CN1703421B - 降低peg化蛋白的聚集体水平的方法 - Google Patents

Abstract

本发明总的涉及制备和收集所需PEG化蛋白的重组方法。这些方法生成的多肽产物含有水平降低的其聚集体以提供所需的其PEG化同工型。

Description

降低PEG化蛋白的聚集体水平的方法

参考相关申请

本申请为非临时申请，要求于2002年9月20日提交的相应临时申请No.60/412,227的优先权。本申请是于2003年8月25日提交的非临时美国申请过渡序列号P-107,891的部分继续申请。上述两个临时和非临时申请在此以其全文引作参考。

发明领域

本发明总的涉及制备所需PEG化多肽的重组方法。这些方法生成的PEG化多肽产物含有水平较低的其聚集体和/或特定同工型杂质。具体而言，本发明还涉及(1)制备聚集体和/或同工型杂质降低的生长激素的重组方法，以及(2)制备聚集体和/或同工型杂质降低的生长激素拮抗剂(诸如派格索曼(pegvisomant)，及其蛋白中间体)的重组方法。更具体而言，通过本发明方法降低的同工型杂质分别为生长激素和生长激素拮抗剂(或其中间体)的三硫化物和des-phe同工型杂质。总之，聚集体同样是PEG化的生长激素，PEG化的生长激素拮抗剂或PEG化蛋白的不想要的聚集体。

发明背景

派格索曼(Pharmacia Corp.)为人生长激素受体拮抗剂。其是人生长激素(“hGH”)在结构上改变的类似物。派格索曼的蛋白组分/中间体(B-2036)的氨基酸序列与hGH的氨基酸序列区别在9个位置上。特定氨基酸取代如下：H18D，H21N，G120K，R167N，K168A，D171S，K172R，E174S，和I179T。正如本领域公认的，第一个字母(即，H18D)表示hGH的序列在编号位置处的氨基酸(即，如H18D所示的氨基酸位置18)，其被第二个字母所示的氨基酸(即，H18D)所取代。因此，H18D表示在野生型hGH氨基酸序列的第18位氨基酸位置处的氨基酸his被氨基酸asp取代。

图1A示意性显示派格索曼(PEG B-2036或B-2036PEG)的蛋白成分/中间体(B-2036)的氨基酸序列结构，星号表明聚乙二醇聚合物(“PEG”单元)连接的潜在位点。另外，派格索曼的蛋白成分/中间体(B-2036-未连接PEG单元)的氨基酸序列表在此示成SEQ.ID.NO.1。对比而言，人生长激素的氨基酸序列表在此识别成SEQ.ID.NO.2。这两个序列表均随本发明提供。hGH的序列也可参见，Jorgensen等，“Quantifying biosynthetic human growth hormone in Escherichia coliwith electrophoresis under hydrophobic conditions(利用电泳在疏水性条件下定量测定大肠杆菌中的生物合成人生长激素)”，J.Chromatography A 817：205-214(1998)。

在结构上，派格索曼为主要有4-6个PEG单元与之共价结合的蛋白(含有191个氨基酸残基)。派格索曼的蛋白成分/中间体(B-2036)的分子量为21,998道尔顿。派格索曼中各个PEG单元的分子量约为5000道尔顿。由此派格索曼的主要分子量约为42,000(4PEG单元/分子)，47,000(5PEG单元/分子)和52,000(6PEG单元/分子)道尔顿。

提到激动剂，无需受理论的约束，据信当单个hGH分子与其相邻(和相同)的两上受体分子结合时，内源性hGH激活其受体，诱导激素介导的受体同型二聚化。参见U.S.专利Nos.5,849,535和6,057,292。hGH的活性依赖于其结合相邻(和相同)受体中的两个的能力，这两个受体跨越在同一hGH分子上的两个分开的结合位点(位点1和位点2)。这些hGH结合位点命名为位点1和位点2，并编号为1和2以反映它们与介导hGH-依赖性同型二聚化的两个相邻(和相同)hGH受体结合的次序。

此外，无需受理论的约束，据信派格索曼选择性结合到细胞表面上的人生长激素受体(“GH受体”)，阻断内源性人生长激素的结合，由此干扰人生长激素信号转导。对派格索曼的蛋白部分(也称“组分”或“中间体”)(相对于hGH)进行结构修饰，使得派格索曼竞争性阻断hGH分子与hGH受体之间的相互作用。派格索曼结合到GH受体，因此由于受体被占而阻断GH结合。结构修饰防止受体二聚化，结果，信号转导没有发生。通过如此阻断hGH分子和hGH受体之间所需的密切相互作用，派格索曼阻断hGH受体的hGH-介导的同型二聚化，使派格索曼产生其拮抗剂活性。

该拮抗剂用于治疗病症，包括但不限于对外科手术，放疗和/或其他常规医学治疗不足够反应或不耐受这些疗法的患者的肢端肥大症。此外，对派格索曼的蛋白部分(PEG B-2036)进行结构修饰导致其对促乳素受体展现的结合亲和性低于对hGH的亲和性，从而因使用派格索曼引起的不理想的泌乳有关的副作用最小化。

派格索曼的蛋白中间体(B-2036)是通过大肠杆菌(Escherichia.coli)菌株合成的，所述菌株已通过导入质粒而被遗传修饰，而所述质粒携带生长激素拮抗剂(B-2036)的基因。然后，B-2036从微生物细胞中回收，并加以纯化。纯化的B-2036再被PEG化以制备派格索曼(PEG B-2036)。U.S.专利5,849,535和6,057,292描述了制备B-2036的方法，以及将一个或多个PEG单元与B-2036共轭的方法，尽管没有详细说明如何降低，减少，消除，逆转和/或防止形成不可接受的高水平的其三硫化物和des-phe同工型杂质。

利用常规的重组生产方法制备B-2036所遭遇到的问题之一是形成其同工型杂质，诸如其des-phe和三硫化物同工型。利用常规生产和纯化方法从B-2036制备B-2036PEG(即PEG化的B-2036，如派格索曼)所遭遇到的另一问题是形成如下所讨论的B-2036PEG的不需要的“聚集体”。

在des-phe同工型杂质中，B-2036分子的氨基端苯丙氨酸丢失。参见图1A描述了邻近B-2036的氨基端苯丙氨酸残基(即，由字母“F”所示)。在三硫化物同工型杂质中，B-2036分子含有额外的硫原子，其在分子内形成“三硫化物桥”。参见图1B中的框。同样，参见Andersson等，“Isolation and characterization of a trisulfide variant of recombinanthuman growth hormone formed during expression in Escherichia coli(分离和表征在大肠杆菌表达过程中形成的重组人生长激素的三硫化物变体)”，Int.J.Peptide Protein Res.47：311-321(1996)和A.Jesperson等，“Characterisation of a trisulphide derivative of biosynthetic humangrowth hormone produced in Escherichia coli(表征大肠杆菌中生产的生物合成的人生长激素的三硫化物衍生物)”，Eur.J.Biochem.219：365-373(1994)。无需受理论的约束，据信这些同工型杂质通常在细胞生长(如发酵)和B-2036在遗传修饰的宿主细胞中表达(合成和分泌)的过程中，和/或B-2036蛋白的提取和纯化的过程中生成。

关于“聚集体”的问题，这种“聚集体”的形成导致所需蛋白的产率的降低，以及导致其生产成本的上升。同样，如果“聚集体”水平太高，则最终蛋白的纯度可能如此之低以致变成不适合治疗用途。

关于特定的杂质，国际申请WO 94/24157(公布日1994年10月27日)公开了hGH的疏水性衍生物，其与天然hGH比较包含额外的硫原子。参见WO 94/24157第3页第3-10行。hGH疏水衍生物的额外硫原子形成“三硫化物桥”，从而产生hGH三硫化物变体。参见WO94/24157第7页第11-16行。WO 94/24157进一步叙述了通过用半胱氨酸，谷胱苷肽，2-巯基乙醇或二硫苏糖醇等巯基化合物处理hGH三硫化物变体而使该hGH三硫化物变体转化回到其天然hGH形式。参见WO 94/24157第4页和第5页。

国际申请WO 96/02570(公布日1996年2月1日)描述了另一方法，利用亚硫酸钠，亚硫酸钾，亚硫酸铵，或亚硫酸镁或亚硫酸钙等碱土金属亚硫酸盐，将hGH三硫化物变体转化回到其天然形式。参见WO 94/24157第4页第17-21行。

国际申请WO 00/02900(公布日2000年1月20日)的发明名称为“Method for the production of recombinant peptides with a low amount oftrisulfides(具有少量三硫化物的重组肽的生产方法)”，其论述了“在生产重组肽，如蛋白和小肽时减少三硫化物量的方法。本发明是基于下列意想不到的新发现：在发酵过程中或发酵后，通过加入金属盐，优选过量加入，而非如上文所述，通过将已形成的生长激素的三硫化物转化成天然形式，可降低重组肽生产中的三硫化物的量”。参见WO00/02900第2页第21-27行。WO 00/02900进一步叙述了“蛋白可以是任何重组蛋白，但优选为人和动物的重组生长激素，诸如人生长激素(hGH)，牛生长激素(bGH)和猪生长激素(pGH)”。参见WO 00/02900第3页第4-6行。

国际申请No.WO 02/057478(公布日2002年7月25日)的发明名称为“Methods and Composition For Extracting Proteins From Cells(从细胞提取蛋白的方法和组合物)”，涉及通过将宿主细胞与还原剂和去污剂接触而从宿主细胞中释放蛋白的方法。该文献陈述了还原剂的目的在于“便于蛋白以其天然构型回收”。参见WO 02/057478第2页第16-18。此外，WO 02/057478描述了“一种或多种还原剂是指...还原二硫键和/或维持巯基为其还原形式的试剂。可使用任何这样的还原剂。在优选的实施方案中，所用的一种或多种还原剂选自二硫苏糖醇(DTT)；二硫赤藓糖醇(DTE)；半胱氨酸(CYS)和Tris 2-羧乙基膦(TCEP)”。参见WO 02/057478第3页第24行至第4页第4行。

其他有关纯化的参考文献，参见U.S.专利No.6,265,542B1(Fahrner等，发明名称为“分子的纯化”)；U.S.专利No.6,333,398B1(Blank，发明名称为“蛋白纯化”)；U.S.专利No.5,747,639(Seely，发明名称为“利用疏水相互作用层析纯化聚乙二醇”)；国际申请No.PCT/US96/19459(Ibrahim等，发明名称为“活化的接头，及其制备和纯化方法”)；以及U.S.专利申请No.U.S.2002/002271A1(Rinderknecht等，发明名称为“抗体纯化”)。

然而，上述参考文献未提及有关防止，反转，减少，或消除与派格索曼或其蛋白部分B-2036等生长激素拮抗剂相关的同工型杂质形成。因此，需要对B-2036的制备方法进行改进，以降低，减弱，防止，最小化，反转和/或消除其同工型杂质(三硫化物和/或des-phe)的形成和/或PEG化蛋白的聚集体的形成。同样，这些参考文献也未提及检测，弱化，最小化，反转，减少或消除生长激素的des-phe同工型杂质的形成和/或PEG化蛋白的聚集体的形成，例如PEG化生长激素或PEG人生长激素。因此，需要对制备生长激素的方法进行改进，以降低，弱化，防止，最小化，反转和/或消除其des-phe同工型杂质的形成和/或PEG化蛋白，例如PEG化生长激素或PEG化人生长激素的聚集体的形成。

附图简述

图1A描述了B-2036对应的氨基酸序列SEQ.ID.NO.1。图1A中的星号(*)指出PEG单元与各个B-2036分子共价连接的9个潜在的位点。注意的是，虽然有9个可能的位点被鉴定，但不是所有的9个位点都必须与PEG单元共价结合。优选地，每个B-2036分子有4-6个PEG单元。

图1B描述了B-2036的三硫化物同工型杂质的结构(命名为“三硫化物(+32amu)”)，与其理想形式(命名为“天然GHA”)结构的比较。

图2比较了由毛细管电泳和反相HPLC确定的在Q-Sepharose FF级分7至18内发现的B-2036PEG 4的百分比。

图3比较了由毛细管电泳和反相HPLC确定的在Q-Sepharose FF级分7至18内发现的B-2036PEG 5的百分比。

图4比较了由毛细管电泳和反相HPLC确定的在Q-Sepharose FF级分7至18内发现的B-2036PEG 6的百分比。

发明概述

鉴于上述需要提供改进的方法，用于制备重组PEG化的多肽生长激素激动剂，重组PEG化的多肽人生长激素激动剂，重组PEG多肽生长激素拮抗剂，和/或重组PEG化的多肽人生长激素拮抗剂，而其不理想的聚集体和/或同工型杂质的水平降低，本发明涉及改进的方法，用于生产重组PEG化的多肽生长激素(包括但不限于人生长激素)和重组PEG化的多肽生长激素拮抗剂(包括但不限于人生长激素拮抗剂)，而其聚集体，des-phe和/或三硫化物同工型杂质的水平降低。

关于重组生长激素(包括但不限于hGH)，通过分别足量加入(1)螯合剂或(2)金属盐，降低了其des-phe同工型杂质的形成。

关于重组生长激素拮抗剂(包括但不限于人生长激素拮抗剂)，通过三硫化物同工型杂质分别与下列物质之间充分接触，降低了其三硫化物同工型杂质：(1)巯基化合物，(2)螯合剂，(3)金属盐，(4)巯基化合物与金属盐一起，或(5)与螯合剂接触后但在缺乏螯合剂情形下的巯基化合物。

关于重组生长激素拮抗剂(包括但不限于人生长激素拮抗剂)，通过分别加入(1)螯合剂或(2)金属盐，降低其des-phe同工型杂质的形成。

关于重组PEG化蛋白(包括但不限于PEG化的激素，PEG化的生长激素拮抗剂，PEG化的人生长激素拮抗剂，PEG化的生长激素和/或PEG化的人生长激素)，在分离PEG化同工型的过程中，通过阴离子交换层析，使聚集体的水平维持在或降低至或低于理想的水平。优选实施方案的详述

下列缩写用于本申请中。

AC          亲和层析

AEX         阴离子交换

API         活性药物成分

BI          本体中间体；B-2036(未PEG化作用)

B-2036PEG   PEG化的B-2036

PEG B-2036  PEG化的B-2036

CE          毛细管电泳

CEX         阳离子交换

cm          厘米

CV          柱体积

DEAE        二基氨基乙基

HEPES       N-(2-羟基乙基)哌嗪N-(2-乙烷)sulfononic acid

HIC         疏水相互作用层析

IEX         离子交换

kDa         千道尔顿

L           升

LPM         升/分

mL或ml      毫升

mM          毫摩尔

mS          毫西门子

MWCO        截留分子量

μm         微米

N           当量浓度

NaCl        氯化钠

NaOH        氢氧化钠

NWP         标准化水渗透性

PEG         聚乙二醇或其变体

PEG-1       用1分子PEG或其变体PEG化的1分子B-2036

PEG-2       用2分子PEG或其变体PEG化的1分子B-2036

PEG-3     用3分子PEG或其变体PEG化的1分子B-2036

PEG-4     用4分子PEG或其变体PEG化的1分子B-2036

PEG-5     用5分子PEG或其变体PEG化的1分子B-2036

PEG-6     用6分子PEG或其变体PEG化的1分子B-2036

PEG-7     用7分子PEG或其变体PEG化的1分子B-2036

PEG-8     用8分子PEG或其变体PEG化的1分子B-2036

PEG-9     用9分子PEG或其变体PEG化的1分子B-2036

RPHPLC    反相高效液相层析

SD        标准差

SDS-PAGE  十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳

SEHPLC    大小排阻高效液相层析

TMP       跨膜性能

TRIS      三-(2-羟甲基)氨基甲烷

UF/DF     超滤/透滤

UV        紫外

WFI       注射用水

术语“PEG化的蛋白”包括但不限于，激素，生长激素，人生长激素，生长激素拮抗剂，人生长激素拮抗剂，抗体(或其片段)，以及B-2036PEG。“PEG化的蛋白”还包括但不限于在一个或多个位点处PEG化的一个或多个目的蛋白。

除非另外说明，术语“聚集体”是指一个或多个无论是PEG化还是未PEG化的目的蛋白的面条样块。“聚集体”是多个通过位阻相互作用或彼此之间相互作用而变成团的蛋白分子。“聚集体”的例子包括但不限于下列分子之间的缠绕：(1)多个PEG化的蛋白分子，(2)多个未PEG化的蛋白分子，和/或(3)至少一个PEG化的蛋白分子和至少一个未PEG化的蛋白分子。

除非另外说明，“未PEG化的蛋白杂质”包括但不限于，未PEG化的蛋白，即没有连接PEG分子的蛋白或其变体。

除非另外说明，“化学计量的重量比”是指游离PEG分子的量与未PEG化的目的蛋白分子的量的比。

除非另外说明，术语“PEG化的蛋白同工型”是指优选通过共价连接有一个或多个PEG部分的目的蛋白。例如，术语“PEG-1”是指其上连接有一个PEG分子的B-2036，优选在赖氨酸残基和/或氨基端等位置处。同样，PEG-2，PEG-3，PEG-4，PEG-5，PEG-6，PEG-7，PEG-8，和PEG-9是指与一个B-2036分子连接的PEG分子数。因此，PEG-2是指两个PEG分子连接一个B-2036分子，而PEG-3是指三个PEG分子连接一个B-2036分子等。

除非另外说明，术语“填充的床体积”是指根据产商推荐的操作条件而装填的具体树脂的填充的床体积。

除非另外说明，术语“同工型杂质”至少是指在此所述的三硫化物同工型杂质，或des-phe同工型杂质。术语“同工型杂质”也可包括本领域已知的其他杂质。

术语“CE收集导电率”是指通过进行CE处理而收集的CV级分的导电率测量。

术语“生长激素拮抗剂”和“生长激素受体拮抗剂”包括(但不限于)PEG化的多肽，以及抑制或拮抗生长激素与其生长激素受体结合以阻断生长激素的生物学效应的多肽。优选地，PEG化的“生长激素拮抗剂”或PEG化的“生长激素受体拮抗剂”为PEG化的B-2036，B-2036或其变体。这种“变体”包括但不限于，(分别)具有生长激素受体拮抗剂活性的其同系物(尤其是相对于B-2036具有保守性氨基酸替换，添加或缺失的同系物)，类似物，片段，假肽，抗体等。

术语“生长激素激动剂”和“生长激素受体激动剂”包括(但不限于)PEG化的多肽以及与其生长激素受体结合并活化该受体的多肽。优选地，“生长激素激动剂”或“生长激素受体激动剂”为PEG化的人生长激素，人生长激素或其变体。这种“变体”包括但不限于(分别)具有生长激素受体激动剂活性的其同系物(尤其是相对于人生长激素具有保守性氨基酸替换，添加或缺失的同系物)，类似物，片段，假肽，抗体等。

如果合适或必要，在叙述一种方法对相关杂质的水平(例如，三硫化物或des-phe同工型杂质和/或聚集体)生成所需的降低时，术语“和”可表示“和”或者“或”。

如果合适或必要，在叙述一种方法对相关杂质(例如，三硫化物或des-phe同工型杂质和/或聚集体)的水平生成所需的降低时，术语“或”可表示“和”或者“或”。

如本发明所用，除非另外说明，术语“降低”(或其明显变换)表示维持，消除，最小化，减少，防止，反转和/或弱化目的PEG化蛋白的“聚集体”水平和/或相关同工型杂质的量，不管其是三硫化物同工型杂质还是des-phe同工型杂质。

除非另外说明，术语“宿主细胞”(或其明显变换)是指任何其中可形成重组B-2036或重组hGH的宿主细胞。因此，宿主细胞可以是哺乳动物宿主细胞，植物宿主细胞，或微生物宿主细胞，如大肠杆菌(E.coli)或甚至是酵母细胞。值得注意的是，宿主细胞足以产生所需的重组B-2036蛋白组分或重组hGH。同样，对宿主细胞是什么没有限制，除了其能够重组生产B-2036蛋白组分或目的重组hGH或其“变体”之外。

此外，如本发明所用，除非另外说明，术语“成长”(或其明显变换，例如，生长)包括但不限于发酵和培养，或导致宿主细胞增殖足以生产所需量的重组B-2036蛋白组分或重组hGH。

此外，尽管本发明对重组B-2036和重组PEG B-2036进行了描述，但是除非另外说明，本发明可理解采用任何重组生长激素激动剂，重组生长激素拮抗剂，不管其是哺乳动物生长激素或其拮抗剂，人生长激素或其拮抗剂，还是牛生长激素或其拮抗剂等。

派格索曼(在此引作PEG B-2036或B-2036PEG)是重组宿主细胞(例如，重组遗传修饰的大肠杆菌宿主细胞)中生长的重组蛋白(B-2036)的PEG化形式。B-2036蛋白在细胞生长(例如，通过发酵)和表达(合成和分泌)过程中产生。产生后，分离B-2036(例如，通过均质化)，接着纯化(例如，通过抽提，离心，反相层析和阴离子交换层析和缓冲液交换)。然而，如上所述，在重组生产B-2036蛋白过程中，形成了不需要的同工型杂质，即B-2036的三硫化物杂质和des-phe同工型杂质。

如上所述，图1A用标准单字母缩写示出B-2036的氨基酸序列，表明哪种氨基酸存在于各个字母位置。为参考起见，下表1指明字母与其有关氨基酸之间的对应关系。

表1

多肽氨基酸

Ala(A)

Glu(E)

Gln(Q)

Asp(D)

Asn(N)

Leu(L)

Gly(G)

Lys(K)

Ser(S)

Val(V)

Arg(R)

Thr(T)

Pro(P)

Ile(I)

Met(M)

Phe(F)

Tyr(Y)

Cys(C)

Trp(W)

His(H)

另外，B-2036的氨基酸序列在本发明中以SEQ.ID.NO.1所示，而hGH的氨基酸序列在本发明中以SEQ.ID.NO.2所示。

1.重组生长激素拮抗剂及其三硫化物同工型杂质。

图1B说明了B-2036的三硫化物同工型杂质的氨基酸序列结构。具体而言，三硫化物同工型杂质在B-2036蛋白组分的位置182和189的半胱氨酸之间的桥中含有额外的硫原子。

a.用巯基化合物降低三硫化物同工型杂质

无需受理论的约束，据信选定的巯基化合物与重组生长激素拮抗剂B-2036的三硫化物同工型杂质之间的接触使得半胱氨酸-S-S-S-半胱氨酸三硫化物桥转化回到其半胱氨酸-S-S-半胱氨酸天然形式。另外，同样无需受理论约束，巯基化合物的存在有可能防止三硫化物桥本身的进一步形成。

通常，巯基化合物加入到宿主细胞，其在生长过程中和/或生长之后，合成所需的重组B-2036蛋白组分。此外，在生长和接触步骤进行之后，优选纯化B-2036蛋白。其后，纯化的蛋白优选被PEG化以生成PEG B-2036(派格索曼)。PEG化步骤参见U.S.专利No.5,849,535和U.S.专利No.5,672,662。

任何巯基化合物可用于本发明，只要其与B-2036蛋白组分及其三硫化物同工型杂质一起接触(优选地，充分混合)时，足以降低三硫化物同工型杂质的水平，优选不降解(或基本上不降解)B-2036产物。优选的适用于本发明的巯基化合物包括但不限于亚硫酸盐，谷胱苷肽，β-巯基乙醇，二硫苏糖醇，巯基乙胺，二硫赤藓糖醇，三(2-羧基乙基)膦盐酸盐，半胱氨酸，和半胱氨酸与胱氨酸的组合。

其他用于本发明的合适巯基化合物示于下列参考文献中：(1)J.Houk和G.M.Whitesides，“Structure-Reactivity Relations for Thiol-Disulfide Interchange(硫醇-二硫化物交换的结构-反应性关系)”，J.M.Chem.Soc.，109：6825-6836(1987)；(2)Sigmund，M.，The Chemistry& Biochemistry of the Sulfhydro Group in Amino Acids(巯基在氨基酸中的化学&生物化学)，Peptides and Proteins，第1版，Pergamon，NewYork(1973)。具体而言，参见如上(1)项中Houk等所示的表II，列出了适用于本发明的示例性巯基化合物。

在合适的巯基化合物中，半胱氨酸或半胱氨酸与胱氨酸的组合(二聚化的半胱氨酸)是最优选的。适用于本发明的半胱氨酸或半胱氨酸与胱氨酸的组合(二聚化的半胱氨酸，如果有的话)的量应足以使三硫化物同工型杂质降低至少大约10％的形成的最高平衡浓度(或其最高平均平衡浓度，其中取多批次平均)。优选地，三硫化物同工型杂质的量分别降低至少大约20％，30％，40％，或50％形成的最高平衡浓度(或其最高平均平衡浓度)。任何适用于本发明的半胱氨酸与胱氨酸的初始组合浓度优选分别为至少大约0.1mM，大约0.1mM到大约10mM，或大约1mM到大约5mM。

优选提供巯基化合物的缓冲液。优选地，缓冲液适用于本发明，即不会阻止B-2036蛋白组分的形成或一旦B-2036组分形成就将其降解。适用于本发明的缓冲液包括但不限于Tris，磷酸，HEPES，柠檬酸，三乙胺，和组氨酸。优选的缓冲液为Tris。优选的起始缓冲液浓度为大约1mM到大约200mM，更优选大约5mM到大约100mM，甚至更优选大约8mM到大约70mM，以及最优选大约10mM到大约50mM。其他合适的缓冲液也可使用。优选地，这些缓冲液足以维持生长培养基的pH，范围分别大约4到大约9，大约7.5到大约8.5，或大约7.5到大约8.0。显然，如果使用更高浓度的巯基化合物，可以耐受更高的pH水平，例如，高至大约9.5。因此，例如，如果对B-2036使用过量的半胱氨酸，则缓冲液的pH可高达大约9.5。

如上所述，优选提供巯基化合物的缓冲液。此外，缓冲液中巯基化合物的量应使巯基化合物的摩尔数与B-2036蛋白的摩尔数之比为大约0.5到大约1,000。当所用的巯基化合物为半胱氨酸的组合，任选半胱氨酸与胱氨酸的组合时尤其如此。此外，巯基化合物的摩尔数与B-2036蛋白的摩尔数之比可以分别为大约1到大约1,000，大约1到大约500，或大约1到大约10。

通常，在巯基化合物和B-2036蛋白组分(宿主细胞内或来自宿主细胞)之间充分接触(以降低三硫化物同工型杂质的水平)完成后，缓冲液中B-2036蛋白组分的浓度分别大约0.1mg/ml到大约30mg/ml，大约0.5mg/ml到大约20mg/ml，或大约1mg/ml到大约10mg/ml。

此外，在巯基化合物加到宿主细胞或其含有B-2036蛋白组分的裂解液中后，生长培养基连同缓冲液、巯基化合物和其他内容物(包括但不限于B-2036)的温度范围应维持在大约0℃到大约25℃。同样，优选地，宿主细胞和/或从中获得的含有B-2036组分的裂解液的温度分别维持在大约1℃到大约15℃，大约2℃到大约10℃，或大约2℃到大约8℃。值得注意的是，B-2036蛋白在大约40+℃发生变性。为此，理想的是维持匀浆(即，含有宿主细胞，生长培养基，缓冲液，巯基化合物和B-2036等)的温度低于B-2036的蛋白变性温度。

另外，B-2036组分与巯基化合物之间的接触时间应足以降低三硫化物同工型杂质的水平。用于降低三硫化物同工型杂质的合适接触时间示例性分别为至少大约30分钟，大约1小时到大约24小时，或大约1小时到大约4小时。

通常，在巯基化合物与B-2036组分之间充分接触后，含有上述成分的缓冲液的体积分别为大约1升到大约5,000升，大约10升到大约500升，或100升到大约300升。其他合适的体积示例性为160升到大约500升。

在巯基化合物与B-2036组分之间接触的过程中其他有关的参数包括混合比等。混合比应足以形成均匀的混合物(宿主细胞，其裂解液，缓冲液，巯基化合物，B-2036组分以及其他在同一生长培养基中的任何组分的混合物)，同时使形成的泡沫量最小化。本领域技术人员可轻易地确定，怎样的混合比应是足够的。显然，混合比应使温度维持在上述范围内，并且使B-2036蛋白组分的降解最小化。

b.用螯合剂降低三硫化物同工型杂质

无需受理论约束，据信选定的螯合剂与下列物质的接触会使半胱氨酸-S-S-S-半胱氨酸三硫化物桥转化回到其半胱氨酸-S-S-半胱氨酸天然形式或降低杂质的水平：(1)三硫化物同工型杂质，(2)重组生长激素拮抗剂B-2036，(3)宿主细胞组分(用于重组生产拮抗剂)，以及(4)上述(1)-(3)的全部组合。此外，同样无需受理论约束，螯合剂的存在有可能防止三硫化物桥本身的进一步形成。

通常，螯合剂加入到宿主细胞，其在生长过程中和/或生长之后，合成所需的重组B-2036蛋白组分。此外，在生长和接触步骤进行之后，优选纯化B-2036蛋白。其后，纯化的蛋白优选被PEG化以生成PEG B-2036(派格索曼)。PEG化步骤参见U.S.专利No.5,849,535。

任何螯合剂可用于本发明，只要其与B-2036蛋白组分及其三硫化物同工型杂质一起接触(优选充分混合)时，足以降低三硫化物同工型杂质的水平，优选不降解(或基本上不降解)B-2036产物。优选的适用于本发明的螯合剂包括但不限于EDTA，EGTA，和DTPA。其他示例性螯合剂包括但不限于去铁敏(Deferoxamine)，二硫卡钠(Ditiocarb Sodium)，EDTA钙二钠，EDTA二钠，EDTA钠，EDTA三钠，青霉胺，喷替酸钙钠(Pentetate Calcium Trisodium)，喷替酸(Pentetic Acid)，二巯丁二酸(Succimer)，和曲恩汀(Trientine)。注意EDTA钠是EDTA的盐形式。

其他用于本发明的合适螯合剂示于下列参考文献中：(1)TheMerck Index，第12版，S.Budavari(编辑)，Merck & Co.，Inc.，TherapeuticCategory and Biological Activity Index(治疗目录和生物活性索引)，p.THER-19(在“螯合剂”子目录中)，Whitehouse Station，NJ(1996)及其迄今为止的每个后续版本；(2)Remington′s PharmaceuticalSciences(Remington’s药物学)，第16版，Arthur Osol(编辑)，MackPublishing Co.，Easton，Pennsylvania(1980)及其迄今为止的每个后续版本；(3)The United States Pharmacopeia(美国药典)，第21次修订(第16版)，United States Pharmacopeial Convention，Inc.，Rockville，Maryland(1985)及其迄今为止的每个后续版本；(4)SIGMA，Biochemicals andReagents for Life Science Research Catalogue(生命科学研究的生化试剂目录)，St.Louis，Missouri(2002-2003)；以及(5)Aldrich，Handbook ofFine Chemicals and Laboratory Equipment(精细化学品和实验仪器手册)，Milwaukee，Wisconsin(2000-2001)及其(2002-2003)版。

在合适的螯合剂中，EDTA是最优选的。适用于本发明的螯合剂的量应足以使三硫化物同工型杂质降低至少大约10％的形成的最高平衡浓度(或其最高平均平衡浓度，其中取多批次平均)。优选地，三硫化物同工型杂质的量分别降低至少大约20％，30％，40％，或50％的形成的最高平衡浓度(或其最高平均平衡浓度)。适用于本发明的EDTA的初始浓度优选分别为至少大约0.01mM，大约0.01mM到大约100mM，大约0.1mM到大约20mM，大约2mM到大约10mM，或大约2mM到大约5mM。

优选提供螯合剂的缓冲液。优选地，缓冲液适用于本发明，即不会防止B-2036蛋白组分的形成或一旦其形成就被降解。适用于本发明的缓冲液包括但不限于Tris，磷酸，HEPES，柠檬酸，三乙胺，和组氨酸。优选的缓冲液为Tris。优选的起始缓冲液浓度为大约1mM到大约200mM，更优选大约5mM到大约100mM，甚至更优选大约8mM到大约70mM，以及最优选大约10mM到大约50mM。其他合适的缓冲液也可使用。优选地，这些缓冲液足以维持生长培养基的pH，范围分别大约6到大约9，大约6.5到大约7.5，或大约7.2到大约7.5。

如上所述，优选提供螯合剂的缓冲液。此外，缓冲液中螯合剂的量应使螯合剂的摩尔数与B-2036蛋白的摩尔数之比为大约1到大约1,000。此外，螯合剂的摩尔数与B-2036蛋白的摩尔数之比可以分别为大约20到大约1,000，大约50到大约250，或大约60到大约110。

通常，在螯合剂和B-2036蛋白组分(宿主细胞内或来自宿主细胞)之间充分接触(以降低三硫化物同工型杂质的水平)完成后，缓冲液中B-2036蛋白组分的浓度分别大约0.1mg/ml到大约20mg/ml，大约0.5mg/ml到大约5mg/ml，或大约1mg/ml到大约5mg/ml。

此外，在螯合剂加到宿主细胞或其含有B-2036蛋白组分的裂解液中后，生长培养基连同缓冲液，螯合剂和其他内容物(包括但不限于B-2036)的温度范围应维持在大约0℃到大约35℃。同样，优选地，宿主细胞和/或从中获得的含有B-2036组分的裂解液的温度分别维持在大约1℃到大约15℃，大约2℃到大约10℃，或大约2℃到大约15℃。优选地，在加入螯合剂(例如，EDTA)时，其温度为大约4℃，而含有B-2036的匀浆的温度在均质时升至大约30℃。值得注意的是，B-2036蛋白在大约40+℃发生变性。为此，理想的是维持匀浆(即，含有宿主细胞，生长培养基，缓冲液，螯合剂和B-2036等)的温度低于B-2036的蛋白变性温度。

另外，B-2036组分与螯合剂之间的接触时间应足以降低三硫化物同工型杂质的水平。用于降低三硫化物同工型杂质的合适接触时间示例性分别为至少大约30分钟，大约1小时到大约48小时，或大约5小时到约15小时。

通常，在螯合剂与B-2036组分之间充分接触后，含有上述成分的缓冲液的体积分别为大约1升到大约5,000升，大约10升到大约500升，或100升到大约300升。其他合适的体积示例性为160升到大约500升。

在螯合剂与B-2036组分之间接触的过程中其他有关的参数包括混合比等。混合比应足以形成均匀的混合物(宿主细胞，其裂解液，缓冲液，螯合剂，B-2036组分以及生长培养基中的其他任何组分的混合物)，同时使形成的泡沫量最小化。本领域技术人员可轻易地确定，怎样的混合比应是足够的。显然，混合比应使温度维持在上述范围内，并且使B-2036蛋白组分的降解最小化。

C.用金属盐降低三硫化物同工型杂质

无需受理论约束，据信选定的金属盐与下列物质的接触会使半胱氨酸-S-S-S-半胱氨酸三硫化物桥转化回到其半胱氨酸-S-S-半胱氨酸天然形式或降低杂质的水平：(1)三硫化物同工型杂质，(2)重组生长激素拮抗剂B-2036，(3)宿主细胞组分(用于重组生产拮抗剂)，以及(4)上述(1)-(3)的全部组合。此外，同样无需受理论约束，金属盐的存在有可能防止三硫化物桥本身的进一步形成。

通常，金属盐加入到宿主细胞，其在生长过程中和/或生长之后，合成所需的重组B-2036蛋白组分。此外，在生长和接触步骤进行之后，优选纯化B-2036蛋白。其后，纯化的蛋白优选被PEG化以生成PEG B-2036(派格索曼)。PEG化步骤参见U.S.专利No.5,849,535。

任何金属盐可用于本发明，只要其与B-2036蛋白组分及其三硫化物同工型杂质一起接触(优选足够混合)时，足以降低三硫化物同工型杂质的水平，优选不降解(或基本上不降解)B-2036产物。适用于本发明的金属盐包括但不限于碱金属盐，碱土金属盐，过渡金属盐，及其组合。适用于本发明的优选金属盐包括但不限于，磷酸钾，乙酸钾，磷酸钠，乙酸钠，氯化锌及其组合。

其他合适的金属盐示于下列参考文献中：(1)The Merck Index，第12版，S.Budavari(编辑)，Merck&Co.，Inc.，Therapeutic Category andBiological Activity Index(治疗目录和生物活性索引)，p.THER-19(在“螯合剂”子目录下)，Whitehouse Station，NJ(1996)及其迄今为止的每个后续版本；(2)Remington′s Pharmaceutical Sciences，第16版，ArthurOsol(编辑)，Mack Publishing Co.，Easton，Pennsylvania(1980)及其迄今为止的每个后续版本；(3)The United States Pharmacopeia，第21次修订(第16版)，United States Pharmacopeial Convention，Inc.，Rockville，Maryland(1985)及其迄今为止的每个后续版本；(4)SIGMA，Biochemicals andReagents for Life Science Research Catalogue，St.Louis，Missouri(2002-2003)；以及(5)Aldrich，Handbook of Fine Chemicals and LaboratoryEquipment，Milwaukee，Wisconsin(2000-2001)及其(2002-2003)版。

在用于本发明的合适金属盐中，磷酸钠，ZnCl₂及其组合也是优选的。适用于本发明的金属盐的量应足以使三硫化物同工型杂质降低至少大约10％的形成的最高平衡浓度(或其最高平均平衡浓度，其中多批次平均)。优选地，三硫化物同工型杂质的量分别降低至少大约20％，30％，40％，或50％形成的最高平衡浓度(或其最高平均平衡浓度)。适用于本发明的金属盐(例如，磷酸钠)的初始浓度优选分别为至少大约0.1mM，大约1mM到大约500mM，大约1mM到大约200mM，大约5mM到大约175mM，大约10mM到大约150mM，或大约25mM到大约100mM。

优选提供金属盐的缓冲液。然而，磷酸钠可充当缓冲液和合适的金属盐。其他合适的金属盐可加入磷酸钠缓冲液。优选地，缓冲液适用于本发明，即不会阻止B-2036蛋白组分的形成或一旦其形成就被降解。适用于本发明的缓冲液包括但不限于Tris，磷酸，HEPES，柠檬酸，三乙胺，和组氨酸。优选的起始缓冲液浓度为大约1mM到大约200mM，更优选大约5mM到大约100mM，甚至更优选大约8mM到大约70mM，以及最优选大约10mM到大约50mM。其他合适的缓冲液也可使用。优选地，这些缓冲液足以维持生长培养基的pH，范围分别大约4到大约9，大约4.5到大约7.5，或大约5.5到大约7.5。

在金属盐提供在缓冲液(或在NaP的情形下，其中NaP溶液充当金属盐和缓冲液)以后，金属盐在缓冲液(或NaP溶液也充当缓冲液)中的量应使金属盐的摩尔数与B-2036蛋白的摩尔数之比为大约1到大约10,000。此外，金属盐的摩尔数与B-2036蛋白的摩尔数之比可以分别为大约300到大约10,000，大约500到大约5,000，或大约500到大约2500。

通常，在金属盐和B-2036蛋白组分(宿主细胞内或来自宿主细胞)之间充分接触(以降低三硫化物同工型杂质的水平)完成后，缓冲液中B-2036蛋白组分的浓度分别大约0.1mg/ml到大约20mg/ml，大约0.5mg/ml到大约5mg/ml，或大约1mg/ml到大约5mg/ml。

此外，在金属盐加到宿主细胞或其含有B-2036蛋白组分的裂解液中后，生长培养基与缓冲液，金属盐和其他内容物(包括但不限于B-2036)一起的温度范围优选应维持在大约0℃到大约35℃。同样，优选地，宿主细胞和/或从中获得的含有B-2036组分的裂解液的温度分别维持在大约1℃到大约15℃，大约2℃到大约10℃，或大约2℃到大约15℃。注意，在用金属盐(例如，NaP)均质时，匀浆的温度可能上升。值得注意的是，B-2036蛋白在大约40+℃发生变性。为此，理想的是维持匀浆(即，含有宿主细胞，生长培养基，缓冲液，金属盐，B-2036以及任选巯基化合物等)的温度低于B-2036的蛋白变性温度。

另外，B-2036组分与螯合剂之间的接触时间应足以降低三硫化物同工型杂质的水平。用于降低三硫化物同工型杂质的合适接触时间示例性应分别为至少大约30分钟，大约1小时到大约48小时，或大约5小时到大约15小时。

通常，在金属盐与B-2036组分之间充分接触后，含有上述成分的缓冲液的体积分别为大约1升到大约5,000升，大约100升到大约2,000升，或200升到大约1,500升。

在金属盐与B-2036组分之间接触的过程中其他有关的参数包括混合比等。混合比应足以形成均匀的混合物(宿主细胞，其裂解液，缓冲液，金属盐，B-2036组分以及生长培养基中的其他任何组分的混合物)，同时使形成的泡沫量最小化。本领域技术人员可轻易地确定，怎样的混合比应是足够的。显然，混合比应使温度维持在上述范围内，并且使B-2036蛋白组分的降解最小化。

2.重组生长激素拮抗剂及其Des-Phe同工型杂质

a.用螯合剂降低Des-Phe同工型杂质

无需受理论约束，据信向重组生长激素拮抗剂B-2036中加入螯合剂导致des-phe同工型杂质水平的降低，或者使其水平真正减少，和/或防止进一步形成des-phe。

通常，螯合剂加入到宿主细胞，其在生长过程中和/或生长之后，合成所需的重组B-2036蛋白组分。此外，在生长和接触步骤进行之后，优选纯化B-2036蛋白。其后，纯化的蛋白优选被PEG化以生成PEG B-2036(派格索曼)。PEG化步骤参见U.S.专利No.5,849,535。

任何螯合剂可用于本发明，只要其与B-2036蛋白组分及其des-phe同工型杂质一起接触(优选足够混合)时，足以降低des-phe同工型杂质的水平，优选不降解(或基本上不降解)B-2036产物。优选的适用于本发明的螯合剂包括但不限于EDTA，EGTA，和DTPA。其他示例性螯合剂包括但不限于去铁敏，二硫卡钠，EDTA钙二钠，EDTA二钠，EDTA钠，EDTA三钠，青霉胺，喷替酸钙钠，喷替酸，二巯丁二酸，和曲恩汀。注意EDTA钠是EDTA的盐形式。

其他用于本发明的合适螯合剂示于下列参考文献中：(1)TheMerck Index，第12版，S.Budavari(编辑)，Merck & Co.，Inc.，TherapeuticCategory and Biological Activity Index(治疗目录和生物活性索引)，p.THER-19(在“螯合剂”子目录下)，Whitehouse Station，NJ(1996)及其迄今为止的每个后续版本；(2)Remington′s Pharmaceutical Sciences，第16版，Arthur Osol(编辑)，Mack Publishing Co.，Easton，Pennsylvania(1980)及其迄今为止的每个后续版本；(3)The United States Pharmacopeia，第21次修订(第16版)，United States Pharmacopeial Convention，Inc.，Rockville，Maryland(1985)及其迄今为止的每个后续版本；(4)SIGMA，Biochemicals and Reagents for Life Science Research Catalogue，St.Louis，Missouri(2002-2003)；以及(5)Aldrich，Handbook of Fine Chemicals andLaboratory Equipment，Milwaukee，Wisconsin(2000-2001)及其(2002-2003)版。

在合适的螯合剂中，EDTA是最优选的。适用于本发明的螯合剂的量应足以使des-phe同工型杂质降低至少大约10％的形成的最高平衡浓度(或其最高平均平衡浓度，其中取多批次平均)。优选地，des-phe同工型杂质的量分别降低至少大约20％，30％，40％，或50％形成的最高平衡浓度(或其最高平均平衡浓度)。适用于本发明的EDTA的初始浓度优选分别为至少大约0.01mM，大约0.01mM到大约100mM，大约0.1mM到大约20mM，大约2mM到大约10mM，或大约2mM到大约5mM。

优选提供螯合剂的缓冲液。优选地，缓冲液适用于本发明，即不会防止B-2036蛋白组分的形成或一旦其形成就被降解。适用于本发明的缓冲液包括但不限于Tris，磷酸，HEPES，柠檬酸，三乙胺，和组氨酸。优选的缓冲液为Tris。优选的起始缓冲液浓度为大约1mM到大约200mM，更优选大约5mM到大约100mM，甚至更优选大约8mM到大约70mM，以及最优选大约10mM到大约50mM。其他合适的缓冲液也可使用。优选地，这些缓冲液足以维持生长培养基的pH，范围分别大约6到大约9，大约6.5到大约7.5，或大约7.2到大约7.5。

如上所述，优选提供螯合剂的缓冲液。此外，缓冲液中螯合剂的量应使螯合剂的摩尔数与B-2036蛋白的摩尔数之比为大约1到大约1,000。此外，螯合剂的摩尔数与B-2036蛋白的摩尔数之比可以分别为大约20到大约1,000，大约50到大约250，或大约60到大约110。

通常，在螯合剂和B-2036蛋白组分(宿主细胞内或来自宿主细胞)之间充分接触(以降低des-phe同工型杂质的水平)完成后，缓冲液中B-2036蛋白组分的浓度分别大约0.1mg/ml到大约20mg/ml，大约0.5mg/ml到大约5mg/ml，或大约1mg/ml到大约5mg/ml。

此外，在螯合剂加到宿主细胞或其含有B-2036蛋白组分的裂解液中后，生长培养基连同缓冲液，螯合剂和其他内容物(包括但不限于B-2036)的温度范围应维持在大约0℃到大约35℃。同样，优选地，宿主细胞和/或从中获得的含有B-2036组分的裂解液的温度分别维持在大约1℃到大约15℃，大约2℃到大约10℃，或大约2℃到大约15℃。注意，优选的，在加入螯合剂(例如，EDTA)时，其温度为大约4℃，而含有B-2036的匀浆的温度在均质后升至大约30℃。值得注意的是，B-2036蛋白在大约40+℃发生变性。为此，理想的是维持匀浆(即，含有宿主细胞，生长培养基，缓冲液，螯合剂和B-2036等)的温度低于B-2036的蛋白变性温度。

另外，B-2036组分与螯合剂之间的接触时间应足以降低des-phe同工型杂质的水平。用于降低des-phe同工型杂质的合适接触时间示例性应分别为至少大约30分钟，大约1小时到大约48小时，或大约5小时到大约15小时。

通常，在螯合剂与B-2036组分之间充分接触后，含有上述成分的缓冲液的体积分别为大约1升到大约5,000升，大约10升到大约500升，或100升到大约300升。其他合适的体积示例性为160升到大约500升。

在螯合剂与B-2036组分之间接触的过程中其他有关的参数包括混合比等。混合比应足以形成均匀的混合物(宿主细胞，其裂解液，缓冲液，螯合剂，B-2036组分以及生长培养基中的其他任何组分的混合物)，同时使形成的泡沫量最小化。本领域技术人员可轻易地确定，怎样的混合比应是足够的。显然，混合比应使温度维持在上述范围内，并且使B-2036蛋白组分的降解最小化。

b.用金属盐降低Des Phe同工型杂质

无需受理论约束，据信向重组生长激素拮抗剂B-2036中加入金属盐导致des-phe同工型杂质水平的降低，或者使其水平真正减少，和/或防止进一步形成des-phe。

通常，金属盐加入到宿主细胞，其在生长过程中和/或生长之后，合成所需的重组B-2036蛋白组分。此外，在生长和接触步骤进行之后，优选纯化B-2036蛋白。其后，纯化的蛋白优选被PEG化以生成PEG B-2036(派格索曼)。PEG化步骤参见U.S.专利No.5,849,535。

任何金属盐可用于本发明，只要其与B-2036蛋白组分及其des-phe同工型杂质一起接触(优选足够混合)时，足以降低des-phe同工型杂质的水平，优选不降解(或基本上不降解)B-2036产物。适用于本发明的金属盐包括但不限于碱金属盐，碱土金属盐，过渡金属盐，及其组合。适用于本发明的优选金属盐包括但不限于，磷酸钾，乙酸钾，磷酸钠，乙酸钠，氯化锌及其组合。

其他用于本发明的合适金属盐示于下列参考文献中：(1)TheMerck Index，第12版，S.Budavari(编辑)，Merck & Co.，Inc.，TherapeuticCategory and Biological Activity Index(治疗目录和生物活性索引)，p.THER-19(在“螯合剂”子目录下)，Whitehouse Station，NJ(1996)及其迄今为止的每个后续版本；(2)Remington′s Pharmaceutical Sciences，第16版，Arthur Osol(编辑)，Mack Publishing Co.，Easton，Pennsylvania(1980)及其迄今为止的每个后续版本；(3)The United StatesPharmacopeia，第21次修订(第16版)，United States PharmacopeialConvention，Inc.，Rockville，Maryland(1985)及其迄今为止的每个后续版本；(4)SIGMA，Biochemicals and Reagents for Life Science ResearchCatalogue，St.Louis，Missouri(2002-2003)；以及(5)Aldrich，Handbook ofFine Chemicals and Laboratory Equipment，Milwaukee，Wisconsin(2000-2001)及其(2002-2003)版。

在用于本发明的合适金属盐中，磷酸钠，ZnCl₂及其组合也是优选的。适用于本发明的金属盐的量应足以使des-phe同工型杂质降低至少大约10％的形成的最高平衡浓度(或其最高平均平衡浓度，其中多批次平均)。优选地，des-phe同工型杂质的量分别降低至少大约20％，30％，40％，或50％的形成的最高平衡浓度(或其最高平均平衡浓度)。适用于本发明的金属盐(例如，磷酸钠)的初始浓度优选分别为至少大约0.1mM，大约1mM到大约500mM，大约1mM到大约200mM，大约5mM到大约175mM，大约10mM到大约150mM，或大约25mM到大约100mM。

优选提供金属盐的缓冲液。然而，磷酸钠可充当缓冲液和合适的金属盐。其他合适的金属盐可加入磷酸钠缓冲液。优选地，缓冲液适用于本发明，即不会降解B-2036蛋白组分的形成。适用于本发明的缓冲液包括但不限于Tris，磷酸，HEPES，柠檬酸，三乙胺，和组氨酸。优选的起始缓冲液浓度为大约1mM到大约200mM，更优选大约5mM到大约100mM，甚至更优选大约8mM到大约70mM，以及最优选大约10mM到大约50mM。其他合适的缓冲液也可使用。优选地，这些缓冲液足以维持生长培养基的pH，范围分别大约4到大约9，大约4.5到大约7.5，或大约5.5到大约7.5。

在金属盐提供在缓冲液(或在NaP的情形下，其中NaP溶液充当金属盐和缓冲液)以后，金属盐在缓冲液(或NaP溶液也充当缓冲液)中的量应使金属盐的摩尔数与B-2036蛋白的摩尔数之比为大约1到大约10,000。此外，金属盐的摩尔数与B-2036蛋白的摩尔数之比可以分别为大约300到大约10,000，大约500到大约5,000，或大约500到大约2500。

通常，在金属盐和B-2036蛋白组分(宿主细胞内或来自宿主细胞)之间充分接触(以降低des-phe同工型杂质的水平)完成后，缓冲液中B-2036蛋白组分的浓度分别大约0.1mg/ml到大约20mg/ml，大约0.5mg/ml到大约5mg/ml，或大约1mg/ml到大约5mg/ml。

此外，在金属盐加到宿主细胞或其含有B-2036蛋白组分的裂解液中后，生长培养基连同缓冲液，金属盐和其他内容物(包括但不限于B-2036)的温度范围优选应维持在大约0℃到大约35℃。同样，优选地，宿主细胞和/或从中获得的含有B-2036组分的裂解液的温度分别维持在大约1℃到大约15℃，大约2℃到大约10℃，或大约2℃到大约15℃。注意，在用金属盐(例如，NaP)均质时，匀浆的温度可能上升。值得注意的是，B-2036蛋白在大约40+℃发生变性。为此，理想的是维持匀浆(即，含有宿主细胞，生长培养基，缓冲液，金属盐，B-2036以及任选巯基化合物等)的温度低于B-2036的蛋白变性温度。

另外，B-2036组分与金属盐之间的接触时间应足以降低des-phe同工型杂质的水平。用于降低des-phe同工型杂质的合适接触时间示例性应分别为至少大约30分钟，大约1小时到大约48小时，或大约5小时到大约15小时。

通常，在金属盐与B-2036组分之间充分接触后，含有上述成分的缓冲液的体积分别为大约1升到大约5,000升，大约100升到大约2,000升，或200升到大约1,500升。

在金属盐与B-2036组分之间接触的过程中其他有关的参数包括混合比等。混合比应足以形成均匀的混合物(宿主细胞，其裂解液，缓冲液，金属盐，B-2036组分以及生长培养基中的其他任何组分的混合物)，同时使形成的泡沫量最小化。本领域技术人员可轻易地确定，怎样的混合比应是足够的。显然，混合比应使温度维持在上述范围内，并且使B-2036蛋白组分的降解最小化。

3.重组生长激素及其Des-Phe同工型杂质

a.用螯合剂降低Des-Phe同工型杂质

无需受理论约束，据信向重组生长激素中加入螯合剂导致des-phe同工型杂质水平的降低，或者使其水平真正减少，和/或防止进一步形成des-phe。

通常，螯合剂加入到宿主细胞，其在生长过程中和/或生长之后，合成所需的重组生长激素蛋白。此外，在生长和接触步骤进行之后，优选纯化生长激素蛋白。

任何螯合剂可用于本发明，只要其与生长激素蛋白及其des-phe同工型杂质一起接触(优选足够混合)时，足以降低des-phe同工型杂质的水平，优选不降解(或基本上不降解)生长激素产物。优选的适用于本发明的螯合剂包括但不限于EDTA，EGTA，和DTPA。其他示例性螯合剂包括但不限于去铁敏(Deferoxamine)，二硫卡钠(Ditiocarb Sodium)，EDTA钙二钠，EDTA二钠，EDTA钠，EDTA三钠，青霉胺，喷替酸钙钠(Pentetate Calcium Trisodium)，喷替酸(Pentetic Acid)，二巯丁二酸(Succimer)，和曲恩汀(Trientine)。注意EDTA钠是EDTA的盐形式。

其他用于本发明的合适螯合剂示于下列参考文献中：(1)TheMerck Index，第12版，S.Budavari(编辑)，Merck & Co.，Inc.，TherapeuticCategory and Biological Activity Index(治疗目录和生物活性索引)，p.THER-19(在“螯合剂”子目录下)，Whitehouse Station，NJ(1996)及其迄今为止的每个后续版本；(2)Remington′s Pharmaceutical Sciences，第16版，Arthur Osol(编辑)，Mack Publishing Co.，Easton，Pennsylvania(1980)及其迄今为止的每个后续版本；(3)The United States Pharmacopeia，第21次修订(第16版)，United States Pharmacopeial Convention，Inc.，Rockville，Maryland(1985)及其迄今为止的每个后续版本；(4)SIGMA，Biochemicals and Reagents for Life Science Research Catalogue，St.Louis，Missouri(2002-2003)；以及(5)Aldrich，Handbook of Fine Chemicals andLaboratory Equipment，Milwaukee，Wisconsin(2000-2001)及其(2002-2003)版。

在合适的螯合剂中，EDTA是最优选的。适用于本发明的螯合剂的量应足以使des-phe同工型杂质降低至少大约10％的形成的最高平衡浓度(或其最高平均平衡浓度，其中多批次平均)。优选地，des-phe同工型杂质的量分别降低至少大约20％，30％，40％，或50％的形成的最高平衡浓度(或其最高平均平衡浓度)。适用于本发明的EDTA的初始浓度优选分别为至少大约0.01mM，大约0.01mM到大约100mM，大约0.1mM到大约20mM，大约2mM到大约10mM，或大约2mM到大约5mM。

优选提供螯合剂的缓冲液。优选地，缓冲液适用于本发明，即不会防止B-2306蛋白组分的形成或一旦其形成就被降解。适用于本发明的缓冲液包括但不限于Tris，磷酸，HEPES，柠檬酸，三乙胺，和组氨酸。优选的缓冲液为Tris。优选的起始缓冲液浓度为大约1mM到大约200mM，更优选大约5mM到大约100mM，甚至更优选大约8mM到大约70mM，以及最优选大约10mM到大约50mM。其他合适的缓冲液也可使用。优选地，这些缓冲液足以维持生长培养基的pH，范围分别大约6到大约9，大约6.5到大约7.5，或大约7.2到大约7.5。

如上所述，优选提供螯合剂的缓冲液。此外，缓冲液中螯合剂的量应使螯合剂的摩尔数与生长激素蛋白(例如，hGH)的摩尔数之比为大约1到大约1,000。此外，螯合剂的摩尔数与生长激素蛋白(例如，hGH)的摩尔数之比可以分别为大约20到大约1,000，大约50到大约250，或大约60到大约110。

通常，在螯合剂和生长激素蛋白(例如，hGH)(宿主细胞内或来自宿主细胞)之间充分接触(以降低des-phe同工型杂质的水平)完成后，缓冲液中生长激素蛋白(例如，hGH)的浓度分别大约0.1mg/ml到大约20mg/ml，大约0.5mg/ml到大约5mg/ml，或大约1mg/ml到大约5mg/ml。

此外，在螯合剂加到宿主细胞或其含有生长激素蛋白的裂解液中后，生长培养基连同缓冲液，螯合剂和其他内容物(包括但不限于生长激素蛋白)的温度范围应维持在大约0℃到大约35℃。同样，优选地，宿主细胞和/或从中获得的含有生长激素蛋白的裂解液的温度分别维持在大约1℃到大约15℃，大约2℃到大约10℃，或大约2℃到大约15℃。注意，优选地，在加入螯合剂(例如，EDTA)时，其温度为大约4℃，而含有生长激素的匀浆的温度在均质后升至大约30℃。值得注意的是，生长激素蛋白在大约40+℃发生变性。为此，理想的是维持匀浆(即，含有宿主细胞，生长培养基，缓冲液，螯合剂和生长激素蛋白等)的温度低于生长激素的蛋白变性温度。

另外，生长激素蛋白与螯合剂之间的接触时间应足以降低des-phe同工型杂质的水平。用于降低des-phe同工型杂质水平的合适接触时间示例性应分别为至少大约30分钟，大约1小时到大约48小时，或大约5小时到大约15小时。

通常，在螯合剂与生长激素蛋白之间充分接触后，含有上述成分的缓冲液的体积分别为大约1升到大约5,000升，大约10升到大约500升，或100升到大约300升。其他合适的体积示例性为160升到大约500升。

在螯合剂与生长激素蛋白之间接触的过程中其他有关的参数包括混合比等。混合比应足以形成均匀的混合物(宿主细胞，其裂解液，缓冲液，螯合剂，生长激素蛋白以及生长培养基中的其他任何组分的混合物)，同时使形成的泡沫量最小化。本领域技术人员可轻易地确定，怎样的混合比应是足够的。显然，混合比应使温度维持在上述范围内，并且使生长激素蛋白组分的任何降解最小化。

b.用金属盐降低Des Phe同工型杂质

无需受理论约束，据信向重组生长激素中加入金属盐导致des-phe同工型杂质水平的降低，或者使其水平真正减少，和/或防止进一步形成des-phe。

通常，金属盐加入到宿主细胞，其在生长过程中和/或生长之后，合成所需的重组生长激素蛋白。此外，在生长和接触步骤进行之后，优选纯化生长激素蛋白。

任何金属盐可用于本发明，只要其与生长激素蛋白组分及其des-phe同工型杂质一起接触(优选足够混合)时，足以降低des-phe同工型杂质的水平，优选不降解(或基本上不降解)生长激素产物。适用于本发明的金属盐包括但不限于碱金属盐，碱土金属盐，过渡金属盐，及其组合。适用于本发明的优选金属盐包括但不限于，磷酸钾，乙酸钾，磷酸钠，乙酸钠，氯化锌及其组合。

其他用于本发明的合适金属盐示于下列参考文献中：(1)TheMerck Index，第12版，S.Budavari(编辑)，Merck & Co.，Inc.，TherapeuticCategory and Biological Activity Index(治疗目录和生物活性索引)，p.THER-19(在“螯合剂”子目录下)，Whitehouse Station，NJ(1996)及其迄今为止的每个后续版本；(2)Remington′s Pharmaceutical Sciences，第16版，Arthur Osol(编辑)，Mack Publishing Co.，Easton，Pennsylvania(1980)及其迄今为止的每个后续版本；(3)The United StatesPharmacopeia，第21次修订(第16版)，United States PharmacopeialConvention，Inc.，Rockville，Maryland(1985)及其迄今为止的每个后续版本；(4)SIGMA，Biochemicals and Reagents for Life Science ResearchCatalogue，St.Louis，Missouri(2002-2003)；以及(5)Aldrich，Handbook ofFine Chemicals and Laboratory Equipment，Milwaukee，Wisconsin(2000-2001)及其(2002-2003)版。

在用于本发明的合适金属盐中，磷酸钠，ZnCl₂及其组合也是优选的。适用于本发明的金属盐的量应足以使des-phe同工型杂质降低至少大约10％的形成的最高平衡浓度(或其最高平均平衡浓度，其中多批次平均)。优选地，des-phe同工型杂质的量分别降低至少大约20％，30％，40％，或50％的形成的最高平衡浓度(或其最高平均平衡浓度)。适用于本发明的金属盐(例如，磷酸钠)的初始浓度优选分别为至少大约0.1mM，大约1mM到大约500mM，大约1mM到大约200mM，大约5mM到大约175mM，大约10mM到大约150mM，或大约25mM到大约100mM。

优选提供金属盐的缓冲液。然而，磷酸钠可充当缓冲液和合适的金属盐。其他合适的金属盐可加入磷酸钠缓冲液。优选地，缓冲液适用于本发明，即不会防止B-2036蛋白组分的形成或一旦形成就被降解。适用于本发明的缓冲液包括但不限于Tris，磷酸，HEPES，柠檬酸，三乙胺，和组氨酸。优选的起始缓冲液浓度为大约1mM到大约200mM，更优选大约5mM到大约100mM，甚至更优选大约8mM到大约70mM，以及最优选大约10mM到大约50mM。其他合适的缓冲液也可使用。优选地，这些缓冲液足以维持生长培养基的pH，范围分别大约4到大约9，大约4.5到大约7.5，或大约5.5到大约7.5。

在金属盐提供在缓冲液(或在NaP的情形下，其中NaP溶液充当金属盐和缓冲液)以后，金属盐在缓冲液(或NaP溶液也充当缓冲液)中的量应使金属盐的摩尔数与生长激素蛋白(例如，hGH)的摩尔数之比为大约1到大约10,000。此外，金属盐的摩尔数与生长激素蛋白(例如，hGH)的摩尔数之比可以分别为大约300到大约10,000，大约500到大约5,000，或大约500到大约2500。

通常，在金属盐和生长激素蛋白(例如，hGH)(宿主细胞内或来自宿主细胞)之间充分接触(以降低des-phe同工型杂质的水平)完成后，缓冲液中生长激素蛋白的浓度分别大约0.1mg/ml到大约20mg/ml，大约0.5mg/ml到大约5mg/ml，或大约1mg/ml到大约5mg/ml。

此外，在金属盐加到宿主细胞或其含有生长激素蛋白的裂解液中后，生长培养基与缓冲液，金属盐和其他内容物(包括但不限于生长激素蛋白)一起的温度范围优选应维持在大约0℃到大约35℃。同样，优选地，宿主细胞和/或从中获得的含有生长激素蛋白的裂解液的温度分别维持在大约1℃到大约15℃，大约2℃到大约10℃，或大约2℃到大约15℃。注意，在用金属盐(例如，NaP)均质时，匀浆的温度可能上升。值得注意的是，生长激素蛋白在大约40+℃发生变性。为此，理想的是维持匀浆(即，含有宿主细胞，生长培养基，缓冲液，金属盐，生长激素蛋白以及任选巯基化合物等)的温度低于生长激素的蛋白变性温度。

另外，生长激素蛋白与金属盐之间的接触时间应足以降低des-phe同工型杂质的水平。用于降低des-phe同工型杂质的合适接触时间示例性应分别为至少大约30分钟，大约1小时到大约48小时，或大约5小时到大约15小时。

通常，在金属盐与生长激素蛋白之间充分接触后，含有上述成分的缓冲液的体积分别为大约1升到大约5,000升，大约100升到大约2,000升，或200升到大约1,500升。

在金属盐与生长激素蛋白之间接触的过程中其他有关的参数包括混合比等。混合比应足以形成均匀的混合物(宿主细胞，其裂解液，缓冲液，金属盐，生长激素蛋白以及生长培养基中的其他任何组分的混合物)，同时使形成的泡沫量最小化。本领域技术人员可轻易地确定，怎样的混合比应是足够的。显然，混合比应使温度维持在上述范围内，并且使生长激素蛋白组分的降解最小化。

4.PEG化的多肽及其聚集体

a.用阴离子交换层析降低聚集体

在制备和纯化B-2036PEG中，本体中间体或B-2036分子的制备如上所述。其后，B-2036分子的处理根据下列6步进行以生成目的B-2036PEG蛋白的最终API。这6个步骤如下：

1.PEG化以生成PEG化的B-2036，

2.HIC层析(任选步骤)以生成HIC池，

3.超滤/透滤(任选步骤)以生成透滤池，

4.AEX层析结合收集以生成AEX池，

5.透滤AEX池以生成透滤池，以及

6.API过滤(达到灭菌目的，优选地，通过0.22微米过滤器到收集管中用于冷冻)以生成最终API。

上述步骤1-6为示例性的，并且公开在流程图1和实施例1中。

参照步骤1，PEG化步骤完成本发明的第一步，以提供PEG化的目的蛋白同工型。其后，HIC步骤2和随后的透析步骤3两者皆为任选，优选进行以去除任何未PEG化蛋白，游离PEG分子，或其他任何在步骤2中可被去除的杂质。步骤3后，步骤3的透滤池再进行步骤4的阴离子交换层析以分离PEG-1，PEG-2，PEG-3，PEG-4，PEG-5，PEG-6，PEG-7，PEG-8和PEG-9同工型，然后加以收集以优选富集PEG-4，PEG-5和PEG-6同工型的水平至最终产物用于步骤5的透滤，接着步骤6的灭菌过滤的进一步处理，以生成最终API产物。

再参照PEG化步骤1，B-2036分子置于足以使B-2036分子自身PEG化成B-2036PEG的条件下，所述B-2036PEG包括PEG-1，PEG-2，PEG-3，PEG-4，PEG-5，PEG-6，PEG-7，PEG-8和PEG-9同工型。优选的PEG化参数提供在流程图1和实施例1。B-2036分子和优选通过共价连接有PEG分子的其他任何分子为选自PEG-N-羟基琥珀酰亚胺-5K，PEG-琥珀酰亚胺基碳酸酯-5K，PEG-琥珀酰亚胺基丙酸酯-5K，PEG2-马来酰亚胺-40K(2×20K)，PEG2-N-羟基琥珀酰亚胺-40K(2×20K)，以及PEG2-醛-40K(2×20K)的PEG分子。PEG分子加到B-2036分子(或其他任何需要PEG化的目的蛋白)，使其PEG化的量应使游离(未结合的)PEG分子的量与未PEG化蛋白分子的量之化学计量重量比为大约0.5到大约100，优选大约1.5到大约2.5，更优选大约1.9到大约2，以及最优选大约1.95到大约2.05。在PEG化过程中，B-2036分子(或其他任何待PEG化的目的蛋白)被PEG化的pH为大约3到大约10，优选大约7.2到大约7.8，更优选大约7.4到大约7.8，以及最优选大约7.40到大约7.80。PEG化步骤进行时的温度称为PEG化温度。PEG化温度为大约0℃到大约40℃，优选大约10℃到大约30℃，以及更优选大约18℃到大约25℃。

现在参照任选HIC步骤2，进行此步骤的优选参数提供在实施例1和流程图1中。在任选HIC层析步骤2中，将PEG化蛋白和任何未PEG化蛋白上样至HIC树脂上，HIC的上样量为≤大约10g蛋白/升HIC树脂的填充床体积，优选≤大约5g蛋白/升HIC树脂的填充床体积，或者≤大约4.1g蛋白/升HIC树脂的填充体积。同样，HIC上样导电率为大约30到大约60mS/cm，优选大约40到大约52mS/cm，或更优选大约45到大约51mS/cm。此外，HIC步骤进行的温度为大约10到大约40℃，优选大约15到大约30℃，以及最优选大约18到大约25℃。任选HIC步骤2分别去除HIC上样时存在的至少某些游离PEG，未PEG化蛋白和聚集体。

在HIC步骤2之后，获得HIC池。然后，将HIC池进行超滤/透滤步骤3，该步是任选的，如果进行HIC步骤2，则也进行超滤/透滤步骤3。然而，如果不进行HIC步骤2，则无需进行超滤/透滤步骤3。或者，超滤/透滤步骤3仍可在任选HIC步骤2缺乏下进行。超滤/透滤步骤3进行的优选条件如实施例1和流程图1所示。在此，本发明人称该步为UF/DF#3。UF/DF#3步骤进行所用的UF/DF#3膜的截留分子量(MWCO)为大约3kDa到大约20kDa，优选大约8kDa到大约15kDa，更优选大约10kDa到大约12kDa，以及最优选大约10kDa。

步骤3后，该处获得的产物称为透滤池。然后对透滤池进行步骤4，即阴离子交换层析和收集步骤。用于进行此AEX层析和收集步骤的优选条件提供在实施例1和流程图1中。将先前步骤(即，步骤3)的透滤池或PEG化蛋白(例如，如果未进行步骤2和3，则为步骤1的B-2036PEG)进行步骤4。实际上，无需步骤2的HIC处理，将含有B-2036PEG的步骤3的透滤池或步骤1的B-2036PEG，与任意游离PEG，任意PEG化蛋白，未PEG的蛋白部分PEG化蛋白，以及任何杂质(诸如，三硫化物或des-phe杂质)及其任意聚集体一起上样到阴离子交换树脂。

优选地，所用树脂为阴离子交换(AEX)树脂。优选的AEX树脂包括但不限于，ANX4，DEAE，Q-Sepharose，Q-Sepharose FF，Q-Sepharose HP，以及Q-Sepharose XL。优选的AEX树脂为Q-SepharoseFF。

优选地，AEX树脂包含的官能团选自伯，仲，叔，季胺及其组合。此外，AEX树脂包含的官能团选自二乙基氨基乙基，二乙基氨基丙基，二甲基乙醇胺，三甲基-铵乙基，三甲基苄基铵，二甲基乙醇苄基以及多胺官能团。此外，AEX树脂优选包含的支持材料选自亲水聚醚，交联二乙烯基苯聚苯乙烯，交联琼脂糖，聚丙烯，亲水丙烯酰胺乙烯基，甲基丙烯酸酯，带有陶瓷珠基的聚合水凝胶，复合的硅石-葡聚糖材料，聚合物接枝的硅石，二乙烯基苯聚苯乙烯，二乙烯基苯聚丙烯酸酯，交联纤维素，共聚物甲基丙烯酸酯，聚苯乙烯，丙烯酸酯，G5000亲水凝胶，以及纤维素。同样，优选使用AEX树脂，包括大孔树脂或凝胶树脂。通常，支持物质的直径为大约10到大约500μm，以及优选大约30μm。

AEX上样的导电率为大约10mS/cm，优选≤大约5mS/cm，以及最优选≤大约2.4mS/cm。AEC树脂上样的pH为大约5到大约10，优选大约6.6到大约9，更优选大约6.9到大约7.1。

包括三硫化物杂质或des-phe杂质或其聚集体等任何杂质在内的PEG化蛋白的上样量为≤10g蛋白/升AEX树脂的填充床体积，优选≤5.5g蛋白/升AEX树脂的填充的床体积，更优选≤大约4.1g蛋白/升AEX树脂的填充床体积。

根据一个实施方案，上样到AEX树脂上或在第一步提供PEG化蛋白中的PEG化蛋白包括一种或多种PEG化蛋白同工型，PEG-1，PEG-2，PEG-3，PEG-4，PEG-5，PEG-6，PEG-7，PEG-8，PEG-9和任何聚集体，三硫化物杂质及其des-phe-杂质和PEG化蛋白的任何未PEG化杂质，以及任何游离PEG分子。

根据另一实施方案，上样到AEX树脂上或在第一步提供PEG化蛋白中的PEG化蛋白包括一种或多种PEG化蛋白同工型，PEG-2，PEG-3，PEG-4，PEG-5，PEG-6，PEG-7，PEG-8和任何聚集体，三硫化物杂质及其des-phe-杂质和PEG化蛋白的任何未PEG化杂质，以及任何游离PEG分子。

根据另一实施方案，上样到AEX树脂上或在第一步提供PEG化蛋白中的PEG化蛋白包括一种或多种PEG化蛋白同工型，PEG-2，PEG-3，PEG-4，PEG-5，PEG-6，PEG-7，PEG-8和任何聚集体，三硫化物杂质及其des-phe-杂质和PEG化蛋白的任何未PEG化杂质，以及任何游离PEG分子。

根据另一实施方案，上样到AEX树脂上或在第一步提供PEG化蛋白中的PEG化蛋白包括一种或多种PEG化蛋白同工型，PEG-3，PEG-4，PEG-5，PEG-6，PEG-7，PEG-8和任何聚集体，三硫化物杂质及其des-phe-杂质和PEG化蛋白的任何未PEG化杂质，以及任何游离PEG分子。

根据另一实施方案，上样到AEX树脂上或在第一步提供PEG化蛋白中的PEG化蛋白包括一种或多种PEG化蛋白同工型，PEG-4，PEG-5，PEG-6，PEG-7，PEG-8和任何聚集体，三硫化物杂质及其des-phe-杂质和PEG化蛋白的任何未PEG化杂质，以及任何游离PEG分子。

根据另一实施方案，上样到AEX树脂上或在第一步提供PEG化蛋白中的PEG化蛋白包括一种或多种PEG化蛋白同工型，PEG-4，PEG-5，PEG-6，PEG-7和任何聚集体，三硫化物杂质及其des-phe-杂质和PEG化蛋白的任何未PEG化杂质，以及任何游离PEG分子。

根据另一实施方案，上样到AEX树脂上或在第一步提供PEG化蛋白中的PEG化蛋白包括一种或多种PEG化蛋白同工型，PEG-4，PEG-5，PEG-6和任何聚集体，三硫化物杂质及其des-phe-杂质和PEG化蛋白的任何未PEG化杂质，以及任何游离PEG分子。

根据另一实施方案，上样到AEX树脂上或在第一步提供PEG化蛋白中的PEG化蛋白包括一种或多种PEG化蛋白同工型，PEG-4，PEG-5，PEG-6和任何聚集体，三硫化物杂质及其des-phe-杂质和PEG化蛋白的任何未PEG化杂质。

根据另一实施方案，上样到AEX树脂上或在第一步提供PEG化蛋白中的PEG化蛋白包括一种或多种PEG化蛋白同工型，PEG-1，PEG-2，PEG-3，PEG-4，PEG-5，PEG-6，PEG-7，PEG-8和PEG-9及其任何聚集体，三硫化物杂质和des-phe-杂质。

根据另一实施方案，上样到AEX树脂上或在第一步提供PEG化蛋白中的PEG化蛋白包括一种或多种PEG化蛋白同工型，PEG-1，PEG-2，PEG-3，PEG-4，PEG-5，PEG-6，PEG-7，PEG-8和PEG-9及其任何聚集体，三硫化物杂质。

根据另一实施方案，上样到AEX树脂上或在第一步提供PEG化蛋白中的PEG化蛋白包括一种或多种PEG化蛋白同工型，PEG-1，PEG-2，PEG-3，PEG-4，PEG-5，PEG-6，PEG-7，PEG-8和PEG-9及其任何聚集体。

将PEG化蛋白与任何聚集体，三硫化物，和/或其des-phe杂质，任何未PEG化或部分PEG化蛋白以及任何游离PEG一起，在上样至AEX树脂上后，在洗脱步骤过程中用洗脱液进行洗脱，接着以多级分形式收集洗脱物。级分为柱体积的体积级分。洗脱步骤或通过pH梯度或离子强度梯度进行。如果洗脱以离子强度梯度进行，洗脱用盐溶液的含有离子盐的洗脱缓冲液进行，所述离子盐的浓度足以从AEX树脂洗脱上样的PEG化蛋白。优选地，离子盐为氯化物盐。更优选地，离子盐选自NaCl，氯化锂，磷酸钠，硫酸钠，氯化铵，硫酸铵，磷酸铵，KI和KCl。其他合适的离子盐也被认可用作AEX树脂，并引入，如同在此说明。优选地，离子盐为以缓冲液形式提供的氯化钠。在以洗脱缓冲液形式提供的盐溶液洗脱过程中，盐浓度梯度(例如，NaCl盐溶液)为大约2到大约50mM/CV，优选大约5到大约25Mm/CV，以及更优选大约10到大约20mM/CV，以及最优选大约10到大约12.5Mm/CV。其中提供盐溶液的洗脱缓冲液的pH为大约5到大约10，优选大约6.6到大约9，以及最优选大约6.9到大约7.1。此外，洗脱步骤进行的洗脱温度为≤大约50℃，优选≤大约35℃，更优选大约2到大约30℃，甚至更优选大约15到大约30℃，以及最优选大约18到大约25℃。

含有盐溶液的洗脱缓冲液导入AEX树脂柱，并以线性速率≤300cm/hr，优选大约10到大约150cm/hr，更优选30到大约100cm/hr，甚至更优选大约50到大约100cm/hr，亦甚更优选大约50到大约70cm/hr，亦甚更优选大约60到大约65cm/hr，以及最优选大约60cm/hr流过柱子。

当从AEX树脂收集洗脱物时，优选收集洗脱物的多体积级分范围为大约0.1到大约5个柱体积(CV)，优选大约0.1到大约1个CV级分，更优选大约0.1到大约0.5个CV，以及最优选大约0.1到大约0.2个CV体积级分。因此，例如，可收集100个单独级分，其数目多少依赖于盐溶液和通过AEX树脂收集多种不同的CV级分的洗脱缓冲液的总量。可理解的是，CV级分作为洗脱物在AEX柱的出口处(通常位于AEX柱的底部)进行连续收集。

各个收集的CV级分优选含有给定的PEG化蛋白同工型，诸如PEG-1，PEG-2，PEG-3，PEG-4，PEG-5，PEG-6，PEG-7，PEG-8和PEG-9。然后，合并所收集的CV级分以确定那个级分含有哪种PEG化蛋白同工型，再选择性组合如此收集的所需的PEG化蛋白同工型。

b.合并

因此，从AEX树脂收集的CV级分进行合并步骤以选择个别量的PEG化蛋白同工型，诸如PEG-1，PEG-2，PEG-3，PEG-4，PEG-5，PEG-6，PEG-7，PEG-8，以及PEG-9。各种不同的分析技术可用于选择性合并所需的PEG化蛋白同工型。这些技术包括但不限于，CE，SDS-PAGE，IEX层析，HIC层析，AEX层析，CEX层析，RPHPLC，SEHPLC，亲和层析(AC)，及其组合。CE或RPHPLC比SDS-PAGE更为优选。此外，无需受理论约束，SDS-PAGE所用的试剂(例如，十二烷基硫酸钠)据信遮掩任何形成的聚集体的测量值。SDS-PAGE中所用的十二烷基硫酸钠(SDS)据信破坏聚集体，以致聚集体测定的量降低或消失。然而，SDS-PAGE可成功地用于指纹识别(例如，确定收集的级分的PEG-1，PEG-2，PEG-3，PEG-4，PEG-5，PEG-6，PEG-7，PEG-8和PEG-9定性和定量组成)单个PEG化蛋白。当通过CE对池进行分析时，CE分析的温度为大约5到大约50℃，优选大约5到大约45℃，更优选大约20到大约40℃，以及最优选大约30到大约32℃。

同样，当使用CE时，CE进行的CE合并导电率(指样品级分的导电率)为大约0到大约60mS/cm，以及更优选大约5到大约10mS/cm。将导电率在上述CE合并导电率范围内的样品级分导入CE毛细管用于PEG化蛋白指纹识别。如此获得的相关CV级分的PEG化蛋白同工型指纹与对照标准比较以鉴定样品中存在的特定PEG化蛋白同工型。

由各个指纹峰获得的面积％与对应于级分指纹峰的同工型的重量％成比例。然后，以所需同工型的重量％，通过CE鉴定以所需重量％含有所需PEG化蛋白同工型的级分任选混合有其他同样选择的级分，以生成所需的同工型混合物。该工艺生成API混合物。

参见，例如，Swapan K.Chowdhury等，“Fingerprinting ProteinsCoupled with Polymers by Mass Spectrometry：Investigation ofPolyethylene Glycol-Conjugated Superoxide Dismutase(通过质谱指纹识别偶联有聚合物的蛋白：聚乙二醇共轭的超氧化物歧化酶的研究)”，American Society for Mass Spectrometry，Vol.6，pp.478-487，1995。

对收集的CV级分进行CE分析而言，PEG化蛋白在缓冲液中的浓度分别为至少0.2mg/ml，至少大约0.5mg/ml，大约0.1到大约100mg/ml，大约0.5到大约10mg/l，或大约2到大约3mg/ml。利用CE，或上述任何分析技术用于合并级分，各种不同的PEG化蛋白同工型可组合生成所需的PEG化蛋白池。因此，例如，合并的PEG化蛋白可分别包含PEG-1到PEG-9中的一种或多种，PEG-2到PEG-9中的一种或多种，PEG-3到PEG-9中的一种或多种，PEG-3到PEG-8中的一种或多种，PEG-3到PEG-7中的一种或多种，PEG-3到PEG-6中的一种或多种，PEG-4到PEG-6中的一种或多种，PEG-4和PEG-5中的一种或多种，PEG-5和PEG-6中的一种或多种，以及PEG-5。

在上述池中，优选多种多样的PEG化蛋白池。例如，对PEG-4，PEG-5和PEG-6的池而言，基于特定池中的PEG化蛋白同工型的总重，其应含有至少70％重量的PEG-4，PEG-5和PEG-6。优选地，基于池中存在的PEG化蛋白同工型的总重，PEG-4，PEG-5和PEG-6的PEG化蛋白组分至少大约75％重量。该值分别更优选至少大约80％重量，至少大约85％重量，至少大约90％重量，以及至少大约94％重量，至少大约95％重量，至少大约96％重量，至少大约97％重量，至少大约98％重量，至少大约99％重量，至少大约99.5％重量，以及至少大约99.9％重量。

对于合并而言，对CV级分中收集的PEG化蛋白同工型进行合并，在CV级分中PEG化蛋白同工型提供在缓冲液中。其中含有PEG化蛋白同工型的缓冲液的pH大约5到大约10，优选大约6.6到大约9，以及更优选大约6.9到大约7.1。此外，缓冲液选自Tris，磷酸，HEPES，柠檬酸，三乙胺，以及组氨酸。

这时，根据上述方法(还在下文实施例1，3和4中所述)处理的合并的PEG化蛋白同工型应使合并产物的聚集体水平基于上述步骤1-5(步骤2和3是任选的)进行后的PEG化蛋白同工型及其任何聚集体的总重为≤大约10％重量。优选地，聚集体的水平基于上述总重，分别为≤大约9％，8％，7％，6％，5％，4％，3％，2％，1.5％，1％，0.9％，0.8％，0.7％，0.6％，0.5％，0.4％，0.3％，0.2％，0.1％，0.05％和0.01％重量。

如此合并的PEG化蛋白优选主要由PEG-1，PEG-2，PEG-3，PEG-4，PEG-5，PEG-6，PEG-7，PEG-8，和PEG-9中的一种或多种组成。如此合并的PEG化蛋白优选主要由PEG-2，PEG-3，PEG-4，PEG-5，PEG-6，PEG-7，PEG-8和PEG-9中的一种或多种组成。如此合并的PEG化蛋白优选主要由PEG-3，PEG-4，PEG-5，PEG-6，PEG-7，PEG-8和PEG-9中的一种或多种组成。如此合并的PEG化蛋白优选主要由PEG-3，PEG-4，PEG-5，PEG-6，PEG-7和PEG-8中的一种或多种组成。如此合并的PEG化蛋白优选主要由PEG-3，PEG-4，PEG-5，PEG-6和PEG-7中的一种或多种组成。如此合并的PEG化蛋白优选主要由PEG-3，PEG-4，PEG-5和PEG-6中的一种或多种组成。如此合并的PEG化蛋白优选主要由PEG-4，PEG-5和PEG-6中的一种或多种组成。如此合并的PEG化蛋白优选主要由PEG4和PEG-5中的一种或多种组成。如此合并的PEG化蛋白优选主要由PEG-5和PEG-6中的一种或多种组成。如此合并的PEG化蛋白优选主要由PEG-5组成。

可利用上述合并方法用于合并PEG化蛋白同工型，这不依赖于此种同工型是否已进行阴离子交换层析。

如果PEG化蛋白为PEG化生长激素拮抗剂，基于池中或收集的CV级分中PEG化生长激素拮抗剂同工型及其任何聚集体的总重，聚集体的水平优选为≤6％重量。更优选地，基于上述总重，聚集体的水平分别为≤大约5％，4％，3％，2％和1％重量。此外，如果PEG化蛋白为具有多种多样的同工型的PEG化生长激素拮抗剂，基于池中或收集的CV级分中PEG化生长激素拮抗剂同工型、所有三硫化物、所有des-phe杂质及其所有聚集体的总重，所有三硫化物杂质、所有des-phe杂质及其所有聚集体之和的“总水平”优选≤大约15％重量。优选地，上述总水平(所有三硫化物、所有des-phe杂质及其聚集体之和的总水平)基于总重分别为≤12％，10％，9％，8％，7％，6％，5％，4％，3％，2％和1％重量。

同样优选地，如果PEG化蛋白生长激素拮抗剂为B-2036PEG，其多肽骨架为SEQ ID NO.1的B-2036。同样，也优选地，如果PEG化蛋白为生长激素激动剂，则其多肽骨架为SEQ ID NO.2的多肽。

在步骤4AEX层析和合并之后，跟着进行步骤5超滤/透滤。进行此步骤5UF/DF的优选参数提供在实施例1和流程图1中。步骤5结束时，收集透滤池。然后，使所述透滤池进行步骤6，其采用上述透滤池中如此获得的活性药物成分，并且优选地，通过0.22μm过滤器过滤使之灭菌。进行API过滤步骤6的优选参数提供在实施例1和流程图1中。

最后，在下文实施例1中，提供了本发明要求保护的优选方法，其中列举上述步骤1-6的各个细节以及利用阴离子交换树脂层析步骤。为比较目的，提供了比较例2，其中用阳离子交换层析步骤同与之相关的合适缓冲液交换步骤一起替换阴离子交换层析步骤。实施例2的结果提供在表2中，其中聚集体水平的范围从高至大约60％到低至大约6％的聚集体重量。实施例3描述了合并方法，其或者适用于实施例1和流程图1的步骤，或者适用于实施例2和流程图2的步骤，在后者中，RPHPLC用作分析技术而与CE分析技术进行比较。图2，3和4显示RPHPLC等同于CE。实施例4提供CE分析技术的优选方法。

发明的实施方案

1.一种降低PEG化蛋白同工型聚集体水平的方法，所述方法包括下列步骤：

(a)提供所述PEG化蛋白同工型；以及

(b)利用阴离子交换树脂在足以使所述聚集体的水平降低的条件下，通过阴离子交换层析分离所述PEG化蛋白同工型。

2.实施方案1的方法，其中所述步骤(a)包含下列步骤(a1)：使所述蛋白的未PEG化形式或部分PEG化形式PEG化，或者使两形式均PEG化。

3.实施方案2的方法，其中所述步骤(a1)包含用选自下列游离PEG进行PEG化：PEG-N-羟基琥珀酰亚胺-5K，PEG-琥珀酰亚胺基碳酸酯-5K，PEG-琥珀酰亚胺基丙酸酯-5K，PEG2-马来酰亚胺-40K(2×20K)，PEG2-N-羟基琥珀酰亚胺-40K(2×20K)，以及PEG2-醛-40K(2×20K)。

4.实施方案3的方法，其中所述游离PEG与所述未PEG化蛋白的化学计量重量比为大约0.5到大约100。

5.实施方案4的方法，其中所述化学计量重量比为大约1.5到大约2.5。

6.实施方案5的方法，其中所述化学计量重量比为大约1.9到大约2。

7.实施方案6的方法，其中所述化学计量重量比为大约1.95到大约2.05。

8.实施方案2的方法，其中所述PEG化步骤(a1)在PEG化pH从大约3到大约10下进行。

9.实施方案8的方法，其中所述PEG化pH为大约7.2到大约7.8。

10.实施方案9的方法，其中所述PEG化pH为大约7.4到大约7.8。

11.10.实施方案9的方法，其中所述PEG化pH为大约7.40到大约7.80。

12.实施方案2的方法，其中所述PEG化步骤(a1)在PEG化温度从大约0到大约40℃下进行。

13.实施方案12的方法，其中所述PEG化温度为大约10到大约30℃。

14.实施方案13的方法，其中所述PEG化温度为大约18到大约25℃。

15.实施方案1的方法，进一步包含下列任选HIC步骤(a2)：利用HIC树脂通过疏水相互作用层析(HIC)选择所述的PEG化蛋白。

16.实施方案2的方法，进一步包含下列任选HIC步骤(a2)：利用HIC树脂通过疏水相互作用层析(HIC)选择所述的PEG化蛋白。

17.实施方案16的方法，其中所述HIC步骤(a2)包含使所述PEG化蛋白和任何未PEG化蛋白以HIC上样量小于或等于大约10g蛋白/L填充的HIC树脂的床体积上样到所述HIC树脂上。

18.实施方案17的方法，其中所述HIC上样量小于或等于大约5g蛋白/L填充的HIC树脂的床体积。

19.实施方案18的方法，其中所述HIC上样量小于或等于大约4.1g蛋白/L填充的HIC树脂的床体积。

20.实施方案17的方法，其中在所述HIC步骤(a2)中，所述上样在HIC上样导电率为大约30到大约60mS/cm的条件下进行。

21.实施方案20的方法，其中所述HIC上样导电率为大约40到大约52mS/cm。

22.实施方案21的方法，其中所述HIC上样导电率为大约45到大约51mS/cm。

23.实施方案17的方法，其中所述HIC步骤(a2)进行的HIC温度为大约10到大约40℃。

24.实施方案23的方法，其中所述HIC温度为大约15到大约30℃。

25.实施方案24的方法，其中所述HIC温度为大约18到大约25℃。

26.实施方案16的方法，其进一步包含下列UF/DF#3步骤(a3)：超滤/透滤(UF/DF#3)来自所述HIC步骤(a2)的洗脱液。

27.实施方案26的方法，其中所述UF/DF#3步骤(a3)进行所用的UF/DF#3膜的截留分子量(MWCO)为大约3kDa到大约20kDa。

28.实施方案27的方法，其中所述UF/DF#3膜的MWCO为大约8kDa到大约15kDa。

29.实施方案28的方法，其中所述UF/DF#3膜的MWCO为大约10kDa到大约12kDa。

30.实施方案29的方法，其中所述UF/DF#3膜的MWCO为大约10kDa。

31.实施方案1的方法，其中所述步骤(b)进一步包含下列(b1)步骤：使包括任何杂质及其任何聚集体的所述PEG化蛋白上样到所述阴离子交换(AEX)树脂以提供上样的PEG化蛋白。

32.实施方案31的方法，其中所述AEX树脂选自ANX4，DEAE，Q-Sepharose，Q-Sepharose FF，Q Sepharose HP，以及Q-Sepharose XL。

33.实施方案32的方法，其中所述AEX树脂为Q-Sepharose FF。

34.实施方案31的方法，其中所述步骤(b1)在AEX上样导电率小于或等于大约10mS/cm的条件下进行。

35.实施方案34的方法，其中所述AEX上样导电率小于或等于大约5mS/cm。

36.实施方案35的方法，其中所述AEX上样导电率小于或等于大约2.4mS/cm。

37.实施方案31的方法，其中所述步骤(b1)在AEX上样pH为大约5到大约10的条件下进行。

38.实施方案37的方法，其中所述AEX上样pH为大约6.6到大约9。

39.实施方案38的方法，其中所述AEX上样pH为大约6.9到大约7.1。

40.实施方案31的方法，其中所述步骤(b1)以包括任何杂质或其所述聚集体的PEG化蛋白的AEX上样量小于或等于大约10g蛋白/L填充的AEX树脂的床体积进行。

41.实施方案40的方法，其中所述AEX上样量小于或等于大约5.5g蛋白/L填充的AEX树脂的床体积。

42.实施方案40的方法，其中所述AEX上样量小于或等于大约4.1g蛋白/L填充的AEX树脂的床体积。

43.实施方案1的方法，其中所述PEG蛋白包含下列物质中的一种或多种：所述PEG化蛋白同工型PEG-1，PEG-2，PEG-3，PEG-4，PEG-5，PEG-6，PEG-7，PEG-8，和PEG-9，及其任何聚集体，三硫化物杂质和des-phe杂质以及所述蛋白的任何未PEG化杂质和任何游离PEG分子。

44.实施方案1的方法，其中所述PEG蛋白包含下列物质中的一种或多种：所述PEG化蛋白同工型PEG-2，PEG-3，PEG-4，PEG-5，PEG-6，PEG-7，PEG-8，和PEG-9，及其任何聚集体，三硫化物杂质和des-phe杂质以及所述蛋白的任何未PEG化杂质和任何游离PEG分子。

45.实施方案1的方法，其中所述PEG蛋白包含下列物质中的一种或多种：所述PEG化蛋白同工型PEG-2，PEG-3，PEG-4，PEG-5，PEG-6，PEG-7，PEG-8，及其任何聚集体，三硫化物杂质和des-phe杂质以及所述蛋白的任何未PEG化杂质和任何游离PEG分子。

46.实施方案1的方法，其中所述PEG蛋白包含下列物质中的一种或多种：所述PEG化蛋白同工型PEG-3，PEG-4，PEG-5，PEG-6，PEG-7，PEG-8，及其任何聚集体，三硫化物杂质和des-phe杂质以及所述蛋白的任何未PEG化杂质和任何游离PEG分子。

47.实施方案1的方法，其中所述PEG蛋白包含下列物质中的一种或多种：所述PEG化蛋白同工型PEG-4，PEG-5，PEG-6，PEG-7，PEG-8，及其任何聚集体，三硫化物杂质和des-phe杂质以及所述蛋白的任何未PEG化杂质和任何游离PEG分子。

48.实施方案1的方法，其中所述PEG蛋白包含下列物质中的一种或多种：所述PEG化蛋白同工型PEG-4，PEG-5，PEG-6，PEG-7，及其任何聚集体，三硫化物杂质和des-phe杂质以及所述蛋白的任何未PEG化杂质和任何游离PEG分子。

49.实施方案1的方法，其中所述PEG蛋白包含下列物质中的一种或多种：所述PEG化蛋白同工型PEG-4，PEG-5，PEG-6，及其任何聚集体，三硫化物杂质和des-phe杂质以及所述蛋白的任何未PEG化杂质和任何游离PEG分子。

50.实施方案1的方法，其中所述PEG蛋白包含下列物质中的一种或多种：所述PEG化蛋白同工型PEG-4，PEG-5，PEG-6，及其任何聚集体，三硫化物杂质和des-phe杂质以及所述蛋白的任何未PEG化杂质。

51.实施方案1的方法，其中所述PEG蛋白包含下列物质中的一种或多种：所述PEG化蛋白同工型PEG-1，PEG-2，PEG-3，PEG-4，PEG-5，PEG-6，PEG-7，PEG-8，和PEG-9，及其任何聚集体，三硫化物杂质和des-phe杂质。

52.实施方案1的方法，其中所述PEG蛋白包含下列物质中的一种或多种：所述PEG化蛋白同工型PEG-1，PEG-2，PEG-3，PEG-4，PEG-5，PEG-6，PEG-7，PEG-8，和PEG-9，及其任何聚集体和三硫化物杂质。

53.实施方案1的方法，其中所述PEG蛋白包含下列物质中的一种或多种：所述PEG化蛋白同工型PEG-1，PEG-2，PEG-3，PEG-4，PEG-5，PEG-6，PEG-7，PEG-8，和PEG-9，及其任何聚集体。

54.实施方案1的方法，其进一步包含下列合并步骤(c)：合并个别量的所述PEG化蛋白同工型以通过选自下列的技术生成合并的PEG化蛋白：毛细管电泳(CE)，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，离子交换(IEX)层析，疏水相互作用层析(HIC)，阴离子交换(AEX)层析，阳离子交换(CEX)层析，反相高压液相层析(RPHPLC)，大小排阻高压液相层析(SEHPLC)，亲和层析(AC)及其组合。

55.实施方案42的方法，其进一步包含下列合并步骤(c)：合并个别量的所述PEG化蛋白同工型以通过选自下列的技术生成合并的PEG化蛋白：毛细管电泳(CE)，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，离子交换(IEX)层析，疏水相互作用层析(HIC)，阴离子交换(AEX)层析，阳离子交换(CEX)层析，反相高压液相层析(RPHPLC)，大小排阻高压液相层析(SEHPLC)，亲和层析(AC)及其组合。

56.实施方案54的方法，其中所述合并步骤(c)在大约5到大约50℃的CE温度下通过所述CE进行。

57.实施方案55的方法，其中所述合并步骤9c)在大约5到大约50℃的CE温度下通过所述CE进行。

58.实施方案56的方法，其中所述CE温度为大约5到大约45℃。

59.实施方案58的方法，其中所述CE温度为大约20大约40℃。

60.实施方案59的方法，其中所述CE温度为大约30到大约32℃。

61.实施方案56的方法，其中所述合并步骤(c)以从大约0到大约60mS/cm的CE合并导电率通过所述CE进行。

62.实施方案61的方法，其中所述CE合并导电率为大约5到大约10mS/cm。

63.实施方案54的方法，其中所述合并步骤(c)对以蛋白浓度为至少大约0.2mg/ml提供在缓冲液中的所述PEG化蛋白同工型进行。

64.实施方案56的方法，其中所述合并步骤(c)对以蛋白浓度为至少大约0.5mg/ml提供在缓冲液中的所述PEG化蛋白同工型进行。

65.实施方案54的方法，其中所述合并步骤(c)对以蛋白浓度为大约0.1到大约100mg/ml提供在缓冲液中的所述PEG化蛋白同工型进行。

66.实施方案65的方法，其中所述蛋白浓度为大约0.5到大约10mg/ml。

67.实施方案66的方法，其中所述蛋白浓度为大约2到大约3mg/ml。

68.实施方案56的方法，其中所述合并步骤(c)对以蛋白浓度为大约0.1到大约100mg/ml提供在缓冲液中的所述PEG化蛋白同工型进行。

69.实施方案67的方法，其中所述蛋白浓度为大约0.5到大约10mg/ml。

70.实施方案68的方法，其中所述蛋白浓度为大约2到大约3mg/ml。

71.实施方案63的方法，其中所述合并的PEG化蛋白包含PEG-1，PEG-2，PEG-3，PEG-4，PEG-5，PEG-6，PEG-7，PEG-8，和PEG-9中的一种或多种。

72.实施方案63的方法，其中所述合并的PEG化蛋白包含PEG-2，PEG-3，PEG-4，PEG-5，PEG-6，PEG-7，PEG-8，和PEG-9中的一种或多种。

73.实施方案63的方法，其中所述合并的PEG化蛋白包含PEG-3，PEG-4，PEG-5，PEG-6，PEG-7，PEG-8，和PEG-9中的一种或多种。

74.实施方案63的方法，其中所述合并的PEG化蛋白包含PEG-3，PEG-4，PEG-5，PEG-6，PEG-7，和PEG-8中的一种或多种。

75.实施方案63的方法，其中所述合并的PEG化蛋白包含PEG-3，PEG-4，PEG-5，PEG-6，和PEG-7中的一种或多种。

76.实施方案63的方法，其中所述合并的PEG化蛋白包含PEG-3，PEG-4，PEG-5，和PEG-6中的一种或多种。

77.实施方案63的方法，其中所述合并的PEG化蛋白包含PEG-4，PEG-5，和PEG-6中的一种或多种。

78.实施方案63的方法，其中所述合并的PEG化蛋白包含PEG-4和PEG-5中的一种或两种。

79.实施方案63的方法，其中所述合并的PEG化蛋白包含PEG-5和PEG-6中的一种或两种。

80.实施方案63的方法，其中所述合并的PEG化蛋白包含PEG-5。

81.实施方案71的方法，其中基于所述PEG-1，PEG-2，PEG-3，PEG-4，PEG-5，PEG-6，PEG-7，PEG-8和PEG-9的PEG化蛋白同工型及其聚集体的总重，PEG-4，PEG-5和PEG-6合并的PEG化蛋白级分包含至少大约70％重量。

82.实施方案71的方法，其中基于所述PEG-1，PEG-2，PEG-3，PEG-4，PEG-5，PEG-6，PEG-7，PEG-8和PEG-9的PEG化蛋白同工型及其聚集体的总重，PEG-4，PEG-5和PEG-6合并的PEG化蛋白级分包含至少大约75％重量。

83.实施方案71的方法，其中基于所述PEG-1，PEG-2，PEG-3，PEG-4，PEG-5，PEG-6，PEG-7，PEG-8和PEG-9的PEG化蛋白同工型及其聚集体的总重，PEG-4，PEG-5和PEG-6合并的PEG化蛋白级分包含至少大约80％重量。

84.实施方案71的方法，其中基于所述PEG-1，PEG-2，PEG-3，PEG-4，PEG-5，PEG-6，PEG-7，PEG-8和PEG-9的PEG化蛋白同工型及其聚集体的总重，PEG-4，PEG-5和PEG-6合并的PEG化蛋白级分包含至少大约90％重量。

85.实施方案71的方法，其中基于所述PEG-1，PEG-2，PEG-3，PEG-4，PEG-5，PEG-6，PEG-7，PEG-8和PEG-9的PEG化蛋白同工型及其聚集体的总重，PEG-4，PEG-5和PEG-6合并的PEG化蛋白级分包含至少大约94％重量。

86.实施方案64的方法，其中含有所述PEG化蛋白的所述缓冲液的pH为大约5到大约10。

87.实施方案86的方法，其中所述缓冲液的pH为大约6.6到大约9。

88.实施方案87的方法，其中所述缓冲液的pH为大约6.9到大约7.1。

89.实施方案64的方法，其中含有所述PEG化蛋白的所述缓冲液选自Tris，磷酸，HEPES，柠檬酸，三乙胺，以及组氨酸。

90.实施方案1的方法，其中所述聚集体的水平基于所述同工型和所述聚集体的总量小于或等于大约10％重量。

91.实施方案90的方法，其中所述聚集体的水平基于所述总重小于或等于大约9％重量。

92.实施方案91的方法，其中所述聚集体的水平基于所述总重小于或等于大约8％重量。

93.实施方案92的方法，其中所述聚集体的水平基于所述总重小于或等于大约7％重量。

94.实施方案93的方法，其中所述聚集体的水平基于所述总重小于或等于大约6％重量。

95.实施方案94的方法，其中所述聚集体的水平基于所述总重小于或等于大约5％重量。

96.实施方案95的方法，其中所述聚集体的水平基于所述总重小于或等于大约4％重量。

97.实施方案96的方法，其中所述聚集体的水平基于所述总重小于或等于大约3％重量。

98.实施方案97的方法，其中所述聚集体的水平基于所述总重小于或等于大约2％重量。

99.实施方案98的方法，其中所述聚集体的水平基于所述总重小于或等于大约1.5％重量。

100.实施方案99的方法，其中所述聚集体的水平基于所述总重小于或等于大约1％重量。

101.实施方案100的方法，其中所述聚集体的水平基于所述总重小于或等于大约0.9％重量。

102.实施方案101的方法，其中所述聚集体的水平基于所述总重小于或等于大约0.8％重量。

103.实施方案102的方法，其中所述聚集体的水平基于所述总重小于或等于大约0.7％重量。

104.实施方案103的方法，其中所述聚集体的水平基于所述总重小于或等于大约0.6％重量。

105.实施方案104的方法，其中所述聚集体的水平基于所述总重小于或等于大约0.5％重量。

106.实施方案105的方法，其中所述聚集体的水平基于所述总重小于或等于大约0.4％重量。

107.实施方案106的方法，其中所述聚集体的水平基于所述总重小于或等于大约0.3％重量。

108.实施方案107的方法，其中所述聚集体的水平基于所述总重小于或等于大约0.2％重量。

109.实施方案108的方法，其中所述聚集体的水平基于所述总重小于或等于大约0.1％重量。

110.实施方案109的方法，其中所述聚集体的水平基于所述总重小于或等于大约0.05％重量。

111.实施方案110的方法，其中所述聚集体的水平基于所述总重小于或等于大约0.01％重量。

112.实施方案31的方法，其中所述步骤(b)进一步包括下列步骤：(b2)冲洗所述上样的PEG化蛋白，接着(b3)通过pH梯度或离子强度梯度用洗脱液洗脱所述上样的PEG化蛋白，以及(b4)以多体积级分收集洗脱物。

113.实施方案31的方法，其中所述步骤(b)进一步包括步骤(b2)：冲洗所述上样的PEG化蛋白，接着洗脱步骤(b3)：用盐溶液的含有离子盐的洗脱缓冲液，以足以从所述AEX树脂上洗脱所述上样的PEG化蛋白的盐浓度梯度，洗脱所述上样的PEG化蛋白。

114.实施方案113的方法，其中所述离子盐为氯离子盐。

115.实施方案114的方法，其中所述离子盐为NaCl。

116.实施方案115的方法，其中所述步骤(b)在具有柱体积(CV)的柱中进行，以及其中所述盐浓度梯度为大约2到大约50mM/CV。

117.实施方案116的方法，其中所述盐浓度梯度为大约5到大约25mM/CV。

118.实施方案117的方法，其中所述盐浓度梯度为大约10到大约20mM/CV。

119.实施方案113的方法，其中所述洗脱缓冲液的pH为大约5到大约10。

120.实施方案119的方法，其中所述洗脱缓冲液的pH为大约6.6到大约9。

121.实施方案120的方法，其中所述洗脱缓冲液的pH为大约6.9到大约7.1。

122.实施方案113的方法，其中所述洗脱步骤(b3)进行的洗脱温度小于或等于50℃。

123.实施方案122的方法，其中所述温度为小于或等于大约35℃。

124.实施方案123的方法，其中所述温度为大约2到大约30℃。

125实施方案123的方法，其中所述温度为大约15到大约30℃。

126实施方案123的方法，其中所述温度为大约18到大约25℃。

127.实施方案113的方法，其中所述步骤(b)在柱子中进行，以及其中所述洗脱缓冲液通过所述柱子的线性速率为小于或等于大约300cm/hr。

128.实施方案127的方法，其中所述线性速率为大约10到大约150cm/hr。

129.实施方案127的方法，其中所述线性速率为大约30到大约150cm/hr。

130.实施方案127的方法，其中所述线性速率为大约50到大约100cm/hr。

131.实施方案127的方法，其中所述线性速率为大约50到大约70cm/hr。

132.实施方案127的方法，其中所述线性速率为大约60到大约65cm/hr。

133.实施方案127的方法，其中所述线性速率为大约60cm/hr。

134.实施方案1的方法，其中所述PEG化蛋白选自激素，生长激素，人生长激素，生长激素拮抗剂，人生长激素拮抗剂，抗体，以及B-2036PEG。

135.实施方案1的方法，其中所述阴离子交换(AEX)树脂包含的官能团选自伯胺，仲胺，叔胺，季胺及其组合。

136.实施方案1的方法，其中所述阴离子交换(AEX)树脂包含的官能团选自二乙基氨基乙基，二乙基氨基丙基，二甲基乙醇胺，三甲基铵乙基，三甲基苄基铵，二甲基乙醇苄基，以及多胺官能团。

137.实施方案1的方法，其中所述阴离子交换(AEX)树脂包含的支持材料选自亲水聚醚，交联二乙烯基苯聚苯乙烯，交联琼脂糖，聚丙烯，亲水丙烯酰胺乙烯基，甲基丙烯酸酯，带有陶瓷珠基的聚合水凝胶，复合的硅石-右旋糖苷材料，聚合物接枝的硅石，二乙烯基苯苯乙烯，二乙烯基苯聚丙烯酸酯，交联纤维素，共聚物甲基丙烯酸酯，聚苯乙烯，丙烯酸酯，G5000亲水凝胶，以及纤维素。

138.实施方案1的方法，其中所述阴离子交换(AEX)树脂包括大孔树脂。

139.实施方案1的方法，其中所述阴离子交换(AEX)树脂包括凝胶树脂。

140.实施方案63的方法，其中所述合并的PEG化蛋白主要由PEG-1，PEG-2，PEG-3，PEG-4，PEG-5，PEG-6，PEG-7，PEG-8，和PEG-9中的一种或多种组成。

141.实施方案63的方法，其中所述合并的PEG化蛋白主要由PEG-2，PEG-3，PEG-4，PEG-5，PEG-6，PEG-7，PEG-8，和PEG-9中的一种或多种组成。

142.实施方案63的方法，其中所述合并的PEG化蛋白主要由PEG-3，PEG-4，PEG-5，PEG-6，PEG-7，PEG-8，和PEG-9中的一种或多种组成。

143.实施方案63的方法，其中所述合并的PEG化蛋白主要由PEG-3，PEG-4，PEG-5，PEG-6，PEG-7，和PEG-8中的一种或多种组成。

144.实施方案63的方法，其中所述合并的PEG化蛋白主要由PEG-3，PEG-4，PEG-5，PEG-6，和PEG-7中的一种或多种组成。

145.实施方案63的方法，其中所述合并的PEG化蛋白主要由PEG-3，PEG-4，PEG-5，和PEG-6中的一种或多种组成。

146.实施方案63的方法，其中所述合并的PEG化蛋白主要由PEG-4，PEG-5，和PEG-6中的一种或多种组成。

147.实施方案63的方法，其中所述合并的PEG化蛋白主要由PEG-4和PEG-5中的一种或两种组成。

148.实施方案63的方法，其中所述合并的PEG化蛋白主要由PEG-5和PEG-6中的一种或两种组成。

149.实施方案63的方法，其中所述合并的PEG化蛋白主要由PEG-5组成。

150.实施方案31的方法，其中所述步骤(b)在具有柱体积(CV)的柱子中进行，以及其中步骤(b)进一步包括下列步骤：(b2)冲洗所述上样的PEG化蛋白，接着(b3)通过pH梯度或离子强度梯度用洗脱液洗脱所述上样的PEG化蛋白，以及(b4)以大约0.1到大约5个所述柱体积(CV)的多体积级分收集洗脱物。

151.实施方案31的方法，其中所述步骤(b)在具有柱体积(CV)的柱子中进行，以及其中步骤(b)进一步包括下列步骤：(b2)冲洗所述上样的PEG化蛋白，接着(b3)通过pH梯度或离子强度梯度用洗脱液洗脱所述上样的PEG化蛋白，以及(b4)以大约0.1到大约1个所述柱体积(CV)的多体积级分收集洗脱物。

152.实施方案31的方法，其中所述步骤(b)在具有柱体积(CV)的柱子中进行，以及其中步骤(b)进一步包括下列步骤：(b2)冲洗所述上样的PEG化蛋白，接着(b3)通过pH梯度或离子强度梯度用洗脱液洗脱所述上样的PEG化蛋白，以及(b4)以大约0.1到大约0.5个所述柱体积(CV)的多体积级分收集洗脱物。

153.实施方案31的方法，其中所述步骤(b)在具有柱体积(CV)的柱子中进行，以及其中步骤(b)进一步包括下列步骤：(b2)冲洗所述上样的PEG化蛋白，接着(b3)通过pH梯度或离子强度梯度用洗脱液洗脱所述上样的PEG化蛋白，以及(b4)以大约0.1到大约0.2个所述柱体积(CV)的多体积级分收集洗脱物。

154.实施方案113的方法，其中所述离子盐选自NaCl，氯化锂，磷酸钠，硫酸钠，氯化铵，硫酸铵，磷酸铵，KI和KCl。

155.实施方案118的方法，其中所述盐浓度梯度为大约10到大约12.5mM/CV。

156.一种合并PEG化蛋白同工型的方法，所述方法包括下列步骤：(a)通过选自下列的技术分离和收集所述PEG化蛋白同工型：毛细管电泳(CE)，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，离子交换(IEX)层析，疏水相互作用层析(HIC)，阴离子交换(AEX)层析，阳离子交换(CEX)层析，反相高压液相层析(RPHPLC)，大小排阻高压液相层析(SEHPLC)，亲和层析及其组合。

157.实施方案140的方法，其中所述技术为RPHPLC或CE。

158.一种降低PEG化生长激素拮抗剂同工型的聚集体水平的方法，所述拮抗剂同工型具有所述同工型和所述聚集体的总重，所述方法包括下列步骤：

(a)提供所述PEG化生长激素拮抗剂同工型；以及

(b)在足以使所述聚集体水平基于所述总重降低至小于或等于大约6％重量的条件下，通过阴离子交换层析，从阴离子交换(AEX)树脂上分离所述PEG化生长激素拮抗剂同工型。

159.实施方案158的方法，其中所述条件足以使所述聚集体水平基于所述总重降低至小于或等于大约5％重量。

160.实施方案158的方法，其中所述条件足以使所述聚集体水平基于所述总重降低至小于或等于大约4％重量。

161.实施方案158的方法，其中所述条件足以使所述聚集体水平基于所述总重降低至小于或等于大约3％重量。

162.实施方案158的方法，其中所述条件足以使所述聚集体水平基于所述总重降低至小于或等于大约2％重量。

163.实施方案158的方法，其中所述条件足以使所述聚集体水平基于所述总重降低至小于或等于大约1％重量。

164.一种降低PEG化生长激素拮抗剂同工型的任何三硫化物杂质，任何des-phe杂质和任何聚集体之和的总水平的方法，所述拮抗剂同工型具有所述同工型，所述杂质和所述聚集体的总重，所述方法包括下列步骤：

(a)提供所述生长激素拮抗剂同工型；以及

(b)在足以使任何所述三硫化物杂质，任何所述des-phe杂质和任何所述聚集体的总水平基于所述总重降低至小于或等于大约15％重量的条件下，通过阴离子交换层析，从阴离子交换(AEX)树脂上分离所述PEG化生长激素拮抗剂同工型。

165.实施方案164的方法，其中所述条件足以使任何所述三硫化物杂质，任何所述des-phe杂质和任何所述聚集体的总水平基于所述总重降低至小于或等于大约12％重量。

166.实施方案164的方法，其中所述条件足以使任何所述三硫化物杂质，任何所述des-phe杂质和任何所述聚集体的总水平基于所述总重降低至小于或等于大约10％重量。

167.实施方案164的方法，其中所述条件足以使任何所述三硫化物杂质，任何所述des-phe杂质和任何所述聚集体的总水平基于所述总重降低至小于或等于大约9％重量。

168.实施方案164的方法，其中所述条件足以使任何所述三硫化物杂质，任何所述des-phe杂质和任何所述聚集体的总水平基于所述总重降低至小于或等于大约8％重量。

169.实施方案164的方法，其中所述条件足以使任何所述三硫化物杂质，任何所述des-phe杂质和任何所述聚集体的总水平基于所述总重降低至小于或等于大约7％重量。

170.实施方案164的方法，其中所述条件足以使任何所述三硫化物杂质，任何所述des-phe杂质和任何所述聚集体的总水平基于所述总重降低至小于或等于大约6％重量。

171.实施方案164的方法，其中所述条件足以使任何所述三硫化物杂质，任何所述des-phe杂质和任何所述聚集体的总水平基于所述总重降低至小于或等于大约5％重量。

172.实施方案164的方法，其中所述条件足以使任何所述三硫化物杂质，任何所述des-phe杂质和任何所述聚集体的总水平基于所述总重降低至小于或等于大约4％重量。

173.实施方案164的方法，其中所述条件足以使任何所述三硫化物杂质，任何所述des-phe杂质和任何所述聚集体的总水平基于所述总重降低至小于或等于大约3％重量。

174.实施方案164的方法，其中所述条件足以使任何所述三硫化物杂质，任何所述des-phe杂质和任何所述聚集体的总水平基于所述总重降低至小于或等于大约2％重量。

175.实施方案164的方法，其中所述条件足以使任何所述三硫化物杂质，任何所述des-phe杂质和任何所述聚集体的总水平基于所述总重降低至小于或等于大约1％重量。

176.实施方案134的方法，其中所述生长激素拮抗剂为B-2036PEG，以及其中所述B-2036PEG包含[SEQ.ID NO.1]的B-2036的生长激素拮抗剂多肽骨架。

177.实施方案134的方法，其中所述生长激素为[SEQ.ID NO.2]的多肽的PEG化形式。

178.实施方案137的方法，其中所述支持材料的直径为大约10到大约500μm。

179.实施方案178的方法，其中所述直径的平均值为90μm。

180.一种合并PEG化蛋白同工型的方法，其中所述方法包括下列步骤：

(a)使所述PEG化蛋白同工型分离成选定的同工型；以及

(b)组合所述选定的同工型以生成所述选定的同工型的富集池。

181.实施方案180的方法，其中所述选定的同工型为池重量比((PEG-4+PEG-5+PEG-6的第一重量)/(所述富集池中存在的任意PEG-1+PEG-2+PEG-3+PEG-4+PEG-5+PEG-6+PEG-7+PEG-8+PEG-9的第二重量))大于或等于大约70％重量的PEG-4，PEG-5和PEG-6。

182.实施方案181的方法，其中所述池重量比为大于或等于大约75％重量。

183.实施方案181的方法，其中所述池重量比为大于或等于大约80％重量。

184.实施方案181的方法，其中所述池重量比为大于或等于大约85％重量。

185.实施方案181的方法，其中所述池重量比为大于或等于大约90％重量。

186.实施方案181的方法，其中所述池重量比为大于或等于大约94％重量。

187.实施方案181的方法，其中所述池重量比为大于或等于大约95％重量。

188.实施方案181的方法，其中所述池重量比为大于或等于大约96％重量。

189.实施方案181的方法，其中所述池重量比为大于或等于大约97％重量。

190.实施方案181的方法，其中所述池重量比为大于或等于大约98％重量。

191.实施方案181的方法，其中所述池重量比为大于或等于大约99％重量。

192.实施方案181的方法，其中所述池重量比为大于或等于大约99.5％重量。

193.实施方案181的方法，其中所述池重量比为大于或等于大约99.9％重量。

194.实施方案180的方法，其中所述选定的同工型为PEG-1，PEG-2，PEG-3，PEG-4，PEG-5，PEG-6，PEG-7，PEG-8，和PEG-9中的一种或多种。

195.实施方案180的方法，其中所述选定的同工型为PEG-2，PEG-3，PEG-4，PEG-5，PEG-6，PEG-7，PEG-8，和PEG-9中的一种或多种。

196.实施方案180的方法，其中所述选定的同工型为PEG-3，PEG-4，PEG-5，PEG-6，PEG-7，PEG-8，和PEG-9中的一种或多种。

197.实施方案180的方法，其中所述选定的同工型为PEG-4，PEG-5，PEG-6，PEG-7，PEG-8和PEG-9中的一种或多种。

198.实施方案180的方法，其中所述选定的同工型为PEG-4，PEG-5，PEG-6，PEG-7，和PEG-8中的一种或多种。

199.实施方案180的方法，其中所述选定的同工型为PEG-4，PEG-5，PEG-6，和PEG-7中的一种或多种。

200.实施方案180的方法，其中所述选定的同工型为PEG-4，PEG-5，和PEG-6中的一种或多种。

201.实施方案180的方法，其中所述选定的同工型为PEG-4和PEG-5中的一种或两种。

202.实施方案180的方法，其中所述选定的同工型为PEG-5和PEG-6中的一种或两种。

203.实施方案180的方法，其中所述选定的同工型为PEG-4和PEG-6中的一种或两种。

204.一种从至少两种PEG化蛋白同工型的混合物中获得选定的PEG化蛋白同工型的方法，所述方法包括下列步骤：

(a)从所述混合物中分离所述选定的PEG化蛋白同工型。

205.一种从起始组合物中制备富集组合物的方法，其中所述起始组合物包括未PEG化的B-2036和一种或多种选自PEG-1，PEG-2，PEG-3，PEG-4，PEG-5，PEG-6，PEG-7，PEG-8，和PEG-9的B-2036的PEG化同工型，以及其中所述方法包括下列步骤：

(a)使所述起始组合物分离成多个级分，其中至少一个级分中的PEG-4，PEG-5和PEG-6同工型与未PEG化B-2036和PEG化B-2036同工型之总和的第一级分重量比区别于至少一个其他级分中的PEG-4，PEG-5和PEG-6同工型与未PEG化B-2036和PEG化B-2036同工型之总和的第二级分重量比，

(b)确定级分取样或各个级分剩余部分样品中PEG-4，PEG-5和PEG-6同工型与未PEG化B 2036和PEG化B-2036同工型之和的重量比，以及

(c)选择性组合部分所述级分以生成所述富集组合物，其中在所述富集组合物中的PEG-4，PEG-5和PEG-6同工型与未PEG化B 2036和PEG化B-2036同工型之和的富集级分重量比大于在所述起始组合物中的富集级分重量比。

本申请中所有数值和鉴定的分子都是示例性的，并不旨在对权利要求进行限制。下文以实施例方式示出，不应解释成对本发明保护范围的限制。在本申请中所引用的书籍，杂志，期刊文章，专利或其他任何出版物等皆在此以其全文为所有目的专门引作参考。

实施例

实施例1

通过阴离子交换层析维持或降低PEG化生长激素拮抗剂(B-2036-PEG)的聚集体的水平

维持(低于所需水平-例如，≤6％重量的总重)或降低B-2036PEG的聚集体水平，通过BI(本体中间体B-2036)最为起始材料而实现，BI的制备方法示于下列文献中：2003年8月25日向U.S.专利和商标局提交的非临时U.S.专利申请过渡序列No.P-107,891，其发明名称为同工型杂质水平较低的生长激素及其拮抗剂的生产方法(Method forthe Production Of Growth Hormone And Antagonist Thereof HavingLower Levels Of Isoform Impurities Thereof)。如Cunningham等在U.S.专利No.5,849,535中所述，在重组大肠杆菌(E.coli)表达系统中实施发酵(以生成B-2036)。如上非临时U.S.专利申请No.(P-107,891)所述，对B-2036BI进行纯化。然后，利用下文流程图1中所示的初始PEG化和疏水相互作用层析步骤，该材料被处理生成B-2036PEG。在疏水相互作用层析(步骤2)之后，B-2036PEG被UF/DF到pH 7,25mM TRIS缓冲液(而非如流程图2，步骤3，实施例2的方法所示的pH4乙酸钠缓冲液)中。接着，对滞留物进行Q Sepharose FF柱强阴离子交换层析。该步使不同的PEG化形式分离到合并用级分中，从而取得对API释放所必需的PEG化形式分布。该柱富集PEG化BI(B-2036PEG)的PEG-4，PEG-5和PEG-6产物。所述产物在平衡步骤后采用0-250mM NaCl的25mM Tris，pH 7.0进行20CV线性梯度洗脱，以及采用25mM Tris，pH 7.0进行2CV冲洗。利用CE而非实施例2，流程图2中所示的SDS-PAGE，对级分进行分析。参见前述对相同部分的讨论。派格索曼(Pharmacia)根据层析图，通过CE分析，采用下列合并标准收集成级分池：≥75％PEG4+5+6(第一级分)和≥94％PEG4+5+6(最后级分)以及≥0.5％mg/ml。然后，所得产物继续进行流程图1中所述的剩余的B-2036PEG纯化方法。在级分选择和合并后，对合并的材料和最终API进行SEHPLC分析，表明没有可检测的聚集体。同样参见下文表1。

利用上述实施例1的步骤获得下列数据。

表1：阴离子交换层析参数和聚集体收率数据

*＝基于CE分析而计算。

实施例2

小规模步骤用于评价添加剂对B-2036PEG的S-Sepharose FF聚集(阳离子交换层析树脂)的影响

向15ml离心管中加入1.5ml的S-Sepharose FF树脂(沉降床体积)。用于结合蛋白的树脂制备方法是用10ml的1％待评价添加剂的25mM乙酸钠，pH 4的溶液漂洗两次。每次漂洗后，(通过离心)收集上清液，倾出和废弃。向漂洗的树脂沉淀物中，加入2.5ml的1％待评价添加剂的25mM乙酸钠，pH 4的溶液，并且加入一些UF/DF滞留物，含有约5mg来自步骤3的B-2036PEG(由流程图2，步骤1-3的方法制备)。然后，树脂重悬浮于溶液中，并且轻轻混合下温育2-24小时。温育后，离心溶液，并且倾出和废弃上清液。接着，向树脂沉淀中加入2.5ml的1％待评价添加剂的25mM乙酸钠，pH 4和0.25ml的2.5M氯化钠的溶液。将所得溶液中的树脂重新悬浮，并且轻轻混合下温育20分钟。温育后，离心保留上清液，以及倾出用于大小排阻层析(例如，SEHPLC(大小排阻HPLC))进行分析。然后，废弃用过的树脂沉淀。利用阳离子交换层析树脂，对各个待评添加剂重复上述步骤，以确定聚集体形成是否可被消除或充分降低。利用上述步骤，得到下文表2的结果。如表2所示，利用阳离子树脂测试的添加剂不像转用阴离子树脂一样成功降低形成的聚集体水平。

表2

(利用阳离子交换树脂得到的结果)

实施例2的小规模步骤

方法	树脂以3.3g/l上样
			每次试验使用1.5ml树脂
	在蛋白上样前用添加剂平衡树脂
			加入2.5M NaCl/乙酸盐pH 4，1∶10v/v洗脱
	24小时温育，除了所述，所有1％
		添加剂/条件	％聚集体
对照	21.5
		6M尿素	6.0
CHAPS	18.7
		Sarcosyl	9.3
PEG 3350	20.3
		异丙醇	19.3
正丙醇	24.7
		正丁醇	27.1
pH 7.750mM TRIS	30.3
		对照	32.2保持过夜
7.5M尿素	10.7
		6M尿素	8.1
3M尿素	32.3
		1.5M尿素	35.0
Tween 20	19.3
		甲醇	33.7
乙醇	33.5

方法	树脂以3.3g/l上样
		5％蔗糖	31.6
甘露糖醇	30.8
		1％聚磷酸	61.2
0.1％聚磷酸	42.5
		0.01％聚磷酸	33.6
25mm磷酸盐pH 2.2	19.7
		25mm磷酸盐pH 3	22.3
25mm磷酸盐pH 5.5	63.1
		25mm磷酸盐pH 6.5	42.9
25mm磷酸盐pH 4	29.0
		对照1	31.8
对照2	31.1

实施例3

RPHPLC分析技术

在此使用RPHPLC来监控和定量测定在派格索曼通过阴离子交换纯化的Q-Sepharose柱级分中发现的PEG化种类(例如，PEG4，PEG-5，和PEG-6)的百分比。

将25uL的各个Q-Sepharose(阴离子交换步骤，参见上述实施例1)级分(蛋白浓度为0.5到1.3mg/mL)上样到Zorbax 300SB-CN柱(4.6mm×150mm；3.5μm；部件号863973-905；序列号USMJ001205)。移动相A为0.1％三氟乙酸，而移动相B由0.085％三氟乙酸的乙腈组成。线性梯度为40-50％缓冲液B，时间20分钟，流速为1.0mL/min，室温，上述条件用于分离不同PEG化形式的派格索曼。在214nm处监控吸光度。

由RPHPLC获得的结果类似于如下文图2-4所示的来自毛细管电泳(CE)的结果。同样，参见下文实施例4的CE分析技术示例性步骤。

表3

为确定各个PEG化种类的百分比，通过毛细管电泳分析派格索曼的Q-Sepharose级分(级分7-18也由RPHPLC分析-参见表4)

级分	起始浓度(mg/mL)	％PEG-2	％PEG-3	％PEG-4	％PEG-5	％PEG-6	％PEG-7	％PEG-8
2	0.59	0.0	0.0	2.8	26.3	39.6	25.3	6.0
									3	0.88	0.0	0.0	4.6	28.6	44.8	18.8	3.2
4	1.04	0.0	0.0	5.8	28.1	48.6	15.9	1.7
									5	1.16	0.0	0.0	6.2	28.3	49.8	14.1	1.6
6	1.23	0.0	0.0	5.4	29.9	54.5	10.2	0.0
									7	1.27	0.0	0.0	5.2	33.0	54.1	7.7	0.0
8	1.27	0.0	0.0	5.3	39.3	50.6	4.8	0.0
									9	1.27	0.0	0.0	4.5	49.9	41.8	3.8	0.0
10	1.24	0.0	0.0	5.1	59.5	33.1	2.3	0.0
									11	1.21	0.0	0.0	6.2	65.9	25.4	2.5	0.0
12	1.17	0.0	0.0	7.9	74.4	17.7	0.0	0.0
									13	1.12	0.0	0.0	15.3	72.6	12.2	0.0	0.0
14	1.09	0.0	0.0	21.4	70.7	8.0	0.0	0.0
									15	1.05	0.0	0.0	37.3	57.3	5.4	0.0	0.0
16	1.01	0.0	0.0	48.2	47.0	4.8	0.0	0.0

级分	起始浓度(mg/mL)	％PEG-2	％PEG-3	％PEG-4	％PEG-5	％PEG-6	％PEG-7	％PEG-8
									17	0.97	0.0	0.0	55.8	40.2	3.9	0.0	0.0
18	0.91	0.0	2.1	62.4	31.8	3.6	0.0	0.0
									19	0.84	0.0	0.0	80.8	19.2	0.0	0.0	0.0
20	0.77	0.0	1.2	78.2	20.7	0.0	0.0	0.0
									21	0.71	0.0	6.8	77.3	15.9	0.0	0.0	0.0
22	0.65	0.0	12.3	75.9	11.9	0.0	0.0	0.0
									23	0.61	0.0	18.9	70.3	10.8	0.0	0.0	0.0
24	0.56	0.0	21.5	69.5	9.0	0.0	0.0	0.0

阴影区(即级分7-级分18)代表还通过RPHPLC分析的级分。

表4

通过CE和RPHPLC确定的不同PEG化形式的派格索曼在Q-

Sepharose级分中的分布

B-2036PEG-4，B-2036PEG-5和B-2036PEG-6的CE与RPHPLC的比较结果示于图2，3和4中。

图2由毛细管电脉和反相HPLC确定的在Q-Sepharose级分7-18中发现的PEG-4％的比较图。

图3由毛细管电脉和反相HPLC确定的在Q-Sepharose级分7-18中发现的PEG-5％的比较图。

图4由毛细管电脉和反相HPLC确定的在Q-Sepharose级分7-18中发现的PEG-6％的比较图。

实施例4

CE分析技术

Q-Sepharose级分通过毛细管电泳分析如下。毛细管的内径为50μm和有效长度为37cm，以20psi压力用1.0N NaOH漂洗10分钟而调节，接着用工作缓冲液漂洗20分钟。工作缓冲液，40mM磷酸，4mg/mL O’O-双(2-氨基丙基)聚乙二醇，0.1mg/mL聚环氧乙烷，pH1.9-2.0，制备自10×储液，并且通过0.22μm过滤器过滤以去除可引起毛细管堵塞的颗粒。

为了防止与样品稀释缓冲液(40mM磷酸，4mg/mL O’O-双(2-氨基丙基)聚乙二醇，pH 1.9-2.2)或工作缓冲液接触时形成聚集体，样品温热至室温。＜0.5mg/mL的样品不被分析。≥0.5mg/mL的样品进行原液注射，而浓度＞2.0mg/mL的样品利用样品稀释缓冲液稀释至2.0mg/mL。利用0.5psi压力将样品注射至毛细管中，时间10-60秒。样品注射后，为了浓缩样品，以0.5psi注射工作缓冲液，时间3秒。样品以30kV在最低30℃下分离样品25分钟，并且在214nm检测。在各个随后样品注射之前，毛细管用0.1N NaOH以20psi冲洗至少1分钟，以及用工作缓冲液冲洗2分钟，以便从毛细管壁上去除任何残留的样品。样品存储在25-30℃。

所得电泳谱图通过在相邻峰之间的最低点使峰分开而进行积分，并且计算校正的面积百分比。

利用上述方法以及实施例1，流程图1中步骤4的公开内容，由CE获得的结果示于上文图2-4中。

实施例5

第一合并实施例

Q-Sepharose级分通过CE分析如下。毛细管的内径为50μm和有效长度为37cm，在20psi压力下用1.0N NaOH漂洗10分钟而调节，接着用工作缓冲液漂洗20分钟。工作缓冲液，40mM磷酸，4mg/mLO’O-双(2-氨基丙基)聚乙二醇，0.1mg/mL聚环氧乙烷，pH 1.9-2.0，制备自10×储液，并且通过0.22μm过滤器过滤以去除可引起毛细管堵塞的颗粒。

为了防止与样品稀释缓冲液(40mM磷酸，4mg/mL O’O-双(2-氨基丙基)聚乙二醇，pH 1.9-2.2)或工作缓冲液接触时形成聚集体，样品温热至室温。＜0.5mg/mL的样品不被分析。≥0.5mg/mL的样品进行原液注射，而浓度＞2.0mg/mL的样品利用样品稀释缓冲液稀释至2.0mg/mL。利用0.5psi压力将样品注射至毛细管中，时间10-60秒。样品注射后，为了浓缩样品，以0.5psi注射工作缓冲液，时间3秒。样品以30kV在最低30℃下分离样品25分钟，并且以214nm检测。在各个随后样品注射之前，毛细管用0.1N NaOH以20psi冲洗至少1分钟，以及用工作缓冲液冲洗2分钟，以便从毛细管壁上去除任何残留的样品。样品存储在25-30℃。

所得电泳谱图通过在相邻峰之间的最低点使峰分开而进行积分，并且计算校正的面积百分比。

利用上述步骤以及实施例1，流程图1中步骤4的公开内容，由CE获得的结果示于下文表5a中。富集的PEG化同工型池的制备通过利用可接受的池级分的标准进行，级分通过CE分析，组成为≥74％PEG4+5+6(第一级分)和≥94％PEG4+5+6(最后级分)以及≥0.5mg/mL。利用这些标准选择级分6-25(下表5a)并组合成池。将UF/DF#3起始材料和组合的级分进行如上所示的CE分析。选择和合并级分后，对合并的材料分析显示富集PEG-4，PEG-5和PEG-6同工型。参见下文同样所示的表5b。

表5a

级分#	蛋白浓度mg/ml	PEG-2	PEG-3	PEG-4	PEG-5	PEG-6	PEG-7	PEG-8	PEG(4+5+6)
										1	0.23
2	0.65								0

级分#	蛋白浓度mg/ml	PEG-2	PEG-3	PEG-4	PEG-5	PEG-6	PEG-7	PEG-8	PEG(4+5+6)
										3	0.91			2	18	40	32	9	60
4	1.06			3	19	41	31	6	63
										5	1.15			4	22	43	27	5	69
6	1.21			4	26	44	23	3	74
										7	1.27			3	28	49	20		80
8	1.28			3	25	55	17		83
										9	1.28			3	25	60	12		88
10	1.27			4	30	58	8		92
										11	1.25			4	47	43	6		94
12	1.23			4	52	39	5		95
										13	1.20			3	62	31	4		96
14	1.15			5	70	23	3		98
										15	1.11			6	69	24	1		99
16	1.06			10	76	15			101
										17	1.02			23	70	7			100
18	0.98			31	63	6			100
										19	0.94			44	50	5			99
20	0.90			54	41	5			100
										21	0.84			60	35	5			100
22	0.78			66	29	5			100
										23	0.71			77	21	2			100
24	0.64			82	16	2			100

级分#	蛋白浓度mg/ml	PEG-2	PEG-3	PEG-4	PEG-5	PEG-6	PEG-7	PEG-8	PEG(4+5+6)
										25	0.58		2	83	13	2			98
26	0.54		9	74	17	3			94
										27	0.50		18	68	14	0			82

表5b

级分#	蛋白浓度mg/ml	PEG-2	PEG-3	PEG-4	PEG-5	PEG-6	PEG-7	PEG-8	PEG(4+5+6)
										UF/DF#3池	5.86		5	21	33	30	9	1	84
合并的级分	1.04			25	38	30	7		93

实施例6

第二合并实施例

Q-Sepharose级分通过CE分析如下。毛细管的内径为50μm和有效长度为37cm，在20psi压力下用1.0N NaOH漂洗10分钟而调节，接着用工作缓冲液漂洗20分钟。工作缓冲液，40mM磷酸，4mg/mLO’O-双(2-氨基丙基)聚乙二醇，0.1mg/mL聚环氧乙烷，pH 1.9-2.0，制备自10×储液，并且通过0.22μm过滤器过滤以去除可引起毛细管堵塞的颗粒。

为了防止与样品稀释缓冲液(40mM磷酸，4mg/mL O’O-双(2-氨基丙基)聚乙二醇，pH 1.9-2.2)或工作缓冲液接触时形成聚集体，样品温热至室温。＜0.5mg/mL的样品不被分析。≥0.5mg/mL的样品进行原液注射，而浓度＞2.0mg/mL的样品利用样品稀释缓冲液稀释至2.0mg/mL。利用0.5psi压力将样品注射至毛细管中，时间10-60秒。样品注射后，为了浓缩样品，以0.5psi注射工作缓冲液，时间3秒。样品以30kV在最低30℃下分离样品25分钟，并且以214nm检测。在各个随后样品注射之前，毛细管用0.1N NaOH以20psi冲洗至少1分钟，以及用工作缓冲液冲洗2分钟，以便从毛细管壁上去除任何残留的样品。样品存储在25-30℃。

所得电泳谱图通过在相邻峰之间的最低点使峰分开而进行积分，并且计算校正的面积百分比。

利用上述步骤以及实施例1，流程图1中步骤4的公开内容，由CE获得的结果示于下文表6a中。富集的PEG化同工型池的制备通过利用可接受的池级分的标准进行，级分通过CE分析，组成为≥75％PEG4+5+6(第一级分)和≥94％PEG4+5+6(最后级分)以及≥0.5mg/mL。利用这些标准选择级分3-20(下表6a)并组合成池。将UF/DF#3起始材料(作为HIC池测量)和组合的级分进行CE分析，如上所示。选择和合并级分后，对合并的材料分析显示富集PEG-4，PEG-5和PEG-6同工型。参见下文同样所示的表6b。

表6a

级分#	蛋白浓度mg/ml	PEG-2	PEG-3	PEG-4	PEG-5	PEG-6	PEG-7	PEG-8	PEG(4+5+6)
										1	0.17
2	0.59			3	26	40	25	5	69
										3	0.88			5	29	45	19	3	78
4	1.04			6	28	49	16	2	83
										5	1.16			6	28	50	14		98
6	1.24			5	30	55	10		100
										7	1.27			5	33	54	8		100
8	1.27			5	39	51	5		100
										9	1.27			5	50	42	4		100
10	1.24			5	60	33	2		100
										11	1.21			6	66	25	3		100
12	1.17			8	74	18			100
										13	1.13			15	73	12			100
14	1.09			21	71	8			100
										15	1.05			37	57	5			100
16	1.01			48	47	5			100
										17	0.97			56	40	4			100
18	0.91		2	62	32	4			98
										19	0.84		0	81	19				100

级分#	蛋白浓度mg/ml	PEG-2	PEG-3	PEG-4	PEG-5	PEG-6	PEG-7	PEG-8	PEG(4+5+6)
										20	0.77		1	78	21				99
21	0.71		7	77	16				93
										22	0.66		12	76	12				88
23	0.61		19	70	11				81
										24	0.57		22	70	9				79

表6b

级分#	蛋白浓度mg/ml	PEG-2	PEG-3	PEG-4	PEG-5	PEG-6	PEG-7	PEG-8	PEG(4+5+6)
										UF/DF#3池	3.51		9	27	37	22	4		86
合并的级分	1.08			22	46	28	5		96

*以HIC池测定

尽管上述说明涉及重组B-2036和重组B-2036PEG，除非另外说明，应理解的是，本发明的主题可用于任何重组PEG化生长激素激动剂，重组PEG化生长激素拮抗剂，无论是哺乳动物生长激素或其拮抗剂，PEG化人生长激素或其拮抗剂，还是牛生长激素或其拮抗剂，任何PEG化蛋白，任何PEG化激素，任何PEG化抗体(或片段)等。

序列表

<110>法玛西亚公司(PHARMACIA CORPORATION)

降低PEG化蛋白的聚集体水平的方法

<120>

(PROCESS FOR DECREASING AGGREGATE LEVELS OF PEGYLATED PROTEIN)

<130>SCT051000-47

<150>US 60/412,227

<151>2002-09-20

<160>2

<170>FastSEQ for Windows Version 4.0

<210>1

<211>191

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>1

Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg

 1               5                  10                  15

Ala Asp Arg Leu Asn Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu

            20                  25                  30

Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro

        35                  40                  45

Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg

    50                  55                  60

Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu

65                  70                  75                  80

Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val

                85                  90                  95

Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp

            100                 105                 110

Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Lys Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu

        115                 120                 125

Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser

    130                 135                 140

Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr

145                 150                 155                 160

Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Asn Ala Asp Met Ser Arg Val Ser Thr Phe

                165                 170                 175

Leu Arg Thr Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe    

            180                 185                 190

<210>2

<211>191

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>2

Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg

 1               5                  10                  15

Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu

            20                  25                  30

Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro

         35                  40                  45

Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg

    50                  55                  60

Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu

65                  70                  75                  80

Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val

                85                  90                  95

Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp

            100                 105                 110

Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu

        115                 120                 125

Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser

    130                 135                 140

Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr

145                 150                 155                 160

Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe

                165                 170                 175

Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe

            180                 185                 190

Claims (11)

1.一种降低由PEG化生长激素拮抗剂或其同工型形成的聚集体的水平的方法，所述方法包括下列步骤：

(a)提供所述PEG化生长激素拮抗剂或其同工型；

(b)将包括任何杂质和任何聚集体的所述PEG化生长激素拮抗剂或其同工型上样到阴离子交换树脂上，其中上样在导电率小于或等于10mS/cm，pH为5-10，蛋白浓度为小于或等于10g/L填充床体积的条件下进行；以及

(c)通过阴离子交换层析分离所述PEG化生长激素拮抗剂或其同工型；

从而降低形成的聚集体水平。

2.权利要求1的方法，其中所述AEX树脂选自ANX4，DEAE，Q-Sepharose，Q-Sepharose FF，Q Sepharose HP，和Q-Sepharose XL。

3.权利要求1或2的方法，其中在步骤(b)中，上样以导电率小于或等于5mS/cm进行。

4.权利要求1或2的方法，其中在步骤(b)中，上样以导电率小于或等于2.4mS/cm进行。

5.权利要求1或2的方法，其中所述步骤(b)以阴离子交换树脂上样pH为6.6-9进行。

6.权利要求1或2的方法，其中所述步骤(b)以阴离子交换树脂上样pH为6.9-7.1进行。

7.权利要求1的方法，其中所述PEG化生长激素拮抗剂包含选自下列PEG化生长激素拮抗剂同工型中的一种或多种：PEG-1，PEG-2，PEG-3，PEG-4，PEG-5，PEG-6，PEG-7，PEG-8，和PEG-9，及其任何聚集体，三硫化物杂质和des-phe杂质，以及所述生长激素拮抗剂的任何未PEG化杂质和任何游离PEG分子。

8.权利要求1的方法，其进一步包括合并步骤(d)：合并个别量的所述PEG化生长激素拮抗剂同工型，以通过选自下列的技术生成合并的PEG化生长激素拮抗剂：毛细管电泳(CE)，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，离子交换(IEX)层析，疏水相互作用层析(HIC)，阴离子交换(AEX)层析，阳离子交换(CEX)层析，反相高压液相层析(RPHPLC)，大小排阻高压液相层析(SEHPLC)，亲和层析(AC)及其组合。

9.权利要求8的方法，其中所述合并的PEG化生长激素拮抗剂包括PEG-1，PEG-2，PEG-3，PEG-4，PEG-5，PEG-6，PEG-7，PEG-8，和PEG-9中的一种或多种。

10.权利要求9的方法，其中基于所述PEG-1，PEG-2，PEG-3，PEG-4，PEG-5，PEG-6，PEG-7，PEG-8和PEG-9 PEG化生长激素拮抗剂同工型及其任何聚集体的总重，PEG-4，PEG-5和PEG-6合并的PEG化生长激素拮抗剂级分占至少70％重量。

11.权利要求1的方法，其中基于所述同工型和所述聚集体的总重，所述聚集体降低的水平小于或等于10％重量。

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