CN1852976B - 结合构建体及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及新的结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白,其特征在于对同源结构的结合结构域,所述的同源结构例如抗原,反受体等,野生型IgG、IgA或IgE铰链-作用区域,即IgE CH2,具有0、1或2个半胱氨酸残基的区域多肽或突变的IgG1铰链区多肽,和免疫球蛋白CH2和CH3结构域,且其能具有ADCC和/或CDC,尽管主要作为形成二硫键-连接的多聚体的能力受损的多肽产生。可以以高表达水平重组生产融合蛋白。另外,提供了有关的组合物和方法,包括细胞表面形式的融合蛋白,和融合蛋白和能编码这样的融合蛋白的多核苷酸的免疫治疗应用。

Description

结合构建体及其使用方法
本申请要求享有优先权的所有申请都在这里整体引作参考。
发明领域
本发明总体上涉及具有多种应用的化合物,所述应用包括在研究、诊断和治疗(例如,免疫治疗)方面的用途。本发明的化合物包括免疫学上有活性的蛋白和蛋白缀合物。这样的蛋白包括重组的或工程化的结合蛋白,例如,结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白,其可以包括单链Fv-免疫球蛋白融合蛋白和含有单链Fv-免疫球蛋白的化合物。本发明还涉及用于治疗能通过施用例如本发明的多肽和/或核酸构建体来改善、减轻或减弱的状况、疾病和障碍的组合物和方法,所述状况、疾病和障碍包括,例如,恶性状况和B细胞障碍,包括特征在于自身抗体生产和/或炎症的疾病。
发明背景
免疫系统是身体的许多错综复杂的系统中最复杂的系统之一。作为由许多不同类型的细胞组成的、且包含许多不同种类的分子的大而复杂的排列,人免疫系统允许身体对外来侵入物(例如细菌、病毒和其他传染物)和异物(例如花粉)进行反应。通常,将人免疫系统分成2大部分,抗体-介导的免疫(也称作“体液的”或“循环的”免疫)和细胞-介导的免疫,二者都由淋巴细胞管理。淋巴细胞是在血液中循环的5类白细胞(白细胞)中的一种。存在几种类型的淋巴细胞,每种都能执行不同的功能。最常见的淋巴细胞类型是B淋巴细胞(B细胞)(负责产生抗体)和T淋巴细胞(T细胞)。免疫系统的细胞不但包括T细胞和B细胞,而且还包括自然杀伤细胞、粒细胞(或多形核(PMN)白细胞)、巨噬细胞和树突细胞。体液系统由B细胞在T细胞的辅助下管理,并且处理身体的血液和组织中的传染物。细胞-介导的系统由T细胞管理,并且处理已经受到感染的身体细胞。
抗原是能刺激或诱导免疫反应的物质,通常是大分子。因为它的复杂的大分子结构,所以单个的微生物由多个抗原组成(例如,表面结构例如细胞壁组分、伞毛、鞭毛等,或细胞外蛋白,例如由微生物生产的毒素或酶)。外壳蛋白和一些动物病毒的包膜蛋白通常也是抗原性的。宿主一般能对接触它的免疫系统组分的抗原特异性地作出反应。抗体-介导的免疫和细胞-介导的免疫系统都包含复杂的相互关系,这使它们能对几乎任何抗原产生免疫反应。换而言之,免疫系统能识别能刺激该系统产生抗体-介导的免疫、细胞-介导的免疫或二者的异物(抗原)。
免疫系统复合体由分散在全身的许多不同的细胞类型和器官组成。它们包括初级和次级淋巴器官。初级淋巴器官是骨髓和胸腺。所有的免疫系统的细胞都在称作血细胞生成的过程中最初地源自骨髓。在血细胞生成的过程中,骨髓-衍生的干细胞分化成免疫系统的成熟细胞(“B”细胞)或能从骨髓迁移出来的细胞的前体,以在胸腺中成熟(“T”细胞)。除了红细胞、血小板和B细胞以外,骨髓也能生产自然杀伤细胞、粒细胞和未成熟的胸腺细胞。胸腺的功能是生产成熟的T细胞。未成熟的胸腺细胞也称作前胸腺细胞,能离开骨髓,并迁移进胸腺,它们在那里成熟,然后释放进血流中。免疫系统复合体也包括次级淋巴器官,例如,脾、淋巴结等,以及从血管分离出来的循环系统。
脾由B细胞、T细胞、巨噬细胞、树突细胞、自然杀伤细胞和红细胞组成,是血液的免疫过滤器。游走巨噬细胞和树突细胞能捕获来自血液的、穿过脾的抗原。游走巨噬细胞和树突细胞也能通过血流将抗原携带到脾中。当巨噬细胞或树突细胞将抗原呈递给适当的B或T细胞,且B细胞被激活并产生大量的抗体时,会在脾中启动免疫反应。
淋巴管和淋巴结是携带淋巴的特殊的循环系统的部分。淋巴是透明流体,其含有白细胞,主要是淋巴细胞。淋巴包围着身体的组织,然后被收集进淋巴管中。淋巴结点缀在淋巴管网络上,且在输入淋巴管将含有抗原的淋巴带进淋巴结中时,淋巴结能起淋巴的免疫过滤器的作用。淋巴结主要由T细胞、B细胞、树突细胞和巨噬细胞组成,能将流体从大部分组织中排出。在淋巴返回循环之前,在淋巴结中将抗原从淋巴中滤出。能捕获抗原的巨噬细胞和树突细胞也将这些异物呈递给淋巴结中的T和B细胞,导致刺激B细胞在这里发育成能分泌抗体的浆细胞。抗体通过排空入血流的输出管离开淋巴结。淋巴细胞也可以通过输出管离开淋巴结,并转移到淋巴系统的其他部位,或进入血液循环。一个淋巴细胞通过循环血液和淋巴系统,每24小时完成一次循环。
扁桃体、腺状体、淋巴集结和附件也是淋巴组织。淋巴集结(淋巴细胞块)类似于扁桃体,且存在于全身,尤其是消化道和呼吸道的粘膜层衬。在淋巴集结和其他淋巴聚集体滤泡中发现的吞噬细胞的功能是,保护身体,例如防止未充分消化的食物颗粒穿过肠壁和进入血液,和攻击意外的外来侵入物,当它们仍然在肠内时。
B细胞的主要功能是,对细菌、病毒和肿瘤细胞的外来蛋白作出响应,生产抗体。通常将T细胞分成2大类,即细胞毒性T淋巴细胞(“Tc”细胞或CTL)和辅助T细胞(“Th”细胞或T辅助细胞)。Th细胞也称作CD4+T细胞,其通过分泌能激活其他白细胞来击退感染的特化因子,起增加或加强免疫反应的作用。它们能增强B细胞生产抗体。Tc细胞也称作CD8+T细胞,可以直接杀伤某些肿瘤细胞、病毒感染的细胞和有些寄生物。Tc细胞对于免疫反应的下调也是重要的。2种类型的T细胞经常依赖于次级淋巴器官(淋巴结和脾),作为发生激活的位点,但是它们也能在其他身体组织中发现,包括肝、肺、血液和肠道和生殖道。
自然杀伤细胞经常称作NK细胞,代表着另一种类型的淋巴细胞,且类似于Tc细胞亚群。它们起效应细胞的作用,其直接杀伤某些肿瘤,例如黑素瘤和淋巴瘤和病毒感染的细胞。它们称作“自然”杀伤细胞,因为与细胞毒性T细胞不同,它们在实现它们的功能之前不需要识别特异性的抗原。尽管NK细胞与Tc细胞不同,无需事先在淋巴器官中激活,就能杀伤它们的靶,但通过Th细胞分泌激活的NK细胞能更有效地杀伤肿瘤或病毒感染的靶。NK细胞能靶向肿瘤细胞,并保护免受许多种类的传染性微生物。在许多免疫缺陷病中,包括AIDS,自然杀伤细胞功能是异常的。自然杀伤细胞还通过分泌高水平的有影响的淋巴因子,有助于免疫调节。
一些NK细胞具有IgG抗体的Fc部分的表面受体(FcγRIII,也称作CD16)。通过已经与靶细胞上的抗原发生反应的抗体的Fc部分的受体,它们能结合靶细胞。这类细胞-介导的免疫称作依赖抗体的细胞介导细胞毒性(ADCC)。NK细胞也具有补体(另一类免疫防御系统)的C3组分的受体,并因此能将包被了C3的细胞识别为靶。认为ADCC是针对许多寄生物感染(例如,由原生动物和蠕虫造成)的重要的防御。
尽管小淋巴细胞看起来相同,但通过在它们的细胞表面上携带的分子,可以区分它们。这样的标记不但能区分B细胞和T细胞,它们还能区分行为不同的细胞的各种亚群。例如,每种成熟的T细胞都携带称作T3(或CD3)的标记。另外,大多数辅助T细胞携带T4(CD4)标记,该分子能识别II类主要组织相容性复合体(“MHC”)抗原。在许多抑制性/细胞毒性T细胞上,发现了称作T8(CD8)的分子,其能识别I类MHC抗原。
另一组白细胞一起称作粒细胞或多形核白细胞(PMN),其由3种细胞类型组成。这些细胞(嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞)对于从身体去除细菌和寄生物是重要的。嗜中性粒细胞通过毛细管壁迁移,并进入感染的组织,它们在那里杀伤侵入物(例如,细菌),然后通过吞噬作用吞没剩余物。嗜酸性粒细胞是细胞毒性的,能将它们的颗粒内含物释放给侵入物。嗜碱性粒细胞能离开血液,并积累在感染或其他炎症部位,并排出它们的颗粒内含物,从而释放出许多介体,例如组胺、血清素、前列腺素和白细胞三烯,它们能例如增加流向该区域的血液。嗜碱性粒细胞释放的介体也在一些变态反应中起重要作用,例如枯草热和对昆虫针刺的过敏反应。
单核细胞是从骨髓释放进血液循环的大吞噬白细胞。当单核细胞进入组织时,它会发育成巨噬细胞。巨噬细胞也是大吞噬细胞,其能吞没进入身体的异物(抗原)以及身体的死亡的和垂死的细胞。巨噬细胞对于免疫反应的调节是重要的,且经常称作清除剂或抗原呈递细胞(APC),因为它们能选择和摄入异物,并将这些抗原呈递给免疫系统的其他细胞,例如T细胞和B细胞。这是启动免疫反应的重要的第一步之一。刺激的巨噬细胞能表现出高水平的吞噬作用,且也能分泌白细胞介素-1(IL-1),后者是能辅助激活B细胞和T细胞的产物。
树突细胞也起源于骨髓,并起APC的功能。它们常见于淋巴器官的结构性隔室中,例如胸腺、淋巴结和脾,但是也见于血流和其他组织。认为树突细胞能捕获抗原,或者将它带到淋巴器官,在那里启动免疫反应。
与宿主对病原微生物的防御和/或免疫有关的免疫系统的重要特征包括特异性、记忆和耐受性。应当理解,例如,抗体或反应性T细胞能与诱导它的形成的抗原特异性地反应;它不与其他抗原反应。通常,该特异性属于与酶-底物特异性或受体-配体特异性相同的量级,尽管交叉反应性也是可能的。通过克隆选择,可以解释免疫反应的特异性。在初级免疫反应过程中,特异性的抗原能选择特异性的淋巴细胞的预先存在的克隆,并刺激它的激活、增殖和分化。还应当明白,一旦免疫系统已经发生响应,以生产特定类型的抗体或反应性T细胞,它就能更迅速地且更大量地生产更多的抗体或激活的T细胞;这称作次级(或记忆)反应。还应当认识到,动物一般不会对它自己的(潜在地-抗原性的)组分进行免疫反应。说该动物是耐受性的,或不能与它自己的潜在地-抗原性的组分反应。这保证了,在正常的条件下,不会发生对“自身”抗原的免疫反应(称作自身免疫反应)。耐受性由许多方式引起,但是本质上免疫系统能将“自身”组分和“非自身”(外来)抗原区分开;它能对“非自身”反应,但是不对“自身”反应。有时,在动物中,耐受性会受到“破坏”,这可能导致自身免疫病。
抗体-介导的和细胞-介导的免疫反应的生物活性是不同的,且随感染类型的不同而异。有几种类型或种类(和不同类型的亚类)的抗体参与了抗体-介导的免疫。由对特异性的抗原反应产生的所有类型的抗体都能与该抗原立体化学地反应,但是不与其他(不同的)抗原这样反应。宿主具有生产针对数千种不同抗原的特异性抗体的遗传能力,但是在存在适当的(特异性的)抗原性的刺激之前不会如此。由于克隆选择,宿主仅仅生产能与该抗原反应的同源抗体,如上所述,其见于血液(血浆)、淋巴和许多血管外的组织中。一旦在B淋巴细胞和抗原相互作用和它们向能分泌抗体的浆细胞分化后,发生抗体-介导的免疫反应,分泌的抗体就会结合抗原,这又导致它的中和或从身体的消除。
另一方面,细胞-介导的免疫由称作效应T细胞的T-淋巴细胞的特定亚群介导,所述的效应T细胞作为“静止的T细胞”(pT细胞)以前体形式存在。这些细胞携带着特异性的抗原的受体,且能识别在其他细胞表面上的这些抗原。该抗原的刺激会导致T细胞激活。T细胞变大,进入有丝分裂周期,繁殖和发育成效应T细胞,其活性负责该类免疫。它们也会发育成称作记忆T细胞的相同反应性T细胞的克隆。如上所述,身体中的大多数T细胞属于2个亚群中的一个,且可以通过它们的表面上存在称作CD4和CD8的2种糖蛋白中的一种还是另一种来区别开。存在这些分子中的哪一种,能决定T细胞可以结合的细胞的类型。携带CD8的T细胞(CD8+T细胞)总能识别与I类MHC蛋白有关的抗原,且一般起细胞毒性T细胞的作用。几乎所有的身体细胞都能表达I类MHC分子。携带CD4的T细胞(CD4+T细胞)总能识别其他细胞表面上的与II类MHC蛋白有关的抗原。只有特化的抗原呈递细胞能表达II类MHC分子,包括树突细胞、吞噬细胞例如巨噬细胞,和B细胞。CD4+T淋巴细胞一般起T辅助细胞的作用。
T辅助细胞包括Th1细胞和Th2细胞,其能对抗原作出响应,同时生产淋巴因子。基于它们的淋巴因子特征,可以区分开Th1和Th2细胞。与所有的T细胞一样,Th细胞源自胸腺。当抗原呈递树突细胞将它们和抗原一起呈递时,它们开始增殖,并变成激活的。有2种类型的树突细胞,DC1细胞(源自单核细胞)和DC2细胞(其似乎源自淋巴细胞)。
当DC1-类树突细胞将抗原呈递给抗原的T细胞受体(TCR)并分泌白细胞介素12(IL-12)时,会生产Th1细胞(炎性的Th1细胞,其参与清除细胞内地存在于泡状隔室中的病原体)。该旁分泌刺激能激活Th1细胞,以分泌它们自己的淋巴因子,尤其是肿瘤坏死因子-β(TNF-β)(也称作淋巴毒素)和干扰素-γ(IFN-γ)。这些淋巴因子能刺激巨噬细胞杀伤它们已经通过吞噬作用吞没的细菌,且它们将其他白细胞召集到产生炎症的部位。Th1细胞对于细胞-介导的免疫和控制细胞内的病原体(例如利斯特氏菌属(Listeria)和结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis))是必需的。
当DC2-类树突细胞将抗原呈递给抗原的T细胞受体和推测地一种或多种旁分泌刺激物时,会生产Th2细胞(“真正的”辅助Th2细胞,它是B细胞生产抗体所必需的)。Th2细胞分泌的主要淋巴因子是白细胞介素4(IL-4),其能刺激B细胞中的类别-转换,并促进它们的IgE抗体合成,起能促进更多的前-Th细胞进入Th2途径的正反馈装置的作用,和阻断IL-12受体的表达,从而抑制胸腺中的前-Th细胞进入Th1途径。IL-4也能造成B细胞增殖和分化成能分泌抗体的浆细胞和记忆B细胞。IL-4仅仅能激活附近的它们自己已经结合了抗原的B细胞,而不激活其他的,从而维持免疫反应的特异性。Th2细胞也能生产白细胞介素5(IL-5,其能吸引和激活嗜酸性粒细胞)、白细胞介素10(IL-10,其能抑制DC生产IL-12,和阻止前-Th细胞向Th1细胞的成熟)和白细胞介素13(IL-13,其也能促进IgE抗体的合成)。
Th2细胞的激活也会使它开始生产白细胞介素2(IL-2),并表达IL-2的膜受体。分泌的IL-2能自体刺激Th2细胞的增殖。例如,IL-2能结合其他T细胞(其已经结合了抗原)上的IL-2受体,并刺激它们的增殖。除了IL-2以外,刺激的Th2细胞也能生产IFN-γ和白细胞介素6(IL-6),它们能介导免疫反应的不同方面。IFN-γ能激活自然杀伤细胞至它们的完全的细胞溶解潜力,且是巨噬细胞的激活剂,并从而增强它们的抗肿瘤活性。如果巨噬细胞被细胞内的寄生物感染,则它会激活巨噬细胞,这又会破坏寄生物。IFN-γ也能增强细胞毒性淋巴细胞的抗肿瘤活性,增强NK-细胞的非特异性的活性,且是控制B细胞的分化和增加免疫球蛋白的分泌的因素之一。IL-6能刺激几种类型的白细胞,以及急性期蛋白在肝中的生产。在诱导B细胞分化成抗体形成(浆)细胞时,它是特别重要的。因而,Th2细胞能为B细胞提供帮助,且是抗体-介导的免疫所必需的。
细胞毒性T淋巴细胞能杀伤在它们的表面上表现出新的或外来的抗原的细胞(例如,病毒感染的细胞,或肿瘤细胞,或移植的组织细胞)。CD8+CTL也分成2个亚群:Tc1,它类似于Th1细胞,能分泌IFN-γ,和Tc2,它类似于Th2细胞,能分泌IL-4。
细胞-介导的免疫反应也在肿瘤细胞的破坏和组织移植物在动物中的排斥方面起作用。组织移植的主要问题是排斥,这经常是基于对“外来”细胞的细胞-介导的免疫反应的(因为它们不是完美的抗原性匹配)。因为肿瘤细胞含有在正常细胞中不会出现的特异性的抗原,所以它们也可以被识别为外来物,并被细胞-介导的免疫所破坏。如果肿瘤细胞在动物中在规则的基础上发育,那么细胞-介导的免疫能消除它们或者抑制它们。随着年龄的增加,人类中的许多类型的癌症(肿瘤)的发生率的增加,可能与在约25岁年龄时发生的免疫系统的最高效率的下降有关。
下面总结了参与表达细胞-介导的免疫的细胞类型。Tc淋巴细胞能杀伤在表面上携带与I类MHC结合的外来抗原的细胞,且可以杀伤携带细胞内的寄生物(细菌或病毒)的细胞,只要感染的细胞能在它的表面上表现出微生物抗原。Tc细胞能杀伤肿瘤细胞,且是排斥移植的细胞的原因。Tc细胞能识别靶细胞上的抗原-I类MHC复合物,接触它们,并将颗粒内含物直接释放进靶细胞膜中,其裂解细胞。Th淋巴细胞能生产淋巴因子,后者是B细胞发育成能分泌抗体的浆细胞的“辅助”因子。它们也能生产某些淋巴因子,后者能刺激效应T淋巴细胞的分化和巨噬细胞的活性。Th1细胞能识别与II类MHC有关的巨噬细胞上的抗原,且变成激活的(通过IL-1),以生产淋巴因子,包括能激活巨噬细胞和NK细胞的IFN-γ。这些细胞能介导细胞-介导的免疫反应的各个方面,包括迟发型超敏反应。Th2细胞能识别APC上的与II类MHC有关的抗原,然后生产白细胞介素和能刺激特异性的B细胞和T细胞增殖和活性的其他物质。巨噬细胞作为抗原呈递细胞是重要的,其能启动T细胞相互作用、发育和增殖。巨噬细胞也参与表达细胞-介导的免疫,因为它们能通过细胞-介导的免疫反应中生产的IFN-γ变成激活的。激活的巨噬细胞具有增加的吞噬潜力,并能释放出可溶的物质,后者能造成炎症和破坏许多细菌和其他的细胞。自然杀伤细胞是细胞毒性的细胞,其能溶解携带新抗原的细胞,无论它们的MHC类型,且甚至能溶解一些不携带MHC蛋白的细胞。通过它们的杀伤表现出外来抗原的细胞(例如,肿瘤细胞)的能力来定义NK细胞,而无论MHC类型,也无论以前的对抗原的敏化(暴露)。NK细胞可以被IL-2和IFN-γ激活,并以与细胞毒性T淋巴细胞相同的方式溶解细胞。一些NK细胞具有IgG抗体的Fc结构域的受体,因而能结合靶细胞表面上的IgG的Fc部分,并释放细胞溶解组分,后者能通过依赖抗体的细胞介导细胞毒性杀伤靶细胞。
已经将能影响细胞增殖和分化的细胞外的因子定义为细胞因子。这包括淋巴因子,它是由T-淋巴细胞生产的蛋白,其对参与表达细胞-介导的免疫的各种细胞的分化、增殖和活性有影响。通常,淋巴因子通过下述方式起作用:(1)将循环白细胞和淋巴细胞聚集进免疫遭遇部位;(2)刺激B细胞和T细胞的发育和增殖;(3)为它们的吞噬任务,刺激和准备巨噬细胞;(4)刺激自然杀伤细胞;和(5)提供抗病毒的盖和活性。下面总结了多种重要的淋巴因子。首先提到的是淋巴细胞激活因子,IL-1主要是巨噬细胞的产物,且对各种类型的细胞具有不同的作用。它起T细胞和B细胞的生长调节剂的作用,且能诱导其他的细胞例如肝细胞生产与宿主防御有关的蛋白。IL-1能形成嗜中性粒细胞的趋化梯度,且起能产生发热的内源性致热原的作用。因而,IL-1在免疫反应和炎性反应中都起重要作用。IL-2能刺激T细胞的增殖,并激活NK细胞。IL-3能调节干细胞的增殖和肥大细胞的分化。IL-4能造成B细胞增殖和增强的抗体合成。IL-6(也称作干扰素-β2、杂交瘤生长因子、B-细胞分化因子和肝细胞刺激因子)对B细胞分化和抗体生产和T细胞激活、生长和分化有作用,且可能在感染或损伤启动的炎性和免疫反应的介导中有主要作用。IL-8是嗜中性粒细胞的趋化引诱剂。IL-13具有许多IL-4的性质,且是炎性和免疫反应的有效调节剂。IFN-γ由T细胞生成,可以认为是淋巴因子。它有时称作“免疫干扰素”(干扰素-α被称作“白细胞干扰素”,而干扰素-β被称作“成纤维细胞干扰素”)。IFN-γ具有几种抗病毒作用,包括抑制感染的细胞中的病毒蛋白合成。它也能激活巨噬细胞和NK细胞,并刺激IL-1、IL-2和抗体生产。淋巴毒素包括肿瘤坏死因子。T细胞能生产TNF-β,而TNF-α由T细胞以及其他类型的细胞生产。TNF能起杀伤细胞包括肿瘤细胞(在一定的距离内)的作用。存在几种集落刺激因子(CSF),包括粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF),其能造成所有类型的吞噬的白细胞分化和分裂。
相当好地理解了B细胞和T细胞上的抗原膜受体的性质。每个B细胞具有大约105个膜-结合的抗体分子(IgD或IgM),它们对应着对细胞进行编程生产的抗体的特异性(这些受体被称作BCR)。B细胞上的CD32(FcγRII)是IgG的Fc区的受体。B细胞上的CD21和CD35是补体组分的受体。每个T细胞具有约105个分子的暴露于它的表面上的特异性的抗原-结合T细胞受体(TCR)。TCR类似于、但是不等于抗体。存在2种类型的T细胞,它们在它们的TCR上存在差异,即α/β(αβ)T细胞和γ/δ(γδ)T细胞。α/βT细胞的TCR能结合抗原呈递细胞表面上的I类MHC分子显示的双分子复合物。如上所述,大部分Th细胞能表达CD4,而大多数Tc细胞能表达CD8。
BCR和TCR是类似的,因为它们是整合的膜蛋白,它们以暴露于细胞表面的数千个相同的拷贝存在,它们在细胞遇到抗原之前产生,它们由重组DNA片段装配的基因编码,它们具有独特的结合位点,其能通过非共价力结合称作表位(或抗原决定簇)的抗原部分,这依赖于受体表面和表位表面的互补性和抗原受体与表位的成功结合,如果伴有其他的信号,能刺激细胞离开G0并进入细胞周期和重复的有丝分裂,这会导致携带相同抗原受体的细胞克隆(即相同特异性的细胞克隆)的发育。BCR和TCR的不同之处在于:它们的结构,编码它们的基因,和它们结合的表位的类型。
当抗原穿透上皮表面时,开始诱导初级免疫反应。它最终会接触巨噬细胞或某些其他的类型的抗原呈递细胞,包括B细胞、单核细胞、树突细胞、朗格汉斯细胞和内皮细胞。抗原,例如细菌细胞,通过胞吞作用被内在化,并被APC“加工”,然后“呈递”给免疫活性的淋巴细胞,以启动免疫反应的早期步骤。巨噬细胞的加工(例如),能使抗原性的材料附着到与细胞表面上的与I I类MHC分子有关的膜表面上。抗原-II类MHC复合物被呈递给T-辅助(Th2)细胞,后者能识别与巨噬细胞膜上的II类MHC分子有关的加工的抗原。该相互作用,与巨噬细胞分泌的IL-1的刺激一起,将激活Th2细胞。
如上所述,B细胞自身起APC的作用。结合到B细胞表面上的抗体受体的交联抗原能造成一些抗原的内在化和与II类MHC分子一起在B细胞膜上的表达。Th2细胞能识别与II类MHC分子在一起的抗原,并分泌各种淋巴因子,后者能激活B细胞,以使其变成能分泌抗体的浆细胞和记忆B细胞。即使抗原不能交联受体,它也能被B细胞胞吞,加工,并返回与II类MHC有关的表面,它在那里可以被特异性的Th2细胞识别,后者会变成激活的,以启动B细胞分化和增殖。在所有情况下,总的B细胞反应会导致抗体-介导的免疫。
认为B细胞表面上的抗原受体是特定类型的抗体,它们是细胞被遗传地编程生成的。因而,存在数千种B细胞亚群,其通过它们生产独特的抗体分子的能力进行区别。B细胞也可以与巨噬细胞表面上的同源抗原反应,或与可溶的抗原反应。当B细胞结合抗原,且同时受到附近的Th2细胞生产的IL-4的刺激时,刺激B细胞生长和分裂,以形成相同的B细胞的克隆,其每个都能生产相同的抗体分子。激活的B细胞进一步分化成浆细胞,后者能合成和分泌大量的抗体,并分化成记忆B细胞。浆细胞生产和分泌的抗体能与诱导它们形成的同源抗原特异性地反应。许多这样的反应会导致宿主防御,并预防被病原体再感染。记忆细胞在次级免疫反应中起作用。浆细胞相对地寿命较短(约1周),但是在该阶段能生产大量的抗体。另一方面,记忆细胞相对地寿命较长,且在随后向抗原暴露后,它们能迅速转化成能生产抗体的浆细胞。
当例如细胞毒性T细胞识别出加工的与细胞(通常是改变的自身细胞,但是可能是移植的组织细胞或真核的寄生物)膜上的I类MHC有关的抗原时,开始产生细胞介导的免疫。在Th2细胞生产的IL-2的刺激下,Tc细胞变成激活的,以变成细胞毒性T淋巴细胞,后者能溶解在它们的表面上表现出新的外来抗原的细胞,这是细胞-介导的免疫的主要表现。抗原呈递巨噬细胞和Th细胞之间的相互作用,会刺激巨噬细胞生产和分泌白细胞介素-1,其局部地作用于Th细胞,从而刺激Th-细胞分化和生产它自己的细胞因子(其在这里可以称作淋巴因子,因为它们源自淋巴细胞)。这些淋巴因子具有各种功能。IL-4对附近的B细胞具有即时效应。IL-2对如上所述的T细胞具有即时效应。
白细胞也能表达粘附-促进性受体,其能介导细胞-细胞和细胞-基质相互作用。这些粘附相互作用对于造血和胸腺细胞成熟的调节、白细胞穿过组织的运输和迁移的指导和控制和免疫的和非免疫的炎性反应的发展是至关重要的。已经鉴别出了几个家族的粘附受体。白细胞整联蛋白家族包含3种α-β异二聚体膜糖蛋白,它们具有共同的β亚基,称作CD18。3种成员中的每个的α亚基,淋巴细胞功能有关的抗原-1(LFA-1),巨噬细胞抗原-1(Mac-1)和p150,分别称作CD11a、b和c。这些粘附分子在白细胞的免疫和炎性反应中起关键作用。白细胞整联蛋白家族又是整联蛋白超家族的一部分,它的成员是进化上、结构上和功能上相关的。在白细胞上发现的另一个整联蛋白亚族是VLA群,这样称呼的原因是,最初发现“非常晚的激活抗原”VLA-1和VLA-2在T-细胞激活的晚期出现。该家族的成员主要起细胞外的基质粘附受体的作用,且在造血的和非-造血的细胞上都能发现。它们在多种细胞功能中起作用,包括组织结构、淋巴细胞再循环和T-细胞免疫反应。另一个整联蛋白亚族(细胞粘附素(cytoadhesin))是血小板和内皮细胞上的受体,其能结合细胞外的基质蛋白。粘附受体的第二个家族是免疫球蛋白超家族,其成员包括CD2、LFA-3和ICAM-1,其参与T-细胞粘附相互作用,和T和B细胞的抗原-特异性的受体,CD4,CD8,和MHC I和II类分子。另一个识别出的粘附受体家族是选择蛋白,其特征在于共同的凝集素结构域。白细胞粘附分子-1(LAM-1)是鼠归巢受体MEL-14的人同系物,在白细胞上表达,而内皮白细胞粘附分子-1(ELAM-1)和颗粒膜蛋白(GMP-140)是在受刺激的内皮细胞和激活的血小板上表达的。
除了细胞因子以外,免疫反应的激活需要物理的细胞-细胞接触。因而,例如,B和T细胞前体的发育需要和基质细胞的亲密接触。免疫反应的产生,需要至少3个关键的细胞-细胞接触事件。第1种是特异性的抗原和原初T细胞的初期接触。因为MHC呈递的需要,所以这是专性的细胞接触事件。在正常的情形下,关键的抗原呈递细胞是树突细胞。除了MHC/肽-TCR相互作用外,存在其他的非-抗原特异性的膜结合的配体-受体对,其对于树突细胞-T细胞相互作用是重要的。基本的一点是,T细胞上的CD28分子与树突细胞上的2种配体B7.1(CD80)和B7.2(CD86)的每一种的关联。这些分子称作附属分子,且应当理解,CD28分子能送递基本的二级信号给T细胞,没有该信号时,T细胞不能变成激活的。
第2种基本的细胞-细胞接触是在激活的T细胞和抗原-特异性的B细胞之间的。大部分抗原是T细胞-依赖性的,也就是说,抗体对抗原的响应,绝对需要T细胞辅助。该辅助由细胞因子和细胞-细胞接触送递。细胞通过表面Ig结合特异性的抗原,然后内在化,加工,和将它呈递给II类MHC分子。这使得它们能被对来自特异性的抗原的辅助表位特异性的T细胞识别。该细胞-细胞相互作用也需要结合到B细胞上的B7的CD28。另外,称作CD40配体或CD154的分子(其表达由T细胞激活诱导)能结合B细胞上的CD40。CD40交联能促进B细胞增殖,预防生发中心B细胞的凋亡,并促进免疫球蛋白同种型转换。CD28-B7和CD40-CD40L受体配体相互作用都是B和T细胞之间的对话所必需的,这能造成它们的相互的激活。
免疫反应必需的第3种细胞-细胞相互作用是,激活的B细胞(其已经迁移进称作生发中心的淋巴器官的特化结构中)与滤泡树突细胞(FDC)的结合。FDC是特化的基质细胞,其能将完整的(即未加工的)抗原以长寿的免疫复合物的形式保持在它们的表面上。在其他的分子中,FDC能表达CD23,其能通过CR2受体结合生发中心B细胞,并刺激分化成浆细胞。
在初级免疫反应有效地作为宿主防御之前,需要时间。抗原必须被APC识别、摄入、消化、加工和呈递。少数选择Th细胞必须与抗原反应,并响应;预先存在的B或T淋巴细胞必须遇到抗原,并增殖和分化成效应细胞(浆细胞或Tc细胞)。在抗体-介导的免疫的情况下,抗体水平必须增加到有效的生理浓度,以提供它的宿主抗性。可能需要几天或几周来达到有效的免疫水平,即使该免疫可能持续许多个月、或许多年甚至终生,这是由于抗体的存在。在自然感染中,接种物是小的,且即使抗原性的刺激在微生物复制的过程中增加,在前几天中也只能形成小量的抗体,且在感染后约1周之前,不能检出循环抗体。
关于次级免疫反应的诱导,应当理解,在重新暴露于微生物抗原(向抗原的二次暴露)时,存在加速的免疫反应,即次级或记忆反应。仅仅在1-2天中,就形成了大量的抗体。这是由于在初级免疫反应过程中形成的特异性的记忆B细胞或记忆T细胞的活性。当受到同源抗原的刺激时,这些记忆细胞能“记忆”以前看到的抗原,并能迅速地分裂和分化成效应细胞。刺激记忆细胞迅速产生非常高(有效的)水平的持续性循环抗体,是给人和宠物施用“加强”-类疫苗接种的基础。因而,在首次暴露于抗原后,免疫反应(例如,由血清中的特异性的抗体的浓度所证实的)会在几天中逐渐发展,在2-3周内达到较低的平台,并通常在相对较短的时间段内,开始下降。当第二次遇到该抗原时,次级(记忆)反应会造成抗体浓度的迅速升高,从而达到更高的血清水平,这可能持续相对更长的时间段。通过单独的初次暴露,可以达到抗体的保护水平,但是,通常为了确保能持续长时间段的高水平的保护抗体,必须具有免疫系统的重复的抗原刺激。
免疫球蛋白分子(缩写为Ig)是由两条相同的轻链多肽和两条相同的重链多肽(H2L2)组成的多聚蛋白,它们通过链间二硫键(即相邻的半胱氨酸残基的巯基之间的共价键)连接成大分子复合物。存在不同种类的人抗体蛋白,其中的每一类都由浆细胞的特定克隆产生。在它们的重链组成的基础上,定义了5类人免疫球蛋白,并称作IgG、IgM、IgA、IgE和IgD。IgG-类和IgA-类抗体还分成亚类,即IgG1、IgG2、IgG3和IgG4和IgA1和IgA2。链内二硫键能连接同一多肽链的不同区域,这导致形成环,该环与邻近的氨基酸一起构成免疫球蛋白结构域。在氨基-末端部分(也称作“NH2-末端”或“N-末端”),每条轻链和每条重链具有单个可变区,该区表现出抗体之间氨基酸组成的很大变异。轻链可变区VL与重链可变区VH缔合,形成免疫球蛋白的抗原结合部位,称作Fv。
除了可变区以外,每个抗体链具有一个或多个恒定区。轻链具有单个恒定区结构域,因而,轻链具有一个可变区和一个恒定区。重链有几个恒定区结构域。IgG、IgA和IgD抗体中的重链具有三个恒定区结构域,称为CH1、CH2和CH3,而IgM和IgE抗体中的重链具有四个恒定区结构域,CH1、CH2、CH3和CH4。因而,重链具有一个可变区和三个或四个恒定区。免疫球蛋白结构和功能的综述参见,例如,Harlow等,编,Antibodies:A Laboratory Manual,Chapter 14,ColdSpring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor(1988)。
免疫球蛋白的重链可以分为三个功能区:Fd区(该片段包含VH和CH1,即重链的2个N-末端结构域)、铰链区和Fc区(“可结晶段”区,源自恒定区,且在胃蛋白酶消化后形成)。Fd区与轻链组合形成Fab(“抗原结合片段”)。因为抗原能与每个Fab的氨基末端处的抗原-结合区立体化学地反应,所以IgG分子是二价的,即,它可以结合2个抗原分子。Fc含有能与细胞上的免疫球蛋白受体和补体级联的初始元件相互作用的结构域。因而,一般认为Fc片段负责免疫球蛋白的效应子功能,例如,补体固定和结合Fc受体。胃蛋白酶有时也在重链的第3个恒定结构域(CH3)之前剪切,以产生大片段F(abc)和小片段pFcb。这些术语也用于其他免疫球蛋白的类似区域。在IgG、I gA和IgD类抗体中发现的铰链区作为柔性的间隔臂起作用,允许Fab部分在空间上自由移动。与恒定区相反,铰链结构域的结构多样,各类和亚类的免疫球蛋白之间的序列和长度都有变化。
例如,在IgG亚类中,铰链区的长度和柔性都有变化。据报道,IgG1的铰链区包含氨基酸216-231,且因为它是可自由变形的,所以Fab片段可以绕着它们的对称轴旋转,并在以2个重链间二硫键中的第一个为中心的球体内移动。IgG2具有比IgG1更短的铰链,据报道有12个氨基酸残基,和4个二硫键。IgG2的铰链区缺少甘氨酸残基,它相对更短,且含有刚性的聚脯氨酸双螺旋,其通过外部的重链间二硫键稳定化。这些性质能限制IgG2分子的柔性。IgG3与其他亚类的差别在于它的独特的延伸的铰链区(其长度约是IgG1铰链的4倍),且据报道含有62个氨基酸(包括21个脯氨酸和11个半胱氨酸),从而形成非柔性的聚脯氨酸双螺旋。在IgG3中,Fab片段相对远离Fc片段,从而给分子提供更大的柔性。IgG3中的伸长的铰链也是它与其他亚类相比更高的分子量的原因。IgG4的铰链区短于IgG1的,且它的柔性介于IgG1和IgG2之间。据报道,铰链区的柔性以IgG3>IgG1>IgG4>IgG2的次序降低。4个IgG亚类彼此的差异还在于它们的效应子功能。该差异与结构上的不同有关,包括可变区、Fab片段和恒定的Fc片段之间的相互作用。然而,除了例如,CH2区域内的糖基化作用外,且尽管有该知识,但没有关于改变这些亚类的分子的特征(包括序列)的措施或方法的规则或惯例,以改变、控制、添加或去除不同的功能,例如,ADCC、CDC和其他的功能。
根据结晶学研究,免疫球蛋白铰链区可进一步根据功能细分为三个区:上铰链区、核心区和下铰链区。Shin等,1992ImmunologicalReviews 130:87。上铰链区包含CH1的羧基端的氨基酸至能限制运动的铰链的第一个残基,一般是第一个半胱氨酸残基,它在两条重链之间形成链间二硫键。上铰链区的长度与抗体的片段柔性相关。核心铰链区含有重链间二硫键,且下铰链区连接CH2结构域的氨基末端,并且包含CH2中的残基。同前。人IgG1的核心铰链区含有序列Cys-Pro-Pro-Cys(SEQ ID NO:515),当通过二硫键形成而二聚化时,该序列形成一个环状八肽,认为该八肽作为一个轴起作用,由此赋予柔性。铰链区也可以含有一个或多个糖基化作用位点,这包括许多结构上不同类型的碳水化合物附着位点。例如,IgA1在铰链区的17个氨基酸的片段中含有5个糖基化作用位点,它们赋予了铰链区多肽对肠蛋白酶的抗性,这被认为是分泌性免疫球蛋白的有利性质。
免疫球蛋白铰链区多肽序列的结构和柔性所允许的构象改变也可以影响抗体的Fc部分的效应子功能。与Fc区相关的效应子功能的三个大类包括(1)激活经典的补体级联,(2)与效应细胞相互作用,和(3)免疫球蛋白的区室化。不同的人IgG亚类在它们固定补体或激活和扩增补体级联的步骤的相对效力方面有所不同。参见,例如,Kirschfink,2001 Immunol.Rev.180:177;Chakraborti等,2000Cell Signal 12:607;Kohl等,1999Mol.Immunol.36:893;Marsh等,1999 Curr.Opin.Nephrol.Hypertens.8:557;Speth等,1999Wien Klin.Wochenschr.111:378。
认为依赖补体的细胞毒性(CDC)是清除特定的靶细胞例如肿瘤细胞的主要机制。CDC是由一系列酶组成的事件串,这些酶以级联方式彼此激活。补体在清除抗原中起重要作用,这通过它的4个主要功能来实现:(1)局部的血管舒张;(2)免疫细胞、尤其是吞噬细胞的吸引(趋化性);(3)为吞噬作用标记外来生物(调理作用);和(4)膜攻击复合物对侵入的生物的破坏(MAC攻击)。中心分子是C 3蛋白。它是能被经典途径或替代途径的组分切成2个片段的酶。抗体,尤其是IgG和IgM,能诱导经典途径,而替代途径能被细菌的产物(如脂多糖(LPS))非特异性地刺激。简而言之,C3切开的产物包括小肽C3a,它对于吞噬免疫细胞是趋化性的,且通过造成C5a片段从C5的释放,导致局部的血管舒张。C3的其他部分(C3b)包被着外来生物表面上的抗原,并起调理生物以进行破坏的作用。C3b也能与补体系统的其他组分反应,以形成由C5b、C6、C7、C8和C9组成的MAC。
一般说来,IgG1和IgG3能最有效地固定补体,IgG2效力较低,且IgG4不激活补体。补体激活是由C1q与抗原-抗体复合物的结合启动的,所述C1q是级联中的第一个组分C1的亚基。尽管C1q的结合位点位于抗体的CH2结构域,但铰链区会影响抗体激活级联的能力。例如,据报道缺乏铰链区的重组免疫球蛋白不能激活补体。Shin等,1992。如果没有铰链区所赋予的柔性,那么与抗原结合的抗体的Fab部分可能不能采用允许C1q与CH2结合所需的构象。见同前。已报道铰链长度和片段柔性与补体激活相关联;然而,该关联不是绝对的。具有与IgG4相同的刚性的改变的铰链区的人IgG3分子例如仍然可以有效地激活该级联。
铰链区的不存在(或功能铰链区的缺乏)也可以影响某些人IgG免疫球蛋白结合免疫效应细胞上的Fc受体的能力。免疫球蛋白与Fc受体的结合,能促进依赖抗体的细胞介导细胞毒性,如上所述,它被推定为消除肿瘤细胞的重要机制。人IgG Fc受体(FcR)家族被分为三组,即,能够以高亲和力结合IgG的FcγRI(CD64)、都是低亲和力受体的FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)。还没有精确确定三种受体中的每一种和免疫球蛋白之间的分子相互作用,但实验表明,CH2结构域的铰链近端区中的残基对抗体和Fc受体之间的相互作用的特异性是重要的。据报道,IgG1骨髓瘤蛋白和缺乏铰链区的重组IgG3嵌合抗体不能结合FcγRI,这很可能是因为对CH2的可接近性减少。Shin等,1993Intern.Rev.Immunol.10:177,178-79。
在骆驼科动物(camelids)(骆驼、单峰骆驼和美洲驼;Hamers-Casterman等,1993Nature 363:446;Nguyen等,1998J..Mol.Biol 275:413)、铰口鲨(Roux等,1998 Proc.Nat.Acad.Sci.USA95:11804)和有斑点的银鲛(Nguyen,等,“Heavy-Chain antibodies inCamelidae;a case of evolutionary innovation,”2002Immunogenetics 54(1):39-47)中发现的免疫球蛋白的一些同种型中,发生了常规抗体的H2L2结构的不正常的和显然地进化上无关的例外。这些抗体显然可以仅仅使用重链可变区形成抗原-结合区,即这些功能抗体是仅仅重链的同型二聚体(称作“重链抗体”或“HCAb”)。在2个物种中,这些可变区经常含有延长的第3个互补性决定区(CDR3),其可以帮助补偿轻链可变区的缺乏,且在CDR区之间经常存在二硫键,推测其有助于稳定结合位点。Muyldermans等,1994 Prot.Engineer.7:1129;Roux等,1998。但是,不知道只有重链的“抗体”的准确功能,且尚未鉴别出导致它们的形成的进化压力。参见,例如,Nguyen,等,2002,同上。骆驼科动物,包括骆驼、美洲驼和羊驼,也能表达常规的H2L2抗体,且因此只有重链的抗体似乎不简单地作为替代抗体结构存在于这些动物中。
骆驼科动物只有重链的免疫球蛋白的可变区(VHH)和常规的(H2L2)重链可变区含有氨基酸差异,包括可能参与常规的VH和VL结构域之间的界面的几个位置处的差异。Nguyen等,1998 J.Mol.Biol275:413;Muyldermans等,1994 Prot.Efagineer.7:1129。据报道,骆驼科动物VHH能与IgG2和IgG3恒定区重组,后者含有铰链、CH2和CH3结构域,且缺乏CH1结构域。Hamers-Casterman等,1993Nature 363:446。有趣地是,VHH是由不同于VH基因座的染色体基因座编码的(Nguyen等,1998,同上),表明骆驼科动物B细胞具有进化的复杂的抗原识别和分化机制。因而,例如,美洲驼IgG1是常规的(H2L2)抗体同种型,其中VH能与恒定区重组,后者含有铰链、CH1、CH2和CH3结构域,而美洲驼IgG2和IgG3是只有重链的同种型,其缺乏CH1结构域,且不含有轻链。
免疫球蛋白种类具有不同的物理和化学特征,且它们能表现出独特的生物学性质。在免疫反应过程中和/或在感染过程中,在不同的阶段和以不同的速度,发生它们的合成。它们在宿主抗性(免疫)中的重要性和功能是不同的。
免疫球蛋白G(IgG)是一种分子量为约150,000道尔顿(150kD)的蛋白,是血清中的主要Ig。在任意给定的时间,它占在动物中发现的总抗体的约80%,总血清抗体的75%。它可以从血流扩散进血管外空间,且是在那里发现的最常见的Ig。在炎症过程中,它在组织液中的浓度会增加,且在中和细菌的细胞外毒素和病毒时,它是特别有效的。它还具有调理能力和补体-固定能力。无论抗体特异性如何,所有IgG1抗体分子的Fc区的多肽组成都是相对恒定的;但是,如上所述,根据它们的抗原特异性,Fab区总是在它们的准确氨基酸序列上存在差异。该分子的Fc部分的特异性的氨基酸区域能被吞噬细胞和某些其他细胞上的受体识别,且Fc结构域含有肽区域,后者能结合和激活补体,这经常是表现抗体-介导的免疫所需的。因为IgG分子是二价的,所以它可以交联抗原分子,这可以导致抗原的沉淀或凝集;如果IgG结合在微生物细胞或表面上的抗原,则它的Fc区可以提供外在的配体,后者可以被吞噬细胞上的特异性的受体识别。对于吞噬作用,调理了包被了IgG分子的微生物细胞或病毒,且与它们的未-调理的对应物相比,调理的病原体能更容易地被吞噬细胞摄入和破坏。IgG以及IgM和IgA能中和毒素的活性,包括细菌外毒素。另外,细胞表面上的交联的IgG分子可以结合和激活来自血清的补体,并启动可以导致细胞的破坏的反应级联。
IgM是在感染过程中出现在血流中的第一种免疫球蛋白。它主要限于血流,并提供针对血液-传播的病原体的保护。IgM占约10%血清免疫球蛋白,且排列装配成通过它们的Fc结构域连接到一起的5个免疫球蛋白分子的五聚体(具有约900kD的分子量)。除了单体亚基之间的共价连接外,五聚体能被称作J链的15kd多肽稳定化。因此,IgM具有理论上的十“价”(即,它具有10个暴露的Fab结构域)。鉴于它凝集颗粒抗原的效率,IgM的最重要的作用可能是,它在针对血液-传播的病原体的免疫反应早期发挥作用的能力。IgM也能强烈地结合补体,且结合到微生物表面上的IgM抗体能起调理素的作用,从而使微生物对吞噬作用更易感。在存在补体和IgM时,能杀伤和溶解整个的微生物细胞。如上所述,IgM也作为跨膜单体出现在成熟的B细胞的表面上,它在那里起抗原受体的作用,当结合抗原时,能激活B细胞。
在淋巴发育过程中,免疫球蛋白基因座的基因重排会产生能表达多种抗原受体的B淋巴细胞谱。由重排-活化基因(“RAG”)重组酶催化的基因重排能整合免疫球蛋白V、D和J基因片段,以产生有效重排的免疫球蛋白基因,后者能编码IgM抗体的重链和轻链。该初级谱中的IgM抗体的多样性,是通过组合机制(在特定抗体中使用的V、D和J基因片段的选择)以及连接多样性实现的。V、D和J基因片段的连接稍微有些不精确,且核苷酸可以以非模板的方式插入该连接中。因此,在V-D-J边界,存在非常高程度的得到的多样性。这非常有助于抗体的第3个互补性决定区的结构多样性,该区域经常在抗原识别中起关键作用。该IgM抗体的初级谱包含几百万种不同的结构。该谱的大小意味着,任何进入的抗原都可能遇到能以可接受的亲和力识别它的抗体。对于大多数进入的抗原,不可能得到高-亲和力的结合位点(谱不是足够大),但是在初级谱中可得到的IgM抗体的亲和力会随抗原的不同而异。如果表位以高密度反复出现在抗原的表面上(例如,病毒或细菌表面上的重复的结构),那么IgM抗体可能有效地介导该生物的清除,而不论抗原表位和免疫球蛋白结合部位之间的各相互作用的低亲和力。表位的密度可以允许与IgM的多价相互作用,导致高抗体亲抗原性相互作用,前提是可以发生合适的抗原表位间隔。然而,为了确保有效的和特异性的反应,特别当抗原浓度较低时(例如,当身体面临非常小数目的感染病毒颗粒时可能发生的),如果可以得到高-亲和力抗体用于中和例如感染生物,则将是优选的。初级谱的大小会妨碍这样的高-亲和力抗体存在于该谱中的可能性。因此,免疫系统使用2步策略运行。IgM抗体的初级谱通过基因重排过程产生,且在早期的淋巴细胞发育过程中,在遇到抗原之前发生。但是,一旦已经遇到了外来抗原,则在能编码合适的(虽然低-亲和力)抗体的初级谱中的那些B细胞会选择性地扩张,且反复交替地进行定向超变和抗原-介导的选择。这允许产生的抗原-特异性的抗体的亲和力的显著成熟。抗原触发也能驱动同种型转换重组。因而,在没有外部的抗原刺激和任何母性地衍生的免疫球蛋白的情况下,血清会仅仅含有多种已经通过基因重排产生的突变的IgM分子。作为连续的抗原暴露的结果,该谱随年龄而变化,从而使得年老动物中的大多数血清免疫球蛋白是由突变的IgG(和IgA)分子组成的,后者的特异性已经作为抗原选择的结果而发展。
IgA作为约160kD的H2L2单体存在于血清中,且在分泌物中,作为约400kD的H2L2单体的二聚体。如同IgM一样,聚合(二聚化)是通过J-链的。在不同的重链的基础上,IgA具有2个亚类,IgA1和IgA2。IgA1在骨髓中产生,并构成大多数的血清IgA。IgA1和IgA2都是在GALT(肠有关的淋巴组织)中合成的,以分泌到粘膜表面上。因为IgA可以局部地合成,并分泌进身体的浆液粘液性的分泌物,所以它有时称作分泌型抗体或sIgA。定量地,IgA以大于IgG的量合成,但是它在血清中具有更短的半衰期(6天),且在分泌产物中丧失。IgA在血清中的浓度是总抗体的约15%。二聚体的IgA的分泌由称作分泌成分的100kD糖蛋白介导。分泌片段向IgA分子的添加,是它们通过外分泌腺脱离身体暴露于粘膜表面的能力的原因。IgM可以类似的转运,并组成小部分分泌抗体。分泌型IgA是存在于胃肠液、鼻分泌物、唾液、泪水和身体的其他粘液分泌物中的主要免疫球蛋白。IgA抗体对于身体粘膜表面的感染的抗性是重要的,尤其是呼吸道、肠道和尿生殖道。IgA起抗微生物粘附或最初的定居的粘膜表面的保护性涂层的作用。它也可以中和粘膜表面上的毒素活性。在源自呼吸粘膜的单核细胞和嗜中性粒细胞中发现的IgA-包被的微生物的Fc受体表明,IgA可能在肺中起作用,至少在病原体的调理作用中起作用。分泌型IgA也能通过乳汁(即初乳)从哺乳的母体转移至新生儿,这能提供对许多病原体的被动免疫,所述病原体特别是通过GI道进入的那些。
IgE是约190kD的免疫球蛋白,其约占总血清免疫球蛋白的0.002%。它由呼吸上皮和肠上皮下的浆细胞产生。大部分IgE能结合组织细胞,特别是肥大细胞。如果传染物能成功地穿透IgA屏障,且它会碰到下一个防御系,即由IgE管理的MALT(粘膜-有关的淋巴组织)系统。IgE能非常牢固地结合肥大细胞上的特异性的IgE Fc受体。与抗原的接触,会导致肥大细胞释放炎症介体,其能有效地募集各种免疫反应试剂,包括补体,吞噬细胞、T细胞的趋化性的因子等。尽管该反应的众所周知的表现是一类称作特应性变态反应(例如,荨麻疹、哮喘、枯草热,等)的速发型超敏反应,但MALT反应能起防御机制的作用,因为它们能放大炎性反应,且可以促进病原体的排斥。
IgD是约175kd的分子,其在单体形式时类似于IgG。在大部分B淋巴细胞表面上,可以发现IgD抗体。相同的细胞也可以携带IgM抗体。如上所述,认为IgD和IgM起相互作用的抗原受体的作用,以用于控制B细胞激活和抑制。因而,IgD可以具有免疫调节功能。
除了调理作用、补体的激活和ADCC外,抗体在宿主防御中具有其他功能,包括空间位阻、毒素中和、凝集和沉淀。关于空间位阻,应当理解,抗体能结合微生物表面,且可以阻断或阻止它们向易感的细胞或粘膜表面的附着。针对病毒组分的抗体可以阻断病毒向易感的宿主细胞的附着,由此减少感染性。分泌型IgA可以阻断病原体向粘膜表面的附着。毒素-中和抗体(抗毒素)也可以与可溶的细菌毒素反应,并阻断毒素与它的特异性的靶细胞或底物的相互作用。抗体也可以结合微生物的表面或可溶的抗原,并使它们凝集或沉淀。这能减少单独的传染性单元的数目,并使它们能更容易地被吞噬,因为颗粒块的大小更大。吞噬细胞可以去除中和的毒素的絮凝物或聚集体。
已经提出将抗体用于治疗。动物(包括人和小鼠)具有使抗体能实际上识别(通过与之结合)任何抗原决定簇和区别类似表位的能力。这不但能提供针对疾病生物的保护基础,而且它也能使抗体成为靶向在身体中发现的其他类型的分子的有吸引力的候选物,所述分子例如存在于正常细胞表面上的受体或其他蛋白和独特地存在于癌细胞表面上的分子。因而,抗体的显著的特异性使它们成为有前途的用于人治疗的试剂。
可以使用的最初的抗体制剂(例如静脉内的γ球蛋白)包括动物和人抗血清,其体内地用于破坏细菌(破伤风、肺炎球菌)和中和感染的个体的血液中的病毒(甲型和乙型肝炎、狂犬病、巨细胞病毒和水痘带状疱疹)。最重要的早期应用可能是内毒素的应用。但是,存在与抗体在人治疗中的应用有关的问题,因为免疫系统对任意抗原的反应(即使是最简单的)是“多克隆的”,即该系统能在它们的结合区和它们的效应区生产具有广泛结构的抗体。多克隆抗体治疗也与不必要的副作用有关。除了这些抗体制剂的多克隆性质外,还存在被污染病毒感染的危险。血清病和过敏反应也是考虑过的限制因素。另外,即使要分离单个的能分泌抗体的细胞,并培养它,它也会在几代后灭绝,这是因为所有正常的体细胞的有限的生长潜力。
在二十世纪七十年代末之前,从免疫化的动物的血清得到的多克隆抗体能提供用于研究或治疗疾病的抗体的唯一来源。在Kohler和Milstein发现如何制备“单克隆抗体”之前,特异性的抗体的分离基本上是不可能的,所述的“单克隆抗体”具有单一特异性,它们都是类似的,这是由于由单克隆的浆细胞生产,且它们可以无限地生长。该技术记载在1975年出版物(Nature 256:495-97)中,且
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和Milstein因为他们的工作,获得了1984年诺贝尔医学奖。
Kohler和Milstein的生产单克隆抗体的技术的第一步包含用目标抗原免疫实验动物。在他们的大部分实验中,Kohler和Milstein用绵羊红细胞注射了小鼠。小鼠的身体开始免疫反应,并开始生产对抗原特异性的抗体。然后取出小鼠的脾,并分离能生产目标抗体的B细胞。然后,使用聚乙二醇,使已经在培养物中生长的肿瘤-生产性细胞与B淋巴细胞融合,以生产“杂交瘤”。只有融合产生的杂交瘤能够存活。脾淋巴细胞具有有限的寿命,所以没有与骨髓瘤融合的任意B细胞都会在培养物中死亡。另外,缺乏B细胞的抗体-生产方面的那些细胞不能分泌酶HGPRT,后者是在次黄嘌呤-氨基蝶呤胸苷(HAT)培养基中生长所必需的。细胞在上面生长的HAT培养基能抑制核苷酸合成途径。能生产HGPRT的细胞可以绕过该途径,并继续生长。通过将融合的细胞置于HAT培养基上,可以分离真正的杂交瘤。然后,筛选分离的杂交瘤细胞对需要的抗原的特异性。因为每个杂交瘤都源自一个B细胞,所以它仅产生一种抗体的拷贝。在培养物中生长能生产目标抗体的杂交瘤,以生产大量的单克隆抗体,然后将其分离,以用于其他用途。该技术称作体细胞杂交,且得到的杂交瘤(选择了无限增殖和特异性的目标抗体的生产)可以无限培养,即它是潜在地无限增殖的细胞系。
单克隆抗体现在广泛地用作诊断和研究试剂。但是,它们在人治疗中的应用慢得多。一个基本的困难是,人免疫系统将小鼠抗体“视作”外来的。人患者能产生针对它们的免疫反应,从而生产HAMA(“人抗小鼠抗体”)。它们不但使治疗性抗体被迅速地从宿主中消除,而且能形成免疫复合物,其造成对肾的损害。
已经使用了2个方案,来尝试减少HAMA的问题。第1个是,生产嵌合抗体,其中使用基因工程,使小鼠单克隆抗体的抗原-结合部分(可变区)与人抗体的效应部分(恒定区)融合。在第2个方案中,通过称作互补性决定区(CDR)移植或“人源化”的技术,已经改变了啮齿动物抗体。在该方法中,从能分泌啮齿动物mAb的细胞切离由重链的3个CDR和轻链的3个CDR形成的抗原结合部位,并移植进能编码人抗体的构架的DNA中。因为仅仅移植了抗原-结合部位CDR,而不是啮齿动物抗体的整个可变结构域,所以据报道,得到的人源化的抗体(第2代或“镶嵌嵌合的”抗体)的免疫原性低于第1代嵌合抗体。已经进一步改进了改方法,以包括称作下述名称的变化:“重构”(Verhoeyen,等,″Reshaping human antibodies:grafting ananti-lysozyme activity,″1988 Science 239:1534-1536;Riechmann,等,″Reshaping human antibodies for therapy,″1988 Nature332:323-337;Tempest,等,″Reshaping human monoclonal antibodyto inhibit respiratory syncitial virus infection invivo,″Bio/Technol 1991 9:266-271)、“镶嵌嵌合化”(Queen,等,″A humanized antibody that binds to the human interleukin2 receptor,″1989 Proc Natl Acad Sci USA 86:10029-10033;Co,等,″Humanized antibodies for antiviral therapy,″1991 ProcNatl Acad Sci USA 88:2869-2873;Co,等,″Chimeric and humanizedantibodies with specificity for the CD33 antigen,″1992 JImmunol 148:1149-1154)和“镶盖”(Mark,等,″Derivation oftherapeutically active humanized and veneered anti-CD18antibodies.In:Metcalf BW,Dalton BJ,eds.Cellular adhesion:molecular definition to therapeutic potential.New York:PlenumPress,1994:291-312)。
在同源性基础上的重构方法中,将啮齿动物的可变区与它所属的蛋白序列亚群的共有序列进行对比。类似地,将选择的能接受构架的人恒定区与它的家族共有序列进行对比。Gussowal,等,″Humanization of monoclonal antibodies,″1991 Meth Enzymol203:99-121。序列分析能识别残基,其可以在亲和力成熟过程中经历突变,并因此可以是特应性的。据称更普通的人残基的包含能通过替换人受体特应性的残基,来减轻免疫原性问题。此外,据称重构方法能对比人和啮齿动物共有序列,以鉴别任何系统的“物种”差异。通过采用该方法,可以人源化RSV19抗体。Taylor等,″Humanizedmonoclonal antibody to respiratory syncitial virus,″1991Lancet 337:1411-1412;Tempest,等,″Reshaping a humanmonoclonal antibody to inhibit human respiratory syncitialvirus infection in vivo,″1991 Bio/Technol 9:266-271。
镶嵌嵌合化是鉴别CDR区以外的残基的替代方法,所述残基可能参与结合活性的重构。在该方法中,将人序列与鼠可变区序列对比,并选择具有最高同源性的一个作为受体构架。象在重构方法中一样,“特应性的”残基被更普遍发生的人残基替换。可以鉴别出能与CDR序列相互作用的非-CDR残基。最后,确定这些残基中的哪一个要包含在可变区构架中。据报道,通过该方法开发出了针对CD33抗原的人源化的抗体。Co,等,″Chimeric and humanized antibodies withspecificity for the CD33 antigen,″1992 J Immunol 148:1149-154。也参见Carter,等,″Humanization of an anti-p185 HER2 antibodyfor human cancer therapy,″1992 Proc Natl Acad Sci USA89:4285-4289。
显示的蛋白表面是它的免疫原性的基本决定簇。因而,通过替换暴露的与在人抗体中常见的那些不同的残基,可以使人源化的鼠抗体具有更低的免疫原性。该人源化方法称作“镶盖”。外部残基的适当替换可以对内部结构域或结构域间构架具有较少的影响或没有影响。镶盖是2-步方法。在第一步中,选择最同源的人可变区,并将每个单个的残基与对应的小鼠可变区进行对比。在第二步中,存在于人同系物中的残基能替换小鼠构架残基,后者与它的人同系物不同。该替换仅仅包含处于表面上且至少部分地暴露的那些残基。
然而,为了开发用于治疗人疾病的免疫球蛋白分子,耗费了超过四分之一世纪来研究单克隆抗体技术和基因工程方法。实际上,直到过去5年,单克隆抗体才变成一大类治疗剂。参见,Glennie MJ和vande Winkel JG,Drug Discov Today 2003 Jun 1;8(11):503-10;Souriau C和Hudson PJ,″Recombinant antibodies for cancerdiagnosis and therapy,″2003 Expert Opin Biol Ther.3(2):305-18。也参见Pendley C,等,″Immunogenicity oftherapeutic monoclonal antibodies,″2003 Curr Opin Mol Ther.5(2):172-9。
仍然,从1986年(公布单克隆抗体后11年)开始,平均每年有少于一种治疗性抗体面市。在1986-1995的十年中,5种鼠单克隆抗体被用于人药品中,包括“鼠单克隆抗体-CD3”(OrthoClone OKT3),其能结合T细胞表面上的分子,且在1986年投放市场,用于预防急性的器官移植排斥;“edrecolomab”(Panorex
Figure GA20180477200380110470301D00252
),在1995年投放市场,用于治疗结肠直肠癌;“odulimomab”(Antilfa
Figure GA20180477200380110470301D00253
),在1997年投放市场,用于移植排斥;和“ibritumomab”(Zevalin
Figure GA20180477200380110470301D00254
yiuxetan),在2002年投放市场,用于非何杰金淋巴瘤。另外,一种单克隆的Fab,“阿昔单抗”(ReoPro
Figure GA20180477200380110470301D00255
),在1995年投放市场。它能通过结合它们的表面上的受体来抑制血小板聚集,所述受体一般是由血纤蛋白原连接,且可以辅助预防已经经历了血管成形术的患者的冠状动脉再次堵塞。3种嵌合单克隆抗体也投放了市场:“利妥希玛”(Rituxan
Figure GA20180477200380110470301D00256
),在1997年,其能结合在大多数B细胞上发现的CD20分子,且用于治疗B细胞淋巴瘤;“basiliximab”(Simulect),在1998年,用于移植排斥;和“英夫单抗”(Remicade),其能结合肿瘤坏死因子-α(TNF-α),在1998年,用于治疗类风湿性关节炎和Crohn氏病。另外,“阿昔单抗”(ReoPro
Figure GA20180477200380110470301D00259
),它是能结合人血小板的糖蛋白(GP)IIb/IIIa受体的嵌合人-鼠单克隆抗体7E3的47.6kDFab片段,在1995年作为经皮的冠状动脉干涉的助剂投放市场,用于预防经历经皮的冠状动脉干涉的患者的心脏局部缺血并发症。最后,7种“人源化的”单克隆抗体在1997-2003年投放市场:“daclizumab”(Zenapax)在1997年,其能结合在激活的T细胞表面生成的IL-2受体部分,且用于预防急性的移植肾排斥;“palivizumab”(Synagis
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)在1998年,用于RSV;“司徒曼布”(Herceptin
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)在1998年,其能结合HER-2,即在乳腺癌细胞上发现的一种生长因子受体;“gemtuzumab”(Mylotarg
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)在2000年,它是能结合CD33的单克隆抗体的缀合物,所述的CD33是由急性髓细胞性白血病(AML)的癌细胞表达的一种细胞-表面分子,但是在再生骨髓所需的正常干细胞上没有发现;和“alemtuzumab”(MabCampath
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)在2001年,其能结合CD52,即在白细胞上发现的一种分子,且已经产生了慢性淋巴细胞性白血病的暂时缓解;“adalimumab”(Humira(D2E7)),即一种含有人-衍生的重链和轻链可变区和人IgG:κ恒定区的人抗-TNF单克隆抗体,在2002年投放市场,用于治疗类风湿性关节炎;和“omalizumab”(Xolair),其能结合IgE和阻止它结合肥大细胞,在2003年被批准用于治疗患有中等至严重的持续性哮喘的成年人和大于12岁的青少年,其对常年的气源性致敏原具有阳性的皮肤实验或体外反应性,且用吸入的皮质类固醇不能充分地控制其症状。
因而,已经将蛋白工程应用于减少与施用的重组免疫球蛋白多肽的免疫原性有关的问题和尝试改变抗体效应子功能的工作中。但是,仍然存在问题。例如,用利妥希玛治疗的大多数癌症患者会复发,通常在约6-12个月内,且已经报道了利妥希玛输注24小时内的致命的输注反应。这些致命的反应是输注反应综合征的结果,包括缺氧、肺浸润、急性呼吸窘迫综合征、心肌梗死、心室颤动或心源性休克。在用利妥希玛治疗后的肿瘤溶解综合征的建立中,还已经报道了具有致命结果实例的需要透析的急性肾衰竭,同样报道了严重的粘膜与皮肤反应,一些具有致命结果。另外,静脉内注射需要高剂量的利妥希玛,因为该分子较大,大约150kDa,且扩散限于淋巴组织,许多肿瘤细胞停留在那里。
司徒曼布施用可以导致心室功能障碍和充血性心力衰竭的发展,且已经报道,在接受与蒽环霉素和环磷酰胺组合的司徒曼布的患者中,心脏功能障碍的发病率和严重性是特别高的。司徒曼布施用也可以导致严重的超敏反应(包括过敏反应)、输注反应和肺部事件。
接受daclizumab免疫抑制治疗的患者处于发展淋巴组织增生障碍和机会性感染的高度危险中,且不知道daclizumab应用是否对免疫系统在daclizumab-诱导的免疫抑制过程中首先对遇到的抗原作出响应的能力具有长期的作用。
还已经报道,肝毒性,包括严重的肝静脉梗阻症(VOD),与作为单一试剂、作为联合化疗方案的一部分,且在没有肝病或造血干细胞移植(HSCT)历史的患者中的gemtuzumab的应用有关。在HSCT之前或之后接受gemtuzumab的患者,具有潜在肝病或异常肝功能的患者,和接受与其他化疗组合的gemtuzumab的患者,可能处于发展严重的VOD的高度危险中。在接受gemtuzumab的患者中,已经报道了因为肝衰竭和VOD的死亡,且已经注意到,即使小心的监控也不能鉴别出处于危险中的所有患者,或预防肝毒性的并发症。
在接受alemtuzumab的患者中,也报道了肝毒性。严重的,且在一些罕见的情况下致命的各类血细胞减少症/骨髓发育不全、自身免疫性特发性血小板减少症和自体免疫性溶血性贫血,已经在接受alemtuzumab治疗的患者中发生。Alemtuzumab也可以导致严重的输注反应以及机会性感染。
在用adalimumab治疗的患者中,已经报道了严重的感染和脓毒病,包括死亡性事故,同样报道了临床症状的恶化和/或脱髓鞘疾病的射线照相证据,且在临床实验中用adalimumab治疗的患者具有比在一般人群中预期的比率更高的淋巴瘤发病率。
Omalizumab在临床研究中的严重不良反应已经包括恶性肿瘤和过敏反应,其中在omalizumab-治疗的患者中观察到的恶性肿瘤的发病率(0.5%)在数字上高于在对照组的患者中观察到的(0.2%)。
在克服与全免疫球蛋白治疗有关的各种问题的工作中,已经构建了更小的免疫球蛋白分子。单链免疫球蛋白可变区片段多肽(scFv)由通过短接头肽连接到免疫球蛋白轻链可变结构域上的免疫球蛋白重链可变结构域组成。Huston等,1988 Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:5879-83。已经提出,与全免疫球蛋白相比,更小尺寸的scFv分子可以导致从血浆中更迅速地清除和更有效地渗透进组织中。参见,例如,Jain,1990 Cancer Res.50:814s-819s。据报道,与对应的嵌合抗体相比,抗-肿瘤scFv能表现出更迅速的肿瘤穿透和在肿瘤块中的更均匀的分布。Yokota等,Cancer Res.52:3402-08(1992)。
尽管scFv分子可能具有血清疗法方面的优点,但也存在该治疗方法的缺点。例如,scFv的迅速清除可能阻止最低有效剂量向靶组织的送递。另外,由于能不利地影响得率的表达和分离scFv方面的困难,生产足够量的用于给患者施用的scFv已经是面临挑战的。在表达过程中,scFv分子缺乏稳定性,且经常由于不同分子的可变区的配对而聚集。而且,据报道,scFv分子在哺乳动物表达系统中的生产水平较低,这会限制有效地生产用于治疗的scFv分子的潜力。Davis等,1990 J.Biol.Chem.265:10410-18;Traunecker等,1991EMBO J.10:3655-59。已经开发了用于改善生产的措施的策略,且据报道,包括向可变区添加糖基化作用位点。参见,例如,美国专利号5,888,773;Jost等,1994 J.Biol.Chem.269:26267-73。使用scFv进行治疗的另一个缺点是缺乏效应子功能。缺乏细胞溶解功能、ADCC和依赖补体的-细胞毒性的scFv对于治疗疾病是低效的或无效的。即使在超过12年以前就开始了scFv技术的开发,目前仍没有批准用于治疗的scFv产品。
或者,已经提出,scFv与另一种分子例如毒素的融合,能利用特异性的抗原-结合活性和小尺寸的scFv,来将毒素送递到靶组织。Chaudary等,1989 Nature 339:394;Batra等,1991 Mol.Cell.Biol.11:2200。因而,已经提供了毒素与scFv的缀合或融合,作为提供有效的、抗原-特异性的分子的替代方案,但是这样的缀合物或嵌合体的施用,会受到过量的和/或非-特异性的毒性的限制,这是由于这样的制剂的毒素部分。毒性作用可以包括肝酶的超生理(supraphysiological)的升高和血管泄漏综合征和其他不想要的作用。另外,免疫毒素本身在施用给宿主后是高免疫原性的,且针对该免疫毒素产生的宿主抗体会限制个体的重复的治疗性治疗的潜在有用性。
还已经研究了融合蛋白,其中存在免疫球蛋白恒定区多肽序列,且用非免疫球蛋白序列取代抗体可变区。例如,将CD4(即由HIV识别的T细胞表面蛋白)重组地融合到免疫球蛋白Fc效应结构域,且据报道,IL-2-IgG1融合蛋白能实现补体-介导的携带IL-2受体的细胞的溶解。参见,Sensel等,Chem.Immunol.65:129-158(1997)。关于重组抗体技术的所有方面的广泛介绍和详细信息可参见教科书″Recombinant Antibodies ″(John Wiley & Sons,NY,1999)。关于详细的抗体工程实验室规程的全面收集,可参见R.Kontermann和S.Dübel(编),″The Antibody Engineering Lab Manual″(SpringerVerlag,Heidelberg/New York,2000)。
认为易受一些类型的免疫球蛋白治疗影响的疾病和障碍包括癌症和免疫系统障碍。癌症包括宽范围的疾病,影响全世界大约四分之一的个体。恶性细胞的迅速和不受调节的增殖是许多类型的癌症(包括血液学恶性肿瘤)的特点。尽管在过去的20年中,具有血液学恶性状况的患者已从癌症治疗的进展中获益,Multani等,1998 J.Clin.Oncology16:3691-3710,且缓解时间增加,但大多数患者仍然复发并且屈服于他们的疾病。用细胞毒性药物治愈的障碍包括例如肿瘤细胞抗性和化疗的高毒性,这阻碍了许多患者的最佳给药。
然而,已经用靶向恶性细胞(即,靶向在肿瘤细胞上表达的抗原)的免疫治疗剂来治疗患者。关于适用作免疫治疗靶的肿瘤细胞表面抗原的选择,这样的靶抗原优选地不被正常组织表达,特别是当这样的组织的维持对于宿主存活是重要的时。在血液学恶性肿瘤的情况下,恶性细胞能表达许多不表达于干细胞或其他必需细胞的表面上的抗原。使用能减少血液学起源的正常的和恶性的细胞的治疗方案来治疗血液学恶性状况,已经成为可接受的,这时在治疗结束后可以发生从祖先再生正常细胞。另外,靶抗原理想地在所有的或实际上所有的克隆发生肿瘤细胞群上表达,并且尽管存在来自于免疫球蛋白治疗的选择压力,但该表达最好持续。尽管抗原表现出高度的肿瘤选择性,但具有改变的表面独特型表达的肿瘤细胞变体的向外生长会限制选择细胞表面独特型(例如特定独特型)作为用于治疗B细胞恶性肿瘤的靶的策略。Meeker等,1985 N.Engl.J.Med.312:1658-65。选择的抗原在与免疫球蛋白结合后应当适当运输。免疫球蛋白结合抗原后,细胞表面靶抗原的脱落或内在化,可以允许肿瘤细胞逃脱破坏,从而限制血清疗法的有效性。最后,免疫球蛋白与能传送或转导细胞激活信号的细胞表面靶抗原的结合,可以在肿瘤细胞中产生改善的对免疫治疗的功能性应答,且可以导致生长停滞和/或细胞凋亡。尽管所有的这些性质都是重要的,但免疫球蛋白结合靶抗原后,细胞凋亡的引发也可能是实现成功的血清疗法的关键因素。
已经验证作为B和T细胞恶性肿瘤的血清疗法的靶的抗原包括Ig独特型(Brown等,1989 Blood 73:651-61)、CD19(Hekman等,1991Cancer Immunol.Immunother.32:364-72),Vlasveld等,1995Cancer Immunol.Immunother.40:37-47)、CD20(Press等,1987Blood 69:584-91),Maloney等,1997 J.Clin.Oncol.15:3266-74)、CD21(Scheinberg等,1990 J Clin.Oncol.8:792-803)、CD5(Dillman等,1986 J.Biol.Respn.Mod.5:394-410)和CD52(CAMPATH)(Pawson等,1997 J Clin.Oncol.15:2667-72)。其中,使用靶向CD20的分子,已经获得了B细胞淋巴瘤治疗的更大的益处。其他靶受到了抗原的生物学性质的限制。例如,通过体细胞突变,可以改变表面独特型,从而允许肿瘤细胞逃脱。在单克隆抗体结合后,CD5、CD21和CD19被迅速内在化,从而允许肿瘤细胞逃脱破坏,除非单克隆抗体与毒素分子缀合。CD22仅在B细胞淋巴瘤的一个亚群上表达,从而限制了它的有用性,而CD52在T细胞和B细胞上都表达,因此可以通过减少来产生妨碍(counterproductive)的免疫抑制。
已经报道,使用嵌合CD20单克隆抗体来治疗患有低级的或滤泡性B细胞淋巴瘤的患者,能在患者中诱导部分或完全的反应,McLaughlin等,1996 Blood 88:90a(abstract,suppl.1);Maloney等,1997 Blood90:2188-95。然而,如上所述,通常在6个月到1年内发生肿瘤复发。需要进一步改进血清疗法,以诱导更持久的反应,例如在低级B细胞淋巴瘤中,并且允许有效治疗高级淋巴瘤和其他B细胞疾病。
另一种方法是,使用CD20的特异性单克隆抗体,将放射性同位素导向于B细胞淋巴瘤。据报道,尽管治疗的有效性增加,但伴随的来自放射性抗体的长体内半衰期的毒性也增加,有时要求患者进行干细胞拯救。Press等,1993 N.Eng.J.Med.329:1219-1224;Kaminski等,1993 N.Eng.J.Med.329:459-65。还已经用蛋白酶切割了CD20的单克隆抗体,以便在附着放射性同位素之前产生F(ab′)2或Fab片段。已经报道,这会改进放射性同位素缀合物向肿瘤中的穿透,并且缩短体内半衰期,从而减少对正常组织的毒性。但是,这些分子缺乏效应子功能,包括补体固定和/或ADCC。
CD20是第一个由单克隆抗体鉴定的人B细胞谱系-特异性的表面分子。它是非-糖基化的、疏水的35 kDa B细胞跨膜磷蛋白,其具有位于细胞质中的氨基和羧基末端。Einfeld等,1988 EMBOJ.7:711-17。CD20由所有正常的成熟的B细胞表达,但是前体B细胞不能表达。还没有鉴定CD20的天然配体,且仍然没有完全明白CD20在B细胞生物学中的功能。
抗-CD20单克隆抗体能影响B细胞的存活和生长。Clark等,1986Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:4494-98。CD20的广泛交联可以诱导B淋巴瘤细胞系的细胞凋亡,Shan等,1998 Blood 91:1644-52,且已经报道,细胞表面上的CD20的交联能增加信号转导的强度和动力学,例如,如通过测量细胞底物的酪氨酸磷酸化而检测的。Deans等,1993J.Immunol.146:846-53。因此,除了通过补体和ADCC机制的细胞减少外,Fc受体与CD20单克隆抗体的体内结合可以通过CD20交联而促进恶性B细胞的细胞凋亡,这与下述理论相一致,即SCID小鼠模型中的人淋巴瘤的CD20治疗的有效性依赖于CD20单克隆抗体对Fc受体的结合。Funakoshi等.,1996 J.Immunotherapy 19:93-101。CD20多肽中的多个跨膜结构域的存在(Einfeld等,1988 EMBO J:7:711-17;Stamenkovic等,1988 J.Exp.Med.167:1975-80;Tedder等,1988J.Immunol.141:4388-4394),能防止抗体结合后的CD20内在化,且这被认为是当给B细胞淋巴瘤患者注射鼠CD20单克隆抗体1F5时B细胞恶性肿瘤的治疗的重要特征,这导致恶性细胞的显著减少和部分临床反应。Press等.,1987 Blood 69:584-91。
由于正常的成熟B细胞也表达CD20,所以抗-CD20抗体治疗能减少正常的B细胞。Reff,M.E.等,1994 Blood 83:435-445。然而,治疗完成后,从CD20阴性的B细胞前体可以再生正常的B细胞;因此,用抗-CD20疗法治疗的患者不经历明显的免疫抑制。在包含不适当地产生自身抗体的疾病或B细胞可能起作用的其他疾病中,正常B细胞的减少也可能是有益的。据报道,由与人IgG1重链和人κ轻链恒定区融合的小鼠来源的重链和轻链可变区组成的CD20的特异性嵌合单克隆抗体,能保留与CD20的结合和介导ADCC以及固定补体的能力。Liu等,1987 J.Immunol.139:3521-26。认为上面讨论的利妥希玛的抗-肿瘤活性的机理是几种活性的组合,包括ADCC、补体固定和能促进恶性B细胞的细胞凋亡的信号的触发,尽管大尺寸的利妥希玛能阻止分子向含有恶性B细胞的淋巴组织中的最佳扩散,从而限制这些抗-肿瘤活性。自身免疫病包括自身免疫性甲状腺病,后者包括Grave氏病和Hashimoto氏甲状腺炎。仅在美国,就有约2千万患有一些形式的自身免疫性甲状腺病的人。自身免疫性甲状腺病源自自身抗体的生产,该自身抗体能刺激甲状腺、造成甲状腺机能亢进(Grave氏病),或者破坏甲状腺、造成甲状腺机能减退(Hashimoto氏甲状腺炎)。能结合和激活促甲状腺素(TSH)受体的自身抗体,会造成甲状腺的刺激。能与其他甲状腺抗原反应的自身抗体,会造成甲状腺的破坏。当前的Grave氏病治疗包括手术、放射性碘或抗甲状腺药物治疗。放射性碘得到了广泛应用,因为抗甲状腺药物具有明显的副作用,且疾病复发较高。对于大甲状腺肿的患者,或者当需要非常迅速地正常化甲状腺功能时,保留使用手术。没有靶向负责刺激TSH受体的自身抗体的生产的疗法。当前的Hashimoto氏甲状腺炎治疗是左旋甲状腺素钠,且治疗经常是终生的,因为缓解的低可能性。已经证实,抑制性治疗能收缩Hashimoto氏甲状腺炎中的甲状腺肿,但是不知道能减少自身抗体生产以靶向疾病机理的疗法。
类风湿性关节炎(RA)是一种以导致肿胀、疼痛和功能丧失的关节的炎症为特征的慢性疾病。RA在美国影响了大约250万人。RA是由多种事件的组合造成的,包括起始的感染或损伤、异常免疫应答和遗传因素。尽管RA中存在自身反应性T细胞和B细胞,但在RA的诊断中使用了在关节中采集的高水平抗体(即称作类风湿因子的抗体)的检测。目前RA的治疗包括许多用于控制疼痛和延缓疾病进展的药物。还没有发现能够治愈该疾病的治疗。药物包括非类固醇抗炎药(NSAIDS)和缓解疾病的抗风湿性药物(DMARDS)。NSAIDS在良性疾病中有效,但在严重RA中不能阻止进展为关节破坏和虚弱。NSAIDS和DMARDS都与严重的副作用相关。十多年来,只批准了一种新的DMARD,即来氟洛米。来氟洛米能阻断自身抗体的产生,减少炎症,并且延缓RA的进展。然而,该药物也能造成严重的副作用,包括恶心、腹泻、脱发、疹和肝损伤。
系统性红斑狼疮(SLE)是一种由于多个器官(包括肾、皮肤和关节)中的血管的反复损伤导致的自身免疫病。SLE在美国影响了超过500,000人。在SLE患者中,T细胞和B细胞之间的错误相互作用导致了能攻击细胞核的自身抗体的产生。这些抗体包括抗-双链DNA和抗-Sm抗体。在约半数的SLE患者中,也发现了能结合磷脂的自身抗体,并且其负责血管损伤和低血细胞计数。免疫复合物在SLE患者的肾、血管和关节中聚集,它们在那里导致炎症和组织破坏。还没有发现治愈该疾病的对SLE的疗法。根据疾病的严重程度,将NSAIDS和DMARDS用于治疗。用于去除自身抗体的带有血浆交换的血浆去除术可以导致SLE患者的暂时改善。普遍认为自身抗体是SLE的原因,所以能减少B细胞谱系、允许从前体产生新的B细胞的免疫系统重新设置的新疗法,会为SLE患者的长久益处带来希望。
Sjogren氏综合征是以破坏身体中产生湿润的腺体为特征的一种自身免疫病。Sjogren氏综合征是最普遍的自身免疫病之一,在美国影响了多至400万人。约半数Sjogren氏综合征患者也患有结缔组织病,例如RA,而另一半患有原发性Sjogren氏综合征,没有其他并发的自身免疫病。Sjogren氏综合征患者中通常存在自身抗体,包括抗核抗体、类风湿因子、抗胞衬蛋白和抗毒蕈碱性受体。常规治疗包括皮质类固醇,且其他更有效的治疗也是有益的。
免疫性血小板减少性紫癜(ITP)是由能结合血小板并造成它们的破坏的自身抗体导致的。一些ITP病例是由药物导致的,其他与感染、妊娠或自身免疫病如SLE相关。约半数病例分类为“特发性”,表示原因未知。ITP的治疗是由症状的严重性所决定的。在一些情况下,不需要治疗,尽管在大多数情况下,用免疫抑制药物来减少T细胞,所述药物包括皮质类固醇或静脉内输注免疫球蛋白。另一种通常能导致血小板数目增加的治疗方法是切除脾,即能破坏抗体-包被的血小板的器官。更强效的免疫抑制药物,包括环孢菌素、环磷酰胺或硫唑嘌呤,被用于治疗严重情况的患者。通过使患者的血浆通过A蛋白柱而去除自身抗体,可以用作严重疾病患者的二线疗法。其他更有效的治疗也是理想的。
多发性硬化(MS)也是自身免疫病。其特征在于中枢神经系统的炎症和髓鞘质破坏,它绝缘脑、脊髓和身体中的神经细胞纤维。尽管MS的原因未知,但普遍认为自身免疫性T细胞是该疾病发病的主要原因。但是,高水平的抗体存在于MS患者的脑脊液中,且一些理论预测,导致抗体产生的B细胞响应在介导该疾病中是重要的。在MS患者中还没有研究B细胞减少冶疗,且MS不能治愈。目前的治疗是皮质类固醇,它可以减少攻击的持续时间和严重性,但不影响MS随时间的进程。最近批准了MS的新的生物技术干扰素(IFN)治疗,但是其他更有效的治疗也是理想的。
重症肌无力(MG)是一种慢性自身免疫性神经肌肉障碍,其特征在于随意肌群的无力。在美国MG影响了大约40,000人。MG是由能结合在神经肌接点表达的乙酰胆碱受体的自身抗体导致的。该自身抗体能减少或阻断乙酰胆碱受体,阻止信号从神经传递到肌肉。已知MG还不能治愈。常见的治疗包括用皮质类固醇、环孢菌素、环磷酰胺或硫唑嘌呤进行免疫抑制。手术切除胸腺通常用于钝化自身免疫反应。用于降低血液中的自身抗体水平的血浆去除术在MG中是有效的,但作用时间短,因为持续产生自身抗体。血浆去除术通常保留在手术前用于严重的肌无力。新的和有效的治疗也是有益的。
牛皮癣影响了大约5百万人,且其特征在于皮肤的自身免疫性炎症。牛皮癣也与30%的关节炎相关(牛皮癣性关节炎)。已经使用了许多治疗,包括类固醇、紫外线类视黄醇(retenoid)、维生素D衍生物、环孢菌素、氨甲蝶呤,但是也显然的是,牛皮癣能从新的和有效的疗法中获益。硬皮病是结缔组织的一种慢性自身免疫病,也称作系统性硬化病。硬皮病的特征在于胶原的过量产生,导致皮肤增厚,且大约300,000美国人患有硬皮病,他们也能从新的和有效的疗法中获益。
显然需要改进的治疗恶性肿瘤和障碍以及其他疾病、障碍和状况的组合物和方法,所述恶性肿瘤包括B细胞恶性肿瘤,所述障碍包括自身免疫病、障碍和状况。本文所述的和要求保护的本发明的组合物和方法能提供这样的改进的组合物和方法以及其他的优点。
发明概述
本发明的一个方面是,提供结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白,其包含结合结构域多肽,后者融合或另外连接免疫球蛋白铰链或铰链-作用区多肽,后者又融合或另外连接包含一个或多个天然的或工程化的来自免疫球蛋白重链的恒定区的区域,所述恒定区为除了CH1以外的区域,例如,IgG和IgA的CH2和CH3区域或IgE的CH3和CH4区域。结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白还包含一个区域,后者包含下述组分、基本上由其组成或由其组成:天然的或工程化的免疫球蛋白重链CH2恒定区多肽(或CH3,在全部或部分地源自IgE的构建体的情况下),其融合或另外连接铰链区多肽,和天然的或工程化的免疫球蛋白重链CH3恒定区多肽(或CH4,在全部或部分地源自IgE的构建体的情况下),其融合或另外连接CH2恒定区多肽(或CH3,在全部或部分地源自IgE的构建体的情况下)。这样的结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白能够具有至少一种选自下述的免疫活性:依赖抗体的细胞介导细胞毒性和补体固定。这样的结合结构域多肽也能结合或特异性地结合靶,例如,靶抗原。
在某些实施方案中,例如,结合结构域多肽包含至少一个免疫球蛋白可变区多肽,其选自天然的或工程化的免疫球蛋白轻链可变区多肽和/或天然的或工程化的免疫球蛋白重链可变区多肽。在某些其他的实施方案中,结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白包含天然的或工程化的免疫球蛋白重链可变区多肽,其中该重链可变区多肽是工程化的人免疫球蛋白重链可变区多肽(或来自非-人物种的工程化的免疫球蛋白重链可变区多肽),其在与氨基酸位置9、10、11、12、108、110和/或112中的任意一个或多个相对应的位置,包含氨基酸的突变、取代或缺失。在重链可变区的与氨基酸位置9、10、11、12、108、110和/或112中的任意一个或多个相对应的位置处的氨基酸的突变、取代或缺失,可以包含在构建体中,例如与例如SEQ ID NO:212相对应的构建体。在某些实施方案中,免疫球蛋白可变区多肽源自,例如,人免疫球蛋白,且在某些其他的实施方案中,免疫球蛋白可变区多肽包含人源化的免疫球蛋白多肽序列。在某些实施方案中,免疫球蛋白可变区多肽,是或不是人源化的,都源自鼠免疫球蛋白,或源自来自另一物种的免疫球蛋白,所述的物种包括,例如大鼠、猪、猴或骆驼科动物。
根据本发明的某些实施方案,结合结构域多肽包含下述组分、基本上由其组成或由其组成:(a)至少一种天然的或工程化的免疫球蛋白轻链可变区多肽;(b)至少一种天然的或工程化的免疫球蛋白重链可变区多肽;和(c)至少一种接头多肽,其融合或另外连接(a)的多肽和(b)的多肽。在某些其他的实施方案中,天然的或工程化的免疫球蛋白轻链可变区和重链可变区多肽是从人免疫球蛋白衍生或构建的,且在某些其他的实施方案中,接头多肽包含至少一种多肽,后者包含或具有氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser[SEQ ID NO:516]。在其他的实施方案中,接头多肽包含至少2个或3个多肽重复,该多肽具有氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser[SEQ ID NO:516]。在其他的实施方案中,接头包含糖基化作用位点,其在某些其他的实施方案中是天冬酰胺-连接的糖基化作用位点,O-连接的糖基化作用位点,C-甘露糖基化(mannosylation)位点,糖基磷脂酰肌醇化位点或磷酸糖化位点。在另一个实施方案中,天然的或工程化的免疫球蛋白重链CH2恒定区多肽和天然的或工程化的免疫球蛋白重链CH 3恒定区多肽中的至少一个源自IgG或IgA人免疫球蛋白重链。在另一个实施方案中,天然的或工程化的免疫球蛋白重链CH3恒定区多肽和天然的或工程化的免疫球蛋白重链CH4恒定区多肽中的至少一个源自IgE人免疫球蛋白重链。
免疫球蛋白铰链区多肽可以包含下述组分、基本上由其组成或由其组成:例如,下述的任一个,(1)自然产生的任意的铰链或铰链-作用肽或多肽,例如,人免疫球蛋白铰链区多肽包括,例如,野生型人IgG铰链或其一部分,野生型人IgA铰链或其一部分,野生型人IgD铰链或其一部分或野生型人IgE铰链-作用区域,即,IgE CH2,或其一部分,野生型骆驼科动物铰链区或其一部分(包括IgG1美洲驼铰链区或其一部分,IgG2美洲驼铰链区或其一部分和IgG3美洲驼铰链区或其一部分),铰口鲨铰链区或其一部分,和/或有斑点的银鲛铰链区或其一部分;(2)突变的或另外改变的或工程化的铰链区多肽,其不含有半胱氨酸残基,且从具有一个或多个半胱氨酸残基的野生型免疫球蛋白铰链区多肽衍生或构建;(3)突变的或另外改变的或工程化的铰链区多肽,其含有一个半胱氨酸残基,且从具有一个或多个半胱氨酸残基的野生型免疫球蛋白铰链区多肽衍生或构建;(4)铰链区多肽,其已经被突变或另外改变或工程化成含有或添加一个或多个糖基化作用位点,例如,天冬酰胺-连接的糖基化作用位点、O-连接的糖基化作用位点、C-甘露糖基化位点、糖基磷脂酰肌醇化位点或磷酸糖化位点;(5)突变的或另外改变的或工程化的铰链区多肽,其中通过氨基酸取代或缺失减少了半胱氨酸残基的数目,例如,突变的或另外改变的或工程化的IgG1或IgG4铰链区,其含有例如0个、1个或2个半胱氨酸残基,突变的或另外改变的或工程化的IgG2铰链区,其含有例如0个、1个、2个或3个半胱氨酸残基,突变的或另外改变的或工程化的IgG3铰链区,其含有例如0个、1个、2个、3个或4-10个半胱氨酸残基,或突变的或另外改变的或工程化的人IgA1或IgA2铰链区多肽,其含有0个或仅仅1个或2个半胱氨酸残基(例如,“SCC”铰链),突变的或另外改变的或工程化的IgD铰链区,其不含有半胱氨酸残基,或突变的或另外改变的或工程化的人IgE铰链-作用区域,即,IgE CH2区域多肽,其含有0个或仅仅1个、2个、3个或4个半胱氨酸残基;或(6)本文所述或所指的任意的其他的连接区分子,或另外已知或以后发现可以用于连接邻接的免疫球蛋白结构域的分子,所述结构域例如,CH1结构域和CH2结构域。例如,铰链区多肽可以选自:(i)野生型人IgG1免疫球蛋白铰链区多肽,例如,(ii)突变的或另外改变的或工程化的人IgG1或其他的免疫球蛋白铰链区多肽,其从具有3个或更多个半胱氨酸残基的野生型免疫球蛋白铰链区多肽衍生或构建,其中所述的突变的人IgG1或其他的免疫球蛋白铰链区多肽含有2个半胱氨酸残基,且其中野生型铰链区的第一个半胱氨酸没有突变,(iii)突变的或另外改变的或工程化的人IgG1或其他的免疫球蛋白铰链区多肽,其源自具有3个或更多个半胱氨酸残基的野生型免疫球蛋白铰链区多肽,其中所述的突变的人IgG1或其他的免疫球蛋白铰链区多肽含有不超过1个半胱氨酸残基,和(iv)突变的或另外改变的或工程化的人IgG1或其他的免疫球蛋白铰链区多肽,其源自具有3个或更多个半胱氨酸残基的野生型免疫球蛋白铰链区多肽,其中所述的突变的或另外改变的或工程化的人IgG1或其他的免疫球蛋白铰链区多肽不含有半胱氨酸残基。在某些实施方案中,例如,免疫球蛋白铰链区多肽是突变的或另外改变的或工程化的铰链区多肽,且与野生型人免疫球蛋白G或其他的野生型铰链区或铰链-作用多肽相比,能表现处减少的二聚化能力。
免疫球蛋白重链恒定区多肽可以是,例如,同种型(它是人IgG或人IgA)的天然的或工程化的CH2和CH3结构域。免疫球蛋白重链恒定区多肽也可以是,例如,同种型(它是人IgE)的天然的或工程化的免疫球蛋白重链恒定区CH3和CH4多肽。
在某些其他的实施方案中,靶或靶抗原可以是,例如,CD19(B-淋巴细胞抗原CD19,也称作B-淋巴细胞表面抗原B4或Leu-12)、CD20(B-淋巴细胞抗原20,也称作B-淋巴细胞表面抗原B1、Leu-16或Bp 35)、CD22(B-细胞受体CD22,也称作Leu-14、B-淋巴细胞细胞粘附分子或BL-CAM)、CD37(白细胞抗原CD37)、CD40(B-细胞表面抗原CD40,也称作肿瘤坏死因子受体超家族成员5、CD40L受体或Bp 50)、CD80(T淋巴细胞激活抗原CD80,也称作激活B7-1抗原、B7、B7-1或BB1)、CD86(T淋巴细胞激活抗原CD86,也称作激活B7-2抗原、B70、FUN-1或BU63)、CD137(也称作肿瘤坏死因子受体超家族成员9)、CD152(也称作细胞毒性T-淋巴细胞蛋白4或CTLA-4)、CD45(白细胞普通抗原,也称作L-CA、T200和EC 3.1.3.48)、CD45RA(CD45的同种型,和在原初或未成熟的淋巴细胞上表达的抗原)、CD45RB(CD45的同种型)、CD45RO(CD45的同种型,和在记忆B和T细胞上表达的普通白细胞抗原)、L6(肿瘤相关抗原L6,也称作跨膜4超家族成员1、膜组分表面标记1或M3S1)、CD2(T-细胞表面抗原CD2,也称作T-细胞表面抗原T11/Leu-5、LFA-2、LFA-3受体、红细胞受体或莲座受体)、CD28(T-细胞-特异性的同型二聚体表面蛋白CD28,也称作Tp44)、CD30(淋巴细胞激活抗原CD30,也称作肿瘤坏死因子受体超家族成员8、CD30L受体或Ki-1)、CD50(也称作细胞间粘附分子-3(ICAM3)或ICAM-R)、CD54(也称作细胞间粘附分子-1(ICAM1)或大组鼻病毒受体)、B7-H1(由激活的T细胞、B细胞和骨髓细胞表达的免疫抑制受体的配体,也称作PD-L1;参见,Dong,等,″B7-H1,a third member of the B7 family,co-stimulatesT-cell proliferation and interleukin-10 secretion,″1999Nat.Med.5:1365-1369)、CD134(也称作肿瘤坏死因子受体超家族成员4、OX40、OX40L受体、ACT35抗原或TAX-转录地激活的糖蛋白1受体)、41BB(4-1BB配体受体、T-细胞抗原4-1BB或T-细胞抗原ILA)、CD153(也称作肿瘤坏死因子配体超家族成员8、CD30配体或CD30-L)、CD154(也称作肿瘤坏死因子配体超家族成员5、CD40配体、CD40-L、TNF-有关的激活蛋白、TRAP或T细胞抗原Gp39)、ICOS(诱导型共同刺激物)、CD3(δ、ε、γ、η和/或ζ链中的一个或多个,单独地或组合地)、CD4(T-细胞表面糖蛋白CD4,也称作T-细胞表面抗原T4/Leu-3)、CD25(也称作白细胞介素-2受体α链、IL-2受体α亚基、p55或Tac抗原)、CD8α(T-细胞表面糖蛋白CD8α链,也称作T-淋巴细胞分化抗原、T8/Leu-2和Lyt-2)、CD 11b(也称作整联蛋白α-M、细胞表面糖蛋白MAC-1α亚基、CR-3α链、白细胞粘附受体Mo l或嗜中性粒细胞粘附受体)、CD14(单核细胞分化抗原CD14,也称作骨髓细胞-特异性的富亮氨酸糖蛋白或LPS受体)、CD56(也称作神经细胞粘附分子1)或CD69(也称作早期T-细胞激活抗原p60、Gp32/28、Leu-23、MLR-3、激活诱导物分子或AIM)和TNF因子(例如TNF-α)。上面的构建体靶和/或靶抗原的列表仅仅是示例性的,而不是穷举的。
在另一个方面,本发明包括结合构建体(或能编码这样的构建体的多核苷酸),其包含CD154胞外结构域,或需要的它的功能部分。在本发明的该方面的一个实施方案中,例如,结合构建体包含CD154胞外结构域,其融合或另外连接第2个结合结构域。第2个结合结构域,例如,可以包含下述组分、基本上由其组成或由其组成:至少一个免疫球蛋白可变区多肽。至少一个免疫球蛋白可变区多肽可以是天然的或工程化的scFv。天然的或工程化的scFv可以是本文公开的或描述的天然的或工程化的scFv。第2个结合结构域,包括天然的或工程化的scFv,可以是能结合例如任一个靶的结合结构域,所述的靶包括本文公开的或描述的靶抗原,包括但不限于,例如,B7-H1、ICOS、L6、CD2、CD3、CD8、CD4、CD11b、CD14、CD19、CD20、CD22、CD25、CD28、CD30、CD37、CD40、CD45、CD50、CD54、CD56、CD69、CD80、CD86、CD134、CD137、CD152、CD153或CD154中的任一个。
在另一个实施方案中,结合结构域多肽包含CTLA-4胞外结构域或需要的它的功能部分,且在另一个实施方案中,至少一个选自CH2恒定区多肽和CH3恒定区多肽的免疫球蛋白重链恒定区多肽是人IgG1恒定区多肽,其是天然的或工程化的。
在另一个实施方案中,至少一个选自CH2恒定区多肽和CH3恒定区多肽的免疫球蛋白重链恒定区多肽是人IgA恒定区多肽,其是天然的或工程化的。
在另一个实施方案中,至少一个选自CH3恒定区多肽和CH4恒定区多肽的免疫球蛋白重链恒定区多肽是人IgE恒定区多肽,其是天然的或工程化的。
在另一个实施方案中,本发明提供了结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白,其包含下述组分、基本上由其组成或由其组成:(a)结合结构域多肽,其融合或另外连接免疫球蛋白铰链区多肽;(b)天然的或工程化的免疫球蛋白重链CH2(或IgE Ch3)恒定区多肽,其融合或另外连接铰链区多肽;和(c)天然的或工程化的免疫球蛋白重链CH3(或IgE CH4)恒定区多肽,其融合或另外连接CH2(或IgE CH3)恒定区多肽,其中(1)结合结构域多肽包含CTLA-4胞外结构域,或其一部分,其能结合或特异性地结合至少一个选自CD80和CD86的CTLA-4配体,(2)该免疫球蛋白铰链区多肽可以如上面或本文所述,且可以包含下述组分、基本上由其组成或由其组成:例如,多肽,其选自天然的或工程化的人IgA铰链区多肽、天然的或工程化的人IgG1铰链区多肽和天然的或工程化的人IgE CH2区域多肽,(3)免疫球蛋白重链恒定区多肽,其包含下述组分、基本上由其组成或由其组成:多肽,其选自天然的或工程化的人IgA重链CH2恒定区多肽、天然的或工程化的人IgG1重链CH2恒定区多肽和天然的或工程化的人IgE重链CH3恒定区多肽,(4)免疫球蛋白重链恒定区多肽,其包含下述组分、基本上由其组成或由其组成:多肽,其选自天然的或工程化的人IgA重链CH3恒定区多肽、天然的或工程化的人IgG1重链CH 3恒定区多肽和天然的或工程化的人IgE重链CH4恒定区多肽,和(5)结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白,其能诱导至少一种选自下述的免疫活性:依赖抗体的细胞介导细胞毒性、CDC和补体固定。在另一个实施方案中,结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白能诱导2种选自下述的免疫活性:依赖抗体的细胞介导细胞毒性、CDC和补体固定。
在另一个实施方案中,本发明提供了结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白,其包含下述组分、基本上由其组成或由其组成:(a)结合结构域多肽,其融合或另外连接免疫球蛋白铰链区多肽,其中所述的铰链区多肽可以如上面或本文所述,且可以包含下述组分、基本上由其组成或由其组成:例如,天然的或工程化的人IgE铰链-作用区域,即,IgE CH2区域多肽;(b)第一个天然的或工程化的免疫球蛋白重链恒定区多肽,其融合或另外连接铰链区多肽,其中所述的天然的或工程化的恒定区多肽包含下述组分、基本上由其组成或由其组成:天然的或工程化的人IgE CH3恒定区多肽;和(c)第二个天然的或工程化的免疫球蛋白重链恒定区多肽,其融合或另外连接第一个天然的或工程化的恒定区多肽,其中所述的天然的或工程化的第二个恒定区多肽包含下述组分、基本上由其组成或由其组成:天然的或工程化的人IgECH4恒定区多肽,且其中(1)结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白能诱导至少一种免疫活性,其选自依赖抗体的细胞介导细胞毒性和变态反应机理的诱导,和(2)结合结构域多肽能结合或特异性地结合抗原。在另一个实施方案中,抗原是肿瘤抗原。
在某些其他的实施方案中,本发明提供了结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白,其包含下述组分、基本上由其组成或由其组成:(a)结合结构域多肽,其融合或另外连接免疫球蛋白铰链区多肽,其中结合结构域多肽能结合或特异性地结合存在于免疫效应细胞上的至少一种抗原,且其中铰链区多肽可以如上面或本文所述,且可以包含下述组分、基本上由其组成或由其组成:例如,选自下述的多肽,天然的或工程化的人IgA铰链区多肽、天然的或工程化的人IgG铰链区多肽和天然的或工程化的人IgE铰链-作用区域,即,IgE CH2区域多肽;(b)第一个天然的或工程化的免疫球蛋白重链恒定区多肽,其融合或另外连接铰链区多肽,其中所述的第一个天然的或工程化的恒定区多肽包含选自下述的多肽、基本上由其组成或由其组成:天然的或工程化的人IgA CH2恒定区多肽、天然的或工程化的人IgG CH2恒定区多肽和天然的或工程化的人IgE CH3恒定区多肽;(c)第二个天然的或工程化的免疫球蛋白重链恒定区多肽,其融合或另外连接第一个恒定区多肽,其中所述的第二个恒定区多肽包含选自下述的多肽、基本上由其组成或由其组成:天然的或工程化的人IgA CH3恒定区多肽、天然的或工程化的人IgG CH3恒定区多肽和天然的或工程化的人IgECH4恒定区多肽;和(d)天然的或工程化的质膜锚定结构域多肽。在该实施方案的一个实例中,质膜锚定结构域多肽通过天然的或工程化的糖基-磷脂酰肌醇-键连接到膜上。在另一个实施方案中,质膜锚定结构域多肽包含下述组分、基本上由其组成或由其组成:天然的或工程化的跨膜结构域多肽。在另一个实施方案中,膜锚定结构域多肽包含下述组分、基本上由其组成或由其组成:天然的或工程化的跨膜结构域多肽和天然的或工程化的细胞质尾区多肽。在另一个实施方案中,细胞质尾区多肽包含下述组分、基本上由其组成或由其组成:天然的或工程化的细胞凋亡信号传导多肽序列,其在另一个实施方案中是从天然的或工程化的受体死亡结构域多肽、死亡结构域或任一种的功能部分衍生或构建的。在另一个实施方案中,天然的或工程化的死亡结构域多肽包含下述组分、基本上由其组成或由其组成:例如,天然的或工程化的多肽,其选自ITIM结构域(基于免疫受体Tyr的抑制基序)、ITAM结构域(基于免疫受体Tyr的激活基序)、TRAF、RIP、CRADD、FADD(Fas-有关的死亡结构域)、TRADD(肿瘤坏死因子受体类型1有关的死亡结构域蛋白)、RAIDD(也称作RAID)、CD95(肿瘤坏死因子受体超家族成员6,也称作FASL受体、细胞凋亡-介导性表面抗原FAS、FAS和Apo-1抗原)、TNFR1和/或DR5(死亡受体-5)。在另一个实施方案中,天然的或工程化的细胞凋亡信号传导多肽序列包含下述组分、基本上由其组成或由其组成:例如,源自天然的或工程化的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶多肽的多肽序列,所述天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶是天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3或天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-8或天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-10,包括天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶8/FLICE/MACH/Mch5和天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶10/Flice2/Mch4。在另一个实施方案中,质膜锚定结构域多肽包含下述组分、基本上由其组成或由其组成:例如,天然的或工程化的糖基-磷脂酰肌醇-键多肽序列。在另一个实施方案中,存在于免疫效应细胞上的抗原是,例如,CD2、CD16、CD28、CD30、CD32、CD40、CD50、CD54、CD64、CD80、CD86、B7-H1、CD134、CD137、CD152、CD153、CD154、ICOS、CD19、CD20、CD22、CD37、L6、CD3、CD4、CD25、CD8、CD11b、CD14、CD56或CD69。在另一个实施方案中,人IgG是天然的或工程化的人IgG1。这些结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白能诱导,例如,至少一种选自依赖抗体的细胞介导细胞毒性和/或补体固定和/或CDC的免疫活性,且能结合或特异性地结合靶,包括,例如,靶抗原。在其他的实施方案中,结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白能诱导,例如,选自依赖抗体的细胞介导细胞毒性和/或补体固定和/或CDC的2种免疫活性,且能结合或特异性地结合靶。免疫效应细胞包括,例如,粒细胞、肥大细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、NK细胞、T细胞(包括Th1细胞、Th2细胞、Tc细胞、记忆T细胞、裸细胞和大颗粒淋巴细胞等)和B细胞。本发明的该实施方案还包括这样的蛋白在治疗中的应用,和,例如,这样的载体在体内和离体(exvivo)基因治疗中的应用。上面的构建体组分和靶的列表不是穷尽的,且可以包括任何需要的靶或组分,其可以起本文所述的作用,或可以用于本文所述的目的。
在另一个实施方案中,本发明提供了具有第一个蛋白基序的蛋白,其包含下述组分、基本上由其组成或由其组成:(1)天然的或工程化的免疫球蛋白铰链区或铰链-作用区(例如,IgE CH2)多肽,其融合或另外连接到(2)天然的或工程化的CH2恒定区多肽(或天然的或工程化的IgE CH3恒定区多肽)。所述的第一个蛋白基序可以融合或另外连接1个或多个其他这样的第一个蛋白基序,以形成第二个蛋白基序,该第二个蛋白基序融合或另外连接到(3)天然的或工程化的CH3恒定区(或天然的或工程化的IgE CH4恒定区),以形成第三个蛋白基序。所述的第一个、第二个或第三个蛋白基序可以融合或另外连接到1个或多个本文所述的天然的或工程化的质膜锚定结构域多肽,其包括,例如,天然的或工程化的跨膜结构域多肽和天然的或工程化的跨膜结构域多肽和天然的或工程化的细胞质尾区多肽,例如,天然的或工程化的细胞凋亡信号传导多肽序列,其可以从天然的或工程化的受体死亡结构域多肽、死亡结构域或任一种的功能部分衍生或构建。因而,在本发明的该方面内的蛋白或多核苷酸可以是,例如,铰链-CH2-CH3-跨膜结构域-死亡结构域构建体。它也可以是,例如,(铰链-CH2)x-CH3-跨膜结构域-死亡结构域构建体,其中X是2至约5,或者达到需要的长度或Fc受体结合和/或补体固定功能所需的这样的其他的数字。本发明的该实施方案也包括能编码这样的蛋白的多核苷酸、包含这样的多核苷酸的载体和含有这样的多核苷酸和载体的宿主细胞。本发明的该实施方案还包括这样的蛋白在治疗中的用途,和,例如,这样的多核苷酸和/或载体在体内和离体基因治疗中的用途。在另一个实施方案中,本发明提供了结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白,其包含下述组分、基本上由其组成或由其组成:(a)结合结构域多肽,其融合或另外连接免疫球蛋白铰链区多肽,其中结合结构域多肽能结合或特异性地结合至少一种存在于癌细胞表面上的抗原,且其中该铰链区多肽可以如上面或本文所述,且可以包含下述组分、基本上由其组成或由其组成:例如,选自下述的多肽,天然的或工程化的人IgA铰链区多肽、天然的或工程化的人IgG铰链区多肽和天然的或工程化的人IgE铰链-作用区域,即,IgE CH2,区域多肽;(b)第一个天然的或工程化的免疫球蛋白重链恒定区多肽,其融合或另外连接铰链区多肽,其中该第一个恒定区多肽包含下述组分、基本上由其组成或由其组成:多肽,它是天然的或工程化的人IgA CH2恒定区多肽、天然的或工程化的人IgG CH2恒定区多肽或天然的或工程化的人IgE CH3恒定区多肽;和(c)第二个天然的或工程化的免疫球蛋白重链恒定区多肽,其融合或另外连接第一个恒定区多肽,其中该第二个恒定区多肽包含下述组分、基本上由其组成或由其组成:多肽,它是天然的或工程化的人IgA CH3恒定区多肽、天然的或工程化的人IgGCH3恒定区多肽或天然的或工程化的人IgE CH4恒定区多肽。在另一个实施方案中,该人IgG多肽是天然的或工程化的人IgG1多肽。
在另一个实施方案中,本发明提供了结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白,其包含下述组分、基本上由其组成或由其组成:(a)结合结构域多肽,其融合或另外连接免疫球蛋白铰链区多肽,其中所述的铰链区多肽可以如上面或本文所述,且可以包含下述组分、基本上由其组成或由其组成:例如,野生型或工程化的人IgA铰链区多肽;(b)天然的或工程化的免疫球蛋白重链CH2恒定区多肽,其融合或另外连接铰链区多肽,其中所述的天然的或工程化的CH2恒定区多肽包含下述组分、基本上由其组成或由其组成:天然的或工程化的人IgA CH2恒定区多肽;和(c)天然的或工程化的免疫球蛋白重链CH3恒定区多肽,其融合或另外连接天然的或工程化的CH2恒定区多肽,其中该天然的或工程化的CH3恒定区多肽包含下述组分、基本上由其组成或由其组成:多肽,它是(i)野生型人IgA CH3恒定区多肽或其他的IgA区域,优选人的或人源化的,其能与J链结合,(ii)突变的、改变的或另外工程化的人IgA CH3恒定区多肽,其不能,例如,与J链结合,其中(1)结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白能具有至少一种选自依赖抗体的细胞介导细胞毒性、CDC和补体固定的免疫活性,和(2)结合结构域多肽能结合或特异性地结合靶,例如,抗原。在某些其他的实施方案中,不能与J链结合的突变的人IgA CH3恒定区多肽是(i)多肽,其包含下述组分、基本上由其组成或由其组成:如SEQ ID NO:69所述的氨基酸序列,或(ii)多肽,其包含下述组分、基本上由其组成或由其组成:如SEQ ID NO:74所述的氨基酸序列。在其他的实施方案中,IgA铰链区多肽是天然的或工程化的IgA1铰链区多肽或天然的或工程化的IgA2铰链区多肽。在其他的实施方案中,IgA铰链区多肽与野生型IgA1或IgA2铰链区多肽的不同之处是,例如,在所述的野生型铰链区内的1个或多个半胱氨酸残基的改变、取代或缺失。
在某些其他的实施方案中,本发明提供了结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白,其包含下述组分、基本上由其组成或由其组成:(a)结合结构域多肽,其融合或另外连接免疫球蛋白铰链区多肽;(b)天然的或工程化的免疫球蛋白重链CH2恒定区多肽,其融合或另外连接铰链区多肽,其中该天然的或工程化的CH2恒定区多肽包含下述组分、基本上由其组成或由其组成:天然的或工程化的美洲驼CH2恒定区多肽,它是天然的或工程化的美洲驼IgG1 CH2恒定区多肽、天然的或工程化的美洲驼IgG2 CH2恒定区多肽或天然的或工程化的美洲驼IgG3 CH2恒定区多肽;和(c)天然的或工程化的免疫球蛋白重链CH3恒定区多肽,它融合或另外连接到天然的或工程化的CH2恒定区多肽,其中所述的天然的或工程化的CH3恒定区多肽包含下述组分、基本上由其组成或由其组成:天然的或工程化的美洲驼CH3恒定区多肽,其选自天然的或工程化的美洲驼IgG1 CH3恒定区多肽、天然的或工程化的美洲驼IgG2 CH3恒定区多肽和天然的或工程化的美洲驼IgG3 CH3恒定区多肽,其中(1)结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白能具有至少一种选自依赖抗体的细胞介导细胞毒性、固定补体和CDC的免疫活性,和(2)结合结构域多肽能结合或特异性地结合靶,例如靶抗原。在另一个实施方案中,免疫球蛋白铰链区多肽、天然的或工程化的美洲驼CH2恒定区多肽和天然的或工程化的美洲驼CH3恒定区多肽包含源自天然的或工程化的美洲驼IgG1多肽的序列,且该融合蛋白不包含天然的或工程化的美洲驼IgG1 CH1结构域。在某些实施方案中,本发明提供了任一种上述的结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白,其中铰链区多肽突变、工程化或另外改变成含有糖基化作用位点,其在某些其他的实施方案中是天冬酰胺-连接的糖基化作用位点、O-连接的糖基化作用位点、C-甘露糖基化位点、糖基磷脂酰肌醇化位点或磷酸糖化位点。
在本发明的某些实施方案中,提供了任一种上面或本文所述的结合构建体,其包括结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白,其中结合区或结合结构域多肽包含2个或更多个结合结构域多肽序列,其中每个结合结构域多肽序列能结合或特异性地结合靶,例如抗原,该靶或抗原可以相同或不同。天然的,更优选地工程化的IgD铰链是本发明的双特异性的分子的结合结构域之间的理想的连接区,即,其具有2个或更多个结合结构域,优选2个。野生型人IgD铰链具有1个半胱氨酸,其能与天然的IgD结构中的轻链形成二硫键。需要突变或缺失人IgD铰链中的该半胱氨酸以用作例如双特异性的分子的结合结构域之间的连接区。本发明的范围还包括,IgD铰链中的其他氨基酸变化或缺失或改变,其不会导致不想要的铰链刚性。来自其他物种的天然的或工程化的IgD铰链区也在本发明的范围内,来自非-人物种的人源化的天然的或工程化的IgD铰链也如此。在某些实施方案中,本发明还提供了结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白,其包含下述组分、基本上由其组成或由其组成:(a)结合结构域多肽,其融合或另外连接免疫球蛋白铰链区多肽,其中该铰链区多肽可以如上面或本文所述,且可以包含下述组分、基本上由其组成或由其组成:例如,可变铰链区多肽序列;(b)第一个天然的或工程化的免疫球蛋白重链恒定区,例如IgG或IgA CH2恒定区多肽(或IgE CH3恒定区多肽),其融合或另外连接到铰链区多肽;和(c)第二个天然的或工程化的免疫球蛋白重链恒定区,例如IgG或IgA CH3恒定区多肽(或IgE CH4恒定区多肽),其融合或另外连接第一个恒定区多肽,其中:(1)结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白能具有至少一种选自依赖抗体的细胞介导细胞毒性、CDC和补体固定的免疫活性,和(2)结合结构域多肽能结合或特异性地结合靶,例如抗原。
在另一个实施方案中,提供了结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白,其包含下述组分、基本上由其组成或由其组成:(a)结合结构域多肽,其融合或另外连接免疫球蛋白铰链区多肽,其中结合结构域多肽能结合或特异性地结合至少一种靶,例如抗原,其存在于癌细胞表面上,且其中该铰链区多肽可以如上面或本文所述,且可以包含下述组分、基本上由其组成或由其组成:例如,可变铰链区多肽序列;(b)第一个天然的或工程化的免疫球蛋白重链恒定区多肽,其融合或另外连接铰链区多肽,其中所述的天然的或工程化的恒定区多肽包含选自下述的多肽、基本上由其组成或由其组成:天然的或工程化的人IgA CH2恒定区多肽、天然的或工程化的人IgG CH2恒定区多肽和天然的或工程化的人IgE CH3恒定区多肽;和(c)第二个免疫球蛋白重链恒定区多肽,其融合或另外连接第一个恒定区多肽,其中该第二个恒定区多肽包含下述组分、基本上由其组成或由其组成:多肽,它是天然的或工程化的人IgA CH3恒定区多肽、天然的或工程化的人IgG CH3恒定区多肽或天然的或工程化的人IgE CH4恒定区多肽。在某些其他的实施方案中,可变铰链区多肽序列包含下述组分、基本上由其组成或由其组成:此处示出的任一个构建体中Ig铰链区的至少10个连续氨基酸的多肽序列。
在某些实施方案中,本发明提供了多核苷酸或载体(包括克隆载体和表达载体)或转化的或转染的细胞,包括分离的或纯化的或纯的多核苷酸、载体和分离的转化的或转染的细胞,其能编码或含有任一种上面或本文所述的本发明的多肽或蛋白构建体,例如,包括结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白。因而,在各种实施方案中,本发明提供了重组克隆或表达构建体,其包含任一种这样的可操作地连接到启动子上的多核苷酸。
在其他的实施方案中,提供了用任一种这样的重组克隆或表达构建体转化的或转染的宿主细胞,或含有它们的宿主细胞。宿主细胞包括经历了离体细胞治疗(包括,例如,离体基因治疗)的受试者的细胞。
在有关的实施方案中,提供了生产本发明的多肽或蛋白或其他的构建体(例如,包括结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白)的方法,其包含下述步骤:(a)在允许表达构建体(例如,结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白)的条件下,培养如本文所述或提供的宿主细胞;和(b)从宿主细胞或宿主细胞培养物中,分离构建体,例如,结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白。
在另一个实施方案中,提供了药物组合物,其包含任一种上面或本文所述的本发明的多肽或蛋白或其他的构建体,例如(包括,例如,结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白),其与生理上可接受的载体相组合。
在另一个实施方案中,本发明提供了药物组合物,其包含,例如,分离的、纯化的或纯的多核苷酸,其能编码任一种本发明的多肽或蛋白构建体,例如(包括,例如,结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白),其与生理上可接受的载体相组合,或例如,与基因治疗送递媒介物或载体相组合或在其中。
在另一个实施方案中,本发明提供了治疗患有或怀疑患有恶性状况或B细胞障碍的受试者的方法,包含给患者施用治疗有效量的任一种本文所述的或要求保护的药物组合物。
在某些其他的实施方案中,恶性状况或B细胞障碍是B细胞淋巴瘤或B细胞白血病,或特征在于自身抗体生产的疾病,且在某些其他的实施方案中,B细胞障碍是,例如,类风湿性关节炎、重症肌无力、Grave氏病、I型糖尿病、多发性硬化或自身免疫病。在某些其他的实施方案中,恶性状况是,例如,黑素瘤、骨髓瘤、神经胶质瘤、星形细胞瘤、淋巴瘤、白血病、癌或肉瘤等。
本发明的另一个方面是,提供结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白,其包含下述组分、基本上由其组成或由其组成:(a)结合结构域多肽,其融合或另外连接免疫球蛋白铰链区多肽,其中所述的铰链区多肽是如本文所述的,且可以选自(i)突变的、工程化的或另外改变的铰链区多肽,其不含有半胱氨酸残基,且其源自具有一个或多个半胱氨酸残基的野生型免疫球蛋白铰链区多肽,(ii)突变的、工程化的或另外改变的铰链区多肽,其含有一个半胱氨酸残基,且其源自具有2个或更多个半胱氨酸残基的野生型免疫球蛋白铰链区多肽,(iii)野生型人IgA铰链区多肽,(iv)突变的、工程化的或另外改变的人IgA铰链区多肽,其不含有半胱氨酸残基,(v)突变的、工程化的或另外改变的人IgA铰链区多肽,其含有一个半胱氨酸残基,和(vi)突变的、工程化的或另外改变的人IgA铰链区多肽,其含有2个半胱氨酸残基;(b)天然的或工程化的免疫球蛋白重链CH2恒定区多肽,其融合或另外连接铰链区多肽;和(c)天然的或工程化的免疫球蛋白重链CH3恒定区多肽,其融合或另外连接CH2恒定区多肽,其中:(1)结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白能具有至少一种选自依赖抗体的细胞介导细胞毒性和补体固定的免疫活性,和(2)结合结构域多肽能结合或特异性地结合抗原。在一个实施方案中,免疫球蛋白铰链区多肽是例如,突变的铰链区多肽,且与含有野生型人免疫球蛋白G铰链区多肽的构建体相比,得到的构建体能表现出减少的二聚化能力。在另一个实施方案中,结合结构域多肽包含下述组分、基本上由其组成或由其组成:至少一种天然的或工程化的免疫球蛋白可变区多肽,它是天然的或工程化的免疫球蛋白轻链可变区多肽和/或天然的或工程化的免疫球蛋白重链可变区多肽。在另一个实施方案中,天然的或工程化的免疫球蛋白可变区多肽源自人免疫球蛋白且,例如,可以是人源化的。
在另一个实施方案中,本发明提供了结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白,其包括结合结构域多肽,其包含下述组分、基本上由其组成或由其组成:(a)至少一种天然的或工程化的免疫球蛋白轻链可变区多肽;(b)至少一种天然的或工程化的免疫球蛋白重链可变区多肽;和(c)至少一种接头肽,其融合或另外连接(a)的多肽和(b)的多肽。在另一个实施方案中,天然的或工程化的免疫球蛋白轻链可变区和天然的或工程化的重链可变区多肽源自人免疫球蛋白,且可以,例如,是人源化的。
在另一个实施方案中,至少一个天然的或工程化的免疫球蛋白重链CH2(或IgE CH3)恒定区多肽和天然的或工程化的免疫球蛋白重链CH3(或IgE CH4)恒定区多肽是从人免疫球蛋白重链衍生或构建的。在另一个实施方案中,天然的或工程化的免疫球蛋白重链恒定区CH2和CH3多肽属于选自人IgG和人IgA的同种型,或从其衍生或另外制备或构建。在另一个实施方案中,靶,例如,靶抗原选自CD16、CD19、CD20、CD37、CD40、CD45RO、CD80、CD86、CD137、CD152和L6。在上述的融合蛋白构建体的某些其他的实施方案中,结合结构域包含下述组分、基本上由其组成或由其组成:scFv,且该scFv含有接头多肽,其包含下述组分、基本上由其组成或由其组成:至少一种多肽,其包含或具有氨基酸序列Gly-GIy-Gly-Gly-Ser[SEQ ID NO:516],且在某些其他的实施方案中,接头多肽包含下述组分、基本上由其组成或由其组成:至少3个多肽的重复,所述多肽具有氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser[SEQ ID NO:516]。在某些实施方案中,免疫球蛋白铰链区多肽包含下述组分、基本上由其组成或由其组成:天然的或工程化的人IdG、IgA、IgD铰链区多肽或天然的或工程化的IgECH2区域多肽。在某些实施方案中,结合结构域多肽包含下述组分、基本上由其组成或由其组成:天然的或工程化的CD154胞外结构域。在某些实施方案中,结合结构域多肽包含下述组分、基本上由其组成或由其组成:天然的或工程化的CD154胞外结构域和至少一种天然的或工程化的免疫球蛋白可变区多肽。
在其他的实施方案中,本发明提供了分离的能编码任一种本发明的构建体的多核苷酸,所述构建体例如,本发明的蛋白或多肽构建体,包括结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白,且在有关的实施方案中,本发明提供了包含这样的多核苷酸的重组表达构建体,且在某些其他的实施方案中,本发明提供了用这样的重组表达构建体转化的或转染的宿主细胞,或另外含有它们的宿主细胞。在另一个实施方案中,本发明提供了生产本发明的构建体的方法,例如,本发明的蛋白或多肽构建体,例如结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白,其包含下述步骤:(a)在允许表达构建体(例如,能编码结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白的构建体)的条件下,培养已经用本发明的多核苷酸构建体转化的或转染的宿主细胞,或另外含有它们的宿主细胞;和(b)从宿主细胞培养物分离构建体,例如,结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白。
本文所述和要求保护的本发明包括新的分子,其可以用于,例如,治疗和其他目的,包括诊断和研究目的。这样的分子具有,例如,抗原结合或其他的结合功能和一种或多种效应子功能。本发明的DNA构建体可以用于,例如,基因治疗,包括体内和离体基因治疗。
在一个方面,本发明的分子的各种构建体包括包含“结合区”、“尾”区和“连接”区的分子,所述的“连接”区能连接结合区和尾区。
在本发明的分子中的结合区可以包含,例如,理想靶(包括抗原-结合靶)的结合结构域。抗原-结合靶的结合结构域可以包含,例如,单链Fv和scFv结构域。在某些实施方案中,本发明的分子可以包含结合区,其具有至少一个免疫球蛋白可变区多肽,后者可以是轻链或重链可变区多肽。在某些实施方案中,本发明的分子可以包含至少一个这样的轻链V-区和一个这样的重链V-区和至少一个能连接V-区的接头肽。在本发明中使用的ScFv也包括具有嵌合结合结构域或其他结构域或序列的那些。在本发明中使用的其他ScFv也包括具有人源化的结合结构域或其他结构域或序列的那些。在这样的实施方案中,根据公认的产生人源化的抗体(即免疫球蛋白序列,其中导入了人Ig序列,以减少人免疫系统感知这样的蛋白作为异物的程度)的方法,可以“人源化”源自非-人来源的所有或部分免疫球蛋白结合序列或其他的序列。
在本发明中使用的scFv的实例,无论是全部或部分地包含作为鼠的或其他的scFv(包括人scFv)、嵌合scFv或人源化的scFv,包括抗-人CD20 scFv(例如,“2H7”scFv)、抗-人CD37 scFv(例如,“G28-1”scFv)、抗-人CD40 scFv(例如,“G28-5”scFv和“40.2.220”scFv)、抗-癌相关抗原scFv(例如,“L6”scFv)、抗-CTLA-4(CD152)scFv(例如,“10A8”scFv)、抗-人CD28scFv(例如,“2E12”scFv)、抗-鼠CD3 scFv(例如,“500A2”scFv)、抗-人CD3 scFv(例如,G19-4scFv)、抗-鼠4-1BB scFv(例如,“1D8”scFv)、抗-人4-1BB scFv(例如,“5B9”scFv)、抗-人CD45RO(例如,“UCHL-1”scFv)和抗-人CD16(例如,“Fc2”scFv)。
在本发明中使用的scFv也包括scFv,其包括嵌合的和人源化的scFv,其具有一个或多个氨基酸取代。优选的氨基酸取代是在可变的重链(VH)的氨基酸位置11的。这样的取代在本文中可以称作“XxxVH11Zxx”。因而,例如,当在位置VH11处正常产生的氨基酸是亮氨酸,且因此取代了丝氨酸氨基酸残基时,将取代定义为“L VH11S”或“Leu VH11Ser”。本发明的其他的优选的实施方案包括含有scFv的分子,其中缺失了在位置VH11正常出现的氨基酸残基。本发明的其他的优选的实施方案包括含有scFv的分子,其中取代或缺失了在位置VH10和/或VH11和/或VH12正常出现的氨基酸残基。
在本发明的分子内的其他结合区可以包含结构域,其包含糖基化作用的位点,例如,碳水化合物部分(例如单糖或寡糖)的共价附着位点。
在本发明的分子内的其他结合区包括多肽,其可以包含蛋白或其一部分,后者能保留特异性地结合另一种分子(包括抗原)的能力。因而,结合区可以包含或源自激素、细胞因子、趋化因子等;这样的多肽配体的细胞表面或可溶的受体;凝集素;细胞间粘附受体例如特异性的白细胞整联蛋白、选择蛋白、免疫球蛋白基因超家族成员、细胞间粘附分子(ICAM-1,-2,-3)等;组织相容性抗原;等。源自这样的分子的结合区通常包括结合靶必需或需要的那些分子部分。
某些构建体包括结合区,其包含受体或受体-结合结构域。用于结合靶的受体结构域包括,例如;CD154胞外结构域或CTLA-4胞外结构域。在另一个实例中,结合结构域可以包括第一个部分,其包含CD154胞外结构域、基本上由其组成或由其组成,和第二个部分,其包含下述组分、基本上由其组成或由其组成:至少一个免疫球蛋白可变区多肽,所述的第二个部分包括,例如,scFv或VH。其他的细胞表面受体可以包含结合区或结合结构域多肽、基本上由其组成或由其组成,或其一部分可以提供结合区或结合结构域多肽,所述受体的实例包括,例如,HER1、HER2、HER3、HER4、表皮生长因子受体(EGFR)、血管内皮细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子受体、胰岛素-样生长因子-I、胰岛素-样生长因子-II、转铁蛋白受体、雌激素受体、孕酮受体、促卵泡激素受体(FSH-R)、视黄酸受体、MUC-1、NY-ESO-1、Melan-A/MART-1、酪氨酸酶、Gp-100、MAGE、BAGE、GAGE、CTA类受体中的任一种,尤其包括由SSX2基因编码的HOM-MEL-40抗原、癌胚抗原(CEA)和PyLT。可以成为结合区或结合结构域多肽的来源的其他细胞表面受体包括,例如,CD2、4-1BB、4-1BB配体、CD5、CD10、CD27、CD28、CD152/CTLA-4、CD40、干扰素-γ(IFN-γ)、白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-17(IL-17)和白细胞介素-17受体(IL-17R)。可以成为结合区和/或结合结构域多肽的来源的其他细胞表面受体包括,例如,CD59、CD48、CD58/LFA-3、CD72、CD70、CD80/B7.1、CD86/B7.2、B7-H1/B7-DC、IL-17、CD43、ICOS、CD3(例如,γ亚基、ε亚基、δ亚基)、CD4、CD25、CD8、CD11b、CD14、CD56、CD69和VLA-4(α4β7)。下面的细胞表面受体一般与B细胞有关:CD19、CD20、CD22、CD30、CD153(CD30配体)、CD37、CD50(ICAM-3)、CD106(VCAM-1)、CD54(ICAM-1)、白细胞介素-12、CD134(OX40)、CD137(41BB)、CD83和DEC-205。这些列表不是穷举的。可以连接结合区,例如上述的那些,例如,通过天然的或工程化的IgD铰链区多肽,优选人或人源化的天然的或工程化的IgD铰链区多肽。本发明因而还提供了构建体,其包含下述组分、基本上由其组成或由其组成:2个结合区,例如,scFv和细胞表面受体(或其一部分),其通过第三个分子连接,例如,本文所述的IgD铰链区多肽。
本文所述的和要求保护的本发明的各种分子包括连接区,其连接分子的一端和另一端。这样的连接区可以包含,例如,免疫球蛋白铰链区多肽,包括可以自然地产生的任意铰链肽或多肽。连接区也可以包括,例如,可以用于连接尾区和结合区的任意的人工肽或其他分子(包括,例如,非-肽分子、部分的肽分子和肽模拟物(peptidomimetics)等)。它们可以包括,例如,位于负责形成CH1和CH2区域内的链内免疫球蛋白-结构域二硫键的氨基酸残基之间的免疫球蛋白重链多肽的分子的改变。自然产生的铰链区包括位于免疫球蛋白的恒定区结构域CH1和CH2之间的那些。有用的免疫球蛋白铰链区多肽包括,例如,人免疫球蛋白铰链区多肽和美洲驼或其他的骆驼科动物免疫球蛋白铰链区多肽。其他的有用的免疫球蛋白铰链区多肽包括,例如,铰口鲨和有斑点的银鲛免疫球蛋白铰链区多肽。人免疫球蛋白铰链区多肽包括,例如,野生型IgG铰链,其包括野生型人IgG1铰链、人IgG-衍生的免疫球蛋白铰链区多肽、人IgG铰链或IgG-衍生的免疫球蛋白铰链区的一部分、野生型人IgA铰链区多肽、人IgA-衍生的免疫球蛋白铰链区多肽、人IgA铰链区多肽或IgA-衍生的免疫球蛋白铰链区多肽的一部分、野生型人IgD铰链区多肽、人Ig-D衍生的免疫球蛋白铰链区多肽、人IgD铰链区多肽或IgD-衍生的免疫球蛋白铰链区多肽的一部分、野生型人IgE铰链-作用区域,即,IgE CH2区域多肽(其通常具有5个半胱氨酸残基)、人IgE-衍生的免疫球蛋白铰链区多肽、人IgE铰链-作用区域的的一部分,即,IgE CH2区域多肽或IgE-衍生的免疫球蛋白铰链区多肽等。被认为具有铰链功能的“源自”免疫球蛋白多肽链区域或是其“一部分或片段”的多肽,在肽连接中具有一个或多个氨基酸,例如15-115个氨基酸,优选地95-110、80-94、60-80或5-65个氨基酸,优选地10-50,更优选地15-35,更优选地18-32,更优选地20-30,更优选地21、22、23、24、25、26、27、28或29个氨基酸。美洲驼免疫球蛋白铰链区多肽包括,例如,IgG1美洲驼铰链。连接区可以包含一段来自免疫球蛋白铰链区的连续氨基酸。例如,连接区可以包含至少5个连续的铰链区氨基酸,至少10个连续的铰链区氨基酸,至少15个连续的铰链区氨基酸,至少20个连续的铰链区氨基酸,和至少25个或更多个连续的铰链区氨基酸,其来自人IgG铰链、人IgA铰链、人IgE铰链、骆驼科动物铰链区、IgG1美洲驼铰链区、铰口鲨铰链区和有斑点的银鲛铰链区,包括例如IgG1铰链区、IgG2铰链区、IgG3铰链区、IgG3铰链区和IgG4铰链区。
这样的连接区也包括,例如,突变的或另外改变的或工程化的免疫球蛋白铰链区多肽。突变的或另外改变的或工程化的免疫球蛋白铰链区多肽可以包含下述组分、基本上由其组成或由其组成:铰链区,其来源是物种、免疫球蛋白同种型或类或免疫球蛋白亚类的免疫球蛋白,它与任一种包含的天然的或工程化的CH2和CH3结构域相同或不同。突变的或另外改变的或工程化的免疫球蛋白铰链区多肽包括从例如野生型免疫球蛋白铰链区衍生或构建的那些,该铰链区含有一个或多个半胱氨酸残基,例如,自然地包含3个半胱氨酸的野生型人IgG或IgA铰链区。在这样的多肽中,通过例如氨基酸取代或缺失或截短,可以减少半胱氨酸残基的数目。这些多肽包括,例如,突变的人或其他的IgG1或IgG4铰链区多肽,其含有0、1或2个半胱氨酸残基,和突变的人或其他的IgA1或IgA2铰链区多肽,其含有0、1或2个半胱氨酸残基。突变的或另外改变的或工程化的免疫球蛋白铰链区多肽包括从例如野生型免疫球蛋白铰链区衍生或构建的那些,该铰链区含有3个或更多个半胱氨酸残基,例如,野生型人IgG2铰链区(其具有4个半胱氨酸)或IgG4铰链区(其具有11个半胱氨酸)。突变的或另外改变的或工程化的免疫球蛋白铰链区多肽包括从例如IgE CH2野生型免疫球蛋白区域衍生或构建的那些,该区域通常含有5个半胱氨酸残基。在这样的多肽中,通过例如氨基酸取代或缺失或截短,可以使半胱氨酸残基的数目减少一个或多个半胱氨酸残基。也包括改变的铰链区多肽,其中用丝氨酸或一种或多种更低极性的、更不疏水的、更亲水的和/或中性的其他氨基酸取代了铰链区中的半胱氨酸残基。这样的突变的免疫球蛋白铰链区多肽包括,例如,突变的铰链区多肽,其含有一个半胱氨酸残基,且其源自具有2个或更多个半胱氨酸残基的野生型免疫球蛋白铰链区多肽,例如突变的人IgG或IgA铰链区多肽,其含有一个半胱氨酸残基,且其源自野生型人IgG或IgA区域多肽。连接区多肽包括免疫球蛋白铰链区多肽,它们的形成链间的、同型二聚体的二硫键的能力受到减弱。
突变的免疫球蛋白铰链区多肽也包括突变的铰链区多肽,其能表现出比野生型人免疫球蛋白G铰链区多肽减少的二聚化能力,和突变的铰链区多肽,其允许表达单体和二聚体分子的混合物。突变的免疫球蛋白铰链区多肽也包括工程化成含有糖基化作用位点的铰链区多肽。糖基化作用位点包括,例如,天冬酰胺-连接的糖基化作用位点、O-连接的糖基化作用位点、C-甘露糖基化位点、糖基磷脂酰肌醇化位点和磷酸糖化位点。
在本文所述的和要求保护的本发明的分子中使用的特异性的连接区包括,例如,下述的18氨基酸序列,DQEPKSCDKTHTCPPCPA(SEQ IDNO:10)、DQEPKSSDKTHTSPPSPA(SEQ ID NO:18)和DLEPKSCDKTHTCPPCPA(SEQ ID NO:12)。其他的特异性的连接区包括,例如,在本文中称作“2H7 scFv(SSS-S)H WCH2 WCH3”和“2H7 scFv(CSS)H WCH2 WCH3”的序列内的突变的铰链,和在本文中称作“2H7 scFv IgAH WCH2 WCH3”的人IgA-衍生的铰链。
在本发明的分子内的尾区可以包括重链恒定区免疫球蛋白序列。尾区因而可以包括,例如,具有至少一个免疫球蛋白重链CH2恒定区多肽和免疫球蛋白重链CH3恒定区多肽的多肽。至少一个免疫球蛋白重链CH2恒定区多肽和免疫球蛋白重链CH3恒定区多肽可以源自人免疫球蛋白重链。因而,例如,CH2和/或CH3多肽可以源自人IgG、人IgA或人IgD分子。尾区也可以包括,例如,具有至少一个免疫球蛋白重链CH3恒定区多肽和免疫球蛋白重链CH4恒定区多肽的多肽。至少一个免疫球蛋白重链CH3恒定区多肽和免疫球蛋白重链CH4恒定区多肽可以源自人免疫球蛋白重链。因而,例如,CH3和/或CH4多肽可以源自人IgE。包含在本发明的分子内的免疫球蛋白重链CH2区域多肽可以,例如,来自IgG1、IgG2、IgG3和/或IgG4亚类。包含在本发明的分子内的免疫球蛋白重链CH3区域多肽也可以,例如,来自IgG1、IgG2、IgG3和/或IgG4亚类。另外,包含在本发明的分子内的免疫球蛋白重链CH2区域多肽和免疫球蛋白重链CH2区域多肽二者都可以,例如,来自IgG1、IgG2、IgG3和/或IgG4亚类。在本发明的其他分子中,选自CH2恒定区多肽和CH3恒定区多肽的至少一个免疫球蛋白重链恒定区多肽是人IgA恒定区多肽。包含在本发明的分子内的免疫球蛋白重链CH2区域多肽可以,例如,来自IgA1和/或IgA2亚类。包含在本发明的分子内的免疫球蛋白重链CH3区域多肽也可以,例如,来自IgA1和/或IgA2亚类。另外,包含在本发明的分子内的免疫球蛋白重链CH2区域多肽和免疫球蛋白重链CH2区域多肽二者都可以,例如,来自IgA1和/或IgA2亚类。在本发明的其他分子中,尾区可以包含CH2和/或CH3恒定区多肽,或基本上由其组成,该多肽包含来自人IgA和/或人IgE的多肽。在其他的实施方案中,例如,在本发明的分子内的尾区可以包含免疫球蛋白重链CH2和/或CH3恒定区多肽,它是突变的(例如,突变的IgA CH3恒定区多肽,其不能与J链结合,其中,例如,该IgA CH3恒定区多肽是人来源的)。尾区也可以包含下述组分、基本上由其组成或由其组成:来自TNF超家族的蛋白,例如,CD 154的胞外部分。
对于目的在于人用的本发明的分子,这些区域一般基本上或完全地是人的,以使针对该分子的潜在的人免疫反应最小化,并提供适当的效应子功能。在本发明的某些实施方案中,例如,尾区包括人IgG1CH3区域序列,即野生型IgA重链恒定区多肽序列,其能或不能结合J链。
在本发明的优选的实施方案中,CH1结构域不包含在分子的尾区中,且结合区的羧基末端直接地或间接地连接在尾区的CH2部分的氨基末端。结合区可以间接地连接尾区,例如通过连接区多肽或其他的连接分子。
本发明也包括在尾区内具有突变的CH2和/或CH3序列的分子。例如,本发明的分子可以包括突变的Fc结构域,其具有一个或多个导入CH2、CH3和/或CH4结构域中的突变。在本发明的某些实施方案中,分子可以包括IgA CH3恒定区多肽,例如人IgA CH3恒定区多肽,其中已经缺失了2个或更多个来自C-末端的残基,以产生截短的CH3恒定区多肽。在本发明的其他实施方案中,分子包括突变的人IgA CH3恒定区多肽,其不能与J链结合,其包含4或18个氨基酸的C-末端缺失。但是,本发明不限于此,从而含有突变的IgA CH3恒定区多肽的分子可以包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21-25、26-30或更多个氨基酸的缺失,只要融合蛋白能特异性地结合抗原且能具有至少一种免疫活性,例如ADCC、CDC或补体固定。本发明也包括含有尾区的分子,该尾区包含突变的IgA CH3恒定区多肽,其能通过替换倒数第二个半胱氨酸,或通过化学修饰该氨基酸残基,以能阻止链间二硫键形成的方式,而不能与J链结合。
本发明的各种分子包括,例如,具有结合结构域多肽的结合结构域scFv-融合蛋白,其包含下述组分、基本上由其组成或由其组成:(a)至少一个免疫球蛋白轻链可变区多肽,(b)至少一个免疫球蛋白重链可变区多肽,和至少一个接头肽,其能连接(a)的多肽和(b)的多肽。这样的多肽可以,例如,源自人免疫球蛋白或非-人免疫球蛋白。
因而,在一个方面,本发明包括非-自然产生的单链蛋白和/或VH蛋白和/或VL蛋白,或任一种上述分子的需要的部分,其包括第一个多肽,后者包含能结合靶分子的结合结构域多肽,第二个多肽,后者包含附着到所述的第一个多肽上的柔性的或其他的需要的接头,第三个多肽,其包含尾区,例如,N-末端截短的免疫球蛋白重链恒定区多肽(或其需要的部分),其附着到第二个多肽上。柔性的接头可以包含下述组分、基本上由其组成或由其组成:免疫球蛋白铰链区或其一部分,其已经被突变或另外改变或工程化,例如,含有的半胱氨酸残基的数目小于存在于野生型免疫球蛋白铰链区或其一部分中的半胱氨酸残基的数目(例如,在IgG1或IgG4的情况下,0、1或2个半胱氨酸),且其中所述的非-自然产生的单链蛋白能具有至少一种免疫活性,例如,ADCC、CDC和/或补体固定。单链蛋白可以具有2种免疫活性包括,例如,ADCC、CDC和/或补体固定。该蛋白可以包括结合结构域多肽,它是单链Fv。另外,该蛋白可以包括结合结构域多肽,它是单链Fv,其中单链Fv的重链可变区在氨基酸位置9、10、11、12、108、110和112中的一个或多个具有氨基酸缺失或取代。该蛋白也可以包括结合结构域多肽,它是单链Fv,其中单链Fv的轻链可变区在氨基酸位置12、80、81、83、105、106和107中的一个或多个具有氨基酸缺失或取代。
在另一个方面,本发明包括非-自然产生的VH蛋白,或其需要的部分,其包含下述组分、基本上由其组成或由其组成:单独地或与任何其他的分子或构建体组合地,VH区域或其一部分,其在所述的VH区域的氨基酸位置9、10、11、12、108、110和112中的一个或多个具有氨基酸缺失或取代。可以用自然产生的或非-自然产生的氨基酸或任何其他的需要的有用的分子取代氨基酸。
还描述和要求保护的是VH蛋白或其需要的部分的用途,其包含下述组分、基本上由其组成或由其组成:单独地或与任何其他的分子或构建体组合地,VH区域或其一部分,其在所述的VH区域的氨基酸位置9、10、11、12、108、110和112中的一个或多个具有氨基酸缺失或取代。这样的用途包括在噬菌体展示、酵母展示和核糖体展示系统和方法中的用途。
在另一个方面,本发明包括非-自然产生的VL蛋白,或其需要的部分,其包含下述组分、基本上由其组成或由其组成:单独地或与任何其他的分子组合地,VL区域或其一部分,其在所述的VL区域的氨基酸位置12、80、81、83、105、106和107中的一个或多个具有氨基酸缺失或取代。可以用自然产生的或非-自然产生的氨基酸或任何其他的需要的有用的分子取代氨基酸。
还描述和要求保护的是VL蛋白或其需要的部分的用途,其包含下述组分、基本上由其组成或由其组成:单独地或与任何其他的分子组合地,VL区域或其一部分,其在所述的VL区域的氨基酸位置12、80、81、83、105、106和107中的一个或多个具有氨基酸缺失或取代。这样的用途包括在噬菌体展示、酵母展示和核糖体展示系统和方法中的用途。
在另一个方面,本发明包括分子,其包含下述组分、基本上由其组成或由其组成:(1)VH蛋白,或其需要的部分,其中该VH蛋白或其一部分在氨基酸位置9、10、11、12、108、110和112中的一个或多个具有氨基酸缺失或取代,和(2)非-自然产生的VL蛋白,或其需要的部分,单独地或与任何其他的分子组合地,其中该VL蛋白或其一部分在氨基酸位置12、80、81、83、105、106和107中的一个或多个具有氨基酸缺失或取代。可以用自然产生的或非-自然产生的氨基酸或任何其他的需要的有用的分子取代氨基酸。
还描述和要求保护的是分子的用途,其包含下述组分、基本上由其组成或由其组成:(1)VH蛋白,或其需要的部分,其中该VH蛋白或其一部分在氨基酸位置9、10、11、12、108、110和112中的一个或多个具有氨基酸缺失或取代,和(2)非-自然产生的VL蛋白,或其需要的部分,单独地或与任何其他的分子组合地,其中该VL蛋白或其一部分在氨基酸位置12、80、81、83、105、106和107中的一个或多个具有氨基酸缺失或取代。这样的用途包括在噬菌体展示、酵母展示和核糖体展示系统和方法中的用途。
本发明也包括分子构建体,其中结合结构域是单链Fv,且所述的单链Fv的重链可变区在氨基酸位置11具有氨基酸取代。取代单链Fv重链可变区的位置11氨基酸的氨基酸可以选自丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸。本发明因而包括,例如,构建体,其中结合结构域是单链Fv,且所述的单链Fv的重链可变区在氨基酸位置11具有丝氨酸氨基酸取代。在本文中指出了其他的氨基酸位置变化、取代和缺失。
本发明也包括,例如,构建体,其中结合结构域是单链Fv,且已经缺失了在所述的单链Fv的重链可变区的位置10和/或11的氨基酸。
在另一个方面,本发明包括构建体,其中结合区能结合肿瘤或肿瘤相关抗原。本发明的构建体的结合区可以结合,例如,癌细胞抗原。本发明的构建体结合的癌细胞抗原包括癌细胞表面抗原和细胞内的癌细胞抗原。
在另一个方面,本发明包括构建体,其中结合区能结合免疫效应细胞上的抗原。
在另一个方面,本发明包括构建体,其中结合区能结合B细胞抗原,所述抗原包括,例如,选自CD19、CD20、CD22、CD37、CD40、CD80和CD86的B细胞抗原。能结合这样的B细胞抗原的本发明的构建体包括,例如,包含单链Fv的结合区。这样的单链Fv结合区的实例包括包含单链Fv或基本上由单链Fv组成的分子,该单链Fv选自HD37单链Fv、2H7单链Fv、G28-1单链Fv和4.4.220单链Fv。其他的实例包括结合区,其包含CTLA-4的胞外结构域、基本上由其组成或由其组成。
在另一个方面,本发明包括构建体,其中结合区能结合B细胞分化抗原。B细胞分化抗原包括,例如,CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD37、CD40、CD45RO、CD80、CD86和HLA II类。
在另一个方面,本发明包括构建体,其中结合区能结合靶,所述靶选自CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD8、CD10、CD11b、CD14、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD28、CD30、CD37、CD40、CD43、CD50(ICAM3)、CD54(ICAM1)、CD56、CD69、CD80、CD86、CD134(OX40)、CD137(41BB)、CD152(CTLA-4)、CD153(CD30配体)、CD154(CD40配体)、ICOS、L6、B7-H1、和HLA II类。
本发明也包括蛋白构建体,其具有结合区、尾区和连接区,其中该蛋白构建体能作为单体或基本上以单体形式存在于溶液中。
本发明也包括蛋白构建体,其具有结合区、尾区和连接区,其中该蛋白构建体能形成复合物,后者包含2个或更多个所述的蛋白构建体,包括,例如,其中所述的复合物是二聚体。
在另一个方面,本发明的构建体能直接地或间接地参与或诱导或引起或辅助诱导或引起至少一种免疫活性,其选自依赖抗体的细胞介导细胞毒性、依赖补体的细胞毒性(或补体-介导的溶解)、补体固定、细胞凋亡的诱导、一种或多种生物活性的信号的诱导、一种或多种免疫效应细胞的诱导、细胞分化的激活、细胞的激活、一种或多种生物活性分子的释放和传染物或毒素的中和。
在另一个方面,本发明的结合构建体能通过激活或抑制选自下述的一种或多种分子来诱导生物活性的信号:蛋白激酶、蛋白磷酸酶、G-蛋白、环核苷酸或其他的第二信使、离子通道和分泌途径组分。这样的生物活性的分子是,例如,蛋白酶。其他的生物活性的分子是,例如,细胞因子,实例包括单核因子、淋巴因子、趋化因子、生长因子、集落刺激因子、干扰素和白细胞介素。
在另一个方面,本发明的构建体能诱导或参与诱导一种或多种选自下述的免疫效应细胞:NK细胞、单核细胞、巨噬细胞、B细胞、T细胞、肥大细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞。
在另一个方面,本发明的构建体能诱导或参与诱导一种或多种免疫效应细胞,其能导致依赖抗体的细胞介导细胞毒性或一种或多种生物活性分子的释放。
在另一个方面,本发明的构建体能参与和/或启动靶细胞内的细胞凋亡,例如,通过激活一种或多种信号传导机制或分子。
在另一个方面,本发明的构建体能诱导或参与诱导细胞的激活,其中所述的激活能导致细胞转录活性的变化。在一个实施方案中,增加了细胞转录活性。在另一个实施方案中,降低了细胞转录活性。
在另一个方面,具有尾区的本发明的构建体能诱导或参与诱导嗜中性粒细胞和/或肥大细胞的脱粒,所述的尾区包含下述组分、基本上由其组成或由其组成:来自IgA或IgE分子的恒定区。
在另一个方面,本发明的构建体能促进或参与促进传染物的中和,其中所述的传染物是,例如,细菌、病毒、寄生物或真菌。
在另一个方面,本发明的构建体能促进或参与促进毒素的中和,其中所述的毒素选自内毒素和外毒素。这样的毒素包括,例如,外毒素,其选自炭疽毒素、霍乱毒素、白喉毒素、百日咳毒素、大肠杆菌(E.coli)热-不稳定的毒素LT、大肠杆菌热稳定的毒素ST、志贺菌毒素假单胞菌(Pseudomonas)外毒素A、肉毒杆菌毒素、破伤风毒素、百日咳博德特氏菌(Borderella pertussis)AC毒素和炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)EF毒素。其他的毒素包括,例如,蛤蚌毒素、河豚毒素、蘑菇毒素(鹅膏毒素、鹿花毒素、orellanine,等)、黄曲霉毒素、双吡咯烷类生物碱、植物凝集素和木藜芦毒素类。
在另一个方面,本发明的构建体能结合细胞内的靶,以例如,实现(或参与实现)细胞功能。这样的构建体包括,例如,包含尾区的构建体,其包含下述组分、基本上由其组成或由其组成:天然的或工程化的IgA CH2结构域区域和天然的或工程化的IgA CH3结构域区域,所述的尾区能结合J链。在例如2H7 scFv IgAH WIgACH2 WCH3+J链构建体中,发现了这样的尾区。因而,本发明包括构建体,其具有,例如,“抗-细胞内的靶”结合结构域(例如,和“抗-细胞内的靶”scFv)、连接区和天然的或工程化的能结合J链的I gA恒定区(例如,WIgACH2WCH3)。
在另一个方面,本发明的构建体包括分子,其中N-末端免疫球蛋白重链恒定区多肽包含IgG CH2恒定区多肽,后者附着在免疫球蛋白重链IgG CH3恒定区多肽上。
在另一个方面,本发明包括减少受试者中的靶细胞群体的方法,其包含给所述的受试者施用治疗有效量的蛋白分子,其小于约120kK,或小于约150kD,如通过例如HPLC和非-还原凝胶测得的,且基本上由下述组分组成:(a)第一个蛋白或肽分子,其能结合所述的靶细胞群体内的细胞,和(b)第二个蛋白或肽分子,其能(i)结合Fc受体和/或(ii)诱导靶细胞细胞凋亡,和/或(iii)固定补体,其中所述的第一个蛋白或肽分子直接地连接到所述的第二个蛋白或肽分子,或者,任选地,所述的第一个蛋白或肽分子和所述的第二个蛋白或肽分子通过第三个蛋白或肽分子相连,其中所述的蛋白分子不是抗体、TNF家族或TNF受体家族的成员,且不能结合细菌毒素、细胞毒性的药物或放射性同位素。
在另一个方面,本发明也包括单链蛋白,其包含下述组分、基本上由其组成或由其组成:(i)第一个多肽,其具有能结合靶分子的结合结构域多肽;(ii)第二个多肽,其包含附着到所述的第一个多肽的C-末端的连接区;和(iii)第三个多肽,其包含N-末端截短的免疫球蛋白重链恒定区多肽,后者附着到所述的第二个多肽的C-末端上,其中所述的单链蛋白能具有至少一种免疫活性,且前提是(a)当连接区多肽包含不具有半胱氨酸残基的IgG铰链区多肽时,结合结构域多肽靶不是CD20或L6,或(b)当连接区多肽包含不具有半胱氨酸残基的IgG铰链区多肽时,单链蛋白不是能结合CD20的1F5 scFv。本发明也包括单链蛋白,其包含下述组分、基本上由其组成或由其组成:(i)第一个多肽,其具有能结合靶分子的结合结构域多肽;(ii)第二个多肽,其包含附着到所述的第一个多肽的C-末端的连接区;和(iii)第三个多肽,其包含N-末端截短的免疫球蛋白重链恒定区多肽,后者附着到所述的第二个多肽的C-末端上,其中所述的单链蛋白能结合靶细胞上或内的靶分子,并体内地降低靶细胞的数目和/或体内地减少靶细胞群体。本发明也包括单链蛋白,其包含下述组分、基本上由其组成或由其组成:(i)第一个多肽,其具有能结合靶分子的结合结构域多肽;(ii)第二个多肽,其包含附着到所述的第一个多肽的C-末端的连接区;和(iii)第三个多肽,其包含N-末端截短的免疫球蛋白重链恒定区多肽,后者附着到所述的第二个多肽的C-末端上,其中所述的单链蛋白能诱导依赖抗体的细胞介导细胞毒性和补体固定。本发明也包括单链蛋白,其包含下述组分、基本上由其组成或由其组成:(i)第一个多肽,其具有能结合靶分子的结合结构域多肽;(ii)第二个多肽,其包含附着到所述的第一个多肽的C-末端的连接区;和(iii)第三个多肽,其包含N-末端截短的免疫球蛋白重链恒定区多肽,后者附着到所述的第二个多肽的C-末端上,其中所述的单链蛋白能(1)诱导依赖抗体的细胞介导细胞毒性和补体固定,和(2)结合靶细胞上或内的靶分子,并体内地降低靶细胞的数目和/或体内地减少靶细胞群体。本发明也包括单链蛋白,其包含下述组分、基本上由其组成或由其组成:(i)第一个多肽,其具有能结合靶分子的结合结构域多肽;(ii)第二个多肽,其包含附着到所述的第一个多肽的C-末端的连接区;和(iii)第三个多肽,其包含N-末端截短的免疫球蛋白重链恒定区多肽,后者附着到所述的第二个多肽的C-末端上,其中当所述的连接区包含至少具有第一个、第二个和第三个半胱氨酸残基的IgG铰链区多肽时,所述的第一个半胱氨酸是所述的第二个半胱氨酸的N-末端,且所述的第二个半胱氨酸是所述的第三个半胱氨酸的N-末端,所述的第二个和第三个半胱氨酸残基中的1个或2个是取代的或缺失的,且其中所述的单链蛋白能具有至少一种免疫活性。本发明也包括单链蛋白,其包含下述组分、基本上由其组成或由其组成:(i)第一个多肽,其具有能结合靶分子的结合结构域多肽;(ii)第二个多肽,其包含附着到所述的第一个多肽的C-末端的连接区;和(iii)第三个多肽,其包含N-末端截短的免疫球蛋白重链恒定区多肽,后者附着到所述的第二个多肽的C-末端上,其中当所述的连接区包含至少具有第一个、第二个和第三个半胱氨酸残基的IgG铰链区多肽时,所述的第一个半胱氨酸是所述的第二个半胱氨酸的N-末端,且所述的第二个半胱氨酸是所述的第三个半胱氨酸的N-末端,所述的第二个和第三个半胱氨酸残基中的1个或2个是取代的或缺失的,且其中所述的单链蛋白能诱导至少一种选自下述的免疫活性:(a)依赖抗体的细胞介导细胞毒性和(b)补体固定。本发明也包括单链蛋白,其包含下述组分、基本上由其组成或由其组成:(i)第一个多肽,其具有能结合靶分子的结合结构域多肽;(ii)第二个多肽,其包含附着到所述的第一个多肽的C-末端的连接区;和(iii)第三个多肽,其包含N-末端截短的免疫球蛋白重链恒定区多肽,后者附着到所述的第二个多肽的C-端,其中当所述的连接区包含至少具有第一个、第二个和第三个半胱氨酸残基的IgG铰链区多肽时,所述的第一个半胱氨酸是所述的第二个半胱氨酸的N-末端,且所述的第二个半胱氨酸是所述的第三个半胱氨酸的N-末端,所述的第二个和第三个半胱氨酸残基中的1个或2个是取代的或缺失的,且其中所述的单链蛋白能具有依赖抗体的细胞介导细胞毒性和补体固定。本发明也包括单链蛋白,其包含下述组分、基本上由其组成或由其组成:(i)第一个多肽,其具有能结合靶分子的结合结构域多肽;(ii)第二个多肽,其包含附着到所述的第一个多肽的C-末端的连接区;和(iii)第三个多肽,其包含N-末端截短的免疫球蛋白重链恒定区多肽,后者附着到所述的第二个多肽的C-末端上,其中当所述的连接区包含至少具有第一个、第二个和第三个半胱氨酸残基的I gG铰链区多肽时,所述的第一个半胱氨酸是所述的第二个半胱氨酸的N-末端,且所述的第二个半胱氨酸是所述的第三个半胱氨酸的N-末端,所述的第二个和第三个半胱氨酸残基中的1个或2个是取代的或缺失的,且其中所述的单链蛋白能结合靶细胞上或内的靶分子,并体内地降低靶细胞的数目和/或体内地减少靶细胞群体。本发明也包括单链蛋白,其包含下述组分、基本上由其组成或由其组成:(i)第一个多肽,其具有能结合靶分子的结合结构域多肽;(ii)第二个多肽,其包含附着到所述的第一个多肽的C-末端的连接区;和(iii)第三个多肽,其包含N-末端截短的免疫球蛋白重链恒定区多肽,后者附着到所述的第二个多肽的C-末端上,其中当所述的连接区包含至少具有第一个、第二个和第三个半胱氨酸残基的IgG铰链区多肽时,所述的第一个半胱氨酸是所述的第二个半胱氨酸的N-末端,且所述的第二个半胱氨酸是所述的第三个半胱氨酸的N-末端,所述的第二个和第三个半胱氨酸残基中的1个或2个是取代的或缺失的,且其中所述的单链蛋白能诱导至少一种选自下述的免疫活性:依赖抗体的细胞介导细胞毒性和补体固定,且其中所述的单链蛋白能结合靶细胞上或内的靶分子,并体内地降低靶细胞的数目和/或体内地减少靶细胞群体。本发明也包括单链蛋白,其包含下述组分、基本上由其组成或由其组成:(i)第一个多肽,其具有能结合靶分子的结合结构域多肽;(ii)第二个多肽,其包含附着到所述的第一个多肽的C-末端的连接区;和(iii)第三个多肽,其包含N-末端截短的免疫球蛋白重链恒定区多肽,后者附着到所述的第二个多肽的C-末端上,其中当所述的连接区包含至少具有第一个、第二个和第三个半胱氨酸残基的IgG铰链区多肽时,所述的第一个半胱氨酸是所述的第二个半胱氨酸的N-末端,且所述的第二个半胱氨酸是所述的第三个半胱氨酸的N-末端,所述的第二个和第三个半胱氨酸残基中的1个或2个是取代的或缺失的,且其中所述的单链蛋白能诱导依赖抗体的细胞介导细胞毒性和补体固定,且其中所述的单链蛋白能结合靶细胞上或内的靶分子,并体内地降低靶细胞的数目和/或体内地减少靶细胞群体。本发明也包括单链蛋白,其包含下述组分、基本上由其组成或由其组成:(i)第一个多肽,其具有能结合靶分子的结合结构域多肽,所述的结合结构域多肽包含重链可变区,其中在重链可变区的第一个构架区域内的位置11处的亮氨酸是缺失的,或被另一种氨基酸取代;(ii)第二个多肽,其包含附着到所述的第一个多肽的C-末端上的连接区;和(iii)第三个多肽,其包含N-末端截短的免疫球蛋白重链恒定区多肽,后者附着到所述的第二个多肽的C-末端上,其中所述的单链蛋白能具有至少一种免疫活性,且前提是当结合结构域多肽能结合CD20时,所述的连接区包含3个半胱氨酸残基,其中所述的3个半胱氨酸残基中的1个或2个被另一种氨基酸取代或替换。本发明也包括单链蛋白,其包含下述组分、基本上由其组成或由其组成:(i)第一个多肽,其具有能结合靶分子的结合结构域多肽,所述的结合结构域多肽包含重链可变区,其中在重链可变区的第一个构架区域内的位置11处的亮氨酸是缺失的,或被另一种氨基酸取代,(ii)第二个多肽,其包含附着到所述的第一个多肽的C-末端的连接区;和(iii)第三个多肽,其包含N-末端截短的免疫球蛋白重链恒定区多肽,后者附着到所述的第二个多肽的C-末端上,其中所述的单链蛋白能诱导至少一种免疫活性,前提是当结合结构域多肽是能结合CD20的2H7 scFv,且所述的连接区包含至少具有第一个、第二个和第三个半胱氨酸残基的IgG铰链区多肽时,所述的第一个半胱氨酸是所述的第二个半胱氨酸的N-末端,且所述的第二个半胱氨酸是所述的第三个半胱氨酸的N-末端,所述的半胱氨酸残基中的1个或2个被取代或缺失。本发明也包括单链蛋白,其包含下述组分、基本上由其组成或由其组成:(i)第一个多肽,其具有能结合靶细胞上或内的靶分子的结合结构域多肽,所述的结合结构域多肽包含重链可变区,其中在重链可变区的第一个构架区域内的位置11处的亮氨酸是缺失的,或被另一种氨基酸取代;(ii)第二个多肽,其包含附着到所述的第一个多肽上的连接区;和(iii)第三个多肽,其包含附着到第二个多肽上的N-末端截短的免疫球蛋白重链恒定区多肽,其中所述的单链蛋白具有至少一种免疫活性,前提是所述的单链蛋白不包含下述组分或基本上由其组成:能结合CD20的结合结构域多肽,和连接区,其包含(a)IgG铰链,其具有3个半胱氨酸残基,或(b)IgG铰链,其包含3个已经取代半胱氨酸残基的丝氨酸(或类似的氨基酸)残基。这些单链蛋白存在许多可能的变化和变体。例如,结合结构域多肽可以是单链抗体或scFv,包括自然产生的和/或非-自然产生的VH和VL多肽,且结合结构域多肽可以结合许多靶中的任一种。非-自然产生的VH多肽包括,作为实例且不限于,人重链可变区多肽,其在与氨基酸位置9、10、11、12、108、110和/或112中的任意一个或多个相对应的位置上包含氨基酸的突变、取代或缺失。非-自然产生的VL多肽包括,作为实例且不限于,人轻链可变区多肽,其在与氨基酸位置12、80、81、83、105、106和107中的任意一个或多个相对应的位置上包含氨基酸的突变、取代或缺失。靶包括,作为实例且不限于,CD19、CD20、CD28、CD30、CD37、CD40、L6、HER2、表皮生长因子受体(EGFR)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、肿瘤坏死因子(例如,TNF-α),以及本文所述的或所指的或另外有用的其他靶,无论是现在已知的还是以后发现的。另外,连接区多肽可以是许多分子中的任一种,包括自然产生的和非-自然产生的。连接区多肽包括,作为实例且不限于,自然产生的和非-自然产生的免疫球蛋白铰链区多肽。自然产生的免疫球蛋白铰链区多肽包括野生型免疫球蛋白铰链区多肽,例如,作为实例且不限于,人IgG1铰链区多肽、人IgA铰链区多肽、人IgD铰链区多肽、人IgE铰链-作用区域(例如,IgE CH2)、骆驼科动物免疫球蛋白铰链区或本文所述的或所指的或另外有用的任何其他的自然产生的铰链区肽,无论是现在已知的还是以后发现的。非-自然产生的免疫球蛋白铰链区多肽包括,作为实例且不限于,突变的自然产生的免疫球蛋白铰链,包括含有小于野生型数目的半胱氨酸的免疫球蛋白铰链区多肽,例如,突变的自然产生的免疫球蛋白铰链区多肽,其含有0、1或2个半胱氨酸,和本文所述或所指的或另外有用的、或现在已知或以后发现可以用于连接例如,免疫球蛋白结构域例如CH1结构域和CH2结构域的任意的其他的连接区分子。N-末端截短的免疫球蛋白重链恒定区多肽包括自然产生的和非-自然产生的N-末端截短的免疫球蛋白重链恒定区多肽,其含有或不含有单链蛋白的其他部分,能提供一种或多种效应子功能,例如本文所述的那些。自然产生的N-末端截短的免疫球蛋白重链恒定区多肽包括,作为实例且不限于,CH2CH3恒定区多肽,包括分开地或一起地取自人IgG、人IgA和人IgE的CH2CH3恒定区多肽,和本文所述的或所指的、或另外现在已知或以后发现有用的任何其他的免疫球蛋白重链恒定区多肽。非-自然产生的N-末端截短的免疫球蛋白重链恒定区多肽包括,作为实例且不限于,本文所述的或所指的、或另外现在已知或以后发现有用的任何突变的自然产生的重链恒定区多肽。
仅仅作为实例,本发明的各种特异性的构建体包括下面的:
1.2H7 scFv VH L11S(CSC-S)HWCH2 WCH3
2.2H7 scFv VH L11S IgE CH2 CH3 CH4
3.2H7 scFv VH L11S mIgE CH2 CH3 CH4
4.2H7 scFv VH L11S mIgAH WIgACH2 T4CH3
5.2H7 scFv VH L11S(SSS-S)H K322S CH2 WCH3
6.2H7 scFv VH L11S(CSS-S)H K322S CH2 WCH3
7.2H7 scFv VH L11S(SSS-S)H P331S CH2 WCH3
8.2HU scFv VH L11S(CSS-S)H P331S CH2 WCH3
9.2H7 scFv VH L11S(SSS-S)H T256N CH2 WCH3
10.2H7 scFv VH L11S(SSS-S)H RTPE/QNAK(255-258)CH2 WCH3
11.2H7 scFv VH L11S(SSS-S)H K290Q CH2 WCH3
12.2H7 scFv VH L11S(SSS-S)H A339P CH2 WCH3
13.G28-1 scFv(SSS-S)H WCH2 WCH3
14.G28-1 scFv IgAH WCH2 WCH3
15.G28-1 scFv VH L11S(SSS-S)H WCH2 WCH3
16.G28-1 scFv VH L11S(CSS-S)H WCH2 WCH3
17.G28-1 scFv VH L11S(CSC-S)H WCH2 WCH3
18.G28-1 scFv VH L11S(SSC-P)H WCH2 WCH3
19.CTLA4(SSS-S)H P238SCH2 WCH32
20.CTLA4(CCC-P)WH WCH2 WCH3
21.FC2-2 scFv(SSS-S)H WCH2 WCH3
22.FC2-2 scFv VHL11S(SSS-S)H WCH2 WCH3
23.UCHL-1 scFv(SSS-S)H WCH2 WCH3
24.UCHL-1 scFv VHL11S(SSS-S)H WCH2 WCH3
25.5B9 scFv(SSS-S)H WCH2 WCH3
26.5B9 scFv VHL11S(SSS-S)H WCH2 WCH3
27.2H7 scFv(SSS-S)H WCH2 WCH3
28.2H7 scFv(SSS-S)H P238SCH2 WCH3
29.2H7 scFv IgAH WCH2 WCH3
30.2H7 scFv IgAH WIgACH2 T4CH3
31.2H7 scFv IgAH WlgACH2 WCH3+J链
32.2H7 scFv(CCC-P)WH WCH2 WCH3
33.2H7 scFv(SSS-S)H WCH2 F405YCH3
34.2H7 scFv(SSS-S)H WCH2 F405ACH3
35.2H7 scFv(SSS-S)H WCH2 Y407ACH3
36.2H4 scFv(SSS-S)HWCH2 F405A,Y407ACH3
37.2H7 scFv(CSS-S)H WCH2 WCH3
38.2H7 scFv(SCS-S)H WCH2 WCH3
39.2H7 scFv(SSC-P)H WCH2 WCH3
40.2H7 scFv(CSC-S)H WCH2 WCH3
41.2H7 scFv(CCS-P)H WCH2 WCH3
42.2H7 scFv(SCC-P)H WCH2 WCH3
43.2H7 scFv VH L11S(SSS-S)H WCH2 WCH3
44.2H7 scFv VHL11S(CSS-S)H WCH2 WCH3
45.G28-1 scFv VH L11S(SCS-S)H WCH2 WCH3
46.G28-1 scFv VH L11S(CCS-P)H WCH2 WCH3
47.G28-1 scFv VH L11S(SCC-P)HWCH2 WCH3
48.G28-1 scFv VH L11S mlgE CH2 CH3 CH4
49.G28-1 scFv VH L11S mIgAH WIgACH2 T4CH3
50.G28-1 scFv VH L11S hIgE CH2 CH3 CH4
51.G28-1 scFv VH L11S hIgAH WIgACH2 T4CH3
52.HD37 scFv IgAH WCH2 WCH3
53.HD37 scFv(SSS-S)H WCH2 WCH3
54.HD37 scFv VH L11S(SSS-S)H WCH2 WCH3
55.L6 scFv lgAH WCH2 WCH3
56.L6 scFv VHL11S (SSS-S)H WCH2 WCH3
57.2H7 scFv-美洲驼 IgG1
58.2H7 scFv-美洲驼 IgG2
59.2H7 scFv-美洲驼 IgG3
60.CD16-6 低(ED)(SSS-S)H P238SCH2 WCH3
61.CD16-9 高(ED)(SSS-S)H P238SCH2 WCH3
62.2e12 scFv(SSS-s)H P238SCH2 WCH3-hCD80TM/CT
63.10A8 scFv(SSS-s)H P238SCH2 WCH3-hCD80TM/CT
64.40.2.36 scFv(SSS-s)H P238SCH2 WCH3-hCD80TM/CT
65.2H7 scFv(SSS-s)H P238SCH2 WCH3-hCD80TM/CT
66.G19-4 scFv(SSS-s)H P238SCH2 WCH3-hCD80TM/CT
67.2e12 scFv(SSS-s)H WCH2 WCH3-hCD80TM/CT
68.2e12 scFv IgAH IgACH2 T4CH3-hCD80TM/CT
69.2e12 scFv IgE CH2CH3CH4-hCD80TM/CT
70.2e12 scFv(SSS-s)H P238SCH2 WCH3-mFADD-TM/CT
71.2e12 scFv(SSS-s)H WCH2 WCH3-mFADD-TM/CT
72.2e12 scFv(SSS-s)H WCH2 WCH3-mcasp3-TM/CT
73.2e12 scFv(SSS-s)H P238SCH2 WCH3-mcasp3-TM/CT
74.2e12 scFv(SSS-s)H WCH2 WCH3-mcasp8--TM/CT
75.2e12 scFv(SSS-s)H P238SCH2 WCH3-mcasp8-TM/CT
76.2e12 scFv(SSS-s)H WCH2 WCH3-hcasp3--TM/CT
77.2e12 scFv(SSS-s)H P238SCH2 WCH3-hcasp3-TM/CT
78.2e12 scFv(SSS-s)H WCH2 WCH3-hcasp8--TM/CT
79.2e12 scFv(SSS-s)H P238SCH2 WCH3-hcasp8-TM/CT
80.1D8 scFv--hIgG1(SSS-s)H P238SCH2 WCH3-hCD80TM/CT
81.1D8 scFv--hIgG1(SSS-s)H WCH2 WCH3-hCD80TM/CT
82.1D8 scFv-mIgAT4-hCD80TM/CT
83.1D8 scFv--hIgE-hCD80TM/CT
84.1D8 scFv--hIgG1(SSS-s)H P238SCH2 WCH3-mFADD-TM/CT
85.1D8 scFv--hIgG1(SSS-s)H WCH2 WCH3-mFADD-TM/CT
86.1D8 scFv--hIgG1(SSS-s)H WCH2 WCH3-mcasp3-TM/CT
87.1D8 scFv--hIgG1(SSS-s)H P238SCH2 WCH3-mcasp3-TM/CT
88.1D8 scFv--hIgG1(SSS-s)H WCH2 WCH3-mcasp8--TM/CT
89.1D8 scFv--hIgG1(SSS-s)H P238SCH2 WCH3-mcasp8-TM/CT
90.1D8 scFv--hIgG1(SSS-s)H WCH2 WCH3-hcasp3--TM/CT
91.1D8 scFv--hIgG1(SSS-s)H P238SCH2 WCH3-hcasp3-TM/CT
92.1D8 scFv--hIgG1(SSS-s)H WCH2 WCH3-hcasp8--TM/CT
93.1D8 scFv--hIgG1(SSS-s)H P238SCH2 WCH3-hcasp8-TM/CT L6
   scFv(SSS-S)H WCH2 WCH3
94.2H7 scFv CD154(L2)
95.2H7 scFv CD154(S4)
96.CTLA4 IgAH IGACH2CH3
97.CTLA4 IgAH IgACH2 T4CH3
98.2H7 scFv IgAH IgACH2CH3
99.2H7 scFv IgAH IgAHCH2 T18CH3
100.2H&-40.2.220 scFv(SSS-S)H WCH2 WCH3(双特异性抗ccd20-抗-cd40)
101.2H7 scFv IgAH IgACH2 T4CH3-hCD89 TM/CT
102.G19-4 scFv(CCC-P)WH WCH2 WCH3-hCD89 TM/CT
103.2e12 scFv(CCC-P)WH WCH2 WCH3-hCD89 TM/CT
参考下面的发明详述和附图,还可以明白本发明的这些和其他方面。如本文所指出的,在本文中公开的或指出的所有参考专利、文章、文件和其他材料,都在此整体引作参考,如同单独导入每一篇样。
附图简述
图1显示了2H7scFv-Ig的DNA和推测的氨基酸序列[SEQ ID NO:688 和689],它是一种能够特异性地结合CD20的结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白。
图2显示了通过转染的、稳定的CHO细胞系2H7 scFv-Ig产生的生产水平和通过纯化的2H7 scFv-Ig与表达CD20的CHO细胞的结合产生标准曲线。
图3显示了分离的2H7scFv-Ig蛋白的多个制备物的SDS-PAGE分析。
图4显示了由2H7scFv-Ig进行的补体固定(图4A)和依赖抗体的细胞毒性的介导(图4B)。
图5显示了CD20和CD40的同时连接对正常B细胞生长的作用。
图6显示了CD20和CD40的同时连接对B类淋巴母细胞系中CD95表达和细胞凋亡诱导的作用。
图7显示了能够特异性地结合CD20和CD40的2H7scFv-CD154L2(图7A,SEQ ID NO:690和691)和2H7scFv-CD154 S4(图7B,SEQ ID NO 692和693)结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白的DNA和推测的氨基酸序列。
图8显示了通过流式免疫细胞荧光测定法测定的2H7scFv-CD154结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白与CD20+CHO细胞的结合。
图9显示了2H7scFv-CD154结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白与细胞结合后膜联蛋白V与B细胞系Ramos、BJAB和T51的结合。
图10显示了2H7scFv-CD154结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白结合后对B细胞系T51的增殖的作用。
图11示意性地图示了称作CytoxB或CytoxB衍生物的2H7ScFv-Ig融合蛋白CytoxB-MHWTG1C(2H7 ScFv,突变的铰链,野生型人IgG1 Fc结构域),CytoxB-MHMG1C(2H7 ScFv,突变的铰链,突变的人IgG1 Fc结构域)和CytoxB-IgAHWTHG1C(2H7 ScFv,人IgA-衍生的铰链[SEQ IDNO:41],野生型人IgG1 Fc结构域)的结构。箭标指示了认为对FcR结合和ADCC活性(粗箭标)、以及补体固定(细箭标)起作用的氨基酸残基的位置编号。注意没有链间二硫键。还显示了肽接头(SEQ ID NO:682)和人IgA铰链的部分(SEQ ID NO:683)。
图12显示了分离的CytoxB和2H7scFv-CD154结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白的SDS-PAGE分析。
图13显示了CytoxB衍生物的依赖抗体的细胞介导细胞毒性活性。
图14显示了CytoxB衍生物的依赖补体的细胞毒性。
图15显示了猕猴血样中CytoxB-MHWTG1C的血清半衰期测定。
图16显示了CytoxB-MHWTG1C对猕猴血样中的循环CD40+B细胞水平的作用。
图17显示了转染的哺乳动物细胞系的HD37(CD19特异性的)ScFv-Ig生产水平,以及通过纯化的HD37 ScFv-Ig与能表达CD19的细胞的结合产生标准曲线。
图18显示了转染的稳定CHO细胞系的L6(癌抗原)ScFv-Ig的生产水平,以及通过纯化的L6 ScFv-Ig与能表达L6抗原的细胞的结合产生标准曲线。
图19显示了结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白2H7 ScFv-Ig、HD37ScFv-Ig和G28-1(CD37特异性的)ScFv-Ig的依赖抗体的细胞介导细胞毒性活性。
图20显示了L6 ScFv-Ig融合蛋白的依赖抗体的细胞介导细胞毒性活性。
图21显示了L6 ScFv-Ig和2H7 ScFv-Ig融合蛋白的SDS-PAGE分析。
图22显示了G28-1 ScFv-Ig和HD37 ScFv-Ig融合蛋白的SDS-PAGE分析。
图23显示了人IgG1(SEQ ID NO:684)的免疫球蛋白铰链和CH2结构域和美洲驼IgG1(SEQ ID NO:685)、IgG2(SEQ ID NO:686)和IgG3(SEQ ID NO:687)的铰链和CH2结构域的序列比对。
图24说明了纯化的2H7 scFv美洲驼IgG融合蛋白在10%SDS聚丙烯酰胺凝胶中的迁移。在非-还原样品缓冲液(泳道2-5)和还原样品缓冲液(泳道6-9)中,制备了纯化的融合蛋白(每个样品5μg)。泳道1:分子量标记(非还原的);泳道2和6:2H7 scFv-美洲驼IgG1(SEQ ID NOS:21和22);泳道3和7:2H7 scFv-美洲驼IgG2(SEQ IDNOS:23和24);泳道4和8:2H7 scFv-美洲驼IgG3(SEQ ID NOS:25 和26);和泳道5和9:利妥希玛(嵌合的抗-CD20抗体(人IgG1恒定区))。
图25显示了通过流式免疫细胞荧光测定法测得的2H7 scFv-美洲驼IgG1(SEQ ID NOS:21和22)、2H7 scFv-美洲驼IgG2(SEQ ID NOS:23 和24)和2H7 scFv-美洲驼IgG3(SEQ ID NOS:25和26)与CD20+CHO细胞的结合。
图26说明了在有兔补体存在的情况下,2H7 scFv美洲驼IgG融合蛋白、2H7 scFv-美洲驼IgG1(SEQ ID NO:22)、2H7 scFv-美洲驼IgG2(SEQ ID NO:24)和2H7 scFv-美洲驼IgG3(SEQ ID NO:26)和2H7 scFv人IgG1(2H7 scFv IgG WTH WTCH2CH3)(SEQ ID NO:28)针对BJAB细胞的CDC活性。利妥希玛用作对照。
图27显示了2H7 scFv美洲驼IgG融合蛋白、2H7 scFv-美洲驼IgG1(SEQ ID NO:22)、2H7 scFv-美洲驼IgG2(SEQ ID NO:24)和2H7 scFv-美洲驼IgG3(SEQ ID NO:26)的依赖抗体的细胞介导细胞毒性活性。以3个不同的比率,1∶25、1∶50和1∶100,组合效应细胞(人PBMC)和靶细胞(BJAB细胞)。利妥希玛用作对照。每个数据点代表着3个单独的测量。
图28显示了2H7 scFv美洲驼IgG融合蛋白、2H7 scFv-美洲驼IgG1(SEQ ID NO:22)、2H7 scFv-美洲驼IgG2(SEQ ID NO:24)和2H7 scFv-美洲驼IgG3(SEQ ID NO:26)的依赖抗体的细胞介导细胞毒性活性。以3个不同的比率,1∶25、1∶50和1∶100,组合效应细胞(美洲驼PBMC)和靶细胞(BJAB细胞)。利妥希玛用作对照。每个数据点代表着3个单独的测量。
图29说明了能在细胞表面上表达scFv-Ig融合蛋白的Reh细胞(急性淋巴细胞性白血病)的依赖补体的细胞毒性活性。用能编码scFv抗体的构建体转染了Reh细胞,所述的scFv抗体对人共同刺激分子CD152、CD28、CD40和CD20是特异性的,所述构建体是融合到人IgG1野生型铰链-CH2-CH3(其融合到人CD80跨膜和细胞质尾结构域上)上的。在有和没有兔补体存在的情况下(分别为加C′和无C′),测量了依赖补体的细胞毒性活性。数据代表着一式2份样品的平均值。Reh抗-hCD152 scFvIg:用多核苷酸10A8 scFv IgG MTH(SSS)MT CH2CH3(SEQ ID NO:53)转染的Reh细胞;Reh抗-hCD28scFvIg:2E12 scFv IgGMTH(SSS)MT CH2CH3(SEQ ID NO:51);Reh抗-hCD40scFvIg:4.2.220scFv IgG MTH(SSS)MT CH2CH3(SEQ ID NO:49);和Reh抗-hCD20scFvIg:2H7 scFv IgG MTH(SSS)MT CH2CH3(SEQ ID NOS:57 和29)。
图30显示了Reh细胞的依赖抗体的细胞介导细胞毒性活性,该Reh细胞被能编码scFv抗体的构建体转染,该scFv抗体对如图29所述的人共同刺激分子CD152、CD28、CD40和CD20和鼠CD3是特异性的,所述构建体融合到人突变的IgG1铰链和突变的CH2和野生型CH3上(Reh抗-mCD3scFv指用多核苷酸500A2 scFv IgG MTH(SSS)MTCH2WTCH3 SEQ ID NO:55)转染的Reh细胞),其融合到人CD80跨膜和细胞质尾结构域。数据代表着一式4份样品的平均值。
图31列出了在后图所述的实验中使用的免疫球蛋白恒定区构建体。
图32说明了在有和没有兔补体存在的情况下(分别为加C’和无C’),CTLA-4 Ig融合蛋白、CTLA-4 IgG WTH(CCC)WTCH2CH3(SEQ IDNO:__)(2μg/ml)和CTLA-4 IgG MTH MTCH2WTCH3(SEQ ID NO:____)(2μg/ml)的依赖补体的细胞毒性活性。靶细胞是Reh细胞和用CD80转染的Reh细胞(Reh CD80.10)。
图33显示了CTLA-4 Ig融合蛋白、CTLA-4 IgG WTH(CCC)WTCH2CH3(SEQ ID NO:78)(2μg/ml)和CTLA-4 IgG MTH MTCH2WTCH3(SEQ IDNOS:530和86)(2μg/ml)的依赖抗体的细胞介导细胞毒性活性。以所示的比率,将效应细胞人PBMC加给靶细胞Reh或Reh CD80.1。图33A显示了在没有任何Ig融合蛋白的情况下,Reh CD80.1细胞中的自然杀伤水平。图33B显示了CTLA-4 IgG MTH MTCH2WTCH3介导的依赖抗体的细胞介导细胞毒性,图33C显示了CTLA-4 IgG WTH(CCC)WTCH2CH3介导的依赖抗体的细胞介导细胞毒性。每个数据点代表着在4个样品孔中测得的特异性杀伤的平均百分比。
图34说明了通过流式免疫细胞荧光测定法测得的2H7(抗-CD20)scFv Ig融合蛋白与(CD20+)CHO细胞的结合。
图35显示了2H7 scFv IgG和IgA融合蛋白的免疫印迹。用各种2H7 scFv Ig融合蛋白构建体瞬时转染了COS细胞。用A蛋白免疫沉淀表达的多肽,在非还原SDS聚丙烯酰胺凝胶中分离,然后转移到聚氟乙烯膜上。使用抗-人IgG(Fc特异性的)辣根过氧化物酶缀合物,检测了蛋白。泳道1:只有载体;泳道2:2H7 scFv IgG WTH(CCC)WTCH2CH3(SEQ ID NO:28);泳道3:2H7 scFv IgG MTH(CSS)WTCH2CH3(SEQ ID NO:135);泳道4:2H7 scFv IgG MTH(SCS)WTCH2CH3(SEQID NO:137);泳道5:2H7 scFv IgAH IgG WTCH2CH3(SEQ ID NO:60);和泳道6:2H7 scFv IgG MTH(SSS)WTCH2CH3(SEQ ID NO:50)。
图36说明了通过流式免疫细胞荧光测定法测得的2H7 scFv IgAHIgACH2CH3多肽(SEQ ID NO:62)和2H7 scFv IgAH IgAT4(SEQ ID NO:71)与(CD20+)CHO细胞的结合。多肽的来源是来自瞬时转染的COS细胞的培养物上清液。用含有能编码人J链的核苷酸序列的质粒,共转染了用包含能编码2H7 scFv IgAH IgACH2CH3的序列的质粒转染的COS细胞。
图37说明了使用全血作为效应细胞的来源,抗-CD20(2H7)scFvIg融合蛋白针对BJAB靶细胞的依赖抗体的细胞介导细胞毒性活性。滴定了纯化的2H7 scFv Ig融合蛋白,并与51Cr-标记的BJAB细胞(5x104)和全血(1∶4终稀度)组合。每个数据点代表着在4个样品孔中测得的特异性杀伤的平均百分比。
图38说明了在全血的0.25、0.125和0.625稀度时,2H7 scFv Ig融合蛋白(5μg/ml)针对51Cr-标记的BJAB细胞的依赖抗体的细胞介导细胞毒性活性。每个数据点代表着在4个样品孔中测得的特异性杀伤的平均百分比。
图39对比了当人PBMC是效应细胞的来源(图39A)和当人全血是效应细胞的来源(图39B)时,2H7 scFv IgG MTH(SSS)WTCH2CH3(5μg/ml)和2H7 scFv IgAH IgACH2CH3(5μg/ml)的依赖抗体的细胞介导细胞毒性活性。
图40显示了2H7 scFv IgG融合蛋白的免疫印迹。用各种2H7 scFvIg融合蛋白构建体,瞬时转染了COS细胞。在非还原SDS聚丙烯酰胺凝胶中,分离了含有表达的多肽的培养物上清液,然后转移到聚氟乙烯膜。使用抗-人IgG(Fc特异性的)辣根过氧化物酶缀合物,检测了蛋白。泳道1-5:分别在每泳道40ng、20ng、10ng/5ng和2.5ng时,纯化的2H7 scFv IgG MTH(SSS)WTCH2CH3。在泳道6-9中,分离了培养物上清液。泳道6:2H7 scFv IgG WTH(CCC)WTCH2CH3;泳道7:2H7 scFv IgG MTH(CSS)WTCH2CH3;泳道8:2H7 scFv IgG MTH(SCS)WTCH2CH3;和泳道9:2H7 scFv VHSER11 IgG MTH(SSS)WTCH2CH3。在免疫印迹的左侧,标示了标记VHS蛋白的分子量(kDal)。
图41说明了通过流式免疫荧光测定法测得的1D8(抗-鼠4-1BB)scFv IgG WTH WTCH2CH3-CD80融合蛋白在K1735黑素瘤细胞上的细胞表面表达(图41A)。用藻红蛋白-缀合的F(ab′)2山羊抗-人IgG,检测了scFv融合蛋白。图41B说明了肿瘤在首次用于实验的通过皮下注射野生型K1735黑素瘤细胞(K1735-WT)或用1D8 scFv IgG WTHWTCH2CH3-CD80转染的K1735细胞(K1735-1D8)移植的C3H小鼠中的生长。通过测量肿瘤的大小,监控肿瘤生长。图41C说明了在用K1735-1D8细胞移植动物之前,腹膜内地注射单克隆抗体来去除CD8+、CD4+或CD4+和CD8+T细胞的首次用于实验的C 3H小鼠中的肿瘤生长动力学。
图42说明了使用K1735-1D8作为免疫原建立的K1735-WT肿瘤的治疗。在用K1735-WT肿瘤移植小鼠后6天,一组(5只动物)在对侧胁腹皮下地注射了K1735-1D8细胞(空心圆)或放射的K1735-WT细胞(实心正方形)。对照组小鼠接受了PBS(空心正方形)。在箭标所示的天数,重复处理。
图43显示了皮下地注射了2x106 K1735-WT细胞(实心正方形)的动物中的肿瘤生长和皮下地注射了2x106 K1735-WT细胞+2x105K1735-1D8细胞(空心三角形)的动物中的肿瘤生长。
图44显示了用针对抗-人IgG重复淘选多次后分离的1D8 scFvIgG WTH WTCH2CH3-CD80转染的抗原104鼠肉瘤肿瘤细胞的流式细胞计分析。用氟代异硫氰酸酯(FITC)-缀合的山羊抗-人IgG,检测了转染的能表达1D8 scFv IgG WTH WTCH2CH3-CD80的细胞(以黑色说明)。未转染的细胞显示为灰色。
图45说明了各种2H7 scFv Ig融合蛋白在10% SDS-PAGE凝胶中的迁移。2H7是抗-CD20 scFv,且40.2.220是抗-CD40 scFv。泳道1:Bio-Rad预染色的分子量标准物;泳道2:抗-CD20 scFv IgG MTH(SSS)MTCH2WTCH3;泳道3:抗-CD20 scFv IgG MTH(SSS)WTCH2CH3;泳道4:2H7 scFv IgAH IgG WTCH2CH3;泳道5:抗-CD20-抗-CD40 scFvIgG MTH(SSS)MTCH2WTCH3;泳道6:利妥希玛;泳道7:NovexMultimark
Figure GA20180477200380110470301D00771
分子量标准物。
图46说明了如在含有突变的CH2结构域或野生型CH2结构域的2H7 Ig融合蛋白的依赖抗体的细胞介导细胞毒性测定中测得的效应子功能。将在有人PBMC效应细胞存在的情况下,2H7 scFv IgG MTH(SSS)MTCH2WTCH3(菱形)对BJAB靶细胞的特异性杀伤百分比,与2H7 scFv IgG MTH(SSS)WTCH2CH3(正方形)和2H7 scFv IgAH IgGWTCH2CH3(三角形)和利妥希玛(圆形)进行了对比。
图47显示了使用流式免疫细胞荧光测定法,通过测量线性荧光当量(LFE)测得的抗-人CD3 scFv IgG WTH WTCH2CH3-CD80(SEQ IDNO:413)融合蛋白在Reh细胞(图47A)和T51类淋巴母细胞(图47B)上的细胞表面表达。
图48显示了未转染的Reh和T51细胞的特异性杀伤百分比和用能编码对人CD3特异性的scFv抗体的构建体转染的Reh细胞(Reh抗-hCD3)(图48A)和T51细胞(T51抗-hCD3)(图48B)的特异性杀伤百分比,该构建体融合到人IgG1野生型铰链-CH2-CH3,后者融合到人CD80跨膜和细胞质尾结构域(抗-人CD3 scFv IgG WTH WTCH2CH3-CD80(SEQ ID NO:29)。以所示的比率,组合PBMC(效应细胞)BJAB靶细胞。
图49说明了5B9(一种抗-鼠CD137(4-1BB)单克隆抗体)和5B9scFv IgG融合蛋白(5B9 scFv IgG MTH(SSS)WTCH2CH3(SEQ ID NO:133)与受刺激的人PBMC的结合。使用FITC缀合的山羊抗-人IgG,通过流式免疫细胞荧光测定法,检测了5B9 scFv IgG融合蛋白的结合。用FITC缀合的山羊抗小鼠IgG,检测了5B9单克隆抗体的结合。
图50说明了LVH11S突变对2H7 LVH11S scFv WCH2 WCH3(“CytoxBscFv Ig”;SEQ ID NO:369)在CHO细胞系中的表达的影响。
图51显示了当瞬时转染CHO细胞时,用于检查2H7 LVH11S scFvWCH2 WCH3(SEQ ID NO:369)的表达的半定量SDS-PAGE分析。泳道2-5是各种量的2H7 LVH11S scFv WCH2 WCH3。泳道6-10是10μl来自能表达2H7 LVH11S scFv WCH2 WCH3的5个不同克隆的样品。
图52显示了从瞬时转染的COS细胞得到的G28-1 LVH11S scFv Ig构建体(SEQ ID NO:324)和G28-1野生型scFv Ig结合结构域融合蛋白构建体(SEQ I D NO:320)之间的结合能力差异。使用流式细胞计,测量了与Ramos细胞的结合。数据说明了VH11S蛋白与CD37+Ramos细胞的结合的显著增加。
图53说明了与COS中的G28-1野生型scFv Ig构建体相比,G28-1LVH11S scFv Ig构建体(SEQ ID NO:324)的高水平表达。使用免疫印迹分析,对比了蛋白水平。二种免疫印迹凝胶都在泳道1-4中具有确定量的纯化的本发明的G28-1 scFv Ig(SSS-S)H WCH2 WCH3构建体。第一个免疫印迹的泳道5-9代表着5个不同的克隆,每个都被G28-1scFv(SSS-S)H WCH2 WCH3转染,而第二个免疫印迹的泳道5-9代表着5个不同的克隆,每个都被G28-1 LVH11S scFv(SSS-S)H WCH2 WCH3转染。免疫印迹表明,LVH11S形式能造成G28-1 scFv Ig构建体以非常高的水平表达。
图54说明了通过流式细胞计测得的具有改变的铰链的2H7 scFvIg衍生物与能表达CD20的CHO细胞(CD20+CHO)的结合,并表明这些改变的连接区铰链构建体(包括(SSS-S)、(CSS-S)、(SCS-S)和(CSC-S)铰链区)能保留与CD20的结合功能。
图55显示了各种构建体介导针对Bjab靶的依赖抗体的细胞介导细胞毒性的能力:(A)本发明的2H7 scFv Ig构建体,其含有包含(CSS-S)、(SCS-S)、(CSC-S)和(SSS-S)铰链的连接区和(B)本发明的2H7 scFv构建体,其具有各种连接区和尾区。将特异性杀伤百分比与去污剂诱导的总杀伤进行了对比。对照是具有添加的效应物和具有IgA铰链连接区和IgA-衍生的尾区(其不能结合PBMC效应物)的2H7构建体的靶细胞的自然杀伤。
图56说明了包含具有各种铰链区(例如,(CSC-S)、(SSS-S)、(SCS-S)和(CSS-S))的连接区的本发明的各种2H7 scFv Ig构建体介导Ramos细胞中的补体活性的能力。针对仅有补体的对照,测量了特异性杀伤百分比,并通过将细胞暴露于去污剂,测定了100%杀伤。
图57说明了使用免疫细胞荧光测定法测得的含有不同的尾区的本发明的2H7 scFv Ig构建体与CD20+ CHO的结合。使用与抗-IgG、抗-IgA和抗-IgE缀合的FITC,检测了不同的蛋白。
图58A显示了通过流式细胞计测得的,使用疏水电荷感应色谱(HCIC)纯化、并在不同的pH 4.0和3.5洗脱的2H7 VHL11S scFvIgECH2CH3CH4在CD20+CHO细胞中的结合,表明蛋白能结合在pH 4.0或3.5洗脱的CD20。图58B是说明本发明的这些2H7 VHL11S scFv IgE构建体介导例如Bjab靶细胞中的ADCC的能力的数据图。
图59显示了通过流式细胞计测得的G28-1 VH L11SmIgECH2CH3CH4(A)与Bjab和Ramos靶细胞和(B)与CD20+CHO细胞的结合能力。
图60显示了本发明的各种蛋白构建体(A)2H7 scFv(SSS-S)H(P238S)CH2 WCH3(B)2H7 scFv(CSS-S)H WCH2 WCH3,(C)2H7 scFv(SCS-S)H WCH2 WCH3,和(D)2H7 scFv(SSS-S)H WCH2(Y407A)CH3的高效液相色谱(HPLC)图谱,表明构建体A具有100kD和75kD的表观分子量形式,且通过导入某些变化,可以得到主要的75kD分子量形式,如在构建体B、C和D中观察到的。参见,实施例40。
图61显示了本发明的各种蛋白构建体(A)2H7 scFv(SSS-S)HWCH2 WCH3,(B)2H7 scFv(CSC-S)H WCH2 WCH3,(C)2H7 scFv(CCC-P)H WCH2 WCH3,和(D)2H7 scFv IgAH WCH2 WCH3的HPLC图谱,表明构建体A具有100kD和75kD的表观分子量形式,且通过导入某些变化,可以得到主要的75kD分子量形式,如在构建体B和C中观察到的,而构建体D(其具有IgA尾区)具有150kD的表观分子量。参见,实施例40。
图62显示了本发明的各种蛋白构建体(A)2H7 scFv(SSS-S)HWCH2 WCH3,(B)2H7 scFv(SCS-S)H WCH2 WCH3,(C)2H7 scFv IgA3TCH2 WCH3,和(D)2H7 scFv(SSS-S)H WCH2(F405A Y407A)CH3的HPLC图谱,表明构建体A具有100kD和75kD的2种表观分子量形式,构建体B具有75kD表观分子量的主要形式,而具有T4突变的构建体C能产生接近600kD的表观分子量的3种形式,且在CH 3区域具有双点突变的构建体D能产生具有小于44kD的表观分子量的主要形式。T4突变在这里指从CH 3区域截短4个氨基酸。参见,实施例40。
图63对比了通过流式细胞计测得的在CH3区域有和没有F405A和Y407A改变时,2H7 VH L11S scFv Ig构建体对结合CD20+CHO细胞的影响,表明与该双氨基酸变化有关的结合能力丧失。参见,实施例41。
图64显示了通过流式细胞计测得的FI TC缀合的2H7 VH L11S scFvIg衍生物与CH20+CHO细胞的结合能力,表明当与荧光标记缀合时,这些构建体没有丧失结合能力。参见,实施例41。
图65显示了能检查10μg(每个泳道)本发明的各种纯化的2H7VH L11S scFv Ig构建体的非还原SDS-PAGE分析,表明以泳道1的标准分子量标记为参照,每种构建体的表观分子量。参见,实施例41。
图66对比了4个不同的人IgG区域hIgG1、hIgG2、hIgG3、hIgG4、hIgG4和1个大鼠区域rIgG2b的CH2结构域序列(SEQ ID NOs:694-698)。用箭标标记了能影响ADCC和CDC的点突变。参见,实施例52。
图67说明了各种2H7 VH L11S scFv Ig构建体在CHO和Lec13 CHO瞬时转染的细胞中介导ADCC的能力,表明在Lec 13 CHO细胞中表达的构建体的特异性杀伤比在正常的CHO细胞中表达的相同构建体有20%增加。参见,实施例42。
图68显示了可溶的CD 16(ED)(SSS-S)H P283S CH2 WCH3(SEQID NOs:422和426)的高和低亲和力等位基因的还原的和非还原的SDS-PAGE分析。参见,实施例43。
图69说明了高和低亲和力CD16融合蛋白与2H7 VH L11S scFv(CSC-S)WCH2 WCH3或2H7 VH L11S scFv(SSS-S)WCH2 WCH3的不同的结合能力,并表明使用P238S CH2构建体时高和低亲和力等位基因结合的丧失。参见,实施例43。
图70图示了(A)使用FITC缀合的具有突变尾(其能消除自身结合)的CD16胞外结构域Ig融合蛋白,用于检测Fc受体结合中的变化的测定,和B)使用构建体的细胞表面表达的哺乳动物显示系统。参见,实施例44。
图71显示了各种mAb和本发明的scFvIg构建体在Bjab和Ramos细胞中进行的细胞凋亡的诱导。参见,实施例45。
图72说明了2H7 scFv(SSS-S)H WCH2 WCH3和2H7 scFv(SSS-S)H P238CH2 WCH3构建体在Ramos细胞中诱导细胞凋亡的能力,其由天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3的激活来介导。结果表明,在这些条件下,2种构建体都能结合CD20和诱导细胞凋亡。
图73说明了2H7 scFv(SSS-S)H WCH2 WCH3和2H7 scFv(SSS-S)H P238CH2 WCH3构建体在CD20阳性的Bjab靶细胞中介导CDC活性的能力。结果表明,2种构建体都具有介导CDC的能力。
图74对比了2H7 scFv(SSS-S)H WCH2 WCH 3和2H7 scFv(SSS-S)H P238CH2 WCH3构建体在Bjab靶细胞中介导ADCC的能力。结果表明,2H7 scFv(SSS-S)H WCH2 WCH3构建体是非常有效的,且能诱导高水平的特异性杀伤,而2H7 scFv(SSS-S)H P238CH2 WCH3构建体在介导ADCC方面不是有效的。
图75对比了2H7 scFv(SSS-S)H WCH2 WCH3和2H7 scFv(SSS-S)H P238CH2 WCH3构建体结合CD20阳性的CHO细胞中的可溶的CD16(高亲和力和低亲和力形式)的能力。结果表明,2H7 scFv(SSS-S)H WCH2WCH3能结合CD16(2种形式),2H7 scFv(SSS-S)H P238CH2 WCH3不能结合CD 16(任一种形式)。
图76对比了2H7 scFv(SSS-S)H WCH2 WCH3和2H7 scFv(SSS-S)H P238CH2 WCH3构建体结合CD64阳性的U937细胞的能力。结果表明,2种构建体对FcγRI具有高亲和力,P238S突变能选择性地降低与FcγRIII的结合。
图77说明了猕猴体内实验,用于测量2H7 scFv(SSS-S)H WCH2WCH3和2H7 scFv(SSS-S)H P238CH2 WCH3构建体对B细胞减少的作用。隔1周施用构建体,并使用全血细胞计数和双色流式细胞计,在第-7、0、1、3、7、8、10、14、28和43天测量B细胞。结果表明,2H7 scFv(SSS-S)H WCH2 WCH3构建体导致了B细胞的迅速且完全的减少,在第2次注射后,其持续最高达28天。相反地,2H7 scFv(SSS-S)H P238CH2 WCH3构建体在前2周使B细胞缓慢减少至约50%;但是,此后不久,B细胞迅速地开始回复到正常水平。这表明,CD16相互作用介导的ADCC可能是迅速的和持续的B细胞减少所必需的。
图78说明了G28-1 VL11S scFv(SSS)H WCH2 WCH3和G28-1 VL11SscFv(SSC)H WCH2 WCH3构建体的SEC图谱。具有SSS铰链的构建体产生了大约75-100Kd的单个的均匀的峰,而具有SSC铰链的构建体产生了更小的形式和其他的不均匀的形式,包括大于200Kd的一个。
图79说明了G28-1 VL11S scFv(SSS)H WCH2 WCH3和G28-1 VL11SscFv(SSC)H WCH2 WCH3构建体在B细胞淋巴瘤细胞:Bjab、Ramos、WIL-2、Namalwa和Raji中的结合能力。(a)中的结果表明,G28-1VL11S scFv(SSS)H WCH2 WCH3能结合Bjab和Ramos细胞,中等地结合WIL-2细胞,且低水平地结合Namalwa和Raji细胞。(b)中的结果表明,G28-1 VL11S scFv(SSC)H WCH2 WCH3能结合Bjab细胞,中等地结合Ramos和WIL-2细胞,且低水平地结合Namalwa和Raji细胞。
图80说明了在与G28-1 VL11S scFv(SSS)H WCH2 WCH3和G28-1VL11S scFv(SSC)H WCH2 WCH3构建体一起温育过夜的Ramos细胞中的膜联蛋白和v-碘化丙锭结合。结果表明,2种构建体都能诱导细胞凋亡;但是,具有(SSC)铰链的构建体比具有(SSS)铰链的构建体能诱导更多的细胞凋亡。
图81说明了G28-1 VL11S scFv(SSS)H WCH2 WCH3和G28-1 VL11SscFv(SSC)H WCH2 WCH3构建体抑制Ramos细胞的增殖的能力。结果表明,2种构建体都能抑制增殖。
图82说明了G28-1 VL11S scFv(SSS)H WCH2 WCH3和G28-1 VL11SscFv(SSC)H WCH2 WCH3和2H7 scFv(CSS)H WCH2 WCH3构建体在Ramos B细胞中单独地和以不同组合地诱导细胞凋亡的能力。在该实验中所示的结果表明,2种G28-1构建体比2H7构建体更有效。结果还表明,G28-1 VL11S scFv(SSS)H WCH2 WCH3构建体比G28-1 VL11SscFv(SSC)H WCH2 WCH3构建体更有效。但是,当组合使用2H7和G28-1构建体时,细胞凋亡的量最大。
图83对比了G28-1 VL11S scFv(SSS)H WCH2 WCH3、G28-1 VL11SscFv(SSC)H WCH2 WCH3和2H7 scFv(CSS)H WCH2 WCH3构建体在Ramos B细胞中介导CDC的能力。结果表明,所有构建体都能介导CDC。2H7构建体最有效,其次是G28-1 VL11S scFv(SSC)H WCH2 WCH3,然后是G28-1 VL11S scFv(SSS)H WCH2 WCH3。
图84对比了G28-1 VL11S scFv(SSS)H WCH2 WCH3、G28-1 VL11SscFv(SSC)H WCH2 WCH3和2H7 scFv(CSS)H WCH2 WCH3构建体在Ramos B细胞中介导ADCC的能力。结果表明,G28-1 VL11S scFv(SSS)H WCH2 WCH3和G28-1 VL11S scFv(SSC)H WCH2 WCH3构建体能介导ADCC,而2H7 scFv(CSS)H WCH2 WCH3构建体介导ADCC的能力更低,但是仍然高于自然杀伤水平。
发明详述
本发明涉及新的分子,其可以用作,例如,治疗剂,以及用于其他的目的,包括诊断和研究目的。这样的分子具有,例如,抗原结合或其他的结合功能,例如,一种或多种效应子功能。本发明包括分子构建体,其包括结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白,和有关的组合物和方法,其可以用于免疫治疗和免疫诊断用途,和用于研究方法中,且其能提供某些超过现有技术的抗原-特异性的化合物和多肽的优点。本发明的构建体(包括融合蛋白)优选地是单个的多肽链,其在适当的部分包含下面的融合的或另外连接的结构域或区域:结合区构建体,例如结合结构域或多肽,连接区构建体,其包括,例如,天然的或工程化的免疫球蛋白铰链区多肽,和尾区构建体,其包括,例如,构建体,其可以包含下述组分、基本上由其组成或由其组成:天然的或工程化的免疫球蛋白重链CH2恒定区多肽和天然的或工程化的免疫球蛋白重链CH3恒定区多肽。根据特别适用于基因治疗的某些实施方案,本发明的构建体(包括融合蛋白)还可以包含天然的或工程化的质膜锚定结构域。根据某些其他的优选的实施方案,本发明的构建体(包括融合蛋白)还可以包含尾区,后者具有天然的或工程化的免疫球蛋白重链CH4恒定区多肽。在特别优选的实施方案中,结合区,例如多肽结构域,是或源自由人基因序列产生的多肽,包括结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白的构建体包含所述结合区,但本发明不需要限于此,并且实际上可以涉及本文提供的构建体,包括结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白,其源自任何天然或人工来源,包括基因工程化和/或突变的多肽。
本发明部分地涉及出人意料的观察结果,即,本文描述的新的构建体、包括结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白具有免疫学活性。更具体地,这些蛋白保留了参与公知的免疫学效应子活性的能力,所述活性包括,例如,依赖抗体的细胞介导细胞毒性(例如,在细胞表面的抗原结合后,在适当条件下使用和诱导具有适当Fc受体的细胞毒性效应细胞,例如具有FcRγIII的自然杀伤细胞)和/或依赖补体的细胞毒性中的补体固定(例如,细胞表面的抗原结合后,募集和激活作为血液补体级联组分的细胞裂解蛋白),尽管具有预计不能促进这样的效应子活性或促进如本文所述的这样的活性的结构。关于ADCC和CDC的综述,参见,例如,Carter,2001 Nat.Rev.Canc.1:118;Sulica等,2001 Int.Rev.Immunol.20:371;Maloney等,2002Semin.Oncol.29:2;Sondel等,2001 Hematol Oncol Clin North Am15(4):703-21;Maloney 2001 Anticanc.Drugs 12 Suppl.2:1-4。替代途径对补体的IgA激活描述在,例如,Schneiderman等,1990J.Immunol.145:233。如下文更详细地描述的,ADCC、补体固定和CDC是包含例如免疫球蛋白重链区域且具有本文所述的结构的构建体(包括融合蛋白)的预料不到的功能,特别是对于包含例如免疫球蛋白铰链区多肽(它们形成链间的、同型二聚体的二硫键的能力受到减弱)的免疫球蛋白融合蛋白而言预料不到的功能。
本发明提供的另一优点是,本发明的构建体(包括结合结构域-免疫球蛋白融合多肽)能大量产生,其一般大于例如用现有技术的单链抗体构建体常规获得的量。在优选的实施方案中,在哺乳动物或其他的需要的和有用的表达系统中重组表达本发明的构建体,包括结合结构域-免疫球蛋白融合多肽,这能提供以下优点,即能提供体内(例如在生理条件下)稳定的多肽。根据非限制性的理论,这种稳定性可能部分地来源于翻译后修饰和特异性糖基化。已经在静止细胞培养物中通过重组哺乳动物表达而以每升培养物上清液大于50mg蛋白的水平生产了本发明的构建体,包括结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白构建体,且在这种培养物中一般观察到的产量是10-50mg/l,所以在静止培养条件下优选地可以生产至少10-50mg/l;也预期用本领域接受的按比例放大方法如“补料分批”(即非静止)生产方法,来全部地或部分地增加本发明的蛋白构建体的生产,其中获得了至少5-500mg/l的产量,且在一些情况下为至少0.5-1gm/l,这取决于特定的蛋白产物。
根据本发明的构建体(包括结合结构域多肽)可以是,例如,具有特异性识别和结合同源的生物分子或一种以上分子的复合物或这种分子的稳定的或瞬时的装配体(assembly)或聚集体的能力的任何多肽。这样的分子包括蛋白、多肽、肽、氨基酸或其衍生物;脂质、脂肪酸等或其衍生物;碳水化合物、糖等或其衍生物等;核酸、核苷酸、核苷、嘌呤、嘧啶或有关的分子,或其衍生物等;或其任意组合,例如,糖蛋白、糖肽、糖脂、脂蛋白、蛋白脂质等;或可能存在于生物学样品中的任意其他生物分子。通过例如从受试者或生物来源获得血样、活组织检查样品、组织外植块、器官培养物、生物流体或任意其他组织或细胞或其他制备物,可以提供生物学样品。受试者或生物来源可以是例如人或非人动物、原代细胞培养物或适合培养的细胞系,包括但不限于可能含有染色体整合的或附加型重组核酸序列的基因工程化的细胞系、无限增殖化的或可无限增殖化的细胞系、体细胞杂交细胞系、分化的或可分化的细胞系、转化的细胞系等。在本发明的某些优选的实施方案中,受试者或生物来源可能被怀疑患有疾病、障碍或状况、包括恶性疾病、障碍或状况或B细胞障碍,或者具有患它们的风险,在某些其他的实施方案中,其可以是自身免疫病,且在本发明的某些其他的实施方案中,受试者或生物来源可以已知没有患这样的疾病、障碍或状况的风险,或没有该疾病、障碍或状况。
结合区,包括结合结构域多肽,例如,可以是生物分子或其他分子(它是目标靶结构)的任何自然产生的、合成的、半合成的和/或重组生产的结合配偶体,所述生物分子或其他分子在本文中有时称作“抗原”,但根据本发明的公开内容,意欲包括任何需要使本发明例如融合蛋白结合或特异性地结合的靶生物分子或其他分子。本发明的构建体(包括结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白)会被定义为“免疫特异性的”,或能以需要程度结合,包括特异性地结合,如果它们以需要的水平结合需要的靶分子的话,例如如本文提供的抗原,例如,以大于或等于约104M-1的Ka,优选大于或等于约105M-1,更优选大于或等于约106M-1,更优选大于或等于约107M-1结合。甚至大于约107M-1的亲和力仍然是更优选的,例如等于或大于约107M-1、约108M-1、约109M-1和约1010M-1的亲和力。使用常规技术,例如Scatchard等,1949 Ann.N.Y.Acad.Sci.51:660所述的技术,可以容易地测定根据本发明的结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白的亲和力。也可以使用多种已知用于鉴定和获得能特异性地与其他蛋白或多肽相互作用的蛋白的方法中的任一种,例如美国专利号5,283,173和美国专利号5,468,614或其同族专利(equivalent)等描述的酵母双杂交筛选系统,来进行融合蛋白与目标靶抗原的结合的这种测定。
本发明构建体、例如结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白的优选的实施方案包含结合区或结合结构域,其可以包含,例如,至少一个天然的或工程化的免疫球蛋白可变区多肽,例如天然的或工程化的重链和/或天然的或工程化的轻链V-区域的全部或一部分或片段,前提是它能以需要的结合水平和选择性结合或特异性地结合抗原或其他的需要的目标靶结构。在其他优选的实施方案中,结合区或结合结构域包含下述组分、基本上由其组成或由其组成:例如,单链免疫球蛋白-衍生的Fv产物,和scFv,其可以包括至少一个天然的或工程化的免疫球蛋白轻链V-区域的全部或一部分和至少一个天然的或工程化的免疫球蛋白重链V-区域的全部或一部分,和融合或另外连接到V-区域上的接头;本文更详细描述了这样的构建体的制备和检验。其他的制备和检验方法是本领域公知的。
如本文所述的和本领域已知的,免疫球蛋白包含成员能表现出高度的序列保守的基因家族的产物。可以比对和分析2个或更多个免疫球蛋白或免疫球蛋白结构域或区域或其一部分(例如,VH结构域、VL结构域、铰链区、CH2恒定区、CH3恒定区)的氨基酸序列。通过例如序列同源性,可以鉴别彼此对应的序列部分。用许多序列比对和分析工具中的任一种,包括本领域的普通技术人员众所周知的计算机算法,例如比对或BLAST算法(Altschul,1991J.Mol.Biol.219:555-565;Henikoff和Henikoff,1992Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915-10919),其可以在NCBI网站(http://www/ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST)上得到,可以确定序列同源性。可以使用默认参数。
可以将,例如,特定免疫球蛋白参照序列的部分和任意一种或多种其他目标免疫球蛋白序列的部分,与参照序列进行对比。根据Kabat,Sequences of Proteins of Immunological Interest,(第5版Bethesda,MD:Public Health Service,National Institutes ofHealth(1991)),在关于给免疫球蛋白氨基酸位置编号的协定的基础上,可以鉴别出“对应的”序列、区域、片段等。例如,根据该协定,基于可变区多肽序列的不变氨基酸残基的保守,可以确定目标免疫球蛋白序列所属的免疫球蛋白家族,以鉴别免疫球蛋白家族的特定编号系统,然后可以比对目标序列,以为包含这样的序列的单独氨基酸分配序列位置编号。在至少约1000,更优选地约700-950,更优选地约350-700,更优选地约100-350,更优选地约80-100,约70-80,约60-70,约50-60,约40-50或约30-40个连续氨基酸序列的给定氨基酸序列中,优选地至少约70%,更优选地至少约80%-85%或约86%-89%,更优选地至少约90%,约92%,约94%,约96%,约98%或约99%的氨基酸与位于参照序列(例如Kabat(1991)公开的那些)或有关的免疫球蛋白序列的类似概略(例如可以使用例如,上述的那些序列比对工具,从公开的数据库(例如,Genbank,SwissProt,等)产生的)中的对应位置的氨基酸相同。在某些优选的实施方案中,目标免疫球蛋白序列或其区域、部分、衍生物或片段与对应的参照序列有超过约95%的同一性,且在某些优选的实施方案中,这样的目标序列与对应的参照物可以有不超过约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸位置的差异。
例如,在某些实施方案中,本发明涉及构建体,其包括结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白,其在有关的部分中包含人或其他物种的免疫球蛋白重链可变区多肽,后者在与例如SEQ ID NO:212的氨基酸位置9、10、11、12、108、110、111和112中的一个或多个相对应的一个或多个位置的氨基酸处包含突变、改变或缺失,其包含,例如,鼠VH-衍生的序列。在相对有限数目的免疫球蛋白VH序列位置,例如,包括位置11,在哺乳动物物种系间分析的压倒多数的VH序列中观察到了氨基酸保守(例如,Leu11、Val37、Gly44、Leu45、Trp47;Nguyen等,1998 J.Mol.Biol 275:413)。各种这样的氨基酸残基,以及因此它们的侧链,位于可变结构域(VH)的表面。它们可以接触CH1结构域(例如,Leu11)和VL结构域(例如,Val37、Gly44、Leu45和Trp47)的残基,且在没有轻链的情况下,有助于蛋白的稳定性和溶解度(参见,例如,Chothia等,1985 J.Mol.Biol.186:651;Muyldermans等,1994 Prot.Engineer.7:1129;Desmyter等,1996Nat.Struct.Biol.3:803;Davies等,1994 FEBS Lett.339:285)。在某些实施方案中,例如,本发明也涉及构建体,其包括结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白,其在有关的部分中包含人免疫球蛋白轻链可变区多肽,或来自另一物种的免疫球蛋白轻链可变区多肽,其在与氨基酸位置12、80、81、82、83、105、106、107和108中的一个或多个相对应的一个或多个位置的氨基酸处包含突变、改变或缺失。在其他的某些实施方案中,例如,本发明涉及构建体,其包括结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白,其在有关的部分包含(1)人免疫球蛋白重链可变区多肽,或来自另一物种的免疫球蛋白轻链可变区多肽,其包含下述组分、基本上由其组成或由其组成:所述的重链序列,其在与氨基酸位置9、10、11、12、108、110、111和112中的一个或多个相对应的一个或多个位置处具有突变、改变或缺失,和(2)人免疫球蛋白轻链可变区多肽,或来自另一物种的免疫球蛋白轻链可变区多肽,其包含下述组分、基本上由其组成或由其组成:所述的轻链序列,其在与氨基酸位置12、80、81、82、83、105、106、107和108中的一个或多个相对应的一个或多个位置处具有突变、改变或缺失。
作为另一个实例,参考免疫球蛋白序列概略和数据库,例如上面引用的那些,例如,可以以允许鉴别动物物种来源、特定免疫球蛋白或免疫球蛋白区域多肽序列的类别和亚类(例如,同种型)的方式,容易地建立2个或更多个免疫球蛋白序列彼此的相关性,而无需过度的实验。任何免疫球蛋白可变区多肽序列,包括天然的或工程化的VH和/或VL和/或单链可变区(sFv)序列或其他的天然的或工程化的V区-衍生的序列等,都可以用作结合区或结合结构域。工程化的序列包括来自任何物种的免疫球蛋白序列,例如,优选地人或小鼠,其包括例如,在与重链可变区序列或scFv的氨基酸位置9、10、11、12、108、110、111和112中的一个或多个相对应的一个或多个位置的氨基酸处的突变、改变或缺失,和/或在与轻链可变区序列或scFv的氨基酸位置12、80、81、82、83、105、106、107和108中的一个或多个相对应的一个或多个位置处的突变、改变或缺失。
各种优选的实施方案包括,例如,天然的或工程化的免疫球蛋白V区多肽序列,其源自例如抗体,包括单克隆抗体例如鼠的或其他的啮齿动物抗体,或源自其他来源的抗体或单克隆抗体,例如山羊、兔、马、牛、骆驼科动物或其他的物种,包括转基因动物,且也包括人或人源化的抗体或单克隆抗体。非限制性的实例包括源自单克隆抗体的可变区多肽序列,例如本文指出的和/或在下面的实施例中更详细地描述的那些,例如,CD20-结合或特异性的鼠单克隆抗体(例如,2H7),其他的非1F5抗体的CD20-结合或特异性的鼠单克隆抗体,单克隆抗体L6(对碳水化合物-定义的表位是特异性的,且可以作为杂交瘤HB8677从美国典型培养物保藏中心Manassas,VA得到),和能结合CD28(例如,单克隆抗体2E12)、CD40、CD80、CD137(例如,单克隆抗体5B9或单克隆抗体1D8,其能识别CD137、41BB的鼠同系物)和CD152(CTLA-4)或对其特异性的单克隆抗体。
其他的结合区,包括结合结构域多肽,可以包含任何蛋白或其一部分,后者能保留结合或特异性地结合本文所述的抗原的能力,包括非免疫球蛋白。因而,本发明包括构建体,包括融合蛋白,其包含源自多肽配体的结合区或结合结构域多肽,所述的多肽配体例如激素、细胞因子、趋化因子等;这样的多肽配体的细胞表面或可溶的受体;凝集素;细胞间粘附受体例如特异性的白细胞整联蛋白、选择蛋白、免疫球蛋白基因超家族成员、细胞间粘附分子(ICAM-1,-2,-3)等;组织相容性抗原;等。
可以用于制备或作为结合区、或可提供结合结构域多肽、且也可以被选择为本发明的构建体(包括例如结合结构域-Ig融合蛋白)需要结合的靶分子或抗原的细胞表面受体的实例包括以下的等:HER1(例如,GenBank登记号U48722,SEG_HEGFREXS,KO3193),HER2(Yoshino等,1994 J.Immunol.152:2393;Disis等,1994Canc.Res.54:16;也参见,例如,GenBank登记号X03363,M17730,SEG_HUMHER20),HER3(例如,GenBank登记号U29339,M34309),HER4(Plowman等,1993 Nature 366:473;也参见例如,GenBank登记号L07868,T64105),表皮生长因子受体(EGFR)(例如,GenBank登记号U48722,SEG_HEGFREXS,KO3193),血管内皮细胞生长因子(例如,GenBank No.M32977),血管内皮细胞生长因子受体(VEGF)(例如,GenBank登记号AF022375,1680143,U48801,X62568),胰岛素-样生长因子-I(例如,GenBank登记号X00173,X56774,X56773,X06043,也参见欧洲专利号GB 2241703),胰岛素-样生长因子-II(例如,GenBank登记号X03562,X00910,SEG_HUMGFIA,SEG_HUMGFI2,M17863,M17862),转铁蛋白受体(Trowbridge和Omary,1981 Proc.Nat.Acad.USA 78:3039;也参见例如,GenBank登记号X01060,M11507),雌激素受体(例如,GenBank登记号M38651,X03635,X99101,U47678,M12674),孕酮受体(例如,GenBank登记号X51730,X69068,M15716),促卵泡激素受体(FSH-R)(例如,GenBank登记号Z34260,M65085),视黄酸受体(例如,GenBank登记号L12060,M60909,X77664,X57280,X07282,X06538),MUC-1(Barnes等,1989 Proc.Nat.Acad.Sci.USA 86:7159;也参见例如,GenBank登记号SEG_MUSMUCIO,M65132,M64928)NY-ESO-1(例如,GenBank登记号AJ003149,U87459),NA 17-A(例如,欧洲专利号WO 96/40039),Melan-A/MART-1(Kawakami等,1994Proc.Nat.Acad.Sci.USA 91:3515;也参见例如,GenBank登记号U06654,U06452),酪氨酸酶(Topalian等,1994Proc.Nat.Acad.Sci.USA 91:9461;也参见例如,GenBank登记号M26729,SEG_HUMTYRA,也参见Weber等,J Clin.Invest(1998)102:1258),Gp-100(Kawakami等,1994 Proc.Nat.Acad.Sci.USA91:3515;也参见例如,GenBank登记号S73003,也参见欧洲专利号EP 668350;Adema等,1994 J.Biol.Cliem.269:20126),MAGE(vanden Bruggen等,1991 Science 254:1643;也参见例如,GenBank登记号U93163,AF064589,U66083,D32077,D32076,D32075,U10694,U10693,U10691,U10690,U10689,U10688,U10687,U10686,U10685,L18877,U10340,U10339,L18920,U03735,M77481),BAGE(例如,GenBank登记号U19180;也参见美国专利号5,683,886和5,571,711),GAGE(例如,GenBank登记号AF055475,AF055474,AF055473,U19147,U19146,U19145,U19144,U19143,U19142),CTA类受体中的任一种,尤其包括SSX2基因编码的HOM-MEL-40抗原(例如,GenBank登记号X86175,U90842,U90841,X86174),癌胚抗原(CEA,Gold和Freedman,1985 J.Exp.Med.121:439;也参见例如,GenBank登记号SEG_HUMCEA,M59710,M59255,M29540),和PyLT(例如,GenBank登记号J02289,J02038)。
其他可以作为结合区或结合结构域多肽或其部分的来源或可以作为靶(包括靶抗原)的细胞表面受体包括以下的等:CD2(例如GenBank登记号Y00023,SEG_HUMCD2,M16336,M16445,SEG_MUSCD2,M14362),4-1BB(CDw137,Kwon等.,1989 Proc.Nat.Acad.Sci.USA 86:1963,4-1BB配体(Goodwin等.,1993 Eur.J.Immunol.23:2361;Melero等.,1998 Eur.J.Immunol.3:116),CD5(例如GenBank登记号X78985,X89405),CD10(例如GenBank登记号M81591,X76732)CD27(例如GenBank登记号M63928,L24495,L08096),CD28(June等.,1990 Immunol.Today 11:211;也见,例如GenBank登记号J02988,SEG_HUMCD28,M34563),CD152/CTLA-4(例如GenBank登记号L15006,X05719,SEG_HUMIGCTL),CD40(例如GenBank登记号M83312,SEG_MUSC040A0,Y10507,X67878,X96710,U15637,L07414),干扰素γ(IFN-γ,见例如Farrar等.1993 Ann.Rev.Immunol.11:571及其中引用的文献,Gray等.1982 Nature 295:503,Rinderknecht等.1984 J Biol.Chem.259:6790,DeGrado等.1982 Nature 300:379),白细胞介素-4(IL-4,见例如53rd ForuminImmunology,1993 Research in Immunol.144:553-643;Banchereau等.,1994 in The Cytokine Handbook,2nd ed.,A.Thomson,ed.,Academic Press,NY,p.99;Keegan等.,1994 J Leukocyt.Biol..55:272,及其中引用的文献),白细胞介素-17(IL-17)(例如,GenBank登记号U32659,U43088)和白细胞介素-17受体(IL-17R)(例如,GenBank登记号U31993,U58917)。尽管有前述内容,但本发明明确地不包括U.S.5,807,734或U.S.5,795,572所公开的任何免疫球蛋白融合蛋白。
其他可以作为结合区或结合结构域多肽或其部分的来源或可以用作靶(包括靶抗原或结合位点)的细胞表面受体包括以下的等:CD59(例如,GenBank登记号SEG_HUMCD590,M95708,M34671),CD48(例如,GenBank登记号M59904),CD58/LFA-3(例如,GenBank登记号A25933,Y00636,E12817,也见JP 1997075090-A),CD72(例如,GenBank登记号AA311036,S40777,L35772),CD70(例如,GenBank登记号Y13636,S69339),CD80/B7.1(Freeman等.,1989 J.Immunol.43:2714;Freeman等.,1991 J.Exp.Med.174:625,也见,例如GenBank登记号U33208,I683379),CD86/B7.2(Freeman等.,1993J.Exp.Med.178:2185,Boriello等.,1995 J Immunol.155:5490;也见,例如GenBank登记号AF099105,SEG_MMB72G,U39466,U04343,SEG_HSB725,L25606,L25259),B7-H1/B7-DC(例如,Genbank登记号NM_014143,AF177937,AF317088;Dong等,2002Nat.Med.Jun 24[epub ahead of print],PMID 12091876;Tseng等,2001 J.Exp.Med.193:839;Tamura等,2001 Blood 97:1809;Dong等,1999 Nat.Med.5:1365),CD40配体(例如,GenBank登记号SEGHUMCD40L,X67878,X65453,L07414),I L-17(例如,GenBank登记号U32659,U43088),CD43(例如,GenBank登记号X52075,J04536),ICOS(例如,Genbank登记号AH011568),CD3(例如,Genbank登记号NM_000073(γ亚基),NM_000733(ε亚基),X73617(δ亚基)),CD4(例如,Genbank登记号NM_000616),CD25(例如,Genbank登记号NM_000417),CD8(例如,Genbank登记号M12828),CD11b(例如,Genbank登记号J 03925),CD14(例如,Genbank登记号XM_039364),CD56(例如,Genbank登记号U63041),CD69(例如,Genbank登记号NM_001781)和VLA-4(α4β7)(例如,GenBank登记号L12002,X16983,L20788,U97031,L24913,M68892,M95632)。以下细胞表面受体一般与B细胞相关:CD19(例如,GenBank登记号SEG_HUMCD19W0,M84371,SEG_MUSCD19W,M62542),CD20(例如,GenBank登记号SEGHUMCD20,M62541),CD22(例如,GenBank登记号I680629,Y10210,X59350,U62631,X52782,L16928),CD30(例如GenBank登记号M83554,D86042),CD153(CD30配体,例如,GenBank登记号L09753,M83554),CD37(例如,GenBank登记号SEG_MMCD37X,X14046,X53517),CD50(ICAM-3,例如,GenBank登记号NM_002162),CD106(VCAM-1)(例如,GenBank登记号X53051,X67783,SEGMMVCAM1C,也见美国专利号5,596,090),CD54(ICAM-1)(例如,GenBank登记号X84737,S82847,X06990,J03132,SEG_MUSICAM0),白细胞介素-12(见,例如Reiter等,1993 Crit.Rev.Immunol.13:1,及其中引入的参考文献),CD134(OX40,例如,GenBank登记号AJ277151),CD137(41BB,例如,GenBank登记号L12964,NM_001561),CD83(例如,GenBank登记号AF001036,AL021918),DEC-205(例如,GenBank登记号AF011333,U19271)。
本发明的构建体(包括结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白)包含例如,结合结构域,例如结合结构域多肽,其根据某些特别优选的实施方案,能结合或特异性地结合至少一个靶,例如,存在于免疫效应细胞上的靶抗原或其他的结合位点。根据非限制性的理论,这样的构建体,包括例如结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白,可以在治疗背景下有利地募集需要的免疫效应细胞功能,其中众所周知可以在它们对许多种类的细胞表面抗原(包括许多本文所述的本发明的构建体(包括结合结构域多肽)可以特异性地结合的抗原)的差异化表达的基础上,来鉴别或区分具有不同的特化的免疫功能的免疫效应细胞。如本文所指出的,免疫效应细胞包括能直接地介导作为免疫系统功能组分的活性的任何细胞,包括自然地或作为基因工程的结果而具有这样的能力的细胞。
在某些实施方案中,免疫效应细胞包含免疫球蛋白或其他肽结合分子的细胞表面受体,例如免疫球蛋白恒定区的受体,且包括通常称作“Fc受体”(“FcR”)的受体类别。已经在结构上和/或功能表征了许多FcR,且其是本领域众所周知的,包括具有与限定亚型的免疫球蛋白重链同种型相互作用的特定能力,或其能以各种亲和力与Fc结构域相互作用,和/或其可以在某些条件下在限定亚型的免疫效应细胞上表达的FcR(例如,Kijimoto-Ochichai等,2002 CellMol.Life Sci.59:648;Davis等,2002 Curr.Top.Microbiol.Immunol.266:85;Pawankar,2001 Curr.Opin.Allerg.Clin.Immunol:3;Radaev等,2002 Mol.Immunol.38:1073;Wurzburg等,2002Mol.Immunol.38:1063;Sulica等,2001 Int.Rev.Immunol.20:371;Underhill等,2002 Ann.Rev.Immunol.20:825;Coggeshall,2002 Curr.Dir.Autoimm.5:1;Mimura等,2001 Adv.Exp.Med.Biol.495:49;Baumann等,2001 Adv.Exp.Med.Biol.495:219;Santoso等,2001 Ital.Heart J.2:811;Novak等,2001 Curr.Opin.Immunol.13:721;Fossati等,2001 Eur.J Clin.Invest.31:821).
能介导ADCC的细胞是根据本发明的免疫效应细胞的优选的实例。其他的优选的实例包括自然杀伤细胞、肿瘤浸润性T淋巴细胞(TIL)、细胞毒性T淋巴细胞和粒细胞,例如包含变态反应机制的细胞。免疫效应细胞因而包括,但不限于,造血来源的细胞,包括骨髓和淋巴谱系内的处于各种分化阶段的细胞,且其可能(但是不必需)表达一种或多种类型的功能性细胞表面FcR,例如T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、血小板、红细胞和前体、祖先(例如,造血干细胞),以及这样的细胞的休眠的、激活的和成熟的形式。其他的免疫效应细胞可以包括非-造血来源的能介导免疫功能的细胞,例如,内皮细胞、角质细胞、成纤维细胞、破骨细胞、上皮细胞和其他的细胞。免疫效应细胞也可以包括能介导细胞毒性的或抑制细胞事件或内吞作用的、吞噬作用的或胞饮作用的事件的细胞,或能实现细胞凋亡的诱导的细胞,或能实现微生物免疫或微生物感染的中和的细胞,或能介导变态反应的、炎性的、过敏性和/或自身免疫反应的细胞。
变态反应机制是本领域众所周知的,且包括抗原(例如,变应原)-特异性的组分例如免疫球蛋白(例如,IgE)以及细胞和介体,其包含变应原-免疫球蛋白(例如,IgE)相遇的后遗症(例如,Ott等,2000J.Allerg.Clin.Immunol 106:429;Barnes,2000 J Allerg.Clin.Immunol.106:5;Togias,2000 J.Allerg.Clin.Immunol 105:S599;Akdis等,2000 Int.Arch.Allerg.Immunol.121:261;Beach,2000Occup.Med.15:455)。特别地,关于能与FcR相互作用的本发明的构建体(包括结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白),本发明的某些实施方案预期构建体(包括融合蛋白),其包含一个或多个IgE-衍生的结构域,包括,例如,能诱导变态反应机制的那些,包含IgE-特异性的FcR或其部分,其中IgE-特异性的FcR包括上面指出的那些和在引用的文章中描述或鉴别的那些。不希望受特定理论或机理的约束,且如本文所公开的,本发明的构建体(包括融合蛋白)可以包含IgE重链Fc结构域多肽的部分,例如,天然的或工程化的IgE CH3和CH4结构域,无论是提供或表达为细胞表面蛋白(例如,具有质膜锚定结构域)还是可溶的或另外非细胞结合的蛋白(例如,没有质膜锚定结构域)。另外根据非限制性的理论,变态反应机制(例如,能表达FcR-ε的免疫效应细胞)的募集和诱导,可以作为如本文所述的IgE Fc结构域或其部分(例如,能通过FcR交联触发变态反应机制的)的存在和结合区(例如结合结构域)能结合或特异性地结合的靶(例如抗原)的存在之一或二者的结果而发生。因此,本发明在至今未得到重视的背景下开发变态反应机制的诱导,例如恶性状况或B细胞障碍的治疗,包括本文所述的或指出的那些。
免疫球蛋白铰链区多肽包括自然地、作为人工肽或作为基因工程的结果产生的任何铰链肽或多肽,且其位于例如负责形成CH1和CH2区域中的链内免疫球蛋白-结构域二硫键的氨基酸残基之间的免疫球蛋白重链多肽上。在本发明中使用的铰链区多肽也可以包括突变的或另外改变的铰链区多肽。因此,例如,免疫球蛋白铰链区多肽可以源自或可以是传统上视作具有铰链功能的免疫球蛋白多肽链区域的部分或片段(即,肽连接中的一个或多个氨基酸,一般约15-115个氨基酸,优选地约95-110,约80-94,约60-80,或约5-65个氨基酸,优选地约10-50,更优选地约15-35,更优选地约18-32,更优选地约20-30,更优选地约21、22、23、24、25、26、27、28或29个氨基酸),包括本文所述的那些,但是在本发明中使用的铰链区多肽不必需限于此,且在IgG、IgA和IgD的情况下,可以包括位于(如本领域已知的,根据用于将特定残基分配到可以变化的特定结构域上的结构标准)邻接免疫球蛋白结构域例如CH1结构域和/或CH2结构域中(或在IgE的情况下,在邻接免疫球蛋白结构域例如CH1结构域和/或CH3结构域中)的一个或多个氨基酸,或在某些人工地工程化的免疫球蛋白构建体的情况下,包括免疫球蛋白可变区结构域。
野生型免疫球蛋白铰链区多肽包括位于免疫球蛋白例如,人免疫球蛋白的恒定区结构域CH1和CH2之间的任何已知的或以后发现的自然产生的铰链区(或在某些种类的免疫球蛋白例如IgE的CH1和CH3区域之间)。关于在构建一种类型的连接区中的应用,野生型免疫球蛋白铰链区多肽优选地是人免疫球蛋白铰链区多肽,优选地包含来自人IgG、IgA或IgD免疫球蛋白的铰链区(或IgE免疫球蛋白的CH2区域),且更优选地,例如,来自如本文所述的野生型或突变的人IgG1同种型的铰链区多肽。
如本领域已知的,尽管免疫球蛋白氨基酸序列存在极大的总体多样性,但免疫球蛋白一级结构能在免疫球蛋白多肽链的特定部分表现出高度的序列保守,特别是关于半胱氨酸残基的发生,其借助它们的sulfyhydryl基团,能提供与其他可得到的sulfydryl基团形成二硫键的潜力。因此,在本发明的上下文中,用作连接区的野生型免疫球蛋白铰链区多肽包括特征在于一个或多个高度保守的(例如,以统计学上显著的方式,在群体中占优势)半胱氨酸残基的那些,且在某些优选的实施方案中,连接区可以包含下述组分、基本上由其组成或由其组成:突变的铰链区多肽,可以进行选择以使其含有小于自然产生的半胱氨酸的数目,例如,在IgG1和IgG4铰链区的情况下为0或1或2个半胱氨酸残基,且其从(或使用)这样的野生型铰链区序列衍生或构建。
在某些优选的实施方案中,其中连接区是铰链区多肽,且铰链区多肽是突变的、工程化的或另外改变的人IgG1免疫球蛋白铰链区多肽,其从(或使用)野生型铰链区序列衍生或构建,注意到野生型人IgG1铰链区多肽序列包含3个不相邻的半胱氨酸残基,分别称作野生型铰链区的第一个半胱氨酸,野生型铰链区的第二个半胱氨酸和野生型铰链区的第三个半胱氨酸,它们从多肽N-末端沿着铰链区序列向C-末端前进。这在本文中可以称作“CCC”铰链(或“WTH”,即,野生型铰链)。突变的或工程化的铰链区的实例包括没有半胱氨酸的那些,其在本文中可以称作“XXX”铰链(或,例如,“MH-XXX”,是指突变的或工程化的铰链,其具有3个代替自然产生的半胱氨酸的氨基酸或其他分子,例如,“MH-SSS”,其指突变的铰链,其有3个代替自然产生的半胱氨酸残基的丝氨酸残基)。应当理解,术语“突变的”仅仅指一项事实,即在自然产生的残基的位置存在不同的一个或多个分子,或没有分子,且不指任何具体的方法,通过该方法已经进行了这样的取代、改变或缺失。因此,在本发明的某些实施方案中,连接区可以是铰链区多肽,且铰链区多肽是突变的含有2个半胱氨酸残基的人IgG1免疫球蛋白铰链区多肽,且其中野生型铰链区的第一个半胱氨酸例如没有被改变或缺失。这可以称作“MH-CXX”铰链,例如,“MH-CSC”铰链,在这种情况下,半胱氨酸残基已经被替代为丝氨酸残基。在本发明的某些其他的实施方案中,突变的人IgG1免疫球蛋白铰链区多肽含有不超过1个半胱氨酸残基,且包括,例如,“MH-CSS”铰链或“MH-SSC”铰链或“MH-CSC”铰链,且在某些其他的实施方案中,突变的人IgG1免疫球蛋白铰链区多肽不含有半胱氨酸残基,例如,“MH-SSS”铰链。
本发明的构建体(包括结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白)明确地不预期美国专利号5,892,019公开的任何融合蛋白。美国专利号5,892,019涉及人IgG1铰链区,其中第一个IgG1铰链区半胱氨酸残基已经被改变或缺失,但是保留与野生型IgG1铰链区序列的第二个和第三个半胱氨酸相对应的第二个和第三个IgG1铰链区半胱氨酸残基。该专利称,替换野生型IgG1铰链区的第一个半胱氨酸残基,以阻止第一个半胱氨酸残基干扰所述的多肽适当地组装成二聚体。该专利要求保留IgG1铰链区的第二个和第三个半胱氨酸,以提供2个重链恒定区之间的链间二硫键连接,以促进二聚体形成,从而使该分子具有效应子功能,例如介导ADCC的能力。
相反地且如本文所述的,本发明的构建体(包括结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白)中的每一种都能例如,进行ADCC、CDC和/或补体固定,所述构建体不限于此,且可以在适当的部分包含,例如,(i)野生型免疫球蛋白铰链区多肽,例如野生型人免疫球蛋白铰链区多肽,例如,人IgG1免疫球蛋白铰链区多肽,(ii)突变的或另外改变的免疫球蛋白铰链区多肽,例如突变的或另外改变的人免疫球蛋白铰链区多肽,例如,突变的或另外改变的人IgG1免疫球蛋白铰链区多肽,例如,它是或已经从(或使用)具有3个或更多个半胱氨酸残基的野生型免疫球蛋白铰链区多肽或核酸序列衍生的或构建的,其中该突变的或另外改变的人IgG1免疫球蛋白铰链区多肽含有2个半胱氨酸残基,且其中野生型铰链区的第一个半胱氨酸没有被突变或缺失,(iii)突变的或另外改变的免疫球蛋白铰链区多肽,例如突变的或另外改变的人免疫球蛋白铰链区多肽,例如,突变的或另外改变的人IgG1免疫球蛋白铰链区多肽,例如,它是或已经从(或使用)具有3个或更多个半胱氨酸残基的野生型免疫球蛋白铰链区多肽或核酸序列衍生的或构建的,其中该突变的或另外改变的人IgG1免疫球蛋白铰链区多肽含有不超过1个半胱氨酸残基,或(iv)突变的或另外改变的免疫球蛋白铰链区多肽,例如突变的或另外改变的人免疫球蛋白铰链区多肽,例如,突变的或另外改变的人IgG1免疫球蛋白铰链区多肽,它是或已经从(或使用)具有3个或更多个半胱氨酸残基的野生型免疫球蛋白铰链区多肽或核酸序列衍生的或构建的,其中该突变的或另外改变的(例如,通过氨基酸变化或缺失)人IgG1免疫球蛋白铰链区多肽不含有半胱氨酸残基。本发明提供了意料不到的优点,其与本文所述的构建体(包括融合蛋白)保留介导ADCC和/或CDC和/或补体固定的能力有关,尽管通过去除或替代1、2或3个铰链区半胱氨酸残基,消除或减弱了通过IgG1铰链区链间二硫键进行二聚化的能力,且甚至在构建体中,其中IgG1铰链区的第一个半胱氨酸,例如,未被突变或改变或缺失。
连接区可以包含突变的或另外改变的免疫球蛋白铰链区多肽,其自身可以包含铰链区,后者源自物种、免疫球蛋白同种型或类,或与尾区不同的免疫球蛋白亚类的免疫球蛋白,例如,所述的尾区,包含CH2和CH3结构域(或IgE CH3和CH4结构域)、基本上由其组成或由其组成。例如,在本发明的某些实施方案中,构建体,例如,结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白,可以包含结合区例如结合结构域多肽,其融合或另外连接免疫球蛋白铰链区多肽,后者包含下述组分、基本上由其组成或由其组成:野生型人IgA铰链区多肽,或突变的或另外改变的人IgA铰链区多肽,其含有0或仅仅1个或多个半胱氨酸残基(但是小于半胱氨酸的野生型数目),如本文所述的,或野生型人IgG铰链,例如IgG1铰链,区域多肽,或野生型人IgE铰链-作用区域,即,IgE CH2区域多肽,或突变的或另外改变的人IgG铰链,例如IgG1铰链,是或者已经突变或另外改变以含有0、1或2个半胱氨酸残基的区域多肽,其中野生型铰链区的第一个半胱氨酸没有被突变或改变或缺失,也如本文所述的。这样的铰链区多肽可以融合或另外连接到,例如,尾区,后者包含下述组分、基本上由其组成或由其组成:来自不同的Ig同种型或类的免疫球蛋白重链CH2区域多肽,例如IgA或IgD或IgG亚类(或来自IgE亚类的CH3区域),在某些优选的实施方案中,它是IgG1或IgA或IgE亚类,且在某些其他的优选的实施方案中,可以是IgG2、IgG3或IgG4亚类中的任一种。
例如,如本文更详细地描述的,在本发明的某些实施方案中,可以选择连接区为免疫球蛋白铰链区多肽,它是或已经从自然地包含3个半胱氨酸的野生型人IgA铰链区衍生,其中相对于完整的和/或自然产生的铰链区而言,截短或另外改变或取代了选择的铰链区多肽,从而仅仅保留1个或2个半胱氨酸残基(例如,SEQ ID NO:35-36)。类似地,在本发明的某些其他实施方案中,构建体可以是结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白,其包含结合结构域多肽,其融合或另外连接免疫球蛋白铰链区多肽,后者包含突变的或另外改变的铰链区多肽,其中通过氨基酸取代或缺失减少了半胱氨酸残基的数目,例如如本文所述的含有0、1或2个半胱氨酸残基的突变的或另外改变的IgG1铰链区,或含有0个半胱氨酸残基的IgD铰链区。
因而可以从(或使用)含有一个或多个半胱氨酸残基的野生型免疫球蛋白铰链区衍生或构建突变的或另外改变的铰链区多肽。在某些实施方案中,突变的或另外改变的铰链区多肽可以含有0或仅仅1个半胱氨酸残基,其中该突变的或另外改变的铰链区多肽是或已经从分别含有1个或多个、或2个或更多个半胱氨酸残基的野生型免疫球蛋白铰链区衍生的。在突变的或另外改变的铰链区多肽中,野生型免疫球蛋白铰链区的半胱氨酸残基优选地是缺失的,或被不能形成二硫键的氨基酸取代。在本发明的一个实施方案中,突变的或另外改变的铰链区多肽是或已经从人IgG野生型铰链区多肽衍生的,后者可以包括4个人IgG同种型亚类IgG1、IgG2、IgG3或IgG4中的任一个。在某些优选的实施方案中,突变的或另外改变的铰链区多肽是或已经从(或使用)人IgA或IgD野生型铰链区多肽衍生的。作为实例,是或已经从人IgG1或IgA野生型铰链区多肽衍生的突变的或另外改变的铰链区多肽可以包含在野生型免疫球蛋白铰链区的3个半胱氨酸残基中的2个处的突变、改变或缺失,或在所有3个半胱氨酸残基处的突变、改变或缺失。
存在于野生型免疫球蛋白铰链区并且通过根据本发明的特别优选的实施方案的诱变或任何其他技术去除或改变的半胱氨酸残基包括形成或能够形成链间二硫键的半胱氨酸残基。不希望受特定理论或作用机理的约束,本发明预期这些铰链区半胱氨酸残基的突变、缺失或其他改变,认为它们能参与链间二硫键的形成,减少本发明的结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白通过链间二硫键形成而二聚化(或形成更高级的寡聚体)的能力,同时出乎意料地不会消除或不需要地减弱融合蛋白或其他构建体促进ADCC和/或CDC和/或固定补体的能力。具体地,能介导ADCC的Fc受体(例如,FcRIII,CD16)能表现出对免疫球蛋白Fc结构域的低亲和力,这支持了下述概念,即Fc与FcR的功能性结合需要Fc-FcR复合物的抗体亲抗原性稳定化,这借助于常规抗体中重链的二聚体结构,和/或通过常规抗体Fc结构的FcR聚集和交联实现。Sonderman等,2000 Nature 406:267;Radaev等,2001 J.Biol.Chem.276:16469;Radaev等,2001 J.Biol.Chem.276:16478;Koolwijk等,1989 J.Immunol.143:1656;Kato等,2000Immunol.Today 21:310。因而,本发明的构建体(包括例如结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白)能提供与单链构建体(包括单链免疫球蛋白融合蛋白)相关的优点,同时也出乎意料地保留了一种或多种免疫学活性。类似地,固定补体的能力一般与关于诸如包含Fc的重链恒定区二聚化的免疫球蛋白相关,而本发明的各种构建体(包括结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白)能表现出出乎意料的固定补体的能力,其可能由于例如,铰链区半胱氨酸残基的替代或缺失,或由于如本文所述的其他结构修饰,具有减弱的或消除的形成链间二硫键的能力。另外,根据本发明的某些实施方案,其中构建体,包括,例如,结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白,可以包含连接区和尾区,后者包含下述组分、基本上由其组成或由其组成:一个或多个人IgE铰链-作用区域,即,IgE CH2区域多肽,人IgE CH3恒定区多肽,和人IgE CH4恒定区多肽,本发明的构建体(包括融合蛋白)出乎意料地保留了介导ADCC和/或诱导变态反应机制的免疫活性。
选择免疫球蛋白铰链区多肽作为根据本发明构建体(例如结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白)的某些实施方案的连接区,可以涉及“可变铰链区”多肽序列的应用,后者包括多肽序列,其不是必需源自任何免疫球蛋白铰链区序列本身的。相反地,可变铰链区是指包含至少约10个连续的氨基酸或分子的氨基酸序列或其他分子序列的铰链区多肽,且在某些实施方案中,为至少约11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21-25、26-30、31-50、51-60、71-80、81-90或91-110个氨基酸或分子,其存在于此处公开的序列中,例如是或已经从位于链内二硫键-产生的免疫球蛋白基因超家族成员的免疫球蛋白-样环结构域的区域衍生的多肽序列,所述超家族成员例如CD2(例如,Genbank登记号NM_001767)、CD4(例如,Genbank登记号NM_000616)、CD5(例如,Genbank登记号BC027901)、CD6(例如,Genbank登记号NM_006725)、CD7(例如,Genbank登记号XM_046782,BC009293,NM_006137)或CD8(例如,Genbank登记号M12828),或其他的Ig超家族成员。作为非限制性的实例,用作连接区的可变铰链区,例如,可以提供如本文所述的糖基化作用位点,或可以提供人基因-衍生的多肽序列,以用于增强融合蛋白的“人源化”程度的目的,或可以包含下述组分、基本上由其组成或由其组成:氨基酸序列,其能消除或减少本发明的构建体(例如融合蛋白)形成多聚体或寡聚体或聚集体等的能力。可以从(或使用)不是实际的免疫球蛋白本身的免疫球蛋白基因超家族成员的多肽序列衍生或构建某些可变铰链区多肽序列,包括本文所述的那些。例如和根据非限制性的理论,可以整体地或部分地使用位于链内二硫键-产生的免疫球蛋白基因超家族成员蛋白的免疫球蛋白环结构域之间的某些多肽序列作为本文所述的可变铰链区多肽,或可以经进一步修饰以用于这样的用途。
如上所述,根据非限制性的理论,认为本发明的构建体(包括结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白)通过链间二硫键形成进行二聚化的能力受到减弱,且还根据理论,该性质全部地或部分地是减少存在于免疫球蛋白铰链区多肽中的的半胱氨酸残基的数目的结果,所述免疫球蛋白铰链区多肽被选择用于包含在构建体(例如融合蛋白构建体)的构建中。多肽二聚化的相对能力的测定是相关领域的公知知识,其中许多建立的方法学中的任一种都可以用于检测蛋白二聚化(参见,例如,Scopes,Protein Purification:Principles and Practice,1987 Springer-Verlag,New York)。例如,用于在分子大小的基础上分离蛋白的生化分离技术(例如,凝胶电泳、凝胶过滤色谱、分析型超速离心等)和/或在导入巯基-活性剂(例如,碘乙酰胺,N-乙基马来酰亚胺)或二硫键-还原剂(例如,2-巯基乙醇,二硫苏糖醇)之前和之后对比蛋白物理化学性质,或其他的等同方法,都可以用于测定多肽二聚化或寡聚化的程度,并用于测定二硫键对这样的潜在的四级结构的可能的贡献。在某些实施方案中,本发明涉及构建体,例如结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白,相对于如本文所提供的野生型人免疫球蛋白G铰链区多肽,其能表现出减少的(即,相对于例如适当的IgG-衍生的对照,以统计学上显著的方式)二聚化的能力。本领域的技术人员能容易地确定,特定的融合蛋白是否能表现出这样的减少的二聚化的能力。
例如,用于制备免疫球蛋白融合蛋白的组合物和方法,是本领域众所周知的。参见,例如,美国专利号5,892,019,其报道了重组蛋白,后者是单个的编码多核苷酸的产物,但其不是根据本发明的构建体,包括结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白。
对于构建体,例如,在意在人用的本发明的免疫球蛋白融合蛋白中,任何包含的Ig恒定区一般都为人序列来源,或是人源化的,以使潜在的抗-人免疫反应最小化,并提供适当的和/或需要的效应子功能。能编码抗体恒定区的序列的操作,记载在Morrison和Oi的PCT公开WO 89/07142中。在特别优选的实施方案中,从其中CH1结构域是或已经缺失的(在IgE的情况下,是CH1和CH2区域)免疫球蛋白重链恒定区和结合结构域的羧基末端制备了尾区,或当结合结构域包含两个免疫球蛋白可变区多肽时,第二个(即更接近于C末端)可变区通过1个或多个连接区(例如铰链或改变的区域)连接到CH2的氨基末端。描述两个示例性结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白的结构的示意图见图11。在特别优选的实施方案中,不存在链间二硫键,且在其他实施方案中,相对于当存在野生型铰链区多肽时会存在的该键的数目,可以存在有限数目的链间二硫键。在其他实施方案中,本发明的构建体(例如,融合蛋白)包含下述组分、基本上由其组成或由其组成:突变的或另外改变的铰链区多肽,其与野生型人IgG铰链区多肽相比,能表现出减少的二聚化能力。因而,分离的能编码这样的单链构建体(例如免疫球蛋白融合蛋白)的多核苷酸分子具有结合区,例如,能提供对靶(例如靶抗原)的特异性的或另外需要的结合亲和力和选择性的结构域。
本发明也预期,例如,在某些实施方案中,构建体,包括结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白,其包含融合的或另外连接的多肽序列或其部分,后者从许多遗传来源衍生或制备,例如,根据分子“结构域交换”范例。本领域的普通技术人员能够明白,用于组装进构建体(例如结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白)中的这样的多肽序列的选择,例如,可以包含测定每种组分多肽序列的适当部分,例如,基于每种这样的序列的结构和/或功能性质(参见,例如,Carayannopoulos等,1996 J.Exp.Med.183:1579;Harlow等,编,Antibodies:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold SpringHarbor(1988))。因此,组成或制备构建体(例如融合蛋白)的组分多肽序列可以包含完整的或全长的结合结构域、免疫球蛋白、接头和/或质膜锚定结构域多肽序列,或其截短的形式或变体,例如本文提供的那些。根据本发明的这些和有关的实施方案,可以从独立的来源,例如从不同异型、同种型、亚类、类或物种的来源(例如,异种型)的免疫球蛋白序列,衍生或制备组成本发明的构建体(例如,融合蛋白)的任意2种或更多种候选组分多肽。因而,作为非限制性的实例,使用众所周知的技术,并根据例如本文所述的方法,可以从不同的遗传来源单独地得到结合结构域多肽(或它的组分多肽,例如一种或多种可变区多肽和/或接头多肽)、铰链区多肽、免疫球蛋白重链CH2和CH3恒定区多肽和任选的可以从IgM或IgE重链得到的免疫球蛋白重链CH4恒定区多肽,和质膜锚定结构域多肽,并工程化进嵌合的或融合蛋白中。
因此,本发明的构建体,例如根据本发明的某些实施方案的结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白,因而也可以在有关的部分包含免疫球蛋白重链CH3恒定区多肽,它是野生型IgA CH3恒定区多肽,或者,它是突变的或另外改变的或取代的或截短的IgA CH3恒定区多肽,其不能与J链结合,或其不能以不需要的程度结合J链;优选地,在构建体的尾区部分使用的IgA CH3恒定区多肽是人来源的或是人源化的。作为简单的背景,已知IgA分子能被释放到分泌液中,其机制包含IgA通过J链多肽与二硫键-连接的聚合物(例如,二聚体)中的结合(例如,Genbank登记号XM_059628,M12378,M12759;Johansen等,1999 Eur.J.Immunol.29:1701)和形成的复合物与另一种起聚合的免疫球蛋白受体的作用、且称作跨膜分泌组分的蛋白的相互作用(SC;Johansen等,2000 Sc.J.Immunol.52:240;也参见,例如,Sorensen等,2000 Int.Immunol 12:19;Yoo等,1999J.Biol.Chem.274:33771;Yoo等,2002 J.Immunol.Meth.261:1;Corthesy,2002 Trends Biotechnol.20:65;Symersky等,2000Mol.Immunol.37:133;Crottet等,1999 Biochem.J.341:299)。通过能形成IgA重链恒定区CH3结构域多肽的一部分的18-氨基酸C-末端突出端中的倒数第二个半胱氨酸残基,介导IgA Fc结构域和J链之间的链间二硫键形成(Yoo等,1999;Sorensen等,2000)。因此,本发明的构建体(包括例如,融合蛋白)的某些实施方案预期,包含能与J链结合的野生型IgA重链恒定区多肽序列。但是,本发明的某些其他实施方案预期融合蛋白,其包含突变的或另外改变的、取代的或截短的不能与J链结合的IgA CH3恒定区多肽。根据这样的实施方案,例如,可以缺失IgA CH3恒定区多肽(例如人IgA CH3恒定区多肽)的C-末端的2个或更多个残基,以产生如本文所提供的截短的CH3恒定区多肽。在优选的实施方案中,且如本文更详细地描述的,突变的不能与J链结合的人IgA CH3恒定区多肽包含这样的4或18个氨基酸的C-末端缺失。但是,本发明不限于此,从而突变的IgA CH3恒定区多肽可以包含约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21-25、26-30或更多个氨基酸的缺失,只要构建体(例如,融合蛋白)能特异性地结合抗原和具有至少一种本文所提供的免疫活性。或者,本发明也预期构建体,例如,融合蛋白,其具有尾区,后者包含突变的IgA CH3恒定区多肽,其通过倒数第二个半胱氨酸的替代,或通过该氨基酸残基的化学修饰,以能阻止或抑制不需要水平的链间二硫键或多聚体形成的方式,不能与J链结合。本领域的普通技术人员能知道,且本文描述或指出了,确定构建体(例如融合蛋白)是否结合J链的方法。
也如本文所述的和根据本领域已知的方法,还可以常规地测试构建体(例如融合蛋白)的免疫活性,例如,在ADCC或CDC测定中。作为示例性的实例,根据这样的实施方案的构建体(例如融合蛋白)可以包含从(或使用)下述序列衍生或构建的结合结构域多肽:天然的或工程化的人重链可变区多肽序列,天然的或工程化的人IgA-衍生的免疫球蛋白铰链区多肽序列,天然的或工程化的人IgG1免疫球蛋白重链CH2恒定区多肽序列,天然的或工程化的人IgG2免疫球蛋白重链CH3恒定区多肽序列,和任选的天然的或工程化的人IgE免疫球蛋白重链CH4恒定区多肽序列和/或天然的或工程化的人TNF-α受体1型(TNFR1)质膜锚定结构域多肽序列,其包含能进行细胞凋亡信号传导或促进细胞凋亡的细胞质尾区多肽。因此,本发明包括这些和根据本发明的其他的实施方案,其中存在于构建体(例如融合蛋白)中的2或更多个多肽序列具有独立的遗传来源。
如上所述,在某些实施方案中,构建体(例如结合蛋白-免疫球蛋白融合蛋白)包含至少一个天然的或工程化的免疫球蛋白可变区多肽,其可以是天然的或工程化的轻链或天然的或工程化的重链可变区多肽,且在某些实施方案中,融合蛋白包含至少一个这样的天然的或工程化的轻链V-区域和一个这样的天然的或工程化的重链V-区域和至少一个接头肽,后者能融合或另外连接到每个天然的或工程化的V-区域。这样的结合结构域(例如单链Fv结构域)的构建,是本领域已知的,且更详细地记载在下面的实施例中,且已经记载在例如本文引用的各种文献中;单链可变区和可以融合或另外连接到每个重链-衍生的和轻链-衍生的V区(例如,以产生结合区,例如包含单链Fv多肽的结合结构域)上的接头多肽的选择和组装,也是本领域已知的,且记载在本文中。参见,例如,美国专利号5,869,620、4,704,692和4,946,778。在某些实施方案中,根据公认的产生人源化的抗体(即,为了减少人免疫系统感知这样的蛋白作为外来物的程度,向其中导入了人Ig序列的免疫球蛋白序列)的方法,可以“人源化”源自非-人来源的免疫球蛋白序列的全部或一个或多个部分(参见,例如,美国专利号5,693,762;5,585,089;4,816,567;5,225,539;5,530,101;和其中引用的文献)。
根据某些实施方案,如本文所述的本发明的构建体(包括结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白)可以理想地包含糖基化作用位点,例如碳水化合物部分(例如单糖或寡糖)的共价附着位点。能提供多肽糖基化作用的底物的氨基酸序列的整合,也在相关领域的范围内,包括,例如,使用基因工程或蛋白工程方法,以得到含有例如N-(天冬酰胺)-连接的糖基化作用的经典的Asn-X-Ser/Thr位点的多肽序列,或含有适用作O-连接的糖基化作用的底物的Ser或Thr残基的序列,或适于C-甘露糖基化作用、糖基磷脂酰肌醇化/糖基磷脂酰肌醇修饰或磷酸糖化作用的序列,它们都可以根据本领域公知的标准进行鉴别(例如,Spiro,2002 Glybiology 12:43R)。不希望受任何具体理论或机制的约束,与具有相同的或高度相似的氨基酸序列、但是缺少糖基部分的构建体(包括融合蛋白)相比,糖基化的具有特定氨基酸序列的构建体(例如融合蛋白)可以有益地具有与改善的溶解度、增强的溶液稳定性、增强的生理稳定性、改善的生物利用度(包括体内生物分配)和优越的蛋白酶抗性(都是统计学上显著的方式)中的一种或多种有关的属性。在某些优选的实施方案中,本发明的构建体(例如融合蛋白构建体)可以包含存在于本文所提供的接头中的糖基化作用位点,且在某些其他的优选的实施方案中,本发明的构建体(例如,融合蛋白)包含存在于连接区中的糖基化作用位点,所述的连接区例如本文所提供的铰链区多肽序列。
在本发明的某些优选的实施方案中,例如用于基因治疗用途或展示系统或测定(例如筛选测定)(包括文库展示系统和文库筛选测定)的那些,构建体(例如,结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白)是蛋白或糖蛋白,其能由宿主细胞表达,从而定位在细胞表面。定位在细胞表面的构建体(例如结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白),可以借助于自然存在的或人工导入的结构特征来实现,该结构特征能将融合蛋白导向细胞表面(例如,Nelson等2001 Trends Cell Biol.11:483;Ammon等,2002 Arch.Physiol.Biochem.110:137;Kasai等,2001J.Cell Sci.114:3115;Watson等,2001 Am.J.Physiol.CellPhysiol.281:C215;Chatterjee等,200 J.Biol.Chem.275:24013),包括作为示例和非限制性的,分泌信号序列、前导序列、质膜锚定结构域多肽和跨膜结构域例如疏水的跨膜结构域(例如,Heuck等,2002Cell Biochem.Biophys.36:89;Sadlish等,2002 Biochem J.364:777;Phoenix等,2002 Mol.Membr.Biol.19:1;Minke等,2002Physiol.Rev.82:429)或糖基磷脂酰肌醇附着位点(“糖基磷脂酰肌醇化”位点,例如,Chatterjee等,2001 Cell Mol.Life Sci.58:1969;Hooper,2001 Proteomics 1:748;Spiro,2002 Glycobiol.12:43R)、细胞表面受体结合结构域、细胞外的基质结合结构域,或能造成至少需要部分的融合蛋白群体全部或部分地定位在细胞表面上的任何其他的结构特征。特别优选的是融合蛋白构建体,其包含质膜锚定结构域,后者包含跨膜多肽结构域,一般包含膜淘选结构域,其包含能与形成质膜双分子层的内部的磷脂脂肪酰基尾在能量上有利地相互作用的疏水区域。这样的特征是本领域的普通技术人员已知的,他们也熟悉通过基因工程将能编码这些特征的核酸序列导入主题表达构建体的方法,且也熟悉这些构建体的常规测试,以验证产物的细胞表面定位。
根据某些其他的实施方案,质膜锚定结构域多肽包含这样的跨膜结构域多肽,且也包含细胞质尾区多肽,后者指能接触质膜的细胞质面和/或接触胞质溶胶或其他的细胞质组分的多肽序列的区域或部分。已知了大量的细胞质尾区多肽,其包含质膜跨膜蛋白的细胞内的部分,且已经鉴别了许多这样的多肽的离散的功能,包括生物信号转导(例如,激活或抑制蛋白激酶、蛋白磷酸酶、G-蛋白、环核苷酸和其他的第二个信使、离子通道、分泌途径)、生物活性介体释放、与一种或多种细胞骨架组分的稳定的或动态的结合、细胞分化、细胞激活、有丝分裂发生、白细胞郁积、细胞凋亡等(例如,Maher等,2002Immunol.Cell Biol.80:131;El Far等,2002 Biochem J 365:329;Teng等,2002 Genome Biol.2REVIEWS:3012;Simons等,2001 CellSignal 13:855;Furie等,2001 Thromb.Haemost.86:214;Gaffen,2001 Cytokine 14:63;Dittel,2000Arch.Immunol.Ther.Exp.(Warsz.)48:381;Parnes等,2000Immunol.Rev.176:75;Moretta等,2000 Semin.Immunol.12:129;Ben Ze′ev,1999 Ann.N.Y.Acad.Sci.886:37;Marsters等,RecentProg Horm.Res.54:225)。
图70说明了例如荧光素-缀合的FcRIII(CD16)可溶的融合蛋白与附着在细胞(在该实例中,为CHO细胞)表达的CD20上的2H7 scFv-结合结构域构建体的结合。结合到本发明的构建体(例如,scFv-结合结构域构建体)上的CD16,能提供可以用于检测和/或定量结合到改变的本发明的构建体(包括scFv-结合结构域构建体)上的CD16的变化的筛选工具的一个实例,所述变化含有靶向的或位点-特异性的突变、取代、缺失或其他的改变。CD16结合性质的变化,可以由例如CD16高亲和力蛋白(158V)或CD16低亲和力蛋白(158F)或二者的结合的变化来反映。
在图70的第2幅图中,绘出了这样的筛选方法的一个实例的示意图,其中scFv-结合结构域构建体展示在哺乳动物细胞的细胞表面上。在该实例中,scFv-结合结构域分子通过起跨膜结构域锚作用的分子,展示在细胞表面上。这些分子可以代表,例如,单个的scFv-结合结构域构建体,或可以作为这样的分子的文库导入哺乳动物细胞群体中。然后,可以例如通过改变选择条件的严格性,并使用CD16融合蛋白作为结合探针,从其他细胞淘选、分选或分离转染的具有改变的结合性质的细胞。可以分离例如能表达具有改变的与CD 16高亲和力等位基因(158V)或CD16低亲和力等位基因(158F)或二者的结合的scFv-Ig分子的细胞。
该展示系统可以用于,例如,建立具有突变的或另外改变的尾区的本发明的构建体的文库,所述的尾区具有较短的CH2序列段,后者被随机化的寡核苷酸或例如具有所有可能的自然的或非自然的氨基酸取代(包括合成的氨基酸)的单个残基的随机化替代。一旦构建了这样的文库,则通过本领域已知的方法,可以将其转染进适当的细胞中,例如,COS细胞。然后,可以使转染子结合例如标记的CD16构建体,并基于它们对多个等位型/同种型的相对的或需要的结合性质,进行淘选或分选。可以收获需要的细胞,并分离DNA,例如质粒DNA,然后转化进例如细菌。可以反复地重复该过程多次,直到从哺乳动物宿主细胞分离出需要的单克隆。参见,Seed B和Aruffo A,Pro.Nat’lAcad Sci USA 1987 84:3365-3369;Aruffo A和Seed B,Pro.Nat’lAcad Sci USA 1987 84:8573-8577。
该类筛选系统的一个这样的应用是,例如,用于鉴别和/或分离具有尾区的本发明的构建体,或尾区,其能同样好地结合CD 16的高和低亲和力等位基因,目的是提高由多个患者亚群中的scFv-结合结构域构建体介导的效应子功能。使用这样的展示系统,例如,所述的展示系统,也可以选择本发明的具有尾区的构建体,或具有改变的与其他Fc受体的结合性质的尾区。不能糖基化蛋白的其他展示系统,例如,使用噬菌体或酵母的那些,对于本发明的具有基于Ig的尾区的构建体或具有改变的FcR结合性质的基于Ig的尾区的选择,通常不是需要的。例如,大多数非哺乳动物的系统不能糖基化蛋白。
通过将适当的分子整合进构建体中,例如,通过跨膜结构域或GPI锚信号的整合,在哺乳动物细胞表面上表达的本发明的构建体(例如,scFv-结合结构域构建体)的表达,也可以用于其他的展示系统,后者可以用于,例如,选择要以更高的或其他的理想水平生产的本发明的构建体,例如,改变的scFv-结合结构域分子。在一个这样的实施方案中,用能指导它们在细胞表面上的表达的质粒中的scFv-结合结构域构建体文库,转染了可以用于生产糖基化的蛋白的细胞,例如,哺乳动物细胞例如COS细胞。通过本领域已知的技术(例如淘选、无菌的细胞分选、磁珠分离,等),可以选择能表达最高的或其他的理想水平的scFv-结合结构域分子的细胞,例如COS细胞,并分离DNA,例如质粒DNA,用于转化进其他的细胞,例如,细菌。一轮或多轮选择后,分离了能编码scFv-结合结构域分子的单克隆,其能进行高或其他的理想水平的表达。然后,可以改变分离的克隆,以去除膜锚着点,并在适当的细胞系统中表达,例如,哺乳动物细胞系统,其中将生产该scFv-结合结构域构建体,例如,通过以理想水平分泌进培养液中。不受任何具体机制或理论的约束,认为其原因是分泌的糖蛋白和细胞表面糖蛋白对用于表达的信号肽和经高尔基体的加工的一般要求。因而,选择能显示出细胞表面上的提高表达水平的分子,也能导致具有分泌蛋白水平提高的分子的鉴别。
这些使用本发明的构建体的展示系统也可以用于筛选和/或鉴别和/或分离构建体内的结合结构域的亲和力变体。
特别优选的是这样的展示和/或筛选系统,例如,其包含或使用构建体,后者包含(1)免疫球蛋白可变区多肽序列,包括天然的或工程化的VH和/或VL和/或单链可变区(sFv)序列,且其包括,例如,在与VH区域序列(包括scFv或其他的构建体内的VH区域序列)中的氨基酸位置9、10、11、12、108、110、111和112中的一个或多个相对应的一个或多个位置的氨基酸处的突变、改变或缺失,和/或(2)免疫球蛋白可变区多肽序列,包括天然的或工程化的VH和/或VL和/或单链可变区(sFv)序列,且其包括,例如,在与轻链可变区序列(包括scFv或其他的构建体中的VL区域序列)中的氨基酸位置12、80、81、82、83、105、106、107和108中的一个或多个相对应的一个或多个位置的突变、改变或缺失。特别优选的是这样的展示和/或筛选系统,其包含或使用构建体,后者包含工程化的VH序列(与或不与一个或多个其他的序列结合,包括免疫球蛋白-衍生的和包含在例如s Fv或含有scFv的构建体中的其他的序列),其包含在与氨基酸位置11相对应的一个或多个位置的氨基酸处的突变、改变或缺失。VH11氨基酸如果被取代,则被如本文所述的另一种氨基酸或需要的另一种分子取代。
在使用本发明的构建体(包括结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白)治疗如本文所述的恶性状况或B细胞障碍的其他方法的上下文中,包括,例如,通过许多基因治疗方法和有关的构建体送递技术中的一种或多种,本发明也预期某些实施方案,其中在细胞表面表达(或能表达)包含质膜锚定结构域多肽的构建体(例如,结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白),且其还可以包含细胞质尾区多肽,后者包含细胞凋亡信号传导多肽序列。许多细胞凋亡信号传导多肽序列是本领域已知的,综述参见,例如,When Cells Die:A Comprehensive Evaluationof Apoptosis and Programmed Cell Death(R.A.Lockshin等,编,1998 John Wiley & Sons,New York;也参见,例如,Green等,1998Science 281:1309,及其中引用的文献;Ferreira等,2002Clin.Canc.Res.8:2024;Gurumurthy等,2001 CancerMetastas.Rev.20:225;Kanduc等,2002 Int.J.Oncol.21:165)。一般地,细胞凋亡信号传导多肽序列包含受体死亡结构域多肽的全部或一部分,或从其衍生或构建,例如,FADD(例如,Genbank登记号U24231,U43184,AF009616,AF009617,NM_012115),TRADD(例如,Genbank登记号NM_003789),RAIDD(例如,Genbank登记号U87229),CD95(FAS/Apo-1;例如,Genbank登记号X89101,NM_003824,AF344850,AF344856),TNF-α-受体-1(TNFR1,例如,Genbank登记号S63368,AF040257),DR5(例如,Genbank登记号AF020501,AF016268,AF012535),ITIM结构域(例如,Genbank登记号AF081675,BC015731,NM_006840,NM_006844,NM_006847,XM_017977;参见,例如,Billadeau等,2002 J Clin..Invest.109:161),ITAM结构域(例如,Genbank登记号NM_005843,NM_003473,BC030586;参见,例如,Billadeau等,2002),或本领域已知的其他的细胞凋亡-有关的受体死亡结构域多肽,例如,TNFR2(例如,Genbank登记号L49431,L49432),天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶/天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶原(procaspase)-3(例如,Genbank登记号XM_54686),天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶/天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶原-8(例如,AF380342,NM_004208,NM_001228,NM_033355,NM_033356,NM_033357,NM_033358),天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶/天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶原-2(例如,Genbank登记号AF314174,AF314175),等。
可以检查怀疑经历了细胞凋亡的生物样品中的细胞的形态、渗透性或能指示细胞凋亡状态的其他变化。例如作为实例且非限制性的,在许多细胞种类中的细胞凋亡可以造成改变的形态外观,例如质膜起泡、细胞形状变化、基底粘附性质的丧失或本领域的普通技术人员可以容易地检测出的其他形态变化,例如通过使用光学显微镜检查。作为另一个实例,经历细胞凋亡的细胞可以表现出染色体的断裂和分解,这可以通过显微镜检查和/或通过使用本领域已知的DNA-特异性的或染色质-特异性的染料(包括荧光染料)观察到。这样的细胞也可以表现出改变的质膜渗透性性质,如通过使用活体染料(例如,碘化丙锭、锥虫蓝)或通过检测乳酸脱氢酶向细胞外环境中的泄漏可以容易地检测到的。熟悉本领域的技术人员能够明白这些和其他的通过形态标准、改变的质膜渗透和有关的变化检测细胞凋亡的细胞的方法。
在本发明的另一个实施方案中,其中在细胞表面上表达的构建体(例如结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白)包含质膜锚定结构域,其具有跨膜结构域和细胞质尾,后者包含细胞凋亡信号传导多肽,可以测定生物样品中的细胞的细胞膜磷脂酰基丝氨酸(PS)从质膜的内叶向外叶的转运,这可以通过例如测量PS-特异性的蛋白膜联蛋白的外叶结合来检测。Martin等,J.Exp.Med.182:1545,1995;Fadok等,J.Immunol 148:2207,1992。在本发明的其他的有关的实施方案中,其包括这样的实施方案,其中在细胞表面上表达构建体(例如结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白),且其包含具有细胞凋亡信号传导多肽的质膜锚定结构域,也包括这样的实施方案,其中构建体(例如结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白)是缺少膜锚定结构域的可溶蛋白,且其能诱导细胞凋亡,可通过测定称作天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶的细胞凋亡-激活的蛋白酶家族的任何成员的特异性的蛋白酶活性的诱导来确定对apoptogen的细胞反应(参见,例如,Green等,1998Science 281:1309)。本领域的普通技术人员能容易地熟悉测定天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶活性的方法,例如通过测定天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-介导的特异性地识别的蛋白底物的切割。这些底物可以包括,例如,多-(核苷二磷酸-核糖)聚合酶(PARP)或被本领域已知的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶切割的其他的自然产生的或合成的肽和蛋白(参见,例如,Ellerby等,1997 J.Neurosci.17:6165)。合成的肽Z-Tyr-Val-Ala-Asp-AFC(SEQ ID NO:528;),其中“Z”代表着苯甲酰羰基部分,且AFC代表着7-氨基-4-三氟甲基香豆素(Kluck等,1997 Science 275:1132;Nicholson等,1995Nature 376:37),是一种这样的底物。底物的其他的非限制性的实例包括核蛋白,例如U1-70kDa和DNA-PKcs(Rosen和Casciola-Rosen,1997 J.Cell.Biochem.64:50;Cohen,1997 Biochem.J.326:1)。通过测定已经从细胞凋亡的细胞的线粒体中逃出的细胞色素c,也可以检测细胞凋亡(例如,Liu等,Cell 86:147,1996)。可以分光光度法地、免疫化学地或通过其他的确定的检测特定蛋白的存在的方法,进行这样的细胞色素c的检测。本领域的普通技术人员能够容易地明白,可能存在其他的合适的定量细胞凋亡的技术。
在基因治疗应用中有用的构建体(包括包含质膜锚定结构域和/或细胞质尾区多肽(包括,例如,细胞凋亡信号传导序列)的那些构建体)的特别优选的实施方案是这样的构建体,其包括(1)免疫球蛋白可变区多肽序列,包括天然的或工程化的VH和/或VL和/或单链可变区(sFv)序列,且其包括,例如,在与VH区域序列(包括scFv或其他的构建体内的VH区域序列)中的氨基酸位置9、10、11、12、108、110、111和112中的一个或多个相对应的一个或多个位置的氨基酸处的突变、改变或缺失,和/或(2)免疫球蛋白可变区多肽序列,包括天然的或工程化的VH和/或VL和/或单链可变区(sFv)序列,且其包括,例如,在与轻链可变区序列(包括scFv或其他的构建体中的VL区域序列)中的氨基酸位置12、80、81、82、83、105、106、107和108中的一个或多个相对应的一个或多个位置的突变、改变或缺失。特别优选的是这样的构建体,其包括工程化的VH序列(与或不与一个或多个其他的序列结合,包括免疫球蛋白-衍生的和包含在例如sFv或含有scFv的构建体中的其他的序列),其包含在与氨基酸位置11相对应的一个或多个位置的氨基酸处的突变、改变或缺失。VH11氨基酸如果被取代,则被如本文所述的另一种氨基酸或需要的另一种分子取代。
一旦已经设计了本文提供的构建体(例如结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白),就可以通过记载在例如Sinha等.,Nucleic Acids Res.,12,4539-4557(1984)中的寡核苷酸合成方法,全部地或部分地合成能编码该构建体的多核苷酸(包括DNA),其中所述构建体或其相关部分是多肽;通过记载在例如Innis,Ed.,PCR Protocols,AcademicPress(1990)和Better等.J.Biol.Chem.267,16712-16118(1992)中的PCR方法组装;通过记载在例如Ausubel等.,Eds.,CurrentProtocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,New York(1989)以及Robinson等.,Hum.Antibod Hybridomas,2,84-93(1991)中的标准程序进行克隆和表达;并且通过记载在例如Harlow等.,编,Antibodies:A Laboratory Manual,Chapter 14,ColdSpring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor(1988)和Munson等.,Anal Biochem.,107,220-239(1980)中的方法检测需要的活性,例如,与靶的结合,或特异性的抗原结合活性。
Fv区的单多肽链结合分子(单链Fv分子)的制备是本领域已知的。参见例如美国专利号4,946,778。在本发明中,通过编码重链或轻链的第一个可变区,然后分别编码相应轻链或重链的可变区的一个或多个接头,合成可以包含在本发明的构建体中的单链Fv-样分子。两个可变区之间的各种适当的接头的选择,记载在美国专利号4,946,778中(也参见,例如,Huston等,.1993Int.Rev.Immunol.10:195)。本文描述的示例性的接头是(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3(SEQ ID NO:529),但是可以是任何需要的长度。接头用于将天然聚集的但化学上分开的重链和轻链转化为单个多肽链的氨基末端抗原结合部分,例如,其中该抗原结合部分将折叠成类似于由两条多肽链形成的原始结构的结构,或者具有结合靶(例如靶抗原)的能力。对于这样的构建体,其包含作为结合区的scFv、作为连接区的天然的或工程化的免疫球蛋白铰链、和作为结合区的一个或多个天然的或工程化的重链恒定区,根据需要,将由能编码接头的序列连接的能编码天然的或工程化的重链和轻链的可变区的核苷酸序列,连接到能编码天然的或工程化的抗体恒定区的核苷酸序列上。恒定区可以是能允许得到的多肽形成链间二硫键、从而形成二聚体的那些,且其具有需要的效应子功能,例如介导ADCC、CDC或固定补体的能力,尽管不利于二聚体或其他的多聚体形成或聚集的天然的或工程化的恒定区是优选的。对于意欲用于人类的本发明的构建体,例如免疫球蛋白-样分子,包含的具有恒定区和/或需要的恒定区功能的序列一般是人的或基本上是人的或人源化的,以使潜在的抗-人免疫反应最小化,并且提供适当的或需要的效应子功能。对能编码抗体恒定区的序列的操作,记载在Morrison和Oi的PCT公开WO89/07142中。在优选的实施方案中,全部地或部分地从尾区缺失了CH1结构域,该尾区包含下述组分、基本上由其组成或由其组成:天然的或工程化的免疫球蛋白恒定区(例如,天然的或工程化的CH2和/或CH3恒定区,或天然的或工程化的CH2和/或CH3和/或CH4恒定区),且通过连接区(例如,本文提供的天然的或工程化的铰链区多肽),将结合区(例如,结合结构域多肽例如免疫球蛋白可变区多肽)的羧基末端连接到例如,CH2的氨基末端。
如上文所述,本发明提供了能够指导本文提供的本发明的构建体(包括结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白)的表达的重组表达构建体。存在于本文提到的各种氨基酸序列中的氨基酸,是根据它们的公知三字母或单字母缩写而鉴别的。存在于本文提到的各种DNA序列或其片段中的核苷酸,是根据本领域中常用的标准单字母命名法进行命名的。特定的氨基酸序列也可以包括类似的、但是改变的氨基酸序列,例如仅仅具有微小变化的那些,例如作为实例且非限制性的,共价化学修饰、插入、缺失和取代,其还可以包括保守取代或非-自然产生的氨基酸的取代。彼此相似的氨基酸序列可以具有很大的序列同源区。以相似的方式,核苷酸序列可以包括仅具有微小改变的基本相似的核苷酸序列,例如作为实例且非限制性的,共价化学修饰、插入、缺失和取代,其还可以包括由于遗传密码的简并性而导致的沉默突变。彼此相似的核苷酸序列可以具有很大的序列同源区。
受试者中存在恶性状况是指在受试者中存在发育异常的、癌性的和/或转化的细胞,包括,例如赘生性的、肿瘤、非接触抑制的或致癌地转化的细胞等(例如,黑素瘤,癌例如腺癌、鳞状细胞癌、小细胞癌、燕麦形细胞癌、等,肉瘤例如软骨肉瘤、骨肉瘤,等),它们是本领域已知的,且建立了它们的诊断和分类标准。在本发明预期的优选的实施方案中,例如这些癌细胞是恶性造血细胞,例如淋巴谱系的转化细胞,且尤其是B细胞淋巴瘤等;在某些优选的实施方案中,癌细胞也可以是上皮细胞,例如癌细胞。本发明也预期B细胞障碍,其可以包括能影响B细胞的某些恶性状况(如B细胞淋巴瘤),但不限于此,且其也可以包括自身免疫病,尤其是特征在于例如自身抗体产生的疾病、障碍和状况。
自身抗体是能与自身抗原发生反应的抗体。在几种自身免疫病(即其中宿主免疫系统产生不适当的抗“自身”免疫反应的疾病、障碍或状况)中检测到了自身抗体,它们参与疾病活动。目前各种自身免疫病的治疗包括需要连续施用、缺乏特异性并会导致严重副作用的免疫抑制药物。能够消除自身抗体产生并具有最小毒性的新方法,将解决影响许多人的各种疾病的未满足的医学需要。本发明的构建体(包括结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白)是为例如改进的向淋巴组织中的穿透而设计的。B淋巴细胞的减少会中断自身抗体生产循环,并且允许免疫系统重新设置,因为从骨髓中的前体会产生新的B淋巴细胞。
根据非限制性的理论,已经鉴别出了许多认为会从B细胞减少治疗取得有益效果的疾病、障碍和状况。这样的疾病、障碍和状况包括,但不限于,Grave氏病、Hashimoto氏病、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、Sjogrens综合征免疫性血小板减少性紫癜、多发性硬化、重症肌无力、硬皮病、牛皮癣、炎性肠病(包括Crohn氏病和溃疡性结肠炎)。炎性肠病,包括Grohn氏病和溃疡性结肠炎,是消化系统的自身免疫病。
本发明还涉及能编码本发明的构建体(例如,结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白)的核苷酸构建体,且尤其是为基因治疗用途施用能编码这样的蛋白的重组构建体的方法,该构建体可以例如作为这样的多肽的片段、类似物和衍生物来表达。
当提到本发明的构建体(包括,例如,结合结构域-免疫球蛋白融合多肽或融合蛋白)时,术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指能保持与这样的多肽基本相同的生物功能或活性的任何构建体,例如结合结构域-免疫球蛋白融合多肽或融合蛋白。因此,类似物包括原-或前原-形式的构建体,例如,可以通过蛋白原部分的切割来激活蛋白原,以产生活性构建体(例如结合结构域-免疫球蛋白融合多肽)。
本发明的构建体的片段、衍生物或类似物,例如,结合结构域-免疫球蛋白融合多肽或融合蛋白,包括由本文提到的cDNA编码的结合结构域-免疫球蛋白融合多肽或融合蛋白,可以是(i)其中的一个或多个氨基酸残基被保守的或非保守的氨基酸残基(优选保守的氨基酸残基)所取代的一种,并且这样的被取代的氨基酸残基可以由或不由遗传密码编码,或(ii)其中的一个或多个氨基酸残基包含取代基的一种,或(iii)其中其他的氨基酸融合或另外连接到构建体,例如,结合结构域-免疫球蛋白融合多肽的一种,其包括用于构建体(包括象结合结构域-免疫球蛋白融合多肽或蛋白原序列这样的构建体)的检测或特异性的功能改变的氨基酸。根据本文的教导,这样的片段、衍生物和类似物视作在本领域的技术人员的范围内。
本发明的构建体(包括多肽构建体)包括,例如,结合结构域-免疫球蛋白融合多肽和融合蛋白,其具有与本领域已知的序列或其片段或部分相同或相似的结合区,例如结合结构域多肽氨基酸序列。例如用于说明而不是限定性的,人CD154分子胞外结构域可预期根据本发明来使用,这样的多肽的部分,和/或与报道的多肽具有至少约70%相似性(优选大于70%同一性)、更优选约90%相似性(更优选大于90%同一性)的多肽,且更优选地与报道的多肽和这样的多肽的部分具有约95%相似性(更优选大于95%同一性)的多肽也是如此,其中这样的结合结构域-免疫球蛋白融合多肽的部分例如一般含有至少约30个氨基酸,更优选至少约50个氨基酸。胞外结构域包括,例如,细胞表面分子的部分,且在特别优选的实施方案中,包括细胞表面分子,其是完整的膜蛋白或包含跨质膜的跨膜结构域,当该分子在细胞表面表达时,构建该胞外结构域以延伸到质膜磷脂双分子层的外叶,优选地以将该分子的胞外结构域部分暴露于细胞的外部环境(也称作细胞外的环境)中的方式。用于测定细胞表面分子的部分是否包含胞外结构域的方法,是本领域众所周知的,且包括,例如,实验测定(例如,直接或间接地标记分子,评价质膜不能透过的试剂(例如蛋白水解酶或脂解酶)是否能在结构上改变该分子)或基于分子结构的拓扑预测(例如,分析多肽的氨基酸序列)或其他的方法。
如本文所使用的,“氨基酸”是具有下述结构的分子,其中中心碳原子(α-碳原子)连接到氢原子、羧酸基团(它的碳原子在本文中称作“羧基碳原子”)、氨基基团(它的氮原子在本文中称作“氨基氮原子”)和侧链基团R上。当整合进肽、多肽或蛋白中时,在将氨基酸彼此连接的脱水反应中,氨基酸会丧失它的氨基和羧基上的一个或多个原子。结果,当整合进蛋白中时,氨基酸也可以称作“氨基酸残基”。在自然产生的蛋白的情况下,氨基酸残基的R基团不同于一般合成蛋白的20种氨基酸,尽管蛋白中的一个或多个氨基酸残基可能在整合进生物系统的蛋白中以后被衍生或修饰(例如,通过糖基化作用和/或通过氧化2个不相邻的半胱氨酸氨基酸残基的硫醇侧链,形成胱氨酸,产生二硫键共价键,后者经常在稳定蛋白的折叠构象等中起重要作用)。如本领域的技术人员能明白的,非-自然产生的氨基酸也可以整合进蛋白中,尤其是通过合成方法生产的那些,包括固态和其他的自动化的合成方法。这样的氨基酸的实例包括,但不限于,α-氨基异丁酸、4-氨基丁酸、L-氨基丁酸、6-氨基己酸、2-氨基异丁酸、3-氨基丙酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、羟脯氨酸、肌氨酸、citralline、半胱磺酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、苯甘氨酸、环己基丙氨酸、β-丙氨酸、氟代-氨基酸、设计者氨基酸(例如,β-甲基氨基酸、α-甲基氨基酸、Nα-甲基氨基酸)和一般的氨基酸类似物。另外,既然α-碳原子具有4个不同的基团(象生物系统用来合成蛋白的20种氨基酸的情况,除了甘氨酸以外,其具有2个结合到α-碳原子上的氢原子),每种氨基酸存在2种不同的对映体形式,称作D和L。在哺乳动物中,仅仅L-氨基酸能整合进自然产生的多肽中。本发明包括能整合一种或多种D-和L-氨基酸的蛋白,以及仅由D-或L-氨基酸残基组成的蛋白。
在本文中,可以为下面的氨基酸(和其残基)使用下面的缩写:丙氨酸(Ala,A);精氨酸(Arg,R);天冬酰胺(Asn,N);天冬氨酸(Asp,D);半胱氨酸(Cys,C);甘氨酸(Gly,G);谷氨酸(Glu,E);谷氨酰胺(Gln,Q);组氨酸(His,H);异亮氨酸(Ile,I);亮氨酸(Leu,L);赖氨酸(Lys,K);甲硫氨酸(Met,M);苯丙氨酸(Phe,F);脯氨酸(Pro,P);丝氨酸(Ser,S);苏氨酸(Thr,T);色氨酸(Trp,W);酪氨酸(Tyr,Y);和缬氨酸(Val,V)。非-极性的(疏水的)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。中性的氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。带正电荷的(碱性的)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。带负电荷的(酸性的)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。
“蛋白”是指通过肽键连接的2个或更多个单独的氨基酸(是或不是自然产生的)的任何聚合物,且其在结合到1个氨基酸(或氨基酸残基)的α-碳上的羧酸基团的羧基碳原子与结合到临近氨基酸的α-碳上的氨基基团的氨基氮原子共价结合时产生。术语“蛋白”应当理解为包括在它的含义内的术语“多肽”和“肽”(有时,它们可以在本文中互换地使用)。另外,包含多个多肽亚基或其他的组分的蛋白,也应当理解为包含在本文使用的“蛋白”的含义内。类似地,蛋白的片段、肽和多肽也在本发明的范围内,且在本文中可以称作“蛋白”。
在生物系统(它们是体内的或体外的、包括无细胞的系统)中,特定蛋白的特定氨基酸序列(即,多肽的“一级结构”,当从氨基-末端向羧基-末端书写时)由mRNA的编码部分的核苷酸序列决定,后者又由遗传信息、一般是基因组DNA(为了本发明的目的,其应当理解为包括细胞器DNA,例如,线粒体DNA和叶绿体DNA)决定。当然,能构成特定生物的基因组的任意类型的核酸(例如,在大多数动物和植物的情况下,是双链DNA;在一些病毒等的情况下,是单链或双链的RNA)应当理解为能编码该特定生物的基因产物。信使RNA被在核糖体上翻译,其能催化游离氨基酸的聚合,其具体的同一性由随后翻译成新生多肽的mRNA的特定密码子(关于mRNA,在mRNA的编码区中的3个临近的A、G、C或U核糖核苷酸)决定。重组DNA技术已经允许大规模合成具有与在活生物中自然生产时相同的一级序列的蛋白和多肽(例如,人胰岛素、人生长激素、促红细胞生成素、粒细胞集落刺激因子,等)。另外,这样的技术已经允许合成这些和其他蛋白的类似物,该类似物与天然的蛋白相比可以含有一个或多个氨基酸缺失、插入和/或取代。重组DNA技术也能合成全新的蛋白。
在非生物系统(例如,采用固态合成的那些)中,用户可以决定蛋白的一级结构(其也包括二硫键(胱氨酸)位置)。结果,可以得到具有能复制生物地生产的蛋白的一级结构的多肽,这样的蛋白的类似物也一样。另外,也可以合成全新的多肽,象整合了非-自然产生的氨基酸的蛋白一样。
如本领域已知的,通过比较一个多肽的氨基酸序列(包括其中的保守的氨基酸取代)与第二个多肽的序列,可以确定两个多肽间的“相似性”。能编码本发明的多肽的核酸的片段或部分,可以用于合成本发明的全长核酸。如本文所使用的,“%同一性”表示当使用例如有缺口的BLAST算法(例如Altschul等,1997 Nucl.Ac.Res..25:3389;Altschul等,1990 J.Mol.Biol.,215:403-410),对两个或更多个多肽进行比对并分析其序列时,位于相应的氨基酸残基位置处的相同氨基酸的百分比,该算法根据National Institutes of Health/NCBI数据库(Bethesda,MD;参见,www.ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST/nph-newblast)提供的缺省加权,对序列缺口和序列错配进行加权。其他的比对方法包括BLITZ(MP srch)(Sturrock & Collins,1993)和FASTA(Pearson和Lipman,1988 Proc.Natl.Acad.Sci.USA.85:2444-2448)。
术语“分离的”指,在自然产生的材料的情况下,该材料是或已经从它的自然的或来源的环境中取出,或不再与其结合。例如,存在于活动物中的自然产生的核酸或蛋白或多肽不是分离的,但与天然系统中的一些或全部共存材料分开的相同的核酸或多肽则是分离的。这样的核酸可以是载体的一部分,和/或这样的核酸或多肽可以是组合物的一部分,并且仍然是分离的,因为这样的载体或组合物不是它的自然环境的一部分。术语“分离的”,在非-自然产生的材料(例如重组地生产的本发明的构建体)的情况下,包括这样的材料,其实际上或基本上没有通常在生产过程中伴随它的组分,例如,已经纯化至需要的程度的蛋白和肽,优选地,例如,使它们是至少约80%纯的,更优选地至少约90%的,和更优选地至少约95%的,如通过本领域已知的技术测得的。
术语“基因”指参与产生多肽链的DNA的片段;它也可以包括在多肽编码区之前和之后的区域,例如“前导区和非转录尾区”以及有关的单独编码片段(外显子)之间的间插序列(内含子)。
如本文所述的,本发明提供了构建体,包括结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白,其可以全部地或部分地由具有结合区编码序列的核酸编码,例如,在框内融合或另外连接到其他的自然的或工程化的免疫球蛋白结构域编码序列上的结合结构域编码序列,以表达例如融合或另外连接到其他功能性多肽序列上的结合结构域多肽序列,所述的其他功能性多肽序列允许,例如作为实例且非限制性的,检测、功能性改变、分离和/或纯化融合蛋白。这样的融合蛋白可以通过含有其他的能影响融合产物的行为的免疫球蛋白-衍生的多肽序列,例如(和如上所述的)通过减少参与二硫键形成的巯基基团的可用性,和通过赋予加强ADCC和/或CDC和/或固定补体的能力,来允许结合结构域的功能性改变。
通过本领域的技术人员公知的任何方法,可以实现多肽的修饰。本文的优选的方法依赖于能编码例如融合蛋白的DNA的修饰和修饰的DNA的表达。使用标准方法,包括下文所述的那些,可以改变或诱变能编码本发明的构建体之一(例如,本文讨论的结合结构域-免疫球蛋白融合体之一)的DNA。例如,可以从多肽中去除或替代能另外促进多聚体形成或促进特定分子构象的半胱氨酸残基,例如负责或参与聚集体形成的半胱氨酸残基。如果必要,例如,可以通过缺失和/或替代半胱氨酸残基,并确定得到的蛋白是否在含有生理上可接受的缓冲液和盐的溶液中聚集,来经验地确定有利于聚集体形成的半胱氨酸残基的同一性。此外,可以构建和使用例如结合结构域-免疫球蛋白融合体的片段。如上所述,已经描述了许多候选结合结构域-免疫球蛋白融合体的反受体/配体结合结构域,从而本领域的技术人员可以容易地选择用于包含在本发明的表达构建体的编码产物中的适当多肽结构域。
氨基酸的保守取代是众所周知的,且通常可以在不改变得到的结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白分子的生物活性的条件下产生。例如,这样的取代一般是通过极性残基、带电残基、疏水残基、小残基等之间的相互交换产生的。如果必要,可以仅仅通过检测得到的修饰的蛋白在体外生物测定中结合适当的细胞表面受体、或结合适当的抗原或需要的靶分子的能力,经验地测定这样的取代。
本发明还涉及能与本发明的构建体(包括例如,本文提供的能编码结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白的多核苷酸序列或它们的互补序列)杂交的核酸,这对本领域的技术人员是容易理解的,如果在序列之间存在至少约70%,优选地至少约80-85%,更优选地至少约90%,和更优选地至少约95%、96%、97%、98%或99%同一性的话。
本发明特别地涉及能在严格条件下与例如本文提到的结合结构域-免疫球蛋白融合体的编码核酸杂交的核酸。如本文所使用的,在指定的严格性条件下“杂交”,用于描述2个单链的核酸分子之间形成的杂交体的稳定性。杂交的严格性一般表达为这样的杂交退火和洗涤时的离子强度和温度的条件。术语“严格条件”指允许多核苷酸之间杂交的条件。通过盐浓度、有机溶剂(例如,甲酰胺)的浓度、温度和本领域众所周知的其他条件,可以定义严格条件。更具体地,通过降低盐的浓度、增加有机溶剂(例如,甲酰胺)的浓度、或升高杂交温度,可以增加严格性。例如,严格的盐浓度通常小于约750mM NaCl和75mM柠檬酸三钠,优选地小于约500mM NaCl和50mM柠檬酸三钠,且最优选地小于约250mM NaCl和25mM柠檬酸三钠。低严格性杂交可以在没有有机溶剂(例如,甲酰胺)的情况下得到,而高严格性杂交可以在有有机溶剂(例如,至少约35%甲酰胺,最优选地至少约50%甲酰胺)的情况下得到。严格的温度条件通常包括至少约30℃、更优选地至少约37℃、且最优选地至少约42℃的温度。改变其他的参数,例如,杂交时间,去污剂例如十二烷基硫酸钠(SDS)的浓度和包含或排除载体DNA,是本领域的普通技术人员众所周知的。通过根据需要组合各种这些条件,可以实现不同水平的严格性,且在本领域的技术范围内。其他一般的“高”、“中”和“低”严格性包括下面的条件或与其等同的条件:高严格性:0.1x SSPE或SSC,0.1%SDS,65℃;中严格性:0.2x SSPE或SSC,0.1%SDS,50℃;低严格性:1.0x SSPE或SSC,0.1%SDS,50℃。如本领域的普通技术人员已知的,通过改变用于预杂交、杂交和洗涤步骤的溶液的时间、温度和/或浓度,可以实现杂交条件严格性的变化,且合适的条件也可以部分地依赖于使用的探针和印迹的、先证者(proband)核酸样品的具体核苷酸序列。因此,应当明白,无需过度的实验,就可以容易地选择合适的严格条件,这时基于探针与一种或多种某些先证者序列杂交、而不与某些其他的先证者序列杂交的能力,可以鉴别出所述探针的需要的选择性。
如本文所使用的,优选的“严格条件”一般指仅仅在序列之间存在至少约90-95%且更优选地至少约97%同一性的条件下发生的杂交。在优选的实施方案中,能与例如本文所述的结合结构域-免疫球蛋白融合体的编码核酸杂交的核酸构建体能编码这样的多肽,其基本上保留了与例如由cDNA编码的结合结构域-免疫球蛋白融合多肽相同的生物功能或活性。
本发明的核酸,本文也称作多核苷酸,可以是RNA(例如,mRNA)的形式,或DNA的形式,该DNA包括cDNA(也称作“互补DNA”,它是与特定的信使RNA互补的DNA分子)、基因组DNA和合成DNA。DNA可以是双链或单链的,且如果是单链的,则可以是编码链或非编码(反义)链。用于本发明的能编码本发明的构建体(例如,结合结构域-免疫球蛋白融合多肽)的编码序列,可以含有与本领域已知的或本文所述的编码序列的部分相同的部分,或者可以是不同的编码序列,其由于遗传密码的冗余或简并,而能编码相同的构建体或其部分,包括结合结构域-免疫球蛋白融合多肽的全部或部分。
能编码用于本发明的本发明的构建体(例如,结合结构域-免疫球蛋白融合多肽)的核酸可以包括,但不限于:只有构建体(例如,结合结构域-免疫球蛋白融合多肽)的编码序列;构建体(例如,结合结构域-免疫球蛋白融合多肽)的编码序列和其他的编码序列;构建体(例如,结合结构域-免疫球蛋白融合多肽)的编码序列(和任选的其他的编码序列)和非编码序列,例如内含子或结合结构域-免疫球蛋白融合多肽或其部分的编码序列5’和/或3’的非编码序列,其例如还可以包括,但不限于,一种或多种调节性核酸序列,其可以是被调节的或可调节的启动子、增强子、其他的转录调节序列、阻遏物结合序列、翻译调节序列或任何其他的调节核酸序列。因此,术语能编码构建体(例如,结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白)的“核酸”或“多核苷酸”包括,仅含有例如结合结构域-免疫球蛋白融合多肽的编码序列的核酸,以及含有其他的编码和/或非编码序列的核酸。
通过本领域的技术人员已知的任何方法(见,例如WO 93/01286,美国申请系列号07/723,454;美国专利号5,218,088;美国专利号5,175,269;美国专利号5,109,124),可以合成用于如本文所述的用途的核酸和寡核苷酸。各种寡核苷酸和核酸序列的鉴定,也包括本领域已知的方法。例如,用于克隆的寡核苷酸的需要的性质、长度和其他特征是公知的。在某些实施方案中,通过含有硫代硫酸酯、甲基膦酸酯、砜、硫酸酯、羰游基、二硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、磷酸酯等键和其他的已经证实可以在反义应用中使用的这样的键,可以将合成的寡核苷酸和核酸序列设计成能抗内源性宿主细胞核溶解酶的降解。参见,例如,Agrwal等,Tetrehedron Lett.28:3539-3542(1987);Miller等,J.Am.Chem.Soc.93:6657-6665(1971);Stec等,Tetrehedron Lett.26:2191-2194(1985);Moody等,Nucl.AcidsRes.12:4769-4782(1989);Uznanski等,Nucl.Acids Res.(1989);Letsinger等,Tetrahedron 40:137-143(1984);Eckstein,Annu.Rev.Biochem.54:367-402(1985);Eckstein,TrendsBiol.Sci.14:97-100(1989);Stein In:Oligodeoxynucleotides.Antisense Inhibitors of Gene Expression,Cohen,Ed,MacmillanPress,London,P97-117(1989);Jager等.,Biochemistry 27:7237-7246(1988)。
在一个实施方案中,本发明提供了用于本发明的构建体(例如,结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白)中的截短的组分(如结合结构域多肽、铰链区多肽、接头等)。在另一个实施方案中,本发明提供了能编码具有这样的截短的组分的本发明的构建体(例如,结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白)的核酸。截短的分子可以是任何包含小于目标分子的全长形式的分子。本发明提供的截短的分子可以包括截短的生物聚合物,且在本发明的优选的实施方案中,这样的截短的分子可以是截短的核酸分子或截短的多肽。截短的核酸分子小于已知或已描述过的核酸分子的全长核苷酸序列,其中这样的已知或已描述过的核酸分子可以是自然产生的、合成的或重组的核酸分子,只要本领域的技术人员能认为它是全长分子。因而,例如,相当于基因序列的截短的核酸分子含有小于全长的基因,其中该基因包含编码和非编码序列、启动子、增强子和其他调节序列、侧翼序列等,以及认为是基因的一部分的其他功能性和非功能性序列。在另一实例中,相当于mRNA序列的截短的核酸分子含有小于全长的mRNA转录物,后者可以包含各种翻译区和非翻译区以及其他的功能性和非功能性序列。
在其他的优选的实施方案中,截短的分子是包含小于特定蛋白或多肽组分的全长氨基酸序列的多肽。如本文所使用的,“缺失”具有本领域的技术人员所理解的普通含义,并可以指在末端或非末端区相对于相应的全长分子缺少序列的一个或多个部分的分子,例如,在本文提供的截短的分子的情况下。作为线性生物聚合物(例如核酸分子或多肽)的截短分子,可以在分子的任意末端具有一个或多个缺失,或者在分子的非末端区具有一个或多个缺失,其中所述缺失可以是约1-1500个连续核苷酸或氨基酸残基的缺失,优选约1-500个连续核苷酸或氨基酸残基的缺失,更优选约1-300个连续核苷酸或氨基酸残基的缺失,包括约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31-40、41-50、51-74、75-100、101-150、151-200、201-250或251-299个连续核苷酸或氨基酸残基的缺失。在某些特别优选的实施方案中,截短的核酸分子可以具有约270-330个连续核苷酸的缺失。在某些更优选的实施方案中,截短的多肽分子可以具有例如约80-140个连续氨基酸的缺失。
本发明还涉及本文提到的能编码本发明的构建体(例如,结合结构域-免疫球蛋白融合多肽)的片段、类似物和/或衍生物的核酸的变体。能编码本发明的构建体(例如,结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白)的核酸的变体,可以是其中包含的核酸序列的一个或多个部分的自然产生的等位变体,或这样的序列或部分的非-自然产生的变体,或这样的序列,其包括使用例如本领域已知的改变序列的方法,通过分子工程改变的序列。如本领域已知的,等位变体是可能具有一个或多个核苷酸的取代、缺失或添加中的至少一种的核酸序列的替代形式,其中任意一种都不会相当大地或不合需要地改变编码的结合结构域-免疫球蛋白融合多肽的功能。
通过能编码例如结合结构域-免疫球蛋白融合多肽或其任意部分的核苷酸序列的突变,可以获得本发明的构建体(例如,结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白)的变体和衍生物。通过多种常规方法的任一种,可以完成自然氨基酸序列的改变。通过例如合成含有突变序列的寡核苷酸,可以将突变导入特定位置,所述的突变序列由能够连接自然序列的片段的限制位点侧接。连接后,得到的重构序列能编码具有需要的氨基酸插入、取代或缺失的类似物。
或者,例如,可以使用寡核苷酸指导的位点-特异性的诱变方法,提供改变的基因,其中预定的密码子可以通过取代、缺失或插入来改变。进行这样的改变的示例性的方法公开在Walder等,1986 Gene42:133;Bauer等,1985 Gene 37:73;Craik,January 1985BioTechniques 12-19;Smith等,January 1985 GeneticEngineering:Principles and Methods BioTechniques 12-19;CostaGL,等,″Site-directed mutagenesis using a rapid PCR-basedmethod,″1996 Methods Mol Biol.57:239-48;RashtchianA.,″Novel methods for cloning and engineering genes using thepolymerase Chain reaction,″1995 Curr Opin Biotechnol.6(1):30-6;Sharon J,等,″Oligonucleotide-directed mutagenesisof antibody combining sites,″1993 Int Rev Immunol.10(2-3):113-27;Kunkel,1985 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:488;Kunkel等,1987 Methods in Enzymol.154:367;和,美国专利号4,518,584和4,737,462。
作为一个实例,可以通过对能编码蛋白的DNA进行定点诱变并联合使用DNA扩增方法,来进行DNA的修饰,在扩增方法中使用引物在DNA模板中导入并扩增改变,例如通过重叠延伸进行PCR剪接(SOE)。定点诱变一般是采用具有单链和双链形式的噬菌体载体来实现的,所述载体例如公知的并可以商业购得的M13噬菌体载体。可以使用其他适当的含有单链噬菌体复制起点的载体。参见,例如Veira等.,1987Meth.Enzymol.15:3。概言之,通过制备能编码目标蛋白(例如,特定结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白的全部或组成部分)的单链载体,来进行定点诱变。将在与单链载体中的DNA同源的区域内含有所需突变的寡核苷酸引物与载体退火,然后加入DNA聚合酶,例如大肠杆菌DNA聚合酶I(克列诺片段),其使用双链区作为引物,产生异源双链体,其中一条链能编码改变的序列,另一条是原始序列。将异源双链体导入适当的细菌细胞,并选择包含所需突变的克隆。可以在适当宿主细胞中重组表达得到的改变的DNA分子,以产生修饰的蛋白。
本发明也包括例如等同的DNA构建体,其能编码氨基酸残基或序列的添加或取代,或生物活性所不需要的或不希望的末端缺失或内部残基或序列的缺失。例如,如上文所讨论的,可以改变能编码生物活性所不需要的或非关键的Cys残基的序列,以造成例如Cys残基缺失或被其他氨基酸取代,从而防止在合成或复性后形成错误的或不需要的分子内二硫键。
“宿主细胞”或“重组的宿主细胞”是含有载体(例如,表达载体)的细胞,或已经通过重组技术操作来表达目标蛋白的细胞。宿主生物包括其中可以重组生产由本发明的重组构建体编码的本发明的构建体(例如,结合结构域-免疫球蛋白融合产物)的那些生物,例如细菌(如大肠杆菌)、酵母(例如啤酒糖酵母(Saccharomycescerevisae)和巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris))、昆虫细胞和哺乳动物细胞,包括体内和体外表达。因此,宿主生物可以包括用于本文提供的组合物生产中的构建、繁殖、表达或其他步骤的生物。宿主包括其中能发生免疫反应的受试者,如上文所述。现在优选的用于生产本发明的构建体的、能生产糖基化的蛋白的宿主生物是哺乳动物细胞或其他的细胞系统,其允许表达和回收糖基化的蛋白。其他的细胞系包括近交鼠系和鼠细胞系,以及人细胞和细胞系。
可以将能编码需要的本发明的构建体(例如,结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白)的DNA构建体导入载体(例如,质粒)中,以在适当的宿主中表达。在优选的实施方案中,宿主是哺乳动物宿主,例如,哺乳动物细胞系。能编码配体或核酸结合结构域的序列,优选进行了密码子最优化,以用于在特定宿主中表达。因此,例如,如果构建体,例如,是人结合结构域-免疫球蛋白融合体,且在细菌中表达,则可以为细菌使用最优化密码子。对于小的编码区,可以将基因合成为单个寡核苷酸。对于较大的蛋白,可以使用多个核苷酸的剪接、诱变或本领域已知的其他技术。为了转录,彼此可操作地连接质粒或其他载体中的作为调节区的核苷酸序列,例如启动子和操纵基因。能编码结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白的核苷酸序列也可以包括能编码分泌信号的DNA,由此得到的肽是前体蛋白。可以从周质间隙或发酵培养基中回收得到的加工后的蛋白。
在优选的实施方案中,DNA质粒也可以包含转录终止子序列。如本文所使用的,“转录终止子区”是发出转录终止信号的序列。可以从蛋白编码基因获得完整的转录终止子,该基因可以与插入的结合结构域-免疫球蛋白融合体的编码基因或启动子来源相同或不同。转录终止子任选是本文的表达系统的组分,但在优选的实施方案中使用。
本文使用的质粒或其他载体包含与能编码目标蛋白或多肽的DNA可操作地连接的启动子,并且设计用于在上文所述的合适的宿主(例如细菌、鼠或人)中表达蛋白,这取决于需要的质粒用途(例如,施用含有结合结构域-免疫球蛋白融合体的编码序列的疫苗)。可以从多种途径获得用于表达本文的蛋白和多肽的适当启动子,并且其是本领域众所周知的。优选连接于调节区的诱导型启动子或组成型启动子。这些启动子包括,例如,但不限于,T7噬菌体启动子和其他T7样噬菌体启动子,例如T3、T5和SP6启动子,trp、lpp和lac启动子,例如大肠杆菌的lacUV5启动子;杆状病毒/昆虫细胞表达系统的P10或多角体蛋白基因启动子(见,例如美国专利号5,243,041、5,242,687、5,266,317、4,745,051和5,169,784)以及来自其他真核表达系统的诱导型启动子。为了蛋白的表达,将这些启动子插入质粒中,与控制区(例如lac操纵子)可操作地连接。
优选的启动子区是例如在哺乳动物细胞中可诱导的并且具有功能的那些。合适的用于细菌表达的诱导型启动子和启动子区的实例包括,但不限于:能对异丙基β-D-硫代吡喃型半乳糖苷(IPTG;见Nakamura等.,1979 Cell 18:1109-1117)作出响应的大肠杆菌lac操纵基因;能对重金属(例如,锌)诱导作出响应的金属硫蛋白启动子金属调节元件(参见,例如,美国专利号4,870,009);能对IPTG作出响应的噬菌体T7lac启动子(参见,例如,美国专利号4,952,496;和Studier等,1990 Meth.Enzymol.185:60-89)以及TAC启动子。根据要使用的表达宿主系统,质粒可以任选地包括选择标记基因或在宿主中有功能的基因。因而,例如,选择标记基因包括任何能赋予细菌表型的基因,所述表型能使转化的细菌细胞从大量未转化的细胞中鉴定出来并选择性地生长。用于细菌宿主的适当的选择标记,例如包括氨苄青霉素抗性基因(Ampr)、四环素抗性基因(Tcr)和卡那霉素抗性基因(Kanr)。目前为细菌表达优选卡那霉素抗性基因。
在各种表达系统中,质粒或其他载体也可以包括能编码信号的DNA,该信号用于分泌可操作地连接的蛋白。适用的分泌信号可以从多种途径获得,并且是本领域众所周知的。可以使用在大肠杆菌中有功能的原核和真核分泌信号。根据表达系统,目前优选的分泌信号可以包括,但不限于,由以下大肠杆菌基因编码的那些:ompA、ompT、ompF、ompC、β-内酰胺酶和碱性磷酸酶等(von Heijne,J Mol.Biol.184:99-105,1985)。此外,可以使用细菌pelB基因分泌信号(Lei等.,J.Bacteriol.169:4379,1987)、phoA分泌信号和在昆虫细胞中有功能的cek2。对于某些表达系统最优选的分泌信号是大肠杆菌ompA分泌信号。也可以使用本领域的技术人员已知的其他原核和真核分泌信号(见,例如von Heijne,J Mol.Biol.184:99-105,1985)。采用本文描述的方法,本领域的技术人员可以替换在例如酵母、昆虫或哺乳动物细胞中有功能的分泌信号,以从这些细胞中分泌蛋白。
用于转化大肠杆菌细胞的优选质粒包括pET表达载体(例如,pET-11a、pET-12a-c、pET-15b;参见,美国专利号4,952,496;可以从Novagen,Madison,WI.获得)。其他优选的质粒包括pKK质粒,特别是pKK 223-3,它含有tac启动子(Brosius等,1984Proc.Natl.Acad.Sci.81:6929;Ausubel等,Current Protocols inMolecular Biology;美国专利号5,122,463、5,173,403、5,187,153、5,204,254、5,212,058、5,212,286、5,215,907、5,220,013、5,223,483和5,229,279)。已经通过用卡那霉素基因替代氨苄青霉素抗性基因,来修饰质粒pKK(可以从Pharmacia得到;得自pUC4K,见例如Vieira等(1982 Gene 19:259-268;和美国专利号4,719,179.)。杆状病毒载体,例如pBlueBa c(也称作pJVETL及其衍生物),特别是pBlueBac III(见例如美国专利号5,278,050、5,244,805、5,243,041、5,242,687、5,266,317、4,745,051和5,169,784;可以从Invitrogen,San Diego得到)也可以用于在昆虫细胞中表达多肽。其他质粒包括pIN-IIIompA质粒(见美国专利号4,575,013;也见Duffaud等.,Meth.Enz.153:492-507,1987),例如pIN-IIIompA2。
优选地,如果一个或多个DNA分子在细菌细胞中复制,则优选的宿主是大肠杆菌。优选的DNA分子是这样的系统,其也包括细菌复制起点,以保证DNA分子在细菌的各代中保持。以此方式,通过在细菌中复制,可以产生大量DNA分子。在这样的表达系统中,优选的细菌复制起点包括,但不限于,fl-ori和col E1复制起点。这样的系统的优选的宿主含有可操作地连接到诱导型启动子(例如lacUV启动子)上的能编码T7 RNA聚合酶的DNA的染色体拷贝(见美国专利号4,952,496)。这样的宿主包括,但不限于,溶原体大肠杆菌菌株HMS174(DE3)pLysS、BL21(DE3)pLysS、HMS174(DE3)和BL21(DE3)。菌株BL21(DE3)是优选的。pLys菌株能提供低水平的T7溶菌酶,即T7 RNA聚合酶的一种天然抑制剂。
提供的DNA分子也可以含有能编码阻遏物蛋白的基因。阻遏物蛋白能够抑制含有能结合阻遏物蛋白的核苷酸序列的启动子的转录。通过改变细胞的生理条件,可以解除启动子的阻遏。例如,通过向生长培养基中加入能抑制与操纵基因或调节蛋白或DNA的其他区域相互作用的能力的分子,或通过改变生长培养基的温度,可以完成该改变。优选的阻遏物蛋白包括,但不限于,能对IPTG诱导作出响应的大肠杆菌lacI阻遏物、温度敏感的λcI857阻遏物等。大肠杆菌lacI阻遏物是优选的。
概言之,本发明的重组构建体也含有转录和翻译必需的元件。具体地,这样的元件是优选的,其中含有能编码结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白的核酸序列的重组表达构建体,意在用于在宿主细胞或生物中表达。在本发明的某些实施方案中,通过将基因放置在启动子调节下,可以获得细胞结合结构域-免疫球蛋白融合体的编码基因的细胞类型优选的或细胞类型特异性的表达。启动子的选择,取决于待转化的细胞类型和所需控制的程度或类型。启动子可以是组成型的或有活性的,并且还可以是细胞类型特异性的、组织特异性的、单个细胞特异性的、事件特异性的、时间特异性的或诱导型的。细胞类型特异性的启动子和事件类型特异性的启动子是优选的。组成型或非特异性的启动子的实例包括SV40早期启动子(美国专利号5,118,627)、SV40晚期启动子(美国专利号5,118,627)、CMV早期基因启动子(美国专利号5,168,062)以及腺病毒启动子。除病毒启动子外,细胞启动子也用于本发明的情形中。具体地,可以使用所谓的管家基因的细胞启动子。病毒启动子是优选的,因为它们通常是比细胞启动子更强的启动子。已经在许多真核生物(包括高等真核生物)的基因中鉴别了启动子区,从而本领域的技术人员可以容易地选择用于特定宿主的合适的启动子。
也可以使用诱导型启动子。这些启动子包括由地塞米松诱导的MMTV LTR(PCT WO 91/13160);由重金属诱导的金属硫蛋白启动子;和由cAMP诱导的具有cAMP反应元件的启动子。通过使用诱导型启动子,能编码结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白的核酸序列可以由本发明的表达构建体送递至细胞,并且在加入诱导物之前保持静止。这允许进一步控制基因产物的生产时间。
事件类型特异性启动子仅仅在发生某种事件(例如肿瘤发生能力或病毒感染)后才有活性或被上调。HIV LTR是事件类型特异性的启动子的公知实例。该启动子在存在tat基因产物之前是无活性的,后者是在病毒感染后产生的。一些事件类型启动子也是组织特异性的。
此外,可以使用由特定细胞基因协同调节的启动子。例如,当需要使本发明的特定结合构建体(例如,结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白)的编码基因的表达与一个或多个其他的内源性的或外源地导入的基因协同时,可以使用协同地表达的基因的启动子。当人们已知基因表达模式与在免疫系统的特定组织中诱导免疫反应相关时,这种类型的启动子特别有用,这样该组织内的特异性的免疫活性细胞可以被激活或另外募集,以参与免疫反应。
除了启动子外,可以插入阻遏物序列、负调节物或组织特异性的沉默子,以减少某些情况下的结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白的编码基因的非特异性表达,例如,作为治疗策略的一部分而瞬时无免疫应答的宿主。可以在启动子区插入多种阻遏物元件。转录的阻遏独立于阻遏物元件的方向或离启动子的距离。一种类型的阻遏物序列是绝缘序列(insulator sequence)。这种序列能抑制转录(Dunaway等.,1997 Mol Cell Biol 17:182-9;Gdula等.,1996 Proc Natl AcadSci USA 93:9378-83,Chan等.,1996 J Virol 70:5312-28;Scott和Geyer,1995 EMBO J 14:6258-67;Kalos和Fournier,1995 MolCell Biol 15:198-207;Chung等.,1993 Cell 74:505-14),并能沉默不希望的背景转录。
也已经在II型(软骨)胶原、胆碱乙酰基转移酶、清蛋白(Hu等.,1992 J.Cell Growth Differ.3(9):577-588)、磷酸甘油酸激酶(PGK-2)(Misuno等.,1992 Gene 119(2):293-297)和6-果糖磷酸-2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酶基因的启动子区中鉴定了阻遏物元件(Lemaigre等.,Mol.Cell Biol.11(2):1099-1106)。此外,已经在许多肝脏特异性的基因中鉴定了负调节元件Tse-1,且已经显示其能阻断cAMP反应元件(CRE)-介导的肝细胞中基因激活的诱导(Boshart等.,1990 Cell 61(5):905-916)。
在优选的实施方案中,将能增加所需产物的表达的元件整合进构建体中。这样的元件包括内部的核糖体结合位点(IRES;Wang和Siddiqui,1995 Curr.Top.Microbiol.Immunol 203:99;Ehrenfeld和Semler,1995 Curr.Top.Microbiol.Immunol.203:65;Rees等,1996 Biotechniques 20:102;Sugimoto等,1994 Biotechnology12:694)。IRES能增加翻译效率。同样地,其他序列也能增强表达。对于一些基因,序列、特别是在5’端的序列能抑制转录和/或翻译。这些序列通常是可以形成发夹结构的回文序列。一般缺失待送递核酸中的这种序列。对转录物或翻译产物的表达水平进行了测定,以证实或确定哪些序列能影响表达。可以用任何公知的方法,包括RNA印迹杂交、RNA酶探针保护等,测定转录物水平。可以通过任意公知的方法,包括ELISA、蛋白印迹、免疫细胞化学或其他众所周知的技术,测定蛋白水平。
可以将其他元件整合进本发明的构建体中,例如整合进本发明的能编码结合结构域免疫球蛋白融合蛋白的构建体中。在优选的实施方案中,构建体包含转录终止子序列,包括聚腺苷酸化位点、剪接供体和受体位点以及增强子。也可以整合其他用于表达构建体和将其维持在哺乳动物细胞或其他真核细胞中的元件(如复制起点)。由于这些构建体可以方便地在细菌细胞中生产,所以整合了对于在细菌中的增殖是必要的、或者能增强在细菌中的增殖的元件。这样的元件包括复制起点、选择标记等。
如本文所提供的,通过例如同时送递两种或更多种不同调节的核酸构建体,可以提供送递给细胞以用于基因治疗的能编码本发明的构建体(例如,结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白)的核酸的表达控制的其他水平。使用这样的多核酸构建体方法,可以允许免疫反应的协同调节,例如,依赖于细胞类型和/或另一种表达的被编码的组分的存在的时空协同。本领域的技术人员可以理解,通过选择适当的调节序列,包括但不限于启动子、增强子和其他公知的基因调节元件,可以用相似的方式完成多个水平的被调节的基因表达。
本发明也涉及载体,以及由包含本发明的核酸的已知载体制备的构建体,特别涉及包含用于基因治疗的“重组表达构建体”,其包括各种已知的构建体的任何一种,包括送递构建体,其包含能编码例如根据本文提供的本发明的结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白和多肽的核酸;涉及使用本发明的载体和/或其他构建体而基因工程化的宿主细胞,以及通过重组技术施用表达构建体或其他的构建体的方法,后者包含能编码例如本发明的结合结构域-免疫球蛋白融合多肽和融合蛋白、或其片段或变体的核酸序列。
本发明的各种构建体(包括例如,结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白)实际上可以在适当启动子的控制下在任何宿主细胞(在用于基因治疗的情况下,包括体内宿主细胞)中表达,这取决于构建体的性质(例如,启动子的类型,如上所述),以及所需宿主细胞的性质(例如,是否在有丝分裂期后终末分化或活跃地分裂;例如,表达构建体在宿主细胞中是作为附加体存在还是整合到宿主细胞基因组中)。
用于原核和真核宿主的适当克隆和表达载体记载在,例如,Sambrook,等.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor,NY,(1989),如本文所指出的,在本发明的特别优选的实施方案中,在用本发明的重组表达构建体转染或转化的哺乳动物细胞中进行重组表达。也参见,例如,Machida,CA.,″Viral Vectors for Gene Therapy:Mehtods and Protocols″;Wolff,JA,″Gene Therapeutics:Mehtods and Applications ofDirect Gene Transfer″(Birkhauser 1994);Stein,U和Walther,W(eds.P,″Gene Therapy of Cancer:Methods and Protocols″(Humana Press 2000);Robbins,PD(ed.),″Gene TherapyProtocols″(Humana Press 1997);Morgan,JR(ed.),″Gene TherapyProtocols″(Humana Press 2002);Meager,A(ed.),″Gene TherapyTechnologies,Applications and Regulations:From Laboratory toClinic″(John Wiley & Sons Inc.1999);Machida,CA和Constant,JG,″Viral Vectors for Gene Therapy:Methods and Protocols″(Humana Press 2002);″New Methods Of Gene Therapy For GeneticMetabolic Diseases NIH Guide,″Volume 22,Number 35,October1,1993。也参见近期的与基因治疗有关的美国专利,包括疫苗,它们包括美国专利号6,384,210(″Solvent for biopolymer synthesis,sol vent microdroplets and methods of use″);6,384,203(″Familyof immunoregulators designated leukocyte immunoglobulin-likereceptors(LIR)″);6,384,202(″Cell-specific active compoundsregulated by the cell cycle″);6,384,018(″Polynucleotidetuberculosis vaccine″);6,383,814(″Cationic amphiphiles forintracellular delivery of therapeutic molecules″);6,383,811(″Polyampholytes for delivering polyions to a cell″);6,383,795(″Efficient purification of adenovirus″);6,383,794(″Methods of producing high titer recombinant adeno-associatedvirus″);6,383,785(″Self-enhancing,pharmacologicallycontrollable expression systems″);6,383,753(″Yeastmammalian regulators of cell proliferation″);6,383,746(″Functional promoter for CCR5″);6,383,743(″Method forserial analysis of gene expression″);6,383,738(″Herpessimplex virus ORF P is a repressor of viral protein synthesis″);6,383,737(″Human oxalyl-CoA Decarboxylase″);6,383,733(″Methods of screening for pharmacologically active compoundsfor the treatment of tumour diseases″);6,383,522(″Toxicityreduced composition containing an anti-neoplastic agent anda shark cartilage extract″);6,383,512(″Vesicular complexesand methods of making and using the same″);6,383,481(″Methodfor transplantation of hemopoietic stem cells″);6,383,478(″Polymeric encapsulation system promoting angiogenesis″);6,383,138(″Method for transdermal sampling of analytes″);6,380,382(″Gene encoding a protein having diagnostic,preventive,therapeutic,and other uses″);6,380,371(″Endoglycan:a novel protein having selectin ligand andchemokine presentation activity″);6,380,369(″Human DNAmismatch repair proteins″);6,380,362(″Polynucleotides,polypeptides expressed by the polynucleotides and methods fortheir use″);6,380,170(″Nucleic acid construct for the cellcycle regulated expression of structural genes″);6,380,169(″Metal complex containing oligonucleoside cleavage compoundsand therapies″);6,379,967(″Herpesvirus saimiri as viralvector″);6,379,966(″Intravascular delivery of non-viralnucleic acid protease proteins,and uses thereof′)。
一般地,例如,表达构建体源自质粒载体。一种优选的构建体是改进的pNASS载体(Clontech,Palo Alto,CA),其具有能编码氨苄青霉素抗性基因的核酸序列、聚腺苷酸化信号和T7启动子位点。其他适当的哺乳动物表达载体是公知的(参见,例如,Ausubel等,1995;Sambrook等,同上;也参见,例如,catalogues from Invitrogen,San Diego,CA;Novagen,Madison,WI;Pharmacia,Piscataway,NJ;和其他的)。目前可以制备的优选的构建体包含在适当调节调控下的二氢叶酸还原酶(DHFR)编码序列,用于增加结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白的生产水平,该水平是在使用适当的选择试剂(如氨甲蝶呤)后进行基因扩增而达到的。
一般地,重组表达载体包括允许宿主细胞转化的复制起点和选择标记,以及来自高度表达的基因以用于指导下游结构序列的转录的启动子,如上所述。在适当的阶段,装配异源结构序列与翻译起始和终止序列。因此,例如,本文提供的结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白的编码核酸可以包含在各种表达载体构建体的任一种中,作为用于在宿主细胞中表达结合结构域-免疫球蛋白融合多肽的重组表达构建体。在某些优选的实施方案中,构建体包含在体内施用的制剂中。这样的载体和构建体包括染色体的、非染色体的和合成的DNA序列,例如,SV40的衍生物;细菌质粒;噬菌体DNA;酵母质粒,来源于质粒和噬菌体DNA的组合的载体,病毒DNA,例如痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒以及假狂犬病病毒或复制缺陷型逆转录病毒,如下文所述。但是,任何其他载体也可以用于制备重组表达构建体,且在优选的实施方案中,这样的载体是可复制的,并且可在宿主中存活。
通过例如各种程序,可以将适当的DNA序列插入载体中。通常,通过本领域已知的方法,将DNA序列插入适当的限制性内切核酸酶位点。用于克隆、DNA分离、扩增和纯化的标准技术,用于酶促反应(包含DNA连接酶、DNA聚合酶、限制性内切核酸酶等)的标准技术,以及各种分离技术,是本领域的技术人员公知的和常用的。许多标准技术记载在,例如,Ausubel等(1993 Current Protocols in MolecularBiology,Greene Publ.Assoc.Inc.& John Wiley & Sons,Inc.,Boston,MA);Sambrook等(1989 Molecular Cloning,第2版,ColdSpring Harbor Laboratory,Plainview,NY);Maniatis等(1982Molecular Cloning,Cold Spring Harbor Laboratory,Plainview,NY);Glover(Ed.)(1985 DNA Cloning Vol.I和II,IRL Press,Oxford,UK);Hames和Higgins(编),(1985 Nucleic Hybridization,IRL Press,Oxford,UK);和其他地方。
表达载体中的DNA序列与至少一个适当的表达控制序列(例如,组成型启动子或受调节的启动子)可操作地连接,以指导mRNA合成。这种表达控制序列的代表性实例包括真核细胞或它们的病毒启动子,如上所述。使用CAT(氯霉素转移酶)载体或其他具有选择标记的载体,可以从任何需要的基因选择启动子区。真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、逆转录病毒LTR启动子和小鼠金属硫蛋白-I启动子。适当的载体和启动子的选择,属于本领域普通技术人员的水平之内,且本文描述了某些特别优选的重组表达构建体的制备,所述构建体包含与能编码结合结构域-免疫球蛋白融合多肽的核酸可操作地连接的至少一个启动子或受调节启动子。
通过将增强子序列插入载体中,可以增强高等真核动物对能编码包含在本发明中的蛋白和多肽的DNA的转录。增强子是DNA的顺式作用元件,通常约10-300bp,其作用于启动子以增加它的转录。实例包括位于复制起点晚期侧100-270bp的SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、复制起点晚期侧的多瘤病毒增强子和腺病毒增强子。
基因治疗是使用遗传材料来治疗疾病。它包含替换有缺陷的基因或向细胞和/或组织添加新基因的策略,且它被开发用于治疗癌症、代谢障碍的校正和免疫治疗领域。本发明的基因治疗包括使用各种本发明的构建体,有或没有分离载体或送递载体或构建体,以用于治疗本文指出的疾病、障碍和/或状况。这样的构建体也可以用作疫苗,以用于治疗或预防本文指出的疾病、障碍和/或状况。DNA疫苗,例如,使用能编码免疫原性的蛋白和核酸决定簇的多核苷酸来刺激抗病原体或肿瘤细胞的免疫系统。这样的策略可以刺激获得性的或先天的免疫,或可以通过细胞因子表达来参与免疫功能的修饰。体内基因治疗包含将遗传材料直接注射进患者或人疾病的动物模型中。疫苗和免疫调制是全身性的治疗。对于组织-特异性的体内治疗,例如目的在于治疗癌症的那些,定位的基因送递和/或表达/靶向系统是优选的。已经设计了多种基因治疗载体来靶向特定组织,且已经开发了物理地靶向特定组织的方法,例如,使用基于导管的技术,它们都是本文预期的。基因治疗的离体方法也是本文预期的,且涉及患者自己的细胞的去除、遗传修饰、扩大和重新施用。实例包括用于癌症治疗的骨髓移植或淋巴祖细胞的遗传modivation。优选地,将离体基因治疗用于治疗在基因转移过程(例如血液或皮肤细胞)中容易接近且可以培养存活的细胞。
有用的基因治疗载体包括腺病毒载体、慢病毒载体、腺伴随病毒(AAV)载体、单纯疱疹病毒(Hsv)载体和逆转录病毒载体。使用“裸DNA”、基于脂质体的送递、基于脂类的送递(包括附着到带正电荷的脂类上的DNA)和电穿孔,也可以实现基因治疗。
如本文所提供的,在某些实施方案中,包括但不限于基因治疗实施方案,载体可以是病毒载体,例如,逆转录病毒载体。Miller等,1989 BioTechniques 7:980;Coffin和Varmus,1996 Retroviruses,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY。例如,可以从其得到逆转录病毒质粒载体的逆转录病毒包括,但不限于,莫洛尼鼠类白血病病毒、脾脏坏死病毒、逆转录病毒如劳斯肉瘤病毒、Harvey肉瘤病毒、禽类白血病病毒、长臂猿白血病病毒、人免疫缺陷病毒、腺病毒、骨髓增生性肉瘤病毒和乳癌病毒。
逆转录病毒是一种可以通过DNA中间体进行复制并整合到宿主细胞基因组中的RNA病毒。该DNA中间体,或前病毒,可以稳定地整合进宿主细胞DNA。根据本发明的某些实施方案,表达构建体可以包含逆转录病毒,其中整合进了能编码外来蛋白的外来基因,以替代正常的逆转录病毒RNA。当逆转录病毒RNA伴随感染进入宿主细胞时,外来基因也被导入细胞中,然后可以整合到宿主细胞DNA中,如同它是逆转录病毒基因组的一部分。该外来基因在宿主中的表达,会导致外来蛋白的表达。
已经开发的用于基因治疗的大多数逆转录病毒载体系统都是基于鼠逆转录病毒。这样的逆转录病毒以两种形式存在,即作为称作病毒体的游离病毒颗粒,或作为整合到宿主细胞DNA中的前病毒。病毒体形式的病毒含有逆转录病毒的结构蛋白和酶蛋白(包括逆转录酶)、病毒基因组的两个RNA拷贝、以及含有病毒包膜糖蛋白的来源细胞质膜的部分。逆转录病毒基因组组织成四个主要区域:含有转录起始和终止所必需的顺式作用元件并且位于编码基因的5’和3’的长末端重复序列(LTR),以及三个编码基因gag、pol和env。这三个基因gag、pol和env分别能编码内部病毒结构、酶蛋白(例如整合酶)以及能赋予病毒感染性和宿主范围特异性的包膜糖蛋白(称为gp70和p15e),以及未确定功能的“R”肽。
已经开发了单独的包装细胞系和载体生产性细胞系,这是出于使用逆转录病毒的安全性考虑,包括它们在本发明提供的表达构建体中的应用。简而言之,该方法使用两种组分,逆转录病毒载体和包装细胞系(PCL)。逆转录病毒载体含有长末端重复序列(LTR)、待转移的外源DNA和包装序列(y)。该逆转录病毒载体不会自己复制,因为能编码结构蛋白和包膜蛋白的基因没有被包含在载体基因组中。PCL含有能编码gag、pol和env蛋白的基因,但不含有包装信号“y”。这样,PCL自身只能形成空的病毒体颗粒。在此普通方法中,将逆转录病毒载体导入PCL中,从而建立载体生产性细胞系(VCL)。该VCL能制造仅含有逆转录病毒载体(外源)基因组的病毒体颗粒,因此以前被认为是用于治疗用途的安全的逆转录病毒载体。
“逆转录病毒载体构建体”是指装配体,在本发明的优选的实施方案中,所述组装体能够指导目的序列或基因(如结合结构域-免疫球蛋白融合体的编码核酸序列)的表达。简而言之,逆转录病毒载体构建体可以包含5′LTR、tRNA结合位点、包装信号、第二条链DNA合成的起点和3′LTR。可以将多种异源序列包含在载体构建体中,包括例如,能编码蛋白(例如,细胞毒性蛋白、疾病相关抗原、免疫辅助分子或替代基因)的序列,或自身作为分子有用的序列(例如,作为核酶或反义序列)。
可以容易地从多种逆转录病毒(包括例如,B、C和D型逆转录病毒以及泡沫病毒和慢病毒)构建出本发明的逆转录病毒载体构建体(参见,例如RNA Tumor Viruses,第2版,Cold Spring HarborLaboratory,1985)。这样的逆转录病毒可以容易地从存放处或保藏中心获得,例如从美国典型培养物保藏中心(“ATCC”;Rockville,Maryland)获得,或者使用常用技术从已知来源分离。考虑到本文提供的公开内容和标准重组技术(例如,Sambrook等,MolecularCloning:A Laboratory Manual,第2版,Cold Spring HarborLaboratory Press,1989;Kunkle,1985 PNAS 82:488),可以容易地使用任意的上述逆转录病毒组装或构建本发明的逆转录病毒载体构建体、包装细胞或生产细胞。
用于病毒载体中的适当启动子通常可以包括,但不限于,记载在Miller,等.,1989 Biotechniques 7:980-990中的逆转录病毒LTR;SV40启动子和人巨细胞病毒(CMV)启动子,或任意其他启动子(例如,细胞启动子,如真核细胞启动子,包括但不限于组蛋白、pol III和β-肌动蛋白启动子)。其他可以使用的病毒启动子包括,但不限于,腺病毒启动子、胸苷激酶(TK)启动子和B19细小病毒启动子。根据本文包含的教导和上文描述的受调节的启动子或启动子,本领域的技术人员可以明白适当的启动子的选择。
如上文所述,使用逆转录病毒质粒载体来转导包装细胞系,以形成生产细胞系。可以被转染的包装细胞系的实例包括,但不限于,PE501、PA317、ψ-2、ψ-AM、PA12、T19-14X、VT-19-17-H2、ψCRE、ψCRIP、GP+E-86、GP+envAml2和DAN细胞系,如Miller,Human GeneTherapy,1:5-14(1990)所述。通过本领域已知的任何方法,可以用载体转导包装细胞系。这些方法包括,但不限于,电穿孔、脂质体的使用和CaPO4沉淀。在另一替代方案中,可以将逆转录病毒质粒载体被囊化在脂质体中,或偶联于脂类,然后施用给宿主。
生产细胞系能生产感染性的逆转录病毒载体颗粒,其包含能编码结合结构域-免疫球蛋白融合多肽或融合蛋白的核酸序列。然后,用这些逆转录病毒载体颗粒体外地或体内地转导真核细胞。被转导的真核细胞会表达能编码结合结构域-免疫球蛋白融合多肽或融合蛋白的核酸序列。可以被转导的真核细胞包括,但不限于,胚胎干细胞,以及造血干细胞、肝细胞、成纤维细胞、循环外周血单核细胞和多形核细胞,包括骨髓单核细胞、淋巴细胞、成肌细胞、组织巨噬细胞、树突细胞、肝巨噬细胞、淋巴结和脾的淋巴和网状内皮细胞、角质细胞、内皮细胞和支气管上皮细胞。
作为本发明的用病毒载体制备例如重组结合结构域-免疫球蛋白融合表达构建体的实施方案的另一个实例,在一个优选的实施方案中,用能指导结合结构域-免疫球蛋白融合多肽或融合蛋白的表达的重组病毒构建体转导的宿主细胞可以生产病毒颗粒,后者含有被表达的结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白融合多肽或融合蛋白,其源自在病毒出芽过程中被病毒颗粒整合的宿主细胞膜部分。
在另一个方面,本发明涉及含有本文所述的核酸构建体(例如,重组结合结构域-免疫球蛋白融合表达构建体)的宿主细胞。用本发明的载体和/或表达构建体(可以是,例如,克隆载体、穿梭载体或表达构建体)基因工程化(转导、转化或转染)宿主细胞。该载体或构建体可以是,例如,质粒、病毒颗粒、噬菌体等形式。工程化的宿主细胞可以在经适当改进的常规营养培养基中培养,以用于激活启动子、选择转化体或扩增特定基因,例如能编码结合结构域-免疫球蛋白融合多肽或结合结构域-免疫球蛋白融合体融合蛋白的基因。选择的用于表达的特定宿主细胞的培养条件,例如温度、pH等,是本领域的普通技术人员能容易地理解的。
用于生产或表达本发明的构建体的宿主细胞可以是例如高等真核细胞,如哺乳动物细胞,或低等真核细胞,如酵母细胞,或者宿主细胞可以是原核细胞,如细菌细胞。根据本发明,适当宿主细胞的代表性实例包括,但不需限于,细菌细胞,如大肠杆菌、链霉菌(streptomyces)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)细胞;真菌细胞,如酵母;昆虫细胞,如果蝇(Drosophila)S2和灰翅夜蛾(Spodoptera)Sf 9;动物细胞,如CHO、COS或293细胞;腺病毒;植物细胞,或已经适于体外繁殖或从头建立的任何合适的细胞。认为本领域的技术人员根据本文的教导能够选择适当的宿主细胞。
也可以使用多种哺乳动物细胞培养系统来表达重组蛋白。哺乳动物表达系统的实例包括由Gluzman,1981 Cell 23:175描述的猴肾成纤维细胞的COS-7系,以及其他能够表达相容载体的细胞系,如C127、3T3、CHO、HeLa和BHK细胞系。哺乳动物表达载体包含复制起点、适当的启动子和增强子,以及任何必要的核糖体结合位点、聚腺苷酸化位点、剪接供体和受体位点、转录终止序列和5’侧翼非转录序列,例如本文关于结合结构域-免疫球蛋白融合表达构建体的制备所描述的。来源于SV40剪接的DNA序列,以及聚腺苷酸化位点,可以用于提供需要的非转录遗传因子。通过本领域的技术人员熟悉的各种方法,可以将构建体导入宿主细胞,所述方法包括但不限于,例如,磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染或电穿孔(Davis等.,1986 BasicMethods in Molecular Biology)。
可以将本发明的构建体(例如,结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白)或包含一种或多种能编码如本文所述的它们的多核苷酸的组合物(例如,除了别的以外,为了基因治疗,要在允许在宿主细胞内体内或体外表达结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白的条件和足够的时间下施用)制成药物组合物,以用于根据众所周知的方法给药。药物组合物一般包含一种或多种重组表达构建体,和/或所述构建体的表达产物,并组合了药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。所述载体在使用的剂量和浓度下对受体是无毒的。对于基于核酸的制剂,或对于包含本发明的重组构建体的表达产物的制剂,施用约0.01μg/kg-约100mg/kg体重,例如,一般通过皮内、皮下、肌内或静脉内途径或其他途径。优选的剂量是例如约1μg/kg-约1mg/kg,约5μg/kg-约200μg/kg是特别优选的。本领域的技术人员明白,施用的次数和频率取决于宿主的反应。用于治疗用途的“药学上可接受的载体”是制药领域公知的,且记载在,例如Remingtons PharmaceuticalSciences,Mack Publishing Co.(A.R.Gennaro编,1985)。例如,可以使用生理pH的无菌盐水和磷酸缓冲盐水。可以在药物组合物中提供防腐剂、稳定剂、染料和甚直调味剂。例如,可以添加苯甲酸钠、山梨酸和对羟基苯甲酸酯作为防腐剂。同上1449。此外,可以使用抗氧化剂和悬浮剂。同上。
“药学上可接受的盐”是指本发明的化合物的盐,它源自所述化合物和有机或无机酸(酸加成盐)或有机或无机碱(碱加成盐)的组合。本发明的化合物可以以游离碱或盐形式使用,认为两种形式都属于本发明的范围。
含有一种或多种本发明的核酸构建体(例如,结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白编码构建体)(或它们的表达产物)的药物组合物,可以是允许将该组合物施用给患者的任何形式。例如,该组合物可以是固体、液体或气体(气溶胶)的形式。一般的施用途径包括,但不限于,口服、局部、肠胃外(例如,舌下或口腔)、舌下、直肠、阴道和鼻内施用。如本文所使用的,术语肠胃外包括皮下注射、静脉内、肌内、胸骨内、海绵窦内、鞘内、道内(intrameatal)、尿道内注射和输注技术。对药物组合物进行配制,从而允许其中含有的活性组分在将组合物施用给患者后是生物可利用的。要施用给患者的组合物是一个或多个剂量单位的形式,其中例如,片剂可以是单剂量单位,气溶胶形式的本发明的一种或多种化合物的容器可以容纳多个剂量单位。
对于口服施用,可以存在赋形剂和/或粘合剂。实例是蔗糖、高岭土、甘油、淀粉糊精、褐藻酸钠、羧甲基纤维素和乙基纤维素。可以存在着色剂和/或调味剂。可以使用包衣壳。
组合物可以是液体的形式,例如酏剂、糖浆、溶液、乳剂或悬浮液。作为两个实例,该液体可以用于口服施用或通过注射送递。当用于口服施用时,除了一种或多种结合结构域-免疫球蛋白融合构建体或表达的产物以外,优选的组合物还含有一种或多种增甜剂、防腐剂、染料/着色剂和风味增强剂。在用于注射施用的组合物中,可以包含例如一种或多种表面活性剂、防腐剂、湿润剂、分散剂、悬浮剂、缓冲剂、稳定剂和等渗剂。
不论是溶液、悬浮液还是其他类似的形式,如本文所使用的液体药物组合物可以包含一种或多种下述的佐剂:无菌稀释剂,例如注射用水、盐溶液,优选生理盐水、林格液、等渗氯化钠、固定油类例如可以作为溶剂或悬浮介质的合成甘油单酯或甘油二酯、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他溶剂;抗细菌剂,例如苯甲醇或羟苯甲酸甲酯;抗氧化剂,例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠;螯合剂,例如乙二胺四乙酸;缓冲剂,例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐;以及用于调节渗涨度的试剂,例如氯化钠或右旋糖。肠胃外的制剂可以包含在玻璃或塑料制备的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。生理盐水是优选的佐剂。可注射的药物组合物优选地是无菌的。
制剂中也可能需要包含其他组分,例如送递载体,包括但不限于铝盐、油包水乳剂、可生物降解的油载体、水包油乳剂、可生物降解的微胶囊和脂质体。用于所述载体中的免疫刺激物质(佐剂)的实例包括N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸-D-异谷氨酰胺(MDP)、脂多糖(LPS)、葡聚糖、IL-12、GM-CSF、γ干扰素和IL-15。
尽管可以在本发明的药物组合物中使用本领域的技术人员公知的任何适当的载体,但载体的类型将根据施用方式和是否需要持续释放而不同。对于肠胃外施用,例如皮下注射,载体优选地包括水、盐水、醇、脂肪、蜡或缓冲液。对于口服施用,可以使用任何上述载体或固体载体,例如甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖和碳酸镁。也可以将可生物降解的微球体(例如,polylactic galactide)用作本发明的药物组合物的载体。适当的可生物降解的微球体公开在,例如,美国专利号4,897,268和5,075,109中。在这一点上,微球体优选地大于约25微米。
药物组合物也可以含有稀释剂,例如缓冲液、抗氧化剂如抗坏血酸、低分子量(小于约10个残基)多肽、蛋白、氨基酸、碳水化合物(包括葡萄糖、蔗糖或糊精)、螯合剂如EDTA、谷胱甘肽及其他的稳定剂和赋形剂。中性的缓冲盐水或与非特异性的血清清蛋白混合的盐水是示例性的适合的稀释剂。优选地,使用适当的赋形剂溶液(例如,蔗糖)作为稀释剂,将该产物制成冻干物。
如上文所述,本发明包括组合物,其能送递能编码结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白的核酸分子。所述组合物包括重组病毒载体(例如,逆转录病毒(见WO 90/07936,WO 91/02805,WO 93/25234,WO93/25698和WO 94/03622),腺病毒(见Berkner,1988 Biotechniques6:616-627;Li等.,1993 Hum.Gene Ther.4:403-409;Vincent等.,1993 Nat.Genet.5:130-134;和Kolls等.,1994 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:215-219),以及痘病毒(见美国专利号4,769,330;美国专利号5,017,487和WO 89/01973)),与聚阳离子分子络合的重组表达构建体核酸分子(见WO 93/03709),和与脂质体结合的核酸(见Wang等.,1987 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:7851)。在某些实施方案中,DNA可以连接于杀伤的或灭活的腺病毒(见Curiel等.,1992 Hum.Gene Ther.3:147-154;Cotton等.,1992 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:6094)。其他合适的组合物包括DNA-配体(见Wu等.,1989 J.Biol.Chem.264:16985-16987)和脂质-DNA组合(见Felgner等.,1989 Proc.Natl.Acad Sci.USA84:7413-7417)。
除了直接的体内方法,也可以使用离体方法,其中从宿主取出细胞,进行修饰,然后置于同一个或另一个宿主动物。明显地,人们可以使用上述任意一种组合物,以离体的方式,将本发明的构建体(例如,结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白)或结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白的编码核酸分子导入组织细胞。病毒的、物理的和化学的摄入方法是本领域众所周知的。
因此,本发明可以用于治疗患有B细胞障碍或恶性状况的患者,或用于治疗来源于所述患者的细胞培养物。如本文所使用的,术语“患者”是指任何温血动物,优选人。患者可以患有癌症或恶性状况,如B细胞淋巴瘤,或可以是正常的(即没有可检测出的疾病和感染)。“细胞培养物”包括任何可以进行离体处理的制备物,例如,含有免疫系统的免疫活性细胞或分离的细胞(包括但不限于T细胞、巨噬细胞、单核细胞、B细胞和树突细胞)的制剂。通过本领域的普通技术人员众所周知的的多种技术中的任一种(例如,Ficoll-hypaque密度离心),可以分离所述的细胞。细胞可以(但不是必需)已经从患有B细胞障碍或恶性状况的患者中分离,并且可以在治疗后重新导入患者。
用于肠胃外或口服施用的液体组合物应当含有一定量的本发明的构建体(例如,结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白的编码构建体)或表达产物,从而可以获得适当的剂量。一般地,该量是,在组合物中含有至少0.01wt%的结合结构域-免疫球蛋白融合构建体或表达产物。当用于口服施用时,该量可以是组合物的0.1-约70wt%。优选的口服组合物含有约4-约50%的结合结构域-免疫球蛋白融合构建体或表达产物。制备了优选的组合物和制剂,从而例如使1个肠胃外的剂量单位含有0.01-1wt%活性化合物。
药物组合物可以用于局部施用,在此情况下载体可以适当地包含溶液、乳剂、软膏或凝胶基质。该基质,例如,可以包含一种或多种下述的组分:矿脂、羊毛脂、聚乙二醇、蜂蜡、矿物油、稀释剂如水和醇,以及乳化剂和稳定剂。用于局部施用的药物组合物中可以存在增稠剂。如果用于经皮施用,该组合物可以包含经皮贴剂或离子电渗设备。局部制剂可以含有浓度为约0.1-约10%w/v(每单位体积的重量)的本发明的构建体(例如结合结构域-免疫球蛋白融合构建体)或表达产物。
组合物可以用于直肠施用,采取例如在直肠中熔解并释放药物的栓剂形式。用于直肠施用的组合物可以含有油质基质,作为适当的无刺激性的赋形剂。所述基质包括,但不限于,羊毛脂、可可油和聚乙二醇。
在本发明的方法中,通过使用插入物、珠子、定时的-释放制剂、贴剂或快速释放制剂,可以施用本发明的构建体(例如,结合结构域-免疫球蛋白融合体的编码构建体)或表达产物。
可以将本发明的构建体(例如,本发明的抗原-结合构建体)施用给动物或患者,或与其他化合物组合,同时地或大约同时地共同施用给动物或患者。在一个方面,将一种或多种构建体(包括例如一种或多种抗原-结合构建体)与一种或多种化疗化合物(例如烷化剂、核苷类似物等)组合施用给动物或患者。施用或共同施用一种或多种本发明的构建体(包括一种或多种抗原-结合构建体)和一种或多种化疗剂,可以用于治疗动物或患者的肿瘤或癌症。示例性的癌症包括,但不限于,头和颈癌、乳腺癌、结肠直肠癌、胃癌、肝癌、膀胱癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、肺癌(非-小细胞)、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌;绒毛膜癌(肺癌);毛细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病(乳房&膀胱)、急性髓细胞性白血病、脑膜白血病、慢性髓细胞性白血病、红白血病。更常见地,治疗的癌症包括非何杰金淋巴瘤(骨源性肉瘤、成年人软组织肉瘤)、T-细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、缓慢生长的非-何杰金淋巴瘤、何杰金淋巴瘤和卵巢癌。
可以与一种或多种构建体共同施用的烷化剂的实例包括一种或多种本发明的抗原-结合构建体,包括氮芥、苯丁酸氮芥、异环磷酰胺、苯丙氨酸氮芥、百消安、亚硝脲氮芥、环己亚硝脲、甲基苄肼、dacardazine、顺氯氨铂、卡波铂、丝裂霉素C、环磷酰胺、isosfamide、六甲蜜胺、噻替哌和氮烯唑胺,和其类似物。参见,例如描述苯丁酸氮芥的合成的美国专利号3,046,301,描述异环磷酰胺的合成的美国专利号3,732,340,描述环磷酰胺的合成的美国专利号3,018,302,描述苯丙氨酸氮芥的合成的美国专利号3,032,584,和Braunwald等,″Harrison′s Principles of Internal Medicine,″第15版,McGraw-Hill,New York,NY,第536-544页(2001)关于环磷酰胺、苯丁酸氮芥、苯丙氨酸氮芥、异环磷酰胺、甲基苄肼、六甲蜜胺、顺氯氨铂和卡波铂的临床方面。核苷类似物的实例,包括,但不限于,氟达拉滨喷托他丁、氨甲蝶呤、氟尿嘧啶、氟脱氧尿苷、CB3717、氮杂胞苷、阿糖胞苷,5-氟脱氧尿苷、巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、cladribine和其类似物。一个实例是构建体的组合,包括能结合CD20的抗原-结合构建体。该构建体能起化学敏化剂的作用,并能与其他化疗剂一起作用,从而减少实现抗-肿瘤或抗-癌作用所需的化疗剂。例如,描述喷托他丁的合成的美国专利号3,923,785,描述氨甲蝶呤的合成的美国专利号4,080,325,描述氟尿嘧啶的合成的美国专利号2,802,005,和Braunwald等,″Harrison′s Principles of InternalMedicine,″第15版,McGraw-Hill,New York,NY,第536-544页(2001)关于氨甲蝶呤、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤和磷酸氟达拉滨的临床方面。
在另一个方面,可以施用一种或多种本发明的构建体(包括一种或多种抗原-结合构建体),或与能抑制拓扑异构酶I I的化合物或另外能与细胞中的核酸相互作用的化合物共同施用。这样的化合物包括,例如,阿霉素、表柔比星、足叶乙甙、替尼泊甙、米托蒽醌和其类似物。在一个实例中,在治疗中使用该组合以及高-剂量的化疗和自体的干细胞支持(HDC-ASCT),以减少外周血液祖细胞(PBSC)的肿瘤细胞污染。参见,Geroni等的美国专利6,586,428。
在另一个方面,可以施用一种或多种本发明的构建体(包括一种或多种抗原-结合构建体),或与治疗药物共同施用。例如,Virulizin(Lorus Therapeutics),认为它能体外地刺激肿瘤细胞释放肿瘤坏死因子TNF-α,并刺激巨噬细胞的活化。这可以与一种或多种本发明的构建体(包括一种或多种抗原-结合构建体)组合使用,以增加癌细胞的细胞凋亡和治疗各种类型的癌症,包括胰腺癌、恶性黑素瘤、卡波西肉瘤(KS)、肺癌、乳腺癌、子宫癌、卵巢癌和子宫颈癌。另一个实例是CpG 7909(Coley Pharmaceutical Group),认为它能活化NK细胞和单核细胞,并增强ADCC。该药物可以与癌症或肿瘤特异性的本发明的构建体(包括抗原-结合构建体,例如抗-CD20构建体)组合使用,以治疗非-何杰金淋巴瘤和其他癌症。
也可以将一种或多种本发明的构建体(包括一种或多种抗原-结合构建体)与血管发生抑制剂组合使用,以增强抗-肿瘤作用。血管发生是新血管的生长。该过程允许肿瘤生长和转移。抑制血管发生,可以辅助预防转移,并阻止肿瘤细胞的传播。血管发生抑制剂包括,但不限于,血管抑素(angiostatin)、内皮抑制素(endostatin)、血小板反应蛋白、血小板因子4、软骨-衍生的抑制剂(CDI)、类视黄醇、白细胞介素-12、金属蛋白酶1、2和3的组织抑制剂(TIMP-1、TIMP-2和TIMP-3)和能阻断血管发生信号传导级联的蛋白,例如抗-VEGF(血管内皮生长因子)和IFN-α。可以施用血管发生抑制剂,或与肿瘤特异性的本发明的构建体共同施用,所述构建体包括抗原-结合构建体,其能介导例如ADCC和/或补体固定或化疗-缀合的抗原-结合,以抗击各种类型的癌症,例如,实体肿瘤癌例如肺癌和乳腺癌。
在另一个方面,可以施用一种或多种本发明的构建体(包括一种或多种抗原-结合构建体),或与能缓解疾病的抗风湿性试剂(DMAR试剂)共同施用,用于治疗类风湿性关节炎、牛皮癣、溃疡性结肠炎、系统性红斑狼疮(SLE)、Crohn氏病、强直性脊柱炎和各种炎性的疾病过程。在这样的治疗中,本发明的构建体(例如,抗原-结合构建体)一般与化合物结合施用,所述化合物例如硫唑嘌呤、环孢菌素、金、羟氯喹、氨甲蝶呤、penicallamine、柳氮磺胺吡啶等。
在另一个方面,可以施用一种或多种本发明的构建体(包括一种或多种抗原-结合构建体),或与能抵消白细胞介素-1的生物学作用的试剂或化合物共同施用,包括例如白细胞介素-1抑制剂和白细胞介素-1受体拮抗剂。认为白细胞介素-1在类风湿性关节炎(RA)、炎症和关节的破坏的产生中起作用。IL-1抑制剂也可以与本发明的构建体(包括抗原-结合构建体)组合使用,以治疗关节炎、炎性肠病、脓毒病和脓毒性休克、局部缺血性损伤、再灌注、局部缺血性脑损伤例如大脑性麻痹和多发性硬化。参见,Thompson等的美国专利号6,159,460。在另一个方面,例如,可以给动物或患者施用一种或多种本发明的构建体(包括一种或多种抗原-结合构建体),或与一种或多种糖皮质激素结合共同施用,后者例如,methylprednisilone、地塞米松、氢化可的松等。糖皮质激素已经用于诱导细胞凋亡和抑制生长,其独立于ADCC和CDC。这些化合物可以与本发明的能诱导癌细胞的细胞凋亡的构建体(包括抗原-结合构建体)组合。在一个实例中,是抗-CD20和抗-CD40抗原-结合构建体,其可以用于诱导B-细胞的细胞凋亡,与糖皮质激素结合,以治疗B-细胞非何杰金淋巴瘤(NHL)。
在另一个方面,可以施用一种或多种本发明的构建体(包括一种或多种抗原-结合构建体),或与p38抑制剂或拮抗剂共同施用。p38促分裂原-激活的蛋白激酶途径能参与许多有助于发展类风湿性关节炎的细胞过程。例如,白细胞的激活和浸润以及炎性细胞因子的生产是p38-依赖性的过程。
在另一个方面,可以施用一种或多种本发明的构建体(包括一种或多种抗原-结合构建体),或与能促进B-细胞的分化和增殖的化合物共同施用。除了其他的生物活性以外,已经证实细胞因子例如白细胞介素-4(IL-4)和白细胞介素-6(IL-6)能刺激激活的B淋巴细胞的抗体合成和分泌。在本发明的一个具体方面,将构建体(包括能识别和结合CD20的抗原-结合构建体)与白细胞介素-4(IL-4)和白细胞介素-6(IL-6)中的一种或多种共同施用。
在另一个方面,可以施用一种或多种本发明的构建体(包括一种或多种抗原-结合构建体),或与白细胞介素-2(IL-2)共同施用。白细胞介素2(IL-2)是能增加效应细胞的生产的淋巴因子,例如CD4+T-辅助细胞、CD8细胞毒性细胞、能生产抗体的B细胞、自然杀伤细胞(NK)和单核细胞/巨噬细胞。IL-2能辅助生产T-细胞,后者又分泌更多的IL-2(“自分泌环”)。IL-2可以用于增强依赖抗体的细胞介导细胞毒性(ADCC)和与本发明的构建体有关的免疫治疗。在一个实例中,本发明的抗-CD20构建体和IL-2用于治疗患有复发的或难治疗的滤泡性非何杰金淋巴瘤的患者。在另一个实例中,施用IL-2,或与HIV免疫治疗共同施用,以辅助T细胞恢复。
在另一个方面,可以施用一种或多种本发明的构建体(包括一种或多种抗原-结合构建体),或与白细胞介素-12(IL-12)共同施用。已知IL-12能增强细胞溶解的T-细胞反应,促进辅助T细胞的发育,增强自然杀伤(NK)细胞的活性,和诱导T和NK细胞中的IFN-γ的分泌。IL-12也能增加许多能介导细胞凋亡的辅助和效应细胞。在本发明的另一个方面,施用一种或多种构建体,包括一种或多种抗原-结合构建体,或与IL-12共同施用,以治疗患有肿瘤或癌症的动物或患者。例如,将能结合CD20的本发明的构建体(包括抗原-结合构建体)与IL-2组合,以用于治疗患有B-细胞非何杰金淋巴瘤(NHL)的患者。
也可以将一种或多种本发明的构建体(包括一种或多种抗原-结合构建体)与免疫调制剂组合,以加强本发明的抗原-结合构建体的功效。免疫调制剂包括,但不限于,集落刺激因子(CSF)、肿瘤坏死因子(TNF)和干扰素(IFN)。
CSF可以包括粒细胞-巨噬细胞CSF(GM-CSF)、粒细胞-CSF(G-CSF)和巨噬细胞CSF(M-CSF)。认为GM-CSF能调节嗜中性粒细胞、巨噬细胞、单核细胞和嗜酸性粒细胞的发育。已经显示G-CSF能诱导嗜中性粒细胞生产和M-CSF生产。已经显示M-CSF能刺激巨噬细胞和单核细胞。已经长期地建立了CSF在治疗癌症患者的嗜中性粒细胞减少症中的应用。在一个实例中,可以将本发明的构建体(包括抗原-结合构建体)与GM-CSF、G-CSF或其组合相组合,以促进骨髓移植和化疗后的患者的嗜中性粒细胞减少症恢复。嗜中性粒细胞在抗击微生物(例如细菌、真菌和寄生物)中起主要作用。嗜中性粒细胞减少症的患者对细菌和广泛传播的真菌感染特别易感。在另一个实例中,可以将本发明的构建体(包括抗原-结合构建体)与GM-CSF-治疗的嗜中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞相组合,以增强抗细菌、真菌等(包括可怕的卡氏肺囊虫(Pneumocystis carinii))的活性。
IFN的一个实例是干扰素α(IFN-α)。当身体对癌症或病毒感染起反应时,一些类型的白细胞会自然地产生IFN-α,作为免疫反应的一部分。它有2种主要攻击模式,即干扰癌细胞的生长和增殖,和加强杀伤T细胞和能攻击癌细胞的其他细胞的生产。也认为干扰素能促进癌细胞输出化学信号,所述信号使它们成为免疫系统的更好的靶,且在近年来已经用于几种不同类型的癌症,尤其是肾癌、黑素瘤、多发性骨髓瘤和一些类型的白血病。它也用于治疗病毒感染,例如肝炎。例如,干扰素-α2a能增强ADCC,且可以与一种或多种本发明的构建体(包括抗原-结合构建体)相组合,以提高与构建体有关的ADCC活性的效率。在另一个实例中,可以给动物或患者施用一种或多种本发明的构建体,包括一种或多种抗原-结合构建体,或者与干扰素-γ(IFN-γ)共同施用,已经证实其能增加B细胞和骨髓浆细胞(BMPC)上的抗-CD20抗原的数目。这特别适用于治疗患有多发性骨髓瘤的患者,他们的B细胞和骨髓浆细胞(BMPC)具有减少的CD20表达。因此,构建体,包括本发明的抗原-结合构建体,尤其是能结合CD20的构建体,可以与IFN-γ组合共同施用,用于治疗多发性骨髓瘤患者。
TNF是一类具有抗癌性能的天然化学物质。TNF的一个实例是TNF-α。还已经显示TNF-α与IFN-γ和IL-12具有协同作用。在另一个实例中,可以施用TNF,或与一种或多种本发明的肿瘤特异性的构建体(包括一种或多种抗原-结合构建体)共同施用,且其包括本发明的化疗-缀合的抗原-结合构建体,以及IFN-γ、IL-12或其各种组合。还已知TNF是炎症调节分子。TNF-α抗体或拮抗剂可以与本发明的抗-T细胞构建体(包括抗原-结合构建体)组合,以治疗具有类风湿性关节炎、牛皮癣、溃疡性结肠炎、系统性红斑狼疮(SLE)、Crohn氏病、强直性脊柱炎和各种炎性疾病过程的患者。
在另一个方面,可以施用一种或多种本发明的构建体(包括一种或多种抗原-结合构建体),或者与另一种本发明的抗体或抗原-结合构建体共同施用。一个实例是构建体,例如,本发明的抗原-结合构建体,其能结合CD20,后者与能结合CD22、CD19或其组合的构建体组合。该组合可以有效地用于治疗无痛和攻击形式的B-细胞淋巴瘤,和急性和慢性形式的淋巴细胞性白血病。参见,Goldberg的美国专利6,306,393。在另一个实例中,将本发明的构建体(包括抗原-结合构建体)与其他构建体共同施用,例如能辅助介导细胞凋亡的本发明的抗原-结合构建体。例如,能结合CD28、CD3、CD20或其组合的一种或多种构建体(包括一种或多种本发明的抗原-结合构建体)的组合。抗-CD28和CD3的组合,能提供延长增殖T-细胞的方法。参见,June等的美国专利号6,352,694。这种延长的T-细胞增殖,能增加免疫依赖性的细胞毒性效率,尤其是与抗-CD20有关的那些。
在另一个方面,可以施用本发明的构建体(包括抗原-结合构建体),或与一种或多种T-细胞调节分子共同施用。一个实例是与白细胞介素-12(IL-12)的组合。IL-12细胞因子能刺激细胞-介导的免疫,具有血管抑制(angiostatic)活性,且在许多肿瘤模型中具有显著的抗-肿瘤作用。还已经显示,IL-12能刺激干扰素-γ(IFN-γ)的生产。因此,预期当与IL-12组合共同施用时,用一种或多种本发明的构建体(包括一种或多种抗原-结合构建体,尤其是能结合CD20的那些)治疗多发性骨髓瘤患者,是更有效的。在另一个实例中,可以施用一种或多种本发明的构建体(包括一种或多种抗原-结合构建体),或与能结合CTLA-4的本发明其他蛋白的结合-结构域构建体共同施用,以通过抑制T-细胞激活的下调来增强抗-肿瘤免疫反应。
在另一个方面,可以将一种或多种本发明的构建体(包括一种或多种抗原-结合构建体)与基因治疗相组合。在一个实例中,施用化疗-缀合的本发明的构建体,或与Bcl-2反义寡核苷酸共同施用。Bcl-2与对抗-癌疗法的肿瘤抗性有关,且认为它能阻断化疗-诱导的细胞死亡。在另一个实例中,施用一种或多种本发明的构建体(包括一种或多种抗原-结合构建体),或与用于送递“自杀基因”的腺病毒共同施用。腺病毒能直接地将基因插入肿瘤细胞,这能使这些细胞对否则是无效的药物敏感。然后,药物治疗能破坏肿瘤细胞,同时使健康的细胞不受影响。但是,一旦完成了治疗,逃脱了治疗的杂散的癌细胞就可以重新建立和转移。将基因治疗和一种或多种构建体(包括一种或多种抗原-结合构建体)相组合,能辅助杀伤杂散的癌细胞,并使癌症复发最小化。
可以与治标的(非彻底的)手术使用类似的组合,以手术地去除肿瘤。在该实例中,可以在手术取出肿瘤之前和之后,施用一种或多种本发明的构建体(包括一种或多种抗原-结合构建体),以通过杀伤在手术过程中没有取出的所有癌细胞,来增加免疫反应和减少复发的可能性。
另一个方面是组合癌或抗原疫苗和T-细胞调节分子。例如,构建体的结合部分(例如,抗原-结合部分)可以是对癌细胞或抗原、或来自癌细胞或抗原的蛋白片段特异性的。这可以辅助介导针对特定肿瘤或抗原的免疫反应。这样的构建体可以与T-细胞调节剂相组合,以提高免疫反应的效率。
在另一个实例中,可以施用一种或多种本发明的构建体(包括一种或多种抗原-结合构建体),或与类视黄醇共同施用。类视黄醇包括维生素A和它的衍生物,其具有终止细胞分裂并使它们分化的能力。将维生素A与本发明的抗-癌构建体(包括抗原-结合构建体)组合,以抗击各种形式的癌症。
如本文所使用的,术语“结合构建体”和“抗原-结合构建体”可以指,例如,工程化的多肽、重组多肽、合成的、半合成的或能结合靶(例如,抗原)的其他融合蛋白。本发明的抗原-结合构建体可以用于各种用途,包括抗体或有关的免疫球蛋白-类构建体可以应用的多种用途中的那些。可以在体内和体外实验中,使用本发明的构建体(包括抗原-结合构建体),以用于治疗、诊断、研究和其他目的。这样的应用包括,例如,下述的。
构建体(包括本发明的抗原-结合构建体)可以用于免疫组织化学用途。例如,它们可以用于特定抗原或抗原组在组织中的免疫定位。可以固定组织,并与目标抗原-结合构建体一起温育。然后,使用偶联到标记(例如,金颗粒或能产生化学反应的酶,如辣根过氧化物酶或β-半乳糖苷酶)上的第二抗体或本发明的结合构建体,可以定位这些构建体。经常制备第二抗体或结合构建体,它对例如第一结合构建体的部分是反应性的。因而,例如,如果第一结合构建体具有人尾区部分,则第二抗体或结合构建体可以是,例如,已经被连接到β-半乳糖苷酶上的兔抗小鼠抗体或抗原-结合构建体。或者,可以纯化本发明的抗体或结合构建体,然后缀合到另一个分子上,以生产荧光抗体或结合构建体。
也可以使用本发明的构建体(包括抗原-结合构建体),使用例如免疫电子显微镜术,来检测细胞表面上的一种或多种抗原的定位,或检测细胞内的材料的定位。电子致密材料(例如铁蛋白或胶体金)可以缀合到抗原-结合构建体上。可以使用扫描电子显微镜术来检测抗原/结合构建体复合物的定位。
本发明的构建体(包括抗原-结合构建体)也可以用于定量一种或多种抗原的存在,其中使用许多免疫测定方式中的一种,例如,放射免疫测定(RIA)方式或酶联免疫吸附测定(ELISA)方式。这些方案存在许多变体,但是它们是基于类似的观点。例如,如果抗原可以结合固体支持体或表面,或在溶液中,则可以通过它与本发明的特异性的抗原-结合构建体的反应来检测。然后,可以利用它与例如本发明的第二抗体或第二种抗原-结合构建体的反应,通过将标记直接地整合进第一抗体,来检测或定量构建体的存在或量。或者,例如,本发明的抗原-结合多肽可以结合到固体表面上,并添加抗原。可以加入并检测能识别抗原上的不同表位的本发明的第二抗体或抗原-结合多肽。该技术通常称作“夹心测定法”,它常用于避免高背景或非-特异性的反应的问题,除了别的以外。
因为本发明的结合构建体可以具有对特定的一个或多个表位的高亲和力和/或选择性,所以它们也可以用作亲和试剂,例如,在蛋白或抗原纯化中。在这样的方法的一个实例中,将本发明的抗原-结合构建体固定化到合适的支持物上,例如,Sephadex树脂或滤纸。将固定化的构建体暴露于含有或怀疑含有靶蛋白或抗原的样品中。用能去除不希望的材料的合适的缓冲液,冲洗支持物。用能释放结合的蛋白或抗原的另一种缓冲液洗涤支持物。
因为本发明的具体的结合构建体可以高亲和力和选择性地结合蛋白或其他抗原,所以它们也可以用作特定酶或其他大分子在特定反应中的重要性的标准。如果本发明的抗原-结合构建体可以妨碍溶液中的反应,则这能表明该构建体可以特异性地结合蛋白或其他的参与该反应的抗原性的材料。
本发明的构建体(包括抗原-结合构建体)也可以用作受体阻断剂或抑制剂或拮抗剂。
本发明的构建体(包括抗原-结合构建体)也可以用于鉴别和研究蛋白的功能。如果本发明的抗原-结合构建体可以与特定蛋白反应,例如,该蛋白可以随后从例如溶液中沉淀出来。一般地,使用能将第一复合物连接到一起的本发明的第二抗体或抗原-结合构建体,进行沉淀。或者,通过使溶液与A蛋白,或者例如,取决于构建体,与抗-Fc抗体(例如,其已经附着到例如珠子上)反应,从而使其可以容易地从溶液中去除,可以去除复合物。
本发明的构建体(包括抗原-结合构建体)也可以与凝胶-移位实验结合使用,以鉴别特定的核酸-结合蛋白,例如DNA-结合蛋白。例如,通过它们以高亲和力结合特定寡核苷酸的能力,可以测定DNA-结合蛋白。与蛋白结合的寡核苷酸的迁移率明显不同于游离寡核苷酸的迁移率,并产生凝胶迁移模式和信号,这通常称作凝胶移位。向结合测定中添加构建体,可以具有2种作用中的任一种。如果构建体能结合不参与DNA结合的蛋白区域,则可以产生具有更慢的迁移率的复合物,并检测为更大的迁移率移位(超移位(supershift))。或者,如果构建体能结合参与识别DNA的蛋白区域,那么它可以破坏结合和消除移位。在任一种情况下,来自这些实验的数据可以用作鉴别例如DNA-结合蛋白的标准。
也可能通过例如SDS-PAGE分级分离后的蛋白印迹,使用本发明的构建体(包括抗原-结合构建体)来检测蛋白。一旦将分级分离的蛋白转移到膜(例如硝酸纤维素片)上,它们就会暴露于本发明的特定抗原-结合构建体,后者能特异性地识别或以理想的选择性程度识别固定化到印迹上的蛋白。这允许鉴别特定的蛋白。如果蛋白的迁移率在实验过程中发生变化,则该方法是特别有用的。例如,磷酸酯或碳水化合物的整合,或蛋白的切割,会导致迁移率的变化,这可以通过蛋白印迹分析直接进行。利用适当的对照,该方法可以用于测量在对实验操作的反应中的蛋白丰度。
SDS凝胶和免疫沉淀的组合也是非常有效的。如果特定的蛋白可以在溶液中免疫沉淀,则可以在SDS凝胶上分离上清液和沉淀的级分,并使用本发明的抗原-结合构建体进行研究。
有时,针对一种蛋白的本发明的结合构建体也能沉淀能与第一种蛋白相互作用的第二种蛋白。然后,通过凝胶染色或通过放射自显影,可以观察第二种蛋白以及第一种。该关系经常是蛋白起复合物的一部分的功能的第一个迹象,且它也可以用于证实2种蛋白的物理相互作用,在其他证据的基础(例如,双杂交筛选或抑制基因突变)上,猜想所述蛋白能相互作用。该方法可以以几种非常有效的方式与蛋白印迹分析相组合。
因而,例如,在例如信号转导和蛋白加工的研究中,本发明的抗原-结合构建体可以与免疫沉淀和蛋白印迹分析相组合。例如,使用能结合蛋白的本发明的不同的抗体或抗原-结合构建体,通过蛋白印迹分析,可以随后研究免疫沉淀的蛋白。其中最有用的是,针对可能存在于蛋白中的特定结构决定簇的那些。因而,针对能经历蛋白水解加工的蛋白区域的本发明的抗体或抗原-结合构建体,可以有用地进行蛋白水解加工。另外,本发明的构建体或能识别磷酸化的肽的本发明的抗原-结合构建体(例如,抗PY(磷酸化的酪氨酸)的混合物,可以在沉淀后用于研究蛋白的磷酸化程度(使用蛋白印迹分析),反之亦然。通过针对碳水化合物表位的本发明的抗原-结合构建体(或通过凝集素,即,能识别碳水化合物的蛋白),也可以进行糖基化作用反应。同样地,可以制备一些本发明的抗原-结合构建体,其能特异性地识别磷酸化的表位,例如,其能识别磷酸化后的酪氨酸或丝氨酸残基,但是不能结合(或可检测到地结合)没有磷酸酯的表位。该方法可以用于测定特定蛋白的磷酸化状态。例如,通过能以依赖于丝氨酸133的磷酸化的方式特异性地识别表位的抗体,可以检测CREB(cAMP反应元件结合蛋白)的磷酸化。
本发明的构建体(包括抗原-结合构建体)也可以用于筛选表达文库,以分离能表达或存在特定表位、或具有特定亲和力或表达特征的候选多核苷酸。
能结合细胞表面的本发明的构建体(包括抗原-结合构建体)也可以用作标记,以使用流式细胞计定量能表达该标记的细胞级分。如果使用例如,本发明的不同的抗原结合构建体/荧光染料组合,则可以测定能表达几种抗原的细胞级分。
其功能类似于抗-独特型抗体(即,针对另一种抗体的结合结构域的抗体)的本发明的构建体(包括抗原-结合构建体),可以用于许多方法中,其中需要或有用地模仿抗原的结构。这样的应用包括,例如,用作癌症疫苗(包括能整合分子佐剂的本发明的抗原-结合构建体)、作为受体的探针、作为受体激动剂、作为受体拮抗剂、作为受体阻断剂或抑制剂等。
在另一个方面,本发明的构建体(包括抗原-结合构建体)可以是双特异性的,因而能结合2个不同的表位,后者可以存在于相同的或不同的细胞类型中。
本发明的构建体(包括抗原-结合构建体)的体内应用包括单独的或与一种或多种其他治疗相组合的治疗,用于各种疾病,包括癌症及B-细胞障碍包括自身免疫病。在一些情况下,将本发明的构建体施用给患者。在其他的情况下,通过本领域已知的技术,可以使构建体偶联另一种分子,例如,用于辅助靶成像的荧光分子,或治疗性药物和/或用于辅助杀伤靶的毒素。
例如,可以将标记分子或原子缀合或另外连接到本发明的抗原-结合构建体上,以辅助成像或用作诊断试剂。它们包括,但不限于,酶标记、放射性同位素或放射性的化合物或元素、荧光化合物或金属、化学发光的化合物和生物发光的化合物。因而,本发明的结合构建体或抗原-结合构建体可以缀合药物,其允许特异性的药物靶向和药物达到靶后的高效率。这能促进药物治疗,同时减少全身的毒性和副作用。这允许使用否则在全身施用时不可接受的药物。剂量依赖于药物的效力和载体构建体的效率。体内应用的其他实例包括使用本发明的结合构建体或抗原-结合构建体,其中将毒素化学地连接或缀合到本发明的多肽上,以形成例如可以称作“免疫缀合物”或“免疫毒素”的分子。一般,例如,这样的毒素可以包括一种或多种放射性同位素(例如,碘-131、钇-90、铼-186、铜-67和/或Bishmuth-212)、天然毒素、化疗剂、生物反应调节剂或能辅助破坏或杀伤靶细胞、抑制靶细胞复制、或能有效地破坏靶细胞中的需要的细胞功能的任何其他物质。
免疫毒素的毒素部分可以源自各种来源。毒素通常源自植物或细菌,但是也可以使用例如人源的毒素或合成的毒素。源自细菌或植物的毒素的实例包括,但不限于,相思豆毒蛋白、α-帚曲菌素、白喉毒素、篦麻毒蛋白、皂草素和假单胞菌外毒素。哺乳动物酶的实例包括,但不限于,核糖核酸酶(RNA酶)和脱氧核糖核酸酶。本领域已经描述了许多可以与一种或多种本发明的构建体一起使用的免疫毒素。参见,例如,Frankel等的美国专利号4,753,894;Pastan等的美国专利号6,099,842;Nevelle,等,1982 Immunol Rev.62:75-91;Pastan等,1992 Ann Rev Biochem 61:331-354;Chaudary等,1989Nature 339:394;和Batra等,1991 Mol.Cell.Biol.11:2200。本文所述的修饰的毒素和在各种出版物中描述的那些,也在本发明的范围内。
通常,以能治疗上有效地治疗或预防特定疾病、障碍或状况的浓度,施用本发明的免疫毒素和其他治疗剂,例如用于治疗肿瘤和恶性肿瘤,治疗自身免疫病,变态反应和炎症等。该有效剂量和施用模式取决于待治疗的动物或患者、待治疗的疾病或状况、免疫缀合物或免疫毒素的强度和缀合物的效率。为了实现该目的,可以使用许多本领域已知的可接受的制剂和赋形剂,来配制免疫毒素。一般地,例如,通过静脉内的或腹膜内的注射来施用免疫毒素。实现该施用的方法,是本领域的普通技术人员已知的。在另一方面,本发明包括局部地或经口地施用的组合物,例如气溶胶或乳膏或贴剂,其能穿透粘膜。
在施用给待治疗的患者之前,可以向本发明的免疫缀合物或免疫毒素加入制剂(Formulant)。液体制剂是最常见的,但是其他的制剂也在本发明的范围内。制剂可以包括例如油、聚合物、维生素、碳水化合物、氨基酸、盐、缓冲剂、清蛋白、表面活性剂或填充剂。碳水化合物可以包括糖或糖醇例如单、二或多糖,或水-可溶的葡聚糖。糖或葡聚糖可以包括例如果糖、右旋糖、乳糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖、木糖、麦芽糖、蔗糖、葡聚糖、支链淀粉、糊精、α和β环糊精、可溶的淀粉、羟乙基淀粉和羧甲基纤维素或其混合物。“糖醇”可以定义为具有-OH基团的C4-C8烃,且包括,例如,半乳糖醇、肌醇、甘露糖醇、木糖醇、山梨糖醇、甘油和阿拉伯糖醇。可以单独地或组合地使用上面提到的这些糖或糖醇。对用量没有固定的限制,只要糖或糖醇可溶于水制剂中即可。在一个方面,糖或糖醇浓度是0.5w/v%至15w/v%,一般地1.0w/v%至7.0w/v%,更一般地2.0至6.0w/v%。
氨基酸的实例包括左旋(L)形式的camitine、精氨酸和甜菜碱;但是,也可以加入其他的氨基酸。常用的聚合物包括平均分子量为例如2,000至3,000的聚乙烯吡咯烷酮(PVP),或平均分子量为例如3,000至5,000的聚乙二醇(PEG)。可以在组合物中使用缓冲剂,以使冻干之前或重配之后的溶液中的pH变化最小化。可以使用任意的生理缓冲液,但是更常用柠檬酸盐、磷酸盐、琥珀酸盐和谷氨酸盐缓冲液或其混合物。浓度可以是例如约0.01至0.3摩尔。可以使用更高或更低的浓度。
通过共价缀合聚合物,可以化学地修饰本发明的免疫毒素,以增加例如它们的循环半衰期。使它们附着肽的示例性的聚合物和方法,参见Katre等的美国专利号4,766,106;Davis等的4,179,337;Shimizu等的4,495,285;和Hiratani的4,609,546。
以下实施例是用于举例而不是限制的。
实施例1
2H7可变区的克隆和2H7scFv-Ig的构建以及测序
本实施例说明了能编码单克隆抗体2H7的重链和轻链可变区的cDNA分子的克隆。本实施例也证明了2H7scFv-Ig的构建、测序和表达。
在收获之前,使能表达特异性地结合CD20的2H7单克隆抗体的细胞在RPMI 1640培养基(Invitrogen/Life Technologies,Gaithersburg,MD)中在对数期生长几天,该培养基补加了谷氨酰胺、丙酮酸盐、DMEM非-必需氨基酸和青霉素-链霉素。通过离心,从培养基中沉淀细胞,并使用2x107细胞制备RNA。使用Pharmingen(SanDiego,CA)总RNA分离试剂盒(目录号45520K),根据试剂盒所附制造商的说明书,从能生产2H7的杂交瘤细胞分离RNA。用1微克(μg)总RNA作为模板,通过逆转录制备cDNA。合并RNA和300ng随机引物,并在加入酶之前,在72℃变性10分钟。在5X第二条链缓冲液和随酶提供的0.1M DTT存在下,以25μl的总体积向RNA和引物的混合物中加入Superscript II逆转录酶(Life Technologies)。使逆转录反应在42℃下进行1小时。
使用在随机引发的逆转录酶反应中生产的2H7 cDNA和V区特异性的引物,通过PCR扩增2H7抗体的轻链和重链可变区。使用公开的序列(VL为Genbank登记号M17954,VH为M17953)为指导,设计了V区特异性的引物。将两个可变链设计为具有相容的末端序列,从而可以通过在扩增和限制酶消化后连接两个V区,来组装scFv。
通过向2H7的VL的反义引物加入其他的核苷酸,整合要插入到两个V区之间的(Gly4Ser)3肽接头。也在两个V区的接合处导入Sac I限制位点。用于扩增包含HindIII限制位点和轻链前导肽的2H7 VL的有义引物为5′-gtc
Figure GA20180477200380110470301D01571
gcc gcc atg gat ttt caa gtg cag attttt cag c-3′(SEQ ID NO:530)。反义引物为5′-gtc gtcccacct cct cca gat cca cca ccg ccc gag cca ccg cca cct ttc agctcc agc ttg gtc cc-3′(SEQ ID NO:531)。V区的读框表示为粗体的、加下划线的密码子。Hind III和SacI位点表示为加下划线的斜体序列。
对VH结构域进行扩增,其没有前导肽,但包含用于融合VL的5′SacI限制位点和用于融合各种尾的位于3’末端的BclI限制位点,包括人IgG1 Fc结构域和截短形式的CD40配体CD154。有义引物为5′-gct gct
Figure GA20180477200380110470301D01581
tca ggc tta tct aca gca agt ctg g-3′(SEQID NO:532)。SacI位点表示为斜体且加下划线的字体,而VH结构域的第一个氨基酸的密码子的读框表示为粗体且加下划线的字体。反义引物为5′-gtt gtc
Figure GA20180477200380110470301D01582
gag acg gtg acc gtg gtc cc-3′(SEQID NO:533)。BclI位点表示为斜体且加下划线的字体,而VH结构域序列的最后一个丝氨酸表示为粗体且加下划线的字体。
通过将2H7 scFv HindIII-BclI片段插入到含人IgG1铰链区、CH2和CH3区的用限制酶HindIII和BclI消化的pUC19中,组装scFv-Ig。连接后,将连接产物转化到DH5α细菌中。使用位于2H7的VL-VH结合处的SacI位点作为诊断位点,筛选阳性克隆的适当地插入的片段。使2H7scFv-Ig cDNA在PE 9700热循环仪上进行循环测序,其中采用25个循环的程序,在96℃变性10秒,在50℃退火30秒,并在72℃延伸4分钟。测序引物是pUC正向和反向引物,和退火至IgG恒定区部分中的人CH2结构域的内部引物。用Big Dye TerminatorReady测序混合物(PE Applied Biosystems,Foster City,CA),根据制造商的说明书进行测序反应。随后用Centrisep柱(目录号CS-901,Princeton Separations,Adelphia,N.J.)纯化样品,在Savant真空干燥器中干燥洗脱物,在模板抑制试剂(PE-ABI)中变性,并且在ABI 310基因分析仪(PE-Applied Biosystems)上分析。用Vector Nti 6.0版(Informax,North Bethesda,MD)编辑、翻译和分析序列。图1显示了2H7 scFv-Ig构建体的cDNA和推测的氨基酸序列。
实施例2
2H7 scFv-Ig在稳定的CHO细胞系中的表达
本实施例说明2H7scFv-Ig在真核细胞系中的表达,以及通过SDS-PAGE和功能测定(包括ADCC和补体固定)表征表达的2H7scFv-Ig。
将具有正确序列的2H7 scFv-Ig HindIII-XbaI(约1.6kb)片段插入哺乳动物表达载体pD18,用QIAGEN质粒制备试剂盒(QIAGEN,Valencia,CA)扩增阳性克隆的DNA。然后在非必需区,通过用AscI消化,将重组质粒DNA(100μg)线性化,通过酚提取进行纯化,并重新悬浮于组织培养基Excell 302(目录号14312-79P,JRHBiosciences,Lenexa,KS)中。使用于转染的细胞CHO DG44细胞保持在对数生长,每个转染反应收获107个细胞。将线性化的DNA加入0.8ml总体积的CHO细胞,以用于电穿孔。
通过将可选择的、可扩增的质粒pD18电穿孔进中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中,来完成2H7 scFv-Ig融合蛋白(SEQ.ID NO:10)的稳定生产,该质粒pD18含有在CMV启动子控制下的2H7 scFv-Ig cDNA(所有细胞系都从美国典型培养物保藏中心,Manassas,VA得到,除非另有说明)。将2H7表达盒作为约1.6kb的HindIII-XbaI片段,亚克隆至CMV启动子下游的载体多克隆位点中。pD18载体是pcDNA3的修饰形式,其能编码具有减弱的启动子的DHFR选择标记,以增加质粒的选择压力。用Qiagen maxiprep试剂盒制备了质粒DNA,然后在酚提取和乙醇沉淀之前在独特的AscI位点线性化纯化的质粒。将鲑精DNA(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)作为载体DNA加入,并用100μg每种质粒和载体DNA通过电穿孔转染107个CHO DG44细胞。在含有谷氨酰胺(4mM)、丙酮酸盐、重组胰岛素、青霉素-链霉素和2X DMEM非必需氨基酸(均来自Life Technologies,Gaithersburg,Maryland)的Excell 302培养基(JRH Biosciences,此后称作“Excell302完全”培养基)中,使细胞生长至对数期,用于未转染的细胞的培养基也含有HT(从次黄嘌呤和胸苷的100X溶液稀释)(Invitrogen/Life Technologies)。用于在选择下转染的培养基含有各种水平的作为选择试剂的氨甲蝶呤(Sigma-Aldrich),其水平为50nM-5μM。在275伏特、950μF下进行电穿孔。允许转染的细胞在非选择性培养基中回收过夜,然后在96孔平底板(Costar)中,以125细胞/孔-2000细胞/孔的各种系列稀释,进行选择性铺板。用于细胞克隆的培养基是Excell 302完全培养基,其含有100nM氨甲蝶呤。一旦克隆生长足够,则筛选来自主孔的培养物上清液的系列稀释液与CD20-CHO转染细胞的结合。将具有最高融合蛋白生产的克隆扩增至T25烧瓶,然后扩增至T75烧瓶中,以提供足够数目的细胞,用于冷冻和按比例放大2H7scFvIg的生产。通过在含氨甲蝶呤的培养基中逐步扩增,在三个克隆的培养物中进一步提高了生产水平。在细胞的每个连续传代中,Excell 302完全培养基含有增高浓度的氨甲蝶呤,这样只有扩增了DHFR质粒的细胞可以存活。
从能表达2H7scFv-Ig的CHO细胞收集上清液,通过0.2μm PES高速过滤器(Nalgene,Rochester,NY)进行过滤,然后通过A蛋白-琼脂糖(IPA 300交联琼脂糖)柱(Repligen,Needham,MA)。用PBS洗涤柱,然后用pH 3.0的0.1M柠檬酸盐缓冲液洗脱结合的蛋白。收集级分,并用1M Tris,pH 8.0中和洗脱的蛋白,然后在PBS中透析过夜。通过280nm处的吸光度,测定纯化的2H7scFv-Ig的浓度。用Vector Nti 6.0版软件包(Informax,North Bethesda,MD)中的蛋白分析工具,测定出1.77的消光系数。该程序使用氨基酸组合物数据,来计算消光系数。
通过流式细胞计,分析转染的稳定的CHO细胞的2H7scFv-Ig的生产水平。使CHO细胞的纯化的2H7scFv-Ig与能表达CD20的CHO细胞(CD20 CHO)结合,并且使用荧光素-缀合的抗-人IgG第二步骤试剂(目录号H10101和H10501,CalTag,Burlingame,CA),进行流式细胞计分析。图2(上)显示了通过滴定2H7scFv-Ig与CD20 CHO的结合生产的标准曲线。在2H7scFv-Ig的每一个浓度下,表示出了以线性单位表示的荧光素信号平均亮度。然后使从含有能表达2H7scFv-Ig的稳定的CHO细胞克隆的T烧瓶中收集上清液与CD20 CHO结合,并通过流式细胞计分析结合。测量由上清液中含有的2H7scFv-Ig生产的荧光素信号,并从标准曲线计算上清液中的2H7scFv-Ig浓度(图2,下)。
通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,分析了纯化的2H7scFv-Ig。在没有二硫键还原的SDS样品缓冲液中,煮沸通过独立的A蛋白琼脂糖柱纯化的2H7scFv-Ig样品,并应用于SDS 10% Tris-BIS凝胶(目录号NP0301,Novex,Carlsbad,CA)。将20微克每种纯化的批次加载到凝胶上。电泳后,通过考马斯蓝染色(Pierce Gel Code Blue StainReagent,目录号24590,Pierce,Rockford,IL)使蛋白显色,并在蒸馏水中脱色。在相同的凝胶上包含分子量标记(KaleidoscopePrestained Standards,目录号161-0324,Bio-Rad,Hercules,CA)。结果表示于图3。泳道上的数字表示独立的纯化批次。以千道尔顿表示的大小标记的分子量表示在图的左侧。用替代样品制备条件进行的其他实验表明,通过在含有DTT或2-巯基乙醇的SDS样品缓冲液中煮沸蛋白而进行的二硫键的还原,会导致2H7scFv-Ig聚集。
用本领域众所周知的常规测定,可以监控任何数目其他的免疫参数。它们可以包括,例如,依赖抗体的细胞介导细胞毒性(ADCC)测定、第二体外抗体反应、使用确立的标记抗原系统的多种外周血或淋巴单核细胞亚群的流式免疫细胞荧光测定分析、免疫组织化学或其他相关测定。这些和其他测定可以参见,例如Rose等.(编),Manual ofClinical Laboratory Immunology,5th Ed.,1997 American Societyof Microbiology,Washington,DC。
用B细胞系Ramos和Bjab,检测在补体存在下,2H7scFv-Ig杀伤CD20阳性细胞的能力。在测定中,使用最终稀度为1/10的兔补体(Pel Freez,Rogers,AK)。用B细胞和补体在37℃下将纯化的2H7scFv-Ig温育45分钟,然后通过锥虫蓝排除计数活细胞和死细胞。图4A的结果表明,在兔补体存在下,2H7scFv-Ig能裂解表达CD20的B细胞。
通过在4小时测定中使用100∶1的PBMC与Bjab细胞比率,测量51Cr从标记的Bjab细胞的释放,来检验2H7scFv-Ig在有外周血单核细胞(PBMC)存在的情况下杀伤CD20阳性细胞的能力。图4B所示结果表明,2H7scFv-Ig可以介导依赖抗体的细胞毒性(ADCC),因为在有PBMC和2H7scFv-Ig存在的情况下的51Cr释放高于PBMC或2H7scFv-Ig单独存在下的51Cr释放。
实施例3
CD20和CD40的同时连接对正常的B细胞的生长的作用,以及对CD95表达和细胞凋亡的诱导的作用
本实施例说明了在细胞表面上表达的CD20和CD40的交联对细胞增殖的作用。
通过Percoll分级梯度,从人扁桃体分离了密集的静止B细胞,并通过E花结(E-rosetting)去除T细胞。在4-天实验的最后12个小时期间,通过3[H]-胸苷的摄取,测量了静止的、密集的扁桃体B细胞的增殖。在一式四份培养物中测量增殖,平均值和标准差如所示的。使用单独的或与抗-鼠κ单克隆抗体187.1(抗-CD20XL)交联的鼠抗-人CD20单克隆抗体1F5(抗-CD20)。使用与鼠CD8(CD154)(Hollenbaugh等.,EMBO J 11:4212-21(1992))融合的可溶的人CD154完成了CD40激活,并使用抗-鼠CD8单克隆抗体53-6(CD154XL)完成了CD40交联。该程序允许细胞表面上的CD20和CD40的同时交联。结果见图5。
检验了CD20和CD40交联对Ramos细胞(一种B淋巴瘤细胞系)的作用。使用能特异性地结合CD20(1F5)和CD40(G28-5)的鼠单克隆抗体,分析了处理(无山羊抗小鼠IgG(GAM))和/或交联(+GAM)后18小时的Ramos细胞的CD95(Fas)表达和细胞凋亡百分比。用对CD3特异性的非结合同种型对照(64.1)处理了对照细胞。
收获处理后的Ramos细胞,与FITC-抗-CD95温育,并且进行流式细胞计分析,以测定CD20或CD40交联后Fas在细胞表面上的相对表达水平。将数据作图为用指出的刺激处理后细胞的平均荧光(图6A)。
收获来自相同实验的处理后的Ramos细胞,并测量膜联蛋白V的结合,以指示在处理的培养物中的细胞凋亡百分比。使用1F5和G28-5交联CD20和CD40以及随后与GAM交联后18小时的膜联蛋白V的结合,测量细胞凋亡。使用FITC-膜联蛋白V试剂盒(目录号PN-IM2376,Immunotech,Marseille,法国),测量膜联蛋白V的结合。已知膜联蛋白V结合是细胞发展为细胞凋亡中的早期事件。细胞凋亡,或程序性细胞死亡,是以通过自杀导致细胞死亡的分解代谢反应级联为特征的过程。在细胞凋亡的早期阶段中,在细胞改变形态和水解DNA之前,能保持细胞膜的完整性,但是细胞失去了它们的膜磷脂的不对称性,暴露了带负电的磷脂,例如细胞表面的磷脂酰丝氨酸。膜联蛋白V,即一种钙和磷脂结合蛋白,能优先结合磷脂酰丝氨酸,并且对其有高亲和力。能证明CD20和CD40的交联对FAS受体(CD95)表达的作用的结果表示于图6B。CD20和CD40的交联对膜联蛋白V与细胞的结合的作用见图6B。
实施例4
2H7 ScFv-CD 154融合蛋白的构建和表征
为了构建能够结合CD20和CD40二者的分子,将能编码2H7 scFv的cDNA与能编码CD154(即CD40配体)的cDNA相融合。从2H7 scFvIg构建体取出在HindIII-BclI片段上编码的2H7 scFv cDNA,与能编码人CD154的胞外结构域的BamHI-XbaI cDNA片段一起插入pD18载体。在CD154的羧基末端编码胞外结构域,其与其他II型膜蛋白相似。
使用用随机引物和来自于用PHA(植物凝集素)激活的人T淋巴细胞的RNA产生的cDNA,对人CD154的胞外结构域进行PCR扩增。引物组包括两个不同的5’或有义引物,它们在CD154的胞外结构域中的两个不同位置产生融合接合处。设计了两种不同的融合接合处,其能产生包含CD154的胞外结构域的氨基酸108(Glu)-261(Leu)+(Glu)的短或截短形式(S4形),以及包含CD154的胞外结构域的氨基酸48(Arg)-261(Leu)+(Glu)的长或完全形式(L2形),它们都构建为BamHI-XbaI片段。能将两种不同的截短的胞外结构域融合到2H7scFv的有义引物包括用于克隆的BamHI位点。CD154 cDNA的S4形的有义引物命名为SEQUENCE ID NO:535或CD154BAM108,并且能编码具有以下序列的34聚体:5′-gtt gtc gga tcc aga aaa cag ctttga aat gca a-3′,而反义引物命名为SEQUENCE ID NO:536或CD154XBA,并且能编码具有以下序列的44聚体:5′-gtt gtt tct agatta tca ctc gag ttt gag taa gcc aaa gga cg-3′(SEQ ID NO:536)。
用于扩增能编码氨基酸48(Arg)-261(Leu)+(Glu)的CD154胞外结构域的长形式(L2)的寡核苷酸引物如下:命名为CD154 BAM48(SEQUENCE ID NO:537)的有义引物,其能编码具有以下序列的35聚体:5′-gtt gtc gga tcc aag aag gtt gga caa gat aga ag-3′。命名为CD154XBA(SEQUENCE ID NO:538)的反义引物,其能编码44聚体:5′-gtt gtt tct aga tta tca ctc gag ttt gag taa gcc aaagga cg-3′。其他的PCR反应条件与用于扩增2H7 scFv的条件相同(见实施例1)。用PCR快速试剂盒(QIAGEN,San Diego,CA)纯化了PCR片段,在30μl ddH2O中洗脱,然后用BamHI和XbaI(Roche)限制性内切核酸酶在37℃下以40μl的反应体积消化3小时。凝胶纯化片段,根据制造商的说明书(QIAGEN),用QIAEX试剂盒纯化,并且与2H7HindIII-BclI片段一起连接到用HindIII+XbaI消化的pD18表达载体中。将连接反应物转化到DH5-α化学感受态的细菌中,并且铺平板在含100μg/ml氨苄青霉素的LB平板上。使转化体在37℃生长过夜,并用分离的菌落接种含100μg/ml氨苄青霉素的Luria培养液中的3ml液体培养物。小量质粒制备(QIAGEN)后,筛选用于插入2H7scFv和CD154胞外结构域片段的克隆。
在PE 9700热循环仪上,使用25个循环的程序,包括在96℃变性10秒,在50℃退火5秒,和在60℃延伸4分钟,对2H7scFv-CD154构建体cDNA进行循环测序。使用的测序引物为pD18正向(SEQ IDNO:539:5′-gtctatataagcagagctctggc-3′)和pD18反向(SEQ IDNO:540:5′-cgaggctgatcagcgagctctagca-3′)引物。此外,使用了与人CD154序列(SEQ ID NO:5415′-ccgcaatttgaggattctgatcacc-3′)具有同源性的内部引物。测序反应包含3.2pmol的引物,约200ng DNA模板,以及8μl测序混合物。使用Big Dye Terminator Ready测序混合物(PE-Applied Biosystems,Foster City,CA),根据制造商的说明书,进行测序反应。随后,用Centrisep柱(Princeton Separations,Adelphia,NJ)纯化样品。在Savant快速真空干燥器中干燥洗脱物,在95℃下在20μl模板抑制试剂(ABI)中变性2分钟,并且在ABI 310基因分析仪(PE-AppliedBiosystems)上分析。使用Vector Nti 6.0版(Informax,NorthBethesda,MD)编辑、翻译和分析序列。2H7scFv-CD 154 L2 cDNA序列和预测的氨基酸序列见图7A,且2H7scFv-CD154 S4 cDNA序列和预测的氨基酸序列见图7B。
通过流式细胞计,测定了2H7 scFv-CD154融合蛋白(SEQ.IDNOs:691693)与CD20和CD40的同时结合活性。该测定使用能表达CD20的CHO细胞靶。CD20 CHO细胞与2H7 scFv-CD154表达质粒转染的细胞的上清液温育45分钟后,洗涤CD20 CHO细胞两次,并与PBS/2%FBS中的生物素-缀合的CD40-Ig融合蛋白温育。45分钟后,洗涤细胞两次,并与1∶100溶于PBS/2% FBS的藻红蛋白(PE)标记的链霉抗生物素蛋白(Molecular Probes,Eugene OR)进行温育。另外温育30分钟后,洗涤细胞两次,并通过流式细胞计进行分析。结果表明,2H7 scFv-CD154分子能够结合细胞表面上的CD20,并从溶液中捕获生物素-缀合的CD40(图8)。
为了确定2H7scFv-CD154对B淋巴瘤和类淋巴母细胞系的生长和生存力的作用,使细胞与2H7scFv-CD154 L2(SEQ.ID NO:691)温育12小时,然后检验膜联蛋白V的结合。使用FITC-膜联蛋白V试剂盒(Immunotech,Marseille,法国,目录号PN-IM2376),测量了膜联蛋白V的结合。用来自能表达分泌形式的2H7scFv-CD 154融合蛋白的细胞的浓缩的、透析的上清液的稀释液,在1ml培养物中温育B细胞系。结果表示在图9中。
通过24-小时培养的最后6小时的3H-胸苷摄取,检验了在2H7scFv-CD154存在下Ramos B淋巴瘤细胞系的生长速度。2H7scFv-CD154对细胞增殖的作用见图10。
实施例5
CytoxB抗体衍生物的构建和表征
使用2H7 scFv-IgG多肽,制备了CytoxB抗体。通过改变的铰链结构域(见图11),将2H7 scFv(见实施例1)连接于人IgG1 Fc结构域。通过定点诱变和本领域已知的其他方法,用丝氨酸残基取代铰链区的半胱氨酸残基。将突变的铰链融合到野生型Fc结构域,以生产一种命名为CytoxB-MHWTG1C的构建体,或融合于在CH2结构域中导入了其他突变的突变Fc结构域(CytoxB-MHMG1C)。与效应子功能有关的CH2中的氨基酸残基见图11。这些残基中的一个或多个的突变,可以减少FcR结合和效应子功能的介导。在此实施例中,在2H7 scFv融合蛋白CytoxB-[MG1H/MG1C]中,对本领域已知对Fc受体结合具有重要性的亮氨酸残基234进行了突变。在另一构建体中,用人IgA铰链的一部分取代了人IgG1铰链区,该部分与野生型人Fc结构域融合(CytoxB-IgAHWTHG1C)(见图11)。该突变的铰链区允许表达能保持人IgG1CH2和CH3结构域的功能性质的单体和二聚体分子混合物。根据实施例2中描述的方法,构建了用于这些分子的合成的重组cDNA表达盒,并在CHODG44细胞中表达了多肽。
根据实施例2中描述的方法,通过SDS-PAGE分析了CytoxB-scFvIg分子的纯化的融合蛋白衍生物。在非还原和还原条件下,进行了聚丙烯酰胺凝胶电泳。在每种凝胶上,加载两种不同的分子量标记组,BioRad预染色的标记(BioRad,Hercules,CA)和NovexMultimark分子量标记。不同构建体和利妥希玛TM的迁移模式见图12。
用Bjab B淋巴瘤细胞作为靶,并用新制备的人PBMC作为效应细胞,测量了CytoxB-scFvIg分子的不同衍生物介导ADCC的能力(见实施例2)。效应物与靶的比率变化如下:70∶1、35∶1和18∶1,其中每孔的Bjab细胞数保持恒定,但PBMC的数目不同。用51Cr标记Bjab细胞2小时,以5×104细胞/孔的细胞密度,等分试样至平底96孔板的每个孔中。以10μg/ml的浓度,将纯化的融合蛋白或利妥希玛加入PBMC的各种稀释液。在不添加PBMC或融合蛋白的情况下,测量自发的释放,并通过向适当的孔中加入去污剂(1%NP-40),来测量最大释放。将反应物温育4小时,并将100μl培养物上清液收获至Lumaplate(Packard Instruments),并干燥过夜,然后计数释放的cpm。结果见图13。
也测量了CytoxB衍生物的依赖补体的细胞毒性(CDC)活性。基本按实施例2中的描述进行反应。结果见图14,表示为每个融合蛋白浓度下死细胞与总细胞的百分比。
实施例6
在猕猴中进行的体内研究
已经在非人灵长类动物中进行了CytoxB衍生物的初步体内研究。图15显示了能表征CytoxB在猴中的血清半衰期的数据。在箭标所示日,给每只猴子施用6mg/kg的剂量后,对从两只不同的猕猴(J99231和K99334)获得的血清样品进行测量。对于每种样品,通过与标准曲线进行比较,评估了存在的2H7scFvIg水平,该标准曲线由纯化的CytoxB-(MHWTG1C)-Ig融合蛋白与CD20 CHO细胞的结合产生(见实施例2)。数据概括于图15的下部。
研究了CytoxB-(MHWTG1C)Ig融合蛋白对猕猴中的循环CD40+细胞的水平的作用。在图16所示的每一天进行全血细胞计数。此外,使用CD40特异性的荧光素-缀合的抗体,对外周血淋巴细胞进行FACS(荧光激活细胞分选仪)测定,以检测细胞群中的B细胞。然后用阳性细胞百分比,计算原始样品中的B细胞数。将数据作图为注射后的指定日测量的千B细胞数/微升血液(图16)。
实施例7
抗-CD19 scFv-Ig融合蛋白的构建和表达
根据实施例1、2和5描述的方法以及本领域的标准,构建了抗-CD19 scFv-Ig融合蛋白,将其转染到真核细胞中,并进行表达。从分离自能生产抗体HD37的杂交瘤细胞的RNA,克隆了重链可变区和轻链可变区,该抗体HD37能特异性地结合CD19。测量了HD37scFv-IgAHWTG1C和HD37scFv-IgMHWTG1C的表达水平,并与用纯化的HD37 scFvIg产生的标准曲线相比较,结果见图17。
实施例8
抗-L6 scFv-Ig融合蛋白的构建和表达
用源自抗癌单克隆抗体(即L6)的可变区,构建了scFv-Ig融合蛋白。根据实施例1、2和5描述的方法以及本领域的标准,构建了融合蛋白,将其转染至真核细胞中,并且进行表达。测量了L6scFv-IgAH WCH2 CH3和L6 scFv-(SSS-S)H WCH2 WCH3的表达水平,并且与用纯化的L6 scFvIg产生的标准曲线相比较,结果见图18。
实施例9
多种scFv-Ig融合蛋白的表征
除已经描述的scFv-Ig融合蛋白以外,基本按实施例1和5的描述,制备了G28-1(抗CD37)scFv-Ig融合蛋白。根据本领域已知的方法,克隆了重链和轻链可变区。根据上述方法(见实施例2),确定了2H7-MHWTG1C、2H7-IgAHWTG1C、G28-1-MHWTG1C、G28-1IgAHWTG1C、HD37-MHWTG1C和HD37-IgAHWTG1C的ADCC活性。结果见图19。用2981人肺癌细胞系,测量了L6scFv-IgAHWTG1C和L6scFv-IgMHWTG1C的ADCC活性。结果见图20。已知鼠L6单克隆抗体不能表现出ADCC活性。
在还原和非还原条件下,通过SDS-PAGE分析了纯化的蛋白。基本按实施例2和5的描述,制备了样品,并进行凝胶电泳。L6和2H7scFv-Ig融合蛋白的结果见图21,而G28-1和HD37 scFv-Ig融合蛋白的结果见图22。
实施例10
抗-CD20 scFv-美洲驼Ig融合蛋白的构建和表达
本实施例说明了美洲驼IgG1、IgG2和IgG3恒定区结构域的克隆,和用3种恒定区中的每一个和抗-CD20 scFv构建免疫球蛋白融合蛋白。
克隆了美洲驼IgG1、IgG2和IgG3免疫球蛋白的恒定区,并插入含有抗-CD20单链Fv(2H7 scFv)的哺乳动物载体构建体中。根据生产商的说明书,通过在TRIzol
Figure GA20180477200380110470301D01681
(Invitrogen Life Technologies,Carlsbad,CA)中溶解淋巴细胞,从来自美洲驼血液(Triple J Farms,Bellingham,WA)的外周血单核细胞(PBMC)中,分离了总RNA。将1微克(1μg)总RNA用作通过逆转录制备cDNA的模板。合并RNA和200ng随机引物,并在72℃变性10分钟,然后加入酶。在5X第二条链缓冲液和随酶提供的0.1M DTT存在下,以25μl的总体积向RNA加引物的混合物中加入Superscript II逆转录酶(Invitrogen LifeTechnologies)。使逆转录反应在42℃下进行1小时。使用序列特异性的引物,通过PCR扩增cDNA。根据公开的序列,为骆驼科动物的VHH和VH结构域设计了5′引物。使用哺乳动物CH3结构域序列作为向导,设计了用于扩增所有3种同种型的3′引物。使用了下面的特异性的引物。用加下划线的斜体序列,标示了Bcl和XbaI位点。
美洲驼IgG1恒定区的5′引物
LLG1-5′bgl: 5′-gtt gtaa gaa cca cat gga gga tgc acg tg-3′
(SEQ ID NO:542)
美洲驼IgG2恒定区的5′引物
LLG2-5′bgl:5′-gtt gtaa gaa ccc aag aca cca aaa cc-3′
(SEQ ID NO:543)
美洲驼IgG3恒定区的5′引物
LLG3-5′bgl:5′-gtt gtaa gcg cac cac agc gaa gac ccc-3′
(SEQ ID NO:544)
美洲驼IgG1、IgG2和IgG3恒定区的3′引物
LLG123-3′X:5′-gtt gtttta cta ttt acc cga aga ctg ggt gat gga-3′
(SEQ ID NO:545)
将预期大小的PCR片段克隆进TOPO克隆载体(InvitrogenLife Technologies),然后测序。有义测序引物(LLseqsense)具有序列5′-ctg aga tcg agt tca gct g-3′(SEQ ID NO:546),且反义引物(LLseqAS)具有序列5′-cct cct ttg gct ttg tct c-3′(SEQID NO:547)。如实施例1所述进行测序。图23将含有铰链、CH2和CH3结构域的3种同种型美洲驼恒定区的氨基酸序列与人IgG1铰链、CH2和CH3结构域的氨基酸序列进行了对比。
校验序列后,用限制酶BclI和Xbal消化了扩增的PCR产物,以建立相容的限制位点。然后,凝胶-纯化消化的片段,并使用QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN,Valencia,CA)洗脱DNA。用BclI和XbaI消化了2H7scFv-Ig pD18哺乳动物表达载体构建体(见实施例2),以去除人IgG铰链、CH2和CH3结构域。pD18载体是pCDNA3的修饰的衍生物,其含有减弱的DHFR基因,后者用作哺乳动物表达的选择标记(Hayden等,Tissue Antigens 48:242-54(1996))。根据生产商的说明书,用T4 DNA连接酶(Roche Molecular Biochemicals,Indianapolis,IN),在室温过夜将纯化的美洲驼IgG1、IgG2和IgG3恒定区PCR产物连接进双消化的2H7 scFv-pD18载体。连接后,根据标准的分子生物学方法和生产商的说明书,将连接产物转化进大肠杆菌DH5α细菌(BD Biosciences,Palo Alto,CA)中,并铺平板。选择分离的菌落,以筛选含有正确的插入片段的转化体。
为了表达编码的多肽,使用DEAE-葡聚糖,将来自阳性克隆的质粒DNA瞬时转染进COS-7细胞(Hayden等,Ther Immunol.1:3-15(1994))。以大约3x106细胞/150mm平板,接种COS-7细胞,并生长过夜,直到细胞达到约75%汇合。然后,用无血清的DMEM(Invitrogen Life Technologies,Grand Island,NY),洗涤细胞一次。将含有400μg/ml DEAE-葡聚糖、0.1mM氯喹和5μg/ml DNA构建体的转染上清液(10ml)加入细胞中,然后将其在37℃温育3-4小时。温育后,用10ml溶于1x PBS中的10%二甲亚砜(DMSO),在室温脉冲细胞2分钟。然后,将细胞放回完全补充的DMEM/10% FBS(1%L-谷氨酰胺,1%青霉素/链霉素,1%丙酮酸钠,1%MEM必需氨基酸)中(Invitrogen Life Technologies)。24小时后,用无血清的完全补充的DMEM(Invitrogen Life Technologies)替换培养基,将细胞维持最多21天,每3-4天改变培养基。
通过使COS细胞培养物上清液穿过A蛋白琼脂糖(Repligen,Cambridge,MA)柱,纯化了Ig-融合蛋白。应用培养物上清液后,然后用1xPBS(Invitrogen Life Technologies)洗涤A蛋白柱。用0.1M柠檬酸(pH 2.8)洗脱结合的Ig-融合蛋白,然后用Tris碱(pH 10.85)立即中和收集的级分。通过测量光密度(A280),鉴别含有蛋白的级分,然后汇集,在1x PBS(Invitrogen Life Technologies)中透析,并经0.2μm过滤器过滤。
通过SDS-PAGE分析了纯化的Ig-融合蛋白。将2H7 scFv-美洲驼IgG1、2H7 scFv-美洲驼IgG2、2H7 scFv-美洲驼IgG3和Rituxan
Figure GA20180477200380110470301D01701
(利妥希玛,抗-CD20抗体,Genentech,Inc.和IDECPharmaceuticals Corp.)的等分试样(5μg蛋白)与25μl 2x NuPAGESDS样品缓冲液(Invitrogen Life Technologies)(非还原的样品)合并。还在含有5% 2-巯基乙醇(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)的还原样品缓冲液中,制备了每种蛋白的样品。将分子量标记(Invitrogen Life Technologies)应用到仅仅在非还原缓冲液中的凝胶。在NuPAGE10% Bis-Tris凝胶(Invitrogen Life Technologies)上,分缀分离了蛋白。电泳(大约1小时)后,用蒸馏水(InvitrogenLife Technologies)洗涤凝胶3次,每次5分钟,然后在50mlBio-Safe考马斯染料(BioRad,Hercules,CA)中,在室温染色过夜。在蒸馏水中洗涤后,对凝胶照像。每种Ig-融合蛋白的迁移模式见图24。
通过流式细胞计,证实了2H7 scFv-美洲驼Ig融合蛋白结合能表达CD20的细胞的能力。制备了从25μl/ml纯化的2H7 scFv-美洲驼IgG1、2H7 scFv-美洲驼IgG2和2H7 scFv-美洲驼IgG3开始的系列稀释液,并与CD20-转染的(CD20+)CHO细胞(来自S.Skov博士的实验室,Institute of Medical Microbiology and Immunology,Copenhagen丹麦)一起,在冰上,在1%FBS 1x PBS培养基(InvitrogenLife Technologies)中温育1小时。温育后,然后离心细胞,并用溶于1x PBS中的1%FBS洗涤。为了检测结合的2H7 scFv-美洲驼Ig,在冰上,将细胞与荧光素-缀合的山羊抗-骆驼科动物IgG(重链和轻链)(1∶100)(Triple J Farms)温育1小时。然后离心细胞,并重新悬浮到1% FBS-1x PBS中,并使用Coulter Epics XL细胞分选仪(Beckman Coulter,Miami,FL)进行分析。数据(最大亮度的百分比)见图25。
实施例11
抗-CD20 scFV-美洲驼Ig融合蛋白的效应子功能
本实施例证实了抗-CD20美洲驼IgG1、IgG2和IgG3融合蛋白介导依赖补体的细胞毒性(CDC)和依赖抗体的细胞介导细胞毒性(ADCC)的能力。
使用BJAB人B细胞系,测试了在有补体存在的情况下,2H7 scFv-美洲驼IgG融合蛋白杀伤CD20阳性的细胞的能力。从3-4周龄兔(Pel-Freez,Brown Deer,WI),得到了兔补体。合并BJAB细胞(2x106细胞/ml)和兔补体(终稀度1∶10)和纯化的2H7 Ig融合蛋白。从30μg/ml的浓度开始,以1∶3系列稀释,加入2H7 scFv-美洲驼IgG1、2H7 scFv-美洲驼IgG2、2H7 scFv-美洲驼IgG3和2H7 scFv-人IgG1野生型铰链-CH2-CH3)(实施例1)。在37℃ 1小时后,使用血细胞计数器(Bright-line,Horsham,PA),通过锥虫蓝排除(0.4%)(Invitrogen Life Technologies)计数活细胞和死细胞,来确定细胞存活。通过用总细胞数目(死细胞+活细胞)去除死细胞数目,计算出杀伤百分比。在图26中列出的数据表明,所有的Ig融合蛋白都具有CDC活性。
使用BJAB细胞作为靶细胞,且使用人或美洲驼外周血单核细胞(PBMC)作为效应细胞,测定了2H7 scFv-美洲驼IgG融合蛋白的ADCC活性。在含有15%FBS的完全补充的IMDM(Invitrogen LifeTechnologies)中,用51Cr(100μCi)(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ)预温育BJAB细胞大约2小时。在预温育阶段,间歇地混合细胞。使用淋巴细胞分离介质(LSM)(ICN Pharmaceuticals,New York,NY),从全血纯化了新鲜的、静止的人PBMC。以25∶1、50∶1和100∶1的比率,合并PBMC和标记的BJAB细胞(5x104细胞/孔,96孔组织培养平板)。向每个组合中,加入10μg/ml纯化的2H7 scFv-美洲驼IgG1、2H7 scFv-美洲驼lgG2、2H7 scFv-美洲驼IgG3、利妥希玛或没有抗-CD20抗体。在37℃,温育混合物6小时。将含有从溶解的细胞释放出的51Cr的每种反应上清液收集到LumaPlate-96过滤板(Packard,Meiden,CT)上,将其干燥过夜。通过TopCount NXT平板读出器(Packard),测量了51Cr的量。图27表明,2H7 scFv-美洲驼IgG2融合蛋白是介导ADCC最有效的美洲驼融合蛋白。每个数据点代表着一式三份的孔的平均测量值。
效应细胞的来源会影响ADCC活性。使用LSM,从美洲驼血液(Triple J Farms)分离了美洲驼PBMC。以相同的比率,将美洲驼效应细胞加入BJAB靶细胞,后者如关于使用人效应细胞的ADCC测定所述。合并细胞和10μg/ml纯化的2H7 scFv-美洲驼IgG1、2H7 scFv-美洲驼IgG2、2H7 scFv-美洲驼IgG3、利妥希玛或没有抗-CD20抗体。结果显示在图28中。
实施例12
在细胞表面上表达的scFv Ig融合蛋白的构建和表征
本实施例描述了逆转录病毒转染系统,其用于由能结合共同刺激受体的scFv组成的遗传地工程化的细胞表面受体的异位表面表达。本实施例也证实了在靶细胞的表面上表达的这些多种scFv Ig融合蛋白的效应子功能。
从对各种共同刺激受体特异性的鼠单克隆抗体,克隆了重链和轻链可变区,并基本上如实施例1所述,制备了单链Fv构建体。抗体包括2H7,抗-人CD20;40.2.220,抗-人CD40;2E12,抗-人CD28;10A8,抗-人CD152(抗-CTLA-4);和500A2,抗-鼠CD3。根据克隆免疫球蛋白基因的标准方法,和如实施例1所述,克隆了每种抗体的重链和轻链可变区。通过将能编码(gly4ser)3(SEQ ID NO:529)肽接头的核苷酸序列分别插入40.2.220、2E12、10A8和500A2的VL区域核苷酸序列(分别是SEQ ID NOs:31、37和43)和40.2.220、2E12、10A8和500A2的VH区域核苷酸序列(分别是SEQ ID NOs:33、39和 45)之间,如实施例1所述制备了单链Fv构建体。40.2.220、2E12、10A8和500A2的VL的多肽序列分别描述在SEQ ID NOs:32、38和44,40.2.220、2E12、10A8和500A2的VH的多肽序列分别描述在SEQ IDNOs:30、40和46。然后,根据实施例5和11所述的方法,将每个scFv多核苷酸(分别是40.2.220、2E12、10A8和500A2的SEQ IDNOs:36、42和47)融合到人IgG1突变的铰链(CCC→SSS)和突变的CH2(在残基238(根据EU nomenclature,Ward等,1995Therap.Immunol.2:77-94编号为238;根据Kabat等,为残基251)处的脯氨酸至丝氨酸突变和野生型CH3结构域。然后,将每个scFv突变的IgG1融合多核苷酸序列在框内融合到能编码人CD80的跨膜结构域和细胞质尾区的序列(SEQ ID NO:29),从而当在转染的细胞中表达融合蛋白时,CD80能提供用于scFv Ig融合蛋白的表面表达的锚。根据标准的分子生物学方法和出售商的说明书,将能编码scFv-IgG-CD80融合蛋白的cDNA(分别是40.2.220-、2E12-、10A8-和500A2-scFv-IgG-CD80的SEQ ID NOs:49、51、53和55)插入逆转录病毒载体pLNCX(BD Biosciences Clontech,Palo Alto,CA)。将scFv-Ig-CD80 cDNA插入5′LTR-新霉素抗性基因-CMV启动子序列和3′LTR序列之间。将逆转录病毒构建体转染进Reh,即一种急性淋巴细胞性白血病细胞系(ATCC CRL-8286)。筛选转染的细胞,以选择能在细胞表面上表达scFv-Ig融合蛋白的克隆。
用转染的Reh细胞进行了CDC和ADCC测定,以确定scFv-Ig多肽在细胞表面上的表达是否能增加效应细胞功能。使能表达抗-人CD152 scFv-突变的IgG-CD80(SEQ ID N0:56);Reh抗-人CD28 scFv-突变的IgG-CD80(SEQ ID NO:52);Reh抗-人CD40 scFv-突变的IgG-CD80(SEQ ID NO:50);Reh抗-人CD20 scFv-突变的IgG-CD80(SEQ ID NO:___ )的Reh细胞与人PBMC(见实施例11)和兔补体(10μg/ml)在37℃结合1小时。未转染的Reh细胞用作对照。通过锥虫蓝排除,测定了细胞的生存力,并计算了杀伤的细胞的百分比(见实施例11)。图29显示了当在肿瘤细胞的细胞表面上表达时,scFv-IgG-CD80融合蛋白介导依赖补体的细胞毒性的有效性。
分析了在CDC测定中测试的相同的转染的Reh细胞加用能编码抗-鼠CD3-scFv-Ig-CD80的多核苷酸构建体(SEQ ID NO:110)转染的Reh细胞的ADCC活性(见实施例11)。在37℃,用51Cr(100μCi)(Amersham)预标记未转染的和转染的Reh细胞2小时。人PBMC用作效应细胞,并以5∶1、2.5∶1和1.25∶1的比率,加入Reh靶细胞(5x104细胞/孔,96孔平板)。在37℃ 5小时后,收获培养物上清液,并如实施例11所述进行分析。根据下面的方程,计算特异性杀伤百分比:((实验释放-自发释放)/(最大释放-自发释放))x100。数据显示在图30中。每个数据点代表着一式4份样品的平均值。
使用上述的相同方法,使用下面的单克隆抗体作为s Fv的来源,得到了与其他结合结构域相同的结果:对于CD20,是1F5(Genbank AY058907和AY058906);对于CD40,是2.36和G28.5;对于CD28,是9.3。
通过将抗体scFv融合到IgA铰链和恒定区和IgE铰链-作用区(即,IgE CH2)和恒定区,实现了抗体结合结构域的细胞表面表达。SEQ ID NOs:177、181、179和183显示了能编码融合到IgAH IgA T4(缺失了4个末端CH3残基)上的抗-4-1BB scFv、5B9(抗-人4-1BB)scFv和2e12(抗-人CD40)的多核苷酸,所述的IgAH IgA T4融合到CD80跨膜和细胞质结构域和IgE Fc区。编码的多肽如SEQ IDNOs:178、182、180和184所示。
实施例13
人Ig铰链-CH2-CH3突变体和2H7可变区突变体的构建和序列
本实施例描述了含有突变的人IgG1和IgA恒定区的scFv融合蛋白的构建。本实施例也描述了在重链可变区具有单个点突变的2H7scFv突变体的构建。根据本文所述的方法和分子生物学领域已知的方法,将突变导入可变区和恒定区结构域。图31显示了Ig恒定区构建体的命名。
突变了2H7 scFv人IgG1铰链-CH2-CH3融合蛋白的人IgG1铰链区,以取代半胱氨酸残基,后者在完整的免疫球蛋白中会参与形成2个重链分子之间的二硫键。如实施例5所述,制备了融合到人IgG1铰链区上的一个突变体2H7 scFv,其中所有3个半胱氨酸残基都突变成丝氨酸残基(MTH(SSS))(在实施例5中命名为CytoxB-MHWTG1C(包括野生型IgG1 CH2和CH3结构域))(现在称作2H7 scFv MTH(SSS)WTCH2CH3),且包含能编码如SEQ ID NO:58所述的多肽的多核苷酸序列SEQ ID NO:57。将能编码该突变体(SEQ ID NO:57)的多核苷酸序列用作模板,以建立突变体铰链区,其中前2个半胱氨酸残基被丝氨酸残基取代(IgG MTH(SSC))。设计了用半胱氨酸取代第三个丝氨酸残基的寡核苷酸,其具有下面的序列:5′-gtt gtt gat cag gag ccc aaatct tct gac aaa act cac aca tct cca ccg tgc cca gca cct g-3′(HuIgGMHncs 3,SEQ ID NO:548)。制备了第二种突变体,其中突变体铰链具有能取代第一个和第三个半胱氨酸残基的丝氨酸残基(IgGMTH(SCS))。用于建立该突变体的寡核苷酸的序列如下:5′-gtt gttgat cag gag ccc aaa tct tct gac aaa act cac aca tgc cca ccg-3′(HuIgGMHncs2,SEQ ID NO:549)。还使用IgG MTH(SSS)突变体作为模板,和具有下述序列的寡核苷酸:5′-gtt gtt gat cag gag cccaaa tct tgt gac aaa act cac-3′(HuIgGMHncs1,SEQ ID NO:550),制备了第三种突变体,其中取代了在第二个和第三个位置的半胱氨酸残基(IgG MTH(CSS))。
将寡核苷酸(其能将突变导入铰链区)与模板和含有XbaI位点(加下划线的且斜体的)的3′寡核苷酸(5′-gtt gtttca ttt acccgg aga cag gga gag gct ctt ctg cgt gta g-3′(SEQ ID NO:551))组合,以通过PCR扩增突变的铰链-野生型(WT)-CH2-CH3序列。扩增了IgG MTH CSS和IgG MTH SCS突变体序列25个循环,其中在94℃变性,在52℃退火30秒,在72℃延伸30秒。在略有不同的条件下,扩增了IgG MTH SSC突变体序列:在94℃变性,在45℃退火30秒,并在72℃延伸45秒。将扩增的多核苷酸插TOPO克隆载体(Invitrogen Life Technologies),然后如实施例1所述测序,以证实突变的存在。基本上如实施例10所述,消化了含有2H7 scFv的pD18载体,以去除恒定区序列。将突变的铰链-野生型CH2-CH3区域在框内插入消化的载体DNA,以得到包含2H7 scFv MTH(CSS)WTCH2CH3的编码DNA(SEQ ID NO:134);2H7scFv MTH(SCS)WTCH2CH3的编码DNA(SEQ ID NO:136)和2H7 scFv MTH(SSC)WTCH2CH3的编码DNA(SEQ ID NO:138)的载体。
将在重链可变区的第一个构架区域的位置11处的亮氨酸至丝氨酸的突变(根据Kabat等编号,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第5版.Bethesda,MD:Public HealthService,National Institutes of Health(1991)),导入2H7 scFvMTH(SSS)WTCH2CH3融合蛋白(SEQ ID NO:58)。使用寡核苷酸Vhser 11:5′-gga ggt ggg agc tct cag gct tat cta cag cag tct ggggct gag tcg gtg agg cc-3′(SEQ ID NO:552)(该序列,或它编码的氨基酸序列,可以任选地从本发明的具体请求保护的实施方案中排除),通过定点诱变,用丝氨酸取代了野生型亮氨酸残基。PCR的3′-引物是具有序列5′-gtc
Figure GA20180477200380110470301D01761
cta tca ttt acc cgg aga cag-3′(SEQ ID N O:553)(XbaI位点被加下划线且是斜体)的huIgG1-3′。PCR扩增后,将片段插入TOPO克隆载体,并测序,以证实VH11亮氨酸向丝氨酸突变的存在。将2H7scFv-IgG MTH(SSS)WTCH2CH3的编码DNA穿梭进PSL1180克隆载体(Pharmacia Biotech,Inc.,Piscataway,NJ)。用Sac和XbaI消化了构建体PSL1180-2H7scFv-IgG MTH(SSS)WTCH2CH3,以去除野生型VH结构域和铰链和CH2和CH3结构域。根据标准的分子生物学方法,用Sac和XbaI消化包含VH11突变体的PCR产物,然后插入消化的PSL1180构建体。然后,用Hind III和XbaI消化构建体,并插入哺乳动物表达载体pD18(见实施例1和实施例10所述的方法)。将突变体称作2H7 scFvVH11 SER IgG MTH(SSS)WTCH2CH3(图31)。多核苷酸序列提供在SEQ ID NO:369,且编码的多肽序列提供在SEQ ID NO:370(这些序列可以任选地从本发明的具体实施方案中排除)。
制备了含有IgA恒定区结构域的4种构建体。一种构建体含有融合到人IgG1 CH2和CH3(IgAH IgG WTCH2CH3)上的野生型IgA铰链(图31)。进行了顺序的PCR扩增,以用能编码IgA铰链的核苷酸序列取代2H7 scFv构建体的人IgG1铰链。用于第一个PCR反应的5′寡核苷酸引物(huIgA/Gchim5)具有序列,5′-cca tct ccc tca act ccacct acc cca tct ccc tca tgc gca cct gaa ctc ctg-3′(SEQ IDNO:554)。用于在第二个PCR反应种添加更多的I gA特异性的铰链序列和添加BclI限制酶位点(斜体的且加下划线的)的引物(huIgAhg-5′)具有序列,5′-gtt gt
Figure GA20180477200380110470301D01763
g cca gtt ccc tca actcca cct acc cca tct ccc caa ct-3′(SEQ ID NO:555)。用于2个扩增步骤的3′引物是具有下述序列的huIgG1-3′:5′-gtc tct aga ctatca ttt acc cgg aga cag-3′(SEQ ID NO:556)。通过如上所述的TOPO
Figure GA20180477200380110470301D01764
克隆,确认了PCR产物的序列。用BclI和XbaI消化了凝胶-纯化的片段,然后将其插入2H7 scFv-pD18载体,后者已经用BclI和XbaI消化,以去除所有的IgG1恒定区结构域。如实施例10所述进行连接,以提供包含能编码2H7 scFv IgA铰链-IgG1 CH2-CH3多肽(SEQ ID NO:60)的核苷酸序列(SEQ ID NO:59)的哺乳动物表达载体。
构建了第二种pD18哺乳动物表达载体,其具有能编码融合到野生型IgA铰链、CH2和CH3结构域(SEQ ID NO:62)上的2H7 scFv的多核苷酸序列(SEQ ID NO:61)。基本上如实施例10所述,通过使用随机引物,逆转录从人扁桃体分离的总RNA,然后使用序列特异性的引物,PCR扩增cDNA,得到了人IgA恒定区序列。使用5′寡核苷酸huIgAhg-5′(SEQ ID NO:555)和具有序列5′-gtt gtt tct aga ttatca gta gca ggt gcc gtc cac ctc cgc cat gac aac-3′(SEQ ID NO:557)的3′寡核苷酸huIgA3′,扩增了能编码IgA-CH2-CH3多肽(IgAHIgACH2CH3,图31)(SEQ ID NO:64)的人IgA铰链-CH2-CH3核苷酸序列(SEQ ID NO:63)。从转染的哺乳动物细胞分泌2H7-IgA铰链-IgACH2-CH3多肽,需要共表达人J链,后者通过二硫键共价地结合到2个IgA CH3结构域上。从扁桃体B细胞分离了总RNA,并逆转录,以生成如上所述的cDNA。用J链特异性的引物,进行了能编码J链的核苷酸序列的PCR扩增。5′PCR引物HUJCH5nl具有序列,5′-gttgtt aga tct caa gaa gat gaa agg att gtt ctt-3′(SEQ ID NO:558),3′引物HUJCH 3的序列是5′-gtt gtt tct aga tta gtc agg ata gcaggc atc tgg-3′(SEQ ID NO:559)。将cDNA克隆进TOPO,用于如实施例10所述的测序。然后,将能编码cDNA(SEQ ID NO:65)的J链插入pD18和pCDNA3-Hygro(+)(Invitrogen Life Technology)载体,以用于共转染2H7 scFv IgA铰链-CH2-CH3构建体。J链具有如SEQ ID NO:66所述的预测的氨基酸序列。
通过设计截短的CH3结构域,其缺失了4个羧基末端氨基酸(GTCY,SEQ ID NO:67)(IgAH IgA-T4,图31),其包含能与J链形成二硫键的半胱氨酸残基,实现了在没有J链的情况下的scFv IgA恒定区构建体的分泌。使用具有序列5′-gtt gt
Figure GA20180477200380110470301D01772
g cca gtt ccc tca actcca cct acc cca tct ccc tca act-3′(SEQ ID NO:562)(BclI位点被加下划线且斜体)的5′PCR引物(huIgAhg-5′),和具有序列5′-gtt gtt tct aga tta tca gtc cac ctc cgc cat gac aac aga cac-3′(SEQ ID NO:561)的3′PCR引物(HUIGA3T1),制备了含有CH3(SEQID NO:68)中的缺失的IgA铰链-CH2-CH3核苷酸序列。将该突变的IgA恒定区核苷酸序列插入2H7 scFv pD18载体,如关于生成以前的包含能编码2H7 IgAH IgA-T4多核苷酸(SEQ ID NO:71)的多核苷酸序列(SEQ ID NO:70)的2H7 scFv-Ig构建体(见实施例1和本实施例)所述。
制备了第四种构建体,其能编码从IgA CH3的羧基末端缺失了14个其他的氨基酸(其中的大部分是疏水的残基)的2H7 scFv-IgA恒定区融合蛋白。使用2H7 scFv-IgAH IgA-T4编码多核苷酸作为模板,以设计能编码PTHVNVSVVMAEVD(SEQ ID NO:72)的核苷酸序列的缺失。5′寡核苷酸引物具有序列5′-gtt gtg cca gtt ccc tca actcca cct acc cca tct ccc tca act-3′(SEQ ID NO:564)(BclI位点显示为加下划线的且斜体的)。3′寡核苷酸序列是5′-gtt gtt tctaga tta tca ttt acc cgc caa gcg gtc gat ggt ctt-3′(SEQ IDNO:565)。通过使用上面的寡核苷酸扩增从人扁桃体分离的RNA的IgA恒定区,扩增了缺失的IgA CH3区域,从而cDNA含有缺失的18个氨基酸的羧基末端编码区。将IgAH IgA-T18恒定区插入2H7 scFvpD18载体,后者包含能编码如上所述的2H7 IgAH IgA-T18多核苷酸(SEQ ID NO:76)的多核苷酸序列(SEQ ID NO:75)。
实施例14
CTLA-4 IgG融合蛋白的效应子功能
本实施例对比了CDC和ADCC测定中的CTLA-4 Ig融合蛋白的效应子功能。
构建了2种CTLA-4 IgG融合蛋白。一种融合蛋白包含与人IgG1野生型铰链、CH2和CH3结构域融合的CTLA-4的胞外结构域,并称作CTLA-4 IgG WTH(CCC)WTCH2CH3(SEQ ID NO:78)。根据实施例1和10所述的方法,通过在框内将能编码CTLA-4的胞外结构域的核苷酸序列(SEQ ID NO:83)(见美国专利号5,844,095)融合到能编码IgG WTH(CCC)WTCH2CH3的核苷酸序列(SEQ ID NO:77),制备了pD18哺乳动物表达载体,其包含能编码CTLA-4 IgG WTH(CCC)WTCH2CH3的多核苷酸序列(SEQ ID NO:1)。胞外结构域核苷酸序列也包含在3′末端的BclI限制酶位点,和能编码oncoM前导肽(SEQ ID NO:80)的前导肽核苷酸序列(SEQ ID NO:79)。命名为CTLA-4 IgG MTH(SSS)MTCH2WTCH3的第二种CTLA-4 IgG融合蛋白含有融合到突变的IgG铰链上的CTLA-4的胞外结构域(+oncoM前导肽序列),其中所有的3个半胱氨酸残基都被替换为丝氨酸残基。将铰链区融合到突变的IgG1CH2结构域,后者具有在同种型位置238处的突变(EU numbering,Ward等,同上,(位置251,使用根据上面的Kabat等的编号;位置209,其中从IgG1 CH1的第一个残基开始编号;即将野生型IgG1 CH2的PAPELLDGPS(SEQ ID NO:566)修饰成PAPELLDGSS(SEQ IDNO:567)),后者融合到IgG1野生型CH3(美国专利号5,844,095)。CTLA-4 IgG MTH(SSS)MTCH2WTCH3多核苷酸包含SEQ ID NO:85中的核苷酸序列,且推测的氨基酸序列包含SEQ ID NO:86所述的序列。还使用没有前导肽的CTLA-4胞外膜编码序列(SEQ ID NO:87),制备了CTLA-4融合蛋白。
为了测量CDC的活性,在有或没有兔补体(10μg/ml)存在的情况下,将纯化的CTLA-4 IgG WTH(CCC)WTCH2CH3(2μg/ml)或CTLA-4IgG MTH(SSS)MTCH2WTCH3(2μg/ml)加给Reh细胞(见实施例12)和用共同刺激分子CD80转染的Reh细胞,从而使CD80在细胞表面上表达(Reh CD80.10;参见,Doty等,1998 J.Immunol 161:2700;Doty等,1996 J.Immunol.157:3270)。根据实施例10所述的方法,从瞬时转染的COS细胞的培养物上清液制备了纯化的CTLA Ig融合蛋白。基本上如实施例11和12所述,进行测定。图32中列出的数据表明,在有补体和CTLA-4 IgG WTH(CCC)WTCH2CH3融合蛋白存在的情况下,仅仅杀伤了CD80-转染的Reh细胞。
还在ADCC测定中,测试了纯化的CTLA-4 Ig融合蛋白。以1.25∶1、2.5∶1、5.0∶1和10∶1的比率,将用作效应细胞的人PBMC加给Reh或Reh CD80.1靶细胞。基本上如实施例11和12所述,进行细胞的标记和测定。结果显示在图33中。每个数据点代表着在每种效应物:靶细胞比率时的4个独立的培养孔的平均值。数据表明,仅仅CTLA-4IgG WTH(CCC)WTCH2CH3能介导Reh CD80.10细胞的显著的ADCC。
实施例15
CTLA-4 IgA融合蛋白的效应子功能
如关于IgG融合蛋白(见实施例1、13和14)所述,制备了CTLA-4IgA融合蛋白。将CTLA-4胞外结构域核苷酸序列(SEQ ID NO:84)在可读框中融合到能编码IgAH IgACH2CH3(SEQ ID NO:63)的核苷酸,以提供能编码CTLA-4 IgAH IgACH2CH3融合蛋白(SEQ ID NO:88)的核苷酸序列(SEQ ID NO:87)。使融合蛋白在COS细胞(见实施例10)中瞬时表达或在CHO细胞(见实施例1)中稳定地表达。CTLA-4 IgAHIgACH2CH3融合蛋白的分泌,需要共转染含有能编码人J链(SEQ IDNO:66)的多核苷酸序列(SEQ ID NO:65)的构建体。如实施例10和14所述,分离了CTLA-4 IgAH IgACH2CH3融合蛋白。为了表达没有J链的CTLA-4 Ig构建体,制备了CTLA-4 IgAH IgA-T4构建体,并将其转染进哺乳动物细胞。以类似于关于融合到野生型IgA铰链-CH2CH3上的CTLA-4胞外片段所述的方式,将CTLA-4胞外结构域核苷酸序列(SEQ ID NO:84)在可读框中融合到能编码IgAH IgA-T4多肽(SEQ ID NO:69)的核苷酸序列(SEQ ID NO:68),以提供包含能编码CTLA-4 IgAH IgA-T4多肽(SEQ ID NO:90)的SEQ ID NO:89的核苷酸序列。如实施例14所述,通过CDC和ADCC评价了每种构建体的效应子功能。
实施例16
抗-CD20 scFv人Ig融合蛋白与能表达CD20的CHO细胞的结合
本实施例描述了2H7 scFv Ig融合蛋白与能表达CD20的CHO细胞的结合。通过流式细胞计,进行了分析。从瞬时转染的能表达2H7scFv IgG WTH(CCC)WTCH2CH3(SEQ ID NO:28);2H7 scFv IgG MTH(CSS)WTCH2CH3(SEQ ID NO:135);2H7 scFv IgG MTH(SCS)WTCH2CH3(SEQ ID NO:137);和2H7s cFv VHSER11 WTH WTCH2CH3的COS细胞,收集了培养物上清液,并制备了2倍系列稀释液。从5μg/ml的浓度开始,制备了纯化的2H7 s cFv IgG MTH(SSC)WTCH2CH3(SEQ IDNO:139)的系列2倍稀释液。将培养物上清液和纯化的融合蛋白样品与(CD20+)CHO细胞一起在冰上温育1小时。将细胞洗涤2次,然后与1∶100FITC-缀合的山羊抗-人IgG(CalTag)一起温育40分钟。然后,通过洗涤细胞,去除未结合的缀合物,并使用Coulter Epics XL细胞分选仪,进行流式细胞计分析。结果显示在图34中。
实施例17
抗-CD20 scFv人IgG和IgA融合蛋白的免疫印迹分析
本实施例描述了从转染的细胞培养物上清液免疫沉淀的2H7 scFvIgG和2H7 scFv IgA融合蛋白的免疫印迹分析。
基本上根据实施例10所述的方法,用包含2H7 scFv IgG WTH(CCC)WTCH2CH3(SEQ ID NO:28);2H7 scFv IgG MTH(CSS)WTCH2CH3(SEQID NO:135);2H7 scFv IgG MTH(SCS)WTCH2CH3(SEQ ID NO:137);2H7 scFv IgA H IgG WTCH2CH3(SEQ ID NO:60);和scFv IgG MTH(SSS)WTCH2CH3(SEQ ID NO:58)的核苷酸序列的质粒瞬时转染了COS细胞。还只用载体转染了细胞。在37℃ 48-72小时后,收获细胞培养物上清液,并与A蛋白-琼脂糖珠子(Repligen)在4℃结合1小时。离心珠子,并在TNEN[20mM Tris碱,100mM NaCl,1mM EDTA,和0.05%NP-40,pH 8.0]中洗涤几次。将免疫沉淀与25μl 2x NuPAGESDS样品缓冲液(Invitrogen Life Technologies)(非还原的样品)组合。在NuPAGE10% Bis-Tris凝胶(Invitrogen Life Technologies)上,分离蛋白。电泳(大约1小时)后,使用半干印迹仪(EllardInstrumentation,Monroe,WA),将蛋白从凝胶转移到Immobilon P聚偏1,1-二氟乙烯(PVDF)膜(Millipore,Bedford,MA)上。在含有5%脱脂奶的PBS中,封闭PVDF膜,然后用HRP-缀合的山羊抗-人IgG(Fc特异性的)(CalTag)进行探测。在PBS中洗涤免疫印迹数次后,使用ECL(Amersham Biosciences)显现印迹。结果显示在图35中。
实施例18
抗-CD20 scFv人IgA融合蛋白与CD20+CHO细胞的结合
本实施例描述了2H7 scFv IgAH IgACH2CH3(SEQ ID NO:62)和2H7scFv IgAH IgAT4(SEQ ID NO:70)融合蛋白与(CD20+)CHO细胞的结合的流式免疫细胞荧光测定法分析。
如实施例10所述,用包含能编码2H7 scFv IgAH IgACH2CH3多肽(SEQ ID NO:62)的多核苷酸序列(SEQ ID NO:61)的质粒DNA和包含能编码人J链多肽(SEQ ID NO:66)的多核苷酸序列(SEQ ID NO:65)的分开的质粒,瞬时共转染了COS细胞。还用能编码2H7 scFv IgA融合蛋白的多核苷酸序列(SEQ ID NO:70)转染了COS细胞,该融合蛋白在CH3(2H7 scFv IgAH IgA-T4,SEQ ID NO:71)的羧基末端缺失了4个氨基酸。如实施例10所述,进行了转染。将来自转染的COS细胞的培养物上清液与(CD20+)CHO细胞(见实施例1)相组合,并在冰上温育1小时。用PBS-2% FBS洗涤细胞2次,然后与FITC-缀合的山羊抗-人IgA链(CalTag)(1∶100)结合40分钟。再次洗涤细胞,然后用Coulter Epics XL细胞分选仪,通过流式细胞计进行分析。图36表明,2H7 scFv IgAH IgAT4(具有截短的CH 3羧基末端的2H7 IgA融合蛋白)(SEQ ID NO:71)的分泌不需要J链的共转染。
实施例19
抗-CD20 scFv人IgA融合蛋白的效应子功能
本实施例阐明了2H7 IgG和IgA融合蛋白对能表达CD20的细胞的ADCC活性。在37℃,用51Cr(100μCi)(Amersham)预标记BJAB细胞2小时。从新鲜的、静止的人全血得到了效应细胞,所述全血在等体积的Alsever氏溶液中稀释,以防止凝固。通过如实施例10所述的A蛋白色谱,从瞬时转染的COS细胞上清液(100-200ml),纯化了2H7 scFv IgG MTH(SSS)WTCH2CH3(SEQ ID NO:58);2H7 scFv IgGMTH(SCS)WTCH2CH3(SEQ ID NO:137);2H7 scFv IgG WTH(CCC)WTCH2CH3(SEQ ID NO:28);和2H7 scFv IgAH IgACH2CH3(SEQ ID NO:62)融合蛋白。如实施例18所述,用能编码人J链的质粒,共转染了用能编码2H7 scFv IgAH IgACH2CH3的质粒转染的COS细胞。将从5μg/ml开始的纯化的2H7 Ig融合蛋白的2倍系列稀释液,在有全血(在Alsever氏溶液中1∶1稀释的100μl全血,终稀度1∶4)存在的情况下,加入标记的BJAB细胞(5x104细胞/孔,96孔组织培养平板),并在37℃温育5小时。收获培养物上清液,并如实施例11所述进行分析。根据下面的方程,计算了特异性杀伤百分比:((实验释放-自发释放)/(最大释放-自发释放))x100。数据显示在图37中。每个数据点代表着一式4份样品的平均值。
在第二个ADCC测定中,将每份样品中的标记的BJAB靶细胞的数目保持恒定,并以0.25、0.125和0.0625的稀度添加全血。以5μg/ml的浓度,加入纯化的2H7 IgG和IgA融合蛋白。温育BJAB细胞、全血和融合蛋白,收获上清液,如上所述计算特异性杀伤百分比。每种2H7融合蛋白的特异性杀伤百分比显示在图38中。
在有不同的效应细胞群体存在的情况下,对比了纯化的2H7 scFvIgG MTH(SSS)WTCH2CH3(5μg/ml)和纯化的2H7 scFv IgAHIgACH2CH3(5μg/ml)的ADCC活性。如实施例11和12所述,从全血分离了PBMC。以50∶1、25∶1和12.5∶1的比率,使PBMC和标记的BJAB靶细胞(5x104/孔,96孔组织培养平板)结合。如上所述,进行测定和数据分析。图39A表明:当PBMC用作效应细胞时,仅仅2H 7scFv IgG MTH(SSS)WTCH2CH3融合蛋白具有ADCC活性。图39B表明,当全血是效应细胞的来源时,2H7 scFv IgG MTH(SSS)WTCH2CH3和2H7 scFv IgAH IgACH2CH3都能表现出ADCC活性(如图38所示)。
实施例20
2H7 scFv VH11SER IgG MTH(SSS)WTCH2CH3融合蛋白的表达水平
本实施例对比了2H7 scFv VH11Ser IgG MTH(SSS)WTCH2CH3融合蛋白(SEQ ID NO:370)和在重链可变结构域不含有突变的其他的2H7scFv IgG构建体的表达水平。如实施例10所述,将包含核苷酸序列2H7 scFv IgG MTH(SSS)WTCH2CH3(SEQ ID NO:370);2H7s cFv IgGMTH(CSS)WTCH2CH3(SEQ ID NO:372);2H7 scFv IgG MTH(SCS)WTCH2CH3(SEQ ID NO:137);2H7 scFv IgG WTH(CCC)WTCH2CH3(SEQID NO:28);和2H7 scFv VHSER11 IgG MTH(SSS)WTCH2CH3(见实施例1和13)的哺乳动物表达载体pD18瞬时转染进COS细胞。在37℃ 72小时后,收获培养物上清液,使1μl每种上清液与非-还原的样品缓冲液结合(见实施例10所述的方法)。在10% Bis-Tris(MOPS)NuPAGE凝胶(Invitrogen Life Technologies)上,分级分离了培养上清液样品和纯化的2H7 scFv IgG MTH(SSS)WTCH2CH3的等分试样(40ng、20ng、10ng/5ng和2.5ng)。还在凝胶上分离了Multimark蛋白标准(Invitrogen Life Technologies)。将蛋白转移到PDVF膜上,并如实施例17所述进行免疫印迹。免疫印迹显示在图40中。使用Windows下的ScionImage软件,并与标准曲线对比,通过印迹的光密度测定法分析,确定了融合蛋白的量。2H7 scFv IgGWTH(CCC)WTCH2CH3构建体大约生产了12ng/μl或12微克/ml,2H7scFv IgG MTH(CSS)WTCH2CH3大约生产了10ng/μl或10微克/ml,2H7scFv IgG MTH(SCS)WTCH2CH3构建体大约生产了1ng/μl或1微克/ml,且2H7 scFv VHSER11 IgG MTH(SSS)WTCH2CH3构建体大约生产了30ng/ml或30微克/ml。在本发明的具体请求保护的实施方案中,可以任选地从本发明中排除2H7 scFv VHSER11 IgG MTH(SSS)WTCH2CH3的氨基酸序列,或能编码2H7 scFv VHSER11 IgG MTH(SSS)WTCH2CH3的多核苷酸序列。类似地,可以任选地从本发明的具体请求保护的实施方案中排除2H7 scFv VHSER11 IgG WTH(CCC)WTCH2CH3的氨基酸序列或能编码2H7 scFv VHSER11 IgG WTH(CCC)WTCH2CH3的多核苷酸序列。另外,可以任选地从本发明的具体请求保护的实施方案中排除在重链可变结构域的位置11处的亮氨酸向丝氨酸的氨基酸取代,或能编码在重链可变结构域的位置11处的亮氨酸向丝氨酸的氨基酸取代的多核苷酸。
实施例21
具有突变的CH 3结构域的2H7 scFv IgG融合蛋白的构建
将氨基酸突变导入了2H7 IgG融合蛋白的CH3结构域。用BclI和XbaI消化了包含2H7 scFv IgG MTH(SSS)WTCH2CH3(SEQ ID NO:135)的pD18载体,以取出MTH WTCH2CH3片段,然后将其亚克隆进用BclI和XbaI双消化的pShuttle载体(BD Biosciences Clontech,PaloAlto,CA)。在卡那霉素抗性的载体中进行了亚克隆,因为氨苄青霉素抗性基因具有该克隆程序所需的XmnI位点。用下面的取代,制备了5种构建体:(1)使用寡核苷酸CH3Y405,用酪氨酸取代在位置405(根据上面的Kabat等编号)处的苯丙氨酸残基;(2)使用寡核苷酸CH3A405,用丙氨酸残基取代在位置405处的苯丙氨酸;(3)使用寡核苷酸CH3A407,用丙氨酸取代在位置407处的酪氨酸残基;(4)使用寡核苷酸CH3Y405A407,分别用酪氨酸和丙氨酸取代在位置405和407处的野生型氨基酸;和(5)使用寡核苷酸CH3A405A407,用丙氨酸取代在位置405和407处的野生型氨基酸。寡核苷酸是用于PCR扩增CH3结构域的一部分的3′引物。每种3′寡核苷酸的核苷酸序列如下。
CH3Y405:5′-gtt gtt gaa gac gtt ccc ctg ctg cca cct gct ctt gtc cac ggt gag ctt gct gta gaggta gaa gga gcc-3′(SEQ ID NO:568)
CH3A405:5′-gtt gtt gaa gac gtt ccc ctg ctg cca cct gct ctt gtc cac ggt gag ctt gct gta agagggc gaa gga gcc-3′(SEQ ID NO:569)
CH3A407:5′-gtt gtt gaa gac gtt ccc ctg ctg cca cct gct ctt gtc cac ggt gag ctt gct ggc gaggaa gaa gga gcc-3′(SEQ ID NO:570)
CH3Y405A407:5′-gtt gtt gaa gac gtt ccc ctg ctg cca cct gct ctt gtc cac ggt gag ctt gct ggcgag gta gaa gga gcc-3′(SEQ ID NO:571)
CH3A405A407:5′-gtt gtt gaa gac gtt ccc ctg ctg cca cct gct ctt gtc cac ggt gag ctt gct ggcgag ggc gaa gga gcc-3′(SEQ ID NO:572)
模板是突变的铰链MHWTCH2CH3人IgG1。5′PCR寡核苷酸引物是huIgGMHWC。如实施例1和10所述,TOPO
Figure GA20180477200380110470301D01851
克隆了扩增的产物,并测序。用BclI和XmnI消化了具有正确序列的克隆的NDA,并转移到含有MTH WTCH2CH3序列的pShuttle,后者也用相同的限制酶消化过。然后,通过BclI和XbaI消化,取出突变的IgG序列,并将其插入含有2H7 scFv的pD18载体,后者也用BclI和XbaI消化过。突变的CH3结构域MTCH3 Y405、MTCH3 A405、MTCH3 A407、MTCH3Y405A407和MTCH3 A405A407的多核苷酸序列分别显示在SEQ IDNOs:143、145、147和149,各自的多肽序列分别显示在SEQ IDNOs:144、146、148和150。2H7 scFv MTH WTCH2 MTCH3 Y405、2H7scFv MTH WTCH2 MTCH3 A405、scFv MTH WTCH2 MTCH3 A407、scFv MTHWTCH2 MTCH3 Y405A407和scFv MTH WTCH2 MTCH3 A405A407的多核苷酸序列,和推测的氨基酸序列,分别显示在SEQ ID NOs:154、156、158、160和162,且推测的核苷酸序列分别显示在SEQ ID NOs:153、155、157、159、161。
实施例22
具有铰链突变的2H7 scFv IgG融合蛋白的构建
用丝氨酸残基取代IgG1铰链区中的第三个半胱氨酸残基,构建了2H7 scFv IgG融合蛋白。用于导入突变的模板是能编码2H7 scFvWTH WTCH2CH3(SEQ ID NO:28)的多核苷酸。导入突变的寡核苷酸是5′PCR引物寡核苷酸HIgGMHcys3,其具有序列5′-gtt gtt gat caggag ccc aaa tct tgt gac aaa act cac aca tgt cca ccg tcc ccagca cct-3′(SEQ ID NO:573)。使能将突变导入铰链区的寡核苷酸与模板和含有XbaI位点(加下划线的且斜体的)的3′寡核苷酸(5′-gttgtt
Figure GA20180477200380110470301D01861
tca ttt acc cgg aga cag gga gag gct ctt ctg cgtgta g-3′(SEQ ID NO:574))结合,以通过PCR扩增突变的铰链-野生型(WT)-CH2-CH3序列。将IgG MTH CCS突变体序列扩增30个循环,其中在94℃变性,在50℃退火30秒,并在72℃延伸30秒。将扩增的多核苷酸插入TOPO克隆载体(Invitrogen LifeTechnologies),然后如实施例1所述测序,以证实突变的存在。基本上如实施例10所述,消化了含有2H7 scFv的pD18载体,以去除恒定区序列。将突变的铰链-野生型CH2-CH3区域在框内插入消化的载体DNA,以得到包含2H7 scFv MTH(CCS)WTCH2CH3的编码DNA(SEQID NO:167)的载体。推测的多肽序列显示在SEQ ID NO:168
实施例23
抗-CD20 IgE融合蛋白的构建
将结合结构域融合到IgE恒定区序列,从而使表达的多肽能诱导变态反应机制。根据关于其他的scFv免疫球蛋白恒定区构建体所述的方法(见实施例1、5、10和13),将40.2.220(即一种抗-CD40抗体)的单链Fv核苷酸序列(SEQ ID NO:35)融合到IgE CH2-CH3-CH4。为了PCR扩增IgE CH2-CH3-CH4结构域,使用了具有序列5′-gtt gttgat cac gtc tgc tcc agg gac ttc acc cc-3′(SEQ ID NO:575)的5′寡核苷酸引物hIgE5Bcl和具有序列5′-gtt gtt tct aga tta actttt acc ggg att tac aga cac cgc tcg ctg g-3′(SEQ ID NO:576)的3′寡核苷酸引物hIgE3stop。
使用如实施例12所述的用于由能结合共同刺激受体的scFv组成的遗传地工程化的细胞表面受体的异位表面表达的逆转录病毒转染系统,来构建40.2.220scFv IgE-CD80融合蛋白。将40.2.220 scFvIgE融合多核苷酸序列在框内融合到能编码人CD80的跨膜结构域和细胞质尾的序列(SEQ ID NO:30),从而当融合蛋白在转染的细胞中表达时,CD80能提供用于表面表达scFv Ig融合蛋白的锚。根据标准的分子生物学方法和供应商的说明书,将能编码抗CD40scFv-IgE-CD80融合蛋白的cDNA插入逆转录病毒载体pLNCX(BDBiosciences Clontech)。将40.2.220 scFv-Ig-CD80 cDNA插入5′LTR-新霉素抗性基因-CMV启动子序列和3′LTR序列之间。将逆转录病毒构建体转染进癌细胞系,并筛选转染的细胞,以选择能在细胞表面上表达40.2.220 scFv-Ig-CD80融合蛋白的克隆。
实施例24
在细胞表面上表达的IgA-T4突变体的构建
使用如实施例12所述的用于由能结合共同刺激受体的scFv组成的遗传地工程化的细胞表面受体的异位表面表达的逆转录病毒转染系统,来构建2H7 scFv IgA铰链IgA-T4-CD80融合蛋白。将2H7 scFvIgAH IgA-T4融合多核苷酸序列(SEQ ID NO:70)在框内融合到能编码人CD80的跨膜结构域和细胞质尾的序列(SEQ ID NO:29),从而当融合蛋白在转染的细胞中表达时,CD80能提供用于表面表达scFv Ig融合蛋白的锚。根据标准的分子生物学方法和供应商的说明书,将能编码2H7 scFv IgAH IgA-T4-CD80融合蛋白的cDNA插入逆转录病毒载体pLNCX(BD Biosciences Clontech)。将2H7 scFv IgAHIgA-T4-CD80 cDNA插入5′LTR-新霉素抗性基因-CMV启动子序列和3′LTR序列之间。将逆转录病毒构建体转染进Reh,即一种急性淋巴细胞性白血病细胞系(ATCC CRL-8286)。并筛选转染的细胞,以选择能在细胞表面上表达2H7 scFv-Ig融合蛋白的克隆。
实施例25
在肿瘤细胞的细胞表面上表达的抗-4-1BB scFv Ig-CD80融合蛋白的表征和肿瘤细胞的体内生长
本实施例描述了抗-鼠4-1BB(CD137)scFv融合蛋白的构建,其具有IgG野生型铰链和CH2和CH3结构域,后者融合到CD80跨膜和细胞质结构域上。本实施例也阐述了当将转染的肿瘤细胞移植进小鼠中时,抗-4-1BB scFv IgG CD80多肽的细胞表面表达的作用。
基本上如实施例1所述,克隆了大鼠抗-4-1BB(CD137)单克隆抗体(1D8)的重链和轻链可变区,并制备了单链Fv构建体。根据克隆免疫球蛋白基因的标准方法和如实施例1所述,克隆了每种抗体的重链和轻链可变区。如实施例1所述,通过将能编码(gly4ser)3(SEQID NO:529)肽接头的核苷酸序列插入1D8的VL区域核苷酸序列(SEQID NO:102)和1D8的VH区域核苷酸序列(SEQ ID NO:100)之间,制备了单链Fv构建体。1D8 VL的多肽序列显示在SEQ ID NO:103,且VH结构域的多肽序列显示在SEQ ID NO:101。然后,根据实施例1所述的方法,将scFv多核苷酸(SEQ ID NO:104)融合到人IgG1野生型铰链-CH2-CH3结构域。然后,基本上如实施例12所述,将scFv IgG1融合多核苷酸序列在框内融合到能编码人CD80的跨膜结构域和细胞质尾的序列(SEQ ID NO:29),从而当在转染的细胞中表达融合蛋白时,CD80能提供用于scFv Ig融合蛋白的表面表达的锚。根据标准的分子生物学方法和出售商的说明书,将能编码scFv-IgG-CD80融合蛋白的cDNA(SEQ ID NO:110)插入逆转录病毒载体pLNCX(BD BiosciencesClontech)。将scFv-Ig-CD80 cDNA插入5′LTR-新霉素抗性基因-CMV启动子序列和3′LTR序列之间。
将逆转录病毒构建体转染进K1735的转移性的M2克隆,即一种黑素瘤细胞系,其由Dr.I.Hellstrom,PNRI,Seattle,WA提供。筛选转染的细胞,以选择能在细胞表面上表达scFv-Ig融合蛋白的克隆。为了证实在肿瘤细胞的细胞表面上表达了1D8 scFv IgG-CD80构建体,通过流式免疫细胞荧光测定法,分析了转染的细胞。在藻红蛋白-缀合的F(ab′)2山羊抗-人IgG中,在冰上温育转染的细胞(K1735-1D8)1小时。然后,通过洗涤细胞,去除未结合的缀合物,并使用Coulter Epics XL细胞分选仪,进行流式细胞计分析。结果显示在图41A中。
体内地检查了K1735-1D8转染的细胞的生长。当皮下地(s.c.)移植进首次用于实验的C3H小鼠中时,K1735-WT细胞逐渐生长。尽管相同剂量的K1735-1D8细胞最初形成了大约30mm2表面积的肿瘤,但肿瘤在约第7天时开始减退,且到第20天时已经消失,如图41B所示。用类似地构建的能编码不结合的scFv(一种人抗-CD28 scFv构建体)的载体转染的肿瘤细胞,能像未转染的肿瘤细胞细胞一样好地生长。外来蛋白(即人IgG1恒定结构域或大鼠可变区)的存在,不会使转染的K1735-WT细胞成为免疫原性的;K1735-1D8细胞在C3H小鼠中的生长,与K1735-WT细胞(未转染的)的相同。
为了研究CD4+和CD8+T淋巴细胞和NK细胞在K1735-1D8肿瘤的衰退中的作用,给首次用于实验的小鼠腹膜内地(i.p.)注射了单克隆抗体(单克隆抗体,一般50μg,在0.1ml体积中),以去除CD8+、CD4+或CD4+和CD8+2种T细胞,或者注射了抗-脱唾液酸-GM1兔抗体,以去除NK细胞。12天后,当来自相同处理的小鼠的脾细胞的流式细胞计分析表明减少了靶向的T细胞群体时,将K1735-1D8细胞皮下地移植到每个减少了T细胞的组。在已经注射了抗-CD8MAb或对照大鼠IgG的小鼠中,K1735-1D8具有类似的生长动力学,尽管CD4+ T细胞的去除会导致具有与K1735-WT相同的动力学的K1735-1D8生长。无论是否存在CD8+T细胞,这都不能抑制在观察到CD4+T细胞去除后的肿瘤生长。K1735-1D8能在所有NK-减少的小鼠中生长,尽管比在CD4-减少的组中更慢。结果显示在图41C中。
实施例26
能表达抗-4-1BB scFv IgG-CD80融合蛋白的肿瘤细胞的治疗作用
本实施例检查了K1735-1D8转染的能在细胞表面上表达抗-CD137scFv的肿瘤细胞在小鼠中产生足够的免疫反应、以介导建立的未转染的野生型肿瘤的排斥的能力。给C3H小鼠移植了K1735-WT肿瘤(2x106细胞/动物),并生长大约6天。使用具有建立的30mm2表面积的K1735--WT肿瘤的小鼠,进行实验。通过在对侧胁腹皮下注射K1735-1D8或照射过的K1735-WT细胞,给小鼠接种疫苗。在图42指定的时间点,重复相同的注射。给一组动物施用4次每周一次的K1735-1D8细胞注射。根据相同的方法,给另一组施用照射过的(12,000拉德)K1735-WT细胞,给第三组注射PBS。将数据绘图,见图42。在所有对照小鼠中,和在所有接受照射过的K1735-WT细胞的小鼠中,WT肿瘤逐渐生长。相反地,在通过K1735-1D8免疫处理的5只小鼠中,有4只发生了肿瘤衰退。当在3个月后结束实验时,动物保持无肿瘤,且无毒性的迹象。在第5只小鼠中,肿瘤小结的尺寸减小,只要该小鼠接受K1735-1D8细胞,但是在结束治疗后,肿瘤又会长大。
在另一个5只小鼠/组的实验中,给小鼠静脉内地(i.v.)注射了3x105 K1735-WT细胞,以启动肺转移。3天后,皮下移植K1735-1D8细胞。每周重复该方法一次,持续1个月;给对照小鼠注射PBS。当对照组中的1只小鼠死亡时,即在接受K1735-WT细胞后37天,结束实验。此时,对照小鼠的肺都具有超过500个转移性的斑点。相反地,在免疫的小鼠的肺中,存在少于10个转移病灶
在第三个实验中,将K1735-WT细胞和K1735-1D8细胞的混合物注射进免疫活性的同系C3H小鼠中。给小鼠皮下地注射了单独的K7135-WT细胞,或者与2X106 K1735-WT细胞和2x105 K1735-1D8细胞的混合物一起。以5天的间隔,监控肿瘤生长。
实施例27
抗-4-1BB scFv IgG-CD80融合蛋白在肉瘤细胞的细胞表面上的表达
本实施例通过用抗-CD137 scFv IgG-CD80构建体转染鼠肉瘤细胞系,证实了抗-CD137 scFv在第二种类型的肿瘤细胞的细胞表面上的表达。
根据标准的分子生物学方法,使用限制酶消化和连接步骤,将1D8scFv IgG WTH WTCH2CH3-CD80多核苷酸(SEQ ID NO:110)从pLNCX载体转移进pCDNA3-hygro载体。用HindIII+Cla1切割构建体,并用克列诺(Roche)填充sFv片段,将平端的片段连接进pcDNA3的EcoR5位点。用含有1D8 scFv IgG CD80融合蛋白的pCDNA3-hygro载体,转染了Ag104鼠肉瘤肿瘤细胞。使用FITC抗-人IgG抗体来检测转基因的表达,通过流式细胞计筛选潮霉素-抗性的克隆。最初,仅仅大约15%抗性的克隆具有可检测到的融合蛋白。根据标准方法,在包被了固定化的抗-人IgG(10μg/ml)的烧瓶中,重复淘选了通过流式细胞计鉴别出的阳性的细胞。通过在包被的平板上在37℃温育细胞30分钟,进行淘选;然后,在乙二胺四乙酸或PBS中,洗涤平板2-3X。每个周期后,通过FACS测试细胞的IgG表达。图44中的柱状图显示了针对抗-人IgG淘选4遍后的染色模式(黑色)。未转染的细胞被染色,并表示成灰色。群体中的所有细胞都是阳性的。
实施例28
双特异性的scFv Ig融合蛋白和在IgG1 CH2结构域具有突变的scFv Ig融合蛋白的构建和表征
构建了具有突变的铰链(MT(SSS))和突变的CH2结构域的抗-CD20(2H7)scFv IgG融合蛋白,其中在残基(位置编号238,根据上面的Ward等)处的脯氨酸被丝氨酸取代。基本上根据实施例1、5和13所述的方法,构建了2H7 scFv IgG MTH(SSS)MTCH2WTCH3的编码多核苷酸(SEQ ID NO:130)。还将IgG突变的铰链-突变的CH2-野生型CH3结构域融合到抗-CD20(2H7)-抗-CD40(40.2.220)双特异性的scFv上。抗-CD20-抗-CD40 scFv IgG MTH(SSS)MTCH2WTCH3编码多核苷酸序列显示在SEQ ID NO:114,且编码的多肽显示在SEQ IDNO:115。
如实施例10所述,用包含能编码2H7 scFv IgG MTH(SSS)MTCH2WTCH3(SEQ ID NO:131)、抗-CD20-抗-CD40 scFv IgG MTH(SSS)MTCH2WTCH3(SEQ ID NO:114)、2H7 scFv IgG MTH(SSS)WTCH2CH3(SEQ ID NO:58)和2H7 scFv IgAH IgG WTCH2CH3(SEQ ID NO:60)的多核苷酸序列的载体,瞬时转染了COS细胞。收集培养物上清液,并通过A蛋白色谱纯化融合蛋白(见实施例10)。根据实施例10所述的方法,通过SDS-PAGE分级分离纯化的多肽。还将利妥希玛(抗-CD20单克隆抗体);和Bio-Rad预染色的分子量标准物(Bio-Rad,Hercules,CA)和Multimark分子量标准物(Invitrogen LifeTechnologies)应用于凝胶。结果显示在图45中。
在ADCC测定中,将含有CH2结构域中的突变的2H7 scFv Ig融合蛋白与具有野生型CH2结构域的融合蛋白进行对比。基本上如实施例11和19所述,进行测定。以图46所示的比率,将新鲜的静止的PBMC(效应细胞)添加到51Cr-标记的BJAB细胞(靶细胞)。都以10μg/ml,将纯化的2H7 scFv IgG MTH(SSS)MTCH2WTCH3、2H7 scFv IgGMTH(SSS)WTCH2CH3、2H7 scFv IgAH IgG WTCH2CH3和利妥希玛添加到效应物/靶细胞混合物,并在37℃温育5小时。如实施例11和19所述,收获上清液,并测定释放的铬的量。每种融合蛋白的特异性杀伤百分比显示在图46中。
实施例29
抗-人CD3 scFv IgG融合蛋白的肿瘤细胞表面表达
基本上如实施例1和12所述,制备了抗-人CD3 scFv Ig CD80融合蛋白。该融合蛋白包含抗-人CD3 scFv,后者融合到野生型IgG1铰链(SEQ ID NO:12)和野生型CH2(SEQ ID NO:13)和CH3(SEQ IDNO:15)结构域,后者融合到CD80跨膜和细胞质结构域(SEQ IDNO:29),以实现抗-CD3 scFv的细胞表面表达。将能编码多肽(SEQ IDNO:111)的抗-人CD3 scFv IgG WTH WTCH2CH3-CD80多核苷酸(SEQ IDNO:110)转染进Reh细胞和T51细胞(类淋巴母细胞系)。使用FITC缀合的山羊抗-人IgG(见实施例4、10、16、18所述的方法),通过流式细胞计,检测了抗-人CD3 scFv IgG融合蛋白的表达。图47A显示了抗-人CD3融合蛋白在Reh细胞的细胞表面上的表达,且图47B显示了融合蛋白在T41细胞上的表达。
用转染的Reh和T51细胞,进行了ADCC测定,以确定scFv-Ig多肽在细胞表面上的表达是否能增加效应细胞功能。在37℃,用51Cr(100μCi)(Amersham),预标记未转染的和转染的Reh细胞和未转染的和转染的T51细胞2小时。人PBMC用作效应细胞,并以20∶1、10∶1、5∶1和2.5∶1的比率,加给靶细胞(5x104细胞/孔,96孔平板)。在37℃ 4小时后,如实施例11和12所述收获培养物上清液并分析。如实施例12所述,计算特异性杀伤百分比。结果显示在图48中。
实施例30
诱导能在细胞表面上表达抗-CD28 scFv的肿瘤细胞中的细胞因子表达
本实施例描述了细胞表面表达的scFv对与抗-人CD28 scFvIgG-CD80融合蛋白转染的肿瘤细胞共培养的受刺激的淋巴细胞中的细胞因子mRNA诱导的作用。
在来自用Reh、Reh-抗-CD28(2e12)(见实施例12中的2e12 scFvIgG WTH WHTCH3CH2-CD80的构建和Reh细胞的转染)和Reh-CD80(见实施例14)刺激的人PBMC的RNA样品上,进行了实时PCR分析,以测量表面表达的scFv对PBMC效应细胞的细胞因子生产的作用。对于实时PCR测定,使用了SYBR Green(QIAGEN)(Morrison等,Biotechniques 24:954-8,960,962(1998)),并通过能在每个扩增循环后测量PCR产物的形成的ABI PRISM
Figure GA20180477200380110470301D01931
7000序列检测系统(Applied Biosystems,Foster City,CA),进行测量。从培养物收获细胞,并制备了总RNA,其中使用QIAGEN RNA试剂盒,包括能匀浆细胞裂解物的QIA撕碎机柱纯化系统和用于纯化RNA的RNeasy
Figure GA20180477200380110470301D01932
小型柱。使用等量的来自每个细胞类型和Superscript II逆转录酶(Life Technologies)的RNA,逆转录了cDNA。然后,使用制备的cDNA作为模板和对细胞因子基因产物特异性的引物,进行了SYBR Green实时PCR分析。扩增的PCR产物的平均长度为150-250碱基对。测定了许多激活反应分子的cDNA水平,所述的分子包括IFNγ、TNFα、GM-CSF、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-15、ICOSL、CD80和CD86。在每个测定中,测量了对照cDNA的组成型表达的基因,包括GAPDH、β-肌动蛋白和CD3ε。对于IFN-γ,观察到了特定mRNA的最显著的诱导;且对于CTLA-4和ICOS,观察到了更适度的诱导。
实施例31
抗-人4-1BB抗体的克隆和抗-人4-1BB scFv Ig融合蛋白的构建
从Dr.Robert Mittler,Emory University Vaccine Center,Atlanta,GA,得到了能表达小鼠抗-人单克隆抗体(命名为5B9)的杂交瘤细胞系。根据已知的克隆免疫球蛋白基因的方法和如本文所述,克隆了可变的重链和轻链区域。使细胞在IMDM/15% FBS(Invitrogen Life Technologies)培养基中生长数天。从培养物收获对数生长的细胞,并根据生产商的说明书,使用QIAGEN RNA试剂盒,包括能匀浆细胞裂解物的QIA撕碎机柱纯化系统和用于纯化RNA的RNeasy小型柱,制备了总RNA。使用随机的六聚体引物和Superscript II逆转录酶(Invitrogen Life Technologies),逆转录了cDNA。
使用末端转移酶和dGTP,为cDNA锚加尾。然后,使用锚加尾的互补引物和特异性地与小鼠Ck(用于扩增VL)或适当的同种型小鼠CH1(用于扩增VH)的恒定区的反义链退火的引物,进行了PCR。TOPO(Invitrogen Life Technologies)克隆了扩增的可变区片段,然后,对具有正确大小的插入片段的克隆进行测序。从至少4个独立的克隆的序列,测定了每个可变结构域的共有序列。5B9VL和VH多核苷酸序列分别显示在SEQ ID NO:120116,推测的氨基酸序列分别显示在SEQ ID NO:121118。通过缝合(sewing)PCR方法,其使用含有合成的插入到轻链和重链可变区之间的(Gly4Ser)3(SEQ IDNO:529)(接头结构域的重叠引物(见实施例1),构建了scFv。包含SEQ ID NO:122的多核苷酸序列,能编码5B9 scFv多肽(SEQ IDNO:123)。
根据实施例5、10和13所述的方法,将5B9 scFv多核苷酸序列在框内融合到能编码人IgG1突变的铰链和野生型CH2和CH3(MTH(SSS)WTCH2CH3,)的多核苷酸序列。用包含5B9 scFv IgG MTH(SSS)WTCH2CH3多核苷酸序列(SEQ ID NO:132)的载体,瞬时转染了COS细胞。收集上清液,并基本上如实施例4、10、16和18所述,通过流式免疫细胞荧光测定法,测量了5B9 scFv IgG MTH(SSS)WTCH2CH3多肽(SEQ ID NO:133)的结合。来自5B9杂交瘤细胞系的培养物上清液,也包含在结合测定中。在有固定化的抗-CD3存在的情况下,将新鲜的人PBMC温育4天,然后进行结合实验,以诱导激活的T细胞表面上的CD137的表达。洗涤受刺激的PBMC,并使其与分别含有5B9scFv IgG融合蛋白或5B9鼠单克隆抗体的COS或杂交瘤培养物上清液一起在冰上温育1小时。分别用FITC缀合的抗-人IgG或抗小鼠IgG,检测了5B9 scFv IgG融合蛋白或5B9鼠单克隆抗体的结合。结果显示在图49中。
实施例32
具有铰链突变的2H7 scFv IgG融合蛋白的构建
构建了2H7 scFv IgG融合蛋白,其在IgG1铰链区的第一个半胱氨酸残基和第二个半胱氨酸被取代为丝氨酸残基,以提供MTH(SCC)和MTH(CSC)。用于导入突变的模板是能编码2H7 scFv WTH WTCH2CH3的多核苷酸。能导入突变的寡核苷酸是5′PCR引物寡核苷酸HIgGMHcys1(SEQ ID NO:140)和HIgGMHcys2(SEQ ID NO:141)。如在前文所述,制备了构建体。突变体的编码多核苷酸显示在SEQ IDNO:163和165,多肽序列显示在SEQ ID NO:164和166。
实施例33
2H7 VH L11S scFv(SSS-S)H WCH2 WCH3的构建
将重链可变区的位置11(根据Kabat等编号,Sequences ofProteins of Immunological Interest,第5版.Bethesda,MD:PublicHealth Service,National Institutes of Health(1991))处的亮氨酸至丝氨酸的变化,导2H7 scFv MTH(SSS)WTCH2CH3融合蛋白(SEQ ID NO:58)。使用寡核苷酸Vhser11.:5′-gga ggt ggg agc tctcag gct tat cta cag cag tct ggg gct gag tcg gtg agg cc-3′(SEQID NO:577),通过定点诱变,用丝氨酸取代了野生型亮氨酸残基。PCR的3′-引物是huIgG1-3′,其具有序列5′-gtc
Figure GA20180477200380110470301D01951
cta tca tttacc cgg aga cag-3′(SEQ ID NO:578(Xbal位点被加下划线且斜体)。PCR扩增后,将片段插入TOPO
Figure GA20180477200380110470301D01952
克隆载体,并测序,以证实VH11亮氨酸向丝氨酸突变的存在。将2H7 scFv-IgG(SSS-S)H WCH2 WCH3编码DNA穿梭进PSL1180克隆载体(Pharmacia Biotech,Inc.,Piscataway,NJ)。用Sac和XbaI消化构建体PSL1180-2H7 scFv-IgG(SSS-S)H WCH2 WCH3,以去除野生型VH结构域和连接区和CH2和CH3结构域。用Sac和XbaI消化包含VH11突变体的PCR产物,然后根据标准的分子生物学方法,插入消化的PSL1180构建体。然后,用Hind III和XbaI,消化构建体,并插入哺乳动物表达载体pD18(见实施例1和实施例10所述的方法)。将突变体命名为2H7 scFv VH L11S IgG(SSS-S)H WCH2 WCH3。多核苷酸序列显示在SEQ ID NO:369和编码的多肽序列显示在SEQ ID NO:370。
实施例34
2H7 scFv VHL11S(SSS-S)H WCH2 WCH3在稳定的CHO系中的表达
通过电穿孔,用大约150微克线性化的能表达2H7 VH L11S scFv(SSS-S)H WCH2 WCH3的表达质粒转染了CHO DG44细胞。以每孔125至2000的各种细胞数,将培养物铺平板在96孔平底组织培养平板中的含有100nM氨甲蝶呤的选择培养基中。选择氨甲蝶呤抗性的克隆,并使用类似于图1所述的CD20CHO结合测定,筛选培养物上清液的融合蛋白的最高表达子。在逐渐增加剂量的氨甲蝶呤初步选择后,扩增了克隆。以更高的浓度,将细胞传代2代,然后将浓度调节至下一个更高的剂量。扩增克隆至1微摩尔氨甲蝶呤的终浓度。
图50B说明了2H7 VH L11S scFv(SSS-S)H WCH2 WCH3的生产水平。通过流式细胞计,测试了来自能表达该分子且在静止的T25烧瓶中生长的扩增的CHO细胞的消耗的上清液,以定量与CD20 CHO细胞的结合。使用用A蛋白亲和色谱从上清液纯化的相同分子,通过生成标准曲线,将该活性转化成蛋白浓度(图50A)。使用重组蛋白(载体NTI)的氨基酸组成提供的消光系数,通过A280测定了纯化的蛋白的浓度。尽管测试的克隆之间的生产水平存在差异,但多个克隆生产了超过1mg/ml。该蛋白表达水平比相同的分子高超过10倍,除了VH中的氨基酸变化以外。
图51说明了通过SDS-PAGE上的半定量分析测得的2H7 VH L11SscFv(SSS-S)H WCH2 WCH3的生产水平。将来自能表达该分子且在静止的T25烧瓶中生长的扩增的CHO细胞的10微升消耗的上清液,与10微升2X非还原的SDS样品缓冲液混合,上SDS-PAGE凝胶电泳,用考马斯蓝染色。
实施例35
G28-1 scFv Ig构建体的构建和结合能力
根据生产商的说明书,使用Trizol(Invitrogen)试剂,使用从G28-1杂交瘤分离的总RNA,进行了G28-1(抗-CD37)scFv的构建。使用随机引物和以前在实施例1中关于2H7克隆所述的方法,制备了cDNA。使用下述的2种方法之一,克隆了scFv的可变结构域:第一种方法使用(Ig-Prime Kit Mouse Ig-Primer Set,Novagen)中所述的方法和引物,使用对每个V区基因家族特异性的简并的5′寡核苷酸家族和对轻链或重链的恒定区特异性的单个的3′引物。第二种方法使用(Gilliland LK等,Tissue Antigens 47:1-20(1995)中所述的锚加尾方法和引物。在任一种情况下,将PCR扩增的产物克隆进TOPO克隆载体(Invitrogen)。用EcoRI消化了克隆,并筛选合适大小的插入片段。如前面实施例1所述,对阳性克隆测序。
然后,为每个V区设计特定的引物,一个具有前导序列,一个没有。还将引物设计成,在引物末端包含需要的接头和/或限制位点。使用具有下述特征的25个循环程序,在TOPO克隆的DNA上进行PCR反应:94C,30秒;55C,30秒;72C,30秒,然后在72C最终延伸8分钟。凝胶纯化PCR产物,并使用QIAQUICK凝胶提取试剂盒(QIAGEN,Valencia,CA),回收片段。以1∶50稀释片段,并根据实施例1所述的方法,将1微升用于缝合PCR反应。下面的寡核苷酸用于G28-1 scFv的VL结构域的二级PCR反应:
具有SalI位点、没有前导序列的5′引物:
5’-GTTGTTGTCGACATCCAGATGACTCAGTC
   TCCA-3’(SEQ ID NO579)
具有HindIII位点和前导序列的5′引物:
5’-GTCAAGCTTGCCGCCATGGTATCCA
   CAGCTCAGTTCCTTGG-3’(SEQ ID NO:580)
3′引物:
5’-GCCACCCGACCCACCACCGCCCGAGCCACCGCCACCTTTGATCTCCA
   GTTCGGTG CC-3’(SEQ ID NO:581)
下面显示了用于VH结构域的引物:
5′有义引物:
TCGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCGTCAGCGGTCCAGCTGCA
GCAGTCTGGA-3’(SEQ ID NO582)
具有BclI位点的3′反义引物:
5’-TCAGTGCTGATCAGAAGAGACGGTGACTGAGGTTCCTTG-3’(SEQ ID NO:583)
通过定点诱变,将重链可变区的位置11(Kabat编号)处的亮氨酸向丝氨酸的变化,导入G28-1 scFv。通过缝合/重叠PCR,将(gly4ser)3(SEQ ID NO:529)接头插入如上所述的VL和VH结构域之间,初步构建了G28-1 scFv的野生型形式。但是,没有导入SacI位点,作为可变结构域的该融合体的一部分,所以可替代的、在亮氨酸11附近的限制位点(HaeII和PvuII)用于合成VL+突变的VH结构域。将引物设计成含有这些位点中的一个和包含L至S变化的DNA序列,继之以12野生型碱基对。该策略的几种尝试都失败了,所以将使用定点诱变的Genetailor(Invitrogen)方法的替代策略用于导入需要的突变。根据生产商的说明书,进行诱变。简而言之,该方法包含用DNA甲基化酶甲基化质粒DNA,用2个重叠引物(其中的一个含有靶突变)在诱变反应中扩增DNA,将该质粒转化进野生型大肠杆菌中,后者能消化所有甲基化的DNA,仅剩下未甲基化的、突变的扩增产物。2种引物均是约30个核苷酸长(不包括诱变引物上的突变位点),其具有15-20个核苷酸的5′末端重叠区,用于有效地末端连接诱变产物。用于诱变反应的模板是100ng含有野生型G28-1 scFvIg构建体的质粒,且用于G28-1 VH诱变的引物如下:
正向引物:
5’-GCAGCAGTCTGGACCTGAGTCGGAAAAGCCTG-3’(SEQ ID NO584)
反向引物:
5’-CTCAGGTCCAGACTGCTGCAGCTGGACCGC-3’(SEQ ID NO:585)
使用15ng甲基化的模板、上面的引物和如前所述的普通反应组分,进行了PCR反应。使用具有下述特征的20循环程序进行扩增:94C,30秒;55C,30秒;68C,8分钟,继之以最后的68C延伸步骤10分钟。将PCR产物转化进野生型细菌,并通过测序筛选克隆。分离了仅仅具有需要的突变的克隆,并如前面实施例33所述,制备了质粒。将突变体命名为G28-1 scFv VH L11S(SSS-S)H WCH2 WCH3。多核苷酸序列显示在SEQ ID NO:323,且编码的多肽序列显示在SEQ IDNO:324
根据实施例17所述的方法,使用免疫印迹分析,确认了G28-1融合蛋白的表达水平。图53说明了与没有突变的G28-1融合蛋白相比,VH L11S突变的G28-1融合蛋白的蛋白表达的大量增加。
瞬时转染了G28-1 scFv Ig融合蛋白,并根据实施例10所述的方法,在COS细胞中表达。图52说明了来自COS上清液的G28-1 scFvIg融合蛋白结合CD37的能力。Ramos和BJAB细胞都能表达人CD37,并因此用于筛选G28-1上清液的功能活性。根据实施例2所述的方法,通过流式细胞计,测量了G28-1 scFv(SSS-S)H WCH2 WCH3和G28-1 scFv VH L11S(SSS-S)H WCH2 WCH3与CD37+ Ramos细胞的结合。图上的每个点代表着5次重复转染的平均值。该图表明,G28-1scFv VH L11S(SSS-S)H WCH2 WCH3能结合CD37+ Ramos细胞。
用不同的连接区,制备了其他的构建体。用BclI和XbaI,消化了pD18 G28-1 scFv VH L11S(SSS-S)H WCH2 WCH3载体,以去除连接区CH2和CH3。根据实施例13所述的方法,用每种不同的连接区CH2和CH3替换它们。命名了新的构建体:G28-1 scFv VH L11S(CSS-S)H WH2 WH3(SEQ ID NO:325),G28-1 scFv VH L11S(CSC-S)H WH2 WH3(SEQ ID NO:327),G28-1 scFv VH L11S(SSC-P)H WH2WH3(SEQ ID NO:329),G28-1 scFv VH L11S(SCS-S)H WH2 WH3(SEQID NO:373),G28-1 scFv VH L11S(CCS-P)H WH2 WH3(SEQ ID NO:375)和G28-1 scFv VH L11S(SCC-P)H WH2 WH3(SEQ ID NO:377)。
还将G28-1 scFv附着到Ig连接区CH2、CH3和IgE CH2、CH3、CH4。使用上面的方法,消化了pD18 G28-1 scFv VH L11S(SSS-S)HWCH2 WCH3质粒,以去除连接区CH2和CH3。使用实施例13所述的方法,插入了IgA区域。将构建体命名为G28-1 scFv VH L11S IgAHIgACH2 T4CH3(SEQ ID NO:381)。使用实施例39所述的方法,将IgECH2 CH3 CH4区域插入上面的消化的pD18载体。将构建体命名为G28-1scFv VH L11S IgECH2 CH3 CH4(SEQ ID NO:379和383)。
实施例36
2H7 scFv Ig突变体融合蛋白的表征
图54说明了纯化的2H7 scFv Ig构建体与CD20+ CHO细胞的结合能力。根据实施例2所述的方法,将蛋白转染进稳定的CHO细胞。根据实施例2所述的方法,使用流式细胞计,测定了结合。图54中的图表明,这些蛋白能保留与具有改变的连接区的CD20的结合功能。在具有每种类型的改变的连接区的每个2H7 scFv VH L11S突变体中,得到了可比较的结果(省略了结果)。
使用100∶1比率的PBMC和BJAB细胞,在4小时的测定中,通过测量51Cr从标记的BJAB细胞的释放,测试了在有外周血单核细胞(PBMC)存在的情况下,具有突变的连接区的2H7scF′v-Ig构建体通过ADCC杀伤CD20阳性的细胞的能力。显示在图55中的结果表明,2H7scFv-Ig突变体可以介导依赖抗体的细胞毒性(ADCC),因为在有PBMC和2H7scFv-Ig两者存在的情况下的51Cr的释放显著高于有PBMC或2H7scFv-Ig单独存在的情况。在具有每种类型的改变的连接区的每个2H7scFv VH L11S突变体中,得到了可比较的结果(省略了结果)。
使用B细胞系Ramos靶细胞,测试了在有补体存在的情况下,2H7scFv-Ig突变体融合蛋白杀伤CD20阳性的细胞的能力。兔补体购自Pel-Freez(Rogers,AK),并以1/10的终浓度用于测定中。将纯化的2H7scFv-Ig与B细胞和补体一起在37℃温育45分钟,继之以通过锥虫蓝排除计数活细胞和死细胞。图56中的结果表明,在有兔补体存在的情况下,2H7scFv-Ig突变体能溶解表达CD20的B细胞。
实施例37
IgA、IgG和IgE 2H7 scFv构建体的可比较的结合
使用市场上可买到的(Caltag)对每个Ig尾特异性的第二步,根据实施例2所述的方法,使用流式细胞计,测量了Ig构建体IgA、IgG和IgE的结合能力。图57中的结果表明,所有的IgE构建体都能结合CD20+CHO细胞,这与IgG和IgA的结合能力相当。这些结果还表明,用IgE第二步(而不是IgA或IgG第二步)检测到了IgE构建体。
实施例38
2H7 VH L11S IgE构建体的构建和表征
使用QIAGEN QIA撕碎机匀浆和RNA小型试剂盒,从SKO-007细胞(ATCC)分离了IgE尾区RNA。根据普通的方法,用从QIAGEN柱洗脱的4微升RNA,生成了随机引发的cDNA。通过PCR扩增5微升cDNA,利用94C、60秒;72C、2分钟的35个循环的扩增特征和下面的引物,分离了从CH1开始至CH4(大约1.2kb)的人IgE:
5’引物:5’-ggatccacccgctgctgcaaaaacattccctccaatgccacctccgtgac-3’(SEQ ID NO:586)
3’引物:5’-tcatttaccgggatttacagacaccgctcgctggacggtctgtgaggggctcgctgc-3’(SEQ IDNO587)
将PCR片段连接进PCR 2.1-TOPO载体,并根据实施例1所述的方法,用EcoRI消化,筛选具有正确大小的插入片段的转化体。将具有正确序列的克隆之一用作模板,以扩增具有适当的限制位点的CH2-CH4结构域,所述位点被附着用于亚克隆成可溶的或细胞表面(ORF)形式。使用下面的引物,扩增特征为94C,60秒;55C,60秒;72C,2分钟;35个循环,以扩增大约950bp的片段:
5′引物:(附着BclI位点到IgE的CH2结构域的5′末端)
5’-gttgttgatcacgtctgctccagggacttcacc-3’(SEQ ID NO588)
3′引物:(附着终止密码子和XbaI位点到IgE的CH4的3′末端)
5’-gttgtttctagattatcatttaccaggatttacagacaccgctcgctg-3’(SEQ ID NO589)
3′引物:(附着SfuI和BamHI到没有终止密码子的CH4的3′末端)
5’-gttgttttcgaaggatccgctttaccagatttacagacaccgctcgctg-3’(SEQ ID NO590)
用BclI和XbaI消化了具有终止密码子的IgE CH2CH3CH4尾,并将其插入含有2H7 VHL11 S scFv的pD18载体。将该构建体命名为2H7 IgECH2CH3CH4。多核苷酸序列显示在SEQ ID NO:128,编码的多肽序列显示在SEQ ID NO:96。用BclI和SfuI消化没有终止密码子的IgE CH2CH3CH4尾(ORF),并将其插入含有2H7 VHL11 S scFv的pD18载体。将该构建体命名为2H7 IgECH2CH3CH4(ORF)。
还扩增了人IgE,作为缺少CH1和CH2结构域的片段,其中仅仅具有附着到人IgG1铰链上的CH3和CH4结构域。将使用重叠5′寡核苷酸的顺序PCR反应,用于附着IgG1铰链到人IgE的CH3结构域。
PCR反应的第一步的引物:
5’引物:5’-actcacacatccccaccgtccccagcatccaacccgagaggggtgagc-3’(SEQ ID NO591)
PCR反应的第二步的引物:
5’引物:5’-tctgatcaggagcccaaatcttctgacaaaactcacacatccccaccg-3’(SEQ ID NO:592)
3’引物:5’-gttgtttctagattatcatttaccaggatttacagacaccgctcgctg-3’(SEQ ID NO:593)
根据实施例1所述的方法,用EcoRI消化了PCR产物,并测序。将阳性的克隆插入含有2H7 VH L11S scFv(SSS-S)H的pD18质粒。将构建体命名为2H7 VH L11S scFv(SSS-S)H IgE CH3CH4。多核苷酸序列显示在SEQ ID NO:227,编码的多肽序列显示在SEQ ID NO:228
基本上根据实施例2,使用流式细胞计,测量了2H7 scFv VH L11SIgECH2 CH3 CH4的结合能力。使用MEP HyperCel,(Cipergen,目录号12035-010,Lot# 200920/0271)色谱树脂和疏水电荷感应色谱(HCIC),纯化了蛋白。HCIC吸收剂是高容量的、高选择性的吸收剂,其设计用于从各种来源(包括细胞培养物上清液)捕获和纯化单克隆和多克隆抗体。用10ml珠体积的MEP Hypercel装填柱,用含有0.1%NaN3的PBS(pH7.4)平衡。然后,在柱上运行大约1升2H7 scFv VHL11S IgE CH2CH3CH4 CHO培养物上清液。制备了pH 3-6的系列柠檬酸盐缓冲液,用于洗脱融合蛋白。在PBS中洗涤柱子。在pH6、5和4,在15个1ml级分中洗脱蛋白。在pH 3.5,收集最终的15ml级分。在A280,分析来自每个级分的等分试样,并将其还进行SDS-PAGE,其中基于A280读数,装载了大约10微克/孔。这2个分析的结果表明,大部分蛋白在更高的pH下不能在柠檬酸盐缓冲液中洗脱,但是能在pH4洗脱,且在pH 3.5洗脱后洗涤物中,也含有明显量的蛋白。
使用FITC-缀合的山羊-抗-人IgE,根据实施例2所述的方法,使用流式细胞计,测定了这些2H7 VH L11S IgE纯化的蛋白结合CD20+CHO细胞的能力。图58A表明,两种纯化的蛋白都能结合CD20+CHO细胞。
根据实施例2所述的方法,测量了这些2H7 VH L11S IgE纯化的蛋白介导PBMC效应物对BJAB靶细胞的ADCC的能力。图58B表明,两种蛋白都能以类似的水平介导ADCC。
实施例39
具有小鼠IgA和IgE尾区的scFv VH L11S突变体的构建和结合能力
使用基本上与在实施例38中克隆人IgE尾相同的方法,从鼠脾RNA克隆了鼠IgA。进行了PCR反应,其扩增特征为94C 60秒;52C60秒;72C 2分钟,共35个循环。
用于克隆CH1-CH4区域的PCR引物是:
5’引物:5’-atctgttctcctcctactactcctcctccacct-3’(SEQ ID NO:594)
3’引物:5’-tcagtagcagatgccatctccctctgacatgatgacagacacgct-3’(SEQ ID NO:595)
用于缺失CH1区域的PCR引物:
5’引物:5’-gttgttgatcacatctgttctcctcctactactcctcctccacct-3’(SEQ ID NO:596)
3′引物,其具有终止密码子、在Ig尾的XbaI位点和在CH3区域的T4突变:
5’-gttgtttctagattatcaatctccctctgacatgatgacagacac-3’(SEQ ID NO:597)
ORF、一个SfuI和BamHI位点和在CH3区域的T4突变的3′引物:
5’-gttcttcgaaggatccgcatctccctctgacatgatgac-3’(SEQ ID NO:598)
用BclI和XbaI消化了具有终止密码子的小鼠IgACH2 T4CH3尾,并将其插入含有2H7 VH L11S scfv和IgAH的pD18载体。将该构建体命名为2H7 VH L11S scFv IgAH mIgACH2 T4CH3。多核苷酸序列显示在SEQ ID NO:253,编码的多肽序列显示在SEQ ID NO:25
用BclI和SfuI消化了没有终止密码子的小鼠IgACH2 T4CH3尾(ORF),并将其插入含有2H7 VH L11S scFv和IgAH的pD18载体。将该构建体命名为2H7 VH L11S scFv IgAH mIgACH2 T4CH3(ORF)。多核苷酸序列显示在SEQ ID NO:255,编码的多肽序列显示在SEQ IDNO:256。
鼠IgE是基本上根据实施例38所述的方法克隆的鼠IgELa2(ATCC)RNA。进行了PCR反应,其扩增特征为94C 60秒;52C 60秒;72C 2分钟,共35个循环。最初的PCR引物用于克隆CH1-CH4:
5’引物:5’-tctatcaggaaccctcagctctaccccttgaagccctg-3’(SEQ ID NO:599)
3’引物:5’-gttgtttctagattatcaggatggacggagggaggtgttaccaaggct-3’(SEQ ID NO:600)
用于去除CH1区域的PCR引物:
5’引物:5’-gttgttgatcacgttcgacctgtcaacatcactgagcccacc-3’(SEQ ID NO:601)
3’引物,其具有终止密码子和XbaI位点:
5’-gttgtttctagattatcaggatggacggagggaggtgttaccaaggct-3’(SEQ ID NO:602)
3′引物ORF,Sful和BamHI:
5’-gttgttttcgaaggatccgcggatggacggagggaggtgtta-3’(SEQ ID NO:603)
用BclI和XbaI消化了具有终止密码子的小鼠IgE CH2CH3CH4尾,并将其插入含有2H7 VH L11S scFv的pD18载体。将该构建体命名为2H7 VH L11S mIgECH2CH3CH4。多核苷酸序列显示在SEQ ID NO:249,编码的多肽序列显示在SEQ ID NO:250
用BclI和SfuI消化了没有终止密码子的小鼠IgE CH2CH3CH4尾(ORF),并将其插入含有2H7 VH L11S scFv的pD18载体。将该构建体命名为2H7 VH L11S scFv mIgECH2CH3CH4(ORF)。多核苷酸序列显示在SEQ ID NO:249,编码的多肽序列显示在SEQ ID NO:250
使用市场上可买到的IgE或Ig第二步试剂(Caltag),根据实施例2所述的方法,通过流式细胞计,还测量了2H7 VH L11S mIgE和mIgA(具有小鼠尾区)与CD20+CHO细胞的结合能力。图59中的每个数据点代表着通过减去单独的第二步结合校正亮度的群体的平均值。该图表明,这些构建体具有结合CD20+CHO细胞的能力。
实施例40
2H7 scFv Ig突变体融合蛋白的HPLC分布图
具有改变的连接区域和CH3区域的纯化的2H7 scFv-Ig突变体融合蛋白的HPLC分析。通过转染的COS或CHO细胞的上清液的A蛋白亲和色谱,纯化了每种蛋白。以1ml/分钟,将溶于PBS中的25-50微克每种样品在TSK-GEL G3000SWXL 30cm柱(Tosoh Biosep,Stuttgart,德国)运行。在每个分布图的开始附近的箭标,代表着样品注射点。凝胶过滤标准物(Bio-Rad)包括thryoglobulin(670kDa)、γ球蛋白(158kDa)、卵清蛋白(44kDa)、肌红蛋白(12.5kDa)和维生素B-12(1.35kDa)。在每个实验的开始和末尾,运行标准物。显示了标准物的迁移位置,且在实验之间没有差异(图60-62)。
实施例41
2H7 VH L11S突变体融合蛋白的结合能力
将CH3突变体的结合作用与非-突变的CH3融合蛋白进行了对比。将构建体转染进COS细胞,并使用实施例2所述的A蛋白柱纯化技术,从上清液进行纯化。图63说明了根据实施例2所述的方法,使用流式细胞计测得的CH3突变对结合的有差别的作用。该图表明,当将双点突变导入CH3区域时,会丧失一些结合能力。
使用流式细胞计,测定了异硫氰酸荧光素(FITC)缀合的2H7 VHL11S突变体融合蛋白的结合。在DMSO中,制备了1mg/ml FITC的溶液。在4C,在2升体积的pH 9.3碳酸氢盐缓冲液中透析融合蛋白过夜。将蛋白的浓度调节至1-5mg/ml,然后进行缀合。向一系列的Falcon 5ml管设置不同的FITC与蛋白的比率,范围为15-60,但最小比率是20和40。在37C,将缀合反应物避光温育30分钟。在用PBS、0.5M NaCl和1% NaN3平衡的2ml Sephadex G-25柱上,从游离的荧光素分离出荧光素标记的蛋白。荧光素标记的蛋白首先从柱中洗脱,并收集进5ml管中。通过测量稀释的缀合物在280和494nm的吸光度,并利用Molecular Probes(Eugene,OR)的技术部门提供的公式,确定了标记的程度。已经为FITC:蛋白比率校正了数据。图64表明,当与荧光标记缀合时,这些构建体不会丧失结合能力。
根据实施例2所述的方法,在非还原SDS凝胶上运行纯化的2H7 VHL11S构建体。迁移模式显示在图65中。
实施例42
Lec13 CHO细胞中的2H7 scFv VH L11S(CSC-S)H WCH2 WCH3的表征
在Lec13 CHO细胞中瞬时转染并表达了2H7 scFv VH L11S(CSC-S)H WCH2 WCH3。将Lec13 CHO细胞用作能表达并行转染的质粒的2H7scFv VHS11 hIgG1(CSS-S)H WCH2 WCH3和(CSC-S)H WCH2 WCH3中的任一种的哺乳动物细胞宿主。在100mm组织培养皿中,进行所有的转染。当大约90%汇合时,根据生产商的说明书,使用lipofectamine 2000(Invitrogen,目录号:11668-027,0.75ml)转染了细胞。在有血清存在的情况下,使2种细胞系生长,以促进和维持向细胞培养皿的粘附,从而简化转染操作、洗涤和上清液收获。在没有有血清和抗生素的情况下,根据产品插页上记载的建议的规程/条件,使DNA:lipofectamine复合物能够形成。转染后72小时,收获培养物上清液,然后在第一次收获后72小时,再重复一次。通过如前所述的A蛋白纯化,从2种CHO来源分离了融合蛋白,并用于CD20结合和ADCC测定。
使用实施例2所述的方法,测定了突变的融合蛋白介导CD20阳性的细胞中的ADCC的能力。在Lec13 CHO细胞中表达的构建体能表现出更好的与CD20 CHO靶细胞的结合,还在ADCC测定中显示出与等同浓度的CHO DG44衍生蛋白相比明显改善的活性,如图67所示。
实施例43
高和低亲和力CD16等位基因的构建
使用PCR测定,从源自人PBMC的cDNA,克隆了在人CD16胞外结构域的位置158处的低(V)和高(F)亲和力等位基因。PCR反应使用随机引发的cDNA,后者从用固定化的抗-CD3抗体(64.1)刺激了3天,然后收获的PBMC制备。PCR反应物包含2、4、6或8微升cDNA,25pmol的每种引物,且扩增特征是94C 60秒;55C 60秒;72C 2分钟,35个循环。PCR引物如下:
5′引物-无前导肽:
5’-GTTGTTACCGGTGCAATGCGGACTGAAGATCTCCC
   AAAGGCTGTG-3’(SEQ ID NO:604)
3′反义引物:
5’-GTTGTTTGATCAGCCAAACCTTGAGTGATGGTGATGTTCACA-3’(SEQ ID NO:605)
对阳性的克隆测序,并将其插入含有有效的前导肽和(SSS-S)HP238SCH2 WCH3人IgG尾的载体。表达了2种不同形式的CD16 ED融合蛋白。第一种含有F158(高亲和力),第二种含有V158(低亲和力)等位基因。如前面在实施例1和10中所述,将构建体克隆进(SSS-S)H P238S CH2 WCH3 pD18质粒,并在COS和CHO细胞中表达。使用IgG夹心ELISA,筛选CHO克隆的表达,以使用下面的方案,来确定培养物上清液中的融合蛋白的相对表达水平:在4C,用溶于PBS缓冲液中的0.4微克/ml山羊抗-人IgG(小鼠吸附的)(CalTag,目录号H10500)包被了Immulon 1V平板。然后,在4C,在PBS/1.5%脱脂奶中封闭平板过夜。在PBS/0.1%Tween 20中洗涤平板3次,然后与来自CHO克隆培养物上清液的100微升稀释系列,在室温温育3小时。将每个克隆的四份稀释液加入连续的孔中,以5倍的增量从1∶5稀释至1∶375。另外,使用CTLA4 hIgG1(SSS-S)H P238SCH2 WCH3作为浓度标准,衍生了标准曲线。稀释系列利用5倍稀释,从0.5微克/ml开始;第二组8个孔用于制备从0.34微克/ml开始的2-倍稀释系列。在PBS/0.1%Tween 20中洗涤平板3次,与以1∶5000缀合辣根过氧化物酶的山羊抗-人IgG(GAH IgG-HRP)一起,在PBS/0.5%BSA中温育1小时。用PBS/0.1%Tween 20洗涤平板4次,然后加入TMBChromagen底物(BD-Pharmingen)10分钟,并通过加入100微升的1N硫酸,终止反应。然后,在SpectraCount平板读出器上,在415nm阅读平板。通过对比线性范围内的OD和在每个平板上运行的CTLA4Ig标准曲线,估计融合蛋白的浓度。
使用A蛋白纯化,纯化了蛋白,并如实施例42所述,直接地缀合到异硫氰酸荧光素(FITC)。根据实施例2所述的方法,在还原的和非还原的条件下,在SDS凝胶上运行这些蛋白。这些蛋白的迁移显示在图68中。
根据实施例2所述的方法,使用流式细胞计,测定了高和低CD16等位基因结合在CD20+CHO靶细胞的细胞表面上表达的2H7 VHL11S(CSC-S)H WCH2 WCH3或结合2H7 VHL11S(SSS-S)H(P238S)CH2 WCH3的能力。图69中的结果表明,高和低亲和力等位基因都能结合2H7 VHL11S(CSC-S)H WCH2 WCH3(SEQ ID NO:246,并在将P238S突变导入构建体的CH2区域(SEQ ID NOs:417和418)时,会丧失一些结合能力。
实施例44
哺乳动物展示系统
图70A图示了FcRIII(CD16)可溶融合蛋白的FITC缀合物如何结合到2H7 scFv-Ig构建体上,后者附着在由CHO细胞表达的CD20上。结合到scFv-Ig上的CD16,能提供用于检测结合到改变的含有靶向的或位点-特异性的突变的scFv-I g构建体上的CD16中的变化的筛选工具。CD16结合性质的变化,可以是CD16高亲和力蛋白(158F)或CD16低亲和力蛋白(158V)或二者的结合的变化。
图70B图示了这样的筛选方法的简图,其中scFv-Ig构建体展示在哺乳动物细胞的细胞表面上。本实施例中的scFv-Ig分子展示在细胞表面上,因为它们含有跨膜结构域锚。这些分子可以代表单个的scFv-Ig构建体,或者可以导入作为这样的分子的文库的一群哺乳动物细胞中。然后,通过改变选择条件的严格性和使用CD16融合蛋白作为结合探针,可以淘选、分选或者另外从其他细胞分离转染的具有改变的结合性质的细胞。可以分离能表达具有改变的与CD16高亲和力等位基因(158F)或CD16低亲和力等位基因(158V)或二者的结合的scFv-Ig分子的细胞。例如,可以使用该展示系统来建立具有短链的CH2序列的突变的Ig尾的文库,所述的CH2序列被随机化的寡核苷酸替换,或可能用所有可行的氨基酸取代(包括合成的氨基酸)随机化单个残基。一旦构建了这样的文库,就可以通过本领域众所周知的方法,将其转染进COS细胞。然后,可以使转染子结合标记的CD16构建体,并基于它们与多个等位型/同种型的相对结合性质,进行淘选或分选。收获淘选的细胞,分离质粒DNA,然后将其转化进细菌。该过程可以反复重复多次,直到从哺乳动物宿主细胞分离出单克隆(见Seed B和Aruffo A,PNAS 84:3365-3369(1987)和Aruffo A和Seed B,PNAS 84:8573-8577(1987))。这类筛选系统的一个这样的应用是分离Ig尾,其能同样较好地结合CD 16的高和低亲和力等位基因,目的是提高scFv-Ig构建体在多个患者亚群中介导的效应子功能。使用所述的展示系统,也可以选择具有改变的与其他Fc受体的结合性质的Ig尾。其他的展示系统,例如使用噬菌体或酵母的那些,不适用于选择具有改变的FcR结合性质的Ig尾,这是由于对在非-哺乳动物系统中不会发生的Ig CH2结构域糖基化作用的要求。
该系统也可以用于选择以更高的水平生产的改变的scFv-Ig分子。在本实施例中,可以用在质粒中的scFv-Ig构建体文库转染哺乳动物细胞例如COS细胞,所述的质粒能指导它们在细胞表面上的表达。通过本技术领域众所周知的技术(例如淘选、无菌的细胞分选、磁珠分离等),可以选择能表达最高水平的scFv-Ig分子的COS细胞,并分离质粒DNA,以用于转化进细菌中。选择几个回合后,分离能编码高水平表达的scFv-Ig分子的单克隆。当改变分离的克隆以去除膜锚、并随后在哺乳动物细胞中表达时,scFv-Ig构建体会以高水平分泌进培养液中。这能反映分泌的糖蛋白和细胞表面糖蛋白对信号肽和为表达而经高尔基体加工的共同需求,所以对能表现出提高的在细胞表面上的表达水平的分子的选择,也可以选择能表现出提高的分泌蛋白水平的分子。
实施例45
G28-1 mAb和scFv的表征
使用实施例3所述的方法,通过结合膜联蛋白V,测量了G28-1mAb和scFv诱导细胞凋亡的能力。图71中的结果证实,当用2H7抗体和scFv构建体一起处理时,能增强G28-1抗体和scFv的膜联蛋白V结合。
实施例46
FC2-2 scFv构建体的构建
使用从FC2-2杂交瘤分离的总RNA,进行了FC2-2(抗-CD 16)scFv的构建,并使用实施例35所述的方法,进行克隆。多核苷酸序列显示在SEQ ID NO:337,编码的多肽序列显示在SEQ ID NO:338。下面列出了二级PCR反应的特异性的引物。下面是轻链可变区的引物:
具有HindIII位点且没有前导序列的5′引物:
5’-GTTGTTAAGCTTGCCGCCATGGATTCAC
   AGGCCCAGGTTCTT-3’(SEQ ID NO606)
具有SalI位点和前导序列的5′引物:
5’-GTTGTTGTCGACATTGTGATGTCACAGTCTCC
   ATCCTCCCTA-3’(SEQ ID NO:607)
3′引物:
5’-TCAGTGCTGATCATGAGGAGACGGTGACTGAGGTTCCTT-3’(SEQ ID NO608)
下面是重链可变区的引物:
5′引物:
5’-TCGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCGTCACAGGTGCAGTTG
   AAGGAGTCAGGA-3’(SEQ ID NO:609)
3′引物:
5’-ACCCGACCCACCACCGCCCGAGCCACCGCCACCTTTTATTTCCAGCTTG
   GTGCCACCTCCGAA-3’(SEQ ID NO:610)
根据实施例33所述的方法,通过定点诱变,将重链可变区的位置11(Kabat编号)处的亮氨酸向丝氨酸的变化,导入FC2-2 scFv。根据实施例33所述的方法,将scFv附着到(SSS-S)H WCH2 WCH3 IgG尾上。将突变体命名为FC2-2 scFv VH L11S(SSS-S)H WCH2 WCH3。多核苷酸序列显示在SEQ ID NO:345,编码的多肽序列显示在SEQ IDNO:346
实施例47
5B9 scFv构建体的构建
使用实施例35所述的方法,使用从5B9杂交瘤分离的总RNA,进行5B9(抗-CD137)scFv的构建,并进行克隆。多核苷酸序列显示在SEQ ID NO:361,编码的多肽序列显示在SEQ ID NO:362。下面列出了二级PCR反应的特异性的引物。下面是轻链可变区的引物:
具有Hind III位点且没有前导序列的5′引物:
5’-GTTGTTAAGCTTGCCGCCATGAGGTTCT
   CTGCTCAGCTTCTG-3’(SEQ ID NO611)
具有Sa lI位点和前导序列的5′引物:
5’-GTTGTTGTCGACATTTGTGATGACGCAGGCTG
   CATTCTCCAATT-3’(SEQ ID NO:612)
3’引物:5’-TCAGTGCTGATCAGAGGAGGACGGTGACTGAGGTTCCTTG-3’(SEQID NO:613)
下面是重链可变区的引物:
CGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCGTCACAGGTGCAGCTGA
AGCAGTCAGGA-3’(SEQ ID NO614)
3’引物:5’-
CCCGACCCACCACCGCCCGAGCCACCGCCACCCTTCAGCTCCAGCTTG
GTGCCAGCACC-3’(SEQ ID NO:615)
根据实施例33所述的方法,通过定点诱变,将重链可变区的位置11(Kabat编号)处的亮氨酸向丝氨酸的变化,导入5B9 scFv,并附着到(SSS-S)H WCH2 WCH3上。将该构建体命名为5B9 scFv VH L11S(SSS-S)H WCH2 WCH3。多核苷酸序列显示在SEQ ID NO:365,编码的多肽序列显示在SEQ ID NO:366。
实施例48
UCHL1 scFv构建体的构建
使用实施例35所述的方法,使用从UCHL1杂交瘤分离的总RNA,进行UCHL1(抗-CD45RO)scFv的构建,并进行克隆。多核苷酸序列显示在SEQ ID NO:351,编码的多肽序列显示在SEQ ID NO:352。下面是轻链可变区的引物:
具有HindIII位点的5′引物:
5’-GTTGTTAAGCTTGCCGCCATGAAGTTGCCTGTTAGGCTG
TTGGTGCTG-3’(SEQ ID NO:616)
具有Sac位点的3′引物:
5’-AGAGCTCCCACCTCCTCCAGATCCACCACCGCCCGAGCCAC
CGCCATCTTTGATTTCCAGCTTGGT-3’(SEQ ID NO:617)
下面是重链可变区的引物:
5’引物:5’-
TTTCAGAGTAATCTGAGAGCTCCCACCTCCTCCAGATCCACCACCGC
CCGA-3’(SEQ ID NO618)
3’引物:5’-TCAGTGCTGATCATGCAGAGAGACAGTGACCAGAGTCCC-3’(SEQID NO619)
根据实施例33所述的方法,通过定点诱变,将重链可变区的位置11(Kabat编号)处的亮氨酸向丝氨酸的变化,导入5B9 scFv,并连接到(SSS-S)H WCH2 WCH3上。将突变体命名为UCHL1 scFv VH L11S(SSS-S)H WCH2 WCH3。多核苷酸序列显示在SEQ ID NO:359,编码的多肽序列显示在SEQ ID NO:360
实施例49
L6 VH L11S scFv(SSS-S)H WCH2 WCH3
根据实施例33所述的方法,通过定点诱变,将重链可变区的位置11(Kabat编号)处的亮氨酸向丝氨酸的变化,导入L6 scFv(SSS-S)H WCH2 WCH3(根据实施例106所述的方法构建)。使用L6 scFvIg(SSS-S)H WCH2 WCH3 pD18质粒作为模板。根据实施例33所述的方法,将阳性的克隆插入含有(SSS-S)H WCH2 WCH3的pD18质粒。将突变体命名为L6 scFv VH L11S(SSS-S)H WCH2 WCH3。多核苷酸序列显示在SEQ ID NO:415,编码的多肽序列显示在SEQ ID NO:416
下面列出了PCR引物:
具有PstI限制位点的5′引物:
5’-ggcggatctctgcagatccagttggtgcagtctggacctgagtcgaagaagcctggagag-3’(SEQ ID NO:620)
3’引物:5’-ggacagtgggagtggcacc-3’(SEQ ID NO:621)
实施例50
HD37scFv VH L11S构建体的构建
根据实施例33所述的方法,通过定点诱变,将重链可变区的位置11(Kabat编号)处的亮氨酸向丝氨酸的变化,导入HD37 scFv。使用HD37 scFv(SSS-S)H WCH2 WCH3 pD18质粒作为模板。根据实施例33所述的方法,将阳性的克隆插入含有(SSS-S)H WCH2 WCH3的pD18质粒。将突变体命名为HD37 scFv VH L11S(SSS-S)H WCH2 WCH3。多核苷酸序列显示在SEQ ID NO:401,编码的多肽序列显示在SEQ IDNO:402。下面列出了PCR引物:
5’引物:5’-caggttcagctgcagcagtctggggctgagtcggtgaggcctgg-3’(SEQ ID NO622)
3’引物:5’-ggaggattcgtctgcagtcagagtggc-3’(SEQ ID NO:623)
实施例51
2H7 scFv VH L11S构建体
用不同的连接区,制备了其他的2H7 VH L11S构建体。用BclI和XbaI消化了pD18 2H7 scFv VH L11S(SSS-S)H WCH2 WCH3载体,以去除连接区CH2和CH3。根据实施例13所述的方法,用每种不同的连接区CH2和CH3替换它们。将新的构建体命名为:2H7scFv VH L11S(CSS-S)H WH2 WH3(SEQ ID NO:371),2H7scFv VH L11S(CSC-S)HWH2 WH3(SEQ ID NO:245)。也将2H7 scFv VH L11S附着到IgA连接区CH2、CH3和IgE CH2、CH3、CH4。使用上面的方法,消化了pD18 2H7scFv VH L11S(SSS-S)H WCH2 WCH3质粒,以去除连接区CH2和CH3。使用实施例13所述的方法,插入IgA区域。将构建体命名为2H7 scFvVHL11S IgAH IgACH2 T4CH3(SEQ ID NO:251和253)。使用实施例39所述的方法,将IgE CH2 CH3 CH4区域插入消化的pD18载体。将构建体命名为2H7 scFv VHL11S IgECH2 CH3 CH4(SEQ ID NO:247)。
实施例52
2H7 scFv VH L11S(CSC-S)H WCH2 WCH3
该构建体具有2H7(抗-CD20)单链Fv结合区,后者具有在重链可变区的氨基酸残基11处的点突变,其中的亮氨酸已经改变成丝氨酸,如实施例33所述。该结合区连接到人IgG1连接区CH2和CH3区域,其中连接区中的第二个半胱氨酸和脯氨酸已经改变成丝氨酸(SSS-S),如实施例32所述。多核苷酸序列显示在SEQ ID NO:245,编码的多肽序列显示在SEQ ID NO:246。
实施例53
2H7 scFv VH L11S IgE CH2 CH3 CH4
该构建体具有2H7(抗-CD20)单链Fv结合区,后者具有在重链可变区的氨基酸残基11处的点突变,其中的亮氨酸已经改变成丝氨酸,如实施例33所述。该结合区附着到含有CH2、CH3和CH4的人IgE恒定区,如实施例38所述。多核苷酸序列显示在SEQ ID NO:247,编码的多肽序列显示在SEQ ID NO:248。
实施例54
2H7 scFv VH L11S mIgE CH2 CH3 CH4
该构建体具有2H7(抗-CD20)单链Fv结合区,后者具有在重链可变区的氨基酸残基11处的点突变,其中的亮氨酸已经改变成丝氨酸,如实施例33所述。该结合区附着到含有CH2、CH3和CH4的小鼠IgE恒定区,如实施例39所述。多核苷酸序列显示在SEQ ID NO:249,编码的多肽序列显示在SEQ ID NO:250。
实施例55
2H7 scFv VH L11S mIgAH WIgACH2 T4CH3
该构建体具有2H7(抗-CD20)单链Fv结合区,后者具有在重链可变区的氨基酸残基11处的点突变,其中的亮氨酸已经改变成丝氨酸,如实施例33所述。该结合区附着到来自人IgA的连接区,如实施例5所述。该连接区附着到由野生型CH2区域和突变的CH3区域组成的小鼠IgA恒定区,其中在3’终止密码子之前存在4个氨基酸残基的截短,如实施例39所述。多核苷酸序列显示在SEQ ID NO:253,编码的多肽序列显示在SEQ ID NO:254。
实施例56
2H7 scFv VH L11S(SSS-S)H K322S CH2 WCH3
该构建体具有2H7(抗-CD20)单链Fv结合区,后者具有在重链可变区的氨基酸残基11处的点突变,其中的亮氨酸已经改变成丝氨酸,如实施例33所述。该结合区连接到突变的人IgG连接区,其中根据实施例5所述的方法,已经将所有的半胱氨酸和一个脯氨酸改变成丝氨酸(SSS-S)。连接区附着到突变的IgG CH2区域和野生型IgGCH3区域。CH2区域中的K322S突变是在残基322,其中使用重叠PCR测定,已经将赖氨酸改变成丝氨酸。将pD18载体中的(SSS-S)H WCH2WCH3 IgG1模板用于PCR扩增,以建立含有这些CH2突变的(SSS-S)H衍生物。PCR反应使用下述的循环特征:94C,30秒;55C,30秒;72C,30秒,进行37个循环,以完成反应。使用顺序的PCR反应,在一级和二级反应中使用重叠寡核苷酸,构建了该IgG1衍生物。一级扩增引物能导入突变,但是缺失Fc结构域的一个末端。使用重叠引物,二级反应引物重新附着这些末端。在开始PCR时,加入第一种重叠引物,使反应进行12个循环,暂停,然后向反应物加入第二种重叠引物,继之以另外的25个循环,以完成重叠延伸PCR反应。
第一个PCR反应的引物:
5’引物:5’-ggagatggttttctcgatgggggctgggagggctttgttggagaccgagcacttgtactcc-3’(SEQ IDNO:624)
3’引物:5’-ggacagtgggagtggcacc-3’(SEQ ID NO:625)
将PCR产物克隆进TOPO载体,并进行测序验证。将阳性的载体用作第二个重叠PCR反应的模板。
5’引物:5’ccgtctctgatcaggagcccaaatcttctgacaaaactcacacatccccaccgtccccagc-3’(SEQ IDNO:626)
5’引物重叠引物:5’-tccccaccgtccccagcacctgaactcctggggggatcgtcagtcttcctcttccccccaaaacc-3’(SEQ ID NO:627)
3’引物:5’-caggaaacagctatgac-3’(SEQ ID NO:628)
将PCR产物克隆进TOPO载体,并测序。多核苷酸序列显示在SEQID NO:263,编码的多肽序列显示在SEQ ID NO:264。
实施例57
2H7 scFv VH L11S(CSS-S)H K322S CH2 WCH3
该构建体具有2H7(抗-CD20)单链Fv结合区,后者具有在重链可变区的氨基酸残基11处的点突变,其中的亮氨酸已经改变成丝氨酸,如实施例33所述。该结合区附着到突变的IgG连接区,其中根据实施例13所述的方法,已经将第二个和第三个半胱氨酸改变成丝氨酸,且已经将脯氨酸改变成丝氨酸(CSS-S)。连接区附着到突变的IgG CH2区域和野生型IgG CH3区域。CH2区域中的K322S突变是在残基322,其中使用重叠PCR测定,已经将赖氨酸改变成丝氨酸。该区域附着到突变的IgG CH2区域和野生型IgG CH3区域。通过基本上根据实施例57的重叠PCR反应,使用(CSS-S)H WCH2 WHC3 IgG1 pD18载体作为第一个PCR反应中的模板,在第二个PCR反应中使用下列的不同引物,加入CH2区域中的突变。
5’引物:5’-ccgtctctgatcaggaccccaaatcttgtgacaaaactcacacatccccaccgtccccagc-3’(SEQ IDNO:629)
5’重叠引物:5’tccccaccgtccccagcacctgaactcctggggggatcgtcagtcttcctcttccccccaaaacc-3’(SEQ ID NO:630)
3’引物:5’-caggaaacagctatgac-3’(SEQ ID NO:628)
将PCR产物克隆进TOPO载体,并测序。多核苷酸序列显示在SEQID NO:267,编码的多肽序列显示在SEQ ID NO:268。
实施例58
2H7 scFv VH L11S(SSS-S)H P331S CH2 WCH3
该构建体具有2H7(抗--CD20)单链Fv结合区,后者具有在重链可变区的氨基酸残基11处的点突变,其中的亮氨酸已经改变成丝氨酸,如实施例33所述。该结合区连接到突变的人IgG1连接区,其中根据实施例5所述的方法,已经将所有的半胱氨酸和一个脯氨酸改变成丝氨酸(SSS-S)。连接区附着到突变的IgG1 CH2区域和野生型IgG1 CH3区域。使用单个的PCR反应,使用(SSS-S)H WCH2 WCH3 pD18模板和下述循环特征:94C,30秒;55C,30秒;72C,30秒,进行37个循环,整合进CH2区域中的突变P331S突变,其中残基331处的脯氨酸已经改变成丝氨酸。下面列出了反应的特异性的引物。
5’引物:5’ccgtctctgatcaggagcccaaatcttctgacaaaactcacacatccccaccgtccccagc-3’(SEQ IDNO:631)
3’引物:5’-gcagggtgtacacctgtggttctcggggctgccctttggctttggagatggttttctcgatggaggctgggagg-3’(SEQ IDNO:632)
多核苷酸序列显示在SEQ ID NO:273,编码的多肽序列显示在SEQID NO:274。
实施例59
2H7 scFv VH L11S(CSS-S)H P331S CH2 WCH3
该结合区附着到突变的IgG连接区,其中根据实施例13所述的方法,已经将第二个和第三个半胱氨酸改变成丝氨酸,且已经将脯氨酸改变成丝氨酸(CSS-S)。连接区附着到突变的IgG CH2区域和野生型IgG CH3区域。使用单个的PCR反应,使用(CSS-S)H WCH2 WCH3 pD18模板和下述循环特征:94C,30秒;55C,30秒;72C,30秒,进行37个循环,整合进CH2区域中的突变P 331S突变,其中残基331处的脯氨酸已经改变成丝氨酸。下面列出了反应的特异性的引物。
5’引物:5’-ccgtctctgatcaggaccccaaatcttgtgacaaaactcacacatccccaccgtccccagc-3’(SEQ IDNO:633)
3’引物:5’-gcagggtgtacacctgtggttctcggggctgccctttggctttggagatggttttctcgatggaggctgggagg-3’(SEQ IDNO:634)
多核苷酸序列显示在SEQ ID NO:275,编码的多肽序列显示在SEQID NO:276。
实施例60
2H7 scFv VH L11S(SSS-S)H T256N CH2 WCH3
该构建体具有2H7(抗-CD20)单链Fv结合区,后者具有在重链可变区的氨基酸残基11处的点突变,其中的亮氨酸已经改变成丝氨酸,如实施例33所述。该结合区连接到突变的人IgG连接区,其中根据实施例5所述的方法,已经将所有的半胱氨酸和一个脯氨酸改变成丝氨酸(SSS-S)。连接区附着到突变的IgG CH2区域和野生型IgGCH3区域。使用实施例56所述的重叠PCR方法,导入了CH2区域的T256N突变,在残基256处的苏氨酸已经改变成天冬酰胺。下面列出了特异性的引物。
第一个PCR反应的引物:
5’引物:5’ttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggaaccctgaggtcac-3’(SEQ IDNO:635)
3’引物:5’-ggacagtgggagtggcacc-3’(SEQ ID NO:636)
将PCR产物克隆进TOPO载体,并测序。该产物用作第二个PCR反应的模板。第二个PCR反应的引物:
5’引物:5’ccgtctctgatcaggagcccaaatcttctgacaaaactcacacatccccaccgtccccagc-3’(SEQ IDNO:637)
5’重叠引物:5’-tccccaccgtccccagcacctgaactcctggggggatcgtcagtcttcctcttccccccaaaacc-3’(SEQ ID NO:638)
3’引物:5’-caggaaacagctatgac-3’(SEQ ID NO:628)
多核苷酸序列显示在SEQ ID NO:281,编码的多肽序列显示在SEQID NO:282
实施例61
2H7 scFv VH L11S(SSS-S)H RTPE/QNAK(255-258)CH2 WCH3
该构建体具有2H7(抗-CD20)单链Fv结合区,后者具有在重链可变区的氨基酸残基11处的点突变,其中的亮氨酸已经改变成丝氨酸,如实施例33所述。该结合区连接到突变的人IgG连接区,其中根据实施例5所述的方法,已经将所有的半胱氨酸和一个脯氨酸改变成丝氨酸(SSS-S)。连接区附着到突变的IgG CH2区域和野生型IgGCH3区域。使用实施例56所述的重叠PCR反应,导入了CH2区域的RTPE/QNAK突变,其中残基255-258已经分别从精氨酸、苏氨酸、脯氨酸、谷氨酸突变成谷氨酰胺、天冬酰胺、丙氨酸和赖氨酸。下面列出了特异性的引物。
第一个PCR反应的PCR引物:
5’引物:5’-ttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccagaacgctaaggtcacatgc-3’(SEQID NO:641)
3’引物:5’-ggacagtgggagtggcacc-3’(SEQ ID NO:636)
将PCR产物克隆进TOPO载体,测序,并用作第二个PCR反应的模板。第二个PCR反应的引物:
5引物:5’ccgtctctgatcaggagcccaaatcttctgacaaaactcacacatccccaccgtccccagc-3’(SEQ IDNO:637)
5’重叠引物:5’-tccccaccgtccccagcacctgaactcctggggggatcgtcagtcttcctcttccccccaaaacc-3’(SEQ ID NO:638)
3’引物:5’-caggaaacagctatgac-3’(SEQ ID NO:628)
多核苷酸序列显示在SEQ ID NO:289,编码的多肽序列显示在SEQID NO:290
实施例62
2H7 scFv VH L11S(SSS-S)H K290Q CH2 WCH3
该构建体具有2H 7(抗-CD20)单链Fv结合区,后者具有在重链可变区的氨基酸残基11处的点突变,其中的亮氨酸已经改变成丝氨酸,如实施例33所述。该结合区连接到突变的人IgG1连接区,其中根据实施例5所述的方法,已经将所有的半胱氨酸和一个脯氨酸改变成丝氨酸(SSS-S)。连接区附着到突变的人IgG1CH2区域和野生型人IgG1 CH3区域。使用单个的PCR反应,根据实施例58所述的方法,导入了CH2区域的K290Q突变,其中在残基290处的赖氨酸已经改变成谷氨酰胺。下面列出了在该反应中使用的特异性的引物。
5’引物:5’ccgtctctgatcaggagcccaaatcttctgacaaaactcacacatccccaccgtccccagc-3’(SEQ IDNO:642)
3’引物:5’-gctcccgcggctgtgtcttggc-3’(SEQ ID NO:645)
将PCR产物克隆进TOPO,并测序。多核苷酸序列显示在SEQ IDNO:297,编码的多肽序列显示在SEQ ID NO:298
实施例63
2H7 scFv VH L11S(SSS-S)H A339P CH2 WCH3
该构建体具有2H7(抗-CD20)单链Fv结合区,后者具有在重链可变区的氨基酸残基11处的点突变,其中的亮氨酸已经改变成丝氨酸,如实施例33所述。该结合区连接到突变的人IgG1连接区,其中根据实施例5所述的方法,已经将所有的半胱氨酸和一个脯氨酸改变成丝氨酸(SSS-S)。连接区附着到突变的人IgG1 CH2区域和野生型人IgG1 CH3区域。使用单个的PCR反应,根据实施例58所述的方法,导入了CH2区域的A339P突变,其中在残基339处的丙氨酸已经改变成脯氨酸。下面列出了在该反应中使用的特异性的引物。
5’引物:5’ccgtctctgatcaggagcccaaatcttctgacaaaactcacacatccccaccgtccccagc-3’(SEQ IDNO:644)
3’引物:5’-ggaggtgggcagggtgtacacctgtggttctcggggctgccctttgggtttggagatgg-3’(SEQ IDNO:647)
将PCR产物克隆进TOPO,并测序。多核苷酸序列显示在SEQ IDNO:305,编码的多肽序列显示在SEQ ID NO:306
实施例64
G28-1 scFv(SSS-S)H WCH2 WCH3
该构建体具有根据实施例35所述的方法制备的G28-1(抗-CD37)单链Fv结合区。该结合区连接到突变的人IgG1连接区,其中根据实施例5所述的方法,已经将所有的半胱氨酸和一个脯氨酸改变成丝氨酸(SSS-S)。该连接区连接到野生型人IgG1 CH2和CH3区域,如实施例1所述。该构建体以前被称作G28-1 MHWTG1C和G28-1 scFv Ig,二者均具有与上面的构建体相同的序列。多核苷酸序列显示在SEQ IDNO:319,编码的多肽序列显示在SEQ ID NO:320
实施例65
G28-1 scFv IgAH WCH2 WCH3
该构建体具有根据实施例35所述的方法制备的G28-1(抗-CD37)单链Fv结合区。该结合区连接到人Ig连接区和野生型人IgG CH2和CH3恒定区,如实施例5所述。该构建体以前被称作:G28-1-IgAHWTG1C。多核苷酸序列显示在SEQ ID NO:321,编码的多肽序列显示在SEQ ID NO:322
实施例66
G28-1 scFv VH L11S(SSS-S)H WCH2 WCH3
该构建体具有G28-1(抗-CD 37)单链Fv结合区,后者具有在重链可变区的氨基酸残基11处的点突变,其中亮氨酸已经改变成丝氨酸,如实施例35所述。该结合区连接到突变的人IgG1连接区,其中根据实施例5所述的方法,已经将所有的半胱氨酸和一个脯氨酸改变成丝氨酸(SSS-S)。该连接区附着野生型人IgG1 CH2和CH3区域,如实施例1所述。多核苷酸序列显示在SEQ ID NO:323,编码的多肽序列显示在SEQ ID NO:324。
实施例67
G28-1 scFv VH L11S(CSS-S)H WCH2 WCH3
该构建体具有G28-1(抗-CD37)单链Fv结合区,后者具有在重链可变区的氨基酸残基11处的点突变,其中亮氨酸已经改变成丝氨酸,如实施例35所述。该结合区附着到人突变的人IgG1连接区,其中根据实施例13所述的方法,已经将第二个和第三个半胱氨酸改变成丝氨酸,且已经将脯氨酸改变成丝氨酸(CSS-S)。该连接区附着到野生型人IgG1 CH2和CH3区域,如实施例1所述。多核苷酸序列显示在SEQ ID NO:325,编码的多肽序列显示在SEQ ID NO:326。
实施例68
G28-1 scFv VH L11S(CSC-S)H WCH2 WCH3
该构建体具有G28-1(抗-CD37)单链Fv结合区,后者具有在重链可变区的氨基酸残基11处的点突变,其中亮氨酸已经改变成丝氨酸,如实施例35所述。该结合区附着到人突变的人IgG1连接区,其中根据实施例32所述的方法,已经将第二个半胱氨酸和脯氨酸改变成丝氨酸(CSC-S)。该连接区附着到野生型人IgG1 CH2和CH3区域,如实施例1所述。多核苷酸序列显示在SEQ ID NO:327,编码的多肽序列显示在SEQ ID NO:328
实施例69
G28-1 scFv VH L11S(SSC-P)H WCH2 WCH3
该构建体具有G28-1(抗-CD37)单链Fv结合区,后者具有在重链可变区的氨基酸残基11处的点突变,其中亮氨酸已经改变成丝氨酸,如实施例35所述。该结合区附着到突变的人IgG1连接区,其中根据实施例13所述的方法,已经将第一个和第二个半胱氨酸改变成丝氨酸(SSC-P)。该连接区连接到野生型人IgG1 CH2和CH3区域,如实施例1所述。多核苷酸序列显示在SEQ ID NO:329,编码的多肽序列显示在SEQ ID NO:330
实施例70
CTLA4(SSS-S)H P238SCH2 WCH3
该构建体具有胞外CTLA-4结合区,如实施例14所述。该结合区连接到突变的人IgG1连接区,其中根据实施例5所述的方法,已经将所有的半胱氨酸和一个脯氨酸改变成丝氨酸(SSS-S)。该铰链区附着到突变的人IgG1 CH2区域和野生型人IgG1 CH3区域。使用PCR测定,导入了P238S突变,其中在残基238处的脯氨酸改变成了丝氨酸。使用随机引发的从人扁桃体B细胞RNA制备的cDNA,进行了PCR反应。PCR扩增使用下述的扩增特征:94C 4分钟;[94C 1分钟;55C1分钟;72C I分钟;进行30个循环,继之以最后的在72C 6分钟的延伸步骤。TOPO克隆PCR片段,并对具有大约800bp的EcoRI插入片段的克隆进行测序,如实施例1所述。下面列出了用于该PCR的引物:
5’引物:5’-gttgttgatcaggagcccaaatcttctgacaaaactcacacatctccaccgtccccagcacctgaactcctgggtggaccgtcagtcttcc-3’(SEQ ID NO:648)
3’引物:5’gttgtttctagattatcatttacccggagacag-3’(SEQ ID NO:649)
该构建体以前被称作CTLA-4 IgG MTH(SSS)MTCH2WTCH3,其具有与上面的构建体相同的序列。多核苷酸序列显示在SEQ ID NO:331,编码的多肽序列显示在SEQ ID NO:332。
实施例71
CTLA4(CCC-P)WH WCH2 WCH3
该构建体具有CTLA-4结合区,如实施例14所述。该结合区附着到野生型人IgG1连接区(CCC-P),如实施例1所述。该连接区连接到野生型人IgG1 CH2和CH3区域,如实施例1所述。该构建体以前被称作CTLA-4 IgG WTH(CCC)WTCH2CH3,其具有与上面的构建体相同的序列。多核苷酸序列显示在SEQ ID NO:47,编码的多肽序列显示在SEQ ID NO:78
实施例72
FC2-2 scFv(SSS-S)H WCH2 WCH3
该构建体具有根据实施例46所述的方法制备的FC2-2(抗-CD16)单链Fv。该结合区连接到突变的人IgG1连接区,其中根据实施例5所述的方法,已经将所有的半胱氨酸和一个脯氨酸改变成丝氨酸(SSS-S)。该连接区连接到野生型人IgG1 CH2和CH3区域,如实施例1所述。多核苷酸序列显示在SEQ ID NO:343,编码的多肽序列显示在SEQ ID NO:344
实施例73
FC2-2 scFv VH L11S(SSS-S)H WCH2 WCH3
该构建体具有FC2-2(抗-CD16)单链Fv,后者具有在重链可变区的氨基酸残基11处的点突变,其中亮氨酸已经改变成丝氨酸,如实施例46所述。该结合区连接到突变的人IgG1连接区,其中根据实施例5所述的方法,已经将所有的半胱氨酸和一个脯氨酸改变成丝氨酸(SSS-S)。该连接区连接到野生型人IgG1 CH2和CH3区域,如实施例1所述。多核苷酸序列显示在SEQ ID NO:345,编码的多肽序列显示在SEQ ID NO:346
实施例74
UCHL-1 scFv(SSS-S)H WCH2 WCH3
该构建体具有根据实施例48所述的方法制备的UCHL-1(抗-CD45RO)单链Fv。该结合区连接到突变的人IgG1连接区,其中根据实施例5所述的方法,已经将所有的半胱氨酸和一个脯氨酸改变成丝氨酸(SSS-S)。该连接区连接到野生型人IgG1 CH2和CH3区域,如实施例1所述。多核苷酸序列显示在SEQ ID NO:357,编码的多肽序列显示在SEQ ID NO:358
实施例75
UCHL-1 scFv VH L11S(SSS-S)H WCH2 WCH3
该构建体具有UCHL-1(抗-CD45RO)单链Fv,后者具有在重链可变区的氨基酸残基11处的点突变,其中亮氨酸已经改变成丝氨酸,如实施例48所述。该结合区连接到突变的人IgG1连接区,其中根据实施例5所述的方法,已经将所有的半胱氨酸和一个脯氨酸改变成丝氨酸(SSS-S)。该连接区连接到野生型人IgG1 CH2和CH3恒定区,如实施例1所述。多核苷酸序列显示在SEQ ID NO:359,编码的多肽序列显示在SEQ ID NO:360。
实施例76
5B9 scFv(SSS-S)H WCH2 WCH3
该构建体具有根据实施例47所述的方法制备的5B9(抗-CD137)单链Fv。该结合区连接到突变的人IgG1连接区,其中根据实施例5所述的方法,已经将所有的半胱氨酸和一个脯氨酸改变成丝氨酸(SSS-S)。该连接区连接到野生型人IgG1 CH2和CH3恒定区,如实施例1所述。该构建体以前被称作5B9 scFv IgG MTH(SSS)WTCH2CH3,其具有与上面的构建体相同的序列。多核苷酸序列显示在SEQ IDNO:132,编码的多肽序列显示在SEQ ID NO:133
实施例77
5B9 scFv VH L11S(SSS-S)H WCH2 WCH3
该构建体具有5B9(抗-CD137)单链Fv,后者具有在重链可变区的氨基酸残基11处的点突变,其中亮氨酸已经改变成丝氨酸,如实施例47所述。该结合区连接到突变的人IgG1连接区,其中根据实施例5所述的方法,已经将所有的半胱氨酸和一个脯氨酸改变成丝氨酸(SSS-S)。该连接区连接到野生型人IgG1 CH2和CH3恒定区,如实施例1所述。多核苷酸序列显示在SEQ ID NO:365,编码的多肽序列显示在SEQ ID NO:366
实施例78
2H7 scFv(SSS-S)H WCH2 WCH3
该构建体具有如实施例1所述的2H7(抗-CD20)单链Fv结合区。该结合区连接到突变的人IgG1连接区,其中根据实施例5所述的方法,已经将所有的半胱氨酸和一个脯氨酸改变成丝氨酸(SSS-S)。该连接区连接到野生型IgG1 CH2和CH3恒定区,如实施例1所述。该构建体以前被称作2H7-MHWTG1C、CytoxB-(MHWTG1C)-Ig、抗-CD20scFv IgG MTH(SSS)WTCH2CH3、CytoxB-MHWTG1C、2H7 scFv-人IgG1野生型铰链-CH2-CH3和2H7scFv IgG MTH(SSS)WTCH2CH3,它们都具有与上面的构建体相同的序列。多核苷酸序列显示在SEQ ID NO:57,编码的多肽序列显示在SEQ ID NO:58
实施例79
2H7 scFv(SSS-S)H P238SCH2 WCH3
该构建体具有如实施例1所述的2H7(抗-CD20)单链Fv结合区。该结合区连接到突变的人IgG1连接区,其中根据实施例5所述的方法,已经将所有的半胱氨酸和一个脯氨酸改变成丝氨酸(SSS-S)。该结合区连接到突变的人IgG1连接区,其中根据实施例5所述的方法,已经将所有的半胱氨酸和一个脯氨酸改变成丝氨酸(SSS-S)。该铰链区附着到突变的人IgG1 CH2区域和野生型人IgG1 CH3区域。根据实施例70所述的方法,导入了P238S突变,其中在残基238处的脯氨酸改变成丝氨酸。该构建体以前被称作2H7 scFv IgG MTH(SSS)MTCH2WTCH3、抗-CD20 scFv IgG MTH(SSS)MTCH2CH3和CytoxB-MHMG1C,它们都具有与上面的构建体相同的序列。多核苷酸序列显示在SEQ ID NO:419,编码的多肽序列显示在SEQ ID NO:420
实施例80
2H7 scFv IgAH WCH2 WCH3
该构建体具有如实施例1所述的2H7(抗-CD20)单链Fv结合区。该结合区连接到人IgA连接区和野生型人IgG1 CH2和CH3恒定区,如实施例5所述。该构建体以前被称作2H7 scFv IgAH IgG WTCH2CH3、2H7 scFv IgA铰链-IgG1 CH2-CH3和CytoxB-IgAHWTHG1C,它们都具有与上面的构建体相同的序列。多核苷酸序列显示在SEQ ID NO:59,编码的多肽序列显示在SEQ ID NO:60
实施例81
2H7 scFv IgAH WIgACH2 T4CH3
该构建体具有如实施例1所述的2H7(抗-CD20)单链Fv结合区。该结合区附着到来自人IgA的连接区,如实施例5所述。该连接区附着到由野生型CH2区域和突变的CH3区域组成的人IgA恒定区,其中在3′终止密码子之前存在4个氨基酸残基的截短,如实施例13所述。该构建体以前被称作2H7 scFv IgAH IgAT4,其具有与上面的构建体相同的序列。多核苷酸序列显示在SEQ ID NO:70,编码的多肽序列显示在SEQ ID NO:71
实施例82
2H7 scFv IgAH WIgACH2 WCH3+J链
该构建体具有如实施例1所述的2H7(抗-CD20)单链Fv结合区。该结合区附着到野生型人IgA连接区,如实施例5所述。根据实施例13所述的方法,将该连接区附着到野生型人IgA CH2和CH3恒定区。该恒定区附着到J-链区域,如实施例13所述。多核苷酸序列显示在SEQ ID NO:61,编码的多肽序列显示在SEQ ID NO:62
实施例83
2H7 scFv(CCC-P)WH WCH2 WCH3
该构建体具有如实施例1所述的2H7(抗-CD20)单链Fv结合区。该结合区附着到野生型人IgG1连接区(CCC-P),如实施例1所述。该连接区附着到野生型人IgG1 CH2和CH3恒定区,如实施例1所述。该构建体以前被称作2H7 scFv Ig WTH(CCC)WTCH2CH3、2H7 scFv IgGWTH WTCH2CH3和2H7 scFv-Ig,它们二者都具有与上面的构建体相同的序列。多核苷酸序列显示在SEQ 1D NO:688,编码的多肽序列显示在SEQ ID NO:689
实施例84
2H7 scFv(SSS-S)H WCH2 F405YCH3
该构建体具有如实施例1所述的2H7(抗-CD20)单链Fv结合区。该结合区连接到突变的人IgG连接区,其中根据实施例5所述的方法,已经将所有的半胱氨酸和一个脯氨酸改变成丝氨酸(SSS-S)。该连接区附着到野生型人IgG1 CH2和突变的人IgG1 CH3区域。根据实施例21所述的方法,导入了F405Y突变,其中在残基405处的苯丙氨酸已经改变成酪氨酸。该构建体以前被称作2H7 scFv MTH WTCH2 MTCH3Y405,其具有与上面的构建体相同的序列。多核苷酸序列显示在SEQID NO:153,编码的多肽序列显示在SEQ ID NO:154
实施例85
2H7 scFv(SSS-S)H WCH2 F405 ACH3
该构建体具有如实施例1所述的2H7(抗-CD20)单链Fv结合区。该结合区连接到突变的人IgG1连接区,其中根据实施例5所述的方法,已经将所有的半胱氨酸和一个脯氨酸改变成丝氨酸(SSS-S)。该连接区附着到野生型人IgG1 CH2和突变的人IgG1 CH3区域。根据实施例21所述的方法,导入了F405A突变,其中在残基405处的苯丙氨酸已经改变成丙氨酸。该构建体以前被称作2H7s cFv MTH WTCH2MTCH 3A405,其具有与上面的构建体相同的序列。多核苷酸序列显示在SEQ ID NO:155,编码的多肽序列显示在SEQ ID NO:156
实施例86
2H7 scFv(SSS-S)H WCH2 Y407ACH3
该构建体具有如实施例1所述的2H7(抗-CD20)单链Fv结合区。该结合区连接到突变的人IgG1连接区,其中根据实施例5所述的方法,已经将所有的半胱氨酸和一个脯氨酸改变成丝氨酸(SSS-S)。该连接区附着到野生型人IgG1 CH2和突变的人IgG1 CH3区域。根据实施例21所述的方法,导入了Y407A突变,其中在残基407处的酪氨酸已经改变成丙氨酸。该构建体以前被称作scFv MTH WTCH2 MTCH3A407,其具有与上面的构建体相同的序列。多核苷酸序列显示在SEQID NO:157,编码的多肽序列显示在SEQ ID NO:158
实施例87
2H7 scFv(SSS-S)HWCH2 F405A,Y407ACH3
该构建体具有如实施例1所述的2H7(抗-CD20)单链Fv结合区。该结合区连接到突变的人IgG1连接区,其中根据实施例5所述的方法,已经将所有的半胱氨酸和一个脯氨酸改变成丝氨酸(SSS-S)。该连接区附着到野生型人IgG1 CH2和突变的人IgG1 CH3区域。根据实施例21所述的方法,导入了F405A和Y407A突变,其中在残基405处的苯丙氨酸已经改变成丙氨酸,且在残基407处的酪氨酸已经改变成丙氨酸。该构建体以前被称作scFv MTH WTCH2 MTCH3 A405A407,其具有与上面的构建体相同的序列。多核苷酸序列显示在SEQ IDNO:161,编码的多肽序列显示在SEQ ID NO:162
实施例88
2H7 scFv(CSS-S)H WCH2 WCH3
该构建体具有如实施例1所述的2H7(抗-CD20)单链Fv结合区。该结合区附着到突变的人IgG1连接区,其中根据实施例13所述的方法,已经将第二个和第三个半胱氨酸改变成丝氨酸,且已经将脯氨酸改变成丝氨酸(CSS-S)。该连接区附着到野生型人IgG1 CH2和CH3恒定区,如实施例1所述。该构建体以前被称作2H7 scFv MTH(CSS)WTCH2CH3,其具有与上面的构建体相同的序列。多核苷酸序列显示在SEQ ID NO:134,编码的多肽序列显示在SEQ ID NO:135
实施例89
2H7 scFv(SCS-S)H WCH2 WCH3
该构建体具有如实施例1所述的2H7(抗-CD20)单链Fv结合区。该结合区附着到突变的人IgG1连接区,其中根据实施例13所述的方法,已经将第一个和第三个半胱氨酸改变成丝氨酸,且已经将脯氨酸改变成丝氨酸(SCS-S)。该连接区附着到野生型人IgG1 CH2和CH3恒定区,如实施例1所述。该构建体以前被称作2H7 scFv IgG MTH(SCS)WTCH2CH3,其具有与上面的构建体相同的序列。多核苷酸序列显示在SEQ ID NO:136,编码的多肽序列显示在SEQ ID NO:137
实施例90
2H7 scFv(SSC-P)H WCH2 WCH3
该构建体具有如实施例1所述的2H7(抗-CD20)单链Fv结合区。该结合区附着到突变的人IgG1连接区,其中根据实施例13所述的方法已经将第一个和第二个半胱氨酸改变成丝氨酸(SSC-P)。该连接区附着到野生型人IgG1 CH2和CH3恒定区,如实施例1所述。该构建体以前被称作2H7 scFv MTH(SSC)WTCH2CH3,其具有与上面的构建体相同的序列。多核苷酸序列显示在SEQ ID NO:138,编码的多肽序列显示在SEQ ID NO:139
实施例91
2H7 scFv(CSC-S)H WCH2 WCH3
该构建体具有如实施例1所述的2H7(抗-CD20)单链Fv结合区。该结合区附着到突变的人IgG1连接区,其中根据实施例32所述的方法,已经将第二个半胱氨酸和脯氨酸改变成丝氨酸(CSC-S)。该连接区附着到野生型人IgG1 CH2和CH3恒定区,如实施例1所述。该构建体以前被称作2H7 scFv MTH(CSC)WTCH2CH3,其具有与上面的构建体相同的序列。多核苷酸序列显示在SEQ ID NO:165,编码的多肽序列显示在SEQ ID NO:166
实施例92
2H7 scFv(CCS-P)H WCH2 WCH3
该构建体具有如实施例1所述的2H7(抗-CD20)单链Fv结合区。该结合区附着到突变的人IgG1连接区,其中根据实施例22所述的方法,已经将第三个半胱氨酸改变成丝氨酸(CCS-P)。该连接区附着到野生型人IgG1 CH2和CH3恒定区,如实施例1所述。该构建体以前被称作2H7 scFv MTH(CCS)WTCH2CH3,其具有与上面的构建体相同的序列。多核苷酸序列显示在SEQ ID NO:167,编码的多肽序列显示在SEQ ID NO:168
实施例93
2H7 scFv(SCC-P)H WCH2 WCH3
该构建体具有如实施例1所述的2H7(抗-CD20)单链Fv结合区。该结合区附着到突变的人IgG1连接区,其中根据实施例32所述的方法,已经将第一个半胱氨酸改变成丝氨酸(SCC-P)。该连接区附着到野生型人IgG1 CH2和CH3恒定区,如实施例1所述。该构建体以前被称作2H7 scFv MTH(SCC)WTCH2CH3,其具有与上面的构建体相同的序列。多核苷酸序列显示在SEQ ID NO:163,编码的多肽序列显示在SEQ ID NO:164
实施例94
2H7 scFv VH L11S(SSS-S)H WCH2 WCH3
该构建体具有2H7(抗-CD20)单链Fv结合区,后者具有在重链可变区的氨基酸残基11处的点突变,其中亮氨酸已经改变成丝氨酸,如实施例33所述。该结合区连接到突变的人IgG1连接区,其中根据实施例5所述的方法,已经将所有的半胱氨酸和一个脯氨酸改变成丝氨酸(SSS-S)。该连接区附着到野生型人IgG1 CH2和CH3恒定区,如实施例1所述。该构建体以前被称作2H7scFv VH11SER IgG MTH(SSS)WTCH2CH3和2H7 scFv VHSER11 WTH WTCH2CH3,它们二者都具有与上面的构建体相同的序列。多核苷酸序列显示在SEQ ID NO:369,编码的多肽序列显示在SEQ ID NO:370
实施例95
2H7 scFv VH L11S(CSS-S)H WCH2 WCH3
该构建体具有2H7(抗-CD20)单链Fv结合区,后者具有在重链可变区的氨基酸残基11处的点突变,其中亮氨酸已经改变成丝氨酸,如实施例33所述。该结合区附着到突变的人IgG1连接区,其中根据实施例13所述的方法,已经将第二个和第三个半胱氨酸改变成丝氨酸,且已经将脯氨酸改变成丝氨酸(CSS-S)。该连接区附着到野生型人IgG1 CH2和CH3恒定区,如实施例1所述。多核苷酸序列显示在SEQ ID NO:371,编码的多肽序列显示在SEQ ID NO:372
实施例96
G28-1 scFv VH L11S(SCS-S)H WCH2 WCH3
该构建体具有G28-1(抗-CD37)单链Fv结合区,后者具有在重链可变区的氨基酸残基11处的点突变,其中亮氨酸已经改变成丝氨酸,如实施例35所述。该结合区附着到突变的人IgG1连接区,其中根据实施例13所述的方法,已经将第一个和第三个半胱氨酸已经改变成丝氨酸,且已经将脯氨酸改变成丝氨酸(SCS-S)。该连接区附着到野生型人IgG1 CH2和CH3恒定区,如实施例1所述。多核苷酸序列显示在SEQ ID NO:373,编码的多肽序列显示在SEQ ID NO:374
实施例97
G28-1 scFv VH L11S(CCS-P)H WCH2 WCH3
该构建体具有G28-1(抗-CD37)单链Fv结合区,后者具有在重链可变区的氨基酸残基11处的点突变,其中亮氨酸已经改变成丝氨酸,如实施例35所述。该结合区附着到突变的人IgG1连接区,其中根据实施例22所述的方法,已经将第三个半胱氨酸改变成丝氨酸(CCS-P)。该连接区附着到野生型人IgG1 CH2和CH3恒定区,如实施例1所述。多核苷酸序列显示在SEQ ID NO:375,编码的多肽序列显示在SEQ ID NO:376
实施例98
G28-1 scFv VH L11S(SCC-P)H WCH2 WCH3
该构建体具有G28-1(抗-CD37)单链Fv结合区,后者具有在重链可变区的氨基酸残基11处的点突变,其中亮氨酸已经改变成丝氨酸,如实施例35所述。该结合区附着到突变的人IgG1连接区,其中根据实施例32所述的方法,已经将第一个半胱氨酸改变成丝氨酸(SCC-P)。该连接区附着到野生型人IgG1 CH2和CH3恒定区,如实施例1所述。多核苷酸序列显示在SEQ ID NO:377,编码的多肽序列显示在SEQ ID NO:378
实施例99
G28-1 scFv VH L11S mIgE CH2 CH3 CH4
该构建体具有G28-1(抗-CD37)单链Fv结合区,后者具有在重链可变区的氨基酸残基11处的点突变,其中亮氨酸已经改变成丝氨酸,如实施例35所述。使用实施例39所述的方法,将该结合区附着到人野生型小鼠IgE CH2 CH3和CH4区域。多核苷酸序列显示在SEQID NO:379,编码的多肽序列显示在SEQ ID NO:380
实施例100
G28-1 scFv VH L11S mIgAH WIgACH2 T4CH3
该构建体具有G28-1(抗-CD 37)单链Fv结合区,后者具有在重链可变区的氨基酸残基11处的点突变,其中亮氨酸已经改变成丝氨酸,如实施例35所述。该结合区附着到来自小鼠IgA的连接区,如实施例39所述。该连接区附着到由野生型CH2区域和突变的CH3区域组成的小鼠IgA恒定区,其中在如实施例39所述所述的残基处存在4个氨基酸的截短。多核苷酸序列显示在SEQ ID NO:381,编码的多肽序列显示在SEQ ID NO:382
实施例101
G28-1 scFv VH L11S hIgE CH2 CH3 CH4
该构建体具有G28-1(抗-CD37)单链Fv结合区,后者具有在重链可变区的氨基酸残基11处的点突变,其中亮氨酸已经改变成丝氨酸,如实施例35所述。该结合区附着到含有CH2、CH 3和CH4的野生型人IgE恒定区,如实施例38所述。多核苷酸序列显示在SEQ IDNO:383,编码的多肽序列显示在SEQ ID NO:384
实施例102
G28-1 scFv VH L11S hIgAH WIgACH2 T4CH3
该构建体具有G28-1(抗-CD37)单链Fv结合区,后者具有在重链可变区的氨基酸残基11处的点突变,其中亮氨酸已经改变成丝氨酸,如实施例35所述。该结合区附着到来自人IgA的连接区,如实施例5所述。该连接区附着到由野生型CH2区域和突变的CH3区域组成的人IgA恒定区,其中在3’终止密码子之前存在4个氨基酸残基的截短,如实施例13所述。多核苷酸序列显示在SEQ ID NO:385,编码的多肽序列显示在SEQ ID NO:386
实施例103
HD37 scFv IgAH WCH2 WCH3
使用Novagen-Ig家族引物组、TOPO克隆和测序和缝合PCR测定,从HD37杂交瘤克隆了HD37 scFv。对于缝合前的最初的PCR反应,以1∶100使用了TOPO克隆模板HD37 VH C-1和HD37 KVL B-9,扩增特征为94C 30秒;55C,30秒;72C,30秒,25个循环。为了提供二级缝合PCR反应的模板,凝胶纯化、QIAQUICK纯化了一级反应产物,并将洗脱物稀释50倍。将1微升每种VL和VH重叠模板加入具有下述扩增特征的PCR反应中:94C,60秒;55C,60秒;72C,60秒;进行30个循环。2个循环后,暂停机器,分别25pmol,将侧翼5′VL和3′VH引物加入反应,并恢复PCR反应。在凝胶上检查PCR产物中是否存在750-800bp片段,QIAQUICK纯化反应产物,并用适当的限制酶消化,以插入pD18 Ig表达载体。
具有自然的前导肽和glyser接头的一部分的VL结构域的PCR:
5’引物:5’-gttgttaagcttgccgccatggagacagacacactcctgctatgg-3’(SEQ ID NO:650)
3’引物:5’gccacccgacccaccaccgcccgagccaccgccacctttgatttccagcttggtgcctcc-3’(SEQ IDNO:651)
没有前导肽(SalI位点)和glyser接头的一部分的VL结构域的PCR:
5’引物:5’-gttgttgtcgacattgtgctgacccaatctcca-3’(SEQ ID NO:652)
3’引物:5’-gccacccgacccaccaccgcccgagccaccgccacctttgatttccagcttggtgcctcc-3’(SEQ IDNO:651)
具有glyser接头的一部分和用于融合到-Ig尾的BclI位点的VH结构域的PCR:
5’引物:5’-tcgggcggtggtgggtcgggtggcggcggatcgtcacaggttcagctgcagcagtctgg-3’(SEQ IDNO:653)
3’引物:5’-tcagtgctgatcagaggagacggtgactgaggttccttg-3’(SEQ IDNO:654)
该结合区连接到野生型人Ig连接区和野生型人IgG CH2和CH3恒定区,如实施例5所述。该连接区附着到野生型人IgG1 CH2和CH3恒定区,如实施例1所述。该构建体以前被称作HD37scFv-IgAHWTG1C和HD37-IgAHWTG1C,它们二者都具有与上面的构建体相同的序列。多核苷酸序列显示在SEQ ID NO:397,编码的多肽序列显示在SEQ IDNO:398。
实施例104
HD37 scFv(SSS-S)H WCH2 WCH3
该构建体具有HD 37单链Fv,如实施例103所述。该结合区连接到突变的人IgG1连接区,其中根据实施例5所述的方法,已经将所有的半胱氨酸和一个脯氨酸改变成丝氨酸(SSS-S)。该连接区附着到野生型人IgG1 CH2和CH3恒定区,如实施例1所述。该构建体以前被称作HD37-MHWTG1C和HD37 scFv-IgMHWTG1C,它们二者都具有与上面的构建体相同的序列。多核苷酸序列显示在SEQ ID NO:399,编码的多肽序列显示在SEQ ID NO:400
实施例105
HD37 scFvVH L11S(SSS-S)H WCH2 WCH3
该构建体具有HD 37单链Fv,后者具有在氨基酸残基11处的重链可变区突变,其中根据实施例50所述的方法,已经将亮氨酸改变成丝氨酸。该结合区连接到突变的人IgG1连接区,其中根据实施例5所述的方法,已经将所有的半胱氨酸和一个脯氨酸改变成丝氨酸(SSS-S)。该连接区附着到野生型人IgG1 CH2和CH3恒定区,如实施例1所述。多核苷酸序列显示在SEQ ID NO:401,编码的多肽序列显示在SEQ ID NO:402
实施例106
L6 scFv IgAH WCH2 WCH3
使用1996年以来的组织抗原论文中所述的锚加尾方法,从L6杂交瘤(I Hellstrom)克隆了L6 scFv。PCR特征是94C,1分钟;50C,2分钟;72C,2分钟;35个循环。一旦从至少4个TOPO克隆得到了VL和VH区域的共有序列,就定购引物进行PCR反应,然后如下进行缝合PCR反应:对于缝合前的最初的PCR反应,以1∶100使用了TOPO克隆的模板L6VK和L6VH,扩增特征为94C 30秒;55C,30秒;72C,30秒,25个循环。为了提供二级缝合PCR反应的模板,凝胶纯化、QIAQUICK纯化了一级反应产物,并将洗脱物稀释50倍。将1微升每种VL和VH重叠模板加入具有下述扩增特征的PCR反应中:94C,60秒;55C,60秒;72C,60秒;进行30个循环。2个循环后,暂停机器,分别25pmol,将侧翼5′VL和3′VH引物加入反应,并恢复PCR反应。在凝胶上检查PCR产物中是否存在750-800bp片段,QIAQUICK纯化反应产物,并用适当的限制酶消化,以插入pD18 Ig表达载体。
具有自然的前导肽和glyser接头的一部分的VL结构域的PCR:
L6VLHindIII:5’-gttgttaagcttgccgccatggattttcaagtgcagattttcagcttc-3’(SEQ ID NO:655)
L6VLLK3:5’-gccacccgacccaccaccgcccgagccaccgccaccagagagctctttcagctccagcttggt-3’(SEQ ID NO:656)
没有前导肽(SalI位点)和glyser接头的一部分的VL结构域的PCR:
5’引物:5’-gttgttgtcgacattgttctctcccagtctccagcaatcctgtctg-3’(SEQ ID NO:657)
3’引物:5’-gccacccgacccaccaccgcccgagccaccgccaccagagagctctttcagctccagcttggt-3’(SEQ ID NO:656)
具有glyser接头的一部分和用于融合到-Ig尾的BclI位点的VH结构域的PCR:
5’:5’-tcgggcggtggtgggtcgggtggcggcggatctctgcagatccagttggtgcagtct-3’(SEQ ID NO:658)
3’Bcl:5’-tcagtgctgatcagaggagactgtgagagtggtgccttg-3’(SEQ ID NO:659)
该结合区连接到人Ig连接区和野生型人IgG1 CH2和CH3恒定区,如实施例5所述。该连接区附着到野生型人IgG1 CH2和CH3恒定区,如实施例1所述。该构建体以前被称作L6 scFv-IgAHWTG1C,其具有与上面的构建体相同的序列。多核苷酸序列显示在SEQ ID NO:413,编码的多肽序列显示在SEQ ID NO:414
实施例107
L6 scFv VH L11S(SSS-S)H WCH2 WCH3
该构建体具有L6单链Fv,后者具有在氨基酸残基11处的重链可变区突变,其中根据实施例49所述的方法,已经将亮氨酸改变成丝氨酸。该结合区连接到突变的人IgG1连接区,其中根据实施例5所述的方法,已经将所有的半胱氨酸和一个脯氨酸改变成丝氨酸(SSS-S)。该连接区附着到野生型人IgG1 CH2和CH3恒定区,如实施例1所述。多核苷酸序列显示在SEQ ID NO:415,编码的多肽序列显示在SEQ ID NO:416
实施例108
2H7 scFv-美洲驼IgG1
该构建体具有如实施例1所述的2H7(抗-CD20)单链Fv结合区。根据实施例10所述的方法,将该结合区附着到美洲驼IgG1铰链、CH2和CH3区域。多核苷酸序列显示在SEQ ID NO:21,编码的多肽序列显示在SEQ ID NO:22
实施例109
2H7 scFv-美洲驼IgG2
该构建体具有如实施例1所述的2H7(抗-CD20)单链Fv结合区。根据实施例10所述的方法,将该结合区附着到美洲驼IgG2铰链、CH2和CH3区域。多核苷酸序列显示在SEQ ID NO:23,编码的多肽序列显示在SEQ ID NO:24
实施例110
2H7 scFv-美洲驼IgG3
该构建体具有如实施例1所述的2H7(抗-CD20)单链Fv结合区。根据实施例10所述的方法,将该结合区附着到美洲驼IgG3铰链、CH2和CH3区域。多核苷酸序列显示在SEQ ID NO:25,编码的多肽序列显示在SEQ ID NO:26
实施例111
CD16低(ED)(SSS-S)H P238SCH2 WCH3
该构建体具有细胞外的、CD16低亲和力等位基因结合结构域,如实施例43所述。该结合区连接到突变的人IgG1连接区,其中根据实施例5所述的方法,已经将所有的半胱氨酸和一个脯氨酸改变成丝氨酸(SSS-S)。该铰链区附着到突变的人IgG1 CH2区域和野生型人IgG1 CH3区域。根据实施例70所述的方法,导入了P238S突变,其中在残基238处的脯氨酸改变成丝氨酸。多核苷酸序列显示在SEQ IDNO:421,编码的多肽序列显示在SEQ ID NO:422
实施例112
CD16-9高(ED)(SSS-S)H P238SCH2 WCH3
该构建体具有细胞外的、CD16高亲和力等位基因结合结构域,如实施例43所述。该结合区连接到突变的人IgG1连接区,其中根据实施例5所述的方法,已经将所有的半胱氨酸和一个脯氨酸改变成丝氨酸(SSS-S)。该铰链区附着到突变的人IgG1 CH2区域和野生型人IgG1 CH3区域。根据实施例70所述的方法,导入了P238S突变,其中在残基238处的脯氨酸改变成丝氨酸。多核苷酸序列显示在SEQ IDNO:425,编码的多肽序列显示在SEQ ID NO:426
实施例113
2e12 scFv(SSS-S)H P238SCH2 WCH3-hCD80TM/CT
该构建体具有2e12(抗-CD28)单链Fv结合区,如实施例12所述。该结合区连接到突变的人IgG1连接区,其中根据实施例5所述的方法,已经将所有的半胱氨酸和一个脯氨酸改变成丝氨酸(SSS-S)。该连接区附着到突变的人IgG1 CH2区域和野生型人IgG1 CH3区域。根据实施例70所述的方法,导入了P238S突变,其中在残基238处的脯氨酸改变成丝氨酸。将CH3区域附着到人CD80跨膜和细胞质尾区域(hCD80TM/CT)。根据如实施例12所述方法,使用随机引发的源自BJAB细胞系的cDNA,克隆了hCD80 TM/CT。使该TM/CT区域附着到具有可读框(ORF)的Ig CH3区域。通过用这些尾区的ORF(可读框形式)替换可溶形式的每种-Ig尾,建立了目标scFvIg构建体的可读框形式。为现有的可溶的-Ig尾的克隆,设计了PCR引物,所述的Ig尾缺失终止密码子,且向新-Ig盒的3′末端添加了一个或多个限制位点。然后,可以将需要的跨膜和细胞质尾序列亚克隆到这些新-Ig盒的下游。每种构建体都在PCR反应中利用现在可得到的用于扩增可溶形式的尾的5′BCLI寡核苷酸。3′寡核苷酸能用框外的限制位点替换终止密码子,所述的限制位点融合到参与调节细胞凋亡的蛋白结构域的编码区。
用25pmol的每种引物、标准的PCR试剂和不同体积的克隆的结构域或从PBMC、脾或胸腺RNA得到的cDNA,进行PCR扩增。反应使用下述的循环特征:94C,60秒;55C,60秒,72C,2分钟,35个循环。下面列出了IgG ORF的引物。
5’引物:5’-
gttgtagatcaggagcccaaatcttctgacaaaactcacacatctccaccgtccccagcacctgaactcctgggggaccgtcagtcttcc-3’(SEQ ID NO:660)
3’引物:5’-gttgttttcgaaggatccgctttacccgggagcagggagaggctcttctgcgtgtagtg-3’(SEQ IDNO:661)
多核苷酸序列显示在SEQ ID NO:437,编码的多肽序列显示在SEQID NO:438。
实施例114
10A8 scFv(SSS-S)H P238SCH2 WCH3-hCD80TM/CT
该构建体具有10A8(抗-CD2152)单链Fv结合区,如实施例12所述。该结合区连接到突变的人IgG1连接区,其中根据实施例5所述的方法,已经将所有的半胱氨酸和一个脯氨酸改变成丝氨酸(SSS-S)。该铰链区附着到突变的人IgG1 CH2区域和野生型人IgG1CH3区域。根据实施例70所述的方法,导入了P238S突变,其中在残基238处的脯氨酸改变成丝氨酸。根据实施例113所述的方法,将该CH3区域附着到hCD80 TM/CT。多核苷酸序列显示在SEQ IDNO:439,编码的多肽序列显示在SEQ ID NO:440
实施例115
40.2.220 scFv(SSS-S)H P238SCH2 WCH3-hCD80TM/CT
该构建体具有40.2.220(抗-CD40)单链Fv结合区,如实施例12所述。该结合区连接到突变的人IgG1连接区,其中根据实施例5所述的方法,已经将所有的半胱氨酸和一个脯氨酸改变成丝氨酸(SSS-S)。该铰链区附着到突变的人IgG1 CH2区域和野生型人IgG1CH3区域。根据实施例70所述的方法,导入了P238S突变,其中在残基238处的脯氨酸改变成丝氨酸。根据实施例113所述的方法,该CH3区域附着到hCD80 TM/CT。
实施例116
2H7scFv(SSS-S)H P238SCH2 WCH3-hCD80TM/CT
该构建体具有如实施例1所述的2H7(抗-CD20)单链Fv结合区。该结合区连接到突变的人IgG1连接区,其中根据实施例5所述的方法,已经将所有的半胱氨酸和一个脯氨酸改变成丝氨酸(SSS-S)。该铰链区附着到突变的人IgG1 CH2区域和野生型人IgG1 CH3区域。根据实施例70所述的方法,导入了P238S突变,其中在残基238处的脯氨酸改变成丝氨酸。根据实施例113所述的方法,将该CH3区域附着到hCD80 TM/CT。该构建体以前被称作:。多核苷酸序列显示在SEQ ID NO:441,编码的多肽序列显示在SEQ ID NO:442
实施例117
G19-4 scFv(SSS-S)H P238SCH2 WCH3-hCD80TM/CT
该构建体具有G19(抗-CD3)单链Fv结合区,如实施例29所述。该结合区连接到突变的人IgG1连接区,其中根据实施例5所述的方法,已经将所有的半胱氨酸和一个脯氨酸改变成丝氨酸(SSS-S)。该铰链区附着到突变的人IgG1 CH2区域和野生型人IgG1 CH3区域。根据实施例70所述的方法,导入了P238S突变,其中在残基238处的脯氨酸改变成丝氨酸。根据实施例113所述的方法,将该CH3区域附着到hCD80TM/CT。多核苷酸序列显示在SEQ ID NO:443,编码的多肽序列显示在SEQ ID NO:444。
实施例118
2e12 scFv(SSS-S)H WCH2 WCH3-hCD80TM/CT
该构建体具有2e12(抗-CD28)单链Fv结合区,如实施例12所述。该结合区连接到突变的人IgG1连接区,其中根据实施例5所述的方法,已经将所有的半胱氨酸和一个脯氨酸改变成丝氨酸(SSS-S)。该连接区附着到野生型人IgG1 CH2和CH3恒定区,如实施例1所述。根据实施例113所述的方法,将该CH3区域附着到hCD80 TM/CT。该构建体以前被称作2e12 scFv IgG WTH WHTCH3CH2-CD80,其具有与上面的构建体相同的序列。多核苷酸序列显示在SEQ ID NO:126,编码的多肽序列显示在SEQ ID NO:127。
实施例119
2e12 scFv IgAH IgACH2 T4CH3-hCD80TM/CT
该构建体具有2e12(抗-CD28)单链Fv结合区,如实施例12所述。该结合区附着到来自人IgA的连接区,如实施例5所述。该连接区附着到由野生型CH2区域和突变的CH3区域组成的人IgA恒定区,其中在3’终止密码子之前存在4个氨基酸残基的截短,如实施例13所述。根据实施例113所述的方法,将该CH3区域附着到hCD80TM/CT。下面列出了用于建立IgA ORF的特异性的引物。
5’引物:5’-gttgttgatcagccagttccctcaactccacctacc-3’(SEQ ID NO:662)
3’引物:5’-gttgttttcgaaggatccgcgtccacctccgccatgacaacaga(SEQ ID NO:663)多核苷酸序列显示在SEQ ID NO:445,编码的多肽序列显示在SEQID NO:446
实施例120
2e12 scFv IgE CH2CH3CH4-hCD80TM/CT
该构建体具有2e12(抗-CD28)单链Fv结合区,如实施例12所述。该结合区附着到含有CH2、CH3和CH4的人IgE恒定区,如实施例38所述。基本上根据实施例113所述的方法,将该CH4区域附着到hCD80 TM/CT。下面列出了用于建立IgE ORF的特异性的引物。
5’引物:5’-gttgttgatcacgtctgctccagggacttcacc-3’(SEQ ID NO:664)
3’引物:5’-gttgttttcgaaggatccgctttaccagatttacagacaccgctcgctg-3’(SEQ ID NO:665)
多核苷酸序列显示在SEQ ID NO:183,编码的多肽序列显示在SEQID NO:184
实施例121
2e12 scFv(SSS-S)H P238SCH2 WCH3-mFADD-TM/CT
该构建体具有2e12(抗-CD28)单链Fv结合区,如实施例12所述。该结合区连接到突变的人IgG1连接区,其中根据实施例5所述的方法,已经将所有的半胱氨酸和一个脯氨酸改变成丝氨酸(SSS-S)。该铰链区附着到突变的人IgG1 CH2区域和野生型人IgG1 CH3区域。根据实施例70所述的方法,导入了P238S突变,其中在残基238处的脯氨酸改变成丝氨酸。CH3区域附着到小鼠FADD跨膜和细胞质尾区域(mFADD TM/CT)。使用基本上与实施例113所述相同的方法,克隆了该区域。从随机引发的来自小鼠脾RNA的cDNA,PCR扩增了该结构域。下面列出了特异性的引物。
5’引物:5’-gttgtggatccttcgaacccattcctggtgctgctgcactcgctg-3’(SEQ ID NO:666)
3’引物:5’-gttgttatcgatctcgagtcagggtgtttctgaggaagacacagt-3’(SEQ ID NO:667)
下面列出了用于建立小鼠IgG ORF的特异性的引物。
5’引物:5’-gttgtagatctggagcccagagggcccacaatcaagccctctcctccaagcaaaagccca-3’(SEQ IDNO:668)
3’引物:5’-gttgttttcgaaggatccgctttacccggagtccgggagaag-3’(SEQ ID NO:669)
多核苷酸序列显示在SEQ ID NO:447,编码的多肽序列显示在SEQID NO:448
实施例122
2e12 scFv(SSS-S)H WCH2 WCH3-mFADD-TM/CT
该构建体具有2e12(抗-CD28)单链Fv结合区,如实施例12所述。该结合区连接到突变的人IgG1连接区,其中根据实施例5所述的方法,已经将所有的半胱氨酸和一个脯氨酸改变成丝氨酸(SSS-S)。该连接区附着到野生型人IgG1 CH2和CH3恒定区,如实施例1所述。根据实施例113和121所述的方法,将CH3区域附着到mFADD TM/TM区域。多核苷酸序列显示在SEQ ID NO:449,编码的多肽序列显示在SEQ ID NO:450。
实施例123
2e12 scFv(SSS-S)H WCH2 WCH3-mcasp3-TM/CT
该构建体具有2e12(抗-CD28)单链Fv结合区,如实施例12所述。该结合区连接到突变的人IgG1连接区,其中根据实施例5所述的方法,已经将所有的半胱氨酸和一个脯氨酸改变成丝氨酸(SSS-S)。该连接区附着到野生型人IgG1 CH2和CH3恒定区,如实施例1所述。根据实施例113和121所述的方法,将CH3区域附着到小鼠casp3跨膜和细胞质尾区。下面列出了用于分离mcasp3 TM/CT区域的特异性的引物:
5’引物:5’-gttgttggatccttcgaacatggagaacaacaaaacctcagtggattca-3’(SEQ ID NO:670)
3’引物:5’-gttgttatcgatctcgagctagtgataaaagtacagttctttcgt-3’(SEQ ID NO:671)
多核苷酸序列显示在SEQ ID NO:453,编码的多肽序列显示在SEQID NO:454
实施例124
2e12 scFv(SSS-S)H P238SCH2 WCH3-mcasp3-TM/CT
该构建体具有2e12(抗-CD28)单链Fv结合区,如实施例12所述。该结合区连接到突变的人IgG1连接区,其中根据实施例5所述的方法,已经将所有的半胱氨酸和一个脯氨酸改变成丝氨酸(SSS-S)。该铰链区附着到突变的人IgG1 CH2区域和野生型人IgG1 CH3区域。根据实施例70所述的方法,导入了P238S突变,其中在残基238处的脯氨酸改变成丝氨酸。根据实施例113、121和123所述的方法,将CH3区域连接到mcasp3 TM/CT区域。多核苷酸序列显示在SEQ IDNO:455,编码的多肽序列显示在SEQ ID NO:456
实施例125
2e12 scFv(SSS-S)H WCH2 WCH3-mcasp8-TM/CT
该构建体具有2e12(抗-CD28)单链Fv结合区,如实施例12所述。该结合区连接到突变的人IgG1连接区,其中根据实施例5所述的方法,已经将所有的半胱氨酸和一个脯氨酸改变成丝氨酸(SSS-S)。该连接区附着到野生型人IgG1 CH2和CH3恒定区,如实施例1所述。基本上根据实施例113和121所述的方法,将CH3区域附着到小鼠casp8跨膜和细胞质尾区域(mcasp8 TM/CT)。下面列出了用于克隆mcasp8 TM/CT区域的特异性的引物。
5’引物:5’-gttgtttcgaacatggatttccagagttgtctttatgctattgctg-3’(SEQ IDNO:672)
3’引物:5’-gttgttatcgatctcgagtcattagggagggaagaagagcttcttccg-3’(SEQ ID NO:673)
多核苷酸序列显示在SEQ ID NO:459,编码的多肽序列显示在SEQID NO:460
实施例126
2e12 scFv(SSS-S)H P238SCH2W CH3-mcasp8-TM/CT
该构建体具有2e12(抗-CD28)单链Fv结合区,如实施例12所述。该结合区连接到突变的人IgG1连接区,其中根据实施例5所述的方法,已经将所有的半胱氨酸和一个脯氨酸改变成丝氨酸(SSS-S)。该铰链区附着到突变的人IgG1 CH2区域和野生型人IgG1 CH3区域。根据实施例70所述的方法,导入了P238S突变,其中在残基238处的脯氨酸改变成丝氨酸。根据实施例113、121和125所述的方法,将CH3区域附着到mcasp8 TM/CT区域。多核苷酸序列显示在SEQ IDNO:461,编码的多肽序列显示在SEQ ID NO:462。
实施例127
2e12 scFv(SSS-S)H WCH2 WCH3-hcasp3-TM/CT
该构建体具有2e12(抗-CD28)单链Fv结合区,如实施例12所述。该结合区连接到突变的人IgG1连接区,其中根据实施例5所述的方法,已经将所有的半胱氨酸和一个脯氨酸改变成丝氨酸(SSS-S)。该连接区附着到野生型人IgG1CH2和CH3恒定区,如实施例1所述。基本上根据实施例113所述的方法,将CH3区域附着到人casp3跨膜和细胞质尾区域(hcasp3 TM/CT)。下面列出了用于克隆hcasp3TM/CT区域的特异性的引物。
5’引物:5’-gttgtggatccttcgaacatggagaacactgaaaactcagtggat-3’(SEQ ID NO:674)
3’引物:5’-gttgttatcgatctcgagttagtgataaaaatagagttcttttgtgag-3’(SEQ ID NO:675)
多核苷酸序列显示在SEQ ID NO:465,编码的多肽序列显示在SEQID NO:466。
实施例128
2e12 scFv(SSS-S)H P238SCH2 WCH3-hcasp3-TM/CT
该构建体具有2e12(抗-CD28)单链Fv结合区,后者如实施例12所述。该结合区连接到突变的人IgG1连接区,其中根据实施例5所述的方法,已经将所有的半胱氨酸和一个脯氨酸改变成丝氨酸(SSS-S)。该铰链区附着到突变的人IgG1 CH2区域和野生型人IgG1CH3区域。根据实施例70所述的方法,导入了P238S突变,其中在残基238处的脯氨酸改变成丝氨酸。根据实施例113和127所述的方法,将CH3区域附着到hcasp3 TM/CT区域。多核苷酸序列显示在SEQ ID NO:467,编码的多肽序列显示在SEQ ID NO:468
实施例129
2e12 scFv(SSS-S)H WCH2 WCH3-hcasp8--TM/CT
该构建体具有2e12(抗-CD28)单链Fv结合区,如实施例12所述。该结合区连接到突变的人IgG1连接区,其中根据实施例5所述的方法,已经将所有的半胱氨酸和一个脯氨酸改变成丝氨酸(SSS-S)。该连接区附着到野生型人IgG1 CH2和CH3恒定区,如实施例1所述。根据实施例133所述的方法,将CH3区域附着到人casp8跨膜和细胞质尾区域(hcasp8 TM/CT)。下面列出了用于克隆hcasp8TM/CT区域的特异性的引物。
5’引物:5’-gttgtggatccttcgaacatggacttcagcagaaatctttatgat-3’(SEQ ID NO:676)
3’引物:5’-gttgttatcgatgcatgctcaatcagaagggaagacaagtttttttct-3’(SEQ ID NO:677)
多核苷酸序列显示在SEQ ID NO:473,编码的多肽序列显示在SEQID NO:474
实施例130
2e12 scFv(SSS-S)H P238SCH2 WCH3-hcasp8-TM/CT
该构建体具有2e12(抗-CD28)单链Fv结合区,如实施例12所述。该结合区连接到突变的人lgG1连接区,其中根据实施例5所述的方法,已经将所有的半胱氨酸和一个脯氨酸改变成丝氨酸(SSS-S)。该铰链区附着到突变的人IgG1 CH2区域和野生型人IgG1 CH3区域。根据实施例70所述的方法,导入了P238S突变,其中在残基238处的脯氨酸改变成丝氨酸。根据实施例113和129所述的方法,将CH3区域附着到hcasp8 TM/CT。多核苷酸序列显示在SEQ ID NO:475,编码的多肽序列显示在SEQ ID NO:476
实施例131
1D8 scFv(SSS-S)H P238SCH2 WCH3-hCD80TM/CT
该构建体具有如实施例25所述的1D8(抗-4-1BB)单链Fv结合区。该结合区连接到突变的人IgG1连接区,其中根据实施例5所述的方法,已经将所有的半胱氨酸和一个脯氨酸改变成丝氨酸(SSS-S)。该铰链区附着到突变的人IgG1 CH2区域和野生型人IgG1 CH3区域。根据实施例70所述的方法,导入了P238S突变,其中在残基238处的脯氨酸改变成丝氨酸。根据实施例113所述的方法,将CH3区域附着到hCD80 TM/CT区域。多核苷酸序列显示在SEQ ID NO:108,编码的多肽序列显示在SEQ ID NO:109
实施例132
1D8 scFv(SSS-S)H WCH2 WCH3-hCD80TM/CT
该构建体具有如实施例25所述的1D8(抗-4-1BB)单链Fv结合区。该结合区连接到突变的人IgG1连接区,其中根据实施例5所述的方法,已经将所有的半胱氨酸和一个脯氨酸改变成丝氨酸(SSS-S)。该连接区附着到野生型人IgG1 CH2和CH3恒定区,如实施例1所述。根据实施例113所述的方法,将CH3区域附着到hCD80 TM/CT区域。该构建体以前被称作1D8 scFv IgG WTH WTCH2CH3-CD80,其具有与上面的构建体相同的序列。多核苷酸序列显示在SEQ ID NO:481,编码的多肽序列显示在SEQ ID NO:482
实施例133
1D8 scFv-mIgAH WIgA CH2 T4CH3-hCD80TM/CT
该构建体具有如实施例25所述的1D8(抗-4-1BB)单链Fv结合区。该结合区附着到来自人IgA的连接区,如实施例5所述。该连接区附着到由野生型CH2区域和突变的CH3区域组成的小鼠IgA恒定区,其中在3’终止密码子之前存在4个氨基酸残基的截短,如实施例39所述。根据实施例113所述的方法,使用能建立IgA ORF的引物,可以将CH3区域附着到hCD80TM/CT区域(SEQ ID NO s:483和484)。
实施例134
1D8 scFv IgE CH2CH3CH4-hCD80TM/CT
该构建体具有如实施例25所述的1D8(抗-4-1BB)单链Fv结合区。该结合区附着到含有CH2、CH3和CH4的人IgE恒定区,如实施例38所述。根据实施例113和120所述的方法,将CH4区域附着到hCD80 TM/CT。多核苷酸序列显示在SEQ ID NO:175,编码的多肽序列显示在SEQ ID NO:176
实施例135
1D8 scFv(SSS-S)H P238SCH2 WCH3-mFADD-TM/CT
该构建体具有如实施例25所述的1D8(抗-4-1BB)单链Fv结合区。该结合区连接到突变的人IgG1连接区,其中根据实施例5所述的方法,已经将所有的半胱氨酸和一个脯氨酸改变成丝氨酸(SSS-S)。该铰链区附着到突变的人IgG1 CH2区域和野生型人IgG1 CH3区域。根据实施例70所述的方法,导入了P238S突变,其中在残基238处的脯氨酸改变成丝氨酸。根据实施例113和121所述的方法,将CH3区域附着到mFADD TM/TM区域。多核苷酸序列显示在SEQ ID NO:487,编码的多肽序列显示在SEQ ID NO:488
实施例136
1D8 scFv(SSS-S)H WCH2 WCH3-mFADD-TM/CT
该构建体具有如实施例25所述的1D8(抗-41BB)单链Fv结合区。该结合区连接到突变的人IgG1连接区,其中根据实施例5所述的方法,已经将所有的半胱氨酸和一个脯氨酸改变成丝氨酸(SSS-S)。该连接区附着到野生型人IgG1 CH2和CH3恒定区,如实施例1所述。根据实施例113和121所述的方法,将CH3区域附着到mFADD TM/TM区域。多核苷酸序列显示在SEQ ID NO:485,编码的多肽序列显示在SEQ ID NO:486
实施例137
1D8 scFv(SSS-S)H WCH2WCH3-mcasp3-TM/CT
该构建体具有如实施例25所述的1D8(抗-4-1BB)单链Fv结合区。该结合区连接到突变的人IgG1连接区,其中根据实施例5所述的方法,已经将所有的半胱氨酸和一个脯氨酸改变成丝氨酸(SSS-S)。该连接区附着到野生型人IgG1 CH2和CH3恒定区,如实施例1所述。根据实施例113、121和123所述的方法,将CH3区域附着到mcasp3TM/TM区域。多核苷酸序列显示在SEQ ID NO:489,编码的多肽序列显示在SEQ ID NO:490
实施例138
1D8 scFv(SSS-S)H P238SCH2 WCH3-mcasp3-TM/CT
该构建体具有如实施例25所述的1D8(抗-4-1BB)单链Fv结合区。该结合区连接到突变的人IgG1连接区,其中根据实施例5所述的方法,已经将所有的半胱氨酸和一个脯氨酸改变成丝氨酸(SSS-S)。该铰链区附着到突变的人IgG1 CH2区域和野生型人IgG1 CH3区域。根据实施例70所述的方法,导入了P238S突变,其中在残基238处的脯氨酸改变成丝氨酸。根据实施例113、121和123所述的方法,将CH3区域附着到mcasp3 TM/TM区域。多核苷酸序列显示在SEQ IDNO:491,编码的多肽序列显示在SEQ ID NO:492
实施例139
1D8 scFv(SSS-S)H WCH2 WCH3-mcasp8--TM/CT
该构建体具有如实施例25所述的1D8(抗-4-1BB)单链Fv结合区。该结合区连接到突变的人IgG1连接区,其中根据实施例5所述的方法,已经将所有的半胱氨酸和一个脯氨酸改变成丝氨酸(SSS-S)。该连接区附着到野生型人IgG1 CH2和CH3恒定区,如实施例1所述。根据实施例113、121和125所述的方法,将CH3区域附着到mcasp8TM/TM区域。多核苷酸序列显示在SEQ ID NO:493,编码的多肽序列显示在SEQ ID NO:494
实施例140
1D8 scFv(SSS-S)H P238SCH2 WCH3-mcasp8-TM/CT
该构建体具有如实施例25所述的1D8(抗-4-1BB)单链Fv结合区。该结合区连接到突变的人IgG1连接区,其中根据实施例5所述的方法,已经将所有的半胱氨酸和一个脯氨酸改变成丝氨酸(SSS-S)。该铰链区附着到突变的人IgG1 CH2区域和野生型人IgG1 CH3区域。根据实施例70所述的方法,导入了P238S突变,其中在残基238处的脯氨酸改变成丝氨酸。根据实施例113、121和125所述的方法,将CH3区域附着到mcasp8TM/TM区域。多核苷酸序列显示在SEQ IDNO:495,编码的多肽序列显示在SEQ ID NO:496
实施例141
1D8 scFv(SSS-S)H WCH2 WCH3-hcasp3--TM/CT
该构建体具有如实施例25所述的1D8(抗-4-1BB)单链Fv结合区。该结合区连接到突变的人IgG1连接区,其中根据实施例5所述的方法,已经将所有的半胱氨酸和一个脯氨酸改变成丝氨酸(SSS-S)。该连接区附着到野生型人IgG1 CH2和CH3恒定区,如实施例1所述。根据实施例113和127所述的方法,将CH3区域附着到hcasp3 TM/CT。多核苷酸序列显示在SEQ ID NO:497,编码的多肽序列显示在SEQ IDNO NO:498
实施例142
1D8 scFv(SSS-S)H P238SCH2 WCH3-hcasp3-TM/CT
该构建体具有如实施例25所述的1D8(抗-4-1BB)单链Fv结合区。该结合区连接到突变的人IgG1连接区,其中根据实施例5所述的方法,已经将所有的半胱氨酸和一个脯氨酸改变成丝氨酸(SSS-S)。该铰链区附着到突变的人IgG1 CH2区域和野生型人IgG1 CH3区域。根据实施例70所述的方法,导入了P238S突变,其中在残基238处的脯氨酸改变成丝氨酸。根据实施例113和127所述的方法,将CH3区域附着到hcasp3 TM/CT。多核苷酸序列显示在SEQ ID NO:499,编码的多肽序列显示在SEQ ID NO:500
实施例143
1D8 scFv(SSS-S)H WCH2 WCH3-hcasp8--TM/CT
该构建体具有如实施例25所述的1D8(抗-4-1BB)单链Fv结合区。该结合区连接到突变的人IgG1连接区,其中根据实施例5所述的方法,已经将所有的半胱氨酸和一个脯氨酸改变成丝氨酸(SSS-S)。该连接区附着到野生型人IgG1 CH2和CH3恒定区,如实施例1所述。根据实施例113和129所述的方法,将CH3区域附着到hcasp8 TM/CT。多核苷酸序列显示在SEQ ID NO:501,编码的多肽序列显示在SEQ IDNO:502
实施例144
1D8 scFv(SSS-s)H P238SCH2 WCH3-hcasp8-TM/CT
该构建体具有如实施例25所述的1D8(抗-4-1BB)单链Fv结合区。该结合区连接到突变的人IgG1连接区,其中根据实施例5所述的方法,已经将所有的半胱氨酸和一个脯氨酸改变成丝氨酸(SSS-S)。该铰链区附着到突变的人IgG1 CH2区域和野生型人IgG1 CH3区域。根据实施例70所述的方法,导入了P238S突变,其中在残基238处的脯氨酸改变成丝氨酸。根据实施例113和129所述的方法,将CH3区域附着到hcasp8 TM/CT。多核苷酸序列显示在SEQ ID NO:503,编码的多肽序列显示在SEQ ID NO:504
实施例145
L6 scFv(SSS-S)H WCH2 WCH3
该构建体具有如实施例105所述的L6 scFv结合结构域。该结合区连接到突变的人IgG1连接区,其中根据实施例5所述的方法,已经将所有的半胱氨酸和一个脯氨酸改变成丝氨酸(SSS-S)。该连接区附着到野生型人IgG1 CH2和CH3恒定区,如实施例1所述。该构建体以前被称作L6 scFv-IgMHWTG1C,其具有与上面的构建体相同的序列。多核苷酸序列显示在SEQ ID NO:415,编码的多肽序列显示在SEQID NO:416
实施例146
2H7 scFv CD154(L2)
该构建体具有如实施例1所述的2H7(抗-CD20)单链Fv结合区。根据实施例4所述的方法,已经将该结合区附着到CD154胞外结构域。多核苷酸序列显示在SEQ ID NO:690,编码的多肽序列显示在SEQID NO:691
实施例147
2H7 scFv CD154(S4)
该构建体具有如实施例1所述的2H7(抗-CD20)单链Fv结合区。根据实施例4所述的方法,已经将该结合区附着到CD154胞外结构域,从而附着方法会导致与实施例146所述的构建体相比截短的形式。多核苷酸序列显示在SEQ ID NO:692,编码的多肽序列显示在SEQ IDNO:693
实施例148
CTLA4 IgAH IgACH2CH3
该构建体具有如实施例14所述的胞外CTLA-4结合区。该结合区附着到野生型人IgA连接区,如实施例5所述。根据实施例13所述的方法,将该连接区附着到野生型人IgA CH2和CH3恒定区。该恒定区附着到J-链区域,如实施例13所述。该构建体以前被称作CTLA-4IgAH IgACH2CH3,其具有与上面的构建体相同的序列。多核苷酸序列显示在SEQ ID NO:505,编码的多肽序列显示在SEQ ID NO:506
实施例149
CTLA4 IgAH IgACH2 T4CH3
该构建体具有如实施例14所述的胞外CTLA-4结合区。该结合区附着到来自人IgA的连接区,如实施例5所述。该连接区附着到由野生型CH2区域和突变的CH3区域组成的人IgA恒定区,其中在3’终止密码子之前存在4个氨基酸残基的截短,如实施例13所述。该构建体以前被称作CTLA-4 IgAH IgA-T4,其具有与上面的构建体相同的序列。多核苷酸序列显示在SEQ ID NO:507,编码的多肽序列显示在SEQID NO:508
实施例150
2H7 scFv IgAH IgACH2CH3
该构建体具有如实施例1所述的2H7(抗-CD20)单链Fv结合区。该结合区附着到人野生型人Ig连接区,如实施例5所述。根据实施例13所述的方法,该连接区附着到野生型人IgA CH2和CH3恒定区。多核苷酸序列显示在SEQ ID NO:61,编码的多肽序列显示在SEQ IDNO:62
实施例151
2H7 scFv IgAH IgAHCH2 T18CH3
该构建体具有如实施例1所述的2H7(抗-CD20)单链Fv结合区。该结合区附着到来自人IgA的连接区,如实施例5所述。该连接区附着到由野生型CH2区域和突变的CH3区域组成的人IgA恒定区,其中在3′终止密码子之前存在18个氨基酸残基的截短,如实施例13所述。多核苷酸序列显示在SEQ ID NO:509,编码的多肽序列显示在SEQID NO:510
实施例152
2H7-40.2.220 scFv(SSS-S)H WCH2 WCH3
在都能靶向B细胞受体的2H7 scFv(抗-CD20)和40.2.220(抗-CD40)之间,构建了双特异性的融合蛋白。使在表达载体pD18中的2H7 scFv hIgG1(SSS-S)H WCH2 WCH3构建体在dam-细菌中传递,以允许在BclI位点切割。用碱性磷酸酶处理切割的质粒,然后连接到BclI切割的接头-CD40 scFv片段。通过利用重叠引物的连续PCR反应,从现有的40.2.220scFv合成了该片段。附着的接头是以前获得专利保护的(授权的BMS专利)螺旋型接头,其具有大量的赖氨酸和谷氨酸残基。PCR扩增了CD40的scFv,其没有作为SalI-BclI片段的前导肽,但是…尾包含在现有的CD20的scFvIg构建体中(2H7scFv hIgG1构建体)。3′末端类似于其他的具有框外的BclI位点的scFv VH分子,所述的BclI位点融合到在VH结构域的末端的VTVSS型序列上。
PCR寡核苷酸:
40.2.220 scFv:
5′引物--40.2.220S5:
5’-gttgttgtcgacattgttctgactcagtctccagccaccctgtc-3’(SEQ ID NO:678)
3′引物-40.2.220 Bcl3:
5’-gttgttgatcagagacagtgaccagtgtcccttgg-3’(SEQ ID NO:679)
接头引物:
通过退火互补的寡核苷酸,建立的BclI-SalI片段。然后,将该片段与SalI-BcIIscFv一起连接进BclI消化的载体,以建立用于穿梭的(接头-scFv)BclI片段。
5’引物:5’-gatcaatccaactctgaagaagcaaagaaagaggaggccaaaaaggaggaagccaagaaatctaacagcg-3’(SEQ IDNO:560)
3’引物:5’-tcgacgctgttagatttcttggcttcctcctttttggcctcctctttctttgcttcttcagagttggatt-3’(SEQID NO:563)
然后,将该BclI片段连接到pD18-Ig中的2H7 scFv的下游。筛选转化体中是否存在2.4kb Hind III-Xba插入片段,并对阳性的克隆测序,然后进一步研究。用该构建体进行了COS细胞瞬时转染,并筛选了培养物上清液是否存在预计大小的蛋白,和与CD20和CD40转染的CHO细胞的结合。
通过设计铰链型的接头,其在接头的任一个末端整合了1个或优选地2个限制位点,促进不对称的消化和不同的构建体之间的(接头-scFv)或(scFv-接头)盒的转移,可以建立新的双特异性的构建体。这些构建体也会整合VHL11S和其他的V区取代,推测其能促进适当的折叠,并导致它们插入其中的分子的高表达。
该结合区连接到突变的人IgG1连接区,其中根据实施例5所述的方法,已经将所有的半胱氨酸和一个脯氨酸改变成丝氨酸(SSS-S)。该连接区附着到野生型人IgG1 CH2…与上面的构建体相同的序列。多核苷酸序列显示在SEQ ID NO:114,编码的多肽序列显示在SEQ IDNO:115
实施例153
2H7 scFv IgAH IgACH2 T4CH3-hCD80 TM/CT
该构建体具有如实施例1所述的2H7(抗-CD20)单链Fv结合区。该结合区附着到来自人IgA的连接区,如实施例5所述。该连接区附着到由野生型CH2区域和突变的CH3区域组成的人IgA恒定区,其中在3’终止密码子之前存在4个氨基酸残基的截短,如实施例13所述。根据实施例113和119所述的方法,将该CH3区域附着到hCD80TM/CT。该构建体以前被称作2H7 scFv IgA铰链IgA-T4-CD80和2H7scFv IgAH IgA-T4-CD80,它们二者都具有与上面的构建体相同的序列。多核苷酸序列显示在SEQ ID NOs:70和29,编码的多肽序列显示在SEQ ID NOs:71和30
实施例154
G19-4 scFv(CCC-P)WH WCH2 WCH3-hCD80 TM/CT
该构建体具有实施例29所述的G19(抗-CD3)单链Fv结合区。该结合区附着到人野生型人IgG1连接区(CCC-P),如实施例1所述。该连接区附着到野生型人IgG1 CH2和CH3恒定区,如实施例1所述。根据实施例113所述的方法,将该CH3区域附着到hCD80 TM/CT。多核苷酸序列显示在SEQ ID NOs:112和29,编码的多肽序列显示在SEQID NOs:113和30
实施例155
2e12 scFv(CCC-P)WH WCH2 WCH3-hCD80 TM/CT
该构建体具有2e12(抗-CD28)单链Fv结合区,如实施例12所述。该结合区附着到野生型人IgG1连接区(CCC-P),如实施例1所述。该连接区附着到野生型人IgG1 CH2和CH3恒定区,如实施例1所述。根据实施例113所述的方法,将该CH3区域附着到hCD80 TM/CT。多核苷酸序列显示在SEQ ID NO:126,编码的多肽序列显示在SEQ IDNO:127
实施例156
2H7 VH L11S scFv(SSS-S)IgECH3CH4
该构建体具有2H7(抗-CD20)单链Fv结合区,后者具有在重链可变区的氨基酸残基11处的点突变,其中亮氨酸已经改变成丝氨酸,如实施例33所述。该结合区连接到突变的人IgG1连接区,其中根据实施例5所述的方法,已经将所有的半胱氨酸和一个脯氨酸改变成丝氨酸(SSS-S)。该连接区附着到人IgE CH3和CH4恒定区。根据实施例38所述的方法,建立了该截短的恒定区。多核苷酸序列显示在SEQID NO:227,编码的多肽序列显示在SEQ ID NO:228
实施例157
IgD铰链
通过使用PCR测定来分离需要的区域,可以从人IgD免疫球蛋白铰链区分离出替代铰链区。PCR反应与实施例1中使用的相同。该铰链在3′末端截短了6个氨基酸残基。下面列出了用于该PCR反应的引物。
5”引物:5’-GTGGATCCAGGTTCGAAGTCTCCAAAGGCACAGGCC-3’(SEQ IDNQ:534)
3’引物:5’-GTTGTCGACTGCACCGGTCTTTGTCTCTCTCTCTTC-3’(SEQ ID NO:517)
多核苷酸序列显示在SEQ ID NO:237,编码的多肽序列显示在SEQID NO:238
实施例158
hCD28 TM/CT
对于一些细胞表面ORF构建体,CD80的跨膜结构域被人CD28的跨膜结构域取代,因为它会在细胞表面上形成二聚体,而不是象CD80一样形成单体。几种能驱动细胞凋亡程序的分子需要寡聚/三聚作用,以形成信号传导复合物;因此,重要的是能通过控制细胞表面上的这些重组受体的寡聚化程度,来控制信号传导的启动。
下面给出了用于PCR扩增CD28尾的引物:
5’引物:5’-gttgtggatccttcgaaccccttttgggtgctggtggtggttggtgga-3’(SEQ ID NO:518)
3’引物:5’-gttgttatcgatctcgagtcaggagcgataggctgcgaagtc-3’(SEQ ID NO:519)
实施例159
2H7 scFv VH L11S(SSS-S)H K322L CH2 WCH3
该构建体具有2H7(抗-CD20)单链Fv结合区,后者具有在重链可变区的氨基酸残基11处的点突变,其中亮氨酸已经改变成丝氨酸,如实施例33所述。该结合区连接到突变的人IgG连接区,其中根据实施例5所述的方法,已经将所有半胱氨酸和1个脯氨酸改变成丝氨酸(SSS-S)。连接区附着到突变的IgG CH2区域和野生型IgG CH3区域。CH2区域中的K322L突变是在残基322,其中使用实施例56所述的重叠PCR,但是利用下面列出的不同的第一个PCR反应的引物,已经将赖氨酸改变成亮氨酸。
5’引物5’ttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggaaccctgaggtcac-3’(SEQ ID NO:635)
3’引物:5’-ggacagtgggagtggcacc-3’(SEQ ID NO:621)
将PCR产物克隆进TOPO载体,并测序。多核苷酸序列显示在SEQID NO:265,编码的多肽序列显示在SEQ ID NO:266
实施例160
2H7 scFv VH L11S(CSS-S)H K322L CH2 WCH3
该构建体具有2H7(抗-CD20)单链Fv结合区,后者具有在重链可变区的氨基酸残基11处的点突变,其中已经将亮氨酸改变成丝氨酸,如实施例33所述。该结合区附着到突变的IgG连接区,其中根据实施例13所述的方法,已经将第二个和第三个半胱氨酸改变成丝氨酸,且已经将脯氨酸改变成丝氨酸(CSS-S)。连接区附着到突变的IgG CH2区域和野生型IgG CH3区域。CH2区域中的K322L突变是在残基322,其中使用实施例56所述的重叠PCR,在第一个PCR反应中使用来自实施例159的引物,且在第二个PCR反应中使用来自实施例57的引物,已经将赖氨酸改变成亮氨酸。
将PCR产物克隆进TOPO载体,并测序。多核苷酸序列显示在SEQID NO:261,编码的多肽序列显示在SEQ ID NO:262
实施例161
2H7 scFv(SSS-S)H WCH2 WCH3和2H7 scFv(SSS-S)H P238SCH2WCH3导致的体内B细胞减少
本实施例描述了关于B细胞的减少中的ADCC效应物机制的实验,其通过对比了抗-CD20构建体(2H7 scFv(SSS-S)H WCH2 WCH3)和在CH2结构域具有脯氨酸向丝氨酸的氨基酸取代的抗-CD20构建体(2H7scFv(SSS-S)H P238SCH2 WCH3)的活性来进行。图72显示了这些构建体的细胞凋亡诱导实验的结果。结果表明,二种分子均能结合CD20,并诱导由天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3的激活介导的细胞凋亡。
图73表明,抗-CD20构建体能介导朝向CD20阳性的靶细胞的CDC活性。将2H7 scFv(SSS-S)H WCH2 WCH3构建体、2H7 scFv(SSS-S)H P238SCH2 WCH3构建体或利妥希玛以递增浓度与104 Bjab靶细胞和在100微升体积中的1∶10稀度的兔补体(PelFreez)温育60分钟。用锥虫蓝(Invitrogen)染色等分试样,并使用血细胞计数器计数,以确定在处理过程中杀伤的细胞群体的百分比。还包括了具有细胞和仅仅一种试剂的阴性对照。图74表明,2H7scFv(SSS-S)H WCH2 WCH3构建体在利用外周血单核细胞的ADCC中是有效的。体外测量了2H7scFv(SSS-S)H WCH2 WCH3或利妥希玛对作为靶细胞的BJAB B淋巴瘤细胞系的ADCC活性并使用新鲜的人PBMC作为效应细胞。如下改变效应物与靶的比率:100∶1、50∶1和25∶1,每个孔的BJAB细胞的数目保持恒定,但是改变PBMC的数目。用51Cr标记BJAB细胞2小时,并以5x104细胞/孔的细胞密度,等分试样到平底96孔平板的每个孔中。以10μg/ml的浓度,加入纯化的融合蛋白或利妥希玛,以1.25x106细胞/孔(25∶1)、2.5x106细胞/孔(50∶1)或5x106细胞/孔(100∶1),加入PBMC,终体积为200μl。通过省略构建体或MAb,在每个效应物∶靶比率测量了自然杀伤。不加入PBMC或融合蛋白,测量了自发释放,并通过向适当的孔中加入去污剂(1%NP-40),测量了最大释放。将反应物温育5小时,将100μl培养物上清液收获到Lumaplate(Packard Instruments)中,并使其干燥过夜,然后在Packard Top Count NXT小平板闪烁计数器上计数释放的cpm。图75表明,2H7 scFv(SSS-S)H WCH2 WCH3构建体能结合可溶的CD 16融合蛋白(从高或低亲和力等位基因(158V/F)构建的),而2H7 scFv(SSS-S)H P238SCH2 WCH3构建体没有表现出可检测到的结合。将CD20CHO细胞(106)与饱和量的2H7 scFv(SSS-S)H WCH2 WCH3或2H7 scFv(SSS-S)H P238SCH2 WCH3(10μg/ml)在冰上、在PBS/2%FBS中温育1小时。在PBS/2%FBS中洗涤细胞,并与系列稀释的0.5mg/mlFITC-CD16在冰上温育1小时。洗涤细胞,并通过使用Beckman-Coulter Epics C机器的流式细胞计,测量特异性的结合。使用Expo分析软件分析了结果,并将标准化的荧光单位绘制成浓度的函数图。图76说明了关于2H7 scFv(SSS-S)H WCH2 WCH3和2H7scFv(SSS-S)H P238SCH2 WCH3构建体结合U937细胞的能力的实验。在冰上,在PBS/2%FBS中,将能表达CD64的U937细胞(106)与2H7scFv(SSS-S)H WCH2 WCH3或2H7 scFv(SSS-S)H P238SCH2 WCH3一起温育1小时。洗涤细胞,并将其与FITC-山羊抗-人IgG1(Fc特异性的)(Caltag)一起,在冰上以1∶100的终稀度温育1小时。洗涤细胞,在Beckman-Coulter EpicsC流式细胞计上,分析荧光。使用Expo分析软件分析了数据,并将荧光强度绘制成2H7 scFv(SSS-S)H WCH2 WCH3或2H7 scFv(SSS-S)H P238SCH2 WCH3的浓度的函数图。该图表明,2H7 scFv(SSS-S)H WCH2 WCH3构建体和2H7 scFv(SSS-S)H P238SCH2 WCH3构建体二者都能以等同的滴度曲线结合U937细胞。该结果表明,2H7 scFv(SSS-S)H P238SCH2 WCH3构建体与高亲和力Fc受体FcγRI(CD64)的结合未受减弱。在该实验中2种分子与U937细胞上的高亲和力FcγRI的结合相似的事实说明,P238S氨基酸变化能选择性地减少与FcγRIII的结合。图77说明了抗-CD20构建体(2H7 scFv(SSS-S)H WCH2 WCH3)和具有CH2结构域突变的抗-CD20)scFv介导的猕猴中的B细胞减少。通过6mg/kg的静脉内注射,隔周施用2次输注,将2H7scFv(SSS-S)H WCH2 WCH3或2H7 scFv(SSS-S)H P238SCH2 WCH3施用给食蟹猴(M.fasicularis)。通过检测外周血中的CD40阳性的B细胞,测量了对循环B细胞的作用。在第7、0、1、3、7、8、10、14、28和43天,从注射的动物抽取血液样品。通过对猴血液进行CBC(全血细胞计数)和双色流式细胞计分析,估计B细胞减少。以各种组合,使用了抗CD40、CD19、CD20、IgG、CD3、CD8的抗体的FITC或PE缀合物。将数据绘制成与最初的注射前的时间点的B细胞水平(最大值)相比,以每微升的CD40阳性的血液B细胞的千细胞数随时间的变化图。该实验表明,2H7 scFv(SSS-S)H WCH2 WCH3 scFv注射能导致循环B细胞的迅速且完全的减少,其在第二次注射后能持续超过28天。2H7 scFv(SSS-S)H P238SCH2 WCH3 scFv的注射不能完全减少B细胞,即使CD20表位是饱和的。在前2周的过程中,观察到了B细胞缓慢减少至最初水平的大约50%,但是这些动物中的B细胞迅速恢复到起始水平。这些结果表明,结合高亲和力FcγRI和介导依赖补体的细胞毒性的能力,对于CytoxB20G分子完全减少循环B细胞是不够的,且与CD16的相互作用介导的ADCC可能是迅速的且持续的B细胞减少所必需的。
这些实验表明,2H7 scFv(SSS-S)H WCH2 WCH3 scFv能通过3种不同的作用机制:(1)细胞凋亡的诱导,(2)CDC效应物机制和(3)ADCC效应物机制,来触发B细胞减少功能。所有这3种机制可能都有助于体内的B细胞减少。数据表明,完全的和持续的B细胞减少需要完整的ADCC效应物机制。但是,用ADCC阴性的突变体得到的部分减少,也表明细胞凋亡和CDC机制有助于介导总B细胞减少作用的一部分。结果支持了2H7 scFv(SSS-S)H WCH2 WCH3 scFv在患有CD20阳性的B细胞恶性肿瘤或自身免疫病的患者中的应用。
实施例162
抗-CD37 GS-1 VL11S scFv(SSS)H WCH2WCH3构建体对B细胞中的细胞凋亡的诱导
在本实施例中,评价了抗-CD 37GS-1 VL11S scFv(SSS)HWCH2WCH3构建体结合靶细胞的能力和诱导细胞凋亡的能力。通过尺寸排阻色谱(SEC),物理地表征了构建体。图78说明了具有SSC铰链结构域形式的G28-1(抗-CD37)构建体(GS-1VL11S scFv(SSC)HWCH2WCH3)的SEC特征。通过A蛋白亲和色谱,从CHO培养物上清液纯化了G28-1(抗-CD37)构建体。在Tosoh Biosep,Inc.TSK 3000SWXLHPLC柱,孔径5mm上,对10-25mg纯化的等分试样,进行HPLC。流速是1-ml/分钟,在PBS,pH 7.2运行缓冲液中。在图下面标示了分子量标准物的迁移率。GS-1 VL 11S scFv(SSS)H WCH2WCH3构建体标示为蓝色,而GS-1VL 11S scFv(SSC)H WCH2WCH3构建体标示为红色。GS-1VL11S scFv(SSS)HWCH2WCH3构建体产生了大约75-100kDa的均匀峰,而GS-1 VL11S scFv(SSC)HWCH2WCH3构建体产生了更小的形式和其他的不均匀的形式,包括超过200kDa的高分子量形式。图79说明了G28-1(抗-CD37)构建体与B细胞淋巴瘤细胞系的结合。将纯化的GS-1VL11S scFv(SSS)H WCH2WCH3或GS-1 VL11SscFv(SSC)H WCH2WCH3的系列稀释液与每种细胞类型的106细胞一起在冰上、在PBS/2%FBS中温育60分钟。洗涤样品2次,并将其与FITC山羊抗-人IgG和FITC山羊抗-人IgG F(ab′)2(CalTag)的混合物一起在冰上以各1∶100温育45分钟。洗涤样品,并通过使用FACsCalibur(Becton-Dickinson)的流式细胞计,进行分析。该实验的结果表明,GS-1 VL11S scFv(SSS)H WCH2WCH3和GS-1 VL11S scFv(SSC)H WCH2WCH3构建体能结合BJAB和Ramos细胞,并中等地结合WIL-2细胞。在这些实验中,G28-1(抗-CD37)(SSS)H G scFv或G28-1(SSC)H G scFv构建体分子能以更低的水平结合Raji和Namalwa细胞。与所有系的结合都是显著的,因为已经从图79所示的数据减去了背景荧光。图80说明了与GS-1 VL11S scFv(SSS)HWCH2WCH3或GS-1 VL11S scFv(SSC)H WCH2WCH3形式的scFv一起温育过夜后,膜联蛋白和v-碘化丙锭与Ramous细胞的结合。膜联蛋白V-PI染色与G28-1(抗-CD37)scFv一起温育了24小时的Ramos细胞。在12孔皿中,以2ml的总体积,将106细胞/ml的Ramos B细胞与10mg/ml的G28-1(抗-CD37)scFv温育24小时。根据生产商的说明书,利用从Immunotech得到的试剂盒,用膜联蛋白V和碘化丙锭对细胞染色。通过使用FACsCalibur流式细胞计(Becton-Dickinson)的双色流式细胞计,分析了样品。在每个点图的旁边,标示了每个象限中的总细胞的%。图83显示了与GS-1 VL11SscFv(SSS)H WCH2WCH3或GS-1 VL11S scFv(SSC)H WCH2WCH3温育过夜后,膜联蛋白V-碘化丙锭与细胞的结合。结果表明,GS-1VL11S scFv(SSS)H WCH2WCH3和GS-1 VL11S scFv(SSC)H WCH2WCH3构建体能诱导细胞凋亡,但是SSC形式能诱导比SSS形式更多的细胞凋亡。图81说明了在有G28-1(抗-CD 37)构建体存在的情况下,对Ramos细胞生长的增殖的抑制。将Ramos B细胞与纯化的G28-1(抗-CD37)构建体的系列稀释液一起温育,所述构建体含有鉴别为(SSS)H或(SSC)H的IgG1铰链。在96孔平底组织培养皿(Costar)中,在37℃、5%CO2,温育培养物36小时,然后在48小时温育的最后12小时用3H-胸苷脉冲处理(0.75mCi/孔)。使用Packard收获机,将细胞收获到96-孔GFC平板上,干燥,并将25ml Microscint闪烁液加入每个孔中,然后在TopCount NXT小平板(Packard)闪烁计数器上计数。将数据绘制成整合的cpm对蛋白浓度的图。每种构建体都表现出了随着递增的蛋白浓度而递增的增殖抑制。图82说明了在有2H7(抗-CD20)和G28-1(抗-CD37)构建体存在的情况下,培养的Ramos B细胞中的细胞凋亡的诱导。将Ramos B细胞与CD20和/或CD37靶向的构建体(10mg/ml)在溶液中温育20小时。然后收获细胞,洗涤,并使用来自Immunotech的染色试剂盒,在膜联蛋白V和碘化丙锭中温育,然后使用FACsCalibur流式细胞计(Becton-Dickinson),进行双色流式细胞计分析。该图显示了通过在点图的右象限中的染色鉴别出的膜联蛋白V阳性的细胞的百分比。该实验的结果表明,2种G28-1构建体比2H7构建体更有效,且G28-1 VL11S scFv(SSS)HWCH2 WCH3构建体比G28-1 VL11S scFv(SSC)H WCH2 WCH3构建体更有效。但是,当组合使用2H7和G28-1构建体时,Ramos细胞的细胞凋亡的量最大。图83说明了具有铰链区突变的2H7(抗-CD20)构建体和G28-1(抗-CD37)构建体诱导的依赖补体的细胞毒性(CDC)对Ramos细胞的杀伤。将10mg/ml的2H7 scFv(CSS-S)H WCH 2WCH3(抗-CD20)、G28-1 scFv(SSS)HG、G28-1(SCS)H(抗-CD37-scFv)、G28-1(CSS)H(抗-CD37-scFv)或G28-1(SSC)H(抗-CD37-scFv)与104Ramos靶细胞和1∶10稀释的兔补体(PelFreez),150ml的体积温育90分钟。用锥虫蓝(Invitrogen)染色等分试样,使用血细胞计数器计数,以确定在处理过程中杀伤的细胞群体的百分比。还包括了具有细胞和仅仅一种试剂的阴性对照。在该实验中,在有兔补体存在的情况下,G28-1(SSS)(抗-CD37scFv)和G28-1(SSC)(抗-CD37scFv)都能迅速杀伤Ramos细胞。G28-1(SSC)(抗-CD37scFv)的活性高于G28-1(SSS)(抗-CD37 scFv)的,且在该测定中几乎与CD20-指导的2H7 scFv(CSS-S)H WCH2 WCH3 scFv分子一样有效。图84说明了与G28-1(抗-CD37)scFv一起温育的Ramos细胞的ADCC的诱导。以从0至100的不同的效应物∶靶比率,在平底96孔平板中,将10mg/ml的G28-1(抗-CD37)构建体与104 51Cr-标记的Ramos细胞和静止的人PBMC一起温育。在每种效应物∶靶比率,一式三份地进行所有的温育。通过省略构建体,在每种效应物∶靶比率,测量了自然杀伤。不加入PBMC或融合蛋白,测量了自发释放,并通过向适当的孔中加入去污剂(1%NP-40),测量了最大释放。将反应物温育6小时,将100ml培养物上清液收获到Lumaplate(PackardInstruments)中,并干燥过夜,然后在Packard Top Count NXT小平板闪烁计数器上计数释放的cpm。这些实验的结果表明,G28-1(抗-CD37)构建体能结合靶细胞,它们能诱导B细胞系中的细胞凋亡,且它们能介导效应子功能,包括CDC和ADCC。
在本发明范围内的或有用的其他非限制性的代表性的构建体或序列如下:
HuIgG1野生型铰链,CH2,CH3(核苷酸序列)(SEQ ID NO:1)
tctgatcaggagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtctt
cctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaa
gaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaa
cagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaac
aaagccctcccagcccccatcgagaaaacaatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgccccc
atcccgggatgagvtgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgg
gagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaag
ctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgc
agaagagcctctccctgtctccgggtaaatgatctaga
HuIgG1野生型铰链,CH2,CH3(氨基酸序列)(SEQ ID NO:2)
SDQEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE
DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK
VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV
EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH
NHYTQKSLSLSPGK
美洲驼IgG1铰链,CH2,CH3(核苷酸序列)(SEQ ID NO:3)
tgatcaagaaccacatggaggatgcacgtgcccncagtgcccncaatgcccngcnccngaactnccaggaggcccttctgtcttt
gtcttccccccgaaacccaaggacgtcctctccatttttggaggccgagtcacgtgcgttgtagtggacgtcggaaagaaagaccc
cgaggtgtcaatttcaactggtatattgatggcgttgaggtgcgaacggccaatacgaagccaaaagaggaacagttcaacagcacg
taccgcgtggtcagcgtcctgcccatccagcaccaggactggctgacggggaaggaattcaagtgcaaggtcaacaacaaagct
ctcccggcccccatcgagaggaccatctccaaggccaaagggcagacccgggagccgcaggtgtacaccctggccccacacc
gggaagaactggccaaggacaccgtgagcgtaacatgcctggtcaaaggcttctacccagctgacatcaacgttgagtggcaga
ggaacggtcagccggagtcagagggcacctacgccaacacgccgccacagctggacaacgacgggacctacttcctctacagc
aagctctcggtgggaaagaacacgtggcagcggggagaaaccttaacctgtgtggtgatgcatgaggccctgcacaaccactac
acccagaaatccatcacccagtcttcgggtaaatagtaatctaga
美洲驼IgG1铰链,CH2,CH3(在图23中为美洲驼IgG1)(氨基酸序列)(SEQ ID NO:4)
EPHGGCTCPQCPAPELPGGPSVFVFPPKPKDVLSISGRPEVTCVVVDVGKEDPEVN
FNWYIDGVEVRTANTKPKEEQFNSTYRVVSVLPIQHQDWLTGKEFKCKVNNKAL
PAPIERTISKAKGQTREPQVYTLAPHREELAKDTVSVTCLVKGFYPADINVEWQRN
GQPESEGTYANTPPQLDNDGTYFLYSRLSVGKNTWQRGETLTGVVMHEALHNHY
TQKSITQSSGK
美洲驼IgG2(核苷酸序列)(SEQ ID NO:5)
tgatcaagaacccaagacaccaaaaccacaaccacaaccacaaccacaacccaatcctacaacagaatccaagtgtcccaaatgt
ccagcccctgagctcctgggagggccctcagtcttcatcttccccccgaaacccaaggacgtcctctccatttctgggaggcccga
ggtcacgtgcgttgtggtagacgtgggccaggaagaccccgaggtcagtttcaactggtacattgatggcgctgaggtgcgaacg
gccaacacgaggccaaaagaggaacagttcaacagcacgtaccgcgtggtcagcgtcctgcccatccagcaccaggactggct
gacggggaaggaattcaagtgcaaggtcaacaacaaagctctcccggcccccatcgagaagaccatctccaaggccaaagggc
agacccgggagccgcaggtgtacaccctggccccacaccgggaagagctggccaaggacaccgtgagcgtaacatgcctggt
caaaggcttctacccacctgatatcaacgttgagtggcagaggaatgggcagccggagtcagagggcacytacgccaccacgc
caccccagctggacaacgacgggacctacttcctctacagcaagctctcggtgggaaagaacacgtggcagcagggagaaacc
ttcacctgtgtggtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaaatccatcacccagtcttcgggtaaatagtaatctaga
美洲驼IgG2(氨基酸序列)(SEQ ID NO:6)
DQEPKTPKPQPQPQPQPNPTTESKCPKCPAPELLGGPSVFIFPPKPKDVLSISGRPEV
TCVVVDVGQEDPEVSFNWYIDGAEVRTANTRPKEEQFNSTYRVVSVLPIQHQDWL
TGKEFKCKVNNKALPAPIEKTISKAKGQTREPQVYTLAPHREELAKDTVSVTCLVK
GFYPPDINVEWQRNGQPESEGTYATTPPQLDNDGTYFLYSKLSVGKNTWQQGETF
TCVVMHEALHNHYTQKSITQSSGK
美洲驼IgG 3Fc(核苷酸序列)(SEQ ID NO:7)
tgatcaagcgcaccacagcgaagaccccagctccaagtgtcccaaatgcccaggccctgaactccttggagggcccacggtctt
catcttccccccgaaagccaaggacgtcctctccatcacccgaaaacctgaggtcacgtgcttgtggtggacgtgggtaaagaag
accctgagatcgagttcaagctggtccgtggatgacacagaggtacacacggctgagacaaagccaaaggaggaacagttcaac
agcacgtaccgcgtggtcagcgtcctgcccatccagcaccaggactggctgacggggaaggaattcaagtgcaaggtcaacaa
caaagctctcccagcccccatcgagaggaccatctccaaggccaaagggcagacccgggagccgcaggtgtacaccctggcc
ccacaccgggaagagctggccaaggacaccgtgagcgtaacctgcctggtcaaaggcttcttcccagctgacatcaacgttgagt
ggcagaggaatgggcagccggagtcagagggcacctacgccaacacgccgccacagctggacaacgacgggacctacttcct
ctacagcaaactctccgtgggaaagaacacgtggcagcagggagaagtcttcacctgtgtggtgatgcacgaggctctacacaat
cactccacccagaaatccatcacccagtcttcgggtaaatagtaatctagagggccc
美洲驼IgG3 Fc(氨基酸序列)(SEQ ID NO:8)
DQAHHSEDPSSKCPKCPGPELLGGPTVFIFPPKAKDVLSITRKPEVTCLWWTWVKK
TLRSSSSWSVDDTEVHTAETKPKEEQFNSTYRVVSVLPIQHQDWLTGKEFKCKVN
NKALPAPIERTISKAKGQTREPQVYTLAPHREELAKDTVSVTCLVKGFFPADINVE
WQRNGQPESEGTYANTPPQLDNDGTYFLYSKLSVGKNTWQQGEVFTCVVMHEA
LHNHSTQKSITQSSGK
HuIgG1野生型铰链(核苷酸序列)(SEQ ID NO:9)
gatcaggagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagca
HuIgG1野生型铰链(氨基酸序列)(SEQ ID NO:10)
DQEPKSCDKTHTCPPCPA
HuIgG1 H2,在第2个位置具有leu的野生型铰链(核苷酸序列)(SEQ ID NO:11)
gatctggagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagca
HuIgG1 H2,在第2个位置具有leu的野生型铰链(氨基酸序列)(SEQ ID NO:12)
DLEPKSCDKTHTCPPCPA
NTHuIgG1野生型CH2(核苷酸序列)(SEQ ID NO:13)
cctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcac
atgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaa
gacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatg
gcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaa
HuIgG1野生型CH2(氨基酸序列)(SEQ ID NO:14)
PELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHN
AKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK
HuIgG1野生型CH3(核苷酸序列)(SEQ ID NO:15)
gggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcct
ggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctc
ccgtgctggactccgacggctccttcttcctctatagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctca
tgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtccccgggtaaatga
HuIgG1野生型CH3(氨基酸序列)(SEQ ID NO:16)
GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP
VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
HuIgG1突变的铰链(C-C-C→S-S-S)(核苷酸序列)(SEQ IDNO:17)
gatcaggagcccaaatcttctgacaaaactcacacatccccaccgtccccagca
HuIgG1突变的铰链(C-C-C→S-S-S)(氨基酸序列)(SEQ IDNO:18)
DQEPKSSDKTHTSPPSPA
HIgG1MTH WTCH2CH3(具有野生型CH2和CH3的突变铰链(从铰链+Ig尾阅读)(核苷酸序列)(SEQ ID NO:19)
tgatcaccccaaatcttctgacaaaactcacacatctccaccgtcctcagcacctgaactcctgggtggaccgtcagtcttcctcttcc
ccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctg
aggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacg
taccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccc
tcccagcccccatcgagaaaacaatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgg
gatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagc
aatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccg
tggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaaga
gcctctccctgtctccgggtaaatgataatctaga
突变的铰链,但是野生型CH2和CH3(氨基酸序列)(SEQ ID NO:20)
DHPKSSDKTHTSPPSSAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDP
EVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVS
NKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW
ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNH
YTQKSLSLSPGK
2H7 scFv美洲驼IgG1(核苷酸序列)(SEQ ID NO:21)
aagcttgccgccatggattttcaagtgcagattttcagcttcctgctaatcagtgcttcagtcataattgccagaggacaaattgttctct
cccagtctccagcaatcctgtctgcatctccaggggagaaggtcacaatgacttgcagggccagctcaagtgtaagttacatgcact
ggtaccagcagaagccaggatcctcccccaaaccctggatttatgccccatccaacctggcttctggagtccctgctcgcttcagtg
gcagtgggtctgggacctcttactctctcacaatcagcagagtggaggctgaagatgctgccacttattactgccagcagtggagttt
taacccacccacgttcggtgctgggaccaagctggagctgaaagatggcggtggctcgggcggtggtggatctggaggaggtg
ggagctctcaggcttatctacagcagtctggggctgagctggtgaggcctggggcctcagtgaagatgtcctgcaaggcttctggc
tacacatttaccagttacaatatgcactgggtaaagcagacacctagacagggcctggaatggattggagctatttatccaggaaat
ggtgatacttcctacaatcagaagttcaagggcaaggccacactgactgtagacaaatcctccagcacagcctacatgcagctcag
cagcctgacatctgaagactctgcggtctatttctgtgcaagagtggtgtactatagtaactcttactggtacttcgatgtctggggcac
agggaccacggtcaccgtctcttctgatcaagaaccacatggaggatgcacgtgcccncagtgcccncaatgcccngcnccng
aactnccaggaggcccttctgtctttgtcttccccccgaaacccaaggacgtcctctccatttttggaggccgagtcacgtgcgttgt
agtggacgtcggaaagaaagaccccgaggtcaatttcaactggtatattgatggcgttgaggtgcgaacggccaatacgaagcca
aaagaggaacagttcaacagcacgtaccgcgtggtcagcgtcctgcccatccagcaccaggactggctgacggggaaggaatt
caagtgcaaggtcaacaacaaagctctcccggcccccatcgagaggaccatctccaaggccaaagggcagacccgggagccg
caggtgtacaccctggccccacaccgggaagaactggccaaggacaccgtgagcgtaacatgcctggtcaaaggcttctaccca
gctgacatcaacgttgagtggcagaggaacggtcagccggagtcagagggcacctacgccaacacgccgccacagctggaca
acgacgggacctacttcctctacagcaagctctcggtgggaaagaacacgtggcagcggggagaaaccttaacctgtgtggtgat
gcatgaggccctgcacaaccactacacccagaaatccatcacccagtcttcgggtaaatagtaatctaga
2H7 scFv美洲驼IgG1(氨基酸序列)(SEQ ID NO:22)
MDFQVQIFSFLLISASVIIARGQIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYMHWY
QQKPGSSPKPWIYAPSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWS
FNPPTFGAGTKLELKDGGGSGGGGSGGGGSSQAYLQQSGAELVRPGASVKMSCK
ASGYTFTSYNMHWVKQTPRQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTVDKSSS
TAYMQLSSLTSEDSAVYFCARVVYYSNSYWYFDVWGTGTTVTVSSDQEPHGGCT
CPQCPAPELPGGPSVFVFPPKPKDVLSIFGGRVTCVVVDVGKKDPEVNFNWYIDGV
EVRTANTKPKEEQFNSTYRVVSVLPIQHQDWLTGKEFKCKVNNKALPAPIERTISK
AKGQTREPQVYTLAPHREELAKDTVSVTCLVKGFYPADINVEWQRNGQPESEGTY
ANTPPQLDNDGTYFLYSKLSVGKNTWQRGETLTCVVMHEALHNHYTQKSITQSS
GK
2H7 scFv美洲驼IgG2(核苷酸序列)(SEQ ID NO:23)
aagcttgccgccatggattttcaagtgcagattttcagcttcctgctaatcagtgcttcagtcataattgccagaggacaaattgttctct
cccagtctccagcaatcctgtctgcatctccaggggagaaggtcacaatgacttgcagggccagctcaagtgtaagttacatgcact
ggtaccagcagaagccaggatcctcccccaaaccctggatttatgccccatccaacctggcttctggagtccctgctcgcttcagtg
gcagtgggtctgggacctcttactctctcacaatcagcagagtggaggctgaagatgctgccacttattactgccagcagtggagttt
taacccacccacgttcggtgctgggaccaagctggagctgaaagatggcggtggctcgggcggtggtggatctggaggaggtg
ggagctctcaggcttatctacagcagtctggggctgagctggtgaggcctggggcctcagtgaagatgtcctgcaaggcttctggc
tacacatttaccagttacaatatgcactgggtaaagcagacacctagacagggcctggaatggattggagctatttatccaggaaat
ggtgatacttcctacaatcagaagttcaagggcaaggccacactgactgtagacaaatcctccagcacagcctacatgcagctcag
cagcctgacatctgaagactctgcggtctatttctgtgcaagagtggtgtactatagtaactcttactggtacttcgatgtctggggcac
agggaccacggtcaccgtctcttctgatcaagaacccaagacaccaaaaccacaaccacaaccacaaccacaacccaatcctac
aacagaatccaagtgtcccaaatgtccagcccctgagctcctgggagggccctcagtcttcatcttccccccgaaacccaaggac
gtcctctccatttctgggaggcccgaggtcacgtgcgttgtggtagacgtgggccaggaagaccccgaggtcagtttcaactggta
cattgatggcgctgaggtgcgaacggccaacacgaggccaaaagaggaacagttcaacagcacgtaccgcgtggtcagcgtcc
tgcccatccagcaccaggactggctgacggggaaggaattcaagtgcaaggtcaacaacaaagctctcccggcccccatcgag
aagaccatctccaaggccaaagggcagacccgggagccgcaggtgtacaccctggccccacaccgggaagagctggccaag
gacaccgtgagcgtaacatgcctggtcaaaggcttctacccacctgatatcaacgttgagtggcagaggaatgggcagccggagt
cagagggcacytacgccaccacgccaccccagctggacaacgacgggacctacttcctctacagcaagctctcggtgggaaag
aacacgtggcagcagggagaaaccttcacctgtgtggtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaaatccatcacc
cagtcttcgggtaaatagtaatctaga
AA2H7 scFv美洲驼IgG2(氨基酸序列)(SEQ ID NO:24)
MDFQVQIFSFLLISASVIIARGQIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYMHWY
QQKPGSSPKPWIYAPSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWS
FNPPTFGAGTKLELKDGGGSGGGGSGGGGSSQAYLQQSGAELVRPGASVKMSCK
ASGYTFTSYNMHWVKQTPRQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTVDKSSS
TAYMQLSSLTSEDSAVYFCARVVYYSNSYWYFDVWGTGTTVTVSSDQEPKTPKP
QPQPQPQPNPTTESKCPKCPAPELLGGPSVFIFPPKPKDVLSISGRPEVTCVVVDVG
QEDPEVSFNWYIDGAEVRTANTRPKEEQFNSTYRVVSVLPIQHQDWLTGKEFKCK
VNNKALPAPIEKTISKAKGQTREPQVYTLAPHREELAKDTVSVTCLVKGFYPPDIN
VEWQRNGQPESEGTYATTPPQLDNDGTYFLYSKLSVGKNTWQQGETFTCVVMHE
ALHNHYTQKSITQSSGK
NT2H7 scFv美洲驼IgG3(核苷酸序列)(SEQ ID NO:25)
aagcttgccgccatggattttcaagtgcagattttcagcttcctgctaatcagtgcttcagtcataattgccagaggacaaattgttctct
cccagtctccagcaatcctgtctgcatctccaggggagaaggtcacaatgacttgcagggccagctcaagtgtaagttacatgcact
ggtaccagcagaagccaggatcctcccccaaaccctggatttatgccccatccaacctggcttctggagtccctgctcgcttcagtg
gcagtgggtctgggacctcttactctctcacaatcagcagagtggaggctgaagatgctgccacttattactgccagcagtggagttt
taacccacccacgttcggtgctgggaccaagctggagctgaaagatggcggtggctcgggcggtggtggatctggaggaggtg
ggagctctcaggcttatctacagcagtctggggctgagctggtgaggcctggggcctcagtgaagatgtcctgcaaggcttctggc
tacacatttaccagttacaatatgcactgggtaaagcagacacctagacagggcctggaatggattggagctatttatccaggaaat
ggtgatacttcctacaatcagaagttcaagggcaaggccacactgactgtagacaaatcctccagcacagcctacatgcagctcag
cagcctgacatctgaagactctgcggtctatttctgtgcaagagtggtgtactatagtaactcttactggtacttcgatgtctggggcac
agggaccacggtcaccgtctcttctgatcaagcgaaccacagcgaagaccccagctccaagtgtcccaaatgcccaggccctga
actccttggagggcccacggtcttcatcttccccccgaaagccaaggacgtcctctccatcacccgaaaacctgaggtcacgtgctt
gtggtggacgtgggtaaagaagaccctgagatcgagttcaagctggtccgtggatgacacagaggtacacacggctgagacaaa
gccaaaggaggaacagttcaacagcacgtaccgcgtggtcagcgtcctgcccatccagcaccaggactggctgacggggaag
gaattcaagtgcaaggtcaacaacaaagctctcccagcccccatcgagaggaccatctccaaggccaaagggcagacccggga
gccgcaggtgtacaccctggccccacaccgggaagagctggccaaggacaccgtgagcgtaacctgcctggtcaaaggcttctt
cccagctgacatcaacgttgagtggcagaggaatgggcagccggagtcagagggcacctacgccaacacgccgccacagctg
gacaacgacgggacctacttcctctacagcaaactctccgtgggaaagaacacgtggcagcagggagaagtcttcacctgtgtgg
tgatgcacgaggctctacacaatcactccacccagaaatccatcacccagtcttcgggtaaatagtaatctagagggccc
2H7 scFv美洲驼IgG3(氨基酸序列)(SEQ ID NO:26)
MDFQVQIFSFLLISASVIIARGQIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYMHWY
QQKPGSSPKPWIYAPSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWS
FNPPTFGAGTKLELKDGGGSGGGGSGGGGSSQAYLQQSGAELVRPGASVKMS CK
ASGYTFTSYNMHWVKQTPRQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTVDKSSS
TAYMQLSSLTSEDSAVYFCARVVYYSNSYWYFDVWGTGTTVTVSSDQAHSHSED
PSSKCPKCPGPELLGGPTVFIFPPKAKDVLSITRKPEVTCLWWTWVKKTLRSSSSW
SVDDTEVHTAETKPKEEQFNSTYRVVSVLPIQHQDWLTGKEFKCKVNNKALPAPI
ERTISKAKGQTREPQVYTLAPHREELAKDTVSVTCLVKGFFPADINVEWQRNGQP
ESEGTYANTPPQLDNDGTYFLYSKLSVGKNTWQQGEVETCVVMHEALHNHSTQK
SITQSSGK
2H7 scFv WTH WTCH2CH3(核苷酸序列)(SEQ ID NO:27)
aagcttgccgccatggattttcaagtgcagattttcagcttcctgctaatcagtgcttcagtcataattgccagaggacaaattgttctct
cccagtctccagcaatcctgtctgcatctccaggggagaaggtcacaatgacttgcagggccagctcaagtgtaagttacatgcact
ggtaccagcagaagccaggatcctcccccaaaccctggatttatgccccatccaacctggcttctggagtccctgctcgcttcagtg
gcagtgggtctgggacctcttactctctcacaatcagcagagtggaggctgaagatgctgccacttattactgccagcagtggagttt
taacccacccacgttcggtgctgggaccaagctggagctgaaagatggcggtggctcgggcggtggtggatctggaggaggtg
ggagctctcaggcttatctacagcagtctggggctgagctggtgaggcctggggcctcagtgaagatgtcctgcaaggcttctggc
tacacatttaccagttacaatatgcactgggtaaagcagacacctagacagggcctggaatggattggagctatttatccaggaaat
ggtgatacttcctacaatcagaagttcaagggcaaggccacactgactgtagacaaatcctccagcacagcctacatgcagctcag
cagcctgacatctgaagactctgcggtctatttctgtgcaagagtggtgtactatagtaactcttactggtacttcgatgtctggggcac
agggaccacggtcaccgtctcttctgatcaggagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaac
tcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtg
gtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaag
ccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaagga
gtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaacaatctccaaagccaaagggcagccccgagaac
cacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcc
cagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgac
ggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatga
ggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatgatctaga
2H7 scFv WTH WTCH2CH3(氨基酸序列)(SEQ ID NO:28)
MDFQVQIFSFLLISASVIIARGQIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYMHWY
QQKPGSSPKPWIYAPSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWS
FNPPTFGAGTKLELKDGGGSGGGGSGGGGSSQAYLQQSGAELVRPGASVKMSCK
ASGYTFTSYNMHWVKQTPRQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTVDKSSS
TAYMQLSSLTSEDSAVYFCARVVYYSNSYWYFDVWGTGTTVTVSSDQEPKSCDK
THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY
VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPI
EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE
NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL
SPGK
NTCD80膜结构域和细胞质尾(+限制位点)(核苷酸序列)(SEQID NO:29)
gcggatccttcgaacctgctcccatcctgggccattaccttaatctcagtaaatggaatttttgtgatatgctgcctgacctactgctttg
ccccaagatgcagagagagaaggaggaatgagagattgagaagggaaagtgtacgccctgtataaatcgat
CD80跨膜结构域和细胞质尾(氨基酸序列)(SEQ ID NO:30)
ADPSNLLPSWAITLISVNGIFVICCLTYCFAPRCRERRRNERLRRESVRPV
40.2.220 VL(抗人CD40 scFv #1-VL)(核苷酸序列)(SEQ IDNO:31)
aagcttatggattttcaagtgcagattttcagcttcctgctaatcagtgcttcagtcataatgtccagaggagtcgacattgttctgactc
agtctccagccaccctgtctgtgactccaggagatagagtctctctttcctgcagggccagccagagtattagcgactacttacactg
gtatcaacaaaaatcacatgagtctccaaggcttctcatcaaatatgcttcccattccatctctgggatcccctccaggttcagtggca
gtggatcagggtcagatttcactctcagtatcaacagtgtggaacctgaagatgttggaatttattactgtcaacatggtcacagctttc
cgtggacgttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaacgg
40.2.220 VL(抗人CD40 scFv #1-VL)(氨基酸序列)(SEQ IDNO:32)
MDFQVQIFSFLLISASVIMSRGVDIVLTQSPATLSVTPGDRVSLSCRASQSISDYLHW
YQQKSHESPRLLIKYASHSISGIPSRFSGSGSGSDFTLSINSVEPEDVGIYYCQHGHSF
PWTFGGGTKLEIKR
40.2.220 VH(抗人CD40 scFv #1-VH)(核苷酸序列)(SEQ IDNO:33)
cagatccagttggtgcaatctggacctgagctgaagaagcctggagagacagtcaggatctcctgcaaggcttctgggtatgcctt
cacaactactggaatgcagtgggtgcaagagatgccaggaaagggtttgaagtggattggctggataaacaccccactctggagt
gccaaaatatgtagaagacttcaaggacggtttgccttctctttggaaacctctgccaacactgcatatttacagataagcaacctcaa
agatgaggacacggctacgtatttctgtgtgagatccgggaatggtaactatgacctggcctactttgcttactggggccaagggac
actggtcactgtctctgatca
40.2.220 VH(抗人CD40 scFv #1-VH)(氨基酸序列)(SEQ IDNO:34)
QIQLVQSGPELKKPGETVRISCKASGYAFTTTGMQWVQEMPGKGLKWIGWINTPL
WSAKICRRLQGRFAFSLETSANTAYLQISNLKDEDTATYFCVRSGNGNYDLAYFA
YWGQGTLVTVS
40.2.220 scFv(抗人CD40 scFv #1)(核苷酸序列)(SEQ IDNO:35)
aagcttatggattttcaagtgcagattttcagcttcctgctaatcagtgcttcagtcataatgtccagaggagtcgacattgttctgactc
agtctccagccaccctgtctgtgactccaggagatagagtctctctttcctgcagggccagccagagtattagcgactacttacactg
gtatcaacaaaaatcacatgagtctccaaggcttctcatcaaatatgcttcccattccatctctgggatcccctccaggttcagtggca
gtggatcagggtcagatttcactctcagtatcaacagtgtggaacctgaagatgttggaatttattactgtcaacatggtcacagctttc
cgtggacgttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaacggggtggcggtggctcgggcggaggtgggtcgggtggcggcg
gatctcagatccagttggtgcaatctggacctgagctgaagaagcctggagagacagtcaggatctcctgcaaggcttctgggtat
gccttcacaactactggaatgcagtgggtgcaagagatgccaggaaagggtttgaagtggattggctggataaacaccccactctg
gagtgccaaaatatgtagaagacttcaaggacggtttgccttctctttggaaacctctgccaacactgcatatttacagataagcaacc
tcaaagatgaggacacggctacgtatttctgtgtgagatccgggaatggtaactatgacctggcctactttgcttactggggccaag
ggacactggtcactgtctctgatca
40.2.220 scFv(抗人CD40 scFv #1)(氨基酸序列)(SEQ IDNO:36)
MDFQVQIFSFLLISASVIMSRGVDIVLTQSPATLSVTPGDRVSLSCRASQSISDYLHW
YQQKSHESPRLLIKYASHSISGIPSRFSGSGSGSDFTLSINSVEPEDVGIYYCQHGHSF
PWTFGGGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGGSQIQLVQSGPELKKPGETVRISCKASG
YAFTTTGMQWVQEMPGKGLKWIGWINTPLWSAKICRRLQGRFAFSLETSANTAY
LQISNLKDEDTATYFCVRSGNGNYDLAYFAYWGQGTLVTVS
2e12 VL(具有L6VK前导肽)(核苷酸序列)(SEQ ID NO:37)
atggattttcaagtgcagattttcagcttcctgctaatcagtgcttcagtcataatgtccagaggagtcgacattgtgctcacccaatctc
cagcttctttggctgtgtctctaggtcagagagccaccatctcctgcagagccagtgaaagtgttgaatattatgtcacaagtttaatgc
agtggtaccaacagaaaccaggacagccacccaaactcctcatctctgctgcatccaacgtagaatctggggtccctgccaggttt
agtggcagtgggtctgggacagacttcagcctcaacatccatcctgtggaggaggatgatattgcaatgtatttctgtcagcaaagta
ggaaggttccttggacgttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaacgg
2e12 VL(具有L6 VK前导肽)(氨基酸序列)(SEQ ID NO:38)
MDFQVQIFSFLLISASVIMSRGVDIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVEYYVTS
LMQWYQQKPGQPPKLLISAASNVESGVPARFSGSGSGTDFSLNIHPVEEDDIAMYF
CQQSRKVPWTFGGGTKLEIKR
2e12 VH(无前导肽)(核苷酸序列)(SEQ ID NO:39)
caggtgcagctgaaggagtcaggacctggcctggtggcgccctcacagagcctgtccatcacatgcaccgtctcagggttctcatt
aaccggctatggtgtaaactgggttcgccagcctccaggaaagggtctggagtggctgggaatgatatggggtgatggaagcac
agactataattcagctctcaaatccagactgagcatcaccaaggacaactccaagagccaagttttcttaaaaatgaacagtctgcaa
actgatgacacagccagatactactgtgccagagatggttatagtaactttcattactatgttatggactactggggtcaaggaacctc
agtcaccgtctcctca(gatctg)
2e12 VH(氨基酸序列)(SEQ ID NO:40)
QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTGYGVNWVRQPPGKGLEWLGMIWGDG
STDYNSALKSRLSITKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTARYYCARDGYSNFHYYVMD
YWGQGTSVTVSS
2e12scFv(+限制位点)(核苷酸序列)(SEQ ID NO:41)
aagcttatggattttcaagtgtgcagattttcagcttcctgctaatcagtgcttcagtcataatgtccagaggagtcgacattgtgctcaccc
aatctccagcttctttggctgtgtctctaggtcagagagccaccatctcctgcagagccagtgaaagtgttgaatattatgtcacaagtt
taatgcagtggtaccaacagaaaccaggacagccacccaaactcctcatctctgctgcatccaacgtagaatctggggtccctgcc
aggtttagtggcagtgggtctgggacagacttcagcctcaacatccatcctgtggaggaggatgatattgcaatgtatttctgtcagc
aaagtaggaaggttccttggacgttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaacggggtggcggtggctcgggcggaggtggg
tcgggtggcggcggatctcaggtgcagctgaaggagtcaggacctggcctggtggcgccctcacagagcctgtccatcacatgc
accgtctcagggttctcattaaccggctatggtgtaaactgggttcgccagcctccaggaaagggtctggagtggctgggaatgat
atggggtgatggaagcacagactataattcagctctcaaatccagactgagcatcaccaaggacaactccaagagccaagttttctt
aaaaatgaacagtctgcaaactgatgacacagccagatactactgtgccagagatggttatagtaactttcattactatgttatggact
actggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctct(gatcag)
2e12scFv(氨基酸序列)(SEQ ID NO:42)
MDFQVQIFSFLLISASVIMSRGVDIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVEYYVTS
LMQWYQQKPGQPPKLLISAASNVESGVPARFSGSGSGTDFSLNIHPVEEDDIAMYF
CQQSRKVPWTFGGGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSQVQLKESGPGLVAPSQSLS
ITCTVSGFSLTGYGVNWVRQPPGKGLEWLGMIWGDGSTDYNSALKSRLSITKDNS
KSQVFLKMNSLQTDDTARYYCARDGYSNF  YVMDYWGQGTSVTVSS
10A8是抗-CD152(CTLA-4)
10A8 VL(具有L6VK前导肽)(核苷酸序列)(SEQ ID NO:43)
atggattttcaagtgcagattttcagcttcctgctaatcagtgcttcagtcataatgtccagaggagtcgacatccagatgacacagtct
ccatcctcactgtctgcatctctgggaggcaaagtcaccatcacttgcaaggcaagccaagacattaagaagtatataggttggtac
caacacaagcctggaaaaggtcccaggctgctcatatattacacatctacattacagccaggcatcccatcaaggttcagtggaagt
gggtctgggagagattattccctcagcatcagaaacctggagcctgaagatattgcaacttattattgtcaacagtatgataatcttcc
attgacgttcggctcggggacaaagttggaaataaaacgg
10A8 VL(氨基酸序列)(SEQ ID NO:44)
MDFQVQIFSFLLISASVIMSRGVDIQMTQSPSSLSASLGGKVTITCKASQDIKKYIG
WYQHKPGKGPRLLIYYTSTLQPGIPSRFSGSGSGRDYSLSIRNLEPEDIATYYCQQY
DNLPLTFGSGTKLEIKR
10A8 VH(无前导肽)(核苷酸序列)(SEQ ID NO:45)
gatgtacagcttcaggagtcaggacctggcctcgtgaaaccttctcagtctctgtctctcacctgctctgtcactggctactccatcac
cagtggtttctactggaactggatccgacagtttccgggaaacaaactggaatggatgggccacataagccacgacggtaggaat
aactacaacccatctctcataaatcgaatctccatcactcgtgacacatctaagaaccagtttttcctgaagttgagttctgtgactactg
aggacacagctacatatttctgtgcaagacactacggtagtagcggagctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtc
tcctctgatca
10A8 VH(氨基酸序列)(SEQ ID NO:46)
DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVTGYSITSGFYWNWIRQFPGNKLEWMGHISHD
GRNNYNPSLINRISITRDTSKNQFFLKLSSVTTEDTATYFCARHYGSSGAMDYWGQ
GTSVTVSS
10A8 SCFV(核苷酸序列)(SEQ ID NO:47)
aagcttatggattttcaagtgcagattttcagcttcctgctaatcagtgcttcagtcataatgtccagaggagtcgacatccagatgaca
cagtctccatcctcactgtctgcatctctgggaggcaaagtcaccatcacttgcaaggcaagccaagacattaagaagtatataggtt
ggtaccaacacaagcctggaaaaggtcccaggctgctcatatattacacatctacattacagccaggcatcccatcaaggttcagtg
gaagtgggtctgggagagattattccctcagcatcagaaacctggagcctgaagatattgcaacttattattgtcaacagtatgataat
cttccattgacgttcggctcggggacaaagttggaaataaaacggggtggcggtggctcgggcggtggtgggtcgggtggcggc
ggatctgatgtacagcttcaggagtcaggacctggcctcgtgaaaccttctcagtctctgtctctcacctgctctgtcactggctactc
catcaccagtggtttctactggaactggatccgacagtttccgggaaacaaactggaatggatgggccacataagccacgacggta
ggaataactacaacccatctctcataaatcgaatctccatcactcgtgacacatctaagaaccagtttttcctgaagttgagttctgtga
ctactgaggacacagctacatatttctgtgcaagacactacggtagtagcggagctatggactactggggtcaaggaacctcagtc
accgtctcctctgatca
10A8 SCFV(氨基酸序列)(SEQ ID NO:48)
MDFQVQIFSFLLISASVIMSRGVDIQMTQSPSSLSASLGGKVTITCKASQDIKKYIG
WYQHKPGKGPRLLIYYTSTLQPGIPSRFSGSGSGRDYSLSIRNLEPEDIATYYCQQY
DNLPLTFGSGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSDVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCSV
TGYSITSGFYWNWIRQFPGNKLEWMGHISHDGRNNYNPSLINRISITRDTSKNQFFL
KLSSVTTEDTATYFCARHYGSSGAMDYWGQGTSVTVSSD
40.2.220-hmtIgG1-hCD80(核苷酸序列)(SEQ ID NO:49)
aagcttatggattttcaagtgcagattttcagcttcctgctaatcagtgcttcagtcataatgtccagaggagtcgacattgttctgactc
agtctccagccaccctgtctgtgactccaggagatagagtctctctttcctgcagggccagccagagtattagcgactacttacactg
gtatcaacaaataatcacatgagtctccaaggcttctcatcaaatatgcttcccattccatctctgggatcccctccaggttcagtggca
gtggatcagggtcagatttcactctcagtatcaacagtgtggaacctgaagatgttggaatttattactgtcaacatggtcacagctttc
cgtggacgttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaacggggtggcggtggctcgggcggaggtgggtcgggtggcggcg
gatctcagatccagttggtgcaatctggacctgagctgaagaagcctggagagacagtcaggatctcctgcaaggcttctgggtat
gccttcacaactactggaatgcagtgggtgcaagagatgccaggaaagggtttgaagtggattggctggataaacaccccactctg
gagtgccaaaatatgtagaagacttcaaggacggtttgccttctctttggaaacctctgccaacactgcatatttacagataagcaacc
tcaaagatgaggacacggctacgtatttctgtgtgagatccgggaatggtaactatgacctggcctactttgcttactggggccaag
ggacactggtcactgtctctgatctggagcccaaatcttctgacaaaactcacacatccccaccgtccccagcacctgaactcctgg
ggggatcgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtg
gacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcg
ggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaa
gtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacagg
tgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcga
catcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctcct
tcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctg
cacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaagcggatccttcgaacctgctcccatcctgggccattacctta
atctcagtaaatggaatttttgtgatatgctgcctgacctactgctttgccccaagatgcagagagagaaggaggaatgagagattga
gaagggaaagtgtacgccctgtataaatcgat
40.2.220-hmtIgG1-hCD80(氨基酸序列)(SEQ ID NO:50)
MDFQVQIFSFLLISASVIMSRGVDIVLTQSPATLSVTPGDRVSLSCRASQSISDYLHW
YQQKSHESPRLLIKYASHSISGIPSRFSGSGSGSDFTLSINSVEPEDVGIYYCQHGHSF
PWTFGGGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSQIQLVQSGPELKKPGETVRISCKASG
YAFTTTGMQWVQEMPGKGLKWIGWINTPLWSAKICRLQGRFAFSLETSANTAY
LQISNLKDEDTATYFCVRSGNGNYDLAYFAYWGQGTLVTVSDLEPKSSDKTHTSP
PSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVE
VHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK
AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKT
TPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKA
DPSNLLPSWAITLISVNGIFVICCLTYCFAPRCRERRRNERLRRESVRPV
2e12scFv-hmtIgG1-CD80融合蛋白(核苷酸序列)(SEQ ID NO:51)
aagcttatggattttcaagtgcagattttcagcttcctgctaatcagtgcttcagtcataatgtccagaggagtcgacattgtgctcaccc
aatctccagcttctttggctgtgtctctaggtcagagagccaccatctcctgcagagccagtgaaagtgttgaatattatgtcacaagtt
taatgcagtggtaccaacagaaaccaggacagccacccaaactcctcatctctgctgcatccaacgtagaatctggggtccctgcc
aggtttagtggcagtgggtctgggacagacttcagcctcaacatccatcctgtggaggaggatgatattgcaatgtatttctgtcagc
aaagtaggaaggttccttggacgttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaacggggtggcggtggctcgggcggaggtggg
tcgggtggcggcggatctcaggtgcagctgaaggagtcaggacctggcctggtggcgccctcacagagcctgtccatcacatgc
accgtctcagggttctcattaaccggctatggtgtaaactgggttcgccagcctccaggaaagggtctggagtggctgggaatgat
atggggtgatggaagcacagactataattcagctctcaaatccagactgagcatcaccaaggacaactccaagagccaagttttctt
aaaaatgaacagtctgcaaactgatgacacagccagatactactgtgccagagatggttatagtaactttcattactatgttatggact
actggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctcagatctggagcccaaatcttctgacaaaactcacacatccccaccgtcccca
gcacctgaactcctggggggatcgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggt
cacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgc
caagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctga
atggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcag
ccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaa
ggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgct
ggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctcc
gtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaagcggatccttcgaacctgctccc
atcctgggccattaccttaatctcagtaaatggaatttttgtgatatgctgcctgacctactgctttgccccaagatgcagagagagaa
ggaggaatgagagattgagaagggaaagtgtacgccctgtataaatcgat
2e12scFv-hmtIgG1-CD80融合蛋白(氨基酸序列)(SEQ ID NO:52)
MDFQVQIFSFLLISASVIMSRGVDIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVEYYVTS
LMQWYQQKPGQPPKLLISAASNVESGVPARFSGSGSGTDFSLNIHPVEEDDIAMYF
CQQSRKVPWTFGGGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSQVQLKESGPGLVAPSQSLS
ITCTVSGFSLTGYGVNWVRQPPGKGLEWLGMIWGDGSTDYNSALKSRLSITKDNS
KSQVFLKMNSLQTDDTARYYCARDGYSNFHYYVMDYWGQGTSVTVSSDLEPKS
SDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCVVVDVSHEDPEVKFN
WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALP
APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ
PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL
SLSPGKADPSNLLPSWAITLISVNGIFVICCLTYCFAPRCRERRRNERLRRESVRPV
10A8 scFv-hmtIgG1-CD80(核苷酸序列)(SEQ ID NO:53)
aagcttatggattttcaagtgcagattttcagcttcctgctaatcagtgcttcagtcataatgtccagaggagtcgacatccagatgaca
cagtctccatcctcactgtctgcatctctgggaggcaaagtcaccatcacttgcaaggcaagccaagacattaagaagtatataggtt
ggtaccaacacaagcctggaaaaggtcccaggctgctcatatattacacatctacattacagccaggcatcccatcaaggttcagtg
gaagtgggtctgggagagattattccctcagcatcagaaacctggagcctgaagatattgcaacttattattgtcaacagtatgataat
cttccattgacgttcggctcggggacaaagttggaaataaaacggggtggcggtggctcgggcggtggtgggtcgggtggcggc
ggatctgatgtacagcttcaggagtcaggacctggcctcgtgaaaccttctcagtctctgtctctcacctgctctgtcactggctactc
catcaccagtggtttctactggaactggatccgacagtttccgggaaacaaactggaatggatgggccacataagccacgacggta
ggaataactacaacccatctctcataaatcgaatctccatcactcgtgacacatctaagaaccagtttttcctgaagttgagttctgtga
ctactgaggacacagctacatatttctgtgcaagacactacggtagtagcggagctatggactactggggtcaaggaacctcagtc
accgtctcctctgatctggagcccaaatcttctgacaaaactcacacatccccaccgtccccagcacctgaactcctggggggatc
gtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtga
gccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggagga
gcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaa
ggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtaca
ccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgc
cgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcct
ctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaac
cactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaagcggatccttcgaacctgctcccatcctgggccattaccttaatctca
gtaaatggaatttttgtgatatgctgcctgacctactgctttgccccaagatgcagagagagaaggaggaatgagagattgagaagg
gaaagtgtacgccctgtataaatcgat
10A8 scFv-hmtIgG1-CD80(氨基酸序列)(SEQ ID NO:54)
MDFQVQIFSFLLISASVIMSRGVDIQMTQSPSSLSASLGGKVTITCKASQDIKKYIG
WYQHKPGKGPRLLIYYTSTLQPGIPSRFSGSGSGRDYSLSIRNLEPEDIATYYCQQY
DNLPLTFGSGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSDVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCSV
TGYSITSGFYWNWIRQFPGNKLEWMGHISHDGRNNYNPSLINRISITRDTSKNQFFL
KLSSVTTEDTATYFCARHYGSSGAMDYWGQGTSVTVSSDLEPKSSDKTHTSPPSP
APELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH
NAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK
GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP
VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKADPS
NLLPSWAITLISVNGIFVICCLTYCFAPRCRERRRNERLRRESVRPV
500A2-hmtIgG1-CD80(核苷酸序列)(SEQ ID NO:55)
atgttgtatacatctcagctccttgggcttttactcttctggatttcagcctccagaagtgacatagtgctgactcagactccagccactc
tgtctctaattcctggagaaagagtcacaatgacctgtaagaccagtcagaatattggcacaatcttacactggtatcaccaaaaacc
aaaggaggctccaagggctctcatcaagtatgcttcgcagtccattcctgggatcccctccagattcagtggcagtggttcggaaac
agatttcactctcagcatcaataacctggagcctgatgatatcggaatttattactgtcaacaaagtagaagctggcctgtcacgttcg
gtcctggcaccaagctggagataaaacggggtggcggtggctcgggcggaggtgggtcgggtggcggcggatctcaggtcaa
gctgcagcagtccggttctgaactagggaaacctggggcctcagtgaaactgtcctgcaagacttcaggctacatattcacagatc
actatatttcttgggtgaaacagaagcctggagaaagcctgcagtggataggaaatgtttatggtggaaatggtggtacaagctaca
atcaaaaattccagggcaaggccacactgactgtagataaaatctctagcacagcctacatggaactcagcagcctgacatctgag
gattctgccatctattactgtgcaagaaggccggtagcgacgggccatgctatggactactggggtcaggggatccaagttaccgt
ctcctctgatctggagcccaaatcttctgacaaaactcacacatccccaccgtccccagcacctgaactcctggggggatcgtcagt
cttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacg
aagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtac
aacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctcca
acaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgccc
ccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagt
gggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagca
agctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacac
gcagaagagcctctccctgtctccgggtaaagcggatccttcgaacctgctcccatcctgggccattaccttaatctcagtaaatgga
atttttgtgatatgctgcctgacctactgctttgccccaagatgcagagagagaaggaggaatgagagattgagaagggaaagtgta
cgccctgtataaatcgat
500A2-hmtIgG1-CD80(氨基酸序列)(SEQ ID NO:56)
MLYTSQLLGLLLFWISASRSDIVLTQTPATLSLIPGERVTMTCKTSQNIGTILHWYH
QKPKEAPRALIKYASQSIPGIPSRFSGSGSETDFTLSINNLEPDDIGIYYCQQSRSWPV
TFGPGTKLEIKRGGGGS GGGGSGGGGSQVKLQQSGSELGKPGASVKLSCKTSGYIF
TDHYISWVKQKPGESLQWIGNVYGGNGGTSYNQKFQGKATLTVDKISSTAYMEL
SSLTSEDSAIYYCARRPVATGHAMDYWGQGIQVTVSSDLEPKSSDKTHTSPPSPAP
ELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNA
KTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQ
PREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL
DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKADPSNL
LPSWAITLISVNGIFVICCLTYCFAPRCRERRRNERLRRESVRPV
2H7 scFv MTH(SSS)WTCH2CH3(核苷酸序列)(SEQ ID NO:57)
aagcttgccgccatggattttcaagtgcagattttcagcttcctgctaatcagtgcttcagtcataattttgccagaggacaaattgttctct
cccagtctccagcaatcctgtctgcatctccaggggagaaggtcacaatgacttgcagggccagctcaagtgtaagttacatgcact
ggtaccagcagaagccaggatcctcccccaaaccctggatttatgccccatccaacctggcttctggagtccctgctcgcttcagtg
gcagtgggtctgggacctcttactctctcacaatcagcagagtggaggctgaagatgctgccacttattactgccagcagtggagttt
taacccacccacgttcggtgctgggaccaagctggagctgaaagatggcggtggctcgggcggtggtggatctggaggaggtg
ggagctctcaggcttatctacagcagtctggggctgagctggtgaggcctggggcctcagtgaagatgtcctgcaaggcttctggc
tacacatttaccagttacaatatgcactgggtaaagcagacacctagacagggcctggaatggattggagctatttatccaggaaat
ggtgatacttcctacaatcagaagttcaagggcaaggccacactgactgtagacaaatcctccagcacagcctacatgcagctcag
cagcctgacatctgaagactctgcggtctatttctgtgcaagagtggtgtactatagtaactcttactggtacttcgatgtctggggcac
agggaccacggtcaccgtctcttctgatcaggagcccaaatcttctgacaaaactcacacatccccaccgtccccagcacctgaac
tcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtg
gtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaag
ccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaagga
gtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaacaatctccaaagccaaagggcagccccgagaac
cacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcc
cagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgac
ggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatga
ggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatgatctaga
2H7 scFv MTH(SSS)WTCH2CH3(氨基酸序列)(SEQ ID NO:58)
MDFQVQIFSFLLISASVIIARGQIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYMHWY
QQKPGSSPKPWIYAPSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWS
FNPPTFGAGTKLELKDGGGSGGGGSGGGGSSQAYLQQSGAELVRPGASVKMSCK
ASGYTFTSYNMHWVKQTPRQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTVDKSSS
TAYMQLSSLTSEDSAVYFCARVVYYSNSYWYFDVWGTGTTVTVSSDQEPKSSDK
THTSPPSPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYV
DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIE
KTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEN
NYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLS
PGK
2H7 scFv IgAH IGG WTCH2CH3(具有IgA铰链和WT CH2和CH3的2H7 scFv)(核苷酸序列)(SEQ ID NO:59)
aagcttgccgccatggattttcaagtgcagattttcagcttcctgctaatcagtgcttcagtcataattgccagaggacaaattgttctct
cccagtctccagcaatcctgtctgcatctccaggggagaaggtcacaatgacttgcagggccagctcaagtgtaagttacatgcact
ggtaccagcagaagccaggatcctcccccaaaccctggatttatgccccatccaacctggcttctggagtccctgctcgcttcagtg
gcagtgggtctgggacctcttactctctcacaatcagcagagtggaggctgaagatgctgccacttattactgccagcagtggagttt
taacccacccacgttcggtgctgggaccaagctggagctgaaagatggcggtggctcgggcggtggtggatctggaggaggtg
ggagctctcaggcttatctacagcagtctggggctgagctggtgaggcctggggcctcagtgaagatgtcctgcaaggcttctggc
tacacatttaccagttacaatatgcactgggtaaagcagacacctagacagggcctggaatggattggagctatttatccaggaaat
ggtgatacttcctacaatcagaagttcaagggcaaggccacactgactgtagacaaatcctccagcacagcctacatgcagctcag
cagcctgacatctgaagactctgcggtctatttctgtgcaagagtggtgtactatagtaactcttactggtacttcgatgtctggggcac
agggaccacggtcaccgtctctgatcagccagttccctcaactccacctaccccatctccctcaactccacctaccccatctccctca
tgcgcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctga
ggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataa
tgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggc
tgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaacaatctccaaagccaaagggc
agccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtca
aaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtg
ctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctc
cgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatgatctaga
2H7 scFv IgAH IGG WTCH2CH3(氨基酸序列)(SEQ ID NO:60)
MDFQVQIFSFLLISASVIIARGQIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYMHWY
QQKPGSSPKPWIYAPSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWS
FNPPTFGAGTKLELKDGGGSGGGGSGGGGSSQAYLQQSGAELVRPGASVKMSCK
ASGYTFTSYNMHWVKQTPRQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTVDKSSS
TAYMQLSSLTSEDSAVYFCARVVYYSNSYWYFDVWGTGTTVTVSDQPVPSTPPTP
SPSTPPTPSPSCAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFN
WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALP
APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ
PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL
SLSPGK
2H7 scFv IgAH IgACH2CH3(2H7 scFv IgA铰链和IgA CH2和CH3)(核苷酸序列)(SEQ ID NO:61)
aagcttgccgccatggattttcaagtgcagattttcagcttcctgctaatcagtgcttcagtcataattgccagaggacaaattgttctct
cccagtctccagcaatcctgtctgcatctccaggggagaaggtcacaatgacttgcagggccagctcaagtgtaagttacatgcact
ggtaccagcagaagccaggatcctcccccaaaccctggatttatgccccatccaacctggcttctggagtccctgctcgcttcagtg
gcagtgggtctgggacctcttactctctcacaatcagcagagtggaggctgaagatgctgccacttattactgccagcagtggagttt
taacccacccacgttcggtgctgggaccaagctggagctgaaagatggcggtggctcgggcggtggtggatctggaggaggtg
ggagctctcaggcttatctacagcagtctggggctgagctggtgaggcctggggcctcagtgaagatgtcctgcaaggcttctggc
tacacatttaccagttacaatatgcactgggtaaagcagacacctagacagggcctggaatggattggagctatttatccaggaaat
ggtgatacttcctacaatcagaagttcaagggcaaggccacactgactgtagacaaatcctccagcacagcctacatgcagctcag
cagcctgacatctgaagactctgcggtctatttctgtgcaagagtggtgtactatagtaactcttactggtacttcgatgtctggggcac
agggaccacggtcaccgtctcttctgatcagccagttccctcaactccacctaccccatctccctcaactccacctaccccatctccc
tcatgctgccacccccgactgtcactgcaccgaccggccctcgaggacctgctcttaggttcagaagcgatcctcacgtgcacact
gaccggcctgagagatgcctcaggtgtcaccttcacctggacgccctcaagtgggaagagcgctgttcaaggaccacctgaccgt
gacctctgtggctgctacagcgtgtccagtgtcctgccgggctgtgccgagccatggaaccatgggaagaccttcacttgcactgc
tgcctaccccgagtccaagaccccgctaaccgccaccctctcaaaatccggaaacacattccggcccgaggtccacctgctgccg
ccgccgtcggaggagctggccctgaacgagctggtgacgctgacgtgcctggcacgtggcttcagccccaaggatgtgctggtt
cgctggctgcaggggtcacaggagctgccccgcgagaagtacctgacttgggcatcccggcaggagcccagccagggcacca
ccaccttcgctgtgaccagcatactgcgcgtggcagccgaggactggaagaagggggacaccttctcctgcatggtgggccacg
aggccctgccgctggccttcacacagaagaccatcgaccgcttggcgggtaaacccacccatgtcaatgtgtctgttgtcatggcg
gaggtggacggcacctgctactgataatctaga
2H7 scFv IgAH IgACH2CH3(2H7 scFv IgA铰链和IgA CH2和CH3)(氨基酸序列)(SEQ ID NO:62)
MDFQVQIFSFLLISASVIIARGQIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYMHWY
QQKPGSSPKPWIYAPSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWS
FNPPTFGAGTKLELKDGGGSGGGGSGGGGSSQAYLQQSGAELVRPGASVKMSCK
ASGYTFTSYNMHWVKQTPRQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTVDKSSS
TAYMQLSSLTSEDSAVYFCARVVYYSNSYWYFDVWGTGTTVTVSSDQPVPSTPPT
PSPSTPPTPSPSCCHPRLSLHRPALEDLLLGSEAILTCTLTGLRDASGVTFTWTPSSG
KSAVQGPPDRDLCGCYSVSSVLPGCAEPWNHGKTFTCTAAYPESKTPLTATLSKS
GNTFRPEVHLLPPPSEELALNELVTLTCLARGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYLT
WASRQEPSQGTTTFAVTSILRVAAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRLA
GKPTHVNVSVVMAEVDGTCY
IgA铰链-CH2-CH3(人IgA尾,全长)(核苷酸序列)(SEQ IDNO:63)
tgatcagccagttccctcaactccacctaccccatctccctcaactccacctaccccatctccctcatgctgccacccccgactgtca
ctgcaccgaccggccctcgaggacctgctcttaggttcagaagcgatcctcacgtgcacactgaccggcctgagagatgcctcag
gtgtcaccttcacctggacgccctcaagtgggaagagcgctgttcaaggaccacctgaccgtgacctctgtggctgctacagcgtg
tccagtgtcctgccgggctgtgccgagccatggaaccatgggaagaccttcacttgcactgctgcctaccccgagtccaagaccc
cgctaaccgccaccctctcaaaatccggaaacacattccggcccgaggtccacctgctgccgccgccgtcggaggagctggccc
tgaacgagctggtgacgctgacgtgcctggcacgtggcttcagccccaaggatgtgctggttcgctggctgcaggggtcacagg
agctgccccgcgagaagtacctgacttgggcatcccggcaggagcccagccagggcaccaccaccttcgctgtgaccagcata
ctgcgcgtggcagccgaggactggaagaagggggacaccttctcctgcatggtgggccacgaggccctgccgctggccttcac
acagaagaccatcgaccgcttggcgggtaaacccacccatgtcaatgtgtctgttgtcatggcggaggtggacggcacctgctact
gataatctaga
IgA铰链-CH2-CH3(人IgA尾,全长)(氨基酸序列)(SEQ IDNO:64)
DQPVPSTPPTPSPSTPPTPSPSCCHPRLSLHRPALEDLLLGSEAILTCTLTGLRDASGV
TFTWTPSSGKSAVQGPPDRDLCGCYSVSSVLPGCAEPWNHGKTFTCTAAYPESKT
PLTATLSKSGNTFRPEVHLLPPPSEELALNELVTLTCLARGFSPKDVLVRWLQGSQ
ELPREKYLTWASRQEPSQGTTTFAVTSILRVAAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAF
TQKTIDRLAGKPTHVNVSVVMAEVDGTCY
人J链(核苷酸序列)(SEQ ID NO:65)
agatctcaagaagatgaaaggattgttcttgttgacaacaaatgtaagtgtgcccggattacttccaggatcatccgttcttccgaaga
tcctaatgaggacattgtggagagaaacatccgaattattgttcctctgaacaacagggagaatatctctgatcccacctcaccattga
gaaccagatttgtgtaccatttgtctgacctcagctgtaaaaaatgtgatcctacagaagtggagctggataatcagatagttactgct
acccagagcaatatctgtgatgaagacagtgctacagagacctgctacacttatgacagaaacaagtgctacacagctgtggtccc
actcgtatatggtggtgagaccaaaatggtggaaacagccttaaccccagatgcctgctatcctgactaatctaga
人J链(氨基酸序列)(SEQ ID NO:66)
RSQEDERIVLVDNKCKCARITSRIIRSSEDPNEDIVERNIRIIVPLNNRENISDPTSPLR
TRFVYHLSDLSCKKCDPTEVELDNQIVTATQSNICDEDSATETCYTYDRNKCYTAV
VPLVYGGETKMVETALTPDACYP
从IgA CH3缺失的4个羧基末端氨基酸(氨基酸序列)(SEQ IDNO:67)
GTCY
IgAH IgAT4(人IgA尾,截短的(3T1)-(从羧基末端缺失最后4个氨基酸)(核苷酸序列)(SEQ ID NO:68)
tgatcagccagttccctcaactccacctaccccatctccctcaactccacctaccccatctccctcatgctgccacccccgactgtca
ctgcaccgaccggccctcgaggacctgctcttaggttcagaagcgatcctcacgtgcacactgaccggcctgagagatgcctcag
gtgtcaccttcacctggacgccctcaagtgggaagagcgctgttcaaggaccacctgaccgtgacctctgtggctgctacagcgtg
tccagtgtcctgccgggctgtgccgagccatggaaccatgggaagaccttcacttgcactgctgcctaccccgagtccaagaccc
cgctaaccgccaccctctcaaaatccggaaacacattccggcccgaggtccacctgctgccgccgccgtcggaggagctggccc
tgaacgagctggtgacgctgacgtgcctggcacgtggcttcagccccaaggatgtgctggttcgctggctgcaggggtcacagg
agctgccccgcgagaagtacctgacttgggcatcccggcaggagcccagccagggcaccaccaccttcgctgtgaccagcata
ctgcgcgtggcagccgaggactggaagaagggggacaccttctcctgcatggtgggccacgaggccctgccgctggccttcac
acagaagaccatcgaccgcttggcgggtaaacccacccatgtcaatgtgtctgttgtcatggcggaggtggactgataatctaga
IgAH IgAT4(氨基酸序列)(SEQ ID NO:69)
DQPVPSTPPTPSPSTPPTPSPSCCHPRLSLHRPALEDLLLGSEAILTCTLTGLRDASGV
TFTWTPSSGKSAVQGPPDRDLCGCYSVSSVLPGCAEPWNHGKTFTCTAAYPESKT
PLTATLSKSGNTFRPEVHLLPPPSEELALNELVTLTCLARGFSPKDVLVRWLQGSQ
ELPREKYLTWASRQEPSQGTTTFAVTSILRVAAEDWK GDTFSCMVGHEALPLAF
TQKTIDRLAGKPTHVNVSVVMAEVD
2H7 scFv IgAH IgAT4(2H7 scFv IgA 3T1构建体;在3’末端截短CH3结构域)(核苷酸序列)(SEQ ID NO:70)
aagcttgccgccatggattttcaagtgcagattttcagcttcctgctaatcagtgcttcagtcataattgccagaggacaaattgttctct
cccagtctccagcaatcctgtctgcatctccaggggagaaggtcacaatgacttgcagggccagctcaagtgtaagttacatgcact
ggtaccagcagaagccaggatcctcccccaaaccctggatttatgccccatccaacctggcttctggagtccctgctcgcttcagtg
gcagtgggtctgggacctcttactctctcacaatcagcagagtggaggctgaagatgctgccacttattactgccagcagtggagttt
taacccacccacgttcggtgctgggaccaagctggagctgaaagatggcggtggctcgggcggtggtggatctggaggaggtg
ggagctctcaggcttatctacagcagtctggggctgagctggtgaggcctggggcctcagtgaagatgtcctgcaaggcttctggc
tacacatttaccagttacaatatgcactgggtaaagcagacacctagacagggcctggaatggattggagctatttatccaggaaat
ggtgatacttcctacaatcagaagttcaagggcaaggccacactgactgtagacaaatcctccagcacagcctacatgcagctcag
cagcctgacatctgaagactctgcggtctatttctgtgcaagagtggtgtactatagtaactcttactggtacttcgatgtctggggcac
agggaccacggtcaccgtctcttctgatcagccagttccctcaactccacctaccccatctccctcaactccacctaccccatctccc
tcatgctgccacccccgactgtcactgcaccgaccggccctcgaggacctgctcttaggttcagaagcgatcctcacgtgcacact
gaccggcctgagagatgcctcaggtgtcaccttcacctggacgccctcaagtgggaagagcgctgttcaaggaccacctgaccgt
gacctctgtggctgctacagcgtgtccagtgtcctgccgggctgtgccgagccatggaaccatgggaagaccttcacttgcactgc
tgcctaccccgagtccaagaccccgctaaccgccaccctctcaaaatccggaaacacattccggcccgaggtccacctgctgccg
ccgccgtcggaggagctggccctgaacgagctggtgacgctgacgtgcctggcacgtggcttcagccccaaggatgtgctggtt
cgctggctgcaggggtcacaggagctgccccgcgagaagtacctgacttgggcatcccggcaggagcccagccagggcacca
ccaccttcgctgtgaccagcatactgcgcgtggcagccgaggactggaagaagggggacaccttctcctgcatggtgggccacg
aggccctgccgctggccttcacacagaagaccatcgaccgcttggcgggtaaacccacccatgtcaatgtgtctgttgtcatggcg
gaggtggactgataatctaga
2H7 scFv IgAH-T4(氨基酸序列)(SEQ ID NO:71)
MDFQVQIFSFLLISASVIIARGQIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYMHWY
QQKPGSSPKPWIYAPSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWS
FNPPTFGAGTKLELKDGGGSGGGGSGGGGSSQAYLQQSGAELVRPGASVKMSCK
ASGYTFTSYNMHWVKQTPRQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTVDKSSS
TAYMQLSSLTSEDSAVYFCARVVYYSNSYWYFDVWGTGTTVTVSSDQPVPSTPPT
PSPSTPPTPSPSCCHPRLSLHRPALEDLLLGSEAILTCTLTGLRDASGVTFTWTPSSG
KSAVQGPPDRDLCGCYSVSSVLPGCAEPWNHGKTFTCTAAYPESKTPLTATLSKS
GNTFRPEVHLLPPPSEELALNELVTLTCLARGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYLT
WASRQEPSQGTTTFAVTSILRVAAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRLA
GKPTHVNVSVVMAEVD
从IgAH-T4缺失的14个氨基酸(从而从野生型IgA CH3缺失了共18个氨基酸)(氨基酸序列)(SEQ ID NO:72)
PTHVNVSVVMAEVD
IgAH IgA-T18(截短的人IgA尾,3T2)(核苷酸序列)(SEQ IDNO:73)
tgatcagccagttccctcaactccacctaccccatctccctcaactccacctaccccatctccctcatgctgccacccccgactgtca
ctgcaccgaccggccctcgaggacctgctcttaggttcagaagcgatcctcacgtgcacactgaccggcctgagagatgcctcag
gtgtcaccttcacctggacgccctcaagtgggaagagcgctgttcaaggaccacctgaccgtgacctctgtggctgctacagcgtg
tccagtgtcctgccgggctgtgccgagccatggaaccatgggaagaccttcacttgcactgctgcctaccccgagtccaagaccc
cgctaaccgccaccctctcaaaatccggaaacacattccggcccgaggtccacctgctgccgccgccgtcggaggagctggccc
tgaacgagctggtgacgctgacgtgcctggcacgtggcttcagccccaaggatgtgctggttcgctggctgcaggggtcacagg
agctgccccgcgagaagtacctgacttgggcatcccggcaggagcccagccagggcaccaccaccttcgctgtgaccagcata
ctgcgcgtggcagccgaggactggaagaagggggacaccttctcctgcatggtgggccacgaggccctgccgctggccttcac
acagaagaccatcgaccgcttggcgggtaaa
IgAH IgA-T18(氨基酸序列)(SEQ ID NO:74)
DQPVPSTPPTPSPSTPPTPSPSCCHPRLSLHRPALEDLLLGSEAILTCTLTGLRDASGV
TFTWTPSSGKSAVQGPPDRDLCGCYSVSSVLPGCAEPWNHGKTFTCTAAYPESKT
PLTATLSKSGNTFRPEVHLLPPPSEELALNELVTLTCLARGFSPKDVLVRWLQGSQ
ELPREKYLTWASRQEPSQGTTTFAVTSILRVAAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAF
TQKTIDRLAGK
2H7 scFv IgAH IgAT18(截短的人IgA尾,3T2)(核苷酸序列)(SEQ ID NO:75)
aagcttgccgccatggattttcaagtgcagattttcagcttcctgctaatcagtgcttcagtcataattgccagaggacaaattgttctct
cccagtctccagcaatcctgtctgcatctccaggggagaaggtcacaatgacttgcagggccagctcaagtgaagttacatgcact
ggtaccagcagaagccaggatcctcccccaaaccctggatttatgccccatccaacctggcttctggagtccctgctcgcttcagtg
gcagtgggtctgggacctcttactctctcacaatcagcagagtggaggctgaagatgctgccacttattactgccagcagtggagttt
taacccacccacgttcggtgctgggaccaagctggagctgaaagatggcggtggctcgggcggtggtggatctggaggaggtg
ggagctctcaggcttatctacagcagtctggggctgagctggtgaggcctggggcctcagtgaagatgtcctgcaaggcttctggc
tacacatttaccagttacaatatgcactgggtaaagcagacacctagacagggcctggaatggattggagctatttatccaggaaat
ggtgatacttcctacaatcagaagttcaagggcaaggccacactgactgtagacaaatcctccagcacagcctacatgcagctcag
cagcctgacatctgaagactctgcggtctatttctgtgcaagagtggtgtactatagtaactcttactggtacttcgatgtctggggcac
agggaccacggtcaccgtctcttctgatcagccagttccctcaactccacctaccccatctccctcaactccacctaccccatctccc
tcatgctgccacccccgactgtcactgcaccgaccggccctcgaggacctgctcttaggttcagaagcgatcctcacgtgcacact
gaccggcctgagagatgcctcaggtgtcaccttcacctggacgccctcaagtgggaagagcgctgttcaaggaccacctgaccgt
gacctctgtggctgctacagcgtgtccagtgtcctgccgggctgtgccgagccatggaaccatgggaagaccttcacttgcactgc
tgcctaccccgagtccaagaccccgctaaccgccaccctctcaaaatccggaaacacattccggcccgaggtccacctgctgccg
ccgccgtcggaggagctggccctgaacgagctggtgacgctgacgtgcctggcacgtggcttcagccccaaggatgtgctggtt
cgctggctgcaggggtcacaggagctgccccgcgagaagtacctgacttgggcatcccggcaggagcccagccagggcacca
ccaccttcgctgtgaccagcatactgcgcgtggcagccgaggactggaagaagggggacaccttctcctgcatggtgggccacg
aggccctgccgctggccttcacacagaagaccatcgaccgcttggcgggtaaa
2H7 scFv IgAH IgAT18(氨基酸序列)(SEQ ID NO:76)
MDFQVQIFSFLLISASVIIARGQIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYMHWY
QQKPGSSPKPWIYAPSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWS
FNPPTFGAGTKLELKDGGGSGGGGSGGGGSSQAYLQQSGAELVRPGASVKMSCK
ASGYTFTSYNMHWVKQTPRQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTVDKSSS
TAYMQLSSLTSEDSAVYFCARVVYYSNSYWYFDVWGTGTTVTVSSDQPVPSTPPT
PSPSTPPTPSPSCCHPRLSLHRPALEDLLLGSEAILTCTLTGLRDASGVTFTWTPSSG
KSAVQGPPDRDLCGCYSVSSVLPGCAEPWNHGKTFTCTAAYPESKTPLTATLSKS
GNTFRPEVHLLPPPSEELALNELVTLTCLARGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYLT
WASRQEPSQGTTTFAVTSILRVAAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRLA
GK
CTLA-4 IgG WTH WTCH2CH3(人oncoMLP-CTLA4EC-hIgGWT)(核苷酸序列)(SEQ ID NO:77)
gcaacctacatgatggggaatgagttgaccttcctagatgattccatctgcacgggcacctccagtggaaatcaagtgaacctcact
atccaaggactgagggccatggacacgggactctacatctgcaaggtggagctcatgtacccaccgccatactacctgggcatag
gcaacggaacccagatttatgtaattgatccagaaccgtgcccagattctgatcaacccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcc
caccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccgg
acccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggag
gtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccag
gactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaacaatctccaaagcc
aaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctg
cctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgc
ctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtctt
ctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga
CTLA-4 IgG WTH WTCH2CH3(氨基酸序列)(SEQ ID NO:78)
MGVLLTQRTLLSLVLALLFPSMASMAMHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKA
TEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRA
MDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDQPKSCDKTHTCPPCPAP
ELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNA
KTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQ
PREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL
DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
人OncoM前导肽+CTLA4EC(BclI)(核苷酸序列)(SEQ ID NO:79)
atgggggtactgctcacacagaggacgctgctcagtctggtccttgcactcctgtttccaagcatggcgagcatggcaatgcacgt
ggcccagcctgctgtggtactggccagcagccgaggcatcgccagctttgtgtgtgagtatgcatctccaggcaaagccactgag
gtccgggtgacagtgcttcggcaggctgacagccaggtgactgaagtctgtgcggcaacctacatgatggggaatgagttgacct
tcctagatgattccatctgcacgggcacctccagtggaaatcaagtgaacctcactatccaaggactgagggccatggacacggg
actctacatctgcaaggtggagctcatgtacccaccgccatactacctgggcataggcaacggaacccagatttatgtaattgatcc
agaaccgtgcccagattctgatcaa
人OncoM前导肽+CTLA4 EC(氨基酸序列)(SEQ ID NO:80)
MGVLLTQRTLLSLVLALLFPSMASMAMHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKA
TEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRA
MDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQ YVIDPEPCPDSDQ
人OncoM前导肽(核苷酸序列)(SEQ ID NO:81)
atgggggtactgctcacacagaggacgctgctcagtctggtccttgcactcctgtttccaagcatggcgagcatg
人OncoM前导肽(氨基酸序列)(SEQ ID NO:82)
MGVLLTQRTLLSLVLALLFPSM
人CTLA4 EC(无LP)(核苷酸序列)(SEQ ID NO:83)
gcaatgcacgtggcccagcctgctgtggtactggccagcagccgaggcatcgccagctttgtgtgtgagtatgcatctccaggca
aagccactgaggtccgggtgacagtgcttcggcaggctgacagccaggtgactgaagtctgtgcggcaacctacatgacgggga
atgagttgaccttcctagatgattccatctgcacgggcacctccagtggaaatcaagtgaacctcactatccaaggactgagggcca
tggacacgggactctacatctgcaaggtggagctcatgtacccaccgccatactacctgggcataggcaacggaacccagatttat
gtaattgatccagaaccgtgcccagattct
人CTLA4 EC(无LP)(氨基酸序列)(SEQ ID NO:84)
AMHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYM
TGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNG
TQIYVIDPEPCPDS
人CTLA4 IgG MTH(SSS)MTCH2CH3(核苷酸序列)(SEQ ID NO:85)
atgggggtactgctcacacagaggacgctgctcagtctggtccttgcactcctgtttccaagcatggcgagcatggcaatgcacgt
ggcccagcctgctgtggtactggccagcagccgaggcatcgccagctttgtgtgtgagtatgcatctccaggcaaagccactgag
gtccgggtgacagtgcttcggcaggctgacagccaggtgactgaagtctgtgcggcaacctacatgatggggaatgagttgacct
tcctagatgattccatctgcacgggcacctccagtggaaatcaagtgaacctcactatccaaggactgagggccatggacacggg
actctacatctgcaaggtggagctcatgtacccaccgccatactacctgggcataggcaacggaacccagatttatgtaattgatcc
agaaccgtgcccagattctgatcaacccaaatcttctgacaaaactcacacatccccaccgtccccagcacctgaactcctggggg
gatcgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggac
gtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcggga
ggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtg
caaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaacaatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgt
acaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacat
cgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttctt
cctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcac
aaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga
人CTLA4 IgG MTH(SSS)MTCH2CH3(氨基酸序列)(SEQ ID NO:86)
MGVLLTQRTLLSLVLALLFPSMASMAMHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKA
TEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRA
MDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDQPKSSDKTHTSPPSPAP
ELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNA
KTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQ
PREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDLAVEWESNGQPENNYKTTPPVL
DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
CTLA-4 IgAH IgACH2CH3(人-oncoMLP-CTLA4EC-IgA)(核苷酸序列)(SEQ ID NO:87)
atgggggtactgctcacacagaggacgctgctcagtctggtccttgcactcctgtttccaagcatggcgagcatggcaatgcacgt
ggcccagcctgctgtggtactggccagcagccgaggcatcgccagctttgtgtgtgagtatgcatctccaggcaaagccactgag
gtccgggtgacagtgcttcggcaggctgacagccaggtgactgaagtctgtgcggcaacctacatgatggggaatgagttgacct
tcctagatgattccatctgcacgggcacctccagtggaaatcaagtgaacctcactatccaaggactgagggccatggacacggg
actctacatctgcaaggtggagctcatgtacccaccgccatactacctgggcataggcaacggaacccagatttatgtaattgatcc
agaaccgtgcccagattctgatcagccagttccctcaactccacctaccccatctccctcaactccacctaccccatctccctcatgct
gccacccccgactgtcactgcaccgaccggccctcgaggacctgctcttaggttcagaagcgatcctcacgtgcacactgaccgg
cctgagagatgcctcaggtgtcaccttcacctggacgccctcaagtgggaagagcgctgttcaaggaccacctgaccgtgacctct
gtggctgctacagcgtgtccagtgtcctgccgggctgtgccgagccatggaaccatgggaagaccttcacttgcactgctgcctac
cccgagtccaagaccccgctaaccgccaccctctcaaaatccggaaacacattccggcccgaggtccacctgctgccgccgccg
tcggaggagctggccctgaacgagctggtgacgctgacgtgcctggcacgtggcttcagccccaaggatgtgctggttcgctgg
ctgcaggggtcacaggagctgccccgcgagaagtacctgacttgggcatcccggcaggagcccagccagggcaccaccacctt
cgctgtgaccagcatactgcgcgtggcagccgaggactggaagaagggggacaccttctcctgcatggtgggccacgaggccc
tgccgctggccttcacacagaagaccatcgaccgcttggcgggtaaacccacccatgtcaatgtgtctgttgtcatggcggaggtg
gacggcacctgctactgataatctaga
CTLA-4 IgAH IgACH2CH3(氨基酸序列)(SEQ ID NO:88)
MGVLLTQRTLLSLVLALLFPSMASMAMHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKA
TEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRA
MDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDQPVPSTPPTPSPSTPPTP
SPSCCHPRLSLHRPALEDLLLGSEAILTCTLTGLRDASGVTFTWTPSSGKSAVQGPP
DRDLCGCYSVSSVLPGCAEPWNHGKTFTCTAAYPESKTPLTATLSKSGNTFRPEVH
LLPPPSEELALNELVTLTCLARGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYLTWASRQEPSQ
GTTTFAVTSILRVAAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRLAGKPTHVNVS
VVMAEVDGTCY
CTLA-4 IgAH IgA-T4(人-oncoMLP-CTLA4EC-Ig3T1A)(核苷酸序列)(SEQ ID NO:89)
atgggggtactgctcacacagaggacgctgctcagtctggtccttgcactcctgtttccaagcatggcgagcatggcaatgcacgt
ggcccagcctgctgtggtactggccagcagccgaggcatcgccagctttgtgtgtgagtatgcatctccaggcaaagccactgag
gtccgggtgacagtgcttcggcaggctgacagccaggtgactgaagtctgtgcggcaacctacatgatggggaatgagttgacct
tcctagatgattccatctgcacgggcacctccagtggaaatcaagtgaacctcactatccaaggactgagggccatggacacggg
actctacatctgcaaggtggagctcatgtacccaccgccatactacctgggcataggcaacggaacccagatttatgtaattgatcc
agaaccgtgcccagattctgatcagccagttccctcaactccacctaccccatctccctcaactccacctaccccatctccctcatgct
gccacccccgactgtcactgcaccgaccggccctcgaggacctgctcttaggttcagaagcgatcctcacgtgcacactgaccgg
cctgagagatgcctcaggtgtcaccttcacctggacgccctcaagtgggaagagcgctgttcaaggaccacctgaccgtgacctct
gtggctgctacagcgtgtccagtgtcctgccgggctgtgccgagccatggaaccatgggaagaccttcacttgcactgctgcctac
cccgagtccaagaccccgctaaccgccaccctctcaaaatccggaaacacattccggcccgaggtccacctgctgccgccgccg
tcggaggagctggccctgaacgagctggtgacgctgacgtgcctggcacgtggcttcagccccaaggatgtgctggttcgctgg
ctgcaggggtcacaggagctgccccgcgagaagtacctgacttgggcatcccggcaggagcccagccagggcaccaccacctt
cgctgtgaccagcatactgcgcgtggcagccgaggactggaagaagggggacaccttctcctgcatggtgggccacgaggccc
tgccgctggccttcacacagaagaccatcgaccgcttggcgggtaaacccacccatgtcaatgtgtctgttgtcatggcggaggtg
gactgataatctaga
CTLA-4 IgAH IgA-T4(氨基酸序列)(SEQ ID NO:90)
MGVLLTQRTLLSLVLALLFPSMASMAMHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKA
TEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRA
MDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDQPVPSTPPTPSPSTPPTP
SPSCCHPRLSLHRPALEDLLLGSEAILTCTLTGLRDASGVTFTWTPSSGKSAVQGPP
DRDLCGCYSVSSVLPGCAEPWNHGKTFTCTAAYPESKTPLTATLSKSGNTFRPEVH
LLPPPSEELALNELVTLTCLARGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYLTWASRQEPSQ
GTTTFAVTSILRVAAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRLAGKPTHVNVS
VVMAEVD
具有238突变pro→ser的人IgG1 CH2(核苷酸序列)(SEQ IDNO:91)
cctgaactcctggggggatcgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcac
atgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaa
gacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatg
gcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaag
具有238突变pro→ser的人IgG1 CH2(氨基酸序列)(SEQ IDNO:92)
PELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHN
AKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK
CH2中的Pro至Ser周围的氨基酸(氨基酸序列)(SEQ ID NO:93)
PAPELLGGPS
CH2中的Pro至Ser周围的氨基酸(氨基酸序列)(SEQ ID NO:94)
PAPELLGGSS
hIgE3BB(在基因的末端留有可读框,以阅读进附着在BamHI或SfuI位点的跨膜和细胞质尾结构域)(核苷酸序列)(SEQ ID NO:95)
gtt gtt ttc gaa gga tcc gct tta ccg gga ttt aca gac acc gct cgc tgg
人IgE Fc(CH2-CH3-CH4)ORF(核苷酸序列)(SEQ ID NO:96)
tgatcacgtctgctccagggacttcaccccgcccaccgtgaagatcttacagtcgtcctgcgacggcggcgggcacttccccccg
accatccagctcctgtgcctcgtctctgggtacaccccagggactatcaacatcacctggctggaggacgggcaggtcatggacg
tggacttgtccaccgcctctaccacgcaggagggtgagctggcctccacacaaagcgagctcaccctcagccagaagcactggc
tgtcagaccgcacctacacctgccaggtcaccttcaaggtcacacctttgaggacagcaccaagaagtgtgcagattccaaccc
gagaggggtgagcgcctacctaagccggcccagcccgttcgacctgttcatccgcaagtcgcccacgatcacctgtctggtggtg
gacctggcacccagcaaggggaccgtgaacctgacctggtcccgggccagtgggaagcctgtgaaccactccaccagaaagg
aggagaagcagcgcaatggcacgttaaccgtcacgtccaccctgccggtgggcacccgagactggatcgagggggagaccta
ccagtgcagggtgacccacccccacctgcccagggccctcatgcggtccacgaccaagaccagcggcccgcgtgctgccccg
gaagtctatgcgtttgcgacgccggagtggccggggagccgggacaagcgcaccctcgcctgcctgatccagaacttcatgcct
gaggacatctcggtgcagtggctgcacaacgaggtgcagctcccggacgcccggcacagcacgacgcagccccgcaagacc
aagggctccggcttcttcgtcttcagccgcctggaggtgaccagggccgaatgggagcagaaagatgagttcatctgccgtgcag
tccatgaggcagcgagcccctcacagaccgtccagcgagcggtgtctgtaaatcccggtaaagcggatccttcgaa
人IgE Fc(CH2-CH3-CH4)ORF(氨基酸序列)(SEQ ID NO:97)
DHVCSRDFTPPTVKILQSSCDGGGHFPPTIQLLCLVSGYTPGTINITWLEDGQVMDV
DLSTASTTQEGELASTQSELTLSQKHWLSDRTYTCQVTYQGHTFEDSTKKCADSN
PRGVSAYLSRPSPFDLFIRKSPTITCLVVDLAPSKGTVNLTWSRASGKPVNHSTRKE
EKQRNGTLTVTSTLPVGTRDWIEGETYQCRVTHPHLPRALMRSTTKTSGPRAAPE
VYAFATPEWPGSRDKRTLACLIQNFMPEDISVQWLHNEVQLPDARHSTTQPRKTK
GSGFFVFSRLEVTRAEWEQKDEFICRAVHEAASPSQTVQRAVSVNPGKADPS
IFhIgGwtBcl5(核苷酸序列)(SEQ ID NO:98)
gtt gtt tga tca gga gcc caa atc ttg tga caa aac tca cac atg ccc acc gtg ccc agc acc(63mer)
HuIgGMHWC(有义,用于将野生型铰链CCC突变为突变体SSS的5’引物)(核苷酸序列)(SEQ ID NO:99)
gtt gtt gat cag gag ccc aaa tct tct gac aaa act cac aca tct cca ccg tcc cca gca cct gaa ctc ctg
ggt gga ccg tca gtc ttc c
1D8 VH(核苷酸序列)(SEQ ID NO:100)
caggtgcagctgaaggaggcaggacctggcctggtgcaaccgacacagaccctgtccctcacatgcactgtctctgggttctcatt
aaccagcgatggtgtacactggattcgacagcctccaggaaagggtctggaatggatgggaataatatattatgatggaggcaca
gattataattcagcaattaaatccagactgagcatcagcagggacacctccaagagccaagttttcttaaaaatcaacagtctgcaaa
ctgatgacacagccatgtattactgtgccagaatccactttgattactggggccaaggagtcatggtcacagtctcctct
1D8 VH(无前导序列)(氨基酸序列)(SEQ ID NO:101)
QVQLKEAGPGLVQPTQTLSLTCTVSGFSLTSDGVHWIRQPPGKGLEWMGIIYYDG
GTDYNSAIKSRLSISRDTSKSQVFLKINSLQTDDTAMYYCARIHFDYWGQGVMVT
VSS
1D8 VL(无前导序列)(核苷酸序列)(SEQ ID NO:102)
gacattgtgctcactcagtctccaacaaccatagctgcatctccaggggagaaggtcaccatcacctgccgtgccagctccagtgt
aagttacatgtactggtaccagcagaagtcaggcgcctcccctaaactctggatttatgacacatccaagctggcttctggagttcca
aatcgcttcagtggcagtgggtctgggacctcttattctctcgcaatcaacaccatggagactgaagatgctgccacttattactgtca
gcagtggagtagtactccgctcacgttcgggtctgggaccaagctggagatcaaacgg
1D8 VL(氨基酸序列)(SEQ ID NO:103)
DIVLTQSPTTIAASPGEKVTITCRASSSVSYMYWYQQKSGASPKLWIYDTSKLASG
VPNRFSGSGSGTSYSLAINTMETEDAATYYCQQWSSTPLTFGSGTKLEIKR
1D8 scFv(核苷酸序列)(SEQ ID NO:104)
aagcttatggattttcaagtgcagattttcagcttcctgctaatcagtgcttcagtcataatgtccagaggagtcgacattgtgctcactc
agtctccaacaaccatagctgcatctccaggggagaaggtcaccatcacctgccgtgccagctccagtgtaagttacatgtactggt
accagcagaagtcaggcgcctcccctaaactctggatttatgacacatccaagctggcttctggagttccaaatcgcttcagtggca
gtgggtctgggacctcttattctctcgcaatcaacaccatggagactgaagatgctgccacttattactgtcagcagtggagtagtact
ccgctcacgttcgggtctgggaccaagctggagatcaaacggggtggcggtggctcgggcggtggtgggtcgggtggcggcg
gatctcaggtgcagctgaaggaggcaggacctggcctggtgcaaccgacacagaccctgtccctcacatgcactgtctctgggtt
ctcattaaccagcgatggtgtacactggattcgacagcctccaggaaagggtctggaatggatgggaataatatattatgatggagg
cacagattataattcagcaattaaatccagactgagcatcagcagggacacctccaagagccaagttttcttaaaaatcaacagtctg
caaactgatgacacagccatgtattactgtgccagaatccactttgattactggggccaaggagtcatggtcacagtctcctctgatc
a
1D8 scFv(氨基酸序列)(SEQ ID NO:105)
MDFQVQIFSFLLISASVIMSRGVDIVLTQSPTTIAASPGEKVTITCRASSSVSYMYWY
QQKSGASPKLWIYDTSKLASGVPNRFSGSGSGTSYSLAINTMETEDAATYYCQQW
SSTPLTFGSGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSQVQLKEAGPGLVQPTQTLSLTCTV
SGFSLTSDGVHWIRQPPGKGLEWMGIIYYDGGTDYNSAIKSRLSISRDTSKSQVFLK
INSLQTDDTAMYYCARIHFDYWGQGVMVTVSS
1D8 scFv IgG WTH WTCH2CH3(核苷酸序列)(SEQ ID NO:106)
aagcttatggattttcaagtgcagattttcagcttcctgctaatcagtgcttcagtcataatgtccagaggagtcgacattgtgctcactc
agtctccaacaaccatagctgcatctccaggggagaaggtcaccatcacctgccgtgccagctccagtgtaagttacatgtactggt
accagcagaagtcaggcgcctcccctaaactctggatttatgacacatccaagctggcttctggagttccaaatcgcttcagtggca
gtgggtctgggacctcttattctctcgcaatcaacaccatggagactgaagatgctgccacttattactgtcagcagtggagtagtact
ccgctcacgttcgggtctgggaccaagctggagatcaaacggggtggcggtggctcgggcggtggtgggtcgggtggcggcg
gatctcaggtgcagctgaaggaggcaggacctggcctggtgcaaccgacacagaccctgtccctcacatgcactgtctctgggtt
ctcattaaccagcgatggtgtacactggattcgacagcctccaggaaagggtctggaatggatgggaataatatattatgatggagg
cacagattataattcagcaattaaatccagactgagcatcagcagggacacctccaagagccaagttttcttaaaaatcaacagtctg
caaactgatgacacagccatgattactgtgccagaatccactttgattactggggccaaggagtcatggtcacagtctcctctgatc
aggagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttc
cccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccct
gaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcac
gtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagcc
ctcccagcccccatcgagaaaacaatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccg
ggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagag
caatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcacc
gtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaag
agcctctccctgtctccgggtaaatgatctaga
1D8 scFv IgG WTH WTCH2CH3(氨基酸序列)(SEQ ID NO:107)
MDFQVQIFSFLLISASVIMSRGVDIVLTQSPTTIAASPGEKVTITCRASSSVSYMYWY
QQKSGASPKLWIYDTSKLASGVPNRFSGSGSGTSYSLAINTMETEDAATYYCQQW
SSTPLTFGSGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSQVQLKEAGPGLVQPTQTLSLTCTV
SGFSLTSDGVHWIRQPPGKGLEWMGIIYYDGGTDYNSAIKSRLSISRDTSKSQVFLK
INSLQTDDTAMYYCARIHFDYWGQGVMVTVSSDQEPKSCDKTHTCPPCPAPELLG
GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP
REEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREP
QVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDG
SFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
1D8 scFv IgG MTH MTCH2CH3-CD80(核苷酸序列)(SEQ ID NO:108)
aagcttatggattttcaagtgcagattttcagcttcctgctaatcagtgcttcagtcataatgtccagaggagtcgacattgtgctcactc
agtctccaacaaccatagctgcatctccaggggagaaggtcaccatcacctgccgtgccagctccagtgtaagttacatgtactggt
accagcagaagtcaggcgcctcccctaaactctggatttatgacacatccaagctggcttctggagttccaaatcgcttcagtggca
gtgggtctgggacctcttattctctcgcaatcaacaccatggagactgaagatgctgccacttattactgtcagcagtggagtagtact
ccgctcacgttcgggtctgggaccaagctggagatcaaacggggtggcggtggctcgggcggtggtgggtcgggtggcggcg
gactcaggtgcagctgaaggaggcaggacctggcctggtgcaaccgacacagaccctgtccctcacatgcactgtctctgggtt
ctcattaaccagcgatggtgtacactggattcgacagcctccaggaaagggtctggaatggatgggaataatatattatgatggagg
cacagattataattcagcaattaaatccagactgagcatcagcagggacacctccaagagccaagttttcttaaaaatcaacagtctg
caaactgatgacacagccatgtattactgtgccagaatccactttgattactggggccaaggagtcatggtcacagtctcctctgatct
ggagcccaaaatcttctgacaaaactcacacaagcccaccgagcccagcacctgaactcctggggggatcgtcagtcttcctcttcc
ccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctg
aggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacg
taccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccc
tcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgg
gatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagc
aatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccg
tggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaaga
gcctctccctgtctccgggtaaagcggatccttcgaacctgctcccatcctgggccattaccttaatctcagtaaatggaatttttgtga
tatgctgcctgacctactgctttgccccaagatgcagagagagaaggaggaatgagagattgagaagggaaagtgtacgccctgt
ataaatcgata
1D8 scFv IgG MTH MTCH2CH3-CD80(氨基酸序列)(SEQ ID NO:109)
MDFQVQIFSFLLISASVIMSRGVDIVLTQSPTTIAASPGEKVTITCRASSSVSYMYWY
QQKSGASPKLWIYDTSKLASGVPNRFSGSGSGTSYSLAINTMETEDAATYYCQQW
SSTPLTFGSGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSQVQLKEAGPGLVQPTQTLSLTCTV
SGFSLTSDGVHWIRQPPGKGLEWMGIIYYDGGTDYNSAIKSRLSISRDTSKSQVFLK
INSLQTDDTAMYYCARIHFDYWGQGVMVTVSSDLEPKSSDKTHTSPPSPAPELLG
GSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP
REEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREP
QVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDG
SFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKADPSNLLPSW
AITLISVNGIFVICCLTYCFAPRCRERRRNERLRRESVRPV
1D8 scFv IgG WTH WTCH2CH3-CD80(核苷酸序列)(SEQ ID NO:110)
aagcttatggattttcaagtgcagattttcagcttcctgctaatcagtgcttcagtcataatgtccagaggagtcgacattgtgctcactc
agtctccaacaaccatagctgcatctccaggggagaaggtcaccatcacctgccgtgccagctccagtgtaagttacatgtactggt
accagcagaagtcaggcgcctcccctaaactctggatttatgacacatccaagctggcttctggagttccaaatcgcttcagtggca
gtgggtctgggacctcttattctctcgcaatcaacaccatggagactgaagatgctgccacttattactgtcagcagtggagtagtact
ccgctcacgttcgggtctgggaccaagctggagatcaaacggggtggcggtggctcgggcggtggtgggtcgggtggcggcg
gatctcaggtgcagctgaaggaggcaggacctggcctggtgcaaccgacacagaccctgtccctcacatgcactgtctctgggtt
ctcattaaccagcgatggtgtacactggattcgacagcctccaggaaagggtctggaatggatgggaataatatattatgatggagg
cacagattataattcagcaattaaatccagactgagcatcagcagggacacctccaagagccaagttttcttaaaaatcaacagtctg
caaactgatgacacagccatgtattactgtgccagaatccactttgattactggggccaaggagtcatggtcacagtctcctctgatct
ggagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttcc
ccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctg
aggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacg
taccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccc
tcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgg
gatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagc
aatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccg
tggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaaga
gcctctccctgtctccgggtaaagcggatccttcgaacctgctcccatcctgggccattaccttaatctcagtaaatggaatttttgtga
tatgctgcctgacctactgctttgccccaagatgcagagagagaaggaggaatgagagattgagaagggaaagtgtacgccctgt
ataaatcgata
1D8 scFv IgG WTH WTCH2CH3-CD80(氨基酸序列)(SEQ ID NO:111)
MDFQVQIFSFLLISASVIMSRGVDIVLTQSPTTIAASPGEKVTITCRASSSVSYMYWY
QQKSGASPKLWIYDTSKLASGVPNRFSGSGSGTSYSLAINTMETEDAATYYCQQW
SSTPLTFGSGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSQVQLKEAGPGLVQPTQTLSLTCTV
SGFSLTSDGVHWIRQPPGKGLEWMGIIYYDGGTDYNSAIKSRLSISRDTSKSQVFLK
INSLQTDDTAMYYCARIHFDYWGQGVMVTVSSDLEPKSCDKTHTCPPCPAPELLG
GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP
REEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREP
QVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDG
SFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKADPSNLLPSW
AITLISVNGIFVICCLTYCFAPRCRERRRNERLRRESVRPV
抗-人CD3 scFv IgG WTH WTCH2CH3(核苷酸序列)(SEQ ID NO:112)
aagcttatggattttcaagtgcagattttcagcttcctgctaatcagtgcttcagtcataatgtccagaggagtcgacatccagatgaca
cagactacatcctccctgtctgcctctctgggagacagagtcaccatcagttgcagggcaagtcaggacattcgcaattatttaaact
ggtatcagcagaaaccagatggaactgttaaactcctgatctactacacatcaagattacactcaggagtcccatcaaggttcagtg
gcagtgggtctggaacagattattctctcaccattgccaacctgcaaccagaagatattgccacttacttttgccaacagggtaatac
gcttccgtggacgttcggtggaggcaccaaactggtaaccaaacgggagctcggtggcggtggctcgggcggtggtgggtcgg
gtggcggcggatctatcgatgaggtccagctgcaacagtctggacctgaactggtgaagcctggagcttcaatgtcctgcaaggc
ctctggttactcattcactggctacatcgtgaactggctgaagcagagccatggaaagaaccttgagtggattggacttattaatccat
acaaaggtcttactacctacaaccagaaattcaagggcaaggccacattaactgtagacaagtcatccagcacagcctacatggag
ctcctcagtctgacatctgaagactctgcagtctattactgtgcaagatctgggtactatggtgactcggactggtacttcgatgtctgg
ggcgcagggaccacggtcaccgtctcctctgatcaggagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcac
ctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcaca
tgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaag
acaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatgg
caaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaacaatctccaaagccaaagggcagcccc
gagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggct
tctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggac
tccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgat
gcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatgatctaga
抗-人CD3 scFv IgG WTH WTCH2CH3(氨基酸序列)(SEQ ID NO:113)
MDFQVQIFSFLLISASVIMSRGVDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDIRNYLN
WYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTIANLQPEDIATYFCQQ
GNTLPWTFGGGTKLVTKRELGGGGSGGGGSGGGGSIDEVQLQQSGPELVKPGAS
MSCKASGYSFTGYIVNWLKQSHGKNLEWIGLINPYKGLTTYNQKFKGKATLTVD
KSSSTAYMELLSLTSEDSAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGAGTTVTVSSDQEPK
SCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKF
NWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKA
LPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN
GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQ
KSLSLSPGK
2H7-抗CD40 scFv MTH(SSS)MTCH2WTCH3(2h7-40.2.220Ig+限制位点)(核苷酸序列)(SEQ ID NO:114)
aagcttgccgccatggattttcaagtgcagattttcagcttcctgctaatcagtgcttcagtcataattgccagaggacaaattgttctct
cccagtctccagcaatcctgtctgcatctccaggggagaaggtcacaatgacttgcagggccagctcaagtgtaagttacatgcact
ggtaccagcagaagccaggatcctcccccaaaccctggatttatgccccatccaacctggcttctggagtccctgctcgcttcagtg
gcagtgggtctgggacctcttactctctcacaatcagcagagtggaggctgaagatgctgccacttattactgccagcagtggagttt
taacccacccacgttcggtgctgggaccaagctggagctgaaaggtggcggtggctcgggcggtggtggatctggaggaggtg
ggagctctcaggcttatctacagcagtctggggctgagctggtgaggcctggggcctcagtgaagatgtcctgcaaggcttctggc
tacacatttaccagttacaatatgcactgggtaaagcagacacctagacagggcctggaatggattggagctatttatccaggaaat
ggtgatacttcctacaatcagaagttcaagggcaaggccacactgactgtagacaaatcctccagcacagcctacatgcagctcag
cagcctgacatctgaagactctgcggtctatttctgtgcaagagtggtgtactatagtaactcttactggtacttcgatgtctggggcac
agggaccacggtcaccgtctcttctgatcaatccaactctgaagaagcaaagaaagaggaggccaaaaaggaggaagccaaga
aatctaacagcgtcgacattgttctgactcagtctccagccaccctgtctgtgactccaggagatagagtctctctttcctgcagggcc
agccagagtattagcgactacttacactggtatcaacaaaaatcacatgagtctccaaggcttctcatcaaatatgcttcccattccatc
tctgggatcccctccaggttcagtggcagtggatcagggtcagatttcactctcagtatcaacagtgtggaacctgaagatgttggaa
tttattactgtcaacatggtcacagctttccgtggacgttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaacggggtggcggtggctcg
ggcggaggtgggtcgggtggcggcggatctcagatccagttggtgcaatctggacctgagctgaagaagcctggagagacagt
caggatctcctgcaaggcttctgggtatgccttcacaactactggaatgcagtgggtgcaagagatgccaggaaagggtttgaagt
ggattggctggataaacaccccactctggagtgccaaaatatgtagaagacttcaaggacggtttgccttctctttggaaacctctgc
caacactgcatatttacagataagcaacctcaaagatgaggacacggctacgtatttctgtgtgagatccgggaatggtaactatga
cctggcctactttgcttactggggccaagggacactggtcactgtctctgatcaggagcccaaatcttctgacaaaactcacacatcc
ccaccgtccccagcacctgaactcctggggggatcgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccg
gacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtgga
ggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcacca
ggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaacaatctccaaagc
caaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacct
gcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacg
cctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtct
tctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatgatctaga
2H7-抗CD40 scFv MTH(SSS)MTCH2WTCH3(2h7-40.2.220Ig)(氨基酸序列)(SEQ ID NO:115)
MDFQVQIFSFLLISASVIIARGQIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYMHWY
QQKPGSSPKPWIYAPSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWS
FNPPTFGAGTKLELKGGGGSGGGGSGGGGSSQAYLQQSGAELVRPGASVKMSCK
ASGYTFTSYNMHWVKQTPRQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTVDKSSS
TAYMQLSSLTSEDSAVYFCARVVYYSNSYWYFDVWGTGTTVTVSSDQSNSEEAK
KEEAKKEEAKKSNSVDIVLTQSPATLSVTPGDRVSLSCRASQSISDYLHWYQQKSH
ESPRLLIKYASHSISGIPSRFSGSGSGSDFTLSINSVEPEDVGIYYCQHGHSFPWTFGG
GTKLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSQIQLVQSGPELKKPGETVRISCKASGYAFTTTG
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PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPRE
PQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD
GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
5B9 VH(包括VH前导肽)(核苷酸序列)(SEQ ID NO:116)
atggctgtcttggggctgctcttctgcctggtgacatttccaagctgtgtcctatcccaggtgcagctgaagcagtcaggacctggcc
tagtgcagtcctcacagagcctgtccatcacctgcacagtctctggtttctcattaactacctatgctgtacactgggttcgccagtctc
caggaaagggtctggagtggctgggagtgatatggagtggtggaatcacagactataatgcagctttcatatccagactgagcatc
accaaggacgattccaagagccaagttttctttaaaatgaacagtctgcaacctaatgacacagccatttattactgtgccagaaatg
ggggtgataactacccttattactatgctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctca
5B9 VH(无前导序列)(核苷酸序列)(SEQ ID NO:117)
caggtgcagctgaagcagtcaggacctggcctagtgcagtcctcacagagcctgtccatcacctgcacagtctctggtttctcatta
actacctatgctgtacactgggttcgccagtctccaggaaagggtctggagtggctgggagtgatatggagtggtggaatcacaga
ctataatgcagctttcatatccagactgagcatcaccaaggacgattccaagagccaagttttctttaaaatgaacagtctgcaaccta
atgacacagccatttattactgtgccagaaatgggggtgataactacccttattactatgctatggactactggggtcaaggaacctca
gtcaccgtctcctca
5B9 VH(包括前导肽)(氨基酸序列)(SEQ ID NO:118)
MAVLGLLFCLVTFPSCVLSQVQLKQSGPGLVQSSQSLSITCTVSGFSLTTYAVHWV
RQSPGKGLEWLGVIWSGGITDYNAAFISRLSITKDDSKSQVFFKMNSLQPNDTAIY
YCARNGGDNYPYYYAMDYWGQGTSVTVSS
5B9 VH(无前导肽)(氨基酸序列)(SEQ ID NO:119)
QVQLKQSGPGLVQSSQSLSITCTVSGFSLTTYAVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGI
TDYNAAFISRLSITKDDSKSQVFFKMNSLQPNDTAIYYCARNGGDNYPYYYAMDY
WGQGTSVTVSS
5B9 VL(核苷酸序列)(SEQ ID NO:120)
atgaggttctctgctcagcttctggggctgcttgtgctctggatccctggatccactgcagatattgtgatgacgcaggctgcattctc
caatccagtcactcttggaacatcagcttccatctcctgcaggtctagtaagagtctcctacatagtaatggcatcacttatttgtattgg
tatctgcagaagccaggccagtctcctcagctcctgatttatcagatgtccaaccttgcctcaggagtcccagacaggttcagtagca
gtgggtcaggaactgatttcacactgagaatcagcagagtggaggctgaggatgtgggtgtttattactgtgctcaaaatctagaact
tccgctcacgttcggtgctgggaccaagctggagctgaaacgg
5B9 VL(氨基酸序列)(SEQ ID NO:121)
MRFSAQLLGLLVLWIPGSTADIVMTQAAFSNPVTLGTSASISCRSSKSLLHSNGITY
LYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSSSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYC
AQNLELPLTFGAGTKLELKR
5B9 scFv(核苷酸序列)(SEQ ID NO:122)
aagcttgccgccatgaggttctctgctcagcttctggggctgcttgtgctctggatccctggatccactgcagatattgtgatgacgca
ggctgcattctccaatccagtcactcttggaacatcagcttccatctcctgcaggtctagtaagagtctcctacatagtaatggcatca
cttatttgtattggtatctgcagaagccaggccagtctcctcagctcctgatttatcagatgtccaaccttgcctcaggagtcccagaca
ggttcagtagcagtgggtcaggaactgatttcacactgagaatcagcagagtggaggctgaggatgtgggtgtttattactgtgctc
aaaatctagaacttccgctcacgttcggtgctgggaccaagctggagctgaaacggggtggcggtggctcgggcggtggtgggt
cgggtggcggcggatcgtcacaggtgcagctgaagcagtcaggacctggcctagtgcagtcctcacagagcctgtccatcacct
gcacagtctctggtttctcattaactacctatgctgtacactgggttcgccagctccaggaaagggtctggagtggctgggagtgat
atggagtggtggaatcacagactataatgcagctttcatatccagactgagcatcaccaaggacgattccaagagccaagttttcttt
aaaatgaacagtctgcaacctaatgacacagccatttattactgtgccagaaatgggggtgataactacccttattactatgctatgga
ctactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctct
5B9 scFv(氨基酸序列)(SEQ ID NO:123)
MRFSAQLLGLLVLWIPGSTADIVMTQAAFSNPVTLGTSASISCRSSKSLLHSNGITY
LYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSSSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYC
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SQVFFKMNSLQPNDTAIYYCARNGGDNYPYYYAMDYWGQGTSVTVSS
5B9 scFv-hmtIgG1-hCD80(核苷酸序列)(SEQ ID NO:124)
aagcttgccgccatgaggttctctgctcagcttctggggctgcttgtgctctggatccctggatccactgcagatattgtgatgacgca
ggctgcattctccaatccagtcactcttggaacatcagcttccatctcctgcaggtctagtaagagtctcctacatagtaatggcatca
cttatttgtattggtatctgcagaagccaggccagtctcctcagctcctgatttatcagatgtccaaccttgcctcaggagtcccagaca
ggttcagtagcagtgggtcaggaactgatttcacactgagaatcagcagagtggaggctgaggatgtgggtgtttattactgtgctc
aaaatctagaacttccgctcacgttcggtgctgggaccaagctggagctgaaacggggtggcggtggctcgggcggtggtgggt
cgggtggcggcggatcgtcacaggtgcagctgaagcagtcaggacctggcctagtgcagtcctcacagagcctgtccatcacct
gcacagtctctggtttctcattaactacctatgctgtacactgggttcgccagtctccaggaaagggtctggagtggctgggagtgat
atggagtggtggaatcacagactataatgcagctttcatatccagactgagcatcaccaaggacgattccaagagccaagttttcttt
aaaatgaacagtctgcaacctaatgacacagccatttattactgtgccagaaatgggggtgataactacccttattactatgctatgga
ctactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctctgatctggagcccaaatcttctgacaaaactcacacaagcccaccgagcc
cagcacctgaactcctggggggatcgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgag
gtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataat
gccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggct
gaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggc
agccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtca
aaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtg
ctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctc
cgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaagcggatccttcgaacctgctcc
catcctgggccattaccttaatctcagtaaatggaatttttgtgatatgctgcctgacctactgctttgccccaagatgcagagagaga
aggaggaatgagagattgagaagggaaagtgtacgccctgtataaatcgatactcgag
5B9 scFv-hmtIgG1-hCD80(氨基酸序列)(SEQ ID NO:125)
MRFSAQLLGLLVLWIPGSTADIVMTQAAFSNPVTLGTSASISCRSSKSLLHSNGITY
LYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSSSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYC
AQNLELPLTFGAGTKLELKRGGGGSGGGGSGGGGSSQVQLKQSGPGLVQSSQSLS
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YVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA
PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQP
ENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLS
LSPGKADPSNLLPSWAITLISVNGIFVICCLTYCFAPRCRERRRNERLRRESVRPV
2e12 scFv WTHCH2CH3(2e12 scFv-WthIgG-CD80)(核苷酸序列)(SEQ ID NO:126)
aagcttatggattttcaagtgcagattttcagcttcctgctaatcagtgcttcagtcataatgtccagaggagtcgacattgtgctcaccc
aatctccagcttctttggctgtgtctctaggtcagagagccaccatctcctgcagagccagtgaaagtgttgaatattatgtcacaagtt
taatgcagtggtaccaacagaaaccaggacagccacccaaactcctcatctctgctgcatccaacgtagaatctggggtccctgcc
aggtttagtggcagtgggtctgggacagacttcagcctcaacatccatcctgtggaggaggatgatattgcaatgtatttctgtcagc
aaagtaggaaggttccttggacgttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaacggggtggcggtggctcgggcggaggtggg
tcgggtggcggcggatctcaggtgcagctgaaggagtcaggacctggcctggtggcgccctcacagagcctgtccatcacatgc
accgtctcagggttctcattaaccggctatggtgtaaactgggttcgccagcctccaggaaagggtctggagtggctgggaatgat
atggggtgatggaagcacagactataattcagctctcaaatccagactgagcatcaccaaggacaactccaagagccaagttttctt
aaaaatgaacagtctgcaaactgatgacacagccagatactactgtgccagagatggttatagtaactttcattactatgttatggact
actggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctcagatctggagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgccca
gcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggt
cacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgc
caagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctga
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ggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctcc
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atcctgggccattaccttaatctcagtaaatggaatttttgtgatatgctgcctgacctactgctttgccccaagatgcagagagagaa
ggaggaatgagagattgagaagggaaagtgtacgccctgtataaatcgat
2e12 scFv WTH CH2CH3(2e12 scFv-WthIgG-CD80)(氨基酸序列)(SEQ ID NO:127)
MDFQVQIFSFLLISASVIMSRGVDIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVEYYVTS
LMQWYQQKPGQPPKLLISAASNVESGVPARFSGSGSGTDFSLNIHPVEEDDIAMYF
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CDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFN
WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALP
APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ
PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL
SLSPGKADPSNLLPSWAITLISVNGIFVICCLTYCFAPRCRERRRNERLRRESVRPV
2H7-人IgE Fc(CH2-CH3-CH4)(核苷酸序列)(SEQ ID NO:128)
aagcttgccgccatggattttcaagtgcagattttcagcttcctgctaatcagtgcttcagtcataattgccagaggacaaattgttctct
cccagtctccagcaatcctgtctgcatctccaggggagaaggtcacaatgacttgcagggccagctcaagtgtaagttacatgcact
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agggaccacggtcaccgtctctgatcacgtctgctccagggacttcaccccgcccaccgtgaagatcttacagtcgtcctgcgacg
gcggcgggcacttccccccgaccatccagctcctgtgcctcgtctctgggtacaccccagggactatcaacatcacctggctgga
ggacgggcaggtcatggacgtggacttgtccaccgcctctaccacgcaggagggtgagctggcctccacacaaagcgagctca
ccctcagccagaagcactggctgtcagaccgcacctacacctgccaggtcacctatcaaggtcacacctttgaggacagcaccaa
gaagtgtgcagattccaacccgagaggggtgagcgcctacctaagccggcccagcccgttcgacctgttcatccgcaagtcgcc
cacgatcacctgtctggtggtggacctggcacccagcaaggggaccgtgaacctgacctggtcccgggccagtgggaagcctgt
gaaccactccaccagaaaggaggagaagcagcgcaatggcacgttaaccgtcacgtccaccctgccggtgggcacccgagact
ggatcgagggggagacctaccagtgcagggtgacccacccccacctgcccagggccctcatgcggtccacgaccaagaccag
cggcccgcgtgctgccccggaagtctatgcgtttgcgacgccggagtggccggggagccgggacaagcgcaccctcgcctgc
ctgatccagaacttcatgcctgaggacatctcggtgcagtggctgcacaacgaggtgcagctcccggacgcccggcacagcacg
acgcagccccgcaagaccaagggctccggcttcttcgtcttcagccgcctggaggtgaccagggccgaatgggagcagaaaga
tgagttcatctgccgtgcagtccatgaggcagcgagcccctcacagaccgtccagcgagcggtgtctgtaaatcccggtaaatgat
aatctaga
2H7 scFv IgE(CH2-CH3-CH4)(氨基酸序列)(SEQ ID NO:129)
MDFQVQIFSFLLISASVIIARGQIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYMHWY
QQKPGSSPKPWIYAPSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWS
FNPPTFGAGTKLELKGGGGSGGGGSGGGGSSQAYLQQSGAELVRPGASVKMSCK
ASGYTFTSYNMHWVKQTPRQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTVDKSSS
TAYMQLSSLTSEDSAVYFCARVVYYSNSYWYFDVWGTGTTVTVSDHVCSRDFTP
PTVKILQSSCDGGGHFPPTIQLLCLVSGYTPGTINITWLEDGQVMDVDLSTASTTQE
GELASTQSELTLSQKHWLSDRTYTCQVTYQGHTFEDSTKKCADSNPRGVSAYLSR
PSPFDLFIRKSPTITCLVVDLAPSKGTVNLTWSRASGKPVNHSTRKEEKQRNGTLTV
TSTLPVGTRDWIEGETYQCRVTHPHLPRALMRSTTKTSGPRAAPEVYAFATPEWP
GSRDKRTLACLIQNFMPEDISVQWLHNEVQLPDARHSTTQPRKTKGSGFFVFSRLE
VTRAEWEQKDEFICRAVHEAASPSQTVQRAVSVNPGK
2H7 scFv MH(SSS)MCH2WTCH3(核苷酸序列)(SEQ ID NO:130)
aagcttgccgccatggattttcaagtgcagattttcagcttcctgctaatcagtgcttcagtcataattgccagaggacaaattgttctct
cccagtctccagcaatcctgtctgcatctccaggggagaaggtcacaatgacttgcagggccagctcaagtgtaagttacatgcact
ggtaccagcagaagccaggatcctcccccaaaccctggatttatgccccatccaacctggcttctggagtccctgctcgcttcagtg
gcagtgggtctgggacctcttactctctcacaatcagcagagtggaggctgaagatgctgccacttattactgccagcagtggagttt
taacccacccacgttcggtgctgggaccaagctggagctgaaagatggcggtggctcgggcggtggtggatctggaggaggtg
ggagctctcaggcttatctacagcagtctggggctgagctggtgaggcctggggcctcagtgaagatgtcctgcaaggcttctggc
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ggtgatacttcctacaatcagaagttcaagggcaaggccacactgactgtagacaaatcctccagcacagcctacatgcagctcag
cagcctgacatctgaagactctgcggtctatttctgtgcaagagtggtgtactatagtaactcttactggtacttcgatgtctggggcac
agggaccacggtcaccgtctcttctgatcaggagcccaaatcttctgacaaaactcacacatccccaccgtccccagcacctgaac
tcctggggggatcgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtg
gtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaag
ccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaagga
gtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaacaatctccaaagccaaagggcagccccgagaac
cacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcc
cagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgac
ggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatga
ggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatgatctaga
2H7 scFv MH(SSS)MCH2WTCH3(氨基酸序列)(SEQ ID NO:131)
MDFQVQIFSFLLISASVIIARGQIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYMHWY
QQKPGSSPKPWIYAPSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWS
FNPPTFGAGTKLELKDGGGSGGGGSGGGGSSQAYLQQSGAELVRPGASVKMSCK
ASGYTFTSYNMHWVKQTPRQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTVDKSSS
TAYMQLSSLTSEDSAVYFCARVVYYSNSYWYFDVWGTGTTVTVSSDQEPKSSDK
THTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYV
DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIE
KTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEN
NYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLS
PGK
5B9 scFv MTHWTCH2CH3(核苷酸序列)(SEQ ID NO:132)
aagcttgccgccatgaggttctctgctcagcttctggggctgcttgtgctctggatccctggatccactgcagatattgtgatgacgca
ggctgcattctccaatccagtcactcttggaacatcagcttccatctcctgcaggtctagtaagagtctcctacatagtaatggcatca
cttatttgtattggtatctgcagaagccaggccagtctcctcagctcctgatttatcagatgtccaaccttgcctcaggagtcccagaca
ggttcagtagcagtgggtcaggaactgatttcacactgagaatcagcagagtggaggctgaggatgtgggtgtttattactgtgctc
aaaatctagaacttccgctcacgttcggtgctgggaccaagctggagctgaaacggggtggcggtggctcgggcggtggtgggt
cgggtggcggcggatcgtcacaggtgcagctgaagcagtcaggacctggcctagtgcagtcctcacagagcctgtccatcacct
gcacagtctctggtttctcattaactacctatgctgtacactgggttcgccagtctccaggaaagggtctggagtggctgggagtgat
atggagtggtggaatcacagactataatgcagctttcatatccagactgagcatcaccaaggacgattccaagagccaagttttcttt
aaaatgaacagtctgcaacctaatgacacagccatttattactgtgccagaaatgggggtgataactacccttattactatgctatgga
ctactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctctgatcaggagcccaaatcttctgacaaaactcacacatccccaccgtcccc
agcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgag
gtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataat
gccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggct
gaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaacaatctccaaagccaaagggc
agccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtca
aaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtg
ctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctc
cgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatgatctaga
5B9 scFv MTHWTCH2CH3(氨基酸序列)(SEQ ID NO:133)
MRFSAQLLGLLVLWIPGSTADIVMTQAAFSNPVTLGTSASISCRSSKSLLHSNGITY
LYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSSSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYC
AQNLELPLTFGAGTKLELKRGGGGSGGGGSGGGGSSQVQLKQSGPGLVQSSQSLS
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ENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLS
LSPGK
人IgG1铰链突变
2H7 scFv-MTH(CSS)WTCH2CH3(核苷酸序列)(SEQ ID NO:134)
aagcttgccgccatggattttcaagtgcagattttcagcttcctgctaatcagtgcttcagtcataattgccagaggacaaattgttctct
cccagtctccagcaatcctgtctgcatctccaggggagaaggtcacaatgacttgcagggccagctcaagtgtaagttacatgcact
ggtaccagcagaagccaggatcctcccccaaaccctggatttatgccccatccaacctggcttctggagtccctgctcgcttcagtg
gcagtgggtctgggacctcttactctctcacaatcagcagagtggaggctgaagatgctgccacttattactgccagcagtggagttt
taacccacccacgttcggtgctgggaccaagctggagctgaaagatggcggtggctcgggcggtggtggatctggaggaggtg
ggagctctcaggcttatctacagcagtctggggctgagctggtgaggcctggggcctcagtgaagatgtcctgcaaggcttctggc
tacacatttaccagttacaatatgcactgggtaaagcagacacctagacagggcctggaatggattggagctatttatccaggaaat
ggtgatacttcctacaatcagaagttcaagggcaaggccacactgactgtagacaaatcctccagcacagcctacatgcagctcag
cagcctgacatctgaagactctgcggtctatttctgtgcaagagtggtgtactatagtaactcttactggtacttcgatgtctggggcac
agggaccacggtcaccgtctcttctgatcaggagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatccccaccgtccccagcacctgaac
tcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtg
gtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaag
ccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaagga
gtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaacaatctccaaagccaaagggcagccccgagaac
cacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcc
cagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgac
ggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatga
ggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatgatctaga
2H7 scFv-MTH(CSS)WTCH2CH3(氨基酸序列)(SEQ ID NO:135)
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aagcttgccgccatggattttcaagtgcagattttcagcttcctgctaatcagtgcttcagtcataattgccagaggacaaattgttctct
cccagtctccagcaatcctgtctgcatctccaggggagaaggtcacaatgacttgcagggccagctcaagtgtaagttacatgcact
ggtaccagcagaagccaggatcctcccccaaaccctggatttatgccccatccaacctggcttctggagtccctgctcgcttcagtg
gcagtgggtctgggacctcttactctctcacaatcagcagagtggaggctgaagatgctgccacttattactgccagcagtggagttt
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ggtgatacttcctacaatcagaagttcaagggcaaggccacactgactgtagacaaatcctccagcacagcctacatgcagctcag
cagcctgacatctgaagactctgcggtctatttctgtgcaagagtggtgtactatagtaactcttactggtacttcgatgtctggggcac
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ccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaagga
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HIgGMHcys1(核苷酸序列)(SEQ ID NO:140)
gtt gtt gat cag gag ccc aaa tct tct gac aaa act cac aca tg
HIgGMHcys2(核苷酸序列)(SEQ ID NO:141)
gtt gtt gat cag gag ccc aaa tct tgt gac aaa act cac aca tct cca ccg tgc
HIgGMHcys3(核苷酸序列)(SEQ ID NO:142)
gtt gtt gat cag gag ccc aaa tct tgt gac aaa act cac aca tgt cca ccg tcc cca gca cct
HuIgG1 MTCH3Y405(核苷酸序列)(SEQ I D NO:143)
gggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcct
ggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctc
ccgtgctggactccgacggctccttctacctctatagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctc
atgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtccccgggtaaatga
HuIgG 1MTCH3Y405(氨基酸序列)(SEQ ID NO:144)
GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP
VLDSDGSFYLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
HuIgG1 MTCH3A405(核苷酸序列)(SEQ ID NO:145)
gggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcct
ggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctc
ccgtgctggactccgacggctccttcgccctctatagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctc
atgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtccccgggtaaatga
HuIgG1 MTCH3A405(氨基酸序列)(SEQ ID NO:146)
GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP
VLDSDGSFALYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
HuIgG1 MTCH3A407(核苷酸序列)(SEQ ID NO:147)
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tggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcct
cccgtgctggactccgacggctccttcttcctcgccagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttct
catgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtccccgggtaaatga
HuIgG1 MTCH3A407(氨基酸序列)(SEQ ID NO:148)
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VLDSDGSFFLASKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
HuIgG1 MTCH3Y405A407(核苷酸序列)(SEQ ID NO:149)
gggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcct
ggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctc
ccgtgctggactccgacggctccttctacctcgccagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctc
atgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtccccgggtaaatga
HuIgG1 MTCH3Y405A407(氨基酸序列)(SEQ ID NO:150)
GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP
VLDSDGSFYLASKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
HuIgG1 MTCH3A405A407(核苷酸序列)(SEQ ID NO:151)
gggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcct
ggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctc
ccgtgctggactccgacggctccttcgccctcgccagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttct
catgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtccccgggtaaatga
HuIgG1 MTCH3A405A407(氨基酸序列)(SEQ ID NO:152)
GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP
VLDSDGSFALASKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
2H7 scFv MTH(SSS)WTCH2MTCH3Y405(核酸序列)(SEQ ID NO:153)
aagcttgccgccatggattttcaagtgcagattttcagcttcctgctaatcagtgcttcagtcataattgccagaggacaaattgttctct
cccagtctccagcaatcctgtctgcatctccaggggagaaggtcacaatgacttgcagggccagctcaagtgtaagttacatgcact
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gcagtgggtctgggacctcttactctctcacaatcagcagagtggaggctgaagatgctgccacttattactgccagcagtggagttt
taacccacccacgttcggtgctgggaccaagctggagctgaaagatggcggtggctcgggcggtggtggatctggaggaggtg
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tacacatttaccagttacaatatgcactgggtaaagcagacacctagacagggcctggaatggattggagctatttatccaggaaat
ggtgatacttcctacaatcagaagttcaagggcaaggccacactgactgtagacaaatcctccagcacagcctacatgcagctcag
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agggaccacggtcaccgtctcttctgatcaggagcccaaatcttctgacaaaactcacacatccccaccgtccccagcacctgaac
tcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtg
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ccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaagga
gtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaacaatctccaaagccaaagggcagccccgagaac
cacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcc
cagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgac
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ggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtccccgggtaaatgatctaga
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FNPPTFGAGTKLELKDGGGSGGGGSGGGGSSQAYLQQSGAELVRPGASVKMSCK
ASGYTFTSYNMHWVKQTPRQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTVDKSSS
TAYMQLSSLTSEDSAVYFCARVVYYSNSYWYFDVWGTGTTVTVSSDQEPKSSDK
THTSPPSPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYV
DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIE
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cccagtctccagcaatcctgtctgcatctccaggggagaaggtcacaatgacttgcagggccagctcaagtgtaagttacatgcact
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ccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaagga
gtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaacaatctccaaagccaaagggcagccccgagaac
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sgsgsgtsysltisrveaedaatyycqqwsfnpptfgagtklelkdgggsggggsggggssqaylqqsgaelvrpgasvkmsc
kasgytftsynmhwvkqtprqglewigaiypgngdtsynqkfkgkatltvdkssstaymqlssltsedsavyfcarvvyysn
sywyfdvwgtgttvtvssdqepkssdkthtsppspapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnw
yvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemt
knqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfalyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqksl
slspgk
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ac
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cacagattataattcagcaattaaatccagactgagcatcagcagggacacctccaagagccaagttttcttaaaaatcaacagtctg
caaactgatgacacagccatgtattactgtgccagaatccactttgattactggggccaaggagtcatggtcacagtctcctctgatc
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gccccgcgagaagtacctgacttgggcatcccggcaggagcccagccagggcaccaccaccttcgctgtgaccagcatactgc
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agagagaaggaggaatgagagattgagaagggaaagtgtacgccctgtataaatcgatac
AA
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SSTPLTFGSGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSQVQLKEAGPGLVQPTQTLSLTCTV
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INSLQTDDTAMYYCARIHFDYWGQGVMVTVSSDQPVPSTPPTPSPSTPPTPSPSCC
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CGCYSVSSVLPGCAEPWNHGKTFTCTAAYPESKTPLTATLSKSGNTFRPEVHLLPP
PSEELALNELVTLTCLARGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYLTWASRQEPSQGTTT
FAVTSILRVAAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRLAGKPTHVNVSVVM
AEVDADPSNNLLPSWAITLISVNGIFVICCLTYCFAPRCRERRRNERLRRESVRPV
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gacctggcacccagcaaggggaccgtgaacctgacctggtcccgggccagtgggaagcctgtgaaccactccaccagaaagg
aggagaagcagcgcaatggcacgttaaccgtcacgtccaccctgccggtgggcacccgagactggatcgagggggagaccta
ccagtgcagggtgacccacccccacctgcccagggccctcatgcggtccacgaccaagaccagcggcccgcgtgctgccccg
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AA
人IgE Fc(CH2-CH3-CH4)ORF(氨基酸序列)(SEQ ID NO:174)
DHVCSRDFTPPTVKILQSSCDGGGHFPPTIQLLCLVSGYTPGTINITWLEDGQVMDV
DLSTASTTQEGELASTQSELTLSQKHWLSDRTYTCQVTYQGHTFEDSTKKCADSN
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GSGFFVFSRLEVTRAEWEQKDEFICRAVHEAASPSQTVQRAVSVNPGKADPS
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aagcttatggattttcaagtgcagattttcagcttcctgctaatcagtgcttcagtcataatgtccagaggagtcgacattgtgctcactc
agtctccaacaaccatagctgcatctccaggggagaaggtcaccatcacctgccgtgccagctccagtgtaagttacatgtactggt
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gtgggtctgggacctcttattctctcgcaatcaacaccatggagactgaagatgctgccacttattactgtcagcagtggagtagtact
ccgctcacgttcgggtctgggaccaagctggagatcaaacggggtggcggtggctcgggcggtggtgggtcgggtggcggcg
gatctcaggtgcagctgaaggaggcaggacctggcctggtgcaaccgacacagaccctgtccctcacatgcactgtctctgggtt
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caaactgatgacacagccatgtattactgtgccagaatccactttgattactggggccaaggagtcatggtcacagtctcctctgatc
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ttgtccaccgcctctaccacgcaggagggtgagctggcctccacacaaagcgagctcaccctcagccagaagcactggctgtca
gaccgcacctacacctgccaggtcacctatcaaggtcacacctttgaggacagcaccaagaagtgtgcagattccaacccgagag
gggtgagcgcctacctaagccggcccagcccgttcgacctgttcatccgcaagtcgcccacgatcacctgtctggtggtggacct
ggcacccagcaaggggaccgtgaacctgacctggtcccgggccagtgggaagcctgtgaaccactccaccagaaaggaggag
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cagggtgacccacccccacctgcccagggccctcatgcggtccacgaccaagaccagcggcccgcgtgctgccccggaagtct
atgcgtttgcgacgccggagtggccggggagccgggacaagcgcaccctcgcctgcctgatccagaacttcatgcctgaggac
atctcggtgcagtggctgcacaacgaggtgcagctcccggacgcccggcacagcacgacgcagccccgcaagaccaagggct
ccggcttcttcgtcttcagccgcctggaggtgaccagggccgaatgggagcagaaagatgagttcatctgccgtgcagtccatga
ggcagcgagcccctcacagaccgtccagcgagcggtgtctgtaaatcccggtaaagcggatccttcgaagctcccatcctgggc
cattaccttaatctcagtaaatggaatttttgtgatatgctgcctgacctactgctttgccccaagatgcagagagagaaggaggaatg
agagattgagaagggaaagtgtacgccctgtataaatcgata
1D8-scFv-人 IgE Fc(CH2-CH3-CH4)-CD80(氨基酸序列)(SEQ ID NO:176)
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QQKSGASPKLWIYDTSKLASGVPNRFSGSGSGTSYSLAINTMETEDAATYYCQQW
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RCRERRRNERLRRESVRPV
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aagcttgccgccatgaggttctctgctcagcttctggggctgcttgtgctctggatccctggatccactgcagatattgtgatgacgca
ggctgcattctccaatccagtcactcttggaacatcagcttccatctcctgcaggtctagtaagagtctcctacatagtaatggcatca
cttatttgtattggtatctgcagaagccaggccagtctcctcagctcctgatttatcagatgtccaaccttgcctcaggagtcccagaca
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aaaatgaacagtctgcaacctaatgacacagccatttattactgtgccagaaatgggggtgataactacccttattactatgctatgga
ctactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctctgatcagccagttccctcaactccacctaccccatctccctcaactccacct
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cacgtgcacactgaccggcctgagagatgcctcaggtgtcaccttcacctggacgccctcaagtgggaagagcgctgttcaagga
ccacctgaccgtgacctctgtggctgctacagcgtgtccagtgtcctgccgggctgtgccgagccatggaaccatgggaagacctt
cacttgcactgctgcctaccccgagtccaagaccccgctaaccgccaccctctcaaaatccggaaacacattccggcccgaggtc
cacctgctgccgccgccgtcggaggagctggccctgaacgagctggtgacgctgacgtgcctggcacgtggcttcagccccaa
ggatgtgctggttcgctggctgcaggggtcacaggagctgccccgcgagaagtacctgacttgggcatcccggcaggagccca
gccagggcaccaccaccttcgctgtgaccagcatactgcgcgtggcagccgaggactggaagaagggggacaccttctcctgc
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gtgatatgctgcctgacctactgctttgccccaagatgcagagagagaaggaggaatgagagattgagaagggaaagtgtacgcc
ctgtataaatcgatac
5B9-IgAH IgA-T4-CD80(氨基酸序列)(SEQ ID NO:178)
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RRNERLRRESVRPV
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ggctgcattctccaatccagtcactcttggaacatcagcttccatctcctgcaggtctagtaagagtctcctacatagtaatggcatca
cttatttgtattggtatctgcagaagccaggccagtctcctcagctcctgatttatcagatgtccaaccttgcctcaggagtcccagaca
ggttcagtagcagtgggtcaggaactgatttcacactgagaatcagcagagtggaggctgaggatgtgggtgtttattactgtgctc
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cgggtggcggcggatcgtcacaggtgcagctgaagcagtcaggacctggcctagtgcagtcctcacagagcctgtccatcacct
gcacagtctctggtttctcattaactacctatgctgtacactgggttcgccagtctccaggaaagggtctggagtggctgggagtgat
atggagtggtggaatcacagactataatgcagctttcatatccagactgagcatcaccaaggacgattccaagagccaagttttcttt
aaaatgaacagtctgcaacctaatgacacagccatttattactgtgccagaaatgggggtgataactacccttattactatgctatgga
ctactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctctgatcacgtctgctccagggacttcaccccgcccaccgtgaagatcttaca
gtcgtcctgcgacggcggcgggcacttccccccgaccatccagctcctgtgcctcgtctctgggtacaccccagggactatcaac
atcacctggctggaggacgggcaggtcatggacgtggacttgtccaccgcctctaccacgcaggagggtgagctggcctccaca
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aggacagcaccaagaagtgtgcagattccaacccgagaggggtgagcgcctacctaagccggcccagcccgttcgacctgttca
tccgcaagtcgcccacgatcacctgtctggtggtggacctggcacccagcaaggggaccgtgaacctgacctggtcccgggcca
gtgggaagcctgtgaaccactccaccagaaaggaggagaagcagcgcaatggcacgttaaccgtcacgtccaccctgccggtg
ggcacccgagactggatcgagggggagacctaccagtgcagggtgacccacccccacctgcccagggccctcatgcggtcca
cgaccaagaccagcggcccgcgtgctgccccggaagtctatgcgtttgcgacgccggagtggccggggagccgggacaagc
gcaccctcgcctgcctgatccagaacttcatgcctgaggacatctcggtgcagtggctgcacaacgaggtgcagctcccggacgc
ccggcacagcacgacgcagccccgcaagaccaagggctccggcttcttcgtcttcagccgcctggaggtgaccagggccgaat
gggagcagaaagatgagttcatctgccgtgcagtccatgaggcagcgagcccctcacagaccgtccagcgagcggtgtctgtaa
atcccggtaaagcggatccttcgaagctcccatcctgggccattaccttaatctcagtaaatggaatttttgtgatatgctgcctgacct
actgctttgccccaagatgcagagagagaaggaggaatgagagattgagaagggaaagtgtacgccctgtataaatcgata
5B9-scFv-人IgE Fc(CH2-CH3-CH4)-CD80(氨基酸序列)(SEQ ID NO:180)
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LYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSSSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYC
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NGIFVICCLTYCFAPRCRERRRNERLRRESVRPV
2e12-scFv-IgAH IgA-T4-CD80(核苷酸序列)(SEQ ID NO:181)
aagcttatggattttcaagtgcagattttcagcttcctgctaatcagtgcttcagtcataatgtccagaggagtcgacattgtgctcaccc
aatctccagcttctttggctgtgtctctaggtcagagagccaccatctcctgcagagccagtgaaagtgttgaatattatgtcacaagtt
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aggtttagtggcagtgggtctgggacagacttcagcctcaacatccatcctgtggaggaggatgatattgcaatgtatttctgtcagc
aaagtaggaaggttccttggacgttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaacggggtggcggtggctcgggcggaggtggg
tcgggtggcggcggatctcaggtgcagctgaaggagtcaggacctggcctggtggcgccctcacagagcctgtccatcacatgc
accgtctcagggttctcattaaccggctatggtgtaaactgggttcgccagcctccaggaaagggtctggagtggctgggaatgat
atggggtgatggaagcacagactataattcagctctcaaatccagactgagcatcaccaaggacaactccaagagccaagttttctt
aaaaatgaacagtctgcaaactgatgacacagccagatactactgtgccagagatggttatagtaactttcattactatgttatggact
actggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctcagatcagccagttccctcaactccacctaccccatctccctcaactccaccta
ccccatctccctcatgctgccacccccgactgtcactgcaccgaccggccctcgaggacctgctcttaggttcagaagcgatcctc
acgtgcacactgaccggcctgagagatgcctcaggtgtcaccttcacctggacgccctcaagtgggaagagcgctgttcaaggac
cacctgaccgtgacctctgtggctgctacagcgtgtccagtgtcctgccgggctgtgccgagccatggaaccatgggaagaccttc
acttgcactgctgcctaccccgagtccaagaccccgctaaccgccaccctctcaaaatccggaaacacattccggcccgaggtcc
acctgctgccgccgccgtcggaggagctggccctgaacgagctggtgacgctgacgtgcctggcacgtggcttcagccccaag
gatgtgctggttcgctggctgcaggggtcacaggagctgccccgcgagaagtacOtgacttgggcatcccggcaggagcccag
ccagggcaccaccaccttcgctgtgaccagcatactgcgcgtggcagccgaggactggaagaagggggacaccttctcctgcat
ggtgggccacgaggccctgccgctggccttcacacagaagaccatcgaccgcttggcggggtaacccacccatgtcaatgtgtct
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gtataaatcgatac
2e12-scFv-IgAH IgA-T4-CD80(氨基酸序列)(SEQ ID NO:182)
MDFQVQIFSFLLISASVIMSRGVDIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVEYYVTS
LMQWYQQKPGQPPKLLISAASNVESGVPARFSGSGSGTDFSLNIHPVEEDDIAMYF
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KSQVFLKMNSLQTDDTARYYCARDGYSNFHYYVMDYWGQGTSVTVSSDQPVPS
TPPTPSPSTPPTPSPSCCHPRLSLHRPALEDLLLGSEAILTCTLTGLRDASGVTFTWTP
SSGKSAVQGPPDRDLCGCYSVSSVLPGCAEPWNHGKTFTCTAAYPESKTPLTATLS
KSGNTFRPEVHLLPPPSEELALNELVTLTCLARGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKY
LTWASRQEPSQGTTTFAVTSILRVAAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAFTQKTIDR
LAGKPTHVNVSVVMAEVDADPSNNLLPSWAITLISVNGIFVICCLTYCFAPRCRER
RRNERLRRESVRPV
2e12-scFv-人IgE Fc(CH2-CH3-CH4)-CD80(核苷酸序列)(SEQ ID NO:183)
aagcttatggattttcaagtgcagattttcagcttcctgctaatcagtgcttcagtcataatgtccagaggagtcgacattgtgctcaccc
aatctccagcttctttggctgtgtctctaggtcagagagccaccatctcctgcagagccagtgaaagtgttgaatattatgtcacaagtt
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aggtttagtggcagtgggtctgggacagacttcagcctcaacatccatcctgtggaggaggatgatattgcaatgtatttctgtcagc
aaagtaggaaggttccttggacgttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaacggggtggcggtggctcgggcggaggtggg
tcgggtggcggcggatctcaggtgcagctgaaggagtcaggacctggcctggtggcgccctcacagagcctgtccatcacatgc
accgtctcagggttctcattaaccggctatggtgtaaactgggttcgccagcctccaggaaagggtctggagtggctgggaatgat
atggggtgatggaagcacagactataattcagctctcaaatccagactgagcatcaccaaggacaactccaagagccaagttttctt
aaaaatgaacagtctgcaaactgatgacacagccagatactactgtgccagagatggttatagtaactttcattactatgttatggact
actggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctcagatcacgtctgctccagggacttcaccccgcccaccgtgaagatcttacag
tcgtcctgcgacggcggcgggcacttccccccgaccatccagctcctgtgcctcgtctctgggtacaccccagggactatcaacat
cacctggctggaggacgggcaggtcatggacgtggacttgtccaccgcctctaccacgcaggagggtgagctggcctccacac
aaagcgagctcaccctcagccagaagcactggctgtcagaccgcacctacacctgccaggtcacctatcaaggtcacacctttga
ggacagcaccaagaagtgtgcagattccaacccgagaggggtgagcgcctacctaagccggcccagcccgttcgacctgttcat
ccgcaagtcgcccacgatcacctgtctggtggtggacctggcacccagcaaggggaccgtgaacctgacctggtcccgggcca
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ggcacccgagactggatcgagggggagacctaccagtgcagggtgacccacccccacctgcccagggccctcatgcggtcca
cgaccaagaccagcggcccgcgtgctgccccggaagtctatgcgtttgcgacgccggagtggccggggagccgggacaagc
gcaccctcgcctgcctgatccagaacttcatgcctgaggacatctcggtgcagtggctgcacaacgaggtgcagctcccggacgc
ccggcacagcacgacgcagccccgcaagaccaagggctccggcttcttcgtcttcagccgcctggaggtgaccagggccgaat
gggagcagaaagatgagttcatctgccgtgcagtccatgaggcagcgagcccctcacagaccgtccagcgagcggtgtctgtaa
atcccggtaaagcggatccttcgaagctcccatcctgggccattaccttaatctcagtaaatggaatttttgtgatatgctgcctgacct
actgctttgccccaagatgcagagagagaaggaggaatgagagattgagaagggaaagtgtacgccctgtataaatcgata
2e12-scFv-人IgE Fc(CH2-CH3-CH4)-CD80(氨基酸序列)(SEQ ID NO:184)
MDFQVQIFSFLLISASVIMSRGVDIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVEYYVTS
LMQWYQQKPGQPPKLLISAASNVESGVPARFSGSGSGTDFSLNIHPVEEDDIAMYF
CQQSRKVPWTFGGGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSQVQLXESGPGLVAPSQSLS
ITCTVSGFSLTGYGVNWVRQPPGKGLEWLGMIWGDGSTDYNSALKSRLSITKDNS
KSQVFLKMNSLQTDDTARYYCARDGYSNFHYYVMDYWGQGTSVTVSSDHVCSR
DFTPPTVKILQSSCDGGGHFPPTIQLLCLVSGYTPGTINITWLEDGQVMDVDLSTAS
TTQEGELASTQSELTLSQKHWLSDRTYTCQVTYQGHTFEDSTKKCADSNPRGVSA
YLSRPSPFDLFIRKSPTITCLVVDLAPSKGTVNLTWSRASGKPVNHSTRKEEKQRNG
TLTVTSTLPVGTRDWIEGETYQCRVTHPHLPRALMRSTTKTSGPRAAPEVYAFATP
EWPGSRDKRTLACLIQNFMPEDISVQWLHNEVQLPDARHSTTQPRKTKGSGFFVFS
RL EVTRAEWEQKDEFICRAVHEAASPSQTVQRAVSVNPGKADPSKLPSWAITLISV
NGIFVICCLTYCFAPRCRERRRNERLRRESVRPV
500A2 scFv(核苷酸序列)(SEQ ID NO:185)
atgttgtatacatctcagctccttgggcttttactcttctggatttcagcctccagaagtgacatagtgctgactcagactccagccactc
tgtctctaattcctggagaaagagtcacaatgacctgtaagaccagtcagaatattggcacaatcttacactggtatcaccaaaaacc
aaaggaggctccaagggctctcatcaagtatgcttcgcagtccattcctgggatcccctccagattcagtggcagtggttcggaaac
agatttcactctcagcatcaataacctggagcctgatgatatcggaatttattactgtcaacaaagtagaagctggcctgtcacgttcg
gtcctggcaccaagctggagataaaacggggtggcggtggctcgggcggaggtgggtcgggtggcggcggatctcaggtcaa
gctgcagcagtccggttctgaactagggaaacctggggcctcagtgaaactgtcctgcaagacttcaggctacatattcacagatc
actatatttcttgggtgaaacagaagcctggagaaagcctgcagtggataggaaatgtttatggtggaaatggtggtacaagctaca
atcaaaaattccagggcaaggccacactgactgtagataaaatctctagcacagcctacatggaactcagcagcctgacatctgag
gattctgccatctattactgtgcaagaaggccggtagcgacgggccatgctatggactactggggtcaggggatccaagttaccgt
ctcctctgatc
500A2 scFV(氨基酸序列)(SEQ ID NO:186)
MLYTSQLLGLLLFWISASRSDIVLTQTPATLSLIPGERVTMTCKTSQNIGTILHWYH
QKPKEAPRALIKYASQSIPGIPSRFSGSGSETDFTLSINNLEPDDIGIYYCQQSRSWPV
TFGPGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSQVKLQQSGSELGKPGASVKLSCKTSGYIF
TDHYISWVKQKPGESLQWIGNVYGGNGGTSYNQKFQGKATLTVDKISSTAYMEL
SSLTSEDSAIYYCARRPVATGHAMDYWGQGIQVTVSSD
NT
5’寡核苷酸:
名称:IgGWT3(SEQ ID NO:187)
GTTGTTTTCGAAGGATCCGCTTTACCCGGAGACAGGGAGAGGCTCTT
NT
3’寡核苷酸:
名称:hIgGWT5(SEQ ID NO:188)
GTTGTTAGATCTGGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATG
NT
5’寡核苷酸:
名称:FADD5(SEQ ID NO:189)
序列
GTTGTGGATCCTTCGAACCCGTTCCTGGTGCTGCTGCACTCGGTGTCG
NT
3’寡核苷酸:
名称:FADD3(SEQ ID NO:190)
序列
GTTGTTATCGATCTCGAGTTATCAGGACGCTTCGGAGGTAGATGCGTC
NT
FADD-CSSCFV(核苷酸序列)(SEQ ID NO:191)
gtggatccttcgaacccgttcctggtgctgctgcactcggtgtcgtccagcctgtcgagcagcgagctgaccgagctcaagttccta
tgcctcgggcgcgtgggcaagcgcaagctggagcgcgtgcagagcggcctagacctcttctccatgctgctggagcagaacga
cctggagcccgggcacaccgagctcctgcgcgagctgctcgcctccctgcggcgccacgacctgctgcggcgcgtcgacgact
tcgaggcgggggcggcggccggggccgcgcctggggaagaagacctgtgtgcagcatttaacgtcatatgtgataatgtgggg
aaagattggagaaggctggctcgtcagctcaaagtctcagacaccaagatcgacagcatcgaggacagatacccccgcaacctg
acagagcgtgtgcgggagtcactgagaatctggaagaacacagagaaggagaacgcaacagtggcccacctggtgggggctc
tcaggtcctgccagatgaacctggtggctgacctggtacaagaggttcagcaggcccgtgacctccagaacaggagtggggcca
tgtccccgatgtcatggaactcagacgcatctacctccgaagcgtcctgataactcgagatcgataacaac
FADD-CSSCFV(氨基酸序列)(SEQ ID NO:192)
VDPSNPFLVLLHSVSSSLSSSELTELKFLCLGRVGKRKLERVQSGLDLFSMLLEQND
LEPGHTELLRELLASLRRHDLLRRVDDFEAGAAAGAAPGEEDLCAAFNVICDNVG
KDWRRLARQLKVSDTKIDSIEDRYPRNLTERVRESLRIWKNTEKENATVAHLVGA
LRSCQMNLVADLVQEVQQARDLQNRSGAMSPMSWNSDASTSEAS
HCD28tm5B(核苷酸序列)(SEQ ID NO:193)
GTTGTGGATCCTCCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGTCCTGGCTTGCTAT
AGCTTG
HCD28tm3S(核苷酸序列)(SEQ ID NO:194)
GTTGTTTCGAACCCAGAAAATAATAAAGGCCACTGTTACTAGCAAGCTATAGC
AAGCCAG
HCD28tm5’(核苷酸序列)(SEQ ID NO:195)
GTTGTGGATCCTCCCTTTTGGGTGCTGGTGGT
HCD28tm3’(核苷酸序列)(SEQ ID NO:196)
GTTGTTTCGAACCCAGAAAATAATAAAGGCCAC
HCD80tm5’(核苷酸序列)(SEQ ID NO:197)
GTTGTGGATCCTCCTGCTCCCATCCTGG
HCD80tm3’(核苷酸序列)(SEQ ID NO:198)
GTTGTTTCGAACGGCAAAGCAGTAGGTCAGGC
MFADD5BB(核苷酸序列)(SEQ ID NO:199)
GTTGTGGATCCTTCGAACCCATTCCTGGTGCTGCTGCACTCGCTG
MFADD3XC(核苷酸序列)(SEQ ID NO:200)
GTTGTTATCGATCTCGAGTCAGGGTGTTTCTGAGGAAGACAC
鼠FADD核苷酸序列(全长,但是没有侧翼-Ig或跨膜序列)
(核苷酸序列)(SEQ ID NO:201)
gtggatccttcgaacatggacccattcctggtgctgctgcactcgctgtccggcagcctgtcgggcaacgatctgatggagctcaa
gttcttgtgccgcgagcgcgtgagcaaacgaaagctggagcgcgtgcagagtggcctggacctgttcacggtgctgctggagca
gaacgacctggagcgcgggcacaccgggctgctgcgcgagttgctggcctcgctgcgccgacacgatctactgcagcgcctgg
acgacttcgaggcggggacggcgaccgctgcgcccccgggggaggcagatctgcaggtggcatttgacattgtgtgtgacaatg
tggggagagactggaaaagactggcccgcgagctgaaggtgtctgaggccaagatggatgggattgaggagaagtacccccg
aagtctgagtgagcgggtaagggagagtctgaaagtctggaagaatgctgagaagaagaacgcctcggtggccggactggtca
aggcgctgcggacctgcaggctgaatctggtggctgacctggtggaagaagcccaggaatctgtgagcaagagtgagaatatgt
ccccagtactaagggattcaactgtgtcttcctcagaaacaccctgactcgagatcgat
鼠FADD(核苷酸序列)(SEQ ID NO:202)
VDPSNMDPFLVLLHSLSGSLSGNDLMELKFLCRERVSKRKLERVQSGLDLFTVLLE
QNDLERGHTGLLRELLASLRRHDLLQRLDDFEAGTATAAPPGEADLQVAFDIVCD
NVGRDWKRLARELKVSEAKMDGIEEKYPRSLSERVRESLKVWKNAEKKNASVA
GLVKALRTCRLNLVADLVEEAQESVSKSENMSPVLRDSTVSSSETP
MCASP3-5(核苷酸序列)(SEQ ID NO:203)
GTTGTGGATCCTTCGAACATGGAGAACAACAAAACCTCAGTGGATTCA
MCASP3-3(核苷酸序列)(SEQ ID NO:204)
GTTGTTATCGATCTCGAGCTAGTGATAAAAGTACAGTTCTTTCGT
MCASP8-5(核苷酸序列)(SEQ ID NO:205)
GTTGTTTCGAACATGGATTTCCAGAGTTGTCTTTATGCTATTGCTG
MCASP8-3(核苷酸序列)(SEQ ID NO:206)
GTTGTTATCGATCTCGAGTCATTAGGGAGGGAAGAAGAGCTTCTTCCG
hcasp3-5(核苷酸序列)(SEQ ID NO:207)
GTTGTGGATCCTTCGAACATGGAGAACACTGAAAACTCAGTGGAT
hcasp3-3(核苷酸序列)(SEQ ID NO:208)
GTTGTTATCGATCTCGAGTTAGTGATAAAAATAGAGTTCTTTTGTGAG
hcasp8-5(核苷酸序列)(SEQ ID NO:209)
GTTGTGGATCCTTCGAACATGGACTTCAGCAGAAATCTTTATGAT
hcasp8-3(核苷酸序列)(SEQ ID NO:210)
GTTGTTATCGATGCATGCTCAATCAGAAGGGAAGACAAGTTTTTTTCT
1.具有可变VHL11突变的2H7 scFv:(SEQ ID NO:211)
核苷酸序列
Aagcttgccgccatggattttcaagtgcagattttcagcttcctgctaatcagtgcttcagtcataattgccagaggacaaattgttctc
tcccagtctccagcaatcctgtctgcatctccaggggagaaggtcacaatgacttgcagggccagctcaagtgtaagttacatgcac
tggtaccagcagaagccaggatcctcccccaaaccctggatttatgccccatccaacctggcttctggagtccctgctcgcttcagt
ggcagtgggtctgggacctcttactctctcacaatcagcagagtggaggctgaagatgctgccacttattactgccagcagtggagt
tttaacccacccacgttcggtgctgggaccaagctggagctgaaagatggcggtggctcgggcggtggtggatctggaggaggt
gggagctctcaggcttatctacagcagtctggggctgag(下列的一个:tcn,acn,gan,can,aan,
cgn,agn)
gtgaggcctggggcctcagtgaagatgtcctgcaaggcttctggctacacatttaccagttacaatatgcactgggtaaagcagaca
cctagacagggcctggaatggattggagctatttatccaggaaatggtgatacttcctacaatcagaagttcaagggcaaggccac
actgactgtagacaaatcctccagcacagcctacatgcagctcagcagcctgacatctgaagactctgcggtctatttctgtgcaag
agtggtgtactatagtaactcttactggtacttcgatgtctggggcacagggaccacggtcaccgtctcttctgatcag
氨基酸序列(SEQ ID NO:212)
MDFQVQIFSFLLISASVIIARGQIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYMHWY
QQKPGSSPKPWIYAPSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWS
FNPPTFGAGTKLELKDGGGSGGGGSGGGGSSQAYLQQSGAE(下列的一个:
S,T,D,E,Q,N,R,K,H)
VRPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPRQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFK
GKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARVVYYSNSYWYFDVWGTGTTVT
VSSDQ
2.VHL11缺失(SEQ ID NO:213)
核苷酸序列:
Aagcttgccgccatggattttcaagtgcagattttcagcttcctgctaatcagtgcttcagtcataattgccagaggacaaattgttctc
tcccagtctccagcaatcctgtctgcatctccaggggagaaggtcacaatgacttgcagggccagctcaagtgtaagttacatgcac
tggtaccagcagaagccaggatcctcccccaaaccctggatttatgccccatccaacctggcttctggagtccctgctcgcttcagt
ggcagtgggtctgggacctcttactctctcacaatcagcagagtggaggctgaagatgctgccacttattactgccagcagtggagt
tttaacccacccacgttcggtgctgggaccaagctggagctgaaagatggcggtggctcgggcggtggtggatctggaggaggt
gggagctctcaggcttatctacagcagtctggggctgaggtgaggcctggggcctcagtgaagatgtcctgcaaggcttctggct
acacatttaccagttacaatatgcactgggtaaagcagacacctagacagggcctggaatggattggagctatttatccaggaaatg
gtgatacttcctacaatcagaagttcaagggcaaggccacactgactgtagacaaatcctccagcacagcctacatgcagctcagc
agcctgacatctgaagactctgcggtctatttctgtgcaagagtggtgtactatagtaactcttactggtacttcgatgtctggggcaca
gggaccacggtcaccgtctcttctgatcag
氨基酸序列:(SEQ ID NO:214)
MDFQVQIFSFLLISASVIIARGQIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYMHWY
QQKPGSSPKPWIYAPSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWS
FNPPTFGAGTKLELKDGGGSGGGGSGGGGSSQAYLQQSGAEVRPGASVKMSCKA
SGYTFTSYNMHWVKQTPRQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTVDKSSST
AYMQLSSLTSEDSAVYFCARVVYYSNSYWYFDVWGTGTTVTVSSDQ
3.具有可变突变的2H7 VL L106
核苷酸序列:(SEQ ID NO:215)
aagcttgccgccatggattttcaagtgcagattttcagcttcctgctaatcagtgcttcagtcataattgccagaggacaaattgttctct
cccagtctccagcaatcctgtctgcatctccaggggagaaggtcacaatgacttgcagggccagctcaagtgtaagttacatgcact
ggtaccagcagaagccaggatcctcccccaaaccctggatttatgccccatccaacctggcttctggagtccctgctcgcttcagtg
gcagtgggtctgggacctcttactctctcacaatcagcagagtggaggctgaagatgctgccacttattactgccagcagtggagttt
taacccacccacgttcggtgctgggaccaagctggag(tcn,agn,aan,cgn,can,gan,和这些密码
子的非自然衍生物)aaagatggcggtggctcgggcggtggtggatctggaggaggtgggagctc
氨基酸序列:(SEQ ID NO:216)
MDFQVQIFSFLLISASVIIARGQIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYMHWY
QQKPGSSPKPWIYAPSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWS
FNPPTFGAGTKLE(S,T,R,K,H,Q,N,D,E,和位置106的这些氨基酸
的非自然衍生物)KDGGGSGGGGSGGGGSS
4.VL L106缺失(SEQ ID NO:217)
核苷酸序列:
Aagcttgccgccatggattttcaagtgcagattttcagcttcctgctaatcagtgcttcagtcataattgccagaggacaaattgttctc
tcccagtctccagcaatcctgtctgcatctccaggggagaaggtcacaatgacttgcagggccagctcaagtgtaagttacatgcac
tggtaccagcagaagccaggatcctcccccaaaccctggatttatgccccatccaacctggcttctggagtccctgctcgcttcagt
ggcagtgggtctgggacctcttactctctcacaatcagcagagtggaggctgaagatgctgccacttattactgccagcagtggagt
tttaacccacccacgttcggtgctgggaccaagctggagaaagatggcggtggctcgggcggtggtggatctggaggaggtgg
gagctc
氨基酸序列:(SEQ ID NO:218)
MDFQVQIFSFLLISASVIIARGQIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYMHWY
QQKPGSSPKPWIYAPSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWS
FNPPTFGAGTKLEKDGGGSGGGGSGGGGSS
5.IgE CH3 CH4(SEQ ID NO:219)
核苷酸序列:
tccaacccgagaggggtgagcgcctacctaagccggcccagcccgttcgacctgttcatccgcaagtcgcccacgatcacctgtc
tggtggtggacctggcacccagcaaggggaccgtgaacctgacctggtcccgggccagtgggaagcctgtgaaccactccacc
agaaaggaggagaagcagcgcaatggcacgttaaccgtcacgtccaccctgccggtgggcacccgagactggatcgaggggg
agacctaccagtgcagggtgacccacccccacctgcccagggccctcatgcggtccacgaccaagaccagcggcccgcgtgct
gccccggaagtctatgcgtttgcgacgccggagtggccggggagccgggacaagcgcaccctcgcctgcctgatccagaactt
catgcctgaggacatctcggtgcagtggctgcacaacgaggtgcagctcccggacgcccggcacagcacgacgcagccccgc
aagaccaagggctccggcttcttcgtcttcagccgcctggaggtgaccagggccgaatgggagcagaaagatgagttcatctgcc
gtgcagtccatgaggcagcgagcccctcacagaccgtccagcgagcggtgtctgtaaatcccggtaaatgataatctagaa
氨基酸序列:(SEQ ID NO:220)
SNPRGVSAYLSRPSPFDLFIRKSPTITCLVVDLAPSKGTVNLTWSRASGKPVNHSTR
KEEKQRNGTLTVTSTLPVGTRDWIEGETYQCRVTHPHLPRALMRSTTKTSGPRAA
PEVYAFATPEWPGSRDKRTLACLIQNFMPEDISVQWLHNEVQLPDARHSTTQPRK
TKGSGFFVFSRLEVTRAEWEQKDEFICRAVHEAASPSQTVQRAVSVNPGK
6.hIgG1H/IgE WCH3 WCH4(SEQ ID NO:221)
核苷酸序列:
tgatcaggagcccaaatcttctgacaaaactcacacatccccaccgtccccagcatccaacccgagaggggtgagcgcctaccta
agccggcccagcccgttcgacctgttcatccgcaagtcgcccacgatcacctgtctggtggtggacctggcacccagcaagggg
accgtgaacctgacctggtcccgggccagtgggaagcctgtgaaccactccaccagaaaggaggagaagcagcgcaatggca
cgttaaccgtcacgtccaccctgccggtgggcacccgagactggatcgagggggagacctaccagtgcagggtgacccacccc
cacctgcccagggccctcatgcggtccacgaccaagaccagcggcccgcgtgctgccccggaagtctatgcgtttgcgacgcc
ggagtggccggggagccgggacaagcgcaccctcgcctgcctgatccagaacttcatgcctgaggacatctcggtgcagtggct
gcacaacgaggtgcagctcccggacgcccggcacagcacgacgcagccccgcaagaccaagggctccggcttcttcgtcttca
gccgcctggaggtgaccagggccgaatgggagcagaaagatgagttcatctgccgtgcagtccatgaggcagcgagcccctca
cagaccgtccagcgagcggtgtctgtaaatcccggtaaatgataatctagaa
氨基酸序列:(SEQ ID NO:222)
DQEPKSSDKTHTSPPSPASNPRGVSAYLSRPSPFDLFIRKSPTITCLVVDLAPSKGTV
NLTWSRASGKPVNHSTRKEEKQRNGTLTVTSTLPVGTRDWIEGETYQCRVTHPHL
PRALMRSTTKTSGPRAAPEVYAFATPEWPGSRDKRTLACLIQNFMPEDISVQWLH
NEVQLPDARHSTTQPRKTKGSGFFVFSRLEVTRAEWEQKDEFICRAVHEAASPSQT
VQRAVSVNPGK
7.IgE WCH2 WCH3 WCH4(SEQ ID NO:223)
核苷酸序列:
Tgatcacgtctgctccagggacttcaccccgcccaccgtgaagatcttacagtcgtcctgcgacggcggcgggcacttccccccg
accatccagctcctgtgcctcgtctctgggtacaccccagggactatcaacatcacctggctggaggacgggcaggtcatggacg
tggacttgtccaccgcctctaccacgcaggagggtgagctggcctccacacaaagcgagctcaccctcagccagaagcactggc
tgtcagaccgcacctacacctgccaggtcacctatcaaggtcacacctttgaggacagcaccaagaagtgtgcagattccaaccc
gagaggggtgagcgcctacctaagccggcccagcccgttcgacctgttcatccgcaagtcgcccacgatcacctgtctggtggtg
gacctggcacccagcaaggggaccgtgaacctgacctggtcccgggccagtgggaagcctgtgaaccactccaccagaaagg
aggagaagcagcgcaatggcacgttaaccgtcacgtccaccctgccggtgggcacccgagactggatcgagggggagaccta
ccagtgcagggtgacccacccccacctgcccagggccctcatgcggtccacgaccaagaccagcggcccgcgtgctgccccg
gaagtctatgcgtttgcgacgccggagtggccggggagccgggacaagcgcaccctcgcctgcctgatccagaacttcatgcct
gaggacatctcggtgcagtggctgcacaacgaggtgcagctcccggacgcccggcacagcacgacgcagccccgcaagacc
aagggctccggcttcttcgtcttcagccgcctggaggtgaccagggccgaatgggagcagaaagatgagttcatctgccgtgcag
tccatgaggcagcgagcccctcacagaccgtccagcgagcggtgtctgtaaatcccggtaaatgataatctaga
氨基酸序列:(SEQ ID NO:224)
DHVCSRDFTPPTVKILQSSCDGGGHFPPTIQLLCLVSGYTPGTINITWLEDGQVMDV
DLSTASTTQEGELASTQSELTLSQKHWLSDRTYTCQVTYQGHTFEDSTKKCADSN
PRGVSAYLSRPSPFDLFIRKSPTITCLVVDLAPSKGTVNLTWSRASGKPVNHSTRKE
EKQRNGTLTVTSTLPVGTRDWIEGETYQCRVTHPHLPRALMRSTTKTSGPRAAPE
VYAFATPEWPGSRDKRTLACLIQNFMPEDISVQWLHNEVQLPDARHSTTQPRKTK
GSGFFVFSRLEVTRAEWEQKDEFICRAVHEAASPSQTVQRAVSVNPGK
8.hIgG1H/IgE CH3 CH4(ORF)(SEQ ID NO:225)
核苷酸序列:
tgatcaggagcccaaatcttctgacaaaactcacacatccccaccgtccccagcatccaacccgagaggggtgagcgcctaccta
agccggcccagcccgttcgacctgttcatccgcaagtcgcccacgatcacctgtctggtggtggacctggcacccagcaagggg
accgtgaacctgacctggtcccgggccagtgggaagcctgtgaaccactccaccagaaaggaggagaagcagcgcaatggca
cgttaaccgtcacgtccaccctgccggtgggcacccgagactggatcgagggggagacctaccagtgcagggtgacccacccc
cacctgcccagggccctcatgcggtccacgaccaagaccagcggcccgcgtgctgccccggaagtctatgcgtttgcgacgcc
ggagtggccggggagccgggacaagcgcaccctcgcctgcctgatccagaacttcatgcctgaggacatctcggtgcagtggct
gcacaacgaggtgcagctcccggacgcccggcacagcacgacgcagccccgcaagaccaagggctccggcttcttcgtcttca
gccgcctggaggtgaccagggccgaatgggagcagaaagatgagttcatctgccgtgcagtccatgaggcagcgagcccctca
cagaccgtccagcgagcggtgtctgtaaatcccggtaaagcggatccttcgaa
氨基酸序列:(SEQ ID NO:226)
DQEPKSSDKTHTSPPSPASNPRGVSAYLSRPSPFDLFIRKSPTITCLVVDLAPSKGTV
NLTWSRASGKPVNHSTRKEEKQRNGTLTVTSTLPVGTRDWIEGETYQCRVTHPHL
PRALMRSTTKTSGPRAAPEVYAFATPEWPGSRDKRTLACLIQNFMPEDISVQWLH
NEVQLPDARHSTTQPRKTKGSGFFVFSRLEVTRAEWEQKDEFICRAVHEAASPSQT
VQRAVSVNPGKSGSFE
9.2H7 VHL11S scFv hIgG1(SSS-S)H hIgE WCH3 WCH4(SEQ ID NO:227)
核苷酸序列:
aagcttgccgccatggattttcaagtgcagattttcagcttcctgctaatcagtgcttcagtcataattgccagaggacaaattgttctct
cccagtctccagcaatcctgtctgcatctccaggggagaaggtcacaatgacttgcagggccagctcaagtgtaagttacatgcact
ggtaccagcagaagccaggatcctcccccaaaccctggatttatgccccatccaacctggcttctggagtccctgctcgcttcagtg
gcagtgggtctgggacctcttactctctcacaatcagcagagtggaggctgaagatgctgccacttattactgccagcagtggagttt
taacccacccacgttcggtgctgggaccaagctggagctgaaagatggcggtggctcgggcggtggtggatctggaggaggtg
ggagctctcaggcttatctacagcagtctggggctgagtcggtgaggcctggggcctcagtgaagatgtcctgcaaggcttctggc
tacacatttaccagttacaatatgcactgggtaaagcagacacctagacagggcctggaatggattggagctatttatccaggaaat
ggtgatacttcctacaatcagaagttcaagggcaaggccacactgactgtagacaaatcctccagcacagcctacatgcagctcag
cagcctgacatctgaagactctgcggtctatttctgtgcaagagtggtgtactatagtaactcttactggtacttcgatgtctggggcac
agggaccacggtcaccgtctcttctgatcaggagcccaaatcttctgacaaaactcacacatccccaccgtcctcagcatccaacc
cgagaggggtgagcgcctacctaagccggcccagcccgttcgacctgttcatccgcaagtcgcccacgatcacctgtctggtggt
ggacctggcacccagcaaggggaccgtgaacctgacctggtcccgggccagtgggaagcctgtgaaccactccaccagaaag
gaggagaagcagcgcaatggcacgttaaccgtcacgtccaccctgccggtgggcacccgagactggatcgagggggagacct
accagtgcagggtgacccacccccacctgcccagggccctcatgcggtccacgaccaagaccagcggcccgcgtgctgcccc
ggaagtctatgcgtttgcgacgccggagtggccggggagccgggacaagcgcaccctcgcctgcctgatccagaacttcatgcc
tgaggacatctcggtgcagtggctgcacaacgaggtgcagctcccggacgcccggcacagcacgacgcagccccgcaagacc
aagggctccggcttcttcgtcttcagccgcctggaggtgaccagggccgaatgggagcagaaagatgagttcatctgccgtgcag
tccatgaggcagcgagcccctcacagaccgtccagcgagcggtgtctgtaaatcccggtaaatgataatctaga
氨基酸序列:(SEQ ID NO:228)
MDFQVQIFSFLLISASVIIARGQIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYMHWY
QQKPGSSPKPWIYAPSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWS
FNPPTFGAGTKLELKDGGGSGGGGSGGGGSSQAYLQQSGAESVRPGASVKMSCK
ASGYTFTSYNMHWVKQTPRQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTVDKSSS
TAYMQLSSLTSEDSAVYFCARVVYYSNSYWYFDVWGTGTTVTVSSDQEPKSSDK
THTSPPSSASNPRGVSAYLSRPSPFDLFIRKSPTITCLVVDLAPSKGTVNLTWSRASG
KPVNHSTRKEEKQRNGTLTVTSTLPVGTRDWIEGETYQCRVTHPHLPRALMRSTT
KTSGPRAAPEVYAFATPEWPGSRDKRTLACLIQNFMPEDISVQWLHNEVQLPDAR
HSTTQPRKTKGSGFFVFSRLEVTRAEWEQKDEFICRAVHEAASPSQTVQRAVSVNP
GK
10.2H7 VHL11S scFvhIgG1(SSS-P)H hIgE WCH3 WCH4(SEQ ID NO:229)
核苷酸序列:
aagcttgccgccatggattttcaagtgcagattttcagcttcctgctaatcagtgcttcagtcataattgccagaggacaaattgttctct
cccagtctccagcaatcctgtctgcatctccaggggagaaggtcacaatgacttgcagggccagctcaagtgtaagttacatgcact
ggtaccagcagaagccaggatcctcccccaaaccctggatttatgccccatccaacctggcttctggagtccctgctcgcttcagtg
gcagtgggtctgggacctcttactctctcacaatcagcagagtggaggctgaagatgctgccacttattactgccagcagtggagttt
taacccacccacgttcggtgctgggaccaagctggagctgaaagatggcggtggctcgggcggtggtggatctggaggaggtg
ggagctctcaggcttatctacagcagtctggggctgagtcggtgaggcctggggcctcagtgaagatgtcctgcaaggcttctggc
tacacatttaccagttacaatatgcactgggtaaagcagacacctagacagggcctggaatggattggagctatttatccaggaaat
ggtgatacttcctacaatcagaagttcaagggcaaggccacactgactgtagacaaatcctccagcacagcctacatgcagctcag
cagcctgacatctgaagactctgcggtctatttctgtgcaagagtggtgtactatagtaactcttactggtacttcgatgtctggggcac
agggaccacggtcaccgtctcttctgatcaggagcccaaatcttctgacaaaactcacacatccccaccgtccccagcatccaacc
cgagaggggtgagcgcctacctaagccggcccagcccgttcgacctgttcatccgcaagtcgcccacgatcacctgtctggtggt
ggacctggcacccagcaaggggaccgtgaacctgacctggtcccgggccagtgggaagcctgtgaaccactccaccagaaag
gaggagaagcagcgcaatggcacgttaaccgtcacgtccaccctgccggtgggcacccgagactggatcgagggggagacct
accagtgcagggtgacccacccccacctgcccagggccctcatgcggtccacgaccaagaccagcggcccgcgtgctgcccc
ggaagtctatgcgtttgcgacgccggagtggccggggagccgggacaagcgcaccctcgcctgcctgatccagaacttcatgcc
tgaggacatctcggtgcagtggctgcacaacgaggtgcagctcccggacgcccggcacagcacgacgcagccccgcaagacc
aagggctccggcttcttcgtcttcagccgcctggaggtgaccagggccgaatgggagcagaaagatgagttcatctgccgtgcag
tccatgaggcagcgagcccctcacagaccgtccagcgagcggtgtctgtaaatcccggtaaatgataatctaga
氨基酸序列:(SEQ ID NO:230)
MDFQVQIFSFLLISASVIIARGQIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYMHWY
QQKPGSSPKPWIYAPSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWS
FNPPTFGAGTKLELKDGGGSGGGGSGGGGSSQAYLQQSGAESVRPGASVKMSCK
ASGYTFTSYNMHWVKQTPRQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTVDKSSS
TAYMQLSSLTSEDSAVYFCARVVYYSNSYWYFDVWGTGTTVTVSSDQEPKSSDK
THTSPPSPASNPRGVSAYLSRPSPFDLFIRKSPTITCLVVDLAPSKGTVNLTWSRASG
KPVNHSTRKEEKQRNGTLTVTSTLPVGTRDWIEGETYQCRVTHPHLPRALMRSTT
KTSGPRAAPEVYAFATPEWPGSRDKRTLACLIQNFMPEDISVQWLHNEVQLPDAR
HSTTQPRKTKGSGFFVFSRLEVTRAEWEQKDEFICRAVHEAASPSQTVQRAVSVNP
GK
10.2H7 VL L106S(SEQ ID NO:231)
aagcttgccgccatggattttcaagtgcagattttcagcttcctgctaatcagtgcttcagtcataattgccagaggacaaattgttctct
cccagtctccagcaatcctgtctgcatctccaggggagaaggtcacaatgacttgcagggccagctcaagtgtaagttacatgcact
ggtaccagcagaagccaggatcctcccccaaaccctggatttatgccccatccaacctggcttctggagtccctgctcgcttcagtg
gcagtgggtctgggacctcttactctctcacaatcagcagagtggaggctgaagatgctgccacttattactgccagcagtggagttt
taacccacccacgttcggtgctgggaccaagctggagctgaaagatggcggtggctcgggcggtggtggatctggaggaggtg
ggagctc
氨基酸序列:(SEQ ID NO:232)
MDFQVQIFSFLLISASVILARGQIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYMHWY
QQKPGSSPKPWIYAPSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWS
FNPPTFGAGTKLESKDGGGSGGGGSGGGGSS
11.2H7 VL L106S scFv(SEQ ID NO:233)
核苷酸序列:
aagcttgccgccatggattttcaagtgcagattttcagcttcctgctaatcagtgcttcagtcataattgccagaggacaaattgttctct
cccagtctccagcaatcctgtctgcatctccaggggagaaggtcacaatgacttgcagggccagctcaagtgtaagttacatgcact
ggtaccagcagaagccaggatcctcccccaaaccctggatttatgccccatccaacctggcttctggagtccctgctcgcttcagtg
gcagtgggtctgggacctcttactctctcacaatcagcagagtggaggctgaagatgctgccacttattactgccagcagtggagttt
taacccacccacgttcggtgctgggaccaagctggagtctaaagatggcggtggctcgggcggtggtggatctggaggaggtg
ggagctctcaggcttatctacagcagtctggggctgagctggtgaggcctggggcctcagtgaagatgtcctgcaaggcttctggc
tacacatttaccagttacaatatgcactgggtaaagcagacacctagacagggcctggaatggattggagctatttatccaggaaat
ggtgatacttcctacaatcagaagttcaagggcaaggccacactgactgtagacaaatcctccagcacagcctacatgcagctcag
cagcctgacatctgaagactctgcggtctatttctgtgcaagagtggtgtactatagtaactcttactggtacttcgatgtctggggcac
agggaccacggtcaccgtctcttctgatcag
氨基酸序列:(SEQ ID NO:234)
MDFQVQIFSFLLISASVIIARGQIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYMHWY
QQKPGSSPKPWIYAPSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWS
FNPPTFGAGTKLESKDGGGSGGGGSGGGGSSQAYLQQSGAELVRPGASVKMSCK
ASGYTFTSYNMHWVKQTPRQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTVDKSSS
TAYMQLSSLTSEDSAVYFCARVVYYSNSYWYFDVWGTGTTVTVSSDQ
12.2H7 scFv VL L106S VHL11S scFv(SEQ ID NO:235)
核苷酸序列:
Aagcttgccgccatggattttcaagtgcagattttcagcttcctgctaatcagtgcttcagtcataattgccagaggacaaattgttctc
tcccagtctccagcaatcctgtctgcatctccaggggagaaggtcacaatgacttgcagggccagctcaagtgtaagttacatgcac
tggtaccagcagaagccaggatcctcccccaaaccctggatttatgccccatccaacctggcttctggagtccctgctcgcttcagt
ggcagtgggtctgggacctcttactctctcacaatcagcagagtggaggctgaagatgctgccacttattactgccagcagtggagt
tttaacccacccacgttcggtgctgggaccaagctggagtctaaagatggcggtggctcgggcggtggtggatctggaggaggt
gggagctctcaggcttatctacagcagtctggggctgagtcggtgaggcctggggcctcagtgaagatgtcctgcaaggcttctg
gctacacatttaccagttacaatatgcactgggtaaagcagacacctagacagggcctggaatggattggagctatttatccaggaa
atggtgatacttcctacaatcagaagttcaagggcaaggccacactgactgtagacaaatcctccagcacagcctacatgcagctc
agcagcctgacatctgaagactctgcggtctatttctgtgcaagagtggtgtactatagtaactcttactggtacttcgatgtctggggc
acagggaccacggtcaccgtctcttctgatcag
氨基酸序列:(SEQ ID NO:236)
MDFQVQIFSFLLISASVIIARGQIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYMHWY
QQKPGSSPKPWIYAPSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWS
FNPPTFGAGTKLESKDGGGSGGGGSGGGGSSQAYLQQSGAESVRPGASVKMSCK
ASGYTFTSYNMHWVKQTPRQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTVDKSSS
TAYMQLSSLTSEDSAVYFCARVVYYSNSYWYFDVWGTGTTVTVSSDQ
10.具有附着的限制位点的人IgD铰链接头:(SEQ ID NO:237)
核苷酸:
gtggatccaggttcgaagtctccaaaggcacaggcctcctccgtgcccactgcacaaccccaagcagagggcagcctcgccaa
ggcaaccacagccccagccaccacccgtaacacaggaagaggaggagaagagaagaagaaggagaaggagaaagaggaa
caagaagagagagagacaaagaccggtgcagtcgacg
氨基酸:(SEQ ID NO:238)
VDPGSKSPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNTGRGGEEKKKEKEKEEQ
EERETKTGAVD
自然的IgD铰链结构域的序列:(SEQ ID NO:239)
(包括半胱氨酸残基-我们在这些构建体的该残基前截短了铰链)
核苷酸:
gagtctccaaaggcacaggcctcctccgtgcccactgcacaaccccaagcagagggcagcctcgccaaggcaaccacagccc
cagccaccacccgtaacacaggaagaggaggagaagagaagaagaaggagaaggagaaagaggaacaagaagagagaga
gacaaagacaccagagtgtccgagccacacccagcctcttggcgtctacctgctaacccct
氨基酸序列:(SEQ ID NO:240)
ESPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNTGRGGEEKKKEKEKEEQEERET
KTPECPSHTQPLGVYLLTP
12.2H7 VH L11S(SEQ ID NO:241)
核苷酸序列:
caggcttatctacagcagtctggggctgagtcggtgaggcctggggcctcagtgaagatgtcctgcaaggcttctggctacacattt
accagttacaatatgcactgggtaaagcagacacctagacagggcctggaatggattggagctatttatccaggaaatggtgatact
tcctacaatca gaagttcaagggcaaggccacactgactgtagacaaatcctccagcacagcctacatgcagctcagcagcctga
catctgaagactctgcggtctatttctgtgcaagagtggtgtactatagtaactcttactggtacttcgatgtctggggcacagggacc
acggtcaccgtctcttct
氨基酸序列:(SEQ ID NO:242)
QAYLQQSGAESVRPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPRQGLEWIGAIYPG
NGDTSYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARVVYYSNSYWY
FDVWGTGTTVTVSS
13.2H7 VH L11S scFv(SEQ ID NO:243)
核苷酸序列:
aagcttgccgccatggattttcaagtgcagattttcagcttcctgctaatcagtgcttcagtcataattgccagaggacaaattgttctct
cccagtctccagcaatcctgtctgcatctccaggggagaaggtcacaatgacttgcagggccagctcaagtgtaagttacatgcact
ggtaccagcagaagccaggatcctcccccaaaccctggatttatgccccatccaacctggcttctggagtccctgctcgcttcagtg
gcagtgggtctgggacctcttactctctcacaatcagcagagtggaggctgaagatgctgccacttattactgccagcagtggagttt
taacccacccacgttcggtgctgggaccaagctggagctgaaagatggcggtggctcgggcggtggtggatctggaggaggtg
ggagctctcaggcttatctacagcagtctggggctgagtcggtgaggcctggggcctcagtgaagatgtcctgcaaggcttctggc
tacacatttaccagttacaatatgcactgggtaaagcagacacctagacagggcctggaatggattggagctatttatccaggaaat
ggtgatacttcctacaatcagaagttcaagggcaaggccacactgactgtagacaaatcctccagcacagcctacatgcagctcag
cagcctgacatctgaagactctgcggtctatttctgtgcaagagtggtgtactatagtaactcttactggtacttcgatgtctggggcac
agggaccacggtcaccgtctcttctgatcag
氨基酸序列:(SEQ ID NO:244)
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QQKPGSSPKPWIYAPSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWS
FNPPTFGAGTKLELKDGGGSGGGGSGGGGSSQAYLQQSGAESVRPGASVKMSCK
ASGYTFTSYNMHWVKQTPRQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTVDKSSS
TAYMQLSSLTSEDSAVYFCARVVYYSNSYWYFDVWGTGTTVTVSSDQ
14.2H7 scFv VH L11S hIgG1(CSC-S)H WCH2 WCH3(SEQ ID NO:245)
核苷酸序列:
aagcttgccgccatggattttcaagtgcagattttcagcttcctgctaatcagtgcttcagtcataattgccagaggacaaattgttctct
cccagtctccagcaatcctgtctgcatctccaggggagaaggtcacaatgacttgcagggccagctcaagtgtaagttacatgcact
ggtaccagcagaagccaggatcctcccccaaaccctggatttatgccccatccaacctggcttctggagtccctgctcgcttcagtg
gcagtgggtctgggacctcttactctctcacaatcagcagagtggaggctgaagatgctgccacttattactgccagcagtggagttt
taacccacccacgttcggtgctgggaccaagctggagctgaaagatggcggtggctcgggcggtggtggatctggaggaggtg
ggagctctcaggcttatctacagcagtctggggctgagtctgtgaggcctggggcctcagtgaagatgtcctgcaaggcttctggct
acacatttaccagttacaatatgcactgggtaaagcagacacctagacagggcctggaatggattggagctatttatccaggaaatg
gtgatacttcctacaatcagaagttcaagggcaaggccacacttgactgtagacaaatcctccagcacagcctacatgcagctcagc
agcctgacatctgaagactctgcggtctatttctgtgcaagagtggtgtactatagtaactcttactggtacttcgatgtctggggcaca
gggaccacggtcaccgtctcttctgatcaggagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatctccaccgtgctcagcacctgaactc
ctgggtggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggt
ggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagc
cgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggag
tacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaacaatctccaaagccaaagggcagccccgagaacc
acaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcca
agcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacg
gctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgag
gctctgcacaaccacctacacgcagaagagcctctccctgtctcccgggtaaatgatctaga
氨基酸序列:(SEQ ID NO:246)
MDFQVQIFSFLLISASVIIARGQIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYMHWY
QQKPGSSPKPWIYAPSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWS
FNPPTFGAGTKLELKDGGGSGGGGSGGGGSSQAYLQQSGAESVRPGASVKMSCK
ASGYTFTSYNMHWVKQTPRQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTVDKSSS
TAYMQLSSLTSEDSAVYFCARVVYYSNSYWYFDVWGTGTTVTVSSDQEPKSCDK
THTSPPCSAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY
VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPI
EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE
NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL
SPGK
15.2H7 scFv VH L11S IgE WCH2 WCH3 WCH4(SEQ ID NO:247)
核苷酸序列:
aagcttgccgccatggattttcaagtgcagattttcagcttcctgctaatcagtgcttcagtcataattgccagaggacaaattgttctct
cccagtctccagcaatcctgtctgcatctccaggggagaaggtcacaatgacttgcagggccagctcaagtgtaagttacatgcact
ggtaccagcagaagccaggatcctcccccaaaccctggatttatgccccatccaacctggcttcctggagtccctgctcgcttcagtg
gcagtgggtctgggacctcttactctctcacaatcagcagagtggaggctgaagatgctgccacttattactgccagcagtggagttt
taacccacccacgttcggtgctgggaccaagctggagctgaaagatggcggtggctcgggcggtggtggatctggaggaggtg
ggagctctcaggcttatctacagcagtctggggctgagtctgtgaggcctggggcctcagtgaagatgtcctgccaaggcttctggct
acacatttaccagttacaatatgcactgggtaaagcagacacctagacagggcctggaatggattggagctatttatccaggaaatg
gtgatacttcctacaatcagaagttcaagggccaaggccacactgactgtagacaaatcctccagcacagcctacatgccagctcagc
agcctgacatctgaagactctgcggtctatttctgtgccaagagtggtgtactatagtaactcttactggtacttcgatgtctggggcaca
gggaccacggtcaccgtctcttctgatcacgtctgctccagggacttcaccccgcccaccgtgaagatcttacagtcgtcctgcgac
ggcggcgggcacttccccccgaccatccagctcctgtgcctcgtctctgggtacaccccagggactatcaacatcacctggctgg
aggacgggcaggtccatggacgtggacttgtccaccgcctctaccacgcaggagggtgagctggcctccaccacaaagcgagctc
accctcagccagaagcactggctgtcagaccgcacctacacctgccaggtcacctatcaaggtcacacctttgaggacagcacca
agaagtgtgcagattccaacccgagaggggtgagcgcctacctaagccggcccagcccgttcgacctgttcatccgcaagtcgc
ccacgatcacctgtctggtggtggacctggcacccagcaaggggaccgtgaacctgacctggtcccgggccagtgggaagcct
gtgaaccactccaccagaaaggaggagaagcagcgcaatggcacgttaaccgtcacgtccaccctgccggtgggcacccgag
actggatcgagggggagacctaccagtgcagggtgacccacccccacctgcccagggccctcatgcggtccacgaccaagac
cagcggcccgcgtgctgccccggaagtctatgcgtttgcgacgccggagtggccggggagccgggacaagcgcaccctcgcc
tgcctgatccagaacttcatgcctgaggacatctcggtgcagtggctgcacaacgaggtgcagctcccggacgcccggcacagc
acgacgcagccccgcaagaccaagggctccggcttcttcgtcttcagccgcctggaggtgaccagggccgaatgggagcagaa
agatgagttcatctgccgtgcagtccatgaggcagcgagcccctcacagaccgtccagcgagcggtgtctgtaaatcccggtaaa
tgataatctaga
氨基酸序列:(SEQ ID NO:248)
MDFQVQIFSFLLISASVIIARGQIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYMHWY
QQKPGSSPKPWIYAPSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWS
FNPPTFGAGTKLELKDGGGSGGGGSGGGGSSQAYLQQSGAESVRPGASVKMSCK
ASGYTFTSYNMHWVKQTPRQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTVDKSSS
TAYMQLSSLTSEDSAVYFCARVVYYSNSYWYFDVWGTGTTVTVSSDHVCSRDFT
PPTVKILQSSCDGGGHFPPTIQLLCLVSGYTPGTINITWLEDGQVMDVDLSTASTTQ
EGELASTQSELTLSQKHWLSDRTYTCQVTYQGHTFEDSTKKCADSNPRGVSAYLS
RPSPFDLFIRKSPTITCLVVDLAPSKGTVNLTWSRASGKPVNHSTRKEEKQRNGTLT
VTSTL PVGTRDWIEGETYQCRVTHPHLPRALMRSTTKTSGPRAAPEVYAFATPEW
PGSRDKRTLACLIQNFMPEDISVQWLHNEVQLPDARHST TQPRKTKGSGFFVFSRL
EVTRAEWEQKDEFICRAVHEAASPSQTVQRAVSVNPGK
16.2H7 scFv VH L11S mIgE WCH2 WCH3 WCH4(SEQ ID NO:249)
核苷酸序列:
aagcttgccgccatggattttcaagtgcagattttcagcttcctgctaatcagtgcttcagtcataattgccagaggacaaattgttctct
cccagtctccagcaatcctgtctgcatctccaggggagaaggtcacaatgacttgcagggccagctcaagtgtaagttacatgcact
ggtaccagcagaagccaggatcctcccccaaaccctggatttatgccccatccaacctggcttctggagtccctgctcgcttcagtg
gcagtgggtctgggacctcttactctctcacaatcagcagagtggaggctgaagatgctgccacttattactgccagcagtggagttt
taacccacccacgttcggtgctgggaccaagctggagctgaaagatggcggtggctcgggcggtggtggatctggaggaggtg
ggagctctcaggcttatctacagcagtctggggctgagtctgtgaggcctggggcctcagtgaagatgtcctgcaaggcttctggct
acacatttaccagttacaatatgcactgggtaaagcagacacctagacagggcctggaatggattggagctatttatccaggaaatg
gtgatacttcctacaatcagaagttcaagggcaaggccacactgactgtagacaaatcctccagcacagcctacatgcagctcagc
agcctgacatctgaagactctgcggtctatttctgtgcaagagtggtgtactatagtaactcttactggtacttcgatgtctggggcaca
gggaccacggtcaccgtctcttctgatcacgttcgacctgtcaacatcactgagcccaccttggagctactccattcatcctgcgacc
ccaatgcattccactccaccatccagctgtactgcttcatttatggccacatcctaaatgatgtctctgtcagctggctaatggacgatc
gggagataactgatacacttgcacaaactgttctaatcaaggaggaaggcaaactagcctctacctgcagtaaactcaacatcactg
agcagcaatggatgtctgaaagcaccttcacctgcaaggtcacctcccaaggcgtagactatttggcccacactcggagatgccca
gatcatgagccacggggtgtgattacctacctgatcccacccagccccctggacctgtatcaaaacggtgctcccaagcttacctgt
ctggtggtggacctggaaagcgagaagaatgtcaatgtgacgtggaaccaagagaagaagacttcagtctcagcatcccagtggt
acactaagcaccacaataacgccacaactagtatcacctccatcctgcctgtagttgccaaggactggattgaaggctacggctatc
agtgcatagtggaccaccctgattttcccaagcccattgtgcgttccatcaccaagaccccaggccagcgctcagcccccgaggta
tatgtgttcccaccaccagaggaggagagcgaggacaaacgcacactcacctgtttgatccagaacttcttccctgaggatatctct
gtgcagtggctgggggatggcaaactgatctcaaacagccagcacagtaccacaacacccctgaaatccaatggctccaatcaa
ggcttcttcatcttcagtcgcctagaggtcgccaagacactctggacacagagaaaacagttcacctgccaagtgatccatgaggc
acttcagaaacccaggaaactggagaaaacaatatccacaagccttggtaacacctccctccgtccatcctagtaatctagag
氨基酸序列:(SEQ ID NO:250)
MDFQVQIFSFLLISASVIIARGQIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYMHWY
QQKPGSSPKPWIYAPSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWS
FNPPTFGAGTKLELKDGGGSGGGGSGGGGSSQAYLQQSGAESVRPGASVKMSCK
ASGYTFTSYNMHWVKQTPRQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTVDKSSS
TAYMQLSSLTSEDSAVYFCARVVYYSNSYWYFDVWGTGTTVTVSSDHVRPVNIT
EPTLELLHSSCDPNAFHSTIQLYCFIYGHILNDVSVSWLMDDREITDTLAQTVLIKE
EGKLASTCSKLNITEQQWMSESTFTCKVTSQGVDYLAHTRRCPDHEPRGVITYLIP
PSPLDLYQNGAPKLTCLVVDLESEKNVNVTWNQEKKTSVSASQWYTKHHNNATT
SITSILPVVAKDWIEGYGYQCIVDHPDFPKPIVRSITKTPGQRSAPEVYVFPPPEEESE
DKRTLTCLIQNFFPEDISVQWLGDGKLISNSQHSTTTPLKSNGSNQGFFIFSRLEVAK
TLWTQRKQFTCQVIHEALQKPRKLEKTISTSLGNTSLRPS
17.2H7 scFv VH L11S hIgA WH WCH2 T4CH3(SEQ ID NO:251)
核苷酸序列:
aagcttgccgccatggattttcaagtgcagattttcagcttcctgctaatcagtgcttcagtcataattgccagaggacaaattgttctct
cccagtctccagcaatcctgtctgcatctccaggggagaaggtcacaatgacttgcagggccagctcaagtgtaagttacatgcact
ggtaccagcagaagccaggatcctcccccaaaccctggatttatgccccatccaacctggcttctggagtccctgctcgcttcagtg
gcagtgggtctgggacctcttactctctcacaatcagcagagtggaggctgaagatgctgccacttattactgccagcagtggagttt
taacccacccacgttcggtgctgggaccaagctggagctgaaagatggcggtggctcgggcggtggtggatctggaggaggtg
ggagctctcaggcttatctacagcagtctggggctgagtctgtgaggcctggggcctcagtgaagatgtcctgcaaggcttctggct
acacatttaccagttacaatatgcactgggtaaagcagacacctagacagggcctggaatggattggagctatttatccaggaaatg
gtgatacttcctacaatcagaagttcaagggcaaggccacactgactgtagacaaatcctccagcacagcctacatgcagctcagc
agcctgacatctgaagactctgcggtctatttctgtgcaagagtggtgtactatagtaactcttactggtacttcgatgtctggggcaca
gggaccacggtcaccgtctcttctgatcagccagttccctcaactccacctaccccatctccctcaactccacctaccccatctccct
catgctgccacccccgactgtcactgcaccgaccggccctcgaggacctgctcttaggttcagaagcgatcctcacgtgcacactg
accggcctgagagatgcctcaggtgtcaccttcacctggacgccctcaagtgggaagagcgctgttcaaggaccacctgaccgtg
acctctgtggctgctacagcgtgtccagtgtcctgccgggctgtgccgagccatggaaccatgggaagaccttcacttgcactgct
gcctaccccgagtccaagaccccgctaaccgccaccctctcaaaatccggaaacacattccggcccgaggtccacctgctgccg
ccgccgtcggaggagctggccctgaacgagctggtgacgctgacgtgcctggcacgtggcttcagccccaaggatgtgctggtt
cgctggctgcaggggtcacaggagctgccccgcgagaagtacctgacttgggcatcccggcaggagcccagccagggcacca
ccaccttcgctgtgaccagcatactgcgcgtggcagccgaggactggaagaagggggacaccttctcctgcatggtgggccacg
aggccctgccgctggccttcacacagaagaccatcgaccgcttggcgggtaaacccacccatgtcaatgtgtctgttgtcatggcg
gaggtggactgataatctaga
氨基酸序列:(SEQ ID NO:252)
MDFQVQIFSFLLISASVIIARGQIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYMHWY
QQKPGSSPKPWIYAPSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWS
FNPPTFGAGTKLELKDGGGSGGGGSGGGGSSQAYLQQSGAESVRPGASVKMSCK
ASGYTFTSYNMHWVKQTPRQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTVDKSSS
TAYMQLSSLTSEDSAVYFCARVVYYSNSYWYFDVWGTGTTVTVSSDQPVPSTPPT
PSPSTPPTPSPSCCHPRLSLHRPALEDLLLGSEAILTCTLTGLRDASGVTFTWTPSSG
KSAVQGPPDRDLCGCYSVSSVLPGCAEPWNHGKTFTCTAAYPESKTPLTATLSKS
GNTFRPEVHLLPPPSEELALNELVTLTCLARGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYLT
WASRQEPSQGTTTFAVTSILRVAAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRLA
GKPTHVNVSVVMAEVD
18.2H7 scFv VHL11S mIgA WH WCH2 T4 CH3(SEQ ID NO:253)
核苷酸序列:
aagcttgccgccatggattttcaagtgcagattttcagcttcctgctaatcagtgcttcagtcataattgccagaggacaaattgttctct
cccagtctccagcaatcctgtctgcatctccaggggagaaggtcacaatgacttgcagggccagctcaagtgtaagttacatgcact
ggtaccagcagaagccaggatcctcccccaaaccctggatttatgccccatccaacctggcttctggagtccctgctcgcttcagtg
gcagtgggtctgggacctcttactctctcacaatcagcagagtggaggctgaagatgctgccacttattactgccagcagtggagttt
taacccacccacgttcggtgctgggaccaagctggagctgaaagatggcggtggctcgggcggtggtggatctggaggaggtg
ggagctctcaggcttatctacagcagtctggggctgagtctgtgaggcctggggcctcagtgaagatgtcctgcaaggcttctggct
acacatttaccagttacaatatgcactgggtaaagcagacacctagacagggcctggaatggattggagctatttatccaggaaatg
gtgatacttcctacaatcagaagttcaagggcaaggccacactgactgtagacaaatcctccagcacagcctacatgcagctcagc
agcctgacatctgaagactctgcggtctatttctgtgcaagagtggtgtactatagtaactcttactggtacttcgatgtctggggcaca
gggaccacggtcaccgtctcttctgatcacatctgttctcctcctactactcctcctccaccttcctgccagcccagcctgtcactgca
gcggccagctcttgaggacctgctcctgggttcagatgccagcatcacatgtactctgaatggcctgagagatcctgagggagctg
tcttcacctgggagccctccactgggaaggatgcagtgcagaagaaagctgtgcagaattcctgcggctgctacagtgtgtccagc
gtcctgcctggctgtgctgagcgctggaacagtggcgcatcattcaagtgcacagttacccatcctgagtctgacaccttaactggc
acaattgccaaagtcacagtgaacaccttcccaccccaggtccacctgctaccgccgccgtcggaggagctggccctgaatgag
ctcgtgtccctgacatgcctggtgcgagctttcaaccctaaagaagtgctggtgcgatggctgcatggaaatgaggagctgtcccc
agaaagctacctagtgtttgagcccctaaaggagccaggcgagggagccaccacctacctggtgacaagcgtgttgcgtgtatca
gctgaaatctggaaacagggtgaccagtactcctgcatggtgggccacgaggccttgcccatgaacttcacccagaagaccatcg
accgtctgtcgggtaaacccaccaatgtcagcgtgtctgtgatcatgtcagagggagattgataatctagat
氨基酸序列:(SEQ ID NO:254)
MDFQVQIFSFLLISASVIIARGQIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYMHWY
QQKPGSSPKPWIYAPSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWS
FNPPTFGAGTKLELKDGGGSGGGGSGGGGSSQAYLQQSGAESVRPGASVKMSCK
ASGYTFTSYNMHWVKQTPRQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTVDKSSS
TAYMQLSSLTSEDSAVYFCARVVYYSNSYWYFDVWGTGTTVTVSSDHICSPPTTP
PPPSCQPSLSLQRPALEDLLLGSDASITCTLNGLRDPEGAVFTWEPSTGKDAVQKK
AVQNSCGCYSVSSVLPGCAERWNSGASFKCTVTHPESDTLTGTIAKVTVNTFPPQV
HLLPPPSEELALNELVSLTCLVRAFNPKEVLVRWLHGNEELSPESYLVFEPLKEPGE
GATTYLVTSVLRVSAEIWKQGDQYSCMVGHEALPMNFTQKTIDRLSGKPTNVSVS
VIMSEGD
A.mIgA WCH2 T4CH3(SEQ ID NO:255)
核苷酸序列:
Gttgttgatcacatctgttctcctcctactactcctcctccaccttcctgccagcccagcctgtcactgcagcggccagctcttgagga
cctgctcctgggttcagatgccagcatcacatgtactctgaatggcctgagagatcctgagggagctgtcttcacctgggagccctc
cactgggaaggatgcagtgcagaagaaagctgtgcagaattcctgcggctgctacagtgtgtccagcgtcctgcctggctgtgctg
agcgctggaacagtggcgcatcattcaagtgcacagttacccatcctgagtctgacaccttaactggcacaattgccaaagtcaca
gtgaacaccttcccaccccaggtccacctgctaccgccgccgtcggaggagctggccctgaatgagctcgtgtccctgacatgcc
tggtgcgagctttcaaccctaaagaagtgctggtgcgatggctgcatggaaatgaggagctgtccccagaaagctacctagtgtttg
agcccctaaaggagccaggcgagggagccaccacctacctggtgacaagcgtgttgcgtgtatcagctgaaatctggaaacagg
gtgaccagtactcctgcatggtgggccacgaggccttgcccatgaacttcacccagaagaccatcgaccgtctgtcgggtaaacc
caccaatgtcagcgtgtctgtgatcatgtcagagggagattgataatctagat
氨基酸序列:(SEQ ID NO:256)
DHICSPPTTPPPPSCQPSLSLQRPALEDLLLGSDASITCTLNGLRDPEGAVFTWEPST
GKDAVQKKAVQNSCGCYSVSSVLPGCAERWNSGASFKCTVTHPESDTLTGTIAKV
TVNTFPPQVHLLPPPSEELALNELVSLTCLVRAFNPKEVLVRWLHGNEELSPESYL
VFEPLKEPGEGATTYLVTSVLRVSAEIWKQGDQYSCMVGHEALPMNFTQKTIDRL
SGKPTNVSVSVIMSEGD
20.K322S CH2区域(SEQ ID NO:257)
核苷酸序列:
cctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcac
atgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaa
gacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatg
gcaaggagtacaagtgctcggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaacaatctccaaagccaaa
氨基酸序列:(SEQ ID NO:258)
PELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHN
AKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCSVSNKALPAPIEKTISKAK
21.K322S CH2 WCH3(SEQ ID NO:259)
核苷酸序列:
cctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcac
atgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaa
gacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatg
gcaaggagtacaagtgctcggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaacaatctccaaagccaaagggcagccc
cgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaagg
cttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctgg
actccgacggctccttcttcctctacagcaagctcacccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctcccgtg
atgcatgaggctctgcacaacccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatgatctaga
氨基酸序列:(SEQ ID NO:260)
PELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHN
AKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCSVSNKALPAPIEKTISKAKG
QPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPV
LDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
1.K322L CH2 WCH3(SEQ ID NO:261)
核苷酸序列:
tgatccaggagcccaaatcttctgacaaaactcacacatccccaccgtcctcagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcct
cttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaaga
ccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaaca
gcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcctggtctccaacaa
agccctcccagcccccatcgagaaaacaatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccat
cccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtggg
agagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagct
caccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaaccgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgca
gaagagccctctccctgtctccgggtaaatgatctaga
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cccagtctccagcaatcctgtctgcatctccaggggagaaggtcacaatgacttgcagggccagcctcaagtgtaagttacatgcact
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taacccacccacgttcggtgctgggaccaagctggagctgaaagatggcggtggctcgggcggtggtggatctggaggaggtg
ggagctctcaggcttatctacagcagtctggggctgagtcggtgaggcctggggcctcagtgaagatgtcctgcaaggcttctggc
tacacatttaccagttacaatatgcactgggtaaagcagacacctagacagggcctggaatggattggagctatttatccaggaaat
ggtgatacttcctacaatcagaagttcaagggcaaggccacactgactgtagacaaatcctccagcacagcctacatgcagctcag
cagcctgacatctgaagactctgcggtctatttctgtgcaagagtggtgtactatagtaactcttactggtacttcgatgtctggggcac
agggaccacggtcaccgtctcttctgatcaggagcccaaatcttctgacaaaactcacacatccccaccgtcctcagcacctgaact
cctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtgg
tggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcata atgc caagacaaagc
cgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggag
tacaagtgctcggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaacaatctccaaagccaaagggcagccccgagaacca
caggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatccca
gcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacgg
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NYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLS
PGK
25.P331S CH2(SEQ ID NO:269)
核苷酸序列:
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氨基酸序列:(SEQ ID NO:270)
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核苷酸序列:
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氨基酸序列(SEQ ID NO:272)
PELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHN
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27.2H7 scFv VH L11S(SSS-S)H P331S CH2 WCH3(SEQ ID NO:273)
核苷酸序列:
aagcttgccgccatggattttcaagtgcagattttcagcttcctgctaatcagtgcttcagtcataattgccagaggacaaattgttctct
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ctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatgatctaga
氨基酸序列(SEQ ID NO:274)
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QQKPGSSPKPWIYAPSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWS
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TAYMQLSSLTSEDSAVYFCARVVYYSNSYWYFDVWGTGTTVTVSSDQEPKSSDK
THTSPPSSAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYV
DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIE
KTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEN
NYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLS
PGK
28.2H7 scFv VH L11S(CSS-S)H P331S CH2 WCH3(SEQ ID NO:275)
核苷酸序列:
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氨基酸序列(SEQ ID NO:276)
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DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIE
KTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEN
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PGK
29.T256N CH2区域(SEQ ID NO:277)
核苷酸序列:
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氨基酸序列(SEQ ID NO:278)
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AKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK
30.T256N CH2 WCH3(SEQ ID NO:279)
核苷酸序列:
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氨基酸序列(SEQ ID NO:280)
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FNPPTFGAGTKLELKDGGGSGGGGSGGGGSSQAYLQQSGAESVRPGASVKMSCK
ASGYTFTSYNMHWVKQTPRQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTVDKSSS
TAYMQLSSLTSEDSAVYFCARVVYYSNSYWYFDVWGTGTTVTVSSDQEPKSSDK
THTSPPSSAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRNPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY
VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPI
EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE
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32.2H7 scFv VH L11S(CSS-S)H T256N CH2 WCH3(SEQ ID NO:283)
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taacccacccacgttcggtgctgggaccaagctggagctgaaagatggcggtggctcgggcggtggtggatctggaggaggtg
ggagctctcaggcttatctacagcagtctggggctgagtcggtgaggcctggggcctcagtgaagatgtcctgcaaggcttctggc
tacacatttaccagttacaatatgcactgggtaaagcagacacctagacagggcctggaatggattggagctatttatccaggaaat
ggtgatacttcctacaatcagaagttcaagggcaaggccacactgactgtagacaaatcctccagcacagcctacatgcagctcag
cagcctgacatctgaagactctgcggtctatttctgtgcaagagtggtgtactatagtaactcttactggtacttcgatgtctggggcac
agggaccacggtcaccgtctcttctgatcaggagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatccccaccgtcctcagcacctgaact
cctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggaaccctgaggtcacatgcgtgg
tggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagc
cgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggag
tacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaacaatctccaaagccaaagggcagccccgagaacc
acaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatccc
agcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacg
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gctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatgatctaga
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atgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaa
gacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatg
gcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaacaatctccaaagccaaa
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核苷酸序列:
cctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccagaacgctaaggtcac
atgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaa
gacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatg
gcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaacaatctccaaagccaaagggcagccc
cgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaagg
cttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctgg
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atgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatgatctaga
氨基酸序列(SEQ ID NO:288)
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核苷酸序列:
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cctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccagaacgctaaggtcacatgcgtgg
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cgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggag
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核苷酸序列:
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taacccacccacgttcggtgctgggaccaagctggagctgaaagatggcggtggctcgggcggtggtggatctggaggaggtg
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cctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccagaacgctaaggtcacatgcgtgg
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氨基酸序列(SEQ ID NO:292)
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SPGK
36.K290Q CH2区域(SEQ ID NO:293)
核苷酸序列:
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氨基酸序列(SEQ ID NO:294)
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37.K290Q CH2 WCH3(SEQ ID NO:295)
核苷酸序列:
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gatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatgatctaga
氨基酸序列:(SEQ ID NO:296)
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38.2H7 scFv VH L11S(SSS-S)H K290Q CH2 WCH3(SEQ ID NO:297)
核苷酸序列:
aagcttgccgccatggattttcaagtgcagattttcagcttcctgctaatcagtgcttcagtcataattgccagaggacaaattgttctct
cccagtctccagcaatcctgtctgcatctccaggggagaaggtcacaatgacttgcagggccagctcaagtgtaagttacatgcact
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氨基酸序列:(SEQ ID NO:298)
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PGK
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核苷酸序列:
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氨基酸序列:(SEQ ID NO:300)
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TAYMQLSSLTSEDSAVYFCARVVYYSNSYWYFDVWGTGTTVTVSSDQEPKSCDK
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DGVEVHNAKTQPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIE
KTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEN
NYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLS
PGK
40.A339PCH2(SEQ ID NO:301)
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AKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKPK
41.A339P CH2 WCH3(SEQ ID NO:303)
核苷酸序列:
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gcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaacaatctccaaacccaaagggcagccc
cgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaagg
cttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctgg
actccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtg
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氨基酸序列:(SEQ ID NO:304)
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AKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKPKG
QPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPV
LDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
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ggagctctcaggcttatctacagcagtctggggctgagtcggtgaggcctggggcctcagtgaagatgtcctgcaaggcttctggc
tacacatttaccagttacaatatgcactgggtaaagcagacacctagacagggcctggaatggattggagctatttatccaggaaat
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氨基酸序列:(SEQ ID NO:306)
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TAYMQLSSLTSEDSAVYFCARVVYYSNSYWYFDVWGTGTTVTVSSDQEPKSSDK
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gcagtgggtctgggacctcttactctctcacaatcagcagagtggaggctgaagatgctgccacttattactgccagcagtggagttt
taacccacccacgttcggtgctgggaccaagctggagctgaaagatggcggtggctcgggcggtggtggatctggaggaggtg
ggagctctcaggcttatctacagcagtctggggctgagtcggtgaggcctggggcctcagtgaagatgtcctgcaaggcttctggc
tacacatttaccagttacaatatgcactgggtaaagcagacacctagacagggcctggaatggattggagctatttatccaggaaat
ggtgatacttcctacaatcagaagttcaagggcaaggccacactgactgtagacaaatcctccagcacagcctacatgcagctcag
cagcctgacatctgaagactctgcggtctatttctgtgcaagagtggtgtactatagtaactcttactggtacttcgatgtctggggcac
agggaccacggtcaccgtctcttctgatcaggagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatccccaccgtcctcagcacctgaact
ctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtgg
tggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagc
cgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggag
tacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaacaatctccaaacccaaagggcagccccgagaacc
acaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatccc
agcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacg
gctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgag
gctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatgatctaga
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cacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatgatctaga
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YQQKQGKSPQLLVSFAKTLAEGVPSRFSGSGSGTQFSLKISSLQPEDSGSYFCQHHS
DNPWTFGGGTELEIKGGGGSGGGGSGGGGSSAVQLQQSGPESEKPGASVKISCKA
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AYMQLKSLTSEDSAVYYCARSVGPMDYWGQGTSVTVSSDHDQEPKSSDKTHTSP
PSSAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVE
VHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK
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MVSTAQFLGLLLLWLTGGRCDIQMTQSPASLSASVGETVTITCRTSENVYSYLAW
YQQKQGKSPQLLVSFAKTLAEGVPSRFSGSGSGTQFSLKISSLQPEDSGSYFCQHHS
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AYMQLKSLTSEDSAVYYCARSVGPMDYWGQGTSVTVSSDQEPKSCDKTHTSPPC
SAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEV
HNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTP
PVL DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
54.G28-1 scFv VH L11S(SSC-P)H WCH2WCH3(SEQ ID NO:329)
核苷酸序列:
aagcttgccgccatggtatccacagctcagttccttgggttgctgctgctgtggcttacaggtggcagatgtgacatccagatgactc
agtctccagcctccctatctgcatctgtgggagagactgtcaccatcacatgtcgaacaagtgaaaatgtttacagttatttggcttggt
atcagcagaaacagggaaaatctcctcagctcctggtctcttttgcaaaaaccttagcagaaggtgtgccatcaaggttcagtggca
gtggatcaggcacacagttttctctgaagatcagcagcctgcagcctgaagattctggaagttatttctgtcaacatcattccgataat
ccgtggacgttcggtggaggcaccgaactggagatcaaaggtggcggtggctcgggcggtggtgggtcgggtggcggcggat
cgtcagcggtccagctgcagcagtctggacctgagtcggaaaagcctggcgcttcagtgaagatttcctgcaaggcttctggttact
cattcactggctacaatatgaactgggtgaagcagaataatggaaagagccttgagtggattggaaatattgatccttattatggtggt
actacctacaaccggaagttcaagggcaaggccacattgactgtagacaaatcctccagcacagcctacatgcagctcaagagtct
gacatctgaggactctgcagtctattactgtgcaagatcggtcggccctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctc
ttctgatcaggagcccaaatcttctgacaaaactcacacatccccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtctt
cctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaa
gaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaa
cagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaac
aaagccctcccagcccccatcgagaaaacaatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgccccc
atcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgg
gagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaag
ctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgc
agaagagcctctccctgtctccgggtaaatgatctaga
氨基酸序列:(SEQ ID NO:330)
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SGYSFTGYNMNWVKQNNGKSLEWIGNIDPYYGGTTYNRKFKGKATLTVDKSSST
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GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDLAVEWESNGQPENNYKTIPP
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核苷酸序列:
atggcttgccttggatttcagcggcacaaggctcagctgaacctggctgccaggacctggccctgcactctcctgttttttcttctcttc
atccctgtcttctgcaaagcaatgcacgtggcccagcctgctgtggtactggccagcagccgaggcatcgccagctttgtgtgtga
gtatgcatctccaggcaaagccactgaggtccgggtgacagtgcttcggcaggctgacagccaggtgactgaagtctgtgcggc
aacctacatgacggggaatgagttgaccttcctagatgattccatctgcacgggcacctccagtggaaatcaagtgaacctcactat
ccaaggactgagggccatggacacgggactctacatctgcaaggtggagctcatgtacccaccgccatactacctgggcatagg
caacggaacccagatttatgtaattgatccagaaccgtgcccagattctgatcaacccaaatcttctgacaaaactcacacatcccca
ccgtcctcagcacctgaactcctggggggatcgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggac
ccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggt
gcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccagg
actggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaacaatctccaaagcca
aagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgc
ctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcc
tcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttct
catgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga
氨基酸序列:(SEQ ID NO:332)
MACLGFQRHKAQLNLAARTWPCTLLFFLLFIPVFCKAMHVAQPAVVLASSRGIAS
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KTHTSPPSSAPELLGGSSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY
VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPI
EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE
NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL
SPGK
55.Fc2-2VL(SEQ ID NO:333)
核苷酸序列:
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tcacagtctccatcctccctagctgtgtcagttggagagaaggtttctatgagctgcaagtccagtcagagccttttatataatcacaat
caaaagaactacttggcctggtaccagcagataccagggcagtctcctaaactgctgatttactgggcatccactagggaatctgg
ggtccctgatcgcttcacaggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagagtgaaggctgaagacctggcagttta
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gtgggtcgggtggcggcgggagctcg
氨基酸序列:(SEQ ID NO:334)
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VYYCQQYYTYPPTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSS
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核苷酸序列:
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gggttctcattaaccgtctatggtgttaactgggttcgccagcctccaggaaagggtctggactggctgggaatgatatggggtgat
ggaagcacagactataattcagctctcaaatccagactgagcatcagtaaggacaactccaagagccaagttttcttaaaaatggac
agtctacaaactgatgacacagccaggtactactgtgccagagatcactatggtacccac tatgctatggactactggggtcaagga
acctcagtcaccgtctcctctgatcag
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GDGSTDYNSALKSRLSISKDNSKSQVFLKMDSLQTDDTARYYCARDHYGTHYAM
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57.FC2-2scFv (SEQ ID NO:337)
核苷酸序列:
gttgttaagcttgccgccatggattcacaggcccaggttcttatgttactgctgctatgggtatctggtacctgtggggacattgtgatg
tcacagtctccatcctccctagctgtgtcagttggagagaaggtttctatgagctgcaagtccagtcagagccttttatataatcacaat
caaaagaactacttggcctggtaccagcagataccagggcagtctcctaaactgctgatttactgggcatccactagggaatctgg
ggtccctgatcgcttcacaggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagagtgaaggctgaagacctggcagttta
ttactgtcagcaatattatacctatcctcccacgttcggaggtggcaccaagctggaaataaaaggtggcggtggctcgggcggtg
gtgggtcgggtggcggcgggagctctcaggtgcagttgaaggagtcaggacctggcctggtggcgccctcacagagcctgtcc
atcacatgcaccgtctcagggttctcattaaccgtctatggtgttaactgggttcgccagcctccaggaaagggtctggactggctgg
gaatgatatggggtgatggaagcacagactataattcagctctcaaatccagactgagcatcagtaaggacaactccaagagccaa
gttttcttaaaaatggacagtctacaaactgatgacacagccaggtactactgtgccagagatcactatggtacccactatgctatgg
actactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctctgatcag
氨基酸序列:(SEQ ID NO:338)
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VYYCQQYYTYPPTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSSQVQLKESGPGLVAPSQ
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DNSKSQVFLKMDSLQTDDTARYYCARDHYGTHYAMDYWGQGTSVTVSSDQ
58.FC2-2 VHL11S(SEQ ID NO:339)
核苷酸序列:
gggagctctcaggtgcagttgaaggagtcaggacctggctcggtggcgccctcacagagcctgtccatcacatgcaccgtctcag
ggttctcattaaccgtctatggtgttaactgggttcgccagcctccaggaaagggtctggactggctgggaatgatatggggtgatg
gaagcacagactataattcagctctcaaatccagactgagcatcagtaaggacaactccaagagccaagttttcttaaaaatggaca
gtctacaaactgatgacacagccaggtactactgtgccagagatcactatggtacccactatgctatggactactggggtcaaggaa
cctcagtcaccgtctcctctgatcag
氨基酸序列:(SEQ ID NO:340)
(GSS)QVQLKESGPGSVAPSQSLSITCTVSGFSLTVYGVNWVRQPPGKGLDWLGMI
WGDGSTDYNSALKSRLSISKDNSKSQVFLKMDSLQTDDTARYYCARDHYGTHYA
MDYWGQGTSVTVSSDQ
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核苷酸序列:
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tcacagtctccatcctccctagctgtgtcagttggagagaaggtttctatgagctgcaagtccagtcagagccttttatataatcacaat
caaaagaactacttggcctggtaccagcagataccagggcagtctcctaaactgctgatttactgggcatccactagggaatctgg
ggtccctgatcgcttcacaggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagagtgaaggctgaagacctggcagttta
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gtgggtcgggtggcggcgggagctctcaggtgcagttgaaggagtcaggacctggctcggtggcgccctcacagagcctgtcc
atcacatgcaccgtctcagggttctcattaaccgtctatggtgttaactgggttcgccagccccaggaaagggtctggactggctgg
gaatgatatggggtgatggaagcacagactataattcagctctcaaatccagactgagcatcagtaaggacaactccaagagccaa
gttttcttaaaaatggacagtctacaaactgatgacacagccaggtactactgtgccagagatcactatggtacccactatgctatgg
actactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctctgatcag
氨基酸序列:(SEQ ID NO:342)
MDSQAQVLMLLLLWVSGTCGDIVMSQSPSSLAVSVGEKVSMSCKSSQSLLYNHN
QKNYLAWYQQIPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISRVKAEDLA
VYYCQQYYTYPPTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSSQVQLKESGPGSVAPSQ
SLSITCTVSGFSLTVYGVNWVRQPPGKGLDWLGMIWGDGSTDYNSALKSRLSISK
DNSKSQVFLKMDSLQTDDTARYYCARDHYGTHYAMDYWGQGTSVTVSSDQ
60.FC2-2(SSS-S)H WCH2 WCH3(SEQ ID NO:343)
核苷酸序列:
gttgttaagcttgccgccatggattcacaggcccaggttcttatgttactgctgctatgggtatctggtacctgtggggacattgtgatg
tcacagtctccatcctccctagctgtgtcagttggagagaaggtttctatgagctgcaagtccagtcagagccttttatataatcacaat
caaaagaactacttggcctggtaccagcagataccagggcagtctcctaaactgctgatttactgggcatccactagggaatctgg
ggtccctgatcgcttcacaggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagagtgaaggctgaagacctggcagttta
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gtgggtcgggtggcggcgggagctctcaggtgcagttgaaggagtcaggacctggcctggtggcgccctcacagagcctgtcc
atcacatgcaccgtctcagggttctcattaaccgtctatggtgttaactgggttcgccagcctccaggaaagggtctggactggctgg
gaatgatatggggtgatggaagcacagactataattcagctctcaaatccagactgagcatcagtaaggacaactccaagagccaa
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cgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatgatctaga
氨基酸序列:(SEQ ID NO:344)
MDSQAQVLMLLLLWVSGTCGDIVMSQSPSSLAVSVGEKVSMSCKSSQSLLYNHN
QKNYLAWYQQIPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISRVKAEDLA
VYYCQQYYTYPPTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSSQVQLKESGPGLVAPSQ
SLSITCTVSGFSLTVYGVNWVRQPPGKGLDWLGMIWGDGSTDYNSALKSRLSISK
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NWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKA
LPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN
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KSLSLSPGK
61.FC2-2 VHL11S(SSS-S)H WCH2 WCH3(SEQ ID NO:345)
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gttgttaagcttgccgccatggattcacaggcccaggttcttatgttactgctgctatgggtatctggtacctgtggggacattgtgatg
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atcacatgcaccgtctcagggttctcattaaccgtctatggtgttaactgggttcgccagcctccaggaaagggtctggactggctgg
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actactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctctgatcaggagcccaaatcttctgacaaaactcacacatccccaccgtcct
cagcacctgaactcctgggtggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgag
gtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataat
gccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggct
gaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggc
agccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtca
aaggcttctatccaagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtg
ctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctc
cgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatgatctaga
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MDSQAQVLMLLLLWVSGTCGDIVMSQSPSSLAVSVGEKVSMSCKSSQSLLYNHN
QKNYLAWYQQIPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISRVKAEDLA
VYYCQQYYTYPPTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSSQVQLKESGPGSVAPSQ
SLSITCTVSGFSLTVYGVNWVRQPPGKGLDWLGMIWGDGSTDYNSALKSRLSISK
DNSKSQVFLKMDSLQTDDTARYYCARDHYGTHYAMDYWGQGTSVTVSSDQEPK
SSDKTHTSPPSSAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKF
NWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKA
LPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN
GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQ
KSLSLSPGK
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核苷酸序列:
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gcagccctcccagaccctcagtctgacttgttctttctctgggttttcactgaccacttatggtataggagtaggttggattcgtcagcct
ccagggaagggtctggagtggctgacacacatttggtggaatgataataagtactataacacagccctgaggagccggctcacaa
tctccaaggattcctccaacaaccaagtactcctcaagatcgccaatgtggacactgcagataccgccacatactactgtctctacg
gctacacttactggggccaagggactctggtcactgtctctgca
氨基酸序列:(SEQ ID NO:348)
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QPPGKGLEWLTHIWWNDNKYYNTALRSRLTISKDSSNNQVLLKIANVDTADTAT
YYCLYGYTYWGQGTLVTVSA
63.UCHL-1 VL(SEQ ID NO:349)
核苷酸序列:
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ctgtcagtcttggagatcaggcctccatctcttgcagatctagtcagagccttctttacagtaatggaaacacctatttacattggtacct
gcagaagccaggccagtctccaaaactcctgatctacaaactttccaaccgattttctggggtcccagacaggttcagtggcagtgg
atcagggacagatttcacactcaagatcagcagagtggaggctgaggatctgggagtttatttctgctctcaaagtacacatgttccg
tggacgttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaa
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MKLPVRLLVLMFWIPASISDVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLLYSNGNTYL
HWYLQKPGQSPKLLIYKLSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCS
QSTHVPWTFGGGTKLEIK
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核苷酸序列:
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tcaaagtacacatgttccgtggacgttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaagatggcggtggctcgggcggtggtggatct
ggaggaggtgggagctctcagattactctgaaagagtctggccctgggatcttgcagccctcccagaccctcagtctgacttgttctt
tctctgggttttcactgaccacttatggtataggagtaggttggattcgtcagcctccagggaagggtctggagtggctgacacacat
ttggtggaatgataataagtactataacacagccctgaggagccggctcacaatctccaaggattcctccaacaaccaagtactcct
caagatcgccaatgtggacactgcagataccgccacatactactgtctctacggctacacttactggggccaagggactctggtca
ctgtctctgctgatca
氨基酸序列:(SEQ ID NO:352)
MKLPVRLLVLMFWIPASISDVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLLYSNGNTYL
HWYLQKPGQSPKLLIYKLSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCS
QSTHVPWTFGGGTKLEIKDGGGSGGGGSGGGGSSQITLKESGPGILQPSQTLSLTCS
FSGFSLTTYGIGVGWIRQPPGKGLEWLTHIWWNDNKYYNTALRSRLTISKDSSNN
QVLLKIANVDTADTATYYCLYGYTYWGQGTLVTVSAD
65.UCHL-1 VH I11SL12S(SEQ ID NO:353)
核苷酸序列:
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tcactgaccacttatggtataggagtaggttggattcgtcagcctccagggaagggtctggagtggctgacacacatttggtggaat
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caatgtggacactgcagataccgccacatactactgtctctacggctacacttactggggccaagggactctggtcactgtctctgct
gatca
氨基酸序列:(SEQ ID NO:354)
(GSS)QITLKESGPGSSQPSQTLSLTCSFSGFSLTTYGIGVGWIRQPPGKGLEWLTHIW
WNDNKYYNTALRSRLTISKDSSNNQVLLKIANVDTADTATYYCLYGYTYWGQGT
LVTVSAD
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ctcaagatcgccaatgtggacactgcagataccgccacatactactgtctctacggctacacttactggggccaagggactctggtc
actgtctctgctgatca
氨基酸序列:(SEQ ID NO:356)
MKLPVRLLVLMFWPASISDVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLLYSNGNTYL
HWYLQKPGQSPKLLIYKLSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCS
QSTHVPWTFGGGTKLEIKDGGGSGGGGSGGGGSSQITLKESGPGSSQPSQTLSLTC
SFSGFSLTTYGIGVGWIRQPPGKGLEWLTHIWWNDNKYYNTALRSRLTISKDSSNN
QVLLKIANVDTADTATYYCLYGYTYWGQGTLVTVSAD
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核苷酸序列:
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ggaggaggtgggagctctcagattactctgaaagagtctggccctgggatcttgcagccctcccagaccctcagtctgacttgttctt
tctctgggttttcactgaccacttatggtataggagtaggttggattcgtcagcctccagggaagggtctggagtggctgacacacat
ttggtggaatgataataagtactataacacagccctgaggagccggctcacaatctccaaggattcctccaacaaccaagtactcct
caagatcgccaatgtggacactgcagataccgccacatactactgtctctacggctacacttactggggccaagggactctggtca
ctgtctctgctgatcaggagcccaaatcttctgacaaaactcacacatccccaccgtcctcagcacctgaactcctgggtggaccgt
cagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagc
cacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagca
gtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtc
tccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccct
gcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatccaagcgacatcgccgtg
gagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctac
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acacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatgatctaga
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caggttcagtggcagtggatcagggacagatttcacactcaagatcagcagagtggaggctgaggatctgggagtttatttctgctc
tcaaagtacacatgttccgtggacgttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaagatggcggtggctcgggcggtggtggatct
ggaggaggtgggagctctcagattactctgaaagagtctggccctgggagctcccagccctcccagaccctcagtctgacttgttc
tttctctgggttttcactgaccacttatggtataggagtaggttggattcgtcagcctccagggaagggtctggagtggctgacacac
atttggtggaatgataataagtactataacacagccctgaggagccggctcacaatctccaaggattcctccaacaaccaagtactc
ctcaagatcgccaatgtggacactgcagataccgccacatactactgtgtctctacggctacacttactggggccaagggactctggtc
actgtctctgctgatcaggagcccaaatcttctgacaaaactcacacatccccaccgtcctcagcacctgaactcctgggtggaccg
tcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgag
ccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagc
agtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggt
ctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccc
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YQQKQGKSPQLLVSFAKTLAEGVPSRFSGSGSGTQFSLKISSLQPEDSGSYFCQHHS
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GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP
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gtggtactacctacaaccggaagttcaagggcaaggccacattgactgtagacaaatcctccagcacagcctacatgcagctcaa
gagtctgacatctgaggactctgcagtctattactgtgcaagatcggtcggccctatggactactggggtcaaggaacctcagtcac
cgtctcttctgatcaggagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgtccaccgtccccagcacctgaactcctgggtggaccgtc
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核苷酸序列:
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caatctccagcttctttggctgtgtctctagggcagagggccaccatctcctgcaaggccagccaaagtgttgattatgatggtgata
gttatttgaactggtaccaacagattccaggacagccacccaaactcctcatctatgatgcatccaatctagtttctgggatcccaccc
aggtttagtggcagtgggtctgggacagacttcaccctcaacatccatcctgtggagaaggtggatgctgcaacctatcactgtcag
caaagtactgaggatccgtggacgttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaaggtggcggtggctcgggcggtggtgggtc
gggtggcggcgggagctcgcaggttcagctgcagcagtctggggctgagtcggtgaggcctgggtcctcagtgaagatttcctg
caaggcttctggctatgcattcagtagctactggatgaactgggtgaagcagaggcctggacagggtcttgagtggattggacaga
tttggcctggagatggtgatactaactacaatggaaagttcaagggtaaagccactctgactgcagacgaatcctccagcacagcct
acatgcaactcagcagcctagcatctgaggactctgcggtctatttctgtgcaagacgggagactacgacggtaggccgttattact
atgctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctctgatcagccagttccctcaactccacctaccccatctccctc
aactccacctaccccatctccctcatgctgccacccccgactgtcactgcaccgaccggccctcgaggacctgctcttaggttcaga
agcgatcctcacgtgcacactgaccggcctgagagatgcctcaggtgtcaccttcacctggacgccctcaagtgggaagagcgct
gttcaaggaccacctgaccgtgacctctgtggctgctacagcgtgtccagtgtcctgccgggctgtgccgagccatggaaccatg
ggaagaccttcacttgcactgctgcctaccccgagtccaagaccccgctaaccgccaccctctcaaaatccggaaacacattccg
gcccgaggtccacctgctgccgccgccgtcggaggagctggccctgaacgagctggtgacgctgacgtgcctggcacgtggct
tcagccccaaggatgtgctggttcgctggctgcaggggtcacaggagctgccccgcgagaagtacctgacttgggcatcccggc
aggagcccagccagggcaccaccaccttcgctgtgaccagcatactgcgcgtggcagccgaggactggaagaagggggacac
cttctcctgcatggtgggccacgaggccctgccgctggccttcacacagaagaccatcgaccgcttggcgggtaaacccacccat
gtcaatgtgtctgttgtcatggcggaggtggactgataatctaga
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TIDRLAGKPTHVNVSVVMAEVD
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核苷酸序列:
aagcttgccgccatggagacagacacactcctgctatgggtgctgctgctctgggttccaggctccactggtgacattgtgctgacc
caatctccagcttctttggctgtgtctctagggcagagggccaccatctcctgcaaggccagccaaagtgttgattatgatggtgata
gttatttgaactggtaccaacagattccaggacagccacccaaactcctcatctatgatgcatccaatctagtttctgggatcccaccc
aggtttagtggcagtgggtctgggacagacttcaccctcaacatccatcctgtggagaaggtggatgctgcaacctatcactgtcag
caaagtactgaggatccgtggacgttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaaggtggcggtggctcgggcggtggtgggtc
gggtggcggcggatcgtcacaggttcagctgcagcagtctggggctgagctggtgaggcctgggtcctcagtgaagatttcctgc
aaggcttctggctatgcattcagtagctactggatgaactgggtgaagcagaggcctggacagggtcttgagtggattggacagatt
tggcctggagatggtgatactaactacaatggaaagttcaagggtaaagccactctgactgcagacgaatcctccagcacagccta
catgcaactcagcagcctagcatctgaggactctgcggtctatttctgtgcaagacgggagactacgacggtaggccgttattacta
tgctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctctgatcaggagcccaaatcttctgacaaaactcacacatcccc
accgtcctcagcacctgaactcctgggtggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggac
ccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggt
gcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccagg
actggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagcca
aagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgc
ctggtcaaaggcttctatccaagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcc
tcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttct
catgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatgatctaga
氨基酸序列:(SEQ ID NO:400)
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QKSLSLSPGK
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核苷酸序列:
aagcttgccgccatggagacagacacactcctgctatgggtgctgctgctctgggttccaggctccactggtgacattgtgctgacc
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gttatttgaactggtaccaacagattccaggacagccacccaaactcctcatctatgatgcatccaatctagtttctgggatcccaccc
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caaagtactgaggatccgtggacgttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaaggtggcggtggctcgggcggtggtgggtc
gggtggcggcgggagctcgcaggttcagctgcagcagtctggggctgagtcggtgaggcctgggtcctcagtgaagatttcctg
caaggcttctggctatgcattcagtagctactggatgaactgggtgaagcagaggcctggacagggtcttgagtggattggacaga
tttggcctggagatggtgatactaactacaatggaaagttcaagggtaaagccactctgactgcagacgaatcctccagcacagcct
acatgcaactcagcagcctagcatctgaggactctgcggtctatttctgtgcaagacgggagactacgacggtaggccgttattact
atgctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctctgatcaggagcccaaatcttctgacaaaactcacacatccc
caccgtcctcagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccgg
acccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggag
gtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccag
gactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaacaatctccaaagcc
aaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctg
cctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgc
ctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtctt
ctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatgatctaga
氨基酸序列:(SEQ ID NO:402)
METDTLLLWVLLLWVPGSTGDIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDS
YLNWYQQIPGQPPKLLIYDASNLVSGIPPRFSGSGSGTDFTLNIHPVEKVDAATYHC
QQSTEDPWTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSSQVQLQQSGAESVRPGSSVKI
SCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIWPGDGDTNYNGKFKGKATLTAD
ESSSTAYMQLSSLASEDSAVYFCARRETTTVGRYYYAMDYWGQGTSVTVSSDQE
PKSSDKTHTSPPSSAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEV
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ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWES
NGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT
QKSLSLSPGK
91.L6VL(SEQ ID NO:403)
核苷酸序列:
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caatcctgtctgcatctccaggggagaaggtcacattgacttgcagggccagctcaagtgtaagtttcatgaactggtaccagcaga
agccaggatcctcccccaaaccctggatttatgccacatccaatttggcttctgagttccctggtcgcttcagtggcgagtggtctgg
gacctcttactctctcgcaatcagcagagtggaggctgaagatgctgccacttattactgccagcagtggaatagtaacccactcac
gttcggtgctgggaccaagctggagctgaaagagctctctggtggcggtggctcgggcggtggtgggtcgggtggcggcggat
ct
氨基酸序列:(SEQ ID NO:404)
MDFQVQIFSFLLISASVIMSRGQIVLSQSPAILSASPGEKVTLTCRASSSVSFMNWYQ
QKPGSSPKPWIYATSNLASEFPGRFSGEWSGTSYSLAISRVEAEDAATYYCQQWNS
NPLTFGAGTKLELKELSGGGGSGGGGSGGGGS
92.L6 VH(SEQ ID NO:405)
核苷酸序列:
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cacaaactatggaatgaactgggtgaagcaggctccaggaaagggtttaaagtggatgggctggataaacacctacactggaca
gccaacatatgctgatgacttcaagggacggtttgccttctctttggaaacctctgcctacactgcctatttgcagatcaacaacctca
aaaatgaggacatggctacatatttctgtgcaagatttagctatggtaactcacgttacgctgactactggggccaaggcaccactct
cacagtctcctctgatca
氨基酸序列:(SEQ ID NO:406)
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TGQPTYADDFKGRFAFSLETSAYTAYLQINNLKNEDMATYFCARFSYGNSRYADY
WGQGTTLTVSSD
93.L6scFv(SEQ ID NO:407)
核苷酸序列:
atggattttcaagtgcagattttcagcttcctgctaatcagtgcttcagtcataatgtccagaggacaaattgttctctcccagtctccag
caatcctgtctgcatctccaggggagaaggtcacattgacttgcagggccagctcaagtgtaagtttcatgaactggtaccagcaga
agccaggatcctcccccaaaccctggatttatgccacatccaatttggcttctgagttccctggtcgcttcagtggcgagtggtctgg
gacctcttactctctcgcaatcagcagagtggaggctgaagatgctgccacttattactgccagcagtggaatagtaacccactcac
gttcggtgctgggaccaagctggagctgaaagagctctctggtggcggtggctcgggcggtggtgggtcgggtggcggcggat
ctctgcagatccagttggtgcagtctggacctgagctgaagaagcctggagagacagtcaagatctcctgcaaggcttctgggtat
accttcacaaactatggaatgaactgggtgaagcaggctccaggaaagggtttaaagtggatgggctggataaacacctacactg
gacagccaacatatgctgatgacttcaagggacggtttgccttctctttggaaacctctgcctacactgcctatttgcagatcaacaac
ctcaaaaatgaggacatggctacatatttctgtgcaagatttagctatggtaactcacgttacgctgactactggggccaaggcacca
ctctcacagtctcctctgatca
氨基酸序列:(SEQ ID NO:408)
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QKPGSSPKPWIYATSNLASEFPGRFSGEWSGTSYSLAISRVEAEDAATYYCQQWNS
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核苷酸序列:
ctgcagatccagttggtgcagtctggacctgagtcgaagaagcctggagagacagtcaagatctcctgcaaggcttctgggtatac
cttcacaaactatggaatgaactgggtgaagcaggctccaggaaagggtttaaagtggatgggctggataaacacctacactgga
cagccaacatatgctgatgacttcaagggacggtttgccttctctttggaaacctctgcctacactgcctatttgcagatcaacaacct
caaaaatgaggacatggctacatatttctgtgcaagatttagctatggtaactcacgttacgctgactactggggccaaggcaccact
ctcacagtctcctctgatca
氨基酸序列:(SEQ ID NO:410)
QIQLVQSGPESKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTY
TGQPTYADDFKGRFAFSLETSAYTAYLQINNLKNEDMATYFCARFSYGNSRYADY
WGQGTTLTVSSD
95.L6 VHL11S scFv(SEQ ID NO:411)
核苷酸序列:
Aagcttgttgttatggattttcaagtgcagattttcagcttcctgctaatcagtgcttcagtcataatgtccagaggacaaattgttctctc
ccagtctccagcaatcctgtctgcatctccaggggagaaggtcacattgacttgcagggccagctcaagtgtaagtttcatgaactg
gtaccagcagaagccaggatcctcccccaaaccctggatttatgccacatccaatttggcttctgagttccctggtcgcttcagtggc
gagtggtctgggacctcttactctctcgcaatcagcagagtggaggctgaagatgctgccacttattactgccagcagtggaatagt
aacccactcacgttcggtgctgggaccaagctggagctgaaagagctctctggtggcggtggctcgggcggtggtgggtcgggt
ggcggcggatctctgcagatccagttggtgcagtctggacctgagtcgaagaagcctggagagacagtcaagatctcctgcaag
gcttctgggtataccttcacaaactatggaatgaactgggtgaagcaggctccaggaaagggtttaaagtggatgggctggataaa
cacctacactggacagccaacatatgctg atgacttcaagggacggtttgccttctctttggaaacctctgcctacactgcctatttgc
agatcaacaacctcaaaaatgaggacatggctacatatttctgtgcaagatttagctatggtaactcacgttacgctgactactgggg
ccaaggcaccactctcacagtctcctctgatca
氨基酸序列:(SEQ ID NO:412)
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QKPGSSPKPWIYATSNLASEFPGRFSGEWSGTSYSLAISRVEAEDAATYYCQQWNS
NPLTFGAGTKLELKELSGGGGSGGGGSGGGGSLQIQLVQSGPESKKPGETVKISCK
ASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGQPTYADDFKGRFAFSLETSA
YTAYLQINNLKNEDMATYFCARFSYGNSRYADYWGQGTTLTVSSD
96.L6 Or L6 VHL11S scFv IgAH hIgG1 WCH2 WCH3(SEQ ID NO:413)
核苷酸序列:(显示了L6 VHL 11S)
aagcttgttgttatggattttcaagtgcagattttcagcttcctgctaatcagtgcttcagtcataatgtccagaggacaaattgttctctcc
cagtctccagcaatcctgtctgcatctccaggggagaaggtcacattgacttgcagggccagctcaagtgtaagtttcatgaactgg
taccagcagaagccaggatcctcccccaaaccctggatttatgccacatccaatttggcttctgagttccctggtcgcttcagtggcg
agtggtctgggacctcttactctctcgcaatcagcagagtggaggctgaagatgctgccacttattactgccagcagtggaatagta
acccactcacgttcggtgctgggaccaagctggagctgaaagagctctctggtggcggtggctcgggcggtggtgggtcgggtg
gcggcggatctctgcagatccagttggtgcagtctggacctgagtcgaagaagcctggagagacagtcaagatctcctgcaaggc
ttctgggtataccttcacaaactatggaatgaactgggtgaagcaggctccaggaaagggtttaaagtggatgggctggataaaca
cctacactggacagccaacatatgctgatgacttcaagggacggtttgccttctctttggaaacctctgcctacactgcctatttgcag
atcaacaacctcaaaaatgaggacatggctacatatttctgtgcaagatttagctatggtaactcacgttacgctgactactggggcc
aaggcaccactctcacagtctcctctgatcagccagttccctcaactccacctaccccatctccctcaactccacctaccccatctcc
ctcatgcgcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggaccc
ctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgc
ataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggact
ggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaacaatctccaaagccaaag
ggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctg
gtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcc
cgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcat
gctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatgatctaga
氨基酸序列:(SEQ ID NO:414)
MDFQVQIFSFLLISASVIMSRGQIVLSQSPAILSASPGEKVTLTCRASSSVSFMNWYQ
QKPGSSPKPWIYATSNLASEFPGRFSGEWSGTSYSLAISRVEAEDAATYYCQQWNS
NPLTFGAGTKLELKELSGGGGSGGGGSGGGGSLQIQLVQSGPESKKPGETVKISCK
ASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGQPTYADDFKGRFAFSLETSA
YTAYLQINNLKNEDMATYFCARFSYGNSRYADYWGQGTTLTVSSDQPVPSTPPTP
SPSTPPTPSPSCAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFN
WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALP
APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ
PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL
SLSPGK
97.L6 scFv VHL11S(SSS-S)H WCH2 WCH3(SEQ ID NO:415)
核苷酸序列:
aagcttgttgttatggattttcaagtgcagattttcagcttcctgctaatcagtgcttcagtcataatgtccagaggacaaattgttctctcc
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ttctgggtataccttcacaaactatggaatgaactgggtgaagcaggctccaggaaagggtttaaagtggatgggctggataaaca
cctacactggacagccaacatatgctgatgacttcaagggacggtttgccttctctttggaaacctctgcctacactgcctatttgcag
atcaacaacctcaaaaatgaggacatggctacatatttctgtgcaagatttagctatggtaactcacgttacgctgactactggggcc
aaggcaccactctcacagtctcctctgatcaggagcccaaatcttctgacaaaactcacacatccccaccgtcctcagcacctgaac
tcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtg
gtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaag
ccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaagga
gtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaacaatctccaaagccaaagggcagccccgagaac
cacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcc
cagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgac
ggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatga
ggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatgatctaga
氨基酸序列:(SEQ ID NO:416)
MDFQVQIFSFLLISASVIMSRGQIVLSQSPAILSASPGEKVTLTCRASSSVSFMNWYQ
QKPGSSPKPWIYATSNLASEFPGRFSGEWSGTSYSLAISRVEAEDAATYYCQQWNS
NPLTFGAGTKLELKELSGGGGSGGGGSGGGGSLQIQLVQSGPESKKPGETVKISCK
ASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGQPTYADDFKGRFAFSLETSA
YTAYLQINNLKNEDMATYFCARFSYGNSRYADYWGQGTTLTVSSDQEPKSSDKT
HTSPPSSAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYV
DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIE
KTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEN
NYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLS
PGK
98.P238 CH2 WCH3
a.P238S CH2 WCH3(SEQ ID NO:417)
核苷酸序列:
cctgaactcctggggggatcgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcac
atgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaa
gacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatg
gcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaacaatctccaaagccaaagggcagccc
cgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaagg
cttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctgg
actccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtg
atgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatgatctaga
氨基酸序列:(SEQ ID NO:418)
PELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHN
AKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKG
QPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPV
LDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
b.(SSS-S)H P238S CH2 WCH3(SEQ ID NO:419)
核苷酸序列:
tgatcaggagcccaaatcttctgacaaaactcacacatccccaccgtcctcagcacctgaactcctggggggatcgtcagtcttcct
cttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaaga
ccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaaca
gcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaa
agccctcccagcccccatcgagaaaacaatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccat
cccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtggg
agagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagct
caccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgca
gaagagcctctccctgtctccgggtaaatgatctaga
氨基酸序列:(SEQ ID NO:420)
DQEPKSSDKTHTSPPSSAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED
PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKV
SNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE
WESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN
HYTQKSLSLSPGK*
99.a.CD16-6 low(ED)+NL+(SSS-S)H P238S CH2 WCH3(SEQ ID NO:421)
核苷酸序列:
ggagcccaaatcttctgacaaaactcacacatccccaccgtcctcagcacctgaactcctggggggatcgtcagtcttcctcttccc
cccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctga
ggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgt
accgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccct
cccagcccccatcgagaaaacaatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccggg
atgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagca
atgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgt
ggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagag
cctctccctgtctccgggtaaatgatctaga
氨基酸序列:(SEQ ID NO:422)
MWQLLLPTALLLLVSAGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDSVTLKCQGAYSPE
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LQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTALHKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATL
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VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE
QYNSTYRVVSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVY
TLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFF
LYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
100.b.CD16-6 low(ED)+HE4LP+(SSS-S)H P238S CH2 WCH3(SEQ ID NO:423)
核苷酸序列:
aagcttgccgccatgcctgcttgtcgcctaggcccgctagccgccgccctcctcctcagcctgctgctgttcggcttcaccctagtct
caggcaccggtgcaatgcggactgaagatctcccaaaggctgtggtgttcctggagcctcaatggtacagggtgctcgagaagg
acagtgtgactctgaagtgccagggagcctactcccctgaggacaattccacacagtggtttcacaatgagagcctcatctcaagc
caggcctcgagctacttcattgacgctgccacagtcgacgacagtggagagtacaggtgccagacaaacctctccaccctcagtg
acccggtgcagctagaagtccatatcggctggctgttgctccaggcccctcggtgggtgttcaaggaggaagaccctattcacctg
aggtgtcacagctggaagaacactgctctgcataaggtcacatatttacagaatggcaaaggcaggaagtattttcatcataattctg
acttctacattccaaaagccacactcaaagacagcggctcctacttctgcagggggcttgttgggagtaaaaatgtgtcttcagaga
ctgtgaacatcaccatcactcaaggtttggctgatcaggagcccaaatcttctgacaaaactcacacatccccaccgtcctcagcac
ctgaactcctggggggatcgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacat
gcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaaga
caaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggc
aaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaacaatctccaaagccaaagggcagccccg
agaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggctt
ctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggact
ccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatg
catgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatgatctagaaa
氨基酸序列:(SEQ ID NO:424)
MPACRLGPLAAALLLSLLLFGFTLVSGTGAMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDS
VTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRCQTNLSTLSD
PVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTALHKVTYLQNGKGRKYFH
HNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLVGSKNVSSETVNITITQGLADQEPKSSDKTHTSP
PSSAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVE
VHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK
AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKT
TPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
101.CD16-9高(ED)(SSS-S)H P238S CH2 CH3
a.CD16-9高(ED)NL+(SSS-S)H P238S CH2 CH3(SEQ ID NO:425)
核苷酸序列:
gttgttaagcttgccgccatgtggcagctgctcctcccaactgctctgctacttctagtttcagctggcatgcggactgaagatctccc
aaaggctgtggtgttcctggagcctcaatggtacagggtgctcgagaaggacagtgtgactctgaagtgccagggagcctactcc
cctgaggacaattccacacagtggtttcacaatgagagcctcatctcaagccaggcctcgagctacttcattgacgctgccacagtc
gacgacagtggagagtacaggtgccagacaaacctctccaccctcagtgacccggtgcagctagaagtccatatcggctggctgt
tgctccaggcccctcggtgggtgttcaaggaggaagaccctattcacctgaggtgtcacagctggaagaacactgctctgcataag
gtcacatatttacagaatggcaaaggcaggaagtattttcatcataattctgacttctacattccaaaagccacactcaaagacagcg
gctcctacttctgcagggggctttttgggagtaaaaatgtgtcttcagagactgtgaacatcaccatcactcaaggtttggctgatcag
gagcccaaatcttctgacaaaactcacacatccccaccgtcctcagcacctgaactcctggggggatcgtcagtcttcctcttcccc
ccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgag
gtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgta
ccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctc
ccagcccccatcgagaaaacaatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccggga
tgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaat
gggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtgg
acaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcc
tctccctgtctccgggtaaatgatctagaaa
氨基酸序列:(SEQ ID NO:426)
MWQLLLPTALLLLVSAGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDSVTLKCQGAYSPE
DNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRCQTNLSTLSDPVQLEVHIGWLL
LQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTALHKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATL
KDSGSYFCRGLFGSKNVSSETVNITITQGLADQEPKSSDKTHTSPPSSAPELLGGSS
VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE
QYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVY
TLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFF
LYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
CD16-9高(ED)+HE4LP+hIgG1(SSS-S)H P238S CH2 CH3(SEQ ID NO:427)
核苷酸序列:
aagcttgccgccatgcctgcttgtcgcctaggcccgctagccgccgccctcctcctcagcctgctgctgttcggcttcaccctagtct
caggcaccggtgcaatgcggactgaagatctcccaaaggctgtggtgttcctggagcctcaatggtacagggtgctcgagaagg
acagtgtgactctgaagtgccagggagcctactcccctgaggacaattccacacagtggtttcacaatgagagcctcatctcaagc
caggcctcgagctacttcattgacgctgccacagtcgacgacagtggagagtacaggtgccagacaaacctctccaccctcagtg
acccggtgcagctagaagtccatatcggctggctgttgctccaggcccctcggtgggtgttcaaggaggaagaccctattcacctg
aggtgtcacagctggaagaacactgctctgcataaggtcacatatttacagaatggcaaaggcaggaagtattttcatcataattctg
acttctacattccaaaagccacactcaaagacagcggctcctacttctgcagggggctttttgggagtaaaaatgtgtcttcagagac
tgtgaacatcaccatcactcaaggtttggctgatcaggagcccaaatcttctgacaaaactcacacatccccaccgtcctcagcacct
gaactcctggggggatcgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatg
cgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagac
aaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggca
aggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaacaatctccaaagccaaagggcagccccga
gaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttct
atcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactcc
gacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgca
tgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatgatctagaaa
氨基酸序列:(SEQ ID NO:428)
MPACRLGPLAAALLLSLLLFGFTLVSGTGAMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDS
VTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRCQTNLSTLSD
PVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTALHKVTYLQNGKGRKYFH
HNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLFGSKNVSSETVNITITQGLADQEPKSSDKTHTSP
PSSAPELLGGS SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVE
VHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK
AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKT
TPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
102.a.CD16ED低(自然的前导序列)(SEQ ID NO:429)
核苷酸序列:
aagcttgccgccatgtggcagctgctcctcccaactgctctgctacttctagtttcagctggcatgcggactgaagatctcccaaagg
ctgtggtgttcctggagcctcaatggtacagggtgctcgagaaggacagtgtgactctgaagtgccagggagcctactcccctgag
gacaattccacacagtggtttcacaatgagagcctcatctcaagccaggcctcgagctacttcattgacgctgccacagtcgacgac
agtggagagtacaggtgccagacaaacctctccaccctcagtgacccggtgcagctagaagtccatatcggctggctgttgctcca
ggcccctcggtgggtgttcaaggaggaagaccctattcacctgaggtgtcacagctggaagaacactgctctgcataaggtcacat
atttacagaatggcaaaggcaggaagtattttcatcataattctgacttctacattccaaaagccacactcaaagacagcggctcctac
ttctgcagggggcttgttgggagtaaaaatgtgtcttcagagactgtgaacatcaccatcactcaaggtttggctgatcaaaa
氨基酸序列:(SEQ ID NO:430)
mwqlllptallllvsagmrtedlpkavvflepqwyrvlekdsvtlkcqgayspednstqwfhneslissqassyfidaatvdds
geyrcqtnlstlsdpvqlevhigwlllqaprwvfkeedpihlrchswkntalhkvtylqngkgrkyfhhnsdfyipkatlkdsg
syfcrglvgsknvssetvnititqgladq
b.CD16ED低(HE4前导序列)(SEQ ID NO:431)
核苷酸序列:
aagcttgccgccatgcctgcttgtcgcctaggcccgctagccgccgccctcctcctcagcctgctgctgttcggcttcaccctagtct
caggcaccggtgcaatgcggactgaagatctcccaaaggctgtggtgttcctggagcctcaatggtacagggtgctcgagaagg
acagtgtgactctgaagtgccagggagcctactcccctgaggacaattccacacagtggtttcacaatgagagcctcatctcaagc
caggcctcgagctacttcattgacgctgccacagtcgacgacagtggagagtacaggtgccagacaaacctctccaccctcagtg
acccggtgcagctagaagtccatatcggctggctgttgctccaggcccctcggtgggtgttcaaggaggaagaccctattcacctg
aggtgtcacagctggaagaacactgctctgcataaggtcacatatttacagaatggcaaaggcaggaagtattttcatcataattctg
acttctacattccaaaagccacactcaaagacagcggctcctacttctgcagggggcttgttgggagtaaaaatgtgtcttcagaga
ctgtgaacatcaccatcactcaaggtttggctgatcaaa
氨基酸序列(SEQ ID NO:432)
mpacrlgplaaalllslllfgftlvsgtgamrtedlpkavvflepqwyrvlekdsvtlkcqgayspednstqwfhneslissqass
yfidaatvddsgeyrcqtnlstlsdpvqlevhigwlllqaprwvfkeedpihlrchswkntalhkvtylqngkgrkyfhhnsdf
yipkatlkdsgsyfcrglvgsknvssetvnititqgladq
103.a.CD16ED高(自然的前导序列)(SEQ ID NO:433)
核苷酸序列:
gttgttaagcttgccgccatgtggcagctgctcctcccaactgctctgctacttctagtttcagctggcatgcggactgaagatctccc
aaaggctgtggtgttcctggagcctcaatggtacagggtgctcgagaaggacagtgtgactctgaagtgccagggagcctactcc
cctgaggacaattccacacagtggtttcacaatgagagcctcatctcaagccaggcctcgagctacttcattgacgctgccacagtc
gacgacagtggagagtacaggtgccagacaaacctctccaccctcagtgacccggtgcagctagaagtccatatcggctggctgt
tgctccaggcccctcggtgggtgttcaaggaggaagaccctattcacctgaggtgtcacagctggaagaacactgctctgcataag
gtcacatatttacagaatggcaaaggcaggaagtattttcatcataattctgacttctacattccaaaagccacactcaaagacagcg
gctcctacttctgcagggggctttttgggagtaaaaatgtgtcttcagagactgtgaacatcaccatcactcaaggtttggctgatcaa
a
氨基酸序列:(SEQ ID NO:434)
mwqlllptallllvsagmrtedlpkavvflepqwyrvlekdsvtlkcqgayspednstqwfhneslissqassyfidaatvdds
geyrcqtnlstlsdpvqlevhigwlllqaprwvfkeedpihlrchswkntalhkvtylqngkgrkyfhhnsdfyipkatlkdsg
syfcrglfgsknvssetvnititqgladq
b.CD16ED高(HE4前导序列)(SEQ ID NO:435)
核苷酸序列:
aagcttgccgccatgcctgcttgtcgcctaggcccgctagccgccgccctcctcctcagcctgctgctgttcggcttcaccctagtct
caggcaccggtgcaatgcggactgaagatctcccaaaggctgtggtgttcctggagcctcaatggtacagggtgctcgagaagg
acagtgtgactctgaagtgccagggagcctactcccctgaggacaattccacacagtggtttcacaatgagagcctcatctcaagc
caggcctcgagctacttcattgacgctgccacagtcgacgacagtggagagtacaggtgccagacaaacctctccaccctcagtg
acccggtgcagctagaagtccatatcggctggctgttgctccaggcccctcggtgggtgttcaaggaggaagaccctattcacctg
aggtgtcacagctggaagaacactgctctgcataaggtcacatatttacagaatggcaaaggcaggaagtattttcatcataattctg
acttctac attccaaaagccacactcaaagacagcggctcctacttctgcagggggctttttgggagtaaaaatgtgtcttcagagac
tgtgaacatcaccatcactcaaggtttggctgatcaaa
氨基酸序列:(SEQ ID NO:436)
MPACRLGPLAAALLLSLLLFGFTLVSGTGAMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDS
VTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRCQTNLSTLSD
PVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTALHKVTYLQNGKGRKYFH
HNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLFGSKNVSSETVNITITQGLADQ
104.2e12 scFv(SSS-S)HP238S CH2 WCH3-hCD80TM/CT(SEQ ID NO:437)
核苷酸序列:
aagcttatggattttcaagtgcagattttcagcttcctgctaatcagtgcttcagtcataatgtccagaggagtcgacattgtgctcaccc
aatctccagcttctttggctgtgtctctaggtcagagagccaccatctcctgcagagccagtgaaagtgttgaatattatgtcacaagtt
taatgcagtggtaccaacagaaaccaggacagccacccaaactcctcatctctgctgcatccaacgtagaatctggggtccctgcc
aggtttagtggcagtgggtctgggacagacttcagcctcaacatccatcctgtggaggaggatgatattgcaatgtatttctgtcagc
aaagtaggaaggttccttggacgttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaacggggtggcggtggctcgggcggaggtggg
tcgggtggcggcggatctcaggtgcagctgaaggagtcaggacctggcctggtggcgccctcacagagcctgtccatcacatgc
accgtctcagggttctcattaaccggctatggtgtaaactgggttcgccagcctccaggaaagggtctggagtggctgggaatgat
atggggtgatggaagcacagactataattcagctctcaaatccagactgagcatcaccaaggacaactccaagagccaagttttctt
aaaaatgaacagtctgcaaactgatgacacagccagatactactgtgccagagatggttatagtaactttcattactatgttatggact
actggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctcagatctggagcccaaatcttctgacaaaactcacacatccccaccgtcccca
gcacctgaactcctggggggatcgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggt
cacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgc
caagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctga
atggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcag
ccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaa
ggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgct
ggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctcc
gtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaagcggatccttcgaacctgctccc
atcctgggccattaccttaatctcagtaaatggaatttttgtgatatgctgcctgacctactgctttgccccaagatgcagagagagaa
ggaggaatgagagattgagaagggaaagtgtacgccctgtataaatcgat
氨基酸序列:(SEQ ID NO:438)
MDFQVQIFSFLLISASVIMSRGVDIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVEYYVTS
LMQWYQQKPGQPPKLLISAASNVESGVPARFSGSGSGTDFSLNIHPVEEDDIAMYF
CQQSRKVPWTFGGGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSQVQLKESGPGLVAPSQSLS
ITCTVSGFSLTGYGVNWVRQPPGKGLEWLGMIWGDGSTDYNSALKSRLSITKDNS
KSQVFLKMNSLQTDDTARYYCARDGYSNFHYYVMDYWGQGTSVTVSSDLEPKS
SDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFN
WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALP
APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ
PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL
SLSPGKADPSNLLPSWAITLISVNGIFVICCLTYCFAPRCRERRRNERLRRESVRPV
105.10A8 scFv(SSS-S)H P238SCH2 WCH3-hCD80TM/CT(SEQ ID NO:439)
核苷酸序列:
aagcttatggattttcaagtgcagattttcagcttcctgctaatcagtgcttcagtcataatgtccagaggagtcgacatccagatgaca
cagtctccatcctcactgtctgcatctctgggaggcaaagtcaccatcacttgcaaggcaagccaagacattaagaagtatataggtt
ggtaccaacacaagcctggaaaaggtcccaggctgctcatatattacacatctacattacagccaggcatcccatcaaggttcagtg
gaagtgggtctgggagagattattccctcagcatcagaaacctggagcctgaagatattgcaacttattattgtcaacagtatgataat
cttccattgacgttcggctcggggacaaagttggaaataaaacggggtggcggtggctcgggcggtggtgggtcgggtggcggc
ggatctgatgtacagcttcaggagtcaggacctggcctcgtgaaaccttctcagtctctgtctctcacctgctctgtcactggctactc
catcaccagtggtttctactggaactggatccgacagtttccgggaaacaaactggaatggatgggccacataagccacgacggta
ggaataactacaacccatctctcataaatcgaatctccatcactcgtgacacatctaagaaccagtttttcctgaagttgagttctgtga
ctactgaggacacagctacatatttctgtgcaagacactacggtagtagcggagctatggactactggggtcaaggaacctcagtc
accgtctcctctgatctggagcccaaatcttctgacaaaactcacacatccccaccgtccccagcacctgaactcctggggggatc
gtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtga
gccacgaagaccctgaggtcaagttcaacggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggagga
gcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaa
ggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtaca
ccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgc
cgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcct
ctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaac
cactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaagcggatccttcgaacctgctcccatcctgggccattaccttaatctca
gtaaatggaatttttgtgatatgctgcctgacctactgctttgccccaagatgcagagagagaaggaggaatgagagattgagaagg
gaaagtgtacgccctgtataaatcgat
氨基酸序列:
(SEQ ID NO:440)
MDFQVQIFSFLLISASVIMSRGVDIQMTQSPSSLSASLGGKVTITCKASQDIKKYIG
WYQHKPGKGPRLLIYYTSTLQPGIPSRFSGSGSGRDYSLSIRNLEPEDIATYYCQQY
DNLPLTFGSGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSDVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCSV
TGYSITSGFYWNWIRQFPGNKLEWMGHISHDGRNNYNPSLINRISITRDTSKNQFFL
KLSSVTTEDTATYFCARHYGSSGAMDYWGQGTSVTVSSDLEPKSSDKTHTSPPSP
APELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH
NAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK
GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP
VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKADPS
NLLPSWAITLISVNGIFVICCLTYCFAPRCRERRRNERLRRESVRPV
106.2H7 scFv VHL11S(SSS-P)H P238SCH2CH3-hCD80TM/CT(SEQ ID NO:441)
核苷酸序列:
aagcttgccgccatggattttcaagtgcagattttcagcttcctgctaatcagtgcttcagtcataattgccagaggacaaattgttctct
cccagtctccagcaatcctgtctgcatctccaggggagaaggtcacaatgacttgcagggccagctcaagtgtaagttacatgcact
ggtaccagcagaagccaggatcctcccccaaaccctggatttatgccccatccaacctggcttctggagtccctgctcgcttcagtg
gcagtgggtctgggacctcttactctctcacaatcagcagagtggaggctgaagatgctgccacttattactgccagcagtggagttt
taacccacccacgttcggtgctgggaccaagctggagctgaaagatggcggtggctcgggcggtggtggatctggaggaggtg
ggagctctcaggcttatctacagcagtctggggctgagtcggtgaggcctggggcctcagtgaagatgtcctgcaaggcttctggc
tacacatttaccagttacaatatgcactgggtaaagcagacacctagacagggcctggaatggattggagctatttatccaggaaat
ggtgatacttcctacaatcagaagttcaagggcaaggccacactgactgtagacaaatcctccagcacagcctacatgcagctcag
cagcctgacatctgaagactctgcggtctatttctgtgcaagagtggtgtactatagtaactcttactggtacttcgatgtctggggcac
agggaccacggtcaccgtctcttctgatctggagcccaaatcttctgacaaaactcacacatccccaccgtccccagcacctgaact
cctggggggatcgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtgg
tggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagc
cgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggag
tacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaacc
acaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatccc
agcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacg
gctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgag
gctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaagcggatccttcgaacctgctcccatcctgggccatt
accttaatctcagtaaatggaatttttgtgatatgctgcctgacctactgctttgccccaagatgcagagagagaaggaggaatgaga
gattgagaagggaaagtgtacgccctgtataaatcgat
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ggtatcagcagaaaccagatggaactgttaaactcctgatctactacacatcaagattacactcaggagtcccatcaaggttcagtg
gcagtgggtctggaacagatt attctctcaccattgccaacctgcaaccagaagatattgccacttacttttgccaacagggtaatac
gcttccgtggacgttcggtggaggcaccaaactggtaaccaaacgggagctcggtggcggtggctcgggcggtggtgggtcgg
gtggcggcggatctatcgatgaggtccagctgcaacagtctggacctgaactggtgaagcctggagcttcaatgtcctgcaaggc
ctctggttactcattcactggctacatcgtgaactggctgaagcagagccatggaaagaaccttgagtggattggacttattaatccat
acaaaggtcttactacctacaaccagaaattcaagggcaaggccacattaactgtagacaagtcatccagcacagcctacatggag
ctcctcagtctgacatctgaagactctgcagtctattactgtgcaagatctgggtactatggtgactcggactggtacttcgatgtctgg
ggcgcagggaccacggtcaccgtctcctctgatctggagcccaaatcttctgacaaaactcacacaagcccaccgagcccagca
cctgaactcctggggggatcgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcac
atgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaa
gacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatg
gcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccc
cgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaagg
cttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctgg
actccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtg
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ctgggccattaccttaatctcagtaaatggaatttttgtgatatgctgcctgacctactgctttgccccaagatgcagagagagaagga
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PV
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atggggtgatggaagcacagactataattcagct ctcaaatccagactgagcatcaccaaggacaactccaagagccaagttttctt
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cacctgaccgtgacctctgtggctgctacagcgtgtccagtgtcctgccgggctgtgccgagccatggaaccatgggaagaccttc
acttgcactgctgcctaccccgagtccaagaccccgctaaccgccaccctctcaaaatccggaaacacattccggcccgaggtcc
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YH
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catctcgctctggtacggatgtggacgcagccaacctcagagagacattcatgggcctgaaataccaagtcaggaataaaaatgat
cttactcgtgaagacattttggaattaatggatagtgtttctaaggaagatcatagcaaaaggagcagctttgtgtgtgtgattctaagc
catggtgatgaaggggtcatttatgggacaaatgggcctgttgaactgaaaaagttgactagcttcttcagaggcgactactgccgg
agtctgactggaaagccgaaactcttcatcattcaggcctgccggggtacggagctggactgtggcattgagacagacagtggga
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WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALP
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acatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgcc
aagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaa
tggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagc
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H
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SLSPGKADPSNMENTENSVDSKSIKNLEPKIIHGSESMDSGISLDNSYKMDYPEMG
LCIIINNKNFHKSTGMTSRSGTDVDAANLRETFRNLKYEVRNKNDLTREEIVELMR
DVSKEDHSKRSSFVCVLLSHGEEGIIFGTNGPVDLKKITNFFRGDRCRSLTGKPKLFI
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WFIQSLCAMLKQYADKLEFMHILTRVNRKVATEFESFSFDATFHAKKQIPCIVSML
TKELYFYH
123.2e12 scFv hIgG1(SSS-P)H P238SCH2 WCH3-hcasp3-TM/CT(SEQ ID NO:467)
核苷酸序列:
aagcttatggattttcaagtgcagattttcagcttcctgctaatcagtgcttcagtcataatgtccagaggagtcgacattgtgctcaccc
aatctccagcttctttggctgtgtctctaggtcagagagccaccatctcctgcagagccagtgaaagtgttgaatattatgtcacaagtt
taatgcagtggtaccaacagaaaccaggacagccacccaaactcctcatctctgctgcatccaacgtagaatctggggtccctgcc
aggtttagtggcagtgggtctgggacagacttcagcctcaacatccatcctgtggaggaggatgatattgcaatgtatttctgtcagc
aaagtaggaaggttccttggacgttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaacggggtggcggtggctcgggcggaggtggg
tcgggtggcggcggatctcaggtgcagctgaaggagtcaggacctggcctggtggcgccctcacagagcctgtccatcacatgc
accgtctcagggttctcattaaccggctatggtgtaaactgggttcgccagcctccaggaaagggtctggagtggctgggaatgat
atggggtgatggaagcacagactataattcagctctcaaatccagactgagcatcaccaaggacaactccaagagccaagttttctt
aaaaatgaacagtctgcaaactgatgacacagccagatactactgtgccagagatggttatagtaactttcattactatgttatggact
actggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctcagatctggagcccaaatcttctgacaaaactcacacatccccaccgtcccca
gcacctgaactcctgggtggatcgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtc
acatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgcc
aagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaa
tggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagc
cccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaag
gcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctg
gactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgt
gatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaagcggatccttcgaacatggagaac
actgaaaactcagtggattcaaaatccattaaaaatttggaaccaaagatcatacatggaagcgaatcaatggactctggaatatccc
tggacaacagttataaaatggattatcctgagatgggtttatgtataataattaataataagaattttcataaaagcactggaatgacatc
tcggtctggtacagatgtcgatgcagcaaacctcagggaaacattcagaaacttgaaatatgaagtcaggaataaaaatgatcttac
acgtgaagaaattgtggaattgatgcgtgatgtttctaaagaagatcacagcaaaaggagcagttttgtttgtgtgcttctgagccatg
gtgaagaaggaataatttttggaacaaatggacctgttgacctgaaaaaaataacaaactttttcagaggggatcgttgtagaagtct
aactggaaaacccaaacttttcattattcaggcctgccgtggtacagaactggactgtggcattgagacagacagtggtgttgatgat
gacatggcgtgtcataaaataccagtggaggccgacttcttgtatgcatactccacagcacctggttattattcttggcgaaattcaaa
ggatggctcctggttcatccagtcgctttgtgccatgctgaaacagtatgccgacaagcttgaatttatgcacattcttacccgggttaa
ccgaaaggtggcaacagaatttgagtccttttcctttgacgctacttttcatgcaaagaaacagattccatgtattgtttccatgctcaca
aaagaactctatttttatcactaactcgagatcgataa
氨基酸序列:(SEQ ID NO:468)
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WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALP
APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ
PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL
SLSPGKADPSNMENTENSVDSKSIKNLEPKIIHGSESMDSGISLDNSYKMDYPEMG
LCIIINNKNFHKSTGMTSRSGTDVDAANLRETFRNLKYEVRNKNDLTREEIVELMR
DVSKEDHSKRSSFVCVLLSHGEEGIIFGTNGPVDLKKITNFFRGDRCRSLTGKPKLFI
IQACRGTELDCGIETDSGVDDDMACHKIPVEADFLYAYSTAPGYYSWRNSKDGS
WFIQSLCAMLKQYADKLEFMHILTRVNRKVATEFESFSFDATFHAKKQIPCIVSML
TKELYFYH
124.hcasp8-TM/CT(SEQ ID NO:469)
hCaspase8B:
核苷酸序列:
ggatccttcgaacatggacttcagcagaaatctttatgatattggggaacaactggacagtgaagatctggcctccctcaagttcctg
agcctggactacattccgcaaaggaagcaagaacccatcaaggatgccttgatgttattccagagactccaggaaaagagaatgtt
ggaggaaagcaatctgtccttcctgaaggagctgctcttccgaattaatagactggatttgctgattacctacctaaacactagaaag
gaggagatggaaagggaacttcagacaccaggcagggctcaaatttctgcctacagggtcatgctctatcagatttcagaagaagt
gagcagatcagaattgaggtcttttaagtttcttttgcaagaggaaatctccaaatgcaaactggatgatgacatgaacctgctggata
ttttcatagagatggagaagagggtcatcctgggagaaggaaagttggacatcctgaaaagagtctgtgcccaaatcaacaagag
cctgctgaagataatcaacgactatgaagaattcagcaaagagagaagcagcagccttgaaggaagtcctgatgaattttcaaatg
gggaggagttgtgtggggtaatgacaatctcggactctccaagagaacaggatagtgaatcacagactttggacaaagtttaccaa
atgaaaagcaaacctcggggatactgtctgatcatcaacaatcacaattttgcaaaagcacgggagaaagtgcccaaacttcacag
cattagggacaggaatggaacacacttggatgcaggggctttgaccacgacctttgaagagcttcattttgagatcaagccccacg
atgactgcacagtagagcaaatctatgagattttgaaaatctaccaactcatggaccacagtaacatggactgcttcatctgctgtatc
ctctcccatggagacaagggcatcatctatggcactgatggacaggaggcccccatctatgagctgacatctcagttcactggtttg
aagtgcccttcccttgctggaaaacccaaagtgttttttattcaggcttgtcagggggataactaccagaaaggtatacctgttgagac
tgattcagaggagcaaccctatttagaaatggatttatcatcacctcaaacgagatatatcccggatgaggctgactttctgctgggg
atggccactgtgaataactgtgtttcctaccgaaaccctgcagagggaacctggtacatccagtcactttgccagagcctgagaga
gcgatgtcctcgaggcgatgatattctcaccatcctgactgaagtgaactatgaagtaagcaacaaggatgacaagaaaaacatgg
ggaaacagatgcctcagcctactttcacactaagaaaaaaacttgtcttcccttctgattgagcatgcatcgata
氨基酸序列:(SEQ ID NO:470)
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MLEESNLSFLKELLFRINRLDLLITYLNTRKEEMERELQTPGRAQISAYRVMLYQIS
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NKSLLKIINDYEEFSKERSSSLEGSPDEFSNGEELCGVMTISDSPREQDSESQTLDKV
YQMKSKPRGYCLIINNHNFAKAREKVPKLHSIRDRNGTHLDAGALTTTFEELHFEI
KPHDDCTVEQIYEILKIYQLMDHSNMDCFICCILSHGDKGHYGTDGQEAPIYELTS
QFTGLKCPSLAGKPKVFFIQACQGDNYQKGIPVETDSEEQPYLEMDLSSPQTRYIPD
EADFLLGMATVNNCVSYRNPAEGTWYIQSLCQSLRERCPRGDDILTILTEVNYEVS
NKDDKKNMGKQMPQPTFTLRKKLVFPSD
hCaspase8C:
核苷酸序列:(SEQ ID NO:471)
ggatccttcgaacatggacttcagcagaaatctttatgatattggggaacaactggacagtgaagatctggcctccctcaagttcctg
agcctggactacattccgcaaaggaagcaagaacccatcaaggatgccttgatgttattccagagactccaggaaaagagaatgtt
ggaggaaagcaatctgtccttcctgaaggagctgctcttccgaattaatagactggatttgctgattacctacctaaacactagaaag
gaggagatggaaagggaacttcagacaccaggcagggctcaaatttctgcctacagggtcatgctctatcagatttcagaagaagt
gagcagatcagaattgaggtcttttaagtttcttttgcaagaggaaatctccaaatgcaaactggatgatgacatgaacctgctggata
ttttcatagagatggagaagagggtcatcctgggagaaggaaagttggacatcctgaaaagagtctgtgcccaaatcaacaagag
cctgctgaagataatcaacgactatgaagaattcagcaaaggggaggagttgtgtggggtaatgacaatctcggactctccaagag
aacaggatagtgaatcacagactttggacaaagtttaccaaatgaaaagcaaacctcggggatactgtctgatcatcaacaatcaca
attttgcaaaagcacgggagaaagtgcccaaacttcacagcattagggacaggaatggaacacacttggatgcaggggctttgac
cacgacctttgaagagcttcattttgagatcaagccccacgatgactgcacagtagagcaaatctatgagattttgaaaatctaccaa
ctcatggaccacagtaacatggactgcttcatctgctgtatcctctcccatggagacaagggcatcatctatggcactgatggacag
gaggcccccatctatgagctgacatctcagttcactggtttgaagtgcccttcccttgctggaaaacccaaagtgttttttattcaggctt
gtcagggggataactaccagaaaggtatacctgttgagactgattcagaggagcaaccctatttagaaatggatttatcatcacctca
aacgagatatatcccggatgaggctgactttctgctggggatggccactgtgaataactgtgtttcctaccgaaaccctgcagaggg
aacctggtacatccagtcactttgccagagcctgagagagcgatgtcctcgaggcgatgatattctcaccatcctgactgaagtgaa
ctatgaagtaagcaacaaggatgacaagaaaaacatggggaaacagatgcctcagcctactttcacactaagaaaaaaacttgtct
tcccttctgattgagcatgcatcgata
氨基酸序列:(SEQ ID NO:472)
DPSNMDFSRNLYDIGEQLDSEDLASLKFLSLDYIPQRKQEPIKDALMLFQRLQEKR
MLEESNLSFLKELLFRINRLDLLITYLNTRKEEMERELQTPGRAQISAYRVMLYQIS
EEVSRSELRSFKFLLQEEISKCKLDDDMNLLDIFIEMEKRVILGEGKLDILKRVCAQI
NKSLLKIINDYEEFSKGEELCGVMTISDSPREQDSESQTLDKVYQMKSKPRGYCLII
NNHNFAKAREKVPKLHSIRDRNGTHLDAGALTTTFEELHFEIKPHDDCTVEQIYEIL
KIYQLMDHSNMDCFICCILSHGDKGIIYGTDGQEAPIYELTSQFTGLKCPSLAGKPK
VFFIQACQGDNYQKGIPVETDSEEQPYLEMDLSSPQTRYIPDEADFLLGMATVNNC
VSYRNPAEGTWYIQSLCQSLRERCPRGDDILTILTEVNYEVSNKDDKKNMGKQMP
QPTFTLRKKLVFPSD
125.2e12 scFv hIgG1(SSS-P)H WCH2 WCH3-hcasp8-TM/CT(SEQ ID NO:473)
核苷酸序列:
aagcttatggattttcaagtgcagattttcagcttcctgctaatcagtgcttcagtcataatgtccagaggagtcgacattgtgctcaccc
aatctccagcttctttggctgtgtctctaggtcagagagccaccatctcctgcagagccagtgaaagtgttgaatattatgtcacaagtt
taatgcagtggtaccaacagaaaccaggacagccacccaaactcctcatctctgctgcatccaacgtagaatctggggtccctgcc
aggtttagtggcagtgggtctgggacagacttcagcctcaacatccatcctgtggaggaggatgatattgcaatgtatttctgtcagc
aaagtaggaaggttccttggacgttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaacggggtggcggtggctcgggcggaggtggg
tcgggtggcggcggatctcaggtgcagctgaaggagtcaggacctggcctggtggcgccctcacagagcctgtccatcacatgc
accgtctcagggttctcattaaccggctatggtgtaaactgggttcgccagcctccaggaaagggtctggagtggctgggaatgat
atggggtgatggaagcacagactataattcagctctcaaatccagactgagcatcaccaaggacaactccaagagccaagttttctt
aaaaatgaacagtctgcaaactgatgacacagccagatactactgtgccagagatggttatagtaactttcattactatgttatggact
actggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctcagatctggagcccaaatcttctgacaaaactcacacatccccaccgtcccca
gcacctgaactcctgggtggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggt
cacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgc
caagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctga
atggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcag
ccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaa
ggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgct
ggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctcc
gtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaagcggatccttcgaacatggactt
cagcagaaatctttatgatattggggaacaactggacagtgaagatctggcctccctcaagttcctgagcctggactacattccgca
aaggaagcaagaacccatcaaggatgccttgatgttattccagagactccaggaaaagagaatgttggaggaaagcaatctgtcct
tcctgaaggagctgctcttccgaattaatagactggatttgctgattacctacctaaacactagaaaggaggagatggaaagggaac
tcagacaccaggcagggctcaaatttctgcctacagggtcatgctctatcagatttcagaagaagtgagcagatcagaattgaggt
cttttaagtttcttttgcaagaggaaatctccaaatgcaaactggatgatgacatgaacctgctggatattttcatagagatggagaaga
gggtcatcctgggagaaggaaagttggacatcctgaaaagagtctgtgcccaaatcaacaagagcctgctgaagataatcaacga
ctatgaagaattcagcaaagagagaagcagcagccttgaaggaagtcctgatgaattttcaaatggggaggagttgtgtggggtaa
tgacaatctcggactctccaagagaacaggatagtgaatcacagactttggacaaagtttaccaaatgaaaagcaaacctcgggga
tactgtctgatcatcaacaatcacaattttgcaaaagcacgggagaaagtgcccaaacttcacagcattagggacaggaatggaac
acacttggatgcaggggctttgaccacgacctttgaagagcttcattttgagatcaagccccacgatgactgcacagtagagcaaat
ctatgagattttgaaaatctaccaactcatggaccacagtaacatggactgcttcatctgctgtatcctctcccatggagacaagggca
tcatctatggcactgatggacaggaggcccccatctatgagctgacatctcagttcactggtttgaagtgcccttcccttgctggaaa
acccaaagtgttttttattcaggcttgtcagggggataactaccagaaaggtatacctgttgagactgattcagaggagcaaccctatt
tagaaatggatttatcatcacctcaaacgagatatatcccggatgaggctgactttctgctggggatggccactgtgaataactgtgtt
tcctaccgaaaccctgcagagggaacctggtacatccagtcactttgccagagcctgagagagcgatgtcctcgaggcgatgatat
tctcaccatcctgactgaagtgaactatgaagtaagcaacaaggatgacaagaaaaacatggggaaacagatgcctcagcctactt
tcacactaagaaaaaaacttgtcttcccttctgattgagcatgcatcgata
氨基酸序列:(SEQ ID NO:474)
MDFQVQIFSFLLISASVIMSRGVDIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVEYYVTS
LMQWYQQKPGQPPKLLISAASNVESGVPARFSGSGSGTDFSLNIHPVEEDDIAMYF
CQQSRKVPWTFGGGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSQVQLKESGPGLVAPSQSLS
ITCTVSGFSLTGYGVNWVRQPPGKGLEWLGMIWGDGSTDYNSALKSRLSITKDNS
KSQVFLKMNSLQTDDTARYYCARDGYSNFHYYVMDYWGQGTSVTVSSDLEPKS
SDKTHTSPPSPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFN
WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALP
APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ
PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL
SLSPGKADPSNMDFSRNLYDIGEQLDSEDLASLKFLSLDYIPQRKQEPIKDALMLFQ
RLQEKRMLEESNLSFLKELLFRINRLDLLITYLNTRKEEMERELQTPGRAQISAYRV
MLYQISEEVSRSELRSFKFLLQEEISKCKLDDDMNLLDIFIEMEKRVILGEGKLDILK
RVCAQINKSLLKIINDYEEFSKERSSSLEGSPDEFSNGEELCGVMTISDSPREQDSES
QTLDKVYQMKSKPRGYCLIINNHNFAKAREKVPKLHSIRDRNGTHLDAGALTTTF
EELHFEIKPHDDCTVEQIYEILKIYQLMDHSNMDCFICCILSHGDKGIIYGTDGQEAP
IYELTSQFTGLKCPSLAGKPKVFFIQACQGDNYQKGIPVETDSEEQPYLEMDLSSPQ
TRYIPDEADFLLGMATVNNCVSYRNPAEGTWYIQSLCQSLRERCPRGDDILTILTE
VNYEVSNKDDKKNMGKQMPQPTFTLRKKLVFPSD
126.2e12 scFv hIgG1(SSS-P)H P238SCH2 WCH3-hcasp8B-TM/CT
(其他天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶8同种型是相似的)
核苷酸序列:(SEQ ID NO:475)
aagcttatggattttcaagtgcagattttcagcttcctgctaatcagtgcttcagtcataatgtccagaggagtcgacattgtgctcaccc
aatctccagcttctttggctgtgtctctaggtcagagagccaccatctcctgcagagccagtgaaagtgttgaatattatgtcacaagtt
taatgcagtggtaccaacagaaaccaggacagccacccaaactcctcatctctgctgcatccaacgtagaatctggggtccctgcc
aggtttagtggcagtgggtctgggacagacttcagcctcaacatccatcctgtggaggaggatgatattgcaatgtatttctgtcagc
aaagtaggaaggttccttggacgttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaacggggtggcggtggctcgggcggaggtggg
tcgggtggcggcggatctcaggtgcagctgaaggagtcaggacctggcctggtggcgccctcacagagcctgtccatcacatgc
accgtctcagggttctcattaaccggctatggtgtaaactgggttcgccagcctccaggaaagggtctggagtggctgggaatgat
atggggtgatggaagcacagactataattcagctctcaaatccagactgagcatcaccaaggacaactccaagagccaagttttctt
aaaaatgaacagtctgcaaactgatgacacagccagatactactgtgccagagatggttatagtaactttcattactatgttatggact
actggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctcagatctggagcccaaatcttctgacaaaactcacacatccccaccgtcccca
gcacctgaactcctgggtggatcgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtc
acatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgcc
aagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaa
tggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagc
cccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaag
gcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctg
gactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgt
gatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaagcggatccttcgaacatggacttca
gcagaaatctttatgatattggggaacaactggacagtgaagatctggcctccctcaagttcctgagcctggactacattccgcaaa
ggaagcaagaacccatcaaggatgccttgatgttattccagagactccaggaaaagagaatgttggaggaaagcaatctgtccttc
ctgaaggagctgctcttccgaattaatagactggatttgctgattacctacctaaacactagaaaggaggagatggaaagggaactt
cagacaccaggcagggctcaaatttctgcctacagggtcatgctctatcagatttcagaagaagtgagcagatcagaattgaggtct
tttaagtttcttttgcaagaggaaatctccaaatgcaaactggatgatgacatgaacctgctggatattttcatagagatggagaagag
ggtcatcctgggagaaggaaagttggacatcctgaaaagagtctgtgcccaaatcaacaagagcctgctgaagataatcaacgac
tatgaagaattcagcaaagagagaagcagcagccttgaaggaagtcctgatgaattttcaaatggggaggagttgtgtggggtaat
gacaatctcggactctccaagagaacaggatagtgaatcacagactttggacaaagtttaccaaatgaaaagcaaacctcggggat
actgtctgatcatcaacaatcacaattttgcaaaagcacgggagaaagtgcccaaacttcacagcattagggacaggaatggaaca
cacttggatgcaggggctttgaccacgacctttgaagagcttcattttgagatcaagccccacgatgactgcacagtagagcaaatc
tatgagattttgaaaatctaccaactcatggaccacagtaacatggactgcttcatctgctgtatcctctcccatggagacaagggcat
catctatggcactgatggacaggaggcccccatctatgagctgacatctcagttcactggtttgaagtgcccttcccttgctggaaaa
cccaaagtgttttttattcaggcttgtcagggggataactaccagaaaggtatacctgttgagactgattcagaggagcaaccctattt
agaaatggatttatcatcacctcaaacgagatatatcccggatgaggctgactttctgctggggatggccactgtgaataactgtgttt
cctaccgaaaccctgcagagggaacctggtacatccagtcactttgccagagcctgagagagcgatgtcctcgaggcgatgatatt
ctcaccatcctgactgaagtgaactatgaagtaagcaacaaggatgacaagaaaaacatggggaaacagatgcctcagcctacttt
cacactaagaaaaaaacttgtcttcccttctgattgagcatgcatcgataa
氨基酸序列:(SEQ ID NO:476)
MDFQVQIFSFLLISASVIMSRGVDIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVEYYVTS
LMQWYQQKPGQPPKLLISAASNVESGVPARFSGSGSGTDFSLNIHPVEEDDIAMYF
CQQSRKVPWTFGGGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSQVQLKESGPGLVAPSQSLS
ITCTVSGFSLTGYGVNWVRQPPGKGLEWLGMIWGDGSTDYNSALKSRLSITKDNS
KSQVFLKMNSLQTDDTARYYCARDGYSNFHYYVMDYWGQGTSVTVSSDLEPKS
SDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFN
WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALP
APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ
PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL
SLSPGKADPSNMDFSRNLYDIGEQLDSEDLASLKFLSLDYIPQRKQEPIKDALMLFQ
RLQEKRMLEESNLSFLKELLFRINRLDLLITYLNTRKEEMERELQTPGRAQISAYRV
MLYQISEEVSRSELRSFKFLLQEEISKCKLDDDMNLLDIFIEMEKRVILGEGKLDILK
RVCAQINKSLLKIINDYEEFSKERSSSLEGSPDEFSNGEELCGVMTISDSPREQDSES
QTLDKVYQMKSKPRGYCLIINNHNFAKAREKVPKLHSIRDRNGTHLDAGALTTTF
EELHFEIKPHDDCTVEQIYEILKIYQLMDHSNMDCFICCILSHGDKGIIYGTDGQEAP
IYELTSQFTGLKCPSLAGKPKVFFIQACQGDNYQKGIPVETDSEEQPYLEMDLSSPQ
TRYIPDEADFLLGMATVNNCVSYRNPAEGTWYIQSLCQSLRERCPRGDDILTILTE
VNYEVSNKDDKKNMGKQMPQPTFTLRKKLVFPSD
128.2e12scFv-hIgG1(SSS-P)H WCH2WCH3-hFADD-TM/CT(SEQ ID NO:477)
核苷酸序列:
aagcttatggattttcaagtgcagattttcagcttcctgctaatcagtgcttcagtcataatgtccagaggagtcgacattgtgctcaccc
aatctccagcttctttggctgtgtctctaggtcagagagccaccatctcctgcagagccagtgaaagtgttgaatattatgtcacaagtt
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aaagtaggaaggttccttggacgttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaacggggtggcggtggctcgggcggaggtggg
tcgggtggcggcggatctcaggtgcagctgaaggagtcaggacctggcctggtggcgccctcacagagcctgtccatcacatgc
accgtctcagggttctcattaaccggctatggtgtaaactgggttcgccagcctccaggaaagggtctggagtggctgggaatgat
atggggtgatggaagcacagactataattcagctctcaaatccagactgagcatcaccaaggacaactccaagagccaagttttctt
aaaaatgaacagtctgcaaactgatgacacagccagatactactgtgccagagatggttatagtaactttcattactatgttatggact
actggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctcagatctggagcccaaatcttctgacaaaactcacacatccccaccgtcccca
gcacctgaactcctgggtggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggt
cacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgc
caagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctga
atggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcag
ccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaa
ggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgct
ggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctcc
gtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaagcggatccttcgaacccgttcct
ggtgctgctgcactcggtgtcgtccagcctgtcgagcagcgagctgaccgagctcaagttcctatgcctcgggcgcgtgggcaag
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ggggccgcgcctggggaagaagacctgtgtgcagcatttaacgtcatatgtgataatgtggggaaagattggagaaggctggctc
gtcagctcaaagtctcagacaccaagatcgacagcatcgaggacagatacccccgcaacctgacagagcgtgtgcgggagtca
ctgagaatctggaagaacacagagaaggagaacgcaacagtggcccacctggtgggggctctcaggtcctgccagatgaacct
ggtggctgacctggtacaagaggttcagcaggcccgtgacctccagaacaggagtggggccatgtccccgatgtcatggaactc
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aatctccagcttctttggctgtgtctctaggtcagagagccaccatctcctgcagagccagtgaaagtgttgaatattatgtcacaagtt
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aggtttagtggcagtgggtctgggacagacttcagcctcaacatccatcctgtggaggaggatgatattgcaatgtatttctgtcagc
aaagtaggaaggttccttggacgttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaacggggtggcggtggctcgggcggaggtggg
tcgggtggcggcggatctcaggtgcagctgaaggagtcaggacctggcctggtggcgccctcacagagcctgtccatcacatgc
accgtctcagggttctcattaaccggctatggtgtaaactgggttcgccagcctccaggaaagggtctggagtggctgggaatgat
atggggtgatggaagcacagactataattcagctctcaaatccagactgagcatcaccaaggacaactccaagagccaagttttctt
aaaaatgaacagtctgcaaactgatgacacagccagatactactgtgccagagatggttatagtaactttcattactatgttatggact
actggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctcagatctggagcccaaatcttctgacaaaactcacacatccccaccgtcccca
gcacctgaactcctgggtggatcgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtc
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aagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaa
tggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagc
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gatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaagcggatccttcgaacccgttcctgg
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ggaggcacagattataattcagcaattaaatccagactgagcatcagcagggacacctccaagagccaagttttcttaaaaatcaac
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ttcccaccccaggtccacctgctaccgccgccgtcggaggagctggccctgaatgagctcgtgtccctgacatgcctggtgcgag
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氨基酸序列:(SEQ ID NO:488)
MDFQVQIFSFLLISASVIMSRGVDIVLTQSPTTIAASPGEKVTITCRASSSVSYMYWY
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SSTPLTFGSGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSQVQLKEAGPGLVQPTQTLSLTCTV
SGFSLTSDGVHWIRQPPGKGLEWMGIIYYDGGTDYNSAIKSRLSISRDTSKSQVFLK
INSLQTDDTAMYYCARIHFDYWGQGVMVTVSSDLEPKSSDKTHTSPPSPAPELLG
GSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP
REEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREP
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SFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKADPSNMDPFL
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tgtatgcatactccacagcacctggttattattcttggcgaaattcaaaggatggctcctggttcatccagtcgctttgtgccatgctga
aacagtatgccgacaagcttgaatttatgcacattcttacccgggttaaccgaaaggtggcaacagaatttgagtccttttcctttgac
gctacttttcatgcaaagaaacagattccatgtattgtttccatgctcacaaaagaactctatttttatcactaactcgagatcgataa
氨基酸序列:(SEQ ID NO:500)
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agtctccaacaaccatagctgcatctccaggggagaaggtcaccatcacctgccgtgccagctccagtgtaagttacatgtactggt
accagcagaagtcaggcgcctcccctaaactctggatttatgacacatccaagctggcttctggagttccaaatcgcttcagtggca
gtgggtctgggacctcttattctctcgcaatcaacaccatggagactgaagatgctgccacttattactgtcagcagtggagtagtact
ccgctcacgttcgggtctgggaccaagctggagatcaaacggggtggcggtggctcgggcggtggtgggtcgggtggcggcg
gatctcaggtgcagctgaaggaggcaggacctggcctggtgcaaccgacacagaccctgtccctcacatgcactgtctctgggtt
ctcattaaccagcgatggtgtacactggattcgacagcctccaggaaagggtctggaatggatgggaataatatattatgatggagg
cacagattataattcagcaattaaatccagactgagcatcagcagggacacctccaagagccaagttttcttaaaaatcaacagtctg
caaactgatgacacagccatgtattactgtgccagaatccactttgattactggggccaaggagtcatggtcacagtctcctctgatct
ggagcccaaatcttctgacaaaactcacacatccccaccgtccccagcacctgaactcctgggtggaccgtcagtcttcctcttccc
cccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctga
ggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaaacagcacgt
accgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccct
cccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccggg
atgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagca
atgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgt
ggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagag
cctctccctgtctccgggtaaagcggatccttcgaacatggacttcagcagaaatctttatgatattggggaacaactggacagtgaa
gatctggcctccctcaagttcctgagcctggactacattccgcaaaggaagcaagaacccatcaaggatgccttgatgttattccag
agactccaggaaaagagaatgttggaggaaagcaatctgtccttcctgaaggagctgctcttccgaattaatagactggatttgctg
attacctacctaaacactagaaaggaggagatggaaagggaacttcagacaccaggcagggctcaaatttctgcctacagggtca
tgctctatcagatttcagaagaagtgagcagatcagaattgaggtcttttaagtttcttttgcaagaggaaatctccaaatgcaaactgg
atgatgacatgaacctgctggatattttcatagagatggagaagagggtcatcctgggagaaggaaagttggacatcctgaaaaga
gtctgtgcccaaatcaacaagagcctgctgaagataatcaacgactatgaagaattcagcaaagagagaagcagcagccttgaag
gaagtcctgatgaattttcaaatggggaggagttgtgtggggtaatgacaatctcggactctccaagagaacaggatagtgaatcac
agactttggacaaagtttaccaaatgaaaagcaaacctcggggatactgtctgatcatcaacaatcacaattttgcaaaagcacggg
agaaagtgcccaaacttcacagcattagggacaggaatggaacacacttggatgcaggggctttgaccacgacctttgaagagctt
cattttgagatcaagccccacgatgactgcacagtagagcaaatctatgagattttgaaaatctaccaactcatggaccacagtaaca
tggactgcttcatctgctgtatcctctcccatggagacaagggcatcatctatggcactgatggacaggaggcccccatctatgagct
gacatctcagttcactggtttgaagtgcccttcccttgctggaaaacccaaagtgttttttattcaggcttgtcagggggataactacca
gaaaggtatacctgttgagactgattcagaggagcaaccctatttagaaatggatttatcatcacctcaaacgagatatatcccggat
gaggctgactttctgctggggatggccactgtgaataactgtgtttcctaccgaaaccctgcagagggaacctggtacatccagtca
ctttgccagagcctgagagagcgatgtcctcgaggcgatgatattctcaccatcctgactgaagtgaactatgaagtaagcaacaa
ggatgacaagaaaaacatggggaaacagatgcctcagcctactttcacactaagaaaaaaacttgtcttcccttctgattgagcatg
catcgata
氨基酸序列:(SEQ ID NO:502)
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核苷酸序列:(SEQ ID NO:503)
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accagcagaagtcaggcgcctcccctaaactctggatttatgacacatccaagctggcttctggagttccaaatcgcttcagtggca
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ccgctcacgttcgggtctgggaccaagctggagatcaaacggggtggcggtggctcgggcggtggtgggtcgggtggcggcg
gatctcaggtgcagctgaaggaggcaggacctggcctggtgcaaccgacacagaccctgtccctcacatgcactgtctctgggtt
ctcattaaccagcgatggtgtacactggattcgacagcctccaggaaagggtctggaatggatgggaataatatattatgatggagg
cacagattataattcagcaattaaatccagactgagcatcagcagggacacctccaagagccaagttttcttaaaaatcaacagtctg
caaactgatgacacagccatgtattactgtgccagaatccactttgattactggggccaaggagtcatggtcacagtctcctctgatct
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ggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgt
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cctctccctgtctccgggtaaagcggatccttcgaacatggacttcagcagaaatctttatgatattggggaacaactggacagtgaa
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agactccaggaaaagagaatgttggaggaaagcaatctgtccttcctgaaggagctgctcttccgaattaatagactggatttgctg
attacctacctaaacactagaaaggaggagatggaaagggaacttcagacaccaggcagggctcaaatttctgcctacagggtca
tgctctatcagatttcagaagaagtgagcagatcagaattgaggtcttttaagtttcttttgcaagaggaaatctccaaatgcaaactgg
atgatgacatgaacctgctggatattttcatagagatggagaagagggtcatcctgggagaaggaaagttggacatcctgaaaaga
gtctgtgcccaaatcaacaagagcctgctgaagataatcaacgactatgaagaattcagcaaagagagaagcagcagccttgaag
gaagtcctgatgaattttcaaatggggaggagttttgtggggtaatgacaatctcggactctccaagagaacaggatagtgaatcac
agactttggacaaagtttaccaaatgaaaagcaaacctcggggatactgtctgatcatcaacaatcacaattttgcaaaagcacggg
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cattttgagatcaagccccacgatgactgcacagtagagcaaatctatgagattttgaaaatctaccaactcatggaccacagtaaca
tggactgcttcatctgctgtatcctctcccatggagacaagggcatcatctatggcactgatggacaggaggcccccatctatgagct
gacatctcagttcactggtttgaagtgcccttcccttgctggaaaacccaaagtgttttttattcaggcttgtcagggggataactacca
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ggatgacaagaaaaacatggggaaacagatgcctcagcctactttcacactaagaaaaaaacttgtcttcccttctgattgagcatg
catcgataa
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gtatgcatctccaggcaaagccactgaggtccgggtgacagtgcttcggcaggctgacagccaggtgactgaagtctgtgcggc
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caacggaacccagatttatgtaattgatccagaaccgtgcccagattctgatcagccagttccctcaactccacctaccccatctccc
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gctgttcaaggaccacctgaccgtgacctctgtggctgctacagcgtgtccagtgtcctgccgggctgtgccgagccatggaacca
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ttcagccccaaggatgtgctggttcgctggctgcaggggtcacaggagctgccccgcgagaagtacctgacttgggcatcccgg
caggagcccagccagggcaccaccaccttcgctgtgaccagcatactgcgcgtggcagccgaggactggaagaagggggaca
ccttctcctgcatggtgggccacgaggccctgccgctggccttcacacagaagaccatcgaccgcttggcgggtaaacccaccca
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atccctgtcttctgcaaagcaatgcacgtggcccagcctgctgtggtactggccagcagccgaggcatcgccagctttgtgtgtga
gtatgcatctccaggcaaagccactgaggtccgggtgacagtgcttcggcaggctgacagccaggtgactgaagtctgtgcggc
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ccaaggactgagggccatggacacgggactctacatctgcaaggtggagctcatgtacccaccgccatactacctgggcatagg
caacggaacccagatttatgtaattgatccagaaccgtgcccagattctgatcagccagttccctcaactccacctaccccatctccc
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gaagcgatcctcacgtgcacactgaccggcctgagagatgcctcaggtgtcaccttcacctggacgccctcaagtgggaagagc
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ttcagccccaaggatgtgctggttcgctggctgcaggggtcacaggagctgccccgcgagaagtacctgacttgggcatcccgg
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ccttctcctgcatggtgggccacgaggccctgccgctggccttcacacagaagaccatcgaccgcttggcgggtaaacccaccca
tgtcaatgtgtctgttgtcatggcggaggtggactgataatctaga
氨基酸序列:(SEQ ID NO:508)
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QVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDQPVPST
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SGKSAVQGPPDRDLCGCYSVSSVLPGCAEPWNHGKTFTCTAAYPESKTPLTATLS
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PLTATLSKSGNTFRPEVHLLPPPSEELALNELVTLTCLARGFSPKDVLVRWLQGSQ
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TQKTIDRLAGK
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ctctggttactcattcactggctacatcgtgaactggctgaagcagagccatggaaagaaccttgagtggattggacttattaatccat
acaaaggtcttactacctacaaccagaaattcaagggcaaggccacattaactgtagacaagtcatccagcacagcctacatggag
ctcctcagtctgacatctgaagactctgcagtctattactgtgcaagatctgggtactatggtgactcggactggtacttcgatgtctgg
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ctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcaca
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acaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatgg
caaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagcccc
gagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggct
tctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggac
tccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgat
gcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaagcggatccttcgaacctgctcccatcct
gggccattaccttaatctcagtaaatggaatttttgtgatatgctgcctgacctactgctttgccccaagatgcagagagagaaggag
gaatgagagattgagaagggaaagtgtacgccctgtataaatcgat
氨基酸序列:(SEQ ID NO:512)
MDFQVQIFSFLLISASVIMSRGVDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDIRNYLN
WYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTIANLQPEDIATYFCQQ
GNTL PWTFGGGTKLVTKRELGGGGSGGGGSGGGGSIDEVQLQQSGPELVKPGAS
MSCKASGYSFTGYIVNWLKQSHGKNLEWIGLINPYKGLTTYNQKFKGKATLTVD
KSSSTAYMELLSLTSEDSAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGAGTTVTVSSDLEPK
SSDKTHTSPPSPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKF
NWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKA
LPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN
GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQ
KSLSLSPGKADPSNLLPSWAITLISVNGIFVICCLTYCFAPRCRERRRNERLRRESVR
PV
HCD16lowFL+NL
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atcattctttccacctgggtaccaagtctctttctgcttggtgatggtactcctttttgcagtggacacaggactatatttctctgtgaaga
caaacattcgaagctcaacaagagactggaaggaccataaatttaaatggagaaaggaccctcaagacaaatgaccc
氨基酸序列:(SEQ ID NO:514)
MWQLLLPTALLLLVSAGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDSVTLKCQGAYSPE
DNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRCQTNLSTLSDPVQLEVHIGWLL
LQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTALHKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATL
KDSGSYFCRGLVGSKNVSSETVNITITQGLAVSTISSFFPPGYQVSFCLVMVLLFAV
DTGLYFSVKTNIRSSTRDWKDHKFKWRKDPQDK
从前面的内容可以明白,尽管为了解释的目的,在本文中已经描述了本发明的特定实施方案,但是可以进行各种修改,而不脱离本发明的精神和范围。因此,本发明除了受到所附权利要求的限制外,不受限制。
在本文中引用的或提及的所有专利、专利申请、出版物、科学文章、网站和其他的文件和材料,都指明本发明所属领域的技术人员的技术水平,且每篇这样的引用的文件和材料在这里引作参考,其程度与各自整体引作参考或在本文中整体阐述相同。另外,在该申请中的所有权利要求和所有优先权申请,包括但不限于原始的权利要求,在这里整体引入本发明的书面描述,并形成它的一部分。申请人保留将来自任何这样的专利、申请、出版物、科学文章、网站、可电子地获得的信息和其他的引用的材料或文件的任何和所有材料和信息物理地整合进本说明书的权利。申请人保留物理地整合进本文件的任何部分(包括书面说明书的任何部分)、上面提及的权利要求(包括但不限于任何原始的权利要求)的权利。
本文所述的特定的方法和组合物是优选的实施方案的代表,且是示例性的,并无意限制本发明的范围。本领域的技术人员考虑本说明书,能够明白其他的目的、方面和实施方案,且其包含在如权利要求书的范围限定的本发明的精神内。本领域的技术人员能够容易地明白,可以对本文公开的发明进行各种替代和修改,而不脱离本发明的范围和精神。在缺少本文中没有特别公开为必需的任何因素或限制的情况下,可以适当地实现在本文中解释性地描述的本发明。因而,例如,在本文的每种情况下,在本发明的实施方案或实施例中,说明书中的术语“包含”、“基本上由……组成”和“由……组成”中的任一个,都可以用其他的2个术语中的任一个替代。同样,术语“包含”、“包括”、“含有”等应当广义地理解,且没有限制。可以以不同的步骤次序,适当地实现本文解释性地描述的方法和过程,且它们不必限于本文或权利要求中指出的步骤次序。如本文和所附的权利要求中使用的,单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该”也包括复数形式,除非上下文清楚地另有说明。因而,例如,提及“一个宿主细胞”包括许多这样的宿主细胞(例如,培养物或群体),依此类推。在任何情况下,都不能将本专利理解为限于本文特别公开的特定实施例或实施方案或方法。在任何情况下,都不能将本专利理解为限于专利和商标局(Patent and Trademark Office)的任何审查员或任何其他官员或雇员作出的任何陈述,除非这样的陈述被申请人在答复意见书中具体地且无条件地或无保留地明确采纳。
已经采用的术语和表达用作描述而不是限制性的术语,这样的术语和表达的应用,无意排除所示且所述的特征的任何等同方案或其部分,但是应当认识到,各种改进在要求保护的本发明的范围内是可能的。因而,应当理解,尽管已经通过优选的实施方案和任选的特征具体地公开了本发明,但本领域的技术人员可以使用本文公开的概念的修饰和变化,且认为这样的修饰和变化是在所附的权利要求限定的本发明的范围内的。
本文已经广泛地和一般地描述了本发明。每个落入一般公开内容的更窄的种类和亚类组,也形成本发明的一部分。这包括本发明的一般描述,其附带条件或负面限制是,从该种类去除任何主题,无论本文是否特别地引用了删去的材料。例如,本发明的主题可以任选地排除在2003年6月26日公开为U.S.S.N.2003/0118592A1的Ledbetter等的标题为″Binding Domain-Immunoglobulin Fusion Proteins″的相关申请中所述或包含的任一个主题或序列(和USPTO公开的SEQID NO:1-427的序列表)。
其他的实施方案也在下面的权利要求书中。另外,其中根据马库什组,描述了本发明的特征或方面,本领域的技术人员能认识到,此外还根据马库什组的各成员或成员的亚组,描述了本发明。
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Claims (36)

1.融合蛋白,其从氨基-末端到羧基-末端包含:
(i)结合靶分子的免疫球蛋白结合结构域多肽,其中所述免疫球蛋白结合结构域多肽是单链Fv多肽;
(i i)改变的野生型人IgG铰链多肽,其中所述野生型人IgG铰链多肽包含第一个、第二个和第三个半胱氨酸残基和脯氨酸残基,且所述的第一个半胱氨酸残基是在所述的第二个半胱氨酸的氨基-末端,所述的第二个半胱氨酸是在所述的第三个半胱氨酸的氨基-末端,且所述的第三个半胱氨酸是在脯氨酸的氨基-末端,且其中所述改变的野生型人I gG铰链多肽中野生型人IgG铰链多肽的脯氨酸已被突变,且其中一个或多个所述半胱氨酸残基被丝氨酸残基取代;和
(iii)氨基-末端截短的人IgG重链恒定区多肽,
其中所述的融合蛋白具有至少一种免疫活性。
2.权利要求1的融合蛋白,其中所述的免疫球蛋白结合结构域多肽包含人的或人源化的免疫球蛋白可变区。
3.权利要求1的融合蛋白,其中所述的免疫球蛋白结合结构域多肽结合肿瘤抗原或B细胞抗原。
4.权利要求3的融合蛋白,其中所述肿瘤抗原是癌细胞抗原。
5.权利要求3的融合蛋白,其中所述的B细胞抗原是CD20。
6.权利要求3的融合蛋白,其中所述的B细胞抗原是CD37。
7.权利要求3的融合蛋白,其中所述的B细胞抗原是CD22、CD40、CD80或CD86。
8.权利要求1的融合蛋白,其中所述的单链Fv多肽来自单克隆抗体2H7。
9.权利要求1的融合蛋白,其中所述的单链Fv多肽来自单克隆抗体G28-1。
10.权利要求1的融合蛋白,其中所述的单链Fv多肽来自单克隆抗体HD37、FC2.2、UCHL-1、5B9、L6、10A8、2e12、G19-4、1D8或40.2.220。
11.权利要求1的融合蛋白,其中所述的免疫球蛋白结合结构域多肽包含轻链可变区,后者通过接头肽附着到重链可变区,所述的接头肽包含SEQ ID NO:516中示出的氨基酸序列。
12.权利要求11的融合蛋白,其中所述的免疫球蛋白结合结构域多肽包含轻链可变区多肽,后者通过接头肽附着到重链可变区多肽,所述的接头肽具有SEQ ID NO:246中示出的氨基酸129-144。
13.权利要求1的融合蛋白,其中所述的氨基-末端截短的人IgG重链恒定区多肽包含CH2恒定区多肽,后者附着到CH3恒定区多肽。
14.权利要求13的融合蛋白,其中所述CH2和CH3恒定区多肽为人IgG1CH2和CH3恒定区多肽。
15.权利要求1的融合蛋白,其中所述的改变的野生型人IgG铰链多肽包含改变的人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4铰链区。
16.权利要求1的融合蛋白,其中所述脯氨酸被丝氨酸取代。
17.权利要求1的融合蛋白,其中(i)所述结合结构域包含来自单克隆抗体2H7的单链Fv;(ii)在改变的野生型人IgG铰链多肽中所述野生型人IgG铰链多肽的脯氨酸残基被丝氨酸取代,且其中在改变的野生型人IgG铰链多肽中,(a)第一个半胱氨酸被丝氨酸取代,(b)第二个半胱氨酸被丝氨酸取代,(c)第三个半胱氨酸被丝氨酸取代,(d)第一个和第二个半胱氨酸各自被丝氨酸取代,(e)第一个和第三个半胱氨酸各自被丝氨酸取代,(f)第二个和第三个半胱氨酸各自被丝氨酸取代,或(g)第一个、第二个和第三个半胱氨酸各自被丝氨酸取代;且(iii)所述的氨基-末端截短的人IgG重链恒定区多肽包含IgG1CH2和CH3结构域。
18.权利要求1的融合蛋白,其中(i)所述结合结构域包含来自单克隆抗体G28-1的单链Fv;(ii)在改变的野生型人IgG铰链多肽中所述野生型人IgG铰链多肽的脯氨酸残基被丝氨酸取代,且其中在改变的野生型人IgG铰链多肽中,(a)第一个半胱氨酸被丝氨酸取代,(b)第二个半胱氨酸被丝氨酸取代,(c)第三个半胱氨酸被丝氨酸取代,(d)第一个和第二个半胱氨酸各自被丝氨酸取代,(e)第一个和第三个半胱氨酸各自被丝氨酸取代,(f)第二个和第三个半胱氨酸各自被丝氨酸取代,或(g)第一个、第二个和第三个半胱氨酸各自被丝氨酸取代;且(iii)所述的氨基-末端截短的人IgG重链恒定区多肽包含IgG1 CH2和CH3结构域。
19.权利要求1的融合蛋白,其中所述改变的野生型人IgG铰链多肽包含SEQ ID NO:372中示出的氨基酸267-283或SEQ ID NO:374中示出的氨基酸260-276。
20.权利要求1的融合蛋白,其中所述改变的野生型IgG铰链多肽包含SEQ ID NO:246中示出的氨基酸267-283。
21.权利要求14的融合蛋白,其中所述人IgG1 CH2恒定区多肽包含在位置238、255、256、257、258、290、322、331和339处的一个或多个氨基酸突变。
22.权利要求21的融合蛋白,其中所述人IgG1 CH2恒定区多肽包含选自下述的一个或多个氨基酸突变:在位置238的脯氨酸至丝氨酸的取代、在位置255的精氨酸至谷氨酰胺的取代、在位置256的苏氨酸至天冬酰胺的取代、在位置257的脯氨酸至丙氨酸的取代、在位置258的谷氨酸至赖氨酸的取代、在位置290的赖氨酸至谷氨酰胺的取代、在位置322的赖氨酸至丝氨酸或亮氨酸的取代、在位置331的脯氨酸至丝氨酸的取代和在位置339处的丙氨酸至脯氨酸的取代。
23.权利要求14的融合蛋白,其中所述人IgG1 CH3恒定区多肽包含在位置405和407处的一个或多个氨基酸突变。
24.权利要求23的融合蛋白,其中所述在位置405处的氨基酸突变是苯丙氨酸至酪氨酸或丙氨酸的取代,且在位置407处的氨基酸突变是酪氨酸至丙氨酸的取代。
25.权利要求17的融合蛋白,其中所述融合蛋白包含下面示出的氨基酸序列:
SEQ ID NO:135,其中在位置283处的脯氨酸被丝氨酸取代,
SEQ ID NO:137,其中在位置283处的脯氨酸被丝氨酸取代,
SEQ ID NO:166,其中在位置283处的脯氨酸被丝氨酸取代,
SEQ ID NO:372,
SEQ ID NO:246,
SEQ ID NO:268,或
SEQ ID NO:276。
26.权利要求17的融合蛋白,其中所述融合蛋白由下面示出的氨基酸序列组成:SEQ ID NO:135,其中在位置283处的脯氨酸被丝氨酸取代;SEQ ID NO:166,其中在位置283处的脯氨酸被丝氨酸取代;SEQ IDNO:372;或SEQ ID NO:246。
27.权利要求17的融合蛋白,其中所述融合蛋白与由下面示出的氨基酸序列具有99%同一性:SEQ ID NO:166,其中在位置283处的脯氨酸被丝氨酸取代,或SEQ ID NO:246。
28.权利要求17的融合蛋白,其从氨基-末端到羧基-末端包含:(i)结合CD20的scFv结合结构域多肽,其中所述scFv包含由SEQ IDNO:689中示出的氨基酸23-128组成的免疫球蛋白轻链可变区多肽,由SEQ ID NO:246中示出的氨基酸129-144组成的接头肽,和由SEQ IDNO:689中示出的氨基酸145-265组成的免疫球蛋白重链可变区多肽,其中所述重链可变区多肽的亮氨酸155被丝氨酸取代;(ii)由SEQ IDNO:246中示出的氨基酸267-283组成的改变的野生型人IgG铰链多肽;和(iii)由SEQ ID NO:246中示出的氨基酸284-500组成的氨基-末端截短的人IgG重链恒定区多肽。
29.权利要求18的融合蛋白,其中所述融合蛋白包含下面示出的氨基酸序列:
SEQ ID NO:326,
SEQ ID NO:374,或
SEQ ID NO:328。
30.药物组合物,其包含组合了药学上可接受的载体的权利要求1-29中的任一项的融合蛋白。
31.权利要求1-29中任一项的融合蛋白在制备用于治疗B-细胞障碍的药物中的用途。
32.权利要求31的用途,其中所述B-细胞障碍是B-细胞淋巴瘤或慢性淋巴细胞性白血病。
33.权利要求31的用途,其中所述B-细胞障碍选自类风湿性关节炎和系统性红斑狼疮。
34.多核苷酸,其编码权利要求1-29中的任一项的融合蛋白。
35.表达载体,其包含可操作地连接到表达控制序列的权利要求34的多核苷酸。
36.重组宿主细胞,其含有权利要求34的多核苷酸。
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