CN1694959B - 非序列互补的抗病毒寡核苷酸 - Google Patents

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Abstract

描述了具有抗病毒活性的随机序列寡核苷酸和它们作为抗病毒剂的应用。在许多情况下，寡核苷酸是大于40个核苷酸的长度。还描述了预防或治疗人或动物中的病毒感染的方法，和预防性治疗肿瘤病毒在人或动物中造成的癌症的方法。所述方法典型地包括给需要该治疗的人或动物施用药理学上可接受的、治疗有效量的至少一种寡核苷酸，所述寡核苷酸不通过序列互补的作用方式发挥作用。

Description

非序列互补的抗病毒寡核苷酸
技术领域
本发明涉及具有抗病毒活性的寡核苷酸和它们在病毒感染、癌症和病原学是以病毒为基础的其它疾病中作为治疗剂的应用，所述的病毒感染由人和动物病毒造成，所述癌症由癌基因病毒造成。
发明背景
下面的讨论只是用于帮助阅读者理解，不是承认任何讨论的信息或引用的参考文献构成了本发明的现有技术。
人类患有的许多重要传染病都是由病毒造成的。这些疾病包括狂犬病、天花、脊髓灰质炎、肝炎、黄热病、免疫缺陷和各种脑炎病，它们中的许多常常是致命的。其它的是突出的，因为它们是高度传染性的且产生急性不适，例如流感、麻疹、腮腺炎和水痘，以及呼吸道病或胃肠病。其它的例如风疹和巨细胞病毒会造成先天畸形。最后，已知有些病毒是肿瘤病毒，它们会在人类和动物中引起癌症。
在病毒中，非常感兴趣的是疱疹病毒科家族。疱疹病毒科是一类普遍存在的二十面体(icoshedral)、双链DNA病毒。在疱疹病毒科(HHV)的超过100种表征的成员中，仅有8种能感染人类。其中最为熟知的是I型单纯疱疹(HSV-1)、II型单纯疱疹(HSV-2)、水痘带状疱疹(水痘或带状疱疹)、巨细胞病毒(CMV)和EB病毒(EBV)。疱疹病毒在人类中的发病率是较高的，影响世界人口的至少三分之一；在美国，70-80％的人口有某种类型的疱疹感染。尽管疱疹感染的病理学通常不是危险的，如HSV-1通常仅仅造成嘴和面部周围的短期病变，还已知这些病毒是许多更严重症状的起因，这些症状从生殖器溃疡和障碍到能引起脑炎(15％死亡率)或弥散性传染(40％死亡率)的胎儿感染。
疱疹病毒在性质上是弥散，且对人是高度致病的。例如，已知EB病毒(EBV)会在童年晚期或青春期或青壮年时引起传染性单核细胞增多症。急性传染性单核细胞增多症的特点是喉咙痛、发烧、头痛、淋巴结病、扁桃腺肥大和在外周血液中的非典型的分散淋巴细胞。其它的表现经常包括轻度肝炎、脾大和脑炎。EBV还与两种形式的癌症有关：伯基特淋巴瘤(BL)和鼻咽癌(NPC)。在近赤道的非洲的流行地，BL是最常见的儿童恶性肿瘤，占儿童癌症的约80％。尽管适度地在北美高加索观察到，NPC是在中国南部最常见的癌症之一，发病年龄为25～55岁。与巨细胞病毒类似，EBV也与移植后的淋巴组织增生病有关，该病是实质器官或骨髓移植后的慢性免疫抑制的潜在的致命并发症。
其它疾病也与HSV有关，包括皮肤和眼睛感染，例如脉络膜视网膜炎或角膜结膜炎。在美国，每年诊断出约300,000例HSV眼睛感染。
AIDS(获得性免疫缺陷综合征)由人免疫缺陷病毒(HIV)引起。通过杀死或破坏身体免疫系统的细胞，HIV逐渐地摧毁身体抗感染和某些癌症的能力。目前，世界上约有4200万人患有HIV/AIDS。在2002年，共有310万人死于与HIV/AIDS有关的原因。抗-HIV药物疗法的最终目标是阻止病毒复制和破坏免疫系统。尽管在过去的15年中已经在抗击HIV的斗争中取得了实质性的进步，但医学科学上仍然难以治愈。目前，医生可以用3种不同药物类型中的多余一打的抗逆转录病毒的药物来控制疾病。典型地，将两种或三种类型的药物以各种的组合开出处方，称作HAART(高效抗逆转录病毒治疗)。HAART疗法典型地包括2种核苷逆转录酶抑制剂药物和第三种药物，该第三种药物是蛋白酶抑制剂或非核苷逆转录酶抑制剂。临床研究已经证实，HAART是减少病毒负载和使抗药性的可能最小化的最有效的方法。
尽管已经证实HAART能减少体内的HIV的量(通常称作病毒负载)，千分之十的患者使用该疗法会出现显著的问题。一些副作用是严重的，包括异常的脂代谢、肾结石和心脏病。其它的副作用例如恶心、呕吐和失眠不太严重，但是对于终生需要长期药物治疗的HIV患者而言仍然是问题。
目前批准的抗-HIV药物通过进入感染了HIV的CD4+T细胞并阻断病毒酶(逆转录酶或蛋白酶)的作用来发挥作用。为了进行复制，HIV需要这些酶。但是，HIV经常发生突变并变成抗性的，使逆转录酶或蛋白酶抑制剂药物无效。一旦产生抗性，病毒负载就会升高，并指示需要将无效的药物换成另一种抗逆转录病毒的药物。不幸的是，当病毒变得对一类药物中的一种有抗性时，该类中的其它药物也可能变得不太有效。该现象称作交叉抗药性，其原因是许多抗-HIV的药物以类似的方式发挥作用。药物交叉抗性的发生是非常不希望有的，因为它减少了患者可获得的治疗选择的数量。
因此，非常需要开发对HIV有效的其它抗病毒药物，其通过其它的作用机理发挥作用，病毒尚未对其产生抗性。这正在变得特别重要，因为最近的数据表明，欧洲有十分之一的最近被确诊的携带HIV的患者所感染的HIV株已经对至少一种批准的市售药物产生了抗性。
呼吸道合胞病毒(RSV)会造成上和下呼吸道感染。它是一种负义的、包膜的RNA病毒，且是高传染性的。它通常感染幼龄儿童，且通常是婴儿下呼吸道疾病的最常见的原因。RSV感染通常伴有中度至严重感冒样的症状。但是，严重的下呼吸道疾病会发生在任何年龄，特别是在老年的或免疫损害的患者中。重度感染的儿童可能需要氧治疗，且在某些情况下需要机械通风。根据美国医学会，越来越多的儿童因为细支气管炎住院，该病通常由RSV感染造成。RSV感染还占骨髓移植中心中的患者的群体相关的呼吸道病毒感染的约三分之一。在年老的人群中，近来已经认为RSV感染的严重性与流感病毒感染非常相似。
流行性感冒(INF)也称作流感，是由流感病毒造成的传染性疾病。它攻击人类的呼吸道(鼻、喉和肺)。在美国，平均每年有约36,000人死于流感，且每年有114,000人需要因流感而住院。
在所有的传染病中，给定的疗法的功效经常取决于宿主的免疫反应。对于疱疹病毒更是如此，因为这时所有疱疹病毒的造成潜伏感染的能力会在免疫损害的患者中造成非常高的再激活感染的发生率。在肾移植的受体中，40％～70％会再激活潜伏的HSV感染，80％～100％会再激活CMV感染。在AIDS患者中也已经观察到了这样的病毒再激活。
乙型肝炎病毒(HBV)是一种DNA病毒，它属于嗜肝DNA病毒科病毒家族。HBV在人类中造成乙型肝炎。估计世界上有20亿人已经受到感染(3人中有1人)。约3.5亿人是慢性感染的，估计每年有100万人死于乙型肝炎及其并发症。HBV会造成终生感染、肝硬化、肝癌、肝功能衰竭和死亡。该病毒通过血液和体液传播。这可以通过直接的血液至血液接触、无防护的性行为、使用未消毒的针头的和在分娩过程中从感染的妇女向其婴儿的传播发生。大多数健康的受到感染的成年人(90％)能够恢复，并产生对将来的乙肝病毒感染的保护性抗体。少数(5-10％)不能清除该病毒且会发展成慢性感染，当感染了该病毒时，有90％的婴儿和高达50％的幼龄儿童会发展成慢性感染。α-干扰素是最常见的采用的治疗类型。该治疗伴有显著的副作用，包括流感样症状、抑郁、皮疹、其它的反应和异常的血细胞计数。其它的治疗选择包括3TC，其也有许多与其应用有关的副作用。在过去的几年中，已经有越来越多的报道表明，用3TC治疗的患者会产生HBV抗性株。对于同时感染了HBV和HIV的患者群体而言，这是特别成问题的。显然，迫切需要开发能抗该病毒的新的抗病毒疗法。
丙型肝炎病毒(HCV)感染是美国最常见的慢性的通过血液的感染，在美国受感染的患者数目有可能超过了400万。在美国，该常见的病毒感染是肝硬化和肝癌的主要原因，现在也是肝移植的主要原因。感染后恢复是不常见的，约85％受感染的患者会变成该病毒的慢性携带者，且10～20％发展成肝硬化。估计目前世界上有1.7亿人是慢性携带者。根据疾病控制和预防中心，仅仅在美国，慢性丙型肝炎每年造成8,000～10,000人死亡，并导致约1,000例肝移植。没有可以用于丙型肝炎的疫苗。长时间的干扰素α、或干扰素与利巴韦林组合治疗仅仅在约40％患者中有效，且产生显著的副作用。
现在，病毒感染的治疗前景总体上并不乐观。通常，病毒的治疗具有普通功效，并伴有强烈的副作用，其阻止了有效剂量的施用或阻止了长期治疗。能说明这些问题的3种临床情形是疱疹病毒科、HIV和RSV感染。
在疱疹病毒科的情况中，目前主要有5种治疗被批准用于临床：碘苷、阿糖腺苷、无环鸟苷、膦甲酸和更昔洛韦。尽管功效有限，这些治疗还具有副作用。已经报道35％的用碘苷治疗的患者有过敏反应，阿糖腺苷会在15％的患者中造成胃肠紊乱，核苷酸类似物无环鸟苷、膦甲酸和更昔洛韦会影响宿主细胞的DNA复制。在40％的用更昔洛韦治疗的AIDS患者中，报道有中性白细胞减少症和血小板减少症。
尽管目前有许多不同的药物可以用于治疗HIV感染，但是它们都伴有相当明显的副作用，需要广泛地补充药物来给患者提供合理的生活质量。HIV的抗药性株的其它问题(该问题还会出现在疱疹病毒科感染中)通常需要周期性地改变鸡尾酒治疗，并在有些情况下使得感染非常难以治疗。
治疗幼龄婴儿的RSV感染是迫切需要开发新药物的另一个实例。在该情况中，通常的治疗方法是使用隔离袋中的小颗粒气雾剂通过吸入输送利巴韦林。不但利巴韦林只是略微有效，而且它的应用伴有显著的副作用。另外，药物的潜在释放已经引起了医疗人员的高度重视，因为已知的利巴韦林的致畸性。
显然，对于任何新出现的开发出的抗病毒药物，非常理想的是具有下述3个特征：1-提高的功效；2-降低的副作用风险，和3-病毒难以通过突变克服的作用机制。
已经进行了通过各种反义方法抑制具体病毒的许多尝试。
Zamecnik等已经使用了特异性地靶向逆转录酶引物位点和剪接供体/受体位点的ON(Zamecnik，等(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：4143-)(Goodchild和Zamecnik(1989)美国专利4,806,463)。
Crooke和Coworkers.(Crooke等(1992)Antimicrob.Agents Chemother.36：527-532)描述了一种抗HSV-1的反义。
Draper等(1993)(美国专利5,248,670)已经报道了具有抗-HSV活性、含有Cat序列且能与HSV-1基因UL13、UL39和UL40杂交的反义寡核苷酸。
Kean等(Biochemistry(1995)34：14617-14620)已经测试了作为抗-HSV试剂的反义甲基膦酸酯寡聚物。
Peyman等(Biol Chem Hoppe Seyler(1995)Mar；376：195-198)已经报道了对指向IE110的特异性反义寡核苷酸的测试，和对HSV-1的UL30mRNA的抗病毒性质的测试。
Anderson等(1997)(美国专利5,591,720)报道了指向编码IE1、IE2或DNA聚合酶的CMV mRNA的寡核苷酸或寡核苷酸类似物。
Hanecak等(1999)(美国专利5,952,490)已经记载了修饰的寡核苷酸，其具有保守的G四合体序列(G quartet sequence)和足够数量的侧翼核苷酸，以显著抑制病毒如HSV-1的活性。
Jairath等(Antiviral Res.(1997)33：201-213)已经报道了抗RSV的反义寡核苷酸。
Torrence等(1999)(美国专利5,998,602)已经报道了含有与RSV反基因组链(mRNA链)的单链部分互补的反义组分、连接物和核糖核酸酶L的寡核苷酸激活剂的化合物。
Qi等(Zhonghua Shi Yan He Lin Chuang Bing Du Xue Za Zhi(2000)14：253-256)已经报道了对柯萨奇病毒B3中的反义PS-ODN的测试。
国际公开WO9203051(Roizman和Maxwell)记载了甲基膦酸酯反义寡聚物，其与HSV病毒基因组的关键区或其mRNA转录物互补，其表现出抗病毒活性。
已经报道鸟嘌呤核苷/胸腺嘧啶核苷或富含鸟嘌呤核苷的硫代磷酸酯(phophorothioate)寡脱氧核苷酸(GT-PS-ODN)具有抗病毒活性。该文章讲述，“26或27个核苷酸的长度的几种不同的含有PS的GT-丰富的ODN(B106-140、I100-12和G106-57)在减少HIV-2效价方面与由36(B106-96，B106-97)或45个核苷酸组成的GT-丰富的ODN一样有效(表4)”(Fennewald等，Antiviral Res.(1995)26：37-54)。
在美国专利6,184,369中，记载了含有高百分比的鸟嘌呤核苷碱基的抗-HIV、抗-HSV和抗-CMV的寡核苷酸。在优选的实施方案中，该寡核苷酸具有三维结构，且该结构由鸟嘌呤核苷四合体稳定化。在另一个实施方案中，该发明的寡核苷酸组合物含有2个或更多个(two or more runs)的2个相邻的脱氧鸟苷。该专利要求保护G-丰富的ODN，其包括在至少2个位置的至少2个G残基。
Cohen等(美国专利5,264,423和5,276,019)记载了对HIV复制的抑制，更具体地记载了PS-ODN类似物，其可以用于阻止外来核酸在正常肝细胞中的复制。Cohen等描述了对病毒序列特异性的反义PS-ODN的抗病毒活性。他们还描述了对14、18、21和28-mer的polyA、polyT和polyC的PS-ODN序列的测试，并证实了这些PS-ODN的抗病毒作用。
Matsukura等(Matsukura等(1987)Proc Natl Acad Sci USA 84：7706-7710)稍后公开了Cohen等在上面的美国专利中所述的结果。
Gao等(Gao等(1989)J Biol Chem 264：11521-11526)描述了通过测试大小为7、15、21和28个核苷酸的PolyA、polyT和polyC PS-ODN序列，PS-ODN对HSV-2复制的抑制。
Archambault、Stein和Cohen(Archambault等(1994)Arch Virol 139：97109)报道，28个核苷酸的PS-ODN polyC对HSV-1是无效的。
Stein等(Stein等(1989)AIDS Res Hum Retrovir 5：639-646)公开了关于抗-HIV ODN的其它数据的结果，其通常是21-28个核苷酸长度。
Marshal等(Marshal等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：62656269)描述了硫代磷酸酯和长度为4-28个核苷酸的硫代磷酸酯poly-C寡聚物的抗-HIV-1作用。
Stein和Cheng(Stein等(1993)Science 261：1004-1012)在一篇综述中提到了28个核苷酸的非特异性的ODN的抗病毒活性，讲述了“非序列特异性的作用显著影响了PS寡聚物的抗-HIV性质，也就是说，抑制作用独立于碱基序列”。
在一篇综述中，Lebedeva和Stein(Lebedeva等(2001)Annul RevPharmacol 41：403-419)报道了多种PS-ODN的非特异性的蛋白结合活性，包括病毒蛋白。他们声称，“这些分子是高生物活性的，经常相对容易地错将人工产物当作反义”。
Rein等(美国专利6,316,190)报道了连接到融合配偶体且结合到HIV核壳的GT丰富的ON假目标，其可以用作抗病毒的化合物。类似地，Campbell等(Campbell等(1999)J.Virol.73：2270-2279)报道了具有TGTGT基序的PO-ODN，该基序能特异性地结合到HIV的核壳，但是没有抗病毒活性。
Feng等(Feng等(2002)J.Virol.76：11757-11762)描述了结合到重组HIV的核壳的A(n)和TG(n)PO-ODN，但是没有数据表明其有抗-HIV活性。
被开发作抗癌剂、抗病毒剂或者用于治疗其它疾病的反义ODN典型地长为约20个核苷酸。一篇综述(Stein，CA，(2001)J.Clin Invest 108：641-644)证实，“必须优化反义寡核苷酸的长度：如果反义寡核苷酸太长或太短，会缺失特异性元件。目前，反义寡核苷酸的最佳长度好像是约16-20个核苷酸”。类似地，另一篇综述(Crooke，ST(2000)Methods Enzymol313：3-45)声称，“与RNA和RNA双链体的形成相比，硫代磷酸酯寡脱氧核苷酸具有Tm约-2.2°降低/单位。这意味着，为了体外有效，硫代磷酸酯寡脱氧核苷酸必须典型地是17至20-mer的长度......”。
Caruthers和同事(Marshall等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：6265-6269)报道了12mer多胞嘧啶核苷-PS2-ODN和14mer PS2-ODN的二硫代磷酸酯ODN(PS2-ODN)的抗-HIV活性。没有测试其它大小的抗-HIV活性。他们还报道了12、14、20和28mer多胞嘧啶核苷-PS2-ODN对HIV逆转录酶(RT)的抑制。后来，(Marshal等(1993)Science 259：1564-1570)报道的结果证实了HIV RT的序列特异性的抑制。相同的组在几个专利中公开了PS2-ODN的数据。在美国专利5218103和5684148中，记载了PS2-ODN的结构和合成。在美国专利号5,452,496，5,278,302和5,695,979中，记载了不超过15个碱基的PS2-ODN对HIV RT的抑制。在美国专利号5,750,666和5,602,244中，记载了PS2-ODN的反义活性。
发明概述
本发明涉及一项发现，即寡核苷酸(ON)、例如寡脱氧核苷酸(ODN)可以具有广泛应用的非序列互补性的抗病毒活性。因而，该寡核苷酸无需与任何病毒序列互补或者具有特定的核苷酸分布，即可具有抗病毒活性。这样的寡核苷酸甚至可以作为随机物而制备，使得在制备时至多只有少数拷贝的任意特定序列，例如在15μmol的随机物制备中，长度为32个或更多的核苷酸。
另外，本发明人发现，不同长度的寡核苷酸具有不同的抗病毒作用，还发现，能生成最大抗病毒作用的抗病毒寡核苷酸的长度是在40-120个核苷酸的范围内。考虑到本发明的关于寡核苷酸的抗病毒性质的发现，本发明提供了寡核苷酸抗病毒剂，其可以具有抗多种不同病毒的活性，且甚至可以选作广谱抗病毒剂。考虑到目前可以获得的有限的抗病毒治疗选择，这样的抗病毒剂是特别有益的。
因此，本发明的ON(例如ODN)可以用于治疗或预防病毒感染、或治疗或预防病毒、例如肿瘤病毒(例如逆转录病毒、乳头瘤病毒和疱疹病毒)诱导的肿瘤或癌症、和治疗或预防其它病原学是基于病毒的疾病的疗法。这种治疗可以用于许多类型的患者，治疗包括例如预防或治疗免疫损害的人或动物患者的病毒感染。
第一方面，本发明提供了抗病毒的寡核苷酸制剂，其包括至少一种适用作抗病毒剂的抗病毒寡核苷酸，例如至少6个核苷酸的长度，其中寡核苷酸的抗病毒活性主要是通过非序列互补的作用方式来产生。该制剂可以包括不同寡核苷酸(例如至少2、3、5、10、50、100或更多)的混合物。
如这里关于寡核苷酸或其它物质所使用的，术语“抗病毒的”是指寡核苷酸或其它物质存在抑制病毒颗粒的生成的作用，即在否则会适合感染性病毒颗粒的形成的系统中减少形成的感染性病毒颗粒的数目。
术语“抗病毒的寡核苷酸制剂”是指包含至少一种适用作抗病毒剂的抗病毒寡核苷酸的制品。该制剂包括一种或多种寡核苷酸，且可以含有不会干扰作为抗病毒剂在体内应用的其它物质。这样的其它物质可以包括但不限于稀释剂、赋形剂、载体物质和/或其它的抗病毒物质。
如本文所使用的，术语“药物组合物”是指抗病毒的寡核苷酸制剂，其包括生理上或药学上可接受的载体或赋形剂。该组合物还可以包括其它组分，其不会使该组合物不适于对需要的受试者(例如人)施用。
在本发明的上下文中，除非特别说明，术语“寡核苷酸(ON)”指寡脱氧核苷酸(ODN)或寡脱氧核糖核苷酸或寡核糖核苷酸。因而，“寡核苷酸”是指核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)或其类似物的寡聚物或聚合物。该术语包括由天然存在的核碱基、糖和共价的核苷间(主链)键合组成的寡核苷酸、和具有功能类似的非天然存在的部分的寡核苷酸。这种修饰的或取代的寡核苷酸经常优于天然形式，因为理想的性质，例如增强的细胞摄入、增强的向核酸靶位点的亲和力、提高的在核酸酶存在下的稳定性。本文描述了可以使用的修饰的实例。包括主链和/或其它修饰的寡核苷酸也可以称作寡核苷。
如关于抗病毒制剂、药物组合物或其它物质所使用的，短语“适用作抗病毒剂”是指该物质表现出抗病毒作用，且不包括会使其不适用于在体内系统中抑制病毒复制(例如对受试者例如人受试者给药)的任何组分或物质。
如本文关于物质的抗病毒作用所使用的，短语“非序列互补的作用方式”是指该物质表现出抗病毒作用的机理不是由于互补的核酸序列的杂交，例如反义作用。相反地，“序列互补的作用方式”是指物质的抗病毒作用涉及互补的核酸序列的杂交。因而，物质的抗病毒活性“不是主要由于序列互补的作用方式”是指，寡核苷酸的活性满足本文提供的4项试验(参见实施例10)中的至少一项，所述试验用于检测该抗病毒活性是否“非主要由于序列互补的作用方式”。在具体的实施方案中，寡核苷酸满足试验1、试验2、试验3或试验4；寡核苷酸满足2项试验的组合，即试验1和2；试验1和3；试验1和4，试验2和3，试验2和4，或试验3和4；寡核苷酸满足3项试验的组合，即试验1、2和3，试验1、2和4，试验1、3和4，或试验2、3和4；寡核苷酸满足全部试验1、2、3和4。
如这里关于抗病毒物质的施用所使用的，术语“受试者”是指活的高等生物，包括，例如，动物，例如哺乳动物，例如人、非人的灵长类、牛、猪、绵羊、马、狗和猫；鸟类；和植物，例如果树。
一个相关的方面涉及抗病毒的寡核苷酸随机物制剂，其中该随机物的抗病毒活性主要是通过非序列互补的作用方式产生。这种随机物制剂可以例如包括不同长度的随机物的混合物，例如至少2、3、5、10或更多的不同长度。
如这里关于寡核苷酸序列所使用的，术语“随机”表征了不与病毒mRNA互补的序列或ON，其不会形成发夹且不具有包含于其中的回文序列。当术语“随机”用在指向具体病毒的寡核苷酸的抗病毒活性的上下文中时，是指缺少与该具体病毒的病毒mRNA的互补性。互补性的缺少可以是广义的，例如对于多种病毒、对于来自具体病毒家族的病毒或对于感染性的人病毒。
在本申请中，术语“随机物”意指在每个位置都有摆动(N)、例如NNNNNNNNNN的单链DNA。每个碱基都作为摆动合成，所以该ON实际上是作为一群不同的随机产生的相同大小的序列存在。
在另一方面，本发明提供了具有抗目标病毒的抗病毒活性的寡核苷酸，其中该寡核苷酸是至少29个核苷酸的长度(或者在具体实施方案中，至少30、32、34、36、38、40、46、50、60、70、80、90、100、110或120个核苷酸的长度)，且该寡核苷酸的序列不与目标病毒的基因组序列的任何部分互补。
在另一方面，本发明提供了寡核苷酸制剂，其包含至少一种具有抗目标病毒的抗病毒活性的寡核苷酸，其中寡核苷酸是至少6个核苷酸的长度(在具体实施方案中，至少29、30、32、34、36、38、40、46、50、60、70、80、90、100、110或120个核苷酸的长度)，且寡核苷酸的序列与目标病毒的基因组核酸序列的任何部分的互补性低于70％，且基本上不是由polyA、polyC、polyG、polyT、G四合体或TG-丰富的序列组成。在具体实施方案中，该寡核苷酸与目标病毒的基因组核酸序列的任何部分的互补性低于65％、60％、55％、50％、80％、90％、95％或100％。
如关于本发明的寡聚物所使用的，术语“TG-丰富的”是指抗病毒的寡核苷酸序列由至少70％的T和G核苷酸组成，或者如果特别说明，是至少80、90或95％的T和G，或者甚至100％组成。
相关方面涉及分离的、纯化的或富集的如本文所述的抗病毒的寡核苷酸，例如对抗病毒的寡核苷酸制剂和其它寡核苷酸制品(例如适合体外使用的制品)所述的。
用于本发明的抗病毒的寡核苷酸可以是各种长度，例如至少6、10、14、15、20、25、28、29、30、35、38、40、46、50、60、70、80、90、100、110、120、140、160或更多个核苷酸的长度。类似地，该寡核苷酸可以在一定的范围内，例如通过取任意2个前述值作为范围的包含性端点所定义的范围，例如10-20、20-40、30-50、40-60、40-80、60-120和80-120个核苷酸。在具体实施方案中，最小长度或长度范围与本文为本发明的抗病毒的寡核苷酸所列出的任何其它寡核苷酸说明相组合。
抗病毒的核苷酸可以包括各种修饰，例如稳定化修饰，因而可以包括磷酸二酯键中的和/或糖上的、和/或碱基上的至少一个修饰。例如，该寡核苷酸可以包括一个或多个硫代磷酸酯键、二硫代磷酸酯键和/或甲基膦酸酯键；在糖的2′-位置的修饰，例如2′-O-甲基修饰、2′-氨基修饰、2′-卤代修饰例如2′-氟代；非环的核苷酸类似物，也可以包括至少一个磷酸二酯键。其它修饰也是本领域已知的，也可以使用。在含有2′-O-甲基修饰的寡聚物中，该寡聚物不应当具有遍布的2′-O-甲基修饰，因为目前的结果表明，该寡聚物不具有稳定的活性。在具体实施方案中，寡核苷酸具有遍布的修饰键，例如硫代磷酸酯；具有3′-和/或5′-帽；包括末端的3′-5′键；寡核苷酸是或包括由两个或多个寡核苷酸序列通过连接物连接形成的多联体。
在具体实施方案中，寡核苷酸能结合到一个或多个病毒蛋白上；寡核苷酸(或其一部分，例如至少1/2)的序列是源自病毒基因组；具有来自病毒基因组的序列的寡核苷酸的活性不优于相同长度的随机物寡核苷酸或随机寡核苷酸；寡核苷酸包括与病毒序列互补的的部分和不与病毒序列互补的部分；寡核苷酸序列是源自病毒包装序列或参与相似(aptameric)相互作用的其它病毒序列；除非另有说明，寡核苷酸序列包括A(x)、C(x)、G(x)、T(x)、AC(x)、AG(x)、AT(x)、CG(x)、CT(x)或GT(x)，其中x是2、3、4、5、6，...60...120(在具体实施方案中，寡核苷酸是至少29、30、32、34、36、38、40、46、50、60、70、80、90、100、110或120个核苷酸的长度，或者具体的重复序列的长度是至少具体的长度)；寡核苷酸是单链的(RNA或DNA)；寡核苷酸是双链(RNA或DNA)；寡核苷酸包括至少一个G四合体或CpG部分；寡核苷酸包括与病毒mRNA互补的部分，且是至少29、37或38个核苷酸的长度(或者如上所述的其它长度)；寡核苷酸包括至少一个非沃森-克里克寡核苷酸和/或至少一个参与非沃森-克里克与另一个核苷酸相结合的核苷酸；寡核苷酸是随机寡核苷酸，寡核苷酸是随机物或者包括随机物部分，例如具有上面所述寡核苷酸长度的长度的随机物部分；寡核苷酸在一个或多个核苷酸残基处连接或结合到分子上，所述分子修饰寡核苷酸的特征，所述的修饰例如为了提供更高的稳定性(例如在血清中的稳定性或在特定溶液中的稳定性)、更低的血清相互作用、更高的细胞摄入、更高的病毒蛋白相互作用、改善的输送制剂的能力、可检测出的信号、提高的药物代谢动力学性质、特异性的组织分布和/或更低的毒性。
寡核苷酸还可以组合使用，例如作为混合物。这样的组合或混合物可以包括例如至少2、4、10、100、1000、10000、100,000、1,00,000或更多个不同寡核苷酸。这样的组合或混合物可以例如是不同的序列和/或不同的长度和/或不同的修饰和/或不同的连接或结合的分子。在这种组合或混合物的具体实施方案中，许多寡核苷酸具有最小长度，且在如上为寡核苷酸所述的长度范围内。在这种组合或混合物的具体实施方案中，至少一个、许多或每个寡核苷酸可以具有本文为各个抗病毒寡核苷酸所述的任何其它性质(其也可以是任何一致的组合)。
短语“源自病毒基因组”是指特定序列具有的核苷酸碱基序列与病毒基因组核苷酸序列或其互补序列(例如与该病毒基因组序列相同或互补)具有至少70％的同一性，或者是相应的RNA序列。在本发明的具体实施方案中，该术语表明，序列与特定病毒的病毒基因组序列(寡核苷酸指向它)或其互补序列具有至少70％的同一性。在具体实施方案中，同一性是至少80、90、95、98、99或100％。
本发明还提供了抗病毒的药物组合物，其包括治疗有效量的药理学上可接受的抗病毒的寡核苷酸和药用载体，所述寡核苷酸至少6个核苷酸长度(或本文列出的其它长度)，其中寡核苷酸的抗病毒活性主要通过非序列互补的作用方式产生。在具体实施方案中，寡核苷酸或寡核苷酸的组合或混合物如上面为各个寡核苷酸或寡核苷酸的组合或混合物所说明的。在具体实施方案中，药物组合物被批准施用给人或非人的动物，例如非人灵长类。
在具体实施方案中，药物组合物是用于治疗、控制或预防病毒病原学疾病；用于治疗、控制或预防朊病毒疾病；是用于通过眼内施用、经口摄入、肠施用、吸入、经皮的、皮下的、肌肉内的、腹膜内的、鞘内的、气管内的或静脉内的注射或局部施用来输送。在具体实施方案中，该组合物包括输送系统，例如靶向特定的细胞或组织；脂质体制剂，另一种抗病毒药物，例如非核苷酸抗病毒的聚合物、反义分子、siRNA或小分子药物。
在具体实施方案中，抗病毒的寡核苷酸、寡核苷酸制品、寡核苷酸制剂、或抗病毒的药物组合物对靶病毒(例如任何具体病毒或如本文所述的病毒组中的病毒)的IC50为0.50、0.20、0.10、0.09.0.08、0.07、0.75、0.06、0.05、0.045、0.04、0.035、0.03、0.025、0.02、0.015或0.01μM或更少。
在制剂、药物组合物和预防或治疗方法的具体实施方案中，该组合物或制剂是用于治疗、控制或预防病毒病原学疾病；用于治疗、控制或预防朊病毒疾病；是用于通过选自下述的方式输送：眼内的、经口的摄入、肠的、吸入或经皮的、皮下的、肌肉内的或静脉内的注射输送；还包括输送系统，其可以包含能增强与特定细胞的亲和力的分子或与其相关；还包含至少一种组合的其它抗病毒药物；和/或还包含组合的抗病毒的聚合物。
如本文关于抗病毒的寡核苷酸和制剂等所使用的，当提及具体病毒或病毒组时，术语“靶向的”是指寡核苷酸被选择以抑制该病毒或病毒组。如关于具体组织或细胞类型所使用的，该术语表示选择的寡核苷酸、制剂或输送系统能使寡核苷酸在具体组织或细胞类型中或周围优选地存在和/或优选地表现出抗病毒作用。
如本文所使用的，术语“输送系统”是指一种或多种组分，当与本文所述的寡核苷酸组合时，与没有该输送系统时的量和/或持续时间相比，其能增加接触到体内目标位置的寡核苷酸的量、和/或延长其在靶位存在时间，例如至少20、50或100％或更多，和/或预防或减少会造成副作用的相互作用。
如本文关于抗病毒剂和其它药物或测试化合物所使用的，术语“小分子”是指该分子的分子量为1500道尔顿或更少。在有些情况下，分子量是1000、800、600、500或400道尔顿或更少。
在另一方面，本发明提供了一种试剂盒，其包含在带标签的包装中的至少一种抗病毒的寡核苷酸或寡核苷酸制剂，其中寡核苷酸的抗病毒活性主要通过非序列互补性的作用方式产生，且包装上的标签说明了抗病毒的寡核苷酸可以用于抵抗至少一种病毒。
在具体实施方案中，试剂盒包含药物组合物，其包含至少一种本文所述的抗病毒的寡核苷酸；该抗病毒的寡核苷酸适合体内地用于动物，和/或标签说明了该寡核苷酸或组合物是可接受的和/或被批准用于动物；动物是哺乳动物，例如人或非人的哺乳动物，例如牛、猪、反刍动物、绵羊或马；动物是非人的动物；试剂盒被管理机构例如美国食品药品管理局或等同机构批准用于动物，例如人。
在另一方面，本发明提供了一种方法，其可以筛选用作抗病毒剂的抗病毒的寡核苷酸，例如非序列互补的抗病毒的寡核苷酸。该方法涉及合成许多不同的随机寡核苷酸，测试寡核苷酸的抑制病毒产生感染性病毒粒子的能力的活性，和选择具有药学上可接受水平的活性的寡核苷酸用作抗病毒剂。
在具体实施方案中，不同的随机寡核苷酸包含不同长度的随机物；随机寡核苷酸可以具有不同的序列或可以具有共同的序列，例如大多数最短寡聚物的序列；和/或不同的随机寡核苷酸包含许多寡核苷酸，其包含至少5个核苷酸长度的随机物片段，或者该不同的随机寡核苷酸包括许多不同长度的随机物。可以在特定系统中测试其它寡核苷酸，例如本文中为抗病毒的寡核苷酸所述的。
在另一方面，本发明提供了一种在受试者中预防或治疗病毒感染的方法，其通过给需要该治疗的受试者施用治疗有效量的至少一种药理学上可接受的如本文所述的寡核苷酸，例如至少6个核苷酸长度的非序列互补性的寡核苷酸，或含有这种寡核苷酸的抗病毒的药物组合物或制剂进行。在具体实施方案中，该病毒可以是本文列出的适用于利用本发明抑制的那些中的任一种；感染与本文所述的与病毒感染有关的疾病或病症有关；受试者是本文所述的受试者类型，例如人、非人的动物、非人的哺乳动物、植物等；治疗是针对病毒病或病毒病原学的疾病，例如本文的背景技术中所述的疾病。
在具体实施方案中，施用了本文所述的抗病毒的寡核苷酸(或寡核苷酸制剂或药物组合物)；施用是本文所述的方法；使用了本文所述的输送系统或方法；病毒感染是DNA病毒或RNA病毒的感染；病毒是细小病毒科、乳头多瘤空泡病毒科、腺病毒科、疱疹病毒科、痘病毒科、嗜肝DNA病毒科或乳头瘤病毒科；病毒是沙粒病毒科、布尼亚病毒科(bunyaviridae)、calciviridae、冠状病毒科、丝状病毒科、黄病毒科(flaviridae)、正粘病毒科、副粘病毒科、微小RNA病毒科、呼肠孤病毒科、弹状病毒科、逆转录病毒科或披膜病毒科；疱疹病毒科病毒是EBV、HSV-1、HSV-2、CMV、VZV、HHV-6、HHV-7或HHV-8；病毒是HIV-1或HIV-2；病毒是RSV；病毒是流感病毒、例如流感A；病毒是HBV；病毒是天花病毒或牛痘病毒；病毒是冠状病毒；病毒是SARS病毒；病毒是西尼罗病毒；病毒是汉坦病毒；病毒是副流感病毒；病毒是柯萨奇病毒；病毒是鼻病毒；病毒是黄热病毒；病毒是登革病毒；病毒是丙型肝炎病毒；病毒是埃博拉病毒；病毒是马尔堡病毒。
类似地，在一个相关方面，本发明提供了一种用于预防性治疗肿瘤病毒造成的人或动物癌症的方法，其通过给需要该治疗的人或动物施用药理学上可接受的、治疗有效量的至少6个核苷酸长度(或本文所述的其它长度)的至少一种随机寡核苷酸或含有这种寡核苷酸的制剂或药物组合物进行。
在具体实施方案中，寡核苷酸是如本文对本发明所述，例如具有本文所述的长度；使用了如本文所述的施用方法；使用了如本文所述的输送系统。
术语“治疗有效量”是指当施用给意欲类型的典型受试者时足以产生治疗上或预防上显著降低感染性病毒颗粒的生成的作用的量。在涉及给受试者施用抗病毒的寡核苷酸的方面，寡核苷酸、制剂或组合物应当典型地以治疗有效量施用。
在另一方面，发现了非序列互补的相互作用会产生有效的抗病毒活性，这提供了一种筛选方法来鉴别能改变寡核苷酸向病毒组分的结合的化合物，所述的病毒组分例如一种或多种病毒蛋白(例如从感染的宿主的病毒培养物提取的或纯化的，或通过重组方法生产的)。例如，该方法可以涉及，检测测试化合物是否能减少寡核苷酸向一种或多种病毒组分的结合。
如本文所使用的，术语“筛选”是指试验多种化合物来确定它们是否具有理想的性质。化合物的数量可以是例如至少10、100、1000、10,000或更多的测试化合物。
在具体实施方案中，多种试验格式和检测方法中的任何一种都可以用来鉴别结合中的这种变化，例如通过在有或没有要筛选的化合物存在的情况下使寡核苷酸与病毒组分接触(例如在分开的反应中)，和确定在有化合物存在的情况与没有该化合物存在的情况相比，寡聚物与病毒组分的结合是否产生差异。这种差异的存在表明，该化合物改变了随机寡核苷酸向病毒组分的结合。或者，可以使用竞争性置换，使寡核苷酸结合到病毒组分上，并检测通过加入测试化合物造成的置换，或者相反地，使测试化合物结合，并检测通过加入寡核苷酸造成的置换。
在具体实施方案中，寡核苷酸是如本文所述的抗病毒的寡核苷酸；寡核苷酸是至少6、8、10、15、20、25、29、30、32、34、36、38、40、46、50、60、70、80、90、100、110或120个核苷酸的长度，或者至少本文为抗病毒的寡核苷酸所述的另一种长度，或者是在通过取任意2个前述值作为范围的包含性端点所定义的范围内；测试化合物是小分子；测试化合物的分子量低于400、500、600、800、1000、1500、2000、2500或3000道尔顿，或在通过取任意2个前述值作为范围的包含性端点所定义的范围内；病毒提取物或组分是来自本文所列的病毒；筛选了至少100、1000、10,000、20,000、50,000或100,000化合物；寡核苷酸的IC50等于或低于0.500、0.200、0.100、0.075、0.05、0.045、0.04、0.035、0.03、0.025、0.02、0.015或0.01μM。
如本文所使用的，术语“病毒组分”是指由病毒编码的产物，或由病毒感染引起的由受感染的宿主细胞生成的产物。这样的组分可以包括蛋白和其它的生物分子。这样的病毒组分可以例如是得自病毒培养物、受感染的宿主生物，例如动物和植物，或可以在重组系统中(原核生物和真核生物)从病毒序列生成，以及具有与病毒编码的蛋白相对应的氨基酸序列的合成蛋白。术语“病毒培养物提取物”是指来自感染了病毒的细胞的提取物，其包括病毒特异性的产物。类似地，“病毒蛋白”是指病毒特异性的蛋白，其通常由病毒编码，但是还可以由至少部分地由病毒感染引起的宿主序列编码。
在一个相关的方面，本发明提供了通过前述方法鉴别出的抗病毒的化合物，例如新的抗病毒的化合物。
在另一方面，本发明提供了一种从寡核苷酸库中纯化出能结合至少一种病毒组分的寡核苷酸的方法，其通过使寡核苷酸库接触至少一种病毒组分(例如结合到固定相介质)、并收集结合到该病毒组分的寡核苷酸进行。通常，收集涉及将寡核苷酸从病毒组分置换出来。该方法还可以涉及对收集的寡核苷酸(即结合到病毒蛋白的寡核苷酸)进行测序和/或测试其抗病毒活性。
在具体实施方案中，通过任意的合适方法将库中结合的寡核苷酸从固定相介质中置换出来，例如使用离子置换，并收集置换出的寡核苷酸。典型地，关于各种置换方法，可以以逐渐严格的方式进行置换(例如使用浓度逐渐升高的置换剂，例如盐的浓度，产生阶跃的或连续的梯度)，从而通常以升高的结合亲和力的次序置换出寡核苷酸。在许多情况下，会进行低严格性的洗涤以除去弱结合的寡核苷酸，并收集含有置换出的、更紧密结合的寡核苷酸的一个或多个级分。在一些情况下，理想的是选择含有结合非常紧密的寡核苷酸(例如从置换条件更严格的置换得到的级分中的寡核苷酸)的级分备用。
类似地，本发明提供了一种从寡核苷酸库中富集结合至少一种病毒组分的寡核苷酸的方法，其通过使寡核苷酸库接触一种或多种病毒蛋白、并扩增结合到该病毒蛋白的寡核苷酸，得到富集的寡核苷酸库。接触和扩增可以进行多个回合，例如至少1、2、3、4、5、10或更多次，使用来自前一回合的富集的寡核苷酸库作为下一回合的寡核苷酸库。该方法还可以包括在一个或多个接触和扩增回合后，对富集的寡核苷酸库中的寡核苷酸进行测序和测试其抗病毒活性。
该方法可以包括以多种技术中的任一种将寡核苷酸从病毒组分(例如结合到固相介质上的病毒蛋白)中置换出来，例如上述的那些，例如使用置换剂。如上所述，可以有利地选择结合紧密的寡核苷酸备用，例如用于进一步的结合和扩增回合。该方法还可以包括选择一种或多种富集的寡核苷酸、例如高亲和力的寡核苷酸备用。在具体实施方案中，该选择可以包括消除具有与特定目标病毒的宿主基因组序列(例如人)互补的序列的寡核苷酸。这样的消除可以包括对比寡核苷酸序列与来自序列数据库中的特定宿主的序列，例如使用序列比对程序(例如BLAST搜索)，和消除那些具有与宿主序列相同的或在一定水平上相同的序列的寡核苷酸。还可以为了本发明的其它方面来消除这样的宿主互补性的序列和/或选择一种或多种不与宿主序列互补的寡核苷酸。
在前述的鉴别、纯化或富集寡核苷酸的方法中，该寡核苷酸可以是本文所述的类型。上述方法可以有利地用于鉴别、纯化或富集高亲和力的寡核苷酸，例如从寡核苷酸随机物制品中。
在一个相关的方面，本发明涉及抗病毒的寡核苷酸制品，其包含使用任一种前述的用于从初始寡核苷酸库中鉴别、获取或纯化出抗病毒的寡核苷酸的方法鉴别出的一种或多种寡核苷酸，其中寡核苷酸制品中的寡核苷酸表现出的与一种或多种病毒蛋白的平均结合亲和力比初始寡核苷酸库中的寡核苷酸的平均结合亲和力更高。
在具体实施方案中，寡核苷酸的平均结合亲和力高于初始寡核苷酸库中的寡核苷酸的平均结合亲和力的至少2倍、3倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍或更高；该结合亲和力的中间值高于初始寡聚物库的结合亲和力的中间值的至少2倍、3倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍，其中该中间值是指中间的数值。
在另一方面，本发明提供了抗病毒的聚合物的混合物，其包含至少一种抗病毒的寡核苷酸和至少一种非核苷酸的抗病毒的聚合物。在具体实施方案中，该寡核苷酸是本文所述的抗病毒的寡核苷酸，和/或该抗病毒的聚合物如本文所述或是本领域已知的或随后鉴别出的。
在另一方面，本发明提供了寡核苷酸随机物，其中该随机物是至少6个核苷酸的长度。在具体实施方案中，该随机物具有上述的关于抗病毒的寡核苷酸的长度；该随机物包含至少一种硫代磷酸酯键，该随机物包含至少一种二硫代磷酸酯键或如本文列出的其它修饰；该随机物寡核苷酸包括至少一种非随机物的片段(例如与选择的病毒核酸序列互补的片段)，其可以具有上述的关于寡核苷酸的长度；该随机物是在制品或制品库中，其含有至少5、10、15、20、50、100、200、500或700μmol、1、5、7、10、20、50、100、200、500或700mmol或1mol随机物，或在通过取任意2个不同的前述值作为包含性端点所定义的范围内，或以一种上述的数值或数值范围合成。
同样地，本发明提供了一种制备抗病毒的随机物的方法，其通过合成至少一种随机物，例如如上所述的随机物进行。
如上所述，关于涉及病毒感染或病毒感染的风险或靶向特定病毒的任何方面，在具体实施方案中，该病毒如上所述。
表述“人和动物病毒”通常意在包括但不限于DNA和RNA病毒。DNA病毒包括例如细小病毒科、乳头多瘤空泡病毒科、腺病毒科、疱疹病毒科、痘病毒科、嗜肝DNA病毒科和乳头状瘤病毒科。RNA病毒包括例如沙粒病毒科、布尼亚病毒科、calciviridae、冠状病毒科、丝状病毒科、黄病毒科、正粘病毒科、副粘病毒科、微小RNA病毒科、呼肠孤病毒科、弹状病毒科、逆转录病毒科或披膜病毒科。
关于通过连接或结合其它分子或部分修饰寡核苷酸的特征，特征中的修饰是相对于不含有连接或结合的分子或部分的相同寡核苷酸来评价的。
从下面的详细说明和权利要求书，其它实施方案将是明显的。
附图说明
图1.使用HSV-1(毒株KOS)在VERO细胞中进行的噬斑减少试验。用升高浓度的REP1001(a)、REP2001(b)或REP3007(c)处理受感染的细胞。从线性回归计算出的IC50值记载在每幅图中。
图2.PS-ODN大小和抗HSV-1的IC50之间的关系。将从图1得到的IC50值相对于图1中测试的每种PS-ODN的具体大小作图。
图3.使用HSV-1(毒株KOS)在VERO细胞中进行的噬斑减少试验。用升高浓度的REP2001(a)、REP2002(b)或REP3003(c)、REP2004(d)、REP2005(e)、REP2006(f)和无环鸟苷(g)处理受感染的细胞。从线性回归计算出的IC50值记载在每幅图中。
图4.PS-ODN大小和抗HSV-1的IC50之间的关系。将从图3得到的IC50值相对于图3中测试的每种表现出抗-HSV-1活性的PS-ODN的具体大小作图。表示的无环鸟苷的IC50用于临床关联参考。
图5.使用HSV-1(毒株KOS)在VERO细胞中进行的噬斑减少试验。用升高浓度的REP2003(a)、REP2009(b)、REP2010(c)、REP2011(d)、REP2012(e)、REP2004(f)、REP2006(g)、REP2007(h)和REP2008(i)测试了广范围的PS-ODN随机物大小。从线性回归计算出的IC50值记载在每幅图中。
图6.通过丙烯酰胺凝胶电泳分离的在图5中测试的PS-ODN随机物的UV显影。
图7.PS-ODN随机物大小和抗HSV-1的IC50之间的关系。将从图5得到的IC50值相对于图5中测试的每种表现出抗-HSV-1活性的PS-ODN的具体大小作图。
图8.使用HSV-1(毒株KOS)在VERO细胞中进行的噬斑减少试验。用升高浓度的REP2013(a)、REP2014(b)、REP2015(c)、REP2016(d)、REP2017(e)、REP2018(f)、REP2019(g)、REP2020(h)和REP2021(i)测试了未修饰的ODN、具有随机序列的PS-ODN和指向HSV-1 IE110的起始密码子的PS-ODN。从线性回归计算出的IC50值记载在每幅图中。
图9.通过丙烯酰胺凝胶电泳分离的在图8中测试的PS-ODN随机物的UV显影。
图10.PS-ODN随机物、PS-ODN随机序列、PS-ODN HSV-1 IE110序列和抗HSV-1的IC50之间的关系。将从图8得到的IC50值相对于图8中测试的每种表现出抗-HSV-1活性的PS-ODN的具体大小作图。包括了来自图5的其它IC50值，以进行PS-ODN随机物的对比。
图11.使用HSV-1(毒株KOS)在VERO细胞中进行的噬斑减少试验。用升高浓度测试了：在寡聚物的每一端的4个核糖上有2-O甲基修饰的PS-ODN(REP2024，[a])；在寡聚物的每一端的4个酯键上有甲基膦酸酯修饰的ODN(REP2026[b])；和长度为20个碱基(REP2059[C])和30个碱基(REP2060[d])的RNA PS-ODN。从线性回归计算出的IC50值记载在每幅图中。
图12.使用HSV-2(毒株MS2)在人成纤维细胞中进行的噬斑减少试验。用升高浓度的REP1001(a)、REP2001(b)或REP3007(c)处理了受感染的细胞。从线性回归计算出的IC50值记载在每幅图中。
图13.PS-ODN大小和抗HSV-2的IC50之间的关系。将从图12得到的IC50值相对于图12中测试的每种PS-ODN的具体大小作图。
图14.使用HSV-2(毒株MS2)在VERO细胞中进行的噬斑减少试验。用升高浓度的REP2001(a)、REP2002(b)或REP2003(c)、REP2004(d)、REP2005(e)、REP2006(f)和无环鸟苷(g)处理了受感染的细胞。从线性回归计算出的IC50值记载在每幅图中。
图15.PS-ODN大小和抗HSV-2的IC50之间的关系。将从图14得到的IC50值相对于图14中测试的每种表现出抗-HSV-2活性的PS-ODN的具体大小作图。无环鸟苷的IC50用于临床关联参考。
图16.使用CMV(毒株AD169)在VERO细胞中进行的噬斑减少试验。用升高浓度的REP2004(a)或REP2006(b)处理了受感染的细胞。从线性回归计算出的IC50值记载在每幅图中。PS-ODN大小和抗CMV的IC50之间的关系作图如(c)所示。将来自图(a)和(b)的IC50值相对于测试的每种PS-ODN的具体大小作图。
图17.使用CMV(毒株AD169)在VERO细胞中进行的噬斑减少试验。测试了3种临床CMV治疗：丙氧鸟苷(Gancyclovir)(a)、膦甲酸(b)和西多福韦(c)。还用升高浓度的REP2003(d)、REP2004(e)、REP2006(f)和REP2007(g)测试了广范围的PS-ODN随机物大小。最后，测试了自己合成的(h)和商业购买的(i)的REP2036(福米韦生)。从线性回归计算出的IC50值记载在每幅图中。
图18.PS-ODN大小和抗CMV的IC50之间的关系。将从图17得到的IC50值相对于图17中测试的每种表现出抗-CMV活性的PS-ODN的具体大小作图。
图19.使用HIV-1(毒株NL4-3)在MT4细胞中进行了CPE试验。用升高浓度的REP2004(a)或REP2006(b)处理了受感染的细胞。从线性回归计算出的IC50值记载在每幅图中。未受感染的MT4细胞的细胞毒性轮廓表示为REP2004(c)和REP2006(d)。
图20.PS-ODN大小和抗HIV-1的IC50之间的关系。将从图1得到的IC50值相对于图1中测试的每种PS-ODN的具体大小作图。
图21.使用HIV-1(毒株NL4-3)在MT4细胞中进行了CPE试验。用升高浓度的REP2004(a)或REP2006(b)处理了受感染的细胞。从线性回归计算出的IC50值记载在每幅图中。表示了REP2004(c)和REP2006(d)对未受感染的MT4细胞的细胞毒性图谱。
图21.使用重组野生型HIV-1NL4-3(毒株CNDO)在293A细胞中进行了复制试验。用升高浓度的氨普奈韦(a)、茚地那韦(b)、洛匹那韦(c)、沙奎那韦(d)、REP2003(e)、REP2004(f)、REP2006(g)和REP2007(h)处理了受感染的细胞。两条曲线(黑线和虚线)代表了菌株CNDO的剂量反应曲线。
图22.(a)来自图21的IC50值，和(b)PS-ODN大小和抗重组HIV-1的IC50之间的关系。将(a)的IC50值相对于图21中测试的每种PS-ODN的具体大小作图。
图23.使用重组多药抗性的HIV-1(毒株MDRC4)在293A细胞中进行了复制试验。用升高浓度的氨普奈韦(a)、茚地那韦(b)、洛匹那韦(c)、沙奎那韦(d)、REP2003(e)、REP2004(f)、REP2006(g)和REP2007(h)处理了受感染的细胞。CNDO(野生型)的剂量反应曲线表示为虚线，MDRC4(药物抗性)的剂量反应曲线表示为实线。
图24.(a)来自图21和23的IC50值，显示了野生型(CNDO)和重组HIV-1菌株的药物抗性(MDRC4)之间的IC50值倍数增加，和(b)在(a)中计算出的倍数增加图。
图25.使用RSV(毒株A2)在Hep2细胞中进行了CPE试验。用升高浓度的REP2004(a)、REP2006(b)、REP2007(c)或利巴韦林(d)处理了受感染的细胞。从线性回归计算出的IC50值记载在每幅图中。表示了REP2004(e)、REP2006(f)、REP2007(g)或利巴韦林(h)对未受感染的Hep2细胞的细胞毒性图谱。
图26.PS-ODN大小和抗RSV的IC50之间的关系。将从图25得到的IC50值相对于图25中测试的每种表现出抗-RSV活性的PS-ODN的具体大小作图。
图27.使用柯萨奇病毒B2(毒株Ohio-1)在LLC-MK2细胞中进行了CPE试验。用升高浓度的REP2006(a)处理了受感染的细胞。REP2006的细胞毒性图谱如(b)所示。
图28.A)FP相互作用试验，显示了PS-ODN随机物(REP2003、2004、2006和2007)从FBS竞争20个碱基的PS-ODN随机物饵物的相互作用的能力。更大的随机物能更有效地竞争。B)和C)DOTAP和细胞转染剂对293A细胞中的REP2006的血清保护和改善的输送。D)和E)通过FP.检测的DOTAP或细胞转染剂包封的REP2006的血清保护。
图29.通过荧光偏振检测了结合到不同大小的饵物上的病毒裂解物。测试了REP2032-FL、REP2003-FL和REP2004FL在来自HSV-1(a)、HIV-1(b)或RSV(c)的裂解物中的裂解物结合。
图30.通过荧光偏振检测了PS-ODN随机物对病毒裂解物的亲和力。使用REP2004-FL作为饵物，用升高浓度的REP2003、REP2004、REP2006或REP2007挑战了与HSV-1裂解物(a)、HIV-1裂解物(b)或RSV裂解物(c)的复合物形成。
图31.REP2004-FL可以结合到HIV-1p24gag和HIV-1gp41。通过荧光偏振测试了REP2004-FL与升高量的这两种纯蛋白相互作用的能力。
图32.饵物大小对p24和gp41结合的影响。通过荧光偏振测试了增加大小的饵物结合p24gag和gp41的能力。
图33.通过荧光偏振测试了双链PS-ODN结合病毒裂解物的能力。还制备了单链的(ss)或双链(ds)的硫代磷酸酯REP2017(荧光标记的)及其非硫代化的类似物(2017U)。测试了这些饵物与HSV-1和HIV-1病毒裂解物的结合。
图34.通过在存在250nM REP2004-FL的情况下培养293A细胞4小时，检测了荧光标记的PS-ODN向细胞中的输送。培养后，裂解细胞，通过荧光测定法检测了裂解后从细胞中释放出的相对的荧光。
图35.通过荧光偏振检测了不同序列组成的20-mer PS-ODN结合病毒裂解物的能力。在存在1ug HSV-1(a)、HIV-1(b)或RSV(c)裂解物的情况下，孵育3′带有FITC标记的PS-ODN。这些PS-ODN的结合图谱在所有3种病毒裂解物中相似(见图35)。
图36.通过检测这些上清液在原初细胞中诱导的CPE，间接检测了来自牛痘感染的VERO细胞的感染上清液中的病毒负载。在10uM测试了REP2004、2006和2007，在50uM测试了西多福韦。
图37.(A)使用HSV-1(菌株KOS)在VERO细胞中进行噬斑减少试验产生的IC50值。用升高浓度的REP2006(N40)、REP2028(G40)、REP2029(A40)、REP2030(T40)和REP2031(C40)处理了受感染的细胞，以产生IC50值。(B)HSV-1PRA产生了如下的IC50值：N40(REP2006)、AC20(REP2055)、TC20(REP2056)或AG20(REP2057)。
选择的缩写
ON：寡核苷酸
ODN：寡脱氧核苷酸
PS：硫代磷酸酯
PRA：噬斑减少试验
PFU：噬斑形成单位
INF A：流感A病毒
HIV：人免疫缺陷病毒(如果没有说明，包括HIV-1和HIV2)
HSV：单纯疱疹病毒(如果没有说明，包括HSV-2和HSV-3)
RSV：呼吸道合胞病毒
COX：柯萨奇病毒
DHBV：鸭乙型肝炎病毒
优选实施方案的详述
本发明涉及通过非序列互补的机理发挥作用的抗病毒的寡核苷酸的鉴别和应用，还包括下述发现，对于许多病毒而言，越大的寡核苷酸的抗病毒活性越强，长度为40或更多个核苷酸的寡核苷酸典型地是最佳的。
如在背景技术中所述，已经测试了许多反义寡核苷酸(ON)的抗病毒活性。但是，这样的反义ON是序列特异性的，典型地是约16-20个核苷酸的长度。
如通过实施例1和2的结果所证实的，随机PS-ODN的抗病毒作用不是序列特异性的。考虑到在那些试验中使用的PS-ODN的体积和浓度，理论上几乎不可能的是，在混合物中有超过1拷贝的特定随机序列。这意味着，这些PS-ODN随机物没有反义作用。在后一个实施例中，如果抗病毒作用是由PS-ODN的序列特异性造成的，那么这样的作用因而只能是由一个分子造成的，该结果似乎是不可能的。例如，对于40个碱基长度的ON随机物，该群体中的任何特定序列在理论上仅能代表1/440或8.27×10-25的总级分。已知1mol＝6.022×1023个分子，并且事实上我们的最大合成目前是在15μmol的规模完成的，不会存在全部可能的序列，另外，每个序列最可能是仅仅作为一个拷贝存在。当然，本领域的技术人员根据本发明的教导还可以使用序列特异性的ON，但是利用本发明发现的非序列互补的活性。因此，本发明不限于非序列互补的ON，但是放弃在现有技术中已经公开的关于序列特异性的反义ON用于治疗病毒感染的内容。
关于可应用的病毒(包括，例如，本文已经公开了其数据的那些)，随着随机物大小的增加，其抗病毒效力也增加。应当指出，由于目前基于亚磷酰胺的DNA合成的限制，更大的PS-ODN(例如80-和120-mer)具有显著的比需要的尺寸更小的片段的污染。在更大的寡聚物(80和120个碱基对)上观察到更弱的作用(以每个碱基为基础)，这反映了全长随机物在这些群体中的更低浓度，还反映了向细胞中降低的摄入。如果合成或纯化了合理纯度(75％全长)的更大随机物(＞40个碱基)、和/或如果通过输送系统促进了这些ODN中的任一种的细胞摄入，可以实现抗病毒活性的大的多的提高。
在本发明中，随机物(或其它寡核苷酸)可以通过几种机制阻断病毒的复制，包括但不限于下列：1.阻止病毒粒子的吸附或受体相互作用，从而阻止感染；2.参与病毒装配或病毒基因组向衣壳中的包装(与病毒DNA或RNA的包装相竞争)，产生缺陷型病毒粒子；3.中断和/或阻止包装过程中的衣壳形成、或衣壳蛋白与其它结构蛋白的相互作用，导致抑制病毒的释放或释放出缺陷型病毒粒子；4.结合到关键病毒组分，并阻止或降低它们的活性；5.结合到病毒增殖所需要的关键宿主组分。
不限于能实现本发明的病毒抑制的机制，如上所述，有几种可能的机制可以解释和/或预测ON对病毒复制的抑制性质。其中的第一种是，ON的总体相似的(aptameric)作用使得它们结合到细胞表面蛋白或病毒蛋白上，阻止病毒的吸附和融合。发生作用的大小阈值可以由相互作用所需要的某些累积电荷的结果。
第二种可能的机制是，ON可以通过阻止病毒的包装和/或装配在细胞中起作用。超过一定大小阈值的ON会竞争或干扰正常的衣壳/核酸相互作用，阻止新病毒内的功能性病毒基因组的包装。或者，ON可以阻止正常衣壳的形成，这会阻止正常的病毒的芽殖、改变病毒的稳定性或阻止依赖于内在化的合适的病毒粒子分解。
尽管作用机制还不完全清楚，试验结果证实，与临床相关的无环鸟苷、丙氧鸟苷、利巴韦林和蛋白酶抑制剂相比，本发明的ON表现出了更强的病毒抑制功效。根据本发明的ON因此可以用于治疗或预防病毒感染。治疗的病毒感染可以是由人、动物和植物病毒造成的那些。
广谱抗病毒活性
根据上面讨论的结论和本文所述的数据，随机ON和ON随机物似乎可以对病毒具有广谱抗病毒活性，其中病毒基因组的装配和/或包装和/或包壳是复制所需要的步骤。因此，为了检验该假设，选择了几种不同大小的PS-ODN随机物，以测试各种病毒感染的细胞模式。在本文的实施例中描述了许多这样的试验，包括用CMV、HIV-1、RSV、柯萨奇病毒B2、DHBV、汉坦病毒、副流感病毒和牛痘病毒进行的试验，以及在实施例1和2中所述的HSV-1和HSV-2试验。尽管有些测试的寡核苷酸表现出了高活性水平，寡聚物输送系统(例如DOTAP、脂转染胺(lipofectamine)或寡转染胺(oligofectamine))会产生更强的功效，特别是用较大的(≥40个碱基)随机物。
广谱抗病毒活性的结论
不同病毒的功效研究表明，随机ON和随机物对多种不同病毒表现出了抑制性质。而且，这些研究支持了下述结论：更大随机物比更小的随机物表现出更强的病毒抑制功效。这证实了随机ON或ON随机物活性在所有包壳病毒中的依赖于共同大小和/或电荷的机制。
HSV和CMV都是疱疹病毒科家族的双链DNA病毒，HIV是逆转录病毒科的RNA病毒，RSV是副粘病毒科的RNA病毒。基于ON随机物可以不限于上述的列出的机制、在多种不同病毒中产生抑制病毒的功能的事实，下述的机制是合理的：A)ON/ON随机物通过相似的作用抑制病毒感染，防止病毒与质膜融合；和/或B)ON/ON随机物阻止或参与病毒粒子的装配或衣壳中的病毒DNA的包装，产生缺陷型病毒粒子；和/或C)ON/ON随机物干扰病毒的装配和/或包装和/或基因表达所需的宿主蛋白或组分。
抗病毒活性的要求
由于随机化的DNA序列似乎足以抑制病毒，令人感兴趣的是要研究：在没有硫代磷酸酯修饰的情况下是否能维持抗病毒活性、和是否能通过选择在病毒基因组中发现的随机序列或特定序列来提高功效。
因此，研究了DNA和RNA修饰对随机物的抗病毒功效的作用。由于随机物通过非序列互补的机制发挥作用，这些实验用于测试核酸构象和电荷分布的轻微变化对抗病毒功效的影响。
为了测试具有不同核苷酸/核苷修饰的ODN是否能抑制HSV-1，在HSV-1PRA中测试了REP2024、2026、2059和2060，如实施例所述。REP2024(该PS-ODN在ODN两端的4个碱基上的核糖上有2-O-甲基修饰)、REP2026(该PO-ODN在ODN两端的4个碱基之间的键上有甲基膦酸酯修饰)、REP2059(长为20个碱基的RNA PS-ODN随机物)和REP2060(长为30个碱基的RNA PS-ODN随机物)表现出了抗-HSV-1活性(见图11)。
在后一实施例中，如果抗病毒作用仅仅是由DNA硫代磷酸酯主链组成的ON造成的，那么这样的作用只能是由一个分子造成的。但是其它的主链和修饰产生了阳性的抗病毒活性。当然，本领域的技术人员根据本发明的教导还可以使用不同的化学ON。ON的修饰(例如但不限于硫代磷酸酯修饰)似乎有利于抗病毒活性。这很可能是由于需要的ON电荷和/或DNA在介质和细胞内的稳定的需要，它还可能是由于PS-ODN的手性。
化合物REP2026表现出抗病毒活性，尽管其中心部分包含未修饰的PO-核苷酸和4个在两端的甲基膦酸酯键以防止降解。这表明，PO-ODN可以用作不会被降解的抗病毒药。该保护可以通过修饰末端的核苷酸和/或通过使用下述的合适输送系统来实现。
通常，使用的DNA的序列组成对总体功效具有较小的作用，无论是随机物、随机序列还是特异性的HSV-1序列。但是，在中间长度，HSV-1序列的有效性几乎是随机序列的3倍(见图10)。该数据表明，尽管特异性的HSV序列存在特异性的反义功能性，这里所述的非反义机制(非序列互补的机制)可以代表该活性的主要部分。实际上，当ON增长至40个碱基时，基本上所有的抗病毒活性都是由于非反义作用。
随机物的更低毒性
使用ON随机物的一个目的是降低毒性。已知不同的序列会在动物中引起不同的反应，例如总体毒性、与血清蛋白的相互作用和与免疫系统的相互作用(Monteith等(1998)Toxicol Sci 46：365-375)。ON的混合物因而可以降低毒性作用，因为任何特定序列的水平都会非常低，所以没有显著的相互作用，由于序列或核苷酸组成是可能的。
药物组合物
本发明的ON可以是用于治疗(或预防)病毒病的治疗性组合物或制剂的形式，其可以被管理机构批准用于人或非人的动物，和/或针对特定的病毒或病毒组。当与生理学上和/或药学上可接受的载体结合时，这些ON可以用作药物组合物的一部分。载体的特征可以取决于给药途径。本发明的药物组合物还可以含有其它的活性因子和/或能增强活性的试剂。
在药物组合物或制剂中使用的本发明的ON的施用、或治疗动物的方法的实施可以通过多种常规途径实现，例如眼内的、经口的摄入、肠内的、吸入、或经皮的、皮下的、肌肉内的、腹膜内的、鞘内的、气管内的或静脉内的注射。
本发明的药物组合物或寡核苷酸制剂还可以含有用于治疗病毒病的其它的化疗药物，例如但不限于：利福平、利巴韦林、普来可那立(Pleconary)、西多福韦、无环鸟苷、喷昔洛韦(pencyclovir)、丙氧鸟苷、伐西洛韦(Valacyclovir)、泛昔洛韦、膦甲酸、阿糖腺苷、金刚烷胺、扎那米韦、奥塞米韦、Resquimod、抗蛋白酶、HIV融合抑制剂、核苷酸HIVRT抑制剂(例如AZT、拉米夫定、阿巴卡韦)、非核苷酸HIV RT抑制剂、Doconosol、干扰素、丁基化的羟基甲苯(BHT)和金丝桃素。这样的其它因子和/或试剂可以包括在药物组合物中，例如与本发明的ON产生协同作用。
本发明的药物组合物或寡核苷酸制剂还可以含有聚合物，例如但不限于聚阴离子试剂、硫酸化多糖、肝素、葡聚糖硫酸酯、多硫酸酯戊聚糖、聚乙烯醇硫酸酯、乙酰化甘露聚糖(acemannan)、多羟基羧酸酯、硫酸纤维素、含有磺化苯或萘环的聚合物和萘磺酸酯聚合物(naphthalenesulfonate polymer)、乙酰基邻苯二甲酰纤维素、聚-L-赖氨酸、癸酸钠、阳离子两亲物、胆酸。已知聚合物会影响病毒粒子进入细胞，在有些情况下是通过结合或吸附到病毒粒子本身。抗病毒聚合物的该特征可以用于与ON竞争向病毒粒子的结合或吸附，结果与其胞外活性相比提高了ON的胞内活性。
示例性的输送系统
我们通过将培养的细胞暴露于荧光标记的随机物，检测了PS-ODN随机物的摄入，然后在洗涤2次后测定了裂解的细胞中的荧光强度。在没有输送且包封在一种下述的基于脂质的输送系统后：脂转染胺TM(Invitrogen)、polyfectTM(Qiagen)和寡转染胺TM(Invitrogen)，检测了暴露于250nM REP2004-FL的细胞的细胞摄入。4小时后，用PBS洗涤细胞2次，并用MPER裂解试剂(PROMEGA)裂解。图34显示了从等量的有和没有输送的暴露细胞得到的相对荧光产量。我们发现，在存在所有3种测试的输送试剂的情况下，胞内PS-ODN的浓度比没有输送时有显著增加。
于该试验结果相一致，输送系统的应用可以显著地增加ON随机物的抗病毒效力。另外，它们可以用于保护这些化合物不受血清相互作用、减少副作用并使组织和细胞分布最大化。
虽然PS-ODN对内源核酸酶的抗性比天然磷酸二酯更大，但是它们不是完全稳定的，在血液和组织中会被缓慢地降解。PS寡核苷酸药物在临床应用中的一个限制是，它们在静脉内施用后倾向于激活补体。通常，脂质体和其它输送系统能通过降低药物毒性、增加在血浆中的停留时间和向疾病组织输送(通过透过超渗透的脉管系统的载体外渗)更多的活性药物来增强药物(包括ON)的治疗指数。而且，在PS-ODN的情况下，脂质包封预防在循环时与潜在的蛋白结合位点的相互作用(KLIMUK等(2000)J Pharmacol Exp Ther 292：480-488)。
根据我们的本文所述的结果，一种方法是使用能输送本文所述的ON的输送系统，例如但不限于亲脂性的分子、极性脂质、脂质体、单分子层、双分子层、泡囊、可设计的融合泡囊(fusogenic vesicles)、胶束、环糊精、PEG、离子电渗、粉末注射和纳米微粒(例如PIBCA、PIHCA、PHCA、明胶、PEG-PLA)。使用这样的输送系统的目的是(除了其它的以外)降低活性化合物在动物和人中的毒性、增强细胞输送、降低IC50、从药物输送的立场增加作用时间和防止寡核苷酸非特异性的结合到血清蛋白。
我们已经证实，PS-ODN随机物的抗病毒活性随着大小的增加而增加。而且，该活性与病毒蛋白(在病毒裂解物中)的升高的亲和力相关。由于本领域熟知，硫代磷酸酯修饰增强蛋白-DNA相互作用的亲和力，我们使用用于检测与病毒裂解物的相互作用的相同的基于FP的试验，测试了增加的更大PS-ODN随机物结合胎牛血清(FBS)的能力(图28a)。在该试验中，在能饱和地结合(mP值)的条件下，将250ug非加热失活的FBS与荧光标记的20个碱基PS-ODN随机物相络合。增加大小的未标记的PS-ODN随机物(REP2003、REP2004、REP2006和REP2007)用于竞争FBS与标记的饵物的相互作用。该试验的结果清楚地表明，随着PS-ODN随机物的大小的增加，其对FBS的亲和力也增加。该结果表明，抗病毒活性最高的PS-ODN与蛋白的亲和力也是最高的。
本领域已知，硫代磷酸酯反义寡核苷酸的一个主要治疗问题是它们的副作用，这主要是由于其与蛋白(具体地与血清蛋白)增加的相互作用，如由Kandimalla和同事(Kandimalla等(1998)Bioorg.Med Chem.Lett.8：2103-2108)所述的。我们的数据表明了实质的益处，通过合适的输送系统将抗病毒的ON输入细胞，同时防止它们与血清蛋白的相互作用。
为了证实输送系统的益处，我们试验了2种不同的输送技术，它们是基于脂质体的细胞转染剂和DOTAP。通过荧光测定法检测标记的REP2006的胞内浓度，我们检测了在有高浓度血清(50％)存在的情况下PS-ODN随机物REP2006(用细胞转染剂或DOTAP包封的)向293A细胞中的输送(图28b、c)。这些结果表明，输送增加REP2006的胞内浓度，还表明在DOTAP的情况下，在24小时后胞内REP2006的水平有显著增加。最后，通过在基于FP的体外相互作用试验中的DOTAP(28d)和细胞转染剂(28e)，我们检测了对REP2006与血清蛋白相互作用的保护。未包封的REP2006能够从血清竞争结合荧光寡聚物，但是当用DOTAP或细胞转染剂包封REP2006时，其不再能竞争血清结合。这些数据表明，包封会阻止寡聚物的血清相互作用，并会造成更有效的治疗作用和更少的副作用。
使用输送系统的另一潜在益处是防止ON与感染性的病毒粒子发生相互作用(例如吸附)，以通过不同的机制防止病毒感染的扩大，例如增强病毒粒子的细胞穿入。
另一个方法是通过将输送系统与能提高与特定细胞的亲和力的分子相关联完成细胞特异性的输送，这样的分子包括但不限于抗体、受体配体、维生素、激素和肽。
下面提供了输送系统的其它选择。
连接的ODN
在某些实施方案中，以许多方式修饰了本发明的ON，但不损害它们抑制病毒复制的能力。例如，ON是在它们的一个或多个核苷酸残基处连接或结合到另一个部分。因此，本发明的寡核苷酸的修饰可以包括将一个或多个部分或结合物化学地连接到核苷酸，它们能增强活性、细胞分布或细胞摄入、增强特异性的或非特异性的细胞膜传递，或者防止降解或分泌，或者提供其它的有益特征。这样的有益特征可以(例如)包括更低的血清相互作用、更高的病毒-蛋白相互作用、被配制适于输送的能力、可检测的信号、改善的药物代谢动力学性质和更低的毒性。这样的结合物基团可以共价地结合到功能性基团，例如第一或第二羟基。例如，结合物部分可以包括类固醇分子、非芳族的亲脂分子、肽、胆固醇、双胆固醇、抗体、PEG、蛋白、水溶性的维生素、脂溶性的维生素、另一种ON或改善ON的活性和/或生物利用度的任何其它分子。
更具体地，本发明的示例性的结合物基团可以包括嵌入剂、报道分子、多胺、聚酰胺、聚乙二醇、聚醚、SATE、叔-丁基-SATE、增强寡聚物的药效学性质的基团和增强寡聚物的药物代谢动力学性质的基团。典型的结合物基团包括胆固醇、脂质、磷脂、生物素、吩嗪、叶酸(folate)、菲啶、蒽醌、吖啶、荧光素、罗丹明、香豆素、荧光核酸碱基和染料。
在本发明的上下文中，增强药效学性质的基团包括改善寡聚物的细胞摄入和/或增强寡聚物的抗降解性和/或防止血清相互作用的基团。在本发明的上下文中，能增强药物代谢动力学性质的基团包括能改善寡聚物的摄入、分布、代谢或分泌的基团。示例性的结合物基团记载在1992年10月23日提交的国际专利申请PCT/US92/09196中，其全部内容结合于此作为参考。
结合物部分可以包括但不限于脂质部分，例如胆固醇部分(Letsinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1989，86，6553-6556)，胆酸(Manoharan等，Bioorg.Med Chem.Let.，1994，4，1053-1060)，硫醚，例如己基-S-三苯甲基硫醇(Manoharan等，Ann.N.Y.Acad.Sci.，1992，660，306-309；Manoharan等，Bioorg.Med Chem.Let.，1993，3，2765-2770)，硫代胆固醇(Oberhauser等，Nucl.Acids Res.，1992，20，533-538)，脂族链，例如十二烷二醇或十一烷基残基(Saison-Behmoaras等，EMBO J.，1991，10，1111-1118；Kabanov等，FEBS Lett.，1990,259，327-330；Svinarchuk等，Biochimie，1993，75，49-54)，磷脂，例如二-十六烷基-rac-甘油或三乙基-铵1，2-二-O-十六烷基-rac-丙三基-3-H-膦酸酯(Manoharan等，Tetrahedron Lett.，1995，36，3651-3654；Shea等，Nucl.Acids Res.，1990，18，3777-3783)，多胺或聚乙二醇链(Manoharan等，Nucleosides&Nucleotides，1995，14，969-973)或金刚烷醋酸(Manoharan等，Tetrahedron Lett.，1995，36，3651-3654)，棕榈基部分(Mishra等，Biochim.Biophys.Acta，1995，1264，229-237)或十八胺或己基氨羰基-氧胆固醇部分(Crooke等，J.Pharmacol Exp.Ther.，1996,277，923-937。
本发明的寡核苷酸还可以结合到活性药物，例如但不限于阿司匹林、华法林、保泰松、布洛芬、舒洛芬、芬布芬、酮洛芬、(S)-(+)-普拉洛芬、卡洛芬、丹酰肌氨酸、2，3，5-三碘苯甲酸、氟芬那酸、亚叶酸、苯并噻二叠氮化物(benzothiadiazide)、氯噻嗪、diazepine、indomethicin、巴比妥酸盐(酯)、头孢菌素类、磺胺药、抗糖尿病药、抗细菌药或抗生素。
描述了示例性的寡核苷酸结合物的制备的示例性的美国专利包括，例如美国专利号4,828,979；4,948,882；5,218,105；5,525,465；5,541,313；5,545,730；5,552,538；5,578,717,5,580,731；5,580,731；5,591,584；5,109,124；5,118,802；5,138,045；5,414,077；5,486,603；5,512,439；5,578,718；5,608,046；4,587,044；4,605,735；4,667,025；4,762,779；4,789,737；4,824,941；4,835,263；4,876,335；4,904,582；4,958,013；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,245,022；5,254,469；5,258,506；5,262,536；5,272,250；5,292,873；5,317,098；5,371,241,5,391,723；5,416,203,5,451,463；5,510,475；5,512,667；5,514,785；5,565,552；5,567,810；5,574,142；5,585,481；5,587,371；5,595,726；5,597,696；5,599,923；5,599,928和5,688,941，其中的每一篇全文结合于此作为参考。
另一种方法是，通过用酶促的可切割的电荷中和加合物(例如s-乙酰基硫代-乙基或s-pivasloyl硫代-乙基)修饰，制备作为亲脂性的前寡核苷酸的抗病毒的ON(Vives等，1999，Nucl Acids Res 27：4071-4076)。已经证实了这样的修饰会增加ON向细胞中的摄入。
非特异性的ON的设计
在另一个方案中，设计的抗病毒的ON表现出与人(或其它受试者生物体)的基因组较低的、优选最低可能的同源性。目的是得到由于与人或动物的基因组序列和mRNA的相互作用将会表现出最低毒性的ON。第一步是生产理想长度序列的ON，例如手工地或更通常是使用计算机程序通过以随机方式配对核苷酸A、C、G、T。第二步是将ON序列与人序列库(例如GenBank和/或全体人基因组数据库)比对。如果需要，可以重复进行序列生产和比对，以鉴别具有与受试者基因组理想的低同源性水平的一个或多个序列。理想地，ON序列与全部基因组具有最低可能的同源性，同时还优选地最小化自身相互作用。
具有反义活性的非特异性的ON
在另一个方案中，将抗病毒的非特异性的序列部分偶联反义序列部分，以提高最终ON的活性。本发明描述了ON的非特异性部分。反义部分与病毒mRNA互补。
具有G-丰富的基序活性的非特异性的ON
在另一个方案中，将抗病毒的非特异性的序列部分偶联基序部分，以提高最终ON的活性。本发明描述了ON的非特异性部分。作为非限制实例，基序部分可以包括CpG、G四合体和/或CG，它们在文献中记载为免疫系统的刺激物。Agrawal等(2001)Curr.Cancer Drug Targets 3：197-209。
非沃森-克里克ON
另一个方案是使用由一类或几类非沃森-克里克核苷酸/核苷组成的ON。这样的ON可以模仿PS-ODN，其下述特征类似于PS-ODN：a)总电荷；b)单元之间的距离；c)链长度；d)纯偶极子，在一侧有负电荷积累；e)结合蛋白的能力；f)结合病毒蛋白的能力；g)穿透细胞的能力；h)可接受的治疗指数；i)抗病毒活性。该ON具有优选的硫代磷酸酯主链，但是不限于它。非沃森-克里克核苷酸/核苷的实例记载在KOOL，2002，Acc.Chem.Res.35：936-943；和Takeshita等，(1987)J.Biol.Chem.262：10171-10179中，其中描述了含有合成的无碱基位点的ODN。
抗病毒的聚合物
另一个方案是使用模仿硫代磷酸酯ODN的活性的聚合物。如文献中记载，证实了几种阴离子聚合物具有抗病毒的抑制剂活性。这些聚合物属于几种类型：(1)多糖的硫酸酯(糊精和葡聚糖硫酸酯；硫酸纤维素)；(2)含有磺化苯或萘环的聚合物和萘磺酸酯聚合物；(3)聚羧酸酯(丙烯酸聚合物)；和乙酰基邻苯二甲酰纤维素(Neurath等(2002)BMC Infect Dis 2：27)；和(4)无碱基寡核苷酸(Takeshita等，1987，J.Biol.Chem.262：10171-10179)。文献中记载了非核苷酸抗病毒的聚合物的其它实例。本文所述的聚合物能模仿本发明中所述的PS-ODN，其下述特征类似于PS-ODN：a)链长度；b)纯偶极子，在一侧有负电荷积累；c)结合蛋白的能力；d)结合病毒蛋白的能力；e)可接受的治疗指数；f)抗病毒活性。为了模仿PS-ODN的作用，抗病毒的聚合物可以优选地是聚阴离子，其单元之间的距离类似于PS-ODN。其还可以具有独立的或与输送系统相组合的穿透细胞的能力。
双链PS-ODN的抗病毒活性
随机序列(REP2017)和其补体(PS修饰的或未修饰的)是如别处所述的荧光标记的，并通过如本发明所述的荧光偏振测试了它们结合纯化的HSV-1和HIV-1蛋白的能力。通过丙烯酰胺凝胶电泳验证了杂交。单链(ss)或双链(ds)的未修饰的REP2017(2017U)在HSV-1或HIV-1裂解物中没有结合活性。但是，单链或双链的的PS修饰的REP2017能进行HSV-1和HIV-1相互作用(见图33)。
根据本文所述的结果，一个方案是使用双链ON作为有效的抗病毒剂。优选地，这样的ON具有硫代磷酸酯主链，但是还可以具有其它的和/或另外的修饰，其能增强它们的输送和/或抗病毒活性和/或稳定性，如本文中关于单链的ON所述。
药物发现的体外试验
体外试验的开发是基于荧光偏振检测PS-ODN结合病毒组分、例如病毒蛋白的能力。当蛋白(或另一种相互作用物)结合到荧光标记的饵物时，饵物在溶液中的三维折叠(tumbling)会受到阻碍。通过从标记的饵物发出的光的偏振的固有增加检测了该折叠的阻碍。因此，将增强的偏振(记为无因次量纲(dimensionless measure)[mP])与增强的结合相关联。
一种方法是使用作为饵物的PS-ODN随机物，其在3′端使用不可弯曲连接物(3′-(6-荧光素)CPG)标记了FITC。将该PS-ODN随机物在试验缓冲液(10mM Tris，pH7.2，80mM NaCl，10mM EDTA，100mM β-巯基乙醇和1％吐温20)中稀释至2nM。然后将该寡聚物与合适的相互作用物混合。在该情况下，我们使用蔗糖梯度纯化的HSV-1(菌株Maclntyre)、HIV-1(菌株Mn)或RSV(菌株A2)的裂解物，它们悬浮在0.5M KCl和0.5％TritonX-100(HSV-1和HIV-1)或10mM Tris，pH7.5，150mM NaCl，1mM EDTA和0.1％Triton X-100(RSV)中。饵物相互作用后，用各种未标记的PS-ODN挑战复合物，以检测它们从其复合物中置换出饵物的能力。
在图29中，我们显示了用3种不同大小的饵物进行的初步试验：6(REP2032-FL)、10(REP2003-FL)和20个碱基(REP2004-FL)。测试了这些饵物与HSV-1(图29a)、HIV-1(图29b)和RSV(图29c)裂解物相互作用的能力。在存在任何病毒裂解物的情况下，结合度取决于使用的饵物的大小，2004-FL在存在病毒裂解物的情况下表现出最大的mP(结合)位移。我们注意到，这与PS-ODN随机物的大小依赖性的抗病毒功效类似。然后用该饵物评价不同大小的PS-ODN竞争饵物与裂解物的相互作用的能力。
在图30中，用递增大小的PS-ODN挑战了REP2004-FL与HSV-1(图30a)、HIV-1(图30b)和RSV(图30c)裂解物的相互作用。对于每种测试的病毒裂解物，我们注意到REP2003不能将饵物从裂解物中竞争出来。如通过REP2004(未标记的饵物)竞争物引起的相对较弱的竞争所揭示的，饵物相互作用非常强。但是观察到，当竞争物PS-ODN的大小超过20个碱基时，其置换饵物的能力变得更大。这表明，随着PS-ODN随机物大小的增大，在病毒裂解物中对蛋白组分的亲和力也增大。该现象反映了更大的PS-ODN随机物对HSV-1、HSV-2、CMV、HIV-1和RSV的抗病毒活性的增强。
饵物竞争的功效和PS-ODN随机物的抗病毒活性之间的相似性表明，该试验范例是抗病毒活性良好预测物。该试验是有力的、容易执行和非常稳定的，这使得它成为鉴别新的抗病毒分子的高通量筛选的非常好的备选品，所述的鉴别不是基于特定靶位的鉴别，而是基于它们与一种或多种组分(例如病毒蛋白)相互作用的能力。
本文所述的方法是用于筛选来自任何理想来源的新型化合物，例如来自通过组合化学合成的库或通过纯化天然产物分离的库。它可以用于a)检测新ON的合适大小、修饰和主链；b)测试新型分子，包括新型聚合物；预测特定病毒对新型ON或新型化合物的敏感性；或d)检测化合物的合适序列，以最大地抑制特定病毒。
与更大的PS-ODN随机物的增强的裂解物亲和力表明，PS-ODN随机物的抗病毒作用机制是基于与一种或多种病毒蛋白组分的相互作用，其预防感染或改正病毒粒子的复制。它还表明，该相互作用是电荷(大小)依赖性的，而不依赖于序列。由于这些PS-ODN随机物对跨越几个不同家族的多种病毒具有大小依赖性的活性，我们提出，PS-ODN随机物干扰常见的、电荷依赖性的蛋白-蛋白相互作用、蛋白DNA/RNA相互作用和/或其它分子-分子相互作用。这些相互作用可以包括(但不限于)：
a.在衣壳形成过程中各衣壳亚单元之间的相互作用；
b.衣壳/核壳体蛋白和病毒基因组之间的相互作用；
c.在芽殖过程中衣壳和糖蛋白之间的相互作用；
d.在感染过程中糖蛋白和其受体之间的相互作用；
e.参与病毒复制的其它病毒关键组分之间的相互作用。
蛋白-蛋白相互作用的这些多样的、同时的抑制代表了抗病毒的抑制新机制。
PS-ODN序列组成对裂解物的作用
我们监视了不同序列的PS-ODN与几种病毒裂解物相互作用的能力。在每种情况下，如本文前面所述，将20-mer的PS-ODN在3′端标记上FITC。测试的PS-ODN由A20、T20、G20、C20、AC10、AG10、TC10、TG10、REP2004和REP2017组成。这些序列中的每一种都在试验缓冲液中稀释至4nM，并在存在1ug HSV-1、HIV-1或RSV裂解物的情况下孵育。通过荧光偏振检测了相互作用。
所有测试序列的相互作用图谱与全部病毒裂解物类似，这表明结合相互作用的性质是非常相似的。在每种裂解物中，均匀组合物(A20、G20、T20、C20)的PS-ODN是最弱的相互作用物，且A20是其中最弱的相互作用物，形成显著边界。关于剩下的测试的PS-ODN，除了TG10，在每种裂解物中一致地表现出最强的相互作用外，它们都表现出类似的强相互作用(见图35)。
PS-ODN随机物在HIV-I中的靶位鉴别
如实施例9所述，通过荧光偏振测试了PS-ODN随机物结合纯化的HIV-1蛋白的能力。使递增量的纯化的HIV-1 p24或纯化的HIV-1 gp41与REP2004-FL反应(见图31)。我们对这两种蛋白注意到，都存在蛋白浓度依赖性的荧光偏振位移，这指示着与这两种蛋白的相互作用。
还使用REP2032、REP2003、REP2004、REP2006和REP2007的荧光版本测试了一定大小范围的PS-ODN随机物结合到这些蛋白的能力(见图32)。我们对p24观察到，p24没有大小依赖性的相互作用(见图32a)，但是我们确实看到，超过20个碱基的PS-ODN随机物与低于20个碱基的相比，有gp41结合的增加(见图32b)。这表明，当PS-ODN随机物的长度超过20个碱基时，多个拷贝的gp41可以结合到各随机物上，增强它们的偏振。
这是有意义的观察，因为它证实了更大的ON在病毒合成过程中隔绝结构蛋白和限制它们用于形成新病毒粒子的有效性的潜力。
高亲和力寡核苷酸
另一个方案是富集或纯化抗病毒的ON的方法，所述的ON对病毒组分(例如病毒蛋白)的亲和力比起始ON库中的平均ON亲和力更高。该方法因而提供了一种或多种非序列互补的ON，其它将表现出对一种或多种病毒组分增强的亲和力，例如具有有利于这样的更高结合亲和力的三维形状。基本原理是，尽管ON将作为线性分子与病毒组分结合，它们还可以折叠成能增强与这样的病毒组分的相互作用的三维形状。不限于特定的技术，可以以下述方式纯化或富集高亲和力的ON。
纯化一种或多种高亲和力的ON的一种方法包括，使用带有结合的病毒蛋白的固定相介质作为亲合基质来结合ON，其然后可以在递增的严格条件(例如递增浓度的盐或其它离液剂和/或递增的温度和/或pH变化)下洗脱。这样的方法可以例如如下进行：
(a)将ON库装载到交换柱上，所述交换柱具有一种或几种病毒蛋白或结合到固定相的病毒裂解物；
(b)从柱上置换(洗脱)结合的ON，例如通过使用置换溶液，例如递增的盐溶液；
(c)收集在不同的盐浓度洗脱的ON级分；
(d)从不同级分、更优选地从高盐浓度的级分克隆并测序洗脱的ON，在高盐浓度洗脱的ON具有更大的与病毒蛋白的结合亲和力；和
(e)在试验中测试测序的ON的活性，例如在结合和/或病毒抑制试验、例如本文所述的荧光偏振-结合试验中，和/或在细胞病毒抑制试验中和/或在动物病毒抑制试验中。
在第二个实施例中，从SELEX方法(Morris等(1998)Biochemistry 95：2902-2907)衍生和修正出的方法可以用于纯化高亲和力的ON。这种方法的一种实施可以如下进行：
(a)提供起始ON库物质，例如，收集合成的含有高数目序列的随机ON，例如含有1014～1016个不同序列。每个ON分子含有随机序列片段，在每一末端侧接引物结合序列，以促进聚合酶链式反应(PCR)。因为基本上所有的分子的核苷酸序列都是独特的，在群体中取样了巨大数量的结构。这些结构决定了每个分子的生化性质，例如结合给定的病毒靶分子的能力；
(b)使ON与一种或几种病毒蛋白或病毒裂解物接触；
(c)使用分离技术筛选结合到病毒蛋白上的ON，该技术可以分离结合的和未结合的ON，例如天然凝胶迁移和硝酸纤维素过滤。这些方法能将结合物从未结合物中物理地分离出，以便择优地回收结合最好的那些序列。另外，为了筛选能结合小蛋白的ON，理想地将目标结合到固体载体上，并用该载体作为亲合纯化基质。那些不能结合的分子会被洗下，而结合的分子则被游离的靶目标洗脱，从而物理地分离了结合的和未结合的物质；
(d)扩增洗脱的结合的ON，例如通过使用PCR，其使用能与ON的侧翼序列杂交的引物；
(e)为了择优地回收表现出与病毒蛋白的最高结合亲和力的ON，步骤(b)、(c)和(d)可以进行多次(即多个富集和放大的循环或回合)。几个富集和放大循环后，通过表现出理想的生化性质的序列使群体显现；
(f)对选自富集循环(例如最后一个这样的循环)的一种或多种ON进行克隆和测序；和
(g)在试验中测试测序的ON的结合和/或活性，例如在本文所述的荧光偏振结合试验和/或在细胞病毒抑制试验和/或在动物病毒抑制试验中。
另一个方案是采用改进的剪接合成方法，建立一个-珠一个-PS-ODN和一个-珠一个-PS2-ODN库，如Yang等(2002)Nucl.Acids Res.30(e132)：1-8所述。可以进行对病毒蛋白特异性的珠的结合和选择。通过使用选择的珠子的基于PCR的鉴别标记，可以进行核酸碱基和任何硫代酯/二硫代酯键位点的测序。该方法可以快速和方便地鉴别出结合到病毒蛋白上的PS-ODN或PS2-ODN，并表现出有效的抗病毒性质。
一旦确定了(例如通过各序列的扩增和测序)能高亲和力地结合到病毒蛋白上的特异性序列，可以选择和合成(例如通过化学的或酶促的合成)一种或多种这样的高亲和力序列，以提供高亲和力的ON制品，可以修饰它们以提高其活性，包括提高它们的药物代谢动力学性质。在本发明中可以使用这样的高亲和力的ON。
朊病毒疾病
另一个方案是在本发明的备选实施方案中用于朊病毒疾病的治疗、进程控制或预防。该致命的神经变性病是传染性的，可以感染人和动物。认为细胞朊病毒蛋白中的结构变化、其瘙痒病异构的PrPC、PrPSC是朊病毒疾病的发作和传播中的必须步骤。淀粉状蛋白聚合物与朊病毒疾病的神经病理学相关。
朊病毒蛋白片段和双链核酸的孵育导致淀粉状蛋白纤维的形成(Nandi等(2002)，J Mol Biol 322：153-161)。对蛋白具有亲和力的ON，例如硫代磷酸酯，用于竞争或抑制双链核酸与PrPC的相互作用，并随后终止淀粉状蛋白聚合物的形成。这样的不同大小的ON和不同的组合物可以用于合适的输送形式，以治疗患有朊病毒疾病的患者，或用于高危情形下的预防。可以如Nandi等(supra)所述通过测试在有试验ON存在的情形下的淀粉状蛋白聚合酶的折叠变化，鉴别出这样的干扰ON。
推定的病毒病原学
另一个方案是在本发明的另一个实施方案中用于治疗或预防具有如(但不限于)在下面的实施例中所述的推定的病毒病原学的疾病或病症。病毒是疾病和病症(其与原发性病毒感染无关)中的推定的致病物。例如，关节炎与HCV(Olivieri等(2003)Rheum Dis Clin North Am 29：111-122)、细小病毒B19、HIV、HSV、CMV、EBV和VZV(Stahl等(2000)ClinRheumatol 19：281-286)有关。还已经鉴别出其它病毒在不同的疾病中起作用。例如，流感A在帕金森氏疾病中(TAKAHASHI等(1999)，Jpn J InfectDis52：89-98)，冠状病毒、EBV和其它病毒在多发性硬化中(Talbot等(2001)Curr Top Microbiol Immunol253：247-71)；EBV、CMV和HSV-6在慢性疲劳综合症(Lerner等(2002)Drugs Today38：549-561)；和副粘病毒在哮喘(Walter等(2002)J Clin Invest 110：165-175)和在佩吉特病中；和HBV、HSV和流感在Guilfain-Barre综合征中。
因为这些病原学，使用本发明抑制相关的病毒可以延缓、减慢或预防相应疾病或病症的发展、或至少该疾病的一些症状。
寡核苷酸修饰和合成
如上面的总结所述，修饰的寡核苷酸在本发明中是有用的。这样的修饰的寡核苷酸包括例如含有修饰的主链或非天然的核苷间键合的寡核苷酸。具有修饰的主链的寡核苷酸包括在主链中保留有和没有磷原子的那些。
这样的修饰的寡核苷酸主链包括例如硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其它烷基膦酸酯包括3′-亚烷基膦酸酯、5′-亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯、亚膦酸酯，氨基磷酸酯包括3′-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯、硫羰氨基磷酸酯、硫羰烷基膦酸酯、硫羰烷基磷酸三酯、硒基磷酸酯、卡硼烷基(carboranyl)磷酸酯和具有正常的3′-5′键的borano-磷酸酯、它们的2′-5′连接的类似物和具有反转极性的那些，其中一个或多个核苷酸内键是3′至3′、5′至5′或2′至2′键。具有反转极性的寡核苷酸典型地包括在3′-最多核苷酸内键处的单独的3′至3′键，即单独的反转核苷残基，其可以是无碱基的(该核酸碱基是缺失的，或者在其位置具有羟基)。还包括了各种盐、混合盐和游离酸形式。
具有如上所述的含磷键的寡核苷酸的制备记载在例如美国专利号3,687,808；4,469,863；4,476,301；5,023,243；5,177,196；5,188,897；5,264,423；5,276,019；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,939；5,453,496；5,455,233；5,466,677；5,476,925；5,519,126；5,536,821；5,541,306；5,550,111；5,563,253；5,571,799；5,587,361；5,194,599；5,565,555；5,527,899；5,721,218；5,672,697和5,625,050中，其中的每一篇全文结合于此作为参考。
一些不包含磷原子的示例性的修饰的寡核苷酸主链具有通过短链烷基或环烷基核苷间键合、混合的杂原子和烷基或环烷基核苷间键合、或一个或多个短链杂原子的或杂环的核苷间键合形成的主链。它们包括具有下述键的那些：吗啉代键(部分地从核苷的糖部分形成)；硅氧烷主链；硫化物、亚砜和砜主链；formacetyl和thioformacetyl主链；亚甲基formacetyl和thioformacetyl主链；核乙酰基主链；含有链烯基的主链；氨基磺酸酯主链；亚甲基亚氨基和亚甲基肼基主链；磺酸酯和氨磺酰主链；酰胺主链；和其它具有混合的N、O、S和CH2组分部分的。特别有利的是包括一种或多种荷电部分的主链键。描述了前述寡核苷酸的制备的美国专利实例包括美国专利号5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,214,134；5,216,141；5,235,033；5,264,562；5,264,564；5,405,938；5,434,257；5,466,677；5,470,967；5,489,677；5,541,307；5,561,225；5,596,086；5,602,240；5,610,289；5,602,240；5,608,046；5,610,289；5,618,704；5,623,070；5,663,312；5,633,360；5,677,437；5,792,608；5,646,269和5,677,439，其中的每一篇全文结合于此作为参考。
修饰的寡核苷酸还可以含有一种或多种取代的糖部分。例如，这样的寡核苷酸可以包括一个下述的2′-修饰：OH；F；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-链烯基；O-、S-或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中所述的烷基、链烯基和炔基可以是取代的或未取代的C1至C10烷基或C2至C10链烯基和炔基或2′-O-(O-卡硼烷-1-基)甲基。具体的实例是O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2)～OCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2和O(CH2)nON[(CH2)nCH3]]2，其中n和m是1至10。其它示例性的寡核苷酸包括一个下述的2′-修饰：C1至C10低级烷基、取代的低级烷基、链烯基、炔基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷基氨基、聚烷基氨基、取代的甲硅烷基、报道基团、嵌入剂、用于提高寡核苷酸的药物代谢动力学性质的基团或用于提高寡核苷酸的药效学性质的基团。实例包括2′-甲氧基乙氧基(2’-O-CH2CH2OCH3，也称作2’-O-(2-甲氧基乙基)或2′-MOE)(Martin等，Helv.Chim.Acta，1995，78，486-504)即烷氧基烷氧基基团；2′-二甲基-氨基氧基乙氧基，即O(CH2)2ON(CH3)2基团，也称作2′-DMAOE；和2′-二甲基氨基乙氧基乙氧基(也称作2′-O-二甲基氨基乙氧基乙基或2′-DMAEOE)，即2′-O-CH2-O-CH2-N(CH2)2。
其它的修饰包括锁定的核酸(LNAS)，其中的2′-羟基基团是连接到糖环的3′或4′碳原子上，由此形成双环糖部分。键可以是连接2′氧原子和4′碳原子的亚甲基(-CH2-)～基团，其中n是1或2。LNA及其制备记载在WO 98/39352和WO 99/14226中，其全文结合于此作为参考。
其它的修饰包括硫-氮桥修饰，例如在Orum等(2001)Curr.Opin.Mol.Ther.3：239-243中所述的锁定的核酸。
其它的修饰包括2′-甲氧基(2’-O-CH3)、2′甲氧基乙基(2’-O-CH2-CH3)、2′-氨基丙氧基(2’-OCH2CH2CH2NH2)、2′-烯丙基(2′-CH2-CH＝CH2)、2’-O-烯丙基(2’-O-CH2-CH＝CH2)和2′-氟代(2′-F)。2’修饰可以是在arabino(上)位置或核(下)位置。类似的修饰还可以在寡核苷酸的其它的位置，特别是3′端核苷酸上、或2′-5′连接的寡核苷酸的糖的3′位置和5′端核苷酸的5′位置。寡核苷酸还可以具有糖模仿物，例如代替呋喃戊糖基糖的环丁基部分。描述了这种修饰的糖结构的示例性的美国专利包括例如美国专利号：4,981,957；5,118,800；5,319,080；5,359,044；5,393,878；5,446,137；5,466,786；5,514,785；5,519,134；5,567,811；5,576,427；5,591,722；5,597,909；5,610,300；5,627,053；5,639,873；5,646,265；5,658,873；5,670,633；5,792,747；和5,700,920，其中的每一篇全文结合于此作为参考。
其它的修饰包括ON多联体，其由多个通过连接物连接的寡核苷酸序列组成。该连接物可以例如由修饰的核苷酸或非核苷酸单元组成。在一些实施方案中，该连接物为ON多联体提供了弹性。通过连接更小的寡核苷酸结构块来得到理想的长度，应用这样的ON多联体可以提供便利的合成最终分子的方法。例如，可以用12个碳的连接物(C12亚磷酰胺)连接两种或多种ON多联体，并提供长度、稳定性和弹性。
如本文所使用的，“未修饰的”或“天然的”碱基(核酸碱基)包括嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)和嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。寡核苷酸还可以包括碱基修饰或取代。修饰的碱基包括其它的合成的和天然存在的碱基，例如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其它烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其它烷基衍生物、2-硫代尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶、5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基(-C≡C-CH3)尿嘧啶和胞嘧啶和嘧啶碱的其它炔基衍生物、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫代尿嘧啶、8-卤代、8-氨基、8-硫醇、8-硫代烷基、8-羟基和其它的8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-卤代特别是5-溴、5-三氟甲基和其它的5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、2-F-腺嘌呤、2-氨基-腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤和3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。其它修饰的碱基包括三环嘧啶例如吩噁嗪胞嘧啶核苷(1H-嘧啶并[5，4-b][1，4]苯并噁嗪-2(3H)-酮)、吩噻嗪胞嘧啶核苷(1H-嘧啶并[5，4-b][1，4]苯并噻嗪-2(3H)-酮)、G-夹子例如取代的吩噁嗪胞嘧啶核苷(例如9-(2-氨基乙氧基)-H-嘧啶并[5，4-b][1，4]苯并噁嗪-2(3H)-酮)、咔唑胞嘧啶核苷(2H-嘧啶并[4，5b]吲哚-2-酮)、吡啶并吲哚胞嘧啶核苷(H-吡啶并[3′，2′：4，5]吡咯并[2，3-d]嘧啶-2-酮)。修饰的碱基还可以包括这样的，其中的嘌呤或嘧啶碱基被替换为其它的杂环，例如7-脱氮-腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤核苷、2-氨基吡啶和2-吡啶酮。其它的核酸碱基包括：美国专利号3,687,808所述的那些，TheConcise Encyclopedia Of Polymer Science and Engineering，第858-859页，Kroschwitz，J.I.编.John Wiley和Son，1990公开的那些，Englisch等，Angewandte Chemie，International Edition，1991，30，613公开的那些，和Sanghvi，Y.S.，第15章，Antisense Research and Application，第289-302页，Crooke，S.T.和Lebleu，B.编，CRC Press，1993公开的那些。
其它的修饰包含二硫代磷酸酯键。已知二硫代磷酸酯ODN(PS2-ODN)和PS-ODN具有类似的蛋白结合亲和力(Tonkinson等(1994)Antisense Res.Dev.4：269-278)(Cheng等(1997)J.Mol.Recogn.10：101-107)，已知可能的ODN作用机制是结合至病毒蛋白，可以理想地在本发明所述的抗病毒的ODN上包括二硫代磷酸酯键。
修饰ODN的另一个方案是生产立体定义的或立体富集的ODN，如在Yu等(2000)Bioorg.Med Chem.8：275-284和在Inagawa等(2002)FEBS Lett.25：48-52中所述。通过常规方法制备的ODN由借助于围绕参与核苷酸间键的磷原子的不对称性的非对映异构体的混合物组成。这会影响ODN和病毒组分(例如病毒蛋白)之间的结合的稳定性。以前的数据表明，蛋白结合显然地是立体依赖性的(Yu等)。因而，使用立体定义的或立体富集的ODN可以改善它们的蛋白结合性质和改善它们的抗病毒功效。
可以以许多不同的整合方式和水平利用修饰(例如上述的那些)的结合。也就是说，特定的修饰不需要包括在每个核苷酸或寡核苷酸的键上，可以组合地在单独的寡核苷酸或甚至单独的核苷酸中利用不同的修饰。
寡核苷酸的合成
可以使用本领域已知的方法合成本发明的寡核苷酸。例如，利用标准的具有碘氧化的亚磷酰胺化学，可以在自动DNA合成仪(例如AppliedBiosystems型号380B)上合成未取代的和取代的磷酸二酯(P＝O)寡核苷酸。为了逐步进行亚磷酸酯键的硫代，可以将硫代磷酸酯(P＝S)合成为磷酸二酯寡核苷酸，除了可以将标准氧化瓶替换为0.2M的311-1，2-苯并二硫醇-3-酮1，1-二氧化物在乙腈中的溶液之外。硫代等待步骤(thioation waitstep)可以增加到68秒，然后进行帽化步骤(capping step)。从CPG柱剪下后，在55℃、在浓氢氧化铵中去封闭。(18小时)，可以通过用2.5体积的乙醇(来自0.5M NaCl溶液)沉淀2次，纯化寡核苷酸。
可以如美国专利号5,508,270所述制备亚膦酸酯寡核苷酸；可以如美国专利号4,469,863所述制备烷基膦酸酯寡核苷酸；可以如美国专利号5,610,289和5,625,050所述制备3′-脱氧-3′-亚甲基膦酸酯寡核苷酸；可以如美国专利号5,256,775和美国专利号5,366,878所述制备亚磷酰胺寡核苷酸；可以如公开的PCT申请PCT/US94/00902和PCT/US93/06976(分别公开为WO 94/17093和WO 94/02499)所述制备烷基硫代膦酰酯寡核苷酸；可以如美国专利号5,476,925所述制备3′-脱氧-3′-氨基氨基磷酸酯寡核苷酸；可以如美国专利号5,023,243所述制备磷酸三酯寡核苷酸；可以如美国专利号5,130,302和5,177,198所述制备borano磷酸酯寡核苷酸；可以如美国专利号5,378,825、5,386,023、5,489,677、5,602,240和5,610,289所述制备亚甲基甲基亚氨基连接的寡核苷酸(也称作MMI连接的寡核苷酸)、亚甲基二甲基-联亚氨基连接的寡核苷酸(也称作MDII连接的寡核苷酸)和亚甲基羰基氨基连接的寡核苷酸(也称作酰胺-3连接的寡核苷酸)和亚甲基氨基羰基连接的寡-核苷酸(也称作酰胺-4连接的寡聚物核苷)、以及混合的主链化合物(具有例如改变的MMI和P＝O或P＝S键)；可以如美国专利号5,264,562和5,264,564所述制备formacetal和thioformacetal连接的寡核苷酸；可以如美国专利号5,223,618所述制备环氧乙烷连接的寡核苷酸。引用的每项专利和专利申请全文结合于此作为参考。
寡核苷酸制剂和药物组合物
可以在寡核苷酸制剂或药物组合物中制备本发明的寡核苷酸。因而，本发明的寡核苷酸还可以与其它分子、分子结构或化合物的混合物相混合、包封、结合或另外关联，例如脂质体，受体靶向的分子，经口的、直肠的、局部的或其它的制剂，以辅助摄入、分布和/或吸收。描述了这样的摄入、分布和/或吸收的辅助制剂的制备的示例性美国专利包括例如美国专利号5,108,921；5,354,844；5,416,016；5,459,127；5,521,291；5,543,158；5,547,932；5,583,020；5,591,721；4,426,330；4,534,899；5,013,556；5,108,921；5,213,804；5,227,170；5,264,221；5,356,633；5,395,619；5,416,016；5,417,978；5,462,854；5,469,854；5,512,295；5,527,528；5,534,259；5,543,152；5,556,948；5,580,575；和5,595,756，每个全文结合于此作为参考。
本发明的寡核苷酸、制剂和组合物包括任何药学上可接受的盐、酯、或这样的酯的盐、或任何其它化合物，其在施用给动物(包括人)后能直接地或间接地提供生物活性代谢物或其残余物。因此，例如，本申请还包括本发明的化合物的前药和药学上可接受的盐、这样的前药的药学上可接受的盐和其它的生物等同物。
术语“前药”是指制备成无活性形式的治疗剂，其在体内或其细胞中会通过内源酶或其它化学品和/或条件的作用转化成活性形式(即药物)。在具体实施方案中，本发明的寡核苷酸的前药形式是制备成根据在Gosselin等WO 93/24510和在Imbach等WO 94/26764和美国专利号5,770,713中所述的方法的SATE[(S-乙酰基-2-硫代乙基)磷酸酯]衍生物，其全文结合于此作为参考。
术语“药学上可接受的盐”是指本发明的化合物的生理学上和药学上可接受的盐：即保留了母体化合物的理想生物学活性且不引起不希望的毒理学作用的盐。已知许多这样的药学上可接受的盐，且可以用在本发明中。
对于寡核苷酸，药学上可接受的盐的有用实例包括但不限于：与阳离子(例如钠、钾、铵、镁、钙)形成的盐，多胺例如精胺和亚精胺等；与无机酸(例如氢氯酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、硝酸等)形成的酸式加成盐；与有机酸(例如，醋酸、草酸、酒石酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、葡糖酸、柠檬酸、苹果酸、抗坏血酸、苯甲酸、丹宁酸、棕榈酸、藻酸、聚谷氨酸、萘磺酸、甲磺酸、对甲苯磺酸、萘二磺酸、聚半乳糖醛酸等)形成的盐；和与元素阴离子(例如氯、溴和碘)形成的盐。
本发明还包含药物组合物和制剂，其含有本发明的抗病毒的寡核苷酸。根据需要局部的还是全身的治疗以及要治疗的区域，可以以许多方式施用这样的药物组合物。例如，可以局部地施用，(包括眼的和粘膜包括阴道的和直肠的输送)；肺的，例如通过吸入或吹入粉末或气溶胶，包括通过喷雾器；气管内的；鼻内的；表皮的和透皮的；经口的；或肠胃外的。肠胃外的施用包括静脉内的、动脉内的、皮下的、腹膜内的或肌肉内的注射或灌输；或颅内的，例如鞘内的或心室内的施用。
用于局部施用的药物组合物和制剂可以包括透皮贴剂、软膏、洗剂、霜剂、凝胶、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体和粉末。常规的药物载体、水性的、粉末的或油性的基质、增稠剂等可以是需要的或理想的。还可以使用有涂层的避孕套、手套等。优选的局部制剂包括这样的，其中本发明的寡核苷酸是与局部输送剂相混合，例如脂质、脂质体、脂肪酸、脂肪酸酯、甾族化合物、螯合剂和表面活性剂。优选的脂质和脂质体包括中性的(例如二油酰磷脂酰基DOPE乙醇胺、二肉豆蔻酰基磷脂酰基胆碱DMPC、二硬脂酰磷脂酰基胆碱)、阴离子的(例如二肉豆蔻酰基磷脂酰基甘油DMPG)和阳离子的(例如二油酰基四甲基氨基丙基DOTAP和二油酰基磷脂酰基乙醇胺DOTMA)。可以将寡核苷酸包封在脂质体中，或与其形成复合物，特别是与阳离子脂质体。或者，可以使寡核苷酸与脂质络合，特别是与阳离子脂质。优选的脂肪酸和酯包括但不限于花生四烯酸、油酸、花生酸、月桂酸(laurie acid)、辛酸、癸酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、二癸酸酯、三癸酸酯、甘油一油酸酯、甘油二月桂酸酯、1-单癸酸甘油酯、1-十二烷基氮杂环庚-2-酮、酰基肉碱、酰基胆碱或C1-10烷基酯(例如异丙基肉豆蔻酸酯IPM)、单酸甘油酯、甘油二酯或其药学上可接受的盐。
用于经口施用的组合物和制剂包括粉末或颗粒、微粒、纳米颗粒、在水或非水性介质中的混悬液或溶液、胶囊、凝胶胶囊、药囊、片剂或微片剂。增稠剂、调味剂、稀释剂、乳化剂、分散助剂或粘合剂可以是需要的。优选的经口制剂是这样的，其中本发明的寡核苷酸与一种或多种穿透增强剂、表面活性剂和螯合剂一起施用。示例性的表面活性剂包括脂肪酸和/或其酯或盐、胆汁酸和/或其盐。示例性的胆汁酸/盐包括鹅脱氧胆酸(CDCA)和乌索脱氧胆酸(UDCA)、胆酸、脱氢胆酸、脱氧胆酸、葡糖胆酸(glucholic acid)、甘胆酸(glycholic acid)、甘氨脱氧胆酸(glycodeoxycholicacid)、牛磺胆酸、牛磺脱氧胆酸、牛磺-24，25-二氢-梭链孢酸钠、甘氨二氢梭链孢酸钠(sodium glycodihydrofusidate)。示例性的脂肪酸包括花生四烯酸、十一烷酸、油酸、月桂酸、辛酸、癸酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、二癸酸酯、三癸酸酯、甘油一油酸酯、甘油二月桂酸酯、1-单癸酸甘油酯、1-十二烷基氮杂环庚-2-酮、酰基肉碱、酰基胆碱或单酸甘油酯、甘油二酯或其药学上可接受的盐(例如钠盐)。还优选的是穿透增强剂的组合，例如，脂肪酸/盐与胆汁酸/盐组合。特别优选的组合是月桂酸、癸酸和UDCA的钠盐。其它示例性的穿透增强剂包括聚氧乙烯-9-月桂基醚、聚氧乙烯-20-鲸蜡基醚。可以以颗粒形式经口地输送本发明的寡核苷酸，包括喷雾干燥的颗粒或络合形成微米或纳米颗粒。寡核苷酸络合剂包括聚-氨基酸；聚亚胺；聚丙烯酸酯；聚烷基丙烯酸酯、聚氧乙烷(polyoxethanes)、聚烷基氰基丙烯酸酯；阳离子化的明胶、白蛋白、淀粉、丙烯酸酯、聚乙二醇(PEG)和淀粉；聚烷基氰基丙烯酸酯；DEAE-衍生的聚亚胺、短梗霉多糖(pollulans)、纤维素和淀粉。特别有益的络合剂包括脱乙酰壳多糖、N-三甲基脱乙酰壳多糖、聚-L-赖氨酸、聚组氨酸、polyorithine、聚精胺、鱼精蛋白、聚乙烯基吡啶、聚硫代二乙基氨基甲基亚乙基P(TDAE)、聚氨基苯乙烯(例如对氨基)、聚(甲基氰基丙烯酸酯)、聚(乙基氰基丙烯酸酯)、聚(丁基氰基丙烯酸酯)、聚(异丁基氰基丙烯酸酯)、聚(异己基氰基丙烯酸酯)、DEAE-甲基丙烯酸酯、DEAE-己基丙烯酸酯、DEAE-丙烯酰胺、DEAE-白蛋白和DEAE-葡聚糖、聚甲基丙烯酸酯、聚己基丙烯酸酯、聚(D，L-乳酸)、聚(D，L-乳-co-羟基乙酸(PLGA)、藻酸盐和聚乙二醇(PEG)。
用于肠胃外的、鞘内的或心室内给药的组合物和制剂可以包括无菌水性溶液，其还可以含有缓冲剂、稀释剂和其它的合适的添加剂，例如但不限于穿透增强剂、载体化合物和其它的药学上可接受的载体或赋形剂。
本发明的药物组合物包括但不限于溶液、乳剂和含有脂质体的制剂。这些组合物可以从多种组分生成，包括但不限于预制的液体、自乳化固体和自乳化半固体。
本发明的药物制剂可以常规的以单位剂量形式存在，其可以根据制药工业熟知的常规技术制备。这样的技术包括将活性成分与药物载体或赋形剂相结合的步骤。通常，制剂是通过将活性成分与液体载体或磨碎的固体载体或者二者均匀地和紧密地组合，然后在必要时混合产物来制备的。
本发明的组合物可以制成任何多种可能的剂型，例如但不限于片剂、胶囊、凝胶胶囊、液体糖浆、软凝胶、栓剂和灌肠剂。本发明的组合物还可以制成在水性、非水性或混合介质中的混悬液。水性混悬液还可以含有能提高混悬液粘度的物质，包括例如羧甲基纤维素钠、山梨醇和/或葡聚糖。混悬液还可以含有稳定剂。
在本发明的一个实施方案中，药物组合物可以制成并用作泡沫。药物泡沫包括的制剂例如但不限于乳剂、微乳、霜剂、凝胶剂和脂质体。尽管它们的性质基本上类似，这些制剂在组分和最终产品的稠度上有差别。这样的组合物和制剂的制备是药物和制剂领域的技术人员熟知的，可以用于制备本发明的组合物。
乳剂
本发明的制剂和组合物可以制备并制成乳剂。乳剂典型地是一种液体以微滴形式(其直径通常超过0.1μm)分散在另一种液体中的异源系统。(Idson，in Pharmaceutical Dosage Form，Lieberman，Rieger和Banker(LIDS.)，1988，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，卷1，199页；Rosoff，inPharmaceutical Dosage Form，Lieberman，Rieger和Banker(编)，1988，MarcelDekker，Inc.，New York，N.Y.，卷1，245页；Block in Pharmaceutical DosageForms，Lieberman，Rieger和Banker(编)，1988，Marcel Dekker，Inc.，NewYork，N.Y.，卷2，335页；Higuchi等，in Remington′s PharmaceuticalScience，Mack Publishing Co.，Easton，Pa.，1985，301页)。乳剂经常是双相系统，其包含2个彼此紧密地混合并分散的不能混合的溶液相。通常，乳剂可以是油包水(w/o)或水包油(o/w)的形式。当水相作为微小液滴细碎并分散到本体油相中时，得到的组合物称作油包水(w/o)乳剂。或者，当油相作为微小液滴细碎并分散到本体水相中时，得到的组合物称作水包油(o/w)乳剂。除了分散相和活性药物外，乳剂可以含有其它组分，其可以作为在水相、油相中的溶液，或者其自身作为分开的相。需要时，在乳剂中还可以存在药物赋形剂例如乳化剂、稳定剂、染料和抗氧化剂。药物乳剂还可以是含有超过2个相的多重乳剂，例如，油包水包油(o/w/o)和水包油包水(w/o/w)乳剂的情况。这样的复合制剂经常会提供简单的两相乳剂所没有的某些优点。当多重乳剂中的o/w乳剂的各油滴还包有小水滴时，该多重乳剂形成W/O/W乳剂。同样地，在油相中稳定化的水滴中包封的油滴的系统，构成o/w/o乳剂。
乳剂的特征在于较小或没有热力学稳定性。通常，乳剂的分散相或不连续相较好地分散在外相或连续相中，并借助于乳化剂或制剂的粘度维持在该状态。乳剂的每个相都可以是半固体或固体，如乳剂-类型的软膏基质和霜剂的情形。稳定乳剂的其它方法需要使用乳化剂，其可以混合在乳剂的任意相中。乳化剂可以宽泛地分成4类：合成的表面活性剂、天然存在的乳化剂、吸附基质和细分散的固体(Idson，in Pharmaceutical DosageForms，Lieberman，Rieger和Banker(编)，1988，Marcel Dekker，Inc.，NewYork，N.Y.，卷1，199页)。
合成的表面活性剂也称作表面活性剂，在乳剂的配制中有广泛应用，已经记载在文献(Rieger，in Pharmaceutical Dosage Forms，Lieberman，Rieger和Banker(编)，1988，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，卷1，285页；Idson，in Pharmaceutical Dosage Forms，Lieberman，Rieger和Banker(编)，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，1988，卷1，199页)。表面活性剂典型地是两亲的，且含有亲水的和疏水的部分。已经将表面活性剂的亲水性和疏水性的比率定义为亲水性/亲脂性比(HLB)，它是在制剂制备过程中分类和选择表面活性剂的评价工具。根据亲水基团的性质，可以将表面活性剂分成不同的类：非离子的、阴离子的、阳离子的和两性的(Rieger，inPharmaceutical Dosage Forms，Lieberman，Rieger和Banker(编)，1988，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，卷1，285页)。
在乳剂制剂中使用的天然存在的乳化剂包括羊毛脂、蜂蜡、磷脂、卵磷脂和阿拉伯胶。吸附基质具有亲水性，所以它们可以吸收水、形成w/o乳剂，并保留它们的半固体稠度，例如无水的羊毛脂和亲水性凡士林。细碎的固体还已经被用作良好乳化剂，特别是与表面活性剂相组合和在粘性制品中。它们包括极性无机固体，例如重金属氢氧化物、不溶涨的粘土例如膨润土、绿坡缕石、锂蒙脱石、高岭土、蒙脱石、胶体硅酸铝和胶体硅酸铝镁、颜料和非极性固体例如碳或三硬脂酸甘油酯。
在乳剂制剂中还包括许多种类的非乳化物，它们有助于乳剂的性质。这包括脂肪、油、蜡、脂肪酸、脂肪醇、脂肪酯、湿润剂、亲水胶体、防腐剂和抗氧化剂(Block，in Pharmaceutical Dosage Forms，Lieberman，Rieger和Banker(编)，1988，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，卷1，335页；Idson，in Pharmaceutical Dosage Forms，Lieberman，Rieger和Banker(编)，1988，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，卷1，199页)。
亲水胶体或水胶体包括天然存在的树胶和合成的聚合物例如多糖(例如，阿拉伯胶、琼脂、藻酸、卡拉胶、瓜耳胶、刺梧桐树胶和黄芪胶)、纤维素衍生物(例如，羧甲基纤维素和羧丙基纤维素)、和合成的聚合物(例如，碳聚物、纤维素醚和羧乙烯基聚合物)。它们在水中分散或膨胀，形成胶体溶液，其通过围绕着分散相的液滴形成强界面膜和通过增加外相的粘度来稳定乳剂。
由于乳剂经常含有许多成分，例如碳水化合物、蛋白、甾醇和磷脂，它们会容易地支持微生物的生长，所以这些制剂经常含有防腐剂。经常在乳剂制剂中使用的防腐剂包括羟苯甲酸甲酯、羟苯甲酸丙酯、季铵盐、苯扎氯铵、对羟基苯甲酸酯和硼酸，还经常向乳剂制剂中加入抗氧化剂，以预防制剂的变质。使用的抗氧化剂可以是自由基清除剂，例如生育酚、alkylgallates、丁基化的羟基茴香醚、丁基化的羟基甲苯，或还原剂例如抗坏血酸和偏亚硫酸氢钠，和抗氧化剂协同剂例如柠檬酸、酒石酸和卵磷脂。
通过皮肤的、经口的和肠胃外的途径应用乳剂制剂和制备它们的方法已经记载在文献(Idson，in Pharmaceutical Dosage Forms，Lieberman，Rieger和Banker(编)，1988，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，卷1，p.199)。已经广泛地使用了经口输送的乳剂制剂，原因在于该制剂的方便、吸收和生物利用度方面的功效。(Rosoff，in Pharmaceutical Dosage Forms，Lieberman，Rieger和Banker(编)，1988，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，卷1，p.245；Idson，in Pharmaceutical Dosage Forms，Lieberman，Rieger和Banker(编)，1988，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，卷1，P.199)。矿物油基质的缓泻药、油溶性的维生素和高脂肪营养制品属于已经经常作为o/w乳剂经口地施用的物质。
在本发明的一个实施方案中，寡核苷酸的组合物是制成微乳。微乳可以定义为水、油和两亲分子的系统，其是单一的光学各向同性的和热力学稳定的液体溶液(Rosoff，in Pharmaceutical Dosage Forms，Lieberman，Rieger和Banker(编)，1988，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，卷1，p.245)。典型地，微乳是如下制备的系统：首先将油分散到水性表面活性剂溶液中，然后加入足够量的第四组分(通常是中等链长度的醇)，形成透明系统。因此，还已经将微乳描述为2个不能混合液体的热力学稳定的、各向同性的澄清分散系，其通过表面活性分子的界面膜稳定化(Leung和Shah，in：Controlled Release of Drugs：Polymers and Aggregate Systems，Rosoff，M.，编，1989，VCH Publisher，New York，页185-215)。通常通过3～5种组分的组合制备微乳，它们包括油、水、表面活性剂、辅助表面活性剂和电解质。微乳是油包水(w/o)还是水包油(o/w)类型取决于使用的油和表面活性剂的性质和表面活性剂分子的极性头和烃尾的结构和几何包装(Schott，in Remington′s Pharmaceutical Science，Mack Publishing Co.，Easton，Pa.，1985，p.271)。
已经广泛地研究了利用相图的现象学方法，并且可以产生了关于本领域的技术人员如何制备微乳的全面理论(Rosoff，in Pharmaceutical DosageForms，Lieberman，Rieger和Banker(编)，1988，Marcel Dekker，Inc.，NewYork，N.Y.，卷1，p.245；Block，in Pharmaceutical Dosage Forms，Lieberman，Rieger和Banker(编)，1988，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，卷1，p.335)。与常规乳剂相比，微乳的优点是能将水不溶性的药物溶解到同时形成的热力学稳定的液滴制剂中。
在微乳的制备中使用的表面活性剂包括但不限于离子表面活性剂、非离子表面活性剂、Brij96、聚氧乙烯油基醚、聚甘油脂肪酸酯、四甘油一月桂酸酯(ML31O)、四甘油一油酸酯(MO310)、六甘油一油酸酯(PO310)、六甘油五油酸酯(PO500)、十甘油单癸酸酯(MCA750)、十甘油一油酸酯(MO750)、decaglycerol sequioleate(SO750)、十甘油十油酸酯(DA0750)，它们单独使用或与辅助表面活性剂组合使用。辅助表面活性剂通常是短链醇，例如乙醇、1-丙醇和1-丁醇，其可以通过穿透表面活性剂膜并随后建立无序膜(因为在表面活性剂分子中产生了空隙空间)来增强界面的流动性。但是，可以不使用辅助表面活性剂来制备微乳，无醇的自乳化微乳系统是本领域已知的。水相可以典型地是(但不限于)水、药物的水性溶液、甘油、PEG300、PEG400、聚甘油、丙二醇，和乙二醇的衍生物。油相可以包括但不限于下述物质，例如Captex300、Captex355、Capmul MCM、脂肪酸酯、中等链(C8-C12)单-、二-和三甘油酯、聚氧乙基化的甘油脂肪酸酯、脂肪醇、聚乙二醇化的甘油酯、饱和的聚乙二醇化的C8-C10甘油酯、植物油和硅油。
从药物溶解和增强药物的吸附的角度看，微乳是特别令人感兴趣的。已经建议用基于脂质的微乳(o/w和w/o)来增强经口的药物(包括肽)的生物利用度(Constantinides等，Pharmaceutical Research，1994，11，1385-1390；Ritschet，Metli.Find.Exp.Clin.Pharmacol，1993，13，205)。微乳提供的优点是：改善了药物溶解、防止药物被酶水解、可能增强药物吸收(因为表面活性剂诱导的膜流动性和渗透性的变化)、容易制备、容易以固体剂型口服施用、提高了临床效力和降低了毒性(Constantinides等，Pharmaceutical Research，1994，11，1385；Ho等，J.Pharm.Set，1996，85，138-143)。当在环境温度将它们的组分混合到一起时，常常会自然地形成微乳。当制备热不稳定的药物、肽或寡核苷酸时，这是特别有利的。在化妆品和药物应用领域，还已经将微乳有效地用于透皮输送活性组分。预期本发明的微乳组合物和制剂将会有利于增强寡核苷酸和核酸从胃肠道的全身吸收，并改善寡核苷酸和核酸在胃肠道、阴道、口腔和其它给药区域中的局部的细胞摄入。
本发明的微乳还可以含有其它组分和添加剂，例如山梨聚糖单硬脂酸酯(Grill3)、Labrasol和穿透增强剂，以改善制剂的性质和增强本发明的寡核苷酸和核酸的吸收。在本发明的微乳中使用的穿透增强剂可以分为5大类中的一种：表面活性剂、脂肪酸、胆汁盐、螯合剂和非螯合非表面活性剂(Lee等，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems，1991，p.92)。
脂质体
除了微乳以外，还有许多有组织的表面活性剂结构，人们已经对它们进行了研究并用于药物制剂。这包括单分子层、胶束、双分子层和泡囊。泡囊能提供特异性，并延长药物输送的作用时间。因而，如本文所使用的，术语“脂质体”是指由排列成一个或多个球形双分子层的两亲脂质组成的泡囊，即脂质体是单层的或多层的泡囊，其具有从亲脂性物质和水性内部形成的膜。水性部分典型地含有要输送的组合物。为了穿过完整的哺乳动物皮肤，脂质泡囊必须在合适的透皮梯度的影响下穿过一系列的细孔，每个的直径小于50nm。因此，理想的是使用脂质体，其是高变形的且能穿过这样的细孔。脂质体的其它因素包括脂表面电荷和脂质体的水体积。
脂质体的其它优点包括：从天然磷脂得到的脂质体是生物相容的和可生物降解的；脂质体可以包括广范围的水和脂溶的药物；脂质体可以防止包封在其内腔中的药物的代谢和降解(Rosoff，in Pharmaceutical DosageForms，Lieberman，Rieger和Banker(编)，1988，Marcel Dekker，Inc.，NewYork，N.Y.，卷1，p.245)。
关于局部施用，已经证实脂质体与其它制剂相比具有几项优点。这些优点包括：减少了与施用药物的高全身吸收有关的副作用、增加了施用的药物在目标靶物的积累、和将广范围的药物(亲水的和疏水的)输送进皮肤中的能力。包括镇痛药、抗体、激素和高分子量的DNA在内的化合物已经施用给皮肤，通常会导致上表皮的靶向。
脂质体可以分为2大类。阳离子脂质体是带正电荷的脂质体，其与带负电荷的DNA分子相互作用形成稳定的复合物。带正电荷的DNA/脂质体复合物能结合到带负电荷的细胞表面，并内含到内体中。由于内体中的酸性pH，脂质体破裂，释放出它们的内含物到细胞质中(Wang等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，1987，147，980-985)。
pH-敏感的或带负电荷的脂质体会捕获DNA，而不是与其络合。由于DNA和脂质带有相似的电荷，它们相互排斥而不是形成复合物。DNA因而被捕获到这些脂质体的水性内部。已经使用了pH-敏感的脂质体，例如，用于将能编码胸腺嘧啶核苷激酶基因的DNA输送进培养物中的细胞单层(Zhou等，Journal of Controlled Relase 1992，19，269-274)。
一类主要的脂质体组合物包含磷脂，除了天然产生的磷脂酰基胆碱之外。中性的脂质体组合物例如可以从二肉豆蔻酰基磷脂酰基胆碱(DMPC)或二棕榈酰基磷脂酰基胆碱(DPPC)形成。阴离子脂质体组合物通常从二肉豆蔻酰基磷脂酰基甘油形成，而阴离子融合脂质体主要是从二油酰磷脂酰基乙醇胺(DOPE)形成。其它类型的脂质体组合物是从磷脂酰基胆碱(PC)、例如大豆PC和蛋PC形成。另一类是从磷脂和/或磷脂酰基胆碱和/或胆固醇的混合物形成。
几项研究已经评价了脂质体药物制剂向皮肤的局部输送。将含有干扰素的脂质体应用到豚鼠皮肤上，会减轻皮肤疱疹溃疡，而通过其它方式(例如作为溶液或乳剂)输送干扰素则是无效的(Weiner等，Journal of DrugTargeting，1992，2，405-410)。而且，另一项研究测试了作为脂质体制剂的一部分施用的干扰素对使用水性系统的干扰素的施用的功效，结论是，脂质体制剂比水性施用更优越(du Plessis等，Antiviral Research，1992，18，259-265)。
还已经测试了非离子的脂质体系统，以确定它们在向皮肤输送药物的效用，特别是含有非离子的表面活性剂和胆固醇的系统。使用含有NovasoneTM I(二月桂酸甘油酯/胆固醇/聚氧乙烯-10-硬脂基醚)和NovasomeTM II(二硬脂酸甘油酯/胆固醇/聚氧乙烯-10-硬脂基醚)的非离子的脂质体制剂来将环孢素-A输送进小鼠真皮中。结果表面，这样的非离子的脂质体系统能有效地促进环孢素-A在不同的皮肤层中的沉积(Hu等S.T.P.Pharma.SCI.，1994，4，6，466)。
脂质体还包括“空间上稳定的”脂质体，如本文所使用的，该术语是指含有一种或多种特殊脂质的脂质体，当混入脂质体中时，其会导致与没有这种特殊脂质的脂质体相比提高的循环寿命。空间上稳定的脂质体的实例是这样的，其中脂质体的形成泡囊的脂质部分的一部分包括一种或多种糖脂，例如单唾液酰神经节苷脂GM1，或源自一种或多种亲水聚合物，例如聚乙二醇(PEG)部分。不受任何具体理论的限制，相信对于含有神经节苷脂、鞘磷脂或源自PEG的脂质的空间上稳定的脂质体，这些空间上稳定的脂质体的循环半衰期的增加是由于减少了向网状内皮系统(RES)的细胞中的摄入(Allen等，FEBS Lett.，1987，223，42；Wu等，Cancer Research，1993，53，3765)。
包含一种或多种糖脂的各种脂质体已经报道在Papahadjopoulos等、Ann.N.Y.Acad.Sci.，1987，507，64(单唾液酰神经节苷脂GM1，半乳糖脑苷硫酸酯和磷脂酰基肌醇)；Gabizon等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，1988，85，6949，；Allen等，美国专利号4,837,028和国际申请公开WO88/04924(鞘磷脂和神经节苷脂GM1或半乳糖脑苷硫酸酯)；Webb等，美国专利号5,543，152(鞘磷脂)；Lim等，WO 97/13499(1，2-sn-二肉豆蔻酰基磷脂酰基胆碱)。
包含用一种或多种亲水聚合物衍生的脂质的脂质体及其制备方法记载在，例如，Sunamoto等，Bull.Chem.Soc.Jpn.，1980，53，2778(非离子去污剂，2C1215G，其含有PEG部分)；Illum等，FEBS Lett.，1984，167，79(含有聚二醇的聚苯乙烯颗粒的亲水涂层)；Sears，美国专利号4,426,330和4,534,899(通过连接聚亚烷基二醇(例如PEG)的羧基修饰的合成的磷脂)；Klibanov等，FEBS Lett.，1990，268，235(用PEG或PEG硬脂酸酯衍生的磷脂酰基乙醇胺(PE))；Blume等，Biochimica et Biophysica Acta，1990，1029，91(PEG-衍生的磷脂，例如DSPE-PEG，从二硬脂酰磷脂酰基乙醇胺(DSPE)和PEG的组合形成)；Fisher，欧洲专利号EP 0 445 131 B1和WO90/04384(在脂质体外表面共价的结合的PEG部分)；Woodle等，美国专利号5,013,556和5,356,633，和Martin等，美国专利号5,213,804和欧洲专利号EP 0 496 813 B1(含有1-20摩尔百分比的用PEG衍生的PE的脂质体组合物)；Martin等，WO 91/05545和美国专利号5,225,212和Zalipsky等，WO94/20073(含有许多其它脂质-聚合物结合物的脂质体)；Choi等，WO96/10391(包括PEG-修饰的神经酰胺脂质的脂质体)；Miyazaki等，美国专利号5,540,935，和Tagawa等，美国专利号5,556,948(含有PEG的脂质体，其可以进一步用在它们表面的功能性部分衍生)。
包含核酸的脂质体已经记载在，例如，Thierry等，WO 96/40062(将高分子量的核酸包封到脂质体中的方法)；Tagawa等，美国专利号5,264,221(含有RNA的结合蛋白的脂质体)；Rahman等，美国专利号5,665,710(将寡脱氧核苷酸包封到脂质体中的方法)；Love等，WO 97/04787(包含反义寡核苷酸的脂质体)。
另一种类型的脂质体、传递体(transfersomes)是可高度变形的脂质聚集体，它用作药物输送工具是有吸引力的(Cevc等，1998，BiochimBiophys Acta.1368(2)：201-15)。可以将传递体称作脂质液体，它们可高度变形，所以可以穿过比液滴小的孔。传递体能适应使用它们的环境，例如，它们是形状适应的、自修复、经常不分段地接近它们的靶位和经常自动装载。可以制作传递体，例如，通过向标准的脂质体组合物添加表面边界活性剂，通常是表面活性剂。
表面活性剂
表面活性剂广泛地用于制剂，例如乳剂(包括微乳)和脂质体。对许多不同类型的表面活性剂(天然的和合成的)的性质进行分类和排列的最常见方法是通过使用亲水性/亲脂性比(HLB)。亲水基团(也称作“头”)的性质提供了为在制剂中使用的不同表面活性剂分类的最有用的方式(Rieger，in Pharmaceutical Dosage Forms，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，1988，p.285)。
如果表面活性剂分子不是离子化的，将其归类为非离子的表面活性剂。非离子的表面活性剂广泛地用于药物和化妆品产品中，在宽范围的pH值是可用的，随结构不同，典型的HLB值从2至约18。非离子的表面活性剂包含非离子的酯，例如乙二醇酯、丙二醇酯、甘油酯、聚甘油酯、山梨聚糖酯、蔗糖酯和乙氧基化的酯；和非离子的烷醇酰胺和醚，例如脂肪醇乙氧基化物、丙氧基化的醇和乙氧基化的/丙氧基化的嵌段聚合物也包括在该类中。聚氧乙烯表面活性剂是非离子的表面活性剂类中最常用的成员。
当溶解或分散在水中时带有负电荷的表面活性剂分子称为阴离子型的。阴离子表面活性剂包括羧化物例如肥皂、酰基乳酰化物、氨基酸的酰基酰胺，硫酸酯例如烷基硫酸酯和乙氧基化的烷基硫酸酯，磺酸酯例如烷基苯磺酸酯、酰基异硫代硫酸酯、酰基月桂酸酯和磺基琥珀酸酯，和磷酸酯。烷基硫酸酯和肥皂是最常用的阴离子表面活性剂。
当溶解或分散在水中时带有正电荷的表面活性剂分子称为阳离子型的。阳离子表面活性剂包含季铵盐和乙氧基化的胺，季铵盐是最常用的。
可以带有正电荷或负电荷的表面活性剂分子称为两性的。两性的表面活性剂包含丙烯酸衍生物、取代的烷基酰胺、N-烷基甜菜碱和磷脂。
表面活性剂在药物产品、制剂和乳剂中的应用已经记载在Rieger，inPharmaceutical Dosage Forms，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，1988，p.285。
穿透增强剂
在有些实施方案中，穿透增强剂在组合物中、或与其一起使用，以增加向动物皮肤的核酸(特别是寡核苷酸)的输送。大多数药物是以离子化的和非离子化的形式存在于溶液中。但是，通常只有脂溶的或亲脂的药物能容易地穿过细胞膜。已经发现，如果用穿透增强剂处理要穿过的细胞膜，甚至非亲脂的药物也可以穿过该膜。除了辅助非亲脂的药物穿过细胞膜的扩散外，穿透增强剂还能增强亲脂药物渗透性。
穿透增强剂可以归类为5大类之一，即表面活性剂、脂肪酸、胆汁盐、螯合剂和非螯合非表面活性剂(Lee等，Critical Reviews in Therapeutic DrugCarrier Systems，1991，p.92)。在下面更详细地描述了每一类穿透增强剂。
表面活性剂：与本发明有关，表面活性剂是化学实体，当溶解到水性溶液中时，它能减少溶液的表面张力或水性溶液和其它液体之间的界面张力，结果增强了穿过粘膜的寡核苷酸吸收。这些穿透增强剂包括例如十二烷基硫酸钠、聚氧乙烯-9-月桂基醚和聚氧乙烯-20-鲸蜡基醚(Lee等，CriticalReviews in Therapeutic Drug Carrier System，1991，p.92)；和全氟化合物乳剂，例如FC-43.Takahashi等，J.Pharm.Pharmacol.，1988，40，252)，每一篇全文结合于此作为参考。
脂肪酸：能作为穿透增强剂的各种脂肪酸和它们的衍生物包括例如油酸、月桂酸、癸酸(正癸酸)、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、二癸酸酯、三癸酸酯、甘油一油酸酯(1-单油酰-rac-甘油)、甘油二月桂酸酯、辛酸、花生四烯酸、1-单癸酸甘油酯、1-十二烷基氮杂环庚-2-酮、酰基肉碱、酰基胆碱、它们的C1-10烷基酯(例如甲基、异丙基和叔丁基)和它们的单-和二甘油酸酯(即油酸酯、月桂酸酯、癸酸酯、肉豆蔻酸酯、棕榈酸酯、硬脂酸酯、亚油酸酯等)(Lee等，Critical Reviews in TherapeuticDrug Carrier System，1991，p.92；Muranishi，Critical Reviews in TherapeuticDrug Carrier System，1990，7，1-33；EI Hariri等，J.Pharm.Pharmacol.，1992，44，651-654)，每一篇全文结合于此作为参考。
胆汁盐：胆汁的生理作用包括促进脂质和脂溶性维生素的分散和吸收(Brunton，Chapter 38 in：Goodman和Gilman’s The Pharmacological Basis ofTherapeutic，第9版，Hardman等编，Mcgraw-Hill，New York，1996，pp.934-935)。各种天然的胆汁盐和它们的合成的衍生物作为穿透增强剂。因此，术语“胆汁盐”包括任何天然存在的胆汁组分以及它们的任何合成衍生物。本发明的胆汁盐包括例如胆酸(或其药学上可接受的钠盐，胆酸钠)、脱氢胆酸(脱氢胆酸钠)、脱氧胆酸(脱氧胆酸钠)、葡糖胆酸(葡糖胆酸钠)、甘胆酸(甘胆酸钠)、甘氨脱氧胆酸(甘氨脱氧胆酸钠)、牛磺胆酸(牛磺胆酸钠)、牛磺脱氧胆酸(牛磺脱氧胆酸钠)、鹅脱氧胆酸(鹅脱氧胆酸钠)、乌索脱氧胆酸(UDCA)、牛磺-24，25-二氢-梭链孢酸钠(STDHF)、甘氨二氢梭链孢酸钠和聚氧乙烯-9-月桂基醚(POE)(Lee等，Critical Reviews inTherapeutic Drug Carrier System，1991，92页；Swinyard，39章In：Remington′s Pharmaceutical Science，18版，Gennaro，编，Mack PublishingCo.，Easton，Pa.，1990，782-783页；Muranishi，Critical Reviews inTherapeutic Drug Carrier System，1990，7，1-33；Yamamoto等.，J.Pharm.Exp.Ther.，1992，263，25；Yamashita等，J.Pharm：.Sci.，1990，79，579-583)。
螯合剂：在上下文中，可以认为螯合剂是能从溶液中除去金属离子(通过与其形成络合物)的化合物，结果是增强了寡核苷酸透过粘膜的吸收。关于它们作为本发明的穿透增强剂的应用，螯合剂还具有作为脱氧核糖核酸酶抑制剂的附加优点，因为大多数表征的DNA核酸酶的催化需要二价的金属离子，因而会被螯合剂抑制(Jarrett，J.Chromatogr.，1993，618，315-339)。没有限制，螯合剂包括乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、柠檬酸、水杨酸盐(例如水杨酸钠、5-甲氧基水杨酸盐和高香兰酸盐(homovanilate))、胶原的N-酰基衍生物、laureth-9和β-二酮的N-氨基酰基衍生物(烯胺)(Lee等，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier System，1991，92页；Muranishi，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems，1990，7，1-33；Buur等，J.Control Rel.，1990，14，43-51)。
非螯合非表面活性剂：如本文所使用的，非螯合非表面活性剂的穿透增强化合物是这样的化合物，其未表现出显著的螯合剂或表面活性剂活性，但是仍然能增加寡核苷酸透过消化器官粘膜的吸收(Muranishi，CriticalReviews in Therapeutic Drug Carrier Systems，1990，7，1-33)。这样的穿透增强剂的实例包括不饱和的环脲、1-烷基-和1-链烯基氮杂环-烷酮衍生物(Lee等，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems，1991，第92页)；和非甾族化合物的抗炎剂，例如双氯芬酸钠、吲哚美辛和保泰松(Yamashita等，J.Pharm.Pharmacol.，1987，39，621-626)。
还可以向本发明的药物和其它组合物和制剂中加入能增加细胞水平的寡核苷酸摄入的试剂。例如，还已知阳离子脂质例如脂转染试剂(Junichi等，美国专利号5,705,188)、阳离子甘油衍生物和聚阳离子分子例如聚赖氨酸(Lollo等，PCT申请WO 97/30731)能增强寡核苷酸的细胞摄入。
可以利用其它试剂来增强施用的核酸的穿透，包括二醇例如乙二醇和丙二醇，吡咯例如2-吡咯、氮酮(azones)和萜类例如苧烯和薄荷酮。
载体
本发明的某些组合物还在制剂中含有载体化合物。如本文所使用的，“载体化合物”或“载体”是指核酸或其类似物，其是惰性的(即本身不具有生物活性)，但是在体内过程中被认为是核酸，其能降低具有生物活性的核酸的生物利用度，例如通过降解生物活性的核酸或促进其从循环中的除去实现。核酸和载体化合物的共同施用(后一种物质经常过量)可以实质上减少肝、肾或其它循环外的贮器中回收的核酸的量。例如，当与聚肌苷酸、葡聚糖硫酸酯、polycytidic acid或4-乙酰酰胺基-4’-异硫代氰基-鎓-2，2-二磺酸共同施用时，可以部分地减少硫代磷酸酯寡核苷酸在肝组织中的回收(Miyao等，Antisense Res.Dev.，1995，5，115-121；Takakura等，Antisense&Nucl.Acid Drug Dev.，1996，6，177-183)，每一篇全文结合于此作为参考。
赋形剂
与载体化合物不同，“药物载体”或“赋形剂”是药学上可接受溶剂、混悬剂或任何其它的药理学上惰性的载体，其用于给动物输送一种或多种核酸，典型地是液体或固体。当与核酸和特定药物组合物的其它组分组合时，参考意欲的给药方式，通常选择药物载体来提供理想的容积、稠度等。典型的药物载体包含但不限于粘合剂(例如预胶凝的玉米淀粉、聚乙烯基吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素等)；填充剂(例如乳糖和其它糖、微晶纤维素、果胶、明胶、硫酸钙、乙基纤维素、聚丙烯酸酯或磷酸氢钙等)；润滑剂(例如硬脂酸镁、滑石、硅石、胶体二氧化硅、硬脂酸、金属的硬脂酸盐、还原的植物油、玉米淀粉、聚乙二醇、苯甲酸钠、醋酸钠等)；崩解剂(例如淀粉、羟基乙酸淀粉钠(sodium starch glycotate)等)；和湿润剂(例如十二烷基硫酸钠等)。
适合于非肠胃外施用、且不会与核酸发生有毒反应的药学上可接受的有机的或无机的赋形剂也可以用于制备本发明的组合物。合适的药学上可接受的载体包括但不限于水、盐溶液、醇、聚乙二醇、明胶、乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘石蜡、羟甲基纤维素、聚乙烯基吡咯烷酮等。
用于核酸的局部施用的制剂可以包含在普通溶剂(例如醇)中的无菌的和非无菌的水性溶液、非水性溶液，或在液体或固体油基质中的核酸溶液，所述常规溶剂例如醇。溶液还可以含有缓冲剂、稀释剂和其它的合适的添加剂。可以使用适合于非肠胃外施用、且不会与核酸发生有毒反应的药学上可接受的有机的或无机的赋形剂。
其它的药物组合物组分
本组合物还可以含有其它本领域熟知用量的在药物组合物中常用的组分。因而，例如，组合物可以含有其它的、可相容的药学上有活性的物质，例如抗痒剂、收敛剂、局部麻醉剂或抗炎剂，或者可以含有在物理配制本发明的组合物的各种剂型中有用的其它物质，例如染料、调味剂、防腐剂、抗氧剂、遮光剂、增稠剂和稳定剂。但是，当加入了这样的物质时，它们不应当不合适地干扰本发明的组合物组分的生物活性。制剂可以是无菌的，在需要时可以与助剂混合，例如润滑剂、防腐剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂、用于调节渗透压的盐、缓冲剂、着色剂、矫味剂和/或芳族物质等，它们不与制剂中的核酸发生有害的相互作用。
水性混悬液可以含有能提高混悬液粘度的物质，包括例如羧甲基纤维素钠、山梨醇和/或葡聚糖和/或稳定剂。
本发明的某些实施方案提供了药物组合物，其含有(a)一种或多种抗病毒的寡核苷酸和(b)一种或多种其它的通过不同机制发挥作用的化疗剂。
这样的化疗剂的实例包含但不限于柔红霉素、道诺霉素、放线菌素D、多柔比星、表柔比星、伊达比星、依索比星、博来霉素、马磷酰胺、异环磷酰胺、阿糖胞苷、二氯乙基硝基脲、白消安、丝裂霉素C、放线菌素D、普卡霉素、泼尼松、羟孕酮、睾酮、他莫昔芬、达卡巴嗪、丙卡巴肼、六甲蜜胺、五甲蜜胺、米托蒽醌、安吖啶、苯丁酸氮芥、甲基环己基硝基脲、氮芥、美法仑、环磷酰胺、6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氮杂胞嘧啶核苷、羟基脲、脱氧考福霉素、4-羟基过氧环磷酰胺、5-氟代尿嘧啶(5-FU)、5-氟代脱氧尿核苷(5-FUdR)、甲氨喋呤(MTX)、秋水仙碱、泰素、长春新碱、长春碱、依托泊苷(VP-16)、三甲曲沙、伊立替康、托泊替康、吉西他滨、替尼泊苷、顺铂和己烯雌酚(DES)。一般地参见，TheMerck Manual of Diagnosis and Therapy，第15版，1987，1206-1228页，Berkow等，编，Rahway，NJ。当与本发明的化合物使用时，这样的化疗剂可以个别地(例如5-FU和寡核苷酸)、依次地(例如使用5-FU和寡核苷酸一段时间后再用MTX和寡核苷酸一段时间)或与一种或多种其它的这样的化疗剂(例如5-EU、MTX和寡核苷酸或5-FU、放疗和寡核苷酸)组合使用。抗炎药包括但不限于非甾族化合物的抗炎药和皮质甾类和抗病毒药，包括但不限于利巴韦林、西多福韦、阿糖腺苷、无环鸟苷和更昔洛韦，也可以组合在本发明的组合物中。一般地参见，The Merck Manual ofDiagnosis and Therapy，第15版，Berkow等，编，1987，Rahway，NJ.，第2499-2506和46-49页)。其它的非寡核苷酸化疗剂也在本发明的范围内。两种或多种组合的化合物可以一起或依次地使用。
实施例
实施例1：单纯疱疹病毒
单纯疱疹病毒(HSV)影响相当一部分人群。本发明发现，随机ODN或ODN随机物能抑制病毒(例如HSV)的感染。通过在VERO细胞(对HSV-1(毒株KOS)和HSV-2(毒株MS2)感染敏感)中进行的细胞HSV复制试验发现，与HSV复制起点互补的单链的PS-ODN能抑制HSV-1和HSV-2的复制。令人惊奇的是，与人(343ARS)和质粒(pBR322/pUC)起点互补的对照PS-ODN也能抑制病毒的感染性。用随机序列PS-ODN和PS-ODN随机物的实验表明，病毒感染的抑制随着ODN大小的增加而增强。这些数据表明，ON是治疗性治疗病毒感染的有效的抗病毒剂。
发明人已经认为，阻止病毒(例如HHV)传播的潜在机制是阻止了其DNA的复制。鉴于此，将与HSVl和HSV2的复制起点互补的硫代磷酸酯寡核苷酸(ODN)导入受感染的细胞。这些ODN会导致在病毒复制起点形成DNA三倍体，阻断必要的反式作用因子和病毒DNA复制的关联。在本文中描述了这些实验的意外结果，它们表明，在实验范例中，ODN抑制病毒感染的效力随着它们的大小(长度)的增加而增加。
HSV-1的抑制
在噬斑减少试验(PRA)中检测了PS-ODN抑制HSV-1的能力。在MEM(最低必需培养基)+10％胎牛血清(补充了庆大霉素、万古霉素和两性霉素B)中，在37℃和5％CO2下培养无限繁殖的非洲绿猴肾(VERO)细胞。将细胞接种到12孔平板中，其密度是在生长4天后能生成汇合的细胞单层。达到汇合后，将培养基换成仅含有5％血清+如上所述的补充物，并在有测试化合物存在的情况下将细胞暴露于HSV-1(菌株KOS，共约40-60PFU)中90分钟。病毒暴露后，将培养基替换为新的“覆盖”培养基，其含有5％血清、1％人免疫球蛋白、如上所述的补充物和测试化合物。感染后3-4天，对受感染的培养物进行福尔马林固定和甲苯紫(cresylviolet)染色，并进行噬斑计数。
所有的ON(除另有说明外)都是在University of Calgary Core DNAServices lab合成的。ON(见表1)是在1或15μmol的合成规模制备的，并在50cm Sephadex G-25柱上去保护和脱盐。通过UV成影凝胶电泳分析得到的ON，经测定含有全长的约95％、n-1和n-2寡聚物和至多5％的短寡聚物种类(假定它们具有随机缺失)。为了随机寡聚物的合成，将等摩尔量的腺嘌呤、鸟苷、胞嘧啶和胸苷amidite混合到一起，以使在合成过程中在ODN的每个位置整合的随机性最大。
为了测试PS-ODN是否能抑制HSV-1，在HSV-1PRA中测试了REP1001、2001和3007。预期只有REP2001将会表现出任意活性，因为该PS-ODN指向HSV的复制起点(其它的2种是指向人和质粒的复制起点)。但是，所有的3种PS-ODN都表现出抗-HSV-1活性(见图1)。而且，抗-HSV-1作用的效力取决于寡聚物的大小(见图2)。
为了证实PS-ODN的抗-HSV-1活性的大小依赖性和相对的序列独立性，我们试验了不同大小的PS-ODN(REP2002、2003、2004、2005和2006)。通过将每个碱基合成为“摆动”(N)，使每种PS-ODN实际上代表一群具有相同大小的不同随机序列，为这些PS-ODN提供关于序列特异性作用的惰性，这些PS-ODN称作“随机物”。当在HSV-1PRA中测试这些寡聚物时，我们发现，10个或更少碱基的寡聚物没有可检测出的抗-HSV-1活性，但是随着PS-ODN的大小增加到10个碱基以上，效力也增加(IC50减少，见图3和4)。我们还注意到，超过20个碱基的PS-ODN的IC50值明显低于临床上接受的抗-HSV-1药物-无环鸟苷(见图4)。
为了更好地定义PS-ODN的抗-HSV-1活性的有效大小范围，我们测试了覆盖较宽的大小范围(10～120个碱基)的PS-ODN随机物(见图5和6)。我们发现，12个和更大的碱基的寡聚物具有可检测出的抗-HSV-1活性，对HSV-1的效力也随着增加的PS-ODN随机物的长度(至少高达120个碱基)而增加。但是，在超过40个碱基的PS-ODN随机物中，每增加碱基大小，效力的增加更小(见图7)。
为了对比非PS-ODN随机物、随机序列PS-ODN和HSV-1特异性序列PS-ODN的效力，我们试验了在大小为10、20和40个碱基的ODN中的这3种类型的修饰(见图8和9)。未修饰的ODN随机物在测试的大小没有可检测的抗-HSV-1活性(见图8a-c)。随机序列和特异性的HSV-1序列PS-ODN都表现出大小依赖性的抗-HSV-1活性(对于这些修饰的任一个，在10个碱基中没有观察到活性，见图8d和g)。随机序列、特异性的HSV-1序列和随机物PS-ODN的对比(见图10)表明，对于长度为20个碱基的PS-ODN，特异性的HSV-1序列具有增强的抗-HSV-1活性，但是在40个碱基的长度，随机物、随机序列或特异性的HSV-1序列的所有修饰对HSV-1的有效性相同。
据我们所知，这是首次报道的PS-ODN对HSV-1的IC50低至0.059μM和0.043μM。
实施例2：HSV-2的抑制
在PRA中检测了PS-ODN抑制HSV-2的能力。在MEM+10％胎牛血清(补充了庆大霉素、万古霉素和两性霉素B)中，在37℃和5％CO2下培养无限繁殖的非洲绿猴肾(VERO)细胞。将细胞接种到12孔平板中，其密度是在生长4天后能生成汇合的细胞单层。达到汇合后，将培养基换成仅含有5％血清+如上所述的补充物，并在有测试化合物存在的情况下将细胞暴露于HSV-2(菌株MS2，共约40-60PFU)中90分钟。病毒暴露后，将培养基替换为新的“覆盖”培养基，其含有5％血清、1％人免疫球蛋白、如上所述的补充物和测试化合物。感染后3-4天，对受感染的培养物进行福尔马林固定和甲苯紫染色，并进行噬斑计数。
为了测试PS-ODN是否能抑制HSV-2，在HSV-2PRA中测试了REP1001、2001和3007。预期只有REP2001将会表现出任意活性，因为该PS-ODN指向HSV-1/2的复制起点(其它的2种是指向人和质粒的复制起点)。但是，所有的3种PS-ODN都表现出抗-HSV-2活性(见图12)。而且，抗-HSV-2作用的效力依赖于PS-ODN的大小且独立于序列(见图13)。
为了证实PS-ODN的抗-HSV-2活性的大小依赖性和序列独立性，我们试验了不同大小的PS-ODN(REP2001、2002、2003、2004、2005和2006)。通过将每个碱基合成为“摆动”(N)，使每种PS-ODN实际上代表一群具有相同大小的不同随机序列，为这些PS-ODN提供关于序列特异性作用的惰性，这些PS-ODN称作“随机物”。当在HSV-2PRA中测试这些PS-ODN时，我们发现，10个或更少碱基的PS-ODN没有可检测出的抗-HSV-2活性，但是随着PS-ODN的大小增加到10个碱基以上，效力也增加(IC50减少，见图14和15)。我们还注意到，超过20个碱基的PS-ODN的IC50值明显低于临床上接受的抗-HSV-2药物-无环鸟苷TM(见图15)。
据我们所知，这是首次报道的PS-ODN对HSV-2的IC50低至0.012μM。
为了确定非特异性的序列组合物是否对ON的抗病毒活性有影响，测试了几种大小等同但是在其序列组成有差别的PS-ODN在HSV-1PRA中的抗-HSV-1活性。测试的PS-ODN是REP2006(N20)、REP2028(G40)、REP2029(A40)、REP2030(T40)和REP2031(C40)。从HSV-1PRA得到的IC50值(见图37)表明，REP2006(N40)显然是所有的测试序列中最有活性的，而REP2029(A40)则是最少活性的。我们还注意到，所有其它的PS-ODN的活性都明显不如N40，它们按照功效的排列次序是N40＞C40＞T40＞A40＞＞G40。
我们还测试了具有不同的序列成(含有2种不同的核苷酸)的不同PS ODN的功效(见图37b)。PS-ODN随机物(REP2006)对HSV-1的功效明显比AC20(REP2055)、TC20(REP2056)或AG20(REP2057)高，它们的功效排列如下：N40＞AG＞AC＞TC。该数据表明，尽管抗病毒作用是非序列互补的，某些非特异性的序列组成(即C40和N40)具有最有效的抗病毒活性。我们认为可以通过下述事实解释该现象，即虽然保留了固有的蛋白结合能力，C40、A40、T40和G40等序列高亲和力地结合更少的病毒蛋白，可能是由于在这些序列中形成了一些限制性的三级结构。另一方面，由于N40的随机性质，限制了其高亲和力地结合广范围的抗病毒蛋白的能力，这有助于其强大的抗病毒活性。
实施例3：CMV抑制
在噬斑减少试验(PRA)中检测了PS-ODN抑制CMV的能力。该试验与用于测试抗HSV-1和抗-HSV-2的试验相同，只是用CMV(菌株ADl69)作为病毒接种物，用人成纤维细胞作为细胞宿主。
为了测试PS-ODN的抗-CMV活性的大小依赖性和序列独立性，我们试验了不同大小的PS-ODN随机物(见图16a、b)。当在CMV PRA中测试这些PS-ODN时，我们发现，随着PS-ODN大小的增加，效力也增加(IC50减少，见图16c)。
为了更清楚地说明PS-ODN的抗CMV活性的有效大小范围，我们测试了覆盖较宽大小范围(10～80个碱基)的PS-ODN随机物。我们还包含了几种临床上接受的小分子CMV治疗剂(丙氧鸟苷、膦甲酸和西多福韦)和2种市售的CMV视网膜炎的反义治疗剂(福米韦生TM；市场上买到的和由University of Calgary合成)(见图17)。我们发现，尽管增加的PS-ODN随机物大小导致增强的功效，该作用在40个碱基时饱和(见图18)。而且，20、40和80个碱基的PS-ODN随机物都明显比测试的任何小分子治疗剂更有效(图17)。另外，40和80个碱基的PS-ODN随机物比福米韦生TM更有效。
据我们所知，这是首次报道的PS-ODN对CMV的IC50低至0.067μM。
实施例4：HIV-1的抑制
通过2个不同的试验检测了PS-ODN随机物抑制HIV-1的能力：
细胞病变作用(CPE)
通过使用MTT染料报告细胞代谢的程度，监测细胞病变作用。在补充了抗生素的MEM+10％胎牛血清中，在37℃和5％CO2中培养无限繁殖的人淋巴细胞(MT4)细胞。将细胞接种到96孔平板的含有合适的测试化合物的培养基中，孵育2小时。在用测试化合物预孵育后，向孔中加入HIV-1(毒株NL4-3)(0.0002TCID50/细胞)。另外孵育6天后，通过MTT转化监视CPE。在不接种病毒的情况下，通过孵育药物6天来检测细胞毒性。为了将MTT吸收值转化成％存活率，将未受感染、未处理的细胞的吸收值设定为100％，将受感染、未处理的细胞的吸收值设定为0％。
复制试验(RA)
在无限繁殖的人胚肾(293A)细胞中监测了HIV的复制能力。这些细胞是用2种质粒共转染的。一种质粒含有具有被荧光素酶表达盒中断的env基因的重组的野生型HIV-1基因组(NL4-3)(鉴别为毒株CNDO)，另一种质粒含有来自鼠白血病病毒(MLV)的env基因。这两种质粒提供了所有的蛋白因子，它们翻译后生成成熟的嵌合病毒，其含有除了从MLV env基因翻译生成的蛋白产物之外的所有HIV-1组分。从这些细胞生产的病毒粒子是感染性的和可复制的，但是不能生产感染性病毒粒子的下一代，因为它们缺少env基因产物。
转染后24小时，将这些细胞胰蛋白酶化，涂布到96孔平板中。细胞已经粘附后，洗涤培养基，并替换为含有测试化合物的培养基。另外继续生产病毒24小时。然后收获上清液，用于重感染原初293A细胞。通过荧光素酶基因产物鉴别出受感染的原初细胞。荧光素酶阳性的细胞数量是重组HIV-1的复制和/或感染程度的尺度。通过使用具有几个点突变(已知会诱导对几种不同类型的抗-HIV药物的抗性)的HIV-1基因组，还可以用该试验测试对许多临床上接受的抗-HIV-1药物的抗性。将没有可检测的荧光素酶阳性的细胞的抑制百分比设定为100％，在受感染的、未处理的对照组中的阳性细胞的数量为0％。
为了测试PS-ODN的抗-HIV-1活性的大小依赖性和序列独立性，我们试验了不同大小的PS-ODN随机物。当在HIV-1CPE试验中测试这些PS-ODN时，我们发现，随着PS-ODN大小的增加，效力也增加(IC50减少，见图19a、b和20)。我们还注意到，PS-ODN随机物在该试验中没有表现出对宿主细胞的显著毒性(见图19c、d)。
据我们所知，这是首次报道的PS-ODN对HIV-1的IC50低至0.011μM。
为了更清楚地说明PS-ODN的抗HIV-1活性的有效大小范围，我们通过使用野生型HIV-1(重组NL4-3(CNDO))的RA测试了更多的覆盖较宽大小范围(10～80个碱基)的PS-ODN随机物。另外，我们还测试了4种目前用于临床的蛋白酶抑制剂(氨普奈韦(aprenavir)、茚地那韦、洛匹那韦和沙奎那韦)。我们发现，10个和更大碱基的PS-ODN随机物具有抗-HIV-1活性，且抗-HIV-1功效也随着PS-ODN随机物长度的增加而增加，但是在40个碱基时饱和(见图21e-h和图22b)。而且，40和80个碱基的PS-ODN随机物的功效几乎与4种临床的对照相同(见图21a-d和22a)。
据我们所知，这是首次报道的PS-ODN对HIV-1的IC50低至0.014μM。
为了测试PS-ODN随机物抑制HIV的药物抗性毒株的能力，我们使用HIV-1的重组MDRC4毒株复制了上述试验。该重组毒株对来自所有种类的至少16种不同的临床上接受的药物表现出显著的抗性：核苷酸RT抑制剂、非核苷酸RT抑制剂和蛋白酶抑制剂。所有PS-ODN随机物对抗性毒株的表现与它们对野生型毒株的相同(见图23e-h)。但是，4种蛋白酶抑制剂中的3种表现出对突变株的功效的降低(见图23a-d和24)，所以现在40和80个碱基的PS-ODN随机物比这些药物对该抗性毒株更有效。
实施例5：RSV的抑制
通过alamar blue监视CPE(细胞代谢的间接检测)，检测了PS-ODN随机物抑制RSV的能力。在MEM+5％胎牛血清中，在37℃和5％CO2培养人喉癌(Hep2)细胞。将细胞接种到96孔平板中，其密度是能在生长5-6天后产生汇合的细胞单层。接种后，在存在减少体积测试化合物的情况下，用RSV(毒株A2，108.2TCID50/ml)感染细胞2小时。孵育后，将培养基换掉，并补加测试化合物。感染后6天，通过检测alamar blue的荧光转变监测CPE。通过处理未受感染的细胞7天并检测这些细胞中的alamar blue转变，监测测试化合物在Hep2细胞中的毒性。在未受感染的、未处理的细胞中的alamar blue读数设定为100％存活率，在受感染的、未处理的细胞中的读数设定为0％存活率。
为了证实PS-ODN的抗-RSV活性的大小依赖性和序列独立性，我们试验了不同大小的PS-ODN随机物。另外，我们测试了临床上接受的用于RSV感染、利巴韦林(三唑核苷制剂TM)的治疗剂。当在RSV CPE试验中测试时，我们发现，随着PS-ODN随机物大小的增加，功效也增加，但是在40个碱基大小时饱和(见图25a-c和26)。我们还注意到，20、40和80个碱基的PS-ODN随机物的IC50值明显比临床上接受的抗-RSV药物-利巴韦林更低(见图25a-d和26)。PS-ODN随机物在Hep2细胞中没有表现出毒性，但是利巴韦林明显有毒性(治疗指数＝2.08，见图25e-h)。
据我们所知，这是首次报道的PS-ODN对RSV-1的IC50低至0.015μM。
实施例6：柯萨奇病毒B2的抑制
通过alamar blue监视CPE(细胞代谢的间接检测)，检测了PS-ODN随机物抑制COX B2的能力。在MEM+5％胎牛血清中，在37℃和5％CO2培养恒河猴肾(LLC-MK2)细胞。将细胞接种到96孔平板中，其密度是能在生长5-6天后产生汇合的细胞单层。接种后，在存在减少体积的测试化合物的情况下，用COX B2(毒株Ohio-1，107.8TCID50/ml)感染细胞2小时。孵育后，将培养基换掉，并补加测试化合物。感染后6天，通过检测alamarblue的荧光转变监测CPE。通过处理未受感染的细胞7天并检测这些细胞中的alamar blue转变，监测测试化合物在LLC-MK2细胞中的毒性。在未受感染的、未处理的细胞中的alamar blue读数设定为100％存活率，在受感染的、未处理的细胞中的读数设定为0％存活率。
我们在COX B2CPE试验中测试了REP2006的抗-COX B2活性。我们发现，尽管在LLC-MK2细胞中表现出一些轻微毒性(见图27b)，该PS-ODN随机物能使受感染的LLC-MK2细胞部分地从COX B2感染状态获救(见图27a)。
实施例7：牛痘病毒的抑制
我们使用牛痘感染模型测量了我们的化合物对痘病毒(包括天花病毒)的潜在功效。通过alamar blue监测CPE(细胞代谢的间接检测)，检测了PS-ODN随机物抑制牛痘的能力。在MEM+5％胎牛血清中，在37℃和5％CO2培养Vero细胞。将细胞接种到96孔平板中，其密度是能在生长5-6天后产生汇合的细胞单层。接种后，在存在减少体积的测试化合物的情况下，用牛痘(107.9TCID50/ml)感染细胞2小时。孵育后，将培养基换掉，并补加测试化合物(除了西多福韦是在50μM外，都在10μM)。感染后5天，收集上清液。通过用1∶100稀释的上清液重新感染VERO细胞、并在重新感染后7天通过检测alamar blue的荧光转变来监测CPE，检测上清液中的病毒负载。
我们试验了不同大小的PS-ODN随机物(REP2004、2006和2007)。另外，我们试验了用于牛痘感染的已知有效的治疗剂-西多福韦(西多福韦注射剂TM)。当在牛痘CPE试验中测试时，我们发现，REP2004、2006和2007的治疗都表现出抗病毒活性(即，产生的上清液在重新感染后表现出减少的CPE)，但是该活性比用西多福韦时观察到的弱(见图36)。
实施例8：DHBV、副流感病毒-3病毒和汉坦病毒的抑制。
因为DHBV、副流感病毒-3病毒和汉坦病毒不能容易地产生可检测的噬斑或CPE，我们利用荧光灶形成单位(FFFU)检测测试了REP2006在这些病毒中的功效。在该试验中，将REP2006(终浓度为10μM)与随后吸附到细胞上的病毒相混合。吸附后，将受感染的细胞再孵育7-14天，在这时用甲醇固定它们。通过针对合适的病毒抗原的免疫荧光显微法，检测了病毒复制区。对于测试的3种病毒中的每一种，具体的实验条件和结果是如下所述：
Figure GDA00003120185900721
该原始数据表明，在10μM时，REP2006有效地抑制DHBV、副流感病毒-2和汉坦病毒。我们预期，在初步试验中给定的强反应，IC50值会更低。这些数据支持了PS-ODN随机物用于治疗汉坦病毒和乙型肝炎(与DHBV密切相关)的人感染的功效，并提供了即时治疗RSV和副流感病毒-3造成的小儿细支气管炎的基本原理，其在治疗开始时可能不需要区别诊断。
实施例9：目前的非反应性病毒
迄今为止，当在下面的病毒系统中不使用输送系统、药物组合或化学修饰时，我们还没有观察到PS-ODN随机物(至多10μM)的可检测的抗病毒功效：
Figure GDA00003120185900731
在本试验方法中，我们没有证实活性。但是，抗病毒活性的缺失可能是由于PS-ODN在该试验条件下的更低的细胞穿透。但是，进行了其它试验来完成这些病毒的功效结果。当为了提高其胞内浓度而使用输送系统(例如脂质体制剂)时，这些病毒可以对PS-ODN发生反应。另外，当与其它的抗病毒药(例如本文所述的)组合时，PS-ODN可以表现出对这些病毒的抗病毒功效。用于提高胞内浓度的化学修饰还可以用来提供对这些病毒的PS-ODN活性。
由于我们具有有力的证据，即PS-ODN的电荷特征对于抑制来自几种不同家族的病毒是重要的，我们预期该抑制病毒活性的电荷依赖性的机制具有抑制所有包壳病毒的活性的潜力。其必然的结果是，没有检测到针对实施例9所列出的那些病毒的抗病毒功效表明，PS-ODN和这些病毒的结构蛋白之间的相互作用的强度不足以阻止病毒蛋白在这些病毒复制过程中的相互作用。实现针对这些病毒的功效的一种方式是，改变DNA或抗病毒聚合物的电荷特征(例如在DNA用二硫代磷酸酯取代硫代磷酸酯键)，从而增强它们对病毒蛋白的亲和力。
实施例10：检测寡核苷酸是否主要通过非序列互补的作用方式发挥作用的试验
如果能满足下述的3个试验中的任何一个的标准，则认为目标ON(例如ODN)是主要通过非序列互补的作用方式发挥作用。
试验#1-对抗病毒功效的部分简并作用
该试验用于检测特定ON序列在其部分序列被简并时的抗病毒活性。如果具有相同化学性质的简并ON保留了其下述活性，则认为它是主要通过非序列互补的作用方式发挥作用。将根据下述规则使ON简并：
LON＝原始ON中的碱基数目
X＝要简并的寡聚物的每个末端上的碱基数目(但是具有与原始ON相同的化学性质)
如果LON是奇数，那么X＝LON/4
如果LON是偶数，那么X＝(LON/4)的整数部分+1
每个简并碱基应当根据任意的合适方法学合成，例如本文所述的用于合成PS-ODN随机物的方法学。
如果声称ON对疱疹病毒科、逆转录病毒科或副粘病毒科家族的成员具有抗病毒活性，将使用本文所述的病毒家族、优选地使用所述的病毒株的试验生成IC50。如果声称ON对上面没有提到的具体病毒家族的成员具有抗病毒活性，则通过制药工业接受的抗病毒功效试验生成IC50值。使用最少7个化合物浓度生成IC50值，在剂量反应曲线的线性区域有3个或更多的点。使用该试验，将所述ON的IC50与其简并副本进行了对比。如果25个和更少碱基的ON的简并ON的IC50比原始ON大2倍以下，或者26个或更多碱基(基于最小三重检测，标准偏差不超过平均值的15％)的ON的简并ON的IC50比原始ON大10以下，那么应当认为ON是主要通过非序列互补的作用方式发挥作用。
试验#2-随机物的功效对比
该试验用于对比ON的抗病毒功效和在相同病毒或病毒家族中的具有等同大小和相同化学性质的随机物ON的抗病毒功效。
如果声称ON对疱疹病毒科、逆转录病毒科或副粘病毒科家族的成员具有抗病毒活性，将使用本文所述的病毒家族、优选地使用所述的病毒株的试验生成IC50。如果声称ON对上面没有提到的具体病毒家族的成员具有抗病毒活性，则通过制药工业接受的抗病毒功效试验生成IC50。使用最少7个化合物浓度生成IC50值，在剂量反应曲线的线性区域有3个或更多的点。使用该试验，将ON的IC50与等同大小和相同化学性质的ON随机物进行了对比。如果25个和更少碱基的ON的简并ON的IC50比原始ON大2倍以下，或者26个或更多碱基(基于最小三重检测，标准偏差不超过平均值的15％)的ON的简并ON的IC50比原始ON大10倍以下，那么应当认为ON是主要通过非序列互补的作用方式发挥作用。
试验#3-不同病毒家族的功效对比
该试验用于对比ON对靶病毒(其基因组与ON同源)的功效和ON对第二种病毒(其基因组与ON没有同源性)的功效。在许多情况下，不同的病毒将选自与靶病毒的病毒家族不同的病毒家族。使用在2种病毒中的相同长度和化学性质的随机物的活性标准化从2种病毒得到的ON的IC50值，对比了靶病毒和第二种病毒中的ON的相对活性。
因而，如果声称ON对某种病毒具有抗病毒活性，则使用本文所述的疱疹病毒科、逆转录病毒科或副粘病毒科家族的试验之一或本领域已知的其它试验在该病毒中确定IC50的生成。类似地，使用本文所述的一种病毒(其基因组与ON的序列没有同源性)试验，将生成针对第二种病毒的ON的IC50。还生成了等同大小和化学性质的随机物对每种病毒的IC50。用随机物对2种病毒的IC50功效标准化下述具体ON的IC50值：
1.对第一种(同源的)病毒的ON和随机物的IC50进行代数变换，使随机物的IC50现在是1。
2.对第二种(非同源的)病毒的ON和随机物的IC50进行代数变换，使随机物的IC50现在是1。
3.用变换的同源病毒中的ON的IC50除变换的非同源病毒中的ON的IC50，计算在同源的和非同源的病毒中ON的IC50的倍数差异。
对于长度低于25个碱基的ON，如果倍数差异低于2，应当认为ON通过非序列互补的作用方式发挥作用。对于长度为25个碱基或更大的ON，如果倍数差异低于10，应当认为ON通过非序列互补的作用方式发挥作用。
试验#4：不同病毒家族的功效
该试验用于确定ON是否对病毒具有药物样活性，其中所述ON的序列不与病毒基因组的任何部分同源。因而，应当使用本文所述的疱疹病毒科、逆转录病毒科或副粘病毒科的试验之一检测ON，使测试的ON的序列不与要使用的病毒基因组的任何部分同源。应使用最少7个ON浓度生成IC50值，在线性范围有3个或更多的点。如果得到的剂量反应曲线指示药物样活性(其典型地表现为衰减或S形曲线，随着ON浓度的降低，抗病毒功效也减少)且从所述曲线生成的IC50低于1μM，应当认为ON具有药物样活性。如果认为ON对病毒具有药物样活性，且ON不与该病毒互补、因而不具有依赖于互补序列的活性，应当认为是通过非序列互补的作用方式发挥作用。
在这些试验中使用的阈值
在科研或工业领域，都没有科学的或经验的基础来设计大于25个碱基的反义ON。另外，据我们所知，还没有在任何人试验中施用的ON制剂，其使用大于25个核苷酸的ON。
鉴于这些事实，我们已经建立了2个不同的阈值，我们用它们将序列定义为主要通过非序列互补的作用方式发挥作用。对于25和更少碱基的寡聚物，如果要被认为主要是通过反义机制发挥作用，ON的抗病毒活性必须是相同化学性质的随机物或简并ON的至少2倍。如果反义ON不是随机物或简并ON的至少2倍，那么我们的结论是，其活性的多半可以归因于非反义的作用方式。
对于26个和更大碱基的ON，如果要被认为是通过反义机制发挥作用，ON的抗病毒活性必须是相同化学性质的随机物或简并ON的至少10倍(1log)。我们关于该更大阈值的基本原理是，鉴于本领域目前的反义ON设计的状态，可以合理地假设，26个碱基和更大的、且声称具有抗病毒活性的寡聚物是利用本文所述的发明知识来设计的(通常可接受的反义ON的最佳长度是在16和21个碱基之间)。
在上面的试验1～3中所述的阈值是缺省阈值。如果特别说明，其它的阈值也可以用于对比上述的试验1～3中。因此，例如，对于长度低于25个碱基的ON和/或长度为25个或更多碱基的ON，如果特别说明，用于检测ON是否主要通过非序列互补的作用方式发挥作用的阈值可以是10倍、8倍、6倍、5倍、4倍、3倍、2倍、1.5倍或相等中的任一个。在上面的试验4中所述的阈值也是缺省阈值。如果特别说明，用于检测试验4中的ON是否主要通过非序列互补的作用方式发挥作用的阈值可以是小于1μM、0.8μM、0.6μM、0.5μM、0.4μM、0.3μM、0.2μM或0.1μM的IC50。类似地，尽管缺省的是满足上述4个试验中的任一个就足够，如果特别说明，可以要求ON在缺省阈值时能满足任意2个(例如，试验1&2，1&3，1&4，2&3，2&4，3&4)或任意3个(1&2&3，1&3&4，2&3&4)或全部4个试验，或者如果特别说明，在如上所述的另一个阈值。
对疱疹病毒科的抗病毒试验
如下进行噬斑减少试验：
对于HSV-1或HSV-2，在补充了10％热灭活的胎牛血清和庆大霉素、万古霉素和两性霉素B的MEM中，在37℃和5％CO2下，使VERO细胞(ATCC#CCL-81)在12孔组织培养板(NUNC或等同物)中生长至汇合。达到汇合后，将培养基换成如上所述的含有5％胎牛血清和抗生素的培养基，其添加了HSV-1(毒株KOS，共40-60PFU)或HSV-2(毒株MS2，共40-60PFU)。病毒吸附进行90分钟，此后洗涤细胞，替换为新的“覆盖”培养基，其含有5％胎牛血清和1％人免疫球蛋白。吸附后3-4天，用福尔马林固定细胞，并在福尔马林固定后进行噬斑计数。
对于CMV，如在HSV-1/2试验中关于VERO细胞所述培养人成纤维细胞。培养基组分和吸附/覆盖方法相同，但是有下述例外：
1.在吸附过程中用CMV(毒株AD169，共40-60PFU)感染细胞。
2.在覆盖培养基中，将1％人免疫球蛋白替换为4％ sea-plaque琼脂糖。
对于其它疱疹病毒科，在如上所述噬斑试验中，在吸附过程中使用合适的细胞宿主和40-60PFU的病毒进行测试。
只有如果在试验结束时在没有化合物的情况下形成了可鉴别的噬斑，该试验才是有效的。
IC50是与未处理的对照相比存在50％的噬斑时的浓度。
在吸附和覆盖过程中，都存在要测试的化合物。
对逆转录病毒科的抗病毒试验
如下进行在HIV-1感染的细胞的上清液中的总p24的检测：
在有化合物存在的情况下，用HIV-1的原代分离物感染人PBMC。然后在补充了化合物的新鲜培养基中另外培养细胞7天，此后使用商业的p24ELISA试剂盒(BIOMERIEUX或等同物)检测上清液中的p24水平。
只有如果在受感染的、未处理的细胞的组织培养上清液中有p24累积，该试验才是有效的。
IC50是可检测的p24的量为未处理的对照中的p24的量的50％时的浓度。
在吸附过程中和在吸附后的培养基中都存在要测试的化合物。
对副粘病毒科的抗病毒试验
对于RSV，如下检测CPE：
在96孔平板中接种Hep2细胞，在MEM+5％胎牛血清中、在37℃和5％CO2下培养过夜。次日，用RSV(毒株A2，108.2TCID50/ml，以100μl/孔)通过吸附2小时来感染细胞。吸附后，更换培养基，生长7天后，通过活细胞将Alamar Blue染料向其荧光加合物的转化检测CPE。
只有在没有化合物的情况下在受感染的细胞中的CPE测量(如通过Alamar Blue转化所检测的)是在未受感染的细胞中测量到的转化的10％时，该试验才是有效的。
为了进行IC50对比，将在受感染的细胞中观察到的转化水平设定为100％CPE，在未受感染的细胞中观察到的转化水平设定为0％CPE。因此，IC50是生成50％CPE时的化合物浓度。
在吸附过程中和在吸附后的培养基中都存在要测试的化合物。
在说明书中引用的所有专利和其它文献都是用来说明本发明所属领域的普通技术人员的技术水平，它们全文结合于此作为参考，包括任何表格和图，如果每篇文献已经各自整体引作参考，也同样适用。
本领域的技术人员能够容易地明白，本发明充分适用于实现提及的和其中固有的目标和优点。本文所述的作为优选实施方案的目前代表的方法、变化和组合物是示例性的，无意为限制本发明的范围。本领域的技术人员能够进行变化和其它应用，这都在本发明的精神内，由权利要求的范围所限定。
本领域的技术人员能够容易地明白，对本文所述的发明可以进行不同的替代和变化，而不偏离本发明的范围和精神。例如，可以对寡核苷酸的合成条件和组成进行改变。因而，这样的其它实施方案也在本发明和下面的权利要求的范围内。
在缺少任意的一个或多个本文没有特别说明的要素、限制时，也可以合适地实现本文解释说明的发明。因此，例如，在本文的每个情形中，术语“包含”、“基本上由……组成”和“包括”中的任意一个都可以替换为另外2个中的一个。已经采用的术语和表述用作说明性的而不是限制性的术语，使用这样的术语和表达无意排除所列的和所述的特征或其部分的任何等同物，但是应当理解，在要求的本发明的范围内可以进行各种变化。因而，应当理解，尽管本发明已经通过优选的实施方案和最佳特征进行了具体公开，但本领域的技术人员可以使用本文公开的概念的修饰和变体，应当认为这样的修饰和变体也在所附的权利要求所限定的发明范围内。
另外，当描述的本发明的特征或方面涉及到马库什基团或其它的替代基团时，本领域的技术人员能够认识到，本发明还由此描述了马库什基团或其它基团的任意成员或成员的子群。
另外，除非有相反说明，当在实施方案中提及各种数值时，通过取任意2个不同值作为范围的端点描述了其它实施方案。这样的范围也在本发明公开的范围内。
因此，其它的实施方案也在本发明的范围和下面的权利要求内。
表1-寡核苷酸的描述
Figure GDA00003120185900811
Figure GDA00003120185900821

Claims (46)

1.一种抗病毒的寡核苷酸制剂，其含有至少一种抗病毒的完全硫代磷酸酯寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的长度为20至120个核苷酸，其中所述寡核苷酸的抗病毒活性通过非序列依赖的作用方式产生，其中所述寡核苷酸靶向疱疹病毒科的成员。
2.一种抗病毒的寡核苷酸制剂，其含有至少一种抗病毒的完全硫代磷酸酯寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的长度为20至120个核苷酸，其中所述寡核苷酸的抗病毒活性通过非序列依赖的作用方式产生，其中所述的寡核苷酸靶向HSV-1。
3.一种抗病毒的寡核苷酸制剂，其含有至少一种抗病毒的完全硫代磷酸酯寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的长度为20至120个核苷酸，其中所述寡核苷酸的抗病毒活性通过非序列依赖的作用方式产生，其中所述的寡核苷酸靶向HSV-2。
4.一种抗病毒的寡核苷酸制剂，其含有至少一种抗病毒的完全硫代磷酸酯寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的长度为20至120个核苷酸，其中所述寡核苷酸的抗病毒活性通过非序列依赖的作用方式产生，其中所述的寡核苷酸靶向巨细胞病毒。
5.一种抗病毒的寡核苷酸制剂，其含有至少一种抗病毒的完全硫代磷酸酯寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的长度为20至120个核苷酸，其中所述寡核苷酸的抗病毒活性通过非序列依赖的作用方式产生，其中所述的寡核苷酸靶向嗜肝DNA病毒科的成员。
6.一种抗病毒的寡核苷酸制剂，其含有至少一种抗病毒的完全硫代磷酸酯寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的长度为20至120个核苷酸，其中所述寡核苷酸的抗病毒活性通过非序列依赖的作用方式产生，其中所述的寡核苷酸靶向HBV。
7.一种抗病毒的寡核苷酸制剂，其含有至少一种抗病毒的完全硫代磷酸酯寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的长度为20至120个核苷酸，其中所述寡核苷酸的抗病毒活性通过非序列依赖的作用方式产生，其中所述的寡核苷酸靶向痘病毒科的成员。
8.一种抗病毒的寡核苷酸制剂，其含有至少一种抗病毒的完全硫代磷酸酯寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的长度为20至120个核苷酸，其中所述寡核苷酸的抗病毒活性通过非序列依赖的作用方式产生，其中所述的寡核苷酸靶向副粘病毒科的成员。
9.一种抗病毒的寡核苷酸制剂，其含有至少一种抗病毒的完全硫代磷酸酯寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的长度为20至120个核苷酸，其中所述寡核苷酸的抗病毒活性通过非序列依赖的作用方式产生，其中所述的寡核苷酸靶向呼吸道合胞病毒。
10.一种抗病毒的寡核苷酸制剂，其含有至少一种抗病毒的完全硫代磷酸酯寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的长度为20至120个核苷酸，其中所述寡核苷酸的抗病毒活性通过非序列依赖的作用方式产生，其中所述的寡核苷酸靶向副流感病毒。
11.一种抗病毒的寡核苷酸制剂，其含有至少一种抗病毒的完全硫代磷酸酯寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的长度为20至120个核苷酸，其中所述寡核苷酸的抗病毒活性通过非序列依赖的作用方式产生，其中所述的寡核苷酸靶向布尼亚病毒科的成员。
12.一种抗病毒的寡核苷酸制剂，其含有至少一种抗病毒的完全硫代磷酸酯寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的长度为20至120个核苷酸，其中所述寡核苷酸的抗病毒活性通过非序列依赖的作用方式产生，其中所述的寡核苷酸靶向汉坦病毒。
13.一种抗病毒的寡核苷酸制剂，其含有至少一种抗病毒的完全硫代磷酸酯寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的长度为20至120个核苷酸，其中所述寡核苷酸的抗病毒活性通过非序列依赖的作用方式产生，其中所述的寡核苷酸靶向黄病毒科的成员。
14.一种抗病毒的寡核苷酸制剂，其含有至少一种抗病毒的完全硫代磷酸酯寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的长度为20至120个核苷酸，其中所述寡核苷酸的抗病毒活性通过非序列依赖的作用方式产生，其中所述的寡核苷酸靶向黄热病毒。
15.一种抗病毒的寡核苷酸制剂，其含有至少一种抗病毒的完全硫代磷酸酯寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的长度为20至120个核苷酸，其中所述寡核苷酸的抗病毒活性通过非序列依赖的作用方式产生，其中所述的寡核苷酸靶向登革病毒。
16.一种抗病毒的寡核苷酸制剂，其含有至少一种抗病毒的完全硫代磷酸酯寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的长度为20至120个核苷酸，其中所述寡核苷酸的抗病毒活性通过非序列依赖的作用方式产生，其中所述的寡核苷酸靶向西尼罗病毒。
17.一种抗病毒的寡核苷酸制剂，其含有至少一种抗病毒的完全硫代磷酸酯寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的长度为20至120个核苷酸，其中所述寡核苷酸的抗病毒活性通过非序列依赖的作用方式产生，其中所述的寡核苷酸靶向丙型肝炎病毒。
18.一种抗病毒的寡核苷酸制剂，其含有至少一种抗病毒的完全硫代磷酸酯寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的长度为20至120个核苷酸，其中所述寡核苷酸的抗病毒活性通过非序列依赖的作用方式产生，其中所述的寡核苷酸靶向丝状病毒科的成员。
19.一种抗病毒的寡核苷酸制剂，其含有至少一种抗病毒的完全硫代磷酸酯寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的长度为20至120个核苷酸，其中所述寡核苷酸的抗病毒活性通过非序列依赖的作用方式产生，其中所述的寡核苷酸靶向埃博拉病毒。
20.一种抗病毒的寡核苷酸制剂，其含有至少一种抗病毒的完全硫代磷酸酯寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的长度为20至120个核苷酸，其中所述寡核苷酸的抗病毒活性通过非序列依赖的作用方式产生，其中所述的寡核苷酸靶向马尔堡病毒。
21.一种抗病毒的寡核苷酸制剂，其含有至少一种抗病毒的完全硫代磷酸酯寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的长度为20至120个核苷酸，其中所述寡核苷酸的抗病毒活性通过非序列依赖的作用方式产生，其中所述的寡核苷酸靶向正粘病毒科的成员。
22.一种抗病毒的寡核苷酸制剂，其含有至少一种抗病毒的完全硫代磷酸酯寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的长度为20至120个核苷酸，其中所述寡核苷酸的抗病毒活性通过非序列依赖的作用方式产生，其中所述的寡核苷酸靶向流感病毒。
23.一种抗病毒的寡核苷酸制剂，其含有至少一种抗病毒的完全硫代磷酸酯寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的长度为20至120个核苷酸，其中所述寡核苷酸的抗病毒活性通过非序列依赖的作用方式产生，其中所述的寡核苷酸靶向流感A病毒。
24.一种抗病毒的寡核苷酸制剂，其含有至少一种抗病毒的完全硫代磷酸酯寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的长度为20至120个核苷酸，其中所述寡核苷酸的抗病毒活性通过非序列依赖的作用方式产生，其中所述的寡核苷酸靶向披膜病毒科的成员。
25.一种抗病毒的寡核苷酸制剂，其含有至少一种抗病毒的完全硫代磷酸酯寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的长度为20至120个核苷酸，其中所述寡核苷酸的抗病毒活性通过非序列依赖的作用方式产生，其中所述的寡核苷酸靶向冠状病毒科的成员。
26.一种抗病毒的寡核苷酸制剂，其含有至少一种抗病毒的完全硫代磷酸酯寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的长度为20至120个核苷酸，其中所述寡核苷酸的抗病毒活性通过非序列依赖的作用方式产生，其中所述的寡核苷酸靶向弹状病毒科的成员。
27.一种抗病毒的寡核苷酸制剂，其含有至少一种抗病毒的完全硫代磷酸酯寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的长度为20至120个核苷酸，其中所述寡核苷酸的抗病毒活性通过非序列依赖的作用方式产生，其中所述的寡核苷酸靶向沙粒病毒科的成员。
28.根据权利要求1-27中任一项的寡核苷酸制剂，其中所述制剂含有寡核苷酸，所述寡核苷酸是杂聚物，该杂聚物是由交替的腺苷和胞嘧啶残基组成。
29.根据权利要求1-27中任一项的寡核苷酸制剂，其中所述制剂含有寡核苷酸，所述寡核苷酸由20个连续的重复序列AC组成。
30.根据权利要求1-27中任一项的寡核苷酸制剂，其中所述制剂含有寡核苷酸，所述寡核苷酸是杂聚物，该杂聚物是由交替的腺苷和鸟苷残基组成。
31.根据权利要求1-27中任一项的寡核苷酸制剂，其中所述制剂含有寡核苷酸，所述寡核苷酸由20个连续的重复序列AG组成。
32.根据权利要求1-27中任一项的寡核苷酸制剂，其中所述至少一种抗病毒寡核苷酸是至少30个核苷酸的长度。
33.根据权利要求1-27中任一项的寡核苷酸制剂，包含至少两种不同的抗病毒寡核苷酸。
34.根据权利要求1-27中任一项的寡核苷酸制剂，其中所述寡核苷酸不与所述目标病毒的基因组序列的任何部分互补。
35.根据权利要求1-27中任一项的寡核苷酸制剂，其中所述寡核苷酸还包含至少一个磷酸二酯键。
36.根据权利要求1-27中任一项的寡核苷酸制剂，其中所述寡核苷酸还包含至少一个对核糖部分的2’-O甲基修饰。
37.根据权利要求1-27中任一项的寡核苷酸制剂，其中所述寡核苷酸还包含至少一个对核糖部分的2’-O(2-甲氧基乙基)修饰。
38.根据权利要求1-27中任一项的寡核苷酸制剂，其中所述寡核苷酸还包含至少一个对核糖部分的2′-修饰。
39.根据权利要求1-27中任一项的寡核苷酸制剂，其中所述寡核苷酸还包含至少一个甲基膦酸酯键。
40.根据权利要求1-27中任一项的寡核苷酸制剂，其中所述寡核苷酸还包含至少一个二硫代磷酸酯键。
41.根据权利要求1-27中任一项的寡核苷酸制剂，其中所述寡核苷酸还包含至少一种锁定的核酸。
42.根据权利要求1-27中任一项的寡核苷酸制剂，其中所述寡核苷酸是由两个或多个通过连接物连接的寡核苷酸序列组成的多联体。
43.根据权利要求1-27中任一项的寡核苷酸制剂，其中所述寡核苷酸在一个或多个核苷酸残基处连接或结合到分子上以得到一个或多个特征，所述分子修饰寡核苷酸的特征，所述特征选自更高的稳定性、更低的血清相互作用、更高的细胞摄入、更高的病毒蛋白相互作用、改善的被配制适于输送的能力、可检测出的信号、更高的抗病毒活性、更好的药物代谢动力学性质、特异性的组织分布、更低的毒性。
44.根据权利要求1-27中任一项的寡核苷酸制剂，其中所述寡核苷酸包含至少一个能通过非沃森-克里克相互作用进行杂交的碱基。
45.根据权利要求1-27中任一项的寡核苷酸制剂，其中至少一部分所述的寡核苷酸的序列包含polyA、polyC、polyG、polyT、polyAC、polyAG、polyAT、polyCG、polyCT或polyGT。
46.根据权利要求1-27中任一项的寡核苷酸制剂，其中至少一部分所述的寡核苷酸的序列包含两个或多个重复序列。
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