CN1678731A

CN1678731A - 多室生物反应器

Info

Publication number: CN1678731A
Application number: CNA038205068A
Authority: CN
Inventors: 约翰·P·威克思沃; 费朗茨·J·鲍德巴赫; 大卫·克里福; 弗雷德里克·R·哈赛顿; 尤金·里博福; 爱尔丝·波克; 兰德尔·S·瑞斯芮; 马克·斯萃姆雷
Original assignee: Vanderbilt University
Current assignee: Vanderbilt University
Priority date: 2002-08-27
Filing date: 2003-08-27
Publication date: 2005-10-05
Also published as: EP1539919A4; WO2004020342A3; US20060166354A1; AU2003268201A8; EP1543101A2; EP1546299A2; WO2004020573A1; WO2004020590A3; US7977089B2; US8129179B2; EP1546299A4; WO2004020590A2; EP1545750A2; AU2003268200A8; US20110294202A1; AU2003268200A1; CN1678729A; AU2003262906A8; EP1539919A1; AU2003262906A1

Abstract

一种用于在液体介质中培养活细胞的生物反应器。在本发明一个实施方式中，所述生物反应器有一第一基片(140)，其具有第一表面(140a)和相对第二表面(140b)，其间界定了用于接收细胞和液体介质的室(101)。所述生物反应器进一步有一屏障(104)将所述室(101)分成第一亚室(102)和第二亚室(103)，其中所述屏障有多孔性以允许所述第一亚室(102)和所述第二亚室(102)可进行流体传送，且允许至少一个预定的细胞类型在所述第一亚室(102)和所述第二亚室(102)之间透过。

Description

多室生物反应器

本申请是由美国法人范德比尔特大学作为除美国外全部指定国的申请人，以及美国公民且居住在美国的约翰·P·威克思沃(John P.Wikswo)与弗朗茨·J·鲍德巴赫(Franz J.Baudenbacher)作为美国的申请人，于2003年8月27日提出国际专利申请。

本发明是在国防高级研究项目局和海军研究办公室授予基金拨款号N66001-01-C-8064的政府资助下完成的。美国政府可以基于此拨款资助对本发明享有一定权利。

在参考文献目录中引述了包括专利、专利申请和各种出版物在内的一些参考文献，并在本发明的说明中予以论述。这些参考文献的引述和/或论述仅为了阐明本发明的说明而提供的，并不是承认任何这些参考文献相对在此说明的本发明是现有技术。在下文的符号表示中，″[n]″表示在参考文献目录中第n个被引述的参考文献。例如，[¹¹]表示在参考文献目录中第11个被引述的参考文献，即Hu，W.S.and Aunins，J.G.，Large-ScaleMammalian Cell Culture，Curr.Opin.Biotechnol.，8，148-153，1997。

发明领域

本发明通常涉及一种用于培养和维持生物系统的装置及方法。本发明特别涉及一种装置和方法，其具有允许灌注液在扩散交换下流向组织细胞而没有细胞迁移的通路结构。另外，本发明涉及一种装置和方法，其能够培养和维持诸如原生动物等活微生物有机体。

本发明还涉及一种装置和方法，其用于诸如生物膜等细胞集合的动态分析。本发明特别涉及一种装置和方法，其用于测量生物膜对在生物膜不同深度的诸如化学应激物等物质的一个或多个动态流的响应。

本发明的一些实施方式包含了用于培养和维持诸如细胞或细胞集合等的生物系统且监测此生物系统代谢活性状态和对环境变化响应的装置和方法，其中各细胞代谢活性可以由特征时间来表征。该装置和方法特别包含多室生物反应器及使用其的方法。

本发明的一些其他实施方式包含了用于培养和维持诸如细胞或细胞集合等生物系统且监测此生物系统代谢活性状态和对环境变化响应的装置和方法，其中各细胞代谢活性可以由特征时间来表征。该装置和方法特别包含排置有用公共馈送线的数个室的生物反应器及使用其的方法。

本发明的某些另外的实例包含了用于培养和维持诸如细胞或细胞集合等的生物系统且监测此生物系统代谢活性状态和对环境变化响应的装置和方法，其中各细胞代谢活性可以由特征时间来表征。该装置和方法特别包含毛细管灌注的生物反应器及使用其的方法。

本发明的一些进一步的实施方式包含了用于培养和维持诸如细胞或细胞集合等的生物系统且监测此生物系统代谢活性状态和对环境变化响应的装置和方法，其中各细胞代谢活性可以由特征时间来表征。该装置和方法特别包含有物质注射能力的生物反应器及使用其的方法。

发明背景技术

生物反应器是能用于培养活细胞的一种设备。生物反应器特别是能提供适当物理和化学环境，及快速传送底物和产物以使细胞生物反应理想地快速有效地发生的容器。最简单的生物反应器是培养皿：在常规的利用孔板、培养皿和烧瓶的细胞培养中，典型地培养基容量为细胞容量的200至1000倍。当结合使用培养基缓冲时，这个比率允许细胞在不改变介质的情况下生长至少24小时。然而，这个比率的另一个结果是细胞产生的任何细胞外因子及其另外提供的旁分泌细胞至细胞交流的相应稀释减弱，而这在组织中是可能的，因为细胞外容量可能仅是细胞内容量的10％。

生物反应器的发展多定向在功能性组织或生物化学品和药品的生成。例如，最近20年在皮肤、胰腺、软骨、肝脏、角膜和膀胱生成上的研究具有特殊重要性¹。仅在美国，就有超过80,000人在等待器官移植，因此发展改进生物反应器技术的需要是不言而喻的。人们也逐渐认识到，在了解细胞运动和趋化信号发出以及其它复杂细胞过程上的进步往往被可用于在过程中观察和在不同点干预的实验技术所束缚。许多这些过程能够在适当装备的生物反应器中得到很好地检测。

生物反应器有广泛的种类，包括搅拌容器、泡罩塔式反应器、填充床反应器²、气升式反应器、及包括板、旋转台、螺旋缠绕及中空的纤维的膜反应器³。中空纤维反应器特别重要，因为(取决于其结构)它们可以允许每立方米模块容量的膜面积多达30,000平方米^4-6。然而，假设哺乳动物的细胞对于剪切力非常敏感^7-9(其主要由搅动和通气引起)，在细胞生长的反应器中尽可能减小该力是很重要的^9-10。膜已用于生物反应器中以增加细胞存活。例如，众所周知在一些反应器模型中产生的液气相界面对哺乳动物细胞显著有害。这个潜在的致命界面能通过使用疏水膜来消除⁹。

生物反应器也可以按它们操作模式分类：分批式、流加式和连续式培养(也称为灌注式培养)。在第一或分批模式中，不添加培养基，也不移除介质；在流加模式的情况下，连续进料但不移除任何东西直到反应结束且反应器放空。这些系统用于过程控制效果微弱，与灌注式体系相比其生产率低，在这第三种模式中培养基持续流入且介质持续流出。除了高的生产率外，在这类反应器¹¹中还有较好的细胞生理学控制，且在哺乳动物细胞培养情况下也已显示出比静态方法明显更有优势^12，13。

当培养大的三维组织时一个局限性是缺少用于营养物和代谢物传送的适当的维管联结。大量的研究已经分析了人造维管网^14-18，并且对构造功能性微制支架(microfabricated scaffolds)已有大量尝试^{3，16，19-21}。已生产这些网络的技术包括等离子蚀刻、光刻蚀、软刻蚀、微接触印刷、使用微通道的微流成型、层流成型和模版成型^22-25。在等离子蚀刻技术中，我们可以认为高深宽比微加工技术(High Aspect Ratio Micromachining，HARMS)是一个强有力的工具，因为其允许蚀刻实际上无限深的通道而不会增加已经由刻蚀得到的宽度²²。它也可以在PDMS中用综合拓扑学和几何学构造三维微通道系统¹⁵。

另外，需要认识到临床可移植组织的培养要求最终生物降解和组织支架的机械性能¹⁶。这些性能直接涉及到选择构成组织的材料的结晶度、分子量、玻璃化转变温度和单体疏水性⁹。已经使用了诸如胶原质等自然衍生的原料²⁶，以及合成的和半合成的材料。聚羟基乙酸(PGA)具有高多孔性且可以使装置构成容易，因此PGA纤维网孔被考虑用于移植细胞。然而，它们不能抵抗重大的压缩力。解决这个问题可选择的办法是用乳酸和羟基乙酸的聚合物，可以调整其比率以控制材料的结晶性从而控制降解速率和机械性能。已经由这些聚合物构制成纤维基管²⁷。

用由现有的微制细胞灌注生物反应器(microfabricated cell-perfusionbioreactor)系统提供的性能比较活组织维管性能是重要的。在组织中，动脉渐渐分成较小维管，最后到达细动脉然后是毛细管。细动脉很重要，因为它们包含前毛细血管括约肌，其可控制各毛细血管床的灌注，还提供大多个外周阻力从而提供与动脉供应关联的压降。结果，穿过毛细血管内皮膜的压差保持足够低以允许营养物和代谢物扩散传送过膜，以及组织维持和控制感染所需的免疫细胞的放行。如果毛细管中的压力与细动脉中压力一样高，毛细管壁厚度会太大以至不能允许这些重要的迁移现象。虽然压力较低，在许多方面静脉回流系统就象上动脉系统的镜面。活的维管系统的另一特征是上述的分流过程允许所有细胞在50-200微米的毛细管中，取决于特定的组织。结果，动脉供给和静脉回流系统是如此设置，以使每个灌注了大量细胞的毛细管与较大的供给和回流系统相连接，其有自相似性以确保相同灌注和通过毛细管压力。这个设置过程是很难用微制造技术(microfabrication)来复制的。例如，鲍仁斯坦(Borenstein)等人²²所描述的建立两维空间维管系统的过程，其建立一个多尺度灌注系统用于维持内皮细胞，但是没有提供穿过最小毛细管的选择性限定扩散传送以灌注位于灌注网络外侧的细胞。更重要的是，他们所展示的网络有很大的装置区域，其被大的器皿覆盖，且限定于毛细血管的生物反应器的区域实际上很小。

因此，对于微制迁移生物反应器(microfabricated migration bioreactor)有要求，模仿体外正常组织微环境与瘤、感染组织及创伤组织的微环境一样好，同时提供化学激素(chemokine)和生长因子梯度、剪切力、细胞灌注及物理屏障对细胞迁移渗透性的独立控制，因此当细胞迁移、内渗、外渗和血管生成时，允许对正常、免疫、及癌细胞进行详细的光学和电化学观测。血管生成、瘤转移及白细胞浸润入组织是复杂的过程，不仅通过对单一化学激素的细胞响应来调节，也能由外部因素，例如多重竞争化学激素和生长因子信号，自分泌反馈环、细胞-细胞相互作用及诸如脉管剪应力等机械力来调节。目前评价穿过细胞屏障的迁移的方法包括博伊德(Boyden)小室和侵袭(transwell)小室，其提供穿过过滤器迁移的综合荧光分析以进行迁移测定^28-34，平行板流动室^35-38，其中可以被评价在剪应力下在内皮细胞上的粘着和旋转^35，39-44，以及体外活体镜检法，其观测活的动物中的细胞迁移^45-48。这些方法每个都有局限性，包括无法维持和控制趋化梯度(全部体系)，无法实时或在生理剪应力下观测迁移(博伊德小室和侵袭小室)，无法观测下面深的细胞基质(平行板流动室)中外渗或血管生成，以及无法控制实验的所有方面，例如限定细胞密度和控制微流控技术(microfluidics)用于独立控制剪切和组织灌注(全部体系，特别是活体镜检法)。发展移动/转移模型体系独立控制内皮切应力、化学激素梯度、组织灌注及通过不同端口加不同细胞类型的能力，再结合艺术成像技术和传感器性能，将代表超过现有可用系统的巨大前进。

当然，对于这种性能需要是非常急迫的。血管生成是一个动态过程，受细胞微环境的影响并与迁移有联系。已经证明VEGF和血管生成素/酪氨酸激酶(Ang/Tie2)功能对于瘤血管生成^51-53是必需的。然而，来自这两个受体体系的信号如何被整合以调节血管生成并没有确定，部分由于缺乏好的模型体系。下一步应研究在内皮细胞迁移、血管芽生和成熟、及瘤穿过内皮迁移中VEGF和血管紧张素信号的协调和整合。随着血管生成、多重环境输入影响了瘤转移和白细胞浸润。瘤细胞中一化学激素受体的激活影响瘤细胞中其他配体和受体的感应，同样内皮细胞和白细胞也一样，但是这个机制很少被了解⁵⁴。

需要了解在瘤细胞移动通过复合基质时化学激素受体内化变化和/或与接合体分子例如AP-2或β阻止因子(beta-arresting)关联受体的变化如何影响化学激素受体活性。外部因素例如细胞-细胞粘着力、细胞-基质交互作用、及脉管剪应力在移动通过组织期间如何影响细胞骨架重组也是很少被了解的。肌动蛋白结合蛋白(cortactin)过度表达增加了乳癌细胞向骨骼的转移⁵⁵，然而该机制仍不清楚。同样地，人类WASp蛋白的缺乏会导致伴性的免疫紊乱，其由信令、增生或趋化性缺陷产生⁵⁶。需要研究在包括可控制剪切、细胞-细胞相互作用及化学激素梯度的复杂多细胞环境中肌动蛋白结合蛋白和WASp蛋白在乳癌和HL60细胞的趋化中的作用。作为最后的例子，基质金属蛋白酶(MMPS)是可以在多种类型癌中找到的细胞外表达的酶，且被认为在肿瘤发生、生长、侵袭和转移中很重要。最近发现发生在缺乏MMP-3的老鼠(MMP-3缺乏老鼠)中的皮肤瘤发育和生长快于正常、野生型老鼠的皮肤瘤。这个差异与在MMP-3缺乏老鼠的瘤和周围组织中免疫细胞数量减少相关联。这个研究的合理进展是确定失去MMP如何影响免疫细胞的能力，即单核细胞和中性白细胞从外周血液循环侵润到肿瘤位置。控制实验环境的能力，包括多重限定细胞密度，对于阐明在MMP-3诱导细胞趋化中肿瘤-宿主相互作用的相对重要性是很关键的。

尽管这些年取得了进步，但是，现在可用的生物反应器不能提供更多生理性的环境，其包括多细胞型态的体外三维区域、刺激物及测量能力，并且允许对趋化反应的分子研究。因此，很需要开发体外模仿瘤和组织的微环境，同时提供化学激素和生长因子梯度、剪切力、细胞灌注及物理屏障对细胞迁移渗透性的独立控制，因此当细胞迁移、内渗、外渗和血管生成时，允许对正常和癌细胞进行详细的光学和电化学观测的生物反应器。

因此，现有技术中存在这种迄今未解决的需求表明了上述缺陷和不足。

发明概述

一方面，本发明涉及用于在液体介质中培养活细胞的生物反应器。在一个实施例中，所述生物反应器有一个具有第一表面和相对第二表面的第一基片，其间界定了用于接收细胞和液体介质的一室。所述生物反应器进一步具有一个将所述室分成第一亚室和第二亚室的屏障，其中所述屏障有多孔性以允许所述第一亚室和所述第二亚室液体传送，并且允许至少一个预定类型的细胞在所述第一亚室和所述第二亚室之间透过。

如所成形的，所述第一亚室适于接收第一类型材料且所述第二亚室适于接受第二类型材料，其中每个所述第一类型材料和所述第二类型材料包含选自细胞、化学制剂及液体中的至少一种。所述细胞可以是任何类型的活细胞，包括但不限于细菌、原生动物、或两者、正常细胞、瘤细胞、或它们的组合。

所述的生物反应器还包括一生物相容涂层施于室壁，其中所述的生物相容涂层包含可以抑制细胞粘着于所述生物相容涂层、增强细胞粘着于所述生物相容涂层、或起荧光标记或细胞状态指示剂作用的材料。

在所述第一基片中形成至少一个输入口和一个输入转移通道，其中所述输入转移通道可与所述输入口及所述第一亚室和所述第二亚室之一进行液体传送，以允许所述细胞、液体或化学制剂向相应亚室的输送。在所述第一基片中形成至少一个输出口和一个输出转移通道，其中所述输出转移通道可与所述输出口及所述第一亚室和所述第二亚室之一进行液体传送，以允许所述细胞、液体或化学制剂从相应亚室中的移出。另外，在所述第一基片中形成至少一个辅助口和一个辅助通道，其中所述辅助通道可与所述辅助口及所述输入转移通道和所述输出转移通道中之一进行液体传送，以冲洗相应转移通道。此外，在所述第一基片中形成至少一个访问口和访问通道，其中所述访问通道可与所述访问口及所述第一亚室和所述第二亚室之一进行液体传送，以允许所述细胞、液体、化学制剂、涂料或传感材料向相应亚室的输送和移出。

所述生物反应器进一步包括一第二基片，其中所述第二基片位于邻近所述第一基片的所述第一表面处，并界定多个连接通道，每个所述连接通道的形成以使所述输入口、所述输出口、所述辅助口和所述访问口中相应的一个进行液体传送为宜。所述生物反应器另外还有多个连接口，每个所述连接口形成有一通道，并且其相对于所述第二基片的位置设定以使所述连接口的每个通道与在所述第二基片中形成的所述连接通道中相应的一个可进行液体传送为宜。

在一个实施例中，所述第一基片由来自玻璃、聚脂薄膜、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、硅、聚合物、半导体、或它们的任何组合所构成。所述屏障包括多孔材料，其中所述屏障是微制造(microfabricated)的，以形成允许在所述第一亚室和所述第二亚室之间液体传送的结构。

所述生物反应器另外包括一第三基片和位于所述第三基片中的装置，其中所述第三基片位于邻近所述第一基片的所述第二表面处，所说的装置适于电化学测量对所述第一亚室和所述第二亚室的至少一个中的所述液体介质的细胞响应。所述第三基片可以由半导体材料形成，例如硅。

在一个实施例中，用于电化学测量的所述装置包括参考电极、反电极、多个边缘连接器垫板和多个导电端子，其中第一导电端子将所述参考电极电连接至相应的边缘连接器垫板，且第二导电端子将所述反电极电连接至相应的边缘连接器垫板。用于电化学测量的所述装置进一步包括多个单独可寻址工作电极，每一个均通过相应导电端子被电连接至相应的边缘连接器垫板，其中所述液体介质包括至少一种或多种分析物，且其中所述多个单独可寻址工作电极适用于能在短于涉及细胞的至少一个细胞生理活性特征反应时间的时间间隔内，传感在所述室中多个位置上液体介质中单一分析物的浓度或在所述室中多个位置上液体介质中多种分析物的浓度。另外，多个单独可寻址工作电极进一步适用于能在短于涉及细胞的至少一个细胞生理活性特征反应时间的时间间隔内，测量对与在所述室的多个位置上液体介质的细胞响应有关的代谢变量。

所述生物反应器进一步还包括第四基片和位于所述第四基片中的装置，其中所述第四基片位于所述第一基片的所述第二表面上面，所说的装置适于光学测量对在所述第一亚室和所述第二亚室的至少一个中液体介质的细胞响应。所述第四基片至少是半透明的。所述第四基片可以由半导体材料形成，例如硅。

在一个实施例中，用于光学测量的装置包括多个光学传感器、多个边缘连接器垫板和多个端子，各将一光学传感器光学连接至一相应边缘连接器垫板，其中多个光学传感器包含选自发光二级管和光电二极管对、光纤耦合器和光学探测头的一组中的至少一个元件，其中所述液体介质包括至少一种或多种分析物，且其中多个光学传感器适于能在短于涉及细胞的至少一个细胞生理活性的特征反应时间的时间间隔内，传感在所述室中多个位置上液体介质中单一分析物的浓度或在所述室中多个位置上液体介质中多种分析物的浓度。另外，多个光学传感器进一步适于能在短于涉及细胞的至少一个细胞生理活性的特征反应时间的时间间隔内，在所述室的多个位置上测量对液体介质的细胞响应关联的代谢变量。

另一方面，本发明涉及一种用于在液体介质中培养活细胞的生物反应器。在一个实施例中，所述生物反应器有一个基片具有第一表面和相对第二表面，其间界定了用于接收细胞和液体介质的室，其中所述室形成有一中心和一边界，一第一屏障围绕所述中心及部分所述室以形成一中央室，且一第二屏障位于所述第一屏障和所述边界之间以形成了一个中间室和一个外室，其中所述第一屏障有第一多孔性，以允许所述中央室和所述中间室进行液体传送及允许至少一第一预定类型的细胞在所述中央室和所述中间室间透过，且所述第二屏障有第二多孔性，以允许所述外室和所述中间室进行液体传送及允许至少一第二预定类型的细胞在所述外室和所述中间室间透过。

如所成形的，所述中央室适于接收第一类型材料，所述中间室适于接收第二类型材料，且所述外室适于接收第三类型材料，其中各所述第一类型材料、所述第二类型材料和所述第三类型材料包含选自细胞、化学制剂及液体一组中的至少一种。所述第一预定类型细胞包括瘤细胞，其通常被接收于所述中央室对应于一肿瘤空间。所述第二预定类型细胞包括正常组织细胞，其通常被接收于所述中间室对应于一组织空间，其中所述外室是相应于一脉管空间适于接收内皮细胞、巨噬细胞、中性粒细胞(neutophilcells)、任何它们的组合、或其他免疫细胞类型。

所述生物反应器进一步包括一生物相容涂层施于所述边界的所述室壁上，其中所述的生物相容涂层包含可以抑制细胞粘着于所述生物相容涂层、增强细胞粘着于所述生物相容涂层、或起荧光标记或细胞状态指示剂作用的材料。

在所述基片中形成至少一个附加输入口或输出口和一个输入或输出转移通道，其中所述输入或输出转移通道可与相应输入口或输出口及外部室进行液体传送，以允许所述细胞、液体或化学制剂向所述外室的输送。另外，在所述基片中形成至少一个输入口或输出口和输入或输出转移通道，其中所述输入或输出转移通道可与所述输入口或输出口及所述中心室可以液体传送，用于允许所述细胞、液体或化学制剂向所述中心室输送。另外，在所述基片中形成至少一个输入口或输出口和输入口或输出口转移通道，其中所述输入口或输出口转移通道可与所述输入口或输出口及所述中央室进行液体传送，以允许所述细胞、液体、化学制剂、涂料或传感材料向相应所述中央室的输送。

此外，在所述基片中形成至少一个另外输入口或输出口和输入或输出转移通道，其中所述输入或输出转移通道可与所述输入口或输出口及所述中间室进行液体传送，以允许所述细胞、液体或化学制剂向所述中间室输送。

在一个实施例中，所述基片由玻璃、聚脂薄膜、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、硅、聚合物、半导体、或它们的任何组合所构成。所述第一屏障包括多孔材料，其中所述第一屏障是微制造的以形成一第一结构允许液体在所述中央室和所述中间室之间的传送。所述第二屏障包括多孔材料，其中所述第二屏障是微制造的以形成一第二结构允许液体在所述外室和所述中间室之间传送，且所述第二结构与所述第一结构不同。在这个实施例中，所述第一屏障基本上为圆形，所述第二屏障基本上为圆形，且所述边界基本上为圆形。可选择地，各所述第一屏障、所述第二屏障、和所述边界可以形成其他几何形状。

所述生物反应器进一步包括适于电化学测量对在所述外室、所述中间室和所述中央室的至少一个中液体介质的细胞响应的装置，其中用于电化学测量的所述装置包括参考电极、反电极和多个单独可寻址工作电极，其中所述液体介质包括至少一种或多种分析物。

所述多个单独可寻址工作电极包括第一组单独可寻址工作电极，其适于能在短于涉及细胞的至少一个细胞生理活性特征反应时间的时间间隔内，传感在所述外室多个位置上液体介质的单一分析物浓度或在所述外室多个位置上液体介质的多种分析物的浓度。所述第一组单独可寻址工作电极进一步适于能在短于涉及细胞的至少一个细胞生理活性特征反应时间的时间间隔内，测量对在所述外室的多个位置上液体介质的细胞响应关联的代谢变量。

所述多个单独可寻址工作电极进一步包括第二组单独可寻址工作电极，其适于能在短于涉及细胞的至少一个细胞生理活性特征反应时间的时间间隔内，传感在所述中央室的多个位置上液体介质的单一分析物的浓度或在所述中央室的多个位置上液体介质的多种分析物的浓度。所述第二组单独可寻址工作电极进一步适于能在短于涉及细胞的至少一个细胞生理活性特征反应时间的时间间隔内，测量对在所述中央室的多个位置上液体介质的细胞响应关联的代谢变量。

所述多个单独可寻址工作电极另外包括第三组单独可寻址工作电极，其适于能在短于涉及细胞的至少一个细胞生理活性特征反应时间的时间间隔内，传感在所述中间室多个位置上液体介质的单一分析物浓度或在所述中间室多个位置上液体介质的多种分析物的浓度。所述第三组单独可寻址工作电极进一步适于能在短于涉及细胞的至少一个细胞生理活性特征反应时间的时间间隔内，测量对在所述中间室的多个位置上液体介质的细胞响应关联的代谢变量。

在另一方面，本发明涉及一种用于在液体介质中培养活细胞的生物反应器。在一个实施例中，所述生物反应器包括一基片以及用于区分室的装置，所说的基片具有第一表面和相对第二表面，其间界定了用于接收细胞和液体介质带有边界的一室，所说的装置将所述室区分为多个室，其中各多个亚室与多个亚室中至少另一个进行流体传送。

所述的区分装置包括一屏障用于将所述室区分为第一亚室和第二亚室，且其中所述屏障有多孔性以允许所述第一亚室和所述第二亚室可进行流体传送并允许至少一个预定类型的细胞可以透入所述第一亚室和所述第二亚室之间。

可选择地，所述的区分装置包括第一屏障和第二屏障用于将所述室区分为第一亚室、第二亚室和第三亚室，且其中所述第一屏障有第一多孔性以允许所述第一亚室和中间亚室进行流体传送及至少第一预定类型细胞可渗入所述第一亚室和所述第二亚室之间，且所述第二屏障有第二多孔性以允许所述第二亚室和所述第三亚室进行流体传送及至少第二预定类型细胞可渗入所述第二亚室和所述第三亚室之间，其中所述第一多孔性和所述第二多孔性可以相同或不同。

进一步可选择地，所述区分装置包括n多个屏障，n为大于0的整数，以将所述室区分为n+1个亚室，其中n屏障中的每个有相应的多孔性，其可以与其它屏障的多孔性相同或不同。

从以下优选实施例的描述，结合如下附图，将体现出本发明的这些及其它方面，然而其变化和改进可能仍未脱离本发明公开新颖性内容的精神和范围。

附图说明

图1A显示了依照本发明一个实施例的生物反应器的俯视示意图。

图1B显示了依照本发明另一个实施例的生物反应器的透视图。

图2是显示了依照本发明另外一个实施例的生物反应器的俯视示意图。

发明详述

现在详细描述本发明的不同实施例。关于附图，除非在文中清楚指示其它，附图中相同的部分始终用相同的数字标记标示。在这里和如下全部权利要求描述中的所使用的，“一”和“所述的”的意思包括多个，除非在文中清楚的指示其它含义。而且在这里和如下全部权利要求描述中所使用的“在……中”包括“在……中”和“在……上”，除非在文中清楚的指示其它含义。另外，在本说明书中所使用的一些术语在以下明确定义。

定义

在本发明内容中，本说明书中所使用的术语一般在现有技术中，以及每个术语使用在特定内容处，是有通常含义。例如，依照本发明可以使用在分子生物学、微生物学和重组基因技术的常规技术。这些技术和相关术语的含义在文献中被充分解释。参见，例如Sambrook，Fitsch & Maniatis.Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Second Edition(1989)Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York(此处查阅″SAMBROOK ET AL.，1989″)；DNA CLONING：A PRACTICALAPPROACH，VOLUMES I AND II(D.N.Glover ed.1985)；OligonucleotideSynthesis(M.J.Gait ed.1984)；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames & S.J.Higgins，eds.1984)；Animal Cell Culture(R.I.Freshney，ed.1986)；Immobilized Cells and Enzymes(IRL Press，1986)；B.E.Perbal，A PracticalGuide to Molecular Cloning(1984)；F.M.Ausubel et al.(eds.)，CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，Inc.(1994)。也可见，PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications，Innis et al.，eds.，Academic Press，Inc.，New York(1990)；Saiki et al.，Science 1998，239：487；and PCR Technology：Principles and Applications for DNA Amplification，H.Erlich，Ed.，Stockton Press。

用于描述本发明的某些术语将在以下或说明书其它位置论述，以给专业人员在描述本发明设备和方法及如何制造和使用它们时提供附加指导。为方便起见，某些术语被突出了，例如使用斜体字和/或引号标记。突出的使用对术语的范围和含义没有影响；术语的范围和含义在相同语境中相同，无论其是否被突出。应意识到同一东西可能用多于一个的方式叙述。因此，可选择的语言和同义词可以用于任何一个或多个在此论述的术语，无论术语是否在此详细阐述或论述都没有被赋予任何特定意义。某些术语提供了同义词。一个或多个同义词的叙述不排除使用其它同义词。在这个说明书中无论何处使用例子包括在此论述的任何术语的例子，仅是例证性的，且决不是限制本发明或任何示例术语的范围和含义。同样地，本发明不受在此说明书中给出的各种实施例的限制。

这里所用的“大约”或“近似地”一般意味在给出值或范围的20％以内，优选在10％以内，且更优选在5％以内。这里给出的数字数量是近似的，如果没有特别说明，其意味术语“大约”或“近似地”能够被推断出。

术语“分子”意味任何包含一个或多个原子的、清楚或可识别的物质结构单元，且包括例如多肽和多聚核苷酸。

这里所用的“细胞”意味着任何细胞，以及病毒或任何其他具有微观尺寸的质粒，例如与生物细胞尺寸类似的大小，且包括任何原核生物或真核生物的细胞，如细菌、真菌、植物和动物细胞。细胞典型为球形，但也可以是细长的、扁平的、可变形的和不对称的，例如非球形。一个细胞的尺寸或直径典型的范围在大约0.1至120微米，且典型为从大约1至50微米。细胞可以是活的或死的。如这里所用的，细胞一般为活的除非另外说明。如这里所用的，细胞可以是带电的或非带电的。例如，带电颗粒可以被用于促进流动或探测，或者作为指示剂。活的或死的生物细胞可以带电，例如通过使用表面活性剂，如SDS(十二烷基硫酸钠)。细胞或多个细胞也可以包含细胞系。细胞系的例子包括肝脏细胞，巨噬细胞，成神经细胞瘤细胞，内皮细胞，肠细胞，杂交瘤、CHO、纤维原细胞细胞系、红血球、电应激细胞(electrically excitable cells)，例如心脏细胞，肌细胞(AT1细胞)，共培养生长细胞，NG108-15细胞(广泛用于成神经细胞瘤X神经胶质瘤杂交细胞系，ATCC#HB-12317)，初生神经元，由动物新生仔心室或心房分离出的初生心脏肌细胞，AT-1心房瘤心脏细胞，肝脏细胞也称为肝细胞，分泌细胞(去极化且它分泌东西)胰腺β细胞分泌胰岛素，HELA细胞(Helen Lane)，HEK293人上皮肾细胞，红细胞(初生红血球)，淋巴细胞等等。每个细胞系可以包括一种或多种相同或不同的细胞。例如，肝脏细胞包含人肝细胞癌(″HEPG2″)细胞、CCL-13细胞和H4IIE细胞中的至少一种，巨噬细胞包括外周血单核细胞(″PBMC″)、和皮肤纤维细胞中的至少一种，成神经细胞瘤细胞包含U937细胞，内皮细胞包含人脐静脉内皮细胞(″Huv-ec-c″)，且肠细胞包含CCL-6细胞。

“培养”意味在可控制的人工环境中活细胞的生长。它可是微生物培养，如细菌，或动物或植物细胞之一的培养，如组织培养。依照本发明所述的生物反应器可用于这两种培养或更多的培养类型。培养要求适当养料和能量来源，其由培养基提供，以及适当的物理环境。组织培养自身可以成为用于病毒的培养基，其仅与活细胞生长。仅一种细胞的培养被称为纯培养，其不同于混合或污染培养。

“组织”意味形态和机能或多或少相似的细胞的集合。动物体由四个初级组织组成，即上皮细胞、结缔组织(包括骨胳、软组织和血液)、肌肉和神经组织。组织分化和成熟过程被称为组织发生。

“传感器”广义定义为能够测量可测量性质的任何仪器。例如传感器可以是一热探测器、电探测器、化学探测器、光学探测器、离子探测器、生物探测器、放射性同位元素探测器、电化学探测器、辐射探测器、声学探测器、磁探测器、电容探测器、压力探测器、超声波探测器、红外线探测器、微波运动探测器、电波探测器、电眼、图像传感器、它们的任何组合等等。本发明中可以选择应用多种传感器。

术语“分析物”意味能由细胞消耗或生产的材料。感兴趣的分析物例子包括pH、钾、氧、乳酸盐、葡萄糖、抗坏血酸盐、5-羟色胺、多巴胺、铵、谷氨酸盐、嘌呤、钙、钠、钾、NADH、质子、胰岛素、NO(氧化氮)等等。

术语“流动”意味流体如液体或固体通过本发明装置或在本发明方法中的任何移动，且包括但不限于任何流体流，及与所述流、在所述流中或逆着所述流的任何材料，无论材料是否由所述流携带。例如分子或细胞通过本发明装置或在本发明方法中的移动，如在本发明的微流控芯片(microfluidic chip)上基片中通道的运动，包含流动。也就是，依照本发明，无论分子或细胞是否由流体流携带，或者无论分子或细胞是由一些其他直接或间接的力或驱动引起移动，及无论任何驱动力的性质是否是已知的或了解，也都包含流动。任何力的应用都可被用于产生流动，包括但不限于，压力、毛细管现象、电渗、电泳、双向电泳、光镊、及它们的组合，而不论任何特别的理论或作用机制，只要依照本发明分子或细胞可被导引来检验、测量或分类。

“液体或介质”是一流体，其可以包含一种或多种影响细胞生长的物质，一种或多种分析物、或任何它们的组合。介质可提供被一种或多种细胞消耗的一种或多种分析物。介质可以有由一种或多种细胞生成的一种或多种分析物。介质也可以同时有由一种或多种细胞消耗的一种或多种分析物和由一种或多种细胞生成的一种或多种分析物。介质可由天然材料组成，例如酶消化液、酵母或牛肉浸膏、牛奶、土豆片、或鸡胚胎。人造介质可依照特定配方由混合多种成份制备。复合介质包含至少一种来源于天然材料的原材料成分，因而有未知的化学组分。化学方法定义的或合成的介质有已知化学结构和每个组分含量。

“输入区”是接收分子或细胞或液体的生物反应器的一个区域。所述输入区可以包含输入口和通道，井或贮藏器、开口、及可使分子或细胞进入设备的其他特征。如果需要，生物反应器可以包含多于一个的输入区。所述输入区与通道进行流体传送且由此为上游。

“输出区”是收集或分配分子或细胞或液体的生物反应器一个区域。输出区在识别区下游，且可以包含输出通道或输出口。如果需要，生物反应器可包含多于一个的输出区。

“分析单元”是微制造基片，如微制芯片，其有至少一个输入区，至少一个通道和室，至少一个探测区及至少一个输出区。本发明设备可以包括多个分析单元。

“通道”是本发明生物反应器的路径，其允许分子或细胞流动以经过用于探测(识别)或测量的一探测区。所述探测和识别区可以位于或构成在通道内。所述通道典型地在输入口或输入区进行流体传送，其允许分子或细胞或液体流动至通道内。所述通道也典型地在输出区或输出口进行流体传送，其允许分子或细胞或液体流动至通道外。所述通道也能用作生长细胞的室，反之亦然。

“探测区”或“传感区”或“室”是生物反应器内的一区域，典型地与在通道内或与通道(或其中一部分)重合，和/或在探测环路中或与探测环路重合，生长、被识别、表征、杂交、测量、分析或维持(等等)的分子或细胞在此基于预定特性被检测。在一个实施例中，分子或细胞每次检测一个。在另一个实施例中，分子、细胞或样品被一起检测，例如按组、按排、快速、同时或同期连续或平行排列，或采用亲合色谱法。

“反应时间”是关注的体系需要响应变化的时间。例如，细胞反应时间是用于至少一个细胞生理过程适应或响应其环境变化所需要的时间。每种类型的细胞对于其环境中特定变化都有其自己的的特征反应时间。传感器反应时间是用于传感器响应其探测量变化所需要的时间。例如电化学传感器的反应时间由传感器大小及传感器活性表面保护涂层的厚度和性质确定。微流控体系(microfluidic system)反应时间通过对环境变化的细胞反应时间、化学物扩散过传感区所需时间、传感器反应时间和由驱动器控制的分析物扩散时间来决定。

“细菌”是非常小的—通常直径0.3-2.0微米—且相对简单的微生物，具有原核细胞类型结构。每个细菌细胞由有相似特征的已存在细胞分离，或通过两个这种细胞在有性过程中的结合而产生。

“原生动物”意味着传统动物界分出的一组真核微生物。尽管名称表示原始动物，一些原生动物(植物鞭毛虫和粘液菌)表现很多类似植物特性以证明他们是植物。原生动物尺寸范围从1至10⁶微米。鞭毛虫、纤毛虫和肉足纲是已知的群体。尽管生殖和体游动孢子的显著区别可以标记某些群体，如团藻，原生动物不产生组织和器官。

现在参考图1-2描述几个实施例，在图1-2中相同数字标记相同部分。

发明综述

本发明的发明人克服了现有技术中的缺陷，开发了新的生物反应器，除其他新颖性和创造性特征外，其能提供控制的化学激素梯度独立于灌注流动，并且允许细胞基质外渗。

将近来在纳米滤层制作^57-61上的发展用于制造依照本发明的灌注-膜生物反应器，其在所说的设备中可控制的、稳定的化学激素或生长因子梯度的条件下，允许在1毫米×1毫米×100微米体积内在接近组织的密度下细胞混合培养生长，以模仿体内瘤微环境。

本发明的一个优点是可以构造定制设备以使分离的灌注和细胞输送系统允许在实验过程中独立控制剪应力和化学激素梯度。此外，光学和电化学代谢微传感器安置在这些生物反应器中，以允许在反应器选择区域同时定量局部代谢和化学环境(乳酸盐、pH、O₂等)，其间细胞移动或细胞信号发放事件可由荧光显微镜成像。因此，根据本发明所述生物反应器可以被认为是下一代移动生物反应器，其可越过简单的MTW系统(MicroTransWell)迈向那种更接近复制体外微环境活组织的体系。

此外，根据本发明的生物反应器应用微制造技术、微流控(microfluidics)、及微生物传感器(microbiosensors)，给瘤血管生成及白细胞和癌细胞外渗的分子机制研究提供了机会。例如，在脉管形成和再造中Tie2和VEGF作用的系统检查及识别更多特定的用于抗血管生成治疗的分子靶标。类似的微设备模型(microdevice model)可以用于检查白细胞和癌细胞外渗。这些设备给寄主鼠瘤外植体提供了适当的细胞环境，因此潜在提供了用于瘤活组织检查材料的转移分析。这些生物反应器中的代谢传感将帮助提供对瘤微环境的更清楚了解和确定我们的体外系统的有效性^62-65。

另外，平面鲍仁斯坦(Borenstein)设计的局限性是可用的毛细管表面区太小以至于不支持细胞实际体积的增长，这点已被本发明克服，改进这个问题是建造一个多层插入供给和返回的生物反应器，其允许平面生物反应器全部表面被毛细管覆盖，及毛细管灌注的细胞。

更为明确的一方面，本发明涉及生物反应器。这些生物反应器是生物微电动机械式系统((BioMEMS)，其用作移动微环境以研究瘤血管生成、瘤转移和白细胞迁移的分子机制，也可起到更常规的组织生物反应器和灌注系统的作用。除其他方面外，这些微流控设备的一个独特方面是适当细胞培养和微制造技术的结合，其允许细胞在小的、限定的、很好灌注的体积组织密度下生长，提供多化学激素和生长因子梯度、剪切力、组织灌注、及物理屏蔽对细胞迁移渗透性的独立控制，并且允许在细胞移动、内渗、外渗、血管生成和其他细胞过程中对正常和癌细胞的细致的光学和电化学观测。

近来在纳米滤层(nanofilter)制作^57-61上的发展可用于实施本发明以提供灌注-膜生物反应器，其在设备中在可控制的、稳定的化学激素或生长因子梯度的条件下，允许在1毫米×1毫米×100微米体积内在接近组织的密度下细胞混合培养生长，以模仿体内瘤微环境。本发明的一个优点是可以构造定制设备以使分离的灌注和细胞输送系统允许在实验过程中独立控制剪应力和化学激素梯度。此外，光学和电化学代谢微传感器可安置在这些生物反应器中，以允许在反应器选择区域同时定量局部代谢和化学环境(乳酸盐、pH、O₂等)，其间细胞移动或细胞信号发放事件可由荧光显微镜成像。因此，移动生物反应器的下一代最终将越过简单MTW系统(MicroTransWell)迈向一个更接近复制体外微环境活组织的体系。

微制造技术、微流控和微生物传感器的应用，给瘤血管生成、及白细胞和癌细胞外渗的分子机制研究提供了机会。例如，在脉管形成和再造中Tie2和VEGF的作用的系统检查及可识别更多特定的用于抗血管生成治疗的分子靶标。类似的微设备模型可以用于检查白细胞和癌细胞外渗。这些生物反应器给寄主鼠瘤外植体提供了适当的细胞环境，因此潜在提供了用于瘤活检材料的转移分析。在这些生物反应器中代谢传感将帮助提供对瘤微环境的更清楚的认识并确定我们的体外系统的有效性^62-65。

以下给出了根据本发明实施例的典型设备、它们的应用和有关观测，其并非是意图限定本发明范围。注意用在实施例中的标题或副标题是为了方便读者，其决不应限定本发明范围。此外在这里会提及和披露某些理论，然而，无论它们正确或是错误，都绝不应限定本发明范围，只要所用的设备或它们的应用是根据本发明实施的，没有关系任何特定理论或操作。

实施例

单屏障生物反应器

现在参考图1A和图1B，本发明可以由结合图1A和图1B所示的发明生物反应器100来实现。在一个实施例中，生物反应器100包括一具有第一表面140a和相对第二表面104b的第一基片140，其间界定了用于接收细胞和液体介质的室101。生物反应器100有一将所述室101分成第一亚室102和第二亚室103的屏障104，其中屏障104有多孔性以允许所述第一亚室102和所述第二亚室103进行流体传送，并且允许至少一个预定的细胞类型在所述第一亚室102和所述第二亚室103之间透过。屏障104的多孔性也可选择为不让任何细胞透过。

如所构成的，第一亚室102适于接收第一类型材料如细胞113且第二亚室103适于接收第二类型材料如细胞114，其中每个所述第一类型材料和所述第二类型材料包含选自细胞、化学制剂及流体中的至少一种。所述细胞可以是任何类型的活细胞，包括但不限于细菌、原生动物、或两者、正常细胞、瘤细胞、或它们的组合。

生物相容涂层116可应用在生物反应器100的室壁上，其中生物相容涂层116包含可以抑制细胞粘着于所述生物相容涂层、增强细胞粘着于所述生物相容涂层、或起荧光标记或细胞状态指示剂作用的材料。

生物反应器100进一步包括至少一个或多个输入口105、106和一个或多个相应的输入转移通道112、107。如所构成的，输入转移通道112与相应的输入口105和第一亚室102可进行流体传送，且输入转移通道107与相应的输入口106和第二亚室103可进行流体传送，以允许分别输送细胞、流体或化学制剂至相应亚室102或103。例如，流体可从一个外部设备(未显示)通过输入口105和相应的输入转移通道112引入到第一亚室102。输入口105、106各与外部设备或端口(未显示)进行流体传送。

生物反应器100另外包括至少一个或多个输出口111、109和一个或多个相应输出转移通道110、108。如所构成的，输出转移通道110可与相应的输出口111和第一亚室102进行流体传送，且输入转移通道108可与相应输出口109和第二亚室103进行流体传送，以允许分别从相应亚室102或103中移出细胞、流体或化学制剂。例如，流体可从第一亚室102通过输出转移通道110和相应输出口111引出。输出口111、109每个均可与外部设备或端口(未显示)进行流体传送。

生物反应器100进一步包括至少一个或多个辅助口115和一个或多个辅助通道115a。如所构成的，每个辅助通道115a可与一相应辅助口115及输入转移通道112、107和输出转移通道110、108中相应的一个进行流体传送，以冲洗相应转移通道。辅助口115每个均与外部设备或端口(未显示)进行流体传送。辅助口115和辅助通道115a被用于防止生物反应器100中细胞或细胞碎片阻塞。它们也可以用于选择性施加涂敷到有流体传送的通道中。

生物反应器100另外包括一个或多个访问口117和一个或多个访问通道117a。如所构成的，每个访问通道117a可与一相应访问口117和第一亚室102及第二亚室103中相应的一个进行流体传送，用于允许细胞、流体、化学制剂、涂料或传感材料向相应亚室的输送或移出。访问口117和相应访问通道117a的位置设定以使其可提供向第一亚室102和第二亚室103的直接访问为宜。例如，流体可快速通过访问通道117a和相应访问口117引入第一亚室102中，因为访问口117和第一亚室102之间的距离在这个实施例中最短。每个访问口117均可与外部设备或端口(未显示)进行流体传送。

此外，生物反应器100有一第二基片150，其中第二基片150位于邻近第一基片140的第一表面140a处，且界定了多个连接通道155。所形成的每个连接通道155可使其与如以上所述的输入口105、106，输出口111、109，辅助口115和访问口117中相应的一个进行流体传送。

生物反应器100进一步包括相应于多个连接通道155的多个连接口151，每个连接口151形成有通道153并且其相对于所述第二基片150的位置设定以使每个连接口151的通道153可与第二基片150中形成的连接通道155中相应的一个进行流体传送为宜，如图1B所示。

第一基片140由玻璃、聚脂薄膜、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、硅、聚合物、半导体、或它们的任何组合所构成。屏障104由多孔材料形成。屏障104是微制造的以使其形成允许在所述第一亚室102和所述第二亚室103之间进行流体传送的结构，其可允许某些预定类型的细胞透过屏障104而其他类型细胞则不能透过。例如在图1A和1B所示的实施例中，屏障104形成有彼此间隔的多个柱(posts)，以允许细菌而原生动物不能通过。

生物反应器100进一步包括一第三基片160及位于所述第三基片中的装置，所说的第三基片160位于邻近第一基片140的第一表面处，所说的装置适于电化学测量对第一亚室102和第二亚室103之一或两者中液体介质的细胞响应。第三基片160可以由半导体材料形成，例如硅。

在如图1B所示的一个实施例中，电化学测量的装置包括参考电极161、反电极162、多个边缘连接器垫板164和多个导电端子163。第一导电端子163将参考电极161电连接至相应的边缘连接器垫板164，且第二导电端子163将反电极162电连接至相应的边缘连接器垫板164。用于电化学测量的装置进一步包括多个单独可寻址工作电极165，每一个多个单独可寻址工作电极165均通过相应导电端子163被电连接至相应的边缘连接器垫板164。多个单独可寻址工作电极165的探测头战略性位于图1B轮廓线166所示区域。

实际操作中，引入到第一亚室102和第二亚室103之一或两者的液体介质可以包括一种或多种分析物，且多个单独可寻址工作电极适用于在短于涉及细胞的至少一个细胞生理活性特征反应时间的时间间隔内，传感在所述室101多个位置上液体介质的单一分析物浓度或在所述室101多个位置上液体介质的多种分析物浓度。多个单独可寻址工作电极进一步适用于在短于涉及细胞的至少一个细胞生理活性特征反应时间的时间间隔内，测量对在所述室101的多个位置上液体介质的细胞响应关联的代谢变量。多个单独可寻址工作电极165的探测头战略性地位于与室101相应的轮廓线166所示区域以执行此类工作。

生物反应器100进一步还包括一第四基片170及位于第四基片170中的装置，其中第四基片170位于所述第一基片140的第二表面140b上面，所说的装置适于光学测量对在第一亚室102和第二亚室103中至少一个的液体介质的细胞响应。第四基片170至少是部分透明的。例如它可以由半导体材料或玻璃或两者形成。

在如图1B所示的一实施例中，光学测量装置包括多个光学传感器171、多个边缘连接器垫板173和多个端子172，各将光学传感器171连接至相应边缘连接器垫板173。多个光学传感器171可包含选自发光二级管和光电二极管对、光纤耦合器和光学探测头一组中的至少一个设备。

实际操作中，引入至第一亚室102和第二亚室103之一或两者的液体介质可包括一个或更多分析物，且多个光学传感器171适于在短于涉及细胞的至少一个细胞生理活性特征反应时间的时间间隔内，传感在室101多个位置上液体介质的单一分析物浓度或在室101多个位置上液体介质的多种分析物浓度。多个光学传感器171进一步适于在短于涉及细胞的至少一个细胞生理活性特征反应时间的时间间隔内，测量对在室101的多个位置上的液体介质的细胞响应关联的代谢变量。多个光学传感器171的探测头战略性地位于与室101相应的轮廓线174所示区域以执行此类工作。

多屏障生物反应器

参考图2，本发明可以由结合图2所示的发明生物反应器700来实现。在一个实施例中，生物反应器700包括一具有第一表面和相对第二表面的基片730，其间界定了用于接收细胞和液体介质的室732，其中所述室732形成有中心734和边界736。生物反应器700有一第一屏障738，其围绕中心734和部分室732以形成一个中央室706，和一第二屏障740，其位于第一屏障738和边界736之间以形成一个中间室705和一个外室704。

在一个实施例中，第一屏障738有第一多孔性，以允许中央室706和中间室705进行流体传送及允许至少第一预定类型细胞在所述中央室706和所述中间室705之间透过，且第二屏障740有第二多孔性，以允许外室704和中间室705进行流体传送及允许至少第二预定类型细胞在所述外室704和所述中间室705之间透过。

此外，中央室706适于接收第一类型材料例如瘤细胞714，中间室705适于接收第二类型材料例如正常组织细胞713，且外室704适于接收第三类型材料例如内皮细胞712。每个第一类型材料、第二类型材料和第三类型材料包含选自细胞、化学制剂及流体一组中的至少一种。

第一预定类型细胞包括瘤细胞714，其通常接收于中央室706中形成模拟瘤空间。第二预定类型细胞包括正常组织细胞713，其通常接收于中间室705中形成模拟组织空间。此外，外室704形成模拟脉管空间，其适于接收内皮细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、任何它们的组合、或其他免疫细胞类型。

生物相容涂层742被用于在边界736处的室壁上，其中生物相容涂层742包括可以抑制细胞粘着于所述生物相容涂层、增强细胞粘着于所述生物相容涂层、或起荧光标记或细胞状态指示剂作用的材料。

生物反应器700进一步包括一个或更多输入或输出口701及相应的一个或更多输入或输出转移通道751，每个输入或输出转移通道751与相应输入或输出口701及外室704进行流体传送，以允许向外室704输送细胞、流体或化学制剂。

生物反应器700另外可包括一个或更多输入或输出口702和相应的一个或更多输入或输出转移通道752，其中每个输入或输出转移通道752与相应输入或输出口702和中央室706进行流体传送，以允许向中央室706输送细胞、流体、或化学制剂。

生物反应器700进一步包括一个或更多输入或输出口703和相应的一个或更多输入或输出转移通道753，其中每个输入或输出转移通道753与相应输入或输出口703和中间室705进行流体传送，用于允许向中间室705输送细胞、流体、或化学制剂。

基片730由玻璃、聚脂薄膜、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、硅、聚合物、半导体、或它们的任何组合所构成。第一屏障738由多孔材料形成。第一屏障738是微制造的以形成允许在所述中央室706和中间室705之间进行流体传送的第一结构。第二屏障740由多孔材料形成。第二屏障740是微制造的以形成允许在外室704和中间室705之间进行流体传送的第二结构。第一屏障738和第二屏障740可以用相同或不同的材料形成。且第二结构可以与第一结构相同或不同。例如，在图2所示的实施例中，第一屏障738由彼此间隔比第二屏障740更密的多个柱形成。第一屏障738和第二屏障740可以形成相同或不同的形状。例如，在图2所示实施例中，第一屏障738和第二屏障740都基本为圆形。边界736也可以是各种几何形状。例如，在图2所示实施例中，边界736基本为圆形。

生物反应器700进一步包括装置，其战略性地定位，并适于电化学测量对一个或更多外室704、中间室705和中央室706中液体介质的细胞响应。

在图2所示实施例中，用于电化学测量的装置包括参考电极707、反电极708和多个单独可寻址工作电极。

在实际操作中，引入到外室704、中间室705和中央室706之一或多个的液体介质可以包括至少一种或多种分析物，且多个单独可寻址工作电极分别包括第一组单独可寻址工作电极709、第二组单独可寻址工作电极710和第三组单独可寻址工作电极711。

对于图2所示实施例，第一组单独可寻址工作电极709适于能在短于涉及细胞的至少一个细胞生理活性特征反应时间的时间间隔内，传感在外室704多个位置上液体介质的单一分析物浓度或在外室704多个位置上液体介质的多种分析物浓度。第一组单独可寻址工作电极709进一步适于能在短于涉及细胞的至少一个细胞生理活性特征反应时间的时间间隔内，测量对在外室704多个位置上液体介质的细胞响应关联的代谢变量。

第二组单独可寻址工作电极710适于能在短于涉及细胞的至少一个细胞生理活性特征反应时间的时间间隔内，传感在中央室706多个位置上液体介质的单一分析物浓度或在中央室706多个位置上液体介质的多种分析物浓度。第二组单独可寻址工作电极710进一步适用于能在短于涉及细胞的至少一个细胞生理活性特征反应时间的时间间隔内，测量在中央室706多个位置上液体介质的细胞响应关联的代谢变量。

同样地，第三组单独可寻址工作电极711适于能在短于涉及细胞的至少一个细胞生理活性特征反应时间的时间间隔内，传感在中间室705多个位置上液体介质的单一分析物浓度或在中间室705多个位置上液体介质的多种分析物浓度。第三组单独可寻址工作电极711进一步适于能在短于涉及细胞的至少一个细胞生理活性特征反应时间的时间间隔内，测量对在中间室705多个位置上液体介质的细胞响应关联的代谢变量。

如所构成的，除其他方面外，生物反应器700可用于供养、培养、观察、探测和探查细胞、细胞集合、细胞形成的生物膜及相关细胞活性。例如，如图2所示，生物反应器700允许发生一系列细胞活动，包括：细胞715，其可以为免疫类型细胞例如巨噬细胞或中性粒细胞，经过外渗穿过第二屏障740从外室704至中间室705，且细胞716，其可以为通过周围组织自中央室706转移至脉管空间的瘤细胞，经过内渗穿过第二屏障740从中间室705至外室704，及细胞717，例如内皮细胞，经历管形成穿过第二屏障740，最终导致肿瘤血管形成。

尽管展示了本发明多种实施例，但应理解在设备元件形式排列和方法步骤上可以作出改变以实施本发明，如本领域技术人员所知，未背离权利要求所陈述的本发明的范围。此外，上述实施例仅用于举例说明本发明原理，且不是意图将权利要求限定在所披露的元素。当然，由于在不背离本发明精神和范围时本发明很多实施例可以被实现，因此本发明存在于附加在下文中的权利要求中。

参考文献目录

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Claims

1、一种用于在液体介质中培养活细胞的生物反应器，包含：

a.一第一基片，其具有第一表面和相对第二表面，其间界定了一室，用于接受细胞和液体介质；

b.一屏障，将所述室分成第一亚室和第二亚室，其中所述屏障有多孔性以允许所述第一亚室和所述第二亚室进行液体传送，且允许至少一个预定类型细胞在所述第一亚室和所述第二亚室之间透过。

2、如权利要求1所述生物反应器，其中所述第一亚室适于接收第一类型材料且所述第二亚室适于接收第二类型材料。

3、如权利要求2所述生物反应器，其中每个所述第一类型材料和所述第二类型材料包含选自细胞、化学制剂及流体一组中的至少一种。

4、如权利要求3所述生物反应器，其中所述细胞包含细菌。

5、如权利要求3所述生物反应器，其中所述细胞包含原生动物。

6、如权利要求1所述生物反应器，进一步包含一生物相容涂层施于所述室壁。

7、如权利要求6所述生物反应器，其中所述的生物相容涂层包含一材料，其可以抑制细胞粘着于所述生物相容涂层、增强细胞粘着于所述生物相容涂层、或起荧光标记或细胞状态指示剂作用。

8、如权利要求1所述生物反应器，进一步包含至少一个输入口和一个输入转移通道，所述输入转移通道与所述输入口及所述第一亚室和所述第二亚室之一进行流体传送，以允许所述细胞、流体或化学制剂向相应亚室的输送。

9、如权利要求8所述生物反应器，进一步包含至少一输出口和一输出转移通道，所述输出转移通道可与所述输出口及所述第一亚室和所述第二亚室之一进行流体传送，以允许细胞、流体或化学制剂从相应亚室中移出。

10、如权利要求9所述生物反应器，进一步包含至少一辅助口和一辅助通道，所述辅助通道可与所述辅助口及所述输入转移通道和所述输出转移通道中之一进行流体传送，以冲洗相应转移通道。

11、如权利要求10所述生物反应器，进一步包含至少一访问口和一访问通道，所述访问通道可与所述访问口及所述第一亚室和所述第二亚室之一进行流体传送，以允许细胞、流体、化学制剂、涂料或传感材料向相应亚室的输送和移出。

12、如权利要求11所述生物反应器，进一步包含一第二基片，其中所述第二基片位于邻近所述第一基片的所述第一表面处，且界定了多个连接通道，每个所述连接通道的形成以使其可与所述输入口、所述输出口、所述辅助口和所述访问口中的相应之一进行流体传送。

13、如权利要求12所述生物反应器，进一步包含多个连接口，每个所述连接口形成有一通道，并且其相对于所述第二基片的位置设定以使所述连接口的每个通道可与在所述第二基片中形成的所述连接通道中相应的一个进行流体传送。

14、如权利要求1所述生物反应器，其中所述第一基片由玻璃、聚脂薄膜、聚二甲基硅氧烷、硅、聚合物、半导体、或它们的任何组合所构成。

15、如权利要求1所述生物反应器，其中所述屏障包含多孔材料。

16、如权利要求1所述生物反应器，其中所述屏障是微制造的以使其形成允许在所述第一亚室和所述第二亚室之间进行流体传送的结构。

17、如权利要求1所述生物反应器，进一步包含一第三基片，其中所述第三基片位于邻近所述第一基片的所述第二表面处。

18、如权利要求17所述生物反应器，进一步包含位于所述第三基片中的装置，其适于电化学测量对在所述第一亚室和所述第二亚室中至少一个的液体介质的细胞响应。

19、如权利要求18所述生物反应器，其中用于电化学测量的装置包括：

i.参考电极；

ii.反电极；

iii.多个边缘连接器垫板；和

iv.多个导电端子，其中第一导电端子将所述参考电极电连接至相应的所述边缘连接器垫板，且第二导电端子将所述反电极电连接至相应的所述边缘连接器垫板。

20、如权利要求19所述生物反应器，其中用于电化学测量的装置进一步包括：

多个单独可寻址工作电极，每一个均通过一相应的导电端子电连接至一相应的边缘连接器垫板。

21、如权利要求20所述生物反应器，其中所述液体介质包括至少一种分析物，且其中所述多个单独可寻址工作电极适于能在短于涉及细胞的至少一个细胞生理活性特征反应时间的时间间隔内，传感在所述室多个位置上所述液体介质的单一分析物浓度或在所述室多个位置上所述液体介质的多种分析物的浓度。

22、如权利要求21所述生物反应器，其中所述多个单独可寻址工作电极进一步适于能在短于涉及细胞的至少一个细胞生理活性特征反应时间的时间间隔内，测量对在所述室多个位置上液体介质的细胞响应关联的代谢变量。

23、如权利要求17所述生物反应器，其中所述第三基片包含一半导体材料。

24、如权利要求23所述生物反应器，其中所述半导体材料包含硅。

25、如权利要求1所述生物反应器，进一步包含一第四基片，其中所述第四基片位于所述第一基片的所述第二表面上面。

26、如权利要求25所述生物反应器，进一步包含位于所述第四基片中的装置，其适于光学测量对在所述第一亚室和所述第二亚室中至少一个的液体介质的细胞响应。

27、如权利要求26所述生物反应器，其中用于光学测量的所述装置包含：

i.多个光学传感器；

ii.多个边缘连接器垫板；和

iii.多个光传导端子，各将一光学传感器光学连接至一相应边缘连接器垫板。

28、如权利要求26所述生物反应器，其中所述多个光学传感器包含选自发光二级管和光电二极管对、光纤耦合器和光学探测头一组中的至少一个元件。

29、如权利要求28所述生物反应器，其中所述液体介质包括至少一种分析物，且其中多个光学传感器适于能在短于涉及细胞的至少一个细胞生理活性特征反应时间的时间间隔内，传感在所述室多个位置上液体介质的单一分析物的浓度或在所述室多个位置上液体介质的多种分析物的浓度。

30、如权利要求29所述生物反应器，其中所述多个光学传感器进一步适于能在短于涉及细胞的至少一个细胞生理活性特征反应时间的时间间隔内，测量对在所述室的多个位置上液体介质的细胞响应关联的代谢变量。

31、如权利要求25所述生物反应器，其中所述第四基片包含半导体材料。

32、如权利要求31所述生物反应器，其中所述第四基片是至少部分透明的。

33、一种用于在液体介质中培养活细胞的生物反应器，包含：

a.一基片，其具有第一表面和相对第二表面，其间界定了一室用于接收细胞和液体介质，其中所述室形成有一中心和一边界。

b.一第一屏障，其围绕所述中心和部分所述室形成一中央室；和

c.一第二屏障，其位于所述第一屏障和所述边界之间，形成一中间室和一外室；

其中所述第一屏障有第一多孔性，以允许所述中央室和所述中间室进行流体传送及允许至少一种第一预定类型细胞在所述中央室和所述中间室间透过，且所述第二屏障有第二多孔性，以允许所述外室和所述中间室进行流体传送及允许至少一种第二预定类型细胞在所述外室和所述中间室间透过。

34、如权利要求33所述生物反应器，其中所述中央室适于接收第一类型材料，所述中间室适于接收第二类型材料，且所述外室适于接收第三类型材料。

35、如权利要求34所述生物反应器，其中每个所述第一类型材料、所述第二类型材料和所述第三类型材料包含选自细胞、化学制剂及流体一组中的至少一种。

36、如权利要求33所述生物反应器，其中所述第一预定类型细胞包括瘤细胞，其通常被接收于所述中央室中对应一肿瘤空间。

37、如权利要求36所述生物反应器，其中所述第二预定类型细胞包括正常组织细胞，其通常被接收于所述中间室中对应一组织空间。

38、如权利要求37所述生物反应器，其中所述外室对应于一脉管空间适于接收内皮细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、任何它们的组合、或其他免疫细胞类型。

39、如权利要求33所述生物反应器，进一步包括一生物相容涂层施于所述边界的所述室壁上。

40、如权利要求39所述生物反应器，其中所述生物相容涂层包含一种材料，其可抑制细胞粘着于所述生物相容涂层、增强细胞粘着于所述生物相容涂层、或起荧光标记或细胞状态指示剂作用。

41、如权利要求33所述生物反应器，进一步包括至少一个输入或输出口和一个输入或输出转移通道，所述输入或输出转移通道可与所述输入或输出口及所述外室进行流体传送，以允许细胞、流体或化学制剂向外室的输送。

42、如权利要求41所述生物反应器，进一步包括至少一输入或输出口和一输入或输出转移通道，所述输入或输出转移通道可与所述输入或输出口及所述中央室进行流体传送，以允许细胞、流体或化学制剂向所述中央室输送。

43、如权利要求42所述生物反应器，进一步包括至少一输入或输出口和一输入或输出转移通道，所述输入或输出转移通道可与所述输入或输出口及所述中间室进行流体传送，以允许细胞、流体或化学制剂向所述中间室输送。

44、如权利要求33所述生物反应器，其中所述基片由玻璃、聚脂薄膜、聚二甲基硅氧烷、硅、聚合物、半导体、或它们的任何组合所构成。

45、如权利要求33所述生物反应器，其中所述第一屏障包含多孔材料。

46、如权利要求45所述生物反应器，其中所述第一屏障是微制造的以形成允许在所述中央室和所述中间室之间进行流体传送的第一结构。

47、如权利要求46所述生物反应器，其中所述第二屏障包含多孔材料。

48、如权利要求47所述生物反应器，其中所述第二屏障是微制造的以形成允许在所述外室和所述中间室之间进行流体传送的第二结构，且所述第二结构与所述第一结构不同。

49、如权利要求33所述生物反应器，进一步包含装置，其适于电化学测量对所述外室、所述中间室和所述中央室中至少一个的液体介质的细胞响应。

50、如权利要求49所述生物反应器，其中用于电化学测量的所述仪器包含：

i.一参考电极；

ii.一反电极；和

iii.多个单独可寻址工作电极。

51、如权利要求50所述生物反应器，其中所述液体介质包括至少一种分析物，且其中所述多个单独可寻址工作电极包含一第一组单独可寻址工作电极，其适于能在短于涉及细胞的至少一个细胞生理活性特征反应时间的时间间隔内，传感在所述外室多个位置上液体介质的单一分析物浓度或在所述外室多个位置上液体介质的多种分析物浓度。

52、如权利要求51所述生物反应器，其中所述第一组单独可寻址工作电极进一步适于能在短于涉及细胞的至少一个细胞生理活性特征反应时间的时间间隔内，测量对在所述外室的多个位置上液体介质的细胞响应关联的代谢变量。

53、如权利要求52所述生物反应器，其中所述多个单独可寻址工作电极进一步包括一第二组单独可寻址工作电极，其适于能在短于涉及细胞的至少一个细胞生理活性特征反应时间的时间间隔内，传感所述中央室多个位置上的液体介质的单一分析物浓度或所述中央室多个位置上的液体介质的多种分析物浓度。

54、如权利要求53所述生物反应器，其中所述第二组单独可寻址工作电极进一步适于能在短于涉及细胞的至少一个细胞生理活性特征反应时间的时间间隔内，测量对所述中央室的多个位置上液体介质的细胞响应关联的代谢变量。

55、如权利要求54所述生物反应器，其中所述多个单独可寻址工作电极包括一第三组单独可寻址工作电极，其适于能在短于涉及细胞的至少一个细胞生理活性特征反应时间的时间间隔内，传感所述中间室多个位置上的液体介质的单一分析物浓度或在所述中间室多个位置上的液体介质的多种分析物浓度。

56、如权利要求55所述生物反应器，其中所述第三组单独可寻址工作电极进一步适于能在短于涉及细胞的至少一个细胞生理活性特征反应时间的时间间隔内，测量对所述中间室多个位置上液体介质的细胞响应关联的代谢变量。

57、如权利要求33所述生物反应器，其中所述第一屏障基本为圆形。

58、如权利要求33所述生物反应器，其中所述第二屏障基本为圆形。

59、如权利要求33所述生物反应器，其中所述边界基本为圆形。

60、一种用于在液体介质中培养活细胞的生物反应器，包含：

a.一基片，其具有第一表面和相对第二表面，其间界定了带有边界的一室用于接收细胞和液体介质；和

b.区分所述室为多个室的装置；

其中每个多个亚室可与多个亚室中至少另一个进行流体传送。

61、如权利要求60所述生物反应器，其中所说的区分的装置包含一屏障，将所述室区分为第一亚室和第二亚室，且其中所述屏障有多孔性以允许所述第一亚室和所述第二亚室可进行流体传送并允许至少一种预定细胞类型可以透过所述第一亚室和所述第二亚室之间。

62、如权利要求60所述生物反应器，其中所说的区分的装置包含一第一屏障和一第二屏障，将所述室区分为第一亚室、第二亚室和第三亚室，且其中所述第一屏障有第一多孔性以允许所述第一亚室和所述中间亚室进行流体传送以及至少第一预定细胞类型渗过所述第一亚室和所述第二亚室之间，且所述第二屏障有第二多孔性以允许所述第二亚室和所述第三亚室进行流体传送及至少第二预定细胞类型渗过所述第二亚室和所述第三亚室之间。

63、如权利要求62所述生物反应器，其中所述第一多孔性和所述第二多孔性可以相同或不同。

64、如权利要求60所述生物反应器，其中所说的区分的装置包含n多个屏障，n为大于0的整数，将所述室区分为n+1个亚室。

65、如权利要求64所述生物反应器，其中每个n个屏障有相应的多孔性，其可以与其它屏障的多孔性相同或不同。