CN1913921A - 通过靶定暴露在细胞凋亡肿瘤细胞上的内部抗原杀死肿瘤细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了杀死癌细胞的体外和体内方法，包括人体中的治疗方法，还提供了对癌特异抗原C35特异的抗体，和编码此类抗体的多核苷酸，以及使用此类抗体的治疗和诊断方法。

Description

通过靶定暴露在细胞凋亡肿瘤细胞上的 内部抗原杀死肿瘤细胞的方法

发明背景

细胞生长是受到精密调节的过程，其应答身体的特定需要。偶然地，指挥细胞分裂规则的复杂的、并且高度调节的控制损坏。当这种情况发生时，细胞开始独立于它的稳态调节生长和分裂，导致通常称作癌症的疾病。实际上，癌症是年龄25-44岁的美国人中死亡的第二位主要原因。

当前的癌症疗法包括化学疗法和放射疗法。化学治疗药物主要通过诱导细胞凋亡杀死癌细胞(Fisher，D.E.，Cell 78：539-542(1994)；Fung，C.Y.，and D.E.Fisher，J.Clin.Oncol.13：801-807(1995)；Lowe，S.W.，et al.，Cell 74：957-967(1993))。放射疗法通过诱导细胞凋亡和通过其他机制杀死癌细胞。然而，化学疗法和放射疗法不杀死给定肿瘤中的所有细胞，并且从此类治疗幸存的细胞继续生长。从而，这些治疗对于消灭整个肿瘤通常是不够的。因此，需要用于治疗癌症的改进治疗方法。

已经开发了癌症的免疫治疗策略，其使用抗体靶定肿瘤细胞中差别表达的表面膜标记(例如，美国专利号：5,770,195，“MonoclonalAntibodies to the HER2 Receptor”，Filed：May 23，1995；Issued，Jun.23，1998)。然而，在肿瘤中差别表达的许多抗原不暴露于肿瘤细胞的表面上。结果，此类细胞内抗原不适于作为基于抗体的治疗剂的靶标。因此，需要用于治疗癌症的免疫治疗方法的额外靶标。

发明概述

杀死癌细胞的方法

本发明提供了通过施用有效量的细胞凋亡诱导疗法，和使用有效量的抗体缀合物或者抗体复合物杀死癌细胞的方法，所述抗体缀合物或者抗体复合物结合在癌细胞中细胞内表达但是在经历细胞凋亡的癌细胞的细胞表面上暴露的癌相关抗原。安排细胞凋亡诱导疗法和抗体缀合物或者抗体复合物的施用的时间使得抗体达到癌细胞时正在或者已经诱导了细胞凋亡。在优选实施方案中，癌相关抗原是异戊二烯化的蛋白质，其尽管通常在细胞内表达，但是在经历细胞凋亡的肿瘤细胞的细胞表面上暴露。在另一优选实施方案中，异戊二烯化的蛋白质是C35抗原。所述抗体缀合到或者与毒素复合，其确保所述抗体结合的细胞将被杀死，和/或暴露于毒素的周围癌细胞被杀死。在一个实施方案中，所述毒素是放射性同位素。

在一个实施方案中，本发明涉及施用化学治疗剂，同时或者然后施用缀合到放射性试剂的抗体或者其片段或变体。

在一个实施方案中，本发明涉及施用不缀合到毒素或者不与毒素复合的抗体，并且结合该抗体的细胞死亡。

本发明的方法可以在体外或体内进行，并且可以用作患者，包括哺乳动物，如人中的治疗方法。

针对C35的抗体和使用C35抗体的方法

本发明还提供了结合C35多肽的抗体。本发明包括抗体(包括包含或者备选地由抗体片段或其变体组成的分子)，所述抗体免疫特异地结合C35多肽或者C35多肽的多肽片段或变体，如SEQ ID NO：2的C35多肽。

本发明人已经产生了免疫特异地结合一种或多种C35多肽(例如，SEQ ID NO：2)的小鼠和人抗体和编码来自这些抗体的VH和VL区的多核苷酸。从而，本发明包括这些多核苷酸，包括在SEQ ID NO：56、58和60中给出和在下面的表2和3中列出的那些多核苷酸，其在表2和3中所列的日期保藏在美国典型培养物保藏中心(“ATCC”)并且给予表2和3中表示的ATCC保藏号。ATCC位于10801 UniversityBoulevard，Manassas，VA 20110-2209，USA。根据国际承认用于专利程序的微生物保藏的布达佩斯条约进行ATCC保藏。

本发明还包括编码免疫特异结合一种或多种C35多肽(例如，SEQID NO：2)的VH和VL区的保藏的多核苷酸克隆，包含保藏的多核苷酸的细胞，包含所保藏的多核苷酸编码的VH和/或VL区的抗体，编码此类抗体的多核苷酸，和包含此类多核苷酸的细胞。本发明还包括包含SEQ ID NO：56、58和60的多核苷酸的细胞，包含SEQ ID NO：56、58和60编码的VH和/或VL区的抗体，编码此类抗体的多核苷酸，和包含此类多核苷酸的细胞。此类抗体可以有或者没有与包含保藏的多核苷酸编码的VH和VL区的最初抗体相同的表位特异性，并且可以有或者没有与最初抗体的亲和性相同或者更高的亲和性。在一个实施方案中，本发明的抗体结合代表天然C35序列的残基105到115的表位。

此外，本发明包含抗体，其包含或者备选地由这些抗体的片段或变体(例如，scFv、双链抗体(diabody)、三链抗体(triabody)、四链抗体(tetrabody)、微型抗体(minibody)、重链、VH区、VH CDR(互补决定区)、轻链、VL区或者VL CDR)组成，所述片段或变体具有本发明的多核苷酸编码的VH、VH CDRs、VLs、VL CDRs之一的氨基酸序列。此类抗体可以有或者没有与包含所保藏的多核苷酸编码的VH和VL区的最初抗体相同的表位特异性，并且可以有或者没有与最初抗体对C35的亲和性相同或者更高的亲和性。

本发明还提供了结合一种或多种C35多肽的抗体或者其片段或变体，并且其偶联到可检测的标记，如酶、荧光标记、发光标记、或者生物发光标记。本发明还提供了抗体或者其片段或变体，其结合一种或多种C35多肽，并且偶联到治疗剂或毒素，例如，放射性物质。在一个实施方案中，本发明的抗体偶联到放射性同位素。

本发明还提供了通常分离的、编码本发明的抗体(包括分子，如scFv、双链抗体、三链抗体、四链抗体、微型抗体、VH区或者VL区，其包含，或者备选地由抗体片段或其变体组成)的核酸分子。本发明还提供了用编码本发明的抗体(包括分子，如scFv、双链抗体、三链抗体、四链抗体、微型抗体、VH区或者VL区，其包含，或者备选地由抗体片段或其变体组成)的核酸分子转化的宿主细胞和其后代。本发明还提供了产生本发明的抗体(包括包含或者备选地由抗体片段或其变体组成的分子)的方法。本发明还提供了从核酸分子表达本发明的抗体(包括包含或者备选地由抗体片段或其变体组成的分子)的方法。

本发明涉及治疗癌症的方法和组合物，其包括对哺乳动物，优选对人施用有效量的免疫结合C35多肽或其片段或变体的一种或多种抗体或其片段或变体，或相关分子。在优选实施方案中，本发明涉及用于治疗乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌、结肠癌和黑素瘤的基于抗体的方法和组合物。

在优选实施方案中，本发明涉及用于治疗癌症的组合疗法，其包括对哺乳动物，优选对人施用有效量的化学治疗剂和有效量的缀合到毒素，例如，放射性物质的一种或多种抗体，其片段或变体。

本发明还包括用于检测、诊断或预后癌症的方法和组合物，其包括对哺乳动物，优选对人施用有效量的免疫特异结合C35或者其片段或变体的一种或多种抗体或其片段或变体，或者相关分子。在优选实施方案中，本发明涉及用于检测、诊断或预后乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌、结肠癌和黑素瘤的基于抗体的方法和组合物。

本发明的另一实施方案包括本发明的抗体的用途，用作监视C35在癌症中的表达的诊断工具。在某些实施方案中，该方法还可以用作证实细胞凋亡诱导方案的功效的诊断方法。

在下面进一步详细描述本发明的这些和其他方法。

附图简述

图1显示了在表达C35肿瘤抗原的21MT1乳腺肿瘤细胞中辐射诱导的细胞凋亡后乳腺肿瘤细胞的C35表面染色。图1A显示了未处理的活细胞(PI阴性的)，其不经历细胞凋亡(膜联蛋白V阴性的)，不在表面膜上表达C35，如通过用抗-C35抗体和同种型对照抗体的差别染色的不存在所证实。图1B类似地表明保持存活(PI阴性的)并且没有诱导以经历细胞凋亡(膜联蛋白V阴性的)的经辐射的肿瘤细胞也不在肿瘤细胞表面膜上表达C35。相比，图1C表明存活(PI阴性的)但是经历细胞凋亡(膜联蛋白V阳性的)的经辐射的肿瘤细胞与同种型对照抗体相比用抗-C35抗体清楚地差别染色。

图2显示了丝裂霉素C药物诱导的细胞凋亡后乳腺肿瘤细胞的C35表面染色。图2A显示了未处理的活细胞(PI阴性的)，其不经历细胞凋亡(膜联蛋白V阴性的)，不在表面膜上表达C35，如通过用抗-C35抗体和同种型对照抗体的差别染色的不存在所证实。图2B类似地表明保持存活(PI阴性的)并且还没有诱导以经历细胞凋亡(膜联蛋白V阴性的)的丝裂霉素C处理的肿瘤细胞也不在肿瘤细胞表面膜上表达C35。相比，图2C表明丝裂霉素C处理的肿瘤细胞是存活的(PI阴性的)，但是经历细胞凋亡(膜联蛋白V阳性的)，与同种型对照抗体相比，所述肿瘤细胞用抗-C35抗体清楚地差别染色。

图3A-3C表明Taxol^TM诱导细胞凋亡，导致细胞凋亡的肿瘤细胞的表面上C35的暴露。用0.5uM Taxol^TM处理后24小时，将21MT1肿瘤细胞用膜联蛋白V-FITC、碘化丙锭，和用100ng抗-C35抗体1F2(黑色线)或者同种型对照(灰色填充)抗体染色。两种抗体都直接缀合到Alexa-647。对经历细胞凋亡的细胞(膜联蛋白V阳性的/PI阴性的)选通(gated)直方图。将抗体与PAB缓冲液(图3A)、10倍摩尔过量的重组C35蛋白(图3B)，或者100倍摩尔过量的β-半乳糖苷酶蛋白质(图3C)预孵育。

图4表明抗-C35单克隆抗体局部定位到C35+肿瘤的坏死区中。在BALB/c小鼠的相反侧腹植入用或者没有用人C35转染的同系基因的非小细胞肺癌衍生系1肿瘤细胞。通过用抗-C35抗体免疫组化染色证实C35蛋白质表达。14天体内生长后，动物接受静脉内注射¹²⁵I标记的抗-C35抗体。注射放射标记的抗体后120天处死小鼠并通过将肿瘤切片对胶片曝光测定C35-阳性和C35-阴性肿瘤中抗-C35抗体的浓度。图4A表明放射标记的抗-C35抗体仅在C35-阳性而不在C-35阴性肿瘤中浓集。图4B和4C比较了肿瘤内完整细胞的标记分布和H&E染色，证实在这些条件下，经标记的抗-C35抗体在C35-阳性肿瘤的坏死区中特异浓集。

图5显示了在用Colau.C35肿瘤细胞移植的Swiss裸小鼠中用¹³¹I-标记的1B3抗-C35鼠单克隆抗体的放射免疫疗法和化学疗法(氟尿嘧啶，150mg/kg；亚叶酸，100mg/kg)的组合对肿瘤体积的影响。在肿瘤移植后11天启动化学疗法并在第14天施用300μCi ¹³¹I-标记的1B3抗-C35抗体。跟踪肿瘤生长长达8周。

图6显示了化学疗法和放射免疫疗法的组合模式治疗对肿瘤体积的影响。在第0天用Colau.C35细胞移植Swiss裸小鼠。化学疗法：在第15和18天以2mg/kg静脉内施用顺铂；在第18天以180/120mg/kg静脉内施用5FU/LV。放射免疫疗法：在第21天施用300μCi(～50μg)¹³¹I-标记的鼠1B3抗-C35IgG。

图7显示了在天然表达的和C35-转染的人乳腺和结肠肿瘤中的等同表达。用Alexa-647缀合的抗-C35MAb 1F2或者同种型对照对细胞染色。MFI X是1F2的平均荧光强度/同种型对照的平均荧光强度的比值。来自正常乳腺上皮的H16N2和乳腺肿瘤MDAMB231，和结肠肿瘤Colau表达低基础水平的C35。来自乳腺癌的21MT1天然表达高水平的C35。用空载体(null)或者人C35重组载体转导Colau和MDA231。所有肿瘤都在体内生长，切除肿瘤，将其解离并染色。

图8显示了通过体重减轻确定的在Swiss裸小鼠中化学疗法、放射免疫疗法和组合疗法的毒性。

图9显示了用Lys-C内切蛋白酶完全消化6x His-标记的重组人C35(rhC35)后预期的肽片段。显示了rhC35的完整序列，包括氨基末端6xHis标记。相对于天然人C35序列的氨基末端甲硫氨酸(粗体M)编号氨基酸位置。第一个和第三个赖氨酸(K)残基的星号指出这些位置的消化是无效的，并且可能产生一些更长的片段。

图10显示了蛋白质印迹的1B3(Mab11)或者1F2和抗6x His标记染色的比较，指出每种抗体结合的C35片段。

图11表明MAb 165是C35特异的。将141D10重组痘苗病毒与UH8重组痘苗病毒共转染到HeLa细胞中。通过ELISA测试所得分泌的抗体对C35或者对照蛋白质A27L(痘苗病毒蛋白质)的结合。

发明详述

概述

许多研究已经描述了经历细胞凋亡的细胞的表面膜中的改变。如磷脂酰丝氨酸暴露于表面膜的外部小叶上反映的，这些改变中突出的是磷脂不对称的早期消失。已经报导该表面膜组分的改变促进了巨噬细胞对细胞凋亡细胞的识别和去除(Fadok，V.A.，et al.，J.Immunol.148：2207-2216(1992))。已经开发了一般性方法，其允许通过抗凝剂膜联蛋白V与暴露的磷脂酰丝氨酸分子的结合检测经历细胞凋亡的细胞(Koopman，G.，et al.，Blood 84：1415-1420(1994))。

更重要的是在细胞凋亡细胞中其他表面膜分子，尤其蛋白质的表达和暴露可能改变。许多报导已经描述了似乎在细胞内表达的细胞凋亡特异蛋白质(Grand，R.J.A.，et al.，Exp.Cell Res.218：439-451(1995)；U.S.Patent number：5,972,622，“Method of DetectingApoptosis Using an Anti-Human GP46 Monoclonal Antibody”，Filed：Feb.6，1997；Issued，Oct.26，1999)。更直接的相关性是一种单克隆抗体的报导，所述抗体检测38kD蛋白质抗原，该抗原与细胞凋亡细胞的表面膜和线粒体膜结合但是在正常细胞(美国专利号：5,935,801，“Monoclonal Antibody that Detects ApoptoticAntigen”，Filed：Mar.29，1996；Issued，Aug.10，1999)中检测不到。已经描述了在细胞凋亡的角质形成细胞的表面上或接近表面(Casciola-Rosen，L.A.，et al.，J.Exp.Med.179：1317-1330(1994))和在胚胎发育期间经历细胞凋亡的细胞中(Rotello，R.J.，etal.，Development 120；1421-1431(1994))差别暴露的其他抗原。已经描述了三种确定的蛋白质抗原CD3、CD69和CD25在细胞凋亡的胸腺细胞的表面膜上上调(Kishimoto，H.，et al.，J.Exp.Med.181：649-655(1995))。在每种情况中，这些是正常细胞和组织中细胞凋亡的表面标记。尽管相同标记也可以与经历细胞凋亡的肿瘤细胞结合，但是它们不能将细胞凋亡的肿瘤细胞与作为正常组织更新的一部分的正经历细胞凋亡的正常细胞区分开来。因此，它们将不能用作治疗癌症的靶标。

本发明已经确定存在细胞内肿瘤特异的或者肿瘤相关抗原的子集，所述抗原在化学疗法或者放射诱导的细胞凋亡的条件下在肿瘤细胞膜上表达并可以是用于将抗体缀合的放射性同位素或者毒素浓集在肿瘤内的有效靶标。使用针对此类抗原的方法尤其有效，因为它们可以增强标准细胞凋亡诱导性化学疗法和放射疗法在治疗癌症中的治疗益处。本发明将与内部细胞膜结合的肿瘤特异抗原-具体地，差别表达的分子，如表达异戊二烯化基序的C35癌症特异抗原-鉴定为一类细胞内肿瘤抗原，所述抗原暴露在已经通过辐射和/或化学疗法诱导而经历细胞凋亡的肿瘤细胞的表面膜上。

本发明描述了与化学疗法或者放射疗法对细胞凋亡(优选大规模细胞凋亡)的诱导结合作用以增强肿瘤根除的方法。它基于如下新的观察：在肿瘤细胞中差别表达的一类细胞内标记在细胞凋亡细胞的表面上变得暴露，可以通过缀合毒性有效负荷的特异抗体靶定所述标记。该治疗方法的益处是多方面的。例如，该方法允许向肿瘤环境递送毒性有效负荷，其可以破坏细胞凋亡靶标附近中其他非细胞凋亡的肿瘤细胞。此外，该方法可以防止已经引起细胞凋亡过程(如通过表面膜成分的改变证实)的其它存活细胞逆转细胞凋亡发展和恢复生长(Hammill，A.K.，et al.，Exp.Cell Res.251：16-21(1999))。

针对细胞凋亡细胞的本发明将与针对坏死细胞的现有发明区别(美国专利号：6,071,491，“Detection of Necrotic MalignantTissue and Associated Therapy”，Filed：Aug.9，1999；Issued，Jun.6，2000)。坏死导致向细胞外肿瘤环境释放细胞内含物。这些细胞内抗原的一些在该环境中积累并且可以通过特异抗体靶定。然而，坏死与更大肿瘤的含氧量低的区域相关，因为不存在氧自由基，所以所述更大的肿瘤对放射疗法和可能地放射免疫疗法有相对抗性。尽管用化学治疗剂治疗后坏死存在一定增加(Desrues B.，et al.，Br.J.Cancer 72：1076-82，(1995))，但是化学治疗剂的主要作用是增加细胞凋亡。因此，对于癌症的免疫疗法，尤其负责肿瘤扩展的更小的肿瘤和微小转移的根除，坏死是不如细胞凋亡的靶标。从而，在根除小肿瘤和微小转移中有效的方法特别可用于治疗侵袭性癌症。

本发明还应该与专利申请公布号US 2002/0052308 A1(2002年5月2日)中的公开内容相区别，US 2002/0052308 A1公开了842种癌症抗原，包括具有与C35(SEQ ID NO：2)的部分相同的大区域的抗原(SEQ ID NO：966)。US 2002/0052308 A1一般性公开了针对842种癌症抗原的抗体“单独或者与其他类型的治疗(例如，放射疗法、化学疗法、激素疗法、免疫疗法和抗肿瘤剂)”组合施用，205页，[0229]段。然而，所述公布的申请没有指出为了对C35相关的靶标有效，应该通过施用细胞凋亡诱导剂，如化学疗法、放射疗法或者其他抗肿瘤剂诱导细胞凋亡后施用缀合毒素的C35-特异的抗体。实际上，针对与C35相比在肿瘤细胞表面膜上天然表达的抗原的组合化学疗法和放射免疫疗法的许多研究已经断定通过在化学治疗前，即在诱导细胞凋亡前施用放射免疫治疗抗体得到最佳结果(DeNardo S.J.，et al.Anticancer Res.18：4011-18，(1998)；Clarke K.，et al.，Clin.Cancer Res.6：3621-28，(2000)；Burke P.A.，Cancer94：1320-31(2002)；Stein，R.et al.，Cancer 94：51-61(2002)；Odonnel R.T.，et al.，Prostate 50：27-37(2002))。细胞凋亡导致异戊二烯化并且与未治疗的肿瘤细胞的内部膜结合的一类细胞内抗原(包括C35)的细胞膜暴露这一发现使得本发明与众不同。本发明教导，为了得到最佳效果，最好施用针对该类别的靶分子的放射免疫疗法使得通过施用细胞凋亡诱导剂诱导细胞凋亡同时或者不久后，在肿瘤部位积累所述抗体。US 2002/0052308 A1没有描述C35相关的癌抗原的亚细胞定位，也没有描述应该怎样施用针对该抗原的抗体以得到治疗效果。

杀死癌细胞的方法

本发明涉及杀死癌细胞(在本文中也称作肿瘤细胞)的方法，其包括首先施用有效量的细胞凋亡诱导疗法(例如，化学治疗剂和/或放射)，并随后施用有效量的抗体缀合物或者抗体复合物，其结合在肿瘤细胞中细胞内表达但是在经历细胞凋亡的肿瘤细胞的细胞表面上暴露的癌相关抗原。如下述，所述抗体缀合到毒素或与毒素复合。毒素确保抗体结合的细胞将被杀死，和/或杀死也暴露于该毒素的周围细胞。

在一个实施方案中，该方法包括组合使用化学疗法和放射免疫疗法。在本发明前，由于累积剂量限制性骨髓毒性，组合化学疗法和放射免疫疗法造成了问题。本发明提供了此类组合疗法的施用，其中化学疗法导致细胞内抗原向抗体的暴露。施用的最佳时间可以使用本文和实施例中描述的方法精确确定。

在另一实施方案中，所述方法涉及施用不缀合毒素或者不与毒素复合的抗体，并且结合所述抗体的细胞被杀死。在该实施方案中，毒素不必缀合到抗体或者与该抗体复合以杀死该抗体结合的细胞。抗体自身的结合就杀死了细胞或确保细胞死亡。在该实施方案中，优选在多数或者几乎所有癌细胞，例如，多数或者几乎所有肿瘤或转移的细胞中诱导细胞凋亡。

细胞凋亡诱导疗法后，施用抗体、抗体缀合物或者抗体复合物的时间可以改变，然而，它必须在某个时间窗口内，在该时间窗口内肿瘤细胞正经历细胞凋亡。从而，在某一时限内施用抗体、缀合的抗体或者复合的抗体，在该时限期间已经用细胞凋亡诱导疗法(例如，化学治疗剂和/或放射)治疗的肿瘤细胞中正诱导或者正在经历细胞凋亡。化学治疗剂通常在施用后24-72小时诱导细胞凋亡。针对癌相关抗原的抗体(例如，复合的或者缀合的抗体)通常在施用24-48小时后在肿瘤部位积累。完整抗体的积累通常比抗体片段需要更长时间。因此，通常，应该在本发明方法中施用化学治疗剂(对于抗体片段)后0-48小时和化学治疗剂(对于完整抗体)施用前24小时到24小时后施用针对癌症相关的细胞内抗原的抗体(例如，复合的和缀合的抗体)。在优选实施方案中，在施用细胞凋亡诱导性疗法后0-6小时、或6-12小时、或6-24小时、或6-36小时、或6-48小时、或6-72小时、或6-96小时、或6-120小时、或12-24小时、或12-36小时、或12-48小时、或12-72小时、或12-96小时、或12-120小时、或24-36小时、或24-48小时、或24-72小时、或24-96小时、或24-120小时、或36-48小时、或36-72小时、或36-96小时、或36-120小时或0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、或120小时施用所述抗体或缀合的或复合的抗体。在另一实施方案中，在施用细胞凋亡诱导性疗法前，例如，在施用细胞凋亡诱导性疗法前0-6小时、0-12、0-24、6-12、6-24、12-24、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、10、9、8、7、6、5、4、3、2小时、或者1小时前施用所述抗体(例如缀合的或者复合的抗体)。在另一实施方案中，所述抗体(例如缀合的或者复合的抗体)与细胞凋亡诱导性疗法同时施用。

下面讨论用于本发明方法的细胞凋亡诱导疗法。“肿瘤”、“癌”或者“过度增殖性疾病”是指所有恶性或良性的瘤性细胞生长和增殖，包括所有转化的细胞和组织和所有癌性细胞和组织。

癌症的实例包括，但不限于，癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病或者淋巴恶性肿瘤。此类癌症的更具体的实例包括鳞状细胞癌(例如，上皮鳞状细胞癌)、肺癌，包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的腺癌和肺的鳞状细胞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌，包括胃肠癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或者子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、肛门癌、阴茎癌，以及头颈癌。癌症的其他实例在下面的“过度增殖性疾病”中列出。

“周围”癌细胞是指足够接近而可以通过缀合到抗体或者与抗体复合的毒素杀死的癌细胞。

本发明的方法可以在体外或体内进行，并且可以用作患者，包括哺乳动物，如人类中的治疗方法。

癌相关的细胞内抗原

本发明的方法涉及在某个时间施用针对癌相关的细胞内抗原的抗体(例如，复合的或者缀合的抗体)，使得通过施用细胞凋亡诱导疗法诱导细胞凋亡期间或者之后，所述抗体在癌部位积累。

术语“抗原”和“表位”是本领域公知的并且指免疫系统的组分特异识别的大分子的部分，免疫系统的组分例如为抗体或者T细胞抗原受体。术语表位包括能够特异结合免疫球蛋白的任意蛋白质决定簇。表位决定簇通常由分子的化学活性表面簇诸如氨基酸或糖侧链组成并且通常具有特异三维结构特征，以及特定电荷特征。

“癌相关抗原”或者“肿瘤相关抗原”是指相对于来自相同细胞类型的非癌性细胞或者来自相同组织的非癌性细胞，由癌细胞优先表达的抗原。癌相关抗原可以不是仅由癌细胞表达(即，其他正常细胞仍然可以表达这些抗原)。然而，癌相关抗原的表达通常总是在一种或多种特定类型的癌症中受到上调。癌相关抗原为可以在具有特定类型癌症的动物中引起特异免疫应答的抗原，优选蛋白质，从而包括癌相关抗原和癌相关抗原的片段。所述术语不仅包括完整的肿瘤相关抗原，而且包括其包含表位的部分(片段)。肿瘤相关抗原(TAA)可以是在自然中发现的TAA，或者可以是在自然中发现的TAA的合成形式，或者可以是天然发生的TAA的变体，例如，具有增强的免疫原性性质的变体。

许多癌相关抗原是本领域已知的，并且用于确定新近鉴定的基因或者蛋白质是否与一种类型的癌症或肿瘤相关的常规方法是已知的。此类方法包括RNA印迹分析、差别展示、SAGE、二维蛋白质凝胶电泳或者串联质谱法、DNA印迹分析和其他方法，这些方法用于检测与来自癌症或者肿瘤来源的组织的正常(非癌性或者非转化的)细胞相比，或者与来自其他组织的正常细胞相比，来自特定类型癌症或肿瘤的癌细胞中mRNA或者蛋白质表达或特异基因扩增的增加的水平。其他方法包括通过串联质谱法分析与MHC分子结合的差别表达的肽(肿瘤相对于正常细胞)。

“细胞内的”癌相关抗原是指在不经历细胞凋亡的肿瘤细胞(癌性或者转化的细胞)的细胞内膜上表达的癌相关抗原。其上可以表达“细胞内的”癌相关抗原的内部膜包括内质网(ER)、其他细胞膜结合的小泡，包括内体和溶酶体小泡、线粒体膜，和核膜。优选的“内部表达的”癌相关抗原包括在内质网和/或内体或溶酶体小泡的膜上表达的异戊二烯化蛋白质。异戊二烯化的癌相关抗原的实例在表1中列出。异戊二烯化的癌相关抗原还可以排除C35或者表1中列出的任意个体蛋白质，或者它们的组合。例如，异戊二烯化的癌相关蛋白质可以排除CENP-F动粒蛋白、CAAX盒蛋白1、DnaJ同系物亚家族A成员1或者2，或者鸟嘌呤核苷酸结合蛋白G(I)/G(S)/G(O)γ-5亚基。

对于新鉴定的癌相关抗原，例如，癌相关的蛋白质，确定它是否异戊二烯化的常规方法包括在该基因/蛋白质序列的3’末端寻找对应于异戊二烯化基序的核苷酸串。许多真核蛋白质通过在半胱氨酸残基附着法呢基或者牻牛儿基-牻牛儿基进行翻译后修饰(Glomset，J.A.，et al.，Trends Biochem.Sci.15：139-142(1990)；Lowy，D.R.，andWillumsen，B.M.，Nature 341：384-385(1989)；Imagee，A.I.，Biochem.Soc.Trans.17：875-876(1989)；Powers，S.，Curr.Biol.1：114-116(1991))。修饰发生在与C-最末端相距3个残基的半胱氨酸残基上；将该半胱氨酸与C-末端残基分开的两个残基通常是脂族的(Ali)。该Cys-Ali-Ali-X模式通常称作CAAX盒。脂族氨基酸包括异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、丙氨酸和脯氨酸。C35的最后四个氨基酸是CVIL。末端位置的亮氨酸表明这是异戊烯转移酶GGTase I的底物，所述酶导致加入牻牛儿基-牻牛儿基(Moomaw and Casey，J.Biol.Chem.267，17438-17443(1992))。

从而，本发明的方法还提供了在施用所述抗体(例如，复合的和缀合的抗体)或者细胞凋亡-诱导剂之前，确定癌相关抗原是否是在经历细胞凋亡的细胞中细胞表面暴露的细胞内蛋白质。此类确定可以包括通过计算机或者手工分析候选蛋白质氨基酸序列的C-末端的CAAX盒，和/或进行测定来确定在表达该蛋白质的细胞中诱导细胞凋亡后，候选蛋白质是否在细胞外表达。此类测定是本领域已知的并且在本文中描述(见，例如实施例1和2)并且包括在表达候选蛋白质的细胞中诱导细胞凋亡和使用对候选蛋白质特异的抗体(例如，标记的抗体)检测细胞凋亡细胞表面上的蛋白质。

                     表1.编码癌相关的异戊二烯化蛋白质的基因

基因名	GenBank检索号	肿瘤类型	蛋白质名
				CENPF	P49454	结肠、肾、肝、神经、皮肤	CENP-F动粒蛋白(着丝粒蛋白F)(分裂激素)(AH抗原)
CXX1	O15255	乳腺、胰腺	CAAX盒蛋白1(脑蛋白质-5)(hucep-5)
				DNAJA1或HSJ2或HSPF4或DNAJ2或HDJ2	P31689	胃肠道、胰腺、胃、前列腺	DnaJ同源物亚家族A成员1(热休克40kDa蛋白4)(DnaJ蛋白同源物2)(HSJ-2)(HSDJ)
DNAJA2或HIRIP4	O60884	结肠、胃	DnaJ同系物亚家族A成员2(HIRA相互作用蛋白4)(细胞周期进展恢复基因3蛋白质)(Dnj3)
				GNG5或GNGT5	P30670	脑	鸟嘌呤核苷酸-结合蛋白G(I)/G(S)/G(O)γ-5亚基
GNG10或GNGT10	P50151	生殖泌尿的、乳腺	鸟嘌呤核苷酸-结合蛋白G(I)/G(S)/G(O)γ-10亚基
				GNG12	Q9UBI6	结肠、软骨、生殖泌尿的	鸟嘌呤核苷酸-结合蛋白G(I)/G(S)/G(O)γ-12亚基
LMNB1或LMN2或LMNB	P20700	结肠、生殖泌尿的、乳腺	核纤层蛋白B1
				LMNB2或LMN2	Q03252	脑、结肠、乳腺、前列腺、胃、子宫	核纤层蛋白B2
LMNA或LMN1	P02545	胰腺、皮肤、胃、子宫	核纤层蛋白A/C(70kDa核纤层蛋白)
				PPP1R16A	Q96134	胃	蛋白质磷酸酶1调节抑制剂亚基16A
PXF或HK33或PEX19	P40855	卵巢	过氧化物酶体法尼基化蛋白质(33kDa管家蛋白)(Peroxin 19)
				RAB11B或YPT3	Q15907	前列腺、皮肤、子宫、肾	Ras-相关蛋白Rab-11B(GTP-结合蛋白YPT3)
RAB22A	Q9UL26	肝细胞	Ras-相关蛋白Rab-22A(Rab-22)
				RAB7	P51149	结肠、头和颈、胃	Ras-相关蛋白Rab-7
MEL或RAB8	P24407	神经、卵巢、胰腺、肺、子宫	Ras-相关蛋白Rab-8(Rab-8A)(癌基因

基因名	GenBank检索号	肿瘤类型	蛋白质名
							c-mel).
RAC1	P15154	卵巢的、结肠	Ras-相关的C3肉毒杆菌毒素底物1(p21-Rac1)(Ras-样蛋白TC25)
				RAC2	P15153	肾、肝、肺、神经	Ras-相关的C3肉毒杆菌毒素底物2(p21-Rac2)(小G蛋白)(GX)
RAC3	O14658	乳腺、前列腺	Ras-相关的C3肉毒杆菌毒素底物3(p21-Rac3)
				RAP2A	P10114	前列腺	Ras-相关蛋白Rap-2a
RAP1B	P09526	皮肤	Ras-相关蛋白Rap-1b(GTP-结合蛋白smg p21B)
				HRAS或HRAS1	P01112	膀胱、甲状腺	转化蛋白p21/H-Ras-1(c-H-ras)
KRAS2或RASK2	P01116	结肠、卵巢	转化蛋白p21A(K-Ras 2A)(Ki-Ras)(c-K-ras).
				NRAS	P01111	骨髓瘤、黑素瘤、白血病	转化蛋白N-Ras
RAB10	O88386	结肠、胰腺	Ras-相关蛋白Rab-10
				RAB13	P51153	脑、肝、乳腺	Ras-相关蛋白Rab-13
RAB1A或RAB1	P11476	结肠、卵巢、胰腺	Ras-相关蛋白Rab-1A(YPT1-相关蛋白).
				RAB1B	Q9H0U4	乳腺、前列腺、胰腺	Ras-相关蛋白Rab-1B
RAB25或CATX8	P57735	头和颈、卵巢、胰腺	Ras-相关蛋白Rab-25(CATX-8).
				RAB27A或RAB27	P51159	乳腺	Ras-相关蛋白Rab-27A(Rab-27)(GTP-结合蛋白Ram).
RAB30	Q15771	卵巢、肺	Ras-相关蛋白Rab-30
				RAB31或RAB22B	Q13636	胰腺	Ras-相关蛋白Rab-31(Rab-22B).
RAB32	Q13637	脑	Ras-相关蛋白Rab-32
				RAB35或RAB1C或RAY	Q15286	前列腺	Ras-相关蛋白Rab-35(Rab-1C)(GTP-结合蛋白RAY).
RAB36	O95755	鼻咽的	Ras-相关蛋白Rab-36
				RAB38	P57729	黑素瘤	Ras-相关蛋白Rab-38(抗原NY-MEL-1).
RAB3A	P20336	胰岛素瘤	Ras-相关蛋白Rab-3A
				RAB3D或RAB16	O95716	卵巢、前列腺、乳腺	Ras-相关蛋白Rab-3D
RAB4A或	P20338	胃	Ras-相关蛋白Rab-4A

基因名	GenBank检索号	肿瘤类型	蛋白质名
				RAB4
RAB5C	P51148	皮肤、乳腺	Ras-相关蛋白Rab-5C(RAB5L)(L1880).
				RAB6A或RAB6	P20340	结肠	Ras-相关蛋白Rab-6A(Rab-6).
ARHA或ARH12或RHOA或RHO12	P06749	乳腺	转化蛋白RhoA(H12).
				ARHB或ARH6或RHOB	P01121	乳腺	转化蛋白RhoB(H6).
ARHC或ARH9或RHOC	P08134	胰腺	转化蛋白RhoC(H9).
				ARHD或RHOD	O00212	乳腺、胰腺、胃	Rho-相关的GTP-结合蛋白RhoD(Rho-相关蛋白HP1)(RhoHP1).
ARHG或RHOG	P35238	淋巴网状内皮细胞的、胰腺、皮肤	Rho-相关的GTP-结合蛋白RhoG(Sid10750).
				ARHH或TTF	Q15669	AIDS-相关的NHL、NHL、原发性淋巴瘤	Rho-相关的GTP-结合蛋白RhoH(GTP-结合蛋白TTF).
RRAS2或TC21	P17082	卵巢、乳腺	Ras-相关蛋白R-Ras2(Ras-样蛋白TC21)(畸胎癌癌基因).
				RRAS	P10301	胰腺	Ras-相关蛋白R-Ras(p23).

在本发明的多种实施方案中，将异戊二烯化蛋白质作为单独类别处理，它们与经历细胞凋亡的表面暴露的膜的易位具有密切相关的性质。

治疗方法

可以体内使用上述用于杀死癌细胞的方法，作为治疗哺乳动物受试者的方法。

“受试者”或者“个体”或者“患者”或者“哺乳动物”在本文中互换使用，是指希望对其进行诊断或治疗的任意受试者，尤其哺乳动物受试者。哺乳动物受试者包括人、家畜动物、农场动物，和动物园、运动或者宠物动物，如狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、牛、奶牛等等。

术语“治疗”指治疗性治疗和预防性措施，其中目的是防止或者减慢(减小)不希望的生理改变或者疾病，如癌症的发展或者扩散。有益的或者所希望的临床结果包括，但不限于，可检测的或者不可检测的症状的减轻、疾病程度的减轻、疾病的稳定的(即，不恶化)状态、疾病发展的延缓或者减慢、疾病状态的改善或者缓和，和减轻(部分或者总的)。“治疗”还可以指与不接受治疗的预期存活相比延长存活。需要治疗的那些个体包括已经患有该疾病或者病症的个体以及易于患有所述疾病或病症的个体或者将预防所述疾病或病症的个体。也可以排除这些治疗类型或患者类型的任一个。

本发明的方法中优选的是在表1中显示的组合，其中对所列出的异戊二烯化蛋白质特异的抗体(例如，复合的和缀合的抗体)用于治疗针对该异戊二烯化蛋白质所列的癌症类型。例如，对CENP-F动粒特异的抗体可以用于本发明的方法中来治疗结肠、肾、肝、神经和皮肤癌症；对CAAX盒蛋白质1特异的抗体可以用于治疗乳腺和胰腺癌；对DNAJ同系物亚家族A成员1特异的抗体可以用于治疗胃肠道、胰腺、胃、和前列腺癌，等等。此外，对C35蛋白质特异的抗体可以用于治疗、诊断或者检测乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌、结肠癌和黑素瘤。

本发明的方法中还优选用于治疗癌症的组合化学疗法/放射免疫疗法，其包括对哺乳动物，优选对人施用有效量的化学治疗剂，然后接着或者同时施用缀合毒素，优选放射性物质的本发明抗体。

在另一实施方案中，缀合毒素，优选放射性物质的本发明的抗体单独施用。

抗体

本文所用的术语“抗体”或者“免疫球蛋白”指由两个免疫球蛋白重链和两个免疫球蛋白轻链组成的抗体以及其它多种形式，包括，例如，Fv、Fab和F(ab′)2，以及双功能杂合抗体(例如，Lanzavecchiaet al.，Eur.J.Immunol.17，105(1987))和单链(例如，Huston etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，85，5879-5883(1988)和Bird et al.，Science 242，423-426(1988)，将其引入本文作为参考)。(一般见，Hood et al.，Immunology，Benjamin，N.Y.，2ND ed.(1984)，Harlow and Lane，Antibodies.A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory(1988)和Hunkapiller and Hood，Nature，323，15-16(1986)，将其引入本文作为参考)。

本发明的抗体包括，但不限于，多克隆抗体、单克隆抗体、多特异性抗体、人抗体、人源化抗体或者嵌合抗体、单链抗体、Fab片段、F(ab′)2片段、Fab表达文库产生的片段、结构域缺失的抗体(包括，例如，CH2结构域缺失的抗体)、抗独特型(抗-Id)抗体(包括，例如，抗本发明抗体的抗-Id抗体)，和上面抗体任一种的表位结合片段。本文所用的术语“抗体”指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有免疫特异结合抗原的抗原结合位点的分子。本发明的免疫球蛋白分子可以是免疫球蛋白分子的任意类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)，类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。

本发明的抗体也包括，但不限于，抗体和抗体片段的工程化形式，如scFv的双链抗体、三链抗体、四链抗体和更高多聚体，以及微型抗体，如通过两个恒定(C)结构域结合的两个scFv片段。见，例如，Hudson，P.J.and Couriau，C.，Nature Med.9：129-134(2003)；美国公开号20030148409；美国专利号5,837,242。

本发明的抗体可以来自任意动物来源，包括鸟类和哺乳动物。优选地，抗体是人、鼠(例如，小鼠和大鼠)、驴、shiprabbit、山羊、豚鼠、骆驼、马或者鸡。本文所用的“人”抗体包括具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗体并且包括从人免疫球蛋白文库或者从对一种和多种人免疫球蛋白转基因并且不表达内源免疫球蛋白的动物分离的抗体，如上文并且例如，在Kucherlapati等人的美国专利号5,939,598中描述的。

在两种核酸或者多肽(例如，编码C35抗体的DNA或者C35抗体的氨基酸序列)的上下文中短语“基本上相同的”指这样的两种或者多种序列或者子序列，所述序列和子序列当为了最大对应进行比较和比对时，具有至少约80％，更优选90-95％或者更高核苷酸或者氨基酸残基同一性，使用下面的序列比较方法和/或通过目测检测可以确定所述同一性。通常认为此类“基本相同的”序列是同源的。优选地，在序列的区域中存在“基本同一性”，所述区域长为至少约50个残基，更优选至少约100个残基，最优选地，序列在至少约150个残基内基本相同，或者在待比较的两个序列的全长内相同。如下述，可以通过使用Kabat中的编号方案，任意两条抗体序列仅可以以单向比对。因此，对于抗体，百分数同一性具有唯一并且确定的含义。

来自免疫球蛋白的成熟重链和轻链的可变区的氨基酸分别称作Hx和Lx，其中x是根据Kabat，Sequences of Proteins ofImmunological Interest (National Institutes of Health，Bethesda，Md.，1987 and 1991)方案指定氨基酸位置的数。Kabat列出了每个亚组的抗体的许多氨基酸序列，并且列出了该亚组中每个残基位置的最通常发生的氨基酸以产生共有序列。Kabat使用对所列序列中每个氨基酸分配残基数的方法，并且该分配残基数的方法已经成为本领域标准。Kabat的方案可延伸到不包括在该目录中的其他抗体，这可以通过将所讨论的抗体与Kabat中的共有序列之一通过参考保守氨基酸进行比对来实现。Kabat编号系统的使用容易鉴定不同抗体的等价位置的氨基酸。例如，在人抗体的L50位的氨基酸占据小鼠抗体的氨基酸位置L50的等价位置。

已知基本抗体结构单位包含四聚体。每个四聚体由多肽链的两个相同的对组成，每对有一条“轻”链(约25kDa)和一条“重”链(约50-70kDa)。每条链的氨基末端部分包括约100到110或者更多氨基酸的可变区，其主要负责抗原识别。每条链的羧基末端部分定义了主要负责效应子功能的恒定区。每条轻/重链对的可变区形成抗体结合部位。从而，完整抗体有两个结合部位。

将轻链分类为κ或λ。将重链分类为γ、μ、α、δ或ε，并且将抗体同种型分别定义为IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过约12个或更多氨基酸的“J”区连接，重链还包括约10个或更多氨基酸的“D”区。(一般见，FundamentalImmunology，Paul，W.，ed.，3rd ed.Raven Press，N.Y.，1993，SH.9(将其为了所有目的整体引用作为参考))。

从N末端到C-末端，轻链和重链可变区都包含交替的构架区和互补决定区域(CDR)：FR、CDR、FR、CDR、FR、CDR和FR。对每个区域的氨基酸分配是根据Kabat(1987)和(1991)，上文，和/或Chothia&Lesk，J.Mol.Biol.196：901-917(1987)；Chothia et al.，Nature342：878-883(1989)的定义。

本文所用的术语“构架区”指抗体轻链和重链可变区的那些区域，它们在一个物种中的不同免疫球蛋白中是相对保守的(即，不同于CDR)，如Kabat，等人(前面引用)定义。本文所用的“人构架区”是与天然发生的人抗体的构架区基本相同(约85％或以上)的构架区。

对于用于人类最优选地，抗体是本发明的人的或者人源化抗体的抗原结合片段，并且包括但不限于，Fab、Fab′和F(ab′)2、Fd、单链Fvs(scFv)、双链抗体、三链抗体、四链抗体、微型抗体、结构域缺失的抗体、单链抗体、二硫键连接的Fvs(sdFv)和包含VL或者VH区的片段。抗体的抗原结合片段包括单链抗体，可以包含单独或者与下面的完整或者部分组合的可变区：铰链区、CH1、CH2和CH3结构域。本发明还包括抗原结合片段，其还包括可变区与铰链区、CH1、CH2和CH3结构域的任意组合。

在本发明的治疗方法中优选的抗体是含有CH2结构域缺失的那些抗体。

本文所用的术语“人源化的”免疫球蛋白或者“人源化的”抗体指免疫球蛋白，其包含人构架区、来自非人抗体的至少一个CDR，并且其中存在的任意恒定区与人免疫球蛋白恒定区基本相同，即有至少约85-90％，优选至少95％相同性。所以，除了可能的CDR，人源化免疫球蛋白的所有部分都与一种或多种天然人免疫球蛋白序列的对应部分基本相同。例如，人源化的免疫球蛋白将不包含嵌合小鼠可变区/人恒定区抗体。

本文所用的术语“嵌合”抗体指通常这样的抗体，其已经通过遗传工程，从属于不同物种的免疫球蛋白基因片段构建了该抗体的重链和轻链。例如，来自小鼠单克隆抗体的基因的可变(V)片段可以连接到人恒定(C)片段，如γ1和/或γ4。从而典型的治疗性或者诊断性嵌合抗体是杂合蛋白质，其包含来自小鼠抗体的至少一个V区(例如，VH或者VL)或者整个抗原结合结构域(即，VH和VL)和来自人抗体的至少一个C(效应子)区(例如，CH(CH1、CH2、CH3，或CH4)或CL(CL1、CL2、CL3、或者CL4))或者完整C结构域(即CH和CL)，尽管可以使用其他哺乳动物物种。在一些实施方案中，特别对于用于本发明的治疗方法，嵌合抗体不含有CH2结构域。

本发明的抗体可以是单特异的、双特异的、三特异的或者有更大的多特异性。多特异的抗体可以对本发明多肽的不同表位特异或者可以对本发明的多肽以及异源表位(如异源多肽或者固相支持体材料)特异。见，例如，PCT公开WO 93/17715；WO 92/08802；WO 91/00360；WO 92/05793；Tutt，et al.，J.Immunol.147：60-69(1991)；美国专利号4,474,893；4,714,681；4,925,648；5,573,920；5,601,819；Kostelny et al.，J.Immunol.148：1547-1553(1992)。

该小节中的描述可以应用于本发明方法中使用的C35抗体和其他抗体。此类抗体可以缀合到毒素或者与毒素复合，如本文描述，或者可以是非缀合或非复合的。

C35抗体

C35是在乳腺癌和某些其他肿瘤类型(包括黑素瘤、结肠癌、卵巢癌和胰腺癌)中差别表达的抗原。已经表明C35蛋白质是异戊二烯化的并且与内部细胞膜结合但是在活的肿瘤细胞的表面膜上不可检测。发明人已经产生了许多免疫特异识别C35表位的抗体，包括小鼠单克隆抗体和人抗体。本发明人已经阐明通过用化学治疗剂或者放射处理在肿瘤细胞中诱导细胞凋亡导致C35的表面膜暴露，允许完整肿瘤细胞被C35特异抗体识别。

C35多核苷酸和氨基酸序列(SEQ ID NOs：1和2)

gccgcg atg agc ggg gag ccg ggg cag acg tcc gta gcg ccc cct ccc

       Met Ser Gly Glu Pro Gly Gln Thr Ser Val Ala Pro Pro Pro

         1               5                  10

gag gag gtc gag ccg ggc agt ggg gtc cgc atc gtg gtg gag tac tgt

Glu Glu Val Glu Pro Gly Ser Gly Val Arg Ile Val Val Glu Tyr Cys

 15                  20                  25                  30

gaa ccc tgc ggc ttc gag gcg acc tac ctg gag ctg gcc agt gct gtg

Glu Pro Cys Gly Phe Glu Ala Thr Tyr Leu Glu Leu Ala Ser Ala Val

                 35                  40                  45

aag gag cag tat ccg ggc atc gag atc gag tcg cgc ctc ggg ggc aca

Lys Glu Gln Tyr Pro Gly Ile Glu Ile Glu Ser Arg Leu Gly Gly Thr

             50                  55                  60

ggt gcc ttt gag ata gag ata aat gga cag ctg gtg ttc tcc aag ctg

Gly Ala Phe Glu Ile Glu Ile Asn Gly Gln Leu Val Phe Ser Lys Leu

         65                  70                  75

gag aat ggg ggc ttt ccc tat gag aaa gat ctc att gag gcc atc cga

Glu Asn Gly Gly Phe Pro Tyr Glu Lys Asp Leu Ile Glu Ala Ile Arg

     80                  85                  90

aga gcc agt aat gga gaa acc cta gaa aag atc acc aac agc cgt cct

Arg Ala Ser Asn Gly Glu Thr Leu Glu Lys Ile Thr Asn Ser Arg Pro

 95                 100                 105                 110

ccc tgc gtc atc ctg tga

Pro Cys Val Ile Leu

                115

从而，本发明还涉及针对C35的抗体、编码此类抗体的多核苷酸、使用C35抗体和多核苷酸治疗C-35相关癌症的方法，和使用C35抗体和多核苷酸检测和诊断的方法。还提供了包含C35抗体多核苷酸的载体和宿主细胞，和产生C35抗体的方法。如本文更详细描述的，本发明还涉及使用C35抗体用于癌症治疗、检测和诊断的方法。上面“抗体”章节中的描述也适用于本文描述的C35抗体。

本发明还涉及基于抗体的治疗方法，其包括对受试者，优选哺乳动物，最优选人施用本发明的C35抗体，用于治疗一种或多种C35癌症。本发明的治疗性化合物包括，但不限于，本发明的抗体(包括如本文描述的片段、类似物和其衍生物)和编码本发明抗体(包括如本文描述的片段、类似物和其衍生物)的核酸。本发明的抗体还可以用于治疗、检测或诊断C-35相关的癌症，包括乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、胰腺癌和膀胱癌和黑素瘤。本发明的C35抗体可以以本领域已知或者本文描述的可药用组合物提供。

本发明的抗体包括，但不限于，多克隆抗体、单克隆抗体、多特异性抗体、人抗体、人源化抗体或者嵌合抗体、单链抗体、scFv、双链抗体、三链抗体、四链抗体、微型抗体、结构域缺失的抗体、Fab片段、F(ab′)2片段、Fab表达文库产生的片段、抗独特型(抗-Id)抗体(包括，例如，针对本发明抗体的抗-Id抗体)、和上面抗体任一种的表位结合片段。本文所用的术语“抗体”是指免疫球蛋白分子或者免疫球蛋白分子的免疫学活性部分，即，含有免疫特异结合抗原的抗原结合部位的分子。本发明的免疫球蛋白分子可以是任意类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或者亚类的免疫球蛋白分子。

使用杂交瘤技术制备了对C35多肽特异的杂交瘤细胞系1F2.4.1和1B3.6.1。(Kohler et al.，Nature 256：495(1975)；Kohler et al.，Eur.J.Immunol.6：511(1976)；Kohler et al.，Eur.J.Immunol.6：292(1976)；Hammerling et al.，in：Monoclonal Antibodies andT-Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，pp.571-681(1981))。简言之，将来自BALB/c小鼠的用经转导而过表达C35的同基因BCA34成纤维细胞肿瘤细胞免疫的脾细胞与非分泌性的骨髓瘤细胞系NS-1(P3/NS1/1-AG4-1，ATCC#TIB-18)通过标准PEG融合产生杂交瘤细胞系。与NS-1PEG融合后，杂交瘤生长在甲基纤维素半固体培养基中。约2周后，将杂交瘤集落分离到96孔板中并通过ELISA、蛋白质印迹和免疫组织化学测试个体上清液与C35的反应性。亚克隆阳性杂交瘤集落并两次筛选反应性以确保克隆性。通过蛋白G亲和纯化，使用标准方法从杂交瘤上清液分离抗体。在ELISA和蛋白质印迹测定中，来自两种杂交瘤细胞系1F2和1B3的抗体特异结合重组C35蛋白质。通过免疫组织化学，来自杂交瘤细胞系1F2的抗体也特异染色福尔马林固定的、石蜡包埋的C35阳性肿瘤和细胞系。此外，我们开发了细胞内染色流式细胞术测定法，其使用来自杂交瘤细胞系1F2的缀合Alexa-647荧光染料的抗体进行定量分析。这些抗体的每一种都是不同的，但是对C35蛋白质都是特异的。来自细胞裂解物的C35蛋白质可以与这些抗体的一种免疫沉淀并用另一种检测。竞争结合ELISA测定表明杂交瘤细胞系1F2和1B3产生的单克隆抗体结合C35蛋白质的不同表位。

本发明的C35抗体包括免疫特异结合本发明的C35多肽、多肽片段或者SEQ ID NO：2的变体，和/或表位的抗体(如通过用于测定特异抗体-抗原结合的本领域公知的免疫测定法测定)。

本文所用的术语“分离的”意在描述目的化合物(例如，C35抗体)，其所处环境不同于该化合物天然发生的环境。“分离的”意在包括样品内的化合物，所述样品基本上富集了该目的化合物和/或其中目的化合物得到部分或者基本纯化。

本文所用的术语“基本富集的”或者“基本纯化的”指化合物，其从它的天然环境移出并且至少60％，优选75％，最优选90％的不含与该化合物天然相关的其他组分。本文所用的具有与参考抗体“相同特异性”的抗体是指该抗体与参考抗体结合相同的表位。确定抗体是否与参考抗体结合相同的表位可以使用下面的“用于抗体结合的测定法”中描述的测定法进行。

来自本文讨论的小鼠杂交瘤细胞系的抗体是1F2和1B3。编码这些抗体的VL和VH区的多核苷酸克隆到如实施例6中描述的TOPO载体中，它们在表2中列出的日期保藏在美国典型培养物保藏中心(“ATCC”)，并给予表2中所列的ATCC保藏号。ATCC位于10801University Boulevard，Manassas，VA 20110-2209，USA。根据国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约进行ATCC保藏。

克隆1F2G于2003年11月11日保藏在ATCC，ATCC保藏号为PTA-5639。克隆1F2K于2003年11月11日保藏在ATCC，ATCC保藏号为PTA-5640。克隆1B 3G于2003年11月11日保藏在ATCC，ATCC保藏号为PTA-5637。克隆1B3K于2003年11月11日保藏在ATCC，ATCC保藏号为PTA-5638。

表2.编码小鼠抗-C35可变区的保藏的多核苷酸克隆

多核苷酸克隆	ATCC保藏号	保藏日
			1F2G	PTA-5639	2003年11月11日
1F2K	PTA-5640	2003年11月11日
			1B3G	PTA-5637	2003年11月11日
1B3K	PTA-5638	2003年11月11日

小鼠可变区基因和所保藏克隆的载体的部分的序列在下面给出。

斜体＝Topo载体序列(包括在保藏的克隆中)

小写＝5’非翻译区，包括generacer引物

ATG＝鼠信号肽开始

粗体＝构架区(FWR)

下划线＝小鼠IgG1或者κ恒定区的5’部分

1F2鼠抗-C35Vγ1基因多核苷酸序列(来自克隆1F2G)

GAATTTAGCGGCCGC GCCCTTcgactggagcacg

gaaaacatctctctcattagaggttgatctttgaggaaaacagggtgttgcctaaagg AT

GAAAGTGTTGAGTCTGTTGTACCTGTTGACAGCCATTCCTGGTATCCTGTCTGATGTACAGCT

TCAGGAGTCAGGACCTGGCCTCGTGAAACCTTCTCAGTCTCTGTCTCTCACCTGCTCTGTCAC

TGGCTACTCCATCACC TGGATCCGG

                              CDR1

CAGTTTCCAGGGAACAAACTGGAATGGATGGGC

                                                          CR2

CGAATCTCCTTCACTCGTGACACATCTAAGAACCAGTTTTT

CCTGAAGTTTAATTCTGTGACTACTGACGACTCAGCTGCATATTACTGTACAAGA

TGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA GCCAA

  CDR3

AACGACACCCCCATCTGTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAACTAACTCCAAGGG

C

GTTTAAACCTGCAGGACTAGTCCCTT(SEQ ID NO：3)

信号肽＝18AA

FR1＝30AA

CDR1＝6AA

FR2＝14AA

CDR2＝16AA

FR3＝32AA

CDR3＝7AA

FR4＝11AA

1F2VH氨基酸序列(克隆1F2G编码)

DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVTGYSITSGYFWNWIRQFPGNKLEWMGYISYDGS

NNSNPSLKNRISFTRDTSKNQFFLKFNSVTTDDSAAYYCTRGTTGFAYWGQGTLVTV

SA(SEQ ID NO：4)

1F2鼠抗-C35κV基因多核苷酸序列(来自克隆1F2K)

CGC

GCCCTTcgactggagcacga gaaaaatt

agctagggaccaaaattcaaagacaga ATGGATTTTCAGGTGCAGATTTTCAGCTTCCTGCTA

ATCAGTGCCTCAGTCAGAATGTCCAGAGGACAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATG

TCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATATCCTGC

                                             CDR1

TGGTACCAGCAGAAGCCAGGATCCTCCCCCAAACCCTGGA

TTTAT GGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCT

                          CDR2

GGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGC

TTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAA

AA CGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGCAAAGGGCGAATT

CGTTT(SEQ ID NO：5)

信号肽＝22AA

FR1＝23AA

CDR1＝10AA

FR2＝15AA

CDR2＝7AA

FR3＝32AA

CDR3＝9AA

FR4＝10AA

1F2-VK氨基酸序列(克隆1F2K编码)

QIVLTQSPAIMSASPGEKVTISCSASSSVSYMNWYQQKPGSSPKPWIYHTSNLASGVPARFSG

SGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQYHSYPPTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO：6)

1B3鼠抗-C35VγV-基因(克隆1B3G编码)(NC1-A7 V139-D-J1(VH36-60)M13281)

CGC

GCCCTTcgactggagcacga gaaaatc

tctctcactggaggctgatttttgaagaaaggggttgtagcctaaaag ATGATGGTGTTAAGT

CTTCTGTACCTGTTGACAGCCCTTCCGGGTATCCTGTCAGAGGTGCAGCTTCAGGAGTCAGGA

CCTAGCCTCGTGAAACCTTCTCAGACTCTGTCCCTCACCTGTTCTGTCACTGGCGACTCCATC

ACC

TGGATCCGGAAATTCCCAGGAAATA

                                        CDR1

AACTTGAATACGTGGGG

                                                                  CDR2

CGAATCTCCATCACTCGAGACACATCCAAGAACCACTACTACCTGCAGTTGAATTCT

GTGACTACTGAGGACACAGCCACATATTACTGTGCAAGA

TGGGGCGCTGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA

          CDR3

GCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAACTAACTCC

AAGGGC

GTTTAAACCTGC(SEQ ID NO：7)

SIG PEP＝18AA

FR1＝30AA

CDR1＝5AA

FR2＝14AA

CDR2＝16AA

FR3＝32AA

CDR3＝14AA

FR4＝11AA

1B3 VH氨基酸序列(克隆1B3G编码)

EVQLQESGPSLVKPSQTLSLTCSVTGDSITSGYWNWIRKFPGNKLEYVGYISYSGGTYYNPSL

KSRISITRDTSKNHYYLQLNSVTTEDTATYYCARGAYYGGAFFPYFDVWGAGTTVTVSS

(SEQ ID NO：8)

1B3鼠抗-C35κV-基因(来自克隆1B3K)

GCCCTTcccctggagcacga

gaaaatcagtt

cctgccaggacacagtttagat ATGAGGTTCCAGGTTCAGGTTCTGGGGCTCCTTCTGCTCTG

GATATCAGGTGCCCACTGTGATGTCCAGATAACCCAGTCTCCATCTTTTCTTGCTGCATCTCC

TGGAGAAACCATTACTATTAATTGC

                                           CDR1

TGGTATCAGGAGAAACCTGGAGAAACTAAAAAGCTTCTTATCTAC

GGACTTCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGTACAGA

          CDR2

TTTCACTCTCACCATCAGTAGCCTGGAGCCTGAAGATTTTGCAATGTATTACTGT

TTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA CGGGCT

          CDR3

GATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGCAAAGGGC  (SEQ

ID NO：9)

SP＝20AA

FR1＝23aa

CDR1＝11aa

FR2＝15aa

CDR2＝7AA

FR3＝32aa

CDR3＝9AA

FR4＝10AA

1B3 VK氨基酸序列(克隆1B3K编码)

DVQITQSPSFLAASPGETITINCRASKYISKHLVWYQEKPGETKKLLIYSGSTLQSGLPS

RFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAMYYCQQHNEYPLTFGAGTKLELK(SEQ ID NO：10)

本发明人已经使用2002年9月5日公布的US 2002 0123057 A1描述的方法产生了两种C35抗体MAb 165和MAb 171。MAb 165和MAb171的重链可变区包含与上述1B3抗体重链可变区相同的CDR3区。MAb165和MAb 171的剩余部分为人源的。本发明涉及免疫特异结合C35多肽的抗体，其包含SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58或SEQ ID NO：60的VH或VL区的任一个，或者SEQ ID NO：56或SEQ ID NO：60编码的任一VH区和SEQ ID NO：58编码的VH区的组合，和优选地，C35-特异抗体MAb 165或MAb 171。MAb 165和MAb 171都包含相同的κ轻链UH8 VK L120。

MAb 165和MAb 171的重链和轻链可变区的序列在下面给出。

下划线＝CDR1，CDR2，或CDR3

MAb 165 VH(141D10 VH H732)核苷酸序列：

CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTCCGGAGACCCTGT

CCCTCACCTGCAATGTCTCTGGTGGCTCTATCGGT AGATACTATTGGAACTGGATC

                                           CDR1

CGACAGTCCCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATTGGC CATATCCATTACAGTGGGA

GCACCATCTACCATCCCTCCCTCAAGAGTCGAGTCAGCATATCGCTGGACACGTCC

           CDR2

AAGAACCAGGTCTCCCTGAAGTTGAGTTCTGTGACCGCTGCGGACACGGCCGTGT

ATTACTGTGCACGA GGTGCTTACTACGGGGGGGCCTTTTTTCCTTACTTCGATGTC

                           CDR3

TGGGGCCAAGGGACCA CGGTCACCGTCTCCTCA(SEQ ID NO：56)

MAb 165 VH(141D10 VH H732)氨基酸序列：

QVQLQESGPGLVKPPETLSLTCNVSGGSIG RYYWNWIRQSPGKGLEWIG HIHYSGSTI

YHPSLKSRVSISLDTSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAR GAYYGGAFFPYFDVWGQG

TTVTVSS(SEQ ID NO：57)

MAb 171 VH(MSH 3VH H835)核苷酸序列：

CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGAGGAGGCTTAGTTCAGCCTGGGGGGTCCCTGA

GACTCTCTTGTGCAGGCTCTGGATTCACCTTCAGT AGTTACTGGATGCACTGGGTC

                                           CDR1

CGCCAAGCTCCAGGGAAGGGGCTGGTGTGGGTC TCACGTATTGACACTGATGGGA

GTACCACAACCTACGCGGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAA

                CDR2

CGCCAAGAACACACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGTCGAGGACACGGCC

GTGTATTACTGTGCACGA GGTGCTTACTACGGGGGGGCCTTTTTTCCTTACTTCGA

                                CDR3

TGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA(SEQ ID NO：60)

MAb 171 VH(141D10 VH H732)氨基酸序列：

QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAGSGFTFS SYWMHWVRQAPGKGLVWV SRIDTDGS

TTTYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRVEDTAVYYCAR GAYYGGAFFPYFDV

WGQGTTVTVSS(SEQ ID NO：61)

UH8 VK L120核苷酸序列：

GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTATGGGAGACAGAGT

CACCATCACTTGC CGGGCGAGTCAGGGCATTAGGAATCATTTAGCCTGGTATCAG

                                     CDR1

CAGAAACCAGGGAAAGCTCCTAATCTCCTGATCTCT GCTGCATCCACTTTGCAAT

                                     CDR2

CAGGGGTCCCAACTCGATTCAGTGGCAGTGGATCTGGAACAGATTTCACTCTCAC

CATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGACTCTGCAACTTATTACTGC CAACAGTATAATC

GGTACCCCCTCACTTTCGGCCAA GGGACCAAGCTCGAGATCAAA(SEQ ID NO：58)

     CDR3

UH8 VK L120氨基酸序列：

DIQMTQSPSSLSASMGDRVTITC RASQGIRNHLAWYQQKPGKAPNLLIS AASTLQSGV

PTRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDSATYYC QQYNRYPLTFGQGTKLEIK(SEQ IDNO：59)

本发明人已经使用US 2002 0123057 A1中描述的方法产生了人C35抗体MAbc009。本发明涉及免疫特异结合C35多肽的抗体，其包含表3中所列的多核苷酸克隆编码的VH和VL区，优选完整人C35-特异的抗体MAbc009。编码该抗体的VL和VH区的多核苷酸如实施例6中描述的克隆到TOPO载体中，它们在表3中列出的日期保藏在美国典型培养物保藏中心(“ATCC”)，并给予表3中所列的ATCC保藏号。ATCC位于10801 University Boulevard，Manassas，VA 20110-2209，USA。根据国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约进行ATCC保藏。

克隆H0009于2003年11月11日保藏在ATCC，ATCC保藏号为PTA-5641。克隆L0010于2003年11月11日保藏在ATCC，ATCC保藏号为PTA-5642。

表3.编码人抗-C35可变区的保藏的多核苷酸克隆

多核苷酸克隆	编码的抗体区	ATCC保藏号	保藏日
				H0009	MAbc009的VH	PTA-5641	2003年11月11日
L0010	MAbc009的VL	PTA-5642	2003年11月11日

人可变区基因和所保藏克隆的载体的部分的序列在下面给出。

ATG＝人信号肽开始

粗体＝构架区

下划线＝人IgG1GS或者κ恒定区

MAbc0009 VH核苷酸序列(来自克隆H0009)

GCCCTTAATTGCGGCCGCAAACC ATGGGATGGAGCTGTATCATCCTC

TTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGCGCGCACTCCGAGGTGCAGCTGGTGGAG

TCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGC

AGCGTCTGGATTCAACTTCGGT

TGGGTCCGCCA

                           CDR1

GGCTCAAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCA

CGATACACCATCTCCAGAG

                 CDR2

ACAATTCCCAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACACCCTGAGAGCCGAC

GACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAAA

                                        CDR3

GACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA GCCTCCACCAAGGGCCCATCGG

TCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGG

TCAAGGACTACTTAAGGGC  (SEQ ID NO：11)

MAbc0009 VH氨基酸序列(克隆H0009编码)

EVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFNFGTYAMHWVRQAQGKGLEWVALIWYDGTKKYYADS

VKGRYTISRDNSQNTLYLQMNTLRADDTAVYYCAKSKLQGRVIDYWGQGTLVTVSS(SEQID NO：12)

MAbc0009 VK核苷酸序列(来自克隆L0010)

GCCCTTAATTGCGGCCGCAAAC ATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGC

AACAGCTACAGGCGTGCACTCCGACATCCAGATGACCCAGTCTCCAGACtCCCTGGCTGTGTC

TCTGGGCGAGAGGGCCACCATCAACTGC

                                         CDR1

TGGTACCAGCAGAAACCAGGACAGCCTCCTAAGCTGCTCATTTAC

GGGGTCCCTGACCGATTCAGTGGCAGCGGGTCT

CDR2

GGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGGCTGAAGATGTGGCAGTTTATTACTGT

TGGACGTTCGGCC

      CDR3

AAGGGACCAAGCTCGAGATCAAA CGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCAT

CTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAAAAGGGC

(SEQ ID NO：13)

MAbc0009 VK氨基酸序列(克隆L0010编码)

IQMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGV

PDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSTPLWTFGQGTKLEIK(SEQ IDON：14)

小鼠C35抗体有称作SEQ ID Nos：3-10的重链和轻链可变区。小鼠抗体1F2和1B3有γ1同种型和κ轻链。与1B3小鼠抗体有相同重链可变区CDR3的抗体MAb 165和MAb 171具有称作SEQ ID NOs：56-60的重链和轻链可变区。抗体MAb 165和MAb 171有κ轻链。人抗体MAbc009有称作SEQ ID Nos：11-14的重链和轻链可变区。人抗体MAbc009有γ1同种型和κ轻链。

本发明包括免疫特异结合C35多肽或者其片段、变体或者融合蛋白的抗体(包括包含，或者备选地，由抗体片段或者其变体组成的分子)。C35多肽包括，但不限于，SEQ ID NO：2的C35多肽。可以通过编码SEQ ID NO：2的多肽的核酸的重组表达产生C35多肽(关于C35的含有表位的片段，见WO 01/74859)。

优选地，所示例的抗体的类似物通过保守氨基酸替代而与示例的抗体不同。为了将氨基酸替代分类为保守的或者非保守的，可以如下分类氨基酸：组I(疏水侧链)：met，ala，val，leu，ile；组II(中性亲水侧链)：cys，ser，thr；组III(酸性侧链)：asp，glu；组IV(碱性侧链)：asn，gln，his，lys，arg；组V(影响链定向的残基)：gly，pro；和组VI(芳香族侧链)：trp，tyr，phe。保守替代包括相同类别中氨基酸之间的替代。非保守替代为将这些类别中一类中的成员与另一类的成员交换。

在本发明的一个实施方案中，免疫特异结合C35多肽或者其片段和变体的抗体包含具有SEQ ID NO：57或61的氨基酸序列的多肽，或者表2或3中提及的多核苷酸的至少一种和/或SEQ ID NO：59编码的任一个VH区或者表2或3中提及的多核苷酸的至少一种编码的任一个VL区。在其他实施方案中，本发明的抗体包含SEQ ID NO：57或SEQ IDNO：61的氨基酸序列和SEQ ID NO：59的氨基酸序列。在优选实施方案中，本发明的抗体包含表3中提及的克隆H0009编码的VH区和克隆L0010编码的VL区的氨基酸序列。在优选实施方案中，本发明的抗体包含表2的克隆1F2G编码的VH区和克隆1F2K编码的VL区，或者克隆1B3G编码的VH区和克隆1B3K编码的VL区的氨基酸序列。在其他优选实施方案中，本发明的抗体包含表3的克隆H0009编码的VH区的氨基酸序列、SEQ ID NO：57的氨基酸序列，或者SEQ ID NO：61的氨基酸序列和表2的克隆1F2K或1B3K编码的VL区的氨基酸序列；或者表2的克隆1F2G或1B3G编码的VH区，SEQ ID NO：57的氨基酸序列，或者SEQ ID NO：61和表3的克隆L0010编码的VL区的氨基酸序列；或者表2的克隆1F2G或1B3G或表3的克隆H009编码的VH区和SEQ IDNO：59的氨基酸序列。在其他优选的实施方案中，本发明的抗体包含克隆1F2G编码的VH区和表2的克隆1B3K编码的VL区氨基酸序列，或者表2的克隆1B3G编码的VH区和克隆1F2K编码的VL区的氨基酸序列。本发明还包括包含，或者备选地，由表2或表3中提及的至少一种多核苷酸编码的VH和/或VL区的抗体片段或变体组成并且免疫特异结合C35多肽的分子，以及编码这些VH和VL区、分子、片段和/或变体的核酸分子。

本发明还提供了免疫特异结合C35多肽，多肽片段或者C35多肽的变体的抗体，其中所述抗体包含，或者备选地，由SEQ ID NOs：56或者60或者表2或3中提及的一种或多种多核苷酸编码的VH区中含有的任意1、2、3或多个VH CDR的氨基酸序列的多肽组成。具体地，本发明提供了免疫特异结合C35多肽的抗体，其包含，或者备选地，由具有SEQ ID NOs：56或者60或者表2或3中提及的一种或多种多核苷酸编码的VH区中含有的VH CDR1的氨基酸序列的多肽组成。在另一实施方案中，免疫特异结合C35多肽的抗体包含，或者备选地，由具有SEQ ID NOs：56或者60或者表2或3中提及的一种或多种多核苷酸编码的VH区中含有的VH CDR2的氨基酸序列的多肽组成。在优选实施方案中，免疫特异结合C35多肽的抗体包含，或者备选地，由具有SEQ ID NOs：56或者60或者表2或3中提及的一种或多种多核苷酸编码的VH区中含有的VH CDR3的氨基酸序列的多肽组成。本发明还包括免疫特异结合C35多肽或者C35多肽片段或者其变体的、包含，或者备选地，由这些抗体或者抗体片段或其变体组成的分子，以及编码这些抗体、分子、片段和/或变体的核酸分子。

本发明还提供了免疫特异结合C35多肽，多肽片段或者C35多肽的变体的抗体，其中所述抗体包含，或者备选地，由SEQ ID NO：58或者表2或3中提及的一种或多种多核苷酸编码的VL区中含有的任意1、2、3或多个VL CDR的氨基酸序列的多肽组成。具体地，本发明提供了免疫特异结合C35多肽的抗体，其包含，或者备选地，由具有SEQID NO：58或者表2或3中提及的一种或多种多核苷酸编码的VL区中含有的VL CDR1的氨基酸序列的多肽组成。在另一实施方案中，免疫特异结合C35多肽的抗体包含或者备选地，由具有SEQ ID NO：58或者表2或3中提及的一种或多种多核苷酸编码的VL区中含有的VL CDR2的氨基酸序列的多肽组成。在优选实施方案中，免疫特异结合C35多肽的抗体包含或者备选地，由具有SEQ ID NOs：58或者表2或3中提及的一种或多种多核苷酸编码的VL区中含有的VL CDR3的氨基酸序列的多肽组成。本发明还包括免疫特异结合C35多肽或者C35多肽片段或者其变体的、包含，或者备选地，由这些抗体或者抗体片段或其变体组成的分子，以及编码这些抗体、分子、片段和/或变体的核酸分子。

本发明还提供了免疫特异结合C35多肽，多肽片段或者C35多肽的变体的抗体(包括包含，或者备选地由抗体片段或变体组成的分子)，其中所述抗体包含或者备选地由如SEQ ID NOs：57、59或61或者如表2或表3中提及的一种或多种多肽编码的VH区或者VL区中含有的1、2、3或多个VH CDRs和1、2、3或多个VL CDRs组成。具体地，本发明提供了免疫特异结合C35多肽，多肽片段或者C35多肽的变体的抗体，其中所述抗体包含或者备选地由SEQ ID NOs：56、58或60或者如表2或表3中提及的一种或多种多核苷酸编码的VH区或者VL区中含有的VH CDR1和VL CDR1、VH CDR1和VL CDR2、VH CDR1和VL CDR3、VH CDR2和VL CDR1、VH CDR2和VL CDR2、VH CDR2和VL CDR3、VHCDR3和VH CDR1、VH CDR3和VL CDR2、VH CDR3和VL CDR3，或者其VH CDR和VL CDR的任意组合组成。所述1、2、3或多个VH CDRs和1、2、3或多个VL CDRs可以来自克隆H0009和L0010、克隆H0009和1F2K、克隆H0009和1B3K、克隆H009和SEQ ID NO：58、克隆1F2G和1F2K、克隆1F2G和1B3K、克隆1F2G和L0010、克隆1F2G和SEQ ID NO：58、克隆1B3G和1B3K、克隆1B3G和1F2K、克隆1B3G和L0010、克隆1B3G和SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：56和SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：56和克隆L0010、SEQ ID NO：56和克隆1F2K、SEQ ID NO：56和克隆1B3K、SEQ ID NO：60和SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：60和克隆L0010、SEQ IDNO：60和克隆1F2K、或SEQ ID NO：60和克隆1B3K。本发明还包括免疫特异结合C35多肽的、包含，或者备选地由这些抗体的片段或变体组成的分子，以及编码这些抗体、分子、片段或变体的核酸分子。

最优选地，所述抗体是本发明的人、嵌合的(例如，人.小鼠嵌合的)或者人源化的抗体或者抗体的抗原结合片段，包括，但不限于，Fab、Fab′和F(ab′)2、Fd、单链Fvs(scFv)、双链抗体、三链抗体、四链抗体、微型抗体、单链抗体、二硫键连接的Fvs(sdFv)，和胞内抗体(intrabody)和包含VL或者VH区的片段。抗体的抗原结合片段，包括单链抗体，可以包含单独或者与下面的完整或者部分组合的可变区：铰链区、CH1、CH2和CH3结构域。本发明包括抗原结合片段，其包括可变区与铰链区、CH1、CH2和CH3结构域的任意组合。在本发明的治疗方法中优选的C35抗体是含有CH2结构域缺失的那些抗体。

本发明的抗体可以根据本发明的多肽的表位或者部分描述或者详细说明，所述抗体识别或者特异结合所述表位或者部分。例如，通过N-末端和C-末端位置，或者通过连续氨基酸残基的大小描述所述表位或者多肽部分。还可以排除特异结合本发明的表位或者多肽的抗体。因此，本发明包括特异结合本发明的多肽的抗体，并且允许排除所述抗体。

本发明的抗体还可以按照它们对本发明多肽的结合亲和性描述或者详细说明。优选的结合亲和性包含解离常数或者Kd小于5×10(-7)M、10(-7)M、5×10(-8)M、10(-8)M、5×10(-9)M、10(-9)M、5×10(-10)M、10(-10)M、5×10(-11)M、10(-11)M、5×10(-12)M、10(-12)M、5×10(-13)M、10(-13)M、5×10(-14)M、10(-14)M、5×10(-15)M、或者10(-15)M的那些结合亲和性。

本发明的抗体对C35的亲和性与抗体1F2、1B3、MAb 165、MAb 171、或MAbc009对C35的亲和性相同或相似。优选地，本发明的抗体对C35的亲和性高于抗体1F2、1B3、MAb 165、MAb 171、或MAbc009对C35的亲和性。

本发明还提供了竞争性抑制抗体对C35表位的结合的抗体，如通过本领域已知的用于测定竞争性结合的方法，如本文描述的免疫测定法和抗体结合测定法可以测定所述竞争性抑制。在优选实施方案中，抗体竞争性抑制结合所述表位至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少60％、或者至少50％。

还可以按照它们的交叉反应性描述或详细说明本发明的抗体。包括不结合本发明多肽的任意其他类似物、直向同源物或者同源物的抗体。本发明还包括结合与本发明的多肽有至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少65％、至少60％、至少55％和至少50％同一性(如使用本领域已知并且在本文中描述的方法计算)的多肽的抗体。在特定实施方案中，本发明的抗体与人蛋白质的鼠、大鼠和/或兔同源物和其对应的表位交叉反应。本发明还包括这样的抗体，其不结合与本发明的多肽有小于95％、小于90％、小于85％、小于80％、小于75％、小于70％、小于65％、小于60％、小于55％和小于50％同一性(如使用本领域已知并且在本文中描述的方法计算)的多肽。在特定实施方案中，上述交叉反应性是关于本文公开的任意一种特异的抗原性或者免疫原性多肽或者2、3、4、5或者多种特异抗原和/或免疫原性多肽的组合的交叉反应性。本发明还包括结合多核苷酸编码的多肽的抗体，所述多核苷酸在严紧杂交条件(如本文描述)下与本发明的多核苷酸杂交。

本发明的抗体可以按照它们识别或特异结合的本发明的多肽的表位或者部分描述或者详细说明。例如，通过N-末端和C-末端位置，通过连续氨基酸残基的多少，或者在表和图中列出的，在本文中描述所述表位或者多肽部分。还可以排除特异结合本发明的表位或者多肽的抗体。因此，本发明包括特异结合本发明的多肽的抗体，并且允许排除所述抗体。从本发明排除US 2002/0052308和/或WO 01/74859中公开的C35的抗体，和/或特异结合其中公开的表位的抗体。

在特定实施方案中，本发明的抗体结合天然C35序列的残基105-115代表的片段内含有的表位。在另一实施方案中，本发明的抗体结合天然C35序列的残基53-104代表的片段内含有的表位。

本发明的抗体还可以按照它们的交叉反应性或者交叉反应性的缺乏来描述或者详细说明。包括不结合本发明多肽的任意其他类似物、直向同源物或者同源物的抗体。本发明还包括结合与本发明的多肽有至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少65％、至少60％、至少55％和至少50％同一性(如使用本领域已知并且在本文中描述的方法计算)的多肽的抗体。在特定实施方案中，本发明的抗体与人蛋白质的鼠、猴、大鼠和/或兔同源物和其对应的表位交叉反应。本发明还包括这样的抗体，其不结合与本发明的多肽有小于95％、小于90％、小于85％、小于80％、小于75％、小于70％、小于65％、小于60％、小于55％和小于50％同一性(如使用本领域已知并且在本文中描述的方法计算)的多肽。在特定实施方案中，上述交叉反应性是关于本文公开的任意一种特异的抗原性或者免疫原性多肽或者2、3、4、5或者多种特异抗原性和/或免疫原性多肽的组合的交叉反应性。本发明还包括结合多核苷酸编码的多肽的抗体，所述多核苷酸在严紧杂交条件(如本文描述)下与本发明的多核苷酸杂交。

在优选实施方案中，本发明的抗体(包括包含或者备选地，由抗体片段或者其变体组成的分子)免疫特异结合C35多肽并且不与任何其他抗原交叉反应。

在优选实施方案中，本发明的抗体相对于它们结合其他抗原的能力优先结合C35多肽(SEQ ID NO：2)，或者其片段和变体。

作为非限制性实例，如果抗体结合第一种抗原的解离常数(KD)小于该抗体对第二种抗原的KD，那么认为该抗体优先结合第一种抗原。在另一非限制性实施方案中，如果抗体结合第一种抗原的亲和力小于抗体对第二种抗原的KD至少一个数量级，那么认为该抗体优先结合第一种抗原。在另一非限制性实施方案中，如果抗体结合第一种抗原的亲和力小于抗体对第二种抗原的KD至少两个数量级，那么认为该抗体优先结合第一种抗原。

在另一非限制性实施方案中，如果抗体结合第一种抗原的解离速率(off rate)(k(off))小于抗体对第二种抗原的k(off)，那么认为该抗体优先结合第一种抗原。在另一非限制性实施方案中，如果抗体结合第一种抗原的亲和力小于抗体对第二种抗原的k(off)至少一个数量级，那么认为该抗体优先结合第一种抗原。在另一非限制性实施方案中，如果抗体结合第一种抗原的亲和力小于抗体对第二种抗原的k(off)至少两个数量级，那么认为该抗体优先结合第一种抗原。

在特定实施方案中，本发明的抗体结合C35多肽或者其片段或变体的解离速率(k(off))为小于或等于5×10^-2秒^-1、10^-2秒^-1、5×10^-3秒^-1或10^-3秒^-1。更优选地，本发明的抗体结合C35多肽或者其片段或变体的解离速率(k(off))为小于或等于5×10^-4秒^-1、10^-4秒^-1、5×10^-5秒^-1、10^-5秒^-1、5×10^-6秒^-1、10^-6秒^-1、5×10^-7秒^-1、或10^-7秒^-1。

在其他实施方案中，本发明的抗体结合C35多肽或者其片段或变体的结合速率(on rate)(k(on))大于或等于10³M^-1秒^-1、5×10³M^-1秒^-1、10⁴M^-1秒^-1或5×10⁴M^-1秒^-1。更优选地，本发明的抗体结合C35多肽或者其片段或变体的结合速率(k(on))大于或等于10⁵M^-1秒^-1、5×10⁵M^-1秒^-1、10⁶M^-1秒^-1、5×10⁶M^-1秒^-1或10⁷M^-1秒^-1。

本发明还提供了包含或者备选地由本文描述的抗体分子(例如，VH区和/或VL区)的变体(包括衍生物)组成的抗体，所述抗体免疫特异结合C35多肽或者其片段或者变体。本领域技术人员已知的标准技术可以用于在编码本发明的分子的核苷酸序列中引入突变，所述技术包括，但不限于定点诱变和PCR介导的诱变，其导致氨基酸替代。优选地，相对于参考VH区、VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VL区、VLCDR1、VLCDR2、或VLCDR3，变体(包括衍生物)编码小于50个氨基酸替代、小于40个氨基酸替代、小于30个氨基酸替代、小于25个氨基酸替代、小于20个氨基酸替代、小于15个氨基酸替代、小于10个氨基酸替代、小于5个氨基酸替代、小于4个氨基酸替代、小于3个氨基酸替代、或小于2个氨基酸替代。“保守性氨基酸替代”是其中将氨基酸残基用具有相似电荷的侧链的氨基酸残基替代。具有相似电荷的侧链的氨基酸的家族已经在本领域中确定。这些家族包括碱性侧链氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电的极性侧链氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分枝的侧链氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。备选地，可以沿着编码序列的全部或者部分随机导入突变，例如，通过饱和诱变，并且可以对所得突变体筛选生物活性以鉴定保持活性(例如，结合C35多肽的能力)的突变体。

例如，可能仅在抗体分子的构架区或者仅在CDR区中导入突变。所导入的突变可以是沉默的或者中性错义突变，即对抗体结合抗原的能力没有，或者有很小的影响。这些类型的突变可以用于优化密码子利用，或者提高杂交瘤的抗体产生。备选地，非中性错义突变可以改变抗体结合抗原的能力。多数沉默和中性错义突变的位置可能在构架区中，而多数非中性错义突变的位置可能在CDR，尽管这不是绝对的要求。本领域技术人员将可以设计和测试突变分子的所希望的性质，如抗原结合活性没有改变或者结合活性的改变(例如，抗原结合活性的提高或者抗体特异性的改变)。诱变后，所编码的蛋白质可以常规表达并且所编码蛋白质的功能和/或生物活性(例如，免疫特异结合C35多肽的能力)可以使用本文描述的技术或者通过本领域已知的常规修饰技术确定。

在特定实施方案中，免疫特异结合C35多肽或者其片段或变体的本发明的抗体(包括包含或者备选地，由抗体片段或其变体组成的分子)包含，或者备选地，由核苷酸序列编码的氨基酸序列组成，所述核苷酸序列在严紧条件下与和编码SEQ ID NOs：56、58或60的或者表2或表3中提及的一种或多种核酸编码的VH或VL区之一的核苷酸序列互补的核苷酸序列杂交，例如，在高度严紧条件下，在6×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中约45℃下与膜结合的DNA杂交，然后在0.2xSSC/0.1％SDS中约50-65℃下洗涤1次或多次，例如，在6xSSC中约45℃下与膜结合的核酸杂交，然后在0.1xSSC/0.2％SDS中约68℃下洗涤1次或多次，或者在本领域技术人员已知的其他严紧杂交条件下杂交(见，例如，Ausubel，F.M.et al.，eds.，1989，Current Protocols inMolecular Biology，Vol.I，Green Publishing Associates，Inc.and John Wiley & Sons，Inc.，New York，6.3.1-6.3.6页和2.10.3)。本发明还包括编码这些抗体的核酸分子。

本领域公知具有相同氨基酸序列的多肽、其片段或变体通常有相似的结构和许多相同的生物活性。从而，在一个实施方案中，免疫特异结合C35多肽或者其片段或C35多肽的变体的抗体(包括包含或者备选地，由抗体片段或其变体组成的分子)包含，或者备选地由VH区组成，所述VH区的氨基酸序列与SEQ ID NOs：56或60或者表2或表3中提及的核酸编码的VH区的氨基酸序列有至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少99％同一性。

在另一实施方案中，免疫特异结合C35多肽或者其片段或C35多肽的变体的抗体(包括包含或者备选地，由抗体片段或其变体组成的分子)包含，或者备选地由VL区组成，所述VH区的氨基酸序列与SEQID NO：58或者表2或表3中提及的核酸编码的VL区的氨基酸序列有至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少99％同一性。

本发明还包括与本文描述的一种或多种抗体有一种或多种相同的生物学特征的抗体(包括包含或者备选地，由抗体片段或其变体组成的分子)。“生物学特征”指抗体的体外或体内活性或性质，例如，结合C35多肽(例如，细胞凋亡期间在细胞表面上表达的C35多肽)的能力；基本上抑制或消除C35多肽介导的生物活性的能力；杀死C35-结合的癌细胞(例如，治疗或诊断C35相关的癌症)；或者检测C35的能力；抑制或者消除C35多肽介导的生物活性的能力。任选地，本发明的抗体将与本文特别提及的至少一种抗体结合相同的表位。此类表位结合可以用本领域已知的测定法常规地测定。

下面关于产生来自表2中提及的核酸编码的小鼠VH和VL区的人源化抗体描述的规则也可以用于产生抗体变体，其包含SEQ ID NOs：56、58、或60编码的或者表3中提及的核酸编码的人VH和/或VL区。

本发明的人源化免疫球蛋白和人抗体变体具有基本上来自人免疫球蛋白(称作接纳体免疫球蛋白)的可变构架区，和基本上来自表2中克隆编码的小鼠C35VH和VL区的CDRs或者来自表3中克隆编码的人C35VH和VL区的CDRs(称作供体免疫球蛋白)。恒定区(如果存在)也基本上来自人免疫球蛋白。人源化抗体和人抗体变体显示出对C35的特异结合亲和力为至少10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁴、10⁸、10⁹或者10¹⁰M^-1。通常，人源化抗体和人抗体变体的结合亲和力的上限为小鼠抗体1F2或者1B3或者人抗体MAbc009，或者抗体MAb 165或MAb 171的结合亲和力的上限的3、4、5或10倍以内。通常，结合亲和力的下限也为小鼠抗体1F2或者1B3或者人抗体MAbc009，或者抗体MAb 165或MAb 171的结合亲和力的下限的3、4、5或10倍以内。优选的人源化免疫球蛋白和人抗体变体与小鼠抗体1F2或者1B3或者人抗体MAbc009，或者抗体MAb 165或MAb 171竞争结合C35并且防止C35结合各自小鼠或者人抗体。

可能的人接纳体抗体的重链和轻链可变区由Kabat，Sequencesof Proteins of Immunological Interest (National Institutes ofHealth，Bethesda，Md.，1987 and 1991)描述。选择人接纳体抗体使得它的可变区显示出与小鼠C35抗体的可变区的高度序列同一性。重链和轻链可变构架区可以来自相同或者不同的人抗体序列。人抗体序列可以是天然发生的人抗体的序列或者可以是一些人抗体的共有序列。

可以如下进行人源化免疫球蛋白的设计。当氨基酸落入下面的类别时，待使用的人免疫球蛋白的构架氨基酸(接纳体免疫球蛋白)可以由来自提供CDR的非人免疫球蛋白(供体免疫球蛋白)的构架氨基酸替代：

(a)接纳体免疫球蛋白的人构架区中的氨基酸对于人免疫球蛋白在该位置是罕见的，而供体免疫球蛋白中对应氨基酸对于该位置中的人免疫球蛋白是典型的；

(b)该氨基酸的位置与CDRs之一紧密相邻；或者

(c)该氨基酸能够与CDR相互作用(见，Queen et al.WO92/11018.，和Co et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88，2869(1991)，将它们都引入本文作为参考)。关于产生人源化免疫球蛋白的详细描述，见Queen et al.和Co et al。

通常，人源化抗体和人抗体变体中的CDR区基本上相同，更通常地，与它们所源自的小鼠或者人抗体中对应CDR区相同。尽管不是通常希望的，但是有时可以进行CDR残基的一个或多个保守氨基酸替代而不明显地影响所得人源化免疫球蛋白或者人抗体变体的结合亲和性。偶然地，CDR区的替代可以增强结合亲和性。

除了上面讨论的特定氨基酸替代，人源化免疫球蛋白和人抗体变体的构架区通常是基本上相同的，更通常地，与它们所源自的人抗体(接纳体免疫球蛋白)的构架区相同。当然，构架区中的许多氨基酸对于抗体的特异性或者亲和性很少有或者没有贡献。从而，可以耐受构架区残基的许多个别的保守替代而不明显改变所得人源化免疫球蛋白或者人抗体变体的特异性或者亲和性。

例如，HuZAF的类似物显示出与HuZAF的显著的氨基酸序列同一性。类似物的重链和轻链可变区由核苷酸序列编码，所述核苷酸序列在严紧条件下与编码HuZAF的重链或轻链可变区的核酸，或者其简并形式杂交。噬菌体展示技术提供了选择此类保留结合亲和性和特异性的类似物的技术(见，例如，Dower et al.，WO 91/17271；McCaffertyet al.，WO 92/01047；和Huse，WO 92/06204(它们每一个都为了所有目的完整引入本文参考))。

表2或3的核酸克隆中的VH和VL基因或者SEQ ID NO：56、58或60可以用于根据US 2002 0123057A1，“In vitro methods ofproducing and identifying immunoglobulin molecules ineukaryotic cells，”(2002年9月5日公布)教导的方法选择对C35特异的完全人抗体。简言之，连接人CH的小鼠(或者人)VH用于从此类轻链文库选择完全人免疫球蛋白轻链，其当与小鼠(或者人)VH配对时赋予对C35的特异性。然后将所选的完全人免疫球蛋白轻链用于从此类重链的文库选择完全人免疫球蛋白重链，其当与人轻链配对时赋予对C35的特异性。类似地，与人CL连接的小鼠(或人)VL可以用于从此类重链的文库选择完全人免疫球蛋白重链，其当与小鼠(或者人)VL配对时赋予对C35的特异性。然后将所选的完全人免疫球蛋白重链用于从此类轻链文库选择完全人免疫球蛋白轻链，其当与完全人重链配对时赋予对C35的特异性。通常，以该方式选择的完全人抗体具有表位特异性，其与最初小鼠(或者人)C35-特异抗体的表位特异性相同或者密切相关。

US 2002 0123057 A1的方法还可以用于轻链或重链文库，其所有成员都有一个或多个非人(例如，小鼠)CDR。在一个实例中，该文库的每个成员包含来自对C35特异的分离的鼠单克隆抗体(例如，1F2或者1B3)的CDR3区。

本发明包括通过使用US 2002 0123057 A1的方法以SEQ ID NO：56、58或60的核酸或者表2或3中提及的核酸编码的免疫球蛋白重链或轻链可变区开始选择的所有完全人抗体或者具有一个或多个非人(例如，小鼠)CDR的抗体(包括包含，或者备选地由其抗体片段或者变体组成的分子)。

如上述产生的人源化抗体或者人抗体变体的可变片段通常连接到免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常人免疫球蛋白恒定区的至少一部分。人恒定区DNA序列可以根据公知的步骤从多种人细胞，如永生的B细胞分离(见Kabat et al.，上文，和WO 87/02671)。抗体可以含有轻链和重链恒定区。重链恒定区可以包括CH1、铰链区、CH2、CH3，和有时包括CH4区。对于治疗目的，可以缺失或者省略CH2结构域。

人源化抗体或者人抗体变体包括具有所有类型的恒定区的抗体，包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE、和任意同种型，包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。当希望人源化抗体或者人抗体变体显示出细胞毒性活性时，恒定结构域可以通常是补体-结合的恒定区并且该类别通常是IgG1。当不希望此类细胞毒性活性时，恒定结构域可以是IgG2类别。人源化抗体或者人抗体变体可以包含来自一种以上的类别或同种型的序列。

本发明还包括嵌合抗体。此类抗体可以包含SEQ ID NO：56、58或60的核酸或者表2或3中提及的核酸编码的VH区和/或VL区，其融合到另一物种，如人或小鼠或马等等的CH区和/或CL区。在优选实施方案中，嵌合抗体包含表2的核酸编码的VH和/或VL区，其融合到人C区。当抗体用于治疗目的时，可以缺失人CH2结构域。嵌合抗体包含如上述的抗体片段。

嵌合抗体的可变片段通常连接到免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常人免疫球蛋白恒定区的至少一部分。人恒定区DNA序列可以根据公知的步骤从多种人细胞，如永生的B细胞分离(见Kabat et al.，上文，和WO 87/02671)。抗体可以含有轻链和重链恒定区。重链恒定区可以包括CH1、铰链区、CH2、CH3，和有时包括CH4区。对于治疗目的，可以缺失或者省略CH2结构域。

如上述产生的嵌合抗体的可变片段通常连接到免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常人免疫球蛋白恒定区的至少一部分。人恒定区DNA序列可以根据公知的步骤从多种人细胞，如永生的B细胞分离(见Kabat etal.，上文，和WO 87/02671)。抗体可以含有轻链和重链恒定区。重链恒定区可以包括CH1、铰链区、CH2、CH3，和有时包括CH4区。对于治疗目的，可以缺失或者省略CH2结构域。

嵌合抗体可以包括具有所有类型的恒定区的抗体，包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE、和任意同种型，包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。当希望嵌合抗体显示出细胞毒性活性时，恒定结构域通常是补体-结合的恒定区并且该类别通常是IgG1。当不希望此类细胞毒性活性时，恒定结构域可以是IgG2类别。嵌合抗体可以包含来自一种以上的类别或同种型的序列。

多种方法可以用于产生此类免疫球蛋白。由于遗传密码简并性，多种核酸序列编码每种免疫球蛋白氨基酸序列。可以通过从头固相DNA合成或者通过所希望的多核苷酸的较早制备的变体的PCR诱变产生所希望的核酸序列。编码本申请中描述的抗体的所有核酸都明确地包括在本发明内。

一旦表达，本发明的完整抗体、它们的二聚体、单独的轻链和重链或者其他免疫球蛋白形式可以根据本领域的标准方法纯化，所述方法包括硫酸铵沉淀、亲和柱、柱层析、凝胶电泳等等(一般见，Scopes，R.，Protein Purification，Springer-Verlag，N.Y.(1982)，将其引入本文作为参考)。对于制药目的，优选至少约90到95％同质性的基本上纯的免疫球蛋白，最优选98到99％或者更高同质性的免疫球蛋白。一旦部分纯化或者纯化到所希望的同质性，就可以将所述多肽治疗性(包括体外)地用于开发或者进行测定步骤、免疫荧光染色等等(一般见，Immunological Methods，Vols.I and II，Lefkovitsand Pernis，eds.，Academic Press，New York，N.Y.(1979和1981)，或者检测C35或者诊断C-35相关的癌症。

本发明还提供了融合蛋白，其包含或者备选地，由免疫特异结合C35多肽的抗体(包括包含或者备选地，由其抗体片段和变体组成)和异源多肽组成。优选地，该抗体融合的异源多肽用于发挥功能或者用于靶定表达C35多肽的细胞，包括但不限于，乳腺、卵巢、膀胱、结肠和胰腺癌细胞，和黑素瘤细胞。在备选优选的实施方案中，抗体所融合的异源多肽用于T细胞、巨噬细胞，和/或单核细胞功能或者用于将抗体靶定T细胞、巨噬细胞或者单核细胞。在一个实施方案中，本发明的融合蛋白包含或者备选由具有本发明抗体的任意一个或多个VH区的氨基酸序列或者本发明抗体的任意一个或多个VL区的氨基酸序列的多肽或者其片段或者变体，和异源多肽序列组成。在另一实施方案中，本发明的融合蛋白包含或者备选由具有本发明抗体的任意1、2、3或多个VH CDRs的氨基酸序列或者本发明抗体的任意1、2、3或多个VL CDRs的氨基酸序列的多肽或者其片段或者变体，和异源多肽序列组成。在优选实施方案中，融合蛋白包含，或者备选由具有本发明抗体的VH CDR3的氨基酸序列的多肽，或者其片段或变体，和异源多肽序列组成，所述融合蛋白免疫特异结合C35多肽。在另一实施方案中，融合蛋白包含，或者备选由具有本发明抗体的至少一个VH区的氨基酸序列和本发明抗体的至少一个VL区的氨基酸序列或者其片段或变体，和异源多肽序列组成。优选地，融合蛋白的VH和VL区对应于本发明的一种抗体(或者scFv或者Fab片段)。在再一个实施方案中，本发明的融合蛋白包含或者备选由本发明抗体的任意1、2、3或多个VH CDRs的氨基酸序列和本发明抗体的任意1、2、3或多个VL CDRs的氨基酸序列的多肽或者其片段或者变体，和异源多肽序列组成。优选地，2、3、4、5、6、或者多个VHCDR(s)或VLCDR(s)对应于本发明的单个抗体(或者scFv或者Fab片段)。本发明还包括编码这些融合蛋白的核酸分子。

如下文更详细讨论的，本发明的抗体可以单独或者与其他组分组合使用。抗体还可以在N-或者C-末端重组融合到异源多肽或者化学缀合(包括共价和非共价缀合)到多肽或者其他组分。例如，本发明的抗体可以重组融合到或者缀合到用作检测测定法中的标记的分子或者效应分子，如异源多肽、药物、放射性核素或者毒素。见，例如，PCT公开WO 92/08495；WO 91/14438；WO 89/12624；美国专利号5,314,995；和EP 396,387。

作为另一非限制性实例，可以将本发明的抗体作为被动免疫的形式施用于个体。备选地，本发明的抗体可以用于表位作图以鉴定该抗体结合的表位。以该方法鉴定的表位又例如，可以用作疫苗候选物，即，免疫个体以引起针对天然发生的形式的C35的抗体，其用于治疗方法。

本发明的抗体可以作为C35多肽的激动剂或者拮抗剂。

本发明的抗体可以用于例如，但不限于，纯化、检测和靶定本发明的多肽，包括体外和体内诊断和治疗方法。例如，抗体可以用于免疫测定中以定性和定量地测量生物样品中本发明多肽的水平。见，例如，Harlow et al.，Antibodies：A Laboratory Manual，(Cold SpringHarbor Laboratory Press，2nd ed.1988)(将其完整引入本文作为参考)。

本发明的抗体包括经修饰的衍生物，即通过将任意类型的分子共价连接到所述抗体使得该共价连接不防止该抗体产生抗独特型反应或者结合C35。例如，但不限于，抗体衍生物包括经修饰的抗体，所述修饰为例如糖基化、乙酰化、PEG化、phosphylation、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/封闭基团衍生、蛋白酶切、连接到细胞配体或其他蛋白质，等等。可以通过已知技术进行多种化学修饰的任一种修饰，所述技术包括但不限于特异化学切割、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成，等等。此外，衍生物可以含有一种或多种非典型的氨基酸。

本发明的抗体可以由通过肽键或者修饰的肽键相互连接的氨基酸，即肽等排物组成，并且可以含有不同于20种基因编码的氨基酸的氨基酸。C35抗体可以通过天然过程，如翻译后加工，或者通过本领域公知的化学修饰技术进行修饰。此类修饰在基本教科书和在更详细的专著，以及在大部头研究文献中详细描述。修饰可以在C35抗体的任何地方，包括肽主链、氨基酸侧链和氨基或羧基末端发生。将理解在给定C35抗体中一些位点可以以相同或者不同程度存在相同类型的修饰。而且，给定C35抗体可以含有许多类型的修饰。C35抗体可以例如由于遍在蛋白化而分枝，并且它们可以是环状的，有或者没有分枝。环状、分枝的和分枝的环状C35抗体可以来自翻译后天然过程或者可以通过合成方法制备。修饰包括乙酰化、酰基化、ADP-核糖基化、酰胺化、黄素的共价连接、血红素部分的共价连接、核苷酸或者核苷酸衍生物的共价连接、脂类或脂类衍生物的共价连接、磷脂酰肌醇的共价连接、交联、环化、二硫键形成、去甲基化、共价交联的形成、半胱氨酸的形成、焦谷氨酸的形成、甲酰化、γ-羧化、糖基化、GPI锚形成、羟基化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、PEG化、蛋白酶解加工、磷酸化、异戊二烯化、外消旋化、selenoylation、硫酸化、氨基酸向蛋白质的转移RNA介导的加入，如精氨酰化和遍在蛋白化。(见，例如，PROTEINS-STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES，2ndEd.，T.E.Creighton，W.H.Freeman and Company，New York(1993)；POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS.B.C.Johnson，Ed.，Academic Press，New York，pgs.1-12(1983)；Seifter et al.，Meth Enzymol 182：626-646(1990)；Rattanet al.，Ann NY Acad Sci 663：48-62(1992).)。

本发明的另一实施方案涉及包含C35抗体序列的氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列含有至少一个氨基酸替代，但是不多于50个氨基酸替代，甚至更优选地，不多于40个氨基酸替代，更优选地，不多于30个氨基酸替代，甚至更优选地，不多于20个氨基酸替代。当然，按照递增的优选性，高度优选该肽的氨基酸序列包含C35抗体序列，其含有至少1个，但是不多于10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸替代。在特定实施方案中，C35抗体序列中加入、替代和/或缺失数为1-5、5-10、5-25、5-50、10-50或50-150。对于替代，优选保守氨基酸替代。替代可以在构架区或者CDR或者两者内。

该章节中的描述适用于C35抗体和可用于本发明方法的其他抗体。此类抗体可以缀合到毒素或者与毒素复合，如本文描述，或者可以是非缀合或者非复合的。

编码C35抗体的多核苷酸

本发明还提供了编码本发明的C35抗体(包括包含或者备选由其抗体片段或变体组成的分子)的核酸分子。

本发明还包含在如上定义的严紧杂交条件或者备选地，较低严紧杂交条件下与编码抗体，优选特异结合C35多肽的抗体的多核苷酸杂交的多核苷酸。

在特定实施方案中，本发明的核酸分子编码抗体(包括包含或者备选由其抗体片段或变体组成的分子)，所述抗体包含或备选由VH区和VL区组成，VH区具有本发明的核酸编码的任一个VH区的氨基酸序列，VL区具有本发明的核酸编码的任一个VL区的氨基酸序列。在另一实施方案中，本发明的核酸分子编码抗体(包括包含或者备选由其抗体片段或变体组成的分子)，所述抗体包含或备选由VH区或VL区组成，VH区具有本发明的核酸编码的任一个VH区的氨基酸序列，VL区具有本发明的核酸编码的任一个VL区的氨基酸序列。

可以通过本领域已知的方法得到多核苷酸并且确定该多核苷酸的核苷酸序列。例如，如果抗体的核苷酸序列是已知的，那么可以从化学合成的寡核苷酸装配编码所述抗体的多核苷酸(例如，如Kutmeieret al.，BioTechniques 17：242(1994)中描述)，简言之，这包括合成含有编码所述抗体的部分序列的重叠的寡核苷酸，将那些寡核苷酸退火并连接，然后通过PCR扩增所连接的寡核苷酸。

备选地，可以从适宜来源的核酸产生编码抗体的多核苷酸。如果不能得到含有编码特定抗体的核酸的克隆，但是抗体分子的序列是已知的，那么可以化学合成或者从适宜的来源(例如，抗体cDNA文库，或者从核酸，优选聚A+RNA产生、从表达所述抗体的组织或细胞(如选择表达本发明抗体的杂交瘤细胞)分离的cDNA文库)使用与所述序列的3’和5’末端杂交的合成引物通过PCR扩增或者使用对特定基因序列特异的寡核苷酸探针(用于鉴定来自cDNA文库的编码所述抗体的cDNA克隆)通过克隆得到编码所述免疫球蛋白的核酸。然后使用本领域公知的任意方法将PCR产生的扩增的核酸克隆到可复制的克隆载体中。

一旦确定了核苷酸序列或者抗体的对应氨基酸序列，就可以使用本领域公知的用于操作核苷酸序列的技术，例如，重组DNA技术、定点诱变、PCR等等操作抗体的核苷酸序列(见，例如，Sambrook et al.，1990，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2d Ed.，ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.和Ausubelet al.，eds.，1998，Current Protocols in Molecular Biology，JohnWiley & Sons，NY中描述的技术，将这些文献完整引入本文作为参考)，以产生具有不同氨基酸序列的抗体，例如，产生氨基酸替代、缺失和/或插入。

在特定实施方案中，可以检查重链和/或轻链可变结构域的氨基酸序列，通过本领域公知的方法来鉴定互补决定区域(CDR)的序列，例如，通过比较其他重链和轻链可变区的已知氨基酸序列来确定序列高变区。使用常规重组DNA技术，可以将一个或多个CDR插入构架区内，例如，插入人构架区以人源化非人抗体，如上述。构架区可以是天然发生的或者是共有构架区，并且优选是人构架区(关于人构架区列表，见，例如，Chothia et al.，J.Mol.Biol.278：457-479(1998))。优选地，通过组合构架区和CDR产生的多核苷酸编码特异结合C35的抗体。优选地，如上文讨论，可以在构架区中进行一个或多个氨基酸替代，并且优选地，所述氨基酸替代提高了该抗体与其抗原的结合。此外，此类方法可以用于对参与链内二硫键的一个或多个可变区半胱氨酸残基进行氨基酸缺失或替代以产生缺少一个或多个链内二硫键的抗体分子。对多核苷酸的其他改变被本发明包括并且在本领域技术范围内。

此外，可以使用用于产生“嵌合抗体”而开发的技术(Morrison etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.81：851-855(1984)；Neuberger et al.，Nature 312：604-608(1984)；Takeda et al.，Nature 314：452-454(1985))，该技术将来自具有合适抗原特异性的小鼠抗体分子的基因与来自具有适宜生物活性的人抗体分子的基因剪接产生所述嵌合抗体。如上文描述的，嵌合抗体是这样的分子，其中不同部分来自不同动物物种，如具有来自鼠mAb的可变区和人免疫球蛋白恒定区的分子，例如，人源化抗体。

备选地，所描述的用于产生单链抗体的技术(美国专利号4,946,778；Bird，Science 242：423-42(1988)；Huston et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883(1988)；和Ward et al.，Nature334：544-54(1989))可以适用于产生单链抗体。通过将Fv区的重链和轻链片段通过氨基酸桥连接，得到单链多肽，可以形成单链抗体。也可以使用用于大肠杆菌中功能Fv片段的装配的技术(Skerra et al.，Science 242：1038-1041(1988))。

本发明还提供了编码本发明抗体(包括包含或者备选由其抗体片段或变体组成的分子)的核酸分子。在特定实施方案中，本发明的核酸分子编码抗体(包括包含或者备选由其抗体片段或变体组成的分子)，该抗体包含或者备选由VH区和VL区组成，其中VH区具有SEQID NO：56或60的核酸或者表2或3中提及的核酸编码的任意一个VH区的氨基酸序列，VL区具有SEQ ID NO：58的核酸或者表2或3中提及的核酸编码的任意一个VL区的氨基酸序列。在另一实施方案中，本发明的核酸分子编码抗体(包括包含或者备选由其抗体片段或变体组成的分子)，该抗体包含或者备选由VH区或VL区组成，其中VH区具有SEQ ID NO：56或60的核酸或者表2或3中提及的核酸编码的任意一个VH区的氨基酸序列，VL区具有SEQ ID NO：58的核酸或者表2或3中提及的核酸编码的任意一个VL区的氨基酸序列。

本发明还提供了包含或者由本文描述的抗体分子(例如，VH区和/或VL区)的变体(包括衍生物)组成的抗体，所述抗体免疫特异结合C35多肽或者其片段或变体。本领域技术人员已知的标准技术可以用于在编码本发明分子的核苷酸序列中导入突变，所述技术包括，例如，定点诱变和PCR介导的诱变，其导致氨基酸替代。优选地，相对于参考VH区、VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、和/或VL区、VLCDR1、VLCDR2、或VLCDR3，变体(包括衍生物)编码小于50个氨基酸替代、小于40个氨基酸替代、小于30个氨基酸替代、小于25个氨基酸替代、小于20个氨基酸替代、小于15个氨基酸替代、小于10个氨基酸替代、小于5个氨基酸替代、小于4个氨基酸替代、小于3个氨基酸替代或小于2个氨基酸替代。“保守氨基酸替代”是这样的替代，其中将氨基酸残基用具有相似电荷的侧链的氨基酸残基替代。具有相似电荷的侧链的氨基酸的家族已经在本领域中确定。这些家族包括碱性侧链氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电的极性侧链氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分枝侧链的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。备选地，可以沿着编码序列的全部或者部分随机导入突变，例如，通过饱和诱变，并且可以对所得突变体筛选生物活性以鉴定保持活性(例如，结合C35多肽的能力)的突变体。

例如，可能仅在抗体分子的构架区或者仅在CDR区或者两个区中导入突变。所导入的突变可以是沉默的或者中性错义突变，即对抗体结合抗原的能力没有，或者有很小的影响。这些类型的突变可以用于优化密码子利用，或者提高杂交瘤的抗体产生。备选地，非中性错义突变可以改变抗体结合抗原的能力。多数沉默和中性错义突变的位置可能在构架区中，而多数非中性错义突变的位置可能在CDR，尽管这不是绝对的要求。本领域技术人员将可以设计和测试突变分子的所希望的性质，如抗原结合活性没有改变或者结合活性的改变(例如，抗原结合活性的提高或者抗体特异性的改变)。诱变后，所编码的蛋白质可以常规表达并且所编码蛋白质的功能和/或生物活性(例如，免疫特异结合C35多肽的能力)可以使用本文描述的技术或者通过本领域已知的常规修饰技术确定。

在特定实施方案中，免疫特异结合C35多肽或者其片段或变体的本发明的抗体(包括包含或者备选地，由抗体片段或其变体组成的分子)包含，或者备选地，由核苷酸序列编码的氨基酸序列组成，所述核苷酸序列在严紧条件下与和编码SEQ ID NOs：56、58或60的或者表2或表3中提及的核酸编码的VH或VL区之一的核苷酸序列互补的核苷酸序列杂交，例如，在高度严紧条件下，在6×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中约45℃下与膜结合的DNA杂交，然后在0.2xSSC/0.1％ SDS中约50-65℃下洗涤1次或多次，例如，在6xSSC中约45℃下与膜结合的核酸杂交，然后在0.1xSSC/0.2％SDS中约68℃下洗涤1次或多次，或者在本领域技术人员已知的其他严紧杂交条件下杂交(见，例如，Ausubel，F.M.et al.，eds.，1989，Current Protocols inMolecular Biology，Vol.I，Green Publishing Associates，Inc.and John Wiley & Sons，Inc.，New York，6.3.1-6.3.6页和2.10.3)。本发明还包括编码这些抗体的核酸分子。

注意到上面条件的改变可以通过包括和/或替代用于抑制杂交实验中背景的备选封闭试剂来完成。典型的封闭试剂包括Denhardt′s试剂、BLOTTO、肝素、变性的鲑精DNA，和通过商业途径可得到的专利制剂。由于相容性问题，特定封闭试剂的包括可能需要修饰上述杂交条件。

当然，仅与多聚A+序列，或者与T(或者U)残基的互补序列杂交的多核苷酸将不包括在“多核苷酸”的定义中，因为此类多核苷酸将与含有一段多聚(A)或者其互补序列的核酸分子(例如，使用寡聚dT作为引物产生的几乎任意双链DNA克隆)杂交。

C35抗体多核苷酸可以由任意聚核糖核苷酸或者聚脱氧核糖核苷酸组成，其可以是未修饰的RNA或者DNA或者修饰的RNA或者DNA。例如，C35抗体多核苷酸可以由单链和双链DNA、单链和双链区混合的DNA、单链和双链RNA，和单链和双链区混合的RNA、包含DNA和RNA(其可以是单链的，更通常为双链的，或者为单链和双链区的混合物)的杂合分子组成。此外，C35抗体多核苷酸可以由三链区组成，该三链区包含RNA或者DNA或者RNA和DNA。为了稳定或者其他原因，C35抗体多核苷酸还可以含有一个或多个修饰的碱基或者经修饰的DNA或者RNA主链。“修饰的”碱基包括，例如，三苯甲基化碱基和罕见碱基，如肌苷。可以对DNA和RNA进行多种修饰；从而“多核苷酸”包括化学、酶促或者代谢修饰的形式。

可以通过本领域已知的任意方法产生本发明的抗体(包括抗体片段或变体)。例如，将明白根据本发明的抗体可以在不同于杂交瘤细胞系的细胞系中表达。例如，编码cDNA的序列或者特定抗体的基因组克隆可以用于转化适宜的哺乳动物或者非哺乳动物宿主细胞或者产生噬菌体展示文库。此外，本发明的多肽抗体可以化学合成或者通过使用重组表达系统产生。

产生本发明抗体的一种方法是克隆SEQ ID NO：56、58或60的多核苷酸或者表2或3中提及的多核苷酸的任意一种或多种编码的VH和/或VL区。为了从杂交瘤细胞系或者核酸分离VH和VL区，可以使用包括VH或者VL核苷酸序列的PCR引物来扩增含有SEQ ID NOs：56、58或60或者表2或3中的核酸的载体中所含的VH和VL序列。然后可以使用载体克隆PCR产物，所述载体例如有PCR产物克隆位点，该克隆位点由5’和3’单个T核苷酸突出端组成，所述突出端与通过用于PCR反应的许多DNA聚合酶加入PCR产物的5’和3’的突出的单个腺嘌呤核苷酸互补。然后可以用本领域已知的常规方法对VH和VL区测序。

克隆的VH和VL基因可以置于一个或多个适宜的表达载体中。作为非限制性实例，可以用PCR引物扩增VH或者VL序列，所述引物包括VH或者VL核苷酸序列、限制性位点和保护限制性位点的侧翼序列。利用本领域技术人员已知的克隆技术，可以将PCR扩增的VH区克隆到载体中，其中所述载体表达适宜的免疫球蛋白恒定区，例如，VH区的人IgG1或者IgG4恒定区，和κ和λVL区的人κ或λ恒定区。优选地，表达VH或者VL区的载体包含适于在所选表达系统中指导重链和轻链表达的启动子、分泌信号、免疫球蛋白可变结构域的克隆位点、免疫球蛋白恒定结构域和选择标记，如新霉素选择标记。VH和VL区还可以克隆到表达必要恒定区的单个载体。然后使用本领域技术人员已知的技术(见例如，Guo et al.，J.Clin.Endocrinol.Metab.82：925-31(1997)，和Ames et al.，J.Immunol.Methods 184：177-86(1995)，将它们完整引入本文作为参考)将重链转化载体和轻链转化载体共转染到细胞系中以产生表达全长抗体，例如IgG的稳定或瞬时细胞系。

本发明还提供了多核苷酸，其包含编码本发明的抗体和其片段的核苷酸序列。本发明还包含多核苷酸，其在如上文定义的严紧或者较低严紧的杂交条件下与编码抗体，优选特异结合本发明多肽的抗体，优选结合具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽或者所保藏的克隆编码的多肽的抗体的多核苷酸杂交。

对于一些用途，例如对于本发明抗体的体外亲和性成熟，有用的是在噬菌体展示文库中将本发明的一种或多种抗体的重链和轻链的VH和VL区表达为单链抗体或者Fab片段。例如，使用噬菌体展示文库，可以以所有可能的组合表达编码本发明的一种或多种抗体的VH和VL区的cDNA，允许选择VH/VL组合，该组合以优选的结合特征(如提高的亲和性或者提高的解离速率)结合C35多肽。此外，本发明的一种或多种抗体的VH和VL片段、VH和VL区的CDR区尤其可以在体外突变。具有“突变的”CDR的VH和VL区在噬菌体展示文库中的表达允许选择VH/VL组合，该组合以优选的结合特征(如提高的亲和性或者提高的解离速率)结合C35多肽受体多肽。

在噬菌体展示方法中，功能抗体结构域展示在噬菌体克隆的表面，所述噬菌体颗粒携带编码所述结构域的多核苷酸序列。具体地，从动物cDNA文库(例如，淋巴组织的人或者鼠cDNA文库)或者合成的cDNA文库扩增编码VH和VL区的DNA序列。编码VH和VL区的DNA通过PCR方法通过scFv连接体连接在一起并克隆到噬菌粒载体(例如，pCANTAB6或者pComb 3 HSS)。载体在大肠杆菌中电穿孔并且用辅助噬菌体感染大肠杆菌。用于这些方法的噬菌体通常是丝状噬菌体，包括fd和M13，并且VH和VL区通常与噬菌体基因III或者基因VIII重组融合。可以用抗原选择或鉴定表达结合目的抗原(即，C35多肽或者其片段)的抗原结合结构域的噬菌体，例如用标记的抗原或者结合或者捕获到固体表面或者珠子的抗原。可用于制备本发明抗体的噬菌体展示方法的实例包括，但不限于，在Brinkman et al.，J.Immunol.Methods182：41-50(1995)；Ames et al.，J.Immunol.Methods 184：177-186(1995)；Kettleborough et al.，Eur.J.Immunol.24：952-958(1994)；Persic et al.，Gene 187 9-18(1997)；Burton et al.，Advances in Immunology 57：191-280(1994)；PCT申请号PCT/GB91/01134；PCT公开WO 90/02809；WO 91/10737；WO 92/01047；WO 92/18719；WO 93/11236；WO 95/15982；WO 95/20401；WO97/13844；和U.S.Patent Nos.5,698,426；5,223,409；5,403,484；5,580,717；5,427,908；5,750,753；5,821,047；5,571,698；5,427,908；5,516,717；5,780,225；5,658,727；5,735,743和5,969,108中公开的方法，将这些参考文献的每一个都完整引入本文作为参考。

备选地，用于增加本发明抗体的亲和性的优选方法公开在US 20020123057 A1中。

此外，可以使用用于产生“嵌合抗体”而开发的技术(Morrison etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.81：851-855(1984)；Neuberger et al.，Nature 312：604-608(1984)；Takeda et al.，Nature 314：452-454(1985))，该技术将来自具有合适抗原特异性的小鼠抗体分子的基因与来自具有适宜生物活性的人抗体分子的基因剪接产生所述嵌合抗体。如上文描述的，嵌合抗体是这样的分子，其中不同部分来自不同动物物种，如具有来自鼠mAb的可变区和人免疫球蛋白恒定区的分子，例如，人源化抗体。

备选地，所描述的用于产生单链抗体的技术(美国专利号4,946,778；Bird，Science 242：423-42(1988)；Huston et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883(1988)；和Ward et al.，Nature334：544-54(1989))可以适用于产生单链抗体。通过将Fv区的重链和轻链片段通过氨基酸桥连接，得到单链多肽，可以形成单链抗体。也可以使用用于大肠杆菌中功能Fv片段的装配的技术(Skerra et al.，Science 242：1038-1041(1988))。

抗体结合的测定法

可以通过本领域已知的任意方法测定本发明抗体的免疫特异结合。可以使用的免疫测定包括但不限于竞争和非竞争测定系统，使用诸如蛋白质印迹、放射免疫测定、ELISA(酶联免疫吸附测定)、“三明治”免疫测定、免疫沉淀测定、沉淀反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散测定、凝集测定、补体结合测定、免疫放射测定、荧光免疫测定、蛋白A免疫测定，等等。此类测定是本领域常规和公知的(见，例如，Ausubel et al，eds，1994，Current Protocols in MolecularBiology，Vol.1，John Wiley & Sons，Inc.，New York，将其完整引入本文作为参考)。下面简要描述代表性免疫测定(但是意在作为示例)。

免疫沉淀方案通常包括在补加蛋白质磷酸酶和/或蛋白酶抑制剂(例如，EDTA、PMSF、抑肽酶、钒酸钠)的裂解缓冲液中裂解细胞群体，所述裂解缓冲液为诸如RIPA缓冲液(1％NP-40或Triton X-100，1％去氧胆酸钠，0.1％SDS，0.15M NaCl，0.01M磷酸钠，pH 7.2，1％Trasylol)，向细胞裂解物中加入目的抗体，在4℃孵育一定时间(例如1-4小时)，向细胞裂解物中加入蛋白A和/或蛋白Gsepharose珠，在4℃孵育约1小时或以上，在裂解缓冲液中洗涤珠子，并在SDS/样品缓冲液中重悬浮珠子。目的抗体免疫沉淀特定抗原的能力可以通过例如蛋白质印迹分析评估。本领域技术人员将理解这样的参数，可以修改这些参数以增加抗体对抗原的结合和降低背景(例如，用sepharose珠子预清除细胞裂解物)。关于免疫沉淀方案的进一步讨论，见，例如，Ausubel et al，eds，1994，Current Protocols inMolecular Biology，Vol.1，John Wiley & Sons，Inc.，New York的10.16.1。

蛋白质印迹分析通常包括制备蛋白质样品，在聚丙烯酰胺凝胶(例如，8％-20％SDS-PAGE，取决于抗原的分子量)中电泳蛋白质样品，将蛋白质样品从聚丙烯酰胺凝胶转移到膜，如硝酸纤维素、PVDF或者尼龙，在封闭溶液中封闭膜(例如，含有3％BSA或者脱脂奶的PBS)，用洗涤缓冲液(例如，PBS-Tween 20)洗涤膜，用在封闭缓冲液中稀释的一级抗体(目的抗体)封闭膜，在洗涤缓冲液洗涤膜，用在封闭缓冲液中稀释的缀合酶底物(例如，辣根过氧化物酶或者碱性磷酸酶)或者放射性分子(例如，³²P或者¹²⁵I)的二级抗体(其识别一级抗体，例如，抗-人抗体)封闭膜，在洗涤缓冲液中洗涤膜，并检测所述抗原的存在。本领域技术人员将理解可以修改用以增强所检测的信号和减小背景噪声的参数。关于蛋白质印迹方案的进一步讨论，见，例如，Ausubel et al，eds，1994，Current Protocols in Molecular Biology，Vol.1，John Wiley & Sons，Inc.，New York的10.8.1。

ELISA包括制备抗原，用该抗原包被96孔微量滴定板的孔，向孔中加入缀合可检测的化合物，如酶促底物(例如，辣根过氧化物酶或者碱性磷酸酶)的目的抗体，并孵育一定时间，检测所述抗原的存在。在ELISA中，目的抗体不用必须缀合到可检测的化合物；或者，可以向孔中加入缀合可检测化合物的二级抗体(其识别目的抗体)。此外，可以用抗体包被孔，来代替用抗原包被孔。在该情况下，可以在向包被的孔加入目的抗原后，加入缀合到可检测化合物的二级抗体。本领域技术人员将理解可以修改后增强检测的参数以及本领域已知的ELISA的其他变量。关于ELISA的进一步讨论，见，例如，Ausubel etal，eds，1994，Current Protocols in Molecular Biology，Vol.1，John Wiley & Sons，Inc.，New York的11.2.1。

可以通过竞争结合测定法测定抗体对抗原的结合亲和性和抗体-抗原相互作用的解离速率。竞争结合测定的一个实例是放射免疫测定，其包括在数量逐渐增加的未标记抗原的存在下孵育标记的抗原(例如，³H或者¹²⁵I)与目的抗体，并检测与标记的抗原结合的抗体。目的抗体对特定抗原的亲和性和结合解离速率可以从斯卡查德图(scatchardplot)分析的数据确定。还可以使用放射免疫测定法确定与第二种抗体的竞争。在该情况中，在数量逐渐增加的未标记的第二种抗体的存在下，将抗原与缀合标记的化合物(例如，³H或者¹²⁵I)的目的抗体孵育。

单克隆抗体(Mab)与特异抗原的亲和性和动力学的表征可以用于探测抗体或者抗原的结构和功能。动力学测量在用于免疫测定的适宜试剂的选择中也是重要的。

有多种方法可用于测量抗体-抗原相互作用的亲和性，但是相对少的方法可以用于确定速率常数。多数方法依赖标记抗体或者抗原，其不可避免地使得常规测量复杂化并且在所测量的量中引入了不确定性。

在BIAcore上进行的表面等离子体共振(SPR)相对于测量抗体-抗原作用的亲和性的常规方法提供了许多优点：(i)不需要标记抗体或抗原；(ii)抗体不必预先纯化，细胞培养上清液可以直接使用；(iii)能够进行实时测量，允许快速半定量比较不同的单克隆抗体相互作用，并且实时测量对于许多评估目的是足够的；(iv)可以再生生物特异表面使得可以在相同条件下容易地比较一系列不同的单克隆抗体；(v)分析步骤完全自动化，并且不用用户干预就可以进行广泛系列的测量。BIAapplications Handbook，版本AB(再版1998)，BIACORE code No.BR-1001-86；BIAtechnology Handbook，版本AB(再版1998)，BIACORE code No.BR-1001-84。

基于SPR的结合研究需要结合对的一个成员固定在传感器表面上。所固定的结合配偶体称作配体。溶液中的结合配偶体称作分析物。在一些情况中，配体通过另一固定的分子(称作捕获分子)间接附着到表面。SPR反应反映了检测器表面由于分析物结合或者解离引起的质量浓度的改变。

基于SPR，实时BIAcore测量直接监视发生的相互作用。该技术很适合确定动力学参数。比较亲和性等级评定非常容易进行，并且可以从sensorgram数据得到动力学和亲和常数。

当分析物以不连续脉冲注射穿过配体表面时，可以将所得sensorgram分成三个基本阶段：(i)在样品注射期间分析物与配体的结合；(ii)样品注射期间的平衡或者稳态，其中分析物结合速率受到从复合物解离的平衡；(iii)缓冲液流动期间分析物从表面的解离。

结合和解离期提供了关于分析物-配体相互作用的动力学的信息(k_a和k_d，复合物形成和解离的速率，k_d/k_a＝K_D)。平衡期提供了关于分析物-配体相互作用的亲和性的信息(K_D)。

BIAevaluation软件提供了多种功能用于通过数字积分和总体拟合算法进行曲线拟合。使用适当的数据分析，可以从简单的BIAcore研究得到相互作用的单独的速率和亲和常数。通过该技术可以测量的亲和性范围非常宽，从mM到pM。

表位特异性是单克隆抗体的重要特征。与使用放射免疫测定、ELISA或其它表面吸附方法的常规技术相比，用BIAcore进行表位作图不需要标记或者纯化的抗体，并且允许用一些单克隆抗体进行多位点特异性测试。此外，可以自动处理许多分析。

逐对结合实验测试两种MAb同时结合相同抗原的能力。针对分隔表位的MAb将独立地结合，而针对密切相关的表位的MAb将干扰相互的结合。用BIAcore进行的这些结合实验可以直接进行。

例如，可以使用捕获分子结合第一种MAb，然后顺序加入抗原和第二种MAb。Sensorgram将揭示：1.有多少抗原结合到第一种MAb，2.第二种MAb结合到表面附着的抗原的程度，3.如果第二种MAb不结合，那么改变逐对测试的顺序是否改变结果。

肽抑制是用于表位作图的另一种技术。该方法可以补充逐对抗体结合研究，并且当抗原的一级序列是已知的时候，可以将功能表位与结构特征联系起来。测试肽或者抗原片段抑制不同MAb对固定化抗原的结合。认为干扰给定MAb的结合的肽在结构上与该MAb定义的表位相关。

产生抗体的方法

可以通过本领域已知的用于合成抗体的方法，尤其通过化学合成或者优选地，通过重组表达技术制备本发明的抗体。

本发明的抗体，或者其片段、衍生物或者类似物(例如，本发明抗体的重链和轻链或者本发明的单链抗体)的重组表达可能需要构建含有编码所述抗体的多核苷酸的表达载体。一旦已经得到了编码本发明的抗体分子或者抗体的重链或轻链或者其部分(优选含有重链或者轻链可变结构域)的多核苷酸，那么可以通过重组DNA技术，使用本领域公知的技术制备用于生产所述抗体分子的载体。从而，在本文中描述了通过表达含有编码抗体的核苷酸序列的多核苷酸制备蛋白质的方法。本领域技术人员公知的方法可以用于构建表达载体，其含有抗体编码序列和适宜的转录和翻译控制信号。这些方法包括，例如，体外重组DNA技术、合成技术，和体内遗传重组。从而，本发明提供了可复制的载体，其包含有效连接启动子的核苷酸序列，该核苷酸序列编码本发明的抗体分子，或者其重链或轻链或者重链或轻链可变结构域。此类载体可以包括编码抗体分子的恒定区的核苷酸序列(见，例如，PCT公开WO 86/05807；PCT公开WO 89/01036；和美国专利号5,122,464)并且所述抗体的可变区可以克隆到此类载体中用于表达完整重链或轻链。

将表达载体通过常规技术转移到宿主细胞并通过常规技术培养转染的细胞以产生本发明的抗体。从而，本发明包括含有有效连接异源启动子的多核苷酸的宿主细胞，所述多核苷酸编码本发明的抗体，或者其重链或轻链或者本发明的单链抗体。在用于表达双链抗体的优选实施方案中，编码重链和轻链的载体可以在宿主细胞中共表达以表达完整免疫球蛋白分子，如下文详述。

多种宿主表达载体系统可以用于表达本发明的抗体分子。此类宿主表达系统代表载体，通过它可以产生目的编码序列并随后纯化，而且还代表细胞，其当用合适的核苷酸编码序列转化或者转染时，原位表达本发明的抗体分子。这些包括但不限于微生物，如细菌(例如，大肠杆菌、枯草芽孢杆菌)，其用含有抗体编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或者粘粒DNA表达载体转化；酵母(例如，糖酵母属、毕赤氏酵母属)，其用含有抗体编码序列的重组酵母表达载体转化；昆虫细胞系统，其用含有抗体编码序列的重组病毒表达载体(例如，杆状病毒)感染；植物细胞系统，其用含有抗体编码序列的重组病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)感染或者用含有抗体编码序列的重组质粒表达载体(例如，Ti质粒)转化；或者哺乳动物细胞系统(例如，COS、CHO、BIK、293、3T3细胞)，其含有重组表达构建体，该构建体含有来自哺乳动物细胞的基因组的启动子(例如，金属硫蛋白启动子)或者来自哺乳动物病毒的启动子(例如，腺病毒晚期启动子；痘苗病毒7.5K启动子)。优选地，细菌细胞，如大肠杆菌，更优选地，真核细胞，特别是用于表达完整重组抗体分子的真核细胞，用于表达重组抗体分子。例如，整合载体，如来自人巨细胞病毒的主要中等早期基因启动子元件的哺乳动物细胞，如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)是抗体的有效表达系统(Foecking et al.，Gene45：101(1986)；Cockett et al.，Bio/Technology 8：2(1990))。

在细菌系统中，可以根据待表达的抗体分子的预期用途有利地选择许多表达载体。例如，当将大量产生这种蛋白质时(为了产生抗体分子的药物组合物)，指导高水平表达容易纯化的融合蛋白产物的载体是所希望的。此类载体包括，但不限于，大肠杆菌表达载体pUR278(Ruther et al.，EMBO J.2：1791(1983))，其中抗体编码序列可以单独连接到载体中与lac Z编码区按读码框连接从而产生融合蛋白；pIN载体(Inouye & Inouye，Nucleic Acids Res.13：3101-3109(1985)；Van Heeke & Schuster，J.Biol.Chem.24：5503-5509(1989))；等等。pGEX载体还可以用于将外源多肽表达为与谷胱甘肽S转移酶(GST)的融合蛋白。通常，此类融合蛋白是可溶的并且可以通过吸附和结合到基质谷胱甘肽-琼脂糖珠，然后在游离谷胱甘肽的存在下洗脱从裂解的细胞容易地纯化。将pGEX载体设计成包括凝血酶或者因子Xa蛋白酶切割位点，从而可以从GST部分释放所克隆的靶基因产物。

在昆虫系统中，将苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)用作载体来表达外源基因。该病毒生长在草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞中。抗体编码序列可以单独克隆到病毒的非必需区(例如，多角体蛋白基因)中并置于AcNPV启动子(例如，多角体蛋白启动子)的控制下。

在哺乳动物宿主细胞中，可以利用许多基于病毒的表达系统。对于其中腺病毒用作表达载体的情况，可以将目的抗体编码序列连接到腺病毒转录/翻译控制复合体，例如，晚期启动子和三联前导序列。该嵌合基因然后可以通过体外或体内重组插入腺病毒基因组。在病毒基因组的非必需区(例如，E1或E3区)中的插入将产生这样的重组病毒，其是活的并且能够在感染的宿主中表达抗体分子。(例如，见Logan& Shenk，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：355-359(1984))。为了插入的抗体编码序列的有效翻译，还需要特异起始信号。这些信号包括ATG起始密码子和相邻序列。此外，起始密码子必需与所希望的编码序列的读框同相以确保整个插入片段的翻译。这些外源翻译控制信号和起始密码子可以是多种来源的，可以是天然的和合成的。通过包括合适的转录增强子元件、翻译终止子等等可以增强表达效率(见，Bittner et al.，Methods in Enzymol.153：51-544(1987))。

此外，可以选择调节插入序列的表达，或者以所希望的特定方式修饰和加工基因产物的宿主细胞株。蛋白质产物的此类修饰(例如，糖基化)和加工(例如，切割)对于蛋白质的功能可能是重要的。不同的宿主细胞对于蛋白质和基因产物的翻译后加工和修饰有特征性和特定的机制。可以选择适宜的细胞系或者宿主系统来确保所表达的外来蛋白质的正确修饰和加工。为此，可以使用真核宿主细胞，其具有用于正确加工初级转录物、基因产物的糖基化和磷酸化的细胞机制。此类哺乳动物宿主细胞包括但不限于CHO、VERY、BHK、Hela、COS、MDCK、293、3T3、W138，尤其乳腺癌细胞系，如BT483、Hs578T、HTB2、BT20和T47D，和正常的乳腺细胞系，如CRL7030和Hs578Bst。

为了长期、高产率地产生重组蛋白质，优选稳定表达。例如，可以工程化稳定表达抗体分子的细胞系。不使用含有病毒复制起点的表达载体，可以用通过合适的表达控制元件(例如，启动子、增强子、序列、转录终止子、多腺苷酸化位点等等)和选择性标记控制的DNA转化宿主细胞。导入外源DNA后，可以允许工程化的细胞在富集培养基中生长1-2天，然后转至选择培养基。重组质粒中的选择标记赋予对选择的抗性并允许细胞将质粒稳定整合到它们的染色体并生长形成转化灶，其又可以克隆和扩大成细胞系。该方法可以有利地用于工程化表达抗体分子的细胞系。此类工程化的细胞系尤其可以用于筛选和评估与抗体分子直接或者间接相互作用的化合物。

如上面描述的，在US 2002 0123057 A1中公开了产生单克隆抗体的优选方法。

可以使用许多选择系统，包括但不限于单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler et al.，Cell 11：223(1977))，次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(Szybalska & Szybalski，Proc.Natl.Acad.Sci.USA48：202(1992))，和腺嘌呤磷酸核糖转移酶(Lowy et al.，Cell22：817(1980))基因可以分别用于tk-、hgprt-和aprt-细胞中。而且，可以基于下面的基因选择使用抗代谢物抗性：dhfr，其赋予甲氨蝶呤抗性(Wigler et al.，Natl.Acad.Sci.USA 77：357(1980)；O′Hare et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：1527(1981))；gpt，其赋予麦考酚酸抗性(Mulligan & Berg，Proc.Natl.Acad.Sci.USA78：2072(1981))；neo，其赋予对氨基糖苷G-418的抗性(ClinicalPharmacy 12：488-505；Wu和Wu，Biotherapy 3：87-95(1991)；Tolstoshev，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32：573-596(1993)；Mulligan，Scierce 260：926-932(1993)；和Morgan和Anderson，Ann.Rev.Biochem.62：191-217(1993)；May，1993，TIB TECH11(5)：155-215)；和hygro，其赋予潮霉素抗性(Santerre et al.，Gene 30：147(1984))。重组DNA技术领域中公知的方法可以常规地用于选择所希望的重组克隆，并且此类方法描述于例如Ausubel et al.(eds.)，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley &Sons，NY(1993)；Kriegler，Gene Transfer and Expression，ALaboratory Manual，Stockton Press，NY(1990)；和12和13章，Dracopoli et al.(eds)，Current Protocols in Human Genetics，John Wiley & Sons，NY(1994)；Colberre-Garapin et al.，J.Mol.Biol.150：1(1981)，将这些文献完整引入本文作为参考。

可以通过载体扩增增加抗体分子的表达水平(综述见Bebbington和Hentschel，The use of vectors based on gene amplification forthe expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning，Vol.3.(Academic Press，New York，1987))。当表达抗体的载体系统中的标记是可扩增的时候，增加宿主细胞培养物中存在的抑制剂的水平将增加标记基因的拷贝数。因为扩增的区域与抗体基因相关，所有抗体的产量将也增加(Crouse et al.，Mol.Cell.Biol.3：257(1983))。

宿主细胞可以用本发明的两种表达载体共转染，第一种载体编码来自重链的多肽，第二种载体编码来自轻链的多肽。两种载体可以含有相同的选择性标记，其使得等量表达重链和轻链多肽。备选地，可以使用一种载体，其编码并且能够表达重链和轻链多肽两者。在该情况中，轻链应该置于重链的前面以避免毒性的游离重链过量(Proudfoot，Nature 322：52(1986)；Kohler，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：2197(1980))。重链和轻链的编码序列可以包含cDNA或者基因组DNA。

可以开发针对完整C35多肽或者其部分，或者异戊二烯化、糖基化、磷酸化、豆蔻酰化或者酰胺化的部位的抗体。

可以通过任何常规方法产生作为表位的片段(见，例如，Houghten，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：5131-5135(1985)，在美国专利号4,631,211中进一步描述)。

类似地，免疫原性表位可以用于根据本发明公知的方法诱导抗体。(见，例如，Sutcliffe et al.，上文；Wilson et al.，上文；Chowet al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：910-914；和Bittle et al.，J.Gen.Virol.66：2347-2354(1985)。优选的免疫原性表位包括本文公开的免疫原性表位，以及这些免疫原性表位的2、3、4、5或者多个的任意组合。包含一个和多个免疫原性表位的多肽可以用于与载体蛋白，如白蛋白一起呈递以对动物系统(如兔或者小鼠)引起抗体应答，或者，如果所述多肽足够长(至少约25个氨基酸)，那么该多肽可以不用载体而直接呈递。然而，已经表明包含少至8到10个氨基酸的免疫原性表位足够产生抗体，该抗体能够至少结合到变性多肽中的线性表位(例如，在蛋白质印迹中)。在特定实施方案中，本发明的表位包括下文表11中给出的那些表位。

本发明的携带表位的多肽可以用于根据本领域公知的方法诱导抗体，所述方法包括但不限于体内免疫、体外免疫，和噬菌体展示方法。见，例如，Sutcliffe et al.，上文；Wilson et al.，上文，和Bittle et al.，J.Gen.Virol.，66：2347-2354(1985)。如果使用体内免疫，那么可以用游离肽免疫动物；然而，通过将肽偶联到大分子载体，如匙孔血蓝蛋白(KLH)或者破伤风类毒素可以加强抗肽抗体的效价。例如，使用连接体，如马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)可以将含有半胱氨酸残基的肽偶联到载体，而使用更一般的连接试剂，如戊二醛可以将其他肽偶联到载体。

还可以将本发明的具有表位的肽作为多抗原肽(MAPs)合成，首先由J.P.Tam在Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：5409中描述，将该文献完整引入本文作为参考。MAP由连接到非免疫原性赖氨酸核心的多个拷贝的特定肽组成。Map肽通常含有肽的四个或八个拷贝，通常称作MAP-4或者MAP-8肽。作为非限制性实例，可以将MAP合成到赖氨酸核心基质，该基质附着到聚乙二醇-聚苯乙烯(PEG-PS)支持体。使用9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)化学将目的肽合成到赖氨酸残基上。例如，Applied Biosystems(Foster City，CA)提供了MAP树脂，如Fmoc Resin 4 Branch和Fmoc Resin 8 Branch，它们可以用于合成MAP。用本领域已知的标准的基于三氟乙酸(TFA)的混合物进行MAP从树脂的切割。除了脱盐，MAP的纯化是不必要的。MAP肽可以用作免疫疫苗，其引起识别MAP和衍生该肽的天然蛋白质的抗体。

本发明的具有表位的肽还可以掺入病毒的外壳蛋白质，其然后可以用作免疫原或者疫苗免疫动物，包括人，以便刺激产生抗-表位抗体。例如，人1型免疫缺陷病毒(HIV-1)的gp120糖蛋白的V3环已经工程化而在鼻病毒的表面上表达。用展示该V3环肽的该鼻病毒免疫产生了HIV-1免疫原的表观有效的模拟物(如通过它们被抗-HIV-1抗体中和的能力以及它们引起产生能够中和细胞培养物中HIV-1的抗体的能力)。该使用工程化的病毒颗粒作为免疫原的技术在Smith et al.，Behring Inst Mitt Feb；(98)：229-39(1997)，Smith et al，J Virol72：651-9(1998)，和Zhang et al.，Biol Chem 380：365-74(1999)中更详细地描述，将这些文献完整引入本文作为参考。

用游离的或者偶联载体的肽或者MAP肽免疫动物，如兔、大鼠和小鼠，例如，通过腹膜内和/或皮内注射含有约100μg肽或者载体蛋白质和弗氏佐剂或者已知用于刺激免疫应答的任意其他佐剂的乳液进行免疫。可能需要几次加强注射，例如，约两周间隔的加强注射，以提供有用效价的抗肽抗体，其可以例如，通过ELISA测定使用吸附到固体表面的游离肽检测到。可以增加来自免疫动物的血清中抗肽抗体的效价，这可以通过选择抗肽抗体，例如，通过根据本领域公知的方法将肽吸附到固相支持体并洗脱所选抗体来实现。

一旦本发明的抗体分子已经通过动物产生、化学合成或者重组表达，就可以通过本领域已知的用于纯化免疫球蛋白分子的方法，例如，通过层析法(例如，离子交换、亲和，尤其通过蛋白A后对特定抗原的亲和性，和分筛柱层析)、离心、差别溶解性，或者通过任何其他用于纯化蛋白质的标准技术纯化本发明的抗体分子。此外，本发明的抗体或者其片段可以融合到本文描述的或者本领域已知的异源多肽序列以方便纯化。

可以通过本领域已知的任意适宜的方法产生本发明的抗体。可以通过本领域公知的多种方法产生针对目的抗原的多克隆抗体。例如，可以将本发明的多肽施用于多种宿主动物，包括，但不限于，兔、小鼠、大鼠等等，以诱导产生含有对所述抗原特异的多克隆抗体的血清。取决于宿主种类，可以用多种佐剂增加免疫应答，并且所述佐剂包括但不限于弗氏佐剂(完全和不完全佐剂)、矿物凝胶，如氢氧化铝、表面活性物质，如溶血卵磷脂、普流罗尼(pluronic)多元醇、聚阴离子、肽、油乳剂、匙孔血蓝蛋白、二硝基酚、和潜在有用的人佐剂，如BCG(卡介苗)和短小棒状杆菌(corynebacterium parvum)。此类佐剂也是本领域公知的。

可以使用本领域已知的多种技术制备单克隆抗体，所述技术包括杂交瘤、重组和噬菌体展示技术，或者它们的组合。例如，可以使用杂交瘤技术产生单克隆抗体，杂交瘤技术包括本领域已知的并且在例如Harlow et al.，Antibodies：A Laboratory Manual，(Cold SpringHarbor Laboratory Press，2nd ed.1988)；Hammerling，et al.，in：Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681(Elsevier，N.Y.，1981)(所述参考文献完整引入本文作为参考)中教导的那些技术。本文所用的术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。术语“单克隆抗体”指来自单个克隆的抗体，所述克隆包括任意真核的、原核的或者噬菌体克隆，而不是指产生它的方法。

用杂交瘤技术产生和筛选特异抗体的方法是本领域常规和公知的并且在实施例中详细讨论。在非限制性实例中，可以用本发明的多肽或者表达该肽的细胞免疫小鼠。一旦检测到免疫应答，例如，在小鼠血清中检测到对所述抗原特异的抗体，就收获小鼠脾脏并分离脾细胞。然后通过公知技术将脾细胞与任意适宜的骨髓瘤细胞，例如，可以从ATCC得到的细胞系SP20的细胞融合。选择杂交瘤并通过有限稀释克隆。然后通过本领域已知的方法测定杂交瘤克隆中分泌能够结合本发明多肽的抗体的细胞。可以通过用阳性杂交瘤克隆免疫小鼠产生腹水，其一般含有高水平的抗体。

因此，本发明提供了产生单克隆抗体的方法以及通过该方法产生的抗体，所述方法包括培养分泌本发明抗体的杂交瘤细胞，其中优选地，通过将分离自用本发明抗原免疫的小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，然后对所述融合得到的杂交瘤筛选分泌能够结合本发明多肽的抗体的杂交瘤克隆，产生所述杂交瘤。

可以通过已知的技术产生识别特定表位的抗体片段。例如，本发明的Fab和F(ab′)2片段可以通过免疫球蛋白分子的蛋白酶解切割产生，使用诸如木瓜蛋白酶(以产生Fab片段)或者胃蛋白酶(以产生F(ab′)2片段)。F(ab′)2片段含有可变区、轻链恒定区和重链的CH1结构域。

例如，还可以使用本领域已知的多种噬菌体展示方法产生本发明的抗体。在噬菌体展示方法中，功能抗体结构域展示在噬菌体颗粒的表面上，该噬菌体颗粒携带编码所述结构域的多核苷酸序列。在特定实施方案中，此类噬菌体可以用于展示从库或者组合抗体文库(例如，人或者鼠的)表达的抗原结合结构域。可以用抗原选择或者鉴定表达结合目的抗原的抗原结合结构域的噬菌体，例如，使用标记的抗原或者结合或者捕获到固体表面或者珠子的抗原。用于这些方法中的噬菌体通常是丝状噬菌体，其包括从噬菌体表达的fd和M13结合结构域，Fab、Fv或者二硫键稳定的Fv抗体结构域重组融合到噬菌体基因III或者基因VIII蛋白质。可以用于制备本发明抗体的噬菌体展示方法的实例包括Brinkman et al.，J.Immunol.Mthods 182：41-50(1995)；Ames et al.，J.Immunol.Methods 184：177-186(1995)；Kettleborough et al.，Eur.J.Immunol.24：952-958(1994)；Persic et al.，Gene 187 9-18(1997)；Burton et al.，Advancesin Immunology 57：191-280(1994)；PCT申请号PCT/GB91/01134；PCT公开WO 90/02809；WO 91/10737；WO 92/01047；WO 92/18619；WO93/11236；WO 95/15982；WO 95/20401；和美国专利号5,698,426；5,223,409；5,403,484；5,580,717；5,427,908；5,750,753；5,821,047；5,571,698；5,427,908；5,516,637；5,780,225；5,658,727；5,733,743和5,969,108中公开的方法，将这些文献的每一个完整引入本文作为参考。

如上面的参考文献中描述的，噬菌体选择后，可以从噬菌体分离抗体编码区并将其用于产生完整抗体，包括人抗体，或者任意其他希望的抗原结合片段，并在任意希望的宿主中表达，所述宿主包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母和细菌，例如，下文中详述。例如，可以使用重组产生Fab、Fab′和F(ab′)2片段的技术，使用本领域已知的方法，如PCT公开WO 92/22324；Mullinax et al.，BioTechniques 12(6)：864-869(1992)；和Sawai et al.，AJRI34：26-34(1995)；和Better et al.，Science 240：1041-1043(1988)中公开的方法(所述参考文献完整引入作为参考)。

可以用于产生单链Fv和抗体，以及双链抗体、三链抗体和四链抗体的技术的实例包括美国专利号4,946,778和5,258,498；Huston etal.，Methods in Enzymology 203：46-88(1991)；Shu et al.，PNAS90；7995-7999(1993)；Skerra et al.，Science 240；1038-1040(1988)；美国公开号20020018749和美国专利号5,837,242中描述的那些技术。对于一些应用，包括抗体在人体的体内用途和体外检测测定，可以优选使用嵌合、人源化或者人抗体。嵌合抗体是这样的分子，其中抗体的不同部分来自不同的动物物种，如具有来自鼠单克隆抗体的可变区和人免疫球蛋白恒定区的抗体。产生嵌合抗体的方法是本领域已知的。见，例如，Morrison，Science 229：1202(1985)；Oi etal.，BioTechniques 4：214(1986)；Gillies et al.，J.Immunol.Methods 125：191-202(1989)；美国专利号5,807,715；4,816,567；和4,816397，将它们完整引入本文作为参考。人源化抗体是来自结合所希望的抗原的非人物种抗体的抗体分子，其具有来自非人物种的一个和多个互补决定区域(CDR)和来自人免疫球蛋白分子的构架区。通常，人构架区中的构架残基将用来自CDR供体抗体的对应残基替代以改变，优选提高抗原结合。这些构架替代可通过本领域公知的方法鉴定，例如，通过CDR和构架残基的相互作用的建模来鉴定对于抗原结合重要的构架残基和通过序列比较来鉴定特定位置的不寻常的构架残基(见，例如，Queen et al.，美国专利号5,585,089；Riechmann etal.，Nature 332：323(1988)，将其完整引入本文作为参考)。可以使用本领域已知的多种技术人源化抗体，所述技术包括，例如，CDR嫁接(EP 239,400；PCT公开WO 91/09967；美国专利号5,225,539；5,530,101；和5,585,089)，镶面(veneering)或者表面重建(EP592,106；EP 519,596；Padlan，Molecular Immunology28(4/5)：489-498(1991)；Studnicka et al.，Protein Engineering7(6)：805-814(1994)；Roguska.et al.，PNAS 91：969-973(1994))，和链改组(美国专利号5,565,332)。

尤其希望用完全人抗体治疗性治疗人类患者。可以通过本领域已知的多种方法制备人抗体，所述方法包括上面描述的噬菌体方法，使用衍生自人免疫球蛋白序列的抗体文库，和US 2002 0123057 A1中公开的方法。也参见美国专利号4,444,887和4,716,111；和PCT公开WO 98/46645，WO 98/50433，WO 98/24893，WO 98/16654，WO 96/34096，WO 96/33735，和WO 91/10741，将这些文献的每一篇完整引入本文作为参考。

还可以使用转基因小鼠产生人抗体，所述小鼠不能表达功能内源免疫球蛋白，但是能够表达人免疫球蛋白基因。例如，可以将人重链和轻链免疫球蛋白基因复合体随机导入或者通过同源重组导入小鼠胚胎干细胞中。备选地，除了人重链和轻链基因外，还可以将人可变区、恒定区和多样化区导入小鼠胚胎干细胞中。可以单独或者通过同源重组导入人免疫球蛋白基因座的同时使得小鼠重链和轻链免疫球蛋白基因无功能。具体地，JH区的纯合缺失防止内源抗体产生。将修饰的胚胎干细胞扩增并显微注射到胚泡中以产生嵌合小鼠。然后对嵌合小鼠育种产生表达人抗体的纯合后代。将转基因小鼠用所选抗原，例如，本发明多肽的全部或者部分以正常方式免疫。可以用常规杂交瘤技术从免疫的、转基因小鼠得到针对所述抗原的单克隆抗体。转基因小鼠含有的人免疫球蛋白转基因在B细胞分化期间重排，并随后经历类别转换和体细胞突变。从而，使用该技术，可能产生治疗上有用的IgG、IgA、IgM和IgE抗体。关于产生人抗体的该技术的综述，见Lonberg andHuszar，Int.Rev.Immunol.13：65-93(1995)。关于用于产生人抗体和人单克隆抗体的该技术的详细讨论和产生此类抗体的方案，见例如，PCT公开WO 98/24893；WO 92/01047；WO 96/34096；WO 96/33735；欧洲专利号0 598 877；U.S.Pat.Nos.5,413,923；5,625,126；5,633,425；5,569,825；5,661,016；5,545,806；5,814,318；5,885,793；5,916,771；和5,939,598，将它们完整引入本文作为参考。此外，诸如Abgenix，Inc.(Freemont，Calif.)和Genpharm(SanJose，Calif.)的公司可以使用与上述相似的技术提供针对所选抗原的人抗体。

使用称作“引导选择(guided selection)”的技术可以产生识别所选表位的完全人抗体。在该方法中，所选的非人单克隆抗体，例如，小鼠抗体，用于引导识别相同表位的完全人抗体的选择(Jespers etal.，Bio/technology 12：899-903(1988))。

此外，针对本发明多肽的抗体又可以用于使用本领域公知的技术产生“模拟”本发明多肽的抗独特型抗体(见例如，Greenspan & Bona，FASEB J.7(5)：437-444；(1989)和Nissinoff，J.Immunol.147(8)：2429-2438(1991))。例如，结合并且竞争性抑制多肽多聚化和/或本发明多肽对配体的识别的抗体可以用于产生抗独特型抗体，其“模拟”多肽多聚化和/或结合结构域并且，结果，结合并中和多肽和/或它的配体。此类中和性抗独特型和此类抗独特型的Fab片段可以用于治疗方案中中和多肽配体。例如，此类抗独特型抗体可以用于结合本发明的多肽和/或结合它的配体/受体，并从而阻断它的生物活性。

抗体缀合物

在另一实施方案中，本发明提供了特异破坏细胞的方法(例如，破坏异常细胞，包括但不限于，肿瘤细胞)，该方法包括施用与毒素或者细胞毒性前体药物结合的抗癌症相关的细胞内抗原的抗体。

“毒素”指结合并激活内源细胞毒性效应系统的化合物、放射性同位素、全毒素、修饰的毒素、毒素的催化亚基、细胞毒素(细胞毒性剂)，或者通常不存在于细胞内或者细胞表面上的分子或者酶，但它们在确定的条件下导致细胞死亡。根据本发明的方法可以使用的毒素包括但不限于，本领域已知的放射性同位素、化合物，如结合内在的或者诱导的内源细胞毒性效应系统的抗体(或者其含有补体结合的部分)、胸苷激酶、内切核酸酶、RNA酶、α毒素、篦麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、假单胞菌外毒素A、白喉毒素、皂草素、木鳖子皂苷、多花白树毒蛋白(gelonin)、美洲商陆抗病毒蛋白、α-帚曲毒素和霍乱毒素。“毒素”还包括细胞抑制剂或者杀细胞剂、治疗剂或者放射性金属离子，例如，α-发射体，如²¹³Bi，或者其他放射性同位素，例如，¹⁰³Pd、¹³³Xe、¹³¹I、⁶⁸Ge、⁵⁴Co、⁶⁵Zn、⁸⁵Sr、³²P、³⁵S、⁹⁰Y、¹⁵³Sm、¹⁵³Gd、¹⁶⁹Yb、⁵¹Cr、⁵⁴Mn、⁴⁵Se、¹¹³Sn、⁹⁰钇、¹¹⁷锡、¹⁸⁶铼、¹⁶⁶钬、和¹⁸⁸铼，和在下面的“复合物”章节中列出的那些；发光标记物，如鲁米诺；和荧光标记物，如萤光素和罗丹明，和生物素。在特定实施方案中，本发明的抗体(包括其片段或变体)缀合放射性同位素，例如，¹³¹I。在优选实施方案中，使用缀合放射性同位素的抗体以用于放射免疫疗法联合化学疗法。

细胞毒素或者细胞毒性剂包括对细胞有害的任何试剂。实例包括紫杉醇、松胞菌素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、阿霉素、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光辉霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素和其类似物或同系物。细胞毒素或者细胞毒性剂包括，但不限于，抗代谢物(例如，氨甲喋呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、氨烯咪胺)、烷化剂(例如，氮芥、噻替哌、苯丁酸氮芥、苯丙氨酸氮芥、亚硝脲氮芥(BSNU)和罗氮芥(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链唑霉素、丝裂霉素C、和顺式-二氯二胺铂(II)(DDP)顺铂)、蒽环类(例如，柔红霉素(旧称道诺霉素)和阿霉素)、抗生素(例如，更生霉素(旧称放线菌素)、博来霉素、光辉霉素、和氨茴霉素(AMC)，和抗有丝分裂剂(例如，长春新碱和长春碱)。

“细胞毒性前体药物”是指非毒性化合物，其通过通常存在于细胞中的酶转化成为细胞毒性化合物。根据本发明可以使用的细胞毒性前体药物包括但不限于，苯甲酸氮芥烷化剂的谷氨酰基衍生物、依托泊苷或者丝裂霉素C的磷酸衍生物、阿糖胞苷、柔红霉素和阿霉素的苯氧基乙酰胺衍生物。

本发明还涉及重组融合或者化学缀合(包括共价和非共价缀合)到多肽(或者其部分，优选该多肽的至少10、20、30、40、50、60、70、80、90或100个氨基酸)以产生融合蛋白的抗体。融合不必是直接的，而是可以通过连接体序列发生。抗体可以对不同于C35多肽(或者其部分，优选该多肽的至少10、20、30、40、50、60、70、80、90或100个氨基酸)的抗原特异。具体地，抗体可以对其他癌症相关的细胞内抗原特异。在优选实施方案中，此类细胞内抗原是异戊二烯化的蛋白质。

本发明的抗体(包括其片段或者变体)可以融合到异源蛋白质的N-或者C-末端(例如，免疫球蛋白Fc多肽或者人血清白蛋白多肽)。本发明的抗体还可以融合到白蛋白(包括但不限于重组人血清白蛋白(见，例如，1999年3月2日出版的美国专利号5,876,969，欧洲专利0 413 622，1998年6月16日出版的美国专利号5,766,883，将它们完整引入本文作为参考))，得到嵌合多肽。在优选实施方案中，本发明的抗体(包括其片段或变体)与人血清白蛋白的成熟形式融合(即如欧洲专利0 322 094的图1和2中所示的人血清白蛋白的氨基酸1-585)，将其完整引入本文作为参考。在另一优选实施方案中，本发明的抗体(包括其片段或变体)与多肽片段融合，该多肽片段包含或者备选地由人血清白蛋白的氨基酸残基1-z组成，其中z是369到419的整数，该人血清白蛋白如美国专利5,766,883中描述，将该专利完整引入本文作为参考。

本发明还包括编码本发明的融合蛋白的多核苷酸。此类融合蛋白可以例如，方便纯化并且可以增加体内半寿期。使用本领域公知的方法，与多肽融合或缀合的抗体还可以用于体外免疫测定和纯化方法中。见，例如，Harbor et al.，上文，和PCT公开WO 93/21232；EP 439,095；Naramura et al.，Immunol.Lett.39：91-99(1994)；美国专利5,474,981；Gillies et al.，PNAS 89：1428-1432(1992)；Fell etal.，J.Immunol.146：2446-2452(1991)，将这些文献完整引入本文作为参考。

此外，本发明的抗体或者其片段可以融合标记序列，如肽，以方便纯化。在优选实施方案中，标记氨基酸序列是六-组氨酸肽，如在pQE载体等等中提供的标记(QIAGEN，Inc.，9259 Eton Avenue，Chatsworth，Calif.，91311)，它们中的许多可以通过商业途径获得。如在Gentz et al.，Proc.Natl.Acad Sci.USA 86：821-824(1989)中描述的，六-组氨酸提供了融合蛋白的方便的纯化。用于纯化的其他肽标记包括，但不限于，“HA”标记，其对应于来自流感血凝素蛋白的表位(Wilson et al.，Cell 37：767(1984))和“flag”标记。

本发明还包括缀合到诊断剂或治疗剂的抗体，如C35抗体或其片段。所述抗体可以作为临床实验过程的一部分诊断性地用于例如，监视肿瘤的发生或者发展以例如，确定给定治疗方案的功效。可以将抗体偶联到可检测的物质来方便检测。可检测物质的实例包括多种酶、辅基、荧光物质、发光物质、生物发光物质、放射性物质、正电子发射金属(使用多种正电子发射断层术)，和非放射性顺磁金属离子。可检测的物质可以使用本领域已知的技术直接偶联或者缀合到抗体(或者其片段)或者间接地通过中间物(例如，本领域已知的连接体)偶联或者缀合到抗体(或者其片段)。对于金属离子，见例如，美国专利号4,741,900，所述金属离子可以缀合到抗体作为根据本发明的诊断剂。适宜的酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、或者乙酰胆碱酯酶；适宜的辅基复合物的实例包括链霉抗生物素蛋白/生物素和亲和素/生物素；适宜的荧光物质的实例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或者藻红蛋白；发光物质的实例包括鲁米诺；生物发光物质的实例包括萤光素酶、萤光素和水母发光蛋白；适宜的放射性物质的实例包括¹²⁵I、¹³¹I、¹¹¹In或者⁹⁹Tc。

不将治疗剂理解局限于常规化学治疗剂。例如，治疗剂可以是具有所希望的生物活性的蛋白质或者多肽。此类蛋白质可以包括例如，毒素，如相思豆毒蛋白、篦麻毒蛋白A、假单胞菌外毒素或者白喉毒素；蛋白质，如肿瘤坏死因子、α干扰素、β干扰素、神经生长因子、血小板衍生生长因子、组织纤溶酶原激活物、细胞凋亡剂，例如，TNF-α、TNF-β、AIMI(见，国际公开号WO 97/33899)，AIM II(见，国际公开号WO 97134911)，Fas配体(Takahashi et al.，Int.Immunol.，6：1567-1574(1994))，VEGI(见，国际公开号WO99/23105)、血栓形成剂或者抗血管形成剂，例如，血管生长抑素或者内皮生长抑素；或者生物应答调节物，例如，淋巴因子、白介素-1(″IL-1″)、白介素-2(″IL-2″)、白介素-6(″IL-6″)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(″GM-CSF″)、粒细胞集落刺激因子(″G-CSF″)或者其他生长因子。

抗体还可以附着到固相支持体，其尤其用于免疫测定或者靶抗原纯化。此类固相支持体包括，但不限于，玻璃、纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或者聚丙烯。

用于将此类毒素和治疗剂缀合到抗体的技术是公知的，见，例如，Arnon et al.，″Monoclonal Antibodies For Immunotargeting OfDrugs In Cancer Therapy″，in Monoclonal Antibodies And CancerTherapy，Reisfeld et al.(eds.)，pp.243-56(Alan R.Liss，Inc.1985)；Hellstrom et al.，″Antibodies For Drug Delivery″，inControlled Drug Delivery(2nd Ed.)，Robinson et al.(eds.)，pp.623-53(Marcel Dekker，Inc.1987)；Thorpe，″Antibody CarriersOf Cytotoxic Agents In Cancer Therapy：A Review″，in MonoclonalAntibodies′84：Biological And Clinical Applications，Pincheraet al.(eds.)，pp.475-506(1985)；″Analysis，Results，AndFuture Prospective Of The Therapeutic Use Of RadiolabeledAntibody In Cancer Therapy″，in Monoclonal Antibodies ForCancer Detection And Therapy，Baldwin et al.(eds.)，pp.303-16(Academic Press 1985)，和Thorpe et al.，″The Preparation AndCytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates″，Immunol.Rev.62：119-58(1982)。

备选地，抗体可以缀合到另一抗体形成如Segal在美国专利号4,676,980中描述的抗体异源缀合物(heteroconjugate)，将该专利完整引入作为参考。

单独或者与细胞毒性因子和/或细胞因子组合施用的抗体(缀合或不缀合毒素或者治疗剂)可以用作治疗剂。

本领域已知的技术可以应用于标记本发明的抗体。此类技术包括但不限于，使用双功能缀合剂(见，例如，美国专利号5,756,065；5,714,631；5,696,239；5,652,361；5,505,931；5,489,425；5,435,990；5,428,139；5,342,604；5,274,119；4,994,560；和5,808,003；将每篇文献完整引入本文作为参考)。

螯合剂分子是本领域已知的。例如，见Subramanian，R.andMeares，C.F.，″Bifunctional Chelating Agents forRadiometal-labeled monoclonal Antibodies，″in Cancer Imagingwith Radiolabeled Antibodies(D.M.Goldenberg，Ed.)KluwerAcademic Publications，Boston；Saji，H.，″Targeted delivery ofradiolabeled imaging and therapeutic agents：bifunctionalradiopharmaceuticals.″Crit.Rev.Ther.Drug Carrier Syst.16：209-244(1999)；Srivastava S.C.and Mease R.C.，″Progressin research on ligands，nuclides and techniques for labelingmonoclonal antibodies.″Int.J.Rad.Appl.Instrum.B18：589-603(1991)；和Liu，S.and Edwards，D.S.，″Bifunctionalchelators for therapeutic lanthanide radiopharmaceuticals.″Bioconjug.Chem.12：7-34(2001)。可以共价结合所述抗体的任意螯合剂都可以根据本发明使用。螯合剂还包含连接螯合部分与抗体的连接体部分。

可以使用基于大环配体的双功能螯合剂，其中通过连接到配体的碳骨架的活化臂进行结合，如M.Moi et al.，J.Amer.Chem.Soc.49：2639(1989)(2-对硝基苄基-1，4，7，10-四氮杂环十二烷-N，N′，N″，N′″-四乙酸)；S.V.Deshpande et al.，J.Nucl.Med.31：473(1990)；G.Ruser et al.，Bioconj.Chem.1：345(1990)；C.J.Broan et al.，J.C.S.Chem.Comm.23：1739(1990)；和C.J.Anderson et al.，J.Nucl.Med.36：850(1995)描述。

在一个实施方案中，螯合剂是大环螯合剂，如聚氮杂大环螯合剂，任选地含有一个或多个羧基、膦酸或者磷酸基团。在另一实施方案中，螯合剂是选自DOTA、DOTA类似物和DOTA衍生物的螯合剂。

在一个实施方案中，适宜的螯合剂分子包括DOXA(1--4，7，10-三氮杂环十二烷三乙酸)、NOTA(1，4，7-三氮杂环壬烷三乙酸)、TETA(1，4，8，11-四氮杂环十四烷四乙酸)，和THT(4′-(3-氨基-4-甲氧基-苯基)-6，6″-双(N′，N′-二羧基甲基-N-甲基肼基)-2，2′：6′，2″-三联吡啶)，和其类似物和衍生物。见，例如，Ohmono et al.，J.Med.Chem.35：157-162(1992)；Kung et al.，J.Nucl.Med.25：326-332(1984)；Jurisson et al.，Chem.Rev.93：1137-1156(1993)；和美国专利号5,367,080。其他适宜的螯合剂包括美国专利号4,647,447；4,687,659；4,885,363；EP-A-71564；WO89/00557；和EP-A-232751中公开的螯合剂。

在另一实施方案中，可以在本发明中使用的适宜的大环羧酸螯合剂包括1，4，7，10-四氮杂环十二烷-N，N′，N″，N-四乙酸(DOTA)；1，4，8，12-四氮杂环十五烷-N，N′，N″，N-四乙酸(15N4)；1，4，7-三氮杂环壬烷-N，N′，N″-三乙酸(9N 3)；1，5，9-三氮杂环十二烷-N，N′，N″-三乙酸(12N3)；和6-溴乙酰胺-苄基-1，4，8，11-四氮杂环十四烷-N，N′，N″，N-四乙酸(BAT)。

抗体缀合物可以平均含有一个以上的螯合剂分子。在一个实施方案中，抗体缀合物含有约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、或35个螯合剂分子。在另一实施方案中，抗体缀合物含有约1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个螯合剂分子。在另一实施方案中，抗体缀合物含有约1、2、3、4或5个螯合剂分子。在另一实施方案中，抗体缀合物含有平均约1个螯合剂分子。

如上述的抗体缀合物包含共价键合的抗体和螯合剂分子。蛋白质和螯合剂之间的共价键在蛋白质的原子和螯合剂的原子之间形成。蛋白质的形成共价键的原子可以是蛋白质的任何合适的原子，如碳、氮、氧和硫。蛋白质上的某些官能团优选与螯合剂形成共价键。此类基团包括蛋白质末端的氨基；蛋白质末端的羧基；赖氨酸残基上的氨基；天冬氨酸或者谷氨酸残基上的羧基；精氨酸残基上的胍基；半胱氨酸残基上的巯基；丝氨酸或者苏氨酸残基上的羟基；组氨酸残基上的咪唑基；酪氨酸上的羟基；色氨酸基团上的羟基；和天冬酰胺或者谷氨酰胺残基上的酰胺基。

制备抗体缀合物的方法

本发明的额外方面涉及制备抗体缀合物的方法。制备抗体缀合物的一般步骤包括将抗体与螯合剂反应。适宜的螯合剂将能够与抗体反应而在螯合剂和抗体之间形成共价键。

可以形成缀合物部分的螯合剂是本领域已知的，并且制备此类螯合剂的方法是已知的。能够与抗体形成共价键的任意螯合剂可以用于形成抗体缀合物。此类螯合剂在下面描述。

在一个实施方案中，用于根据本发明方法的螯合剂是活化的螯合剂。活化的螯合剂含有官能团，其容易与蛋白质上的官能团反应，从而在蛋白质和螯合剂之间形成共价键。此类官能团是本领域公知的。

适宜的反应性官能团是能直接与抗体上的羧基、醛基、胺、醇或者巯基反应的基团。此类基团包括例如，含有活性卤素的基团，包括例如，氯代甲基苯基和氯代乙酰基(ClCH₂C(＝O)-)；活化的2-(离去基团取代的)乙基磺酰基和乙基羰基，如2-氯代乙基磺酰基和2-氯代乙基羰基；乙烯基磺酰基；乙烯基羰基；环氧；异氰酸根合；异硫氰酸根合；醛；氮丙啶；琥珀酰亚胺氧基羰基；活化的酰基，如酰卤；和混合酸酐。

可以用于本发明方法的螯合剂包括如本文描述的用于抗体缀合物的任何特定螯合剂。此外，在另一实施方案中，用于本发明方法的螯合剂是可以用于制备如上面描述的任何特定抗体缀合物的螯合剂。在一个实施方案中，螯合剂是选自DOTA、DOTA类似物和DOTA衍生物的活化的螯合剂，其中所述DOTA、DOTA类似物和DOTA衍生物的每一种含有适宜的活化基团，其能够使螯合剂分子共价结合抗体。

在另一实施方案中，用于制备根据本发明的缀合物的活化的螯合剂是a-(5-异硫氰酸根合-2-甲氧基苯基)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸，其也称作MeO-DOTA-NCS。也可以使用a-(5-异硫氰酸根合-2-甲氧基苯基)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸的盐或者酯。

在一个实施方案中，制备抗体缀合物的方法包括混合、搅拌或者制备溶液，所述溶液包含抗体和螯合剂。在额外实施方案中，制备抗体缀合物的方法包括混合、搅拌或者制备溶液，该溶液包含抗体、螯合剂、柠檬酸盐缓冲液、HEPES缓冲液，和无菌水。在额外实施方案中，所述溶液还包含NaOH。在额外实施方案中，所述溶液的pH为约8.5。

在额外实施方案中，制备缀合物的方法包括a)在约0℃到约50℃的温度下混合、搅拌或者制备包含抗体和螯合剂的溶液约0.5小时到约24小时，其中所述溶液的pH为约8.0到约9.0；和b)任选加入淬灭剂(quenching aqent)。

在上面方法的一个实施方案中，在约0℃到约50℃的温度下混合、搅拌或者制备溶液。在上面方法的另一个实施方案中，在约20℃到约30℃的温度下混合、搅拌或者制备溶液。混合、搅拌或者制备溶液的温度可以为约0、5、10、15、20、25、20、35、40、45或50℃。

如上述的任意合适的螯合剂可以用于本发明方法。

用于制备缀合物的抗体与螯合剂的摩尔比可以改变。抗体与螯合剂的摩尔比可以为约1000∶1到约1∶1000，约1到约100；约5到约20，约10到约15，约12。抗体与螯合剂的摩尔比是指反应溶液中抗体分子的数目与螯合剂分子数目的比。

当制备抗体缀合物时，可以混合、搅拌溶液或者允许其静置不同的小时数，这取决于许多变量，如包括螯合剂的性质、抗体的性质、反应温度和pH、缓冲液的性质、反应物的摩尔比、可用的试剂的纯度、催化剂或者激活物的存在的因素，和本领域技术人员显而易见的其他因素。在上面方法的一个实施方案中，将包含抗体和螯合剂的溶液混合、搅拌或者允许静置约0.5小时到约24小时。在另一实施方案中，将所述溶液混合、搅拌或者允许静置约1小时到约20小时。在另一实施方案中，将所述溶液混合、搅拌或者允许静置约2小时到约10小时。在另一实施方案中，将所述溶液混合、搅拌或者允许静置约3小时到约5小时。在另一实施方案中，将所述溶液混合、搅拌或者允许静置约4小时。在其他实施方案中，将所述溶液混合、搅拌或者允许静置约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小时。

用于制备抗体缀合物的溶液的pH可以改变。在一个实施方案中，pH将为约6、7、8、9或10。在另一实施方案中，所述溶液的pH为约7到约10。在另一实施方案中，所述溶液的pH为约7.5到约9.5。在另一实施方案中，所述溶液的pH为约8到约9。在另一实施方案中，所述溶液的pH为约8.5。

用于制备抗体缀合物的溶液可以还包含缓冲液。缓冲液是本领域公知的。用于制备抗体的适宜的缓冲液在下面关于用于制备抗体缀合物的方法中描述。在一个实施方案中，缓冲液是柠檬酸缓冲液或者乙酸缓冲液。在另一实施方案中，缓冲液包括浓度为约1到约50mM并且NaCl浓度为约1到约500mM的乙酸缓冲液。在另一实施方案中，缓冲液包括浓度为约10mM并且NaCl浓度为约140mM的乙酸缓冲液。适宜的乙酸缓冲液包括浓度为约1、5、10、15、20、25、20、35、40、45或55mM的乙酸缓冲液。适宜的缓冲液和溶液包括NaCl浓度为约1、50、75、100、125、140、150、175、200、225、250、275、300、350、400、450或500mM的缓冲液。额外适宜的缓冲液是HEPES缓冲液，尤其浓度为约100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000mM的HEPES缓冲液。在额外实施方案中，所述溶液包含浓度为约500mM的HEPES缓冲液。

用于本发明方法的抗体的浓度可以改变。在一个实施方案中，溶液中抗体的浓度为约0.1mg/mL到约10mg/mL。在另一实施方案中，抗体浓度为约0.5mg/mL到约5mg/mL。在其他特定实施方案中，抗体浓度为约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4或2.5mg/mL。在另一特定实施方案中，溶液中抗体的浓度为约1mg/mL到约2mg/mL。

还可以使用促进缀合物形成的试剂。此类试剂通常活化螯合剂以更容易地与蛋白质反应。备选地，所述试剂可以活化蛋白质以更容易地与螯合剂反应。此类试剂的实例是本领域已知的并且包括二环己基碳二亚胺(DCC)、二乙基偶氮二羧酸(DEAD)，和二异丙基偶氮二羧酸(DIAD)。

根据本发明的方法，抗体缀合物制备到足够程度后，可以将淬灭剂任选加入反应溶液中。适宜的淬灭剂是本领域已知的。在一个实施方案中，淬灭剂是甘氨酸。在特定实施方案中，包含甘氨酸缓冲液的溶液用作淬灭实例。作为实例，包含抗体和螯合剂的反应溶液经混合、搅拌或者允许静置足够时间后，例如，1-10小时、3-5小时、或者1-3小时后，向反应溶液中加入包含甘氨酸缓冲液的溶液以终止反应。然后允许反应溶液静置额外的时间，例如，约0.25、0.5、0.75、1或1.5小时。

制备抗体缀合物的方法可以包括混合、搅拌或者制备溶液，该溶液包含：

浓度为约1到约2mg/mL的抗体；

MeO-DOTA-NCS，其量使得抗体与MeO-DOTA-NCS的比为约1到12；

柠檬酸缓冲液，其浓度为约0.5到约20mM；

浓度为约1到约200mM的NaCl；

浓度为约10到约500mM的HEPES缓冲液；和

无菌水。

该方法可以包括：

制备包含抗体和柠檬酸缓冲液的第一种溶液；

向所述第一种溶液加入包含HEPES缓冲液的第二种溶液；

向所述第一种溶液加入包含螯合剂和NaOH的第三种溶液；

任选调节所述第一种溶液的pH到约8.5；

在约25℃混合、搅拌或者允许所述第一种溶液静置约3到约5小时；和

任选向所述第一种溶液加入淬灭剂。

制备根据本发明的抗体缀合物的方法还任选包括纯化所述缀合物的方法。许多已知的方法可以用于纯化所述蛋白质缀合物。

在一个实施方案中，纯化步骤使用法向流过滤(normal flowfiltration)或者切向流过滤。在另一实施方案中，纯化根据本发明的缀合物的方法是渗滤方法。

抗体复合物

本发明的额外方面涉及包含抗体缀合物和金属离子的抗体复合物，其中所述金属离子与所述抗体缀合物的螯合剂部分非共价结合。本发明的抗体复合物的特定实施方案包括包含如本文给出的抗体缀合物和金属离子的复合物。

可以使用非共价结合所述抗体缀合物的螯合部分的任意金属离子。此类金属离子包括选自Ac、Ag、At、Au、Bi、Ce、Co、Cr、Cu、Dy、Er、Eu、Fe、Ga、Gd、Hg、Ho、In、La、Lu、Mn、Mo、Nd、Ni、Os、Pb、Pd、Pm、Pr、Pt、Rb、Re、Rh、Ru、Sb、Sc、Si、Sm、Sn、Sr、Tb、Tc、Tl、Tm、V、W、Y和Yb的金属离子。

在本发明的一个实施方案中，复合物的金属离子是放射性核素。用于抗体复合物的放射性核素是本领域已知的。用于本发明的放射性核素包括γ-发射体、正电子发射体、X射线发射体、荧光发射体、β-发射体、α-发射体、和电子和中子捕获剂。在一个实施方案中，γ-发射体、正电子-发射体、X射线发射体和荧光发射体适于定位和/或治疗，而β和α发射体和电子和中子捕获剂，如硼和铀也可以用于治疗。

用于本发明复合物的放射性核素可以适于治疗、诊断或者治疗和诊断目的。适宜的金属的实例包括Ag、At、Au、Bi、Cu、Ga、Ho、In、Lu、Pb、Pd、Pm、Pr、Rb、Re、Rh、Sc、Sr、Tc、Tl、Y和Yb。用于诊断目的的放射性核素的实例是Fe、Gd、¹¹¹In、⁶⁷Ga或⁶⁸Ga。在另一个实施方案中，用于诊断目的的放射性核素是¹¹¹In或⁶⁷Ga。用于治疗目的的放射性核素的实例是¹⁶⁶Ho、¹⁶⁵Dy、⁹⁰Y、¹¹⁵mIn、⁵²Fe或⁷²Ga。在一个实施方案中，用于诊断目的的放射性核素是¹⁶⁶Ho或⁹⁰Y。用于治疗和诊断目的的放射性核素的实例包括¹⁵³Sm、¹⁷⁷Lu、¹⁵⁹Gd、¹⁷⁵Yb或⁴⁷Sc。在一个实施方案中，放射性核素是¹⁵³Sm、¹⁷⁷Lu、¹⁷⁵Yb或¹⁵⁹Gd。

优选的金属放射性核素包括⁹⁰Y、^99mTc、¹¹¹In、⁴⁷Sc、⁶⁷Ga、⁵¹Cr、^177mSn、⁶⁷Cu、¹⁶⁷Tm、⁹⁷Ru、¹⁸⁸Re、¹⁷⁷Lu、¹⁹⁹Au、⁴⁷Sc、⁶⁷Ga、⁵¹Cr、^177mSn、⁶⁷Cu、¹⁶⁷Tm、⁹⁵Ru、¹⁸⁸Re、¹⁷⁷Lu、¹⁹⁹Au、²⁰³Pb和¹⁴¹Ce。

在特定实施方案中，抗体复合物的金属离子选自⁹⁰Y、¹¹¹In、¹⁷⁷Lu、¹⁶⁶Ho、²¹⁵Bi和²²⁵Ac。

此外，γ发射性放射性核素，如^99mTc、¹¹¹In、⁶⁷Ga和¹⁶⁹Yb已经批准或者正在研究用于诊断成像，而β发射体，如⁶⁷Cu、¹¹¹Ag、¹⁸⁶Re和⁹⁰Y的复合物用于肿瘤治疗。其他有用的放射性核素包括γ发射体，如^99mTc、¹¹¹In、⁶⁷Ga和¹⁶⁹Yb，和β-发射体，如⁶⁷Cu、¹¹¹Ag、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re和⁹⁰Y，以及其他目的放射性核素，如²¹¹At、²¹²Bi、¹⁷⁷Lu、⁸⁶Rb、¹⁰⁵Rh、¹⁵³Sm、¹⁹⁸Au、¹⁴⁹Pm、⁸⁵Sr、¹⁴²Pr、²¹⁴Pb、¹⁰⁹Pd、¹⁶⁶Ho、²⁰⁸Tl和⁴⁴Sc。

在另一实施方案中，顺磁金属离子包括过渡金属和镧系金属的离子，如原子序数为21-29、42、43、44或57-71的金属，尤其Cr、V、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、La、Ce、Pr、Nd、Pm、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb和Lu的离子。用于磁共振成像的组合物的顺磁金属包括原子序数为22到29、42、44和58-70的元素。

在另一实施方案中，荧光金属离子包括镧系元素，尤其La、Ce、Pr、Nd、Pm、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb和Lu。

在另一实施方案中，含有重金属的报导分子可以包括Mo、Bi、Si和W的原子。

在优选实施方案中，本发明的抗体复合物包含抗体缀合物和金属离子，其中所述缀合物的抗体是人抗体。

在一个实施方案中，本发明缀合物的螯合剂是大环螯合剂，如聚氮杂大环螯合剂，任选含有一个或多个羧基、膦酸或磷酸基团。在另一实施方案中，本发明缀合物的螯合剂选自DOTA、DOTA类似物和DOTA衍生物。

在一个实施方案中，适宜的螯合剂分子包括DOXA(1--4，7，10-三氮杂环十二烷三乙酸)、NOTA(1，4，7-三氮杂环壬烷三乙酸)、TETA(1，4，8，11-四氮杂环十四烷四乙酸)，和THT(4′-(3-氨基-4-甲氧基-苯基)-6，6″-双(N′，N′-二羧基甲基-N-甲基肼基)-2，2′：6′，2″-三联吡啶)，和其类似物和衍生物。见，例如，Ohmono et al.，J.Med.Chem.35：157-162(1992)；Kung et al.，J.Nucl.Med.25：326-332(1984)；Jurisson et al.，Chem.Rev.93：1137-1156(1993)；和美国专利号5,367,080。其他适宜的螯合剂公开在美国专利号4,647,447；4,687,659；4,885,363；EP-A-71564；WO89/00557；和EP-A-232751。

在另一实施方案中，可以在本发明中使用的适宜的大环羧酸螯合剂包括1，4，7，10-四氮杂环十二烷-N，N′，N″，N-四乙酸(DOTA)；1，4，8，12-四氮杂环十五烷-N，N′，N″，N-四乙酸(15N4)；1，4，7-三氮杂环壬烷-N，N′，N″-三乙酸(9N 3)；1，5，9-三氮杂环十二烷-N，N′，N″-三乙酸(12N3)；和6-溴乙酰胺-苄基-1，4，8，11-四氮杂环十四烷-N，N′，N″，N-四乙酸(BAT)。

制备抗体复合物的方法

本发明的额外方法涉及制备抗体复合物的方法。在一个实施方案中，通过将如本文描述的抗体缀合物与能够非共价结合该缀合物的金属离子，如放射性核素反应可以制备抗体复合物。在另一实施方案中，金属离子非共价结合所述抗体缀合物的螯合剂部分。抗体复合物和金属离子之间的反应可以在溶液中，如在适宜的缓冲液中发生。

在一个实施方案中，制备抗体复合物的方法包括将抗体缀合物与放射性核素反应。此类方法包括混合、搅拌或者制备包含抗体缀合物和放射性核素的溶液。在一个实施方案中，所述溶液还包含缓冲液。

在另一实施方案中，制备抗体复合物的方法包括将抗体缀合物与复合金属离子的螯合剂反应。在该实施方案中，根据本领域已知的步骤，首先将螯合剂与金属离子复合。例如，见美国专利号5,654,361。螯合剂可以是如上述的激活的螯合剂。螯合剂与金属离子复合并形成螯合剂-金属离子复合物后，使用上面关于制备抗体缀合物描述的方法或者本领域已知的另一方法可以将抗体与螯合剂-金属离子复合物反应。根据该方法，包含抗体与螯合剂-金属离子复合物的溶液经混合、搅拌或者制备，从而形成所述抗体复合物。

当制备抗体复合物时，可以混合、搅拌或者允许所述溶液静置不同的小时，这取决于许多变量，如包括螯合剂的性质、抗体的性质、金属离子的性质、反应温度和pH、缓冲液的性质、反应物的摩尔比、可用的试剂的纯度、催化剂或者激活物的存在的因素，和本领域技术人员显而易见的其他因素。包含抗体缀合物和金属离子的溶液可以混合、搅拌或允许静置任意时间，该时间允许足够形成抗体复合物。在上面方法的一个实施方案中，将溶液混合、搅拌或者允许静置约0.5分钟到约24小时。在另一实施方案中，将所述溶液混合、搅拌或者允许静置约1小时到约20小时。在另一实施方案中，将所述溶液混合、搅拌或者允许静置约2小时到约10小时。在另一实施方案中，将所述溶液混合、搅拌或者允许静置约1分钟到约1小时。在另一实施方案中，将所述溶液混合、搅拌或者允许静置约1分钟到约30分钟。在另一实施方案中，将所述溶液混合、搅拌或者允许静置约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50或55分钟。

用于制备抗体复合物的溶液的pH可以改变。在一个实施方案中，pH将为约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在另一实施方案中，所述溶液的pH为约4到约8。在另一实施方案中，所述溶液的pH为约5到约7。在另一实施方案中，所述溶液的pH为约5.5到约7。在另一实施方案中，所述溶液的pH为约6.5。

用于制备抗体复合物的溶液可以还包含缓冲剂。缓冲剂是本领域公知的。用于制备抗体复合物的适宜的缓冲剂可以包括但不限于，柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐、碳酸盐、二磷酸、甘氨酰-甘氨酸-哌嗪-2HCl-NaOH、MES-NaOH-NaCl、TRIS-苹果酸-NaOH、MES-NaOH、ADA-NaOH-NaCl、ACES-NaOH-NaCl、ACES-NaOH-NaCl、BES-NaOH-NaCl、MOPS-NaOH-NaCl、TES-NaOH-NaCl、MOPS-KOH、HEPES-NaOH-NaCl、TRIS-HCl、HEPPSO-NaOH、BICINE-NaOH-NaCl、TAPS-NaOH-NaCl、HEPPS(EPPS)-NaOH、TRICINE-NaOH、BICINE-NaOH、柠檬酸-磷酸氢二钠、硼酸-柠檬酸-磷酸二氢钾-二乙基-巴比妥酸-NaOH、柠檬酸-柠檬酸钠、乙酸钠-乙酸、苯二甲酸氢钾-NaOH、卡可基酸钠盐-HCl、磷酸二氢钾-磷酸氢二钠、磷酸二氢钾-NaOH、磷酸二氢钠-磷酸氢二钠、咪唑-HCl、四硼酸钠-硼酸、2-氨基-2-甲基-1，3-丙二醇-HCl、二乙醇胺-HCl、氯化钾-硼酸-NaOH、硼酸-NaOH-KCl、甘氨酸-NaOH；和碳酸钠-碳酸氢钠。

抗体缀合物与金属离子的摩尔比可以改变。在一个实施方案中，抗体缀合物与金属离子的摩尔比为约1∶1000到约1000∶1。在另一实施方案中，抗体缀合物与金属离子的摩尔比为约1∶100到约100∶1，在另一实施方案中，为约1∶10到约10∶1，在另一实施方案中，为约1∶5到约5∶1，在另一实施方案中，为约1∶2，在另一实施方案中为约1∶3，在另一实施方案中为约2∶1，在另一实施方案中为约1∶1。在其他实施方案中，抗体缀合物与金属离子的摩尔比为约1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9或1∶10。

备选地，抗体和螯合剂-金属离子复合物的比例可以改变。在一个实施方案中，抗体和螯合剂-金属离子复合物的比为约1∶1000到约1000∶1。

可用于本发明的放射性核素在上文描述和列举并且是公知的和通过商业途径可得到的。此外，一些已知的方法可以用以制备用于本发明的放射性核素。在一个实施方案中，金属离子为盐的形式，例如，氯化物盐。此类盐是本领域已知的。在另一实施方案中，金属离子盐是氯化钇或者乙酸钇。在一个实施方案中，金属离子用于本发明。

根据一个实施方案当制备本发明的复合物时，可以与螯合剂竞争复合的其他金属离子不以显著量存在于溶液中。例如，当制备包含⁹⁰Y的抗体复合物时，Fe³⁺不以显著量或者浓度存在于溶液中。如关于本方法中一种或多种竞争性金属离子使用的，术语显著量指显著干扰、延缓、延迟、抑制或者防止抗体复合物的制备的量或者浓度。

制备抗体复合物的方法可以还包括从反应溶液和/或抗体复合物除去过量金属离子的步骤。在一个实施方案中，此类步骤包括加入二级螯合剂，其能够与溶液中的过量金属离子复合。此类二级螯合剂可以包括一种或多种已知的螯合剂，如DTPA、EDTA和MeO-DOTA-甘氨酸。在一个实施方案中，MeO-DOTA-甘氨酸用作二级螯合剂。

制备抗体复合物的方法可以还包括从包含螯合剂-金属离子复合物的反应溶液除去过量金属离子的步骤。在一个实施方案中，螯合剂-金属离子复合物形成并且在溶液中后，加入能够复合过量金属离子的二级螯合剂。然后将该溶液通过DEAE-纤维素阴离子交换树脂(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)洗脱，该树脂已经转化成乙酸盐形式以从带电种类，即二级螯合剂-金属离子复合物纯化中性种类的螯合剂-金属离子复合物。纯化的螯合剂-金属离子复合物然后用于制备如本文描述的抗体复合物。

二级螯合剂可以作为固体或者溶液加入反应混合物。在一个实施方案中，向缓冲液中加入二级螯合剂。在本发明的另一实施方案中，抗体复合物形成到满意的完成水平后，向反应溶液加入缓冲液，其包含浓度为约1到约50mM，优选约10mM的乙酸缓冲液，浓度为约1到约500mM，优选约140mM的NaCl，浓度为约1％到约20％，优选约7％到约8％，更优选约7.5％的HAS，pH为约3-8，优选约6，MeO-DOTA-甘氨酸的浓度为约0.01mM到约100mM，优选约1mM。在一个实施方案中，形成抗体复合物后约5分钟加入二级螯合剂。在其他实施方案中，形成抗体复合物后约1、2、3、4、5、6、7，8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50 55或60分钟加入二级螯合剂。

在另一实施方案中，从反应溶液和/或抗体复合物除去过量金属离子的步骤包括将反应溶液和/或抗体复合物离心。将反应溶液和/或抗体复合物离心可以除去非螯合的金属离子。

在另一实施方案中，从反应溶液和/或抗体复合物除去过量金属离子的步骤包括用缓冲液从反应溶液和/或抗体复合物洗涤过量金属离子。如果必要，洗涤可以重复一次或多次。在一个实施方案中，洗涤重复两次或三次。

在该方法的一个实施方案中，除去过量金属离子的两种或多种方法组合用于从除去反应溶液和/或抗体复合物的过量金属离子的步骤除去过量金属离子。

在本方法的另一实施方案中，对于放射药物和放射治疗应用，从与所希望的复合物不同的氧化态的金属制备抗体复合物。在该情况中，取决于所用的金属的氧化态和所希望的最终产物的氧化态，可以将还原剂或者氧化剂加入反应混合物中使得金属达到所希望的氧化态。可以用氧化剂或者还原剂形成中间复合物，其处于所希望的氧化态但是具有不稳定的配体。然后这些不稳定配体可以用本发明的所希望的螯合部分置换。在另一实施方案中，将不稳定配体与还原剂或者氧化剂和所希望的配体一起加入反应混合物以实现在一步中改变到所希望的氧化态和螯合所希望的金属。

在本发明的另一实施方案中，制备抗体复合物的方法包括：

制备包含抗体缀合物的第一种溶液；

向所述第一种溶液加入包含能够与所述抗体缀合物复合的金属离子的第二种溶液；

混合、搅拌所述第一种溶液或者允许其静置；和

任选加入第二种螯合剂，如EDTA，以与未复合的金属离子复合。

在另一实施方案中，制备抗体复合物的方法包括：

组合第一种溶液、第二种溶液和第三种溶液，

其中

所述第一种溶液包含抗体缀合物，

所述第二种溶液包含乙酸缓冲液；和

所述第三种溶液包含⁹⁰YCl₃；

混合、搅拌合并的溶液或者允许其静置；

向合并的溶液加入第四种溶液，所述第四种溶液包含MeO-DOTA-NCS、人血清白蛋白(HSA)、乙酸缓冲液，和NaCl。

免疫表型分型

抗体，如本发明的C35抗体可以用于细胞系和生物样品的免疫表型分型。C35可用作肿瘤特异标记。针对特定表位或者表位组合的单克隆抗体可以允许诊断癌症和筛选细胞群体。可以利用多种技术，使用单克隆抗体来筛选表达标记的细胞群体，所述技术包括使用抗体包被的磁珠进行磁性分离，用附着到固体基质(例如，平板)的抗体“淘选”，和流式细胞术(见，例如，美国专利号5,985,660；和Morrisonet al.，Cell，96：737-49(1999))。

这些技术允许筛选特定细胞群体，如可以发现具有血液学恶性的细胞群体(例如，C35-相关的癌症，如乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌和结肠癌，和黑素瘤)。

诊断和成像

特异结合目的多肽的经标记的C35抗体和其衍生物和类似物可以用于诊断目的，用来检测、诊断或者监视与本发明多肽的异常表达和/或活性有关的疾病、病症和/或障碍(例如，C35-相关的癌症，如乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌和结肠癌，和黑素瘤)。本发明提供了目的多肽的异常表达的检测方法，其包括(a)使用对目的多肽特异的一种或多种抗体测定个体的细胞或者体液中目的多肽的表达和(b)比较基因表达水平与标准基因表达水平，从而与标准表达水平相比所测定的多肽基因表达水平的升高或降低表明异常表达。

本发明提供了用于诊断病症的诊断测定法，其包括(a)使用对目的多肽特异的一种或多种抗体测定个体的细胞或者体液中目的多肽的表达和(b)比较该基因表达水平与标准基因表达水平，从而与标准表达水平相比所测定的多肽基因表达水平的升高或降低表明特定病症。关于癌症，来自个体的活组织检查组织中转录物的相对高的量表明易患该疾病的倾向性，或者可以提供在实际的临床症状出现前检测该疾病的方法。该类型的更确定的诊断可以允许健康专业人员较早使用预防性措施或者积极地治疗，从而预防癌症的发生或者进一步恶化。

本发明的抗体可以用于测定生物样品中的蛋白质水平，可以使用本领域技术人员已知的常规免疫组织学方法(见，例如，Jalkanen，etal.，J.Cell.Biol.101：976-985(1985)；Jalkanen，et al.，J.Cell Biol.105：3087-3096(1987))。用于检测蛋白质基因表达的其他基于抗体的方法包括免疫测定法，如酶联免疫吸附测定(ELISA)和放射免疫测定(RIA)。适宜的抗体测定标记是本领域已知的并且包括酶标记，如葡萄糖氧化酶；放射性同位素，如碘(¹²⁵I、¹²¹I)、碳(¹⁴C)、硫(³⁵S)、氚(³H)、铟(¹¹²In)、和锝(⁹⁹Tc)；发光标记，如鲁米诺；和荧光标记，如荧光素和罗丹明和生物素。

本发明的一方面是检测和诊断动物，优选哺乳动物，最优选人中与本发明的多肽的异常表达相关的疾病或者病症。在一个实施方案中，诊断包括：a)对受试者施用(例如，肠胃外、皮下或者腹膜内)有效量的特异结合目的多肽的经标记的分子；b)使用后等待一段时间以允许标记的分子在受试者中多肽表达的部位优先浓集(和未标记的分子被清除到背景水平)；c)测定背景水平；和d)检测受试者中经标记的分子，从而检测到高于背景水平的标记分子表明该受试者患有与目的多肽的异常表达相关的特定疾病或病症。可以通过多种方法确定背景水平，所述方法包括比较检测的标记分子量和以前对特定系统确定的标准值。

本领域中将理解受试者的大小和所用的成像系统将决定需要产生诊断图像的成像部分的量。对于放射性同位素部分的情况，对于人类受试者，注射的放射性的量将通常为约5到20毫居里^99mTc。标记的抗体或者抗体片段将优先积累在含有该特定蛋白质的细胞部位。体内肿瘤成像描述于S.W.Burchiel et al.，″Immunopharmacokinetics ofRadiolabeled Antibodies and Their Fragments.″(Chapter 13 inTumor Imaging：The Radiochemical Detection of Cancer，S.W.Burchiel and B.A.Rhodes，eds.，Masson Publishing Inc.(1982)。

取决于几种变量，包括所用的标记类型和施用方式，施用后允许标记的分子优先在受试者中的部位浓集和未标记的分子清除到背景水平的时间间隔为6到48小时或者6到24小时或者6到12小时。在另一实施方案中，施用后的时间间隔为5到20天或者5到10天。

在一个实施方案中，例如在最初诊断后1个月，最初诊断后6个月，最初诊断后1年等等，通过重复诊断方法进行疾病或病症的监视。

使用本领域中已知的用于体内扫描的方法，可以检测患者中经标记分子的存在。这些方法取决于所用的标记类型。技术人员将能够确定检测特定标记的适宜方法。可用于本发明的诊断方法的方法和装置包括，但不限于，电子计算机化断层X线摄影术(CT)、全身扫描，如正电子发射体层摄影术(PET)、磁共振成像(MRI)和声像图检查。

在特定实施方案中，将分子用放射性同位素标记并用放射反应性手术仪器在患者中检测(Thurston et al.，美国专利号5,441,050)。在另一实施方案中，将分子用荧光化合物标记并用荧光反应扫描仪器在患者中检测。在另一实施方案中，将分子用正电子发射金属标记并用正电子发射体层摄影术在患者中检测。在另一实施方案中，将分子用顺磁标记物标记并用磁共振成像(MRI)在患者中检测。

本发明的抗体可用以诊断、治疗、预防和/或预后哺乳动物，优选人中的癌症疾病。此类疾病包括，但不限于，癌症、赘生物、肿瘤和/或如下面“过度增殖性疾病”中描述，特别是C35-相关的癌症，如乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌和结肠癌，和黑素瘤。

具体地，认为患有癌症的哺乳动物的某些组织表达与对应的“标准”水平相比显著增强或者降低水平的正常或者改变的癌症抗原和编码与癌症相关的多肽的mRNA。此外，认为当与来自没有癌症的相同物种的哺乳动物的血清比较时，在来自患有这种癌症的哺乳动物的某些体液(例如，血清、血浆、尿和脊髓液)或者细胞或组织中可以检测到与癌症相关的肽的升高或降低的水平。

例如，如本文公开的，C35表达与某些癌症(例如，乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、结肠癌和胰腺癌，和黑素瘤)相关。因此，针对C35的抗体(和抗体片段)可以用于定量或者定性表达C35的细胞的浓度。这些抗体还具有诊断应用，用于检测C35表达水平的异常，或者C35的结构和/或时序、组织、细胞、或者亚细胞定位的异常。这些诊断测定可以在体内或者体外进行，例如，用血样、活检组织或者尸检组织进行。

从而，本发明提供了在癌症的诊断期间使用的诊断方法，其涉及测量来自个体的组织或其他细胞或者体液中癌症抗原多肽的表达水平并比较所测量的表达水平与标准癌症抗原表达水平，从而与标准相比表达水平的增加指示病症。

当已经根据常规方法进行疾病的诊断，包括肿瘤的诊断时，本发明可以用作预后指示，从而显示出增强的癌症抗原基因表达的患者将相对于所述基因表达水平较接近标准水平的患者经历更差的临床结果。

“测定癌症相关多肽的表达水平”意在定性或者定量地测量或者估计第一种生物样品中癌症抗原多肽的水平，可以直接(例如，通过确定或者估计绝对蛋白质水平)或者相对地(例如，通过比较第二种生物样品中癌症相关多肽水平)进行所述测量或估计。优选地，测量或者估计第一种生物样品中癌抗原多肽表达水平并将其与标准癌抗原多肽水平比较，所述标准来自从没有所述疾病的个体得到的第二种生物样品得到或者通过来自没有所述疾病的个体群体的平均水平确定。如本领域将明白的，一旦已知标准癌抗原多肽水平，它就可以作为比较标准重复使用。

“生物样品”意指从个体、细胞系、组织培养物，或者含有癌抗原多肽(包括其部分)的其他来源得到的任意生物样品。如所指出的，生物样品包括含有表达癌抗原多肽的细胞的体液(如血清、血浆、尿、滑液和脊髓液)，和发现表达全长癌抗原或者其片段的其他组织来源。从哺乳动物得到组织活检样品和体液的方法是本领域公知的。

本发明还涉及诊断测定，如用于检测生物样品(例如，细胞和组织)中癌抗原多肽的水平(包括测定多肽的正常和异常水平)的定量和诊断测定。从而，例如，根据本发明的用于检测与正常对照组织样品相比癌抗原的过表达的诊断测定可以用于检测肿瘤的存在。可以用于测定来自宿主的样品中多肽的水平，如本发明的癌抗原多肽的水平的测定技术是本领域技术人员公知的。此类测定方法包括放射免疫测定、竞争结合测定、蛋白质印迹分析和ELISA测定。测定生物样品中癌抗原多肽水平可以用任意本领域已知的方法进行。

还可以用典型免疫组织化学方法研究组织中癌抗原多肽表达(Jalkanen et al.，J.Cell.Biol.101：976-985(1985)；Jalkanen，M.，et al.，J.Cell.Biol.105：3087-3096(1987))。用于检测癌抗原多肽基因表达的其他基于抗体的方法包括免疫测定法，如酶联免疫吸附测定(ELISA)和放射免疫测定(RIA)。适宜的抗体测定标记是本领域已知的并且包括酶标记，如葡萄糖氧化酶和放射性同位素，如碘(¹²⁵I、¹²¹I)、碳(¹⁴C)、硫(³⁵S)、氚(³H)、铟(¹¹²In)、和锝(^99mTc)，和荧光标记，如荧光素和罗丹明，和生物素。

待分析的组织或者细胞类型将通常包括已知或者怀疑表达癌抗原基因的那些组织或者细胞类型。本文所用的蛋白质分离方法可以例如，为如Harlow and Lane(Harlow，E.and Lane，D.，1988，″Antibodies：A Laboratory Manual″，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，New York)中描述的方法，将该文献完整引入本文作为参考。分离的细胞可以来自细胞培养物或者来自患者。从培养物得到的细胞的分析可以是评估细胞的必要步骤，其可以用作基于细胞的基因治疗技术的部分，或者备选地，用来测试化合物对癌抗原基因表达的影响。

在额外优选的实施方案中，针对癌抗原的构象表位的抗体或者抗体片段可以用于定量或者定性地检测癌抗原基因产物或者其保守变体或者多肽片段的存在。这可以例如，通过免疫荧光技术(使用荧光标记的抗体)，结合光学显微镜、流式细胞术或者荧光检测来完成。

本发明的抗体(或者其片段)和/或癌抗原多肽可以额外地用于组织学，如在免疫荧光、免疫电子显微术或者非免疫学测定中，用于原位检测癌抗原基因产物或者其保守变体或者肽片段。从患者取出组织学样品，并对其应用本发明的标记的抗体或者癌抗原多肽，可以完成原位检测。优选将标记的抗体(或者片段)覆盖在生物样品上来应用抗体(或者片段)或者癌抗原多肽。通过使用这种方法，可以不仅确定癌抗原基因产物或者保守变体或者肽片段的存在，或者癌抗原多肽结合，还可以确定它在所检查的组织中的分布。本领域技术人员使用本发明将容易地理解为了实现这种原位检测，可以修改多种组织学方法(如染色步骤)的任一种。

用于癌抗原基因产物或者其保守变体或肽片段的免疫测定和非免疫测定将通常包括在能够结合癌抗原基因产物或者其保守变体或肽片段的可检测的经标记抗体的存在下，孵育样品，如生物液体、组织提取物、新鲜收获的细胞，或者已经在细胞培养物中孵育的细胞裂解物，并通过本领域公知的多种技术的任一种检测结合的抗体。

可以将生物样品接触或者固定在固相支持体或者载体上，如硝酸纤维素，或者能够固定细胞、细胞颗粒或者可溶性蛋白质的其他固相支持体。然后可以用适宜的缓冲液洗涤支持体，接着用可检测的经标记的抗癌抗原抗体或者可检测的癌抗原多肽处理。然后可以用缓冲液再次洗涤固相支持体以除去未结合的抗体或者多肽。任选地，随后标记抗体。然后可以通过常规方法检测固相支持体上结合的标记的量。

“固相支持体或者载体”意指能够结合抗原或者抗体的任意支持体。公知的支持体或者载体包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龙、淀粉酶、天然和修饰的纤维素、聚丙烯酰胺、辉长岩和磁石。对于本发明，载体的形式可以是一定程度上可溶的或者不溶的。支持体材料可以几乎是任意可能的结构形状，只要偶联的分子能够结合抗原或抗体。从而，支持体形状可以是球形的，如珠子，或者圆柱形，如试管的内表面，或者棒的外表面。备选地，表面可以是平的，如片、试验带，等等。优选的支持体包括聚苯乙烯珠。本领域技术人员将知道用于结合抗体或者抗原的许多其他适宜的载体，或者将能够使用常规实验确定所述载体。

可以根据本领域公知的方法确定给定的许多抗-癌抗原抗体或者癌抗原多肽的结合活性。本领域技术人员将能够用常规实验方法对每次测定确定可操作的和最佳的测定条件。

除了测定从个体得到的生物样品中癌抗原多肽水平或者多核苷酸水平，还可以通过成像体内检测癌抗原多肽或者多核苷酸。例如，在本发明的一个实施方案中，癌抗原多肽和/或抗-癌抗原抗体用于成像患病细胞，如赘生物。在另一实施方案中，本发明的癌抗原多核苷酸(例如，与癌抗原mRNA的所有或者部分互补的多核苷酸)和/或抗-癌抗原抗体(例如，针对癌抗原的一种表位或者表位组合的抗体，针对癌抗原的构象表位的抗体，针对在哺乳动物细胞的细胞表面上表达的全长多肽的抗体)用于成像患病或者瘤性细胞。

用于癌抗原多肽的体内成像的抗体标记或者标记物包括可以通过X-放射照相术、NMR、MRI、CAT-扫描或者ESR检测的标记。对于X-放射照相术，适宜的标记包括放射性同位素，如钡或者铯，所述同位素发射可检测的辐射但是对受试者无明显伤害。用于NMR和ESR的适宜的标记物包括具有可检测的特征性自旋的标记物，如氘，所述标记物可以通过标记相关杂交瘤的营养物掺入到抗体中。当体内成像用于检测癌抗原多肽的增强的水平并用于人的诊断时，优选使用人抗体或者“人源化”嵌合单克隆抗体。可以使用本文描述或者本领域已知的技术产生此类抗体。例如，产生嵌合抗体的方法是本领域已知的。综述见，Morrison，Science 229：1202(1985)；Oi et al.，BioTechniques 4：214(1986)；Cabilly et al.，美国专利号4,816,567；Taniguchi et al.，EP 171496；Morrison et al.，EP173494；Neuberger et al.，WO 8601533；Robinson et al.，WO8702671；Boulianne et al.，Nature 312：643(1984)；Neuberger etal.，Nature 314：268(1985)。

此外，可以施用可以检测其存在的任意癌抗原多肽。例如，可以施用用不透射线的或者其他适宜的化合物标记的癌抗原多肽并且如上面关于标记的抗体讨论的进行体内显示。其他此类癌抗原多肽可以用于体外诊断步骤。

将已经用适宜的可检测的成像部分，如放射性同位素(例如，¹³¹I、¹¹²In、^99mTc)，不透射线的物质或者通过核磁共振可以检测的物质标记的癌抗原多肽-特异抗体或者抗体片段可以导入(例如，肠胃外、皮下或者腹膜内导入)将检查疾病的哺乳动物。本领域将理解受试者的大小和所用的成像系统将决定产生诊断图像需要的成像部分的量。对于放射性同位素部分的情况，对于人类受试者，注射的放射性的量将通常为约5到20毫居里^99mTc。标记的抗体或者抗体片段将优先积累在含有癌抗原蛋白质的细胞部位。体内肿瘤成像描述于S.W.Burchielet al.，″Immunopharmacokinetics of Radiolabeled Antibodies andTheir Fragments.″(Chapter 13 in Tumor Imaging：TheRadiochemical Detection of Cancer，S.W.Burchiel and B.A.Rhodes，eds.，Masson Publishing Inc.(1982)。

关于抗体，可检测地标记抗癌抗原抗体的方法之一是将所述抗体连接到酶并且在酶免疫测定(EIA)中使用连接的产物(Voller，A.，″The Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)″，1978，Diagnostic Horizons 2：1-7，Microbiological AssociatesQuarterly Publication，Walkersville，Md.)；Voller et al.，J.Clin.Pathol.31：507-520(1978)；Butler，J.E.，Meth.Enrymol.73：482-523(1981)；Maggio，E.(ed.)，1980，Enzyme Immunoassay，CRC Press，Boca Raton，Fla.，；Ishikawa，E.et al.，(eds.)，1981，Enzyme Immunoassay，Kgaku Shoin，Tokyo)。结合抗体的所述酶将与合适的底物，优选显色底物反应，以某种方式产生化学部分，其可以例如通过分光光度法、荧光法或者通过目视检测。可以用于可检测地标记抗体的酶包括，但不限于，苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、δ-5-类固醇异构酶、酵母醇脱氢酶、α-磷酸甘油脱氢酶、丙糖磷酸异构酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡萄糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。此外，可以通过比色法进行检测，比色法使用酶的显色底物。还可以通过目视比较底物与类似制备的标准物的酶反应程度完成检测。

还可以使用多种其他免疫测定法完成检测。例如，通过放射性标记抗体或者抗体片段，可以通过使用放射免疫测定(RIA)检测癌抗原(见，例如，Weintraub，B.，Principles of Radioimmunoassays，Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques，TheEndocrine Society，March，1986，将其引入本文作为参考)。可以通过包括但不限于γ计数器、闪烁计数器或者放射自显影的方法检测放射性同位素。

还可能用荧光化合物标记抗体。当荧光标记的抗体暴露于适当波长的光时，由于荧光，可以检测它的存在。最常用的荧光标记化合物是异硫氰酸荧光素、罗丹明、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二醛和荧光胺。

还可以使用荧光发射金属，如¹⁵²Eu或者其他镧系金属可检测地标记抗体。使用诸如二乙烯三胺五乙酸(DTPA)或者乙二胺四乙酸(EDTA)的金属螯合基团可以将这些金属连接到抗体。

还可以将抗体偶联到化学发光化合物进行可检测地标记。然后通过检测化学反应期间产生的发光的存在确定化学发光标记的抗体的存在。特别有用的化学发光标记化合物的实例是鲁米诺、异氨基苯二酰肼、theromatic吖啶酯、咪唑、吖啶盐和草酸酯。

同样地，可以用生物发光化合物标记本发明的抗体。生物发光是在生物系统中发现的一类化学发光，其中催化性蛋白质增加了化学发光反应的效率。通过检测发光的存在确定生物发光蛋白质的存在。用于标记的重要的生物发光化合物是萤光素、萤光素酶和水母发光蛋白。

通常，如果从患者得到的生物样品(例如，血、血清、尿和/或肿瘤活组织检查)中存在本发明的一种或多种癌抗原蛋白和/或编码此类蛋白的多核苷酸，那么可以据此检测患者中的癌症。换句话说，此类蛋白质和/或多核苷酸可以用作指示癌症的存在或不存在的标志。用本发明的组合物可以诊断和/或预后的癌症包括但不限于，结肠直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、肝癌、子宫癌和/或皮肤癌。本文提供的结合剂通常允许检测生物样品中结合所述结合剂的抗原的水平。多核苷酸引物和探针可以用于检测编码癌抗原多肽的mRNA的水平，该mRNA指示癌的存在或缺失。通常，癌抗原多肽将以一定水平存在，即患病组织中的水平比正常组织中的高至少3倍。

本领域技术人员已知多种测定形式可以使用结合剂检测样品中的多肽标记物。见，例如，Harlow and Lane，上文。通常，患者中疾病的存在与否可以如下检测：(a)将从患者得到的生物样品与结合剂接触；(b)检测样品中结合所述结合剂的多肽的水平；和(c)比较多肽的水平与预定的截止值。

在优选实施方案中，所述测定涉及使用固定在固相支持体上的结合剂结合和从样品的剩余部分除去本发明的癌抗原多肽。然后用检测试剂可以检测结合的多肽，所述检测试剂含有报道基团并且特异结合所述结合剂/多肽复合体。此类检测试剂可以包含，例如，特异结合所述多肽或抗体的结合剂或者特异结合该结合剂的其他试剂，如抗免疫球蛋白、蛋白G、蛋白A或者凝集素。备选地，可以利用竞争测定，其中多肽用报道基团标记并允许在结合剂与样品孵育后结合固定化的结合剂。样品的组分抑制经标记的多肽与结合剂的结合的程度表明样品与固定化的结合剂的反应性。用于此类测定的适宜的多肽包括癌抗原多肽和其部分，或者结合剂结合的抗体，如上述。

固相支持体可以是本领域技术人员已知的本发明的癌抗原多肽可以附着的任何材料。例如，固相支持体可以是微量滴定板中的测试孔或者硝酸纤维素或者其他适宜的膜。备选地，支持体可以是珠子或者盘，如玻璃纤维玻璃、乳胶或者塑料材料，如聚苯乙烯或者聚氯乙烯。支持体还可以是磁性颗粒或者纤维光学传感器，如在美国专利号5,359,681中公开的那些。可以用本领域技术人员已知的多种技术将结合剂固定在固相支持体上，所述技术在专利和科学文献中详细描述。在本发明的上下文中，术语“固定化”指非共价结合，如吸附，和共价附着(其可以是试剂和支持体上官能团之间的直接连接或者可以是通过交联剂进行的连接)。优选通过吸附到微量滴定板中的孔或者吸附到膜进行固定。在此类情况中，可以通过适宜的缓冲液中的结合剂与固相支持体接触适宜的时间来实现吸附。接触时间随着温度而变，但是通常为约1小时到约1天。通常，塑料微量滴定板(如聚苯乙烯或者聚氯乙烯)的孔与约10ng到约10μg，更优选约100ng到约1μg的结合剂接触就足够固定足量的结合剂。

首先将支持体与双功能试剂反应可以通常将结合剂共价附着到固相支持体，所述双功能试剂将与支持体和结合剂上的官能团，如羟基或者氨基反应。例如，使用苯醌或者通过支持体上的醛基与结合配偶体上的胺或者活性氢缩合，可以将结合剂共价附着到具有适宜聚合物涂层的支持体(见，例如，Pierce Immunotechnology Catalog andHandbook，1991，A12-A13)。

治疗/预防性使用和组合物

在一个实施方案中，在单次推注(bolus)中提供完整抗体剂量。备选地，可以通过多次使用提供剂量，如使用延长输注方法或者通过在数小时或数天的时间内，例如，约2到约4天内施用重复注射。也参见实施例5、9和10，和表6-9。

上面描述了当化合物包含核酸或者免疫球蛋白时，可以使用的制剂和施用方法；额外的合适的制剂和施用途径可以选自下文描述的那些。

多种递送系统是已知的并且可以用于施用本发明的化合物，例如，封装在脂质体中、微粒、微囊、能够表达所述化合物的重组细胞、受体介导的内吞(见，例如，Wu and Wu，J.Biol.Chem.262：4429-4432(1987))，和构建核酸作为逆转录病毒或者其他载体的部分，等等。导入方法包括但不限于皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外和经口途径。可以通过常规途径施用化合物或组合物，例如，通过输注或者推注，通过上皮或者粘膜皮肤内层(例如，口腔粘膜、直肠和肠粘膜等等)吸收，并且可以与其他生物活性剂一起施用。施用可以是全身或局部的。此外，希望通过适宜的途径向中枢神经系统导入本发明的药物化合物或组合物，所述途径包括心室内和鞘内注射；可以通过心室内导管，例如，附着到贮库，如Ommaya贮库的导管方便心室内注射。例如，使用吸入器或者喷雾器，和具有雾化剂的制剂，可以使用经肺施用。

在特定实施方案中，希望对需要治疗的部位局部施用本发明的药物化合物或者组合物；这可以通过例如，但不限于，在手术期间局部输注、局部应用，例如与手术后伤口敷料结合，通过注射，通过导管，通过栓剂，或者通过植入物来实现，所述植入物是有孔的、无孔的、或者胶状材料，包括膜，如sialastic膜或者纤维。优选地，当施用本发明的蛋白质，包括抗体时，必须小心使用蛋白质不吸收的材料。

在另一实施方案中，化合物或者组合物可以以囊泡，尤其以脂质体递送(见Langer，Science 249：1527-1533(1990)；Treat et al.，in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer，Lopez-Berestein and Fidler(eds.)，Liss，New York，pp.353-365(1989)；Lopez-Berestein，同前，pp.317-327；一般见同前)。

在再一个实施方案中，化合物或者组合物可以以控释系统递送。在一个实施方案中，可以使用泵(见Langer，上文；Sefton，CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14：201(1987)；Buchwald et al.，Surgery 88：507(1980)；Saudek et al.，N.Engl.J.Med.321：574(1989))。在另一实施方案中，可以使用聚合物材料(见Medical Applications ofControlled Release，Langer and Wise(eds.)，CRC Pres.，BocaRaton，Florida(1974)；Controlled Drug Bioavailability，DrugProduct Design and Performance，Smolen and Ball(eds.)，Wiley，New York(1984)；Ranger and Peppas，J.，Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23：61(1983)；还参见Levy et al.，Science228：190(1985)；During et al.，Ann.Neurol.25：351(1989)；Howard et al.，J.Neurosurg.71：105(1989))。在再一个实施方案中，控释系统可以在治疗靶标，即脑附近放置，从而仅需要递送剂量的一部分(见，例如，Goodson，in Medical Applications ofControlled Release，supra，vol.2，pp.115-138(1984))。

其他控释系统由Langer(Science 249：1527-1533(1990))在综述中讨论。

在特定实施方案中，本发明的化合物是编码蛋白质的核酸，可以体内施用该核酸以促进它编码的蛋白质的表达，通过将核酸构建为适宜的核酸表达载体的一部分并将其施用从而它变成细胞内的，例如，通过使用逆转录病毒载体(见美国专利号4,980,286)，或者通过直接注射，或者通过使用微粒轰击(例如，基因枪；Biolistic，Dupont)，或者通过用脂质或者细胞表面受体或者转染试剂包被，或者通过将它与已知进入细胞核的同源异形框样肽连接后施用(见例如，Joliot etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：1864-1868(1991))等等可以实现体内施用。备选地，可以将核酸导入细胞内并通过同源重组整合到宿主细胞DNA用于表达。

本发明还提供了药物组合物。此类组合物包含治疗有效量的化合物，和可药用载体。在特定实施方案中，术语“可药用的”指得到联邦或者州政府的管理机构批准或者在美国药典或者其他公认的药典中列出用于动物，更具体地用于人。术语“载体”指与治疗剂一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或者媒介物。此类药物载体可以是无菌液体，如水和油，包括石油、动物、植物或者合成来源的，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等等。当静脉内施用药物组合物时，水是优选的载体。盐溶液和水性葡萄糖和甘油溶液也可以用作液态载体，尤其用于注射液。适宜的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙二醇、水、乙醇等等。如果希望，组合物可以还含有少量湿润剂或者乳化剂，或者pH缓冲剂。这些组合物可以为溶液剂、混悬剂、乳剂、片剂、丸剂、胶囊剂、粉剂、缓释制剂等等的形式。用常规粘合剂和载体，如甘油三酯可以将组合物配制成栓剂。经口制剂可以包括标准载体，如药物级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁，等等。适宜的药物载体的实例描述于E.W.Martin的″Remington′s Pharmaceutical Sciences″。此类组合物将含有治疗有效量的化合物，优选纯化形式的化合物，以及适宜量的载体以便提供正确施用于患者的形式。制剂将适于施用方式。

在优选实施方案中，根据常规方法将组合物配制成适于静脉内施用于人的药物组合物。通常，用于静脉内施用的组合物是无菌等渗水性缓冲液中的溶液。必要时，组合物还可以包括增溶剂和局部麻醉剂，如利多卡因，以减轻注射部位的疼痛。通常，成分单独或者以单位剂型混合提供，例如，作为密封容器如安瓿或者药囊中干燥冻干的粉剂或者无水浓缩物，所述容器指出活性剂的量。当通过输注施用组合物时，可以用含有无菌药物级水或者盐水的输注瓶分配组合物。当通过注射施用组合物时，可以提供一安瓿注射用水或者盐水从而可以在施用前混合成分。

本发明的化合物可以配制成中性或者盐形式。可药用的盐包括用阴离子或者用阳离子形成的盐，所述阴离子为例如来自氢氯酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等等的阴离子，所述阳离子为例如来自氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等等的阳离子。

可以通过标准临床技术确定在与本发明多肽的异常表达和/或活性有关的疾病或病症的治疗、抑制和预防中有效的本发明化合物的量。此外，体外测定可以任选用于帮助鉴定最佳剂量范围。用于制剂的精确剂量也取决于施用途径、疾病或病症的严重性，并且将根据从业者的判断和每位患者的情形决定。可以从来自体外或者动物模型测试系统的剂量反应曲线外推有效剂量。

对于抗体，施用于患者的剂量通常为0.1mg/kg到100mg/kg患者体重。优选地，施用于患者的剂量为0.1mg/kg到20mg/kg患者体重，更优选1mg/kg到10mg/kg患者体重。通常，由于对外来多肽的免疫反应，人抗体在人体中比来自其他物种的抗体有更长的半寿期。从而，较低剂量的人抗体和较低频率的施用通常是可能的。此外，通过修饰，如脂化，增强抗体的摄入和组织穿透(例如，进入脑)可以减少本发明抗体的剂量和施用频率。也参见实施例5。

本发明还提供了药物包装或者药盒，其包含填装本发明药物组合物的一种或多种成分的一个或多个容器。与此类容器任选结合的可以是由管理药物或者生物产品的生产、使用或销售的政府机构规定形式的布告，该布告反映了得到生产、使用或者销售的机构批准用于人类施用。

使用本领域技术人员已知的常规免疫组织学方法(见，例如Jalkanen，et al.，J.Cell.Biol.101：976-985(1985)；Jalkanen，et al.，J.Cell.Biol.105：3087-3096(1987)))，可以用抗体测定生物样品中本发明的多核苷酸编码的多肽的水平。用于检测蛋白质基因表达的其他基于抗体的方法包括免疫测定法，如酶联免疫吸附测定(ELISA)和放射免疫测定(RIA)。适宜的抗体测定标记是本领域已知的并且包括酶标记，如葡萄糖氧化酶；放射性同位素，如碘(¹³¹I、¹²⁵I、¹²³I、¹²¹I)、碳(¹⁴C)、硫(³⁵S)、氚(³H)、铟(¹¹⁵mIn、¹¹³In、¹¹²In、¹¹¹In)、和锝(⁹⁹Tc、⁹⁹mTc)、铊(²⁰¹Ti)、镓(⁶⁸Ga、⁶⁷Ga)、钯(¹⁰³Pd)、钼(⁹⁹Mo)、氙(¹³³Xe)、氟(¹⁸F)、¹⁵³Sm、¹⁷⁷Lu、¹⁵⁹Gd、¹⁴⁹Pm、¹⁴⁰La、¹⁷⁵Yb、¹⁶⁶Ho、⁹⁰Y、⁴⁷Sc、¹⁸⁶Re、⁸⁸Re、¹⁴²Pr、¹⁰⁵Rh、⁹⁷Ru；发光标记，如鲁米诺；和荧光标记，如荧光素和罗丹明，和生物素。

除了测定生物样品中本发明多肽的水平外，还可以通过成像体内检测蛋白质。用于蛋白质的体内成像的蛋白质标记或标记物包括通过X-放射照相术、NMR或者ESR可以检测的那些标记。对于X-放射照相术，适宜的标记包括放射性同位素，如钡或者铯，所述同位素发射可检测的辐射但是对受试者无明显伤害。用于NMR和ESR的适宜的标记物包括具有可检测的特征性自旋的标记物，如氘，所述标记物通过标记相关杂交瘤的营养物掺入到抗体中。

将已经用适宜的可检测的成像部分，如放射性同位素(例如，¹³¹I、¹¹²In、⁹⁹mTc、(¹³¹I、¹²⁵I、¹²³I、¹²¹I)、碳(¹⁴C)、硫(³⁵S)、氚(³H)、铟(¹¹⁵mIn、¹¹³mIn、¹¹²In、¹¹¹In)、和锝(⁹⁹Tc、⁹⁹mTc)、铊(²⁰¹Tl)、镓(⁶⁸Ga、⁶⁷Ga)、钯(¹⁰³Pd)、钼(⁹⁹Mo)、氙(¹³³Xe)、氟(¹⁸F)、¹⁵³Sm、¹⁷⁷Lu、⁵⁹Gd、¹⁴⁹Pm、¹⁴⁰La、¹⁷⁵Yb、¹⁶⁶Ho、⁹⁰Y、⁴⁷Sc、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、¹⁴²Pr、¹⁰⁵Rh、⁹⁷Ru)，不透射线的物质或者通过核磁共振可以检测的物质标记的蛋白质特异的抗体或者抗体片段导入(例如，肠胃外、皮下或者腹膜内导入)将检查免疫系统疾病的哺乳动物。本领域将理解受试者的大小和所用的成像系统将决定产生诊断图像需要的成像部分的量。对于放射性同位素部分的情况，对于人类受试者，注射的放射性的量将通常为约5到20毫居里⁹⁹mTc。标记的抗体或者抗体片段将优先积累在表达本发明的多核苷酸编码的多肽的细胞部位。体内肿瘤成像描述于S.W.Burchiel et al.，″Immunopharmacokinetics of Radiolabeled Antibodies and TheirFragments″(Chapter 13 in Tumor Imaging：The RadiochemicalDetection of Cancer，S.W.Burchiel and B.A.Rhodes，eds.，Masson Publishing Inc.(1982))。

在一个实施方案中，本发明提供了通过施用与异源多肽或者核酸结合的本发明多肽(例如，本发明的多核苷酸编码的多肽和/或抗体)特异递送本发明的组合物的方法。在一个实例中，本发明提供了向靶细胞递送治疗性蛋白质的方法。在另一实例中，本发明提供了向靶细胞递送单链核酸(例如，反义或者核酶)或者双链核酸(例如，整合到细胞的基因组或者附加型复制并且可以转录的DNA)的方法。

本领域已知的技术可以用于标记本发明的多肽(包括抗体)。此类技术包括，但不限于，使用双功能缀合剂(见，例如，美国专利号5,756,065；5,714,631；5,696,239；5,652,361；5,505,931；5,489,425；5,435,990；5,428,139；5,342,604；5,274,119；4,994,560；和5,808,003；将每篇专利的内容完整引入本文作为参考)。

基因疗法

在特定实施方案中，通过基因疗法施用包含编码诸如C35抗体或者其功能衍生物的序列的核酸以治疗、抑制或者预防与C35的异常表达和/或活性相关的疾病或者病症。基因疗法指通过对受试者施用表达的或者可表达的核酸进行治疗。在本发明的该实施方案中，核酸产生了它们编码的蛋白质，所述蛋白质介导治疗效果。

根据本发明可以使用本领域可利用的任何一种基因治疗方法。示例性方法在下文描述。

对于基因治疗方法的一般综述，见Goldspiel et al.，ClinicalPharmacy 12：488-505(1993)；Wu and Wu，Biotherapy 3：87-95(1991)；Tolstoshev，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32：573-596(1993)；Mulligan，Science 260：926-932(1993)；和Morgan andAnderson，Ann.Rev.Biochem.62：191-217(1993)；May，TIBTECH11(5)：155-215(1993)。可以使用的本领域公知的重组DNA技术的方法描述于Ausubel et al.(eds.)，Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley & Sons，NY(1993)；and Kriegler，GeneTransfer and Expression，A Laboratory Manual，Stockton Press，NY(1990)。

在优选方面，化合物包含编码抗体的核酸序列，所述核酸序列是表达载体的一部分，所述表达载体在适宜的宿主中表达抗体或者其片段或者嵌合蛋白或者重链或轻链。具体地，此类核酸序列具有与抗体编码区有效连接的启动子，所述启动子是诱导型或组成型的，并且任选为组织特异的。在另一具体实施方案中，使用核酸分子，其中抗体编码序列和任意其他希望的序列的侧翼是这样的区域，该区域在基因组的目标部位促进同源重组，从而提供抗体编码核酸的染色体内表达(Koller and Smithies，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：8932-8935(1989)；Zijlstra et al.，Nature 342：435-438(1989)。在特定实施方案中，所表达的抗体分子是单链抗体；备选地，核酸序列包括编码抗体的重链和轻链两者或者其片段的序列。

核酸向患者的递送可以是直接的，在该情况中患者直接暴露于核酸或者携带核酸的载体，或者是间接的，在该情况中细胞首先用核酸体外转化，然后植入患者。这两种方法分别已知为体内和离体基因疗法。

在特定实施方案中，直接体内施用核酸序列，其中它表达而产生编码的产物。这可以通过本领域已知的多种方法的任一种实现，例如，通过将它们构建为适宜的核酸表达载体的部分并将其施用从而它们变成细胞内的，例如，通过用缺陷的或者减毒的逆转录病毒或者其他病毒载体感染(见，美国专利号4,980,286)，或者通过直接注射裸DNA，或者通过使用微粒轰击(例如，基因枪；Biolistic，Dupont)，或者通过用脂质或者细胞表面受体或者转染试剂包被，封装在脂质体、微粒或者微囊中，或者通过将它们与已知进入细胞核的肽连接后施用，与受到受体介导的内吞的配体连接后施用(其可以用于靶定特异表达受体的细胞类型)(见，例如，Wu and Wu，J.Biol.Chem.262：4429-4432(1987))等等。在另一实施方案中，可以形成核酸-配体复合物，其中配体包含用于破坏内体的促融病毒肽，允许核酸避免溶酶体降解。在再一个实施方案中，通过靶定特定受体，核酸可以体内靶定用于细胞特异吸收和表达(见，例如，PCT公开WO 92/06180；WO92/22635；WO92/20316；WO93/14188，WO 93/20221)。备选地，可以将核酸导入细胞内并通过同源重组掺入宿主细胞DNA用于表达(Koller and Smithies，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：8932-8935(1989)；Zijlstra et al.，Nature 342：435-438(1989))。

在特定实施方案中，使用含有编码本发明抗体的核酸序列的病毒载体。例如，可以使用逆转录病毒载体(见Milier et al.，Meth.Enzymol.217：581-599(1993))。这些逆转录病毒载体含有病毒基因组正确包装和整合到宿主细胞DNA所需的组分。将编码用于基因治疗的抗体的核酸序列克隆到一个或多个载体，这促进了基因向患者的递送。关于逆转录病毒载体的更多细节可以见Boesen et al..Biotherapy 6：291-302(1994)，其描述了使用逆转录病毒载体递送mdrl基因到造血干细胞以使得干细胞对化学治疗更具抗性。阐明在基因疗法中使用逆转录病毒载体的其他参考文献为：Clowes et al.，J.Clin.Invest.93：644-651(1994)；Kiem et al.，Blood83：1467-1473(1994)；Salmons and Gunzberg，Human Gene Therapy4：129-141(1993)；和Grossman and Wilson，Curr.Opin.inGenetics and Devel.3：110-114(1993)。

腺病毒是可以用于基因疗法的其他病毒载体。腺病毒是用于将基因递送到呼吸上皮的特别吸引人的载体。腺病毒天然地感染呼吸上皮，在这里它们导致轻微疾病。基于腺病毒的递送系统的其他靶标是肝脏、中枢神经系统、内皮细胞，和肌肉。腺病毒的优点是能够感染非分裂的细胞。Kozarsky and Wilson，Current Opinion in Genetics andDevelopment 3：499-503(1993)给出了基于腺病毒的基因疗法的综述。Bout et al.，Human Gene Therapy 5：3-10(1994)阐明使用腺病毒载体将基因转移到猕猴的呼吸上皮。腺病毒在基因疗法中使用的其他实例可以见Rosenfeld et al.，Science 252：431434(1991)；Rosenfeld et al.，Cell 68：143-155(1992)；Mastrangeli et al.，J.Clin.Invest.91：225-234(1993)；PCT公开WO94/12649；和Wang，et al.，Gene Therapy 2：775-783(1995)。在优选实施方案中，使用腺病毒载体。

也已经提出将腺伴随病毒(AAV)用于基因疗法(Walsh et al.，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.204：289-300(1993)；美国专利号5,436,146)。

基因治疗的另一种方法包括将基因转移到组织培养物的细胞中，这可以使用诸如电穿孔、脂转染、磷酸钙介导的转染或者病毒感染的方法。通常，转移方法包括将选择性标记转移到细胞。然后选择细胞以分离已经摄入并且正表达转移的基因的那些细胞。然后将那些细胞递送到患者。

在该实施方案中，在体内施用所得重组细胞前向细胞导入核酸。此类导入可以通过本领域已知的任意方法进行，这些方法包括但不限于，转染、电穿孔、微注射、用含有核酸序列的病毒或者噬菌体载体感染、细胞融合、染色体介导的基因转移、微细胞介导的基因转移、原生质球融合等等。本领域已知多种技术可以向细胞导入外来基因(见，例如，Loeffler and Behr，Meth.Enzymol.217：599-618(1993)；Cohen et al.，Meth.Enzymol.217：618-644(1993)；Cline，Pharmac.Ther.29：69-92m(1985)并且可以根据本发明使用，条件是受体细胞的必要的发育和生理功能未受破坏。该技术将提供核酸向细胞的稳定转移，从而该核酸可以由细胞表达并且优选是可以通过它的后代遗传和表达的。

通过本领域已知的多种方法可以向患者递送所得重组细胞。优选静脉内施用重组血细胞(例如，造血干细胞或者祖细胞)。设想的使用的细胞量取决于所希望的效果、患者状态等等，并且可以由本领域技术人员决定。

为了基因治疗目的，可以导入核酸的细胞包括任意希望的、可以利用的细胞类型，并且包括但不限于上皮细胞、内皮细胞、角质细胞、成纤维细胞、肌细胞、肝细胞；血细胞，如T淋巴细胞、B淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、巨核细胞、粒细胞；多种干细胞或祖细胞，尤其造血干细胞或祖细胞，例如，如从骨髓、脐血、外周血、胎儿肝脏等等得到的造血干细胞或祖细胞。

在优选实施方案中，用于基因治疗的细胞是患者自体的。

在其中重组细胞用于基因治疗的实施方案中，将编码抗体的核酸序列导入细胞，从而它们可以由细胞或者它们的后代表达，然后体内施用重组细胞以得到治疗效果。在特定实施方案中，使用干细胞或祖细胞。可以分离并体外保存的任何干细胞/或祖细胞都可以根据本发明的该实施方案使用(见例如PCT公开WO 94/08598；Stemple andAnderson，Cell 71：973-985(1992)；Rheinwald，Meth.Cell Bio.21A：229(1980)；和Pittelkow and Scott，Mayo Clinic Proc.61：771(1986))。

在特定实施方案中，为了基因治疗目的导入的核酸包含有效连接编码区的可诱导的启动子，从而核酸的表达可以通过控制转录的适宜诱导物的存在和缺失来控制。

过度增殖性疾病

本发明的方法可以用于治疗过度增殖疾病、病症和/或障碍，包括赘生物。

可以用本发明的方法治疗的过度增殖疾病、病症和/或障碍的实例包括但不限于，位于如下部位的瘤：前列腺、结肠、腹部、骨、乳腺、消化系统、肝脏、胰腺、腹膜、内分泌腺(肾上腺、甲状旁腺、垂体、睾丸、卵巢、胸腺、甲状腺)、眼、头和颈、神经(中枢和外周神经)、淋巴系统、骨盆、皮肤、软组织、脾、胸和泌尿生殖器。

此类过度增殖疾病的其他实例包括，但不限于：急性儿童成淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性髓性白血病、肾上腺皮质癌、成人(原发)肝细胞癌、成人(原发)肝癌、成人急性淋巴细胞性白血病、成人急性髓性白血病、成人何杰金病、成人何杰金淋巴瘤、成人淋巴细胞性白血病、成人非何杰金淋巴瘤、成人原发肝癌、成人软组织肉瘤、艾滋病相关的淋巴瘤、艾滋病相关的恶性肿瘤、肛门癌、星形细胞瘤、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑干神经胶质瘤、脑瘤、乳腺癌、肾盂和输尿管癌、中枢神经系统(原发)淋巴瘤、中枢神经系统淋巴瘤、小脑星形细胞瘤、大脑星形细胞瘤、子宫颈癌、儿童(原发)肝细胞癌、儿童(原发)肝癌、儿童急性成淋巴细胞性白血病、儿童急性髓性白血病、儿童脑干神经胶质瘤、儿童小脑星形细胞瘤、儿童大脑星形细胞瘤、儿童颅外生殖细胞肿瘤、儿童何杰金病、儿童何杰金淋巴瘤、儿童下丘脑和视通路神经胶质瘤、儿童成淋巴细胞性白血病、儿童成神经管细胞瘤、儿童非何杰金淋巴瘤、儿童松果体和幕上原始神经外胚层肿瘤、儿童原发肝癌、儿童横纹肌肉瘤、儿童软组织肉瘤、儿童视通路和下丘脑神经胶质瘤、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、结肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤、内分泌胰岛细胞癌、子宫内膜癌、室管膜瘤、上皮癌、食管癌、尤因肉瘤和相关肿瘤、外分泌胰腺癌、颅外生殖细胞瘤、性腺外生殖细胞瘤、肝外胆管癌、眼癌、女性乳腺癌、高歇氏病、胆囊癌、胃癌、胃肠类癌瘤、胃肠肿瘤、生殖细胞瘤、妊娠性滋养层细胞瘤、毛细胞白血病、头颈癌、肝细胞癌、何杰金病、何杰金淋巴瘤、高γ球蛋白血症、咽下癌、肠癌、眼内黑素瘤、胰岛细胞癌、胰岛细胞胰腺癌、卡波西肉瘤、肾癌、喉癌、唇和口腔癌、肝癌、肺癌、淋巴增生性障碍、巨球蛋白血症、男性乳癌、恶性间皮细胞瘤、恶性胸腺瘤、成神经管细胞瘤、黑素瘤、间皮瘤、转移性隐性原发性鳞状细胞颈癌、转移性原发性鳞状细胞颈癌、转移性鳞状细胞颈癌、多发性骨髓瘤、多发性骨髓瘤/浆细胞瘤、骨髓增生异常综合征、髓细胞性白血病、髓性白血病、骨髓增生病、鼻腔和鼻旁窦癌、鼻咽癌、成神经细胞瘤、怀孕期间非何杰金淋巴瘤、非黑素瘤皮肤癌、非小细胞肺癌、隐性原发性转移鳞状细胞颈癌、口咽癌、骨/恶性纤维肉瘤、骨肉瘤/恶性纤维组织细胞瘤、骨肉瘤/骨的恶性纤维组织细胞瘤、卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞瘤、卵巢低恶性潜力肿瘤、胰腺癌、病变蛋白血、紫癜、甲状旁腺癌、阴茎癌、嗜铬细胞瘤、垂体瘤、浆细胞瘤/多发性骨髓瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、原发性肝癌、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌、肾盂和输尿管癌、成视网膜细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、肉样瘤病、塞扎里综合征、皮肤癌、小细胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状细胞颈癌、胃癌、幕上原始神经外胚层和松果体瘤、T细胞淋巴瘤、睾丸癌、胸腺瘤、甲状腺癌、肾盂和输尿管的移行细胞癌、过渡性肾盂和输尿管癌、滋养层细胞瘤、输尿管和肾盂细胞癌、尿道癌、子宫癌、子宫肉瘤、阴道癌、视通路和下丘脑神经胶质瘤、外阴癌、特发性巨球蛋白血、维尔姆斯肿瘤和除了瘤形成外，位于上面列出的器官系统中的任意其他过度增殖性疾病。

本发明的方法可以用于治疗恶化前状况和预防发展到瘤性或者恶性状态，包括但不限于，上面描述的那些疾病。此类应用适应于已知或者怀疑在发展到瘤形成或者癌症前的状况，尤其其中已经发生了由增生、组织变形或者最尤其发育异常组成的非瘤性细胞生长(关于此类异常生长状况的综述，见Robbins and Angell，1976，BasicPathology，2d Ed.，W.B.Saunders Co.，Philadelphia，pp.68-79.)。

增生是受控的细胞增殖的形式，涉及组织或者器官中细胞数目的增加，在结构或功能中没有显著改变。通过本发明的方法可以治疗的增生疾病包括但不限于，血管滤泡纵隔淋巴结增生、嗜酸细胞增多性血管淋巴样增生、非典型黑素细胞增生、基底细胞增生、良性大淋巴结增生、牙骨质增生、先天性肾上腺增生、先天性皮脂腺增生、囊性增生病、乳腺囊性增生病、牙列增生、导管增生、子宫内膜增生、纤维肌性增生、局灶性上皮增生、牙龈增生、炎性纤维增生、炎症性乳头状增生、血管内乳头状内皮增生、前列腺结节性增生、结节再生性增生、假性上皮瘤性增生、老年皮脂腺增生、和疣状增生。

组织变形是受控的细胞生长的一种形式，其中一种类型的成熟或者完全分化的细胞取代另一种类型的成熟细胞。通过本发明的方法可以治疗的组织变形疾病包括，但不限于，特发性骨髓外化生、顶浆分泌腺化生、非典型组织变形、autoparenchymatous组织变形、结缔组织组织变形、上皮化生、肠化生、组织变形性贫血、化生性骨化、化生性息肉、髓样化生、原发髓样化生、继发性髓样化生、鳞状化生、羊膜的鳞状化生和症状性髓样化生。

发育异常通常是癌症的先兆，主要在上皮中发生；它是非瘤性细胞生长的最无序的形式，涉及个体细胞一致性和细胞的结构定向的丧失。发育异常的细胞通常具有异常大、深度染色的细胞核，并且显示出多型现象。当存在慢性刺激或炎症时，特征性地发生发育异常。通过本发明的方法可以治疗的发育异常疾病包括但不限于，无汗性外胚叶发育不全、anterofacial dysplasia、窒息性胸廓发育异常、心房-手指发育不良、支气管肺发育异常、大脑发育异常、宫颈非典型增生、软骨外胚层发育不良、锁骨颅骨发育不全、先天性外胚叶发育不良、craniodiaphysial dysplasia、颅腕跖骨发育不全、craniometaphysial dysplasia、牙本质发育异常、骨干发育异常、外胚层发育不良、釉质发育异常、脑性眼球发育不全、偏侧骨骺发育不良、多发性骨骺发育不良、亨纳曼综合征、上皮异常增生、面-指(趾)-生殖器综合征、颌骨纤维性结构不良、familial white foldeddysplasia、纤维肌性发育异常、纤维性骨结构不良、旺盛骨性发育不良、遗传性肾-视网膜发育异常、出汗性外胚层发育不良、少汗性外胚叶发育不全、lymphopenic胸腺发育不全、乳腺结构不良、下颌面发育异常、干骨后端发育异常、Mondini发育异常、单骨纤维性骨发育不良、mucoepitheilal发育异常、多发性骺发育异常、眼耳脊椎发育不良、眼-牙-指(趾)发育不良、眼椎骨发育不全、牙原性发育异常、眼下颌支发育不全、根尖周牙骨质异常增生、多发性骨纤维性发育不良、pseudoachondroplastic spondyloepiphysial dysplasia、视网膜发育异常、隔-视力发育异常、spondyloepiphysial发育异常、和ventriculoradial发育异常。

通过本发明的方法可以治疗的额外的肿瘤发生前疾病包括但不限于，良性过度增殖性疾病(例如，良性肿瘤、纤维囊性疾病、组织肥大、肠息肉、结肠息肉、和食管发育异常)、粘膜白斑病、角化病、上皮内上皮瘤、农民皮肤、日光性唇炎和日光性角化病。

在优选实施方案中，本发明的方法用于抑制癌，尤其上面所列癌的生长、发展和/或转移。

通过本发明的方法可以治疗的与增加的细胞存活有关的额外疾病和病症包括但不限于，恶性肿瘤和相关疾病的发展和/或转移，如白血病(包括急性白血病(例如，急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病(包括成髓细胞、前髓细胞、髓单核细胞、单核细胞和红细胞白血病))和慢性白血病(例如，慢性髓细胞性(粒细胞性)白血病和慢性淋巴细胞性白血病))、真性红细胞增多症、淋巴瘤(例如，何杰金病和非何杰金病)、多发性骨髓瘤、特发性巨球蛋白血、重链病和实体瘤，包括但不限于，肉瘤和癌，如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、Wilm瘤、子宫颈癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、emangioblastoma、听神经瘤、少突神经胶质瘤、menangioma、黑素瘤、成神经细胞瘤和成视网膜细胞瘤。

通过本发明的方法可以治疗的过度增殖性疾病和/或病症包括但不限于，位于肝脏、腹部、骨、乳腺、消化系统、胰腺、腹膜、内分泌腺(肾上腺、甲状旁腺、垂体、睾丸、卵巢、胸腺、甲状腺)、眼、头和颈、神经系统(中枢和外周的)、淋巴系统、骨盆、皮肤、软组织、脾脏、胸腔和泌尿生殖道中的癌。

类似地，通过本发明的方法也可以治疗其他过度增殖性疾病。此类过度增殖性疾病的实例包括但不限于：高γ球蛋白血、淋巴增生性障碍、病变蛋白血、紫癜、肉样瘤病、塞扎里综合征、Waldenstron巨球蛋白血症、高歇病、组织细胞增多病，和除了瘤形成外，位于上面所列器官系统中的任意其他过度增殖性疾病。

治疗活性的阐明

在人体中使用前，本发明的方法和抗体优选在体外测试，然后在体内测试所希望的治疗或者预防活性。例如，用于阐明化合物或者药物组合物的治疗或者预防效用的体外测定包括化合物对细胞或者患者组织样品的效果。化合物或组合物对细胞和/或组织样品的效果可以用本领域技术人员已知的技术确定，所述技术包括但不限于，玫瑰花瓣状形成测定和细胞裂解测定。根据本发明，可以用于确定特定化合物的施用是否合适的体外测定包括体外细胞培养测定，其中将患者组织样品培养生长，并暴露于或者对其施用化合物，并观察该化合物对组织样品的效应。

试剂盒

本发明提供了可以用于上面方法的试剂盒。在一个实施方案中，试剂盒包含在一个或多个容器中的本发明的抗体，优选纯化的抗体。在特定实施方案中，本发明的试剂盒含有基本上分离的多肽，该多肽包含与该试剂盒中包括的抗体特异免疫反应的表位。优选地，本发明的试剂盒还包含不与目的多肽反应的对照抗体。在另一特定实施方案中，本发明的试剂盒含有检测抗体与目的多肽的结合的手段(例如，抗体可以缀合可检测的底物，如荧光化合物、酶促底物、放射性化合物或者发光化合物，或者识别一级抗体的二级抗体可以缀合到可检测的底物)。

在本发明的另一特定实施方案中，所述试剂盒是诊断试剂盒，其用于筛选含有对增殖性和/或癌性多核苷酸和多肽特异的抗体的血清。此类试剂盒可以包括不与目的多肽反应的对照抗体。此类试剂盒可以包括基本上分离的多肽抗原，其包含与至少一种抗多肽抗原抗体特异免疫反应的表位。此外，此类试剂盒可以包括检测所述抗体与所述抗原结合的手段(例如，抗体可以缀合荧光化合物，如荧光素或者罗丹明，其可以通过流式细胞术检测)。在特定实施方案中，试剂盒可以包括重组产生的或者化学合成的多肽抗原。试剂盒的多肽抗原可以附着到固相支持体。

在更特定实施方案中，上述试剂盒的检测手段包括所述多肽抗原附着的固相支持体。此类试剂盒还可以包括未附着的报道分子标记的抗人抗体。在该实施方案中，抗体与多肽抗原的结合可以通过所述报道分子标记的抗体的结合检测。

在额外实施方案中，本发明包括诊断试剂盒，其用于筛选含有本发明多肽的抗原的样品。该诊断试剂盒包括与多肽或者多核苷酸抗原特异免疫反应的基本上分离的抗体和检测所述多核苷酸或者多肽抗原与抗体反应的手段。在一个实施方案中，抗体附着到固相支持体。在特定实施方案中，抗体可以是单克隆抗体。试剂盒的检测手段可以包括二级的、经标记的单克隆抗体。备选地，或者附加地，检测手段可以包括经标记的竞争抗原。

在一种诊断方案中，试样与固相试剂反应，该固相试剂具有通过本发明的方法得到的表面结合的抗原。特异抗原抗体与试剂结合并通过洗涤除去未结合的样品组分后，试剂与报道分子标记的抗人抗体反应以将报道分子与固相支持体上结合的抗-抗原抗体的量成比例地结合试剂。再次洗涤试剂以除去未结合的标记抗体，并测定与试剂结合的报道分子的量。通常报道分子是酶，通过在适宜的荧光、发光或者量热底物(Sigma，St.Louis，Mo.)存在下通过孵育固相支持体可以检测所述酶。

通过用于将蛋白质材料附着到固相支持体材料的已知技术制备上面测定中的固体表面试剂，所述固相支持体材料为诸如聚合物珠、标尺、96孔板或者过滤材料。这些附着方法通常包括蛋白质与支持体的非特异吸附或者蛋白质的共价附着，通常是通过游离胺基共价附着到固相支持体上的化学反应基，如活化的羧基、羟基或者醛基。备选地，链霉抗生物素蛋白包被的板可以与生物素化的抗原结合使用。

从而，本发明提供了用于进行该诊断方法的测定系统或者试剂盒。该试剂盒通常包括具有表面结合的重组抗原的支持体，和用于检测表面结合的抗-抗原抗体的报道分子标记的抗人抗体。

细胞凋亡诱导疗法

细胞凋亡诱导疗法包括化学治疗剂(也称作抗肿瘤剂)、放射疗法和放射疗法和化学疗法的联合。

示例性化学治疗剂是长春花碱类、鬼臼乙叉甙、蒽环类抗生素、放线菌素D、普卡霉素、嘌呤霉素、短杆菌肽D、紫杉醇(Taxol.RTM.，Bristol Myers Squibb)、秋水仙碱、细胞松弛素B、吐根碱、美登素和胺苯吖啶(或者″mAMSA″)。长春花碱类在Goodman和Gilman的ThePharmacological Basis of Therapeutics(7th ed.)，(1985)，pp.1277-1280中描述。长春花碱类的代表是长春新碱、长春碱和长春地辛。鬼臼乙叉甙类在Goodman和Gilman的The PharmacologicalBasis of Therapeutics(7th ed.)，(1985)，pp.1280-1281中描述。鬼臼乙叉甙的代表是依托泊苷、依托泊苷邻醌和替尼泊苷。蒽环类抗生素在Goodman和Gilman的The Pharmacological Basis ofTherapeutics(7th ed.)，(1985)，pp.1283-1285中描述。蒽环类抗生素的代表是柔红霉素、阿霉素、米托蒽醌和必桑郡。放线菌素D也称作更生霉素，在Goodmand和Gilman的The PharmacologicalBasis of Therapeutics(7th ed.)，(1985)，pp.1281-1283中描述。普卡霉素也称作光辉霉素，在Goodmand和Gilman的ThePharmacological Basis of Therapeutics(7th ed)，(1985)，pp.1287-1288中描述。额外的化学治疗剂包括顺铂(Platinol.RTM.，Bristol Myers Squibb)，卡铂(Paraplatin.RTM.，Bristol MyersSquibb)，丝裂霉素(Mutamycin.RTM.，Bristol Myers Squibb)，六甲密胺(Hexalen.RTM.，U.S.Bioscience，Inc.)，环磷酰胺(Cytoxan.RTM.，Bristol Myers Squibb)，罗氮芥(CCNU)(CeeNU.RTM.，Bristol Myers Squibb)，卡氮芥(BCNU)(BiCNU.RTM.，Bristol Myers Squibb)。

示例性化学治疗剂还包括阿克拉希霉素A、阿克拉霉素、阿克罗宁、山油柑碱、阿霉素、阿地白介素(白介素-2)、六甲密胺(六甲基密胺)、氨鲁米特、氨鲁米特(cytadren)、氨基咪唑羧酰胺、胺苯吖啶(m-AMSA；amsidine)、阿那曲唑(瑞宁得)、环胞苷、anthracyline、氨茴霉素、天冬酰胺酶(elspar)、氮杂胞苷、氮杂胞苷(阿扎胞苷)、氮杂鸟嘌呤、氮丝氨酸、氮尿苷、1，1′，1″-phosphinothioylidynetris氮丙啶、azirino(2′、3′：3，4)吡咯并(1，2-a)吲哚-4，7-二酮、BCG(theracys)、BCNU、BCNU氯乙基亚硝脲、苯甲酰胺、4-(二(2-氯乙基)氨基)苯丁酸、比卡鲁胺、二氯乙基亚硝脲、博来霉素、博来霉素(blenozane)、博来霉素、溴脱氧尿苷、溴尿苷、白消安(马利兰)、氨基甲酸乙酯、卡铂、卡铂(paraplatin)、卡氮芥、卡氮芥(BCNU；BiCNU)、苯丁酸氮芥(leukeran)、氯乙基亚硝脲、chorozotocin(DCNU)、色霉素A3、顺式-视黄酸、顺铂(cis-ddpl；platinol)、克拉屈滨(2-氯脱氧腺苷；2cda；克拉立平)、助间型霉素、环亮氨酸、环磷酰胺、无水环磷酰胺、苯丁酸氮芥、阿糖胞苷、阿糖胞苷、阿糖胞苷HCl(cytosar-u)、2-脱氧-2-(((甲基亚硝基氨基)羰基)氨基)-D-葡萄糖、达卡巴嗪、更生霉素(cosmegen)、柔红霉素、柔红霉素HCl(cerubidine)、氨烯咪胺、氨烯咪胺(DTIC-dome)、地美可辛、地塞米松、二去水矛醇、重氮氧代正亮氨酸、己烯雌酚、多西他赛(taxotere)、阿霉素HCl(adriamycin)、盐酸阿霉素、依洛尼塞、雌莫司汀、雌莫司汀磷酸钠(emcyt)、乙碘油、依托格鲁、氨基甲酸乙酯、甲磺酸乙酯、依托泊苷(VP16-213)、维甲酰酚胺、氟尿苷、氟尿苷(fudr)、氟达拉滨(fludara)、氟尿嘧啶(5-FU)、氟氢甲睾酮(halotestin)、氟他米特、氟他米特(eulexin)、fluxuridine、硝酸镓(granite)、西他滨(gemzar)、染料木黄酮、2-脱氧-2-(3-甲基-3-nitrosoureido)-D-吡喃葡萄糖、戈舍瑞林(zoladex)、己烷雌酚、羟基脲(hydra)、伊达比星(idamycin)、ifosfagemcitabine、异环磷酰胺(iflex)、异环磷酰胺与美司钠(MAID)、干扰素、α干扰素、α干扰素-2a、α-2b、α-n3、白细胞介素-2、碘苄胍、碘苄胍碘苄胍、依立替康(camptosar)、异维甲酸(accutane)、酮康唑、4-(二(2-氯乙基)氨基)-L-苯丙氨酸、L-丝氨酸重氮基醋酸酯、香菇多糖、亚叶酸、醋酸亮丙瑞林(LHRH-类似物)、左旋咪唑(ergamisol)、罗氮芥(CCNU；cee-NU)、甘露莫司汀、美登素、氮芥、氮芥HCl(氮芥)、醋酸甲羟孕酮(普维拉、depo provera)、醋酸甲地孕酮(menace)、醋酸美仑孕酮、苯丙氨酸氮芥(alkeran)、美洛格瑞、巯嘌呤、巯嘌呤(purinethol)、无水巯嘌呤、MESNA、美司钠(mesne)、甲磺酸乙酯、氨甲喋呤(mtx；氨甲喋呤)、赛氮芥、含羞草碱、醚醇硝唑、光辉霉素、米托蒽醌、二溴甘露醇、丙米腙、二溴卫矛醇、丝裂霉素(mutamycin)、丝裂霉素C、米托坦(o，p′-DDD；lysodren)、米托蒽醌、米托蒽醌HCl(novantrone)、单哌潘生丁、N，N-双(2-氯乙基)四氢-2H-1，3，2-oxazaphosphorin-2-胺-2-氧化物、N-(1-甲基乙基)-4-((2-甲基肼基)甲基)苯甲酰胺、N-甲基-双(2-氯乙基)胺、尼卡地平、尼鲁米特(nilandron)、嘧啶亚硝脲、二胺硝吖啶、氮芥、洛可达唑、诺加拉霉素、奥曲肽(sandostatin)、紫杉醇(taxon)、紫杉醇、密旋霉素、天门冬酰胺酶(PEGx-1)、喷司他丁(2′-脱氧柯福霉素)、培来霉素、苯丙氨酸芥肽、photophoresis、普卡霉素(mithracin)、溶血链球菌Su、哌泊溴烷、普卡霉素、普达非洛、鬼臼毒素、泊非霉素、泼尼松、甲基苄肼、甲基苄肼HCl(matulane)、prospidium、嘌呤霉素、嘌呤霉素氨基核苷、PUVA(补骨脂素+紫外线a)、吡喃共聚物、雷帕霉素、s-氮胞苷、2，4，6-三(1-氮丙啶基)-s-三嗪、甲环亚硝脲、焦土霉素、西罗莫司、链脲霉素(zanosar)、苏拉明、柠檬酸他莫昔芬(nolvadex)、taxon、喃氟啶、替尼泊苷(VM-26；vumon)、细格孢氮杂酸、TEPA、睾内酯、噻替哌、硫鸟嘌呤、噻替哌(thioplex)、替洛龙、拓扑替康、维甲酸(vesanoid)、三亚胺醌、木霉素、环氧甘醚、三亚胺嗪、三亚乙基磷酰胺、噻替哌、曲美沙特(neutrexin)、三(1-氮丙啶基)氧化膦、三(1-氮丙啶基)硫化膦、三(氮丙啶基)-对-苯醌、三(氮丙啶基)硫化膦、尿嘧啶氮芥、阿糖腺苷、磷酸阿糖腺苷、长春碱、硫酸长春碱(velban)、硫酸长春新碱(oncovin)、长春地辛、长春瑞滨、长春瑞滨(navelbine)、(1)-含羞草碱、1-(2-氯乙基)-3-(4-甲基环己基)-1-亚硝脲、(8S-顺式)-10-((3-氨基-2，3，6-三脱氧-α-L-lyxo-hexopyranosyl)氧)-7，8，9，10-四氢-6，8、11-三羟基-8-(羟基乙酰基)-1-甲氧基-5，12-萘并萘二酮、131-间-碘代苄基胍(I-131 MIBG)、5-(3，3-二甲基-1-三氮烯基)-1H-咪唑-4-羧酰胺、5-(二(2-氯乙基)氨基)-2，4(1H，3H)-嘧啶二酮、2，4，6-三(1-氮丙啶基)-s-噻嗪、2，3，5-三(1-氮丙啶基)-2，5-环己二烯-1，4-二酮、2-氯-N-(2-氯乙基)-N-甲基乙胺、N，N-二(2-氯乙基)四氢-2H-1，3，2-oxazaphosphorin-2-胺-2-氧化物、3-去氮杂尿苷、3-碘代苄基胍、5，12-萘并萘二酮、5-氮胞苷、5-氟尿嘧啶、(1aS，8S，8aR，8bS)-6-氨基-8-(((氨基羰基)氧基)甲基)-1，1a，2，8，8a，8b-六氢-8a-甲氧基-5-甲基azirino(2′，3′：3，4)吡咯并(1，2-a)吲哚-4，7-二酮、6-氮尿苷、6-巯嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤、和其组合。

可以作为细胞凋亡诱导疗法施用的优选的治疗剂和组合包括阿霉素和Doxetaxel、拓扑替康、紫杉醇、卡铂和紫杉酚、紫杉酚、顺铂和放射、5-氟尿嘧啶(5-FU)、5-FU和放射、Toxotere、氟达拉滨、Ara C、依托泊苷、长春新碱和长春碱。

示例性化学治疗剂还包括doxetaxel(TOXOTERE)和拓扑替康(HYCAMTIN)。

可以在本发明的方法中施用的化学治疗剂包括，但不限于，抗生素衍生物(例如，阿霉素、博来霉素、柔红霉素和更生霉素)；抗雌激素药(例如，他莫昔芬)；抗代谢物(例如，氟尿嘧啶、5-FU、氨甲喋呤、氟尿苷、α干扰素-2b、谷氨酸、普卡霉素、巯嘌呤、和6-硫代鸟嘌呤)；细胞毒性剂(例如，卡氮芥、BCNU、罗氮芥、CCNU、阿糖胞苷、环磷酰胺、雌莫司汀、羟基脲、甲基苄肼、丝裂霉素C、白消安、顺铂和硫酸长春新碱)；激素(例如，甲羟孕酮、磷雌氮芥、乙炔基雌二醇、雌二醇、醋酸甲地孕酮、甲睾酮、二磷酸己烯雌酚、氯烯雌醚和睾内酯)；氮芥衍生物(例如，mephalen、chorambucil、氮芥和噻替哌)；类固醇和组合(例如，倍他米松磷酸酯钠)；和其它(例如，达卡巴嗪、天冬酰胺酶、曼托坦、硫酸长春新碱、硫酸长春碱、和依托泊苷)。

在特定实施方案中，本发明的抗体与CHOP(环磷酰胺、阿霉素、长春新碱和泼尼松)的组合或者CHOP组分的任意组合一起施用。在另一实施方案中，本发明的抗体与利妥昔单抗(Rituximab)组合施用。在另一实施方案中，本发明的抗体与利妥昔单抗和CHOP，或者利妥昔单抗和CHOP的任意组分的组合施用。

表4：用于主要癌症适应症的常用的化学治疗药物

1.乳腺癌：佐剂疗法(全身疗法，作为手术的辅助或者附加疗法)。阿霉素(Adriamycin)、环磷酰胺和紫杉烷类[紫杉醇(Taxol)和多西他赛(Taxotere)]。这三种药物对转移性乳腺癌也有活性，但是如果患者已经接受它们作为辅助疗法，那么常用的药物是卡培他滨(Xeloda)、吉西他滨(Gemzar)、长春瑞滨(Navelbine)。激素受体阳性肿瘤的骨转移的通常开处方的激素治疗剂是他莫昔芬和芳香酶抑制剂(瑞宁得、弗隆、阿诺新)。
	2.结肠癌：5-FU加亚叶酸、伊立替康(camptosar)、奥沙利铂和卡培他滨。
3.肺癌：顺铂、卡铂、紫杉醇、多西他赛、吉西他滨、长春瑞滨。
	4.前列腺癌：多西他赛、雌莫司汀、米托蒽醌(Novantrone)、和泼尼松。
5.非何杰金淋巴瘤：环磷酰胺、阿霉素、长春新碱(Oncovin)、和泼尼松。

治疗性放射包括例如，分次放射治疗、非分次放射治疗和超分次放射治疗，和放射与化学治疗的组合。放射的类型还包括电离(γ)放射、粒子辐射、低能量传递(LET)、高能量传递(HET)、紫外辐射、红外辐射、可见光、和光敏化辐射。本文所用的化学治疗包括用一种化学治疗剂或者用治疗剂的组合进行治疗。在需要治疗的受试者中，化学治疗可以与手术治疗或者放射治疗组合，或者与其他抗肿瘤治疗形式组合。

其他治疗剂

在另一实施方案中，本发明的抗体与抗病毒剂组合施用。可以与本发明的抗体一起施用的抗病毒剂包括，但不限于阿昔洛维、利巴韦林、金刚烷胺和remantidine。

本发明的抗体还可以与止吐剂，如2-(乙基硫代)-10-(3-(4-甲基-1-哌嗪基)丙基)-10H-吩噻嗪(乙基硫代培拉嗪)、1-(对-氯-α-苯基苄基)-4-(间-甲基苄基)-哌嗪(美克洛嗪，氯苯甲嗪)等等，和它们的组合施用。本发明的多核苷酸和多肽还可以与本文公开或者本领域已知的其他治疗剂，和它们的组合施用。

在另一实施方案中，本发明的抗体与抗生素治疗剂组合施用。可以与本发明的抗体施用的抗生素治疗剂包括，但不限于，阿莫西林、β-内酰胺酶、氨基糖甙类、β-内酰胺(糖肽)、β-内酰胺酶、克林霉素、氯霉素、先锋霉素类、环丙沙星、环丙沙星、红霉素、氟喹诺酮类、大环内酯类、甲硝唑、青霉素类、喹诺酮类、利福平、链霉素、氨苯磺胺、四环素类、甲氧苄氨嘧啶、甲氧苄氨嘧啶-sulfamthoxazole和万古霉素。

可以与本发明的抗体组合施用的常规非特异免疫抑制剂包括，但不限于，类固醇类、环胞菌素、环胞菌素类似物、环磷酰胺甲基泼尼松、泼尼松、硫唑嘌呤、FK-506、15-脱氧精胍菌素、和其他通过抑制反应性T细胞的功能起作用的免疫抑制剂。

在特定实施方案中，本发明的抗体与免疫抑制剂组合施用。可以与本发明的抗体施用的免疫抑制剂制剂包括，但不限于，ORTHOCLONE.TM.(OKT3)、SANDIMMUNE.TM./NEORAL.TM./SANGDYA.TM.(环胞菌素)、PROGRAF.TM.(他克莫司)、CELLCEPT.TM(麦考酚酯)、硫唑嘌呤、糖皮质类固醇和RAPAMUNE.TM.(西罗莫司)。在特定实施方案中，免疫抑制剂可以用于预防器官或者骨髓移植的排斥。

在额外实施方案中，本发明的抗体单独或者与一种或多种静脉内免疫球蛋白制剂组合施用。可以与本发明的抗体施用的静脉内免疫球蛋白制剂包括，但不限于，GAMMAR.TM.、IVEEGAM.TM.、SANDOGLOBULIN.TM.、GAMMAGARD S/D.TM.、和GAMIMUNE.TM.。在特定实施方案中，本发明的抗体与静脉内免疫球蛋白制剂组合在移植疗法(例如，骨髓移植)中施用。

在额外实施方案中，本发明的抗体单独或者与消炎剂组合施用。可以与本发明的抗体施用的消炎剂包括，但不限于，糖皮质激素和非类固醇消炎剂、氨基芳基羧酸衍生物、芳基乙酸衍生物、芳基丁酸衍生物、芳基羧酸、芳基丙酸衍生物、吡唑、吡唑酮、水杨酸衍生物、噻嗪羧酰胺、e-乙酰氨基己酸、S-腺苷甲硫氨酸、3-氨基-4-羟基丁酸、阿米西群、苄吲酸、苄达明、丁环己巴比妥、联苯吡胺、地他唑、依莫法宗、愈创蓝油烃、萘普酮、尼美舒利、奥古蛋白、奥沙西罗、瑞尼托林、哌异噁唑、哌酰苯肟、普罗喹宗、胺丙噁二唑和替尼达普。

在另一实施方案中，本发明的抗体与化学治疗剂组合施用。可以与本发明的抗体施用的化学治疗剂包括，但不限于，抗生素衍生物(例如，阿霉素、博来霉素、柔红霉素和更生霉素)；抗雌激素药(例如，他莫昔芬)；抗代谢物(例如，氟尿嘧啶、5-FU、氨甲喋呤、氟尿苷、α干扰素-2b、谷氨酸、普卡霉素、巯嘌呤、和6-硫代鸟嘌呤)；细胞毒性剂(例如，卡氮芥、BCNU、罗氮芥、CCNU、阿糖胞苷、环磷酰胺、雌莫司汀、羟基脲、甲基苄肼、丝裂霉素、白消安、顺铂和硫酸长春新碱)；激素(例如，甲羟孕酮、雌莫司汀磷酸酯钠、乙炔基雌二醇、雌二醇、醋酸甲地孕酮、甲睾酮、二磷酸己烯雌酚、氯烯雌醚和睾内酯)；氮芥其它(例如，mephalen、chorambucil、氮芥和噻替哌)；类固醇和组合(例如，倍他米松磷酸酯钠)；和其它(例如，达卡巴嗪、天冬酰胺酶、曼托坦、硫酸长春新碱、硫酸长春碱、和依托泊苷)。

在特定实施方案中，本发明的抗体与CHOP(环磷酰胺、阿霉素、长春新碱和泼尼松)组合或者CHOP组分的任意组合施用。在另一实施方案中，本发明的抗体与利妥昔单抗组合施用。在另一实施方案中，本发明的抗体与利妥昔单抗和CHOP，或者利妥昔单抗和CHOP的任意组分的组合施用。

在额外实施方案中，本发明的抗体与细胞因子组合施用。可以与本发明的抗体施用的细胞因子包括，但不限于，IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL10、IL12、IL13、IL15、抗-CD40、CD40L、IFN-γ和TNF-α。在另一实施方案中，本发明的抗体可以与任意白介素施用，所述白介素包括但不限于，IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20和IL-21。

在额外实施方案中，本发明的抗体与血管生成蛋白质组合施用。可以与本发明的抗体施用的血管生成蛋白质包括，但不限于，神经胶质瘤衍生生长因子(GDGF)(如欧洲专利号EP-399816中公开)；血小板衍生生长因子-A(PDGF-A)(如欧洲专利号EP-682110中公开)；血小板衍生生长因子-B(PDGF-B)(如欧洲专利号EP-282317中公开)；胎盘生长因子(PIGF)(如国际公开号WO 92/06194中公开)；胎盘生长因子-2(PIGF-2)(如Hauser et al.，Gorwth Factors，4：259-268(1993)中公开)；血管内皮生长因子(VEGF)(如国际公开号WO 90/13649中公开)；血管内皮生长因子A(VEGF-A)(如欧洲专利号EP-506477中公开)；血管内皮生长因子-2(VEGF-2)(如国际公开号WO 96/39515中公开)；血管内皮生长因子B(VEGF-3)；血管内皮生长因子B-186(VEGF-B186)(如国际公开号WO 96/26736中公开)；血管内皮生长因子-D(VEGF-D)(如国际公开号WO 98/02543中公开)；血管内皮生长因子-D(VEGF-D)(如国际公开号WO 98/07832中公开)；和血管内皮生长因子-E(VEGF-E)(如德国专利号DE19639601中公开)。将上面的参考文献引入本文作为参考。

在额外实施方案中，本发明的抗体与造血生长因子组合施用。可以与本发明的抗体施用的造血生长因子包括，但不限于，LEUKINE.TM.(SARGRAMOSTIM.TM.)和NEUPOGEN.TM.(FILGRASTIM.TM.)。

在额外实施方案中，本发明的抗体与成纤维细胞生长因子组合施用。可以与本发明的抗体施用的成纤维细胞生长因子包括，但不限于，FGF-1、FGF-2、FGF-3、FGF-4、FGF-5、FGF-6、FGF-7、FGF-8、FGF-9、FGF-10、FGF-11、FGF-12、FGF-13、FGF-14和FGF-15。

实施例1

放射诱导的细胞凋亡后暴露于乳腺肿瘤细胞的表面膜上的C35

将表达C35肿瘤抗原的连续生长的乳腺肿瘤细胞系用300Gy辐射或者不处理。在体外连续培养数天以允许发生细胞凋亡后，收获细胞，将其洗涤并用50ng 1F2单克隆抗-C35抗体或者小鼠IgG抗体对照染色，所述抗体都缀合荧光染料Alexa 647。在25℃孵育50分钟后，使用标准商业试剂盒(Pharmingen)将细胞用膜联蛋白V和碘化丙锭(PI)染色。通过流式细胞术，使用标准方案分析细胞用膜联蛋白V、碘化丙锭和Alexa 647的染色。

图1的结果显示没有经历细胞凋亡(膜联蛋白V阴性)的未处理的活细胞(PI阴性)不在表面膜上表达C35，如用抗-C35抗体和同种型对照抗体不存在差别染色所证明的(图1A)。类似地，保持存活(PI阴性)和诱导但不经历细胞凋亡(膜联蛋白V阴性)的放射的肿瘤细胞也不在肿瘤细胞表面膜上表达C35(图1B)。形成鲜明对照的是，存活(PI阴性)但是经历细胞凋亡(膜联蛋白V阳性)的经放射的肿瘤细胞用抗-35抗体与同种型对照抗体相比清楚地差别染色(图1C)。

实施例2

药物诱导的细胞凋亡后乳腺肿瘤细胞的表面膜上暴露的C35

将表达C35肿瘤抗原的连续生长的乳腺肿瘤细胞系用6ug/ml丝裂霉素C处理或者不处理。在体外连续培养48小时以允许发生细胞凋亡后，收获细胞，将其洗涤并用50ng 1F2单克隆抗-C35抗体或者小鼠IgG抗体对照染色，所述抗体都缀合荧光染料Alexa 647。在25℃孵育50分钟后，使用标准商业试剂盒(Pharmingen)将细胞用膜联蛋白V和碘化丙锭(PI)染色。通过流式细胞术，使用标准方案分析细胞用膜联蛋白V、碘化丙锭和Alexa 647的染色。

图2的结果显示没有经历细胞凋亡(膜联蛋白V阴性)的未处理的活细胞(PI阴性)不在表面膜上表达C35，如用抗-C35抗体和同种型对照抗体不存在差别染色所证明的(图2A)。类似地，保持存活(PI阴性)和没有诱导经历细胞凋亡(膜联蛋白V阴性)的丝裂霉素C处理的细胞也不在肿瘤细胞表面膜上表达C35(图2B)。形成鲜明对照的是，存活(PI阴性)但是经历细胞凋亡(膜联蛋白V阳性)的丝裂霉素C处理的肿瘤细胞用抗-35抗体与同种型对照抗体相比清楚地差别染色(图2C)。

实施例3

哺乳动物细胞中抗体的表达

本发明的多肽可以在哺乳动物细胞中表达。典型的哺乳动物表达载体含有介导mRNA转录启动的启动子元件、蛋白质编码序列和转录终止和转录物多聚腺苷酸化所需的信号。额外的元件包括增强子、Kozak序列和间插序列，其侧翼是RNA剪接的供体和受体位点。用来自SV40的早期和晚期启动子、来自逆转录病毒(例如RSV、HTLVI、HIVI)的长末端重复序列(LTR)和来自巨细胞病毒(CMV)的早期启动子实现高度有效转录。然而，也可以使用细胞元件(例如，人肌动蛋白启动子)。

用于实践本发明的适宜的表达载体包括，例如，诸如pSVL和pMSG(Pharmacia，Uppsala，Sweden)、pRSVcat(ATCC 37152)、pSV2dhfr(ATCC 37146)、pBC12MI(ATCC 67109)、pCMVSport 2.0和pCMVSport3.0的载体。可以使用的哺乳动物宿主细胞包括人Hela、293、H9和Jurkat细胞、小鼠NIH3T3和C127细胞、Cos 1、Cos 7和CV1、quailQC1-3细胞、小鼠L细胞和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。

备选地，多肽可以在含有掺入到基因组的多核苷酸的稳定细胞系中表达。用选择性标记，如DHFR、gpt、新霉素、潮霉素共转染允许鉴定和分离转染的细胞。

也可以扩增转染的基因以大量表达编码的蛋白质。DHFR(二氢叶酸还原酶)标记可用于开发携带数百或者甚至数千拷贝的目的基因的细胞系(见，例如，Alt，F.W.，et al.，J.Biol.Chem.253：1357-1370(1978)；Hamlin，J.L.and Ma，C.，Biochem.et Biophys.Acta，1097：107-143(1990)；Page，M.J.and Sydenham，M.A.，Biotechnology 9：64-68(1991).)。另一种有用的选择标记是谷氨酰胺合酶(GS)(Murphy et al.，Biochem J.227：277-279(1991)；Bebbington et al.，Bio/Technology 10：169-175(1992)。使用这些标记，哺乳动物细胞生长在选择培养基中并且选择具有最高抗性的细胞。这些细胞系含有整合到染色体的扩增的基因。中国仓鼠卵巢(CHO)和NSO细胞通常用于产生蛋白质。

质粒pSV2-dhfr(ATCC检索号37146)、表达载体pC4(ATCC检索号209646)和pC6(ATCC检索号209647)的衍生物含有劳氏肉瘤病毒的强启动子(LTR)(Cullen et al.，Molecular and Cellular Biology，438-447(March，1985))和CMV-增强子的片段(Boshart et al.，Cell41：521-530(1985).)。多克隆位点，例如具有限制酶切割位点BamHI、XbaI和Asp718的多克隆位点允许克隆目的基因。载体还含有3’内含子、大鼠前胰岛素原基因的多聚腺苷酸化和终止信号，和处于SV40早期启动子控制下的小鼠DHFR基因。

特别地，例如，将质粒pC6用适宜的限制酶消化然后通过本领域已知的步骤使用小牛肠磷酸酶去磷酸化。然后从1％琼脂糖凝胶分离载体。

根据本领域已知的方案扩增本发明的多核苷酸。如果用天然发生的信号序列产生本发明的多肽，那么载体不需要第二种信号肽。备选地，如果不使用天然发生的信号序列，那么可以修饰载体以包含异源信号序列(见，例如，WO 96/34891.)。

用通过商业途径可获得的试剂盒(″Geneclean，″BIO 101 Inc.，LaJolla，Calif.)从1％琼脂糖凝胶分离扩增的片段。然后将该片段用适宜的限制酶消化并在1％琼脂糖凝胶上再次纯化。

然后将扩增片段用相同的限制酶消化并在1％琼脂糖凝胶上纯化。然后将分离的片段和去磷酸化的载体用T4DNA连接酶连接。然后转化大肠杆菌HB101或XL-1 Blue细胞并使用例如限制酶分析鉴定含有插入质粒pC6的片段的细菌。

缺少活性DHFR基因的中国仓鼠卵巢细胞用于转染。用lipofectin将5mu.g表达质粒pC6或pC4与0.5mu.g质粒pSVneo共转染(Felgneret al.，如前)。质粒pSV2-neo含有显性选择标记，来自Tn5的neo基因(编码赋予对包括G418的一组抗生素的抗性的酶)。将细胞接种在补加1mg/ml G418的alpha minus MEM中。2天后，将细胞用胰蛋白酶消化并接种在杂交瘤克隆板(Greiner，Germany)中补加10、25或50ng/ml氨甲蝶呤加上1mg/ml G418的alpha minus MEM中。约10-14天后，将单个克隆用胰蛋白酶处理并接种在6孔培养皿中或者10ml培养瓶中，使用不同浓度的氨甲蝶呤(50nM、100nM、200nM、400nM、800nM)。然后将在最高浓度的氨甲蝶呤中生长的克隆转移到含有甚至更高浓度氨甲蝶呤(1uM、2uM、5uM、10mM、20mM)的6孔板中。重复相同的步骤直到获得生长在100-200uM浓度的克隆。通过例如，SDS-PAGE和蛋白质印迹或者通过反相HPLC分析法分析所希望的基因产物的表达。

实施例4

放射标记的C-35特异抗体浓集在表达C35的活肿瘤的坏死区中

将BALB/c小鼠在相对的两个侧腹移植同基因小细胞肺癌来源的系1肿瘤细胞，其已经用人C35转染或者没有转染。通过用抗-C35抗体进行免疫组织化学染色证实C35蛋白质表达。体内生长14天后，动物接受静脉内注射¹²⁵I-标记的抗-C35抗体。注射放射标记的抗体后120小时处死动物并通过将肿瘤切片对胶片曝光确定C35阳性和C35阴性肿瘤中抗-C35抗体的浓度。如图4中所示，放射标记的C-35抗体仅在C35阳性并且不在C-35阴性肿瘤中浓集。比较肿瘤内完整细胞的标记分布和H&E染色证实在这些条件下标记的抗C-35抗体在C35阳性肿瘤的坏死区中特异浓集。

实施例5

施用剂量测定法的(dosimetric)和治疗性放射标记的抗体的方案

以注射形式在静脉内或者动脉内施用放射标记的抗体(或者抗体片段)组合物，其包括剂量测定法的放射标记的抗体和治疗性放射标记抗体。可注射的放射标记的抗体组合物将在5分钟到约60分钟，优选约15分钟到30分钟时间内输入静脉或者动脉。当肿瘤由已知的动脉供应时，动脉内施用优选适用于治疗性放射标记的抗体组合物。剂量测定法的放射标记的抗体和治疗性放射标记的抗体将作为生理磷酸缓冲盐溶液或者适于肠胃外注射的其他载体中的无菌水溶液施用。最初剂量测定法的放射标记的抗体剂量将约为5-100mg抗体，其将递送约5-50mCi放射。施用剂量测定法的剂量后约5-10天，治疗性放射标记的抗体将以约10-500mg的剂量施用，其对于每个治疗剂量将递送多达300mCi放射。该剂量测定法/治疗方案可以重复。也参见US5,057,313和US 5,120,525。

实施例6

将抗-C35小鼠和人抗体可变区基因克隆到保藏的TOPO克隆中

将免疫球蛋白重链和轻链可变区通过V区的PCR扩增并TA克隆到TOPO载体中从而克隆到TOPO载体(Invitrogen)中。该连接系统不需要限制酶消化(尽管TOPO载体掺入EcoRI位点以允许插入片段的随后切除)。TA克隆利用Taq聚合酶的PCR扩增产物中天然加入的3’A突出端，该突出端可以与TOPO克隆试剂盒(Invitrogen)中提供的线性化载体的5’T突出端配对。

为了PCR扩增用于插入TOPO的可变区基因，我们利用与恒定区序列(对于重链和轻链是不同的并且对于小鼠和人也是不同的)的5’末端互补的下游引物并且通过5’RACE使用Invitrogen GeneRacer试剂盒在可变区的5’末端加入已知的固定化引物序列。这些方法是本领域技术人员公知的。

实施例7

将来自保藏的TOPO克隆的可变基因克隆到pCMV表达构建体

产生pCMV表达构建体

痘苗转移质粒-pVHE、pVKE和pVLE-的构建已经在以前的专利申请(US 2002 0123057 A1，“In vitro Methods of Producing andIdentifying Immunoglobulin Molecules in Eukaryotic Cells”，2002-09-05公布)中描述。为了产生哺乳动物表达载体来表达免疫球蛋白重链和轻链，从这些痘苗转移质粒切除从NotI到SalI的表达盒并克隆到pCMV-Script载体(其在载体多克隆位点中的XhoI位点通过填充和钝端连接而破坏)，产生pCMV-VH、pCMV-VK和pCMV-VL载体。这些表达盒含有信号肽、V基因的克隆位点和来自膜结合的μ重链和κ轻链基因的恒定区。

在pCMV-VH中，表达盒含有从相对于起始密码子氨基酸位置-19[aa(-19)]到aa(-3)的信号肽，接着是VH基因的aa(109到113)和完整重链恒定区。所选的VH基因(从aa(-4)到aa(110))可以克隆到pCMV-VH中BssHII[aa(-4到-3)]和BstEII[aa(109-110)]位点。

在pCMV-VK(kappa)中，表达盒含有从aa(-19)到aa(-2)的信号肽，接着是VK基因的aa(104到107)和完整κ链恒定区。所选的VK基因(从aa(-3)到aa(105))可以克隆到pCMV-VK中ApaLI[aa(-3到-2)]和XhoI[aa(104-105)]位点。

在pCMV-VL(lambda)中，表达盒含有从aa(-19)到aa(-2)的信号肽，接着是VL基因的aa(103到107)和完整κ链恒定区。所选的VL基因(从aa(-3)到aa(104))可以克隆到pCMV-VL中ApaLI[aa(-3到-2)]和HindIII[aa(103-104)]位点。所得λ轻链将显示出VλCκ嵌合结构。

为了将所选抗体表达为分泌型人IgG1，通过RT-PCR从B细胞或者骨髓细胞克隆IgG1的恒定区。使用的引物对为：

5’正向引物：5’-ATTAGGATCCGGTCACCGTCTCCTCAGCC-3’(SEQ IDNO：15)

3’反向引物：5’-ATTAGTCGACTCATTTACCCGGAGACAGGGA-3’(SEQ IDNO：16)

所得PCR产物显示出下面的结构：BamHI-BstEII(aa109-110)-(aa111-113)-Cγ₁-TGA-SalI。使用标准方案将PCR产物亚克隆到pBluescriptII/KS中BamHI和SalI位点以进行定点诱变，从而通过沉默突变除去CH1区的内部BstEII。然后一旦VH基因亚克隆到该载体中的BssHII/BstEII处，将所得Cγ₁亚克隆到pCMV-VH中BstEII和SalI以产生pCMV-Cγ₁用来指导分泌型IgG1重链的表达。

用于插入V基因的分泌型IgG1、人γ1重链前导序列和恒定区盒的序列如下。

下划线＝限制位点

粗体＝恒定区

粗体/斜体＝信号肽

Not1          NcoI

gcggcZcgcaaa ccatgggatggagctgtatcatcctcttcttggtagcaacagctacag

BssHII        BsteII

gcgcgcatat ggtcaccgtctcctcagcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggcac

cctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttcc

ccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccgg

ctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtcgtgaccgtgccctccagcagct

tgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaaga

aagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcc

tggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccgga

cccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaact

ggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaaca

gcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagt

acaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagcca

aagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaaga

accaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtggg

agagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggct

ccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttct

catgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccct

                 Sal1

Gtctccgggtaaatga gtcgac(SEQ ID NO：17)

用于插入Vκ基因的人轻链前导序列和κ恒定区盒的序列如下。

Not1          NcoI

gcggccgcaaa ccatgggatggagctgtatcatcctcttcttggtagcaacagctacag

ApaL1         XhoI

gc gtgcacttga ctcgagatcaaacgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgcca

tctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatccc

agagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagt

gtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaa

gcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcaccc

                                                      Sal1

Atcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgttag gtcgac

(SEQ ID NO：18)

用于插入Vλ基因的人轻链前导序列和κ恒定区盒的序列如下。

Not 1          Nco1

gcggccgcaaa ccatgggatggagctgtatcatcctcttcttggtagcaacagctacag

ApaL1              HindIII

gc gtgcacttgactcgag aagcttaccgtcctacgaactgtggctgcaccatctgtcttcatc

ttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataac

ttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcc

caggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacg

ctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctg

agctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt

   SAL 1

Tag gtcgac(SEQ ID NO：19)

为了构建表达其他同种型的分泌型人抗体(包括IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgD、IgE和IgM的分泌型)的载体，可以用相同方法克隆各自恒定区，诱变任意内部BstEII位点，并在pCMV-Cγ₁载体的BstEII和SalI位点之间用其他同种型的恒定区替代Cγ₁。

为了克隆其他同种型的恒定区，使用下面的引物对：

IgG2-F：5’-ATTAGGATCCGGTCACCGTCTCCTCAGCC-3’(SEQ IDNO：20)

IgG2-R：5’-ATTAGTCGACTCATTTACCCGGAGACAGGGA-3’(SEQ IDNO：21)

IgG3-F：5’-ATTAGGATCCGGTCACCGTCTCCTCAGCT-3’(SEQ IDNO：22)

IgG3-R：5’-ATTAGTCGACTCATTTACCCGGAGACAGGGA-3’(SEQ IDNO：23)

IgG4-F：5’-ATTAGGATCCGGTCACCGTCTCCTCAGCT-3’(SEQ IDNO：24)

IgG4-R：5’-ATTAGTCGACTCATTTACCCAGAGACAGGGA-3’(SEQ IDNO：25)

IgA1-F：5’-ATTAGGATCCGGTCACCGTCTCCTCAGCAT-3’(SEQ IDNO：26)

IgA1-R：5’-ATTAGTCGACTCAGTAGCAGGTGCCGTCCAC-3’(SEQ IDNO：27)

IgA2-F：5’-ATTAGGATCCGGTCACCGTCTCCTCAGCAT-3’(SEQ IDNO：28)

IgA2-R：5’-ATTAGTCGACTCAGTAGCAGGTGCCGTCCAC-3’(SEQ IDNO：29)

IgD-F：5’-ATTAGGATCCGGTCACCGTCTCCTCAGCAC-3’(SEQ IDNO：30)

IgD-R：5’-ATTAGTCGACTCATTTCATGGGGCCATGGTC-3’(SEQ IDNO：31)

IgE-F：5’-ATTAGGATCCGGTCACCGTCTCCTCAGCC-3’(SEQ IDNO：32)

IgE-R：5’-ATTAGTCGACTCATTTACCGGGATTTACAGA-3’(SEQ IDNO：33)

IgM-F：5’-ATTAGGATCCGGTCACCGTCTCCTCAGGG-3’(SEQ IDNO：34)

IgM-R：5’-ATTAGTCGACTCAGTAGCAGGTGCCAGCTGT-3’(SEQ IDNO：35)

注意到因为高度序列保守性，所用的引物在IgG1和IgG2之间、IgG3和IgG4之间、IgA1和IgA2之间相同。

将来自Topo克隆的可变基因克隆到pCMV表达构建体。

步骤1：产生V-基因片段

A.人v-基因

MMH1

1.使用标准方法用BssHII(GCGCGC(SEQ ID NO：36))和BsteII(GGTCACC(SEQ ID NO：37))消化MMH1质粒DNA(克隆H0009)。

2.用标准方法在琼脂糖凝胶上分离DNA。

3.用标准方法从凝胶切除357bp片段并分离DNA。

  MMK1

1.用标准方法使用ApaL1(GTGCAC(SEQ ID NO：38))和Xho1(CTCGAG(SEQ ID NO：39))消化MMK1质粒DNA(克隆L0010)。

2.用标准方法在琼脂糖凝胶上分离DNA。

3.用标准方法从凝胶切除343bp片段并分离DNA。

B.小鼠杂交瘤v-基因：

  1F2 VK

1.必须使用下面的引物从ATCC保藏的克隆1F2K PCR扩增小鼠杂交瘤v基因。这对于在人κ轻链恒定区表达盒中产生具有人恒定区的小鼠v-基因的嵌合抗体是必要的。

1F2VK正向引物：

5’-tatcc gtgcactccCAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCAG-3’(SEQ ID NO：40)

1F2VK反向引物：

5’-atatt ctcgAGCTTGGTCCCCCCTCCGAA-3’(SEQ ID NO：41)

(小写＝不与小鼠1F2 VK同源，包括限制性位点。大写＝与小鼠1F2VK序列同源)

2.使用标准方法用ApaL1(GTGCAC(SEQ ID NO：42))和Xho1(CTCGAG(SEQ ID NO：43))消化331bp PCR产物。

3.用标准方法在琼脂糖凝胶上分离DNA。

4.用标准方法从凝胶切除315bp片段并分离DNA。

1F2 VH

1.必须使用下面的引物从ATCC保藏的克隆1F2G PCR扩增小鼠杂交瘤v基因。这对于在人重链恒定区表达盒中产生具有人恒定区的小鼠v-基因的嵌合抗体是必要的。

1F2VH正向引物：

5’-tataa gcgcgcactccGATGTACAGCTTCAGGAGTCAGGAC (SEQ ID NO：44)

1F2VH反向引物：

5′-atatt gGTGACCAGAGTCCCTTGGCCCC-3′(SEQ ID NO：45)

(小写＝非同源的，含有限制性位点。大写＝同源的)

2.用标准方法使用BssHII(GCGCGC(SEQ ID NO：36))和BsteII(GGTCACC(SEQ ID NO：37))消化360bp PCR产物。

3.用标准方法在琼脂糖凝胶上分离DNA。

4.用标准方法切除含有343bp的DNA消化片段的凝胶片并分离DNA。

1B3VK

1.必须使用下面的引物从保藏的克隆1B3K通过PCR扩增小鼠杂交瘤v基因。这对于在人κ轻链恒定区表达盒中产生具有人恒定区的小鼠v-基因的嵌合抗体是必要的。

1B3VK正向引物：

5’-tatcc gtgcactccGATGTCCAGATAACCCAGTCTCCATC-3’(SEQ IDNO：46)

1B3VK反向引物：

5’-atatt ctcgAGCTTGGTCCCAGCACCGAA-3’(SEQ ID NO：47)

(小写＝非同源的，含有限制性位点。大写＝同源的)

2.使用标准方法用ApaL1(GTGCAC(SEQ ID NO：42))和Xho1(CTCGAG(SEQ ID NO：43))消化334bp PCR产物。

3.用标准方法在琼脂糖凝胶上分离DNA。

4.用标准方法切除含有消化的322bp的DNA片段的凝胶片并分离DNA。

1B3VH

1.必须使用下面的引物从保藏的克隆1B3G通过PCR扩增小鼠杂交瘤v基因。这对于在人重链恒定区表达盒中产生具有人恒定区的小鼠v-基因的嵌合抗体是必要的。

1B3VH正向引物：

5’-tataa gcgcgcactccGAGGTGCAGCTTCAGGAGTCAGGAC-3’(SEQ IDNO：48)

1B3VH反向引物：

5’-atatt GGTGACCGTGGTCCCAGCG-3’(SEQ ID NO：49)

(小写＝非同源的，含有限制性位点。大写＝同源的)

2.使用标准方法用BssHII(GCGCGC(SEQ ID NO：36))和BsteII(GGTCACC(SEQ ID NO：37))消化378bp PCR产物。

3.用标准方法在琼脂糖凝胶上分离DNA。

4.用标准方法切除含有366bp消化的DNA片段的凝胶片并分离DNA。

步骤2：表达构建体的装配

1.用标准方法使用适宜的酶消化pCMV-VH和pCMV-VK表达载体：

a. pCMV-VH-BsteII和BssHII

b. pCMV-VK-ApaL1和XhoI

2.用标准方法在琼脂糖凝胶上分离DNA并切除线性化的载体。

3.用标准方法从凝胶片分离DNA。

4.用标准方法将轻链v基因连接到pCMV-VK并将重链v-基因连接到pCMV-VH。

5.用标准方法将连接的DNA转化到感受态细胞并分离质粒DNA。

实施例8

免疫球蛋白恒定区的序列

下面的基因和编码的氨基酸序列可以用于制备人源化抗体、人变异抗体、嵌合抗体，和其片段。

免疫球蛋白恒定区的智人G2基因(IgG2(n-)同种异型)(GenBank号Z49802)(SEQ ID NO：50)

  1 tcttctctct gcagagcgea aatgttgtgt cgagtgccca ccgtgcccag gtaagccagc

 61 ccaggcctcg ccctccagct caaggcggga caggtgccct agagtagcct gcatccaggg

121 acaggcccca gctgggtgct gacacgtcca cctccatetc ttcctcagca ccacctgtgg

181 caggaccgtc agtcttcctc ttccccccaa aacccaagga caccctcatg atctcccgga

241 cccctgaggt cacgtgcgtg gtggtggacg tgagccacga agaccccgag gtccagttca

301 actggtacgt ggacggcgtg gaggtgcata atgccaagac aaagccacgg gaggagcagt

361 tcaacagcac gttccgtgtg gtcagcgtcc tcaccgttgt gcaccaggac tggctgaacg

421 gcaaggagta caagtgcaag gtctccaaca aaggcctccc agcccccatc gagaaaacca

481 tctccaaaac caaaggtggg acccgcgggg tatgagggcc acatggacag acggcggctt

541 cggcccaccc tctgccctgg gagtgaccgc tgtgccaacc tctgtcccta cagggcagcc

601 ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggag gagatgacca agaaccaggt

661 cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta ccccagcgac atcgccgtgg agtgggagag

721 caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacacctccc atgctggact ccgacggctc

781 cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg tggcagcagg ggaacgtctt

841 ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac acgcagaaga gcctctccct

901 gtctccgggt aaatgagtgc cacggccggc aagcc

免疫球蛋白恒定区的智人G2基因(IgG2(n+)同种异型)(GenBank号Z49801)(SEQ ID NO：51)

  1 tcttctctct gcagagcgca aatgttgtgt cgagtgccca ccgtgcccag gtaagccagc

 61 ccaggcctcg ccctccagct caaggcggga caggtgccct agagtagcct gcatccaggg

121 acaggcccca gctgggtgct gacacgtcca cctccatctc ttcctcagca ccacctgtgg

181 caggaccgtc agtcttcctc ttccccccaa aacccaagga caccctcatg atctcccgga

241 cccctgaggt cacgtgcgtg gtggtggacg tgagccacga agaccccgag gtccagttca

301 actggtacgt ggacggcatg gaggtgcata atgccaagac aaagccacgg gaggagcagt

361 tcaacagcac gttccgtgtg gtcagcgtcc tcaccgtcgt gcaccaggac tggctgaacg

421 gcaaggagta caagtgcaag gtctccaaca aaggcctccc agcccccatc gagaaaacca

481 tctccaaaac caaaggtggg acccgcgggg tatgagggcc acatggacag acggcggctt

541 cggcccaccc tctgccctgg gagtgaccgc tgtgccaacc tctgtcccta cagggcagcc

601 ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggag gagatgacca agaaccaggt

661 cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta ccccagcgac atcgccgtgg agtgggagag

721 caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacacctccc atgctggact ccgacggctc

781 cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg tggcagcagg ggaacgtctt

841 ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac acacagaaga gcctctccct

901 gtctccgggt aaatgagtgc cacggccggc aagcc

编码免疫球蛋白恒定区重链α-2亚基的智人CH基因(GenBankNo.AJ012264)(SEQ ID NO：52)

  1 ctcgaggacc tgctcttagg ttcagaagcg aacctcacgt gcacactgac cggcctgaga

 61 gatgcctctg gtgccacctt cacctggacg ccctcaagtg ggaagagcgc tgttcaagga

121 ccacctgagc gtgacctctg tggctgctac agcgtgtcca gtgtcctgcc tggctgtgcc

181 cagccatgga accatgggga gaccttcacc tgcactgctg cccaccccga gttgaagacc

241 ccactaaccg ccaacatcac aaaatccggt gggtccagac cctgctcggg gccctgctca

301 gtgctctggt ttgcaaagca tattcctggc ctgcctcctc cctcccaatc ctgggctcca

361 gtgctcatgc caagtacaca gggaaactga ggcaggctga ggggccagga cacagcccag

421 ggtgcccacc agagcagagg ggctctctca tcccctgccc agccccctga cctggctctc

481 taccctccag gaaacacatt ccggcccgag gtccacctgc tgccgccgcc gtcggaggag

541 ctggccctga acgagctggt gacgctgacg tgcctggcac gtggcttcag ccccaaggat

601 gtgctggttc gctggctgca ggggtcacag gagctgcccc gcgagaagta cctgacttgg

661 gcatcccggc aggagcccag ccagggcacc accacctacg ctgtaaccag catactgcgc

721 gtggcagctg aggactggaa gaagggggag accttctcct gcatggtggg ccacgaggcc

781 ctgccgctgg ccttcacaca gaagaccatc gaccgcatgg cgggtaaacc cacccacatc

 841 aatgtgtctg ttgtcatggc ggaggcggat ggcacctgct actgagccgc ccgcctgtcc

 901 ccacccctga ataaactcca tgctccccca agcagcccca cgcttccatc cggcgcctgt

 961 ctgtccatcc tcagggtctc agcacttggg aaagggccag ggcatggaca gggaagaata

1021 ccccctgccc tgagcctcgg ggggcccctg gcacccccat gagactttcc accctggtgt

1081 gagtgtgagt tgtgagtgtg agagtgtgtg gtgcaggagg cctcgctggt gtgagatctt

1141 aggtctgcca aggcaggcac agcccaggat gggttctgag agacgcacat gccccggaca

1201 gttctgagtg agcagtggca tggccgtttg tccctgagag agccgcctct ggctgtagct

1261 gggagggaat agggagggta aaaggagcag gctagccaag aaaggcgcag gtagtggcag

1321 gagtggcgag ggagtgaggg gctggactcc agggccccac tgggaggaca agctccagga

1381 gggccccacc accctagtgg gtgggcctca ggacgtccca ctgacgcatg caggaagggg

1441 cacctcccct taaccacact gctctgtacg gggcacgtgg gcacacatgc acactcacac

1501 tcacatatac gcctgagccc tgcaggagtg gaacgttcac agcccagacc cagttccaga

1561 aaagccaggg gagtcccctc ccaagccccc aagctcagcc tgctccccca ggcccctctg

1621 gcttccctgt gtttccactg tgcacagctc agggaccaac tccacagacc cctcccaggc

1681 agcccctgct ccctgcctgg ccaagtctcc catcccttcc taagcccaac taggacccaa

1741 agcatagaca gggaggggcc gcgtggggtg gcatcagaag

智人恒定区重链α-2亚基(GenBank No.CAA09968.1)(SEQ IDNO：53)

LEDLLLGSEANLTCTLTGLRDASGATFTWTPSSGKSAVQGPPER

DLCGCYSVSSVLPGCAQPWNHGETFTCTAAHPELKTPLTANITKSGNT

FRPEVHLLPPPSEELALNELVTLTCLARGFSPKDVLVRWLQGSQELPRE

KYLTWASRQEPSQGTTTYAVTSILRVAAEDWKKGETFSCMVGHEALP

LAFTQKTIDRMAGKPTHINVSVVMAEADGTCY

智人免疫球蛋白重链恒定区α1(IGHA1基因)的部分mRNA(GenBank No.AJ294729)(SEQ ID NO：54)

  1 gcaagcttga ccagccccaa ggtcttcccg ctgagcctct gcagcaccca gccagatggg

 61 aacgtggtca tcgcctgcct ggtccagggc ttcttccccc aggagccact cagtgtgacc

121 tggagcgaaa gcggacaggg cgtgaccgcc agaaacttcc cacccagcca ggatgcctcc

181 ggggacctgt acaccacgag cagccagctg accctgccgg ccacacagtg cctagccggc

 241  aagtccgtga catgccacgt gaagcactac acgaatccca gccaggatgt gactgtgccc

 301  tgcccagttc cctcaactcc acctacccca tctccctcaa ctccacctac cccatctccc

 361  tcatgctgcc acccccgact gtcactgcac cgaccggccc tcgaggacct gctcttaggt

 421  tcagaagcga acctcacgtg cacactgacc ggcctgagag atgcctcagg tgtcaccttc

 481  acctggacgc cctcaagtgg gaagagcgct gttcaaggac cacctgaccg tgacctctgt

 541  ggctgctaca gcgtgtccag tgtcctgtcg ggctgtgccg agccatggaa ccatgggaag

 601  accttcactt gcactgctgc ctaccccgag tccaagaccc cgctaaccgc caccctctca

 661  aaatccggaa acacattccg gcccgaggtc cacctgctgc cgccgccgtc ggaggagctg

 721  gccctgaacg agctggtgac gctgacgtgc ctggcacgtg gcttcagccc caaggatgtg

 781  ctggttcgct ggctgcaggg gtcacaggag ctgccccgcg agaagtacct gacttgggca

 841  tcccggcagg agcccagcca gggcaccacc accttcgctg tgaccagcat actgcgcgtg

 901  gcagccgagg actggaagaa gggggacacc ttctcctgca tggtgggcca cgaggccctg

 961  ccgctggcct tcacacagaa gaccatcgac cgcttggcgg gtaaacccac ccatgtcaat

1021  gtgtctgttg tcatggcgga ggtggacggc acctgctac

免疫球蛋白重链恒定区α1(GenBank No.CAC20453.1)(SEQ IDNO：55)

ASLTSPKVFPLSLCSTQPDGNVVIACLVQGFFPQEPLSVTWSESGQGVT

ARNFPPSQDASGDLYTTSSQLTLPATQCLAGKSVTCHVKHYTNPSQDV

TVPCPVPSTPPTPSPSTPPTPSPSCCHPRLSLHRPALEDLLLGSEANLTCT

LTGLRDASGVTFTWTPSSGKSAVQGPPDRDLCGCYSVSSVLSGCAEPW

NHGKTFTCTAAYPESKTPLTATLSKSGNTFRPEVHLLPPPSEELALNEL

VTLTCLARGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYLTWASRQEPSQGTTTFA

VTSILRVAAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRLAGKPTHVN

VSVVMAEVDGTCY

额外的恒定区序列(人IgM1、IgM2、IgD1、IgA1、IgG1、IgG3、IgE1、IgE2、κ、和λ；小鼠IgM1、κ、和λ；大鼠IgM1、κ、和λ；和狗IgM1)可以见FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY(3d ed.)，William E.Paul(ed.)，Raven Press，New York，NY(1993)的296-300页。许多其他恒定区序列(多核苷酸和氨基酸)是本领域已知的并且可以用于本发明。

实施例9

组合放射免疫疗法和化学疗法

化学疗法和抗-C35放射免疫疗法的组合经证明在减小肿瘤体积方面比单独任一种疗法更有效。在第一个实验中，在用Colau.C35肿瘤细胞移植的Swiss裸小鼠中测试¹³¹I标记的1B3抗-C35单克隆抗体与用150mg/kg的5-氟尿嘧啶(FU)以及100mg/kg的亚叶酸(LV)的组合放射免疫疗法的效果。Colau.C35是Colau细胞的C35抗原阳性克隆，其是从人结肠癌适应并且用C35逆转录病毒重组体转导的组织培养物。

肿瘤移植后11天开始化学治疗并在第14天施用300μCi ¹³¹I标记的1B3抗-C35单克隆抗体。跟踪肿瘤生长长达8周。

图5中的结果表明与仅接受化学治疗或者非-放射标记的(“冷的”)1B3抗-C35抗体和化学治疗的组相比，在接受放射免疫治疗和化学治疗组合的组中肿瘤生长受到抑制。将接受组合放射免疫治疗和化学治疗的组与未治疗的对照组相比较，计算生长抑制的标准参数。

如图5中显示，肿瘤倍增延迟(TDD)等于3.8(在400mm³肿瘤体积)，其中TDD等于(治疗的-对照{达到特定体积的天数})/TVDT，并且TVDT＝对照的肿瘤体积倍增时间{在指数生长期}。将细胞杀死对数(LCK)定义为TDD/3.3＝1.15，其满足有效肿瘤治疗的公认标准(见，例如，Sipper HE et al.，Cancer Chemotherapy Rep.35：1-111(1964)；Coldman AJ and Goldie JH，Mathematical Biosciences65：291-307(1983)；和Norton L and Simon R，Cancer Treat.Rep.61：1307-1317(1977))。

在第二个实验中，在移植Colau.C35肿瘤细胞的Swiss裸小鼠中测试在第15和18天时，组合放射免疫治疗¹³¹I标记的1B3抗-C35单克隆抗体与用2mg/kg的顺铂的化学治疗的效果。肿瘤移植后第15和18天施用顺铂。在第21天施用300μCi ¹³¹I标记的1B3抗-C35单克隆抗体。跟踪肿瘤生长长达10周。

在相同实验中，单独组的用Colau.C35肿瘤细胞移植的Swiss裸小鼠用180mg/kg的5-氟尿嘧啶(5FU)，以及120mg/kg的亚叶酸(LV)治疗或者该相同的化学治疗方案在第18天施用，然后在第21天施用300μCi ¹³¹I标记的1B3抗-C35单克隆抗体。

图6中的结果显示了在仅接受化学治疗(顺铂或者5FU/LV)的组中Colau.C35肿瘤生长的一定抑制，接受¹³¹I标记的1B3抗-C35单克隆抗体的组中的抑制更大，接受组合化学治疗和¹³¹I标记的1B3抗-C35单克隆抗体的组中肿瘤的抑制最大。见下面的表5。

                    表5：图6中治疗形式对肿瘤体积的影响的比较

	仅5FU/LV	仅顺铂	RIT：131I-1B3	5FU/LV+RIT	顺铂+RIT
						T-C(天)	5	5	29	37	40
TDD	0.66	0.66	3.84	4.89	5.29
						LCK	0.20	0.20	1.16	1.48	1.60

RIT＝放射免疫疗法

T-C＝治疗的(T)和对照(C)肿瘤达到给定体积(1200mm³)

所需时间的差异

TDD＝肿瘤倍增延迟＝T-C/未处理的肿瘤体积倍增时间

LCK＝细胞杀死对数＝TDD/3.32

为了在这些实验模型中方便使用，选择生长相对快速并且必须用重组C 35转导的肿瘤异种移植物。然而，组合疗法的成功不是由于转导的肿瘤中C35表达的异常高的水平。图7表明C35表达在肿瘤中非常相似，如在天然表达C35的21MT1的肿瘤中，和在C35-转导的肿瘤如Colau.C35和MDA231.C35中。将细胞用缀合Alexa-647的抗-C35MAb 1F2或者同种型对照染色。“MFI X”是1F2的平均荧光强度/同种型对照的平均荧光强度的比例。来自正常乳腺上皮的H16N2，和乳腺肿瘤MDAMB231和结肠肿瘤Colau表达低的基底水平的C35。来自乳腺癌的21MT1天然表达高水平C35。用空载体(空的)或者人C35重组载体转导Colau和MDA231。所有肿瘤都在体内生长，切除肿瘤、解离并染色。

实施例10

确定化学治疗剂的最大耐受剂量(MTD)

因为化学疗法和免疫放射疗法组合时，涉及累积剂量限制的骨髓毒性的考虑时，必须确定组合疗法的最大耐受剂量(MTD)，并且当两种治疗剂的毒性是累加的时候，采取将允许施用两种毒性剂的策略。通过与外周循环中血小板和白细胞回收所需的时间有关的管理标准建立MTD。此类标准是本领域技术人员熟悉的。对于鼠模型的情况，通常使用的对MTD的代替定义是导致平均小于20％重量减轻或者小于10％死亡率的最大剂量。用于标准临床方案或者动物模型中最常用的化学治疗剂的当前建立的MTD在下面的表6到9中显示。

表6：异种移植模型(裸小鼠)中代表性化学治疗方案

细胞毒性药物	最大耐受剂量	剂量+RIT	方案
				氟尿嘧啶/亚叶酸	180/120mg/kg1	150/100mg/kg	推注，静脉内
奥沙利铂	5mg/kg3	TBD	腹膜内每天，5个循环
				顺铂	4mg/kg4，5	2mg/kg	静脉内每3天，2个循环
伊立替康	15mg/kg3	TBD	腹膜内每天，5个循环
				紫杉酚	无毒性2	30mg/kg4，6	静脉内每7天，2-3个循环
环磷酰胺	无毒性2	175mg/kg4，7	静脉内每7天，2个循环
				阿霉素	10mg/kg1	8mg/kg	静脉内每4天，3个循环
吉西他滨	无毒性5	120mg/kg5	腹膜内每3天，4个循环
				长春瑞滨	20mg/kg4	TBD	推注，静脉内
外光束辐射	无毒性2	20Gy	局部递送

注释

TBD：待定

1.MTD通过本发明人确定。最大耐受剂量定义为≥20％平均重量减轻和/或＞10致死率。

2.所示方案的无毒剂量。

3.Fichtner I et al.Anticancer drug response andexpression of molecular markers in early-passagexenotransplanted colon carcinomas.Eur J Can 2004.40：298-307.

4.Villena-Heinsen C et al.Human ovarian cancerxenografts in nude mice：chemotherapy trials with paclitaxel，cisplatin，vinorelbine，and titanocene dichloride.Anticancer Drugs 1998.9：557-563.

5.Higgins B.et al.Antitumor activity of erlotinib(OSI-774，Tarceva)alone or in combination in human non-smallcell lung cancer tumor xenograft models.Anti-Cancer Drugs2004.15：503-512.

6.Kraeber-Bodere F.et al.Enhanced Antitumor Activityof Combined pretargeted radioimmunotherapy and Paclitaxel inMedullary Thyroid Cancer Xenograft.Mol Can Ther 2002.1：267-274

7.Kraus-Berthier，L et al.Histology and sensitivity toanticancer Drugs of two human non-small cell lung carcinomasimplanted in the pleural cavity of nude mice.2000.Clin CanRes 6：297-304.

                       表7：代表性乳腺癌化学治疗方案

方案	细胞毒性药物	剂量	方案
				AC	阿霉素环磷酰胺	60mg/m2IV600mg/m2IV	每3周重复，4个循环
CAF	环磷酰胺阿霉素氟尿嘧啶	100mg/m2/天1-14天PO第1和8天30mg/m2IV第1和8天500mg/m2IV	每28天重复，6个循环
				CMF	环磷酰胺氨甲喋呤氟尿嘧啶	100mg/m2/天1-14天PO第1和8天40mg/m2IV第1和8天600mg/m2IV	每28天重复，6个循环
	长春瑞滨	第1和8天30mg/m2IV	每21天重复，6-8个循环
					紫杉醇	175mg/m2IV	每21天重复，6个循环

来源：DataMonitor Pipeline Insight：Breast Cancer June2004；http：//www.bccancer.bc.ca

                         表8：代表性结肠癌治疗方案

方案	药物	剂量	方案
					亚叶酸氟尿嘧啶	氟尿嘧啶前20mg/m2/天×5天(d1-5)IV425mg/m2/天×5天(d1-5)IV	每28天重复，6个循环
	伊立替康	35020mg/m2IV	取决于临床益处和毒性，每21天重复，2-6个循环
				FOLFOX	奥沙利铂亚叶酸氟尿嘧啶氟尿嘧啶	100mg/m2IV400mg/m2IV亚叶酸后400mg/m2IV推注，然后2400mg/m2IV，46个小时	每14天重复，最大12个循环
FOLFIRI	伊立替康亚叶酸氟尿嘧啶氟尿嘧啶	180mg/m2IV400mg/m2IV亚叶酸后400mg/m2IV推注，然后2400mg/m2IV，46个小时	每14天重复，最大12个循环

来源：http：//www.bccancer.bc.ca

              表9：代表性肺癌化学治疗方案

药物	剂量	方案
			多西他赛	75mg/m2IV	每21天重复，6个循环
多西他赛顺铂	75mg/m2IV75mg/m2IV	每21天重复，4个循环
			顺铂吉西他滨	在第1天75mg/m2IV在第1和8天1250mg/m2IV	每21天重复，6个循环

来源：http：//www.bccancer.bc.ca

减小化学治疗和放射免疫治疗的组合MTD的有效策略包括：将施用的化学治疗剂的剂量减小到当与MTD的放射免疫疗法组合施用时不导致累加毒性的水平(见，下面的实施例10A)；选择当与放射免疫疗法组合使用时不促进累加毒性的化学治疗剂(见下面的实施例10B)；和减小放射免疫治疗剂的骨髓毒性(见下面的实施例10C)。

A.减小化学治疗剂的剂量以减小毒性

将2mg/kg顺铂(约MTD的50％)在第15和18天施用于Swiss裸小鼠并且在72小时后使用MTD(300μCi)的¹³¹I-标记的1B3抗-C35单克隆抗体。如图8中所示，通过重量减轻确定的顺铂和放射免疫治疗剂的组合毒性与在MTD施用的单独放射免疫治疗剂的毒性没有显著不同。

B.化学治疗剂不促进累加毒性

在第18天施用180mg/kg的处于MTD的5-氟尿嘧啶与120mg/kg的亚叶酸，然后在第21天以MTD(300μCi)施用¹³¹I-标记的1B3抗-C35单克隆抗体。如图8中所示，不超过两种毒性剂组合的MTD，尽管每种毒性剂都以各自的MTD施用。

C.放射免疫治疗剂的减小的骨髓毒性

备选策略是通过生物化学修饰减小放射免疫治疗剂的骨髓毒性，所述修饰导致放射标记的抗体从外周循环中加速清除。适宜的修饰包括使用不同的抗体同种型，如表10中所示的IgG3、IgA、IgD或IgE，或者缺失IgG的CH2结构域，其负责它的延长的血清半寿期(见Mueller BM，RA Reisfeld，and SD Gillies，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：5702-5705(1990)；Slavin-Chiorini DC，et al.，Int.J.Cancer 53：97-103(1993))。

表10：人免疫球蛋白同种型的血清半寿期

免疫球蛋白同种型	血清半寿期
		IgG1	21天
IgG2	20天
		IgG3	7天
IgG4	21天
		IgM	10天
IgA	6天
		IgD	3天
IgE	2天

另一种工程化抗体和/或抗体片段，或者修饰抗体结构以减小血清半寿期的策略也是可行的。此类工程化的抗体和/或抗体片段的实例包括，但不限于，结构域缺失的抗体、Fab、F(ab’)2、scFv、微型抗体、双链抗体、三链抗体、四链抗体等等。

实施例11

1B3和1F2抗体的C35肽表位

为了定位1B3和1F2抗体的表位特异性，将在大肠杆菌中合成的具有6x His标签的重组人C35(rhC35)用Lys-C内切蛋白酶消化。该酶在蛋白质序列中赖氨酸(K)残基后切割。图9显示了用Lys-C完全消化rhC35后预计的肽片段。显示了rhC35的完整序列，包括氨基末端添加的6x His标签。氨基酸位置相对于天然人序列的氨基末端甲硫氨酸(M)编号。注意到在后面为带负电残基的第一和第三个赖氨酸处消化是无效的，并且可以产生一些更长的组合片段。以50∶1的重量比加入Lys-C内切蛋白酶至纯化的rhC35并在37℃在25mM Tris，pH 8.0中孵育18小时。将消化物用乙醇沉淀并在还原性Tricine样品缓冲液中再溶解。100℃下加热5分钟后，在16％Tricine凝胶(Invitrogen)上通过电泳分离样品。将肽转移到PVDF膜并用考马斯蓝对图10中描绘的印迹染色(左和右图中的泳道1-3)以检测所有肽或者用下面的一种方式处理：1μg/ml鼠1F2抗-C35抗体，然后是碱性磷酸酶缀合的山羊抗-小鼠抗体(左图的泳道4)；1μg/ml连接人恒定区(MAb11)的1B3抗-C35免疫球蛋白可变区，然后是碱性磷酸酶缀合的山羊抗-人抗体(左图的泳道5)；或者抗-6x His标记小鼠抗体(Amersham)，然后是碱性磷酸酶缀合的山羊抗-小鼠抗体(右图的泳道4和5)。加入BCIP/NBT底物并显色以检测二级试剂。在两个图的侧翼泳道中显示了分子量标记。

在图10中，所指示的带 A迁移到未消化的rhC35的位置。注意到带 B被1F2但不被MAb11(1B3)抗-C35抗体染色，而带 C不被1F2也不被MAb11(1B3)抗体染色。因为带 B和 C都用针对rhC35的氨基末端的6x His标签的抗-6x His标签抗体染色，所以可以推断两个片段都缺少C-末端肽片段。对于约15kDa带 B的情况，用MAb11(1B3)染色所需的丧失的表位是11个氨基酸的C-末端C35肽ITNSRPPCVIL，其代表天然C35序列的残基105-115。该表位不是用1F2染色所需的。相反，1F2抗体不与约8kDa的带 C反应，带 C还缺少天然C35序列的残基53-104。结果表明1B3抗体对C35残基105-115(ITNSRPPCVIL)内的表位是特异的，而1F2抗体对C35残基53-104内的表位是特异的。

实施例12

与1B3抗-C35单克隆抗体相关的人抗体

通过2002年9月5日公布的US 2002 0123057 A1中公开的方法产生两种抗体，其是人来源的，只是与小鼠1B3抗-C35单克隆抗体有相同的免疫球蛋白重链CDR3区。

MAb 165包含141D10 VH H732重链可变区(SEQ ID NOS：56和57)，和UH8 VK L120κ轻链可变区(SEQ ID NOS：58和59)。如图11中所示，MAb 165是C35特异的。将141D10重组痘苗病毒与UH8重组痘苗病毒共转染到HeLa细胞中。通过ELISA测试所分泌的抗体对C35或者对照蛋白质A27L(痘苗病毒蛋白)的结合。

MAb 171包含MSH3 VH H835重链可变区(SEQ ID NOS：60和61)和UH8 VK L120κ轻链可变区(SEQ ID NOS：58和59)。

实施例13

鉴定抗-C35抗体识别的C35肽表位

用本领域公知的标准免疫方法产生针对重组C 35的兔多克隆抗体。合成长为15个氨基酸的重叠肽，其对应于在从1到101的每个氨基酸残基开始的115个氨基酸长的C35蛋白质序列。基于每15个氨基酸肽中氨基末端残基的C35位置命名肽。在重叠天然C35序列的30、33和112位的半胱氨酸残基的每种肽中，用丙氨酸取代半胱氨酸以避免形成二硫键交联的肽。

用2μg C35蛋白质或者来自C35蛋白质序列的14μg或40μg所指示的15个氨基酸的肽包被96孔Maxisorp微量滴定板的孔并如下面详细描述的测定兔C35免疫血清中抗体的结合。对阳性和阴性对照和检测到阳性结合的那些C35衍生肽在下面的表11中显示了数据。肽结合水平的差异可以是由于特定抗体种类的浓度差异、抗体亲和性的差异或者它们的组合。

A.肽样品制备

将100％DMSO中的C35肽15聚体(10mg/ml)在无菌条件下等分到1.5ml管(40μg/管)，然后真空离心除去DMSO。将肽以1ml/管重悬浮在PBS(pH 7.2)中，混合均匀并离心。每种肽浓度(“肽溶液”)为40μg/ml。肽溶液应该保存在-20℃待用。一旦解冻，它将保持在4℃不超过2周。

B.在Maxisorp板上包被样品

对于14μg/ml肽包被的板，每孔加入65μl PBS，pH7.2，然后每孔加入35μl肽溶液(总体积100μl/孔)，并混合均匀。对于40μg/ml肽包被的板，将100μl肽溶液直接置于板上，100μl/孔。将对照C35蛋白质稀释入PBS，pH7.2中至2μg/ml并加入到板中，100μl/孔。将包被的板在室温孵育2小时，然后4℃过夜。

C.ELISA条件

每板在板洗涤器上洗涤3次。将板在室温下用“封闭缓冲液”(PBS，pH7.2和10％FBS)封闭2小时，然后在板洗涤器上每板洗涤3次。将一级抗体兔抗-人C35多克隆抗体(由Bethyl生产，批次62902)稀释到“测定稀释剂”(PBS，pH7.2加上0.05％ Tween 20和10％FBS)中并加入板中，100μl/孔。将板在室温孵育2小时。对于14μg/ml肽包被的板，加入100ng/ml一级抗体。对于40μg/ml肽包被的板，加入1μg/ml一级抗体。将板在板洗涤器上洗涤5次。将二级抗体HRP(来自Zymed的辣根过氧化物酶缀合的山羊抗兔Fc多克隆抗体)以1∶20,000稀释到测定稀释剂中并加入平板，100μl/孔。平板在室温孵育2小时。在板洗涤器上洗涤平板7次。按照试剂盒生产商的说明加入底物并在室温黑暗中孵育15分钟。通过加入2N H₂SO₄，100μl/孔停止反应。立即读取450-570nm的吸收。

表11：抗体与C35表位的结合

在450-570nm的吸收

肽	序列	14μg/ml	40μg/ml
				无		0.009	0.013
没有一级兔抗体	C35蛋白或肽	0.009	0.009
				C35蛋白	C35蛋白	3.765	3.5225
P1	MSGEPGQTSVAPPPE	0.257
				P2	SGEPGQTSVAPPPEE	0.108	1.227
P3	GEPGQTSVAPPPEEV	1.458	3.349

肽	序列	14μg/ml	40μg/ml
				P4	EPGQTSVAPPPEEVE	1.254	3.282
P5	PGQTSVAPPPEEVEP	2.719	3.383
				P6	GQTSVAPPPEEVEPG	2.483	3.381
P7	QTSVAPPPEEVEPGS	2.635	3.388
				P8	TSVAPPPEEVEPGSG	0.059	0.394
P9	SVAPPPEEVEPGSGV	2.31	3.367
				P10	VAPPPEEVEPGSGVR	1.736	3.407
P11	APPPEEVEPGSGVRI	1.526	3.317
				P12	PPPEEVEPGSGVRIV	0.836
P13	PPEEVEPGSGVRIVV	0.385	2.522
				P14	PEEVEPGSGVRIVVE	0.127	0.972
P15	EEVEPGSGVRIVVEY	0.039	0.334
				P16	EVEPGSGVRIVVEYA	0.027	0.172
P62	TGAFEIEINGQLVFS	0.023	0.107
				P63	GAFEIEINGQLVFSK	0.079	0.557
P64	AFEIEINGQLVFSKL	0.055	0.423
				P65	FEIEINGQLVFSKLE	0.043	0.269
P66	EIEINGQLVFSKLEN	0.028	0.182
				P80	NGGFPYEKDLIEAIR	0.018	0.1
P81	GGFPYEKDLIEAIRR	0.032	0.204
				P82	GFPYEKDLIEAIRRA	0.02	0.18
P83	FPYEKDLIEAIRRAS	0.025	0.19
				P84	PYEKDLIEAIRRASN	0.037	0.391
P85	YEKDLIEAIRRASNG	0.024	0.179
				P86	EKDLIEAIRRASNGE	0.023	0.166
P88	DLIEAIRRASNGETL	0.025	0.135
				P89	LIEAIRRASNGETLE	0.015	0.053
P90	IEAIRRASNGETLEK	0.04	0.403

肽	序列	14μg/ml	40μg/ml
				P91	EAIRRASNGETLEXI	0.023	0.144
P92	AIRRASNGETLEKIT	0.04	0.267
				P93	IRRASNGETLEKITN	0.051	0.389
P94	RRASNGETLEKITNS	0.061	0.526
				P95	RASNGETLEKITNSR	0.062	0.462
P97	SNGETLEKITNSRPP	0.046	0.373
				P98	NGETLEKITNSRPPA	0.035	0.213
P99	GETLEKITNSRPPAV	0.026	0.18
				P100	ETLEKITNSRPPAVI	0.017	0.124
P101	TLEKITNSRPPAVIL	0.472	2.519

本说明书中提到的所有出版物，如教科书、杂志文章、GenBank条目和公布的申请，和专利申请都引入本文作为参考，就像将每个单独的出版物或者专利申请特别且个别地指出引入作为参考一样。

                          序列表

<110>Vaccinex，Inc.

<120>通过靶定暴露在细胞凋亡肿瘤细胞上的内部抗原杀死肿瘤细胞的方法

<130>1843.019PC03

<140>PCT/US2004/040573

<141>2004-12-06

<150>US 60/526,572

<151>2003-12-04

<150>US 60/531,688

<151>2003-12-23

<160>61

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>354

<212>DNA

<213>智人

<220>

<221>CDS

<222>(7)..(354)

<400>1

gccgcg atg agc ggg gag ccg ggg cag acg tcc gta gcg ccc cct ccc         48

       Met Ser Gly Glu Pro Gly Gln Thr Ser Val Ala Pro Pro Pro

       1               5                   10

gag gag gtc gag ccg ggc agt ggg gtc cgc atc gtg gtg gag tac tgt        96

Glu Glu Val Glu Pro Gly Ser Gly Val Arg Ile Val Val Glu Tyr Cys

15                  20                  25                  30

gaa ccc tgc ggc ttc gag gcg acc tac ctg gag ctg gcc agt gct gtg       144

Glu Pro Cys Gly Phe Glu Ala Thr Tyr Leu Glu Leu Ala Ser Ala Val

                35                  40                  45

aag gag cag tat ccg ggc atc gag atc gag tcg cgc ctc ggg ggc aca       192

Lys Glu Gln Tyr Pro Gly Ile Glu Ile Glu Ser Arg Leu Gly Gly Thr

            50                  55                  60

ggt gcc ttt gag ata gag ata aat gga cag ctg gtg ttc tcc aag ctg       240

Gly Ala Phe Glu Ile Glu Ile Asn Gly Gln Leu Val Phe Ser Lys Leu

        65                  70                  75

gag aat ggg ggc ttt ccc tat gag aaa gat ctc att gag gcc atc cga      288

Glu Asn Gly Gly Phe Pro Tyr Glu Lys Asp Leu Ile Glu Ala Ile Arg

    80                  85                  90

aga gcc agt aat gga gaa acc cta gaa aag atc acc aac agc cgt cct      336

Arg Ala Ser Asn Gly Glu Thr Leu Glu Lys Ile Thr Asn Ser Arg Pro

95                  100                 105                 110

ccc tgc gtc atc ctg tga                                              354

Pro Cys Val Ile Leu

                115

<210>2

<211>115

<212>PRT

<213>智人

<400>2

Met Ser Gly Glu Pro Gly Gln Thr Set Val Ala Pro Pro Pro Glu Glu

1               5                   10                  15

Val Glu Pro Gly Set Gly Val Arg Ile Val Val Glu Tyr Cys Glu Pro

            20                  25                  30

Cys Gly Phe Glu Ala Thr Tyr Leu Glu Leu Ala Set Ala Val Lys Glu

        35                  40                  45

Gln Tyr Pro Gly Ile Glu Ile Glu Ser Arg Leu Gly Gly Thr Gly Ala

    50                  55                  60

Phe Glu Ile Glu Ile Asn Gly Gln Leu Val Phe Set Lys Leu Glu Asn

65                  70                  75                  80

Gly Gly Phe Pro Tyr Glu Lys Asp Leu Ile Glu Ala Ile Arg Arg Ala

                85                  90                  95

Ser Asn Gly Glu Thr Leu Glu Lys Ile Thr Asn Ser Arg Pro Pro Cys

            100                 105                 110

Val Ile Leu

        115

<210>3

<211>627

<212>DNA

<213>Mus sp.

<400>3

gaatttagcg gccgcgaatt cgcccttcga ctggagcacg ggacactgac atggactgaa     60

ggagtagaaa acatctctct cattagaggt tgatctttga ggaaaacagg gtgttgccta    120

aaggatgaaa gtgttgagtc tgttgtacct gttgacagcc attcctggta tcctgtctga    180

tgtacagctt caggagtcag gacctggcct cgtgaaacct tctcagtctc tgtctctcac    240

ctgctctgtc actggctact ccatcaccag tggttatttc tggaactgga tccggcagtt    300

tccagggaac aaactggaat ggatgggcta cataagctac gacggtagca ataactccaa    360

cccatctctc aaaaatcgaa tctccttcac tcgtgacaca tctaagaacc agtttttcct    420

gaagtttaat tctgtgacta ctgacgactc agctgcatat tactgtacaa gaggaactac    480

ggggtttgct tactggggcc aagggactct ggtcactgtc tctgcagcca aaacgacacc    540

cccatctgtc tatccactgg cccctggatc tgctgcccaa actaactcca agggcgaatt    600

cgtttaaacc tgcaggacta gtccctt                                        627

<210>4

<211>116

<212>PRT

<213>Mus sp.

<400>4

Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1               5                   10                  15

Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly

            20                  25                  30

Tyr Phe Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp

        35                  40                  45

Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Asn Ser Asn Pro Ser Leu

    50                  55                  60

Lys Asn Arg Ile Ser Phe Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe

65                  70                  75                  80

Leu Lys Phe Asn Ser Val Thr Thr Asp Asp Ser Ala Ala Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Thr Arg Gly Thr Thr Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

            100                 105                 110

Thr Val Ser Ala

        115

<210>5

<211>540

<212>DNA

<213>Mus sp.

<400>5

cgcgaattcg cccttcgact ggagcacgag gacactgaca tggactgaag gagtagaaaa     60

attagctagg gaccaaaatt caaagacaga atggattttc aggtgcagat tttcagcttc    120

ctgctaatca gtgcctcagt cagaatgtcc agaggacaaa ttgttctcac ccagtctcca    180

gcaatcatgt ctgcatctcc aggggagaag gtcaccatat cctgcagtgc cagctcaagt    240

gtaagttaca tgaactggta ccagcagaag ccaggatcct cccccaaacc ctggatttat    300

cacacatcca acctggcttc tggagtccct gctcgcttca gtggcagtgg gtctgggacc    360

tcttactctc tcacaatcag cagcatggag gctgaagatg ctgccactta ttactgccaa    420

cagtatcata gttacccacc cacgttcgga ggggggacca agctggaaat aaaacgggct    480

gatgctgcac caactgtatc catcttccca ccatccagtg agcaaagggc gaattcgttt    540

<210>6

<211>106

<212>PRT

<213>Mus sp.

<400>6

Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly

1               5                   10                  15

Glu Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

            20                  25                  30

Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr

        35                  40                  45

His Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

    50                  55                  60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu

65                  70                  75                  80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His Ser Tyr Pro Pro Thr

                85                  90                  95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

            100                 105

<210>7

<211>618

<212>DNA

<213>Mus sp.

<400>7

cgcgaattcg cccttcgact ggagcacgag gacactggac atggactgaa ggagtagaaa     60

atctctctca ctggaggctg atttttgaag aaaggggttg tagcctaaaa gatgatggtg    120

ttaagtcttc tgtacctgtt gacagccctt ccgggtatcc tgtcagaggt gcagcttcag    180

gagtcaggac ctagcctcgt gaaaccttct cagactctgt ccctcacctg ttctgtcact    240

ggcgactcca tcaccagtgg ttactggaac tggatccgga aattcccagg aaataaactt    300

gaatacgtgg ggtacataag ctacagtggt ggcacttact acaatccatc tctcaaaagt    360

cgaatctcca tcactcgaga cacatccaag aaccactact acctgcagtt gaattctgtg    420

actactgagg acacagccac atattactgt gcaagaggtg cttactacgg gggggccttt    480

tttccttact tcgatgtctg gggcgctggg accacggtca ccgtctcctc agccaaaacg    540

acacccccat ctgtctatcc actggcccct ggatctgctg cccaaactaa ctccaagggc    600

gaattcgttt aaacctgc                                                  618

<210>8

<211>122

<212>PRT

<213>Mus sp.

<400>8

Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Lys Pro Ser Gln

1               5                   10                  15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Asp Ser Ile Thr Ser Gly

            20                  25                  30

Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Tyr Val

        35                  40                  45

Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Gly Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

    50                  55                  60

Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn His Tyr Tyr Leu

65                  70                  75                  80

Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala

                85                  90                  95

Arg Gly Ala Tyr Tyr Gly Gly Ala Phe Phe Pro Tyr Phe Asp Val Trp

            100                 105                 110

Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210>9

<211>528

<212>DNA

<213>Mus sp.

<400>9

gaattcgccc ttcccctgga gcacgaggac actgacatgg actgaaggag tagaaaatca     60

gttcctgcca ggacacagtt tagatatgag gttccaggtt caggttctgg ggctccttct    120

gctctggata tcaggtgccc actgtgatgt ccagataacc cagtctccat cttttcttgc    180

tgcatctcct ggagaaacca ttactattaa ttgcagggca agtaagtaca ttagcaaaca    240

tttagtctgg tatcaggaga aacctggaga aactaaaaag cttcttatct actctggatc    300

cactttgcaa tctggacttc catcaaggtt cagtggcagt ggatctggta cagatttcac    360

tctcaccatc agtagcctgg agcctgaaga ttttgcaatg tattactgtc aacagcataa    420

tgaatacccg ctcacgttcg gtgctgggac caagctggag ctgaaacggg ctgatgctgc    480

accaactgta tccatcttcc caccatccag tgagcaaagg gcgaattc                 528

<210>10

<211>107

<212>PRT

<213>Mus sp.

<400>10

Asp Val Gln Ile Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ala Ala Ser Pro Gly

1               5                   10                  15

Glu Thr Ile Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Lys Tyr Ile Ser Lys His

            20                  25                  30

Leu Val Trp Tyr Gln Glu Lys Pro Gly Glu Thr Lys Lys Leu Leu Ile

        35                  40                  45

Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Leu Pro Ser Arg Phe Ser Gly

    50                  55                  60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65                  70                  75                  80

Glu Asp Phe Ala Met Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Glu Tyr Pro Leu

                85                  90                  95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

             100                105

<210>11

<211>553

<212>DNA

<213>智人

<400>11

gaattcgccc ttaattgcgg ccgcaaacca tgggatggag ctgtatcatc ctcttcttgg     60

tagcaacagc tacaggcgcg cactccgagg tgcagctggt ggagtctggg ggaggcgtgg    120

tccagcctgg gaggtccctg agactctcct gtgcagcgtc tggattcaac ttcggtacct    180

atgccatgca ctgggtccgc caggctcaag gcaaggggct ggagtgggtg gcactcatat    240

ggtatgatgg aactaagaaa tactatgcag actccgtgaa gggccgatac accatctcca    300

gagacaattc ccagaacacg ctgtatctgc aaatgaacac cctgagagcc gacgacacgg    360

ctgtgtatta ctgtgcgaaa tcaaaactcc aggggcgcgt tatagactac tggggccagg    420

gaaccctggt caccgtctcc tcagcctcca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac    480

cctcctccaa gagcacctct gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact    540

taagggcgaa ttc                                                       553

<210>12

<211>119

<212>PRT

<213>智人

<400>12

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Phe Gly Thr Tyr

            20                  25                  30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Gln Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

        35                  40                  45

Ala Leu Ile Trp Tyr Asp Gly Thr Lys Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

    50                  55                  60

Lys Gly Arg Tyr Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Gln Asn Thr Leu Tyr

65                  70                  75                  80

Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Lys Ser Lys Leu Gln Gly Arg Val Ile Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

            100                 105                 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

        115

<210>13

<211>528

<212>DNA

<213>智人

<400>13

gaattcgccc ttaattgcgg ccgcaaacat gggatggagc tgtatcatcc tcttcttggt     60

agcaacagct acaggcgtgc actccgacat ccagatgacc cagtctccag actccctggc    120

tgtgtctctg ggcgagaggg ccaccatcaa ctgcaagtcc agccagagtg ttttatacag    180

ctccaacaat aagaactact tagcttggta ccagcagaaa ccaggacagc ctcctaagct    240

gctcatttac tgggcatcta cccgggaatc cggggtccct gaccgattca gtggcagcgg    300

gtctgggaca gatttcactc tcaccatcag cagcctgcag gctgaagatg tggcagttta    360

ttactgtcag caatattata gtactcctct gtggacgttc ggccaaggga ccaagctcga    420

gatcaaacga actgtggctg caccatctgt cttcatcttc ccgccatctg atgagcagtt    480

gaaatctgga actgcctctg ttgtgtgcct gctgaaaagg gcgaattc                 528

<210>14

<211>113

<212>PRT

<213>智人

<400>14

Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu

1               5                   10                  15

Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser

            20                  25                  30

Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro

        35                  40                  45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro

    50                  55                  60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

65                  70                  75                  80

Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr

                85                  90                  95

Tyr Ser Thr Pro Leu Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile

            100                 105                 110

Lys

<210>15

<211>29

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于将所选抗体表达为分泌型人IgG1的引物

<400>15

attaggatcc ggtcaccgtc tcctcagcc                                     29

<210>16

<211>31

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于将所选抗体表达为分泌型人IgG1的引物

<400>16

attagtcgac tcatttaccc ggagacaggg a                                    31

<210>17

<211>1084

<212>DNA

<213>智人

<400>17

gcggccgcaa accatgggat ggagctgtat catcctcttc ttggtagcaa cagctacagg     60

cgcgcatatg gtcaccgtct cctcagcctc caccaagggc ccatcggtct tccccctggc    120

accctcctcc aagagcacct ctgggggcac agcggccctg ggctgcctgg tcaaggacta    180

cttccccgaa ccggtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgcc ctgaccagcg gcgtgcacac    240

cttcccggct gtcctacagt cctcaggact ctactccctc agcagcgtcg tgaccgtgcc    300

ctccagcagc ttgggcaccc agacctacat ctgcaacgtg aatcacaagc ccagcaacac    360

caaggtggac aagaaagttg agcccaaatc ttgtgacaaa actcacacat gcccaccgtg    420

cccagcacct gaactcctgg ggggaccgtc agtcttcctc ttccccccaa aacccaagga    480

caccctcatg atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg gtggtggacg tgagccacga    540

agaccctgag gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg gaggtgcata atgccaagac    600

aaagccgcgg gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg gtcagcgtcc tcaccgtcct    660

gcaccaggac tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag gtctccaaca aagccctccc    720

agcccccatc gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag ccccgagaac cacaggtgta    780

caccctgccc ccatcccggg atgagctgac caagaaccag gtcagcctga cctgcctggt    840

caaaggcttc tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag agcaatgggc agccggagaa    900

caactacaag accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc tccttcttcc tctacagcaa    960

gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc ttctcatgct ccgtgatgca   1020

tgaggctctg cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc ctgtctccgg gtaaatgagt   1080

cgac                                                                1084

<210>18

<211>413

<212>DNA

<213>智人

<400>18

gcggccgcaa accatgggat ggagctgtat catcctcttc ttggtagcaa cagctacagg     60

cgtgcacttg actcgagatc aaacgaactg tggctgcacc atctgtcttc atcttcccgc    120

catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg aataacttct    180

atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg ggtaactccc    240

aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc agcaccctga    300

cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc acccatcagg    360

gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgttaggtc gac           413

<210>19

<211>422

<212>DNA

<213>智人

<400>19

gcggccgcaa accatgggat ggagctgtat catcctcttc ttggtagcaa cagctacagg     60

cgtgcacttg actcgagaag cttaccgtcc tacgaactgt ggctgcacca tctgtcttca    120

tcttcccgcc atctgatgag cagttgaaat ctggaactgc ctctgttgtg tgcctgctga    180

ataacttcta tcccagagag gccaaagtac agtggaaggt ggataacgcc ctccaatcgg    240

gtaactccca ggagagtgtc acagagcagg acagcaagga cagcacctac agcctcagca    300

gcaccctgac gctgagcaaa gcagactacg agaaacacaa agtctacgcc tgcgaagtca    360

cccatcaggg cctgagctcg cccgtcacaa agagcttcaa caggggagag tgttaggtcg    420

ac                                                                   422

<210>20

<211>29

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>IgG2-F引物

<400>20

attaggatcc ggtcaccgtc tcctcagcc                                       29

<210>21

<211>31

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>IgI2-R引物

<400>21

attagtcgac tcatttaccc ggagacaggg                                   31

<210>22

<211>29

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>IgG3-F引物

<400>22

attaggatcc ggtcaccgtc tcctcagct                                    29

<210>23

<211>31

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>IgG3-R引物

<400>23

attagtcgac tcatttaccc ggagacaggg a                                 31

<210>24

<211>29

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>IgG4-F引物

<400>24

attaggatcc ggtcaccgtc tcctcagct                                    29

<210>25

<211>31

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>IgG4-R引物

<400>25

attagtcgac tcatttaccc agagacaggg a                                31

<210>26

<211>30

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>IgA1-F引物

<400>26

attaggatcc ggtcaccgtc tcctcagcat                                  30

<210>27

<211>31

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>IgA1-R引物

<400>27

attagtcgac tcagtagcag gtgccgtcca c                                31

<210>28

<211>30

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>IgA2-F引物

<400>28

attaggatcc ggtcaccgtc tcctcagcat                                  30

<210>29

<211>31

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>IgA2-R引物

<400>29

attagtcgac tcagtagcag gtgccgtcca c                                31

<210>30

<211>30

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>IgD-F引物

<400>30

attaggatcc ggtcaccgtc tcctcagcac                                  30

<210>31

<211>31

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>IgD-R引物

<400>31

attagtcgac tcatttcatg gggccatggt c                                31

<210>32

<211>29

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>IgE-F引物

<400>32

attaggatcc ggtcaccgtc tcctcagcc                                   29

<210>33

<211>31

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>IgE-R

<400>33

attagtcgac tcatttaccg ggatttacag a                                31

<210>34

<211>29

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>IgM-F

<400>34

attaggatcc ggtcaccgtc tcctcaggg                                   29

<210>35

<211>31

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>IgM-R

<400>35

attagtcgac tcagtagcag gtgccagctg t                                31

<210>36

<211>6

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>BssHII位点

<400>36

gcgcgc                                                             6

<210>37

<211>7

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>BsteII位点

<400>37

ggtcacc                                                            7

<210>38

<211>6

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>ApaL1位点

<400>38

gtgcac                                                             6

<210>39

<211>6

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>Xho1位点

<400>39

ctcgag                                                             6

<210>40

<211>39

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>1F2VK正向引物

<400>40

tatccgtgca ctcccaaatt gttctcaccc agtctccag                        39

<210>41

<211>29

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>1F2VK反向引物

<400>41

atattctcga gcttggtccc ccctccgaa                                   29

<210>42

<211>6

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>ApaL1位点

<400>42

gtgcac                                                             6

<210>43

<211>6

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>Xho1位点

<400>43

ctcgag                                                             6

<210>44

<211>41

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>1F2VH正向引物

<400>44

tataagcgcg cactccgatg tacagcttca ggagtcagga                       41

<210>45

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>1F2VH反向引物

<400>45

atattggtga ccagagtccc ttggcccc                                    28

<210>46

<211>40

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>1B3VK正向引物

<400>46

tatccgtgca ctccgatgtc cagataaccc agtctccatc                        40

<210>47

<211>29

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>1B3VK反向引物

<400>47

atattctcga gcttggtccc agcaccgaa                                    29

<210>48

<211>41

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>1B3VH正向引物

<400>48

tataagcgcg cactccgagg tgcagcttca ggagtcagga c                      41

<210>49

<211>24

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>1B3VH反向引物

<400>49

atattggtga ccgtggtccc agcg                                         24

<210>50

<211>935

<212>DNA

<213>智人

<400>50

tcttctctct gcagagcgca aatgttgtgt cgagtgccca ccgtgcccag gtaagccagc  60

ccaggcctcg ccctccagct caaggcggga caggtgccct agagtagcct gcatccaggg    120

acaggcccca gctgggtgct gacacgtcca cctccatctc ttcctcagca ccacctgtgg    180

caggaccgtc agtcttcctc ttccccccaa aacccaagga caccctcatg atctcccgga    240

cccctgaggt cacgtgcgtg gtggtggacg tgagccacga agaccccgag gtccagttca    300

actggtacgt ggacggcgtg gaggtgcata atgccaagac aaagccacgg gaggagcagt    360

tcaacagcac gttccgtgtg gtcagcgtcc tcaccgttgt gcaccaggac tggctgaacg    420

gcaaggagta caagtgcaag gtctccaaca aaggcctccc agcccccatc gagaaaacca    480

tctccaaaac caaaggtggg acccgcgggg tatgagggcc acatggacag acggcggctt    540

cggcccaccc tctgccctgg gagtgaccgc tgtgccaacc tctgtcccta cagggcagcc    600

ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggag gagatgacca agaaccaggt    660

cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta ccccagcgac atcgccgtgg agtgggagag    720

caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacacctccc atgctggact ccgacggctc    780

cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg tggcagcagg ggaacgtctt    840

ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac acgcagaaga gcctctccct    900

gtctccgggt aaatgagtgc cacggccggc aagcc                               935

<210>51

<211>935

<212>DNA

<213>智人

<400>51

tcttctctct gcagagcgca aatgttgtgt cgagtgccca ccgtgcccag gtaagccagc     60

ccaggcctcg ccctccagct caaggcggga caggtgccct agagtagcct gcatccaggg    120

acaggcccca gctgggtgct gacacgtcca cctccatctc ttcctcagca ccacctgtgg    180

caggaccgtc agtcttcctc ttccccccaa aacccaagga caccctcatg atctcccgga    240

cccctgaggt cacgtgcgtg gtggtggacg tgagccacga agaccccgag gtccagttca    300

actggtacgt ggacggcatg gaggtgcata atgccaagac aaagccacgg gaggagcagt    360

tcaacagcac gttccgtgtg gtcagcgtcc tcaccgtcgt gcaccaggac tggctgaacg    420

gcaaggagta caagtgcaag gtctccaaca aaggcctccc agcccccatc gagaaaacca    480

tctccaaaac caaaggtggg acccgcgggg tatgagggcc acatggacag acggcggctt    540

cggcccaccc tctgccctgg gagtgaccgc tgtgccaacc tctgtcccta cagggcagcc    600

ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggag gagatgacca agaaccaggt    660

cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta ccccagcgac atcgccgtgg agtgggagag    720

caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacacctccc atgctggact ccgacggctc    780

cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg tggcagcagg ggaacgtctt    840

ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac acacagaaga gcctctccct    900

gtctccgggt aaatgagtgc cacggccggc aagcc                               935

<210>52

<211>1780

<212>DNA

<213>智人

<400>52

ctcgaggacc tgctcttagg ttcagaagcg aacctcacgt gcacactgac cggcctgaga     60

gatgcctctg gtgccacctt cacctggacg ccctcaagtg ggaagagcgc tgttcaagga    120

ccacctgagc gtgacctctg tggctgctac agcgtgtcca gtgtcctgcc tggctgtgcc    180

cagccatgga accatgggga gaccttcacc tgcactgctg cccaccccga gttgaagacc    240

ccactaaccg ccaacatcac aaaatccggt gggtccagac cctgctcggg gccctgctca    300

gtgctctggt ttgcaaagca tattcctggc ctgcctcctc cctcccaatc ctgggctcca    360

gtgctcatgc caagtacaca gggaaactga ggcaggctga ggggccagga cacagcccag    420

ggtgcccacc agagcagagg ggctctctca tcccctgccc agccccctga cctggctctc    480

taccctccag gaaacacatt ccggcccgag gtccacctgc tgccgccgcc gtcggaggag    540

ctggccctga acgagctggt gacgctgacg tgcctggcac gtggcttcag ccccaaggat    600

gtgctggttc gctggctgca ggggtcacag gagctgcccc gcgagaagta cctgacttgg    660

gcatcccggc aggagcccag ccagggcacc accacctacg ctgtaaccag catactgcgc    720

gtggcagctg aggactggaa gaagggggag accttctcct gcatggtggg ccacgaggcc    780

ctgccgctgg ccttcacaca gaagaccatc gaccgcatgg cgggtaaacc cacccacatc    840

aatgtgtctg ttgtcatggc ggaggcggat ggcacctgct actgagccgc ccgcctgtcc    900

ccacccctga ataaactcca tgctccccca agcagcccca cgcttccatc cggcgcctgt    960

ctgtccatcc tcagggtctc agcacttggg aaagggccag ggcatggaca gggaagaata   1020

ccccctgccc tgagcctcgg ggggcccctg gcacccccat gagactttcc accctggtgt   1080

gagtgtgagt tgtgagtgtg agagtgtgtg gtgcaggagg cctcgctggt gtgagatctt   1140

aggtctgcca aggcaggcac agcccaggat gggttctgag agacgcacat gccccggaca   1200

gttctgagtg agcagtggca tggccgtttg tccctgagag agccgcctct ggctgtagct   1260

gggagggaat agggagggta aaaggagcag gctagccaag aaaggcgcag gtagtggcag   1320

gagtggcgag ggagtgaggg gctggactcc agggccccac tgggaggaca agctccagga   1380

gggccccacc accctagtgg gtgggcctca ggacgtccca ctgacgcatg caggaagggg   1440

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tcacatatac gcctgagccc tgcaggagtg gaacgttcac agcccagacc cagttccaga   1560

aaagccaggg gagtcccctc ccaagccccc aagctcagcc tgctccccca ggcccctctg   1620

gcttccctgt gtttccactg tgcacagctc agggaccaac tccacagacc cctcccaggc   1680

agcccctgct ccctgcctgg ccaagtctcc catcccttcc taagcccaac taggacccaa   1740

agcatagaca gggaggggcc gcgtggggtg gcatcagaag                         1780

<210>53

<211>220

<212>PRT

<213>智人

<400>53

Leu Glu Asp Leu Leu Leu Gly Ser Glu Ala Asn Leu Thr Cys Thr Leu

1               5                   10                  15

Thr Gly Leu Arg Asp Ala Ser Gly Ala Thr Phe Thr Trp Thr Pro Ser

            20                  25                  30

Ser Gly Lys Ser Ala Val Gln Gly Pro Pro Glu Arg Asp Leu Cys Gly

        35                  40                  45

Cys Tyr Ser Val Ser Ser Val Leu Pro Gly Cys Ala Gln Pro Trp Asn

    50                  55                  60

His Gly Glu Thr Phe Thr Cys Thr Ala Ala His Pro Glu Leu Lys Thr

65                  70                  75                  80

Pro Leu Thr Ala Asn Ile Thr Lys Ser Gly Asn Thr Phe Arg Pro Glu

                85                  90                  95

Val His Leu Leu Pro Pro Pro Ser Glu Glu Leu Ala Leu Asn Glu Leu

            100                 105                 110

Val Thr Leu Thr Cys Leu Ala Arg Gly Phe Ser Pro Lys Asp Val Leu

        115                 120                 125

Val Arg Trp Leu Gln Gly Ser Gln Glu Leu Pro Arg Glu Lys Tyr Leu

    130                 135                 140

Thr Trp Ala Ser Arg Gln Glu Pro Ser Gln Gly Thr Thr Thr Tyr Ala

145                 150                 155                 160

Val Thr Ser Ile Leu Arg Val Ala Ala Glu Asp Trp Lys Lys Gly Glu

                165                 170                 175

Thr Phe Ser Cys Met Val Gly His Glu Ala Leu Pro Leu Ala Phe Thr

            180                 185                 190

Gln Lys Thr Ile Asp Arg Met Ala Gly Lys Pro Thr His Ile Asn Val

        195                 200                 205

Ser Val Val Met Ala Glu Ala Asp Gly Thr Cys Tyr

    210                 215                 220

<210>54

<211>1059

<212>DNA

<213>智人

<400>54

gcaagcttga ccagccccaa ggtcttcccg ctgagcctct gcagcaccca gccagatggg     60

aacgtggtca tcgcctgcct ggtccagggc ttcttccccc aggagccact cagtgtgacc    120

tggagcgaaa gcggacaggg cgtgaccgcc agaaacttcc cacccagcca ggatgcctcc    180

ggggacctgt acaccacgag cagccagctg accctgccgg ccacacagtg cctagccggc    240

aagtccgtga catgccacgt gaagcactac acgaatccca gccaggatgt gactgtgccc    300

tgcccagttc cctcaactcc acctacccca tctccctcaa ctccacctac cccatctccc    360

tcatgctgcc acccccgact gtcactgcac cgaccggccc tcgaggacct gctcttaggt    420

tcagaagcga acctcacgtg cacactgacc ggcctgagag atgcctcagg tgtcaccttc    480

acctggacgc cctcaagtgg gaagagcgct gttcaaggac cacctgaccg tgacctctgt    540

ggctgctaca gcgtgtccag tgtcctgtcg ggctgtgccg agccatggaa ccatgggaag    600

accttcactt gcactgctgc ctaccccgag tccaagaccc cgctaaccgc caccctctca    660

aaatccggaa acacattccg gcccgaggtc cacctgctgc cgccgccgtc ggaggagctg    720

gccctgaacg agctggtgac gctgacgtgc ctggcacgtg gcttcagccc caaggatgtg    780

ctggttcgct ggctgcaggg gtcacaggag ctgccccgcg agaagtacct gacttgggca    840

tcccggcagg agcccagcca gggcaccacc accttcgctg tgaccagcat actgcgcgtg    900

gcagccgagg actggaagaa gggggacacc ttctcctgca tggtgggcca cgaggccctg    960

ccgctggcct tcacacagaa gaccatcgac cgcttggcgg gtaaacccac ccatgtcaat   1020

gtgtctgttg tcatggcgga ggtggacggc acctgctac                          1059

<210>55

<211>353

<212>PRT

<213>智人

<400>55

Ala Ser Leu Thr Ser Pro Lys Val Phe Pro Leu Ser Leu Cys Ser Thr

1               5                   10                  15

Gln Pro Asp Gly Asn Val Val Ile Ala Cys Leu Val Gln Gly Phe Phe

            20                  25                  30

Pro Gln Glu Pro Leu Ser Val Thr Trp Ser Glu Ser Gly Gln Gly Val

        35                  40                  45

Thr Ala Arg Asn Phe Pro Pro Ser Gln Asp Ala Ser Gly Asp Leu Tyr

    50                  55                  60

Thr Thr Ser Ser Gln Leu Thr Leu Pro Ala Thr Gln Cys Leu Ala Gly

65                  70                  75                  80

Lys Ser Val Thr Cys His Val Lys His Tyr Thr Asn Pro Ser Gln Asp

                85                  90                  95

Val Thr Val Pro Cys Pro Val Pro Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro

            100                 105                 110

Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser Cys Cys His Pro Arg Leu Ser

        115                 120                 125

Leu His Arg Pro Ala Leu Glu Asp Leu Leu Leu Gly Ser Glu Ala Asn

    130                 135                 140

Leu Thr Cys Thr Leu Thr Gly Leu Arg Asp Ala Ser Gly Val Thr Phe

145                 150                 155                 160

Thr Trp Thr Pro Ser Ser Gly Lys Ser Ala Val Gln Gly Pro Pro Asp

                165                 170                 175

Arg Asp Leu Cys Gly Cys Tyr Ser Val Ser Ser Val Leu Ser Gly Cys

            180                 185                 190

Ala Glu Pro Trp Asn His Gly Lys Thr Phe Thr Cys Thr Ala Ala Tyr

        195                 200                 205

Pro Glu Ser Lys Thr Pro Leu Thr Ala Thr Leu Ser Lys Ser Gly Asn

    210                 215                 220

Thr Phe Arg Pro Glu Val His Leu Leu Pro Pro Pro Ser Glu Glu Leu

225                 230                 235                 240

Ala Leu ASn Glu Leu Val Thr Leu Thr Cys Leu Ala Arg Gly Phe Ser

                245                 250                 255

Pro Lys Asp Val Leu Val Arg Trp Leu Gln Gly Ser Gln Glu Leu Pro

            260                 265                 270

Arg Glu Lys Tyr Leu Thr Trp Ala Ser Arg Gln Glu Pro Ser Gln Gly

        275                 280                 285

Thr Thr Thr Phe Ala Val Thr Ser Ile Leu Arg Val Ala Ala Glu Asp

    290                 295                 300

Trp Lys Lys Gly Asp Thr Phe Ser Cys Met Val Gly His Glu Ala Leu

305                 310                 315                 320

Pro Leu Ala Phe Thr Gln Lys Thr Ile Asp Arg Leu Ala Gly Lys Pro

                325                 330                 335

Thr His Val Asn Val Ser Val Val Met Ala Glu Val Asp Gly Thr Cys

            340                 345                 350

Tyr

<210>56

<211>366

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>嵌合小鼠/人141D10 VH H732

<400>56

caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc ctccggagac cctgtccctc     60

acctgcaatg tctctggtgg ctctatcggt agatactatt ggaactggat ccgacagtcc    120

ccagggaagg ggctggagtg gattggccat atccattaca gtgggagcac catctaccat    180

ccctccctca agagtcgagt cagcatatcg ctggacacgt ccaagaacca ggtctccctg  240

aagttgagtt ctgtgaccgc tgcggacacg gccgtgtatt actgtgcacg aggtgcttac  300

tacggggggg ccttttttcc ttacttcgat gtctggggcc aagggaccac ggtcaccgtc  360

tcctca                                                             366

<210>57

<211>122

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>嵌合小鼠/人141D10 VH H732

<400>57

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Pro Glu

1               5                   10                  15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Asn Val Ser Gly Gly Ser Ile Gly Arg Tyr

            20                  25                  30

Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

        35                  40                  45

Gly His Ile His Tyr Ser Gly Ser Thr Ile Tyr His Pro Ser Leu Lys

    50                  55                  60

Ser Arg Val Ser Ile Ser Leu Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu

65                  70                  75                  80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

                85                  90                  95

Arg Gly Ala Tyr Tyr Gly Gly Ala Phe Phe Pro Tyr Phe Asp Val Trp

            100                 105                 110

Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210>58

<211>321

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>嵌合小鼠/人UH8 VK L120

<400>58

gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctatgggaga cagagtcacc     60

atcacttgcc gggcgagtca gggcattagg aatcatttag cctggtatca gcagaaacca    120

gggaaagctc ctaatctcct gatctctgct gcatccactt tgcaatcagg ggtcccaact    180

cgattcagtg gcagtggatc tggaacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct    240

gaagactctg caacttatta ctgccaacag tataatcggt accccctcac tttcggccaa    300

gggaccaagc tcgagatcaa a                                              321

<210>59

<211>107

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>嵌合小鼠/人UH8 VK L120

<400>59

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Met Gly

1               5                   10                  15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn His

            20                  25                  30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile

        35                  40                  45

Ser Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Thr Arg Phe Ser Gly

    50                  55                  60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65                  70                  75                  80

Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Arg Tyr Pro Leu

                85                  90                  95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

            100                 105

<210>60

<211>369

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>嵌合小鼠/人MSH3 VH(H835)

<400>60

caggtgcagc tgcaggagtc gggaggaggc ttagttcagc ctggggggtc cctgagactc     60

tcttgtgcag gctctggatt caccttcagt agttactgga tgcactgggt ccgccaagct    120

ccagggaagg ggctggtgtg ggtctcacgt attgacactg atgggagtac cacaacctac    180

gcggactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa cacactgtat    240

ctgcaaatga acagcctgag agtcgaggac acggccgtgt attactgtgc acgaggtgct    300

tactacgggg gggccttttt tccttacttc gatgtctggg gccaagggac cacggtcacc    360

gtctcctca                                                            369

<210>61

<211>123

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>嵌合小鼠/人MSH3 VH(H835)

<400>61

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

            20                  25                  30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Val Trp Val

        35                  40                  45

Ser Arg Ile Asp Thr Asp Gly Ser Thr Thr Thr Tyr Ala Asp Ser Val

    50                  55                  60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65                  70                  75                  80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Arg Gly Ala Tyr Tyr Gly Gly Ala Phe Phe Pro Tyr Phe Asp Val

            100                 105                 110

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

                     PCT/RO/134表

申请人或代理机构文件编号：1843.019PC03

国际申请：待指定

                 关于保藏的微生物的说明

                 (PCT实施细则第13条之二)

A.以下所作的说明涉及说明书第 26页第 22、23行所指的微生物。

C.其它说明(如果不适用则留空)     该信息续在附页上□
	质粒DNA：1B3G

D.本说明所适用的指定国(如果本说明不用于所有指定国)

E.单独提交的说明(如果不适用则留空)
	以下说明将在以后提交给国际局(指明说明的一般性质，如“保藏编号”)

申请人或代理机构文件编号：1843.019PC03

国际申请：待指定

                关于保藏的微生物的说明

                (PCT实施细则第13条之二)

A.以下所作的说明涉及说明书第 26页第 23、24行所指的微生物。

C.其它说明(如果不适用则留空)    该信息续在附页上□
	质粒DNA：1B3K

D.本说明所适用的指定国(如果本说明不用于所有指定国)

E.单独提交的说明(如果不适用则留空)
	以下说明将在以后提交给国际局(指明说明的一般性质，如“保藏编号”)

申请人或代理机构文件编号：1843.019PC03

国际申请：待指定

                 关于保藏的微生物的说明

                 (PCT实施细则第13条之二)

A.以下所作的说明涉及说明书第 26页第 20、21行所指的微生物。

C.其它说明(如果不适用则留空)    该信息续在附页上□
	质粒DNA：1F2G

D.本说明所适用的指定国(如果本说明不用于所有指定国)

E.单独提交的说明(如果不适用则留空)
	以下说明将在以后提交给国际局(指明说明的一般性质，如“保藏编号”)

申请人或代理机构文件编号：1843.019PC03

国际申请：待指定

               关于保藏的微生物的说明

               (PCT实施细则第13条之二)

A.以下所作的说明涉及说明书第 26页第 21、22行所指的微生物。

C.其它说明(如果不适用则留空)    该信息续在附页上□
	质粒DNA：1F1K

D.本说明所适用的指定国(如果本说明不用于所有指定国)

E.单独提交的说明(如果不适用则留空)
	以下说明将在以后提交给国际局(指明说明的一般性质，如“保藏编号”)

申请人或代理机构文件编号：1843.019PC03

国际申请：待指定

                 关于保藏的微生物的说明

                 (PCT实施细则第13条之二)

A.以下所作的说明涉及说明书第 33页第 22、23行所指的微生物。

C.其它说明(如果不适用则留空)    该信息续在附页上□
	质粒DNA：H0009

D.本说明所适用的指定国(如果本说明不用于所有指定国)

E.单独提交的说明(如果不适用则留空)
	以下说明将在以后提交给国际局(指明说明的一般性质，如“保藏编号”)

申请人或代理机构文件编号：1843.019PC03

国际申请：待指定

                关于保藏的微生物的说明

                (PCT实施细则第13条之二)

A.以下所作的说明涉及说明书第 33页第 23、24行所指的微生物。

C.其它说明(如果不适用则留空)    该信息续在附页上□
	质粒DNA：L0010

D.本说明所适用的指定国(如果本说明不用于所有指定国)

E.单独提交的说明(如果不适用则留空)
	以下说明将在以后提交给国际局(指明说明的一般性质，如“保藏编号”)

Claims (50)

1.对C35特异的分离的抗体，其选自：

a)包含克隆1B3G编码的VH区的抗体，

b)包含克隆1B3K编码的VL区的抗体，

c)包含克隆1F2G编码的VH区的抗体，

d)包含克隆1F2K编码的VL区的抗体，

e)包含克隆H0009编码的VH区的抗体，

f)包含克隆L0010编码的VL区的抗体，

g)包含(a)的VH区和(b)的VL区的抗体，

h)包含(c)的VH区和(d)的VL区的抗体，

i)包含(e)的VH区和(f)的VL区的抗体，

j)包含SEQ ID NO：56编码的VH区的抗体，

k)包含SEQ ID NO：60编码的VH区的抗体，

l)包含SEQ ID NO：58编码的VL区的抗体，

m)包含(j)的VH区和(1)的VL区的抗体，

n)包含(k)的VH区和(1)的VL区的抗体，

o)包含SEQ ID NO：56编码的VH区的CDR1或CDR2的至少一个的抗体，

p)包含SEQ ID NO：60编码的VH区的CDR1或CDR2的至少一个的抗体，

q)包含SEQ ID NO：58编码的VL区的CDR1、CDR2或CDR3的至少一个的抗体，

r)包含(a)或(c)的VH区的嵌合抗体，

s)包含(b)或(d)的VL区的嵌合抗体，

t)包含(a)的VH区和(b)的VL区的嵌合抗体，

u)包含(c)的VH区和(d)的VL区的嵌合抗体，

v)(r)、(s)、(t)或(u)的嵌合抗体，其是人嵌合抗体，

w)包含(g)或(h)的抗体的1、2、3、4、5或6个CDR的人源化抗体，

x)包含(i)的抗体的1、2、3、4、5或6个CDR的抗体，

y)结合(a)到(x)任一个的抗体所结合的表位的抗体。

2.权利要求1的分离的抗体，其中所述分离的抗体是包含SEQ IDNO：56编码的VH区的抗体。

3.权利要求2的分离的抗体，其还包含SEQ ID NO：58的VL区。

4.权利要求1的分离的抗体，其中所述分离的抗体是包含SEQ IDNO：60编码的VH区的抗体。

5.权利要求4的分离的抗体，其还包含SEQ ID NO：58的VL区。

6.多核苷酸，其编码权利要求1的任一种抗体。

7.载体，其包含权利要求6的多核苷酸。

8.宿主细胞，其包含权利要求7的载体。

9.组合物，其包含权利要求1的任一种抗体，和可药用载体。

10.杀死癌细胞的方法，其包括

(a)对癌细胞使用诱导细胞凋亡的疗法，和

(b)对所述细胞施用对细胞内的癌相关蛋白质特异的抗体，条件是所述蛋白质不是C35，其中所述蛋白质在经历细胞凋亡的细胞的细胞表面上暴露，其中所述抗体缀合到毒素或者与毒素复合，并且其中所述抗体在(a)之前或者之后的时间施用，使得当在所述癌细胞中已经诱导或者正在诱导细胞凋亡时，所述抗体结合所述癌细胞，从而杀死经历细胞凋亡的癌细胞和/或周围的癌细胞。

11.权利要求10的方法，其包括在(a)之前，确定所述蛋白质是否是在经历细胞凋亡的细胞的细胞表面上暴露的细胞内蛋白质。

12.权利要求10的方法，其中所述抗体选自完整抗体、抗体片段和结构域缺失的抗体，并且其中(b)在(a)之后0-6小时、或6-12小时、或6-24小时、或6-36小时、或6-48小时、或6-72小时、或6-96小时、或6-120小时、或12-24小时、或12-36小时、或12-48小时、或12-72小时、或12-96小时、或12-120小时、或24-36小时、或24-48小时、或24-72小时、或24-96小时、或24-120小时、或36-48小时、或36-72小时、或36-96小时、或36-120小时或0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、或120小时发生。

13.权利要求10的方法，其中所述抗体是完整抗体，并且其中(b)在(a)之前0-6小时、0-12、0-24、6-12、6-24、12-24、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、10、9、8、7、6、5、4、3、2小时、或1小时发生或者与(a)同时发生。

14.权利要求10的方法，其中所述细胞内的癌相关抗原是异戊二烯化的蛋白质。

15.权利要求10的方法，其在体外进行。

16.权利要求10的方法，其在体内进行。

17.权利要求10的方法，其在需要癌症治疗的哺乳动物中进行。

18.权利要求17的方法，其中所述哺乳动物是人。

19.权利要求10的方法，其中所述抗体对细胞内的癌相关蛋白质特异，所述蛋白质选自：CENP-F动粒蛋白、CAAX盒蛋白1、DnaJ同系物亚家族A成员1、DnaJ同系物亚家族A成员2、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白G(I)/G(S)/G(O)γ-5亚基、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白G(I)/G(S)/G(O)γ-10亚基、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白G(I)/G(S)/G(O)γ-12亚基、核纤层蛋白B1、核纤层蛋白B2、核纤层蛋白A/C、蛋白质磷酸酶1调节抑制剂亚基16A、过氧化物酶体法尼基化蛋白质、Ras-相关蛋白Rab-11B、Ras-相关蛋白Rab-22A、Ras-相关蛋白Rab-7、Ras-相关蛋白Rab-8、Ras-相关的C3肉毒杆菌毒素底物1、Ras-相关的C3肉毒杆菌毒素底物2、Ras-相关的C3肉毒杆菌毒素底物3、Ras-相关蛋白Rap-2a、Ras-相关蛋白Rap-1b、转化蛋白p21/H-Ras-1、转化蛋白p21A、转化蛋白N-Ras、Ras-相关蛋白Rab-10、Ras-相关蛋白Rab-13、Ras-相关蛋白Rab-1A、Ras-相关蛋白Rab-1B、Ras-相关蛋白Rab-25、Ras-相关蛋白Rab-27A、Ras-相关蛋白Rab-30、Ras-相关蛋白Rab-31、Ras-相关蛋白Rab-32、Ras-相关蛋白Rab-35、Ras-相关蛋白Rab-36、Ras-相关蛋白Rab-38、Ras-相关蛋白Rab-3A、Ras-相关蛋白Rab-3D、Ras-相关蛋白Rab-4A、Ras-相关蛋白Rab-5C、Ras-相关蛋白Rab-6A、转化蛋白RhoA、转化蛋白RhoB、转化蛋白RhoC、Rho-相关的GTP-结合蛋白RhoD、Rho-相关的GTP-结合蛋白RhoG、Rho-相关的GTP-结合蛋白RhoH、Ras-相关蛋白R-Ras2、和Ras-相关蛋白R-Ras。

20.权利要求10的方法，其排除对细胞内的癌相关蛋白质特异的抗体，所述蛋白质选自：CENP-F动粒蛋白、CAAX盒蛋白质1、DnaJ同系物亚家族A成员1、DnaJ同系物亚家族A成员2、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白G(I)/G(S)/G(O)γ-5亚基、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白G(I)/G(S)/G(O)γ-10亚基、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白G(I)/G(S)/G(O)γ-12亚基、核纤层蛋白B1、核纤层蛋白B2、核纤层蛋白A/C、蛋白质磷酸酶1调节抑制剂亚基16A、过氧化物酶体法尼基化蛋白质、Ras-相关蛋白Rab-11B、Ras-相关蛋白Rab-22A、Ras-相关蛋白Rab-7、Ras-相关蛋白Rab-8、Ras-相关的C3肉毒杆菌毒素底物1、Ras-相关的C3肉毒杆菌毒素底物2、Ras-相关的C3肉毒杆菌毒素底物3、Ras-相关蛋白Rap-2a、Ras-相关蛋白Rap-1b、转化蛋白p21/H-Ras-1、转化蛋白p21A、转化蛋白N-Ras、Ras-相关蛋白Rab-10、Ras-相关蛋白Rab-13、Ras-相关蛋白Rab-1A、Ras-相关蛋白Rab-1B、Ras-相关蛋白Rab-25、Ras-相关蛋白Rab-27A、Ras-相关蛋白Rab-30、Ras-相关蛋白Rab-31、Ras-相关蛋白Rab-32、Ras-相关蛋白Rab-35、Ras-相关蛋白Rab-36、Ras-相关蛋白Rab-38、Ras-相关蛋白Rab-3A、Ras-相关蛋白Rab-3D、Ras-相关蛋白Rab-4A、Ras-相关蛋白Rab-5C、Ras-相关蛋白Rab-6A、转化蛋白RhoA、转化蛋白RhoB、转化蛋白RhoC、Rho-相关的GTP-结合蛋白RhoD、Rho-相关的GTP-结合蛋白RhoG、Rho-相关的GTP-结合蛋白RhoH、Ras-相关蛋白R-Ras2、和Ras-相关蛋白R-Ras。

21.权利要求10的方法，其中所述毒素是放射性同位素、放射性核素、细胞毒素或者细胞毒性前体药物。

22.权利要求17的方法，其在需要清除较小肿瘤和/或微转移瘤的哺乳动物中进行。

23.权利要求22的方法，其中所述哺乳动物是人。

24.杀死癌细胞的方法，其包括

(a)对癌细胞使用诱导细胞凋亡的疗法，和

(b)对所述细胞施用抗体，其中所述抗体对C35特异，并且其中所述抗体在(a)之前或者之后的时间施用，使得当在所述癌细胞中已经诱导或者正在诱导细胞凋亡时，所述抗体结合所述癌细胞，从而杀死经历细胞凋亡的癌细胞。

25.权利要求24的方法，其中所述抗体缀合到毒素或者与毒素复合。

26.权利要求25的方法，其中所述对C35特异的抗体是选自下面的抗体：

a)包含克隆1B3G编码的VH区的抗体，

b)包含克隆1B3K编码的VL区的抗体，

c)包含克隆1F2G编码的VH区的抗体，

d)包含克隆1F2K编码的VL区的抗体，

e)包含克隆H0009编码的VH区的抗体，

f)包含克隆L0010编码的VL区的抗体，

g)包含(a)的VH区和(b)的VL区的抗体，

h)包含(c)的VH区和(d)的VL区的抗体，

i)包含(e)的VH区和(f)的VL区的抗体，

j)包含SEQ ID NO：56编码的VH区的抗体，

k)包含SEQ ID NO：60编码的VH区的抗体，

l)包含SEQ ID NO：58编码的VL区的抗体，

m)包含(j)的VH区和(l)的VL区的抗体，

n)包含(k)的VH区和(l)的VL区的抗体，

o)包含SEQ ID NO：56编码的VH区的CDR1或CDR2的至少一个的抗体，

p)包含SEQ ID NO：60编码的VH区的CDR1或CDR2的至少一个的抗体，

q)包含SEQ ID NO：58编码的VL区的CDR1、CDR2或CDR3的至少一个的抗体，

r)包含(a)或(c)的VH区的嵌合抗体，

s)包含(b)或(d)的VL区的嵌合抗体，

t)包含(a)的VH区和(b)的VL区的嵌合抗体，

u)包含(c)的VH区和(d)的VL区的嵌合抗体，

v)(r)、(s)、(t)或(u)的嵌合抗体，其是人嵌合抗体，

w)包含(g)或(h)的抗体的1、2、3、4、5或6个CDR的人源化抗体，

x)包含(i)的抗体的1、2、3、4、5或6个CDR的抗体，

y)结合(a)到(x)任一个的抗体所结合的表位的抗体。

27.权利要求26的方法，其中所述抗体包含SEQ ID NO：56或SEQID NO：60编码的VH区。

28.权利要求24的方法，其中所述抗体选自完整抗体、抗体片段和结构域缺失的抗体，并且其中(b)在(a)之后0-6小时、或6-12小时、或6-24小时、或6-36小时、或6-48小时、或6-72小时、或6-96小时、或6-120小时、或12-24小时、或12-36小时、或12-48小时、或12-72小时、或12-96小时、或12-120小时、或24-36小时、或24-48小时、或24-72小时、或24-96小时、或24-120小时、或36-48小时、或36-72小时、或36-96小时、或36-120小时或0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、或120小时发生。

29.权利要求24的方法，其中所述抗体是完整抗体，并且其中(b)在(a)之前0-6小时、0-12、0-24、6-12、6-24、12-24、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、10、9、8、7、6、5、4、3、2小时、或1小时发生或者与(a)同时发生。

30.权利要求24的方法，其在体外进行。

31.权利要求24的方法，其在体内进行。

32.权利要求24的方法，其在需要癌症治疗的哺乳动物中进行。

33.权利要求32的方法，其在需要C35相关癌症的癌症治疗的哺乳动物中进行，所述癌症选自：乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌、结肠癌和黑素瘤。

34.权利要求33的方法，其中所述哺乳动物是人。

35.权利要求25的方法，其中毒素是放射性同位素、放射性核素、细胞毒素或者细胞毒性前体药物。

36.权利要求32的方法，其在需要清除较小肿瘤和/或微转移瘤的哺乳动物中进行。

37.权利要求36的方法，其中所述哺乳动物是人。

38.权利要求25的方法，其中所述抗体是选自IgG3、IgM、IgA、IgD、和IgE的免疫球蛋白同种型。

39.权利要求28的方法，其中所述抗体是结构域缺失的抗体。

40.权利要求39的方法，其中所述结构域缺失的抗体是CH2结构域缺失的抗体。

41.权利要求28的方法，其中所述抗体是选自Fab、F(ab′)2、scFV、微型抗体、双链抗体、三链抗体和四链抗体的抗体片段。

42.杀死癌细胞的方法，其包括对所述细胞施用抗体，其中所述抗体对C-35特异，并且其中所述抗体缀合到毒素或者与毒素复合。

43.权利要求42的方法，其中所述毒素是放射性同位素、放射性核素、细胞毒素或者细胞毒性前体药物。

44.权利要求42的方法，其中所述抗体选自：

a)包含克隆1B3G编码的VH区的抗体，

b)包含克隆1B3K编码的VL区的抗体，

c)包含克隆1F2G编码的VH区的抗体，

d)包含克隆1F2K编码的VL区的抗体，

e)包含克隆H0009编码的VH区的抗体，

f)包含克隆L0010编码的VL区的抗体，

g)包含(a)的VH区和(b)的VL区的抗体，

h)包含(c)的VH区和(d)的VL区的抗体，

i)包含(e)的VH区和(f)的VL区的抗体，

j)包含SEQ ID NO：56编码的VH区的抗体，

k)包含SEQ ID NO：60编码的VH区的抗体，

l)包含SEQ ID NO：58编码的VL区的抗体，

m)包含(j)的VH区和(l)的VL区的抗体，

n)包含(k)的VH区和(l)的VL区的抗体，

o)包含SEQ ID NO：56编码的VH区的CDR1或CDR2的至少一个的抗体，

p)包含SEQ ID NO：60编码的VH区的CDR1或CDR2的至少一个的抗体，

q)包含SEQ ID NO：58编码的VL区的CDR1、CDR2或CDR3的至少一个的抗体，

r)包含(a)或(c)的VH区的嵌合抗体，

s)包含(b)或(d)的VL区的嵌合抗体，

t)包含(a)的VH区和(b)的VL区的嵌合抗体，

u)包含(c)的VH区和(d)的VL区的嵌合抗体，

v)(r)、(s)、(t)或(u)的嵌合抗体，其是人嵌合抗体，

w)包含(g)或(h)的抗体的1、2、3、4、5或6个CDR的人源化抗体，

x)包含(i)的抗体的1、2、3、4、5或6个CDR的抗体，

y)结合(a)到(x)任一个的抗体所结合的表位的抗体。

45.权利要求42的方法，其在需要C35相关癌症的癌症治疗的哺乳动物中进行，所述癌症选自：乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌、结肠癌和黑素瘤。

46.权利要求45的方法，其中所述哺乳动物是人。

47.权利要求42的方法，其中所述抗体是选自IgG3、IgM、IgA、IgD、和IgE的免疫球蛋白同种型。

48.权利要求42的方法，其中所述抗体是结构域缺失的抗体。

49.权利要求48的方法，其中所述结构域缺失的抗体是CH2结构域缺失的抗体。

50.权利要求42的方法，其中所述抗体是选自Fab、F(ab′)2、scFV、微型抗体、双链抗体、三链抗体和四链抗体的抗体片段。

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