CN1761535A - 用于控制聚合物微粒的溶质载荷的方法 - Google Patents

用于控制聚合物微粒的溶质载荷的方法 Download PDF

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Abstract

通过将微粒浸入含有溶于三元溶剂体系的选定溶质的浴中，得到溶质载荷的聚合物微粒。该三元体系的第一溶剂是一种对于溶质和形成微粒的聚合物而言都强的溶剂。第二溶剂是一种对于溶质和聚合物而言的弱溶剂或者非溶剂(调谐溶剂)。第三溶剂是一种对于溶质和聚合物而言的弱溶剂或者非溶剂，但是用作共溶剂，对于第一和第二溶剂而言，其与第一和第二溶剂都是混溶的。通过调节溶质相对于微粒聚合物的比率、和通过调节三元溶剂体系的组成，特别是调谐溶剂的数量，来控制溶质结合至微粒的数量。本方法用于提供含有可辨染料载荷，特别是可辨荧光染料载荷的组合编码微粒库，是特别有用的。

Description

用于控制聚合物微粒的溶质载荷的方法
发明的技术领域
本发明涉及一种方法，其用于控制溶质在液体连续相与固体分散相之间的分配，例如在染色粒子生产中。
发明的背景技术
含有一种夹带溶质如染料的聚合物粒子被广泛用作生物分子的标记物，以及用作内标和校对标准，用于诸如流式血细胞计数的化验检测方法。在生产荧光聚合物粒子的现有技术中已描述了四种常规的方法：(A)染料和单体的共聚合；(B)水溶性或油溶性染料分配至预制粒子；(C)预制粒子的表面功能化；和(D)染料微滴的封装。另外，也已将聚合方法应用于制备核-壳粒子，也就是，由聚合物核和聚合物壳层组成的微粒。
A.依据共聚合的方法
在荧光染料的存在下，用单体单元聚合以形成微粒，可合成荧光微粒。Rembaum(1982年)的美国专利4,326,008描述了通过功能化丙烯酸单体与可聚合荧光共聚单体的共聚合来合成荧光微粒。该方法通常需要可聚合染料分子。这种方法，通常遭遇这些缺点：荧光染料导致聚合的可能抑制和/或聚合反应的活性组分导致的荧光漂白。
Rembaum(1981年)的美国专利4,267,235描述了使用悬浮聚合法合成聚戊二醛微球。使用共增溶的异硫氰酸荧光素(FITC)制造荧光微球。该单体与共增溶染料分子的悬浮液缩合聚合，尽管大部分防止了染料破坏和聚合抑制，仍产生了较宽的粒径分布，因此不是用于单分散荧光微球生产的适当途径。
Schwartz等(1991年)的美国专利5,073,498描述了一种通过种子聚合(seeded polymerization)制造荧光微粒的工艺。将一种或多种疏水荧光染料溶于含有单体和引发剂的溶液中。将该溶液加入预溶胀的微粒中。该专利公开了使三种不同染料导入粒子的方法。该方法遭遇这样的缺点：荧光染料导致聚合的可能抑制，或者相反聚合工艺导致荧光漂白。
多步乳液聚合已经被利用以制备没有表面官能团的核-壳粒子。Kumaceheva等的美国专利5,952,131公开了一种用于制备染色核-壳粒子的方法。该方法是基于两种单体(甲基丙烯酸甲酯和二甲基丙烯酸乙二醇酯)混合物和一荧光染料(4-氨基-7-硝基苯并-2-氧杂-1，3二唑标记的甲基丙烯酸甲酯)的多步半连续聚合。然后，该粒子在链转移剂(十二烷基硫醇)存在下，通过甲基丙烯酸甲酯和甲基丙烯酸丁酯的共聚，用外壳层封装。Kumaceheva等人没有制备，也没有作为目的获得引入表面官能团的核-壳聚合物产品。
Ober等人的美国专利4,613,559公开了一种通过溶胀制备着色调色剂的方法。在乙醇、聚(丙烯酸)、甲基溶纤剂(methylcellosolve)和过氧化苯甲酰的存在下，用苯乙烯的分散聚合制备聚苯乙烯粒子(5.5微米)。通过将该聚苯乙烯分散在十二烷基硫酸钠和丙酮的水溶液中实现溶胀。通过将乳化的染料溶液(用十二烷基硫酸钠水溶液乳化二氯甲烷中的Passaic油红2144)加至该粒子分散体系来得到着色粒子。
聚合方法已经被用于制备含有表面官能团的核-壳粒子。Wang等人的美国专利5,395,688公开了包括用一层含磁响应性金属氧化物的聚合物层包覆的聚合物核的磁响应荧光聚合物粒子。该最终的聚合物壳是用功能性单体来合成的，以便于与生物材料共价偶合。Wang等人的工序是基于三步：(1)荧光核粒子的制备；(2)在没有乳化剂但引发剂过量的条件下，通过自由基聚合，金属氧化物被封装在荧光核上形成的聚苯乙烯壳内；和(3)用一层功能性聚合物包覆磁性荧光粒子。该功能性聚合物具有羧基、氨基、羟基或者磺酸基。Wang等人没有描述获得着色核的方法，而且也没有说明在自由基聚合过程中染料破坏的问题。
Kraemer等人的美国专利4,829,101公开了通过核-壳聚合法得到2微米荧光粒子。所述的核是通过用过硫酸铵引发甲基丙烯酸异丁酯、甲基丙烯酸甲酯和二甲基丙烯酸乙二醇酯的混合物于80℃聚合得到的。通过在第一步中半连续地加入含有荧光染料(氟-绿-金)的相同单体的混合物，在核上合成壳。直至反应结束，在1个多小时的时段内加入两种不同的单体混合物：第一种混合物，其含有甲基丙烯酸甲酯、乙二醇-双-(甲基丙烯酸)酯和甲基丙烯酸缩水甘油酯，第二种混合物，其含有甲基丙烯酰胺和引发剂。所述的聚合是用4，4′-偶氮双-(氰基戊酸)引发的。
Okubo等Colloid Polym.Sci.269：222-226(1991年)、Yamashita等Colloids and Surfaces A.，153：153-159(1999年)以及美国专利4,996,265描述了通过种子分散聚合法生产微米级大小的单分散聚合物粒子。聚合物种子粒子在种子聚合前用大量的单体预溶胀。这种溶胀是通过缓慢、连续、逐滴将水加至含有种子粒子、单体、稳定剂和引发剂的乙醇-水混合物来完成的。水的加入降低了单体在连续相的溶解度，导致单体沉淀和随后吸收到该种子聚合物粒子上或进入其中。这种被吸收到种子聚合物粒子内的单体然后被聚合，以产生大量的单分散聚合物粒子。
B.水溶性或油溶性染料的分配
根据最初由L.B.Bangs(《Uniform Latex Particles》；Seragen Diagnostics公司，1984年，40页)描述的技术，通过使染料分子分配至预溶胀的微粒内可生产荧光粒子。该工艺包括染料分子或染料分子混合物溶解于含有聚合物微粒的选择溶剂或溶剂混合物中。微粒对该溶剂的吸收导致溶胀，使微粒吸收了一部分存在于溶剂混合物中的染料。该染色过程通常用除去溶剂来终止。染料分配的水平是通过调节染料的浓度，以及在多种染料的情况下，单个染料的相对丰度来控制的。以这种方式染色的微粒非常稳定和均一。但是，在多数情况下，依赖于选择的溶剂体系，需要大量的染料过量以获得想要的分配，导致了昂贵的染料原料大量损失。
Haugland等(1998年)的美国专利5,723,218、Zhang等(1998年)的美国专利5,786,219、Brinkley等(1994年)的美国专利5,326,692和Singer等(1996年)的美国专利5,573,909描述了通过在有机溶剂和有机溶剂混合物中溶胀和染料分配以生产各种荧光染色粒子的方案。也描述了各种类型的荧光粒子，例如含有多种染料的荧光粒子、表现可控和提高斯托克司(Stokes)频移的粒子以及显示荧光球区的粒子。
Chandler等(1997年)的国际专利申请WO 99/19515描述了一种用两种染料生产一系列编码比率测量(ratiometrically-encoded)微球的改进方法。其报道一种生产64种不同编码微球的方案，也公开了使用有机溶剂与醇(在无水条件下)的混合物的溶胀浴组合物。
Matsudo等(1993年)的美国专利5,266,497描述了一种用溶于有机溶剂的疏水性染料在水中乳化以产生染料标记聚合物粒子的方法。这种染色的粒子被用于免疫-色谱分析的目的。
Ober等(1986年)的美国专利4,613,559描述了用油溶性染料合成着色聚合物粒子。该公开的方法使用了二氯甲烷染料溶液在水和丙酮混合物中的乳液来着色微粒。
C.内或外微粒表面的功能化
通过表面功能化生产荧光粒子涉及一种或多种染料共价结合到在预制微粒表面上的活泼基团。这样就使得染料分子曝露于环境下，其能加速染料的分解。另外，表面功能化常常导致粒子表面非常疏水，引起不想要的非特异性吸收，以及，在有些情况下，安放在粒子表面之上或接近粒子表面的生物分子的活性丧失。将染色小粒子(代替染料分子)结合至载体粒子的表面，可防止这些问题。这种从少量的染料(编码比率)产生大量的编码粒子的方法功效还不清楚。
Shih(1984年)的美国专利4,487,855、Cheung(1993年)的美国专利5,194,300以及Schwartz(1988年)的美国专利4,774,189公开了通过将一种或多种染料共价结合至预制粒子表面的活泼基团，来制备着色或荧光微球的方法。Battersby等，“通向较大的化学库：在组合化学中用荧光胶体编码(Toward Larger Chemical Libraries：Encoding with Fluorescent Colloidsin Combinatorial Chemistry)”J.Am.Chem.Soc.2000年，122，2138-2139；Grondahl等，“编码组合库：荧光硅胶的新应用(Encoding CombinatorialLibraries：A Novel Application of Fluorescent Silica Colloids)”，Langmuir2000年，16，9709-9715；和Chandler等(2001年)的美国专利6,268,222描述了通过将一组较小的、被染色的聚合物粒子结合至载体微粒表面来生产荧光微球的方法。
D.封装方法
通过封装形成荧光粒子利用了预聚物和一种或多种染料的溶液。在一种方法中，用振动喷嘴或喷射器使溶液以液滴的形式分散，而且将溶剂除去，以生产封装染料的聚合物微粒。这个工艺需要特殊的工艺设备，而且显示有限的产量。可选择地，将聚合物染料混合物在高沸点溶剂中乳化，并且将该溶液蒸发以得到聚合物封装的染料粒子。这个工艺常常产生具有宽粒径分布的非球形粒子。
Fulwyler等(1974年)的美国专利3,790,492公开了一种使用喷射器从预溶解聚合物和染料溶液中生产均一荧光微球的方法。Fulwyler等(1988年)的美国专利4,717,655公开了一种工艺，其包括在聚合物微粒中预指定比率的两种染料，来生产5种可辨的双色粒子。
生产荧光微粒的各种现有技术方法都存在某些缺点。当使用强溶胀溶剂时，必须将微粒交联以防止其在染料溶液中分解和变形。这种制约代表了严重的限制，原因是多数的染料需要它们以任何合理浓度溶解于溶剂体系中，在该溶剂体系中绝大多数感兴趣的聚合物粒子，特别是聚苯乙烯，也会溶解。这些顾虑限制了将现有技术中的溶剂溶胀应用于化学稳定化(“交联”)微粒。这种限制在微粒合成中引起了额外的难度和成本；高度交联粒子常常极难于合成。同样地，对交联粒子的约束限制了微粒溶胀的程度以及染料结合的程度。特别是，在交联微粒上实施现有技术的溶剂溶胀方案应用，常常限制了染料渗透至微粒的外层，据此阻止了单个粒子的整个内部体积均一染色，而且一般也阻止了高水平染料结合的实现。这就需要一种能利用非交联以及交联粒子的方法。就需要这样一种方法，其将提供载有染料的非交联聚合物微粒，其可以用于，例如制备具有包含不同染料和/或不同染料量的染色微粒库。
在现有技术的基于溶剂溶胀的染料结合方法中，粒子溶胀程度决定了染料运输至粒子的速度。扩散壁垒导致在微粒中的非均一染料分布。基于此原因，为了产生均一染色微粒群，需要剧烈的微量混合(通过有效机械混合或通过超声波处理来实现)。这些剧烈混合方法，尽管用于实验室规模制备是有效的，并非毫不费力地适用于大规模。例如，超声波常常需要特殊设备如探针超声波仪(probe sonicators)，而且限制了多重染色反应的平行完成。这就需要的是一种染色粒子制造的工艺，其要求很小的剧烈混合或者无混合，并且允许进行平行染色反应。
通过现有技术溶胀方法染色的微粒随后易暴露于于溶剂下，这导致染料的大量损失，并且可能阻止了提供多重连续染料结合步骤的方案实施。
在现有技术的方法中，染料分配至聚合物母体的程度是通过染料溶液中染料初始浓度明确变化来控制的。这种方法，当允许实施多种、不同水平染料包覆时，遭遇大量的缺点。例如，高水平的染色经常不能获得，原因是染料在浴中有限的溶解度。即使当溶解度不是主要问题时，许多染料的低分配系数需要在溶液中的染料过量，引起对随后的生物分析检验的毒害作用。事实上，当通过现有技术溶剂-溶胀方法制备羧化物修饰的小球时，羧基功能可能不发挥作用，并且可能不再适用于通过共价偶合至其它化学基团来功能化。另外，贵重的染料原料大量地损失。这就需要这样一种工艺，其用于制备染色的微粒，特别是荧光微粒，即使从溶解性差的染料/溶剂配方中也可实现染料的结合。所需要的是这样一种工艺，其允许在染色过程中准确地控制在聚合物微粒内的溶质(染料)载荷水平。
发明概述
根据一个具体实施方式，本发明提供了一种用于调节在聚合物微粒中的溶质载荷的方法。该方法包括：
(a)提供
(i)至少一种第一溶剂，溶质和微粒聚合物可溶解于其中；
(ii)至少一种第二溶剂，溶质和微粒聚合物不能或者较差地溶解于其中，所述的第一和第二溶剂不混溶或者至多部分混溶；
(iii)至少一种第三溶剂，溶质和微粒聚合物不能或者较差地溶解其中，所述的第三溶剂与第一和第二溶剂可混溶；
(b)在指定体积的、含有至少一种第二溶剂和至少一种第三溶剂的混合物中，形成所述聚合物微粒的悬浮液；
(c)将含有溶于所述第一溶剂的溶质的溶液，加至所述的聚合物微粒悬浮液，由此，该溶质被所述的微粒吸收；
(d)通过在所述微粒悬浮液或者其小部分中控制所述溶质和第二溶剂的相对浓度，以使所述溶质从悬浮液液相至所述微粒的完全分配很少发生，来控制溶质在所述聚合物微粒中的浓度。
根据一个具体实施方式，所选择的第二溶质浓度是通过将选择量的至少一种第二溶剂加入特征为所述第一溶质载荷浓度的微粒悬浮液，来实现的。根据另一个具体实施方式，通过将微粒悬浮液分成小部分，并将选择量的第二溶剂加至所述的小部分，来提供多种选择溶质浓度的微粒小部分。
根据本发明的另一个具体实施方式，一种用于调节聚合物微粒的溶质载荷的方法包括：
(a)提供
(i)至少一种第一溶剂，溶质和微粒聚合物可溶解其中；
(ii)至少一种第二溶剂，溶质和微粒聚合物不能或者是较差地溶解其中，所述的第一和第二溶剂不混溶的或者至多部分混溶；
(iii)至少一种第三溶剂，溶质和微粒聚合物不能或者是较差地溶解其中，所述的第三溶剂与第一和第二溶剂可混溶的；
(b)在指定体积的、含有至少一种第二溶剂和至少一种第三溶剂的混合物中，形成所述聚合物微粒的悬浮液；
(c)将溶于所述第一溶剂中的溶质的溶液加入所述的聚合物微粒悬浮液，由此，所述溶质被所述的微粒吸收；和
(d)将第二溶剂连续或半连续地加入所述的微粒悬浮液，以连续或半连续地调节所述的微粒溶质浓度，并据此控制溶质在所述微粒中的吸收和最终浓度。
在上述用于调节聚合物微粒的溶质载荷方法的一个具体实施方式中，该方法进一步包括在加入所述的第二溶剂的过程中、以一定时间间隔从所述悬浮液中除去至少一部分所述微粒的步骤，以提供至少两个溶质浓度不同的微粒组。
在另一个具体实施方式中，本发明是一种用于调节聚合物微粒的染料负荷的方法，其包括：
(a)提供微粒，其特征为包含在所述微粒中至少一种染料的第一浓度，所述微粒悬浮于含有至少一种染料和一种溶剂体系的染料溶液中，所述溶剂体系包括：
(i)至少一种第一溶剂，所述染料和所述微粒聚合物可溶解其中；
(ii)至少一种第二溶剂，所述染料和所述聚合物不能或者是较差地溶解其中，所述的第一和第二溶剂不混溶的或者至多部分混溶；
(iii)至少一种第三溶剂，染料和该聚合物不能或者是仅较差地溶解其中，所述的第三溶剂与所述第一和第二溶剂可混溶；
(b)将一选择量的所述第二溶剂加入所述的微粒悬浮液，以改变所述染料分配至聚合物微粒的量和在所述微粒中染料的浓度；和
(c)培养微粒悬浮液一段时间，使得染料分配至微粒的量，对于在染料溶液中给定初始染料浓度的情况，通过被加至微粒悬浮液的第二溶剂量来控制。
另一个具体实施方式中，本发明是一种生产染色聚合物微粒的方法，包括：
(a)提供
(i)至少一种第一溶剂，染料和微粒聚合物可溶解其中的；
(ii)至少一种第二溶剂，染料和微粒聚合物不能或者是较差地溶解于其中，所述的第一和第二溶剂不混溶地或者至多部分混溶；
(iii)至少一种第三溶剂，染料和微粒聚合物不能或者是较差地溶解于其中，所述的第三溶剂与第一和第二溶剂可混溶；
(b)在指定体积的、含有至少一种第二溶剂和至少一种第三溶剂的混合物中，形成所述聚合物微粒的悬浮液；
(c)将含有溶于所述第一溶剂中染料的溶液加入所述的聚合物微粒悬浮液，由此，该染料被所述的微粒吸收，以提供在微粒中特征为所述染料第一浓度的微粒母料(master-batch)悬浮液；
(d)从含有选定被加入量的第二溶剂的所述微粒母料悬浮液中，制备两个或多个等分试样(aliquots)，以改变在所述的等分试样里分配至聚合物微粒的染料量；和
(e)培养微粒悬浮液等分试样一段时间，使得分配至微粒的染料量，对于在染料溶液中给定初始染料浓度情况下，通过被加至微粒悬浮液等分试样的第二溶剂量来控制。
本发明也提供了一种生产染色聚合物微粒的自动方法。该方法包括：
(a)提供一种含有微粒的微粒母料悬浮液，其特征为以在微粒中第一染料浓度，悬浮于含有至少一种染料和一种溶剂体系的染料溶液中，该溶剂体系包括：
(i)至少一种第一溶剂，所述染料和微粒聚合物可溶解其中；
(ii)至少一种第二溶剂，所述染料和聚合物不能或者是较差地溶解其中，所述的第一和第二溶剂不混溶地或者至多部分混溶；
(iii)至少一种第三溶剂，所述染料和聚合物不能或者是较差地溶解其中，所述的第三溶剂与第一和第二溶剂可混溶；
(b)从所述母料悬浮液中，制备两个或多个微粒悬浮液等分试样，每个这种悬浮液等分试样，其特征为所述第一染料浓度的微粒被悬浮于所述的染料溶液；
(c)每个制备的等分试样至少一次，执行下列顺序的步骤，以转换在每个等分试样中的微粒染料状态，从所述的第一染料浓度到选定的第二染料浓度：
(i)计算，对于选定的第二染料浓度：
(1)染料溶解在所述第一溶剂中的量，和
(2)第二溶剂量，其为加入至所述等分试样以获得所述选定第二微粒染料浓度所需要的量；和
(ii)将溶于所述第一溶剂的染料量和要求的第二溶剂量分配至所述等分试样，以获得所述选定第二微粒染料浓度。
用于生产染色聚合物微粒的设备包括，运行地连接至移液自动装置的计算机，其中该计算机被编程以完成上述自动化方法。
制备所述含有选定加入量第二溶剂的两种或多种微粒悬浮液等分试样的步骤可包括，将微粒悬浮母料分成两个或多个等分试样，和加入选定数量第二溶剂至所述等分试样。作为一种选择，制备含有选定加入量第二溶剂的两种或多种微粒悬浮液等分试样的步骤也可包括，连续地或半连续地将第二溶剂加至微粒悬浮液母料，以及在第二溶剂加入过程中以一定时间间隔移除至少一部分该母料。结果是形成了含有选定加入量的第二溶剂的两种或多种微粒悬浮液等分试样。
附图说明
图1(a).是用于本发明的三元溶剂溶液示意图
图1(b).是本发明一个具体实施方式的步骤顺序图
图2.是根据本发明染料结合至溶剂浴中聚合物微粒的水平的三维图，该水平是三个变量的函数。(X)是染料在浴中的质量(代表染料的浓度，C(s)，乘以加入至浴的染料体积，V(s))除以微粒的体积，V(p)。(Y)是在浴中的微粒体积分数，φ(P)，除以溶剂体积分数φ(s)。(Z)是包含在微粒中的染料浓度，C(p)。因此，(Z)轴代表分配至微粒的染料质量除以微粒的体积。粒子的体积分数，φ(p)，以方程φ(p)＝(1-φ(s))给出。在(X，Z)平面的直线(P0)代表在没有调谐溶剂(tuning solvent)条件下染料分配(作为X的函数)至微粒。直线(P1)代表在调谐溶剂的体积分数，φ，存在下染料分配至微粒(作为在浴中染料质量(X)的函数)。
图3(a).是平行进行本发明具体实施方式的示意图，用于从n溶剂体系/微粒悬浮液Bn生产荧光染色微粒的n亚群(Fn(Sn))。每个悬浮液含有指定数量Sn调谐溶剂。
图3(b).是顺序进行本发明具体实施方式的示意图，用于从单一反应生产荧光染色微粒的n亚群。[B]代表溶剂体系/微粒悬浮液的预培养母料，调谐溶剂的连续流输入至其中。Fn(Sn)代表在时间t＝tFn时从母料移除的微粒悬浮液分数。该分数包括调谐溶剂的Sn数量。
图3(c).是本发明一个具体实施方式的示意图，用于通过用顺序和平行进行的组合来生产荧光染色微粒的n亚群Fn(Sn)。[B]代表溶剂体系/微粒悬浮液的预培养母料，已知量的调谐溶剂，S(tF)，输入至其中。然后，母料被分为n个不同的等分试样，Bn，将n个不同指定数量的调谐溶剂，δSn，加入至其中。
图3(d).是本发明一具体实施方式的示意图，用于通过用顺序然后平行进行、使用溶剂调谐和染料添加的组合来生产荧光染色微粒的mxn亚群Fm(Sm，Dn)。Sm表示调谐溶剂的数量，Dn为荧光染料被加至各种亚群Fm(Sm，Dn)的数量。
图4.是根据下面的实施例1制备粒子收集的荧光图。
图5.是根据下面的实施例2制备粒子收集的荧光图。
图6(a).是荧光标定曲线，其为对于溶于乙醇的绿色荧光染料，4，4-二氟-5，7-二甲基-4-硼杂-3a，4a-二氮杂-s-indacene-3-戊酸琥珀酰亚胺酯，在发射波长512nm下的荧光强度相对于染料浓度绘制的图。
图6(b).是在粒子中捕获的绿色荧光染料计算量变化图，作为用于在实施例3-6的制备粒子中水体积分数的函数。
图6(c).是在粒子中捕获的绿色荧光染料计算量变化图，作为用于实施例3-6粒子绿色荧光染料强度的函数。
图6(d).是作为Y函数(这里，Y＝(1-φs)/φs)的绿色荧光染料的分配系数变化图。
图7.是根据实施例26制备粒子收集的荧光图。
图8.是根据实施例30制备粒子发射的荧光图。
图9.是根据实施例31制备粒子发射的荧光图。
发明的详细描述
溶质在指定为1和2的两个不混溶相之间的分布是由分配系数，K，决定的，K代表了在所述两相中溶质(N)平衡量的比率，即，K＝[N1/N2]。
本发明提供了调谐分配系数K的方法，K决定了溶质在两个基本不混溶相之间的分布，也就是，在液体连续相与分散的固相之间的分布，所述分散的固相包括被分散在该液体连续相内的固体粒子。因此，本发明提供了用于在溶剂体系中将溶质向聚合物微粒内的控制导入。所述的溶质可包括任何可被分配至聚合物微粒相的任何物质，例如染料、颜料、药物、催化剂、纳米粒子，或者任何其他的需要载至聚合物微粒之上或进入聚合物微粒内的有用物质。
在优选的具体实施方式中，所述的溶质是一种染料，并且以下通过染料(溶质)在两种基本不混溶相，即总的预聚物微粒(相1)和均匀三元溶剂混合物(相2)之间的分配来说明本发明。所述的微粒包括固相。所述的溶剂混合物包括液相。所述的染料可以是任何能将想要的颜色或者想要的荧光给至聚合物微粒的物质。因此，所述的染料可包括发色团或者荧光团。在所述微粒中结合的染料数量通过在给定初始染料浓度情况下调谐该三元溶剂混合物的组成来准确地控制。如下面例证的，所述的方法能够生产大量可辨的染料染色微粒，该微粒含有可再生的预定水平的染料，即“染料编码”，具有染料含量的最小样本内变化。
本发明的方法因此引入溶剂组成作为一种新的控制参数，用以通过提供分配系数的定量(宽范围的)调节来制备染色微粒，该分配系数确定了在染料浴和微粒之间的染料分布。特别是，在溶剂调谐下的染料分配系数K遵循下面的关系：K＝a exp(bY)，这里Y＝(1-φs)/φs；φs表示溶剂的体积分数；而(a)和(b)是常数。
根据本发明，染料编码起因于改变粒子的染料载荷。关于包含在微粒中的染料，用“载荷”是指染料结合至微粒内的数量和/或特征。所述的载荷可因此被选自下面的至少一个特性改变，(i)被结合染料的数量和(ii)被结合染料的同一性。编码可因此采取的形式是：改变作为不同组微粒之间的单个染料的数量，改变染料的化学性质(使用不同的染料或者染料的不同组合)，或者两者。
根据本发明，用于制备染色微粒，特别是荧光染色微粒的均匀三元溶剂混合物图示在图1(a)中。#1号溶剂是一种对染料和聚合物(由此形成微粒)而言的强溶剂其。#2号溶剂，这里也视作“调谐溶剂”，是一种对染料和聚合物而言的弱溶剂或者非溶剂。在优选的具体实施方式中，#2号溶剂是一种水溶性溶剂，优选水。#1号和#2号溶剂彼此不混溶或者部分混溶。第三种溶剂，#3号溶剂，是一种对染料和聚合物而言的弱溶剂或者非溶剂，但是用作对#1号和#2号溶剂的共溶剂，其中，它与#1号和#2号溶剂都是混溶的。在优选的具体实施方式中，#3号溶剂是一种醇。
现有技术的微粒染料结合的“溶胀”法受限于用于感兴趣染料的可选用的溶剂范围窄，通常需要使用交联粒子。这些现有技术方法包括确定选用的溶剂(染料在该溶剂中以较宽的浓度范围溶解)，和制备想要浓度的染料溶液。然后，该染料溶液与聚合物微粒接触一段时间，以使染料渗透至微粒。
荧光粒子生产的现有技术溶胀法，遭遇了染料在染料浴中有限的溶解度。即便是染料的溶解度不是问题，用于聚合物的许多染料的低分配系数需要大大过量的贵重荧光染料，但是这些荧光染料被损失了。相对照的是，本发明生产了非常高染料含量的微粒，甚至是从溶解较差的染料/溶剂制剂。本发明的这个方面反映了这样的事实，在浴中的染料可以通过溶剂调谐完全地消耗掉。
对照现有技术基于溶剂溶胀的方法，本发明的染料结合方法可等效用于非交联以及交联粒子的染色。用“交联”来描述含有微粒的聚合物，是指这样的聚合物，其中链被连接在一起以形成三维的网状结构。在聚合过程中，通过使用交联剂可实现交联，所述的交联剂也就是具有两个或多个能与在聚合物链上官能团反应的基团的试剂。也可通过聚合具有平均官能度大于2的单体来制备交联聚合物。
本发明因此首次提供了由非交联聚合物组成的载有染料的微粒。这是一个重大的改进，原因是高交联粒子常常是极难合成的。此外，不像许多现有技术粒子染色方法，依赖于强烈的混合物以在微粒的染料染色中实现均一化，本发明的方法仅需要适度的搅拌。这种适度搅拌只是为了保持粒子悬浮所需要的。这是对现有技术的方法重大的改进，原因是强烈混合的那些方法需要特殊的设备，并且难于大规模化。
聚合物交联通常约束了从交联聚合物形成微粒的溶胀，并且也阻止了染料渗透至粒子中。结果是，染料被限于微粒的薄外层，以及限制了染料载荷。利用非交联聚合物作微粒材料的能力首次允许染色聚合物微粒的生产，所述微粒的特征是非常均一的染料分布贯穿微粒的全部。所用的“非常均一”是指，在荧光成像的条件下染色粒子产生对称的而且单峰的荧光强度图。相对照地，表面染色粒子(这里，荧光剂被束缚在表面或者靠近表面的浅层区)产生对称的但是双峰荧光强度图。
在有些情况下，在微粒中可能想要得到一种控制的非均一染料分布。在微粒相染料已经与液相染料达到平衡之前，通过从染色浴除掉微粒不能实现完全的染料渗透。染料渗透的程度是由在染色浴中的微粒培养时间决定的。在平衡前，从所述的浴除去微粒导致对称的但是双峰的荧光强度图。粒子荧光强度图的形状，特别是强度峰的位置，是预平衡培养时间的函数。因此，在染色浴中的微粒培养时间为微粒编码提供了进一步的维数。在使用相同的染料时，通过改变在染色浴中微粒培养的时间，可产生各种荧光强度图的微粒组。也可利用多重染料来提供甚至更多的编码。
根据本发明，染料结合至微粒的数量通过调节涉及聚合物的染料比率，以及调节染料浴的组成来控制。特别是，并且对照现有技术的方法，三元溶剂体系其中一种成份即调谐溶剂的体积分数是便于改变的，以控制染料在溶剂和含有微粒的聚合物之间的分配。不同于现有技术的方法，本发明在染料选择和溶剂体系配方方面提供非常大的机动性。使用多组分溶剂体系实现了非常大的染料分配控制。如以下详细阐述的，本发明的方法利用分配系数K对溶剂组成的指数关系，并据此得到了比现有技术“溶胀”法可取得的更大的染料结合控制。现有技术的方法简单地改变在浴中的初始染料浓度，而不是调谐分配系数，并据此取得了在微粒的染料容量中成比例的变化(比例常数就是分配系数K)。
图2比较了在改变染料分配至聚合物微粒的情况下的本发明溶剂调谐方法与现有技术的溶胀法。点X1 (1)，X2 (1)和X3 (1)各自代表在该溶剂体系中的染料质量除以包含在体系内的微粒体积。点Z1 (1)，Z2 (1)和Z3 (1)各自代表染料结合至微粒的相应浓度。染料结合至微粒的水平是线性相关(线P0)于在溶剂体系中的染料质量，线的斜率是分配系数K的函数。因此，可以看出，现有技术的溶剂溶胀法限制了用于制备染色微粒的抛射线于XZ平面。只有通过明显地改变溶剂浴初始染料浓度(用于设定量的微粒染色)，可获得多重亚群的着色微粒，以在染料结合至粒子载荷的水平方面产生相应比例的变化。
相对照地，本发明引入溶剂组成作为一个新的变量，以控制生产多种染色微粒的工艺。通过对图2的思考，可看出，本发明提供了全部额外参数空间(Y)的维数，通过在一个三维参数空间(XYZ)内允许抛射线来制备染色微粒。例如，从组成Z1 (1)，Z2 (1)和Z3 (1)出发，独特粒子亚群表现为准确定义的，而且通过图2所示的非线性运行曲线来制备可预测水平的染料结合Z1 (2)，Z2 (2)和Z3 (2)。在任何固定溶剂组成(固定Y)下，Z和X彼此以线性方式相关(线OP1，表示具有调谐溶剂体积分数的溶剂组成＝φ)。
因此，在图2的三维参数空间XYZ中任意点可以沿着一个多重抛射线来逼近。反过来，每个抛射线允许以可预测的方式制备多重亚群染色微粒。本发明的方法，通过在热力学平衡决定的领域内运行和提供对这些抛射线的定量表达，允许合理的设计方案以制备多重亚群染色微粒。
在不希望被任何理论限制下，本发明的操作，其用于控制溶质(染料)在液体连续相和分散固相(微粒)间的分配，可通过下面的数学关系予以描述。
方程Z＝G(X，Y)决定了体系从第一状态，{X1，Y1，Z1}，到想要的第二状态{X2，Y2，Z2}的转变，这里，在分散(微粒)相中溶质(染料)地浓度(Z)是溶质浓度(X)和溶剂组成(Y)的函数。想要的第二状态{X2，Y2，Z2}是，根据方程Z＝G(X，Y)，通过按规定的方式调节X和Y，从多种可能的、从给定第一状态可得到这种第二状态中选择出来的。这种关系是由变量(X)、(Y)和(Z)决定的，将其定义如下：
X＝C(S){φ(S)/φ(P)}
Y＝{φ(P)/φ(S)}
Z＝C(P)
这里：
φ(P)＝{V(P)/(V(P)+V(S))}＝粒子相的体积分数
φ(S)＝(1-φ(P))＝溶剂相的体积分数
C(S)＝平衡时在溶液相中的溶质浓度
C(P)＝平衡时在粒子相中的溶质浓度
V(P)＝粒子相的体积
V(S)＝溶剂相的体积
溶质(染料)在粒子相(P)和溶剂相(S)之间分布是由分配系数K决定的：
K＝{N(P)/N(S)}
这里，N(P)是平衡时溶质分子在粒子相中的数目，和N(S)是平衡时溶质分子在溶剂相中的数目。
因此，在状态1中分配系数K的值为
K1＝N(P) 1/N(S) 1
以及在状态2中分配系数K的值为
K2＝N(P) 2/N(S) 2
应用下列的质量平衡方程，
NT 1＝NT 2                               溶质的总量                (1)
N(P) 1+N(S) 1+ΔN(S) 1＝NT 1               在状态1时溶质的总数      (2)
N(P) 2+N(S) 2＝NT 2                       在状态2时溶质的总数       (3)
这里，NT i是在状态i时溶质分子的总量(数目)，N(S) i时在状态i时被加入到溶剂相的额外溶质分子的数目，导致下列的迭代方程：
X2＝{(1+K1)/(1+K2)}X1+{1/(1+K2)}ΔX1                          (4)
Y2＝Y1+ΔY1                                                       (5)
Z2＝{(1+K1 -1)/(1+K2 -1)}Z1+{1/(1+K2 -1)}ΔX1                    (6)
在保持变量Y为常数特殊情况下，即，单独通过加入溶质从状态1转变至状态2，所以K1＝K2，得到下列方程：
Z2＝Z1+{1/(1+K-1)}ΔX1                                           (7)
此外，Z对X和Y的关系是以Z＝K(Y)X的形式得到。分配系数K对Y的关系反映了这样的事实，向溶剂相加入调谐溶剂削弱了溶剂溶解溶质的能力，并因此使得溶质重新分布至可用的分散相。特别是，实验数据和分析支持下列的函数公式：
K＝a exp(bY)                                        (8)
这里，a和b是常数，这是从分析如在图6d中表示出的数据确定的。
因此，本发明提供一组实现想要的状态转换的有效规定。特别是，全部系列的第二状态可通过单一的第一状态转换来产生。
上述的转换方程，特别是以如这里提供的它们的迭代形式，便于使用个人计算机和标准自动化移液装置(“遥控设备”)以分配必需计量的、染料或其它溶质以及调谐溶剂的等分试样，促进自动化生产收集的染料修饰微粒。使用以任何标准编程语言，如BASIC或C，开发的应用软件，以评价所述的迭代转换方程。编程计算机需要染料和调谐溶剂的等分试样。因此，使用标准实验室仪器控制界面如GPIB协议的和标准软件开发环境如LabView(国家工具)，来控制移液遥控设备计量和分配这些必需的等分试样。例如，使用如这里公开的母料，染色微粒组是易于制备的，利用这样的体系和通过执行下列的步骤：分配一种或多种母料的等分试样来制造第一状态的悬浮液，计算染料和染料溶剂的必需量来得到想要的第二状态的悬浮液，分配所述必需量的溶质和染料溶剂，以及允许转化发生。如需要可重复这些步骤。
通过现有技术溶胀法来着色官能团修饰微粒，可对官能团的完整性有不利地影响。如下面实施例28示例的，官能团修饰粒子可根据本发明的方式来染色，而不损失官能团的完整性。
应当认识到，本领域的普通技术人员可容易地利用可用的信息，来根据这里描述的溶解度参数选择微粒化学、溶剂和染料，用于实施本发明。
从本发明的工艺描述，这是很显然的，如果能得到或制造稳定分散的聚合物粒子的稳定分散体，可利用任何的聚合物来提供聚合物粒子。材料可包括均聚物或者共聚物，后一术语是指不仅包括两个单体单元形成的聚合物，也包括三个或多个单体单元形成的聚合物，有时定义为“三元聚合物”。优选疏水性聚合物。聚合物含有乙烯基类单体，也就是含乙烯基基团，最特别优选苯乙烯基团的单体，是特别优选的。一组优选的聚合物包括聚苯乙烯，或者含有从约50％至约100％重量份的苯乙烯单体单元的聚苯乙烯共聚物。所述的聚合物任选地可以是交联的或非交联的。在一具体实施方式中，微粒是由用1％二乙烯基苯(基于微粒的重量)交联的聚苯乙烯形成的。在另一具体实施方式中，微粒含有苯乙烯/甲基丙烯酸共聚物，该共聚物基于微粒的重量，含有从约0.6至约1％的甲基丙烯酸。
适合的聚合物材料包括下列单体的聚合物，以示例而非限制的方式：丙烯酸或其任意的酯，如丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸丙酯、丙烯酸丁酯、2-乙基丙烯酸己酯或者丙烯酸缩水甘油酯；
甲基丙烯酸或其任意的酯，如甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸丙酯、甲基丙烯酸丁酯、甲基丙烯酸月桂醇酯(1aurylmathacrylate)、甲基丙烯酸十六烷醇酯、甲基丙烯酸十八烷醇酯、二甲基丙烯酸乙二醇酯、四甘醇二甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸缩水甘油酯或者N，N-(甲基丙烯酰氧羟丙基)-(羟烷基)氨基乙基氮杂环丁酮酰胺(N，N-(methacryloxy hydroxy propyl)-(hydroxy alkyl)amino ethylamidazolidinone)；
烯丙酯如甲基丙烯酸烯丙酯；
衣康酸，或者其酯；
巴豆酸，或者其酯；
马来酸，或者其酯，如马来酸二丁酯，马来酸二辛酯或者马来酸二乙酯；
苯乙烯，或者其取代的衍生物如乙基苯乙烯、丁基苯乙烯或者二乙烯基苯；
含有胺官能度的单体单元，如甲基丙烯酸羟二甲氨基乙酯或甲基丙烯酸丁氨基乙酯；
含酰胺官能度的单体如丙烯酰胺或者甲基丙烯酰胺；
含乙烯基的单体如乙烯醚；乙烯硫醚；乙烯醇；乙烯酮；乙烯卤代物如氯乙烯；乙烯酯，如乙酸乙烯酯或柯赫酸乙烯酯(vinyl versatate)；乙烯腈类，如丙烯腈或甲基丙烯腈；
亚乙烯卤化物，如二氯乙烯和二氟乙烯；
四氟乙烯；
二烯烃单体，如丁二烯和异戊二烯；和
烯丙醚，如烯丙基缩水甘油醚。
含包括乙烯基单体的特别优选的均聚物和共聚物，包括聚苯乙烯、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚丙烯酰胺、聚(乙二醇)、聚(羟乙基甲基丙烯酸酯)、聚(乙烯基甲苯)和聚(二乙烯基苯)。
适合的聚合材料可包括下列聚合物，以示例而非限制的方式：聚氧化物，如聚(环氧乙烷)和聚(环氧丙烷)；聚酯，如聚(对苯二甲酸乙二酯)；聚氨酯；聚磺酸盐(polysulfonate)；聚硅氧烷，如聚(二甲基硅氧烷)；聚硫化物；聚乙炔；聚砜；聚磺酰胺；聚酰胺如聚己内酰胺和聚己二酰己二胺；聚亚胺(polyimin)；聚脲；杂环聚合物如聚乙烯吡啶和聚乙烯吡咯烷酮；天然聚合物如天然橡胶、明胶、纤维素；聚碳酸酯；聚酸酐；和聚烯烃如聚乙烯、聚丙烯和乙烯-丙烯共聚物。
所述的聚合物材料可含有官能团如羧基、酯、氨基、醛、醇或者卤素，这些提供了用于化学或者生物残基结合的位点，以此提高粒子在化学或生物分析中的实用性。从这些聚合物制备微粒的方法在现有技术中是熟知的。用于制备微粒以及交联微粒的代表性程序将在下面制备实施例中提出。
本发明的方法也可用于核-壳微粒的染色。核-壳微粒包括一个一种或多种核聚合物的中心核和一个含有所述核的一种或多种壳聚合物的壳。所述的聚合物壳可以任何聚合物涂层技术形成。如果壳形成聚合物比核形成聚合物显示更高的极性或更低的界面张力，那么核-壳形态是热动力学上占优的。如果壳形成聚合物的体积分数比核形成聚合物的大，那么核-壳形态也是占优的。因此，以壳/核的重量比大于1，实现核-壳粒子的合成。在有些具体实施方式中，核聚合物是疏水性的，而壳聚合物是相对的亲水的并带有感兴趣的官能团。
用于核聚合物，苯乙烯和比苯乙烯更亲水的单体(例如甲基丙烯酸)的共聚物，比聚苯乙烯均聚物更优选。该共聚单体用于降低核的疏水性，以及使其与亲水性壳聚合组分更兼容。
在这些约束内，任何单体或单体的组合可被选作壳聚合物。优选乙烯基单体的混合物。根据本发明的一个具体实施方式，使用一种作为主要成份的甲基丙烯酸甲酯和作为较少成份的甲基丙烯酸羟乙酯以及甲基丙烯酸的单体混合物，以在聚苯乙烯或改性的聚苯乙烯核上形成壳。一种这样的单体混合物组成为，以重量比，约6％甲基丙烯酸羟乙酯，从约5％至约20％的甲基丙烯酸，其余为甲基丙烯酸甲酯。这些单体比聚苯乙烯更亲水。
为了最终的用途，可适当地选择微粒的大小。代表性地，粒子直径的大小为从约0.1至约100微米，更具代表性地，从约0.5至约50微米，甚至更具代表性地，从约2至约10微米。优选地，微粒为“单分散的”，即，一组中的微粒具有窄的粒度范围，优选显示平均直径的变化系数(“CV”)不大于约5％的。
根据已知的方法，在染色前或之后，通过结合适宜的磁性材料可使微粒产生磁响应。根据一种这样的方法，用铁磁流体来充满粒子，例如根据实施例19制备的铁磁流体。所用的“磁响应”是指适应应用的磁场而改变位置或方位的能力。
所述的染料可包括赋予视觉的、或机器可观察的颜色或者荧光的任何的染料。所述的颜色或荧光用肉眼或者借助显微镜或其它光学仪器是可检测的。优选的荧光染料是苯乙烯染料，如对-二(邻甲基苯乙烯基)苯；焦甲烷(pyromethane)染料如荧光绿染料4，4-二氟-5，7-二甲基-4-硼杂-3a，4a-二氮杂-s-indacene-3-戊酸琥珀酰亚胺酯和荧光橙染料4，4-二氟-5-(2-噻吩基)-4-硼杂-3a，4a-二氮杂-s-indacene-3-丙酸琥珀酰亚胺酯；和香豆素染料如甲氧基香豆素。优选的那些荧光染料具有发射波长在从约400nm至约1000nm的范围内。当使用一种以上的染料时，可选择这样的染料，使它们具有实质上不同的吸收谱、发射谱或者发射半衰期。
根据一具体实施方式，微粒含有聚苯乙烯聚合物或共聚物，而且染料是疏水性染料。可能选择的溶剂，例如，从表1。
表1：用于聚苯乙烯微粒和疏水性染料组合的候选溶剂
  #1号溶剂：用于疏水性染料和聚苯乙烯微粒的良好溶剂(染料溶剂)   #2号溶剂：用于疏水性染料和聚苯乙烯微粒的弱溶剂或非溶剂(调谐溶剂)   #3号溶剂：用于疏水性染料和聚苯乙烯微粒的弱溶剂或非溶剂(共-溶剂)
  二氯甲烷氯仿四氢呋喃二氧己环环己烷苯甲苯乙酸丁酯低氯代脂肪烷烃   水   丙酮低级醇，尤其是甲醇、乙醇和异丙醇
利用极性、水溶性染料的代表体系由在三元溶剂体系中的聚(环氧乙烷)微粒组成，所述的三元体系包括作为#1号溶剂的水；作为#2号溶剂的己烷；和作为#3号溶剂的二氧六环。
从上面表中列出的溶剂和标准溶剂混溶性图表，根据本发明，可设计多个三元溶剂体系，用于组合聚苯乙烯聚合物或共聚物和疏水性染料。例如，可将疏水性染料溶质溶解于液相中，并接触固体聚合物相，所述的液相包括水(调谐溶剂，#2号溶剂)、醇(共溶剂，#3号溶剂)和二氯甲烷(染料溶剂，#1号溶剂)的均匀三元混合物，所述的固体聚合物相包括聚苯乙烯或聚苯乙烯共聚物微粒。染料分配系数K，其决定了染料在聚合物相中相对于在三元溶剂混合物中的相对丰度，K随着液相中调谐溶剂的体积分数增加而增加，相应地，随着染料溶剂或溶剂的体积分数减少而减少)。除了公开的水/醇/二氯甲烷三元体系之外，其它代表性三元体系包括，例如，水/丙酮/二氯甲烷。
为了示例的目的，已经描述了本发明，如含有每一个的#1号溶剂、#2号溶剂和#3号溶剂，它们的特征已在上面描述了。尽管如此，可能通过包括在每个类别中一种以上的溶剂来实施本发明。例如，溶剂混合物可含有单个#1型的溶剂、两个#2型的溶剂和单个#3型的溶剂。
本发明的微粒可被功能化，以包括化学的或生物的实体如，例如，核酸及其片断，包括智能配体(aptamers)、蛋白质、肽和小的有机分子。使用现有技术已知的工艺，例如，共价偶合反应，可实现这些分子的结合。参见，如G.T.Hermanson，《生物共轭技术》(Bioconjugate Techniques)(学会出版社(Academic Press)，1996年)和L.Illum，P.D.E.Jones，《在酶学中的方法》(Methods in Enzymology)112，67-84(1985年)，其全部公开的内容被引入这里作为参考。根据检验的兴趣，可选择这些实体。这些检验的实例被公开在PCT/US01/20179和美国专利号6,251,691，这里，全部地将其加入作为参考。
在图1(b)中，以图表的形式概述了本发明的一个具体实施方式的方法。首先，在任选的稳定剂存在的条件下，用含有#2号溶剂和#3号溶剂的溶剂溶液培养微粒，以形成悬浮液。该稳定剂的作用是防止微粒悬浮液的去稳定化。代表性的稳定剂包括聚合物，特别是聚合醇，如聚乙烯醇；聚合氧化物，如聚环氧乙烷；聚乙烯聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；聚合酸，如聚丙烯酸。其它代表性的稳定剂包括离子表面活性剂，如十二烷基硫酸钠和Aeroso OT；和非离子表面活性剂，如聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酸酯和聚乙二醇叔-辛烷基苯基醚。稳定剂的浓度可从大约0％至约2％的范围，以与溶剂/微粒悬浮液的重量比。
优选地，对所述的悬浮液进行缓慢地搅拌。通常在室温进行培养，只要微粒的完整性不会被不利地影响，并且溶剂的组成保持稳定，也可利用较高的温度或较低的温度。为了使任选的稳定剂吸收到微粒上，而进行培养。这种必需的预培养时间将根据溶剂和微粒的组成而改变，并可被相应地选择。
在上面首次培养步骤之后，然后将溶解在染料溶剂(#1号溶剂)中的染料加至微粒悬浮液。为了产生可检测的染料信号，应当加入足量的染料，以确保染料结合达到想要的水平。通常在室温完成培养，但是，也可使用较高或较低的温度。为了使染料溶剂(#1号溶剂)渗透至微粒，而进行第二次培养。
已经发现，将第一步的培养粒子与#2号溶剂、#3号溶剂和任选稳定剂(s)的混合物组合，然后是第二步加入溶解在#1号溶剂的染料，实质上减少了在着色步骤中对强烈机械或声波混合的需要，而这是现有技术方案必需的。在着色过程中，所述的粒子仅需要适度的搅拌以保持它们悬浮。这是一个重大的改进，原因是强烈混合需要特定的设备，并且难于规模化。
根据一个具体实施方式，将在微粒悬浮液中染料的浓度选自这样的范围，从大约1μg/g的粒子至大约100μg/g的粒子，基于该粒子悬浮液的重量。在有些应用中，根据溶剂溶液和微粒的组成，在这个范围之下或之上的浓度也是合适的。
然后，将一定量的调谐溶剂慢慢地加入以利于染料分配至微粒，同时将悬浮液慢慢地搅拌。选择调谐溶剂的体积分数，φ，以沿着在图2中的抛射线得到想要的终点组成。
应当以控制速度加入调谐溶剂，以维持在悬浮液中的相稳定性。所用的“相稳定性”是指这样的情形，其特征是存在基本均匀的溶质(染料)和液相混合物。在相稳定的条件下，染料保持溶解在溶液相中同时被结合至微粒。染料不从溶剂中沉淀出来。相稳定性进一步的特征为不存在液-液相分离。
根据现有技术的方法，必须实现染料完全吸入微粒相，以便于基于在溶剂浴中的初始染料量和微粒的体积，产生确定的微粒染料载荷。在这些方法中，必须知道准确的染料载荷水平，以确保发射的染料信号是在用于检测这种信号的仪器的动态范围内。当准备构建粒子库，以及不同粒子组将通过相同染料的不同载荷来分辩的时候，染料载荷的准确检测是非常重要的。因此，必须监测染料结合的水平直至在悬浮液连续相中染料不再明显，表示实质上所有的被导入系统的染料已经被微粒相吸收。
根据本发明，通过调节加入到微粒悬浮液的调谐溶剂的量，准确地控制染料结合到微粒的数量，这可用上面讨论地迭代方程来确定。染料载荷的预选定水平可明确地给出，即使不存在染料完全分配至微粒相的情况下。涉及溶质(例如染料)所用的“完全分配”是指这样的状态，其特征是溶质基本完全地从液相摄入微粒相，并且染料基本完全地不存在液相中。因此，监测染料从微粒悬浮液的液相迁移至微粒相的状况，以确保体系中的所有染料已经被微粒吸收，是没有必要的，原因是完全染料吸收不是控制染料载荷的关键。
应当将在染色浴中微粒的悬浮液培养一段时间，以提供染料至微粒的非常均一的分配。
为了完成这个过程，将微粒悬浮液离心分离，并任选地冲洗微粒，再悬浮于合适的缓冲液中，代表性地，含有任选的表面活性剂的水溶性缓冲液。得到的微粒含有一组包含预测定的、特定染料数量的着色粒子，使得粒子从给定的组鉴别开来。
根据一个具体实施方式，以平行的方式，可生产含有不同水平被结合染料的聚合物微粒亚群。将预算量的调谐溶剂加入至被预培养在染料溶液中的微粒悬浮液的独立等分试样中。根据本发明，通过调谐溶剂的最终体积分数和在悬浮液中初始的染料浓度，来决定染料分配至微粒的水平。这种方法被示例在图3(a)，这里各种预培养等分试样被表示为Bn。各自量的、被导入每个等分试样的调谐溶剂以Sn表示，在每批中相应得到的粒子亚群以Fn(Sn)代表。
根据本发明的另一个具体实施方式，可以连续的方式生产含有不同水平染料的聚合物微粒亚群。在连续或半连续的将调谐溶剂加入到在染料溶液中的微粒悬浮液的过程中，在不同的经历时间里，从在染料溶液中的母料微粒悬浮液，撤出等分试样。在“半连续”添加调谐溶剂的情况下，短时间内中止该过程，例如，以允许从批中取出微粒样品的操作。在连续经历时间(tFn)内收集的部分悬浮液Fn(Sn)，含有相应地不同量的溶剂Sn以及从相同的母料中生产多个亚群染色粒子。这些对应于染料结合水平的亚群将产生相应地不同的荧光强度。这个方法被示例在图3(b)，这里，[B]表示预培养母料，调谐溶剂的连续流输入其中。Fn(Sn)分别是在连续经历时间tFn内从母料收集的微粒悬浮液的部分。
作为选择地，当经过一定的时间(tF)，中止了调谐溶剂的连续添加，而且着色微粒的悬浮液被分成两个或多个等分试样，用于通过溶剂调谐来调节最终染料含量。将选定量的调谐溶剂(δSn)加入至每个等分试样，以在至少两个等分试样中产生不同水平的染料结合，每一个所述的水平是由在溶剂调谐期间加入的和加入至初始染料浓度的调谐溶剂的总量决定的。
应当认识到，加入到每个等分试样的调谐溶剂的选定量，可在一个或多个等分试样中包括零，假设将一非零量的调谐溶剂加入到至少一个等分试样。这种连续然后平行的处理方法被示例在图3(c)。
连续和平行处理的其它变化是可能的。图3(d)说明了一个组合了连续和平行处理的工艺，使用了溶剂调谐和染料浓度的直接调节。如图3(d)所示，将调谐溶剂连续流输入母料[B]。收集微粒悬浮液的小部分Fn(Sn)，其分别包括Sn量的调谐溶剂。然后将每一个小部分进行单独的标注步骤，开始，例如加入第三种染料Dn，使微粒区别于以前相同的等分试样。分别涉及染料D1，D2，…Dn的该标注步骤产生了与每个等分试样可区别的亚群Fm(Sm，Dn)。
源自每个等分试样的微粒含有一组包括预确定的、特定量的一种或多种荧光团(或发色团)，使得粒子从给定的组中鉴别出来。
通过有序的加入可区别的荧光染料溶液，本发明的方法可适于提供一个组合编码微粒库。根据任何一种可用的编码变化，包括二进制编码，将该微粒编码。优选地，用二进制编码方法对该微粒进行编码，该方法允许原位解码，例如WO 98/53093的方法，其全部公开的内容被引入这里作为参考。
本发明的实施是通过下列非限制性实施例来说明的。
准备性实施例1：非交联聚苯乙烯均聚物粒子
将装有回流冷凝器、入口-出口N2调节器和搅拌器的100ml圆底玻璃烧瓶放置在带夹套的油浴中。将在43.3ml乙醇(Aldrich，200 proof，无水，99.5％)中的0.9475g聚乙烯吡咯烷酮(Aldrich，平均分子量大约29,000)的溶液和18.95g苯乙烯加入到烧瓶。为了除去游离氧，在轻搅拌(50-70rpm)下，用N2对体系吹洗半小时。然后，将温度升至70℃，搅拌速度达到350rpm。通过加入10ml在乙醇中的2.4重量％2，2’-氮二异丁腈溶液，引发苯乙烯单体聚合。在反应17小时后，将体系降至室温。得到具有体积平均直径4.1μm的单分散聚苯乙烯。单体转化率为96.4％，并且最终胶乳的固体含量为27.9％。
准备性实施例2：非交联共聚粒子
应用如准备性实施例1的相同步骤，来制备含3％甲基丙烯酸的聚苯乙烯共聚物，用10.5g苯乙烯和甲基丙烯酸单体(3重量％甲基丙烯酸单体，基于全部的单体重量)混合物进行反应。得到单分散的粒子。最终转化率为95.7％，粒径3.2μm，胶乳含15.9％固体。该共聚物粒子具有2.45μm2/COOH基团的排列区。
准备性实施例3：交联共聚粒子
将装有回流冷凝器、入口-出口N2调节器和搅拌器的100ml圆底玻璃烧瓶放置在夹套的油浴中。将1.5g聚乙烯吡咯烷酮(如在准备性实施例1中)、0.475g的磺基琥珀酸二辛酯钠(Aldrich，98％)、53.5ml的乙醇(Aldrich，200proof，无水，99.5％)、9.405g苯乙烯和0.095g二乙烯苯(Aldrich，异构体混合物，80％纯度)加入烧瓶。用N2吹洗30分钟，除去游离氧后，将温度升至70℃。通过加入溶解在10ml乙醇中的0.095g 4，4’-偶氮双(4-氰基戊酸)(Aldrich，75％)，引发聚合。在反应27小时后，通过降至室温来停止反应。得到单分散粒子。单体转化率为93％，并且粒子体积平均直径为1.6μm。
准备性实施例4：非交联核-壳粒子
将装有机械搅拌器、入口-出口N2吹洗和冷凝器的100ml三颈圆底烧瓶放置在70℃的恒温的水浴中。将5.48g的含有12.3重量％聚苯乙烯单分散粒子(直径为3.15μm)的胶乳加入烧瓶。将溶解于43.3ml蒸馏的去离子水中的0.009g十二烷基硫酸钠和0.007g碳酸氢钠的溶液加入这种胶乳中。以100rpm速度搅拌悬浮液，并在N2吹洗下达到70℃。当反应混合物的温度稳定时，加入在0.5ml蒸馏的去离子水中的0.0068g过硫酸钾。通过用注射泵以0.01ml/分钟的速度输入0.676g的74％甲基丙烯酸甲酯、6％甲基丙烯酸羟乙酯与20％甲基丙烯酸的混合物，迅速开始反应。在完成输入(1.2小时)后，使反应继续进行，于70℃再搅拌2小时。然后，通过加入于1ml水中的0.0068g氢醌，使反应停止，并迅速冷却至室温。得到2.75重量％固体的胶乳，该胶乳具有直径为3.32μm的单分散核-壳粒子。表面羧基基团排列面积为1.522/基团。
实施例1  荧光绿非交联微粒(染料/聚合物＝0.334mg/g)的合成
在25ml三颈圆底玻璃烧瓶中，加入0.05g净化的(1ml乙醇、三轮次的离心(6500rpm，室温)和再分散)并且非交联的共聚物粒子，加入0.312ml如准备性实施例2中制备的胶乳。将1ml十二烷基硫酸钠溶液(“SDS”)(0.75重量％)、1.5ml为0.1％水溶液的聚(乙烯醇)(Aldrich，分子量85,000-146,000，水解等级87-89％)和4.75ml乙醇加入到粒子悬浮液。将含有0.0167mg荧光绿染料Bodipy FL C5 SE(4，4-二氟-5，7-二甲基-4-硼杂-3a，4a-二氮杂-s-indacene-3-戊酸琥珀酸亚胺酯，Mw＝417.22，分子探针)的0.0835ml二氯甲烷(Aldrich，99.9％)溶液加入到该混合物。最后，加入10.6ml蒸馏过的去离子水，并且再搅拌混合物2小时。然后将全部的混合物转移至50ml塑料离心管中，以4500rpm离心1分钟。除去上清液，用2ml乙醇冲洗含有染色珠的微球三次，并且最后再悬浮于2ml 0.2％的SDS溶液中。绿染料对聚合物的比率为0.334mg/g。用带有电荷偶合元件(CCD)照像机和成像获得软件的Nikon荧光显微镜，检测绿色荧光的强度和均一度。结果表示在图4，为一离散的图。每个点的纵坐标代表相关单一粒子的绿色荧光的强度；没有对数据进行背景信/噪的校正。
实施例2：绿色荧光交联微粒(染料/聚合物＝1.667mg/g)的制备
本实施例与实施例1相似，除了聚合物粒子具有交联的结构和实验的规模增加了四倍之外。通过加入1ml乙醇和在6500rpm离心2分钟，将含有0.2g交联核-壳粒子(Bangs实验室公司，3.2μm，10％固体，12.5％二乙烯苯)的2ml胶乳乳化液净化，除掉乳化剂。将这种操作重复3次。将净化的聚合物粒子转移至100ml圆底烧瓶，该烧瓶装有6ml 1.0重量％聚乙烯醇水溶液，4ml 0.75重量％SDS水溶液和19ml乙醇。将1.5ml含有0.3334mg荧光绿染料Bodipy FL C5，SE的CH2Cl2加入该混合物。之后，加入53ml蒸馏过的去离子水。然后将粒子悬浮液转移至旋转蒸发器，在真空(26.5Hg英寸)下除去溶剂，此时将温度慢慢地升至40℃，然后至56℃，最后至63℃，用于除去有机溶剂。收集浓缩地染色悬浮液，并于6500离心2分钟，弃去上清液。通过三轮的离心分离来冲洗微粒小球，并用5ml乙醇再悬浮。最后，将净化染色珠再悬浮在2ml SDS 0.2重量％中，达到大约10％固体的浓度。绿染料对聚合物的比率为1.667mg/g。用带有CCD照像机和成像获得软件的Nikon荧光显微镜，检测绿色荧光的强度和均一度。结果表示在图5，为一离散的图。每个点的纵坐标代表相关单一粒子的绿色荧光强度；没有对数据进行背景信/噪的校正。
实施例2A：荧光绿染料编码的交联微粒库(初始染料/聚合物浓度＝0.833mg/g)
遵循实施例1的方法实施，除了绿色荧光染料在CH2Cl2溶液中的量是166.67mg和水输入速度是21ml/小时之外。在加水的过程中，以30分钟时间的间隔，提取四个分开的小部分。因此，顺序运行产生5个不同染色粒子群(在开始输入水之前就收集一小部分)，提取具有独特的平均荧光强度的每一个群，该强度是在该小部分加入水的数量的函数。根据在实施例1中所述的方法，分析这些粒子。将测得的每一类型染色粒子的绿色荧光强度值列于表1a。在表1a和这里的其它地方，“a.u.”是指任意单位的意思。
表1a：在实施例2A中提取样品的绿色荧光强度值
 小部分#   加入的水/聚合物(ml/g)   粒子荧光强度(a.u.)
  1   52.5   283.4
  2   105.0   1396
  3   157.5   3623
  4   210.0   13061
  5   262.5   14658
实施例2B：用绿色和橙色荧光染料编码的双染色非交联微粒库(初始染料/聚合物浓度：绿色染料/聚合物＝橙色染料/聚合物＝0.75mg/g)
通过采用本发明的顺序溶剂调谐方法，产生了一组可辨的用绿色和橙色荧光染料编码的双染色非交联粒子，使用了下列的初始染料浓度：绿色荧光染料/聚合物＝0.75mg/g；橙色荧光染料/聚合物＝0.75mg/g。根据上面实施例2A的方法，除了两种荧光染料存在于初始的预培养悬浮液之外，收集三个分开的小部分。直至提取小部分时间所加入的水的数量和收集到不同小部分的微粒的平均强度，都表示在表1b
表1b：源自实施例2B的绿色和橙色荧光强度(输入水的速度，26.5ml/h)
  小部分#   [绿色]i/聚合物   [橙色]i/聚合物   输入的水/聚合物   绿色荧光强度(a.u.)   橙色荧光强度(a.u.)
mg/g   mmol/g×10-3 mg/g   mmol/g×10-3 ml/g
  1   0.75   1.79   0.75   1.69   265.0   1220   1388
  2   0.75   1.79   0.75   1.69   265.0   7082   7798
  3   0.75   1.79   0.75   1.69   265.0   11698   15479
实施例3-6：在制备绿色荧光交联微粒中染料分配的分析
根据在实施例2中的方案，以与实施例1的规模相比更小的规模，制备四种分开的绿色荧光着色的粒子制剂。加入水的各个量：0.833ml，1.74ml，5.31ml和10.59ml，相应的水体积分数分别为：0.398、0.463、0.623和0.738。在染料结合完成后，将染色粒子离心。保留上清液以确定，保留在溶液中绿色染料。因此，用醇稀释(24×)各个等量的四种上清液，记录荧光光谱。根据图6(a)标定曲线，用发射强度值(见表2)来计算保留在每个溶液中的绿色染料的浓度。计算绿色染料浓度结合至粒子的浓度，即在反应中绿色染料的总初始量和保留在上清液中的量之间的差额。这些数值表示在表2。
表2：染料分配明细
实施例# 染料浴水体积分数 上清液荧光强度(a.u.) 上清液染料浓度(源自标定曲线)(μg/ml) 初始染料浓度(μg/ml)   结合于粒子的染料(μg/mg)(计算值) 测定的粒子荧光强度
  3   0.39806   580.4   1.808   1.929   0.0208   135
  4   0.4629   494.15   1.539   1.72   0.0348   539
  5   0.6227   270.1   0.841   1.205   0.0997   2909
  6   0.73823   54.34   0.169   0.834   0.2639   7581
图6(b)显示了被结合染料含量的非线性变异，其作为水体积分数的函数。
计算的被结合绿色染料含量也与荧光显微仪记录的、来自染色粒子的绿色荧光强度相关。在图6(c)中的结果显示线性相关。
6(d)显示染料分配系数K对Y的绘图。该曲线显示特征的指数关系，其示例了，根据本发明通过调节溶剂组成来精细调谐染料结合。
实施例7：含有绿色荧光染料的交联粒子(染料/聚合物＝0.833mg/g)
按照实施例2的方法实施，除了加入到粒子悬浮液的在CH2Cl2中的绿色染料溶液具有0.1mg/ml的浓度，以及实验是以一半的规模、在50ml烧瓶中进行之外。因此，在染料溶液加入后，加入水的量为1.765ml。通过重复的离心和再分散，将染色粒子回收和冲洗。
实施例8-10：含有绿色荧光染料的交联粒子
按照实施例7的方法实施，产生另外三个粒子组，除了水量分别是5.3ml、10.6ml和21.2ml。
实施例11：含有橙色荧光染料的交联粒子(染料/聚合物＝0.334mg/g)
按照实施例7的方法实施，除了染料是橙色Bodipy 558/568，SE(4，4-二氟-5-(2-噻吩基)-4-硼杂-3a，4a-二氮杂-s-indacene-3-丙酸琥珀酰亚胺酯，Mw＝443.23，分子探针)之外。橙色染料在二氯甲烷溶液中的浓度为0.045mg/ml。在加入染料溶液后，加入水的量为1.765ml。橙色染料对聚合物的比率是0.833mg/g。橙色染料在二氯甲烷溶液中的浓度为0.045mg/ml。
实施例12-14：含有橙色荧光染料的交联粒子
按照实施例11的方法实施，以产生另外三个粒子组，除了各自加入水的量分别为5.3ml、10.6ml和21.2ml。
实施例15：含有绿色与橙色荧光染料1∶1摩尔比率的交联粒子(绿色染料/聚合物＝0.150mg/g；橙色染料/聚合物＝0.153mg/g)
按照实施例7的方法实施，除外的是，代替一种染料，使用实施例7-14的绿色与橙色染料的等摩尔混合物。特别是含有两种染料的二氯甲烷溶液具有绿色染料0.20mg/ml和橙色染料0.212mg/ml的浓度。
实施例16-17：含有不同量绿色和橙色荧光染料的交联粒子
按照实施例15的方法实施，以产生另外两个粒子组，除了各自加入水的量为5.3ml和21.2ml。
实施例18：含有绿色与橙色荧光染料1∶0.5摩尔比率的交联粒子(绿色染料/聚合物＝0.150mg/g；橙色染料/聚合物＝0.765mg/g)
按照实施例15的方法实施，除外的是，所用的绿色与橙色染料的摩尔比为1∶0.5。特别是，含有两种染料的二氯甲烷溶液具有绿色染料0.20mg/ml和橙色染料0.10mg/ml的浓度。
实施例19-21：含有绿色与橙色荧光染料的交联粒子
按照实施例18的方法实施，以产生另外三个粒子组，除外的是，加入水的量分别是5.3ml、10.6ml和21.2ml。
实施例22：含有荧光绿色与橙色染料0.5∶1摩尔比率的交联粒子(绿色染料/聚合物＝0.150mg/g；橙色染料/聚合物＝0.765mg/g)
按照实施例15的方法实施，除外的是，(a)所用的绿色与橙色染料的摩尔比为0.5∶1和(b)加入水的量为1.5ml。含有两种染料的二氯甲烷溶液具有绿色染料0.10mg/ml和橙色染料0.212mg/ml的浓度。
实施例23-25：含有绿色与橙色荧光染料的交联粒子
按照实施例22的方法实施，以产生另外三个粒子组，除外的是，加入水的量分别是5.3ml、10.6ml和21.2ml。
根据实施例7-25制备的着色粒子组，其荧光强度表示在表3。
表3：作为初始染料浓度和加入水量函数的绿色与橙色强度
 实施例#
染料量(mg/g聚合物) 水的体积分数   橙色强度(平均值)   绿色强度(平均值)
  7   0.833   0.2626   -   980.184
  8   0.833   0.5168   -   2638.53
  9   0.833   0.6815   -   7251.29
  10   0.833   0.8106   -   13175.8
  11   0.333   0.2626   655.519   -
  12   0.333   0.5168   1676.34   -
  13   0.333   0.6815   6518.44   -
  14   0.333   0.8106   12434.9   -
  15   0.303   0.2626   1118.73   851.539
  16   0.303   0.5168   2707.29   1989.1
  17   0.303   0.8106   7296   5575.43
  18   0.227   0.2626   196.022   326.917
  19   0.227   0.5168   537.007   740.114
  20   0.227   0.6815   1175.03   1686.59
  21   0.227   0.8106   3140.37   5008.65
  22   0.228   0.2324   261.14   176.635
  23   0.228   0.5168   1087.38   439.545
  24   0.228   0.6815   3469.4   1162.34
  25   0.228   0.8106   8659.33   2974.67
实施例26：荧光编码微粒库的构建
根据实施例7-25，构建一含有十九个荧光微粒组的库。将十九组中十组汇合，并且使用带有CCD照像机和成像获得软件的Nikon荧光显微镜，其可记录绿色与橙色荧光，来记录混合物的荧光图像。在汇合中对应于十组的十簇(clusters)显示在图7的分散图(簇图)中，在横坐标和纵坐标上分别使用了橙色和绿色强度的对数单位。在表4中，概述了这些簇的分析结果。
表4：簇平均强度和相应的变异系数变化系数
  簇#                             簇的明细
  橙色强度(mean)   CV％   绿色强度(mean)   CV％
  11   211.363   10.27   541.5   8.65
  12   584.10   6.74   1309.52   6.93
  13   1300.47   5.66   3154.83   6.49
  14   3369.32   4.75   9083.26   5.47
  15   1228.41   5.81   1515.42   6.61
  16   7699.52   4.53   9973.90   5.40
  17   2868.52   5.28   3511.96   6.0
  18   1242.01   5.95   825.846   6.93
  19   4077.29   4.60   2386.0   5.54
  20   9546.03   4.92   5627.64   5.79
实施例27：编码磁性粒子的制备
A.水溶性铁磁流体的合成
制备在1N HCl中1M FeCl3和在1N HCl中2M FeCl2的备用溶液。在100ml的玻璃瓶中，将4ml的1M FeCl3和1ml的2M FeCl2溶液合并，将400ml的去离子蒸馏水和100ml的30重量％NH4OH混合，以得到500ml约1.7M的NH3水溶液。在剧烈搅拌下，将50ml的氨水溶液慢慢地加入装有铁盐溶液的玻璃瓶。在完成这一步后，加入2ml的25重量％氢氧化四甲基铵溶液，将该溶液超声波处理大约1小时。此后，允许将该铁磁流体在磁场的作用下放置过夜。下一步，倾出上清液，并用蒸馏水冲洗沉淀。将在去离子水中的铁氧化物纳米粒子悬浮液均匀化，并允许在重力作用下放置过夜。经过放置后，将沉淀弃去，并收集黑色的上清液作为最终的铁磁流体悬浮液。
B.合成编码磁性粒子
根据这里描述的方法，制备相同染料含量和直径大约3微米的染色聚合物微粒，以包含聚苯乙烯的核和甲基丙烯酸甲酯(MMA)、甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)以及丙烯酸(MAA)壳。将粒子分散于去离子水中，以提供1ml的大约1％悬浮液。然后，将50微升铁磁流体悬浮液的等分试样加入到上述的悬浮液。用翻滚转动(end-over-end rotation)来将悬浮液混合，48小时，室温。将得到的溶液以大约200g离心分离10分钟。将棕黄色粒子小球与含有大量纳米粒子的棕红色上清液分开。弃去上清液，并将小球再悬浮于1％SDS溶液中，再一次离心分离。重复这一步两次，最终将小球再分散于含有0.5％吐温-20的PBS缓冲液中。以一标准的1.5ml标准Eppendorf管，取1ml粒子悬浮液，并将这个管装在Promega多管磁性台架上。在大约10分钟内，发生悬浮粒子(如管壁上的小球)的完全分离。
实施例28：抗生物素偶合至荧光编码的、羧基功能化微粒的表面
根据实施例1的方法将准备性实施例4制备的羧基功能化聚合物微粒赋予荧光，以提供绿色荧光微粒(染料/聚合物＝0.334mg/g)。在一个2ml的小瓶中，将含有10mg绿色荧光微粒的等分试样与1ml的10mM硼酸盐缓冲液(pH＝8.5)混合。然后，用离心分离来分离该粒子，将上清液吸走。随后，在0.1M MES缓冲液(pH＝4.5)中将分离到的小球冲洗2次，最后再悬浮在600μl同样的溶液中。在一个单独小瓶中，将3mg Neutravidin(一种生物素结合的蛋白，Pierce Chemicals，Rockford，IL)溶解于300μl的该MES缓冲液中，并且将该溶液缓慢地加入到聚合物微粒的悬浮液。用探针超声波仪将该悬浮液进行简单地超声波处理。然后，将150μl的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(Aldrich-Sigma，Milwaukee，WI)(EDAC)溶液(200mg/ml)加入该粒子溶液。使该混合物在室温反应2小时，此后，分离NeutrAvidin-功能化的聚合物微粒，在偶合缓冲液中冲洗一次、在硼酸盐缓冲液中冲洗两次，并且最终于2-8℃下再悬浮和储存于贮藏缓冲液(PBS pH＝7.4，0.1％(w/v)BSA，0.5％(w/v)吐温20，10mM乙二胺四乙酸(EDTA)以及0.02％(w/v)NaN3)中。
实施例29：抗生物素偶合至荧光编码的、甲苯磺酰基功能化微粒的表面
在本实施例中，使用商业上可获得的交联的、甲苯磺酰基功能化的荧光核-壳微粒(Bangs实验室公司，3.2μm，10％固体，12.5％二乙烯基苯)。该微粒包括载有大约0.3mg染料/g微粒的绿色荧光染料。用500μl 100mM磷酸盐缓冲液(pH7.4)将200μl含1％微粒的悬浮液冲洗3次，并再悬浮于500μl该缓冲液。随后，加入20μl 5mg/ml NeutrAvidin并于37℃使反应进行，过夜。在完成培养后，用含有10mg/ml BSA的500μl PBS(pH7.4)冲洗该功能化粒子一次，再悬浮于500μl的该缓冲液中，并于37℃反应1小时，以阻滞微粒表面未反应的位点。在阻滞步骤之后，用含有10mg/mlBSA的500μl PBS(pH7.4)冲洗该微粒三次，并储存于含有10mg/ml BSA的200μl PBS(pH7.4)中。
实施例30：用荧光微粒进行NeutrAvidin-生物素结合的检验
将100微升含有1％实施例28固体的NeutrAvidin-功能化荧光微粒放置于1.5ml小瓶中，并用900μl含有0.01％(w/v)吐温-20(PBST)的PBS稀释该悬浮液。用涡流来混合该微粒，然后离心分离。吸去上清液，将小球再悬浮于980μl的PBS中。加入20μl一定浓度(26.7ng/ml)的生物素-Oligo(dT)5-CY5.5(用荧光染料Cy5.5标记oligo)(IDT，Coralville，IA)，而且将该混合物室温培养30分钟。在这之后，分离该微粒和在PBST中冲洗两次，并再悬浮于1ml的PBST中。然后，将该微粒装配在芯片上，通过直接测定生物素-Oligo(dT)5-CY5.5结合至NeutrAvidin-功能化粒子的量，来检测它们表面的荧光。显示在图8中的结果表明了，使用本发明方法着色的两种不同粒子(标记为样品)的生物素化(biotinylated)探针捕获效率，以及用作正调节的非着色微粒的捕获效率。
实施例31：使用荧光微粒进行杂化分析
将生物素化并具有已知碱基序列的寡核苷酸附着到，用NeutrAvidin(如在实施例30中制备的)功能化的荧光编码微粒，如下。将50微升含1％NeutrAvidin功能化微粒的溶液，置于0.1ml含有0.4μM生物素化寡核苷酸和约7×105微粒的反应缓冲液(150mM NaCl，0.05M EDTA，0.5％牛血清清蛋白，0.5mM Tris-HCl，和100mM磷酸钠，pH7.2)中。在涡流的条件下，将该反应混合物室温培养30分钟。在完成反应后，通过离心分离来收集粒子，用PBST(150mM NaCl，100mM磷酸钠，pH7.2和0.05％Tween 20)冲洗三次，并再悬浮于0.2ml PBS(150mM NaCl，100mM磷酸钠，pH7.2)中。可利用上述方法，将任何感兴趣的生物素化寡核苷酸偶合到NeutrAvidin功能化微粒。
用19μl的1×TMAC(4.5M氯化四甲基铵，75mM Tris pH8.0，3mMEDTA，0.15％SDS)将1微升在去离子水中的10μM合成靶(5′-/CY5.5/SEQID NO：1/-3′)溶液稀释至20μl的最终体积。将两种类型的寡核苷酸-功能化荧光微粒装配至在硅基片上的平面阵列。用匹配的探针序列5′-生物素/(TEG间隔)/SEQ ID NO：2/-3′，将第一种类型的微粒功能化。用错配的探针序列生物素/(TEG间隔)/SEQ ID NO：3/-3′)，将第二种类型的微粒功能化。将20微升的合成靶加入到基片的表面，并且将该基片置于53℃的加热器中15分钟、以30rpm摇动。然后，从加热器中除去载片(slide)，吸取靶溶液。用1×TMAC在室温冲洗基片一次。随后，将10μl的1×TMAC放置在基片表面上，用玻璃盖片覆盖，并且使用上述的仪器记录阵列的荧光强度。图9中的结果表明杂化是特异性的。
实施例32：用荧光微粒进行免疫测定
在本实施例中，使用商业上可获得的交联的、甲苯磺酰基功能化的荧光核-壳微粒(Bangs实验室公司，3.2μm，10％固体，12.5％二乙烯基苯)。该微粒包括载有大约0.3mg染料/g微粒的绿色荧光染料。将1毫升PBST(pH7.4，含有0.1％吐温-20的PBS)和50μL的1％着色的甲苯磺酰基功能化微粒(0.5mg)的悬浮液合并至eppendorf管中，并通过涡旋混匀。随后，将该悬浮液以7500rpm离心分离2分钟，并倾出上清液。用1mL的PBST重复该操作一次，以及用1mL的PBS重复一次。微粒最终被悬浮在1mL的PBS中。加入预算量的抗-TNF-α抗体(R&D Systems)，以50μg蛋白质/mg微粒的浓度，并且用翻滚转动来将悬浮液混合，室温，过夜。然后，冲洗微粒，并再悬浮于1ml阻滞/贮藏缓冲液(含有0.1％BSA，0.1％吐温20以及0.1％NaN3的0.1M PBS pH7.4)中。将10微升抗体-功能化微粒悬浮液置于1.5mL Eppendorf管中。用1mL的PBST冲洗该粒子两次，以及用1mL的PBS(pH7.2)一次。通过加入1470μl的PBS(1∶50)，将30微升的Cy5.5标记山羊抗小鼠IgG贮备溶液稀释。将500微升的该溶液转移至微粒悬浮液，并且通过翻转混合来培养抗体-结合反应，室温，60分钟。经过培养之后，用1mL的PBST冲洗粒子两次，然后再悬浮于10μl的PBS中。然后，将微粒的平面阵列装配在硅基片上，用于如在实施例31中的分析。应用如上所述的条件和仪器，记录6,500的平均Cy5.5强度。
这里讨论的所有文献都引入作参考。本领域的技术人员会很容易地认识到，本发明适于很好地实现目标和获得上述的结果与优点，以及其中固有的那些。本发明也可以在没有背离其精神或实质特征的情况下，以其它特定的形式具体实施，因此，应当参照附后的权利要求书，而不是上面的说明书，来表示本发明的范围。
                            序列表
                               42970-2 PC
                            SEQUENCE LISTING
<110>BioArray Solutions，Ltd.
     Banerjee，Sukanta
     Georgescu，Cecilia
     Seul，Michael
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POLYMER MICROPARTICLES
<130>42970-2 PC
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Claims (39)

1、一种用于调节聚合物微粒的溶质载荷的方法，其包括：
(a)提供
(i)至少一种第一溶剂，溶质和微粒聚合物可溶解其中；
(ii)至少一种第二溶剂，溶质和微粒聚合物不能或者仅较差地溶解其中，所述的第一和第二溶剂不混溶的或者至多部分混溶；
(iii)至少一种第三溶剂，溶质和微粒聚合物不能或者仅较差地溶解其中，所述的第三溶剂与第一和第二溶剂可混溶；
(b)在指定体积的、含有至少一种所述第二溶剂和至少一种所述第三溶剂的混合物中，形成所述聚合物微粒的悬浮液；
(c)将含有溶于所述第一溶剂溶质的溶液，，加入所述的聚合物微粒悬浮液，由此，所述溶质被所述的微粒吸收；
(d)通过在所述微粒悬浮液或者其小部分中控制所述溶质和所述第二溶剂的相对浓度，来控制在所述聚合物微粒中溶质的浓度，以使很少发生所述溶质从悬浮液液相完全分配至微粒。
2、根据权利要求1所述的方法，其中所述的溶质是一种染料。
3、根据权利要求1所述的方法，其中通过将微粒悬浮液分成小部分，并将选定量的所述第二溶剂加入所述的小部分，来提供多种选定溶质浓度的微粒小部分。
4、一种用于调节聚合物微粒的溶质载荷的方法，其包括：
(a)提供
(i)至少一种第一溶剂，溶质和微粒聚合物可溶解其中；
(ii)至少一种第二溶剂，溶质和微粒聚合物不能或者仅较差地溶解其中，所述的第一和第二溶剂不混溶的或者至多部分混溶；
(iii)至少一种第三溶剂，溶质和微粒聚合物不能或者是仅较差地溶解其中，所述的第三溶剂与第一和第二溶剂可混溶；
(b)在指定体积的、含有至少一种所述第二溶剂和至少一种所述第三溶剂的混合物中，形成所述聚合物微粒的悬浮液；
(c)将溶于所述第一溶剂中的溶质溶液加入所述的聚合物微粒悬浮液，由此，所述溶质被所述的微粒吸收；和
(d)将所述第二溶剂连续或半连续地加入所述的微粒悬浮液，以连续或半连续地调节所述的微粒溶质浓度，并据此控制溶质在所述微粒中的吸入和最终浓度。
5、根据权利要求4所述的方法，其进一步包括在加入第二溶剂的过程中、以一定时间间隔从所述的悬浮液中除去至少一部分所述微粒的步骤，以提供溶质浓度不同的至少两个微粒组。
6、根据权利要求3所述的方法，其中所述的溶质是一种染料。
7、根据权利要求4所述的方法，其中所述的溶质是一种染料。
8、一种用于调节聚合物微粒的染料负荷的方法，其包括：
(a)提供微粒，其特征为包含在所述微粒中至少一种染料的第一浓度，所述微粒悬浮于含有至少一种染料和一种溶剂体系的染料溶液中，该溶剂体系包括：
(i)至少一种第一溶剂，染料和微粒聚合物可溶解其中；
(ii)至少一种第二溶剂，染料和所述聚合物不能或者仅较差地溶解其中，所述的第一和第二溶剂不混溶的或者至多部分混溶；
(iii)至少一种第三溶剂，染料和所述聚合物不能或者是仅较差地溶解其中，所述的第三溶剂与所述第一和第二溶剂可混溶；
(b)将一选择量的所述第二溶剂加入所述的微粒悬浮液，以改变所述染料分配至聚合物微粒的量和在所述微粒中染料的浓度；和
(c)培养微粒悬浮液一段时间，使得染料分配至微粒的数量，对于在染料溶液给定初始染料浓度情况，通过被加至微粒悬浮液的第二溶剂数量来控制。
9、一种生产染色聚合物微粒的方法，包括：
(a)提供
(i)至少一种第一溶剂，染料和微粒聚合物是可溶解其中的；
(ii)至少一种第二溶剂，染料和微粒聚合物不能或者是仅较差地溶解其中，所述的第一和第二溶剂不混溶或者至多部分混溶；
(iii)至少一种第三溶剂，染料和微粒聚合物不能或者是仅较差地溶解其中，所述的第三溶剂与所述第一和第二溶剂可混溶；
(b)在指定体积的、含有至少一种第二溶剂和至少一种第三溶剂的混合物中，形成所述聚合物微粒的悬浮液；
(c)将含有溶于所述第一溶剂中染料的溶液加入所述的聚合物微粒悬浮液，由此，所述染料被所述的微粒吸收，以提供微粒的母料悬浮液，所述微粒特征为微粒中所述染料的第一浓度；
(d)从含有选定加入量的第二溶剂的所述微粒母料悬浮液中，制备两个或多个等分试样，以改变染料在所述的等分试样里分配至聚合物微粒的量；和
(e)培养微粒悬浮液等分试样一段时间，使得染料分配至微粒的量，对于在染料溶液给定初始染料浓度情况下，通过被加至微粒悬浮液等分试样的第二溶剂量来控制。
10、根据权利要求9所述的方法，其中制备所述两个或多个含有选定加入量第二溶剂的微粒悬浮液等分试样的步骤，包括将微粒悬浮液母料分成两个或多个等分试样，并将选定量的第二溶剂加入所述的等分试样。
11、根据权利要求9所述的方法，其中制备所述两个或多个含有选定加入量第二溶剂的微粒悬浮液等分试样的步骤，包括连续地或半连续地将第二溶剂加入微粒悬浮液母料，并在所述第二溶剂加入的过程中、以一定的时间间隔除去至少一部分所述的母料，以形成两个或多个含有选定加入量第二溶剂的微粒悬浮液等分试样。
12、根据权利要求9所述的方法，其中所述的染料是一种荧光染料。
13、根据权利要求12所述的方法，其中所述的染料是一种疏水性染料。
14、根据权利要求12所述的方法，其中所述的染料选自苯乙烯基染料、pyrromethane染料、香豆素染料，以及它们的组合。
15、根据权利要求13所述的方法，其中所述的微粒包括一种疏水性聚合物。
16、根据权利要求15所述的方法，其中所述的聚合物是一种含有具有乙烯基单体的均聚物和共聚物。
17、根据权利要求15所述的方法，选自聚苯乙烯、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚丙烯酰胺、聚(乙二醇)、聚(甲基丙烯酸羟乙酯)、聚(乙烯基甲苯)、聚(二乙烯基苯)的均聚物或者共聚物及其组合。
18、根据权利要求17所述的方法，其中所述的聚合物是聚苯乙烯或者其含有至少50％重量苯乙烯单体单元的共聚物。
19、根据权利要求18所述的方法，其中所述的聚合物是一种苯乙烯/甲基丙烯酸共聚物。
20、根据权利要求16所述的方法，其中所述的聚合物是交联的。
21、根据权利要求15所述的方法，其中所述的微粒具有直径约0.1至约100微米。
22、根据权利要求21所述的方法，其中所述的粒子是单分散的。
23、根据权利要求15所述的方法，其中存在于微粒悬浮液中的所述染料浓度为从约10μg/g至约100μg/g，基于所述微粒悬浮液的重量，所述微粒悬浮液是通过将所述的染料溶液接触微粒形成的。
24、根据权利要求15所述的含有一种溶剂的方法，其中所述第一溶剂选自二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、二氧己环、环己烷、苯、甲苯、乙酸丁酯、低氯代脂肪烷烃以及它们的组合；所述的第二溶剂是水，和所述的第三溶剂选自丙酮、低级醇及其它们的组合。
25、根据权利要求24所述的方法，其中所述的第一溶剂是二氯甲烷，和所述第二溶剂是醇。
26、根据权利要求25所述的方法，其中所述的第三溶剂是醇。
27、根据权利要求9所述的方法，其中所述的微粒是一种含有一个中心核的核-壳微粒，所述中心核含有一个或多个被含有一种或多种壳聚合物的壳包围的核聚合物。
28、根据权利要求27所述的方法，其中所述的核聚合物包含苯乙烯和比苯乙烯更亲水的单体的共聚物。
29、根据权利要求27所述的方法，其中所述的核聚合物包含甲基丙烯酸。
30、根据权利要求9所述的方法，其中至少一部分的所述微粒是磁响应性的。
31、一种用于生产染色聚合物微粒的自动化方法，其包括：
(a)提供一种含有微粒的微粒母料悬浮液，其特征为微粒中第一染料浓度，所述微粒悬浮于含有至少一种染料和一种溶剂体系的染料溶液中，所述溶剂体系包括：
(i)至少一种第一溶剂，所述染料和微粒聚合物可溶解其中；
(ii)至少一种第二溶剂，所述染料和聚合物不能或者是仅较差地溶解其中，所述的第一和第二溶剂不混溶的或者至多部分混溶的；
(iii)至少一种第三溶剂，所述染料和聚合物不能或者是仅较差地溶解其中，所述的第三溶剂与所述第一和第二溶剂可混溶；
(b)从所述母料悬浮液，制备两个或多个微粒悬浮液等分试样，每个这种悬浮液等分试样，其特征为所述第一染料浓度的微粒被悬浮于所述的染料溶液中；
(c)每个制备的等分试样至少一次，执行下列顺序的步骤，以转换在每个等分试样中的微粒染料状态，在该微粒中从所述的第一染料浓度到选定的第二染料浓度：
(i)计算，用于选定的第二染料浓度：
(1)染料溶解在所述第一溶剂的量，和
(2)第二溶剂的量，其为加入至所述等分试样以获得所述选定第二微粒染料浓度所需要的量；和
(ii)将溶于所述第一溶剂的染料量和所需要的第二溶剂量分散至所述等分试样，以获得所述选定第二微粒染料浓度。
32、根据权利要求31所述的方法，其中制备所述两个或多个含有选定加入量第二溶剂的微粒悬浮液等分试样的步骤，包括将微粒悬浮液母料分成两个或多个等分试样，并将选定量的第二溶剂加入所述的等分试样。
33、根据权利要求31所述的方法，其中制备所述两个或多个含有选定加入量第二溶剂的微粒悬浮液等分试样的步骤，包括连续地或半连续地将第二溶剂加入微粒悬浮液母料，并在所述第二溶剂加入的过程中、以一定的时间间隔除去至少一小部分所述的母料，以形成两个或多个含有选定加入量第二溶剂的微粒悬浮液等分试样。
34、根据权利要求31所述的方法，其中所述的染料是一种荧光染料。
35、根据权利要求34所述的方法，其中所述的染料是一种疏水性染料。
36、根据权利要求34所述的方法，其中所述的染料选自苯乙烯染料、pyrromethane染料、香豆素染料，以及它们的组合。
37、根据权利要求35所述的方法，其中所述的微粒包括一种疏水性聚合物。
38、根据权利要求31所述的方法，其中至少一部分的所述微粒是磁响应性的。
39、一种用于生产染色聚合物微粒的仪器，其包括运行地连接至移液自动仪的计算机，所述的计算机被编程以完成权利要求31的方法。
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