CN1816359A - 可注射的交联聚合制剂及其应用 - Google Patents

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Abstract

一种用于促进受损组织修复的组合物，是交联的藻酸盐溶液，其能长期保持液体形式(在稳定条件下)且仅在体内为凝胶。该交联的藻酸盐溶液是一种用于组织修复的理想材料。在心肌梗塞后将所述材料注射入心脏组织诱导了组织再生。本发明提供了这种可注射的溶液、组合物及其制备方法。本发明也提供了交联的藻酸盐溶液的各种方法和应用，尤其是用于心脏组织再生、诱导新血管形成、增强SDF－1表达和指导干细胞趋化性。也提供了一种用于组织修复的试剂盒。

Description

可注射的交联聚合制剂及其应用
发明领域
本发明涉及可注射的药物制剂，包含作为活性成分的交联的聚合物，特别是藻酸盐，该聚合物在体内形成水凝胶。本发明也涉及可注射的交联的藻酸盐制剂的各种应用和使用上述制剂进行治疗的方法，特别是修复心脏组织损伤和消除心律失常。
发明背景
本申请全文中提及的所有出版物在此都并入作为参考，包括其中所引证的所有参考文献。
心肌梗塞(MI)引起心肌急性损失并在诱发左心室(LV)重塑的负荷条件下突然增加[Sutton，M.G.和Sharpe，N.(2000)Circulation 101：2981-2988；Mann，D.L.(1999)Circulation 100：999-1008；Jugdutt，B.I.(2003)Circulation 108：1395-1403]。LV重塑早期涉及梗死区伸展，可导致早期心室破裂或动脉瘤形成。晚期重塑涉及整个LV并与时间依赖性伸展、心肌层缘带恢复成瘢痕、心室形状畸变及腔壁肥大相关。导致收缩功能的进行性劣化、心力衰竭和死亡[Sutton，M.G.和Sharpe，N.(2000)同前.；Mann，D.L.(1999)同前.；Jugdutt，B.I.(2003)同前]。心力衰竭疗法的重要目的在于停止或逆转进行性心室重塑。然而，当前临床干预只能使心脏病发作的破坏性后果尽量最小，通常无法足以阻止不可逆损伤、LV重塑及随后发生的心力衰竭和死亡[Khand，A.U.等.(2001)Eur.Heart J.22：153-164；Jessup，M.和Brozena，S.(2003)N.Engl.J.Med.348：2007-2018；Redfield，M.M.(2002)N.Engl.J.Med.347：1442-1444]。然而，在过去十年中，一些科研小组包括本发明人已显示将胎儿或新生心肌细胞的细胞悬液直接注射入试验性心肌梗塞中改善了心脏的重塑与功能[Etzion S.等(2001)J Mol CellCardiol；33 1321-1330；Leor J.等(2003)Expert 0pin.Biol.Ther.3：1023-39]。其他小组通过使用骨骼成肌细胞、骨髓衍生的细胞或胚胎干细胞重复着那些令人鼓舞的发现。近来有报告认为内源性心脏干细胞在某种情况下也许能在心肌中增殖，并且可能从骨髓迁移到心脏以及也许能有助于心脏病后的修复作用[Beltrami，A.P.等(2003)Cell；114：763776]。
在动物模型中心脏细胞移植的有希望结果业已部分归因于细胞外基质(ECM)再建之故，其维持了LV壁的结构、厚度以及弹性[Etzion，S.等(2001)J Mol Cell Cardiol；33：1321-1330]。然而，当这种局部心脏结构不存在或严重受损无法由局部心脏结构支持细胞接种时，细胞移植方法可能在临床上没有多少用处。组织工程学概念可通过使用置换丢失或受损的基础结构(ECM)的3-D生物材料支架并提供用于自身或植入细胞的临时支架解决该问题[Leor J.等Circulation(2000)；102：11156-61]。
之前，本发明人介绍了怎样将心肌细胞-接种的藻酸盐支架植入梗塞的心肌上，可预防LV重塑和功能异常[Leor，J.等(2000)同前]。然而，该方法可能受限于缺乏适当的细胞，外科手术过程的风险、全身麻醉以及LV隔和下壁受限的入口。本研究当提供了用于愈合和自修复的生物支架时，目的是研究注射一种新的基于藻酸盐的生物材料是否能在急性MI之后有效地保持LV的结构和功能。在此，本发明人给出了使用该方法的证据并认为该方法优于常用方法。
迄今为止，生物聚合物注射已用于支持共移植细胞并加速其移入。
之前，可注射的藻酸盐制剂是基于缓慢聚合的藻酸钙凝胶制剂的[WO 94/25080]。为产生新的软骨，该制剂借助于注射被用于递送大量软骨细胞。注射藻酸盐-软骨细胞是进行膀胱输尿管逆流内窥镜疗法的尝试。然而，系统性能还是无法令人满意。
通过将合适的细胞悬于My99培养基中，将细胞悬液与等量的2％藻酸钠溶液混合，然后添加固体硫酸钙粉末启动藻酸盐的交联以形成凝胶，从而制备得到包含细胞的可注射的组合物。在相当于200mg/ml的水凝胶和不溶性硫酸钙混悬液中，上述组合物一般包含1％藻酸钠。少量氯化钙可从细胞悬液中带入到该组合物中。经验表明上述混悬液具有约为1小时的潜伏期，随后粘性快速增加，在粘性增加的半小时内产生了相对坚硬、甚至易碎的凝胶[WO 94/25080]。
然而，在需要的患者中上述类型的水凝胶-细胞悬液的稠度不完全适合注射应用。有时，水凝胶-细胞悬液在其注射给患者之前就变硬了。特别是，致使这些可注射的细胞-藻酸盐剂型不能在临床试验中使用的缺点是在各批产品之间所存在的不一致特性，其归因于配制期间组分的不良分布。
US 6,134,334描述了不可注射的、含有凝胶物质的水性药物载体，其可用作为药物递送系统，或特别地用作为角膜保护组合物或烧蚀的角膜保护组合物。
WO 99/15211描述了一种可注射的组合物，在注射时具有类似于POLYTEFTMTeflon糊剂的稠度。
US 5,709,854描述了细胞和聚合物的可注射溶液，在体内该胶凝用于促进组织形成。具体地说，该可注射的藻酸盐溶液是利用硫酸钙进行聚合的。该藻酸盐溶液仅在一段有限的时间内是液体(在4℃下，在30-45分钟之间)，其包含软骨细胞，并被用于软骨再生。
业已描述了其他可注射的聚合的药物组合物，例如US 6,129,761描述了用于通过注射递送细胞的缓慢聚合的水凝胶。具体地说，该出版物描述了细胞-聚合物混悬液，其中聚合物尤其可能是一种藻酸盐并且旨在改善细胞植入。
US 6,171,610描述了使用包含水凝胶和组织前体细胞的液体水凝胶组合物产生新组织。
描述于这些参考文献中的技术必需要使用细胞。这是所要考虑的不利之处。而且，上述制备可注射聚合物的方法，例如描述于WO94/25080的方法，与本发明所提供的方法不同。
一种预防阴性LV重塑并保护心肌梗塞后心脏功能的可注射的生物高聚物描述于Karen L.Christman[International.Conference onEngineering Tissue Growth，Pittsburg，Pennsylvania USA，2003年3月17-20日]中。作者宣称可注射的纤维蛋白胶原可充当一种内壁支持物和/或组织工程支架以预防有害的心室重塑和心脏功能衰退。虽然该出版物建议使用无细胞组合物，但是应当注意在体内纤维蛋白胶原照此仅可保持约7天，而且其具有免疫原性并能形成血栓。这在相当长的组织再生过程中显然是不利的。
WO 97/44070(本发明人的)描述了可植入的多糖类，例如藻酸盐、作为基质的海绵、用于置换或修复业已清除或受损组织的底物或支架。描述于该出版物中的这些海绵是不可注射的，并需要且外科手术介入。避免进行外科手术应当是主要考虑的。
US 5,776,445描述了一种包含具有特定比例古洛糖醛酸的藻酸盐的眼递药系统，在与泪液接触下其经历了从溶解相到胶体相的变化。
在寻找用于促进受损组织修复的组合物过程中，发明人发现可注射的聚合物溶液可能是有用的。更具体地说，本发明人开发了一种新型水凝胶，一种交联的藻酸盐，其能在长时间内保持液态形式(在稳定条件下)并且在体内仅为凝胶。因此，其能充当一种用于组织修复的最佳材料。
所以，本发明的一个目的是提供上述可注射的溶液，其包含非免疫原性的、酶不可降解的、可生物蚀解的聚合物，以及制备其的方法。所述聚合物能通过共价键、离子键或氢键交联，从而形成捕捉水分子的结构网络。
本发明另一目的是提供包含上述可注射的溶液的组合物，其中所述聚合物是藻酸盐，尤其是交联的藻酸盐。
此外，本发明的另一目的是所述交联的藻酸盐在制备用于促进组织修复和再生，尤其是用于修复受损的心脏组织的可注射的溶液中的应用。
如以下说明书所述，本发明的这些及其他目的应该是显而易见的。
发明概述
于此所述，本发明人开发了一种交联的藻酸盐生物材料，其像液体一样流动但仍保持足够的稠度直至注射入体内预期位置，在此其形成固体凝胶。最令人惊奇的是，注射交联的藻酸盐生物材料促进了受损心肌再生及其功能增强，无需共移植细胞。因此，在心肌梗塞(MI)和慢性心力衰竭(CHF)治疗中，对于以胚细胞移植为基础的治疗来说，通过利用这些可注射的聚合物溶液治疗心脏梗塞可能是一种有效的替代手段。
因此，在第一方面，本发明涉及一种交联聚合物溶液，当对其施加小形变振荡频率时，其弹性响应等于或大于其粘性响应，并显示了以幂律关系存在的剪力减小行为。优选用于本发明的聚合物是水凝胶型聚合物，例如多糖。更优选地，所述多糖是藻酸盐。
在一个实施方案中，当该混合物被均质化以获得均一交联的藻酸盐生物材料时，藻酸盐溶液与二价或多价阳离子(钙离子或其他离子)交联的。于此定义的典型的交联溶液包含0.1-4％(w/v)的藻酸盐。而且是贮藏稳定的，即保持了溶液形式并具有长期可注射性。通常，在室温或低于室温下，至少24小时、7天、乃至长达1年的一段时期内，交联的藻酸盐溶液是稳定的。
在另一方面，本发明提供了一种制备交联的藻酸盐溶液的方法，当对所述藻酸盐溶液施加小形变振荡频率时溶液的弹性响应等于或大于其粘性响应，并显示了以幂律关系存在的剪力减小行为，其中所述方法包括步骤：(a)溶解藻酸钠于水或其他合适的含水缓冲液中；(b)用合适的交联剂交联步骤(a)中所获得的藻酸盐溶液，其是通过添加所述试剂的水溶液同时剧烈搅拌直至获得均一的交联的藻酸盐溶液。
因此，在本发明制备交联藻酸盐溶液方法的一个特定实施方案中，所述交联剂是钙离子，优选为2％(w/v)葡萄糖酸钙溶液所提供的钙离子。
因此，本发明也提供了一种根据于此所述方法制备的交联的藻酸盐溶液。本发明交联的藻酸盐溶液可用于促进受损心脏组织修复和再生。
在另一方面，本发明提供了一种包含作为活性剂的本发明定义的交联的聚合物溶液的组合物。可用于交联的聚合物溶液(包含于组合物中的活性剂)的聚合物的例子是水凝胶型聚合物，例如多糖。优选地，所述聚合物是藻酸盐。
根据本发明方法制备的可注射制剂特别适用于心肌梗塞后受损心脏组织的治疗，和/或慢性心脏病的治疗。尤其是，根据本发明方法制备的可注射制剂在心肌事件后预计将增厚左心室壁。
在本发明组合物的一个实施方案中，所述损伤选自：心肌梗塞、局部缺血性、中毒性、炎症性或机械性心肌损伤。
在另一个实施方案中，本发明组合物用于预防和/或治疗由心肌损伤、重塑和功能异常引起的疾病，其中所述疾病选自：左心室重塑、梗塞区伸展、心力衰竭和局部缺血性二尖瓣回流。或者，本发明组合物可用于治疗局灶性(focal)或折返性心律失常，以及用于治疗血管发生。
本发明组合物也用于指导干细胞趋化性并归巢至受损心肌。
在另一个实施方案中，本发明组合物还任选地含有附加治疗剂，其中所述附加治疗剂选自：抗生素、生长因子、抗炎症药物、激素、抗细胞凋亡药、生长和干细胞刺激因子。
还在本发明组合物的另一个实施方案中，所述组合物还含有细胞，优选成肌细胞、心肌细胞、成纤维细胞、内皮细胞、祖细胞、干细胞或其他可促进心脏血管发生和再生的合适的细胞。
仍在另一方面，本发明提供了本发明交联的聚合物溶液在制备用于促进受损组织修复和再生的药物组合物中的应用。优选地，所述交联的聚合物是藻酸盐，以及所述组织是心脏组织，更优选地是左心室壁。所述损伤来源可不同，例如心肌梗塞、局部缺血性、中毒性、炎症性或机械性心肌损伤。
因此，还在另一方面，本发明提供了一种治疗受损组织的方法，包括对需要的患者施用本发明定义的交联聚合物溶液。优选地，所述聚合物是交联藻酸盐。
在一个实施方案中，所述要被治疗的组织是心脏组织，优选为左心室壁。本发明交联的藻酸盐溶液或组合物应施用于受损的心肌，用于消除致心律失常性底物。
在另一方面，本发明也提供了一种增强SDF-1表达的方法，包括对需要的患者施用交联的藻酸盐溶液或本发明定义的组合物。
在另一方面，本发明提供了一种指导干细胞趋化性或归巢至受损心脏的方法，包括对需要的患者施用藻酸盐溶液交联的藻酸盐溶液或本发明定义的组合物。
仍在另一方面，本发明提供了一种诱导新血管形成的方法，包括对需要的患者施用交联的藻酸盐溶液或本发明定义的组合物。
还在另一方面，本发明提供了一种诱导治疗性血管发生的方法，包括对需要的患者施用交联的藻酸盐溶液或本发明定义的组合物。
此外，本发明提供了一种预防疾病的方法，所述疾病选自：左心室重塑、梗塞区伸展、心力衰竭和局部缺血性二尖瓣回流，包括对需要的患者施用交联的藻酸盐溶液或本发明定义的组合物。
还在另一方面，本发明提供了一种治疗局灶性或折返性心律失常的新的和可选择的方法，包括对需要的患者的消融部位施用交联的藻酸盐溶液或本发明定义的组合物。
同样地，在本发明的最后一方面，提供了一种改善心脏收缩性的方法，包括对需要的患者施用交联的藻酸盐溶液或本发明定义的组合物。
本发明的另一方面是一种诱导心脏细胞增殖的方法，包括在体内或体外将所述细胞与交联的藻酸盐溶液或本发明的组合物接触。
最后，本发明提供了一种用于修复受损组织的试剂盒，包含：(a)本发明定义的交联聚合物溶液或其组合物；(b)用于将(a)的聚合物溶液施用于需要的患者心脏部位的装置；(c)指导如何使用所述聚合物溶液的手册。
在本发明提供的试剂盒的一个实施方案中，所述聚合物优选是交联的藻酸盐。
在本发明提供的试剂盒的另一个实施方案中，所述用于施用交联的聚合物的装置可以是任何一种带有18-27G注射针的注射器，任何合适的经皮心脏递药系统，其包括带有导线的心脏递药装置，包括机电定位或MRI引导的导管，以及任何一种被设计经由左心室腔、动脉或静脉冠循环系统以接近心肌的经皮的心脏装置。
附图简述
图1A-B：添加钙离子对稳定1％(w/v)LF 5/60藻酸盐水溶液剪切粘度的影响(LF 5/60粘度＝40cP)。
图1A：0.3％(w/v)钙离子。
图1B：0.4％(w/v)钙离子。
缩写：visc.，粘度；S.R.，剪切速率。
图2：添加钙离子对稳定1％(w/v)LVG藻酸盐水溶液剪切粘度的影响(LVG粘度＝127cP)。
缩写：visc.，粘度；S.R.，剪切速率。
图3A-C：1％(w/v)LF 5/60藻酸盐溶液的力学谱及钙离子对交联的影响。
图.3A：无钙离子。
图.3B：0.3％(w/v)钙离子。
图.3C：0.4％(w/v)钙离子。
缩写：Freq.，频率
图4A-B：1％(w/v)LVG藻酸盐溶液的力学谱及钙离子对交联的影响。
图.4A：无钙离子。
图.4B：0.3％(w/v)钙离子。
缩写：Freq.，频率
图5A-H：通过超声波心动描记术评估LV重塑。
图.5A：LV舒张期内径M-型(藻酸盐)。
图.5B：LV舒张期内径M-型(对照)。
图.5C：LV收缩期内径(藻酸盐)。
图.5D：LV收缩期内径(对照)。
图.5E：LV舒张期面积(藻酸盐)。
图.5F：LV舒张期面积(对照)。
图.5G：LV收缩期面积(藻酸盐)。
图.5H：LV收缩期面积(对照)。
缩写：B.，基线；2mo.，2个月
图6A-F：通过2-D超声波心动描记术评估LV重塑。
图.6A：AW2-D(藻酸盐)。
图.6B：AW2-D(对照)。
图.6C：LV舒张期内径2-D(藻酸盐)。
图.6D：LV舒张期内径2-D(对照)。
图.6E：LV收缩期内径2-D(藻酸盐)。
图.6F：LV收缩期内径2-D(对照)。
缩写：B.，基线；2mo.，2个月
图7A-D：通过超声波心动描记术评估LV功能
图.7A：LV缩短分数(藻酸盐)。
图.7B：LV缩短分数(对照)。
图.7C：LV面积变化分数(藻酸盐)。
图.7D：LV面积变化分数(对照)。
缩写：B.，基线；2mo.，2个月；T.，时间
图8A-D：藻酸盐生物材料诱导增强的新血管形成并增加瘢痕厚度
图.8A：藻酸盐生物材料注射入正常心肌。α-SMA抗体鉴定新血管形成(箭头)和成肌纤维细胞。
图.8B：藻酸盐生物材料注射入梗塞心肌，显示大量的成肌纤维细胞迁移至瘢痕处并增加了瘢痕厚度(×12.5放大率)。
图.8C：图.8B的高倍放大(×100)显示增加的新血管形成(棕色染色)。
图.8D：图.8B的高倍放大(×200)显示许多成肌纤维细胞和增加的新血管形成(棕色染色)。
缩写：Norm.，正常
图9A-C：藻酸盐生物材料注射入梗塞心肌增强了干细胞SDF-1-a化学引诱物的表达。载玻片进行显微镜检查，用抗-SDF-1抗体免疫染色，显示在内皮细胞、SMCs、成纤维细胞以及出乎意料地在缘带的心肌细胞处SDF-1蛋白(棕色)大量表达。
图.9A：交联的藻酸盐生物材料处理组样品的抗-SDF-1染色，×200。
图.9B：对照(用培养液处理的)样品的抗-SDF-1染色，×200。
图9C：藻酸盐生物材料处理组载玻片的抗-SDF-1染色，聚焦于梗塞和正常心肌之间缘带处的染色肌细胞。
缩写：Cont.，对照
图10：血管发生的定量(每一区域血管数量)。
缩写：Ves.，血管；Alg.，藻酸盐；cont.，对照。
图11A-B：在梗塞心肌中藻酸盐生物材料注射诱导细胞复制和再生。在LAD梗塞后第8周用抗Ki67抗体免疫染色。
图11A：接受藻酸盐注射的猪显示高频出现的具DNA活性的内皮细胞(箭头)。
图11B：对缘带的检查显示一些心肌细胞(细箭头)、内皮细胞和成纤维细胞具有阳性的Ki67染色。相比之下，在注射生理盐水的动物中(数据未给出)，具有成纤维细胞形态和对Ki67反应性的细胞仅在梗塞区带内高频出现。
缩写：myoc.，心肌；Inf.，梗塞。
图12A-D：可注射的组织工程学逆转了缺血性二尖瓣回流。
图12A：具有二尖瓣环扩张的局部缺血性二尖瓣回流的图解。
图12B：具有左心室整体几何形态改变和二尖瓣小叶圈合的局部缺血性二尖瓣回流的图解。
图12C：将基于藻酸盐的生物材料注射入梗塞的LV后外侧段(箭头)复位了向前方环状部移位的乳头肌以缓解圈合及MR。
图12D：藻酸盐注射的图解。
图13A-C：藻酸盐-成肌细胞混悬液注射显示该聚合物在注射部位增加细胞保留和血管发生。
图13A：用抗结蛋白抗体免疫染色鉴定多核成肌细胞(棕色染色，×400)。
图13B：通过注射成肌细胞混悬液和藻酸盐溶液处理的心脏的H&E染色切片，显示了新血管形成和充满红血球的功能性血管(×400)。
图13C：4周后心肌中残存的成肌细胞及其定位。用抗骨骼，快肌球蛋白重链抗体免疫染色显示了在注射部位的骨骼横纹肌细胞(箭头)(×400)。
图14：藻酸盐生物材料注射增强干细胞归巢至梗塞心肌。
对人祖细胞(棕色)HLA-DR免疫染色显示了输注的CD133+祖细胞归巢并迁移至位于瘢痕组织的交联的藻酸盐生物材料注射部位(输液后1周)。
发明详述
如下缩写用于本申请中：
BMP：骨形态发生蛋白
bFGF：碱性成纤维细胞生长因子
CHF：慢性心力衰竭
2-D：二维
DDW：重蒸馏水
ECM：细胞外基质
EDA：舒张末期面积
ESA：收缩末期面积
GPC：凝胶渗透色谱法
IGF：胰岛素-样生长因子
LA：左心房
LAD：左前降支
LV：左心室
LVEF：LV射血分数
LVID：LV内径
MALLS：多角度激光散射
MHC：肌球蛋白重链
MI：心肌梗塞
Mn：分子序数
MR：二尖瓣回流
Mw：分子量
PD：聚合度分散性
PM：乳头肌
SDF：基质细胞衍生因子
SMA：平滑肌肌动蛋白
TGF：转化生长因子
VEGF：血管内皮生长因子
WMSI：室壁活动计分指数。
在动物模型中心脏细胞移植或组织工程学的有希望结果部分归因于细胞外基质(ECM)的再建，其维持了LV壁的结构、厚度和弹性。发明人已经研究了当提供一种用于愈合和自修复的支架时，通过注射交联的基于藻酸盐的生物材料对ECM的处理是否能有效地维持LV的结构与功能。
令人惊奇的是，如以下实例所示，发明人发现通过注射一种交联的藻酸盐溶液可减少心肌梗塞后的LV扩张和心肌机能障碍，该溶液被注射至大鼠模型的梗塞心肌，其疗效与通过胚胎心肌细胞移植所取得的效果相当。
因此，在心肌梗塞(MI)和慢性心力衰竭(CHF)治疗中，对于难以获得胚细胞的上述移植而言，使用可注射的聚合物的溶液来治疗心脏梗塞可能是一种有效的替代方式。
对于该目的，本发明人开发了一种交联的藻酸盐生物材料，其象液体一样流动，但在静止条件下能保持足够的稠度直至注射入体内所需位置，在该位置产生固体凝胶。在体外，在0℃-30℃之间，优选在室温下(在21℃-25℃之间)变化的温度下该交联的藻酸盐可长时间保持流动形式，且仅在注射部位产生固体或半固体凝胶基质。
基于其的流变特性(如下详述)，于此开发的交联的藻酸盐生物材料定义为缠结分子网，不同于强共价凝胶，因为它们不具永久交联，具强频率依赖性，存在G’-G”交叉，并且在低频区象液体一样流动(如实施例1所示)。
因此，在第一方面，本发明涉及一种交联聚合物溶液，当对其施加小形变振荡频率时其弹性响应等于或大于其粘性响应，并显示了以幂律关系存在的剪力减小行为。
剪力减小行为特点在于该溶液在较低的剪切速率下较牛顿流体更粘稠，而在较高的剪切速率下其粘性则较小。具有幂律关系的溶液是一种粘度随剪切速率增加而减少的溶液。
为获得具有上述性质的溶液，本发明的交联聚合物溶液是由具有牛顿流体特性的，并且当对其施加小形变振荡频率时其粘性响应大于其弹性响应的聚合物前体溶液制备的。具有牛顿流体特性的聚合物溶液也被认为是一种牛顿流体，即在恒温恒压下，一种在所有剪切速率下都具有恒定粘度的流体，并且其中形变速率与所施加给流体的压力成正比，当对其施加小形变振荡频率时该溶液的弹性响应等于或大于其粘性响应。
所述施加小形变振荡频率在0.01-100Hz的粘弹性极限范围之内，优选在约0.1-10Hz范围之内。
本发明所用的聚合物优选为水凝胶型聚合物，例如多糖。
更优选地，所述多糖是藻酸盐。藻酸盐是一种水溶性多糖，当与诸如钙离子等二价阳离子交联时，其粘度增加直至形成固体或半固体凝胶。
如实施例1所举例说明，所述藻酸盐可具有不同分子量，优选地在10kDa-300kDa之间，更优选地在25kDa-250kDa之间。
可通过共价键、离子键和氢键中任何一种进行本发明聚合物溶液的交联，以便形成一种捕捉水分子的结构网络。
在一个实施方案中，当混合物被均质化以获得均一交联的藻酸盐生物材料时，藻酸盐溶液是与二价或多价阳离子(钙离子或其他离子)交联的。
于此定义的典型的交联溶液包含0.1-4％(w/v)的藻酸盐，优选0.5-2％的藻酸盐。而且其是贮藏稳定的，即保持了其溶液形式并具有长期可注射性。
通常，对于至少24小时、7天、乃至长达1年的一段时期，在室温或低于室温下交联的藻酸盐溶液是稳定的。
于此使用的术语可注射性用于表示保持其流体特性的溶液，且能通过注射(使用注射器和注射针头)、插入导管(通过导管或分流器)或任何合适的经皮心脏递药系统施用，所述递药系统包括带有导线的心脏递药装置，包括机电定位或MRI引导的导管，以及任何一种被设计通过左心室腔、动脉或静脉冠循环系统以接近心肌的经皮的心脏装置，以及对于将流体施用于需要的患者躯体任何部分的任何一种更合适的方法和手段，尤其是非外科手术方法。因此，本发明交联的藻酸盐溶液可通过任何一种于上详述的方法施用于需要的患者。
该交联的藻酸盐生物材料是流动的且可通过一种18-27G注射针注射到身体组织(如梗塞心肌)。或者，如上所述的其他合适的心脏递药系统也可使用。在注射部位(体内)，交联的生物材料形成一种凝胶并凝成固体或半固体。
应着重注意的是，于此提及的凝胶由分布有液体的网状结构组成，就水凝胶来说，该液体通常是水。定义凝胶的两个通用标准是：(i)其应包含液体，和(ii)其应具有覆盖整个样品的网状结构。
在另一方面，本发明提供了一种制备交联藻酸盐溶液的方法，当对所述藻酸盐溶液施加小形变振荡频率时溶液的弹性响应等于或大于其粘性响应，并显示了以幂律关系存在的剪力减小行为，其中所述方法包括步骤：(a)溶解藻酸钠于水或其他合适的含水缓冲液中；(b)用一种合适的交联剂交联步骤(a)中获得的藻酸盐溶液，其通过添加所述试剂的水溶液同时剧烈搅拌直至获得均一的交联的藻酸盐溶液。
交联可通过使用离子、改变pH或温度来实现。离子交联剂包括金属阳离子，例如钙、铜、铝、镁、锶、钡、锡、锌、铬、二、三及四官能团有机阳离子。可使用的聚离子例如聚(氨基酸)、聚(二甲亚胺)、聚(乙烯胺)、聚(烯丙胺)、和阳离子多糖。
因此，在本发明制备交联的藻酸盐溶液的一个特定实施方案中，所述交联剂是钙离子，优选为2％(w/v)葡萄糖酸钙溶液所提供的钙离子。
应注意的是，在注射条件下交联度决定了体内形成的固体沉淀物的蚀解速度。可注射溶液中聚合物的浓度取决于其分子量和预期的交联度。设计制剂应考虑到对于实现适当的液/固相转变所必需的因素，例如聚合物分子量和浓度以及交联剂的浓度。这样的设计在药学领域技术人员的能力范围之内。实施例1是获得本发明聚合物溶液的优选条件的举例说明。
本发明所使用交联的聚合物应当是一种生物相容的聚合物，能在体内胶凝并因此在注射部位形成水凝胶沉淀物。该聚合物应当是酶不可降解的和可生物蚀解的。最重要的是，该聚合物优选是非免疫原性的。如下列实施例所示，本发明交联的藻酸盐溶液是非免疫原性的，因为注射该溶液的实验动物没有一只显示出对该交联藻酸盐具免疫反应的任何征兆。
因此，实质上，本发明提供了一种制备交联的藻酸盐溶液的方法，当对所述藻酸盐溶液施加小形变振荡频率时溶液的弹性响应等于或大于其粘性响应，并显示了以幂律关系存在的剪力减小行为，其中所述方法包括步骤：(a)溶解藻酸钠于水或任何一种合适的含水缓冲液中；(b)用钙离子交联步骤(a)中获得的藻酸盐溶液，其通过添加合适体积的2％(w/v)葡萄糖酸钙溶液同时剧烈搅拌直至获得均一的溶液。
任选地，步骤(a)中获得的藻酸盐溶液科通过一系列合适的薄膜过滤器过滤，例如1.2、0.45和0.2μm尼龙过滤器，然后进行步骤(b)。
因此，本发明也提供了一种通过于此所述方法制备的交联的藻酸盐溶液。
出乎意料地，发明人发现单独注射交联的藻酸盐生物材料能促进受损心肌的再生并能提高其功能，而无需进行细胞共移植。
因此，本发明交联的藻酸盐溶液可用于促进受损心脏组织的修复和再生。
在另一方面，本发明提供了一种包含作为活性剂的本发明定义的交联聚合物溶液的组合物。
可用于交联聚合物溶液(包含于组合物中的活性剂)的聚合物的例子是水凝胶型聚合物，例如多糖。优选地，所述聚合物是藻酸盐。
根据本发明方法制备的可注射制剂特别适用于心肌梗塞后受损的心脏组织的治疗，和/或慢性心脏病的治疗。尤其是，根据本发明方法制备的可注射制剂在心肌事件后预计将增厚左心室壁。
因此，本发明组合物可用于促进受损组织的修复和再生，优选心脏组织，特别是左心室壁。
在本发明组合物的一个实施方案中，所述损伤选自：心肌梗塞、局部缺血性、中毒性、炎症性或机械性心肌损伤。
在另一个实施方案中，本发明组合物用于预防和/或治疗由心肌损伤、重塑和功能异常引起的疾病，其中所述疾病选自：左心室重塑、梗塞区伸展、心力衰竭和局部缺血性二尖瓣回流。
或者，应当预计本发明组合物可适用于由心律失常引起的组织损伤的治疗。使用电化学定位，本发明可注射的制剂可用于“生物消融”，即通过注射至心律失常病灶和通路中以消融心律失常。
心脏对肥大的适应可使患者易患心力衰竭并可能产生致命的心律失常。心律失常机制分为局灶性和折返性两种。折返性原理简单，是临床上最重要的心律失常机制。其描述了经由心肌通过通道返回其起点的电激活作用的波前导联(progression)，就完成了一个循环的折返线路。且倘若存在某些临界条件，则将继续沿着该回路反复传导以产生有规律的心律失常。
在任何情况下，凡是其中存在着提供类似的环状传导通路的结构变异型—其为先天性的(例如附加通道介导的心动过速、房室结折返性心动过速、以及可能的心房扑动)，或后天性的(例如心肌梗塞后心室性心搏过速)—都有可能产生折返性心律失常。反之，当心肌电特性产生严重性、泛发性分裂时，如在许多类型的结构性心脏病中所出现的，折返性波前可无引导地迂回穿过心肌而不沿着固定通道并导致纤维性颤动。该机制支持了局灶性心律失常是波及到其他心肌的一群细胞异常的、快速的自发性电活性。通过注射藻酸盐生物材料进行导管消融术的目的在于通过定位并除去最有把握和最易受影响的点消除心律失常，将横断并阻止折返性回路或除去病灶。为了记录来自心脏相关部位的电信号，该技术涉及导管电极(在绝缘导线的顶端具有电极，很像暂时起博导线)在透视导向下经皮导入心脏。一旦确定了心律失常的机制，将其中一个导管电极导入至关键部位，在该部位消融能(射频电流，其是可预测的、有效的、且易忍耐的)被传送于此以产生局部的瘢痕，将破坏心律失常的成因。总而言之，将交联的藻酸盐注射入兴奋折返通道或心律失常病灶，产生了纤维化并中断了心律失常回路。
因此，换句话说，本发明组合物可用于治疗局灶性或折返性心律失常。
本发明组合物的另一用途是治疗血管发生。
本发明组合物也用于指导干细胞趋化性并归巢至受损心肌。
在另一个实施方案中，本发明组合物还任选地含有附加治疗剂，其中所述附加治疗剂选自：抗生素、生长因子、抗炎症药物、激素、抗细胞凋亡药、生长和干细胞刺激因子。
多种生长因子可用作为附加治疗剂，例如血管发生刺激因子和血管重建促进因子，如碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、TGF家族成员、骨形态发生蛋白(BMP)、血小板衍生的生长因子、血管生成因子和其他因子，例如生肌因子、转录因子、细胞因子以及同源基因产物。
细胞因子、生长因子和血管生成因子可封装入生物可降解的微粒或毫微粒中并埋入生物材料中，如本发明的交联藻酸盐溶液，以增强组织再生。能模拟细胞基质的支架，如通过注射本发明的交联藻酸盐溶液产生的一种支架，其在注射条件下在体内胶凝并具有刺激新心肌生长和指导血管重建的潜能，如下列实施例所示。
还在本发明组合物的另一个实施方案中，所述组合物还含有细胞，优选成肌细胞、心肌细胞、成纤维细胞、内皮细胞、祖细胞、干细胞或其他可促进心脏血管发生和再生的合适的细胞。
如实施例6所示，注射成肌细胞和本发明交联的藻酸盐溶液增加了注射部位移植的成肌细胞保留，诱导了血管发生和功能性血管的形成。成肌细胞分化为具有骨骼横纹的多核纤维。
药物组合物的制备为本领域众所周知并已描述于许多论文和教科书中，参见，例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，Gennaro A.R.编.，Mack Publishing Co.，Easton，PA，1990，特别是在其中第1521-1712页。
仍在另一方面，本发明提供了本发明交联的聚合物溶液在制备用于促进受损组织修复和再生的药物组合物中的应用。优选地，所述交联的聚合物是藻酸盐，以及所述组织是心脏组织，更优选地是左心室壁。所述损伤来源可不同，例如心肌梗塞、局部缺血性、中毒性、炎症性或机械性心肌损伤。
因此，还在另一方面，本发明提供了一种治疗受损组织的方法，包括对需要的患者施用本发明定义的交联的聚合物溶液。优选地，所述聚合物是交联的藻酸盐。
在一个实施方案中，所述要被治疗的组织是心脏组织，优选为左心室壁。本发明交联的藻酸盐溶液或组合物应施用于受损的心肌，用于除去致心律失常性底物。
在本发明中，发明人已第一次证实了注射基于藻酸盐的生物材料至广泛性MI的大鼠模型的梗塞心肌中，能减少LV扩张和心肌机能障碍(实施例2)。该结果提供了上述观点的证据，还提供了一种新的选择，即注射生物材料支架以保持LV几何形状和功能。这项工作提出了一个可行的备选方案以克服在心脏组织工程学中要获得适当数量的功能性供体细胞的困难[Etzion，S.等.(2001)Am J Cardiovasc Drugs；1：233-244]。此外，其可与细胞递送共同使用，通过诱导新血管形成和SDF-1存活因子的表达以改善细胞保留、建群和生存。
尚不清楚注射藻酸盐生物材料如何引起组织修复和再生的机制。可能是，注射本发明交联的藻酸盐溶液可通过稳定室径并增加瘢痕厚度以降低壁应力。在心肌区该机制可抑制梗塞区伸展并阻止动脉瘤形成。换句话说，注射藻酸盐的有利效应可超越其有限的机械性能，与新血管形成和再生的诱导部分相关。
伴发壁应力增加的LV扩张和球面变形是LV重塑发病机理的关键所在[Sutton和Sharpe(2000)同前；Mann(1999)同前.]。被动的外部抑制其原理是通过进行网孔皮移植片植入，目的在于抵消左心室扩张和变形的进行。一些使用动物模型或具MI或扩张性心肌病患者的研究已证明被动的心脏抑制对心肌结构和功能的有利效应[Kelley，S.T.等.Circulation 1999；99：135-142；Pilla，J.J.等.(2002)Circulation；106：I207-211；Saavedra，W.F.等.(2002)J Am Coll Cardiol；39：2069-2076；Lembcke，A.等.(2004)Eur J Cardiothorac Surg；25：84-90]。除抑制心脏扩张之外，环割效应被认为能降低局部心室壁应力及减缓心肌工作。可能是注射的生物材料置换了受损的ECM并提供了临时支架，直至移植或植入的细胞产生它们自己的ECM及更坚固的瘢痕。
在本研究中，令人兴奋的新发现是在藻酸盐注射处理的心脏的梗塞区和缘带中强的SDF-1表达。SDF-1是一种关键的干细胞归巢和趋化性调节剂。这种作用暗示注射的生物材料激活了将干细胞吸引至注射部位的信号系统，该信号系统参与了新血管形成和心肌再生。
因此，在另一方面，本发明也提供了一种增强SDF-1表达的方法，包括对需要的患者施用交联的藻酸盐溶液或本发明定义的组合物。
显而易见，循环的干细胞归巢至高SDF-1浓度场所，如给出对SDF-1梯度的迁移容量之体外实验清楚所示[Kollet，O.等.Blood2001；97：3283-3291；Lapidot，T.和Petit，I.(2002)Exp Hematol；30：973-981]。注射人SDF-1至免疫缺陷大鼠的脾和骨髓中导致移植的人干细胞快速归巢至脾和骨髓中[Kollet等.(2001)同前.]。其他数据也与SDF-1原理一致，即干细胞归巢并不仅局限于骨髓，也可发现于创伤的心脏中[Askari，A.T.等.Lancet 2003；362：697-703；Pillarisetti，K.和Gupta，S.K.Inflammation 2001；25：293-300]。因此，SDF-1在触发这些归巢效应中可能起重要的作用。SDF-1通过CXCR4诱导体内血管发生。[Salcedo，R.等.Am J Pathol 1999；154：1125-1135；Tachibana，K.等.Nature 1998；393：591-594；Salvucci，O.等.Blood 2002；99：2703-2711]。SDF-1和CXCR4直接增加了细胞存活[Broxmeyer，H.E.等.(2003)J.Leukoc.Biol.73：630-638；Yamaguchi J-I等.(2003)Circulation 107：1322-1328].Yamaguchi和同事[Yamaguchi等.(2003)同前.]披露了SDF-1对新血管形成的效应似乎是由其增强移植的内皮祖细胞(EPCs)之募集和掺入所致。在另一研究中，Askari和同事披露了表达SDF-1的遗传修饰的心脏成纤维细胞的移植与用粒细胞集落刺激因子进行的干细胞转移结合能还原低下的心肌功能[Askari等.(2003)同前.]。此外，SDF-1通过CXCR4直接增强祖细胞的存活/抗细胞凋亡[Broxmeyer，H.E.等.(2003)同前.；Yamaguchi J-1等.(2003)同前.]。
因此，在另一方面，本发明提供了一种指导干细胞趋化性或归巢至受损的心脏的方法，包括对需要的患者施用藻酸盐溶液交联的藻酸盐溶液或本发明定义的组合物。
重塑过程中不可缺少的组成部分是心肌梗塞瘢痕中新血管形成的发生。在正常情况下，新血管形成对梗塞层毛细管网的贡献无法跟上收缩性代偿作用所需要的组织生长，并且不能支持肥大但能存活的心肌更多的需要。肥大心肌细胞相对缺少的氧气和营养可能是导致存活的心肌死亡的重要病因，该死亡导致了进行性梗塞伸展和纤维置换。因为在人和动物模型中梗塞血管床后期再灌注都明显地有利于心室重塑，所以新血管形成可通过阻止肥大但存活的心肌细胞的损失来改善心脏功能。
已治疗心脏的显微镜检查(图8A-D)揭示了藻酸盐注射补充了许多肌成纤维细胞并促进梗塞心肌中加强的血管发生。很可能环梗塞区血流量的恢复与所有较好的梗塞治愈相关。[Kocher，A.A.等.(2001)Nat Med；7：430-436]。新血管形成支架的有利作用，如提供自充满血的冠状血管床的‘勃起力’，最初业已为Salisbury等所提出[Salisbury，P.F.等.(1960)Circ Res；8：794-800]并进一步地为Braunwald的研究结果所支持[Braunwald，E.Circulation 1989；79：441-444]。而且，Hale和Kloner报道了在后期再灌注大鼠的梗塞中出现了较厚的瘢痕(显示对径向应力增加的阻力)[Hale，S.L.和Kloner，R.A.Am Heart J1988；116：1508-1513]。
总之，广泛性MI后新血管形成可阻止细胞死亡，保持其生活力并阻止LV重塑和机能障碍[Kocher等.(2001)同前.；Abbate，A.等.JCell Physiol 2002；193：145-153；Abbate，A.等.Circulation 2002；106：1051-1054]。其可提供生物学支架并被动限制阻止LV扩张和机能障碍。
考虑到上述讨论的结果，还在另一方面，本发明提供了一种诱导新血管形成的方法，包括对需要的患者施用交联的藻酸盐溶液或本发明定义的组合物。
减少急性MI肌损伤程度的努力业已在许多方面取得成功，但是仍留下梗塞后瘢痕、重塑、扩张和随之发生的心力衰竭问题。令人遗憾的是，现时有助于梗塞治疗的有限方法，例如早期再灌注、改进的溶纤维蛋白药和抗血小板疗法、以及心肌保护法表面上都已接近其极限。因此，研究人员正积极地开发新的目的在于用新组织置换旧梗塞心肌的方法，而非仅仅集中在限制或组织原有损伤的研究。已显示治疗性血管发生可作为潜在的新方法用于治疗症状性缺血性心脏病，而不受传统经皮或外科手术方法所限。上述“没有选择权”的患者在所有那些要进行闭塞性冠状动脉疾病治疗的患者中占12％之多。通过诱导新血管形成和侧支循环，治疗性血管发生增强了局部缺血组织灌注和生存能力，治愈并阻止了进行性心肌损伤。
因此，还在另一方面，本发明提供了一种诱导治疗性血管发生的方法，包括对需要的患者施用交联的藻酸盐溶液或本发明定义的组合物。
术语新生血管形成和血管发生于此可互换使用。
此外，本发明提供了一种预防疾病的方法，所述疾病选自：左心室重塑、梗塞区伸展、心力衰竭和局部缺血性二尖瓣回流，包括对需要的患者施用交联的藻酸盐溶液或本发明定义的组合物。
还在另一方面，本发明提供了一种治疗局灶性或折返性心律失常的新的和可选择的方法，包括对需要的患者的消融部位施用交联的藻酸盐溶液或本发明定义的组合物。
本发明的交联藻酸盐可用于改善心脏收缩功能，其定义为具有心肌收缩的特征，例如压力、最高压、动力、射血时间、心输出量等。
同样地，在本发明最后一方面，提供了一种改善心脏收缩性的方法，包括对需要的患者施用交联的藻酸盐溶液或本发明定义的组合物。
有趣的是，本发明人已证明了在注射本发明交联的藻酸盐溶液下，诱导心肌细胞增殖。阐明于实施例4中，在该实施例中在受损的心脏中存在抗细胞增殖标记物Ki67抗体的阳性反应。这暗示本发明交联的藻酸盐溶液能诱导细胞增殖或细胞分裂，以及以随之而发生的DNA合成。换句话说，该交联的藻酸盐溶液触发了外围组织再进入细胞周期。
因此，本发明的另一方面是一种诱导心脏细胞增殖的方法，包括在体内或体外将所述细胞与交联的藻酸盐溶液或本发明的组合物接触。
最后，本发明提供了一种用于修复受损组织的试剂盒，包含：(a)本发明定义的交联聚合物溶液或其组合物；(b)用于将(a)的聚合物溶液施用于需要患者心脏部位的装置；(c)指导如何使用所述聚合物溶液的手册。
在本发明提供的试剂盒的一个实施方案中，所述聚合物优选是交联的藻酸盐。
在本发明提供的试剂盒的另一个实施方案中，所述用于施用交联聚合物的装置可以是任何一种带有18-27G注射针的注射器，任何合适的经皮心脏递药系统，其包括带有导线的心脏递药装置，包括机电定位或MRI引导的导管，以及任何一种被设计通过左心室腔、动脉或静脉冠循环系统以接近心肌的经皮的心脏装置。
于此所介绍的原位组织工程学方案的主要优点在于使用基于导管的方法导入植入物或将形成该植入物的前体材料(如本发明交联的藻酸盐溶液)的可行性，因此避免了对外科胸廓切开术的需要。所以，本工作提出了藻酸盐注射是一种可产生用于干细胞归巢、集群和自我修复的环境的新选择方法。
本发明通过权利要求得到定义，所要阅读到的其内容包括在本发明说明书所公开的内容中。根据所公开和描述的内容，应当理解本发明不限于于此所公开的特定的实施例、工序和材料，照此工序和材料可由稍许改变。
也应当理解的是于此使用的术语目的仅在于描述特定的实施方案而非意在限制，既然本发明的范围将仅由所附加的权利要求及其等价物所限定。必须指出的是，除非该内容另有清楚的规定，说明书和附加的权利要求中所使用的单数形式“a”、“an”和“the”包括了复数对象。
除非上下文另有需要，说明书全文和随后的权利要求中措词“包含(comprise)”及变体例如“包含(comprises)”和“包含(comprising)”应理解为意味着包含规定的完整的事物或步骤或完整的事物群或步骤群，而非排除所有其他完整的事物或步骤或完整的事物群或步骤群。
如下实施例表示发明人在进行本发明内容种所使用的方法。应当意识到当这些方法对于本发明实施是例证性的优选方案时，本领域技术人员根据本发明所公开的内容将认识到许多修改可被进行而不背离本发明的精神和预期的范围。
实施例
实验方法
本研究根据Ben-Gurion大学动物护理和使用委员会(The AnimalCare and Use Committee)和Tel-Aviv大学的Sheba医学中心的指导方针执行，符合美国心脏病协会(American Heart Association)和“实验室动物护理和使用手册(Guide for the Care and Use of LaboratoryAnimals)”(卫生和人类服务部(Department of Health and HumanServices)，NIH出版物第85-23号)的政策。
交联的藻酸盐生物材料的制备
将藻酸钠(分子量在3-300kDa之间，FMC Biopolymers，Drammen，Norway)溶解在重蒸馏水(DDW)中至2％(w/v)的终浓度。通过添加2％(w/v)葡萄糖酸钙溶液(D-葡糖酸、半钙盐，Sigma)，使用钙离子交联藻酸盐溶液同时剧烈搅拌直至获得更平滑的溶液。交联的藻酸盐溶液粘度可通过改变钙离子和藻酸盐的重量比进行操纵，也可以通过审慎地选择聚合物分子量和组合物(M/G比)进行操纵，尽管如此，就一切情况而论该交联的藻酸盐溶液具有允许其注射的粘度。交联是通过均质器来进行的。
一种典型的交联的藻酸盐注射溶液由1％(w/v)藻酸盐和0.3％(w/v)葡萄糖酸钙组成，并例如通过混合1ml的2％(w/v)藻酸盐、0.3ml的2％(w/v)葡萄糖酸钙溶液以及0.7ml的水以产出2ml交联的藻酸盐组合物而制备得到。然后将该交联的藻酸盐置于4℃下直至使用。在猪中，注射1-5ml本发明的交联的藻酸盐。虽然注射的最佳量和频率应当由负责患者治疗的专业人员决定，但可将0.2-5ml交联藻酸盐注射入人体中。
发明人开发的方法实质上不同于之前用于制备藻酸盐凝胶的方法。在一种方法中，通过滴加方式将藻酸盐溶液添加至CaCl2浓溶液中制备藻酸盐凝胶。该方法涉及藻酸盐液滴快速并广泛地交联，主要在液滴表面上发生。由于钙离子扩散入液滴，藻酸盐从一种粘稠溶液快速转变为一种高交联固体凝胶。上述剂型通常被用来包囊细胞以及经常涉及在藻酸盐和带正电聚合物之间的另一种反应，以形成半透膜[Lim，F.和Sun，A.M.(1980)Microencapsulated islets as bioartificialendocrine pancreas.Science 210：908-910]。相比之下，在本发明的方法中，通过剧烈的混合用藻酸盐水溶液分散钙离子溶液，产生一种均一的藻酸盐生物材料的缠结分子网，其通过钙交联得到支持。
在WO 94/25080描述的方法中，对于可注射藻酸盐，主要应用了将固体颗粒硫酸钙添加到藻酸盐溶液的方法。因此，藻酸盐胶凝速度取决于硫酸钙的溶解度，其也取决于盐粒度。通常，具有大范围粒度分布的盐粒会影响它们的溶解速率(越小的粒子溶解越快)。其导致无法控制的藻酸盐胶凝过程并形成非均一的凝胶。相比之下，本发明人开发的方法能制造出一种均一的互相贯通的网络，如流变学研究所示。
GPC-MALLS用于藻酸盐分子量测定
在一种包括Waters 606泵，后接两根串联的PSS Suprema凝胶渗透柱的色谱系统上对藻酸盐样品进行分离。柱子描述：外形尺寸300×8mm2，粒度10mm，孔隙度3000和10,000A。流速为0.5ml/min。在Techlab K-4可控烘箱中，柱子保持在25℃的恒温。该色谱系统连到Dawn DSP(Wyatt Technology Corporation)多角度激光散射(MALLS)光度计，其装备有工作在632.8nm的He/Ne激光器、K5折射池和在14-163°角度的18个探测器。通过校准的干涉型折射计OptilabDSP(Wyatt Technology Corporation)来监测浓度。用Wyatt ASTRA软件4.7版进行数据处理和摩尔量计算。每一样品注射三次以确保重现性。用Wyatt dn/dc软件控制的Optilab DSP测定藻酸盐的dn/dc，为0.155ml/g(含水缓冲液)。含水缓冲溶液制备自添加有0.1M NaNO3，0.02％(w/v)NaN3和10mM咪唑的超纯水(0.055s/cm，USF SERALPurelab R075后接USF SERAL Purelab UV)。用NaNO3滴定缓冲液至pH 7.0并经0.1μm过滤器(Gelman Sciences VacuCap 60)过滤。
流变学测量
在CarriMed CLS50可控应力流变仪(CarriMed InstrumentsLtd.Dorking，UK)上，于圆锥平板模式(锥度1°和4°，直径分别为60和40mm)下操作，进行流变学测量。在线性粘弹性极限内进行小振幅振荡剪切试验(0.1-10Hz)。在防止损伤样品的可能最低应力下进行频率扫描。连续监测响应值的线性以确定线性粘弹性。
MI大鼠模型和注射
之前，发明人描述了该MI模型[Etzion等.(2001)同前.；Leor等.(1996)同前.]。用40mg/kg氯胺酮和10mg/kg甲苯噻嗪联合麻醉雄性Sprague-Dawley大鼠(～250g)，插管并机械通风。通过左侧胸廓切开术打开胸腔，除去心包膜并通过壁内缝线永久闭塞邻近的左冠状动脉。梗塞形成一周后，麻醉大鼠并利用无菌技术开胸。依据表面瘢痕和室壁运动不能目视确定梗塞面积。挑选大鼠使用27-计量注射针注射100-200μL基于藻酸盐的生物材料或无血清培养基。在注射入瘢痕后，缝线闭合外科切口。
组织学和免疫组织化学检查
注射后8周，用过剂量的苯并巴妥对动物施无痛致死术。收获心脏，并进行组织学和免疫组织化学检查。将毗连的块埋入石蜡中，切成5μm切片并用苏木精和伊红染色。用抗存在于胚胎心肌细胞中，但不存在于成人正常的心肌细胞中[Leor，J.等.(1996)Circulation；94：11332-336]的α-肌动蛋白平滑肌(SMA)同种型、快肌球蛋白重链(MHC)(Sigma)、Ki67(Novocastra Ltd.)、SDF-1(R&D systems)的抗体对连续切片进行免疫标记。
新血管形成的评估
通过使用抗-α-SMA抗体(Sigma)对周细胞和小动脉的代表性玻片进行免疫组织学染色以评估藻酸盐注射对梗塞和梗塞周围心肌中新血管形成的影响。低倍镜检后，在X200放大倍率在对来自每一切片的5个连续相邻视野照相。血管数量评估自显微照片，通过计算机化图像分析以计数植入物体的心脏和对照组中血管数量并计算血管密度(每平方毫米毛细血管和小动脉的平均数量)。
超声波心动描记术评估重塑和收缩性
在MI后24小时内(基线超声波心动图)和8周后对所有动物进行经胸壁超声波心动描记术。之前报道已证实在大鼠中经胸壁超声波心动图的准确性和再现性[Etzion等.(2001)同前.；Leor，J.等.(2000)同前.；Litwin，S.E.等.(1994)Circulation；89：345-354；Schwarz，E.R.等.(1998)Basic Res.Cardiol.93：477-486]。如之前所报道的，使用商业渠道可购得的装备有12MHz相控探头的超声波心动描记系统(Hewlett Packard)记录超声波心动图。测量的参数是：LV前壁的厚度；在M-型和2-D成像中最大LV舒张末期内径和最小左心室收缩末期内径；以及作为收缩功能量度的缩短分数，其计算为FS(％)＝[(LVIDd-LVIDs)/LVIDd]×100，其中LVID指LV内径，s是收缩，以及d是舒张。LV面积改变指数(％)计算为[(EDA-ESA)/EDA]×100，其中EDA指LV舒张末期面积，ESA指LV收缩末期面积[Mehta，P.M.等.(1988)J.Am.Coll.Cardio].11：630-636]。对三次连续心博周期的所有测量结果平均，由无法得知是处理组的富有经验之技术人员来进行操作。
猪心肌梗塞的产生
用于产生心肌梗塞的方法与之前所描述的那些方法相同[Yau，T.M.等.(2003)Ann Thorac Surg 75：169-176；Watanabe，E.等.(1998)Cell Transplant 7：239-246]。简言之，使用了体重30-40kg的雌性Sincklaire(迷你型)猪。所有对猪的手术操作均在全身麻醉和连续心电图监护下进行。动物在用4％异氟烷诱导麻醉前，先施用氯胺酮(20-30mg/kg，肌内施用)。用1％-2.5％异氟烷维持麻醉。分离并用带护套的插管器将导管插入右股动脉。在这期间，在透视导向下将心导管置于左前降动脉(LAD)中部，用导线从导管中拉出旋管(Boston Scientific，USA)并置于LAD远侧部。该过程引发了导致左心室心肌梗塞的血栓，并通过血管造影术和心电描记术所证实。需要时，施用电DC心脏复律。
二尖瓣回流(MR)的产生
在冠状动脉回旋支螺圈栓塞后通过形成广泛性后侧MI产生二尖瓣回流。
藻酸盐生物材料注射
在MI后7-10天时进行藻酸盐注射。麻醉猪并用无菌技术开胸。依据表面瘢痕和室壁运动不能目视确定梗塞面积。将猪随机分为2-3只一组，将藻酸盐(达2.5ml)或作为对照的生理盐水(达2.5ml)注射入梗塞心肌。从胸腔中排出空气并缝合外科切口。在最初一系列的预试验中，细化该操作的技术内容。移植后8周，用过剂量的苯并巴妥对猪施无痛致死术。收获心脏，切片并进行组织学和免疫组织化学检查。
LV重塑和功能的超声波心动描记术评估
在麻醉下，MI不久后，移植前，在MI后第10天和在第30和60天时，使用带有(2.5MHz)相控探头的超声系统(Sonos 5500，Hewlett-Packard，Andover，Massachusetts)进行超声波心动描记。在VHS录像带上记录图像。从标准的顶端(apical)和胸骨旁视图中选择舒张末期和收缩末期帧。
通过目视估计总体左心室射血分数(LVEF)。当＞80％的心内膜边界在顶端4-和2-室视图中可被检测时，通过使用单平面改良的Simpson氏算法手动描绘左心室腔来测量LV体积，当80％的心内膜边界仅在顶端4-室视图中可被检测到时，使用单面算法进行测量。局部心肌评估和室壁运动评分指数通过对16个左心室节段的每一部分赋予如美国超声波心动描记术协会(American Society of Echocardiography)所推荐的节段评分(1＝正常，2＝运动功能减退，3＝运动不能，4＝运动障碍)来确定[Schiller，N.B.等.(1989)J.Am.Soc.Echocardiogr.2：358-367]。所有节段评分相加并除以所分析的阶段数量以获得室壁运动评分指数。
通过使用标准的16节段评估分区LV功能[Schiller，N.B.等.(1989)J.Am.Soc.Echocardiogr.2：358-367].。对于每一节段，使用如下半定量评分系统(1-4)∶1＝正常或运动过度；2＝运动功能减退；3＝运动不能和4＝运动障碍，目视分级收缩期室壁运动和肥厚。通过将个体评分之和除以所分析节段的总数获得左心室壁运动评分指数(WMSI)。通过相同方法对中间-LAD区(梗塞相关的动脉区)计算分区运动评分指数。该研究由单个有经验的观察者来进行，以及由单个技术人员脱机获得所有的测量结果。
使用在左心房射血偏心度和邻近区域大小范围内对射血扩张进行积分的算法，通过彩色多普勒血流定位进行MR分级。在不存在壁射血及邻近的可见速度异常表面区没有基线位移时，当返流的射血面积占＜20％的LA面积时，MR被认为是中度的。在所有患者中射血面积＞40％LA面积时，其被认为是重度的。射血偏心度或相当大的邻近流动会聚半径(在具有射血面积＜20％的患者中为0.6mm，以及在射血面积在20％-40％之间的患者中为0.9mm)增加了1级的MR。
形态学和组织学研究
在心室功能侵入性研究完成后，用氯化钾使心脏停搏并快速离体。除去心房并对心脏称重。然后，用100mL 10％甲醛灌注冠状动脉，并在进行组织学切片前，在甲醛溶液中将具有30mmHg心室内压的舒张期心脏固定7天。在固定后，将心脏切成5mm厚薄切片，并对每一切片照相。每一切片中的平均瘢痕长度被计算为心外膜瘢痕长度和心内膜瘢痕长度的平均值。接着将切片的平均瘢痕长度乘以0.5cm计算该瘢痕面积。对所有切片瘢痕面积求和计算总的瘢痕面积。计算每一切片中瘢痕厚度，并将总的瘢痕面积乘以平均瘢痕厚度计算出瘢痕体积。将来自梗塞区中心量得每一边为5mm的组织立方体包埋入石蜡中并切成5μm切片用于苏木精和伊红染色。对于免疫组织化学研究而言，在用甲苯去石蜡化后，组织切片在100％、95％和70％乙醇中逐次再水化。封闭样品中内源性过氧化物酶并用抗体染色样品。将毗邻的块包埋入石蜡中，切成5μm切片并用苏木精和伊红染色。用抗SMA、慢MHC(Sigma)、Ki67(Novoeastra Ltd.)和SDF-1(R & D systems)抗体免疫标记连续切片。
统计学分析
对于连续变量使用t检验评价对照和处理组之间的单变量差。因为在两组中每只大鼠都被用作为它自己的对照，所以使用成对t检验评价对照和处理组织中基线和第8周之间的改变。使用用于Windows的GraphPad Prism 4.00版(GraphPad Software，San Diego，California，USA)进行重复测量ANOVA，以比较对照和处理组中从基线到第8周的改变。ANOVA模型包括作为因子的对照/处理和基线/第8周，以及也包括两因子之间的相互作用[Perin，E.C.等.(2003)Circulatiow；107：2294-2302]。概率值p＜0.05被认为统计学显著。
实施例1
可注射的交联的藻酸盐生物材料的制备和流变学评估
生物聚合物藻酸盐分子量(Mw)及其多分散性(PD)(分子量分布范围的指示)可影响合成的缠结分子网的形成速率和结构。因此，使用GPC-MALLS(如实验方法所描述)鉴定藻酸盐Mw和PD(表1)。
表1：藻酸盐特性
  藻酸盐   Mn(g/mol)   Mw(g/mol)   PD(Mw/Mn)
  LF 5/60   2.102e+42.113e+4   2.752e+42.656e+4   1.309±0.0071.257±0.01
  LVG   1.469e+51.385e+5   1.667e+51.559e+5   1.135±0.0161.126±0.012
  MVG   2.103e+52.055e+5   2.596e+52.385e+5   1.235±0.0061.161±0.007
附注：
(i)每次测量所给的两个数值代表两个不同批次的材料。
(ii)g/mol＝道尔顿
流变学
藻酸盐凝胶属于物理凝胶类，与共价交联相比其中所形成的物理交联既不持久也不强。
恒稳剪切粘度
粘度η是流体流动的阻力测定值。其定义为剪切应力τ对剪切速率γ的比值。
(1)η＝τ/γ
当对于所有剪切速率流体遵守方程式(1)时，意味着其是牛顿流体[Ferry，J.D.(1980)Viscoelastic properties of polymers.John Wiley& Sons]。描述于此的1％(w/v)藻酸钠溶液是牛顿流体(表2)。
表2：粘度作为剪切速率的函数(剪切速率10-2-10-4(秒-1))
  藻酸盐溶液   粘度(cP)
  1％(w/v)LF 5/60   40
  1％(w/v)LVG   127
  1％(w/v)MVG   400
当添加钙离子时，它们启动藻酸盐的交联，产生缠结分子网结构并形成之。对于钙交联的藻酸盐来说，大形变恒稳剪切出现在粘度(η)对剪切速率(γ)的图中。图1和2显示了表观粘度，其与剪切速率成正比。该特性称为剪切减弱或假塑性。对于logη对logγ的图，观察到幂律关系(η～γ-1)，其代表结构材料[Lapasin，R.和Pricl，S.(1995)Rheology of industrial polysaccharide：Theory and application.London，Blackbie，p.620].
小形变振荡测量
为获得有关材料(此际，聚合物-藻酸盐溶液的流变学信息)，使用动态粘弹性测量。优于粘度测定法，因为不扰动材料结构，并可获得材料的粘性和弹性信息。该测量通过对样品施加频率f的正弦应力或形变并测量响应来进行。该响应分为(i)与所施加应力或形变同相的弹性部分，和(ii)异相的粘性部分。因为是二元的，所以使用了复数记法。复数切变模量表示为G*，其定义为如下公式：
G*＝G’+jG”
其中G’是储能模量，即弹性部分，G”是损耗模量(粘性部分)，和j2＝-1。
作为频率函数的模量图通常被认为是材料的力学谱。在G’对频率的log-log图中频率相关性可表示为斜率n，f，表示为：Log G’＝n logf+K。
其中K是常数。在物理凝胶中，n＞0，而在共价凝胶中n＝0。
根据作为角频率函数的储能模量G’(弹性响应)和损耗模量G”(粘性响应)进行小形变振荡测量；G’被用作为凝胶样(结构)系统的主要指标。图3和4分别显示了在添加不同钙离子浓度前和后1％(w/v)LF 5/60藻酸盐或LVG藻酸盐样品的力学谱。对于两种1％(w/v)藻酸盐溶液(无钙离子)，G”值大于G’值，其为无规卷曲多糖溶液的典型特性。
刚一添加钙离子，合成系统的力学谱就显示了G’-G”交叉，其为“缠结分子网”型物理凝胶的典型特征。该类型凝胶不同于强共价凝胶是由于：(i)它们不具有永久交联；(ii)它们具有强频率依赖性；(iii)它们具有G’-G”交叉；和(iv)它们如流体般低频流动。“强凝胶”具有永久的网络(共价)并显示出极小频率依赖性的剪切模量[Clark，A.和Ross-Murphy，S.B.(1987)Structural and mechanical properties ofbiopolymer gels.Adv.Poly.Sci.Springer-Verlag，Berlin，Heidelberg]。弱凝胶属于中间类型，它们较缠结分子网具更小的频率依赖性且不存在10-2-102rad/s频率的G’-G”交叉。在更低频率处，它们可具有G’-G”交叉以及不同的行为。
实施例2
在MI大鼠模型中比较藻酸盐生物材料和心脏细胞移植的疗效
广泛性MI7天后，对大鼠随机进行心肌瘢痕基于藻酸盐生物材料的注射、胚胎心肌细胞(1.5×106)植入或培养基注射。如上所述藻酸盐生物材料是钙交联的，在注射条件下还能流动。超声波心动描记研究在植入前或后1和2月进行以评估LV重塑和功能。植入2个月后收获心脏进行组织学评价。
连续的超声波心动描记研究揭示了交联的基于藻酸盐生物材料注射增加了瘢痕厚度，防止LV扩张和机能障碍，比得上心脏细胞移植，而对照动物发生明显的LV扩张，伴随着LV收缩性进行性劣化。结果概述于表3中。
表3
  藻酸盐(n＝7)   细胞(n＝5)   培养基(n＝4)
  2-DEcho   前   2个月后   前   2个月后   前   2个月后
  LVDDmm   0.70±0.02   0.85±0.05   0.068±0.03   0.69±0.01   0.73±0.04   0.97±0.04*
  LVSDmm   0.52±0.05   0.65±0.06   0.45±0.02   0.45±0.04   0.56±0.04   0.8±0.04*
  LVSAmm   0.22±0.03   0.34±0.06   0.17±0.02   0.18±0.02   0.23±0.3   0.42±0.03*
  LVFS％   27±5   25±4   33±3   34±6   23±3   17±1*
*2个月后对前；p＜0.05
LVDD：LV舒张期内径；LVSD：LV收缩期内径；LVSA：LV收缩期面积；FS：缩短分数。
这些结果认为在大鼠模型中基于藻酸盐生物材料注射入梗塞心肌减弱了LV扩张和心肌机能障碍。这些结果比得上那些通过胚胎心脏细胞移植所获得的结果。该结果提出了对于获得合适的细胞以治疗MI和CHF困难性的可行替换。
实施例3
用钙交联的藻酸盐生物材料处理的MI动物模型
总的说来，该研究使用了39只大鼠。13只大鼠在诱发MI的手术操作后死亡。在24只大鼠上进行超声波心动描记研究和分析。15只大鼠用藻酸盐生物材料注射处理，以及对照组(n＝9)接受无血清培养基注射。注射藻酸盐至两只大鼠正常心脏中以研究其对正常心肌的安全性和影响。
-超声波心动描记功能研究
藻酸盐生物材料注射显著增加了瘢痕厚度(表4，p＜0.0001)。此外，其有效地减弱了并发广泛性前MI的LV扩张的典型病程(图5，表4)。
虽然LV室内径和面积增加了，但是其显著小于对照动物中所观察到的结果(图5和表4)。该藻酸盐生物材料对LV重塑的有益作用解释为通过减弱缩短分数和LV面积变化分数的劣化而反映出的LV机能障碍的预防(图6，表4)。
与生物材料处理的大鼠相比，对照组显示了广泛性心肌梗塞、LV重塑和心力衰竭的典型病程。观察到LV舒张期和收缩期内径的显著增加(图5和6，表4)。LV舒张末期和收缩期腔面积分别显著增加75％和大于100％(图5和6，表4；p＜0.05)。该过程类似于在广泛性前MI后人患者中所观察到的结果[Pilla，J.J.等.(2002)Cireulation 106：1207-211]。从基线开始的进行性LV扩张也并发着LV性能显著的劣化，反映为在研究结束时缩短分数的劣化(从30±5％至22±3％；p＜0.05)和LV面积变化分数百分数的劣化(从49±5％至38±3％；p＜0.05)(图7)。
表4：超声波心动描记研究结果
  藻酸盐生物材料(n＝15)   对照(n＝9)
  前   后  P   前   后   P
  M-型
  AW d cm   0.14±0.01   0.15±0.01  0.11   0.14±0.01   0.14±0.02   0.6
  LVEDDcm   0.71±0.02   0.86±0.03  0.004   0.74±0.02   0.98±0.03   ＜0.0001
  LVESDcm   50±0.03   65±0.04  0.01   0.51±0.04   0.78±0.05   ＜0.0001
  LVSF(％)   30±4   27±3  0.4   30±5   22±3   0.04
  2-D
  AW d cm   0.14±0.01   0.16±0.01  ＜0.001   0.14±0.01   0.14±0.01   0.8
  LVEDDcm   0.71±0.02   0.86±0.03  ＜0.01   0.73±0.02   0.98±0.03   ＜0.0001
  LVESDcm   0.50±0.03   0.65±0.04  ＜0.01   0.51±0.04   0.78±0.05   ＜0.0001
  LVED面积cm2   0.38±0.03   0.56±0.05   0.17   0.40±0.03   0.70±0.03   ＜0.0001
  LVES面   0.21±0.03   0.32±0.04   0.05   0.20±0.02   0.44±0.04   ＜0.0001
  积cm2
  FAC％  47±4  45±3  0.6  49±4  38±3   0.02
AW d-前壁舒张期厚度
LVEDD-LV舒张末期内径
LVESD-LV收缩末期内径
LV FS-LV缩短分数-[(LVIDd-LVIDs)/LVIDd]×100
LV EDA-LV舒张末期面积；LV ESA-LV收缩末期面积
FAC％-面积变化分数-[(EDA-ESA)/EDA]×100
组织学和免疫组织学分析
藻酸盐生物材料注射入正常心肌中引起密集的血管发生和成肌纤维细胞的迁移，如使用抗α-SMA抗体的免疫染色所示(图8A)。通过藻酸盐注射处理的梗塞心脏的切片检查显示密集的新血管形成和很多的成肌纤维细胞移至梗塞的心肌(图8B、C、D)。用抗-Ki67抗体进行的可注射的藻酸盐生物材料处理动物的免疫染色(图11)揭示了位于梗塞部位内皮和心肌细胞中的阳性染色，表明DNA活性和复制。因此，显然藻酸盐诱导了与心脏再生相关的细胞复制。
用抗-SDF-1抗体免疫染色的载玻片的显微镜检查揭示了在内皮细胞、SMCs、成纤维细胞中以及出乎意料地在缘带处心肌细胞中SDF-1蛋白的强表达(图9)。与未处理动物相比藻酸盐生物材料注射增加了SDF-1在梗塞部位的表达。因为SDF-1是干细胞归巢的关键调节物，该作用认为注射的生物材料激活了将干细胞吸引至注射部位的信号系统，其参与了新血管形成和心肌再生。
处理动物梗塞心肌中血管密度(毛细血管和小动脉的平均数量/mm2+S.E.)明显高于对照动物(231±13对180±16；p＜0.02；图10)。
实施例4
通过藻酸盐注射处理心肌梗塞的猪模型
总的说来，该研究使用了18头猪。手术期间死亡率为27％(18头死亡5头)。对具有前MI的10头猪进行超声波心动描记研究和分析。5头猪用藻酸盐注射处理及对照组(n＝5)接受PBS注射。使4头猪患后外侧MI(MR研究)。
-免疫组织化学
LAD或卷曲(MR研究)闭塞8周后，猪接受藻酸盐注射证明了具有DNA活性的内皮细胞(图11A)和心肌细胞(图11B)的高频出现，如通过用抗Ki67反应性的单克隆抗体免疫染色所确定的。相比之下，在接受生理盐水动物中具有成纤维细胞形态和与Ki67反应性的细胞仅在梗塞区中高频出现。这些结果认为藻酸盐生物材料在诸如心肌细胞的细胞中能诱导细胞增殖，该细胞在成人心脏中通常不具有该活性。上述现象通常与心脏再生相关。
实施例5
超声波心动描记功能研究：逆转心室重塑减少局部缺血性二尖瓣回流(MR)
局部缺血性MR是一种常见的冠心病并发症，使晚期死亡率加倍[Lamas，G.A.等.(1997)Circulation 96：827-833]。大量证据业已显示局部缺血性MR起因于左心室畸变，其置换了乳头肌(PMs)并栓住了顶端的二尖瓣瓣叶，限制它们的闭合。然而，对局部缺血性MR的治疗仍然问题重重。二尖瓣环瓣膜成形术，通常在外科分流术时应用，减少了二尖瓣环尺寸但无法直接解决具有圈合的局部缺血性LV畸变的主要问题；因此其作用是不完全的，特别是当手术后LV重塑持续发展时。未明确的作用和对房切口和心肺分流术的需要阻了止手术修补。使用外部设备复位PMs可缓解局部缺血性MR。
于此提出的预实验显示注射基于交联的藻酸盐生物材料复位了PMs并缓解了局部缺血性MR，而不使LV功能遭致损害。而且，该相对简单的技术可应用于搏动心脏(图12)。
实施例6
将在交联的藻酸盐溶液中的骨骼成肌细胞悬浮物注射入大鼠的正常心脏
将藻酸盐生物材料注射入心肌中以促进血管发生并改善细胞移植保留和存活。该实施例显示了藻酸盐生物材料注射可有利于延长诸如骨骼成肌细胞的共注射细胞的保留。
根据先前描述的方法分离并纯化来自Sprague-Dawley新生大鼠后肢肌肉的成肌细胞[Rosenblatt，J.D.(1995)In Vitro Cell Deu.Biol.Anim.31：773-779]。为了验证成肌细胞占总体的百分数，用洁蛋白(Sigma)染色培养的细胞，其染色了成肌细胞(图13A)。如上所述制备可注射的藻酸盐溶液。
用40mg/kg氯胺酮和10mg/kg甲苯噻嗪联合麻醉雄性Sprague-Dawley大鼠(～250g)，插管并机械通风。通过左侧胸廓切开术打开胸腔，除去心包膜并给大鼠注射悬于100-200μL基于藻酸盐生物材料中的骨骼成肌细胞，使用27-计量注射针，注射入左心室游离壁肌肉中。在注射入心脏肌肉后，缝线闭合外科切口。
注射四周后，用过剂量的苯并巴妥对动物施无痛致死术。收获心脏，并进行组织学和免疫组织化学检查。将毗连的块埋入石蜡中，切成5μm切片并用苏木精和伊红染色。用抗快MHC抗体(Sigma，UK)对连续切片进行免疫标记。
如图13A-C所示，成肌细胞与本发明交联的藻酸盐溶液一起注射诱导了新血管形成，如功能性新血管形成所示，其为红细胞的出现所证实(图13B)。此外，与藻酸盐生物材料共注射增加了移植的成肌细胞在注射部位的保留。该成肌细胞分化为具有骨骼横纹的多核纤维。
实施例7
注射交联的藻酸盐生物材料增加干细胞归巢至梗塞的心肌
让无胸腺裸大鼠患心肌梗塞，随后注射交联的藻酸盐生物材料至梗塞组织中，梗塞后一周时，通过静脉输注人脐带血衍生的CD133+祖细胞(2-4×106细胞)处理动物。输液一周后，收获心脏并将代表性的切片固定或冷冻切片。通过对HLA-DR免疫染色证实在受体心脏中出现人供体细胞。HLA免疫染色(图14，棕色)揭示了在瘢痕组织处灌注的供体细胞归巢并移居至交联的藻酸盐注射部位。该实验清楚地证实了交联的藻酸盐注射至受损组织能增加干细胞归巢，其与在注射部位SDF-1的大量表达一致。
实施例6和7显示了交联的藻酸盐生物材料对移植入跳动心脏的细胞保留的有利作用。相比之下，在不存在聚合物下注射细胞，会导致广泛的细胞泄漏，并因此，大部分细胞无法保留在注射部位，同时，高比例的细胞死亡。
权利要求书
(按照条约第19条的修改)
1.一种交联的聚合物水溶液，当对其施加小形变振荡频率时具有等于或大于其粘性响应的弹性响应并显示了以幂律关系存在的剪力减小行为。
2.一种均一的交联的聚合物水溶液，当对其施加小形变振荡频率时其具有等于或大于其粘性响应的弹性响应并具有以幂律关系存在的剪力减小行为。
3.如权利要求1或2所定义的溶液，其中所述聚合物可通过共价键、离子键和氢键任何之一交联，从而形成捕捉水分子的结构网络。
4.如权利要求3所定义的溶液，其中所述聚合物通过二价或多价阳离子任何之一交联。
5.如权利要求4所定义的溶液，其中所述阳离子是钙、铜、铝、镁、锶、钡、锡、锌、铬或有机阳离子、聚(氨基酸)、聚(二甲亚胺)、聚(乙烯胺)、聚(烯丙胺)和多糖。
6.如权利要求1-5任一所定义的溶液，其中所述聚合物是水凝胶型聚合物。
7.如权利要求6所定义的溶液，其中所述聚合物是多糖。
8.如权利要求7所定义的溶液，其中所述聚合物是藻酸盐。
9.如权利要求8所定义的交联的藻酸盐溶液，其中所述藻酸盐具有10KDa-300KDa范围的分子量，优选在25KDa-150KDa范围内。
10.如权利要求9所定义的交联的藻酸盐溶液，其中所述溶液通过交联具有牛顿特性的藻酸盐母体溶液得到制备，并在施加小形变振荡频率时具有大于其弹性响应的粘性响应。
11.如权利要求10所定义的交联的藻酸盐溶液，其中所述施加的小形变振荡频率在粘弹性极限内。
12.如权利要求11所定义的交联的藻酸盐溶液，其中所述施加的小形变振荡频率在约0.01-100Hz范围内，优选在0.1-10Hz之间。
13.如权利要求7-12任一所定义的交联的藻酸盐溶液，包含0.1-4％(w/v)交联的藻酸盐。
14.如权利要求7-13任一所定义的交联的藻酸盐溶液，其中所述溶液由于保持了其溶液形式因此是贮藏稳定的，并具有长期可注射性。
15.如权利要求14所定义的交联的藻酸盐溶液，其在至少24小时、优选7天、更优选1年的一段时间内是贮藏稳定的。
16.如权利要求7-15任一所定义的交联的藻酸盐溶液，其是可注射的。
17.如权利要求13-16任一所定义的交联的藻酸盐溶液，当施用于患者时其中所述溶液在体内形成凝胶。
18.一种制备当对其施加小形变振荡频率时具有等于或大于其粘性响应的弹性响应并显示了以幂律关系存在的剪力减小行为的交联的藻酸盐水溶液的方法，其中所述方法包括步骤：
(a)溶解藻酸钠于水或其他合适的含水缓冲液中；
(b)用合适的交联剂交联步骤(a)中所获得的藻酸盐溶液，其通过添加所述试剂的水溶液同时剧烈搅拌直至获得均一的交联的藻酸盐溶液。
19.如权利要求18所定义的方法，其中所述交联剂选自：钙、铜、铝、镁、锶、钡、锡、锌、铬的盐和有机阳离子、聚(氨基酸)、聚(二甲亚胺)、聚(乙烯胺)、聚(烯丙胺)以及多糖。
20.如权利要求19所定义的方法，其中所述钙盐是葡萄糖酸钙。
21.一种制备当对其施加小形变振荡频率时具有等于或大于其粘性响应的弹性响应并显示了以幂律关系存在的剪力减小行为的交联的藻酸盐水溶液的方法，其中所述方法包括步骤：
(a)溶解藻酸钠于水或其他合适的含水缓冲液中；
(b)用钙离子交联步骤(a)中所获得的藻酸盐溶液，通过添加合适体积的2％(w/v)葡萄糖酸钙溶液同时剧烈搅拌直至获得均一的交联的藻酸盐溶液。
22.一种通过权利要求17-21任一方法所制备的交联的藻酸盐溶液。
23.一种如权利要求1-16和22任一所定义的交联的聚合物溶液，用于促进受损心脏组织的修复和再生。
24.如权利要求23所定义的溶液，其中所述聚合物是藻酸盐。
25.一种组合物，包含作为活性剂的权利要求1-16和22任一的溶液。
26.如权利要求25所定义的组合物，用于促进受损组织的修复和再生。
27.如权利要求25和26任一所定义的组合物，其中所述聚合物是藻酸盐。
28.如权利要求27所定义的组合物，其中所述组织是心脏组织。
29.如权利要求28所定义的组合物，其中所述心脏组织是左心室壁。
30.如权利要求27-29任一所定义的组合物，其中所述损伤选自：心肌梗塞、局部缺血性、中毒性、炎症性或机械性心肌损伤。
31.如权利要求27-30任一所定义的组合物，在预防和/或治疗由心肌损伤、重塑和机能障碍所引起疾病中的应用。
32.如权利要求31所定义的组合物，其中所述疾病选自：左心室重塑、梗塞区伸展、心力衰竭和局部缺血性二尖瓣回流。
33.如权利要求27-30任一所定义的组合物，在治疗折返性心律失常中的应用。
34.如权利要求27-30任一所定义的组合物，在治疗血管发生中的应用。
35.如权利要求27-30任一所定义的组合物，在干细胞趋化性和/或归巢中的应用。
36.如权利要求27-35任一所定义的组合物，其中所述组合物进一步任选地包含附加治疗剂。
37.如权利要求36所定义的组合物，其中所述附加治疗剂选自：抗生素、生长因子、抗炎症药物、激素、抗细胞凋亡药、生长和干细胞刺激因子。
38.如权利要求27-37任一所定义的组合物。进一步包含细胞。
39.如权利要求38所定义的组合物，其中所述细胞是成肌细胞、心肌细胞、成纤维细胞、内皮细胞、祖细胞、干细胞或其他可促进心脏血管发生和再生的合适的细胞的任何之一。
40.如权利要求1-17和23任一所定义的聚合物溶液在制备用于促进受损组织修复和再生的药物组合物中的应用。
41.如权利要求40所定义的应用，其中所述聚合物是藻酸盐。
42.权利要求41的应用，其中所述组织是心脏组织。
43.权利要求42的应用，其中所述心脏组织是左心室壁。
44.权利要求41-43任一的应用，其中所述损伤选自：心肌梗塞、局部缺血性、中毒性、炎症性或机械性心肌损伤。
45.权利要求41-44任一的应用，其中所述组合物进一步任选地包含附加治疗剂。
46.权利要求45的应用，其中所述附加治疗剂选自：抗生素、生长因子、抗炎症药物、激素、抗细胞凋亡药、生长和干细胞刺激因子。
47.如权利要求8-17和22任一所定义的交联的藻酸盐溶液在预防和/或治疗由心肌损伤、重塑和机能障碍所引起疾病中的应用。
48.如权利要求48中所定义的应用，其中所述疾病选自：左心室重塑、梗塞区伸展、心力衰竭和局部缺血性二尖瓣回流。
49.如权利要求8-17和22任一所定义的交联的藻酸盐溶液在治疗折返性心律失常中的应用。
50.如权利要求8-17和22任一所定义的交联的藻酸盐溶液在治疗血管发生中的应用。
51.如权利要求8-17和22任一所定义的交联的藻酸盐溶液在干细胞趋化性中的应用。
52.一种治疗受损组织的方法，包括对需要的患者施用如权利要求1-17和23任一所定义的交联的聚合物溶液或如权利要求25-39任一所定义的组合物。
53.权利要求52的方法，其中所述聚合物是藻酸盐。
54.权利要求53的方法，其中所述组织的心脏组织。
55.一种增强SDF-1表达的方法，包括对需要的患者施用如权利要求8-17和22任一所定义的交联的藻酸盐溶液或如权利要求25-39任一所定义的组合物。
56.一种指导干细胞趋化至受损心脏的方法，包括对需要的患者施用如权利要求8-17和22任一所定义的交联的藻酸盐溶液或如权利要求25-39任一所定义的组合物。
57.一种诱导新血管形成的方法，包括对需要的患者施用如权利要求8-17和22任一所定义的交联的藻酸盐溶液或如权利要求25-39任一所定义的组合物。
58.一种诱导治疗性血管发生的方法，包括对需要的患者施用如权利要求8-17和22任一所定义的交联的藻酸盐溶液或如权利要求25-39任一所定义的组合物。
59.一种预防由心肌损伤、重塑和机能障碍所引起疾病的方法，包括对需要的患者施用如权利要求8-17和22任一所定义的交联的藻酸盐溶液或如权利要求25-39任一所定义的组合物。
60.如权利要求59所定义的方法，其中所述疾病选自：左心室重塑、梗塞区伸展、心力衰竭和局部缺血性二尖瓣回流。
61.一种治疗局灶性或折返性心律失常的方法，包括对需要的患者施用如权利要求8-17和22任一所定义的交联的藻酸盐溶液或如权利要求25-39任一所定义的组合物。
62.一种改善心脏收缩性的方法，包括对需要的患者施用如权利要求8-17和22任一所定义的交联的藻酸盐溶液或如权利要求25-39任一所定义的组合物。
63.一种诱导心脏细胞增殖的方法，包括在体内或体外将所述细胞与如权利要求8-17和22任一所定义的交联的藻酸盐溶液或如权利要求25-39任一所定义的组合物接触。
64.一种用于修复受损组织的试剂盒，包含：
(a)如权利要求1-17和22任一所定义的交联的聚合物溶液，或如权利要求25-39任一所定义的组合物；
(b)用于将交联的聚合物溶液施用于需要的患者的心脏部位的装置；
(c)指导如何使用所述聚合物溶液的手册。
65.如权利要求64所定义的试剂盒，其中所述聚合物是藻酸盐。
66.如权利要求65所定义的试剂盒，其中所述用于施用交联的聚合物溶液的装置可以是任何一种具有18-27G注射针的注射器、任何合适的经皮心脏递药系统，其包括带有导线的心脏递药装置，包括机电定位或MRI引导的导管，以及任何一种被设计通过左心室腔、动脉或静脉冠循环系统以接近心肌的经皮的心脏装置。

Claims (65)

1.一种交联的聚合物水溶液，当对其施加小形变振荡频率时具有等于或大于其粘性响应的弹性响应并显示了以幂律关系存在的剪力减小行为。
2.如权利要求1所定义的溶液，其中所述聚合物可通过共价键、离子键和氢键任何之一交联，从而形成捕捉水分子的结构网络。
3.如权利要求2所定义的溶液，其中所述聚合物通过二价或多价阳离子任何之一交联。
4.如权利要求3所定义的溶液，其中所述阳离子是钙、铜、铝、镁、锶、钡、锡、锌、铬或有机阳离子、聚(氨基酸)、聚(二甲亚胺)、聚(乙烯胺)、聚(烯丙胺)和多糖。
5.如权利要求1-4任一所定义的溶液，其中所述聚合物是水凝胶型聚合物。
6.如权利要求5所定义的溶液，其中所述聚合物是多糖。
7.如权利要求6所定义的溶液，其中所述聚合物是藻酸盐。
8.如权利要求7所定义的交联的藻酸盐溶液，其中所述藻酸盐具有10KDa-300KDa范围的分子量，优选在25KDa-150KDa范围内。
9.如权利要求8所定义的交联的藻酸盐溶液，其中所述溶液通过交联具有牛顿特性的藻酸盐母体溶液得到制备，并在施加小形变振荡频率时具有大于其弹性响应的粘性响应。
10.如权利要求9所定义的交联的藻酸盐溶液，其中所述施加的小形变振荡频率在粘弹性极限内。
11.如权利要求10所定义的交联的藻酸盐溶液，其中所述施加的小形变振荡频率在约0.01-100Hz范围内，优选在0.1-10Hz之间。
12.如权利要求7-11任一所定义的交联的藻酸盐溶液，包含0.1-4％(w/v)交联的藻酸盐。
13.如权利要求7-12任一所定义的交联的藻酸盐溶液，其中所述溶液由于保持了其溶液形式因此是贮藏稳定的，并具有长期可注射性。
14.如权利要求13所定义的交联的藻酸盐溶液，其在至少24小时、优选7天、更优选1年的一段时间内是贮藏稳定的。
15.如权利要求7-14任一所定义的交联的藻酸盐溶液，其是可注射的。
16.如权利要求13-15任一所定义的交联的藻酸盐溶液，当施用于患者时其中所述溶液在体内形成凝胶。
17.一种制备当对其施加小形变振荡频率时具有等于或大于其粘性响应的弹性响应并显示了以幂律关系存在的剪力减小行为的交联的藻酸盐水溶液的方法，其中所述方法包括步骤：
(a)溶解藻酸钠于水或其他合适的含水缓冲液中；
(b)用合适的交联剂交联步骤(a)中所获得的藻酸盐溶液，其通过添加所述试剂的水溶液同时剧烈搅拌直至获得均一的交联的藻酸盐溶液。
18.如权利要求17所定义的方法，其中所述交联剂选自：钙、铜、铝、镁、锶、钡、锡、锌、铬的盐和有机阳离子、聚(氨基酸)、聚(二甲亚胺)、聚(乙烯胺)、聚(烯丙胺)以及多糖。
19.如权利要求18所定义的方法，其中所述钙盐是葡萄糖酸钙。
20.一种制备当对其施加小形变振荡频率时具有等于或大于其粘性响应的弹性响应并显示了以幂律关系存在的剪力减小行为的交联的藻酸盐水溶液的方法，其中所述方法包括步骤：
(a)溶解藻酸钠于水或其他合适的含水缓冲液中；
(b)用钙离子交联步骤(a)中所获得的藻酸盐溶液，通过添加合适体积的2％(w/v)葡萄糖酸钙溶液同时剧烈搅拌直至获得均一的交联的藻酸盐溶液。
21.一种通过权利要求17-20任一方法所制备的交联的藻酸盐溶液。
22.一种如权利要求1-16和21任一所定义的交联的聚合物溶液，用于促进受损心脏组织的修复和再生。
23.如权利要求22所定义的溶液，其中所述聚合物是藻酸盐。
24.一种组合物，包含作为活性剂的权利要求1-16和21任一的溶液。
25.如权利要求24所定义的组合物，用于促进受损组织的修复和再生。
26.如权利要求24和25任一所定义的组合物，其中所述聚合物是藻酸盐。
27.如权利要求26所定义的组合物，其中所述组织是心脏组织。
28.如权利要求27所定义的组合物，其中所述心脏组织是左心室壁。
29.如权利要求26-28任一所定义的组合物，其中所述损伤选自：心肌梗塞、局部缺血性、中毒性、炎症性或机械性心肌损伤。
30.如权利要求26-29任一所定义的组合物，在预防和/或治疗由心肌损伤、重塑和机能障碍所引起疾病中的应用。
31.如权利要求30所定义的组合物，其中所述疾病选自：左心室重塑、梗塞区伸展、心力衰竭和局部缺血性二尖瓣回流。
32.如权利要求26-29任一所定义的组合物，在治疗折返性心律失常中的应用。
33.如权利要求26-29任一所定义的组合物，在治疗血管发生中的应用。
34.如权利要求26-29任一所定义的组合物，在干细胞趋化性和/或归巢中的应用。
35.如权利要求26-34任一所定义的组合物，其中所述组合物进一步任选地包含附加治疗剂。
36.如权利要求35所定义的组合物，其中所述附加治疗剂选自：抗生素、生长因子、抗炎症药物、激素、抗细胞凋亡药、生长和干细胞刺激因子。
37.如权利要求26-36任一所定义的组合物。进一步包含细胞。
38.如权利要求37所定义的组合物，其中所述细胞是成肌细胞、心肌细胞、成纤维细胞、内皮细胞、祖细胞、干细胞或其他可促进心脏血管发生和再生的合适的细胞的任何之一。
39.如权利要求1-16和22任一所定义的聚合物溶液在制备用于促进受损组织修复和再生的药物组合物中的应用。
40.如权利要求39所定义的应用，其中所述聚合物是藻酸盐。
41.权利要求40的应用，其中所述组织是心脏组织。
42.权利要求41的应用，其中所述心脏组织是左心室壁。
43.权利要求40-42任一的应用，其中所述损伤选自：心肌梗塞、局部缺血性、中毒性、炎症性或机械性心肌损伤。
44.权利要求40-43任一的应用，其中所述组合物进一步任选地包含附加治疗剂。
45.权利要求44的应用，其中所述附加治疗剂选自：抗生素、生长因子、抗炎症药物、激素、抗细胞凋亡药、生长和干细胞刺激因子。
46.如权利要求8-17和22任一所定义的交联的藻酸盐溶液在预防和/或治疗由心肌损伤、重塑和机能障碍所引起疾病中的应用。
47.如权利要求47中所定义的应用，其中所述疾病选自：左心室重塑、梗塞区伸展、心力衰竭和局部缺血性二尖瓣回流。
48.如权利要求8-17和22任一所定义的交联的藻酸盐溶液在治疗折返性心律失常中的应用。
49.如权利要求8-17和22任一所定义的交联的藻酸盐溶液在治疗血管发生中的应用。
50.如权利要求8-17和22任一所定义的交联的藻酸盐溶液在干细胞趋化性中的应用。
51.一种治疗受损组织的方法，包括对需要的患者施用如权利要求1-16和22任一所定义的交联的聚合物溶液或如权利要求25-39任一所定义的组合物。
52.权利要求52的方法，其中所述聚合物是藻酸盐。
53.权利要求53的方法，其中所述组织的心脏组织。
54.一种增强SDF-1表达的方法，包括对需要的患者施用如权利要求8-17和22任一所定义的交联的藻酸盐溶液或如权利要求25-39任一所定义的组合物。
55.一种指导干细胞趋化至受损心脏的方法，包括对需要的患者施用如权利要求8-17和22任一所定义的交联的藻酸盐溶液或如权利要求25-39任一所定义的组合物。
56.一种诱导新血管形成的方法，包括对需要的患者施用如权利要求8-17和22任一所定义的交联的藻酸盐溶液或如权利要求25-39任一所定义的组合物。
57.一种诱导治疗性血管发生的方法，包括对需要的患者施用如权利要求8-17和22任一所定义的交联的藻酸盐溶液或如权利要求25-39任一所定义的组合物。
58.一种预防由心肌损伤、重塑和机能障碍所引起疾病的方法，包括对需要的患者施用如权利要求8-17和22任一所定义的交联的藻酸盐溶液或如权利要求25-39任一所定义的组合物。
59.如权利要求58所定义的方法，其中所述疾病选自：左心室重塑、梗塞区伸展、心力衰竭和局部缺血性二尖瓣回流。
60.一种治疗局灶性或折返性心律失常的方法，包括对需要的患者施用如权利要求8-17和22任一所定义的交联的藻酸盐溶液或如权利要求25-39任一所定义的组合物。
61.一种改善心脏收缩性的方法，包括对需要的患者施用如权利要求8-17和22任一所定义的交联的藻酸盐溶液或如权利要求25-39任一所定义的组合物。
62.一种诱导心脏细胞增殖的方法，包括在体内或体外将所述细胞与如权利要求8-17和22任一所定义的交联的藻酸盐溶液或如权利要求25-39任一所定义的组合物接触。
63.一种用于修复受损组织的试剂盒，包含：
(a)如权利要求1-16和21任一所定义的交联的聚合物溶液，或如权利要求24-39任一所定义的组合物；
(b)用于将交联的聚合物溶液施用于需要的患者的心脏部位的装置；
(c)指导如何使用所述聚合物溶液的手册。
64.如权利要求63所定义的试剂盒，其中所述聚合物是藻酸盐。
65.如权利要求64所定义的试剂盒，其中所述用于施用交联的聚合物溶液的装置可以是任何一种具有18-27G注射针的注射器、任何合适的经皮心脏递药系统，其包括带有导线的心脏递药装置，包括机电定位或MRI引导的导管，以及任何一种被设计通过左心室腔、动脉或静脉冠循环系统以接近心肌的经皮的心脏装置。
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