CN1854157A - 胰岛素样生长因子i受体的抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及与胰岛素样生长因子I受体(IGF－IR)，优选地是人的IGF－IR，特异性结合的抗体和其抗原结合部分。本发明还涉及人的抗－IGF－IR抗体，包括嵌合的、双特异性的、衍生化的、单链抗体或部分融合蛋白。本发明还涉及分离的衍生自抗－IGF－IR抗体的重链和轻链免疫球蛋白分子和编码这种分子的核酸分子。本发明还涉及制备抗－IGF－IR抗体的方法，含有这些抗体的药物组合物和利用该抗体和其组合物进行诊断和治疗的方法。本发明还提供了利用编码重链和/或轻链免疫球蛋白分子的核酸分子进行基因治疗的方法，所述免疫球蛋白分子含有人的抗－IGF－IR抗体。本发明还涉及基因疗法和含有本发明的核酸分子的转基因动物。

Description

胰岛素样生长因子I受体的抗体
本申请是分案申请，母案申请号为01821808.3(国际申请号PCT/US01/51113)，申请日2001年12月20日，发明名称为“胰岛素样生长因子I受体的抗体”。
技术领域
该申请要求了申请日为2001年1月5日的美国临时申请60/259,927的优先权。
技术背景
胰岛素样生长因子(IGF-I)是7.5-kD的多肽，该多肽以非常高的浓度循环于血浆之中，并于大多数的组织中被发现。IGF-I刺激细胞的分化和增殖，而且是大多数哺乳动物类型细胞进行持续增殖所必需的。这些类型的细胞包括人二倍体成纤维细胞、上皮细胞、平滑肌细胞、T淋巴细胞、神经细胞、骨髓细胞、软骨细胞、成骨细胞和骨髓干细胞等。有关由IGF-I/IGF-I受体的相互作用介导细胞增殖的多种类型细胞的综述参见Goldring等，Eukar.Gene Express，1：31-326(1991)。
在转导途径中引起IGF-I-刺激的细胞增殖或分化的第一个步骤是IGF-I或IGF-II(或超生理学浓度的胰岛素)与IGF-I受体的结合。IGF-I受体由两种类型的亚单位组成：α亚单位(一种130-135kD的蛋白，该蛋白全部是胞外蛋白，且在配体结合过程中发挥作用)和β亚单位(一种95-kD的跨膜蛋白，具有跨膜和胞质区域)。IGF-IR属于酪氨酸激酶生长因子受体家族(μllrich等，Cell 61：203-212，1990)，而且在结构上类似于胰岛素受体(μllrich等，EMBO J.5：2503-2512，1986)。IGF-IR最初被合成为一种单链前体受体多肽的形式，然后通过糖基化处理、蛋白水解裂解和共价结合而被装配成一种含有两个α-亚单位和两个β-亚单位的460-kD的成熟异四聚体。β-亚单位具有由配体激活的酪氨酸激酶活性。该活性与介导配体作用的信号途径有关，所述配体作用包括β-亚单位的自磷酸化和IGF-IR底物的磷酸化。
IGF-I的体内血清浓度依赖于垂体生长激素(GH)的存在。尽管肝脏是GH-依赖性IGF-I合成的一个主要场所。但是最近的研究工作表明大多数的正常组织也产生IGF-I。各种赘生性组织也可以产生IGF-I。因此通过自分泌或旁分泌以及内分泌机制IGF-I可以作为正常或异常细胞增殖的调节剂。IGF-I和IGF-II在体内与IGF结合蛋白(IGFBP)结合。与IGF-IR相互作用的游离IGF的利用率受IGFBP的调控。有关IGFBP和IGF-I的综述参见Grimberg等，J.Cell.Physiol.183：1-9，2000。
IGF-I和/或IGF-IR在体外和体内对肿瘤细胞的维持作用得到了有力的证实。IGF-IR在肺肿瘤(Kaiser等，J.Cancer Res.Clin Oncol.119：665-668，1993；Moody等，Life Sciences 52：1161-1173，1993；Macaμley等，Cancer Res.，50：2511-2517，1990)，乳腺肿瘤(Pollak等，Cancer Lett.38：223-230，1987；Foekens等，Cancer Res.49：7002-7009，1989；Cμllen等，Cancer Res.49：7002-7009，1990；Arteaga等，J.Clin.Invest.84：1418-1423，1989)，前列腺和结肠肿瘤(RemaoleBennet等，J.Clin.Endocrinol.Metab.75：609-616，1992；Guo等，Gastroenterol.102：1101-1108，1992)中的浓度增高。IGF-I在前列腺上皮中的去调控表达导致转基因小鼠体内肿瘤的形成(DiGiovanni等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：3455-60，2000)。另外，IGF-I似乎是一种自分泌的人神经胶质瘤刺激物(Sandberg-Nordqvist等，Cancer Res.53：2475-2478，1993)，而IGF-I刺激过表达IGF-IR的纤维肉瘤的生长(Butler等，Cancer Res.58：3021-27，1998)。而且，IGF-I水平偏高的个体患常见癌症的风险要比IGF-I处于正常范围内偏低水平的个体患常见癌症的风险大(Rosen等，Trends Endocrinol.Metab.10：136-41，1999)。许多这些类型的肿瘤细胞对培养物中具有增殖信号的IGF-I产生应答(Nakanishi等，J.Clin.Invest.82：354-359，1988；Freed等，J.Mol.Endocrinol.3：509-514，1989)，并且已经推导出体外增殖的自分泌或旁分泌环路(LeRoith等，Endocrine Revs.16：143-163，1995；Yee等，Mol.Endocrinol.3：509-514，1989)。有关IGF-I/IGF-I受体间的相互作用在多种人肿瘤生长过程中的作用的综述参见Macaμlay，Br.J.Cancer，65：311-320，1992。
增高的IGF-I水平还与包括肢端巨大症和巨人症在内的几种非癌性病理状态有关(Barkan，Cleveland Clin.J.Med.65：343，347-349，1998)，而异常的IGF-I/IGF-I受体功能与牛皮癣(Wraight等，Nat.Biotech.18：521-526，2000)，动脉粥样硬化和血管成形术后的血管平滑肌再狭窄(Bayes-Genis等，Circ.Res.86：125-130，2000)有关。增高的IGF-I水平还可能导致糖尿病或其并发症，如微血管增殖(Smith等，Nat.Med.5：1390-1395，1999)。尤其是当GH血清水平降低时或当对GH不敏感或具有抗性时发生的IGF-I水平的降低与诸如身材矮小(Laron，Paediatr.Drμgs 1：155-159，1999)、神经病、肌肉块减少和骨质疏松(Rosen等，Trends Endocrinol.Metab.10：136-141，1999)这样的病症有关。
已经利用反义表达载体或IGF-IR RNA的反义寡核苷酸证实了干扰IGF-IR造成对IGF-I-介导的或IGF-II-介导的细胞生长的抑制(参见例如Wraight等，Nat.Biotech.18：521-526，2000)。反义策略在抑制几种正常细胞类型和人肿瘤细胞系的细胞增殖方面取得了成功。生长还可以通过利用IGF-I的肽类似物(Pietrzkowski等，Cell Growth &Diff.3：199-205，1992；和Pietrzkowski等，Mol.Cell.Biol.，12：3883-3889，1992)或表达IGF-I RNA的反义RNA的载体(Trojan等，Science 259：94-97，1992)得到抑制。另外，IGF-IR的抗体(Arteaga等，Breast Canc.Res.Treatm.，22：101-106，1992；和Kalebic等，Cancer Res.54：5531-5534，1994)和IGF-IR的显性失活突变体(Prager等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91：2181-2185，1994；Li等，J.Biol.Chem.，269：32558-32564，1994和Jiang等，Oncogene 18：6071-77，1999)能够逆转被转化的表型，抑制肿瘤发生和诱导转移性表型的丧失。
IGF-I在编程性细胞死亡的调节过程中也发挥着重要的作用。编程性细胞死亡，即细胞程序死亡与包括免疫和神经系统成熟过程在内的多种发育过程有关。除了在发育过程中的作用外，编程性细胞死亡还涉及防止肿瘤发生的重要细胞防护作用(Williams，Cell 65：1097-1098，1991；Lane，Nature 362：786-787，1993)。各种遗传损伤对编程性细胞死亡的程序的抑制可能会导致恶性肿瘤的发生和发展。
IGF-I避免了由于去除了IL-3依赖性造血细胞中的细胞因子而引起的编程性细胞死亡(Rodriguez-Tarduchy，G.等，J.Immunol.149：535-540，1992)，而且避免了由于去除了Rat-1/mycER细胞中的血清而引起的编程性细胞死亡(Harrington，E.，等，EMBO J.13：3286-3295，1994)。IGF-I对编程性细胞死亡的抑制作用在细胞循环周期的后期-定型阶段中发挥着重要的作用，并且也在细胞循环进展中由鬼臼亚乙苷或胸苷封闭的细胞中发挥着重要的作用。由c-myc驱动的成纤维细胞的存活依赖于IGF-I的实验证据表明通过特异性地抑制编程性细胞死亡，IGF-IR在维持肿瘤细胞方面起着重要的作用，一种不同于IGF-I或IGF-IR的增殖效应的作用。这可能类似于被认为是由其它抑制-编程性细胞死亡基因如bcl-2在促进肿瘤存活方面发挥的作用(McDonnell等，Cell 57：79-88，1989；Hockenberry等，Nature 348：334-336，1990)。
IGF-I对编程性细胞死亡的保护作用取决于使细胞上的IGF-IR与IGF-I相互发生作用(Resnicoff等，Cancer Res.55：3739-3741，1995)。用于证实IGF-IR在维持肿瘤细胞过程中具有抑制编程性细胞死亡功能的证据还可以通过以下研究来提供：利用IGF-IR的反义寡核苷酸确定IGF-IR的水平、编程性细胞死亡的程度和大鼠同系肿瘤的肿瘤发生率之间的定量关系(Rescinoff等，Cancer Res.55：3739-3741，1995)。已经发现IGF-1R的超表达能够使体外肿瘤细胞避免发生由鬼臼亚乙苷诱导的编程性细胞死亡(Sell等，Cancer Res.55：303-306，1995)，甚至更加惊奇地发现IGF-IR的水平低于野生型的水平从而引起体内肿瘤细胞的大量编程性细胞死亡(Resnicoff等，Cancer Res.55：2463-2469，1995)。
用于诱导编程性细胞死亡或用于抑制与IGF-I增加、IGF-II增加和/或IGF-IR受体增加有关的细胞增殖的可能性策略包括抑制IGF-I的水平或IGF-II的水平或者避免IGF-I与IGF-IR的结合。例如，长效促生长素抑制素类似物奥曲肽(octreotide)已被用来减少IGF的合成和/或分泌。可溶性的IGF-IR已被用来诱导体内肿瘤细胞的编程性细胞死亡和抑制动物实验系统中的肿瘤发生(D′Ambrosio等，CancerRes.56：4013-20，1996)。另外，IGF-IR反义寡核苷酸、IGF-I的肽类似物和IGF-IR的抗体已经被用来降低IGF-I或IGF-IR的表达(参见上文)。然而，这些化合物中没有一种适用于对人类患者进行长期给药。另外，尽管IGF-I已经被施用于患者来治疗身材矮小症、骨质疏松症、降低肌肉量、神经病或糖尿病，IGF-I与IGFBP的结合经常使得利用IGF-I的治疗非常困难或无效。
因此，由于当IGF-I和/或IGF-IR过表达时，IGF-I和IGF-IR对诸如癌症和其它增殖性疾病的病症具有作用，而当IGF-I和/或IGF-IR表达不足时，IGF-I和IGF-IR对诸如身材矮小和虚弱这样的病症几乎没有作用，因此需要产生用来抑制或刺激IGF-IR的IGF-IR的抗体。尽管已报道在某些患有自身免疫疾病的患者体内存在抗-IGF-IR抗体，然而这些抗体还未得到纯化，并且也没有证实这些抗体适于在诊断或临床过程中抑制IGF-I的活性。参见例如Thompson等，Pediat.Res.32：455-459，1988；Tappy等，Diabetes 37：1708-1714，1988；Weightman等，Autoimmunity 16：251-257，1993；Drexhage等，Nether.J.of Med.45：285-293，1994。因此，希望获得能够用于治疗人体疾病的高-亲合力的人抗-IGF-IR抗体。
附图的简要描述
图1A-1C表示六种人抗-IGF-IR抗体的轻链可变区核苷酸序列彼此之间的序列对比以及与种系序列之间的序列对比。图1A表示抗体2.12.1(SEQ ID NO：I)、2.13.2(SEQ ID NO：5)、2.14.3(SEQ ID NO：9)和4.9.2(SEQ ID NO：13)的轻链可变区(VL)的核苷酸序列彼此之间的序列对比以及与种系VκA30序列(SEQ ID NO：39)之间的序列对比。图IB表示抗体4.17.3的VL的核苷酸序列(SEQ ID NO：17)与种系VκO12序列(SEQ ID NO：41)之间的序列对比。图1C表示抗体6.1.1的VL的核苷酸序列(SEQ ID NO：21)与种系VκA27序列(SEQ ID NO：37)之间的序列对比。所述排列序列还表示各种抗体的VL的CDR区域。附图1A-1C的共有序列分别如SEQ ID NO：53-55所示。
附图2A-2D表示六种人抗-IGF-IR抗体的重链可变区的核苷酸序列彼此之间的序列对比以及与种系序列之间的序列对比。附图2A表示抗体2.12.1的VH的核苷酸序列(SEQ ID NO：3)与种系VH DP-35序列(SEQ ID NO：29)之间的序列对比。附图2B表示抗体2.14.3的VH的核苷酸序列(SEQ ID NO：11)与种系VIV-4/4.35序列(SEQ IDNO：43)之间的序列对比。附图2C-1和2C-2表示抗体2.13.2(SEQ IDNO：7)，4.9.2(SEQ ID NO：15)和6.1.1(SEQ ID NO：23)的VH的核苷酸序列彼此之间的序列对比以及与种系VH DP-47序列(SEQ ID NO：31)之间的序列对比。附图2D表示抗体4.17.3的VH的核苷酸序列(SEQ ID NO：19)与种系VH DP-71序列(SEQ ID NO：35)之间的序列对比。所述排列序列还表示抗体的CDR区域。附图2A-2D的共有序列分别如SEQ ID NO：56-59所示。
附图3表示抗-IGF-IR抗体2.13.2、4.9.2和2.12.1抑制IGF-I与3T3-IGF-IR细胞的结合。
附图4表示抗-IGF-IR抗体4.9.2抑制由IGF-I-诱导的受体酪氨酸磷酸化(上图)，且在细胞表面诱导IGF-IR负调节(下图)。
附图5表示抗-IGF-IR抗体2.13.2和4.9.2减弱3T3-IGF-IR肿瘤内的IGF-IR磷酸酪氨酸信号。
附图6表示抗-IGF-IR抗体2.13.2和4.9.2降低3T3-IGF-IR内的IGF-IR。
附图7表示抗-IGF-IR抗体2.13.2能够单独(左图)或与阿霉素结合右图)抑制体内3T3-IGF-IR肿瘤的生长。
附图8表示抗-IGF-IR抗体2.13.2的血清水平与3T3-IGF-IR肿瘤内的IGF-IR负调节之间的关系。
附图9表示抗-IGF-IR抗体2.13.2单独进行多次给药或与阿霉素结合多次给药能够抑制体内的3T3-IGF-IR肿瘤的生长。
附图10表示抗-IGF-IR抗体2.13.2与阿霉素联用能够抑制体内大肿瘤的生长。
附图11表示抗-IGF-IR抗体2.13.2单独或与5-脱氧尿苷(5-FU)联用抑制体内的Colo 205肿瘤的生长。
附图12表示抗-IGF-IR抗体2.13.2单独进行多次给药或与5-FU联用多次给药能够抑制体内的Colo 205肿瘤的生长。
附图13表示抗-IGF-IR抗体2.13.2单独进行多次给药或与紫杉醇联用多次给药能够抑制体内的MCF-7肿瘤的生长。
附图14表示抗-IGF-IR抗体2.13.2单独(左图)或与阿霉素联用(右图)能够抑制体内的MCF-7肿瘤的生长。
附图15表示抗-IGF-IR抗体2.13.2单独进行多次给药或与他莫昔芬(tamoxifen)联用多次给药能够抑制体内的MCF-7肿瘤的生长。
附图16表示抗-IGF-IR抗体2.13.2单独进行多次给药(左图)或与表皮生长因子受体(EGF-R)酪氨酸激酶抑制剂CP-358，774联用多次给药能够抑制体内的A431肿瘤的生长。
附图17表示对猕猴(Cynomologus monkeys)单次静脉内注射抗-IGF-IR抗体2.13.2的药动学评价。
附图18表示抗-IGF-IR抗体2.13.2与阿霉素的联用增强了IGF-IR对体内3T3-IGF-IR肿瘤的负调节。
附图19A表示与种系序列比较在2.13.2和2.12.1的重链和轻链的不同区域内发生的突变数目。
附图19A-D表示抗体2.13.2和2.12.1的重链和轻链的氨基酸序列与从中获得这些氨基酸序列的种系序列之间的序列对比。附图19B表示抗体2.13.2的重链氨基酸序列(SEQ ID NO：45)与种系序列DP-47(3-23)/D6-19/JH6的氨基酸序列(SEQ ID NO：46)的序列对比。附图19C表示抗体2.13.2的轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO：47)与种系序列A30/Jk2的氨基酸序列(SEQ ID NO：48)之间的序列对比。附图19D表示抗体2.12.1的重链氨基酸序列(SEQ ID NO：49)与种系序列DP-35(3-11)/D3-3/JH6的氨基酸序列(SEQ ID NO：50)之间的序列对比。附图19E表示抗体2.12.1的轻链氨基酸序列(SEQ ID NO：51)与种系序列A30/Jkl的氨基酸序列(SEQ ID NO：52)之间的序列对比。在附图19B-E中，信号序列以斜体表示，CDR加上了下划线，恒定区是粗体，构架(FR)突变通过在氨基酸残基上加注加号(″+″)来加以突出，而CDR突变通过在氨基酸残基上加注星号来加以突出。
发明简述
本发明提供了结合IGF-IR的分离抗体或其抗原-结合部分，优选地是与灵长目动物和人IGF-IR结合的抗体或其抗原-结合部分，以及更优选地是人的抗体。本发明提供了抑制IGF-I或IGF-II与IGF-IR结合的抗-IGF-IR抗体，并且还提供了激活IGF-IR的抗-IGF-IR抗体。
本发明提供了含有所述抗体和药学可接受的载体的药物组合物。该药物组合物可进一步含有另一种成分，诸如抗肿瘤剂或显影剂。
本发明还提供了诊断和治疗方法。诊断方法包括用于利用抗-IGF-IR抗体诊断IGF-IR-表达组织的存在或定位的方法。治疗方法包括给需要抗体的受试者施用所述抗体，优选地结合施用另一种治疗剂。
本发明提供了分离的产生抗-IGF-IR抗体的细胞系，诸如杂交瘤。
本发明还提供了编码抗-IGF-IR抗体的重链和/或轻链或其抗原结合部分的核酸分子。本发明提供了含有所述核酸分子的载体和宿主细胞以及重组生产由所述核酸分子编码的多肽的方法。
还提供了表达抗-IGF-IR抗体的重链和/或轻链或其抗原结合部分的非人类转基因动物。本发明还提供了采用有效量的核酸分子治疗需要治疗的主体，该核酸分子编码抗-IGF-IR抗体的重链和/或轻链或其抗原结合部分.
发明详述
定义和常规技术
除非本文另有定义，本发明涉及使用的科技术语具有本技术领域中的普通技术人员通常理解的含义。而且，除非本文另有需要，单数形式的术语包括复数以及复数术语包括单数。通常，与本文记载的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白质和核酸化学和杂交有关的术语和技术是本技术领域中熟知和通用的术语和技术。除非另有说明，本发明的方法和技术通常按照本技术领域中已知的以及如本说明书中所列举和讨论的各种一般性的和比较具体的参考文献中所记载的常规方法进行。参见例如Sambrook等。分子克隆(Molecμlar Cloning)：实验手册(A Laboratory Manual)，第二版，冷泉港实验出版社，冷泉港，纽约(1989)和Ausubel等，最新分子生物学实验方法汇编(Current Protocols in Molecμlar Biology)，格林氏出版联合会(Greene Publishing Associates)(1992)以及Harlow和Lane抗体(Harlow和Lane Antibodies)：实验手册(A Laboratory Manual)，冷泉港实验出版社，冷泉港，纽约(1990)，这些文献被引入本文作为参考。酶促反应和纯化技术是按照厂商提供的产品使用说明书、本技术领域中的通用方法或本文所记载的方法进行的。与本文记载的分析化学、有机合成化学以及医药和药用化学有关的术语、实验室操作规程和技术是在本技术领域中通晓和通用的。化学合成、化学分析、药物制备、配制和给药以及对患者的治疗所采用的是标准技术。
除非另有说明，下列术语被理解成具有以下含义：
术语“多肽”包括天然或人工蛋白质、蛋白质片段和蛋白质序列的多肽类似物。多肽可以是单体或多具体的形式。
术语“被分离的蛋白质”或“被分离的多肽”是指就其来源来说(1)不含在其自然状态与其共存的自然结合的成分，(2)不含同种其它蛋白质，(3)由不同种细胞表达的或(4)自然界中不存在的蛋白质。因此，化学合成的或在不同于自然产生其的细胞的细胞系统中合成的多肽被从与其自然结合的成分中“分离”出来。通过利用本技术领域中通晓的蛋白质纯化技术进行分离还可以提供出基本不含自然结合成分的蛋白质。
当至少约60至75％的样品具有单独种类的多肽时，那么蛋白质或多肽就是“基本纯的”、“基本同质的”或“基本被纯化的”。所述多肽或蛋白质可以是单体或多体形式。基本纯的多肽或蛋白质通常含有约50％，60，70％，80％或90％W/W的蛋白质样品，优选约95％、更优选地是具有99％以上的纯度。蛋白质的纯度或同质性可以通过本技术领域中通晓的多种方法来测定，诸如对蛋白质样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，接着通过采用本技术领域中熟知的染色剂将凝胶染色来检测单一的多肽电泳带。为了特定的目的，可以通过采用HPLC或其它本技术领域中熟知的纯化技术来达到较高的分离度。
本文使用的术语“多肽片段”是指具有氨基端和/或羧基端缺失、而剩余的氨基酸序列与自然存在序列中的相应位点相同的多肽。片段通常是至少5，6，8或10个氨基酸的长度，优选地是至少14个氨基酸的长度，更优选地是至少20个氨基酸的长度，通常是至少50个氨基酸的长度，甚至更优选地是至少70，80，90，100，150或200个氨基酸的长度。
本文使用的术语“多肽类似物”是指由与部分氨基酸序列基本具有相同性的至少25个氨基酸长度的片段组成的、而且具有至少一种以下特性的多肽，所述特性是：(1)在适当的结合条件下与IGF-IR特异结合，(2)能够阻断IGF-I或IGF-II与IGF-IR的结合，或(3)能够降低IGF-IR细胞的表面表达或者体外或体内的酪氨酸磷酸化作用。多肽类似物通常具有关于自然存在序列的保守氨基酸的取代(或着插入或者缺失)。类似物通常是至少20个氨基酸的长度，优选地是至少50，60，70，80，90，100，150或200个氨基酸的长度或更长的长度，而且经常与自然存在的全长多肽具有同样的长度。
优选的氨基酸取代是以下这些取代：(1)降低了针对蛋白水解作用的敏感性，(2)降低了针对氧化作用的敏感性，(3)改变了形成蛋白复合物的结合亲合力，(4)改变了亲合力和(5)赋予或改变了这种类似物的其它物理化学或性能。类似物可以包括除自然存在的肽序列以外的各种突变蛋白的序列。例如，可以在自然存在的序列中(优选地在形成分子间接触的区域以外的肽部分中)进行单个或多个氨基酸的取代(优选地是保守氨基酸的取代)。保守氨基酸的取代基本上不会改变母本序列的结构特性(例如一个取代氨基酸不会破坏存在于母本序列中的螺旋结构或破坏决定母本序列特性的其它类型的二级结构)。人工识别的多肽的二级和三级结构的实例被记载在“蛋白，结构和分子原理(Proteins，Structures and Molecμlar Principles)”(Creighton，Ed.，W.H.Freeman和Company，纽约(1984))；“蛋白质结构入门(Introductionto Protein Structure)”(C.Branden和J.Tooze，eds.，GarlandPublishing，纽约，N.Y.(1991))；和Thornton等，自然(Nature)354：105(1991)中，这些文献被分别引入本文作为参考。
非-肽类似物在制药业中被通常用作具有类似于模板肽的特性的药物。这些类型的非-肽化合物被命名为“肽模拟物”(peptide minectics或peptidomimetics)。Fauchere，J.Adv.Drμg Res.15：29(1986)；Veber和Freidinger TINS p.392(1985)；以及Evans等，J.Med.Chem.30：1229(1987)，其被引入本文作为参考。这种化合物通常借助于计算机分子模拟来进行研制。可以采用结构类似于治疗用肽的肽模拟物来提供等价的治疗或预防效果。一般而言，肽模拟物的结构类似于范例性质(paradigm)的多肽(即具有所需生物化学特性或药物活性的多肽)，诸如人抗体，但是具有一个或多个任选地由选自--CH2NH--、--CH2S--、--CH2-CH2--、--CH＝CH--(顺式和反式)，--COCH2--、--CH(OH)CH2--和--CH2SO--的键、通过本技术领域中熟知的方法取代的肽键。以同种类型的D-氨基酸(例如D-赖氨酸取代L-赖氨酸)系统取代共有序列的一个或多个氨基酸的方法可以被用来制备更稳定的肽。另外，可以通过本技术领域中的已知方法(Rizo和Gierasch，Ann.Rev.Biochem.61：387(1992)，被引入本文作为参考)，例如通过添加能够形成环化肽的分子内二硫键的内部半胱氨酸残基来制备含有共有序列或基本相同的共有序列变异体的限制肽。
“免疫球蛋白”是一种四聚体分子。在自然存在的免疫球蛋白中，每个四聚体由两对相同的肽链组成，每对具有一个“轻”链(约25kDa)和一个“重”链(约50-70kDa)。每条链的氨基端部分包含一个约100至110个或更多个氨基酸的主要用于识别抗原的可变区。每条链的羧基端部分限定了一个主要起效应物功能的恒定区。人的轻链被分为κ和λ轻链。重链被分为μ，Δ，γ，a或ε，并由此将抗体的同种型分别定义为IgM，IgD，IgG，IgA和IgE。在轻链和重链中，可变区和恒定区被由约12个或更多个氨基酸的″J″区域连接在一起，同时重链还可包含一个约10个以上的氨基酸的″D″区域。一般参见基础免疫学(Fundamental Immunology)第7章(Paμl，W.编辑，第2版.RavenPress，N.Y.(1989))(被全文引入用于所有目的参考)。每对轻链/重链可变区形成抗体结合位点从而使得完整的免疫球蛋白具有两个结合位点。
免疫球蛋白链具有由三个高变区连接而成的相对保守构架区域(FR)的相同总结构，其中所述高变区也被称作互补性决定区或CDR。来自每对中的两条链的CDR由构架区域连成一行，从而能与特异性表位结合。从N-端到C-端，两个轻链和重链含有FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3和FR4结构域。每个结构域的氨基酸分配按照Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest(NationalInstitutes of Health，Bethesda，Md.(1987 and 1991))，或Chothia &Lesk J.Mol.Biol.196：901-917(1987)；Chothia等.Nature 342：878-883(1989)中的定义进行。
“抗体”是指完整的免疫球蛋白或其与完整抗体进行特异性结合竞争的抗原结合部分。抗原结合部分可以通过DNA重组技术或通过酶促或化学裂解完整抗体来制备。抗原结合部分具体包括Fab，Fab′，F(ab′)2，Fv，dAb和互补性决定区域片段，单链抗体(scFv)，嵌合抗体，双体(diabodies)和含有至少部分免疫球蛋白的多肽，所述部分免疫球蛋白足以使得所述多肽具有特异结合抗原的特性。
本文使用的例如被指定为2.12.1，2.13.2，2.14.3，4.9.2，4.17.3和6.1.1的抗体是得自于相同名称的杂交瘤的抗体。例如，抗体2.12.1得自于杂交瘤2.12.1。
Fab片段是一种由VL，VH，CL和CH I结构域组成的单价片段；F(ab′)2片段是一种含有两个由铰链区的二硫键连接的Fab片段的双价片段；Fd片段由VH和CH1结构域组成；Fv片段由抗体的单臂的VL和VH结构域组成；以及dAb片段(Ward等，Nature 341：544-546，1989)由VH结构域组成。
单链抗体(scFv)是一种其中VL和VH区域配对形成通过合成接头连接的单价分子、从而使这些分子被制成单链蛋白的抗体(Bird等，Science 242：423-426，1988和Huston等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883，1988)。双体是双价的、双特异性抗体，该抗体中的VH和VL结构域被表达在单一多肽单链上，但利用了一个短得不能使同一链上的两个结构域之间进行配对的接头，从而使所述结构域与其它链上的互补性结构域配对而创建了两个抗原结合位点(参见例如Holliger，P.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448，1993，和Poljak，R.J.等，Structure 2：1121-1123，1994)。可以将一个或多个CDR共价或非共价地引进分子当中从而使其成为一种免疫粘附素。免疫粘附素可以将CDR引进作为多肽长链的一部分，可以将CDR共价连接到另一条多肽链上，或者可以非共价引进CDR。CDR使得免疫粘附素与特定目的抗原进行特异性结合。
一种抗体可以具有一个或多个结合位点。如果具有一个以上的结合位点，结合位点可以是彼此相同的或不同的。例如，一种自然存在的免疫球蛋白具有两个相同的结合位点，一种单链抗体或Fab片段具有一个结合位点，而一种“双特异性”或“双功能”抗体具有两个不同的结合位点。
“被分离的抗体”是(1)不与包括其它自然存在的结合抗体在内的天然结合成分结合的，所述成分以其天然状态与其共存，(2)不含其它同种蛋白，(3)由不同种细胞表达的或(4)自然界不存在的抗体。被分离的抗体的实例包括利用IGF-IR亲和纯化的抗-IGF-IR的抗体，通过杂交瘤或其它细胞系体外合成的抗-IGF-IR抗体，和得自转基因鼠的人抗-IGF-IR抗体。
术语“人抗体”包括所有具有一个或多个得自人免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。在一个优选的实施方案中，所有可变区和恒定区得自人免疫球蛋白序列(一种完整的人抗体)。这些抗体可以通过多种下述方式来制备。
人源化抗体是一种得自非人品种的抗体，其中构架中以及重链和轻链的恒定区的某些氨基酸被突变从而避免或消除了人体内的免疫应答。或者，可以通过将人抗体的恒定区和非人抗体的可变区融合到一起来制备人源化抗体。如何制备人源化抗体的实例见美国专利US6054297，US5886152和US5877293。
术语“嵌合抗体”是指含有一个或多个来源于一个抗体的区域以及一个或多个来源于一个或多个其它抗体的区域的抗体。在一个优选的实施方案中，一个或多个CDR得自一种人的抗-IGF-IR抗体。在一个更有选的实施方案中，所有CDR得自一种人的抗-IGF-IR抗体。在另一个优选的实施方案中，源自一种以上的人的抗-IGF-IR抗体的CDR被混合在一起从而匹配成一种嵌合抗体。例如，嵌合抗体可以含有一个源自第一种人抗IGF-IR抗体的轻链CDR1，该CDR1可以与源自第二种人抗IGF-IR抗体的轻链CDR2和CDR3结合，源自重链的CDR可以得自第三种人抗IGF-IR抗体。而且，构架区域可以得自于一种相同的抗IGF-IR抗体，可以得自于一种或多种不同抗体如人抗体，或者得自于人源化抗体。
“中和抗体”或“抑制性抗体”是一种抑制IGF-IR与IGF-I结合的抗体，其中过量的抗IGF-IR抗体将与IGF-IR结合的IGF-I的量降低了至少约20％。在一个优选的实施方案中，抗体将与IGF-IR结合的IGF-I的量降低了至少约40％，更优选地是60％，甚至更优选地是80％，或者更优选地是85％。结合量的降低可以通过本技术领域普通技术人员已知的方法进行测定，例如通过体外竞争结合试验进行测定。测定IGF-I与IGF-IR的结合量降低的实例由下面的实施例IV来提供。
“激活抗体”是一种当其被加到表达IGF-IR的细胞、组织或生物体时激活至少约20％IGF-IR的抗体。在一个优选的实施方案中，所述抗体激活至少40％的IGF-IR活性，更优选地是60％，甚至更优选地是80％，或者甚至更优选地是85％。在一个更优选的实施方案中，在有IGF-I或IGF-II存在的条件下加入所述激活抗体。在另一个优选的实施方案中，通过确定IGF-IR的酪氨酸自动磷酸化的量来测定激活抗体的活性。
抗体的片段或类似物可以由本技术领域中的技术人员按照本说明书记载的技术进行毫无困难的制备。片段或类似物的优选氨基端和羧基端存在于功能域的边界附近。结构或功能结构域可以通过核苷酸和/或氨基酸序列库与公共或适当的数据库的比较来确定。优选地，采用计算机化的比较方法来确定序列基元或存在于已知结构和/或功能的其它蛋白质中的预测蛋白构型结构域。测定折叠成已知三维结构的蛋白质序列的方法是已知的。Bowie等，Science 253：164(1991)。
本文使用的术语“表面胞质团共振(Surface plasmon resonace)”是指能够通过例如利用BIAcore系统(Pharmacia Biosensor AB，Uppsala，Sweden和Piscataway，N.J.)检测生物传感基质内的蛋白质浓度的变化来实时分析生物特异相互作用的光学现象。进一步说明参见Jonsson，U.等，(1993)Ann.Biol.Clin.51：19-26；Jonsson，U.等.(1991)Biotechniques 11：620-627；Johnsson，B.等.(1995)J.Mol.Recognit.8：125-131；和Johnson，B.等.(1991)Anal.Biochem.198：268-277。
名词“Koff”是指从抗体/抗原复合物分离抗体的解离速率常数。
名词“Kd”是指特定抗体-抗原相互作用的解离常数。
术语“表位”包括任何能够特异结合免疫球蛋白或T细胞受体的蛋白决定簇。表位决定簇通常由诸如氨基酸或糖侧链这样的分子的化学活性表面基团组成，并且通常具有特定三维结构特性以及特定的带电特性。据说当解离常数＜1uM，优选地＜100nM和最优选地≤10nM时，抗体与抗原特异性结合。
如本文使用的，二十个常规氨基酸及其缩写遵循常规用法。参见Immunology-A Synthesis(第二版，由E.S.Golub和D.R.Gren，编辑，Sinauer Associates，Sunderland，Mass.(1991))，其被引入本文作为参考。二十个常规氨基酸的立体异构体(例如D-氨基酸)，非天然氨基酸如α-，α-双取代的氨基酸，N-烷基氨基酸，乳酸和其它非常规氨基酸也可以是本发明的多肽的合适成分。非常规氨基酸的实例包括：4-羟脯氨酸，γ-羧谷氨酸，ε-N，N，N-三甲基赖氨酸，ε-N-乙酰赖氨酸，O-磷酸丝氨酸，N-乙酰丝氨酸，N-甲酰甲硫氨酸，3-甲基组氨酸，5-羟赖氨酸，s-N-甲基精氨酸和其它类似的氨基酸和亚氨基酸(例如4-羟脯氨酸)。在本文使用的多肽注释中，按照标准用法和惯例，左边方向是氨基端方向而右边方向是羧基端方向。
本文涉及的术语“多核苷酸”的含义是至少10个碱基长度的聚合体形式的核苷酸，核糖核苷酸或脱氧核苷酸或每种核苷酸的改变形式。术语包括单链和双链形式的DNA。
本文使用的术语“分离的多核苷酸”是指基因组、cDNA或合成来源或其一些组合形式的多核苷酸，根据来源，“分离的多核苷酸”(1)不与“分离的多核苷酸”天然存在其中的全部或部分多核苷酸结合，(2)可操作性地连接于“分离的多核苷酸”天然与其连接的多核苷酸，或(3)不以较长序列的一部分自然存在。
本文所涉及的术语“寡核苷酸”包括通过自然存在的和非自然存在的寡核苷酸键连接在一起的天然存在的和改变的核苷酸。寡核苷酸是多核苷酸的亚型，通常具有200个碱基或更少的长度。优选地是寡核苷酸是10至60个碱基的长度以及最优选地是12，13，14，15，16，17，18，19，或者20至40个碱基长度。尽管寡核苷酸可以是双链的，例如被用于构建基因突变体，寡核苷酸通常是单链的，例如被用作探针。本发明的寡核苷酸既可以是有义的也可以是反义的寡核苷酸。
本文所涉及的术语“自然存在的核苷酸”包括脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸。本文所涉及的术语“改变的核苷酸”包括具有被改变的或被取代的糖基等的核苷酸。本文所涉及的术语“寡核苷酸键”包括寡核苷酸键如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、phosphoroanilothioate、phoshoraniladate、氨基磷酸酯等。例如参见LaPlanche等，Nucl.Acids Res.14：9081(1986)；Stec等，J.Am.Chem.Soc.106：6077(1984)；Stein等，Nucl.Acids Res.16：3209(1988)；Zon等，Anti-Cancer Drμg Design 6：539(1991)；Zon等，Oligonucleotides and Analogues：A Practical Approach，pp.87-108(F.Eckstein，Ed.，Oxford University Press，Oxford England(1991))；Stec等，美国专利US5151510；Uhlmann and Peyman Chemical Reviews90：543(1990)，其全部内容被引入本文作为参考。如果需要，寡核苷酸还可以包含用于检测的标记物。
“可操作性连接的”序列既包括与目的基因邻接的表达控制序列也包括反式或远距离调控目的基因的表达控制序列。本文所涉及的术语″表达控制序列″是指进行表达和加工与其连接的编码序列所必需的多核苷酸序列。表达控制序列包括适当的转录起始序列、终止序列、启动子和增强子序列；RNA有效加工信号如剪接和聚腺苷酸化信号；稳定胞质mRNA的序列；提高翻译效率的序列(即Kozak共有序列)；增强蛋白质稳定性的序列；而且如果需要，促进蛋白质分泌的序列。这种控制序列的性质随着宿主生物的不同而不同；在原核生物体内，这种控制序列通常包括启动子、核糖体结合位点和转录终止序列；在真核生物体内，这种控制序列通常包括启动子和转录终止序列。术语“控制序列”旨在最低限度包括表达和加工所必需的所有成分，而且还可以包括其存在是有利的附加成分，例如前导序列和融合配偶体序列。
本文使用的术语“载体”是指能够转移与其相连的另一种核酸的核酸分子。载体的一种类型是“质粒”，质粒是指其中可以连接附加DNA片段的环状双链DNA环。载体的另一种类型是病毒载体，其中附加的DNA片段可以被连接到病毒的基因组内。某些载体能够在其被引进的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制原点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。通过引入到宿主细胞中，其它载体(例如，非附加哺乳动物载体)可以被整合到宿主细胞的基因组中，因而随宿主基因组一起被复制。而且，某些载体能够指导与其可操作性连接的基因的表达。这种载体在本文被定义为“重组表达载体”(或者被简称作“表达载体”)。通常，重组DNA技术使用的表达载体经常为质粒的形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可以被交替使用，而质粒是载体最通用的形式。然而，本发明旨在包括其它形式的表达载体，诸如病毒载体(例如，复制缺陷型反转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)，其具有等价的功能。
本文使用的术语“重组宿主细胞”(或被简称为“宿主细胞”)是指其中引进了重组表达载体的细胞。应当理解该术语不但是指特定的实验细胞而且还指这种细胞的子细胞。因为由于突变或环境的影响而使子代发生了某些改变，因此这种子细胞实际上可能不同于母细胞，但仍被包含在本文使用的术语“宿主细胞”的范围内。
本文所涉及的术语“选择性杂交”是指可检测性地和特异性地结合。根据本发明，在使与非特异性核酸可检测性结合的量最小化的杂交和洗涤条件下，多核苷酸、寡核苷酸及其片段选择性地与核酸链杂交。“高严紧”或“高度严格”条件被用来获得本技术领域中已知的和本文所讨论的选择性杂交条件。“高严紧”或“高度严格”条件的一个实例是这样一种方法：将一种多核苷酸与另一种多核苷酸一起进行温育的方法，其中可以将一种多核苷酸固定在固体表面如膜上，在一种6X SSPE或SSC、50％甲酰胺、5X Denhardt试剂、0.5％SDS、100μg/ml变性的鲑精DNA片段的杂交缓冲液中于42℃的杂交温度下维持12-16小时，然后在55℃下用1X SSC、0.5％SDS组成的洗涤缓冲液冲洗两次。还可参见Sambrook等，如上文，9.50-9.55页。
核酸序列中使用的术语“序列相同性百分率”是指当进行最大对应性比对时两条序列中相同的残基。序列相同性比较的长度可以延伸至少约9个核苷酸，通常至少约18个核苷酸，更通常至少约24个核苷酸，典型地至少约28个核苷酸，更典型地至少约32个核苷酸，以及优选地至少约36，48个或更多个核苷酸。在本技术领域中有许多不同的算法也可以被用来测定核苷酸序列的相同性。例如，多核苷酸序列可以利用FASTA，Gap或Bestfit来进行比较，FASTA，Gap或Bestfit是Wisconsin Package Version 10.0，Genetics Computer Group(GCG)，Madison，Wisconsin中的程序。包括例如FASTA2和FASTA3程序的FASTA提供了查询和检索序列之间最大重叠区域的比对和序列相同性百分率(Pearson，Methods Enzymol.183：63-98(1990)；Pearson，Methods Mol.Biol.132：185-219(2000)；Pearson，Methods Enzvmol.266：227-258(1996)；Pearson，J.Mol.Biol.276：71-84(1998)；引入本文作为参考)。除非另有说明，使用的是特定程序或算法的缺省参数。例如，核酸序列之间的序列相同性百分率可以利用具有缺省参数的FASTA(字长为6和评分矩阵的NOPAM系数)或利用具有GCGVersion 6.1所提供的缺省参数的Gap来进行确定，其被引入本文作为参考。
除非另有说明，有关核酸序列应当包括它的互补序列。因此，有关具有特定序列的核酸序列应当被理解为包括它的具有互补序列的互补链。
在分子生物学领域中，研究人员交替使用术语“序列相同性百分率”、“序列相似性百分率”和“序列同源性百分率”。在本申请中，这些术语只有针对核酸序列才具有相同的含义。
涉及核酸或其片段的术语“基本相似”或“序列基本相似”是指当与另一个核酸(或其互补链)进行最佳序列对比具有适当的核苷酸插入或缺失时，通过任何已知的序列相同性的算法如上述FASTA，BLAST或Gap测定的核苷酸序列相同性至少约为85％，优选地至少约为90％，以及更优选地至少约为95％，96％，97％，98％或99％的核苷酸碱基。
至于应用于多肽的术语“基本相同”是指当例如通过利用缺省缺口权重的GAP或BESTFIT程序对两条肽序列进行最佳序列对比时，具有至少75％或80％的序列相同性，优选地至少90％或95％的序列相同性，甚至更优选地至少98％或99％的序列相同性。优选地，不同的残基位点由于保守氨基酸的取代而不同。“保守氨基酸的取代”是指其中一个氨基酸残基被另一个具有化学性质(例如带电性或疏水性)相似侧链(R基团)的氨基酸残基所取代。通常，保守氨基酸的取代基本上不会改变蛋白质的功能。当两个或更多个氨基酸序列由于保守取代而彼此不同时，序列相同百分比或相似的程度可被上调从而校正了取代的保守特性。进行这种调整的手段是本技术领域中的技术人员所熟知的。例如参见Pearson，Methods Mol.Biol.24：307-31(1994)，其被引入本文作为参考。具有化学性质相似侧链的氨基酸组实例包括1)脂肪族侧链：甘氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸和异亮氨酸；2)脂肪族-羟基侧链：丝氨酸和苏氨酸；3)含酰胺侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；4)芳族侧链：苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸；5)碱性侧链：赖氨酸，精氨酸和组氨酸；和6)含硫侧链是半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守氨基酸取代组是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸，苯丙氨酸-酪氨酸，赖氨酸-精氨酸，丙氨酸-缬氨酸，谷氨酸-天冬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。
或者，保守取代是在Gonnet等，Science 256：1443-45(1992)中记载的PAM250log-似然矩阵(log-likehood matrix)中具有正值的任何改变，所述文献被引入本文作为参考。“中度保守”取代是PAM250log-似然矩阵中具有非负值的任何改变。
多肽的序列相似性，也被称作序列相同性，典型地利用序列分析软件来测定。蛋白分析软件利用归因于各种取代、缺失和包括保守氨基酸取代在内的其它修饰的相似程度的测定来比较相似序列。例如，GCG包括诸如“Gap”和“Bestfit”这样程序，该程序在缺省参数下可被用来测定密切相关多肽之间的序列同源性或序列相同性，诸如来源于不同种生物的同源多肽或野生型蛋白质及其突变蛋白之间的序列同源性或序列相同性。参见例如GCG 6.1版。还可以利用具有缺省的或推荐的参数的FASTA，一种GCG 6.1版中的程序来比较多肽序列。FASTA(例如FASTA2和FASTA3)提供了查询和检索序列之间最大重叠区域的比对和序列相同性百分率(Pearson(1990)；Pearson(2000))。当将本发明的序列与含有源自不同生物的多种序列的数据库进行比较时，另一种优选的算法是计算机程序BLAST，尤其是利用缺省参数的blastp或tblastn。参见例如Altschμl等，J.Mol.Biol.215：403-410(1990)；Altschμl等，Nucleic Acids Res.25：3389-402(1997)；被引入本文作为参考。
进行同源性比较的多肽序列的长度一般是至少约16个氨基酸残基，通常至少约20个残基，更通常地是至少约24个残基，典型地至少约28个残基，以及优选地多于35个残基。当检索包括源于多种不同生物体的序列的数据库时，优选地是进行氨基酸序列的比较。
如本文使用的，术语“标记”或“被标记的”是指在抗体中掺入了另一种分子。在一个实施方案中，标记是一种可检测的标记，例如可以通过标记的抗生物素蛋白(例如，可以通过光学或比色方法进行测定的含有荧光标记或具有酶活性的链霉抗生物素)进行检测的放射性标记氨基酸的掺入或生物素部分与多肽的连接。在另一个实施方案中，标记可以是治疗性质的，例如一种药物缀合物或毒素。标记多肽和糖蛋白的各种方法在本技术领域中是已知的并且可以被使用。用于多肽的标记物的实例包括但不限于下列物质：放射性同位素或放射性核素(例如，3H，14C，15N，35S，90Y，99Tc，111In，125I，131I)，荧光标记物(例如，FITC，罗丹明，镧系元素磷光体)，酶标记物(例如，辣根过氧化物酶，β-半乳糖苷酶，萤光素酶，碱性磷酸酶)，化学发光标记物，生物素基团，预先确定的由第二报道分子识别的多肽表位(例如亮氨酸拉链序列，第二抗体的结合位点，金属结合区域，表位尾端)，磁性剂如钆螯合物，毒素如百日咳毒素，紫杉醇，细胞松弛素B，短杆菌肽D，溴化乙锭，吐根碱，丝裂霉素，鬼臼亚乙苷，替尼泊苷(tenoposide)，长春新碱，长春花碱，秋水仙碱，阿霉素，柔红霉素，二羟基炭疽菌二酮(dihyclroxy anthracin dione)，米托蒽醌(mitoxantrone)，光神霉素，放线菌素D，1-脱氢睾丸激素，糖皮质素，普鲁卡因(procaine)，丁卡因(tetracaine)，利多卡因(lidocaine)，普萘洛尔(propranolol)和嘌呤霉素及其类似物或同系物。
在某些实施方案中，通过各种长度的间隔区臂进行标记物的连接从而降低潜在的空间障碍。
本文使用的术语“剂”表示化合物，化合物的混合物，生物大分子或由生物材料制成的提取物。本文使用的术语“药剂或药物”是指当适当施用于患者时能够产生所需的治疗效果的化合物或组合物。本文中的其它化学术语按照本技术领域的常规用法进行使用，如McGralv-Hill化学词汇字典(McGralv-Hill Dictionay of ChemicalTerms)(Parker，S.，Ed.，McGraw-Hill，San Francisco(1985))，被引入本文作为参考)所例示。
本文使用的术语“抗肿瘤剂”是指具有抑制人体内肿瘤，尤其是恶性(癌性)损伤如癌、肉瘤、淋巴瘤或白血病的发生或发展这样的功能特性的药物。抑制转移通常是抗肿瘤剂的特性。
术语“患者”包括人和兽受试者。
人抗-IGF-IR抗体及其特征描述
人抗体避免了某些由具有小鼠或大鼠可变区和/或恒定区的抗体所产生的问题。这种得自小鼠或大鼠的序列的存在能够导致抗体的快速清除或者能够引起患者对抗体产生免疫应答。因此，在一个实施方案中，本发明提供了人源化的抗-IGF-IR抗体。在一个优选的实施方案中，通过将人免疫球蛋白基因引入啮齿动物体内从而使啮齿动物产生了完整的人抗体，由此本发明提供了完整的人抗-IGF IR抗体。更优选的是完整的人抗人IGF-IR抗体。完整的人抗-IGF-IR抗体预计能使针对小鼠或小鼠衍生的单克隆抗体(Mab)固有的免疫原性和变应性应答最小化，由此提高了被施用抗体的效力和安全性。完整人抗体的使用预计能够在治疗慢性和复发性人类疾病的过程中提供实质性的优点，所述人类疾病诸如是可能需要反复施用抗体的炎症和癌症。在另一个实施方案中，本发明提供了一种不结合补体的抗-IGF-IR抗体。
在一个优选的实施方案中，所述的抗-IGF-IR抗体是2.12.1，2.13.2，2.14.3，3.1.1，4.9.2，4.17.3或6.1.1。在另一个优选的实施方案中，抗-IGF-IR抗体具有一条含有选自SEQ ID NO：2，6，10，14，18或22的氨基酸序列，或者一个或多个源自这些氨基酸序列的CDR的轻链。在另一个优选实施方案中，抗-IGF-IR抗体具有一条含有选自SEQID NO：4，8，12，16，20或24的氨基酸序列，或者一个或多个源自这些氨基酸序列的CDR的重链。
抗-IGF-IR抗体的种类和亚类
所述抗体可以是IgG，IgM，IgE，IgA或IgD分子。在一个优选的实施方案中，所述抗体是IgG而且是IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亚型。在一个更优选的实施方案中，抗-IGF-IR抗体是亚类IgG2。在另一个优选的实施方案中，抗-IGF-IR抗体是与抗体2.12.1，2.13.2，2.14.3，3.1.1，4.9.2，4.17.3或6.1.1相同的种类或亚类，为IgG2。
抗-IGF-IR抗体的种类和亚类可以通过本技术领域中已知的方法来确定。通常，抗体的种类和亚类可以利用对特定种类和亚类的抗体具有特异性的抗体来确定。这种抗体可从商业途径获得。种类和亚类可以通过ELISA、Western印迹以及其它技术来确定。或者，种类和亚类可以通过对抗体的重链和/或轻的整个或部分恒定区进行测序、将其氨基酸序列与不同种类和亚类的免疫球蛋白的已知氨基酸序列进行比较以及确定抗体的种类和亚类来确定。
物种和分子的选择性
根据本发明的另一方面，抗-IGF-IR抗体证明具有物种和分子选择性。在一个实施方案中，抗-IGF-IR抗体与人、猕猴或恒河猴IGF-IR.结合。在一个优选的实施方案中，抗-IGF-IR抗体不与小鼠、大鼠、豚鼠、狗或兔子的IGF-IR结合。在另一个优选的实施方案中，抗-IGF-IR抗体不与新世界品种的猴如狨(marmoset)结合。按照本说明书的教导，可以利用本技术领域中的已知方法来确定抗-IGF-IR抗体的物种选择性。例如，可以通过Western印迹、FACS、ELISA或RIA来确定物种的选择性。在一个优选的实施方案中，可以通过Western印迹来确定物种的选择性。
在另一个实施方案中，抗-IGF-IR抗体具有对IGF-IR的选择性，其比对胰岛素受体的选择性至少大50倍。在一个优选的实施方案中，抗-IGF-IR抗体对IGF-IR的选择性比其对胰岛素受体的选择性至少大100倍。在以更优选的实施方案中，抗-IGF-IR抗体对除IGF-IR以外的其它蛋白质不具有任何可观的特异结合性。可利用本技术领域中的已知方法而且按照本说明书的教导测定抗-IGF-IR抗体对IGR-IR的选择性。例如，可以通过Western印迹、FACS、ELISA或RIA来确定选择性。在一个优选的实施方案中，可以通过Western印迹来确定分子的选择性。
抗-IGF-IR对IGF-IR的结合亲合力
根据本发明的另一个方面，抗-IGF-IR抗体以很高的亲合力与IGF-IR结合。在一个实施方案中，抗-IGF-IR抗体与IGF-IR的Kd为1×10-8M或更低。在一个优选的实施方案中，所述抗体与IGF-IR的Kd为1×10-9M或更低。在一个更优选的实施方案中，所述抗体与IGF-IR的Kd为5×10-10M或更低。在另一个优选的实施方案中，所述抗体与IGF-IR的Kd为1×10-10M或更低。在另一个优选的实施方案中，所述抗体与IGF-IR的Kd与选自2.12.1，2.13.2，2.14.3，3.1.1，4.9.2，4.17.3或6.1.1的抗体的Kd基本上相同。在另一个优选的实施方案中，所述抗体与IGF-IR的Kd与含有选自2.12.1，2.13.2，2.14.3，3.1.1，4.9.2，4.17.3或6.1.1抗体的一个或多个CDR的抗体的Kd基本上相同。在一个更优选的实施方案中，所述抗体与IGF-IR的Kd与含有一个选自SEQ ID NO：2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22或24的氨基酸序列的抗体的Kd基本上相同。在一个优选的实施方案中，所述抗体与IGF-IR的Kd与含有一个或多个CDR的抗体的Kd基本上相同，其中CDR源于含有一个选自SEQ ID NO：2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22或24的氨基酸序列的抗体。
根据本发明的另一个方面，抗-IGF-IR抗体具有很低的解离速率。在一个实施方案中，抗-IGF-IR抗体具有的Koff为1×10-4s-1或更低。在一个优选的实施方案中，Koff为1×10-5s-1或更低。在另一个优选的实施方案中，Koff基本上与选自2.12.1，2.13.2，2.14.3，3.1.1，4.9.2，4.17.3或6.1.1的抗体相同。在另一个优选的实施方案中，所述抗体与IGF-IR结合的Koff与含有一个或多个源自选自2.12.1，2.13.2，2.14.3，3.1.1，4.9.2，4.17.3或6.1.1的抗体的CDR的抗体基本上相同。在一个更优选的实施方案中，所述抗体与IGF-IR结合的Koff与含有一个选自SEQID NO：2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22或24的氨基酸序列的抗体基本相同。在另一个优选的实施方案中，所述抗体与IGF-IR结合的Koff与含有一个或多个CDR的抗体基本上相同，其中所述CDR源自含有一个选自SEQ ID NO：2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22的氨基酸序列的抗体。
抗-IGF-IR抗体与IGF-IR的结合亲合力和解离速率可以通过本技术领域中的任一种方法来测定。在一个实施方案中，所述结合亲合力通过竞争性ELISA，RIA或表面胞质基因共振如BIAcore来测定。解离速率也可以通过表面胞质基因共振来测定。在一个更优选的实施方案中，结合亲合力和解离速率通过表面胞质基因共振来测定。甚至在一个更优选的实施方案中，结合亲合力和解离速率通过BIAcore来测定。测定结合亲合力和解离速率的实例被记载在以下的实施例II中。
抗-IGF-IR抗体的半衰期
根据本发明的另一个目的，抗-IGF-IR抗体在体外或体内的半衰期至少为一天。在一个优选的实施方案中，所述抗体或其片段具有至少三天的半衰期。在一个更优选的实施方案中，所述抗体或其片段具有四天或更长的半衰期。在另一个实施方案中，所述抗体或其片段具有八天或更长的半衰期。在另一个实施方案中，如下所述，所述抗体或其抗原结合部分被衍生化或改变从而具有如下所述的更长半衰期。在另一个优选的实施方案中，所述抗体可以含有点突变以便增加血清半衰期，诸如2000年2月24日公布的WO 00/09560中所记载的。
抗体的半衰期可以通过对本技术领域中的普通技术人员来说是已知的任何方法来测定。例如，所述抗体的半衰期可以通过Western印迹、ELISA或RIA经过适当长的时间来测定。所述抗体的半衰期可以在适当的动物体内来测定，所述动物例如是猴如猕猴(cynomologousmonkey)，灵长类动物或人。
由抗-IGF-IR抗体识别的IGF-IR表位的鉴定
本发明还提供了结合与人抗-IGF-IR抗体相同的抗原或表位的抗-IGF-IR抗体。而且本发明提供了与人抗-IGF-IR抗体进行交叉竞争的抗-IGF-IR抗体。在一个优选的实施方案中，人抗-IGF-IR抗是2.12.1，2.13.2，2.14.3，3.1.1，4.9.2，4.17.3或6.1.1。在另一个优选的实施方案中，人抗-IGF-IR抗体含有一个或多个源自选自2.12.1，2.13.2，2.14.3，3.1.1，4.9.2，4.17.3或6.1.1抗体的CDR。在另一个更优选的实施方案中，人抗-IGF-IR抗体含有一个选自SEQ ID NO：2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22或24的氨基酸序列。在另一个优选的实施方案中，所述人抗-IGF-IR抗体包含一个或多个CDR，该CDR源自含有一个选自SEQID NO：2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22或24的氨基酸序列的抗体。在一个非常优选的实施方案中，抗-IGF-IR抗体是另一种人抗体。
利用本技术领域中的多种方法可以测定抗-IGF-IR抗体是否与相同抗原结合。例如，可以通过利用抗-IGF-IR抗体捕获已知与抗-IGF-IR抗体结合的抗原，诸如IGF-IR，从所述抗体上将所述抗原洗脱下来，然后测定所测试的抗体是否与被洗脱的抗原结合来确定抗-IGF-IR抗体是否与相同抗原结合。可以通过在饱和条件下使抗-IGF-IR抗体与IGF-IR结合，然后测定所测试抗体结合IGF-IR的能力来确定抗体是否结合与抗IGF-IR抗体相同的表位。如果所测试的抗体能够在与抗-IGF-IR-抗体相同的时间结合IGF-IR，那么所测试的抗体与抗-IGF-IR-抗体结合不同的表位。然而，如果所测试的抗体不能在相同的时间结合IGF-IR，那么所测试的抗体与人抗-IGF-IR-抗体一样结合相同的表位。可以通过ELISA、RIA或表面胞质基因共振来进行该实验。在一个优选的实施方案中，利用表细胞质基团共振来进行该实验。在一个更优选的实施方案中，采用了BIAcore。还可以测定抗-IGF-IR抗体是否与抗-IGF-IR抗体产生交叉竞争。在一个优选的实施方案中，可以通过利用与测定抗-IGF-IR抗体是否能够结合与另一种抗-IGF-IR抗体相同的表位一样的方法来测定抗-IGF-IR抗体是否与另一种抗-IGF-IR抗体产生交叉竞争。
羟链和重链使用
本发明还提供了含有由人κ基因编码的可变序列的抗-IGF-IR抗体。在一个优选的技术方案中，可变序列是由VκA27，A30或O12基因家族所编码的。在一个优选的技术方案中，可变序列是由人VκA30基因家族所编码的。在一个更优选的技术方案中，轻链含有不超过10个由种系VκA27，A30或O12的氨基酸置换，优选地不超过6个氨基酸的置换，更优选地不超过3个氨基酸的置换。在一个优选的实施方案中，所述的氨基酸置换是保守置换。
SEQ ID NO：2，6，10，14，18和22提供了六个抗-IGF-IRκ轻链的可变区氨基酸序列。SEQ ID NO：38，40和42提供了三个种系κ轻链的可变区氨基酸序列，由所述三个种系κ轻链衍生出所述的六个抗-IGF-IRκ轻链。图1A-1C表示所述六个抗-IGF-IR抗体的轻链可变区的核苷酸序列彼此之间以及与其被衍生自其中的种系序列之间的对比。按照本说明书的教导，本技术领域的普通技术人员能够测定被编码的六个抗-IGF-IRκ轻链和种系κ轻链的氨基酸序列，而且还能测定种系序列与抗体序列之间的差异。
在一个优选的实施方案中，抗-IGF-IR抗体的VL相对于种系氨基酸序列含有与抗体2.12.1，2.13.2，2.14.3，3.1.1，4.9.2，4.17.3或6.1.1的任何一个或多个VL相同的氨基酸置换。例如，抗-IGF-IR抗体的VL可以含有一个或多个与抗体2.13.2中存在的置换相同的氨基酸置换，另一个与抗体2.14.3中存在的置换相同的氨基酸置换，和另一个与抗体4.9.2中存在的置换相同的氨基酸置换。以这种方式，可以将抗体结合的不同特征组合和配合在一起以便改变例如抗体对IGF-IR的亲合力以及从抗原上的解离速率。在另一个实施方案中，在与抗体2.12.1，2.13.2，2.14.3，3.1.1，4.9.2，4.17.3或6.1.1的任意一个或多个VL中发现的位点相同的位点上进行氨基酸置换，而保守氨基酸置换不是采用相同的氨基酸。例如，如果相对于种系，在抗体2.12.1，2.13.2，2.14.3，3.1.1，4.9.2，4.17.3或6.1.1中的一个抗体内进行的氨基酸置换是谷氨酸，那么可以保守转换天门冬氨酸。类似地，如果进行氨基酸置换的是丝氨酸，那么可以保守置换苏氨酸。
在另一个优选的实施方案中，轻链含有与2.12.1，2.13.2，2.14.3，3.1.1，4.9.2，4.17.3或6.1.1的VL的氨基酸序列相同的氨基酸序列。在另一个非常优选的实施方案中，轻链含有与2.12.1，2.13.2，2.14.3，3.1.1，4.9.2，4.17.3或6.1.1的轻链的CDR区相同的氨基酸序列。在另一个优选的实施方案中，轻链含有源自至少一个2.12.1，2.13.2，2.14.3，3.1.1，4.9.2，4.17.3或6.1.1的轻链CDR区域的氨基酸序列。在另一个优选的实施方案中，轻链含有源自不同轻链的CDR的氨基酸序列。在一个更优选的实施方案中，源自不同轻链的CDR是由2.12.1，2.13.2，2.14.3，3.1.1，4.9.2，4.17.3或6.1.1获得的。在另一个优选的实施方案中，轻链含有选自SEQ ID NO：2，6，10，14，18或22的氨基酸序列。在另一个实施方案中，轻链含有由选自SEQ ID NO：1，5，9，13，17或21的核苷酸序列或由编码具有1-10个氨基酸插入、缺失或置换的氨基酸序列的核苷酸序列编码的氨基酸序列。优选地，氨基酸置换是保守氨基酸的置换。在另一个实施方案中，抗体或其片段含有一条λ轻链。
本发明还提供了含有人重链或得自人重链的序列的抗-IGF-IR抗体或其部分。在一个实施方案中，重链氨基酸序列得自人VHDP-35，DP-47，DP-70，DP-71或VIV-4/4.35基因家族。在一个优选的实施方案中，重链氨基酸序列得自人VHDP47基因家族。在一个更优选的实施方案中，重链含有不超过8个由种系VHDP-35，DP-47，DP-70，DP-71或VIV-4/4.35基因的氨基酸变化，更优选地不超过6个氨基酸变化，以及甚至更优选地不超过3个氨基酸变化。
SEQ ID NO：4，8，12，16，20和24提供了六个抗-IGF-IR重链的可变区氨基酸序列。SEQ ID NO：30，32，34，36和44分别提供了种系重链DP-35，DP-47，DP-70，DP-71和VIV-4的氨基酸序列以及SEQ IDNO：29，31，33，35和43分别提供了种系重链DP-35，DP-47，DP-70，DP-71和VIV-4的核苷酸序列。图2A-2D表示所述六个抗-IGF-IR抗体的可变区的氨基酸序列其种系序列之间的对比。按照本说明书的教导，本技术领域的普通技术人员能够测定被编码的六个抗-IGF-IR重链和种系重链的氨基酸序列，而且还能测定种系序列与抗体序列之间的差异。
在一个优选的实施方案中，抗-IGF-IR抗体的VH相对于种系氨基酸序列含有与抗体2.12.1，2.13.2，2.14.3，3.1.1，4.9.2，4.17.3或6.1.1的任何一个或多个VH相同的氨基酸置换。与上述类似，抗-IGF-IR抗体的VH可以含有一个或多个与抗体2.13.2中存在的置换相同的氨基酸置换，另一个与抗体2.14.3中存在的置换相同的氨基酸置换，和另一个与抗体4.9.2中存在的置换相同的氨基酸置换。以这种方式，可以将抗体结合的不同特征组合和配合在一起以便改变例如抗体对IGF-IR的亲合力以及从抗原上的解离速率。在另一个实施方案中，在与抗体2.12.1，2.13.2，2.14.3，3.1.1，4.9.2，4.17.3或6.1.1的任意一个或多个VH中发现的位点相同的位点上进行氨基酸置换，而保守氨基酸的置换不是采用相同的氨基酸。
在另一个优选的实施方案中，重链含有与2.12.1，2.13.2，2.14.3，3.1.1，4.9.2，4.17.3或6.1.1的VH的氨基酸序列相同的氨基酸序列。在另一个非常优选的实施方案中，重链含有与2.12.1，2.13.2，2.14.3，3.1.1，4.9.2，4.17.3或6.1.1的重链的CDR区域相同的氨基酸序列。在另一个优选的实施方案中，重链含有源自至少一个2.12.1，2.13.2，2.14.3，3.1.1，4.9.2，4.17.3或6.1.1的重链中的CDR区域的氨基酸序列。在另一个优选的实施方案中，重链含有源自不同重链的CDR的氨基酸序列。在一个更优选的实施方案中，源自不同重链的CDR是由2.12.1，2.13.2，2.14.3，3.1.1，4.9.2，4.17.3或6.1.1获得的。在另一个优选的实施方案中，重链含有选自SEQ ID NO：4，8，12，16，20或24的氨基酸序列。在另一个实施方案中，重链含有由选自SEQ ID NO：3，7，11，15，19或23的核苷酸序列或由编码具有1-10个氨基酸插入、缺失或置换的氨基酸序列的核苷酸序列编码的氨基酸序列。在另一个实施方案中，置换是保守氨基酸的置换。
由抗-IGF-IR抗体抑制IGF-IR活性
抑制IGF-I结合IGF-IR
在另一个实施方案中，本发明提供了抑制IGF-I与IGF-IR结合或IGF-II与IGF-IR结合的抗-IGF-IR抗体。在一个优选的实施方案中，所述IGF-IR是人的。在另一个优选的实施方案中，抗-IGF-IR抗体是一种人的抗体。在另一个实施方案中，所述抗体或其片段抑制IGF-IR和IGF-I的结合具有不超过100nM的IC50。在一个优选的实施方案中，IC50不超过10nM。在一个更优选的实施方案中，IC50不超过5nM。所述IC50可以通过本技术领域中的已知方法来测定。典型地，IC50可以通过ELISA或RIA来测定。在一个优选的实施方案中，IC50可以通过RIA来测定。
在另一个实施方案中，本发明提供了在有IGF-I存在的条件下阻止IGF-IR激活的抗-IGF-IR抗体。在一个优选的实施方案中，所述抗-IGF-IR抗体抑制由IGF-IR-诱导的在受体上发生的酪氨酸磷酸化作用。在另一个优选的实施方案中，抗-IGF-IR抗体抑制下游细胞事件的进行。例如，抗-IGF-IR能够抑制Shc和胰岛素受体底物(IRS)1和2的酪氨酸磷酸化作用，当用IGF-I处理细胞时，其全部被正常磷酸化(Kim等，J.Biol.Chem.273：34543-34550，1998)。可以通过Western印迹或免疫沉淀法测定IGF-IR，Shc，IRS-1或IRS-2的自磷酸化的水平来确定抗-IGF-IR抗体是否能够在有IGF-1存在的条件下抑制IGF-IR的活性。在一个优选的实施方案中，可以通过Western印迹来测定IGF-IR的自磷酸化水平。参见例如实施例VII。
根据本发明的另一方面，所述抗体引起被抗体处理的细胞的IGF-IR的下调。在另一个实施方案中，IGF-IR被内在化成细胞的胞质。当抗-IGF-IR抗体与IGF-IR结合后，如聚焦显微镜法所示，所述抗体被内在化。不希望受到任何理论的限制，确信抗体-IGF-IR复合物被内在化成溶酶体并且被降解。可以通过本技术领域中的已知方法包括免疫沉淀法、聚焦显微镜法或Western印迹在内的方法来测定IGF-IR的下调。参见例如实施例VII。在一个优选的实施方案中，所述抗体选自2.12.1，2.13.2，2.14.3，3.1.1，4.9.2或6.1.1，或者含有其重链、轻链或抗原结合区域。
IGF-IR被抗-IGF-IR抗体激活
本发明的另一方面涉及活化抗-IGF-IR抗体。活化抗体不同于抑制抗体，这是由于活化增强或取代了IGF-I对IGF-IR的作用。在一个实施方案中，活化抗体能够与IGF-IR结合并且在没有IGF-I存在的条件下使其活化。这类活化抗体本质上是IGF-1的一种模拟物。在另一个实施方案中，活化抗体增强了IGF-I对IGF-IR的作用。这类抗体本身不激活IGF-IR，但确在有IGF-1存在的条件下增强了IGF-IR的活化作用。通过在有或没有低浓度IGF-1存在的条件下，用抗体体外处理细胞可以轻易地将模拟的抗-IGF-IR抗体与放大的抗-IGF-IR抗体区分开。如果抗体能够在没有IGF-1存在的条件下引起IGF-IR的活化，例如增强了IGF-IR的酪氨酸磷酸化作用，那么所述抗体就是模拟抗体。如果抗体不能在没有IGF-1存在的条件下引起IGF-IR的活化却能扩大IGF-IR活化的量，那么所述抗体就是一种放大抗体。在一个优选的实施方案中，活化抗体是4.17.3。在另一个优选的实施方案中，所述抗体含有一个或多个源自4.17.3的CDR。在另一个优选的实施方案中，所述抗体得自种系序列012(轻链)和/或D71(重链)中的一个或两个。
抗-IGF-IR抗体对体内的IGF-IR酪氨酸磷酸化作用、IGF-IR水平和肿瘤细胞生长的抑制
本发明的另一个实施方案提供了抑制体内的IGF-IR酪氨酸磷酸化作用和受体水平的抗-IGF-IR抗体。在一个实施方案中，对动物施用抗-IGF-IR抗体能够引起GF-IR-表达肿瘤内的IGF-IR磷酸酪氨酸信号的减弱。在一个优选的实施方案中，抗-IGF-IR抗体使磷酸酪氨酸信号至少减弱20％。在一个更优选的实施方案中，抗-IGF-IR抗体使磷酸酪氨酸信号至少减弱60％，更优选地是50％。在一个更优选的实施方案中，所述抗体使磷酸酪氨酸信号至少减弱40％，更优选地是30％，甚至更优选地是20％。在一个优选的实施方案中，在测定酪氨酸磷酸化作用前约24小时施用所述抗体。酪氨酸磷酸化作用的水平可以通过本技术领域中的任何已知方法来测定，所述方法诸如下文所述。参见例如实施例III和图5。在一个优选的实施方案中，所述抗体选自2.12.1，2.13.2，2.14.3，3.1.1，4.9.2或6.1.1，或者含有一条重链、轻链或其抗原-结合片段。
在另一个实施方案中，对动物施用抗-IGF-IR抗体引起IGF-IR-表达肿瘤中的IGF-IR水平的降低。在一个优选的实施方案中，抗-IGF-IR抗体使受体水平比未处理的动物降低至少20％。在一个更优选的实施方案中，抗-IGF-IR抗体使受体水平降至未处理动物体内的受体水平的至少60％，更优选地是50％。在一个甚至更优选的实施方案中，所述抗体使受体水平降低到至少40％，更优选地是30％。在一个优选的实施方案中，在测定IGF-IR水平前约24小时施用所述抗体。IGF-IR水平可以通过本技术领域中的任何已知方法来测定，诸如下文所描述的方法。参见例如实施例VIII和图6。在一个优选的实施方案中，所述抗体选自2.12.1，2.13.2，2.14.3，3.1.1，4.9.2或6.1.1，或者含有重链、轻链或其抗原结合片段。
在另一个实施方案中，抗-IGF-IR抗体抑制体内肿瘤细胞的生长。所述肿瘤细胞可以得自任何包括但不限于表皮细胞、上皮细胞、内皮细胞、白血病细胞、肉瘤细胞、多发骨髓瘤或中胚层细胞的细胞类型。肿瘤细胞的实例包括A549(非-小细胞肺癌)细胞，MCF-7细胞，Colo205细胞，3T3/IGF-IR细胞和A431细胞。在一个优选的实施方案中，与未被处理的动物体内的肿瘤细胞的生长相比，所述抗体抑制肿瘤细胞的生长。在一个更优选的实施方案中，所述抗体使肿瘤细胞的生长抑制了50％。在一个甚至更优选的实施方案中，所述抗体使肿瘤细胞的生长抑制了60％，65％，70％or 75％。在一个实施方案中，在开始采用所述抗体处理动物至少7天后测定对肿瘤细胞生长的抑制作用。在一个更优选的实施方案中，在开始采用所述抗体处理动物至少14天后测定对肿瘤细胞生长的抑制作用。在另一个优选的实施方案中，将另一种抗肿瘤剂与抗-IGF-IR抗体一用施用给动物。在一个优选的实施方案中，所述抗肿瘤剂能够进一步抑制肿瘤的生长。在一个甚至更优选的实施方案中，所述抗肿瘤剂是阿霉素，紫杉醇，他莫昔芬，5-氟脱氧尿苷(5-FU)或CP-358，774。在一个优选的实施方案中，共同施用抗肿瘤剂和抗-IGF-IR抗体后22-24天将肿瘤细胞的生长抑制至少50％，更优选地是60％，65％，70％或75％，更优选地是80％，85％或90％。参见例如图7和实施例IX。在一个优选的实施方案中，所述抗体选自2.12.1，2.13.2，2.14.3，3.1.1，4.9.2或6.1.1，或者含有重链、轻链或其抗原结合片段。
由抗-IGF-IR抗体诱导的编程性细胞死亡
本发明的一个方面提供了诱导细胞死亡的抗-IGF-IR抗体。在一个实施方案中，所述抗体引起编程性细胞死亡。所述抗体可以诱导体内或体外的编程性细胞死亡。通常，肿瘤细胞比正常细胞对编程性细胞死亡更敏感，因此施用抗-IGF-IR抗体比正常细胞优先引起肿瘤细胞的编程性细胞死亡。在另一个实施方案中，施用抗-IGF-IR抗体降低了酶，akt的水平，该酶涉及磷脂酰肌醇(PI)激酶途径。PI激酶途径依次涉及细胞的繁殖和编程性细胞死亡的预防。因此，akt的抑制能够引起编程性细胞死亡。在一个更优选的实施方案中，体内施用所述抗体以便引起the IGF-IR-表达细胞的编程性细胞死亡。在一个优选的实施方案中，所述抗体选自2.12.1，2.13.2，2.14.3，3.1.1，4.9.2或6.1.1，或者含有重链、轻链或其抗原结合片段。
制备抗体和抗体-产生细胞系的方法
免疫
在本发明的一个实施方案中，人抗体是通过用IGF-IR抗原免疫非人动物而制备的，其含有部分或全部的人免疫球球蛋白基因座。在一个优选的实施方案中，所述非人动物是XENOMOUSETM，其为一种含有人 免疫球蛋白基因座的大片段并且小鼠抗体产生缺陷的工程鼠品系。参见例如Green等.Nature Genetics 7：13-21(1994)和美国专利US5916771，5939598，5985615，5998209，6075181，6091001，6114598和6,130,364。还参见1991年7月25日公布的WO 91/10741，1994年2月3日公布的WO 94/02602，1996年10月31日公布的WO 96/34096和WO 96/33735，1998年4月23日公布的WO 98/16654，1998年6月11日公布的WO 98/24893，1998年11月12日公布的WO 98/50433，1999年9月10日公布的WO 99/45031，1999年10月21日公布的WO99/53049，2000年2月24日公布的WO 00 09560和2000年6月29日公布的WO 00/037504。XENOMOUSETM产生完整人抗体的成熟型的人的所有组成成分，并且产生抗原-特异性人的Mab。通过引入人的重链基因座和κ轻链基因座的兆碱基大小的种系结构YAC片段而使第二代XENOMOUSETM含有约80％的人抗体成分。参见Mendez等.Nature Genetics 15：146-156(1997)，Green和Jakobovits J.Exp.Med.188：483-495(1998)，其全部公开内容被引入本文作为参考。
本发明还提供了通过免疫含有人免疫球球蛋白基因座的非人转基因动物由非人、非小鼠动物制备抗-IGF-IR抗体的方法。可以利用以上直接记载的方法生产这种动物。可以按照美国专利US5994619所公开的内容来改进这些专利中公开的方法。在一个优选的实施方案中，非人动物可以是大鼠、绵羊、猪、山羊、牛或马。
在另一个实施方案中，含有人免疫球蛋白基因座位的所述非人动物是具有人免疫球蛋白的“小基因座(minilocus)”的动物。在小基因座方法中，通过源自Ig基因座的个别基因的包含来模拟外源Ig基因座。因此，一个或多个VH基因，一个或多个DH基因，一个或多个JH基因，一个mu恒定区和第二个恒定区(优选地γ恒定区)形成一个适于插入到动物体内的构建体。该方法被记载在美国专利号5545807，5545806，5625825，5625126，5633425，5661016，5770429，5789650，5814318，5591669，5612205，5721367，5789215和5643763中，这些专利被引入本文作为参考。
小基因座方法的优点在于能够快速制备含有部分Ig基因座的构建体并引进到动物体内。然而，小基因座方法的潜在缺点在于不具有充分的免疫球蛋白多样性来支持完整B细胞的发育，因而抗体的产量可能会很低。
为了生产人的抗-IGF-IR抗体，用IGF-IR抗原免疫含有部分或全部人免疫球蛋白基因座位的非人动物，并从所述动物体内分离抗体或产生抗体的细胞。IGF-IR抗原可以是分离的和/或纯化的IGF-IR，并且优选地是人IGF-IR。在另一个实施方案中，所述IGF-IR抗原是IGF-IR片段，优选地是IGF-IR的胞外区域。在另一个实施方案中，所述IGF-IR抗原是含有IGF-IR的至少一个表位的片段。在另一个实施方案中，所述IGF-IR抗原是在细胞表面表达IGF-IR的细胞，优选地是在细胞表面过表达IGF-IR的细胞。
可以按照本技术领域中的任何已知方法来进行动物免疫。参见例如Harlow和Lane，Antibodies：A Laboratory Manual，纽约：冷泉港出版社，1990。用于免疫非人动物如小鼠、大鼠、绵羊、山羊、猪、牛和马的方法在本技术领域中是已知的。参见例如Harlow和Lane以及美国专利US5994619。在一个优选的实施方案中，IGF-IR抗原与佐剂一起进行施用从而激发免疫应答。这种佐剂包括完全的或不完全的弗氏佐剂、RIBI(胞壁酰二肽)或ISCOM(免疫刺激复合物)。这种佐剂可以通过以局部沉积使其隔离而使多肽避免快速分散，或者这些佐剂可以含有刺激宿主分泌对巨噬细胞和免疫系统的其它组分具有趋化性的因子的物质。优选地，如果施用所述多肽，那么免疫程序将包括两次或多次的多肽施用，时间跨度为若干个星期。
实施例I提供了利用溶解在磷酸盐缓冲液中的人的全长IGF-IR免疫XENOMOUSETM的方案。
抗体和抗体产生细胞系的制被
用IGF-IR抗原免疫动物后，可以从该动物体内获得抗体和/或产生抗体的细胞。通过放血或杀死动物来从动物体内获得含有抗-IGF-IR抗体的血清。可以使用从动物体内获得的血清，可以从所述血清中获得免疫球蛋白成分或可以从所述血清中纯化得到抗-IGF-IR抗体。以这种方式获得的血清或免疫球蛋白是多克隆的，其缺点在于获得的抗体量非常有限，并且多克隆抗体具有异种特性。
在另一个实施方案中，可以由被免疫的动物制备产生抗体的无限增殖化杂交瘤。免疫后，将动物处死并将脾的B细胞融合到无限增殖化的骨髓瘤细胞上，这在本技术领域中是已知的。参见例如Harlow和Lane，上文。在一个优选的实施方案中，骨髓瘤细胞不分泌免疫球蛋白多肽(一种非分泌性细胞系)。融合并进行抗生素筛选后，利用IGF-IR，其部分片段或表达IGF-IR的细胞筛选杂交瘤。在一个优选的实施方案中，通过酶联免疫分析(ELISA)或放射性免疫分析(RIA)，优选地通过ELISA来进行最初的筛选。ELISA筛选的一个实例由WO00/37504来提供，被引入本文作为参考。
在另一个实施方案中，产生抗体的细胞由具有自身免疫缺陷和表达抗-IGF-IR抗体的人体内制备。表达抗-IGF-IR抗体的细胞可以通过分离白血细胞并将这些细胞进行荧光-活化细胞分类(FACS)或通过扫描包被了IGF-IR或其部分片段的板来进行分离。这些细胞可以与人的非分泌型骨髓瘤融合从而产生表达人的抗-IGF-IR抗体的杂交瘤。通常，这是一个不太优选的实施方案，这是因为抗-IGF-IR抗体对IGF-IR的亲合力似乎很低。
选出产生抗-IGF-IR抗体的杂交瘤，克隆并进一步筛选出包括杂交瘤的健康生长、高抗体产量和所需抗体特性在内的所需特性，下面将进一步进行讨论。可以在同系动物、缺乏免疫系统的动物，例如裸鼠体内培养和扩展杂交瘤，或者可以在体外细胞培养物中培养和扩大杂交瘤。选择、克隆和扩大杂交瘤的方法对于本技术领域中的普通技术人员来说是熟知的。
优选地，被免疫的动物是表达人免疫球蛋白基因的非人动物，而且脾的B细胞被融合到得自与所述非人动物相同的动物品种的骨髓瘤中。更优选地，被免疫动物是XENOMOUSETM，而且所述骨髓瘤细胞系是一种非分泌型的小鼠骨髓瘤，诸如骨髓瘤细胞系是NSO-bcl2。参见例如实施例I。
一方面，本发明提供产生人的抗-IGF-IR抗体的杂交瘤。在一个优选的实施方案中，所述杂交瘤是如上所述的小鼠杂交瘤。在另一个优选的实施方案中，所述杂交瘤产自非人、非小鼠的品种如大鼠、绵羊、猪、山羊、牛或马。在另一个实施方案中，所述杂交瘤是人的杂交瘤，其中人的非分泌型骨髓瘤与表达抗-IGF-IR抗体的人细胞融合在一起。
制备抗体的核酸、载体、宿主细胞和重组方法
核酸
提供了编码本发明的抗-IGF-IR抗体的核酸分子。在一个实施方案中，所述核酸分子编码抗-IGF-IR免疫球蛋白的重链和/或轻链。在一个优选的实施方案中，单个核酸分子编码抗-IGF-IR免疫球蛋白的重链以及另一个核酸分子编码抗-IGF-IR免疫球蛋白的轻链。在一个更优选的实施方案中，被编码的免疫球蛋白是人免疫球蛋白，优选地是人IgG。被编码的轻链可以是λ连或κ链，优选地是κ链。
编码轻链可变区的核酸分子可以得自A30，A27或012Vк基因。在一个优选的实施方案中，所述轻链得自A30Vκ基因。在另一个优选的实施方案中，编码轻链的核酸分子含有得自Jκ1，Jκ2或Jκ4的连接区域。在一个甚至更优选的实施方案中，编码轻链的核酸分子含有不超过十个由种系A30Vκ基因的氨基酸变化，优选地是不超过六个氨基酸变化，甚至更优选地是不超过三个氨基酸变化，
本发明提供了编码轻链可变区(VL)的核酸分子，所述可变区与种系序列相比至少具有三个氨基酸变化，其中所述的氨基酸变化与源自抗体2.12.1，2.13.2，2.14.3，3.1.1，4.9.2，4.17.3或6.1.1中的一个抗体的VL的种系序列的氨基酸变化相同。本发明还提供了含有编码2.12.1，2.13.2，2.14.3，3.1.1，4.9.2，4.17.3或6.1.1的轻链可变区的氨基酸序列的核酸序列的核酸分子。本发明还提供了含有编码2.12.1，2.13.2，2.14.3，3.1.1，4.9.2，4.17.3或6.1.1中的任何一个轻链的一个或多个CDR的氨基酸序列的核酸序列的核酸分子。在一个优选的实施方案中，所述核酸分子含有编码2.12.1，2.13.2，2.14.3，3.1.1，4.9.2，4.17.3或6.1.1中的任何一个轻链的所有CDR的氨基酸序列的核酸序列。在另一个的实施方案中，所述核酸分子含有编码SEQ ID NO：2，6，10，14，18或22中的一个氨基酸序列的核酸序列或着含有SEQ ID NO：1，5，9，13，17或21中的一个核酸序列。在另一个优选的实施方案中，所述核酸分子含有编码SEQ ID NO：2，6，10，14，18或22中的任意一个的一个或多个CDR的核酸序列或者含有SEQ ID NO：1，5，9，13，17或21中的任意一个的一个或多个CDR的核酸序列。在一个更优选的实施方案中，所述核酸分子含有编码SEQ ID NO：2，6，10，14，18或22中的任意一个的所有CDR的氨基酸序列的核酸序列或者含有SEQ ID NO：1，5，9，13，17或21中的任意一个的所有CDR的核酸序列。
本发明还提供了编码VL的氨基酸序列的核酸分子，所述VL具有至少70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同于上述VL的氨基酸序列，尤其含有SEQ ID NO：2，6，10，14，18或22中的一个的氨基酸序列的VL。本发明还提供了至少70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同于SEQ ID NO：1，5，9，13，17或21中的一个的核酸序列的核酸序列。在另一个实施方案中，本发明提供了编码VL的核酸分子，所述VL在高度严格条件下与编码上述VL的核酸分子杂交，特别是含有编码SEQ ID NO：2，6，10，14，18或22的氨基酸序列的核酸序列的核酸分子。本发明还提供了编码VL的核酸序列，所述VL在高度严格条件下与含有SEQ ID NO：1，5，9，13，17或21中的一个的核酸序列的核酸分子杂交。
本发明还提供了编码得自DP-35，DP-47，DP-71或Vit-4/4.35VH基因的重链(VH)可变区的核酸分子，优选地是DP-35VH基因。在一个优选的实施方案中，编码VH的核酸分子含有得自JH6或JH5的连接区域，更优选地是JH6。在另一个优选的实施方案中，所述D片段得自3-3，6-19或4-17。在一个甚至更优选的实施方案中，编码VH的核酸分子含有不超过十个由种系DP-47基因的氨基酸变化，优选地不超过六个氨基酸变化，以及甚至更优选地不超过三个氨基酸变化。在一个非常优选的实施方案中，与种系序列相比，编码VH的核酸分子含有至少一个氨基酸变化，其中所述氨基酸变化相同于源自抗体2.12.1，2.13.2，2.14.3，3.1.1，4.9.2，4.17.3或6.1.1中的一个的重链的种系序列的氨基酸变化。在一个甚至更优选的实施方案中，与种系序列相比，VH含有至少三个氨基酸变化，其中所述变化相同于源自抗体2.12.1，2.13.2，2.14.3，3.1.1，4.9.2，4.17.3或6.1.1中的一个的VH的种系序列的那些变化。
在一个实施方案中，所述核酸分子含有编码2.12.1，2.13.2，2.14.3，3.1.1，4.9.2，4.17.3或6.1.1的VH的氨基酸序列的核酸序列。在另一个实施方案中，所述核酸分子含有编码2.12.1，2.13.2，2.14.3，3.1.1，4.9.2，4.17.3或6.1.1的重链的一个或多个CDR的氨基酸序列的核酸序列。在一个优选的实施方案中，所述核酸分子含有编码2.12.1，2.13.2，2.14.3，3.1.1，4.9.2，4.17.3或6.1.1的重链的所有CDR的氨基酸序列的核酸序列。在另一个优选的实施方案中，所述核酸分子含有编码SEQID NO：4，8，12，16，20或24中的一个的氨基酸序列的核酸序列或者含有SEQ ID NO：3，7，11，15，19或23中的一个的核酸序列。在另一个优选的实施方案中，所述核酸分子含有编码SEQ ID NO：4，8，12，16，20或24中的任意一个的一个或多个CDR的氨基酸序列的核酸序列或者含有SEQ ID NO：3，7，11，15，19或23中的任意一个的一个或多个CDR的核酸序列。在一个优选的实施方案中，所述核酸分子含有编码SEQ ID NO：4，8，12，16，20或24中的任意一个的所有CDR的氨基酸序列的核酸序列或者含有SEQ ID NO：3，7，11，15，19或23中的任意一个的所有CDR的核酸序列。
在另一个实施方案中，所述核酸分子编码VH的氨基酸序列，该VH的氨基酸序列至少70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同于编码上述VH的氨基酸序列中的一个，尤其是含有SEQ ID NO：4，8，12，16，20或24中的一个的氨基酸序列的VH。本发明还提供了至少70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同于SEQ ID NO：3，7，11，15，19或23中的一个的核酸序列的核酸序列。在另一个实施方案中，编码VH的核酸分子是一种在高度严格条件下与编码上述VH的核酸分子杂交的核酸分子，特别是与含有编码SEQ ID NO：4，8，12，16，20或24中的一个的氨基酸序列的VH杂交。本发明还提供了一种编码VH的核酸分子，该VH在高度严格条件下与含有SEQ ID NO：3，7，11，15，19或23中的一个的核酸序列的核酸分子杂交。
编码抗-IGF-IR抗体的完整重链和轻链中的一种或两种或其可变区域的核酸分子可以由产生抗-IGF-IR抗体的任何来源获得。分离编码抗体的mRNA的方法在本技术领域中是已知的。参见例如Sambrook等。所述mRNA可以被用来制备用于聚合酶链式反应(PCR)或抗体基因cDNA克隆的cDNA。在本发明的一个实施方案中，所述核酸分子可以由上述表达抗-IGF-IR抗体的的杂交瘤来获得，优选地是一种以表达人免疫球蛋白基因的转基因动物细胞作为其融合配体中的一种配体的杂交瘤，所述转基因动物是诸如XENOMOUSETM，非-人小鼠转基因动物或非-人、非-小鼠转基因动物。在另一个实施方案中，所述杂交瘤得自非-人、非-转基因动物，其被用于，例如人源化抗体。
编码抗-IGF-IR抗体的完整重链的核酸分子可以通过将编码重链可变区的核酸分子或其抗原结合区的核酸分子与重链恒定区融合来进行构建。类似的，编码抗-IGF-IR抗体的轻链的核酸分子可以通过将编码轻链可变区的核酸分子或其抗原结合区的核酸分子与轻链恒定区融合来进行构建。通过分别将其插入到已经能够编码重链恒定区和轻链恒定区的表达载体中，从而将VH片段可操作性地连接到载体中的重链恒定区(CH)片段上和将VL片段可操作性地连接到载体中的轻链恒定区(CL)片段上，可以将编码VH和VL的核酸分子转化成全长抗体基因。或者，通过利用标准分子生物学技术将编码VH链的核酸分子连接到编码CH链的核酸分子上来把编码VH或VL链的核酸分子转化成全长抗体基因。利用编码VL和CL链的核酸分子可以达到相同的效果。人的重链和轻链恒定区基因的序列在本技术领域中是已知的。参见例如Kabat等，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版，NIH公开号91-3242，1991。可以将编码全长重链和/或轻链的核酸分子引入到一种细胞内来进行表达并分离抗-IGF-IR抗体。
在一个优选的实施方案中，编码重链可变区的核酸分子编码SEQID NO：4，8，12，16，20或24的氨基酸序列，并且编码轻链可变区的核酸分子编码SEQ ID NO：2，6，10，14，18或22的氨基酸分子。SEQ IDNO：28描述了抗体2.12.1，2.13.2，2.14.3，3.1.1，4.9.2，4.17.3和6.1.1的重链恒定区的氨基酸序列而SEQ ID NO：27描述了编码抗-IGF-IR抗体2.12.1，2.13.2，2.14.3，3.1.1，4.9.2，4.17.3和6.1.1的重链恒定区的核酸序列。SEQ ID NO：26描述了抗-IGF-IR抗体2.12.1，2.13.2，2.14.3，3.1.1，4.9.2，4.17.3和6.1.1的氨基酸序列而SEQ ID NO：25描述了编码抗-IGF-IR抗体2.12.1，2.13.2，2.14.3，3.1.1，4.9.2，4.17.3和6.1.1的轻链恒定区的核酸序列。因此，在一个优选的实施方案中，编码重链恒定区的核酸分子编码SEQ ID NO：28，而编码轻链恒定区的核酸分子编码SEQ ID NO：26。在一个更优选的实施方案中，编码重链恒定区的核酸分子具有SEQ ID NO：27所示的核酸分子，而编码恒定区的核酸分子具有SEQ ID NO：25所示的核酸分子。
在另一个实施方案中，编码抗-IGF-IR抗体的重链或其抗原结合区，或者轻链或其抗原结合区的核酸分子可以从表达人免疫球蛋白基因并且用IGF-IR抗原免疫的非人、非小鼠动物体内分离出来。在另一个实施方案中，核酸分子可以从得自非转基因动物的抗-IGF-IR抗体-产生细胞或从产生抗-IGF-IR抗体的病人体内分离出来。可以通过标准技术从抗-IGF-IR抗体-产生细胞中分离mRNA，可以利用PCR和文库构建技术进行克隆和/或扩增和利用标准技术方案进行筛选从而获得编码抗-IGF-IR抗体的重链和轻链的核酸分子。
如下所述，所述核酸分子可以被用来重组表达大量的抗-IGF-IR抗体。如下进一步描述的，所述核酸分子还可以被用来生产嵌合抗体、单链抗体、免疫粘附素、双体、突变抗体和抗体衍生物。而且如下文所述，如果所述核酸分子得自非人、非转基因动物，那么所述核酸分子可被用于抗体的人源化。
在另一个实施方案中，本发明的核酸分子可以被用作特定抗体序列的探针或PCR引物。例如，核酸分子探针可以被用在诊断方法中或者核酸分子PCR引物可以被用来扩增可能使用的DNA区域，被用来分离在生产抗-IGF-IR抗体可变区中使用的核酸序列。在一个优选的实施方案中，所述核酸分子是寡核苷酸。在一个更优选的实施方案中，所述寡核苷酸源自目的抗体的重链和轻链高变区。在一个甚至更优选的实施方案中，所述寡核苷酸编码一个或多个CDR的全部或部分。
载体
本发明提供了含有本发明的编码重链或其抗原结合片段的核酸分子的载体。本发明还提供了含有本发明的编码轻链或其抗原结合片段的核酸分子的载体。本发明还提供了含有编码融合蛋白、改变抗体、抗体片段及其探针的核酸分子的载体。
为了表达本发明的抗体或抗体片段，将按照上述方法获得的编码部分或全长轻链和重链的DNA插到表达载体中以使所述基因可操作性地连接到转录或翻译的控制序列上。表达载体包括质粒、反转录病毒、粘粒、YAC、EBV的衍生附加体等。将所述抗体基因连接到载体中以使载体中的转录和翻译控制序列起到调节抗体基因的转录和翻译的预期功能。选择所述表达载体和表达控制序列以与所用的表达宿主细胞相容。可以将抗体轻链基因和抗体重链基因插入到分离的载体中。在一个优选的实施方案中，将所述两种基因插入到同一表达载体中。通过标准方法将所述抗体基因插入到表达载体中(例如，在抗体基因片段上的互补限制位点与在体连接，或者如果不存在限制位点就进行平端的连接)。
适当的载体是这样一种载体，该载体编码具有合适加工限制位点的功能完整的人CH或CL免疫球蛋白序列从而使得任何VH或VL序列能够按照上述方法容易地被插入和表达。在这种载体中，通常在被插入的J区域中的剪接供体位点与人C区域前面的剪接受体位点之间进行剪接，而且还在人CH外显子内存在的剪接区域进行剪接。聚酰苷酸化和转录终止发生于编码区下游的天然染色体位点。重组的表达载体还可以编码促进抗体链从宿主细胞中分泌出来的信号肽。所述抗体链基因可以被克隆到所述载体中从而使得信号肽被符合读框地连接到抗体链基因的氨基端。所述信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即，源自非免疫球蛋白的信号肽)。
除了所述抗体链基因外，本发明的重组表达载体还携带控制抗体链基因在宿主细胞中进行表达的调控序列。本技术领域的技术人员应当理解表达包括选择调控序列在内的载体的设计取决于诸如待转化的宿主细胞的选择、所需蛋白的表达水平等这些因素。用于哺乳动物宿主细胞表达的优选调控序列包括指导在哺乳动物细胞中进行高水平蛋白表达的病毒元件，诸如得自反转录病毒LTRs、巨细胞病毒(CMV)(诸如CMV启动子/增强子)，猿猴病毒40(SV40)(诸如SV40启动子/增强子)、腺病毒(例如腺病毒主要后期启动子(AdMLP))、多形瘤和哺乳动物强启动子如天然免疫球蛋白和肌动蛋白启动子的启动子和/或增强子。有关病毒调控元件及其序列的进一步描述参见例如Stinski的美国专利US5168062，Bell等的美国专利US4510245和Schaffner的美国专利US4968615。
除了抗体链基因和调控序列，本发明的重组表达载体还可以含有附加序列，诸如调节所述载体在在宿主细胞中进行复制的序列(例如复制的起始)和选择标记基因。该选择标记基因有利于对其中已被引进所述载体的宿主细胞进行选择(参见例如美国专利US4399216，4634665和5,179,017，全部属于Axel等)。例如，典型地所述选择标记基因赋予了其中引进了所述载体的宿主细胞对药物如G418、潮霉素或甲氨蝶呤的抗性。优选的选择标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于具有甲氨蝶呤选择性/扩增作用的dhfr-宿主细胞)和neo基因(用于G418选择)。
非杂交瘤宿主细胞和重组生产蛋白的方法
编码抗-IGF-IR抗体的重链或其抗原结合片段和/或轻链或其抗原结合片段的核酸分子以及含有这些核酸分子的载体可被用于转化合适的哺乳动物宿主细胞。可以通过任何已知的方法将多核苷酸引进宿主细胞来进行转化。用于将异源多核苷酸引进哺乳动物细胞的方法在本技术领域中是已知的，并且包括葡聚糖-介导的转染、磷酸钙沉淀、聚凝胺-介导的转染、原生质体融合、电穿孔、用脂质体包封多核苷酸、将DNA生物导弹(biolistic)注射和直接显微注射到核中。另外，可以通过病毒载体将核酸分子引进哺乳动物细胞。转化细胞的方法在本技术领域中是已知的。参见例如美国专利US4399216，4912040，4740461和4959455(这些专利被引入本文作为参考)。
作为表达宿主的哺乳动物细胞系在本技术领域中是已知的并且包括从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的许多无限增殖化细胞。这些细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，NSO，SP2细胞，HeLa细胞，幼龄仓鼠肾(BHK)细胞，猴肾细胞(COS)，人肝细胞癌细胞(例如，HepG2)，A549细胞，3T3细胞和其它一些细胞系。哺乳动物宿主细胞包括人、小鼠、大鼠、狗、猴、猪、山羊、牛、马和仓鼠细胞。特别优选的细胞系通过确定哪种细胞系具有高表达水平来进行选择。可以使用的其它细胞系是昆虫细胞系如Sf9细胞，两栖动物细胞，细菌细胞，植物细胞和真菌细胞。当编码重链或其抗原结合片段，轻链和/或其抗原结合片段的重组表达载体被引进哺乳动物宿主细胞时，通过将宿主细胞培养足以使抗体在宿主细胞中进行表达的一段时间来生产抗体，或者更优选地是使抗体分泌到培养所述宿主细胞的培养基中。利用标准蛋白纯化方法从所述培养基中回收抗体。
而且，利用多种已知技术可以增强产生细胞系对本发明的抗体(或源自抗体的其它部分)的表达。例如，谷氨酰胺合成酶基因表达系统(GS系统)是一种在某些条件下增强表达的通用手段。GS系统在欧洲专利EP0216846，EP0256055和EP0323997和欧洲专利申请89303964.4得到全部或部分的讨论。
由不同细胞系或转基因动物表达的抗体彼此之间似乎具有不同的糖基化作用。然而，由本文提供的核酸分子编码的抗体，或者含有本文提供的氨基酸序列的抗体属于本发明的一部分，而不考虑抗体的糖基化。
转基因动物
本发明还提供了含有一种或多种本发明用于生产本发明抗体的核酸分子的非人转基因动物。可以在和从组织或体液中产生和回收抗体，所述体液诸如是山羊、牛、马、猪、大鼠、小鼠、兔、仓鼠或其它哺乳动物的乳液、血液或尿。参见例如美国专利US5827690，5756687，5750172和5,741,957。如上所述，含有人 免疫球蛋白基因座的非人转基因动物可以通过用IGF-IR或其片段进行免疫来制备。
在另一个实施方案中，非人转基因动物是通过采用标准的转基因技术将一种或多种本发明的核酸分子引进动物体内来制备的。参见Hogan，如上文所述。用于制备转基因动物的转基因细胞可以是胚胎干细胞或体细胞。所述非人转基因生物可以是嵌合的、非嵌合的杂合体和非嵌合的纯合体。参见例如Hogan等， Manipμl ating the Mouse Embrvo：A Laboratorv Manual 2ed.，冷泉港出版社(1999)；Jackson等， Mose Genetics and Transaenics：A Practical Approach，牛津大学出版社(2000)；和Pinkert， Transgenic Animal Technology：A Laboratory Handbook，学术出版社(1999)。在另一个实施方案中，所述非人转基因生物可以具有编码所需重链和/或轻链的靶裂解和取代。在一个优选的实施方案中，所述转基因动物含有并表达编码与IGF-IR、优选地是人IGF-IR特异结合的重链和轻链的核酸分子。在另一个实施方案中，所述转基因动物含有编码改变抗体如单链抗体、嵌合抗体或人源化抗体的核酸分子。抗-IGF-IR抗体可以在任何转基因动物中制备。在一个优选的实施方案中，所述非人动物是小鼠、大鼠、羊、猪、山羊、牛或马。所述非人转基因动物在血液、乳液、尿液、唾液、眼泪、粘液合其它体液中表达所鼠被编码的多肽。
噬菌体展示文库
本发明提供了用于生产抗-IGF-IR抗体或其抗原结合片段的方法，该方法包括以下步骤：合成人抗体的噬菌体文库，用IGF-IR或其片段筛选文库，分离与IGF-IR结合的噬菌体并从该噬菌体内获得所述抗体。制备抗体文库的一种方法包括以下步骤：用IGF-IR或其抗原结合片段免疫含有人 免疫球蛋白基因座的非人宿主动物，由此产生免疫应答，从宿主动物体内提取能够产生抗体的细胞；从被提取的细胞中分离RNA，反转录所述RNA来制备cDNA，利用引物扩增所述cDNA，并将所述cDNA插入到噬菌体展示载体中从而在所述噬菌体中表达抗体。本发明重组的抗-IGF-IR抗体可以通过这种方式来获得。
除本文公开的抗-IGF-IR抗体外，本发明的重组人的抗-IGF-IR抗体也可以通过筛选重组的组合抗体文库、优选地scFv噬菌体展示文库来进行分离，所述文库是利用由得自人淋巴细胞的mRNA制成的人VL和VH cDNA而制备的。用于制备和筛选这种文库的方法在本技术领域中是已知的。有可商购得到的制备噬菌体展示文库的试剂盒(例如，Pharmacia重组噬菌体抗体系统，目录号27-9400-01；和Stratagene SurfZAPTM噬菌体展示试剂盒，目录号240612)。还存在可用于制备和筛选抗体展示文库的其它方法和试剂(参见例如Ladher等的美国专利US5223409；Kang等的PCT公开文献WO 92/18619；Dower的PCT公开文献WO 91/17271；Winter等的PCT公开文献WO 92/20791；Markland等的PCT公开文献WO 92/15679；Breitling等的PCT公开文献WO 93/01288；McCafferty等的PCT公开文献WO92/01047；Garrard等的PCT公开文献WO 92/09690；Fuchs等(1991)Bio/Technology 9：1370-1372；Hay等(1992)Hum.Antibod.Hybridomas 3：81-85；Huse等(1989)Science 246：1275-1281；McCafferty等，Nature(1990)348：552-554；Griffiths等，(1993)EMBO J 12：725-734；Hawkins等，(1992)J.Mol. Biol.226：889-896；Clackson等，(1991)Nature 352：624-628；Gram等，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：3576-3580；Garrad等.(1991)Bio/Technology 9：1373-1377；Hoogenboom等，(1991)Nuc Acid Res 19：4133-4137；和Barbas等，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：7978-7982。
在一个优选的实施方案中，为了分离具有所需特性的人抗-IGF-IR抗体，首先按照Hoogenboom等的PCT公开文献WO 93/06213所记载的表位印记方法，采用本文记载的人抗-IGF-IR抗体，来选择对IGF-IR具有类似结合活性的人的重链和轻链序列。在该方法中使用的抗体文库优选地是scFv文库，该文库是按照McCafferty等的PCT公开文献WO 92/01047，McCafferty等，Nature(1990)348：552-554；和Griffiths等，(1993)EMBO J 12：725-734所述进行制备和筛选。所述scFv抗体文库优选地是以人IGF-IR作为抗原进行筛选地。
一旦筛选择出最初的VL和VH片段，就进行″混合和比较″实验来选择优选的VL/VH配对结合体，在所述实验中就结合IGF-IR筛选出不同对的初步选择的VL和VH片段。另外，为了进一步改进抗体的质量，在类似于体内体细胞突变过程的过程中可以对优选的VL/VH配对的VL和VH片段进行随机突变，优选地在VL和/或VH的CDR3区域内进行随机突变，所述体细胞突变过程导致自然免疫应答过程中的抗体亲合力的成熟。该体外亲合力的成熟可以通过分别利用与VHCDR3或VL CDR3互补的PCR引物扩增VH和VL区域来完成，所述引物在某些位点“掺加”四种核苷酸碱基的随机混合物，从而使得所产生的PCR产物编码其中随机突变被引进VH和/或VL CDR3区域的VH和VL片段。这些被随机突变的VH和VL片段可被再次就结合IGF-IR筛选。
从重组免疫球蛋白展示文库中筛选和分离出本发明的抗-IGF-IR抗体后，可以从所述展示包(例如从噬菌体基因组)中回收编码选择抗体的核酸，并通过标准的重组DNA技术将该核酸亚克隆到其它表达载体中。如果需要，按照下文所述，该核酸可被进一步加工从而制备出本发明其它形式的抗体。为了表达通过筛选组合文库分离得到的抗体，将编码该抗体的DNA克隆到重组表达载体中，然后引进上述的哺乳动物细胞中。
类型转换
本发明的另一方面是为了提供抗-IGF-IR抗体转换成另一种的机制。根据本发明的一个方面，利用本技术领域中已知的方法分离编码VL或VH的核酸分子以使该核酸分子不含编码CL或CH的任何核酸序列。然后将编码VL或VH的核酸分子与编码源自不同类型的免疫球蛋白分子的CL或CH的核酸分子可操作性地连接。如上所述，利用含有CL或CH链的载体或核酸分子可以达到此目的。例如，可以将最初为IgM的抗-IGF-IR抗体转型为IgG。而且，类型转换可以被用来将一种IgG亚型转化成另一种亚型，例如由IgGI转化成IgG2。用于生产本发明的含有目的同种型的抗体一个优选方法包括以下步骤：分离编码抗-IGF-IR抗体的重链的核酸和编码抗-IGF-IR抗体的轻链的核酸，得到重链的可变区，将重链的可变区与所需同种型的重链的恒定区连接，在细胞中表达轻链和被连接的重链并收集具有所需同种型的抗-IGF-IR抗体。
抗体衍生物
可以通过本技术领域中的普通技术人员已知的技术和方法利用上述的核酸分子制备抗体衍生物。
人源化的抗体
如上所述的人抗体的制备方法具有生产免疫原性降低的抗体的优点。利用免疫技术和采用适当文库的展示技术可以在一定程度上实现此目的。应当理解利用本技术领域中的已知技术可以将鼠抗体或源自其它品种的抗体人源化或灵长类化。参见例如Winter和HarrisImmunol Today 14：43-46(1993)和Wright等.Crit.Reviews inImmunol.12125-168(1992)。通过重组DNA技术、采用相应的人序列取代CH1，CH2，CH3，铰链区和/或构架区来对目的抗体进行改造(参见WO 92/02190和美国专利US5530101，5585089，5693761，5693792，5714350和5777085)。在一个优选的实施方案中，通过用相应的人序列取代CH1，CH2，CH3，铰链区和/或构架区而保留重链、轻链或重链和轻链两者的所有CDR来使抗-IGF-IR抗体人源化
突变抗体
在另一个实施方案中，核酸分子、载体和宿主细胞可以被用来制备突变的抗-IGF-IR抗体。所述抗体可以在重链和/或轻链的可变区进行突变以便改变抗体的结合特性。例如，可以在一个或多个CDR区内进行突变从而增加或降低抗体对IGF-IR的Kd，增加或降低Koff，或改变抗体的结合特性。定点突变技术在本技术领域中是已知的。参见例如Sambrook等.和Ausubel等，如上文所述。在一个优选的实施方案中，对抗-IGF-IR抗体的可变区内的已知相对种系发生了改变的氨基酸残基进行突变。在一个更优选的实施方案中，对抗-IGF-IR抗体2.12.1，2.13.2，2.14.3，3.1.1，4.9.2，4.17.3或6.1.1中的一个的可变区或CDR区内的、已知相对种系发生了改变的氨基酸残基进行一个或多个突变。在另一个实施方案中，对其氨基酸序列如SEQ ID NO：2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22或24所示或其核酸序列如SEQ ID NO：1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21或23所示的可变区或CDR区内的、已知相对种系发生了改变的氨基酸残基进行一个或多个突变。在另一个实施方案中，所述核酸分子在一个或多个构架区被突变。在构架区或恒定区进行突变从而延长抗-IGF-IR抗体的半衰期。参见例如2000年2月24日公布的WO 00/09560，其被引入本文作为参考。在另一个实施方案中，可能存在一个、三个或五个点突变并且不超过十个点突变。可以在构架区或恒定区内进行突变以便改变抗体的免疫原性，从而提供用于与另一个分子进行共价或非共价结合的位点，或者改变补体固定这样的特性。可以在单独一个突变抗体内的构架区、恒定区和可变区中的每一个区域中进行突变。或者可以只在单独一个突变抗体内的构架区、可变区或恒定区中的一个区域进行突变。
在一个实施方案中，相对突变前的抗-IGF-IR抗体，突变的抗-IGF-IR抗体的VH或VL区中存在不超过十个氨基酸的改变。在更优选的实施方案中，突变的抗-IGF-IR抗体的VH或VL区中存在不超过五个氨基酸的改变，更优选地是不超过三个氨基酸的改变。在另一个实施方案中，在恒定区存在不超过十五个氨基酸的改变，更优选地是不超过十个氨基酸的改变，甚至更优选地是不超过五个氨基酸的改变。
改变的抗体
在另一个实施方案中，可以制备含有与另一种多肽连接的完整抗-IGF-IR抗体或其片段的融合抗体或免疫粘附素。在一个优选的技术方案中，只是抗-IGF-IR抗体的可变区与所述多肽连接。在另一个优选的技术方案中，抗-IGF-IR抗体的VH区与第一种多肽连接，而抗-IGF-IR抗体的VL区与结合了第一种多肽的第二种多肽以其中VH和VL区能够相互作用形成抗体结合位点的方式连接。在另一个优选的实施方案种，所述VH区通过一个接头与VL隔离开以使VH和VL区能够相互作用(参见下文的单链抗体)。然后将VH-接头-VL抗体与目的抗体连接。该融合抗体被用于将多肽定位到IGF-IR-表达细胞或组织中。所述多肽可以是治疗剂如毒素，生长因子或其它调节蛋白，或者可以是诊断试剂如可以进行简单目测的酶，诸如辣根过氧化物酶。另外，融合抗体可以被制成其中两条(或多条)单链抗体彼此连接的形式。如果需要制备单一多肽链形式的双价或多价抗体，或者需要制备一种双特异性抗体，可以采用这种方式。
为了制备单链抗体(scFv)，将VH-和VL-编码DNA片段与另一个编码柔性接头的片段可操作性地连接在一起，所述片段例如编码氨基酸序列(Gly4-Ser)3(SEQ ID NO：60)，从而使得VH和VL序列被表达成一种具有通过柔性接头连接的VL和VH区的连续单链蛋白(参见例如Bird等，(1988)Science 242：423-426；Huston等.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883；McCafferty等，Nature(1990)348：552-554)。如果仅使用一个VH和VL，所述单链抗体可以是单价的，如果使用两个VH和VL，则可以是双价的，如果使用多于两个VH和VL，则可以是多价的。
在另一个实施方案中，利用抗-IGF-IR-编码核酸分子可以制备出其它的改变抗体。例如，″κ体″(Ill等，Protein Eng 10：949-57(1997))，″小体(Minibody)″(Martin等，EMBO J 13：5303-9(1994))，″双体″(Holliger等，PNAS USA 90：6444-6448(1993))，或″Janusins″(Traunecker等，EMBO J 10：3655-3659(1991)和Traunecker等，″Janusin：new molecμlar design for bispecific reagents″Int J Cancer增刊7：51-52(1992))可以利用标准生物技术按照本说明书的教导来制备。
另一方面，可以制备嵌合的和双特异的抗体。可以制备出含有源自不同抗体的CDR和构架区的嵌合抗体。在一个优选的实施方案中，嵌合抗体的CDR含有抗-IGF-IR抗体的轻链或重链可变区的所有CDR，而构架区域得自一种或多种不同抗体。在一个更优选的实施方案中，所述嵌合抗体的CDR含有抗-IGF-IR抗体的轻链或重链可变区的所有CDR。构架区域可以是来源于另一个品种而且在一个优选的实施方案中，可以被人源化。或者，所述构架区域可以源自另一种人抗体。
可以制备出通过一个结合区与IGF-IR特异性结合的以及通过第二个结合区与第二个分子结合的双特异性抗体。所述双特异性抗体可以通过重组分子生物技术来生产，或者可以通过物理缀合在一起。另外，可以制备出含有多于一个的VH和VL的并且与IGF-IR和另一种分子特异结合的单链抗体。这种双特异性抗体可以利用已知技术来制备，例如结合(i)和(ii)参见例如，Fanger等，Immunol Methods 4：72-81(1994)以及Wright和Harris，如上所述，和结合(iii)参见例如，Traunecker等，Int.J.Cancer(Suppl.)7：51-52(1992)。在一个优选的实施方案中，所述双特异性抗体与IGF-IR和另一种在癌或肿瘤细胞上高水平表达的分子结合。在一个更优选的实施方案中，另一种分子是erbB2受体，VEGF，CD20或EGF-R。
在一个实施方案中，上述被改变的抗体是利用选自2.12.1，2.13.2，2.14.3，3.1.1，4.9.2，4.17.3或6.1.1的一种抗体的一个或多个可变区或者一个或多个CDR区域而制备的。在另一个实施方案中，所述改变的抗体是利用其氨基酸序列如SEQ ID NO：2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22或24所示或者其核酸序列如SEQ ID NO：1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21或23所示的一个或多个可变区或者一个或多个CDR区域而制备的。
衍生和标记的抗体
本发明的抗体或抗体片段可以被衍生化或与另一种分子连接(例如另一种多肽或蛋白质)。通常，所述抗体或其片段被衍生化以使IGF-IR结合免受衍生化或标记的不利影响。因此，本发明的抗体或其片段被设计成既含有完整的又含有改变形式的本文所述的人的抗-IGF-IR-抗体。例如本发明的抗体或其片段可以与一个或多个其它分子实体如另一种抗体(例如双特异性抗体或双体)、检测试剂、细胞毒性试剂、药剂和/或能够介导抗体或其片段与另一种分子结合的蛋白质或肽(诸如链霉抗生物素核区或聚组氨酸标记物)进行功能性连接(通过化学偶连、基因融合、非共价结合等)。
一种类型的衍生化抗体是通过交联两种或多种抗体来生产的(同类型或不同类型的抗体，例如创建双特异性抗体)。合适的交联剂包括那些具有由适当间隔区隔开的两个不同反应基团的异型双功能的(例如，间-马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯)或同型双功能的(例如双琥珀酰亚胺基辛二酸盐)交联剂。这种交联剂可以从PierceChemical Company，Rockford，III得到。
另一种类型的衍生化抗体是标记的抗体。可将本发明的抗体或抗体片段衍生化的有用检测试剂包括包括荧光素、荧光素异硫氰酸盐、罗丹明、5-二甲胺-1-萘磺酰氯、藻红蛋白、镧系元素磷光体等在内的荧光化合物。抗体也可以采用用于检测的酶如辣根过氧化酶、β-半乳糖苷酶、萤光素霉、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等来进行标记。当抗体被可检测酶标记后，通过添加被酶用来产生可被辨别产物的附加试剂来检测抗体。例如，当试剂辣根过氧化物酶存在时，添加过氧化氢和二氨基联苯胺导致可检测的有色反应产物的产生。抗体也可以用生物素来标记，并且通过间接测定抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白的结合来检测。抗体可以用磁性剂如钆来进行标记。抗体也可以用由第二报道分子(例如亮氨酸拉链配对序列、第二种抗体结合位点、金属结合区域、表位尾端)识别的预定多肽表位来标记。在一些实施方案中，由不同长度的间隔臂来连接标记物以便减小潜在的空间障碍。
抗-IGF-IR抗体还可以用放射性标记的氨基酸来标记。所述放射性标记可以被用于诊断或治疗目的。例如，可以使用所述放射性标记通过X-射线或其它诊断技术来检测IGF-IR-表达肿瘤。而且，所述放射性标记可被治疗性地用作癌细胞或肿瘤的毒素。用于多肽的标记实例包括但不限于下列放射性同位素或放射性核素--3H，14C，15N，35S，90Y，99Tc，111In，125I，131I。
抗-IGF-IR抗体还可以被化学基团如聚乙二醇(PEG)、甲基或乙基或糖基衍生化。这些基团可以被用来改进抗体的生物学特性，例如延长血清半衰期或提高组织的结合力。
药物组合物合试剂盒
本发明还涉及用于治疗哺乳动物体内过度增殖性病症的药物组合物，该组合物含有治疗有效量的本发明化合物和药物可接受的载体。在一个实施方案中，所述药物组合物被用于治疗癌症如脑癌、肺癌、鳞状上皮细胞癌、膀胱癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌、头癌、颈癌、肾癌、卵巢癌、前列腺癌、结肠直肠癌、食管癌、妇科癌症或甲状腺癌。在另一个实施方案中，所述药物组合物涉及非癌性过度增殖性病症如但不限于血管成形术后的再狭窄和牛皮癣。在另一个实施方案中，本发明涉及用于对需要激活IGF-IR的哺乳动物进行治疗的药物组合物，其中该组合物含有治疗有效量的本发明活化抗体和药学可接受的载体。含有激活抗体的药物组合物可以被用来治疗缺乏充足的IGF-I或IGF-II的动物，或者可以被用来治疗骨质疏松、虚弱或哺乳动物分泌生长激素过少或不能对生长激素产生应答的病症。
本发明的抗-IGF-IR抗体可以被组合到适于对受治疗者进行施用的药物组合物中。典型地，所述药物组合物含有本发明的抗体和药物可接受的载体。本文所使用的“药物可接受的载体”包括在生理学上相容的任何和所有试剂、分散介质、包衣、抗细菌剂、抗真菌剂、等渗剂和吸收延缓剂等。药物可接受的载体的实例包括一种过多种水、盐水、磷酸盐缓冲液、葡萄糖、甘油、乙醇等及其组合物。在多种情况下，在所述组合物中优选地含有等渗剂，例如糖、多醇如甘露醇、山梨醇，或氯化钠。药物可接受的物质如润湿剂或少量的辅助物质如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲液，能够延长所述抗体或抗体片段的保存期或有效性。
本发明的组合物可以是多种形式的。这些包括例如液体、半固体和固体剂型，诸如液体溶液(例如可注射的和可输注的溶液)，分散液或悬浮液，片剂，丸剂，粉剂，脂质体和栓剂。优选的剂型取决于给药的方式和治疗用途。典型的优选组合物是可注射或可输注溶液的形式，诸如类似于用于采用其它抗体进行的人体被动免疫的那些组合物的组合物。优选的用药方式是否非肠道用药(例如静脉内用药、皮下用药、腹膜内用药、肌内用药)。在一个优选的实施方案中，所述抗体通过静脉内输注或注射进行用药。在一个更优选的实施方案中，所述抗体通过肌内或皮下注射进行用药。
治疗组合物典型地在制备和贮存的条件下必须是无菌的和稳定的。所述组合物可被配制成溶液、微乳状液、分散剂、脂质体或适用于高药物浓度的其它有序结构。无菌注射溶液可以通过下一步骤来制备：将所需量的抗-IGF-IR抗体与所需的上述组分的一种或组合物组合到合适溶剂中，然后进行过滤除菌。通常，分散液可以通过将所述活性化合物组合到无菌载体中来制备，该无菌载体含有基本分散介质和所需的上述其它组分。对于用于制备无菌注射溶液的无菌粉状物，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，该方法能够产生所述活性成分与源自已无菌过滤的溶液的任何所需附加成分的粉状物。溶液的合式流动性可以例如通过利用包衣如卵磷脂、通过在分散液中保持所需粒径和通过利用表面活性剂来维持。可以通过在组合物中包含一种延迟吸收的物质，例如单硬脂酸盐和明胶来延长可注射组合物的吸收。
尽管对于许多治疗用途来说，优选的给药途径/方式是腹膜内、皮下、肌内、静脉内或输注给药，但本发明的抗体可以通过本技术领域中的多种已知方法来进行给药。如本技术领域的技术人员所理解的，给药途径/方式将随所需结果的变化而变化。在一个实施方案中，本发明的抗体能以单次剂量的形式进行给药或者以多次剂量形式进行给药。
在某些实施方案中，所述活性化合物可以与能够使该化合物避免快速释放的载体一起制备成诸如包括植入片、透皮贴片和微囊包封的传输系统在内的控释制剂。可以使用可生物降解的、生物相容的聚合物，诸如乙烯醋酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备这种制剂的多种方法被授予了专利或者对于本技术领域中的技术人员来说是已知的。参见例如Sustained and ControlledRelease Drμg Delivery Systems，J.R.Robinson编辑，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。
在某些实施方案中，本发明的抗-IGF-IR可以口服给药，例如与惰性稀释剂或可同化的可食用载体一起口服给药。所述化合物(如果需要，和其它成分)也可以被包封在一种硬或软壳明胶囊中，压成片或直接组合到被治疗者的食物中。针对口服治疗给药的情况，所述化合物可以与赋形剂组合并以一种可摄取的片剂、口腔片、锭剂、胶囊、酏剂、悬浮剂、糖浆剂、糯米纸囊剂等的形式进行使用。为了通过除非肠道给药以外的方式施用本发明的化合物，有必要用避免其失活的物质包衣所述化合物或者与避免失活的物质一起共同施用所述化合物。
还可以将补充活性化合物组合到所述组合物中。在某些实施方案中，本发明的抗-IGF-IR可以与一种或多种附加治疗剂，诸如化学治疗剂、抗肿瘤剂或抗瘤剂一起进行配制和/或施用。例如，抗-IGF-IR抗体可以与一种或多种附加治疗剂一起进行配制和/或施用。这些药剂包括但不限于与其它靶向物结合的抗体(例如结合一种或多种生长因子或细胞因子、它们的细胞表面受体或IGF-I的抗体)，IGF-I-结合蛋白质，抗肿瘤剂，化学治疗剂，抗瘤剂，抗IGF-IR或IGF-I的反义寡核苷酸，抑制IGF-IR活化的肽类似物，可溶性IGF-IR和/或本领域中已知的一种或多种抑制IGF-I产生或活性的化学剂，例如奥曲肽(octreotide)。为了制备含有活化抗体的药物组合物，可以将抗-IGF-IR抗体与增强细胞增殖或避免编程性细胞死亡的因子一起进行配制。这种因子包括生长因子，如IGF-I，和/或激活IGF-IR的IGF-I的类似物。这种组合疗法需要低剂量的抗-IGF-IR抗体以及被共同施用的药剂，因而避免了可能的毒性或与各种单疗法有关的并发症。在一个实施方案中，所述抗体和一种或多种附加治疗剂。
本发明的药物组合物可以含有“治疗有效量”的或“预防有效量”的本发明的抗体或抗体片段。“治疗有效量”是指在必需的剂量下和时间段内对获得所需治疗结果有效的量。抗体或抗体片段的治疗有效量可以随着诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重，抗体或抗体片段在个体体内激发所需应答的能力这样的因素而发生变化。治疗有效量还是一种其中治疗的有益效果超过了抗体或抗体片段的毒性或有害作用的量。“预防有效量”是指是指在必需的剂量下和时间段内对获得所需预防结果有效的量。典型地，由于在患病前或患病早期使用预防剂量，所以预防有效量将低于治疗有效量。
可以对用药量方案进行调节从而提供所需的最佳结果(例如一种治疗或预防结果)。例如，可以单次施用一个大丸剂，可以在一段时间内进行若干次分开给药或者可以根据治疗紧急程度按比例减少或增加。含有抗体的药物组合物或者含有包含抗体和一种或多种附加治疗剂的组合的药物组合物可以被配制成单次或多次剂量。尤其有利地是以单位剂量形式配制非肠道组合物从而便于给药和均匀给药。本文使用的单位剂量形式是指适于被待治疗哺乳动物受试者用作单位剂量的物理分离单位；每个单位含有预定量的活性化合物，所述预定量被计算成能够与所需药物载体一起产生理想的治疗效果。本发明用于单位剂量形式的规格取决于(a)所述活性化和物的独特性质和需要达到的特定治疗或预防效果以及(b)此类活性化合物领域中的就个体治疗敏感性的固有限制。特别有用的制剂是在20mM的柠檬酸钠、pH5.5、140mM NaCI和0.2mg/ml吐温80(polysorbate 80)的缓冲液中的5mg/ml抗-IGF-IR抗体。
本发明抗体或抗体片段的范例性的、非限制性的治疗或预防有效量范围是0.1-100mg/kg，更优选地是0.5-50mg/kg，更优选地是1-20mg/kg，以及甚至更优选地是1-10mg/kg。应当注意到所述剂量值可能随待减轻的病症的类型和严重程度而变化。应当进一步理解针对特定的受试者，整个期间应当根据个体的需要和个人对组合物用药的管理和监控的专业判断来调节特定的用药方案并且应当理解本文给出的剂量范围只是举例性质的，目的不是要对所要求保护的组合物范围或实施进行限制。在一个实施方案中，治疗有效量或预防有效量的抗体或其抗原结合片段同一种或多种附加治疗剂一起进行施用。
另一方面，本发明涉及以每月低于300mg的剂量施用抗-IGF-IR抗体来治疗癌症。
本发明的另一方面提供了含有抗-IGF-IR抗体的试剂盒以及含有这些抗体的药物组合物。试剂盒除了含有抗体或组合物外，还含有诊断试剂或治疗剂。试剂盒还可含有用于诊断或治疗方法的使用说明书。在一个优选的实施方案中，所述试剂盒含有所述抗体或其药物组合物和能被用于下述方法的诊断试剂。在另一个优选的实施方案中，所述试剂盒含有所述抗体或其药物组合物和一种或多种能被用于下述方法的治疗剂，诸如附加的抗肿瘤剂、抗瘤剂或化学治疗剂。
本发明还涉及用于抑制哺乳动物体内异常细胞生长的药物组合物，该药物组合物含有一定量的本发明化合物与一定量的化学治疗剂，其中所述一定量的化合物、盐、溶剂化物或前体药物，和所述一定量的化学治疗剂在抑制异常细胞生长的过程中共同起作用。许多化学治疗剂目前在本技术领域中是已知的。在一个实施方案中，所述化学治疗剂选自有丝分裂抑制剂、烷基化剂、抗-代谢物、嵌入剂、生长因子抑制剂、细胞循环抑制剂、酶、拓扑异构酶抑制剂、抗-存活剂、生物应答改构剂、抗-激素，例如抗-雄性激素，和抗-血管生成剂。
抗-血管生成剂如MMP-2(基质-金属蛋白酶2)抑制剂、MMP-9(基质-金属蛋白酶9)抑制剂和COX-II(环加氧酶II)抑制剂可以与本发明的化合物联用。有用的COX-II抑制剂的实例包括CELEBREXTM(alecoxib)，valdecoxib和rofecoxib。有用的基质-金属蛋白酶抑制剂的实例被记载在WO 96/33172(于1996年10月24日公布)、WO96/27583(于1996年3月7日公布)、欧洲专利申请97304971.1(于1997年7月8日提交申请)、欧洲专利申请99308617.2(于1999年10月29日提交申请)、WO 98/07697(于1998年2月26日公布)、WO 98/03516(于1998年1月29日公布)、WO 98/34918(于1998年8月13日公布)、WO 98/34915(于1998年8月13日公布)、WO 98/33768(于1998年8月6日公布)、WO 98/30566(于1998年7月16日公布)、欧洲专利公开出版物606,046(于1994年7月13日公开)，欧洲专利公开出版物931,788(于1999年7月28日公布)、WO 90/05719(于1990年5月31公布)、WO 99/52910(于1999年10月21日公布)、WO 99/52889(于1999年10月21日公布)、WO 99/29667(于1999年6月17日公布)、PCT国际专利申请98/01113(于1998年7月21日提交申请)、欧洲专利申请99302232.1(于1999年3月25日提交申请)、大不列颠专利申请9912961.1(于1999年6月3日提交申请)、美国临时申请60/148,464(于1999年8月12日提交申请)、美国专利US5863949(于1999年1月26日授权)、美国专利US5861510(于1999年1月19日授权)、和欧洲专利申请780,386(于1997年6月25日公布)、所有文献被全部引入本文作为参考。优选的MMP抑制剂是那些不显示关节痛的抑制剂。更优选的是那些相对其它基质-金属蛋白酶(即MMP-1，MMP-3，MMP-4，MMP-5，MMP-6，MMP-7，MMP-8，MMP-10，MMP-11，MMP-12，和MMP-13)选择性地抑制MMP-2和/或MMP-9的抑制剂。被用于本发明的MMP抑制剂的某些特定实例是AG-3340，RO32-3555，RS13-0830和下列化合物：3-[[4-(4-氟-苯氧基)-苯磺酰基]-(1-羟基氨基甲酰基-环戊基)氨基]-丙酸；3-外-3-[4-(4-氟-苯氧基)-苯磺酰基氨基]-8-氧杂-双环[3.2.1]辛烷-3-羧酸羟酰胺；(2R，3R)1-[4-(2-氯-4-氟-苄氧基)-苯磺酰]-3-羟基-3-甲基-哌啶-2-羧酸羟酰胺；4-[4-(4-氟-苯氧基)-苯磺酰氨基]-四氢-吡喃-4-羧酸羟酰胺；3-[[4-(4-氟-苯氧基)-苯磺酰基]-(1-羟基氨基甲酰基-环丁基)-氨基]-丙酸；4-[4-(4-氯-苯氧基)-苯磺酰氨基]-四氢-吡喃-4-羧酸羟酰胺；(R)3-[4(4-氯-苯氧基)-苯磺酰氨基]-四氢-吡喃-3-羧酸羟酰胺；(2R，3R)1-[4-(4-氟-2-甲基-苄氧基)-苯磺酰基]-3-羟基-3-甲-哌啶-2-羧酸羟酰胺；3-[[4-(4-氟-苯氧基)-苯磺酰基]-(1-羟基氨基甲酰基-1-甲基-乙基)-氨基]-丙酸；3-[[4-(4-氟-苯氧基)-苯磺酰基]-(4-羟基氨基甲酰基-四氢-吡喃-4-基)-氨基]-丙酸；3-外-3-[4-(4-氯-苯氧基-苯磺酰氨基)-8-氧杂-双环[3.2.1]辛烷-3-羧酸羟酰胺；3-内-3-[4-(4-氟-苯氧基)-苯磺酰氨基]-8-氧杂-双环[3.2.1]辛烷-3-羧酸羟酰胺；和(R)3-[4-(4-氟-苯氧基)苯磺酰氨基]-四氢-呋喃-3羧酸羟酰胺；及其所述化合物的药用盐和溶剂。
本发明的化合物还可以与一下抑制剂一起使用：信号转导抑制剂，诸如能够抑制EGF-R(表皮生长因子受体)应答的药剂如EGF-R抗体、EGF抗体和EGF-R抑制剂分子；VEGF(血管内皮生长因子)抑制剂，诸如VEGF受体和能够抑制VEGF的分子；以及erbB2受体抑制剂，诸如有机分子或能够与erbB2受体结合的抗体，例如HERCEPTINTM(Genentech，Inc.)。EGF-R抑制剂被描述在例如WO95/19970(于1995年7约27日公布)、WO 98/14451(于1998年4月9日公布)、WO 98/02434(于1998年1月22日公布)和美国专利US5747498(于1998年5月5日授权)中，以及这种物质可被用于本文记载的发明中。EGFR-抑制剂包括但不限于单克隆抗体C225和抗-EGFR 22Mab(ImClone Systems Incorporated)、ABX-EGF(Abgenix/Cell Genesys)、EMD-7200(Merck KgaA)、EMD-5590(Merck KgaA)、MDX-447/H-477(Medarex Inc.和Merck KgaA)、和化合物ZD1834、ZD-1838和ZD-1839(AstraZeneca)、PKI-166(Novartis)、PKI-166/CGP75166(Novartis)、PTK 787(Novartis)、CP701(Cephalon)、leflunomide(Pharmacia/Sμgen)、CI-1033(WarnerLambert Parke Davis)、CI-1033/PD 183,805(Warner Lambert ParkeDavis)、CL-387,785(Wyeth-Ayerst)、BBR-1611(BoehringerMannheim GmbH/Roche)、Naamidine A(Bristol Myers Squibb)、RC-3940-II(Pharmacia)、BIBX-1382(Boehringer Ingelheim)、OLX-103(Merck&Co.)、VRCTC310(Ventech Research)，EGF融合毒素(Seragen Inc.)、DAB-389(Seragen/Lilgand)、ZM-252808(Imperial Cancer Research Fund)、RG-50864(INSERM)、LFM-A12(Parker Hμghes Cancer Center)、WHI-P97(Parker Hμghes CancerCenter)、GW-282974(Glaxo)、KT-8391(Kyowa Hakko)和EGF-R疫苗(York Medical/Centro de Immunologia Molecμlar(CIM))。这些以及其它EGF-抑制剂可被用于本发明中。
VEGF抑制剂，例如SU-5416和SU-6668(Sμgen Inc.)、SH-268(Sobering)，和NX-1838(NeXstar)也可与本发明的化合物联用。VEGF抑制剂被记载在例如WO 99/24440(于1999年5月20日公布)、PCT国际申请PCT/IB99/00797(于1999年5月3日提交)、WO95/21613(于1995年8月17日公布)、WO 99/61422(于1999年12月2日公布)、美国专利US5834504(于19998年11月10日授权)、WO 98/50356(于1998年11月12日公布)、美国专利US5883113(于1999年3月16日授权)、美国专利US5886020(于1999年3月23日授权)、美国专利US5792783(于1998年8月11日授权)，WO 99/10349(于1999年3月4日公布)、WO 97/32856(于1997年9月12日公布)、WO 97/22596(于1997年6月26日公布)、WO 98/54093(于1998年12月3日公布)、WO 98/02438(于1998年1月22日公布)、WO 99/16755(于1999年4月8日公布)，和WO 98/02437(于1998年1月22日公布)中，所有文献被全部引入本文作为参考。被用于本发明的某些特定VEGF的其它实例是IM862(Cytran Inc.)；Genentech，Inc.的抗-VEGF单克隆抗体；和血管酶(angiozyme)，一种源自Ribozyme和Chiron的合成核酶。这些和其它VEGF抑制剂可以被用于本文所述的本发明中。
ErbB2受体抑制剂，诸如GW-282974(Glaxo Wellcome plc)，和单克隆抗体AR-209(Aronex Pharmaceuticals Inc.)和2B-1(Chiron)，可进一步与本发明的化合物联用，例如被记载在WO 98/02434(于1998年1月22日公布)、WO 99/35146(于1999年7月15日公布)、WO99/35132(于1999年7月15日公布)、WO 98/02437(于1998年1月22日公布)、WO 97/13760(于1997面4月17日公布)、WO 95/19970(于1995年7月27日公布)、美国专利US587458(于1996年12月24日授权)和美国专利US5877305(于1999年3月2日授权)中的那些化合物，所述文献被全部引入本文作为参考。用于本发明的ErbB2受体抑制剂还被记载在1999年1月27日提交的美国临时申请60/117,341和1999年1月27日提交的美国临时申请60/117,346中，两篇文献被全部引入本文作为参考。根据本发明，所述erbB2受体抑制剂化合物和被记载在上述PCT申请、美国专利和美国临时申请中的物质以及抑制erbB2受体的其它化合物和物质可与本发明的化合物一起使用。
抗-存活剂包括抗-IGF-IR抗体和抗-整合蛋白剂，诸如抗-整合蛋白抗体。
使用的诊断方法
抗-IGF-IR抗体可以被用来检测体外或体内生物样品中的IGF-IR。所述抗-IGF-IR抗体可被用于传统的免疫测定，所述免疫测定包括但不限于ELISA、RIA、FACS、组织免疫组织化学、Western印迹或免疫沉淀。本发明的抗-IGF-IR抗体可被用来检测人体内的IGF-IR。在另一个实施方案中，所述抗-IGF-IR抗体可被用来检测旧世界(Old World)灵长目如猕猴和恒河猴，黑猩猩和无尾猿的IGF-IR。本发明提供了用于检测生物样品中的抗-IGF-IR的方法，该方法包括使生物样品与本发明的抗-IGF-IR抗体接触并检测与抗-IGF-IR结合的结合抗体来检测生物样品中的IGF-IR。在一个实施方案中，所述抗-IGF-IR抗体被检测标记物直接标记。在另一个实施方案中，所述抗-IGF-IR抗体(第一抗体)没有被标记而第二种抗体或能够结合抗-IGF-IR抗体的其它分子被标记了。本技术领域中的技术人员熟知选出能够特异结合特定品种和类型的第一抗体的第二抗体。例如，如果抗-IGF-IR抗体是人IgG，那么所述第二抗体可以是一种抗-人-IgG。能够结合抗体的其它分子包括但不限于蛋白A和蛋白G，两者可以例如从Pierce Chemical Co购买得到。
适用于抗体或第二抗体的标记物已在上文中公开，并且包括多种酶、修复基团、荧光物质、发光物质、磁性剂和放射性物质。合适酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适修复基团复合物的实例包括链霉抗生物素/生物素和抗生物素/生物素；合适荧光物质的实例包括7-羟基香豆素，荧光素，荧光素异硫氰酸盐，罗丹明，二氯三嗪基胺荧光素，丹磺酰氯或藻红蛋白；发光物质的实例包括鲁米诺；磁性剂的实例包括钆；以及合适放射性物质的实例包括125I，131I，35S或3H。
在另一个实施方案中，利用被检测物质标记的IGF-IR标准品和未被标记的IGF-IR抗体通过竞争性免疫测定可以分析生物样品中的IGF-IR。在该测定方法中，生物样品、被标记的IGF-IR标准品和抗-IGF-IR抗体被混合在一起并测定与未标记抗体结合的被标记的IGF-IR标准品的量。生物样品中的IGF-IR量与结合了抗-IGF-IR抗体的被标记的IGF-IR的量成反比。
为了达到某些目的可以利用上述的免疫测定方法。在一个实施方案中，抗-IGF-IR抗体可以被用来检测细胞培养物中的细胞中的IGF-IR。在一个优选的实施方案中，抗-IGF-IR抗体可以被用来测定经用多种化合物处理细胞后在细胞表面上的IGF-IR的酪氨酸磷酸化作用、酪氨酸自磷酸化作用的水平和/或IGF-IR的量。该方法可被用来测试可被用来活化或抑制IGF-IR的化合物。在该方法中，用测试化合物将细胞样品处理一段时间而对另一份样品不进行处理。如果要测定酪氨酸自磷酸化作用，就将细胞溶解并利用上述或实施例III中记载的免疫测定方法测定IGF-IR的酪氨酸磷酸化作用，所述免疫测定方法利用了ELISA。如果要测定IGF-IR的总水平，就将细胞溶解并利用上述的一种免疫测定方法测定IGF-IR的总水平。
用于测定IGF-IR的酪氨酸磷酸化作用或用于测定IGF-IR的总水平的优选免疫测定方法是ELISA或Western印迹。如果只是测定IGF-IR的细胞表面水平，就不需要溶解细胞，而且利用上述的一种免疫测定方法就能测定IGF-IR的细胞表面水平。用于测定IGF-IR的细胞表面水平的优选免疫测定方法包括以下步骤：用可检测标记物如生物素或125I标记细胞表面蛋白质，用抗-IGF-IR抗体免疫沉淀IGF-IR，然后检测被标记的IGF-IR。用于测定IGF-IR的定位，例如细胞表面水平的另一个优选免疫测定方法是通过利用免疫组织化学。方法如ELISA、RIA、Western印迹、免疫组织化学、膜整合蛋白的细胞表面标记和免疫沉淀在本技术领域中是已知的。参见例如Harlow和Lane，上文。另外，可以将所述免疫测定法的规模扩大到高物料通过量筛选水平(high throμghput screening)以便检测大量的用于活化或抑制IGF-IR的化合物。
本发明的抗-IGF-IR抗体还可以被用来测定组织中的或源自该组织的细胞中的IGF-IR的水平。在一个优选的实施方案中，所述组织是疾病组织。在一个更优选的实施方案中，所述组织是肿瘤组织或其活检组织。在该方法的一个优选的实施方案中组织或其活检组织是从患者身上切除下来的。然后将所述组织或其活检组织用于免疫测定从而通过上述方法测定，例如IGF-IR水平，IGF-IR的细胞表面水平，IGF-IR的酪氨酸磷酸化作用水平或IGF-IR的定位。该方法可被用来测定肿瘤是否以高水平表达IGF-IR。
上述诊断方法可被用来测定肿瘤是否表达高水平的IGF-IR，这一点可以作为肿瘤对利用抗-IGF-IR抗体进行的治疗产生良好反应的指征。如果表达高水平的IGF-IR，该诊断方法还可以被用来测定肿瘤是否可能是癌性，如果表达低水平的IGF-IR，或者是良性的。而且，所述诊断方法还可以被用来测定利用抗-IGF-IR抗体进行的治疗(参见下文)是否能引起肿瘤表达低水平的IGF-IR和/或表现低水平的酪氨酸自磷酸化作用，由此可被用来确定所述治疗是否有效。通常，测定抗-IGF-IR抗体是否降低酪氨酸磷酸化作用的方法包括以下步骤：测定目的细胞或组织中的酪氨酸磷酸化水平，与抗-IGF-IR抗体或其抗原结合片段一起培养细胞或组织，然后再次测定细胞或组织中的酪氨酸磷酸化水平。可以测定IGF-IR或另一种蛋白的酪氨酸磷酸化作用。所述诊断方法还可以被用来测定组织或细胞是否不表达足够高水平的IGF-IR或足够高水平的活化IGF-IR，这是患有矮小症、骨质疏松症或糖尿病的个体出现的情况。对IGF-IR或活性IGF-IR的水平过低的诊断可被用于采用活化抗-IGF-IR抗体、IGF-I或其它治疗剂用于提高IGF-IR水平或活性。
本发明的抗体还可以被用于对表达IGF-IR的组织和器官进行体内定位。在一个优选的实施方案中，所述抗-IGF-IR可被用于对IGF-IR-表达肿瘤进行定位。本发明的抗-IGF-IR抗体的优势在于通过施用它们不产生免疫应答。该方法包括以下步骤：对需要这种诊断试验的患者施用抗-IGF-IR抗体或其药物组合物并对患者进行图像分析来确定IGF-IR-表达组织的位置。图像分析在医学领域中是已知的，并且包括但不限于X-光分析，磁共振成象(MRI)或计算化X射线断层术(CE)。在该方法的一个实施方案中，从患者身上获得活检组织来测定目的组织是否表达IGF-IR而不需要对患者进行图像分析。在一个优选的实施方案中，抗-IGF-IR抗体可以用能在患者体内显像的检测剂来标记。例如，所述抗体可以用造影剂如可被用于X-光分析的钡，或磁性造影剂如可被用于MRI或CE的钆螯合物来标记。其它标记物包括但不限于放射性同位素如99Tc。在另一个实施方案中，抗-IGF-IR抗体不被标记而且通过施加可检测的和能结合抗-IGF-IR抗体的第二抗体或其它分子来进行图像分析。
治疗方法的应用
在另一个实施方案中，本发明提供了通过向需要抗-IGF-IR抗体的患者施用抗-IGF-IR抗体的来抑制IGF-IR活性的方法。本文记载的任何类型的抗体都可进行治疗性的使用。在一个优选的实施方案中，抗-IGF-IR抗体是人的、嵌合的或人源化的抗体。在另一个优选的实施方案中，IGF-IR是人的而患者也是人患者。或者所述患者可以是表达抗-IGF-IR抗体与之发生交叉反应的IGF-IR的哺乳动物。为了兽用目的或作为人类疾病的动物模型，所述抗体可以被施用于表达抗体与之发生交叉反应的IGF-IR的非人类哺乳动物(即灵长类或猕猴或恒河猴)。这种动物模型可被用于评价本发明抗体的治疗效力。
本文所使用的术语“其中IGF-IR活性是有害的病症”旨在包括这样的疾病，其中患病体内存在高水平的IGF-IR已被证明是或者可能导致所述病症的生理病理学原因或导致所述病症恶化的因素。因此，其中高水平的IGF-IR活性是有害的病症是一种其中抑制IGF-IR活性就有望减轻该疾病症状和/或发展的病症。这种病症可以例如通过细胞表面的IGF-IR水平的增加或患有所述病症的受试者的受影响的细胞或组织内的酪氨酸磷酸化作用的增强来得到证实。例如通过利用上述的抗-IGF-IR抗体可以检测到IGF-IR水平的增加。
在一个优选的实施方案中，可以将抗-IGF-IR抗体施加给具有IGF-IR-表达肿瘤的患者。肿瘤可以是实体瘤或者是可以是非实体瘤，诸如淋巴瘤。在一个更优选的实施方案中，抗-IGF-IR抗体可以被施用于其具有的IGF-IR-表达肿瘤是癌性的患者。在一个甚至更优选的实施方案中，抗-IGF-IR抗体可以被施用于具有肺肿瘤、乳腺肿瘤、前列腺肿瘤或结肠肿瘤的患者。在一个高度优选的实施方案中，该方法使得肿瘤不再增加重量或体积或者减小了重量和体积。在另一个实施方案中，该方法使得肿瘤上的IGF-IR内在化。在一个优选的实施方案中，所述抗体选自2.12.1，2.13.2，2.14.3，3.1.1，4.9.2或6.1.1，或者含有其重链、轻链或抗原结合片段。
在另一个优选的实施方案中，可以将抗-IGF-IR抗体施用于不恰当地表达高水平的IGF-I的患者。在本技术领域中，已知IGF-I的高水平表达能够导致多种常规癌症。在一个更优选的实施方案中，将抗-IGF-IR抗体施用于前列腺癌、神经胶质瘤或纤维肉瘤患者。在一个甚至更优选的实施方案中，该方法使得癌症停止异常增殖，或者重量或体积不再增大或者减小了重量或体积。
在一个实施方案中，所述方法涉及癌症如脑癌、鳞状细胞癌、膀胱癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌、头部癌症、颈部癌症、食管癌、前列腺癌、结肠直肠癌、肺癌、肾癌、卵巢癌妇科癌症或甲状腺癌的治疗。能按照本发明的方法采用本发明的化合物进行治疗的患者包括例如被诊断为肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头部和颈部癌症、皮肤或眼内的黑素瘤、子宫癌、卵巢癌的患者、直肠癌、肛门区域的癌症、胃癌、结肠癌、乳腺癌、妇科肿瘤(例如子宫肉瘤、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌或外阴癌)、霍金森氏病、食管癌、小肠癌、内分泌系统的癌症(例如甲状腺癌、旁甲状腺癌或肾上腺癌)、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、慢性或急性白血病，儿童实体瘤、淋巴细胞淋巴癌、膀胱癌、肾癌或输尿管癌(例如肾细胞癌、肾盂癌)、或中枢神经系统瘤(例如初级CNS淋巴瘤、脊柱枢椎(Spinal axis)肿瘤、脑干神经胶质瘤或脑垂体腺瘤)的患者。
所述抗体可以一次给药，但更优选地是进行多次给药。所述抗体的给药可以从一日三次至每六个月一次。所述给药可以按照诸如每日三次、每日两次、每日一次、每两日一次、每三日一次、每周一次、每两周一次、每月一次、每两个月一次、每三个月一次和每六个月一次的方案进行。所述抗体可以通过口、粘膜、口腔、鼻内、吸入、静脉内、皮下、肌内、非肠道、瘤内或局部给药途径进行给药。所述抗体可以在远离肿瘤位点的位置上给药。所述抗体还可以通过一个微型泵进行连续给药。所述抗体可以进行一次、至少两次或至少一段时间的给药，直到病症被治疗、减轻或治愈。如果抗体能使肿瘤或癌停止生长或减小肿瘤或癌重量或体积，只要一出现肿瘤，通常就可以施用所述抗体。所述抗体通常是作为上文所述药物组合物的一部分来进行给药。所述抗体的剂量范围通常为0.1-100mg/kg，更优选地0.5-50mg/kg，更优选地1-20mg/kg，和甚至更优选地1-10mg/kg。抗体的血清浓度可以通过本技术领域中的已知方法来测定。参见例如下面的实施例XVII。为了避免癌症或肿瘤的发生，也可以进行预防性给药所述抗体。这特别适用于IGF-I水平偏高的患者，这是因为这些患者已被证明是患普通癌症的高危人群。参见Rosen等，上文。
另一方面，所述抗-IGF-IR抗体可以与其它治疗剂如抗肿瘤药物或分子共同施用于患有过度增殖性病症如癌症或肿瘤的患者。一方面，本发明涉及用于治疗哺乳动物的过度增殖性病症的方法，该方法包括对所述哺乳动物施用治疗有效量的本发明的化合物与选自但不限于有丝分裂抑制剂、烷基化剂、抗-代谢物、嵌入剂、生长因子抑制剂、细胞循环抑制剂、酶、拓扑异构酶抑制剂、生物应答改构剂、抗-激素、激酶抑制剂、基质金属蛋白酶抑制剂、遗传治疗剂和抗雄性激素的抗肿瘤剂。在一个更优选的实施方案中，所述抗体可以与抗肿瘤剂如阿霉素或紫杉醇一起施用。在另一个优选的实施方案中，所述抗体或联合治疗法可以与放射疗法、化学疗法、光动力学疗法、手术或其它免疫疗法一起实施。在另一个优选的实施方案中，所述抗体可以与另一种抗体一起施用。例如，所述抗-IGF-IR抗体可以与已知抑制肿瘤或癌细胞增殖的抗体或其它药物，例如抑制erbB2受体、EGF-R、CD20或VEGF的抗体或药物一起施用。
所述抗体与附加的治疗剂的共同施用(联合疗法)包括施用含有抗-IGF-IR抗体和附加治疗剂的药物组合物，并且施用两种或多种独立的药物组合物，一种含有抗-IGF-IR抗体而其它含有附加的治疗剂。而且，尽管共同施用或联合疗法通常意味着所述抗体和附加治疗剂彼此被同时施用，但也包括所述抗体和附加治疗剂不同时施用的情况。例如所述抗体可以每三天进行一次给药，而所述附加治疗剂可以每日给药一次。或者所述抗体可以在用所述附加治疗剂治疗所述病症之前或之后进行给药。类似地，所述抗体可以在其它疗法如放射疗法、化学疗法、光动力学疗法、手术或其它免疫疗法之前或之后进行给药。
所述抗体和一种或多种附加治疗剂(联合疗法)可以进行一次、两次或至少一段时间的给药，直到病症被治疗、减轻或治愈。优选地是所述联合疗法进行多次给药。所述联合疗法的给药可以从一日三次至每六个月一次。所述给药可以按照诸如每日三次、每日两次、每日一次、每两日一次、每三日一次、每周一次、每两周一次、每月一次、每两个月一次、每三个月一次和每六个月一次的方案进行，或者可以通过一个微型泵进行连续给药。所述联合疗法可以通过口、粘膜、口腔、鼻内、吸入、静脉内、皮下、肌内、非肠道、瘤内或局部给药途径进行给药。所述联合疗法可以在远离肿瘤位点的位置上给药。如果抗体能使肿瘤或癌停止生长或减小肿瘤或癌重量或体积，只要一出现肿瘤，通常就可以进行所述的联合疗法。
在另一个实施方案中，所述抗-IGF-IR抗体被放射性标记物、免疫毒素或毒素所标记，或者是一种含有毒性肽的融合蛋白质。抗-IGF-IR抗体或抗-IGF-IR抗体融合蛋白质将放射性标记物、免疫毒素、毒素或毒性肽定位到IGF-IR-表达肿瘤或癌细胞。在一个优选的实施方案中，当抗-IGF-IR抗体结合了肿瘤或癌细胞表面上的IGF-IR后，所述放射性标记物、免疫毒素、毒素或毒性肽就被内在化了。
另一方面，所述抗-IGF-IR抗体可被治疗性用来诱导需要治疗的患者体内的特定细胞发生编程性细胞死亡。在许多情况下，靶向编程性细胞死亡的细胞是癌细胞或肿瘤细胞。因此，在一个优选地实施方案中，本发明提供了通过对需要治疗的患者施用治疗有效量的抗-IGF-IR抗体来诱导编程性细胞死亡的方法。在一个优选地实施方案中，所述抗体选自2.12.1，2.13.2，2.14.3，3.1.1，4.9.2或6.1.1，或者含有其重链、轻链或抗原结合片段。
另一方面，抗-IGF-IR抗体可以被用来治疗其中高水平的IGF-I和/或IGF-IR与非癌性病症或疾病相关的非癌性病症。在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：对具有非癌性病理学症状的患者施用抗-IGF-IR抗体，其中所述非癌性病理学症状是由高水平的IGF-I和/或IGF-IR水平或活性引起或加重的。在一个优选的实施方案中，所述非癌性病理学症状是肢端肥大症、巨人症、牛皮癣、动脉粥样硬化、诸如作为糖尿病并发症而发现的，有其是眼部的血管平滑肌再狭窄或微血管的不适当增殖。在一个更优选的实施方案中，所述抗-IGF-IR抗体减缓了非癌性病理学症状的发展。在一个更优选的实施方案中，所述抗-IGF-IR抗体至少部分终止或逆转了非癌性病理学症状。
另一方面本发明提供了给需要治疗的患者施用激活抗-IGF-IR抗体的方法。在一个实施方案中，所述激活抗体或药物组合物以有效量施用于需要治疗的患者从而增强了IGF-IR活性。在一个更优选的实施方案中，所述激活抗体能够恢复正常的IGF-IR活性。在另一个优选的实施方案中，所述激活抗体可以被施用于身材矮小、神经病、肌肉量下降或骨质疏松症的患者。在另一个优选的实施方案中，所述激活抗体可以与一种或多种其它因子一起施用以便增强细胞的增殖，避免编程性细胞死亡或增强IGF-IR活性。这类因子包括生长因子如IGF-I和/或能够激活IGF-IR的IGF-I类似物。在另一个优选的实施方案中，所述抗体选自4.17.3，或者含有其重链、轻链或抗原结合片段。
基因疗法
本发明的核酸分子可以被施用于需要通过基因疗法治疗的患者。该疗法在体内或离体进行。在优选的实施方案中，施用既编码重链又编码轻链的核酸分子。在更优选的实施方案中，施用所述核酸分子以使它们被稳定地整合到B细胞的染色体中，这是由于这些细胞被专门用于生产抗体。在一个优选的实施方案中，前体B细胞被离体转染或感染后再被移植到需要治疗的患者体内。在另一个实施方案中，利用已知感染所需细胞类型的病毒对前体B细胞或其它细胞进行体内感染。用于基因疗法的典型载体包括脂质体、质粒或病毒载体，如反转录病毒、腺病毒或腺伴随病毒。体内或离体感染后，可以通过从被治疗患者的身上取样并利用本技术领域中已知的和本文中所述的免疫测定法来监控抗体的表达水平。
在一个优选的实施方案中，所述基因疗法包括以下步骤：施用有效量的分离的核酸分子并对该核酸分子进行表达，所述核酸分子编码人抗体或其片段的重链或其抗原结合片段。在另一个实施方案中，所述基因疗法包括以下步骤：施用有效量的分离的核酸分子并对该核酸分子进行表达，所述核酸分子编码人抗体或其片段的轻链或其抗原结合片段。在一个更优选的实施方案中，所述基因疗法包括以下步骤：施用有效量的分离的编码人抗体或其片段的重链或其抗原结合片段的核酸分子和有效量的分离编码人抗体或其片段的轻链或其抗原结合片段的核酸分子并对所述核酸分子进行表达。所述基因疗法还可以包括施用另一种抗癌药物，诸如紫杉醇、他莫昔芬、5-FU、阿霉素或CP-358,774。
为了本发明能被更好的理解，列出了以下实施例。这些实施例只是说明性质的而无论如何不能被理解为是对本发明范围的限制。
实施例1：产生抗-IGF-IR抗体的杂交瘤的产生
按照以下方法制备、选择和测定本发明的抗体：
免疫接种和杂交瘤的产生
采用人的IGF-IR的胞外区域(10μg/剂量/小鼠)、或者采用3T3-IGF-IR或300.19-IGF-IR细胞(10×106细胞/剂量/小鼠)对八至十周龄的XENOMICETM进行腹膜内或后爪垫内进行免疫，其中所述的两种细胞是两种被转染的并在其质膜上表达人的IGF-IR的细胞系。在三至八周内将这种剂量重复五至七次。在融合前四天，采用溶于PBS中的人IGF-IR的胞外区域对所述小鼠进行最后一次注射。将得自免疫小鼠的脾脏和淋巴结的淋巴细胞与非-分泌型骨髓瘤P3-X63-Ag8.653细胞融合并按照以前记载的方法进行HAT选择(Galfre和Milstein，Methods Enzymol.73：3-46，1981)。回收了一组都能分泌IGF-IR特异性的人IgG2κ抗体的杂交瘤。选择出七个产生特异于IGF-IR的单克隆抗体的杂交瘤用于进一步的研究并将其命名为2.12.1，2.13.2，2.14.3，3.1.1，4.9.2，4.17.3和6.1.1。
杂交瘤2.12.1，2.13.2，2.14.3，3.1.1，4.9.2和4.17.3于2000年12月12日被保藏在在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，10801 UniversityBoμlevard，Manassas，VA 20110-2209，具有下列保藏号：
杂交瘤            保藏号
2.12.1            PTA-2792
2.13.2            PTA-2788
2.14.3            PTA-2790
3.1.1             PTA-2791
4.9.2             PTA-2789
4.17.3            PTA-2793
实施例II：通过BIAcore测定人的完整抗-IGF-IRD单克隆抗体的亲合常数(Kd)
利用BIAcore 3000仪器并按照厂商提供的使用说明书通过表面胞质团共振对经纯化的抗体进行亲合力的测定
方案1
为了进行动力学分析，将蛋白质-A固定在BIAcore的传感芯片表面上。然后用所述传感芯片捕获本发明的抗-IGF-IR抗体。将不同浓度的IGF-IR的胞外区域注入到所述的传感芯片上，并分析抗-IGF-IR抗体与IGF-IR的胞外区域之间相互作用的结合和解离动力学。利用由BIAcore提供的BIA评估软件中的基线漂移模型、以通用适合朗缪尔(globalfit Langmuir)1:1评估所述数据。
方案2
基本上按照Fagerstam等，″Detection of antigen-antibodyinteractions by surface plasmon resonance.Applications to epitopemapping.″J.Mol.Recog.3：208-214.(1990)中的记载内容进行BIAcore测定。
表I列出了对本发明的典型抗-IGF-IR抗体的亲合力测定值：
表I
  单克隆抗体   Kd(M)方案1   Kd(M)方案2
  2.12.1   7.37×10-9
  2.13.2   3.5×10-9   1.53×10-9
  2.14.3   6.41×10-10
  3.1.1   1.15×10-9
  4.9.2   6.84×10-10   4.27×10-10
  4.17.3   1.3×10-8
  6.1.1   5.65×10-10
动力学分析表明按照本发明制备的抗体对IGF-IR的胞外区域具有很高的亲合力和很强的结合常数。
实施例III：抗体-介导的对IGF-I-诱导的IGF-IR磷酸化作用的抑制
为了确定本发明的抗体是否能够阻断IGF-I-介导的IGF-IR活化反应，我们进行了ELISA实验。IGF-I-介导的IGF-IR活化反应通过增强的受体-相关酪氨酸磷酸化作用来检测。
制备ELISA平板
我们通过向蛋白G-包被的ReactiBind 96-孔板(Pierce)的每个孔中加入100μl的封闭缓冲液(含有3％牛血清白蛋白[BSA]的Tris-缓冲盐溶液[TBS])来制备ELISA捕获平板，并在室温下将所述平板振荡温育30分钟。用封闭缓冲液将兔全-特异性SC-713抗-IGF-IR抗体(SantaCruz)稀释到5μg/ml的浓度，并向每个孔中加入100μl的被稀释抗体。在室温下将所述平板振荡温育60-90分钟。然后用洗涤缓冲液(TBS+0.1％Tween 20)将平板冲洗5次并用纸巾将剩余缓冲液轻轻吸干。在加入溶胞产物之前不能使这些平板完全干燥。
由IGF-IR-表达细胞制备溶胞产物
将IGF-IR-转染的NIH-3T3细胞(5×104/ml)置于在96-孔U形底平板中的100μl的培养基(DMEM高葡萄糖含量培养基，其中添加了L-谷氨酰胺(0.29mg/ml)，10％的热失活FBS和500μg/ml的遗传霉素，青霉素和链霉素中的每一种)当中。在37℃、5％的CO2下将所述平板培养过夜从而使细胞附着。将培养基从所述平板中轻轻倒掉并向每孔中重新加入100μl的新鲜培养基。为了进行测定，用培养基将潜在的抗-IGF-IR抗体稀释到所需最终浓度的五倍并向每孔加入25μl。所有样品都按照一式三份进行实验。然后在37℃下将平板温育1小时。用25μl/孔的600ng/ml IGF-1(用培养基制备)刺激细胞并在室温下将平板温育10分钟。通过翻转平板轻轻倒掉培养基并轻轻印迹到纸巾上，并通过加入50μl的溶胞缓冲液(50mM HEPES，pH7.4，10mM EDTA，150mM NaCl，1.5mM MgCl2，1.6mM NaVO4，1％Triton X-100，1％的甘油和每50μl一个不含EDTA的蛋白酶抑制剂的片剂[RocheMolecμlar Sciences]，是在使用前才加入)和在室温下振荡5分钟来裂解附着的细胞。向每孔中加入200μl稀释缓冲液(50mM HEPES，pH7.4，1.6mM NaVO4)并通过吸上吸下来进行混合。将每孔中的100μl溶胞产物转移到按照上述方法制备的ELISA捕获平板的每个孔中，并在室温下轻轻振荡温育2小时。
用抗-酪氨酸-磷酸酯(pTYR)抗体进行ELISA
通过翻转平板除去细胞溶胞产物，用洗涤缓冲液将所述平板冲洗5次并印迹到纸巾上。每孔加入100μl用封闭缓冲液稀释到0.2μg/ml的pTYR-特异性抗体(HRP-PY54)，并在室温下将平板振荡温育30分钟。然后用洗涤缓冲液将所述平板冲洗5次并印迹到纸巾上。
通过每孔加入100μl TMB过氧化物酶底物溶液(Kirkegaard &Perry)并振荡温育到产生颜色(大约1-10分钟)来检测HRP-PY54抗体的结合。通过每孔加入100μl TMB终止溶液(Kirkegaard & Perry)来终止产色反应。然后在室温下将平板振荡10秒钟从而将溶液混合并通过在OD450nm测定来进行定量分析。
表II和图4表示用本发明的几种抗体进行实验的结果。该实验的结果表明本发明抗体阻断IGF-IR-介导的IGF-IR活化反应的能力，该能力由受体-相关性酪氨酸磷酸化作用的增强来表示。而且，这些结果能被用来对本发明抗体的相对效力进行定量。
表II
  单克隆抗体   IC50(μg/ml)
  2.12.1   0.172
  2.13.2   0.0812
  2.14.3   0.325
  4.9.2   0.0324
实施例IV：由抗体-介导阻断IGF-I/IGF-IR的结合
在基于细胞的测定中进行ELISA实验来定量分析本发明抗体抑制IGF-I与IGF-I结合的能力。将IGF-IR-转染的NIH-3T3细胞(5×104/ml)置于在96-孔U形底平板中的100μl的DMEM高葡萄糖含量培养基当中，该培养基中添加了L-谷氨酰胺(0.29mg/ml)、10％的热失活FBS和500μg/ml的遗传霉素、青霉素和链霉素中的每一种。然后在37℃、5％的CO2下将所述平板温育过夜从而使细胞附着。将培养基从所述平板中轻轻倒掉并向每孔中重新加入100μl的新鲜培养基。为了进行测定，用测定培养基(DMEM高葡萄糖含量培养基，该培养基中添加了L-谷氨酰胺(0.29mg/ml)、10％的热失活BSA和200μg/ml的遗传霉素、青霉素和链霉素中的每一种)将抗体稀释到所需最终浓度并向每孔加入50μl。所有样品都按照一式三份进行实验。然后在37℃下将平板温育10分钟。用测定培养基将[125I]-IGF-I稀释到1μCi/ml并向平板的每个孔中加入50μl。作为背景放射性的对照，加入冷却的IGF-I直至终浓度达到100ng/ml。在37℃下将所述平板温育10分钟，通过轻轻印迹到纸巾上而将培养基倾去，并用测定培养基冲洗两次。通过加入50μl 0.1N NaOH，0.1％SDS并在室温下将平板振荡5分钟来裂解细胞。然后将样品转移到闪烁平板上，加入150μl OptiPhaseSupermix并读取Wallac Micro-Beta技术器上的信号。
表III和图3表示用本发明的三个典型抗体进行实验的结果。该实验表明本发明的抗体特异性抑制[125I]-IGF-I与过表达IGF-IR的细胞的结合。
表III
  单克隆抗体   IC50
  2.12.1   0.45μg/ml
  2.13.2   0.18μg/ml
  4.9.2   0.1μg/ml
实施例V：表位图谱的研究
已表明本发明的抗体能够识别IGF-IR后，我们对本发明的几种抗体进行了表位图谱的研究。我们尤其将实验的重点放在2.12.1，2.13.2，2.14.3和4.9.2抗体上。
我们进行BIAcore竞争实验来确定本发明的抗体是否与IGF-IR分子上的相同或不同位点结合。使IGF-IR的胞外区域(ECD)与上述实施例II中记载的BIAcore传感芯片结合。在饱和条件下将本发明的第一种抗体结合到传感芯片-结合的IGF-IR上。然后测定本发明后来的第二种抗体与第一种抗体竞争结合IGF-IR的能力。该技术能使我们将本发明的抗体分成不同的结合类型。
我们对抗体2.12.1，2.13.2，2.14.3和4.9.2进行了这种实验。结果发现2.13.2和4.9.2竞争IGF-IR胞外区域上的相同位点。其它抗体2.12.1和2.14.3结合IGF-IR胞外区域上的彼此不相同而且不同于2.13.2和4.9.2所结合的位点。
实施例VI：本发明抗体的种交叉反应性
为了确定本发明抗体的种交叉反应性，我们进行了几种实验，包括免疫沉淀、抗体-介导的阻断由IGF-I诱导的受体磷酸化反应和FACS分析。
为了进行免疫沉淀实验，我们将细胞置于T25摇瓶中的DMEM高葡萄糖含量培养基中直至达到50％的汇合度，所述DMEM高葡萄糖含量培养基中添加了L-谷氨酰胺(0.29mg/ml)、10％热-失活的FBS，和500μg/ml的遗传霉素、青霉素和链霉素中的每一种。然后加入将100μl 1μg/ml浓度的Hank缓冲盐溶液(HBSS；Gibco BRL)中的本发明的抗体。在37℃下于培养箱中将所述平板温育30分钟，然后在室温下用100ng/ml的IGF-I将细胞刺激10分钟。在RIPA缓冲液(Harlow和Lane，见上文)中裂解所述细胞，并在4℃下用加有蛋白A琼脂糖珠粒的2μg的全-特异性SC-713抗-IGF-IR抗体(Santa Cruz)免疫沉淀IGF-IR。将所述珠粒沉淀下来并用PBS/T(PBS+0.1％Tween-20)冲洗三次，然后在40μl含有5％βME的Laemmli缓冲液中将珠粒煮沸。
按照上述方法制备的样品通过Western印迹进行分析。将12μl的每种样品上样到4-10％梯度的NovexTM凝胶上的电泳道中并在IXMES缓冲液(NovexTM)中运行。在150V下运行1小时或在200V下运行约30分钟。然后通过利用10％的甲醇在100mA下过夜或在250mM下保持1-1.5小时来将所述胶转移到NovexTM转移缓冲液中的膜上。接着使所述膜彻底干燥并在室温下用含有Superblock(PierceChemical Co.)的TBS(Tris-缓冲盐溶液pH8.0)进行封闭。加入IGF-IR印迹抗体SC713(Santa Cruz)来检测被免疫沉淀的IGF-IR。
用本发明的抗体、尤其是2.12.1，2.13.2，4.17.3和4.9.2，在源自多种哺乳动物的细胞上进行这种实验。结果发现抗体2.12.1，2.13.2和4.9.2能够结合结合人，但不能结合犬、豚鼠、兔IGF-IR。而且，这些抗体能够结合全部得自旧世界猴的COS7和恒河猴IGF-IR，但不结合得自狨的IGF-IR，所述狨属于新世界猴。这些实验表明所述抗体是高度特异性的。
在非人灵长类动物体内由抗体介导的对IGF-I/IGF-IR结合的阻断反应
在观察了本发明的抗体识别源自旧世界猴的IGF-IR后，我们还测试了它们在源自这些旧世界猴体内阻断IGFI/IGF-IR结合的能力。将细胞置于T25摇瓶中的DMEM高葡萄糖含量的培养基中达到50％的汇合度，该培养基中添加了L-谷氨酰胺、10％热-失活的FBS和500μg/ml遗传霉素、青霉素和链霉素中的每一种。然后加入本发明的抗体，或者以不含抗体的培养基作对照，并且在室温下用100ng/ml的IGF-I将所述细胞刺激10分钟。刺激后，如上所述将细胞裂解并用全-特异性IGF-IR抗体SC713免疫沉淀IGF-IR。然后利用HRP-PY54抗体如上所述进行Western印迹分析以便检测被激活的IGF-IR中的磷酸化了的酪氨酸。
我们观察到本发明的抗体，尤其是2.13.2和4.9.2能够阻断COS7和恒河猴细胞中的IGF-I-诱导的IGF-IR的磷酸化。针对COS7和恒河猴IGF-IR所观察到的抑制作用的IC50分别是0.02μg/ml和0.005μg/ml。
确定本发明的抗体的交叉种间亲合力
进行FACS分析来确定本发明抗体对源自其它动物、尤其是上述旧世界猴的IGF-IR的亲合力。以浓度不断增高的生物素化的本发明抗-IGF-IR抗体或者作为阴性对照的生物素化的抗-匙孔血蓝蛋白(KLH)抗体(Abgenix)将人和猴细胞(5×105)的等分样品冰浴1小时。然后将所述样品与链霉抗生物素-缀合的RPE(藻红蛋白)一起冰浴30分钟。通过流式细胞术测定结合力，并利用CellQuest软件分析荧光强度(F12-H)相对细胞数目(计数)的直方图。从平均荧光强度相对抗体浓度的图上计算每种抗体的结合力(Kd)。在大多数实验中，测定在培养的人MCF-7细胞和恒河猴或猕猴组织培养细胞中的结合力。在一定细胞浓度范围内通过测定结合力来控制抗体的消耗。
进行上述的FACS分析来测试本发明的抗体、尤其是2.13.2和4.9.2结合人、恒河猴和猕猴细胞的能力。我们发现所有被测试细胞系的半最大结合力(Kd)的是0.1μg/ml。
实施例VII：IGF-I受体的减量调节
基本上按照上述实施例IV进行阻断实验直到加入[125I]-标记的IGF-I。这时在含50％ME的40μl Laemmli缓冲液中将细胞煮沸。然后按照上述实施例VI所述通过Western印迹对样品进行分析并利用全-特异性IGF-IR抗体SC713定量分析IGF-IR的水平和利用HRP-PY54监控被激活的IGF-IR中的被磷酸化的酪氨酸的水平来检测所述印迹。
如上述所观察到的(实施例III)，我们观察到在采用本发明的抗体处理后由IGF-I诱导的IGF-IR的磷酸化被阻断了(图4)。而且，我们发现由IGF-I诱导的磷酸化作用被阻断后，这些细胞内的IGF-IR发生减量调节。参见例如图4。在有本发明抗体存在的条件下用IGF-I刺激后16小时，IGF-IR水平被最大程度地降低。
实施例VIII：本发明抗体对IGF-IR的体内作用
我们确定本发明的抗体对上述实施例中记载的IGF-IR的作用是否会在体内发生。按照已公开的方法(V.A.Pollack等，″Inhibition ofepidermal growth factor receptor-associated tyrosine phosphorylationin human carcinomas with CP-358,774：Dynamics of receptorinhibition in situ and antitumor effects in athymic mice，″J.Pharmacol.Exp.Ther.291：739-748(1999))在无胸腺小鼠体内诱导肿瘤。
简而言之，将IGF-IR-转染的NIH-3T3细胞(5×106)与0.2ml的Matrigel制剂皮下注射到3-4周龄的无胸腺(nu/nu)小鼠体内。然后在肿瘤(即约400mm3)形成后，用本发明的抗体对小鼠进行腹膜内注射。
24小时后，取出肿瘤，将其均质并测定IGF-IR的水平。为测定IGF-IR的水平，用封闭缓冲液将SC-713抗体稀释μg/ml的最终浓度并将100μl加到Reacti-Bind山羊抗-兔(GAR)包被的平板(Pierce)的每个孔中。在室温下将所述平板振荡温育1小时，然后用洗涤缓冲液冲洗5次。然后称重按照上述方法制备的肿瘤样品并在裂解缓冲液(1ml/100mg)中将样品均质。用裂解缓冲液将12.5μl的肿瘤提取物稀释到100μl的最终体积并将其加到96-孔板的每个孔中。在室温下将所述平板振荡温育1-2小时，然后用洗涤缓冲液冲洗5次。然后向每个孔中加入100μl封闭缓冲液中的HRP-PY54或生物素化的抗-IGF-IR抗体，并在室温下振荡温育30分钟。然后用洗涤缓冲液冲洗5次并使平板显色。通过每孔加入100μl的TMB微孔底物使得用HRP-PY54检测的平板显色，然后通过加入100μl的0.9M H2SO4来终止显色反应。然后通过振荡10秒钟并测定OD450nm定量分析信号。将所述信号标准化成总蛋白。通过向每孔中加入100μl的用封闭缓冲液稀释的链霉抗生物素，在室温下振荡温育30分钟，然后按照针对HRP-PY54的方法继续进行从而使经抗-IGF-IR抗体检测的平板显色。
如测得的IGF-IR磷酸酪氨酸(磷酸化的IGF-IR)和总IGF-IR蛋白质发生了减少，我们发现腹膜内注射本发明的抗体，尤其是2.13.2和4.9.2，结果导致IGF-IR活性的抑制(图6)。另外我们还发现IGF-IR磷酸酪氨酸(磷酸化的IGF-IR)也减少了(图5)。不希望受到任何理论的约束，IGF-IR磷酸酪氨酸水平的降低可能是由于采用抗体处理后体内IGF-IR蛋白质水平的降低或者可能是由于IGF-IR蛋白质水平和对IGF-IR的酪氨酸磷酸化作用同时降低，其存在是由于阻断了配体(例如IGF-I或IGF-II)的活化作用。而且，该抑制作用与注射抗体的剂量相对应(图6)。这些数据表明本发明的抗体能够以类似于我们在体外进行观察的方式靶向体内的IGF-IR。
实施例IX：3T3/IGF-IR细胞肿瘤的生长抑制(TGI)
我们测试了本发明的抗-IGF-IR抗体是否能够起到抑制生长的作用。按照上述方法(实施例VIII)诱导肿瘤，一旦形成了确定的、可触知的肿瘤(即250mm3，在6-9天内)，就用0.20ml单次剂量的抗体通过腹膜内注射来处理小鼠。每隔三天用游标卡尺测量肿瘤的两个直径来确定肿瘤的尺寸，并按照由Geran等建立的方法，″Protocols forscreening chemical agents and natural products against animaltumors and other biological systems，″Cancer Chemother.Rep.3：1-104、利用公式(长度×[宽度]2)/2来计算肿瘤的体积。
当用本发明的抗体进行这种分析时，发现仅用抗体2.13.2进行的单次处理抑制IGF-IR-转染的NIH-3T3细胞-诱导的肿瘤的生长(图7，左侧)。而且，在以7.5mg/kg的单剂量静脉内输注阿霉素的组合研究中，我们观察到施用单剂量的2.13.2增强了阿霉素(已知的肿瘤生长抑制剂)的效力。阿霉素与本发明的抗体2.13.2的结合使用证明能够使生长相对于仅单独使用抗体或阿霉素时的生长推迟了7天(图7，右侧)。
实施例X：抗体水平与IGF-IR减量调节的关系
按照实施例VIII中的记载在裸鼠体内诱导肿瘤。然后按照实施例VIII中的记载通过腹膜内注射125μg的2.13.2来对所述小鼠进行处理。按照实施例VIII中的记载取出肿瘤并通过ELISA测定IGF-IR的水平。附图8表示血清2.13.2抗体水平和IGF-IR受体水平随时间的变化。该实验表明IGF-IR受到该抗体的减量调节而且IGF-IR抑制作用的程度与抗体的血清浓度成剂量比例。
实施例XI：通过多次联用抗体与阿霉素抑制3T3/IGF-IR肿瘤的生长
按照实施例IX的记载在裸鼠体内诱导肿瘤。在第1、8、15和22天按照实施例IX的记载，以单剂或组合的方式采用不同用量的2.13.2抗体(i.p.)或7.5mg/kg阿霉素(i.v.)处理体内形成了约250mm3的皮下肿瘤的小鼠。图9表示肿瘤大小与不同处理方法随时间变化的关系。该实验表明用抗-IGF-IR抗体每7天一次的处理方法抑制了肿瘤细胞的生长，并且通过与已知是肿瘤抑制剂的阿霉素结合使用增强了对肿瘤细胞生长的抑制作用。
实施例XII：大肿瘤生长的抑制
按照实施例IX的记载在裸鼠体内诱导肿瘤。在第1和第8天按照实施例IX的记载，以单剂或组合的方式采用不同用量的2.13.2抗体(i.p.)或7.5mg/kg阿霉素(i.v.)处理体内形成了略小于2000mm3的皮下大肿瘤的小鼠。图10表示肿瘤大小与不同处理方法随时间变化的关系。在第5天终止只施用了抗体和只施用了阿霉素的动物对照组的实验，这时的肿瘤大小超过了2000mm3。该实验表明和阿霉素结合、多次施用抗-IGF-IR抗体进行处理对抗大肿瘤具有很强的效力。
实施例XIII：结肠直肠细胞肿瘤的生长抑制
除了使用的是Colo 205细胞(ATCC CCL 222)外，按照实施例IX的记载在裸鼠体内诱导肿瘤。Colo 205细胞是人的结肠直肠腺癌细胞。按照实施例IX的记载，以单剂或组合的方式采用不同用量的2.13.2抗体(i.p.)或100mg/kg的5-氟脱氧尿核苷(i.v.)处理体内形成了约250mm3的皮下肿瘤的小鼠。图11表示肿瘤大小与不同处理方法随时间变化的关系。该实验表明以单剂方式用抗-IGF-IR抗体处理一次抑制了人结肠直肠癌细胞的生长，并且增强了已知是肿瘤抑制剂的5-FU的效力。
在第1、8、15和22天，采用500μg2.13.2(i.p.)，100mg/kg 5-FU(i.v.)或两者的结合处理形成了Colo 205肿瘤的小鼠。图12表示肿瘤大小与不同处理方法随时间变化的关系。该实验表明用抗-IGF-IR抗体每7天一次的处理方法抑制了人结肠直肠癌细胞的生长并且增强了5-FU的效力。
实施例XIV：乳腺癌细胞肿瘤的生长抑制
按照实施例VIII的记载给裸鼠植入可生物降解的雌激素丸粒(0.72mg 17-β雌二醇/丸粒，释放60天；Innovative Research ofAmerica)。48小时后，除了用的是MCF-7细胞(ATCC HTB-22)，基本上按照实施例IX的记载在裸鼠体内诱导肿瘤。MCF-7细胞是人的雌激素-依赖性乳腺癌细胞。基本上按照实施例IX的记载，以单剂或组合的方式在第1，4，7，10，13，16，19和22天(q3dx7)用50μg2.13.2抗体(i.p.)，或者在第1，2，3，4，5天(q1dx5)用6.25mg/kg紫杉醇处理体内形成了约250mm3的皮下肿瘤的小鼠。图13表示肿瘤大小与不同处理方法随时间变化的关系。该实验表明单独用抗-IGF-IR抗体每3天施用一次的处理方法抑制了人乳腺癌细胞的生长，并且当与已知是乳癌抑制剂的紫杉醇联用时增强了紫杉醇的效力。
在第1天用不同用量的2.13.2抗体(i.p.)单独或与3.75mg/kg的阿霉素(i.v.)，基本上按照实施例IX的记载对具有按照上述方法由MCF-7细胞形成的肿瘤的小鼠进行处理。图14表示肿瘤大小与不同处理方法随时间变化的关系。该实验表明单独用抗-IGF-IR进行处理抑制了人乳腺癌细胞的生长，并且增强了已知是肿瘤抑制剂的阿霉素的效力。
在第1，8，15和23天，按照实施例IX的记载，以单剂或组合的方式采用250μg2.13.2抗体(i.p.)或可生物降解的他莫昔芬丸粒(25mg/丸粒，游离碱，释放60天，Innovative Research of America)处理上述的具有由MCF-7细胞形成的肿瘤的小鼠。形成肿瘤后的第1天植入他莫昔芬丸粒。图15表示肿瘤大小与不同处理方法随时间变化的关系。该实验表明单独用抗-IGF-IR每7天施用一次的处理方法抑制了人乳腺癌细胞的生长，并且增强了已知是肿瘤抑制剂的他莫昔芬的效力。
实施例XVI：表皮样癌细胞肿瘤的生长抑制
除了使用的是A431细胞(ATCC CRL 1555)，基本按照实施例IX的机载在裸鼠体内诱导肿瘤。A431细胞是过表达EGFR的人表皮样癌细胞。按照实施例IX的记载，在第1，8，15，22和29天，以单剂或组合的方式采用500μg2.13.2抗体(i.p.)处理体内形成了约250mm3的皮下肿瘤的小鼠，或者通过每日口服一次10mg/kg CP-358，774(p.o.)共持续27天来进行处理。CP-358,774被记载在美国专利US5747498和Moyer等，Cancer Research 57：4838-4848(1997)中，引入本文作为参考。图16表示肿瘤大小与不同处理方法随时间变化的关系。该实验表明用抗-IGF-I进行处理增强了已知是EGF-R酪氨酸激酶抑制剂用于抑制人表皮样癌肿瘤生长的CP-358,774的效力。
实施例XVII：体内抗-IGF-IR抗体的药动学
为了评价抗-IGF-IR抗体的药动学，给猕猴静脉内注射3，30或100mg/kg的溶于醋酸盐缓冲液中的2.13.2抗体。在不同的时间点从所述猴体内收集血清并测定猴体内的抗-IGF-IR抗体浓度，一直持续10周。为了定量分析功能性血清抗体的水平，将人的IGF-IR胞外区域(IGF-I-sR，R&D Systems，Catalog#391GR)连接到96-孔板上。将猴血清(稀释为1∶100至1∶15,000)加到所述的测定板中以便使每种样品落入标准曲线的线性范围内，并在抗-IGF-IR抗体能够与IGF-I-sR结合的条件下温育所述的平板。冲洗平板后，将标记的抗-人IgG抗体加到所述平板中，并在抗人IgG抗体能够与抗-IGF-IR抗体结合的条件下进行温育。然后冲洗所述的平板并进行显色，并利用对照标准曲线和线性回归拟合定量分析抗-IGF-IR抗体的量。图17表示血清中2.13.2的浓度随时间的变化。该实验表明抗-IGF-IR抗体的半衰期是4.6至7.7天，并且其体积分布为74-105mL/kg。而且，该实验证明猴中的量是与剂量成比例的，从而表明抗-IGF-IR抗体甚至在3mg/kg最低的剂量饱和了体内任何可能的IGF-IR结合位点。
实施例XVIII：抗-IGF-IR抗体和阿霉素的联合治疗减量调节了体内的IGF-IR
按照实施例IX的记载在裸鼠体内诱导肿瘤。按照实施例IX的记载，以单剂或组合的方式单次注射250μg的2.13.2抗体(i.p.)或7.5mg/kg阿霉素(i.v.)处理体内形成了约400mm3的皮下肿瘤的小鼠。施用所述药剂后72小时，按照实施例VIII的记载取出肿瘤，并对等量的肿瘤提取物进行十二烷基磷酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS PAGE)和利用抗-IGF-IR抗体SC-713(Santa Cruz)进行Western印迹分析。图18表示对照动物体内(每块凝胶板的头三条泳道)、仅用抗体处理的动物(上图)、仅用阿霉素处理过的动物体内(中图)和用抗体和阿霉素处理过的动物体内(下图)的肿瘤细胞中的IGF-IR含量。每条泳道代表等量的源自小鼠个体的个体肿瘤的蛋白。该实验证明仅用阿霉素处理对IGF-IR水平几乎没有影响，而仅用抗体处理显示IGF-IR水平一定程度的降低。令人惊奇地是，同时使用阿霉素和抗体进行处理能够大幅度地降低IGF-IR的水平，表明阿霉素和抗体明显地减量调节了IGF-IR的水平。
本说明书中列举的所有出版物和专利出版物被引入本文作为参考，就好象每种单独的出版物或专利出版物被特定地和单独地指引入本文作为参考。尽管通过说明的方式和用于透彻理解目的的实施例在某种程度上描述了上述发明，但是在本发明教导下，就本发明进行某种改变和改进对于本技术领域的技术人员来说是显而易见而不会偏离所附权利要求的实质或保护范围。
                                  序列表
<110>ABGENIX，INC.
     PFIZER，INC.
<120>针对胰岛素样生长因子I受体的抗体
<130>ABX-PF2
<140>
<141>
<150>60/259,927
<151>2001-01-05
<160>60
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>291
<212>DNA
<213>人
<400>1
tgcatctgta ggagacagag tcaccttcac ttgccgggca agtcaggaca ttagacgtga 60
tttaggctgg tatcagcaga aaccagggaa agctcctaag cgcctgatct atgctgcatc 120
ccgtttacaa agtggggtcc catcaaggtt cagcggcagt ggatctggga cagaattcac 180
tctcacaatc agcagcctgc agcctgaaga ttttgcaact tattactgtc tacagcataa 240
taattatcct cggacgttcg gccaagggac cgaggtggaa atcatacgaa c          291
<210>2
<211>136
<212>PRT
<213>人
<400>2
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Phe Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp
  1               5                  10                  15
Ile Arg Arg Asp Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
             20                  25                  30
Lys Arg Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser
         35                  40                  45
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser
     50                  55                  60
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn
 65                  70                  75                  80
Asn Tyr Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Glu Val Glu Ile Ile Arg
                 85                  90                  95
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
            100                 105                 110
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
        115                 120                 125
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp
    130                 135
<210>3
<211>352
<212>DNA
<213>人
<400>3
gggaggcttg gtcaagcctg gaggtccctg agactctcct gtgcagcctc tggattcact    60
ttcagtgact actatatgag ctggatccgc caggctccag ggaaggggct ggaatgggtt    120
tcatacatta gtagtagtgg tagtaccaga gactacgcag actctgtgaa gggccgattc    180
accatctcca gggacaacgc caagaactca ctgtatctgc aaatgaacag cctgagagcc    240
gaggacacgg ccgtgtatta ctgtgtgaga gatggagtgg aaactacttt ttactactac    300
tactacggta tggacgtctg gggccaaggg accacggtca ccgtctcctc ag            352
<210>4
<211>174
<212>PRT
<213>人
<400>4
Gly Arg Leu Gly Gln Ala Trp Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala
  1               5                  10                  15
Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala
             20                  25                  30
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser
         35                  40                  45
Thr Arg Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg
     50                  55                  60
Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala
 65                  70                  75                  80
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg Asp Gly Val Glu Thr Thr
                 85                  90                  95
Phe Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr
            100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
        115                 120                 125
Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys
    130                 135                 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145                 150                 155                 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ser Cys Ala
                165                 170
<210>5
<211>322
<212>DNA
<213>人
<400>5
gacatccaga tgacccagtt tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc    60
atcacttgcc gggcaagtca gggcattaga aatgatttag gctggtatca gcagaaacca    120
gggaaagccc ctaagcgcct gatctatgct gcatcccgtt tgcacagagg ggtcccatca    180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca caatcagcag cctgcagcct    240
gaagattttg caacttatta ctgtttacaa cataatagtt acccgtgcag ttttggccag    300
gggaccaagc tggagatcaa ac                                             322
<210>6
<211>107
<212>PRT
<213>人
<400>6
Asp Ile Gln Met Thr Gln Phe Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
  1               5                  10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp
             20                  25                  30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile
         35                  40                  45
Tyr Ala Ala Ser Arg Leu His Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
     50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
 65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Ser Tyr Pro Cys
                 85                  90                  95
Ser Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105
<210>7
<211>375
<212>DNA
<213>人
<400>7
aggtgcagct gttggagtct gggggaggct tggtacagcc tggggggtcc ctgagactct    60
cctgtacagc ctctggattc acctttagca gctatgccat gaactgggtc cgccaggctc    120
cagggaaggg gctggagtgg gtctcagcta ttagtggtag tggtggtacc acattctacg    180
cagactccgt gaagggccgg ttcaccatct ccagagacaa ttccaggacc acgctgtatc    240
tgcaaatgaa cagcctgaga gccgaggaca cggccgtata ttactgtgcg aaagatcttg    300
gctggtccga ctcttactac tactactacg gtatggacgt ctggggccaa gggaccacgg    360
tcaccgtctc ctcag                                                     375
<210>8
<211>124
<212>PRT
<213>人
<400>8
Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser
  1               5                  10                  15
Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala
             20                  25                  30
Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
         35                  40                  45
Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Thr Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val Lys
     50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Arg Thr Thr Leu Tyr Leu
 65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                 85                  90                  95
Lys Asp Leu Gly Trp Ser Asp Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp
            100                 105                 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>9
<211>302
<212>DNA
<213>人
<400>9
tcctccctgt ctgcatctgt aggagacaga gtcaccttca cttgccgggc aagtcaggac    60
attagacgtg atttaggctg gtatcagcag aaaccaggga aagctcctaa gcgcctgatc    120
tatgctgcat cccgtttaca aagtggggtc ccatcaaggt tcagcggcag tggatctggg    180
acagaattca ctctcacaat cagcagcctg cagcctgaag attttgcaac ttattactgt    240
ctacagcata ataattatcc tcggacgttc ggccaaggga ccgaggtgga aatcatacga    300
ac                                                                   302
<210>10
<211>100
<212>PRT
<213>人
<400>10
Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Phe Thr Cys Arg
  1               5                  10                  15
Ala Ser Gln Asp Ile Arg Arg Asp Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
             20                  25                  30
Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Arg Leu Gln Ser
         35                  40                  45
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr
     50                  55                  60
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
 65                  70                  75                  80
Leu Gln His Asn Asn Tyr Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Glu Val
                 85                  90                  95
Glu Ile Ile Arg
            100
<210>11
<211>338
<212>DNA
<213>人
<400>11
gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc acctgcactg tctctggtgg    60
ctccatcagt aattactact ggagctggat ccggcagccc gccgggaagg gactggagtg    120
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cgcggacacg gccgtgtatt actgtgcggt aacgattttt ggagtggtta ttatctttga    300
ctactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctcag                            338
<210>12
<211>112
<212>PRT
<213>人
<400>12
Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr
  1               5                  10                  15
Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Asn Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln
             20                  25                  30
Pro Ala Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Arg Ile Tyr Thr Ser Gly
         35                  40                  45
Ser Pro Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Met Ser Val
     50                  55                  60
Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Ala
 65                  70                  75                  80
Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Val Thr Ile Phe Gly Val Val
                 85                  90                  95
Ile Ile Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
            100                 105                 110
<210>13
<211>322
<212>DNA
<213>人
<400>13
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc    60
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aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca caatcagccg cctgcagcct    240
gaagattttg caacttatta ctgtctacag cataatagtt accctctcac tttcggcgga    300
gggaccaagg tggagatcaa ac                                             322
<210>14
<211>107
<212>PRT
<213>人
<400>14
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
  1               5                  10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Ser Asp
             20                  25                  30
Leu Gly Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile
         35                  40                  45
Tyr Ala Ala Ser Lys Leu His Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
     50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Gln Pro
 65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Ser Tyr Pro Leu
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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105
<210>15
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<212>DNA
<213>人
<400>15
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc    60
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gtcaccgtct cctcag                                                    376
<210>16
<211>125
<212>PRT
<213>人
<400>16
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
  1               5                  10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
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Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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 65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                 85                  90                  95
Ala Lys Asp Leu Gly Tyr Gly Asp Phe Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met
            100                 105                 110
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
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<210>17
<211>279
<212>DNA
<213>人
<400>17
caggagacag agtcaccatc acttgccggg caagtcagag cattagtacc tttttaaatt    60
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cactcacttt cggcggaggg accaaggtgg agatcaaac                           279
<210>18
<211>92
<212>PRT
<213>人
<400>18
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Thr
  1                   5                  10                  15
Phe Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
                 20                  25                  30
Ile His Val Ala Ser Ser Leu Gln Gly Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
             35                  40                  45
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
         50                  55                  60
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Asn Ala Pro
 65                  70                  75                  80
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
                 85                  90
<210>19
<211>341
<212>DNA
<213>人
<400>19
cccaggactg gtgaagcctt cggagaccct gtccctcacc tgcactgtct ctggtggctc    60
catcagtagt tactactgga gttggatccg gcagccccca gggaagggac tggagtggat    120
tgggtatatc tattacagtg ggagcaccaa ctacaacccc tccctcaaga gtcgagtcac    180
catatcagta gacacgtcca agaaccagtt ctccctgaag ctgagttctg tgaccgctgc    240
ggacacggcc gtgtattact gtgccaggac gtatagcagt tcgttctact actacggtat    300
ggacgtctgg ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctca g                        341
<210>20
<211>113
<212>PRT
<213>人
<400>20
Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val
  1               5                  10                  15
Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro
             20                  25                  30
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser
         35                  40                  45
Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp
     50                  55                  60
Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala
 65                  70                  75                  80
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr Tyr Ser Ser Ser Phe Tyr
                 85                  90                  95
Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
            100                 105                 110
Ser
<210>21
<211>274
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>修饰碱基
<222>(240)
<223>a，c，t，g，其它或未知的
<400>21
agagccaccc tctcctgtag ggccagtcag agtgttcgcg gcaggtactt agcctggtac    60
cagcagaaac ctggccaggc tcccaggctc ctcatctatg gtgcatccag cagggccact    120
ggcatcccag acaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcactct caccatcagc    180
agactggagc ctgaagattt tgcagtgttt tactgtcagc agtatggtag ttcacctcgn    240
acgttcggcc aagggaccaa ggtggaaatc aaac                                274
<210>22
<211>91
<212>PRT
<213>人
<400>22
Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Arg Gly Arg Tyr
  1               5                  10                  15
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
             20                  25                  30
Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly
         35                  40                  45
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro
     50                  55                  60
Glu Asp Phe Ala Val Phe Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Arg
 65                  70                  75                  80
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
                 85                  90
<210>23
<211>367
<212>DNA
<213>人
<400>23
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc    60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct    120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcaggt attactggga gtggtggtag tacatactac    180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat    240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagatcca    300
gggactacgg tgattatgag ttggttcgac ccctggggcc agggaaccct ggtcaccgtc    360
tcctcag                                                              367
<210>24
<211>122
<212>PRT
<213>人
<400>24
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
  1               5                  10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
             20                  25                  30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
         35                  40                  45
Ser Gly Ile Thr Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
     50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
 65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                 85                  90                  95
Ala Lys Asp Pro Gly Thr Thr Val Ile Met Ser Trp Phe Asp Pro Trp
            100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>25
<211>320
<212>DNA
<213>人
<400>25
gaactgtggc tgcaccatct gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag ttgaaatctg    60
gaactgcctc tgttgtgtgc ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc aaagtacagt    120
ggaaggtgga taacgccctc caatcgggta actcccagga gagtgtcaca gagcaggaca    180
gcaaggacag cacctacagc ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca gactacgaga    240
aacacaaagt ctacgcctgc gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc gtcacaaaga    300
gcttcaacag gggagagtgt                                                320
<210>26
<211>106
<212>PRT
<213>人
<400>26
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
  1               5                  10                  15
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
             20                  25                  30
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
         35                  40                  45
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
     50                  55                  60
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
 65                  70                  75                  80
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
                 85                  90                  95
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
            100                 105
<210>27
<211>978
<212>DNA
<213>人
<400>27
gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcgccct gctccaggag cacctccgag    60
agcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg    120
tggaactcag gcgctctgac cagcggcgtg cacaccttcc cagctgtcct acagtcctca    180
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcaacttcgg cacccagacc    240
tacacctgca acgtagatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagac agttgagcgc    300
aaatgttgtg tcgagtgccc accgtgccca gcaccacctg tggcaggacc gtcagtcttc    360
ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacgtgc    420
gtggtggtgg acgtgagcca cgaagacccc gaggtccagt tcaactggta cgtggacggc    480
gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagcca cgggaggagc agttcaacag cacgttccgt    540
gtggtcagcg tcctcaccgt tgtgcaccag gactggctga acggcaagga gtacaagtgc    600
aaggtctcca acaaaggcct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa aaccaaaggg    660
cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggaggagat gaccaagaac    720
caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctacccca gcgacatcgc cgtggagtgg    780
gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacac ctcccatgct ggactccgac    840
ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac    900
gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc    960
tccctgtctc cgggtaaa                                                  978
<210>28
<211>326
<212>PRT
<213>人
<400>28
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
  1               5                  10                  15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
             20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
         35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
     50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
 65                  70                  75                  80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
                 85                  90                  95
Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
            100                 105                 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
        115                 120                 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
    130                 135                 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145                 150                 155                 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
                165                 170                 175
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp
            180                 185                 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
        195                 200                 205
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu
    210                 215                 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
225                 230                 235                 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
                245                 250                 255
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
            260                 265                 270
Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
        275                 280                 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
    290                 295                 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305                 310                 315                 320
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
                325
<210>29
<211>296
<212>DNA
<213>人
<400>29
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtcaagc ctggagggtc cctgagactc  60
tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt gactactaca tgagctggat ccgccaggct  120
ccagggaagg ggctggagtg ggtttcatac attagtagta gtggtagtac catatactac  180
gcagactctg tgaagggccg attcaccatc tccagggaca acgccaagaa ctcactgtat  240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gagaga      296
<210>30
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>30
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
  1               5                  10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
             20                  25                  30
Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
         35                  40                  45
Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
     50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
 65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                 85                  90                  95
Ala Arg
<210>31
<211>296
<212>DNA
<213>人
<400>31
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc  60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct  120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac  180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat  240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaaga      296
<210>32
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>32
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
  1               5                  10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
             20                  25                  30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
         35                  40                  45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
     50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
 65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                 85                  90                  95
Ala Lys
<210>33
<211>296
<212>DNA
<213>人
<400>33
caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggggac cctgtccctc  60
acctgcgctg tctctggtgg ctccatcagc agtagtaact ggtggagttg ggtccgccag  120
cccccaggga aggggctgga gtggattggg gaaatctatc atagtgggag caccaactac  180
aacccgtccc tcaagagtcg agtcaccata tcagtagaca agtccaagaa ccagttctcc  240
ctgaagctga gctctgtgac cgccgcggac acggccgtgt attactgtgc gagaga      296
<210>34
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>34
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gly
  1               5                  10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser
             20                  25                  30
Asn Trp Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
         35                  40                  45
Ile Gly Glu Ile Tyr His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
     50                  55                  60
Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Gln Phe Ser
 65                  70                  75                  80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                 85                  90                  95
Ala Arg
<210>35
<211>293
<212>DNA
<213>人
<400>35
caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc  60
acctgcactg tctctggtgg ctccatcagt agttactact ggagctggat ccggcagccc  120
ccagggaagg gactggagtg gattgggtat atctattaca gtgggagcac caactacaac  180
ccctccctca agagtcgagt caccatatca gtagacacgt ccaagaacca gttctccctg  240
aagctgagct ctgtgaccgc tgcggacacg gccgtgtatt actgtgcgag aga         293
<210>36
<211>97
<212>PRT
<213>人
<400>36
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
  1               5                  10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr
             20                  25                  30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
         35                  40                  45
Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
     50                  55                  60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
 65                  70                  75                  80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                 85                  90                  95
Arg
<210>37
<211>290
<212>DNA
<213>人
<400>37
gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc  60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa  120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca  180
gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag  240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcacctcc             290
<210>38
<211>96
<212>PRT
<213>人
<400>38
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
  1               5                  10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
             20                  25                  30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
         35                  40                  45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
     50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
 65                  70                  75                  80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
                 85                  90                  95
<210>39
<211>288
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>修饰碱基
<222>(288)
<223>a，c，t，g，其它或未知的
<400>39
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc  60
atcacttgcc gggcaagtca gggcattaga aatgatttag gctggtatca gcagaaacca  120
gggaaagccc ctaagcgcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca  180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca caatcagcag cctgcagcct  240
gaagattttg caacttatta ctgtctacag cataatagtt accctccn               288
<210>40
<211>96
<212>PRT
<213>人
<400>40
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
  1               5                  10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp
             20                  25                  30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile
         35                  40                  45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
     50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
 65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Ser Tyr Pro Pro
                 85                  90                  95
<210>41
<211>288
<212>DNA
<213>人
<400>41
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc  60
atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca  120
gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca  180
aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct  240
gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacagta cccctcch               288
<210>42
<211>96
<212>PRT
<213>人
<400>42
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
  1               5                  10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
             20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
         35                  40                  45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
     50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
 65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro
                 85                  90                  95
<210>43
<211>293
<212>DNA
<213>人
<400>43
caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc  60
acctgcactg tctctggtgg ctccatcagt agttactact ggagctggat ccggcagccc  120
gccgggaagg gactggagtg gattgggcgt atctatacca gtgggagcac caactacaac  180
ccctccctca agagtcgagt caccatgtca gtagacacgt ccaagaacca gttctccctg  240
aagctgagct ctgtgaccgc cgcggacacg gccgtgtatt actgtgcgag aga         293
<210>44
<211>97
<212>PRT
<213>人
<400>44
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
  1               5                  10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr
             20                  25                  30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Ala Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
         35                  40                  45
Gly Arg Ile Tyr Thr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
     50                  55                  60
Ser Arg Val Thr Met Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
 65                  70                  75                  80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                 85                  90                  95
Arg
<210>45
<211>470
<212>PRT
<213>人
<400>45
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly
  1               5                  10                  15
Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
             20                  25                  30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe
         35                  40                  45
Ser Ser Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
     50                  55                  60
Glu Trp Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Thr Thr Phe Tyr Ala
 65                  70                  75                  80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Arg Thr
                 85                  90                  95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
            100                 105                 110
Tyr Tyr Cys Ala Lys Asp Leu Gly Trp Ser Asp Ser Tyr Tyr Tyr Tyr
        115                 120                 125
Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
    130                 135                 140
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
145                 150                 155                 160
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
                165                 170                 175
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
            180                 185                 190
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
        195                 200                 205
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
    210                 215                 220
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
225                 230                 235                 240
Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
                245                 250                 255
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
            260                 265                 270
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
        275                 280                 285
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
    290                 295                 300
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
305                 310                 315                 320
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp
                325                 330                 335
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
            340                 345                 350
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu
        355                 360                 365
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
    370                 375                 380
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
385                 390                 395                 400
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
                405                 410                 415
Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
            420                 425                 430
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
        435                 440                 445
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
    450                 455                 460
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465                 470
<210>46
<211>470
<212>PRT
<213>人
<400>46
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly
  1               5                  10                  15
Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
             20                  25                  30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
         35                  40                  45
Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
     50                  55                  60
Glu Trp Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala
 65                  70                  75                  80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn
                 85                  90                  95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
            100                 105                 110
Tyr Tyr Cys Ala Lys Gly Tyr Ser Ser Gly Trp Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr
        115                 120                 125
Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
    130                 135                 140
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
145                 150                 155                 160
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
                165                 170                 175
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
             180                 185                 190
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
        195                 200                 205
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
    210                 215                 220
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
225                 230                 235                 240
Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
                245                 250                 255
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
            260                 265                 270
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
        275                 280                 285
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
    290                 295                 300
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
305                 310                 315                 320
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp
                325                 330                 335
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
            340                 345                 350
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu
        355                 360                 365
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
    370                 375                 380
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
385                 390                 395                 400
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
                405                 410                 415
Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
            420                 425                 430
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
        435                 440                 445
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
    450                 455                 460
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465                 470
<210>47
<211>236
<212>PRT
<213>人
<400>47
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
  1               5                  10                  15
Phe Pro Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Phe Pro Ser Ser
             20                  25                  30
Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser
         35                  40                  45
Gln Gly Ile Arg Asn Asp Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
     50                  55                  60
Ala Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Arg Leu His Arg Gly Val
 65                  70                  75                  80
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr
                 85                  90                  95
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln
            100                 105                 110
His Asn Ser Tyr Pro Cys Ser Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
        115                 120                 125
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
    130                 135                 140
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
145                 150                 155                 160
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
                165                 170                 175
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
            180                 185                 190
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
        195                 200                 205
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
    210                 215                 220
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225                 230                 235
<210>48
<211>236
<212>PRT
<213>人
<400>48
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
 1               5                  10                  15
Phe Pro Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser
             20                  25                  30
Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser
         35                  40                  45
Gln Gly Ile Arg Asn Asp Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
     50                  55                  60
Ala Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val
 65                  70                  75                  80
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr
                 85                  90                  95
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln
            100                 105                 110
His Asn Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
        115                 120                 125
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
    130                 135                 140
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
145                 150                 155                 160
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
                165                 170                 175
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
            180                 185                 190
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
        195                 200                 205
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
    210                 215                 220
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225                 230                 235
<210>49
<211>470
<212>PRT
<213>人
<400>49
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Ile Lys Gly
  1               5                  10                  15
Val Gln Cys Gln Ala Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys
             20                  25                  30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
         35                  40                  45
Ser Asp Tyr Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
     50                  55                  60
Glu Trp Val Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Arg Asp Tyr Ala
 65                  70                  75                  80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
                 85                  90                  95
Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
            100                 105                 110
Tyr Tyr Cys Val Arg Asp Gly Val Glu Thr Thr Phe Tyr Tyr Tyr Tyr
        115                 120                 125
Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
    130                 135                 140
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
145                 150                 155                 160
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
                165                 170                 175
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
            180                 185                 190
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
        195                 200                 205
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
    210                 215                 220
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
225                 230                 235                 240
Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
                245                 250                 255
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
            260                 265                 270
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
        275                 280                 285
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
    290                 295                 300
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
305                 310                 315                 320
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp
                325                 330                 335
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
            340                 345                 350
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu
        355                 360                 365
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
    370                 375                 380
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
385                 390                 395                 400
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
                405                 410                 415
Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
            420                 425                 430
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
        435                 440                 445
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
    450                 455                 460
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465                 470
<210>50
<211>473
<212>PRT
<213>人
<400>50
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Ile Lys Gly
  1               5                  10                  15
Val Gln Cys Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys
             20                  25                  30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
         35                  40                  45
Ser Asp Tyr Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
     50                  55                  60
Glu Trp Val Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala
 65                  70                  75                  80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
                 85                  90                  95
Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
            100                 105                 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Leu Arg Phe Leu Glu Trp Leu Leu Tyr Tyr
        115                 120                 125
Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
    130                 135                 140
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
145                 150                 155                 160
Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
                165                 170                 175
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
            180                 185                 190
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
        195                 200                 205
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly
    210                 215                 220
Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
225                 230                 235                 240
Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys
                245                 250                 255
Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
            260                 265                 270
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
        275                 280                 285
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr
    290                 295                 300
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
305                 310                 315                 320
Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His
                325                 330                 335
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
            340                 345                 350
Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln
        355                 360                 365
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
    370                 375                 380
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
385                 390                 395                 400
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
                405                 410                 415
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
            420                 425                 430
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
        435                 440                 445
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
    450                 455                 460
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465                 470
<210>51
<211>236
<212>PRT
<213>人
<400>51
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
  1               5                  10                  15
Phe Pro Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser
             20                  25                  30
Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Phe Thr Cys Arg Ala Ser
         35                  40                  45
Gln Asp Ile Arg Arg Asp Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
     50                  55                  60
Ala Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Arg Leu Gln Ser Gly Val
 65                  70                  75                  80
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr
                 85                  90                  95
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln
            100                 105                 110
His Asn Asn Tyr Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Glu Val Glu Ile
        115                 120                 125
Ile Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
    130                 135                 140
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
145                 150                 155                 160
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
                165                 170                 175
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
            180                 185                 190
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
        195                 200                 205
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
    210                 215                 220
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225                 230                 235
<210>52
<211>236
<212>PRT
<213>人
<400>52
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
  1               5                  10                  15
Phe Pro Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser
             20                  25                  30
Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser
         35                  40                  45
Gln Gly Ile Arg Asn Asp Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
     50                  55                  60
Ala Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val
 65                  70                  75                  80
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr
                 85                  90                  95
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln
            100                 105                 110
His Asn Ser Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
        115                 120                 125
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
    130                 135                 140
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
145                 150                 155                 160
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
                165                 170                 175
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
            180                 185                 190
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
        195                 200                 205
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
    210                 215                 220
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225                 230                 235
<210>53
<211>326
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：共有序列
<220>
<221>修饰碱基
<222>(289)
<223>a，c，t，g，其它或未知的
<400>53
gacatccaga tgacccagty tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc  60
wtcacttgcc gggcaagtca ggrcattaga mrtgatttag gctggtwtca gcagaaacca  120
gggaaagcyc ctaagcgcct gatctatgct gcatccmrwt trcammgwgg ggtcccatca  180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca caatcagcmg cctgcagcct  240
gaagattttg caacttatta ctgtytacar cataatartt aycckybsns kttyggcsrr  300
gggaccrags tggaratcaw acgaac                                       326
<210>54
<211>322
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：共有序列
<400>54
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgyaggaga cagagtcacc  60
atcacttgcc gggcaagtca gagcattagy asctwtttaa attggtatca gcagaaacca  120
gggaaagccc ctaarctcct gatcyatgyt gcatccagtt trcaargtgg ggtcccatca  180
aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct  240
gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacartr ccccayychc tttcggcgga  300
gggaccaagg tggagatcaa ac                                           322
<210>55
<211>325
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：共有序列
<220>
<221>修饰碱基
<222>(291)
<223>a，c，t，g，其它或未知的
<400>55
gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc  60
ctctcctgya gggccagtca gagtgttmgc rgcagstact tagcctggta ccagcagaaa  120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca  180
gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag  240
cctgaagatt ttgcagtgtw ttactgtcag cagtatggta gytcacctcs nacgttcggc  300
caagggacca aggtggaaat caaac                                        325
<210>56
<211>376
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：共有序列
<400>56
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtcaagc ctggagggtc cctgagactc  60
tcctgtgcag cctctggatt cacyttcagt gactactaya tgagctggat ccgccaggct  120
ccagggaagg ggctggartg ggtttcatac attagtagta gtggtagtac cakakactac  180
gcagactctg tgaagggccc attcaccatc tccagggaca acgccaagaa ctcactgtat  240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgy gagagatgga  300
gtggaaacta ctttttacta ctactactac ggtatggacg tctggggcca agggaccacg  360
gtcaccgtct cctcag                                                  376
<210>57
<211>358
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：共有序列
<220>
<221>修饰碱基
<222>(337)
<223>a，c，t，g，其它或未知的
<400>57
caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc  60
acctgcactg tctctggtgg ctccatcagt arttactact ggagctggat ccggcagccc  120
gccgggaagg gactggagtg gattgggcgt atctatacca gtgggagcmc caactacaac  180
ccctccctca agagtcgagt caccatgtca gtagacacgt ccaagaacca gttctccctg  240
aagctgarct ctgtgaccgc cgcggacacg gccgtgtatt actgtgcggt aacgattttt  300
ggagtggtta ttatctttga ctactggggc cagrganccc tggtcaccgt ctcctcag    358
<210>58
<211>418
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：共有序列
<400>58
caggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc  60
tcctgtrcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgarctgggt ccgccaggct  120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagst attastggka gtggtggtab yacatwctac  180
gcagactccg tgaagggccc gttcaccatc tccagagaca attccargam cacgctgtat  240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagatctk  300
ggctrsksyg actyttacta ctactactac ggtatggacg tctggggcca agggacyacg  360
gtgattatga gttggttcga cccctggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctcag    418
<210>59
<211>364
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：共有序列
<400>59
caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc  60
acctgcactg tctctggtgg ctccatcagt agttactact ggagytggat ccggcagccc  120
ccagggaagg gactggagtg gattgggtat atctattaca gtgggagcac caactacaac  180
ccctccctca agagtcgact caccatatca gtagacacgt ccaagaacca gttctccctg  240
aagctgagyt ctgtgaccgc tgcggacacg gccgtgtatt actgtgccag gacgtatagc  300
agttcgttct actactacgg tatggacgtc tggggccaag ggaccacggt caccgtctcc  360
tcag                                                               364
<210>60
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：Gly-Ser接头
<400>60
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
  1               5                  10                  15

Claims (33)

1.一种特异性结合胰岛素样生长因子I受体(IGF-IR)的人源化的、嵌合的或人的单克隆抗体或其抗原-结合部分。
2.如权利要求1所述的抗体或其抗原-结合部分，其中所述IGF-IR是人的。
3.如权利要求1或2中任一项所述的抗体或其抗原-结合部分，其中所述抗体或其部分至少具有一种选自以下的特性：
a)不结合小鼠、大鼠、狗或兔的IGF-IR；
b)结合猕猴或恒河猴的IGF-IR但不结合狨的IGF-IR；
c)抑制IGF-I或IGF-II与IGF-IR的结合；
d)对IGF-IR的选择性比对胰岛素受体的选择性至少大50倍；
e)抑制体内肿瘤的生长；
f)当与表达IGF-IR的细胞一起温育时，引起IGF-IR细胞表面消失；
g)抑制IGF-IR-诱导的酪氨酸磷酸化作用；
h)以8×10-9M或更低的Kd与IGF-IR结合；和
i)对IGF-IR具有10-4或更小的Koff的解离速率。
4.如权利要求3所述的抗体或其抗原-结合部分，其中所述抗体或其部分具有所述的全部特性。
5.如权利要求1或2任一项所述的抗体或其抗原-结合部分，其中所述抗体或其部分具有至少一种选自以下的特性：
a)与选自2.12.1，2.13.2，2.14.3，3.1.1，4.9.2和4.17.3的抗体交叉竞争结合IGF-IR；
b)结合与选自2.12.1，2.13.2，2.14.3，3.1.1，4.9.2和4.17.3的抗体相同的IGF-IR的表位；
c)结合与选自2.12.1，2.13.2，2.14.3，3.1.1，4.9.2和4.17.3的抗体所结合的抗原相同的抗原；
d)以与选自2.12.1，2.13.2，2.14.3，3.1.1，4.9.2和4.17.3的抗体基本相同的Kd结合IGF-IR；
e)以与选自2.12.1，2.13.2，2.14.3，3.1.1，4.9.2和4.17.3的抗体基本相同的解离速率结合IGF-IR。
6.如权利要求5所述的抗体或其抗原-结合部分，其中所述抗体或其部分具有所述的全部特性。
7.如权利要求1-6中的任意一项权利要求所述的抗体或其抗原-结合部分，其中所述抗体或其部分以小于100nM的IC50抑制IGF-IR和IGF-I或IGF-II之间的结合。
8.如权利要求1-7中的任意一项权利要求所述的抗体或其抗原-结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分含有κ轻链的可变区，其中所述κ轻链的所述可变区的序列含有不多于10个由被种系VκA30，A27或O12基因所编码的氨基酸序列的氨基酸变化。
9.如权利要求8所述的抗体或其抗原-结合部分，其中所述κ轻链的可变区含有选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：22所示的氨基酸序列的氨基酸序列，或在这些序列中具有1-10个氨基酸插入、缺失或置换的氨基酸序列。
10.如权利要求1-7中的任意一项权利要求所述的抗体或其抗原-结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分含有重链可变区，其中所述可变区的序列含有不多于8个由被种系VH DP37，DP-35，DP-71或VIV-4基因所编码的氨基酸序列的氨基酸变化。
11.如权利要求10所述的抗体或其抗原-结合部分，其中所述重链可变区含有选自SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：24所示的氨基酸序列的氨基酸序列，或在这些序列中具有1-10个氨基酸插入、缺失或替换的氨基酸序列。
12.如权利要求1-11中的任意一项权利要求所述的抗体或其抗原-结合部分，其为
a)免疫球蛋白G(IgG)，IgM，IgE，IgA或IgD分子，或由其衍生得到；或
b)Fab片段，F(ab′)2片段，Fv片段，单链抗体，人源化抗体，嵌合抗体或双特异性抗体。
13.如权利要求1-12中的任意一项权利要求所述的抗体或其抗原-结合部分，其中所述抗体或其部分含有源自可变区的至少一种CDR区的氨基酸序列，其中所述可变区选自：
a)选自2.12.1，2.13.2，2.14.3，3.1.1，4.9.2和4.17.3的抗体的轻链可变区；
b)含有选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：22的氨基酸序列，或在这些序列中具有1-10个氨基酸插入、缺失或替换的氨基酸序列的轻链可变区；
c)选自2.12.1，2.13.2，2.14.3，3.1.1，4.9.2和4.17.3的抗体的重链可变区；和
d)含有选自SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：24的氨基酸序列，或在这些序列中具有1-10个氨基酸插入、缺失或替换的氨基酸序列的重链可变区。
14.如权利要求13所述的抗体或其抗原-结合部分，其中所述抗原或其部分含有所有源自可变区的CDR区的氨基酸序列，其中所述可变区选自：
a)选自2.12.1，2.13.2，2.14.3，3.1.1，4.9.2和4.17.3的抗体的轻链可变区；
b)含有选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：22的氨基酸序列、或在这些序列中具有1-10个氨基酸插入、缺失或替换的氨基酸序列的轻链可变区；
c)选自2.12.1，2.13.2，2.14.3，3.1.1，4.9.2和4.17.3的抗体的重链可变区；
d)含有选自SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：24的氨基酸序列、或在这些序列中具有1-10个氨基酸插入、缺失或替换的氨基酸序列的重链可变区；和
e)选自2.12.1，2.13.2，2.14.3，3.1.1，4.9.2和4.17.3的抗体的轻链和重链的可变区。
15.如权利要求1所述的抗体，其中所述抗体选自2.12.1，2.13.2，2.14.3，3.1.1，4.9.2和4.17.3。
16.如权利要求1所述的抗体，其中所述抗体含有重链和轻链，而且所述轻链和重链的氨基酸序列选自：
a)2.12.1的重链的氨基酸序列和轻链的氨基酸序列；
b)2.13.2的重链的氨基酸序列和轻链的氨基酸序列；
c)SEQ ID NO：45的氨基酸序列和SEQ ID NO：47的氨基酸序列；和
d)SEQ ID NO：49的氨基酸序列和SEQ ID NO：51的氨基酸序列。
17.如权利要求1所述的抗体，其中所述抗体具有这样的氨基酸序列，该氨基酸序列含有抗体2.12.1或2.13.2的CDR的氨基酸序列或具有不多于5个保守氨基酸变化的抗体的CDR的氨基酸序列。
18.含有如权利要求1-17中的任意一项权利要求所述的抗体或其部分和药学可接受的载体的药物组合物。
19.如权利要求18所述的药物组合物，进一步含有抗瘤剂、化学治疗剂或抗肿瘤剂。
20.一种用于制备与IGF-IR结合的抗体的方法，包括步骤：
a)用含有IGF-IR的免疫原免疫非人哺乳动物，其中所述哺乳动物能够在动物B细胞中表达人抗体；
b)从哺乳动物体内分离B细胞；
c)筛选所述B细胞，或衍生自其中的细胞系以便鉴别出产生与IGF-IR结合的抗体的细胞系；
d)培养表达与IGF-IR结合的抗体的细胞系；
e)从所述细胞系种分离与IGF-IR结合的抗体。
21.一种产生权利要求1-17中任意一项权利要求所述抗体的分离细胞系。
22.如权利要求21所述的细胞系，其产生选自2.12.1，2.13.2，2.14.3，3.1.1，4.9.2和4.17.3的抗体，或者其中所述抗体具有与其相同的氨基酸序列。
23.一种诊断需要治疗的受试者体内的IGF-IR-表达肿瘤的存在或位置的方法，包括步骤：
a)将如权利要求1-17中的任意一项权利要求所述的抗体注射到受试者体内；
b)通过定位抗体所结合的位点来确定IGF-IR在受试者内的表达；
c)比较(b)部分中的表达与正常参照对象或标准的表达，和
d)诊断肿瘤的存在或位置。
24.一种采用与IGF-IR特异性结合的抗体或其抗原-结合部分治疗人体内癌症的方法，包括对人体施用一定量的有效治疗所述癌症的抗体。
25.一种采用如权利要求1-17中的任意一项权利要求所述的抗体或其抗原-结合部分对有此需要的患者进行治疗的方法，包括对患者施用有效量的抗体。
26.如权利要求24或25所述的方法，进一步包括施用抗瘤剂、抗肿瘤剂、抗-血管生成素或化学治疗剂。
27.分离的核酸分子，含有编码如权利要求1-17中的任意一项权利要求所述抗体的重链或其抗原结合部分或轻链或其抗原结合部分的核酸序列。
28.如权利要求27所述的分离的核酸分子，其中所述核酸分子含有选自以下的核酸序列：
a)编码至少一种选自2.12.1，2.13.2，2.14.3，3.1.1，4.9.2和4.17.3抗体的重链的CDR区的核酸序列；
b)编码选自2.12.1，2.13.2，2.14.3，3.1.1，4.9.2和4.17.3抗体的重链的三个CDR区的核酸序列；
c)编码选自2.12.1，2.13.2，2.14.3，3.1.1，4.9.2和4.17.3抗体的重链或其抗原结合部分的氨基酸序列的核酸序列；
d)编码选自2.12.1，2.13.2，2.14.3，3.1.1，4.9.2和4.17.3抗体的轻链的至少一种CDR序列的核酸序列；
e)编码选自2.12.1，2.13.2，2.14.3，3.1.1，4.9.2和4.17.3抗体的轻链的三个CDR序列的核酸序列；
f)编码选自2.12.1，2.13.2，2.14.3，3.1.1，4.9.2和4.17.3抗体的轻链或其抗原结合部分的氨基酸序列的核酸序列；
g)编码选自SEQ ID NO：2，4，6，8，10，12，14，16，18，20和22的氨基酸序列的核酸序列；
h)选自SEQ ID NO：1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21和23的核酸序列；
其中所述核酸分子选择性地含有编码SEQ ID NO：28或SEQ IDNO：26的氨基酸序列的核酸序列。
29.含有如权利要求27或28所述的核酸分子的载体，其中所述载体任选地含有与所述核酸分子可操作性连接的表达控制序列。
30.含有如权利要求29所述的载体或如权利要求27或28所述的核酸分子的宿主细胞。
31.制备抗-IGF-IR抗体或其抗原结合部分的方法，包括在适当的条件下培养如权利要求30所述的宿主细胞或如权利要求21所述的细胞系，并回收所述的抗体或抗原-结合部分。
32.含有如权利要求27或28所述的核酸的非人转基因动物，其中所述非人转基因动物表达所述的核酸。
33.采用与IGF-IR特异性结合的抗体或其抗原-结合部分治疗需要治疗的受试者的方法，包括步骤：
(a)施用有效量的编码重链或其抗原结合部分的分离的核酸分子，编码轻链或其抗原结合部分的分离的核酸分子，或编码轻链和重链或其抗原结合部分的两种核酸分子；和
(b)表达所述的核酸分子。
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