CN1678628A - 应激蛋白和肽及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了HLA泛DR肽和使用这些肽在免疫介导疾病和状况如炎症和自身免疫疾病、癌症和微生物感染中来调制、阻断或抑制免疫应答的方法。这些肽和方法可用于筛选诊断上有用的肽或肽类似物，其能够抑制病原性免疫应答或者上调针对异常或侵入细胞的免疫应答，可用于监控效力或治疗用途，并且可以鉴定可以有效地抑制或调制免疫应答的其它试剂。

Description

应激蛋白和肽及其使用方法
发明领域
本发明涉及新颖的应激相关肽及其使用方法。更明确地说，本发明提供了新颖的热休克蛋白(hsp)肽序列，其在调制免疫介导疾病中的炎症反应中有用，这些疾病的范围是从自身免疫疾病到癌症到感染性疾病。
背景技术
脊椎动物有能力对来自环境中的病原体以及对异常细胞如肿瘤细胞发动起防御作用的免疫应答，其中异常细胞是在体内发展的。这可以采取先天免疫的形式，先天免疫由天然杀伤细胞(NK细胞)、嗜中性白细胞和单核细胞/巨噬细胞系的细胞介导，或者可以采取由淋巴细胞介导的针对特定抗原的后天免疫或自动免疫的形式。自动免疫应答可以被进一步细分为两个作用，即体液应答和细胞作用，体液应答必需产生特定抗体，其中特定抗体能用于中和暴露于体循环中的抗原，也能有助于它们被消化性吞噬细胞摄取，细胞作用需要识别体内的感染细胞或异常细胞。通常这些免疫应答导致疾病和对生物体本身有害的病症。这些病症与将自身蛋白和自身细胞识别为外源物质相关，因而激发针对这些细胞或细胞蛋白的攻击。一般的自身免疫病症包括，例如牛皮癣、关节炎、狼疮、糖尿病以及本领域已知的其它疾病。
关于自身免疫疾病如I型糖尿病的发病机理的最可能的模式之一可能在于自身反应T细胞的不正常调节，其原因或者在于旁立者激活(bystander activation)或者在于分子模拟。例如，病毒性感染或暴露于超抗原可以提供足够的共刺激作用，导致非常少的低亲和力自身反应性T细胞的激活，它们逃脱了胸腺选择。这些自身反应性应答的不正常下调可能导致致病T细胞的扩散，使得这些细胞渗透进存在识别抗原的器官中。一些宿主相关因子有助于非致病自身反应性和自身免疫疾病之间的转变：允许更多的自身反应前体逃脱的渗漏性中枢负选择；由于包括由淋巴细胞活性的下调所介导的受体或配体的异常性所致的受损的外周耐受性；倾向于产生TH1前炎症应答，而不是更加平衡的TH1/TH2应答；消化性抗原呈递细胞(APC)的高频率和不正常活性。局部炎症和宿主细胞的直接破坏激活抗原释放，由消化性APC摄取，以及呈递至特定的T细胞，从而维持使自身免疫恶化的正反馈。同时，通常隐藏的与器官有关的抗原可能暴露在造成消化性抗原呈递细胞激活和抗原释放的环境中，导致对这些其它自身抗原来说是特定的T细胞的激活。尤其在有助于整个TH1/TH2不平衡的情况下，使用额外特异性可能会加速疾病。普遍认为，尽管TH1细胞因子如IFN-K有利于自身免疫的发病机理，但TH2细胞因子如IL-4和IL-10可能抑制致病TH1或Tc1细胞的活性。
热休克蛋白(hsp)是高度保守蛋白，其在多个细胞过程中担任着重要的角色。hsp是应激蛋白，在细胞应激过程中通常被上调。除此之外，已经表明hsp是免疫显性的。那些hsp的独特特性(进化保守、免疫优势和应激过程中的上调)已经使hsp成为免疫疗法和疫苗的靶物质的有吸引力的候补物质。实际上，目前已经在不同疾病模型中提出了hsp免疫反应性的作用，这些疾病从癌症到感染性疾病到自身免疫疾病而有所不同。Hsp在炎症疾病的免疫调节中的作用的许多证据来自于慢性关节炎模型。该研究已经表明用hsp10；hsp60和hsp70免疫都可以在实际上在所有实验性关节炎模型中赋予保护。在佐剂性关节炎模型中，hsp的免疫反应性在疾病诱导和提供保护不受疾病之害中都起着作用。另一方面，已表明佐剂性关节炎可以通过T细胞克隆的方式来诱导，称作A2b，其对分枝杆菌hsp60 180-188而言是特异的。另一方面，后期研究表明用分枝杆菌hsp60幼儿期免疫接种可以有效地防止遭受疾病诱导的攻击。然而，在用hsp60免疫后，发现几个抗原决定簇被免疫系统识别。有意思的是，发现在八个抗原决定簇中只有一个抗原决定簇(分枝杆菌hsp60 256-270)能诱导保护。该保护基于(自身hsp)交叉反应T细胞的诱导。这样从佐剂性关节炎的动物模型的数据中，就形成了在关节炎的调节中，即在提供保护不受疾病之害和疾病诱导中，针对hsp的免疫反应性具有重要的角色。不同抗原决定簇具有完全相反的效果的事实强调了确定肽T细胞抗原决定簇的重要性，这在人类系统中也具有重要性。
在过去的10多年里，已经清楚，hsp的免疫反应性也在人类慢性关节炎中起着至关重要的作用，称作青少年型自发性关节炎(JIA)和类风湿性关节炎(RA)。首先，在JIA和RA患者的滑膜覆盖型细胞中检测到了hsp60的表达递增。其次，在两种疾病中都发现了T细胞针对自身和非自身hsp60的反应性。同样地，在JIA和RA患者中检测到了针对其它hps如hsp70和DnaJ的免疫反应性。在患有JIA的儿童中，针对自身hsp60的免疫反应性似乎预示了有利的预后。因此，期望在免疫介导疾病中针对hsp的炎症应答的调制，这些疾病从自身免疫疾病到癌症到感染性疾病。
发明概述
本发明通过提供基本上纯的人类白细胞抗原(HLA)泛DR-结合肽克服了本领域的许多问题，这些肽包括与II类主要组织相容性复合物分子(II类MHC分子)结合的应激蛋白的片断。
在一个实施方案中，本发明提供了在患有疾病或处于患病风险的被试者中治疗或预防免疫介导疾病的方法，该方法包括将有效量的基本上纯的肽施用于被试者，这些肽包括存在于药物上可接受的载体中的一种能与一种或多种II类MHC分子结合的应激蛋白的片断，其中所述肽调制免疫应答，从而治疗或预防该疾病。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种药物组合物，包括在药物上可接受的载体中的一种或多种本发明的HLA泛DR-结合肽。
仍然在另一个实施方案中，本发明提供了编码本发明的HLA泛DR-结合肽的分离的核酸序列。
仍然在另一个实施方案中，本发明提供了在被试者中诱导免疫应答的方法，所述方法包括将有效量的基本上纯的HLA泛DR-结合肽施用于被试者，这种肽包括能与一种或多种II类MHC分子结合的应激蛋白的片断。
附图简述
图1表明在来自80个青少年型自发性关节炎患者的细胞中针对泛DR结合hsp60肽的T细胞增殖反应。Y轴是刺激指数(S)，定义为在加有用抗原培养细胞的孔中的每分钟平均计数(CPM)除以加有单独用培养基培养细胞的孔中的平均cpm。X轴所示为分析中测试的不同抗原：(从左到右)全分枝杆菌hsp60(Mhsp)，全人类hsp60(Hhsp60)，p1(分枝杆菌254-268)，p2(人类280-294)，p3(分枝杆菌216-230)，p4(人类242-256)，p5(分枝杆菌210-224)，p6(人类236-250)，p7(分枝杆菌503-517)，和p8(人类535-546)。
图2表示用泛DR结合hsp60肽进行体外培养后，IL-10的抗原特异性产量。Y轴上所示为响应不同肽的IL-10(pg/ml)的产量。X轴上是该研究中所用的不同抗原：(从左到右)全分枝杆菌hsp60(M hsp)，全人类hsp60(H hsp)，破伤风，和泛DR结合肽p1-p8(p1(分枝杆菌254-268)，p2(人类280-294)，p3(分枝杆菌216-230)，p4(人类242-256)，p5(分枝杆菌210-224)，p6(人类236-250)，p7(分枝杆菌503-517)，和p8(人类535-546))。
图3表明在用泛DR结合hsp60肽进行体外培养后，干扰素-γ(IFN-γ)的抗原特异性产量。Y轴上所示为响应不同肽的干扰素-γ(pg/ml)的产量。X轴上是该研究中所用的不同抗原：全分枝杆菌hsp60(M hsp)，全人类hsp60(H hsp)，破伤风，和泛DR结合肽(p1-p8)。阴性对照组肽分枝杆菌hsp60 256-270不诱导任何细胞因子的产生。
图4表明在用泛DR结合hsp60肽进行体外培养后，TNF-α的抗原特异性产量。Y轴上所示为响应不同肽的TNF-α(pg/ml)的产量。X轴上是该研究中所用的不同抗原：全分枝杆菌hsp60(M hsp)，全人类hsp60(H hsp)，破伤风，和泛DR结合肽p1-p8。阴性对照组肽分枝杆菌hsp60 256-270不诱导任何细胞因子的产生。
图5表明在来自18个JIA患者的细胞中响应本发明的hsp60肽的免疫识别(被定义为T-细胞增殖和/或细胞因子的产生)。
图6表示与基于泛DR结合(p1，分枝杆菌254-268，和p2，人类280-294)的本发明的两个肽相比，由肽256-270诱导的免疫反应性的比较。右边的Y轴描述了刺激指数，左边的Y轴描述了以pg/ml为单位的细胞因子的产量。
图7A-E由一系列图构成，这些图表明了针对dnaJP1的T细胞应答的治疗诱导调制。图7A表示T细胞增殖反应：用10μg/ml的dnaJP1肽将来自病人(n＝7)的外周血单个核细胞(PBMC)刺激5天时间。以每月一次的时间间隔进行评价。对照组包括作为一般性促细胞分裂原的植物血凝素(PHA)和dnaJpV。图7B-E表示通过病人的PBMC细胞，以每月为时间间隔，用荧光激活细胞分类术(FACS)以胞内细胞因子的产量进行评价(促炎细胞因子：图7B-D；耐受原细胞因子：图7E)，其中病人在对dnaJP1肽筛选中做出了响应。图7B：IL-2，n＝6；图7C：IFN-γ，n＝8；图7D：TNF-α，n＝6；图7E：IL-4和IL-10，n＝4。结果以dnaJP1刺激-未刺激的培养物中的CD3+细胞的百分比表示。(*＝p.＜0.05)
图8表示了针对用dnaJ肽治疗的被试者的RADAR调查表的结果。(*＝p.＜0.05)
图8B-E表示在用dnaJ肽治疗的被试者中触痛性和肿胀性关节数(n＝13)。图8A表示触痛性关节数；图8B表示肿胀性关节数。测量以每月为时间间隔进行。(*＝p.＜0.05)
发明详述
本发明提供了新颖的肽序列，其调制T细胞响应，由于该肽与多种MHC分子能够滥交结合和呈递。在一个实施方案中，本发明的肽呈递增强导致免疫识别的可能性增强，因此这些肽是调制免疫应答的分子的理想候补物，如疫苗和炎症反应的调制剂，其中免疫应答被下调，以及癌症和感染性疾病药物，其中免疫应答被上调以加强人体对异常细胞的攻击。
在佐剂性关节炎中的分枝杆菌hsp60的不同抗原决定簇的对立角色使得必须确定JIA和RA患者中hsp60的肽T-细胞抗原决定簇。基于在动物模型中收集的数据，已进行了多种尝试在JIA患者中鉴定T细胞抗原决定簇。然而，基于来自佐剂性关节炎模型的数据，对于潜在抗原决定簇的预测证明了在人体系统中鉴定T细胞抗原决定簇是无效的。尤其在患有JIA的情况下，JIA患者的异源HLA背景妨碍了对潜在的hsp60的T细胞抗原决定簇的预测。这使基于MHC结合分析进行预测成为不可能，并且使基于与DR4的理论上的最佳结合进行的预测没有了价值。
本发明可以鉴定滥交泛-DR T细胞抗原决定簇。这些肽适用于各种不同的MHC分子，尤其是II类MHC分子，并且在大多数患者中它们由T细胞识别。为了鉴定滥交泛-DR T细胞抗原决定簇，使用了在美国专利6,037,135(完整引用于此作为参考)中描述的计算机算法，该算法鉴定将肽结合到不同II类MHC分子上的模体。对分枝杆菌和人类hsp60的序列进行扫描，并且基于肽序列与三种HLADR亚型即DR1、DR4和DR7的预测结合来设计这些肽(表1)。在与DR1、DR4和DR7的预测结合的水平上选择这些肽。在体外实验中已经鉴定出包括表1中所列出的那些肽的本发明所述肽有能力诱导自身反应T细胞的增殖，或者有能力从这些T细胞诱导细胞因子(如淋巴因子)的分泌，或者有能力诱导其它效应因子功能如细胞毒性。
正如上边所讨论的，在免疫介导慢性炎症中，hsp是免疫系统的靶物质。更明确地说，基于实验模型使用hsp的免疫调制可以对糖尿病、发炎性肠病、糖尿病、关节炎和移植相关疾病提供新颖疗法。
本发明提供了肽和使用所述新颖肽来调制、阻断或抑制炎症应答的方法。这些肽和方法可用于筛选肽或肽类似物，其调制(即或者下调、上调或者改变所产生的TH1∶TH2分子的比率)病原性免疫应答；可用于监控效力或治疗用途；并且可以鉴定在这些慢性炎症情况的治疗中可以有效地下调或抑制免疫应答的其它试剂。
在免疫介导患癌情况和病原性感染中，Hsp也是免疫系统的靶物质。在这种情况下，使用基于实验模型的hsp免疫调制可以提供对于这些患癌状态如黑素瘤、白血病、淋巴瘤、实体瘤(肺、肝脏、肾、脑、膀胱)、视网膜母细胞瘤、肉瘤、其它结缔组织癌及类似情况的新颖疗法。可以用本发明的HLA泛DR肽治疗的免疫介导病原性感染包括这些免疫介导的微生物感染，如肺结核、麻风病、革兰氏阳性和革兰氏阴性微生物的细菌感染、HIV/AIDS、EB病毒(埃-巴二氏病毒)和细胞肥大病毒感染和原生动物感染如利什曼原虫，等等。
本发明提供了肽和使用所述新颖肽来上调人体免疫应答以便调制、阻断或抑制癌前期或患癌状态和微生物感染的方法。这些肽和方法可用于筛选肽或肽类似物，其上调人体免疫应答以便阻碍患癌状态或微生物感染的发展；可用于监控这些肽的效力或治疗用途；并且可用于鉴定在这些免疫介导癌前期或患癌状态和微生物感染的治疗中可以有效地上调或调制免疫应答的其它试剂。
本发明的基本上纯的HLA泛DR结合肽包括与II类MHC分子，例如HLADR1、DR4和DR7结合的应激蛋白的片断。本发明的HLA泛DR结合肽可以衍生于，例如，分枝杆菌热休克蛋白(hsp60)和人类热休克蛋白(hsp60)。
脊椎动物有能力对来自环境中的病原体以及对异常细胞如肿瘤细胞发动起防御作用的免疫应答，其中异常细胞是在体内发生的。这可以采取先天免疫的形式，先天免疫是由天然杀伤细胞、嗜中性白细胞和单核细胞/巨噬细胞系的细胞介导的，或者可以采取由淋巴细胞介导的针对特定抗原的后天免疫或自动免疫的形式。自动免疫应答可以被进一步细分为两个作用，即体液应答和细胞作用，体液应答必需产生特定抗体，其中特定抗体能用于中和暴露于体循环中的抗原，也能有助于它们被消化性吞噬细胞摄取，细胞作用需要识别体内的感染细胞或异常细胞。
在两种情况下，特定应答是由效应T细胞的抗原胞内加工和识别调节的。成熟的溶细胞性T淋巴细胞(CTL)或T辅助细胞(Th)保持为静止状态，除非它们遇到抗原，它们的受体可以在I类或II类MHC分子范围内识别。一旦遇到特定抗原，T细胞增殖并且执行效应因子功能，其结果是除去了反应性抗原。当抗原通过细胞质途径处理时，所得到的肽被结合到初生I类MHC分子上，初生I类MHC分子有助于对效应T细胞的适当呈递。I类MHC呈递有利于识别携带有CD8配体的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。相反，经由内吞途径的胞内加工导致在II类MHC分子上的呈递，其加工模式有助于涉及刺激体液作用的T辅助细胞应答。疫苗接种的目的是发动两种应答并且产生记忆T细胞，这样免疫系统就是预致敏的，以便对病原性感染做出反应。
T细胞的激活必需产生一系列导致直接作用或刺激免疫系统的其它细胞发挥作用的化学信号(主要是细胞因子)。在由I类MHC抗原激活的情况下，细胞毒性T淋巴细胞(CTL)增殖并且发挥作用，以破坏那些呈递给定抗原的受感染细胞。杀死受感染细胞可以防止病毒增殖，并且使得病毒与中和抗体接触，从而允许除去病毒。相反，由II类MHC抗原复合物激活的Th细胞不破坏抗原呈递细胞(它是宿主防御系统的一部分)，而是刺激Th细胞增殖并且产生影响各种细胞的信号(主要还是细胞因子)。在其它后果中，该信号导致B细胞受到刺激、巨噬细胞激活、CTL分化以及促进炎症。该协同应答是相对特异的，并且通常被导向具有由II类MHC系统呈递的肽的外来成分。
当适当地起作用时，免疫应答在将微观病原体消除到较小程度和消除赘生性细胞上具有令人惊讶的有效性。一般而言，自身识别的复杂机理是效率很高的，并且可以允许只针对外源抗原产生定向强烈应答。在T和B淋巴细胞的发育和生命周期中，自身/非自身辨别的调节涉及许多机理，该调节是免疫系统的一个关键功能。然而自身反应T和B细胞前体在中枢性淋巴器官中的缺失除去了许多自身反应细胞，需要Fas、IL-2R和CTLA-4介导信号的外周机理被认为对免疫稳态极为重要。不幸地是，免疫系统有时会发生功能失常，矛头指向宿主细胞，从而引起自身免疫应答。当免疫细胞上的抗原受体识别宿主细胞上的特定自身抗原(如自身抗原决定簇)，并且发动导致破坏宿主细胞的反应时，通常会发生自身免疫或自身反应。在许多情况下，自身免疫反应是自身限制的，其中当引起自身免疫反应的抗原被清除掉时，它们会消失。然而，在一些情况下，自身反应淋巴细胞比它们应该存活的时间要长，并且继续诱导细胞程序死亡或者换句话说消灭宿主细胞。自身免疫病症或情况的实例包括多发性硬化症(MS)、类风湿性关节炎(可能多于一种机理)、红斑狼疮和I型糖尿病。
最近该领域的发展，尤其是等位基因特异性肽结合模体的识别，已经使整个领域有所改观(Madden等人，1991；Rotschke和Falk，1991)。基于这个知识，可以在足以解决该领域中为时已久的问题的细节水平上再次评价与自身免疫疾病易感性相连锁的MHC的结构基础。对于与几个I类和II类MHC分子结合的肽的模体，已经由自然加工肽的序列分析和已知抗原决定簇的突变分析所确定。已发现I类MHC结合肽很短(通常8-10个氨基酸长)并且有两个显性MHC锚状残基；已发现II类MHC结合肽较长并且在大小上更加不同(Madden等人，1991；Rotschke & Falk，1991；Jardetzky等人，1991，Chicz等人，1993)。在最近，HLA-DR1的结晶结构表明，有一个接近该肽N末端的显性疏水锚状残基，并且在几个其它肽位置发现了次级锚状残基(Brown等人，1993)。
包括在已知为应激蛋白的类别中，并且在本发明的实践中有用的热休克蛋白可以选自任何满足下述任一个标准的细胞蛋白。热休克蛋白的特征在于：当细胞暴露于应激性刺激下时，其胞内浓度会增加；能结合其它蛋白或肽；在存在腺苷三磷酸(ATP)或低pH的情况下，能释放结合的蛋白或肽；或者与具有任意上述特性的任意细胞蛋白具有至少35％的同源性。
到目前为止，已经基于分子量鉴定了hsp的三个主要家族。这些家族被称作hsp60、hsp70和hsp90，其中数据反映应激蛋白的近似分子量，以千道尔顿表示。哺乳动物hsp90和gp96都是hsp90家族的成员。随后发现了这些家族的许多成员被诱导以响应其它应激性刺激，这些刺激包括但不限于，营养丧失、代谢破坏、氧自由基和胞内病原体的感染。(参见Welch，1993年5月，Scientific American 56-64；Young，1990，Annu.Rev.Immunol.8：401-420；Craig，1993，Science260：19021903；Gething等人，1992，Nature 355：33-45；和Lindquist等人，1998，Annu.Rev.Genetics 22：631-677)，将这些公开文献引用于此作为参考。可以预期到的是，可以将属于所有这三个家族的hsp/应激蛋白用于本发明的实践中。在一个优选的实施方案中，用hsp60蛋白和蛋白序列来获得本发明的肽。在常温下在大部分但不是全部哺乳动物细胞中，hsp60蛋白很丰富，并且可以进一步用热来诱导(Lai等人，1984，Mol.Cell.Biol.4：2802-10；van Bergen en Henegouwen等人，1987，Genes Dev.1：525-31)。
热休克蛋白是高度保守蛋白。例如，hsp60和hsp90家族表现出高水平的家族内保守性。而且，已经发现，hsp60、hsp70和hsp90家族包括在序列上与应激蛋白相关的蛋白，例如，具有大于35％的氨基酸同一性，但其表达水平没有被应激改变。因此可以预期到的是，正如此处所用，应激蛋白的定义包括与这三个家族的成员具有至少35％-55％，优选55％-75％，且最优选75％-85％的氨基酸同一性的其它蛋白、突变蛋白、类似物及其变体，并且这三个家族成员在细胞中的表达水平被提高以响应应激性刺激。(参见美国专利5,961,979，将其完整引用于此作为参考)。下面将描述属于这三个家族的应激蛋白的纯化。
在一个实施方案中，本发明所用的hsp是哺乳动物hsp。在另一个实施方案中，本发明所用的用于治疗自身免疫疾病的hsp是hsp60家族的一个成员。
60kDa热休克蛋白(hsp60)是在所有人体细胞中可以表达的应激蛋白。不过，健康个体表现出对hsp60自身抗原决定簇来说是特异性的高频率的自身免疫T细胞。正常的健康小鼠和人类已经表现出以它们自身hsp60抗原作为靶物质的T细胞(Kaufmann，1990；Kaufmann等人，1994；Young，1989；Cohen，1992b)。然而，这些自身免疫T细胞也与T细胞介导自身免疫疾病有关：在人类慢性关节炎(Cohen，1991；Res等人，1989；van Eden等人，1989)、多发性硬化症(Selmaj等人，1991)、实验自身免疫脑脊髓炎(Selmaj等人，1991)和佐剂性关节炎(Hogervorst等人，1992)的自身免疫伤害中已经发现了以自身hsp60抗原上作为靶物质的高浓度T细胞。在非肥胖性糖尿病的(NOD)小鼠模型中，抗hsp60 T细胞也已经表现出在糖尿病中起着作用(Elias等人，1990；Elias等人，1991；Elias等人，1994；Elias等人，1995；Birk等人，1996a；Birk等人，1993；Cohen，1991)。
本发明的HLA泛DR结合肽有一个氨基酸序列，它在人类和其它低级生物体之间的相应的热休克蛋白是保守的，尤其是在人类和细菌或人类和分枝杆菌热休克蛋白，如分别是hsp60和dnaJ。
术语“分离的”或“纯化的”指从其自然状态“被人为”改变；即如果它在自然界中发生，它已经被改变或者已从其原始环境中被除去，或者既被改变又被除去。例如，正如此处所用的该术语，自然发生的多核苷酸或以其自然状态在活动物中自然存在的多肽是未“分离的”或“纯化的”，但从其自然状态的共存物质中分离出来的相同多核苷酸或多肽是“分离的”或“纯化的”。
“基本上纯的肽”通常是纯的，即当它至少是60wt.％，不含与其自然相关的蛋白质和自然发生的有机分子时。优选地，制剂是至少75wt.％，更优选至少90wt.％，最优选至少99wt.％，并且有一个序列，该序列是SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：13(如SEQ ID NO：2，3，4，5，6，7，8，9，10)中阐述的序列的片断。例如，本发明的基本上纯的hsp60肽可以通过如下方法获得：例如，通过从天然来源中提取，通过表达编码全长多肽(如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：13)的重组核酸，随后用蛋白酶裂解；通过表达编码SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：13(如SEQ ID NO：2，3，4，5，6，7，8，9或10)的片断的重组核酸；或通过化学方法合成本发明的肽。可以通过任何适当的方法来测量纯度，例如通过柱层析、聚丙烯酰胺凝胶电泳或通过高效液相层析(HPLC)分析。
本发明的热休克蛋白-60(hsp60)肽包括SEQ ID NO：1中阐述的序列的片断。Hsp60热休克蛋白的发明片断的实例包括具有如表1中阐述的序列的肽(P1，2，3，4，5，6，7和8分别是SEQ ID NO：2，3，4，5，6，7，8和9)。本发明的热休克蛋白dnaJ肽包括SEQ ID NO：14中阐述的序列的片断，如具有SEQ ID NO：10的序列的肽。本发明的这些肽或多肽可以是基本上纯化的。
                                                                                      表1
分枝杆菌/人类 Hsp60  序列(SEQ ID NO：2-9)  核心抗原决定簇  DR1得分  DR4得分  DR7得分  泛DR得分
 P1 分枝杆菌 254-268  GEALSTLVVNKIRGT  LSTLVVNKI  42.37  17.03  276.91  3
 P2 人类 280-294  GEALSTLVLNRLKVG  LSTLVLNRL  12.46  .94  8.74  1
 P3 分枝杆菌 216-230  PYILLVSSKVSTVKD  LVSSKVSTV  3.59  14.29  26.68  3
 YILLVSSKV  131.96  4.19  29.83  3
 P4 人类 242-256  AYVLLSEKKISSIQS  LSEKKISSI  .17  2.82  7.94  1
 P5 分枝杆菌 210-224  EAVLEDPYILLVSSK  LEDPYILLV  28.51  .37  15.45  2
 P6 人类 236-250  KCEFQDAYVLLSEKK  FQDAYVLLS  40.82  3.63  96.80  3
 P7 分枝杆菌 503-517  IAGLFLTTEAVVADK  LTTEAVVAD  1.76  .28  3.66  1
 FLTTEAVVA  10.51  1.28  18.65  2
 P8 人类 535-546  VASLLTTAEVVVTEI  LTTAEVVVT  12.03  3.34  68.00  3
表1表示在DR结合上选择的一组hsp60肽。该表(从左到右)给出了肽的个数；来源(人类或分枝杆菌)，肽组分(在黑体核心抗原决定簇中)；核心抗原决定簇；与DR1、DR4、DR7的预期结合；以及泛DR得分。认为一个抗原决定簇是一个好的结合物的截断点如下：DR1～1.570；DR4～2.617；DR7～9.106。
多肽、肽或蛋白质指聚合物，其中单体是通过酰胺键结合在一起的氨基酸残基。当氨基酸是α-氨基酸时，可以使用L-光学异构体或D-光学异构体，典型的是L-异构体。本发明的肽意在包括SEQ ID NO：1的片断。本发明所包括的SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：13的片断的特定实例包括在SEQ ID NO：2，3，4，5，6，7，8，9或10中阐述的序列，包括L-或D-氨基酸，并且包括修饰序列如糖蛋白。因此，本发明的肽意在包括自然发生的蛋白质，以及通过重组或化学合成的蛋白质。本发明也包括的是与SEQ ID NO：2，3，4，5，6，7，8，9或10具有基本上相同的序列的肽，并且这些肽保持着与其相关的序列的功能活性。可以基于保守氨基酸取代来设计具有基本上相同的序列的肽，它们将仍然与原始肽在相应部分具有大约70％-90％的同源性。如果相似氨基酸，即保守氨基酸取代不能算做序列中的变化，那么允许与同源性具有更大程度的偏差。这些肽长大约为10-30个氨基酸；优选长为15-25氨基酸，更优选长为15-20氨基酸。
保守性变异表示用另一个生物学上相似的残基替换一个氨基酸残基。保守变化的实例包括疏水残基的替换，如用异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸取代另一个，或者用另一个极性残基取代一个极性残基，如用精氨酸取代赖氨酸，用谷氨酸取代天冬氨酸，或者用谷氨酰胺取代天冬酰胺，等等。保守取代的其它例证性实例包括如下变化：丙氨酸变为丝氨酸；精氨酸变为赖氨酸；天冬酰胺变为谷氨酰胺或组氨酸；天冬氨酸变为谷氨酸；半胱氨酸变为丝氨酸；谷氨酰胺变为天冬酰胺；谷氨酸变为天冬氨酸；甘氨酸变为脯氨酸；组氨酸变为天冬酰胺或谷氨酰胺；异亮氨酸变为亮氨酸或缬氨酸；亮氨酸变为缬氨酸或异亮氨酸；赖氨酸变为精氨酸，谷氨酰胺或谷氨酸；甲硫氨酸变为亮氨酸或异亮氨酸；苯丙氨酸变为酪氨酸，亮氨酸或甲硫氨酸；丝氨酸变为苏氨酸；苏氨酸变为丝氨酸；色氨酸变为酪氨酸；酪氨酸变为色氨酸或苯丙氨酸；缬氨酸变为异亮氨酸变为亮氨酸。术语“保守性变异”也包括在未取代的亲本氨基酸位置使用一个取代的氨基酸，只要针对取代多肽产生的抗体也能与未取代的多肽发生免疫反应。
修饰和置换不限于氨基酸的替换。为了所关心的多个用途，如增加的稳定性、溶解性或构型，本技术领域的技术人员将认识到引入(通过缺失、替换或添加)其它修饰的需要。这样的其它修饰的实例包括引入稀有氨基酸、右-氨基酸、糖基化位点、用于特定二硫桥键形成的胞嘧啶。修饰的肽可以化学合成，或者分离的基因可以是定点诱变的，或者合成基因可以在细菌、酵母、杆状病毒、组织培养物等等中合成且表达。
通过本发明可以预期到的本发明的hsp60肽的“盐”是生理上可接受的有机和无机盐。
在此所用，hsp60肽的“功能性衍生物”包括用本领域已知的方法从功能性基团获得的衍生物，其中所述功能基团在残基或N-或C-末端基团上以侧链出现，并且这些衍生物也包括在本发明中，只要它们保持药物上可接受，即它们不破坏该肽的活性，不对含有该衍生物的组合物赋予毒性，并且不会不利地影响其抗原特性。
例如，这些衍生物可以包括羧基的脂族酯，通过与氨或与伯胺或仲胺反应而产生的羧基的酰胺，通过与酰基部分(例如烷酰基或碳环芳酰基基团)反应形成的氨基酸残基的自由氨基基团的N-酰基衍生物，或通过与酰基部分反应形成的自由羟基基团(例如丝氨酰或苏氨酰残基的自由羟基基团)的O-酰基衍生物。
可以用测序算法来测量已知和未知序列之间的同源性或同一性。这些方法和算法在鉴定存在于其它微生物中的相应序列，以及在设计本发明的肽中有用。同源性或同一性通常是用序列分析软件测量的(例如Sequence Analysis Software Package，来自the Genetics ComputerGroup，University of Wisconsin Biotechnology Center，1710University Avenue，Madison，WI 53705)。这样的软件通过将同源性等级分配给各种缺失、置换及其它修饰来匹配相似序列。对于两个或多个核酸、多肽或肽序列，术语“同源性”和“同一性”指两个或多个相同序列或子序列，当用许多序列比较算法或通过人工对比和视觉观察测量时，在比较窗口或指定区域比较且对比最大化对应时，是相同的或者具有特定百分比的氨基酸残基或核苷酸相同的两个或更多个序列或者子序列。
对于序列比较，通常一个序列作为参考序列，测试序列与其进行比较。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机，如果必要，指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。可以使用缺省程序参数，或可以指定备选参数。然后基于程序参数，用序列比较算法计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。
正如此处所用，“比较窗口”包括是指选自8-10，10-20，20-600，通常大约50-大约200，更通常是大约100-大约150的邻接位置的任一个数目的片断，在这些片断中，在两个序列被最优地对比后，一个序列可以与具有相同数目的邻接位置的参考序列进行比较。用于比较的序列对比方法在本领域是熟知的。可以进行最优的序列对比比较，例如，通过Smith & Waterman，Adv.Appl.Math.2：482(1981)的局部同源性算法，通过Needleman & Wunsch，J.Mol.Biol 48：443(1970)的同源性配比算法，通过person & Lipman，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA85：2444(1988)的相似性搜索方法，通过这些算法的计算机化工具(Wisconsin Genetics Software Package，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，WI中的GAP，BESTFIT，FASTA和TFASTA)，或者通过人工对比和视觉观察。
一个有用算法的实例是BLAST和BLAST 2.0算法，对它们的描述分别在Altschul等人，Nuc.Acids Res.25：3389-3402，(1977)和Altschul等人，J.Mol.Biol.215：403-410，(1990)中。完成BLAST分析的软件可以通过National Center for Biotechnology Information( http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)公开获得。该算法首先涉及通过鉴定查询序列中的长度W的短单词来鉴定高计分序列对(HSP)，当在数据库序列中用相同长度的单词对比时，该高记录序列对或者匹配或者满足一些正阈值T。T指相邻单词得分阈值(Altschul等人，见上文)。这些起始的相邻单词击中作为寻找包括它们的更长HSP的初始搜索的种子。这些单词击中在两个方向沿着每一个序列一直延伸，直到累积对比值增加。对于核苷酸序列，用参数M(一对匹配残基的得分；通常＞0)对累积值进行计算。对于氨基酸序列，用计分矩阵来计算累积值。当发生下列情况时暂停在每一方向的单词击中的延伸：累积对比值从其最大获得值而下降数量X；由于一个或多个负得分残基对比值的累积，累积值达到零或零以下；或者达到了任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X确定对比的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)使用的缺省值为：单词长度(W)或11，期望值(E)或10，M＝5，N＝-4，以及两个链的比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用的缺省值为：单词长度为3，期望值(E)为10，BLOSUM62计分矩阵(参考Henikoff &Henikoff.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915，1989)对比值(B)为50，期望值(E)为10，M＝5，N＝-4，以及两个链的比较。
BLAST算法也进行两个序列之间相似性的统计分析(如参考Karlin& Altchul，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873，1993)。由BLAST算法提供的相似性的一个测量是最小的总计几率(P(N))，该值提供了几率指标，通过它两个核苷酸或氨基酸序列之间的匹配将偶然地发生。例如，如果测试核酸与参考核酸的比较中最小的总计几率小于大约0.2，更优选小于大约0.01，最优选小于大约0.001，那么核酸被认为与参考序列是相似的。
用于确定同源性或同一性的其它算法，例如，除了BLAST程序(Basic Local Alignment Search Tool at the National Center forBiological Information)、ALIGN、AMAS(Analysis of MultiplyAligned Sequences)、AMPS(Protein Multiple Sequence Alignment)、ASSET(Aligned Segment Statist ical Evaluation Tool)、BANDS、BESTSCOR、BIOSCAN(Biological Sequence Comparative AnalysisNode)、BLIMPS(Blocks IMProved Searcher)、FASTA、Intervals &Points、BMB、CLUSTAL V、CLUSTAL W、CONSENSUS、LCONSENSUS、WCONSENSUS、Smith-Waterman algorithm、DARWIN、Las Vegas算法、FNAT(Forced Nucleotide Alignment Tool)、Framealign、Framesearch、DYNAMIC、FILTER、FSAP(Fristensky Sequence Analysis Package)、GAP(Global Alignment Program)、GENAL、GIBBS、GenQuest、ISSC(Sensitive Sequence Comparison)、LALIGN(Local SequenceAlignment)、LCP(Local Content Program)、MACAW(Multiple AlignmentConstruction & Analysis Workbench)、MAP(Multiple AlignmentProgram)、MBLKP、MBLKN、PIMA(Pattern-Induced Multi-sequenceAlignment)、SAGA(Sequence Alignment by Genetic Algorithm)和WHAT-IF。这些对比程序也可以用来筛选基因组数据库，以及鉴定具有基本上相同的序列的多核苷酸序列。许多基因组数据库是可利用的，例如，人类基因组的实质部分可以作为人类基因组测序项目的一部分来利用(J.Roach， http：//weber.u.Washington.edu/～ roach/human genome progress 2.html)(Gibbs，1995)。至少21个其它基因组已经被测序，例如包括生殖道枝原体(M.genitalium)(Fraser等人，1995)、詹氏甲烷球菌(M.jannaschii)(Bult等人，1996)、流感嗜血菌(H.influenzae)(Fleischmann等人，1995)、大肠杆菌(Blattner等人，1997)和酵母(S.cerevisiae)(Mewes等人，1997)和果蝇(D.melanogaster)(Adams等人，2000)。在模型生物的基因组的测序上已经取得了显著的进步，如鼠、秀丽新小杆线虫(C.elegans)和拟南芥(Arabadopsis sp)。几个含有注解有某些功能信息的基因组信息由不同的组织所保存，可以通过因特网访问，例如
http：// www.tigr.org/tdb：http：//www.genetics.wisc.edu；
http：//genome-www.stanford.edu/～ ball；http：//hiv-web.lanl.gov；
http：//www.ncbi.nlm.nih.gov；http：//www.ebi.ac.uk；http：//Past eur.fr/other/biology；和www.genome.wi.mit.edu。
除了本发明的肽，编码SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：13(如SEQ ID NO：2，3，4，5，6，7，8，9或10)的片断的核酸序列(如寡核苷酸或多核苷酸序列)也包括在本发明中。例如，可以用几种方法获得本发明的DNA序列。例如，可以基于遗传密码的简并性获得SEQ ID NO：2，3，4，5，6，7，8，9或10或12的核酸(如DNA或RNA)序列，并且可以基于算法和序列程序用计算机来确定。有20种天然氨基酸，大部分是用不止一个密码子规定的。因此，所有简并核苷酸序列包括在本发明中，只要由核酸序列编码的本发明的肽的氨基酸序列在功能上没有变化。
多核苷酸、寡核苷酸或核酸序列指一种多聚形核苷酸，并且在此互换使用。因此该术语包括，例如，被引入载体的重组DNA；被引入自主复制质粒或病毒的重组DNA；或被引入原核生物或真核生物的基因组DNA的重组DNA，或者其作为独立于其它序列的分离的分子(例如cDNA)存在。本发明的核苷酸可以是核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或任一种核苷酸的修饰形式。而且，涉及产生多肽链的多核苷酸序列可以包括编码区之前和之后的区(前导区和非转录尾区)，以及依赖于多核苷酸序列来源的单个编码片断(外显子)之间的间插序列(内含子)。
术语多核苷酸通常指任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸，可以是未修饰的RNA或DNA或修饰的RNA或DNA。因此，例如，在此所用，多核苷酸指，除了其它之外，单链和双链DNA，单链和双链区的混合物的DNA、单链和双链RNA，以及单链和双链区的混合物的RNA，包括DNA和RNA的杂交分子，可能是单链或更特别的是双链或单链和双链区的混合物。
而且，多核苷酸或核酸序列可能含有一个或多个修饰碱基。因此，正如此处所指的术语，带有为了稳定性或其它原因而被修饰的骨架的DNA或RNA是“多核苷酸”。而且，正如此处所用的术语，仅在两个实施例中提到，含有不寻常碱基如肌苷，或修饰碱基如三苯甲基化碱基的DNA或RNA是多核苷酸。
编码本发明的肽的核酸序列(如寡核苷酸或多核苷酸)包括互补的多核苷酸序列。当序列是RNA时，脱氧核糖核苷酸A，G，C和T分别被核糖核苷酸A，G，C和U取代。上述长为至少15个碱基的核酸序列的片断(部分)也包括在本发明中，这足以允许该片断选择性地与编码本发明的多肽或肽序列的DNA杂交。在此所用，“选择性杂交”指在适度严格或高度严格生理条件(参见，例如，Maniatis等人，1989 MolecularCloning A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，N.Y.中描述的技术，在此引用作为参考)下杂交，这区分了不相关核苷酸序列和相关核苷酸序列。
在核酸杂交反应中，用于实现特别严格程度的条件将依赖于将被杂交的核酸的性质而变化。例如，在选择杂交条件中，可以考虑核酸的杂交区的长度、互补性程度、核苷酸序列组分(如GC与AT含量)和核酸类型(如RNA与DNA)。一个额外的考虑因素是，核酸之一是否被固定，例如固定在滤膜上。
逐渐地更加严格的条件的一个实例如下：大约室温下2×SSC/0.1％SDS(杂交条件)；大约室温下0.2×SSC/0.1％SDS(较低严格条件)；大约42℃下0.2×SSC/0.1％SDS(中度严格条件)；和大约68℃下0.1×SSC(高度严格条件)。可以仅用这些条件中一个来完成洗涤，例如高度严格条件，或者可以使用每一个条件，例如以上述列出的次序，重复列出的任意或全部步骤，每一个10-15分钟。然而，正如上边所提及的，最优条件将依赖于所涉及的特定杂交反应而变化，并且可以根据经验来确定。
依赖于核酸杂交的筛选程序使得从任意生物上分离任意基因序列成为可能，只要可以获得适当的探针。例如，应该想象到，这样的探针可以用来在其它生物体中鉴定其它同系物。在完成这个过程时，可以用对比算法(如上所述)来筛选基因组数据库。可选择地，寡核苷酸探针，相当于正在谈论中的编码蛋白质的序列的一部分，可以用化学方法合成。这需要，氨基酸序列的短的寡肽序列必需是已知的(如，SEQID NO：2，3，4，5，6，7，8，9或10)。可以从遗传密码推导出编码蛋白质的DNA序列，然而，必需考虑密码的简并性。
在本发明中，编码SEQ ID NO：2，3，4，5，6，7，8，9或10的核酸序列可以被插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域已知的质粒、病毒或其它载体，它们已经通过插入或引入编码SEQ ID NO：2，3，4，5，6，7，8，9或10的核酸序列被操作。这样的表达载体含有启动子序列，其有助于所插入的遗传序列的有效转录。表达载体通常包括复制起点、启动子，以及允许对转化细胞的表型进行选择的特定基因。适合用于本发明中的载体包括此处描述的那些载体。
可以用本技术领域熟知的方法来构建包括编码例如SEQ ID NO：2，3，4，5，6，7，8，9或10的序列和适当转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术和体内重组/基因技术。(参见，例如在Maniatis等人，1989，Molecular Cloning A LaboratoryManual Cold Spring Harbor Laboratory，N.Y.中描述技术)。
可以对遗传构建物进行设计以提供额外好处，例如添加C-末端或N-末端氨基酸残基，这将有助于通过在柱上吸附或通过使用抗体进行纯化。所有这些操作方法都是累加的。本领域的技术人员基于实际考虑因素可以容易地选择产生特定构建物的方法：目标肽的大小，起始材料的可用性和成本，等等。所涉及的所有技术都是在本领域已良好建立并是熟知的。例如，参见Ausubel等人，Current Protocols inMolecular Biology，第1和2卷(1987)，以及增刊，和Maniatis等人，Molecular Cloning，a Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory(1989)。然而其它技术参考文献也是已知的，并且本领域技术人员可以容易地获得。
可以产生编码融合蛋白的核酸序列，并且可以将其可操作地连接到表达控制序列上。术语“可操作性地连接”指并置，其中这里描述的组分的关系是允许它们以预定的方式发挥作用。例如，当RNA聚合酶将这两个编码序列转录为单一mRNA时，编码序列被“可操作地连接”到另一个编码序列上，然后mRNA被翻译为一个具有衍生自这两个编码序列的氨基酸的单一多肽。编码序列不需要彼此邻接，只要被表达序列最终能加工产生目标产物。可操作地连接到编码序列上的表达控制序列被连接，以便完成在与表达控制序列相适应的条件下实现编码序列的表达。在此所用，术语“表达控制序列”指调节与其可操作地连接的核酸序列的表达的核酸序列。当表达控制序列控制且调节核酸序列的转录和适当的翻译时，表达控制序列被可操作地与核酸序列连接。因此，表达控制序列可以包括适当的启动子、增强子、转录终止子、编码肽或蛋白的核酸序列前的起始密码子(即ATG)、内含子的剪接信号、维持该基因的正确的阅读框以允许mRNA的正确翻译，以及终止密码子。术语“控制序列”以最小量包括因其存在可以影响表达的组分，并且也包括其它因其存在是有利因素的组分，例如前导序列和融合配偶体序列。表达控制序列可以包括一个启动子。
通过“启动子”指足以指导转录的最小序列。那些足以使启动子依赖型基因表达可以控制的启动子元件也包括在本发明中，其中启动子依赖型基因表达对于细胞型专一性，组织专一性是可控制的，或者可以通过外源信号或试剂诱导；这样的元件可以位于核酸序列的5’或3’区。组成型启动子和诱导型启动子也包括在本发明中(参见，例如Bitter等人，Methods in Enzymology 153：516-544，1987)。例如，当在细菌系统中克隆时，可以使用诱导型启动子如噬菌体的pL，plac，ptrp，ptac(ptrp-lac杂交启动子)等等。当在哺乳动物细胞系统中克隆时，可以使用衍生于哺乳动物细胞的基因组的启动子(例如金属硫蛋白启动子)或衍生于哺乳动物病毒的启动子(例如反转录病毒长末端重复顺序；腺病毒晚期启动子；痘苗病毒7.5K启动子)。也可以用通过重组DNA或合成技术产生的启动子为本发明的核酸序列的转录做准备。
可以将包括，例如包括编码融合蛋白的核酸序列的本发明的核酸序列插入到重组表达载体中。重组表达载体通常指质粒、病毒或其它本领域已知的载体，其已经通过插入或引入核酸序列而被操作。例如，本发明的重组表达载体包括核酸序列，其编码具有，例如具有一个如SEQ ID NO：2，3，4，5，6，7，8，9或10中阐述的序列的肽。表达载体通常包括一个复制起点，一个启动子，以及允许对转化细胞表型进行选择的特定基因。适合用于本发明中的载体包括，但不限于，用于在细菌中表达的含有T7启动子的表达载体(Rosenberg等人，Gene56：125，1987)，用于在哺乳动物细胞中表达的pMSXND表达载体(Lee和Nathans，J.Biol.Chem.263：3521，1988)，用于在昆虫细胞中表达的衍生于杆状病毒的载体，花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV。本发明的核酸序列也包括一个定向序列，其通过融合到适当的细胞器官引导信号或定位宿主蛋白将指示物导向特定细胞位点。例如，编码定向序列或信号序列的多核苷酸可以被用作阻抑物，从而可以在编码本发明的肽的核酸序列的5’末端被连接或融合，这样定向或信号肽被定位到所得的编码的融合多肽的氨基末端。表达载体的构建物和转染细胞中的基因表达涉及使用也在本领域熟知的分子克隆技术。(参见，例如Sambrook等人，Molecular Cloning-A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY，1989，和Current Protocols in Molecular Biology，M.Ausubel等人编著，(Current Protocols，Greene Publishing Associates，Inc.和John Wiley & Sons，Inc.的一个合资企业，最新补遗))。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术和体内重组/基因重组。(也参见，Maniatis等人，Molecular Cloning A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory，N.Y.，1989)。
在酵母中，可以使用许多含有组成型启动子或诱导型启动子的载体。作为参考，参见Current Protocols in Molecular Biology，第二卷，编者Ausubel等人，Greene Publish.Assoc.& WileyInterscience，第13章，1988；Grant等人，“Expression andSecretion Vectors for Yeast，”出处为Methods in Enzymology，编者Wu和Grossman，1987，Acad.Press，N.Y.，第153卷，516-544，1987；Glover，DNA Cloning，第II卷，IRL Press，Wash.，D.C.，第3章，1986；和Bitter，“Heterologous Gene Expression in Yeast，”Methods in Enzymology，编者Berger和Kimmel，Acad.Press，N.Y.第152卷，673-684，1987；和The Molecular Biology of the YeastSaccharomyces，编者Strathern等人，Cold Spring Harbor Press，第I和II卷，1982。可以使用组成型酵母启动子如ADH或LEU2或诱导型启动子如GAL(“Cloning in Yeast，”第3章，R.Rothstein，出处为DNACloning第11卷，A Practical Approach，编者DM Glover，IRL Press，Wash.，D.C.，1986)。可选择地，可以使用可促进外源DNA序列整合进酵母染色体中的载体。
昆虫系统是可以用来表达具有一个如SEQ ID NO：2，3，4，5，6，7，8，9或10中阐述的序列的肽的可选择的表达系统。在一个这样的系统中，苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)被用作载体来表达外源或突变序列。该病毒生长在草地夜蛾细胞中。编码本发明所述肽的序列可以被克隆进该病毒的非必需区(例如polyhedrin基因)，并且在AcNPV启动子的控制下放置(例如polyhedrin启动子)。成功地插入编码本发明所述肽的序列将导致polyhedrin基因的失活，以及无包含体重组病毒(即缺乏蛋白质外壳的病毒，由polyhedrin基因编码)的产生。然后这些重组病毒被用来感染草地夜蛾(S.frugiperda)细胞，在该细胞中被插入的基因在其中被表达，参见Smith等人，J.Viol.46：584，1983；Smith，美国专利4,215,051。
本发明的载体可以被用来转化宿主细胞。通过转化或转化作用指在引入新DNA(即对细胞来说是外源的DNA)之后，在细胞中诱导的永久或短暂的遗传变化。其中细胞是哺乳动物细胞，永久遗传变化通常是通过将DNA引入细胞的基因组而实现的。
转化细胞或宿主细胞通常指，已经通过重组DNA技术将编码本发明所述肽的DNA分子引入了其中(或引入其祖先)的细胞(如原核或真核的)，或编码本发明所述肽的DNA分子的类似物。
可以通过本领域技术人员熟知的传统技术用重组DNA完成宿主细胞的转化。其中宿主是原核的，如大肠杆菌，可以从指数生长期之后收获并且随后用本领域熟知的过程用CaCl2方法处理的细胞制备能摄取DNA的感受态细胞。可选择地，可以使用MgCl2或RbCl。也可以在形成宿主细胞的原生质体之后或通过电穿孔来完成转化。
当宿主是真核细胞时，用DNA转染或转化的方法包括磷酸钙共沉淀，可以使用传统的机械方法，如微量注射、电穿孔、插入包装在病毒载体中的质粒等等，以及其它本领域已知的方法。可以用编码本发明所述肽的DNA序列和编码选择性标记的第二个外源DNA分子如单纯疱疹胸苷激酶基因来转染真核细胞。另一种方法是使用真核病毒载体如猿病毒40(SV40)或牛乳头瘤病毒来瞬时地感染或转化真核细胞并且表达该蛋白。(Eukaryotic Viral Vectors，Cold Spring HarborLaboratory，Gluzman编著，1982)。通常，真核宿主被用作宿主细胞。真核细胞可以是酵母细胞(例如酿酒酵母)，昆虫细胞(例如果蝇)，或可以是哺乳动物细胞，包括人类细胞。
真核系统和哺乳动物表达系统允许发生表达的哺乳动物蛋白质的翻译后修饰。应该使用具有能加工初级转录物、糖基化、磷酸化，并且有利基因产物分泌的细胞器的真核细胞。这样的宿主细胞系可以包括，但不限于，中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、非洲绿猴肾细胞株系(VERO)、BHK、海拉细胞(HeLa)、COS、MDCK、Jurkat、HEK-293和WI38。
可以对哺乳动物细胞系统进行基因工程，该系统使用重组病毒或病毒元件来指导表达。例如，当使用腺病毒表达载体时，可以将编码本发明所述肽的核酸序列连接到腺病毒转录/翻译控制复合体上，例如晚期启动子和三联前导序列。然后通过体外或体内重组将该嵌合序列插入到腺病毒基因组中。插入病毒基因组的非必需区(如E1或E3区)将导致活的且能在感染宿主中表达本发明所述肽的重组病毒(例如参见，Logan & Shenk，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：3655-3659，1984)。可选择地，可以使用痘苗病毒7.5K启动子。(例如参见，Mackett等人，Proc Natl.Acad.Sci.USA，79：7415-7419，1982；Mackett等人，J.Virol.49：857-864，1984；泛icali等人，Proc Natl.Acad.Sci.USA，79：4927-4931，1982)。特别感兴趣的是基于牛乳头瘤病毒的载体，其有能力作为染色体外元件进行复制(Sarver等人，Mol.Cell.Biol.1：486，1981)。该DNA进入小鼠细胞后不久，质粒在每个细胞中复制到大约100-200个拷贝。所插入的cDNA的转录不需要将质粒整合进宿主的染色体中，从而产生高水平的表达。通过在质粒中包括选择性标记，如新霉素基因(neo)，这些载体可以用于稳定的表达。可选择地，可以对反转录病毒基因组进行修饰，以用作能在宿主细胞中引入且指导基因表达的载体(Cone & Mulligan，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6349-6353，1984)。也可以用诱导型启动子来实现高水平表达，包括但不限于金属硫蛋白IIA启动子和热休克启动子。
为了长期且高产量的生产重组蛋白质，优选稳定的表达。不是使用含有病毒复制起点的表达载体，而是可以用编码本发明所述肽(例如具有一个如SEQ ID NO：2，3，4，5，6，7，8，9或10中阐述的序列的肽)的DNA转化宿主细胞，由适当的表达控制元件(如启动子、增强子、序列、转录终止子、聚腺苷酸化作用位点等等)和选择性标记控制。重组载体中的选择性标记使得对选择具有抗性，并且允许细胞稳定地将质粒整合进它们的染色体中，生长形成转化灶，其反过来可以被克隆且扩展成细胞系。例如，在引入外源DNA之后，使进行了基因工程的细胞在富集培养基中生长1-2天，然后换到选择性培养基中。可以使用许多选择系统，包括但不限于，单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等人，Cell，11：223，1977)，次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Szybalsk &Szybalski，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，48：2026，1962)，和腺嘌呤磷酸核糖转移酶(Lowy等人，Cell，22：817，1980)基因，它们可以分别在tk-，hgprt-或aprt-细胞中使用。而且，抗代谢物质抗性可以被用作选择如下基因的基础：选择能赋予氨甲蝶呤抗性的dhfr基因(Wigler等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：3567，1980；O’Hare等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，8：1527，1981)；选择能赋予霉酚酸抗性的gpt基因(Mulligan & Berg，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，78：2072，1981)；选择能赋予氨基糖苷G-148抗性的neo基因(Colberre-Garapin等人，J.Mol.Biol.150：1，1981)；和能赋予潮霉素抗性的hygro基因(Santerre等人，Gene 30：147，1984)。最近，已经描述了其它的选择性基因，名为：trpB，其允许细胞利用吲哚代替色氨酸；hisD，其允许细胞利用histinol代替组氨酸(Hartman &Mulligan，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：8047，1988)；和ODC(鸟氨酸脱羧酶)，其能给鸟氨酸脱羧酶抑制因子，2-(二氟甲基)-DL-鸟氨酸，DFMO赋予抗性(McConlogue L.，出处为Current Communicationsin Molecular Biology，Cold Spring Harbor Laboratory，编著，1987)。
在另一个实施方案中，本发明提供了与本发明所述肽(例如SEQ IDNO：2，3，4，5，6，7，8，9或10)特定结合的抗体。例如，与具有SEQ ID NO：2的序列的肽特定结合的抗体不与具有SEQ ID NO：4的序列的肽结合。如果肽被糖基化，糖基化方式可以被用作纯化计划的一部分，例如通过凝集素层析来纯化。这样的抗体在炎症病症和疾病(例如类风湿性关节炎、糖尿病等等)的研究中对于研究和诊断学有用，以及对一般的相关病理学有用。
这样的抗体可以被单独施用，或者包含在药物组合物中，该组合物含有与SEQ ID NO：2，3，4，5，6，7，8，9或10中阐述的一个序列特定地结合的抗体，和可以有效地作为在体外和体内的炎症反应的调制剂的其它试剂。
在此所用，术语“抗原决定簇”指抗原上的抗原决定簇，如具有一个如SEQ ID NO：2，3，4，5，6，7，8，9或10中阐述的序列的肽，抗体的抗原互补位，如与本发明的SEQ ID NO：2，3，4，5，6，7，8，9或10中阐述的序列特定地结合的抗体。抗原决定簇通常包括分子的化学活性表面基团，如氨基酸或糖侧链，并且可以具有特定的三维结构特性，以及特定的电荷特性。
可以用与本发明所述肽序列相应的完整的肽或片断(例如SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：13的片断)来制备与本发明所述肽结合的抗体，其中本发明所述肽含有有价值的小肽作为免疫抗原。用于给动物免疫的多肽或肽可以衍生于翻译的cDNA或化学合成，如果期望，其可以与载体蛋白质连接。这些通常所用的与肽化学偶联的载体包括，匙孔血蓝蛋白(KLH)、甲状腺球蛋白、牛血清清蛋白(BSA)和破伤风毒素。然后将偶联肽用于使动物免疫(例如小鼠、大鼠或兔子)。
如果期望，可以进一步纯化多克隆或单克隆抗体，例如通过与基质结合并且从基质洗脱，基质与用于产生抗体的多肽或肽结合。那些本领域的技术人员将知道多种在免疫领域常用的用于多克隆抗体以及单克隆抗体的纯化和/或浓缩技术(例如参见Coligan等人，第9单元，Current Protocols in Immunology，Wiley Interscience，1991，引用作为参考)。
使用抗独特型抗体技术来生产模拟抗原决定簇的单克隆抗体也是可能的。例如，产生第针对一单克隆抗体的抗独特型单克隆抗体将在高变区有一个结合域，高变区是被第一单克隆抗体结合的抗原决定簇的“图象”。
本发明的抗体包括多克隆抗体、单克隆抗体以及多克隆抗体和单克隆抗体的片断。
多克隆抗体的制备对本领域的技术人员是熟知的。参见，例如Green等人，Production of Polyclonal Antisera，出处为Immunochemical Protocols(Manson编著)，1-5页(HumanaPress1992)；Coligan等人，Production of Polyclonal Antisera inRabbits，Rats，Mice and Hamsters，出处为Current in Immunology，2.4.1部分(1992)，将其引用于此作为参考。
同样地单克隆抗体的制备是常规性的。参见，例如Kohler &Milstein，Nature，256：495(1975)；Coligan等人，2.5.1-2.6.7部分；和Harlow等人，Antibodies：A Laboratory Manual，726页(ColdSpring Harbor Pub.1988)，将其引用于此作为参考。可选择地，抗体可以衍生于“人源化”单克隆抗体。人源化单克隆抗体是通过将来自小鼠免疫球蛋白的重链可变区和轻链可变区的小鼠互补性决定区转移到人类可变域中，然后在鼠科对等物的构架区中取代人类残基而产生的。使用衍生于人源化单克隆抗体的抗体成分避免了与鼠科恒定区的免疫原性相关的潜在问题。已经有对克隆鼠科免疫球蛋白可变域的一般技术进行的描述，例如，由Orlandi等人，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA，86：3833(1989)描述，将其完整引用于此作为参考。已经有对产生人源化单克隆抗体的技术进行的描述，例如，由Jones等人，Nature，321：522(1986)；Riechmann等人，Nature，332：323(1988)；Verhoeyen等人，Science，239：1534(1988)；Carter等人，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA，89：4285(1992)；Sandhu，Crit.Rev.Biotech.，12：437(1992)；和Singer等人，J.Immunol.，150：2844(1993)描述，将这些文献引用于此作为参考。
在另一个实施方案中，本发明提供了自反应细胞的产生，所述自反应细胞可以识别器官专有抗原并且可以产生抑制病原性细胞的活性而不是有潜力促进疾病的介质。例如，期望选择性地刺激免疫调制剂化合物的产生，例如细胞因子如IL-4、IL-10、IL-9、IL-13和TGF-9。应该意识到这些免疫调制剂化合物的诱导可能与T细胞所有组成成分的范围中的选择抗原决定簇的识别，引发过程中的细胞因子范围，以及接种方式有关。值得注意地，应该意识到该策略不限于对自身免疫疾病的发病机理起决定性的抗原，但潜在地使用了任意的器官专一性抗原。同样地，这些免疫调制剂化合物的选择性诱导在改善自身免疫病症上有几个优点。例如，该治疗不需要识别那些触发发病机理的抗原决定簇，相反地它可能提供对各种抗原决定簇起作用的T细胞的宽基旁立者抑制(broad-based bystander suppression)。而且，由于在抗原治疗过程中存在病原性T细胞的短暂激活阶段，该策略将限制了疾病恶化的风险，并且由于其挫败了病原性T细胞对外周耐受性机理介导的无反应性和缺失。
在另一个实施方案中，本发明的肽在用于调制(如阻止或抑制)免疫介导疾病(即与免疫应答相关的疾病)的药物组合物中被用作免疫试剂。因此，本发明的肽意在包括其盐和功能衍生物，以及hsp60肽类似物，只要对于调制免疫介导疾病(即与免疫应答相关的疾病)而言，维持了蛋白质或肽的生物活性。
在具有这种危险的患者中，本发明的肽(如具有一个如SEQ ID NO：2，3，4，5，6，7，8，9或10中阐述的序列的肽)在免疫介导疾病发展之前被优选施用。术语“之前”意指一段时间，在这段时间中基于hsp60自身免疫的反应是由在宿主中的这种治疗调制的，优选地在使得最优调制(如下调)与炎症反应的时间一致的时间。可选择地，本发明的肽可以与另一种抗炎试剂联合施用，如抗炎细胞因子或抗-TNFI试剂。
在本发明中，可以通过本领域已知的各种途径来施用药物组合物，如局部地、口服地、鼻内地、静脉内地、肌内地或皮下地，所述药物组合物含有hsp60肽或其类似物作为免疫活性试剂在患者中调制炎症。优选的施用方式是已知诱导耐受性的静脉内方式，或已知诱导TH1→TH2转换的口服或鼻内方式。本发明所述肽或其类似物的优选剂量将依赖于多种因素，包括疾病类型、患者年龄和患者体重，以及症状的严重性。本领域的技术人员可以根据经验确定适当的剂量。例如，通过测量TH1细胞因子应答到TH2细胞因子应答的转换，本领域的技术人员将可以确定最适剂量和服用方式。
可以在免疫或炎症反应过程中或之后给予本发明的肽或其类似物，以进一步调制(如降低或下调)炎症反应。适用于本发明的这些方法和组合物的炎症反应包括，例如，自身免疫疾病或病症(如胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)、多发性硬化症、系统性红斑狼疮、Sjogren综合症、硬皮病、多肌炎、慢性活动型肝炎、混合型结缔组织病、原发性肝汁性肝硬变、恶性贫血、自免疫性甲状腺炎、自发性艾迪生病、白癜风、非热带性口炎性腹泻、格雷夫斯病、炎症肠病、重症肌无力、自免疫性中性白细胞减少、自发性血小板减少性紫斑病、类风湿性关节炎、硬化、慢性天疱疮、自免疫性不育、古德帕斯彻综合症、大疱性类天疱疮、盘状狼疮、溃疡性结肠炎和膜增殖性肾小球肾炎)。正如此处所指的，上述列出的疾病包括那些用于这些疾病的动物模型所表现的疾病，例如用于IDDM的非肥胖糖尿病(NOD)小鼠和用于多发性硬化症的实验性自身免疫脑脊髓炎(EAE)小鼠。
通过调制(如降低或消除)针对患者本身(自己)组织的免疫应答，或可选择地，通过降低或消除针对被移植的用以取代被自身免疫应答破坏的自身组织或器官的组织或器官的先存在原始自身免疫应答，本发明的方法可以被用来治疗这些自身免疫介导疾病和炎症疾病或病症。
一种或多种本发明所述肽(如具有如SEQ ID NO：2，3，4，5，6，7，8，9或10中阐述的序列的肽)的施用优选地伴随着传统抗炎或免疫抑制治疗的施用。
期望hsp60蛋白质的不同抗原决定簇，如那些在表1中给出的(如SEQ ID NO：2，3，4，5，6，7，8，9或10)，在不同个体中的炎症应答中可能更有效。因此，可以针对指定患者的外周血淋巴细胞对本发明所述肽进行筛选，以观察哪一个肽对炎症具有最佳效果。例如，II类MHC分子与长度为12-15个氨基酸残基的肽(如短至9个氨基酸残基)结合，并且I类MHC分子与7-9个氨基酸残基的肽结合。因此，可以容易地对hsp60的肽片断如那些在表1中给出的肽片断进行筛选，以确定可以被施用于特定个体患者，或施用于给定的HLA型以便调制个体的免疫应答，例如，以便转换至TH2细胞因子应答并且从而下调他的/她的炎症的一个或多个最佳肽。
通过本领域熟知的Ficoll-Hypaque密度梯度离心，可以从全血来分离个体人类患者的外周血淋巴细胞(PBL)。可以测试患者的淋巴细胞样品与被筛选的肽的结合，根据Mozes等人，美国专利5,356,779中公开的方法，或者可以测试其体外T细胞增殖和随后的T细胞细胞因子应答，正如对特定个体或者确定最佳或近似最佳的肽序列的分析。
另一种筛选一组肽的方式是在存在该组肽的每一种的情况下测试患者淋巴细胞的体外增殖，或者测试由这些肽引起的TH1→TH2转换。因此，可以在不同时间点收集在5-50ug/ml的浓度下用这些肽培养的T细胞的上清液，并且测试各种细胞因子的活性，如分泌到培养基中的IFNK和IL-4，可以用标准ELISA流程通过ELISA对其量化，或者测试特定类别的抗体的存在。TH1细胞分泌诱导T细胞增殖的细胞因子，和介导组织炎症的细胞因子如IFNK。另一方面，TH2细胞分泌IL-4，其有助于θ-细胞分泌IgG和IgE类型的抗体，并且有助于抑制TH1炎症细胞因子的产生，以及IL-10，其通过影响抗原呈递和用巨噬细胞产生炎症细胞因子而间接地阻止TH1激活。因此，体外增殖的T细胞的细胞因子组成成分的测量也将是从TH1 T细胞应答到TH2 T细胞应答的转换的迹象。因此，TH1→TH2转换可以在确定最佳或近似最佳肽中作为监控患者的T淋巴细胞针对各种测试肽的体外应答的标志。
本发明的治疗方式和药物组合物可以与额外的免疫应答增强子或生物应答调节剂一起使用，包括但不限于细胞因子IFN-I、IFN-K、IL-2、IL-4、IL-6、TNF或其它影响免疫细胞的细胞因子。
对于体外应用，本发明的一种或多种肽可以通过粘膜(如通过栓剂、吸入剂或口服)，肠胃外注射，或者通过在一定时间内逐渐灌注施用。施用可以是口服、静脉内、腹膜内、肌内、皮下、腔内或经皮施用。本发明的一种或多种肽也可以与佐药、激素、细胞因子、皮质类固醇或类似物共同施用。为了体外研究，可以将这些试剂加入或溶解在适当的生物学上可接受的缓冲剂中，并且加入到细胞或组织中。
肠胃外施用的制剂包括无菌水溶液或不含水的溶液、悬浮液和乳液。不含水的溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油，和可注射的有机酯如油酸乙酯。含水载体包括水、酒精/水溶液、乳液或悬浮液，包括含盐和缓冲介质。肠胃外赋形剂包括氯化钠溶液、林格氏(Ringer)葡萄糖、葡萄糖和氯化钠，分泌乳汁的林格氏静脉内赋形剂包括流体和营养补充剂、电解质补充剂(如那些基于林格氏葡萄糖的补充剂)等等。也可以存在防腐剂和其它添加剂，例如抗菌剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等等。
应该想象到，本发明可以被用来通过在被治疗的患者中调制免疫应答来治疗与免疫介导病症相关的病状，如炎症和自身免疫病症、病原性感染和患癌或癌前期状况。因此，本发明包括改进与免疫介导疾病相关的病症的方法，免疫介导疾病包括那些与针对自身抗原的抗原专一性免疫应答相关疾病。本发明的方法包括，在病症或疾病位点，用一种或多种本发明的肽，例如具有如SEQ ID NO：2，3，4，5，6，7，8，9或10中阐述的一个序列的肽，或其类似物，来治疗有病症或疾病状况的患者。通常，在此所用，术语“治疗”或“治疗作用”和类似表达指影响患者、组织或细胞，以获得期望的药理和/或生理效果。以完全或部分地阻止疾病或迹象或其症状的观点而言，效果可以是预防性的，和/或以部分或完全治疗感染或疾病和/或有助于感染或疾病的反作用的观点而言，效果可以是治疗性的。在此所用，“治疗”包括对脊椎动物、哺乳动物，尤其是人类疾病的任何治疗或预防，包括：(a)防止可能有病症趋向的病症在患者体中发生，但仍然没有诊断出已患病；(b)抑制病症，即阻止其发展；(c)减轻或改善病症，即使得病症消退，或(d)调制正在发生的介导病症的免疫应答，以便阻碍疾病或病症的发展。
正如此处所描述的，本发明包括各种药物组合物，其可用于改善有助于免疫介导病症的症状。根据本发明的一个实施方案的药物组合物是通过用载体、赋形剂和添加剂或助剂将针对如下物质的抗体制成适合施用于患者的形式，这些物质包括具有选自SEQ ID NO：2，3，4，5，6，7，8，9或10的一个序列的肽、前述序列的肽类似物、前述的肽模拟、药物、化学制品，或调制本发明的肽的生物活性的化学制品或试剂的组合。经常使用的载体或助剂包括碳酸镁、二氧化钛、乳糖、甘露醇和其它糖、滑石粉、牛乳蛋白质、凝胶、淀粉、维生素、纤维素及其衍生物、动物和植物油、聚乙二醇和溶剂，如无菌水、醇、甘油和多元醇。静脉内赋形剂包括流体和营养补充剂。防腐剂包括抗菌剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体。其它药物学上可接受的载体包括水溶液、无毒赋形剂，包括盐、防腐剂、缓冲剂等等，正如所描述的，例如Remington’s Pharmaceutical Sciences，第15版，Easton：Mack Publishing Co.，1405-1412，1461-1487(1975)和The NationalFormulary XIV.，第14版，Washington：American PharmaceuticalAssociation(1975)，将其内容引用于此作为参考。根据本领域常规技能对药物组合物的各种成分的pH值和精确的浓度进行调节。参见Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis forTherapeutics(第7版)。
优选地以剂量单位制备且施用该药物组合物。固态剂量单位是片剂、胶囊和栓剂。对于患者的治疗，依赖于化合物的活性、施用方式、病症的性质和严重性、患者的年龄和体重，日剂量必需不同。然而，在某些情况下，较高或较低的日剂量可能更适当。日剂量的施用可以以个体剂量单位的形式通过单一施用完成，或者几个较小剂量单位，也可以通过在特定的时间间隔多次施用细分剂量完成。
根据本发明的药物组合物可以以治疗上有效的剂量局部地或全身地施用。当然，使用的有效量将依赖于疾病的严重性和患者的体重和一般状况。典型地，体外使用的剂量在原位施用该药物组合物的量上可以提供有用的指导，并且可以用动物模型来确定治疗特殊病症的有效剂量。已有对各种考虑因素的描述，例如参见Langer，Science，249：1527，(1990)；Gilman等人，(编著)(1990)，将每一种参考文献引用于此作为参考。
在一个实施方案中，本发明提供了一种药物组合物，其可用于将本发明所述肽、其类似物或编码本发明所述肽的核酸施用于需要这种治疗的患者。“施用”本发明的药物组合物可以用熟练技术人员已知的任何方法来完成。优选地，“患者”指哺乳动物，最优选地指人类，但可以是任何生物体。
本发明的肽或抗体可以通过口服、肠胃外、肠、注射、快速灌输、鼻咽吸收、皮肤吸收、直肠和口服施用。用于肠胃外施用的药物上可接受的载体制剂包括无菌或水溶液或不含水的溶液、悬浮液和乳液。不含水的溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油，和可注射的有机酯如油酸乙酯。可以用用于闭塞敷料的载体来增加皮肤渗透性并且提高抗原吸附性。用于口服施用的液体剂量形式通常可以包括含有液体剂量形式的溶液。合适的固体或液体药物制剂形式是，例如颗粒、粉末、片剂、包衣片剂、(微)胶囊、栓剂、糖浆、乳液、悬浮液、膏状物、气溶胶、滴剂或以一次用量的针剂形式的可注射的溶液，以及具有活性化合物的持久释放的制剂，在其制备中赋形剂和添加剂和/或助剂如崩解剂、粘合剂、包衣剂、溶胀剂、滑润剂、调味料、甜味佐料和酏剂含有在本领域通常所用的惰性稀释剂，如净化水。
另一个用于本发明核酸和肽序列的传递系统是胶体分散系统。胶体分散系统包括大分子络合物、纳米囊剂、微球体、小珠等等。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种鉴定一种与hsp60蛋白质或本发明的肽作用或者调制hsp60蛋白质的活性或本发明所述肽的生物活性的试剂的方法，包括含有该试剂和本发明所述肽(如具有一个如SEQ ID NO：2，3，4，5，6，7，8，9或10中阐述的序列的肽)的温育成分，或者表达该肽的重组细胞，条件是足以使试剂互相作用，并且确定该试剂对该多肽或肽的活性的影响。在此所用，术语“影响”包括任何可以调制肽的活性的方法，并且包括通过物理方式测量该试剂与该肽的相互作用，所述物理方式包括例如，荧光检测试剂与肽的结合。正如在此所所描述的，“试剂”可以包括，例如，多肽、肽模拟体(peptidomimetics)、化学化合物、小分子和生物试剂。
温育包括允许测试试剂与本发明所述肽，或者表达本发明所述肽的细胞接触的条件。接触包括在溶液中和在固相中。测试试剂可以任选地是筛选多种试剂的组合文库。可以进一步对在本发明的方法中鉴定的试剂进行评价、检测、克隆、测序等等，或者在溶液中或者在与固相支持物结合之后，通过通常用于检测特定DNA序列如PCR、寡聚体限制酶(Saiki等人，Bio/Technology，3：1008-1012，1985)、寡核苷酸连接分析(OLA)(Landegren等人，Science，241：1077，1988)等等的任何方法。已经对用于DNA分析的分子技术进行讨论(Landegren等人，Science，242：229-237，1988)。
研究领域是治疗处理方法的开发。筛选鉴定在定向生物体内调制本发明所述肽的生物活性的试剂。特别感兴趣的是用于对人类具有低毒性或数量减少的副作用的筛选分析。
在此所用，术语“试剂”描述了有能力改变或模仿具有一个如SEQID NO：2，3，4，5，6，7，8，9或10中阐述的序列的肽的生理机能或该肽表达的任何分子，如蛋白质或药物。通常，多种分析混合物是与不同试剂浓度并行作用的，以获得对各种浓度的有差别的应答。典型地，这些浓度中的一种作为负对照组，即在零浓度或低于检测水平。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种鉴定调制(如抑制)与hsp60相关的病症(如炎症病症或疾病)的试剂的方法，该方法是通过将有效量的含有本发明所述肽或其类似物或与hsp60相关性病症相互作用或抑制其症状的试剂(如抗体、核酶、反义分子或双链干扰RNA分子)的组合物施用于细胞或具有与hsp60相关的病症的患者来鉴定的。症状可以包括，例如此处所鉴定的细胞因子的产生，TH1和TH2应答，以及与炎症相关的病理学(如肿胀、血管舒张等等)。
体内和体外hsp60或dnaJP1多肽的检测
在又一个实施方案中，本发明提供了一种在患者体中检测hsp60多肽的方法，该方法包括用结合到细胞多肽上(下文称为细胞成分)的试剂(如特定地与SEQ ID NO：2，3，4，5，6，7，8，9或10中阐述的肽序列结合的抗体)接触含有或怀疑可能含有hsp60或dnaJP1多肽的细胞成分。细胞成分除了hsp60或danJP1多肽之外可以含有核酸，如DNA或RNA。当细胞成分是蛋白质时，试剂通常是抗体探针。探针是被检测标记的，例如用放射性同位素、荧光化合物、生物发光化合物、化学发光化合物、金属螯合剂或酶。本领域的普通技术人员将已知其它适合于结合抗体或核酸探针的标记物，或将能够用常规实验方法确定这些。在本领域有许多对普通技术人员来说是已知的不同标记物和标记方法。可以在本发明中使用的标记物类型的实例包括酶、放射性同位素、胶体金属、荧光化合物、化学发光化合物和生物发光化合物。
针对本发明所述肽(如具有一个如SEQ ID NO：2，3，4，5，6，7，8，9或10中阐述的序列的肽)的本发明的单克隆抗体可用于抗原的体内和体外检测。检测标记过的单克隆抗体以诊断上有效的剂量给出。术语“诊断上有效”指检测标记过的单克隆抗体的量以足量施用，以便能检测对单克隆抗体来说专一的蛋白质或多肽抗原。
施用于患者的检测标记过的单克隆抗体的浓度应该足量，以便当与背景比较时，与具有hsp60多肽序列的那些细胞、体液或组织的结合是可检测的。而且，期望从循环系统中快速地清除掉检测标记过的单克隆抗体，以便给出靶物质与背景的最佳信号比率。
对于体内诊断，放射性同位素可以直接或间接地通过使用中间官能基团与免疫球蛋白结合。通常用于将作为金属离子存在的放射性同位素与免疫球蛋白结合的中间官能基团是双官能螯合剂，如二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)和亚乙基二胺四乙酸(EDTA)和类似分子。可以结合本发明所述单克隆抗体的金属离子的典型实例是111In、97Ru、67Ga、68Ga、72As、89Zr和201Tl。
也可以用用于体内诊断的顺磁同位素来标记本发明的单克隆抗体，正如在磁共振成像(MRI)或电子自旋共振(ESR)中。一般而言，可以使用任何用于形成肉眼观察诊断成像的传统方法。通常，γ和正电子发射放射性同位素被用于摄象机成像，并且顺磁同位素被用于MRI。在这些技术中特别有用的元素包括157Gd、55Mn、162Dy、52Cr和56Fe。
在某些情况下，局部地(如在特定组织或细胞类型内)传送且表达本发明的肽序列是有利的。例如，在软骨组织、胰腺组织、皮肤组织或动物的内脏组织中局部表达本发明的肽(如具有一个如SEQ ID NO：2，3，4，5，6，7，8或9中阐述的序列的肽)。例如，可以将核酸序列直接传送给组织和细胞。这些提供方法在本领域是已知的，包括电穿孔、病毒性载体和直接DNA摄取。
例如，本发明的核酸构建物将包括核酸分子，为适合摄取到宿主组织内的靶细胞中的形式。核酸可以是裸的DNA或RNA分子的形式，其中该分子可以包括一个或多个结构基因、一个或多个调节基因、反义链、能形成三股螺旋结构的链或类似物。通常，核酸构建物将包括至少一种在合适的调节区的转录和翻译控制下的结构基因。更通常地，本发明地核酸构建物将包括被引入到传送载体中的核酸，以提高转染效率，其中传送载体将被分散到包括干燥的亲水赋形剂物质的较大颗粒中。
一个这样的传送载体包括病毒载体，如反转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒，它们已经被失活以防止自复制，但它们维持了自然的病毒能力，以结合靶宿主细胞，将遗传物质传送到靶宿主细胞的细胞质中，并且促进结构基因或被引入到颗粒中的其它基因的表达。用于介导基因转移的合适的反转录病毒载体在Kahn等人(1992)CIRC.RES.71：1508-1517中有所描述，将其公开内容引用于此作为参考。合适的腺病毒基因传送在Rosenfeld等人(1991)Science 252：431-434中有所描述，将其公开内容引用于此作为参考。对反转录病毒和腺病毒传送系统，两者在Friedman(1998)Science 244：1275-1281中有所描述，也将其公开内容引用于此作为参考。
实施例1
肽的鉴定
为了鉴定滥交的泛-DR肽，使用了在美国专利6,037,135(将其完整引用于此作为参考)中描述的计算机算法，该算法鉴定肽与各种II类MHC分子的结合的模体。对分枝杆菌和人类hsp60的序列都进行了扫描，并且基于肽序列与HLADR的三个亚型的预定结合来设计肽(表1)，三个亚型名为DR1、DR4和DR7。肽是在与DR1、4和7的预定结合的水平上选择的。已经通过体外实验证明了本发明所述肽包括那些在表1中列出的肽具有如下能力：诱导自反应T细胞的增殖能力，或诱导细胞因子(如淋巴因子)从这些T细胞分泌的能力，或诱导其它效应子功能如细胞毒性的能力。
当可以预知用计算机算法鉴定的抗原决定簇HLA DR1、DR4和DR7(泛-DR得分＝3)有足够的亲和力时，该抗原决定簇被认为是合格的。随后用这样的方式设计一个15-寡聚体的肽，在预知的核心抗原决定簇的两侧存在至少两个，但优选地是三个侧冀氨基酸残基。随后用每一个肽的同源(人类或分枝杆菌)对应物匹配每一个含有一个泛DR结合抗原决定簇的肽。用这种方式，总共设计了8个肽，4个分枝杆菌肽(p1，p3，p5，p7)和4个同源人类肽(p2，p4，p6，p8)。表1给出了这些肽。
实施例2
T细胞增殖
为了测试T细胞增殖，用表1的肽接触外周血单核细胞(PBMC)的直接培养物。测试患有JIA的80多个患者。该组包括随机选择的在疾病活性和医疗治疗的不同阶段患有JIA的所有亚型的患者。用标准增殖分析测试患者的PBMC。PBMC是用Ficoll Isopaque密度梯度从肝素化血液中分离的。PBMC是在含有15％AB血清的RPMI中，在96孔圆底平板中，以每孔每200微升(T1)200,000个细胞培养的。在37℃下在5％的CO2中，以100％的相对湿度将细胞培养6天(120小时)。在培养的最后16小时中，将1Tci(＝37kBq)氚化胸腺嘧啶核苷加入到每一孔中。用液体闪烁计数测量引入的放射性，并且表示为每分钟闪烁数(cpm)。增殖应答的数量被表示为cpm，并且作为刺激指数(SI)：用抗原培养的细胞的平均cpm除以在单独用培养基培养的细胞的平均cpm。SI为2或更高被认为是针对抗原的正应答。结果在图1给出。大多数患者对人类和分枝杆菌全hsp60都表现出正T细胞增殖应答，正如从先前的数据中所预料的。所有hsp60肽在40-60％的患有JIA的患者中诱导肽特异性增殖T细胞应答。
在18个患有JIA的较小的组中，将抗原特异性细胞因子产生的测量与T细胞增殖结合起来。PBMC是如上边所述的，在一个96孔平板中以每孔200 T1以200,000个细胞培养的。在72小时后，除去上清液，并且根据制造商的流程(B&D)用标准ELISA测量细胞因子产生。对下述细胞因子进行了测试：IL-4、IL-10、IFN-K、TGF-θ、TNF-I和IL-lRA。图2-4给出了在用泛DR结合肽培养72小时后，IL-10、IFN-K和TNF-I的抗原特异性细胞因子产生。而且，在大多数患者中，可以在用肽体外培养的PBMC中检测到抗原特异性细胞因子产生。没有检测到IL-4的抗原特异性产生，这可能是由于细胞因子ELISA的敏感性。
抗原的免疫识别可以被定义为用特定抗原培养后的抗原特异性T细胞增殖和/或抗原特异性细胞因子产生。而且，在患者中的非常高的百分比中(范围从60％-100％)，可以检测到这些泛DR结合hsp60肽的T细胞识别(图5)。如果有人考虑先前在JIA中确定T细胞抗原决定簇以及在患有JIA的患者中确定异源HLA背景的研究失败的话，那么这个百分比被认为非常高。
如果有人将这样鉴定的肽与先前已经通过关节炎的大鼠模型鉴定的肽进行比较，那么此处使用的方法的优势性就变得很明显。在先前在佐剂性关节炎的模型的研究中，已经表现出含有氨基酸256-270的分枝杆菌hsp60肽可以在佐剂性关节炎中诱导保护。在这个发现之后，已经付出了很多努力来尝试鉴定在患有JIA的患者中存在256-270特异性T细胞。基于由计算机算法提供的数据，我们设计了一种与256-270aa肽相比而言的一种新肽。正如在大多数JIA患者中由T细胞增殖和细胞因子产生所确定的，这个新肽，分枝杆菌hsp60254-268(p1)确实可以诱导T细胞应答；然而在患有JIA的患者中没有识别到256-270肽。数据在图6中给出。因此，用与DR1、DR4和DR7的预定结合已经提供了一种非常有效的方式在患有JIA的患者中鉴定T细胞抗原决定簇。
实施例3
鉴定DNAJP1在患有RA的病人中作为促炎抗原决定簇
来自热休克蛋白dnaJ的肽被先前鉴定为T细胞增殖和来自RA病人的外周血液和滑液细胞的促炎细胞因子产生的触发物。该肽(dnaJP1：QKRAAYDQYGHAAFE)(SEQ ID NO：10)与“共同表位”共享序列同源性，共同表位是一个在RA相关性HLA等位基因中共同存在5个氨基酸的片段。该研究是I期免疫耐受性(Phage I Immune Tolerization)研究，用来确定在RA病人中，HLA和衍生于dnaJ的肽之间的相互影响是否维持并且刺激T细胞，其参与自身免疫炎症。设计了该实验(完成的病人的n＝13)，以便遵守用于效力评价的American College ofRheumatology(ACR)20标准。
来源于I期的数据：在图7A-E和8A-E中给出的数据来源于相位I实验，在该实验中用dnaJP1 qd po的3种不同剂量对总共13个人类RA病人进行了6个月的治疗。免疫学数据：通过在用本发明的肽dnaJP1和用对照组治疗的病人中测量T细胞增殖和细胞因子产生，在每月时间间隔对针对dnaJP1的体外T细胞应答进行监控。对照组包括促细胞分裂原(植物血凝素(PHA))和不相关的肽dnaJpV(DERAAYDQYGHAAFE)(SEQ ID NO：11)，在病人体中不刺激的改变了的配体肽，和PADRE，设计的泛-DR结合肽(KXVAAWTLKAA)(SEQ IDNO：12)。来自用10Tg/ml的dnaJP1刺激了5天的7个病人的PBMC的T细胞增殖应答的结果在图7A-E中给出(通过在每月时间间隔完成的FASC进行评价)。图7A-E的用于FACS细胞因子数据分析的对照实验(没有给出)包括来自用PADRE治疗的临床实验的4个病人的PBMC的促炎胞内细胞因子IL-2、IFN-K和TNF-I的产生的FACS测量值。对照组也包括通过用PADRE治疗的临床实验中的4个病人的PBMC产生的耐受原胞内细胞因子IL-F和IL-10的FACS测量值。
由于RA的周期性性质，带有症状缓解和复发，以及研究病人数量少，重要的是表明发现的免疫变化是治疗诱导性的，不依赖于一组病人的更加普通的激活“状态”，其中这组病人是被偶然地被周期在一起的。
也可以用在三个不同时间点采取用dnaJP1刺激，从来自4个未治疗的病人的PBMC产生的耐受原胞内细胞因子IL-F和IL-10得到FACS测量值。耐受原研究的结果表明，在图7A-E中给出的免疫变化是治疗特异性的并且是治疗诱导的。
图8A-E表明了用dnaJP1刺激的病人(n＝13)中的病人的自我评价所完成的(风湿病学疾病活性的快速评价，RADAR)试验结果。
尽管每一次努力都是为了保持评价的完整性，这里应该强调，此处描述的像I期这样的开放标记试验的性质仅可以提供与治疗效力相关的趋势。根据ACR 20标准，84.6％的病人可以被分类为应答者。
尽管上述描述的方法和组合物是那些典型的可以被用来完成本发明的某些方面，也可以使用本领域技术人员已知的其它方法。
而且，根据上述教导，对本发明的许多修改和变化也是可能的，因此，在所附权利要求的范围内，除了详细描述过的，也可以使用本发明。应该理解到，尽管已经参考上述描述对本发明进行了描述，但前述描述意在说明，但不限定，本发明的范围。本发明的其它方面、优点和修改在下述权利要求的范围内。所有此处提及的出版物、专利申请、专利和其它参考文献都被完整引用于此作为参考。

Claims (59)

1.一种基本上纯的HLA泛DR结合肽，其包括与一种或多种II类MHC分子结合的应激蛋白的片断。
2.如权利要求1的基本上纯的肽，其中所述肽结合HLADR1、DR4和DR7。
3.如权利要求1的基本上纯的肽，其中所述肽包括一个在人类和细菌热休克蛋白之间保守的氨基酸序列。
4.如权利要求1的基本上纯的肽，其中所述肽包括一个在人类和分枝杆菌蛋白之间保守的氨基酸序列。
5.如权利要求1的基本上纯的肽，其中所述肽与SEQ ID NO：2，3，4，5，6，7，8，9或10中阐述的一个序列是至少70％相同的。
6.如权利要求5的基本上纯的肽，其中所述肽与SEQ ID NO：2，3，4，5，6，7，8，9或10中阐述的一个序列是至少80％相同的。
7.如权利要求5的基本上纯的肽，其中所述肽与SEQ ID NO：2，3，4，5，6，7，8，9或10中阐述的一个序列是至少90％相同的。
8.如权利要求5的基本上纯的肽，其中所述肽与SEQ ID NO：2，3，4，5，6，7，8，9或10中阐述的一个序列是至少95％相同的。
9.如权利要求5的基本上纯的肽，其中所述肽具有一个如SEQ IDNO：2，3，4，5，6，7，8，9或10中阐述的序列。
10.如权利要求1的基本上纯的肽，其中所述应激蛋白是热休克蛋白。
11.如权利要求10的基本上纯的肽，其中所述热休克蛋白是细菌热休克蛋白。
12.如权利要求10的基本上纯的肽，其中所述热休克蛋白是分支杆菌种类热休克蛋白。
13.如权利要求12的基本上纯的肽，其中所述分支杆菌种类热休克蛋白是hsp65或hsp60。
14.如权利要求10的基本上纯的肽，其中所述热休克蛋白是哺乳动物热休克蛋白。
15.如权利要求14的基本上纯的肽，其中所述哺乳动物热休克蛋白是人类热休克蛋白。
16.如权利要求15的基本上纯的肽，其中所述人类热休克蛋白是人类hsp60。
17.如权利要求1的基本上纯的肽，其中所述片断的长度是大约10-30个氨基酸。
18.如权利要求17的基本上纯的肽，其中所述片断的长度是大约15-25个氨基酸。
19.如权利要求17的基本上纯的肽，其中所述片断的长度是大约15-20个氨基酸。
20.如权利要求1的基本上纯的肽，其中所述肽具有一个或多个D-氨基酸。
21.如权利要求5的基本上纯的肽，其中SEQ ID NO：2，3，4，5，6，7，8，9或10中的一个或多个氨基酸已经被一个或多个具有类似大小、电荷和极性的氨基酸所取代。
22.如权利要求1的基本上纯的肽，其中所述肽是与佐剂共价连接的。
23.如权利要求22的基本上纯的肽，其中所述佐剂是匙孔血蓝蛋白、牛血清清蛋白和人血清清蛋白或同源IgG。
24.一种药物组合物，其在药物上可接受的载体中包括一种如权利要求1所述的肽。
25.一种编码权利要求1所述肽的分离的核酸序列。
26.如权利要求25的核酸序列，其中所述序列编码具有一个如SEQID NO：2，3，4，5，6，7，8，9或10中阐述的序列的肽。
27.如权利要求26的分离的核酸序列，其中T可以是U或前述的互补序列，以及长为15-20个核苷酸，并且特定地与编码具有一个如SEQ ID NO：2，3，4，5，6，7，8，9或10中阐述的序列的肽杂交的序列。
28.一种特异地与权利要求1所述肽结合的抗体。
29.如权利要求28的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体。
30.如权利要求28的方法，其中抗体是在药物上可接受的载体中配制的。
31.一种以可操作连接含有权利要求25，26或27所述的核酸序列的表达载体。
32.一种含有权利要求31所述载体的宿主细胞。
33.一种用于治疗或抑制炎症病症的免疫调制组合物，其包括一种基本上纯的肽，所述肽包括在药物上可接受的载体中与一种或多种II类MHC分子结合的应激蛋白的片断。
34.如权利要求33的免疫调制组合物，其中所述片断与HLADR1、DR4和DR7结合。
35.如权利要求34的组合物，其中所述炎症病症是免疫介导疾病。
36.如权利要求34的组合物，其中所述免疫介导疾病是自身免疫疾病。
37.如权利要求34的组合物，其中所述免疫介导疾病是选自多发性硬化症(MS)、类风湿性关节炎、红斑狼疮、I型糖尿病、硬皮病、重症肌无力和溃疡性结肠炎。
38.如权利要求34的组合物，其中所述基本上纯的肽具有一个如SEQ ID NO：2，3，4，5，6，7，8，9或10中阐述的序列。
39.如权利要求34的组合物，其进一步包括一种生物应答调节物。
40.如权利要求39的组合物，其中所述生物应答调节物选自细胞因子、趋化因子、激素、类固醇和白细胞介素。
41.如权利要求40的组合物，其中所述生物应答调节物是干扰素。
42.如权利要求39的组合物，其中所述生物应答调节物选自IL-1(α或β)，，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-10，IL-11，IL-12，GM-CSF，M-CSF，G-CSF，LIF，LT，TGF-β，γ-IFN，TNF-α，BCGF，CD2或ICAM。
43.一种在患有疾病或处于患病风险的被试者中治疗或预防免疫介导疾病的方法，该方法包括将有效量的基本上纯的肽施用于被试者，这些肽包括在药物上可接受的载体中能与II类MHC分子结合的应激蛋白的片断，其中所述肽调制免疫应答，从而治疗或预防该疾病。
44.如权利要求43的方法，其中所述被试者是哺乳动物。
45.如权利要求44的方法，其中所述被试者是人。
46.如权利要求43的方法，其中所述免疫介导疾病是自身免疫疾病。
47.如权利要求43的方法，其中所述免疫介导疾病是选自多发性硬化症(MS)、类风湿性关节炎、红斑狼疮、I型糖尿病、硬皮病、重症肌无力和溃疡性结肠炎。
48.如权利要求43的方法，其中所述免疫介导疾病是癌症。
49.如权利要求43的方法，其中所述癌症选自黑素瘤，白血病，淋巴瘤，肺、肝脏、肾、脑、膀胱实体瘤，视网膜母细胞瘤、肉瘤和结缔组织癌。
50.如权利要求43的方法，其中所述免疫介导疾病是感染性疾病。
51.如权利要求43的方法，其中所述基本上纯的肽有一个如SEQ IDNO：2，3，4，5，6，7，8，9或10中阐述的序列。
52.一种在被试者中调制免疫应答的方法，该方法包括将有效量的基本上纯的HLA泛DR-结合肽施用于被试者，这些肽包括与一种或者更多种II类MHC分子结合的应激蛋白的片断。
53.如权利要求52的方法，其中所述片段与HLADR1、DR4和DR7结合。
54.如权利要求52的方法，其中所述被试者是哺乳动物。
55.如权利要求54的方法，其中所述哺乳动物是人类。
56.如权利要求52的方法，其中所述免疫应答与免疫介导疾病相关，这些疾病选自多发性硬化症(MS)、类风湿性关节炎、红斑狼疮、I型糖尿病、硬皮病、重症肌无力和溃疡性结肠炎。
57.如权利要求52的方法，其中所述免疫应答与感染性疾病相关。
58.如权利要求52的方法，其中所述免疫应答与免疫介导癌症相关，这些癌症选自黑素瘤，白血病，淋巴瘤，肺、肝脏、肾、脑、膀胱实体瘤，视网膜母细胞瘤，肉瘤和结缔组织癌。
59.如权利要求52的方法，其中所述基本上纯的肽有一个如SEQ IDNO：2，3，4，5，6，7，8，9或10中阐述的序列。
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