，其特征在于：取代基(C2-C4)酰基不同于乙酰基。
42.如权利要求34-40中的任何一项所述的N-酰基-K5-胺-O-过硫酸盐-衍生物，其特征在于：取代基(C2-C4)酰基是乙酰基，具有硫酸化度2.7-2.9。
43.如权利要求42中所述的N-酰基-K5-胺-O-过硫酸盐-衍生物，其特征在于：具有硫酸化度约2.8。
44.如权利要求34-43中的任何一项所述的N-酰基-K5-胺-O-过硫酸盐-衍生物，其特征在于：所述盐或相应阳离子是碱金属或碱土金属，铵，(C1-C4)四烷基铵，铝或锌。
45.药物组合物，包含，作为其活性成分之一，(表)K5-胺-O-过硫酸盐-衍生物或其制药学上可接受盐之一，按权利要求1步骤(a)和(b)的方法得到，以钠盐的形式离析，并任选转化成制药学上可接受盐，与制药赋形剂混合。
46.如权利要求45中所述的组合物，其特征在于：所述活性成分是具有平均分子量约4500-40000的(表)K5-胺-O-过硫酸盐-衍生物。
47.如权利要求45或46所述的药物组合物，其特征在于：所述活性成分是(表)K5-胺-O-过硫酸盐-衍生物，它由至少90％具分子式II链的链混合物组成
Figure A038189330008C1
其中，n是2-100整数，R，R’和R”是氢或SO3 -，糖醛酸单元全部是葡糖醛酸，硫酸化度为2.2-3，或由20-60％艾杜糖醛酸组成，硫酸化度至少为3.4，相应的阳离子是制药学上可接受的。
48.如权利要求47中所述的药物组合物，其特征在于：所述活性成分是低分子量-(表)K5-胺-O-过硫酸盐，它由至少90％具分子式II链的链混合物组成
Figure A038189330009C1
其中，q是2-20整数，R，R’和R”是氢或SO3 -，糖醛酸单元包括20-60％艾杜糖醛酸，优选40-60％，硫酸化度为3.55-4。
49.如权利要求48中所述的药物组合物，其特征在于：在所述分子式II’的链混合物中，糖醛酸单元由40-60％艾杜糖醛酸组成，R是至少40％SO3 -，R’和R”都是SO3 -或一个是氢，另一个是葡糖醛酸中的5-10％SO3 -和艾杜糖醛酸中的10-15％SO3 -，n是3-15整数，平均分子量约4000-8000。
50.如权利要求48或49所述的药物组合物，，其特征在于：所述低分子量-(表)K5-胺-O-过硫酸盐，由优势体具分子式II’a的链混合物组成
Figure A038189330009C2
其中，p是4-8整数，R，R’和R”如上定义的，硫酸化度为3.55-4，相应的阳离子是制药学上可接受的。
51.如权利要求50中所述的药物组合物，其特征在于：所述优势体为分子式II’b的化合物
Figure A038189330009C3
其中，R，R’和R”是氢或SO3 -，X”是OH或OSO3 -，m是4，5或6，糖醛酸单元由40-60％艾杜糖醛酸组成，硫酸化度为3.55-4，艾杜糖醛酸单元交替出现，以葡糖醛酸的或艾杜糖醛酸单元开始，相应的阳离子是化学上或制药学上可接受的离子。
52.如权利要求45中所述的药物组合物，作为其活性成分之-，包括K5-胺-O-过硫酸盐-衍生物，它由至少90％具分子式III链的链混合物组成
Figure A038189330010C1
其中，n是2-100整数，R，R’和R”是氢或SO3 -，硫酸化度至少为2.2，相应的阳离子是制药学上可接受的。
53.如权利要求52中所述的药物组合物，其特征在于：所述其活性成分是低分子量-K5-胺-O-过硫酸盐，它由至少90％具分子式III’链的链混合物组成
其中，q是2-20整数，R，R’和R”代表氢或SO3 -基团，硫酸化度至少为2.2。
54.如权利要求53中所述的药物组合物，其特征在于：所述低分子量-K5-胺-O-过硫酸盐由具分子式III’a优势体的链混合物组成
其中，p是4-8整数，R，R’和R”如上定义的，硫酸化度为2.2-3。
55.如权利要求50中所述的药物组合物，其特征在于：所述优势体为分子式III’b的化合物
其中，R，R’和R”是氢或SO3 -，X”是OH或OSO3 -，硫酸化度为2.2-3，m是4，5或6，相应的阳离子是制药学上可接受的离子。
56.如权利要求45-54中的任何一项所述的药物组合物，其特征在于：所述制药学上可接受盐或阳离子是钠、钾、钙、镁或锌。
57.如权利要求45-56中的任何一项所述的药物组合物，其特征在于：它是以面霜、药膏、擦剂、凝胶体、泡沫、香液、阴道栓剂、栓剂、溶液或悬浮液形式局部给药。
58.药物组合物，含有，作为活性成分之一的药学活性量的、基本上不含乙酰基的低分子量-(表)K5-N-硫酸盐，或其制药学上可接受盐之一，与药物赋形剂混合。
59.含有权利要求1-10和25-37的任何一项所述有效量的低分子量-(表)K5-N-硫酸盐化妆品组合物，其特征在于：所述盐或阳离子是药学上可接受的，它与化妆品赋形剂混合。
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