CN1935143A - Tau－Tau结合的抑制 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于检测能够调节或抑制病理性tau－tau蛋白结合和病理性神经丝聚集的药物的新方法，本发明的方法特别用于筛选那些预防和治疗阿尔茨海默氏病、运动神经元疾病、路易体疾病、皮克氏体病以及进行性核上麻痹的药物。另外，也对在保持正常细胞骨架功能的同时能选择性地抑制病理性聚集的药物作了说明。

Description

Tau-Tau结合的抑制
此案是1996年3月25日提交的、中国申请号为200410031740.8、发明名称为“Tau-Tau结合的抑制”的专利申请的分案申请。
本发明涉及检测能调节或抑制病理性tau-tau蛋白(T形物蛋白)结合和病理性神经丝聚积物质的新方法。本方法特别用于筛选、预防和治疗阿尔茨海默氏病的物质。
阿尔茨海默氏病(简称AD)是老年性痴呆最常见的原因[Lingstone(1994)疾病等级，疾呆(Burns和Levy编)Chapman & Hall伦敦，21-35页]。阿尔茨海默氏病患者的特征表现为进行性痴呆伴随逐渐加重的记忆力丧失，辨认、感觉和语言能力受干扰，以及全脑智力减退(Roth，Zversen(1996)英国医学通报，42(特刊))。
AD的主要病理特征为老年斑和神经纤维缠结，两者中均含有由微管结合蛋白Tau构成的双股螺旋形纤丝(PHF)(Wischid等(1998)美国国家科学院汇刊，85，4506-4510)。老年斑中还存在β-淀粉样纤维，这些纤维来源于尚未探明的淀粉样前体蛋白(APP)形成过程中的畸变(APP；Kang等(1987)自然，325，733-736)。
对AD的研究一直着眼于正常的微管结合蛋白Tau的丧失(Mukaetova-Ladinska等(1993)美国病理杂志，143，565-578；Wischik等(1995a)神经生物老化，16：409-417；Lai等(1995b)神经生物老化，16：433-445)，病理性双股螺旋纤丝的聚集(PHFs；Mukaetova-Ladinska等(1993)，出处同前；Harrington等，(1994a)痴呆，5，215-228；Harrington等(1994b)美国病理学杂志，145，1472-1484；Wischik等，(1995a)，出处同前)；以及作为识别力损伤的明显辨别标志的额中部皮层突触的丧失(Terry等(1991)神经病学年刊，30，572-580)。突触的丧失(Terry等，出处同前)以及锥体细胞的丧失(Bondareff等(1993)普通精神病学文献，50，350-356均与Tau反应性神经原纤维病理的形态测定相关，这在分子水平上关系到AD中Tau蛋白池从溶解形式转化为聚合形式(PHFs)的完全重分配(Mukaetova-Ladinska等，(1993)，出处同前；Lai等，(1995)，出处同前)。这些转化的一种可能解释为：病理性Tau蛋白重分配形成双股螺旋形纤丝(PHFs)，使锥体细胞内聚合状态的轴突微管蛋白产生失衡，造成皮层-皮层交联通路的轴突传导障碍(Wischik等(1995a)，出处同前；(Wischik等(1995b)神经生物老化，(在印刷中)；Wischik等(1995c)，AD中双股螺旋形纤丝的结构、生化和分子病理，A.Goate，F.Ashall编(在印刷中)；Lai等，(1995)，出处同前)。从体细胞到远距离神经皮层的突触传导障碍会造成突触丧失及识别力损伤。另一些因素包括锥体细胞中PHF聚积的直接毒性(Bondareff等，(1993)，普通精神病学文献，50：350-356；(1994)，神经病理学与实验神经病学杂志，50：158-164)和损伤细胞功能的Tau聚积性可能的直接毒性(Mena等，(1991)，神经病理学与实验神经病学杂志，50：474-490)。
尽管分子病理模型的研究强调β-淀粉样聚积的神经毒性作用[Harrington，Wischik(1994)探讨AD的分子病理生物学：痴呆(A.Bums，R.Levy编)Chapman & Hall，伦敦，211-238页]，但有关β-淀粉样聚积与人类识别力损伤相关联的证据不足。APP转变过程可能只是引发Tau蛋白转化的多种因素之一。其它引发因素包括未明的与载脂蛋白E4(apoE4)相关的过程(Harrington等，(1994b)，出处同前)、染色体21的三体性[Mukaetova-Ladinska等(1994)脑功能不全展望，7：311-329]以及环境因素，例如铝亚毒性环境长期暴露(Harrington等(1994c)Lancet，343，993-997)。可能诱发一般模式的Tau-蛋白作用障碍的明确病因学因素包括：谷氨酸-391(Glu-391)处C-末端截断、PHF-Tau多媒体的形成、可溶性tau蛋白的丢失以及异常磷酸化Tau种类的聚积[Wischik等，(1996)国际精神病学评论(印刷中)]。
作为抗蛋白酶PHF核心成分的微管交联蛋白tau片段93/95是来自Tau蛋白微管交联区的氨基酸残基片段[Wischik等，(1988)，出处同前；Kanda等，(1988)，神经原，1，827-834；Jakes等(1997)欧洲分子生物学学会杂志，10，2725-2729；Novak等(1993)，欧洲分子生物学学会杂志，12，365-370]。Tau蛋白在成人脑中有6种352至441个氨基酸残基组成的同型体[Goedert等，(1989)，神经原，3，519-526]。在一般结构中tau分子的组成是一个有252个残基的N-末端区(从微管分子处凸出来)、一个由3或4个串联重复构成的93-125个残基的串联重复区(该区为微管结合区)、以及一个含64个残基的C-末端尾。每个串联重复结构由一种含19个残基的微管蛋白结合区段和一种含12个残基的连接区段构成[Butner，和Kirschner，(1991)，细胞生物学杂志，115，717-730；图1]。tau蛋白的主要有效成份是一种来源于3-或4-重复同型体(isoform)的12(KDa)的片段。该片段可以从富含抗蛋白酶的核心PHF制剂中提取，但每一同型体都限制在3个串联重复结构的平衡状态(Jakes等，出处同前；图2)。该片段的N和C-末端边界限定了特征性抗蛋白酶PHF核心tau单位的确切范围，该范围根据Butner和Kirschner定义的正常分子结合体/连接体的结构按14/16个残基发生周期性变化(Butner，Kirschner，出处同前，图1)，并在与Glu-391或4-重复同型体的3个重复结构相同的位置发生C-末端截断(Novak等(1993)，出处同前，图3)。一种单克隆抗体(mAb423)可以特异性识别该C-末端截点，并应用该抗体进行的组织学研究表明在整个神经原纤维退化过程中都在Glu-391有C-末端截短的tau蛋白(Mena等(1995)神经病理学报，89，50-56；Mena等(1996)神经病理学报(印刷中))。因此，涉及PHF形成的翻译后修饰可能是一种异常的蛋白水解作用。
现在已发展的一些方法可以识别AD人的脑组织中不同tau-蛋白池，包括：正常可溶性Tau蛋白、磷酸化Tau蛋白、以及抗蛋白酶PHFs[Harrington等，(1990)(1991)(1994a)，出处同前]。这些方法已经被推广应用于研究严重的AD和Down′s综合征[Mukaetovce-Ladinska等，(1993)(1995)，出处同前]，也应用于早期AD患者(Wischik等(1995a)，出处同前；Lai等(1995)，出处同前)和其它由神经病理性诊断的病例(包括路易体疾病(lewy body disease)和帕金森氏病引起的老年痴呆)的前瞻性研究(Harrington等，(1994a)(1994b)，出处同前)。根据脑组织中完整的PHF构成能明确区别有或没有阿尔茨海默型痴呆的患者，两者PHF含量存在19倍的差异，在颞部皮层中可达40倍。组织学研究认为主要的PHF聚积点(按抗蛋白酶PHFs或磷酸化tau蛋白形成的聚积来说)与年龄控制区无差别(Harrington等，(1994a)(1994b)，出处同前)。而且载脂蛋白E4基因型在路易体疾病皮层和在AD中具有相同程度的E4等位基因。因此，E4等位基因的存在不是ADtau蛋白病理特征的唯一原因，因为该病理特征尚未在路易体疾病中发现(Harrington等(1996)出处同前)。
正常溶解性tau蛋白的数量是鉴别有或没有AD病例的另一参数。尽管白质中tau蛋白水平比灰质中高，但对于轴突微管交联蛋白，灰质中的数量也能反映传入神经轴突的分布。AD患者存在明显的正常可溶性tau蛋白丧失，该丧失均匀地影响到全脑各部位(Mukaetova-Ladinska等，(1993)，出处同前)。这种脑衰退的分子基础尚属未知，也无法用tau蛋白mRNA减少来解释(Goedort等，(1998)，美国国家科学院汇刊，85，4051-4058)。PHFs聚积和可溶性tau蛋白丧失造成了tau蛋白池解剖上的再分配：由白质占主体转变为灰质占主体，由额面占主体转变为颞壁占主体。
AD中全脑tau蛋白再分配的程度可用图4中显示的数据表示。该图对全部正常活动的tau蛋白池和PHF交联tau池进行了比较，对照组中97％的tau蛋白池处于可溶状态，而AD中87％的处于不可溶状态，而且几乎全部为截断形式和聚合成PHFs形式(Mukaetova-Ladinska等(1993)，出处同前)。应用临床诊断仪CAMDEX对早发AD病患者进行的前瞻性研究(Roth等(1986)，英国精神病学杂志，149，698-709)和按Braak的标准进行的尸体解剖(Braak(1991)，神经病理学报，82，239-259)研究表明可溶性Tau蛋白的丧失与缠结数与PHF聚积的程度直接相关(Lai等，(1995)，出处同前)。
尽管异常磷酸化tau蛋白被认为可能是一种PHF前体(Lee等(1991)科学，251，675-678；Goedert等，(1994)微管(Hyams，Llogd编)183-200页，JohnWiley and Sons，纽约)，但在许多曾被认为是PHF结合的tau蛋白异常磷酸化的部位，正常tau蛋白也发生了磷酸化(Matsuo等，(1994)，神经元，13，989-1002)，对早发AD研究发现，非溶解性高度磷酸化tau蛋白最早出现于可测知的tau蛋白重分配后转化为PHFs后(Lai等，1995；图5)。尚无证据表明磷酸化tau蛋白在出现PHFs或神经原纤维混乱之前有选择性的聚集(Lai等，(1995)，同前)。同样，也无证据表明在病理进程中有磷酸化tau蛋白供应PHF-结合池(Lai等，(1995)，同前)。tau蛋白的磷酸化至今仍是一种异常现象，它可能是在病理阶段影响大约5％PHFs的一种次级过程(Wischik等(1995a)(1995c)同前)。
早期AD研究还表明溶解性tau蛋白转变为PHFs的转化率与PHF水平呈等比级数关系随周围高水平的PHFs聚集率而逐渐增长(Lai等，(1995)，出处同前，图6B)。而且，病理进程中所观察到的溶解性Tau丧失率不能充分解释PHFs聚集率，当周围溶解性tau水平降至580pmol/g以下时，可引起进行性新的tau合成，并进入PHF组成系统(图6A)。因此PHF聚集率并非由溶解性前体的状态或聚集浓度决定。(该前体的状态和聚集情况即使在AD中也是完全正常的)。(Wischik等，(1995a)(1995b)出处同前)。更确切地说，可溶性tau蛋白转化为PHFs的转化率是由周围PHF-tau水平决定的，这就提示，在tau蛋白转变为PHF聚积时的关键性翻译后的修饰决定了PHF聚积的发生。
这些发现的一个可能解释为Tau蛋白在转变为PHF聚积时遭受了结构上的变化。这一变化与串联重复区的半重复阶段的转变相联系，如以前的文献报导一样(Novak等(1993)，出处以前)。该tau蛋白结构的变化使高亲和tau蛋白捕获位点暴露，捕获tau蛋白并诱导另一tau分子发生结构调整，等等。这种决定PHF聚积率的tau蛋白关键性结构变化不是可溶性tau所需的化学修饰，而是一个由tau蛋白结合到病理性基体时发生的诱导性结构改变。这一过程也可被非tau蛋白启动，例如APP代谢产物(Caputo等(1992)脑研究，597，227-232)、修饰后线粒体蛋白(Wallale(1994)，美国国家科学院汇刊，91，8739-8746)等。一旦tau捕获过程发生，将使下一捕获过程的发生率超出病理性tau复合物的降解率。PHF核心tau复合物抗蛋白酶的作用会限制这一降解过程(Wischik等(1988)，出处同前；Jakes等，出处同前)。一般认为，在没有任何可溶性tau蛋白间插性化学修饰的干扰下，tau蛋白淀粉样作用过程会被启动并呈等比级数速度发展。
图7概括描述了AD中tau蛋白转变为PHFs的过程。PHF核心主要的蛋白组成形式是一种截至93个残基的tau蛋白，该片段包含tau分子串联重复区的移码翻译(phase shifted version)版本，tau分子的串联重复区在正常情况下作为微管结合区。PHF系统的装配可以看作为一种重复序列的结果。其中病理性tau-tau结合起到主导作用。游离tau蛋白的这种结合只有在不对称情况中才有助于生理性聚积，在这种情况中tau分子经受了病理性捕获，例如APP代谢产物(caputo等(1992)神经生物学，老化，13，267-274)，或修饰后线性蛋白(Jancsit等，(1989)细胞能动力与细胞骨架，14，372-381；Wallace，出处同前)。下一tau蛋白结合由捕获种类的不完全蛋白水解过程促进，最后只剩下截短的tau蛋白单位。一旦一个全长或截短的tau单位与另一全长tau分子结合，病理性复合物的不完全蛋白水解过程将产生一个核心tau单位的二聚体，伴随着失去前一完整tau分子的N-或C-末端区。蛋白水解过程的局限性是由tau-tau结合区域决定的，该区域与最小抗蛋白酶tau单位准确对应，对这方面我们已作了报道(Novok等，(1993)，出处同前)(见图16，17)。但是，不完全水解的最终结果是核心tau单位的再生，该tau单位能捕获下一全长tau分子，这一过程不断重复直到可获得的tau-蛋白池耗竭，其中需要两个关键步骤：首先是截短的单位重复捕获全长tau蛋白，第二是截断结合的全长tau蛋白，再产生核心单位。
到目前为止，尚无检测病理性tau-tau产联的可靠方法的报导。也无关于调节或抑制病理性tau-tau结合的药物的发表。
在本申请权利要求书中提出了解决以上问题的具体方案的技术特征。
因此，本发明涉及检测能调节或抑制病理性tau-tau结合制剂的方法，该方法包括将：
a)一种tau蛋白或其含有tau核心片段的衍生物与
b)一种推测能调节或抑制tau-tau交联的制剂和
c)一种能与a)中tau蛋白结合的标记的tau蛋白或其标记的衍生物接触，或和不同于a)中的tau蛋白，而也能与a)中的tau蛋白结合的tau蛋白或其衍生物接触，以及
d)tau-tau结合的检测。
与聚合物反应有关的tau蛋白修饰转化为PHFs的过程是由物理结构变化而不是由tau蛋白的任何化学翻译后的修饰进行的。但令人吃惊的是，通过把tau先结合到固相上，将这种由病理性tau捕获发生时产生的体内修饰转移或按上述过程进行的体外方法是可能的。从新生大鼠脑中分离出的tau蛋白完全不能结合到PHF的核心tau单位上(图14，“POTr”)。但以前已经被动结合到固相基质上的新生tau蛋白能够被诱导与无修饰的全长tau蛋白结合，该全长tau蛋白与核心tau单位有相同的高亲和力。因此，将一种不能发生病理性结合的tau蛋白转化为能捕获另一种高亲和力的tau分子所需要的关键性因素是由新生tau蛋白与固相物质发生被动结合所导致的结合变化。这表明高亲和tau捕获位点的暴露能被发生在tau蛋白与适当物质结合时的结构变化所诱导。
根据本发明，在体外实验中再现的病理性结合的某些重要特性与在人脑中所见到的相同，特别是结合在丙氨酸-390(Ala-390)(图21，SEQ ID NO：4)终止的核心tau单位的全长tau蛋白，该核心tau单位因此而缺乏被单克隆抗体423(mAb423)识别所需的Glu-391，在用广谱蛋白酶(键霉蛋白酶)消化处理该结合的tau复合物后，能以一种定量依赖于链霉蛋白酶消化(图17)程度的方式与mAb423发生反应(图16)。N-末端tau蛋白免疫反应性的消化依赖性的丧失可表明它与获得核心PHF的特征mAb423免疫反应性相平行(图16)。因此从PHF核心分离并在AD患者脑中生成tau单位的必要条件是病理性tau-tau相互作用。这已在体外实验中再现。
而且，全长tau蛋白重复循环结合到Ala-390上终止的tau单位上，接着用链霉蛋白酶处理，再与全长tau结合，以及再进行链霉蛋白酶的消化，就这样一直到4个循环完成，都与Glu-391C-末端截短的tau蛋白逐渐聚集相关(图18)，并且每一循环都伴有全长tau蛋白结合能力的逐渐增加(图18)。这表明图7所示的模型中蛋白酶解的重要作用是防止饱和，并因此促进可溶性tau无限制逐渐转化到PHF核心截短的t单位。
已证明图7中所有步骤均能在体外实验中复制。这一进程的关键条件是tau捕获阶段的高亲和力。这可证明对该结合情况的鉴定可用来寻找能阻断高亲和力tau-tau结合的化合物。
大多数有抑制能力化合物在其与tau蛋白的摩尔比为1∶1时，可显示20％的竞争性抑制，进一步的抑制大约在其摩尔比提高到10∶1时才能显现(图19)。
因为串联重复区作为整体发挥作用，所以出乎意料的是病理性tau-tau结合的选择性竞争的抑制作用不干扰同一分子区的tau与微管蛋白的正常结合是可能的。确定任何可能干扰的方法(即干扰tau或其衍生物与微管蛋白分子的结合)，包括将解聚的微管蛋白制剂或用紫杉酚(taxol)固定的微管蛋白制剂与一种估计能调节或抑制病理性tau-tau交联的制剂和一种上述c)中提到的tau化合物接触，接着检测tau-微管蛋白的结合。
“tau蛋白”这一术语指的是以上提到的tau蛋白家庭中的任一种蛋白及其衍生物。tau蛋白是大量蛋白家庭中的一类，这些蛋白家族在结合和分解的重复循环中与微管发生共纯化(Shelanski等，(1973)，美国国家科学院汇刊)，70，765-768)，并且tau蛋白还被称为微管结合蛋白(MAPs)。此外tau家族包含一个特征性N-末端片段，该片段为该tau蛋白家庭的所有成员共有；一个插入到N-末端片段中在脑中在发育中被调节的约50个氨基酸构成的序列；一个特征性串联重复区，由31-32个氨基酸串联重复3或4次构成；以及一个C-末端尾(图2)。
在本发明的一优选方案中，tau蛋白包含图21的氨基酸序列(SEQ IDNO：5)，被称为“T40”(Goedert等，(1989)，神经元3：519-526)，或其片段，并且其形状是含有2个N-末端插入和4个串联重复结构的tau蛋白。
“tau核心片段”是指最基本形式的tau片段，含有一个由串联重复区产生的截短的tau蛋白序列，该串联重复区在适当条件下能与另一高亲和性tau蛋白的串联重复区结合。一般说来，优选的tau蛋白、tau蛋白衍生物以及tau蛋白核心片段都具有一氨基酸序列，该序列至少有70％与相应人类tau蛋白氨基酸序列(图21，SEQ ID NO：5)相同。至少80％为更优选。至少90％为最优选，并且它们的特征在于这些优选tau蛋白能与人类tau核心片段结合。本发明检测方法的独特优点体现在它包括了具有图22中所示的氨基酸序列的tau核心片段(SEQ ID NO：6；Novak等，1993)。这一由大肠杆菌在体外表达的重组tau肽与从抗蛋白酶PHF核心制剂中分离出的相应(Wischik等(1988)，出处同前；Jakes等，(1991)出处同前)。“tau核心片段”也包括它在以下所述的及在图25、26中提及的衍生物(SEQ ID NO：9，10)。
“tau蛋白衍生物”及“tau核心片段衍生物”包括天然或非天然生成的tau蛋白以及相关蛋白的片段。所谓相关蛋白是指那些至少含有与tau蛋白串联重复区部分相似的氨基酸序列的蛋白，即天然tau或其片段中一个或多个氨基酸已被取代或除去而未丧失结合活性的蛋白。与串联重复区有相似序列的天然蛋白，其实例有微管结合蛋白(MAP2；图25、26；SEQ ID NO：9，10；Kindler和Garner(1994)，分子脑研究，26，218-224)。这样的类似物可由已知的肽化学方法或DNA重组技术制备。
“tau蛋白衍生物”和“Tau核心片段衍生物”是指那些可用现有技术中已知的方法从残基的侧链或N，C-末端基团制备的衍生物。这些衍生物包括羧基脂肪族酯、羧基与氨或者与伯或仲胺反应而产生的羧基酰胺、氨基酸残基中游离的氨基团与酰基(例如链烷醇或碳环芳酰基团)形成的N-酰基衍生物或游离羟基团(例如丝氨酰基或苏氨酰基残基)与酰基部分形成的O-酰基衍生物。
核心PHF tau片段可用Wischik等所述的方法从AD患者脑组织中分离出来(1988，1995a出处同前)，这种方法依赖于一系列不同速度的离心。这些离心步骤是在经验确定的缓冲液和浓度条件下进行的。最后关键性的一步离心在从1.05到1.18密度之间的连续变化的蔗糖密度梯度以及10μg/ml链霉蛋白酶存在下进行的，在高浓度氯化铯缓冲垫层交界面上形成一抗蛋白酶PHF核心片段。tau蛋白是从PHF核心中释放出来在pH＝5.5的上清液(50mmol氨基乙酸酯)中一种基本纯化的制剂，该上清液经浓缩甲酸处理PHF制剂，冻干，并在pH5.5的缓冲液中进行声处理后获得。
正常可溶性tau可从死后3小时内尸解的AD患者、对照组人脑组织或动物脑组织中分离出来，微管蛋白可按Shelanski等所述(1973，同前)通过温度依赖性的三个结合-分解循环获得。tau蛋白可经凝胶过滤从耐热级份中纯化制备(Hezzog，Weber(1978)欧洲分子生化杂志，92，1-8)。或者也可按Lindwall和Cole(1984；生物化学杂志，259，12241-12245)的方法分离，这种方法以tau蛋白在2.5％高氯酸中的溶解性为基础。
tau蛋白和其片段的产生也可用传统的DNA重组技术。该技术属于该领域的已知技术，在文献中有详细报道，例如Sambrook，Frisch和Maniatis编的“分子克隆、实验手册”(1989)，Cold Spring Harbor实验室，纽约；及Ausubel等的“分子生物学实验方案”Green出版社，Association & Wileyinterscience。
而且，编码全部或部分tau蛋白的DNA分子或其衍生片段可经聚合酶链反应(PCR)技术获得，编码相关的DNA分子3′，5′部位的引物可合成为需要的tau蛋白，也可用来扩增tau蛋白家族中的各个成员。
目前已知的制备微管蛋白或其片段的方法由Slobuda等在“细胞活动”(R.Goldman，T，Pollard和J.Rosenbanm编，Cold Spring Harbor实验室，ColdSpring港，纽约，1171-121 2页)一书中进行了说明。
DNA序列和DNA分子可应用多种宿主/载体联合系统进行表达。例如，可应用的表达载体包含染色体片段、非染色体片段及合成的DNA序列片段。这些载体的例子有病毒载体，如多种已知的SV40；细菌载体如来自大肠杆菌的质粒；噬菌体DNA载体如大量的噬菌体λ衍生物，MB及其它丝状单链DNA噬菌体；以及酵母中应用的载体如2μ质粒衍生物；用于真核生物细胞的载体(更优选用于动物细胞的载体)如包含来自SV40、腺病毒和/或反转录病毒的DNA序列的载体。
这里所述的“DNA序列”是指其形式为分散片段或较大DNA结构成分的DNA聚合物，来自至少分离一次的基本上纯化形式DNA，即，未污染的内源性物质并且其量和浓度为使其序列和其组成的核酸序列能用标准生化方法(例如应用克隆载体)鉴定、调控及恢复。这些序列优选不含非翻译区(或内含子，典型存在于真核生物基因中)的连续的开放读框形式。但是，也能选用含有相关序列的基因组DNA。非翻译区DNA序列可存在于开放读框的5′或3′位置，同样也不干扰编码区的调控或表达。
这里所说的“表达载体”“表达质粒”是指包含转录单位的质粒。该转录单位的装配成分包括：(1)一遗传因子或在基因表达中具有调控作用的一些因子，例如启动子或增强子，(2)能转录为mRNA并翻译成蛋白质的结构或编码序列，(3)适当的转录和翻译的启动及终止序列。在多种真核细胞表达系统中应用的结构因子优选包含有能被宿主细胞用于进行细胞外分泌翻译蛋白质的前导序列。再者，在无前导或转运序列的重组蛋白表达的位置，可以含有N-末端蛋氨酸残基。该残基随后可以从表达的重组蛋白断裂而提供最终产物。
用以表达DNA序列的宿主细胞可从多种已知的宿主中选择，这些宿主的例子有原核生物或真核生物细胞。从不同的保藏单位可获得大量这样的宿主，例如ATCC(美国典型培养物保藏中心)或德意志微生物保藏中心(DSM)。原核生物细胞宿主的例子包括大肠杆菌、枯叶杆菌及其它的一些菌株。优选宿主是可购得的哺乳动物细胞，例如小鼠3T3细胞、或神经细胞瘤细胞株(如NIE-115、N2A、PC-12、或SV40转染的非洲绿猿肾细胞株COS等。
用本发明的DNA序列转化的原核或真核生物细胞经发酵制备的tau蛋白能应用以下已知方法纯化为基本的同型体，例如用不同速度离心的方法、与硫酸铵共沉淀、在常压或低压下透析、制备性等电聚焦、制备性凝胶电脉、或多种层析法例如凝胶过滤、高效液相色谱(HPLC)、离子交换层析、反相层析以及亲和层析(例如应用Sepharose Blue CL-6B束缚载体的单克隆抗体)。
根据本发明将tau蛋白或其含有tau核心片段的衍生物与另一tau蛋白及推测有调节或抑制病理性tau-tau结合的制剂共同孵育。tau-tau结合程度与该制剂的抑制能力相关，可用以下各种方法检测：
优选方法：tau蛋白或其含有tau核心片段的片段与一tau衍生物孵育，该衍生物具有明确的与第一种tau蛋白不同的免疫学特性。在这种情况下，tau衍生物的结合可用多克隆抗体或单克隆抗体或其衍生物检测。以下的这一种检测tau-tau结合的鉴定方法就是这类检测方法的例子：将相应于核心片段的截短的tau蛋白与受试物质及全长tau蛋白或截短的tau蛋白片段一起孵育，该片段能模拟含水相中核心PHF的tau单位(图8，10)。
在此情况下，tau-tau结合可用传统的方法应用识别抗体进行免疫生化检测，该抗体能识别全长tau蛋白的N-末端区段，例如：抗体mAb423能识别Glu-391截短的tau核心片段。有利的是，本发明的单克隆抗体自身携带有标记物或直接或间接与标记物偶联的基团，这将在下面举例说明。也能使用由相应的tau抗原注射到动物(优选兔)体内而产生的多克隆抗血清，应用免疫亲和纯化法可以恢复该抗血清，该方法包括将多克隆抗体经过一限制性抗原柱并且传统方式洗脱该多克隆抗体。
本发明特别优选的实施方案包括应用一种能直接对抗位于tau蛋白N-末端附近Gly-16和Gln-26之间的人类特异性区段的抗体。该类抗体的应用使本方法能够检测全长重组人类tau蛋白与来自其它动物(如大鼠)在不同发育阶段的全长tau同种型之间的结合。截短的tau蛋白的结合可用一种特定抗体检测，例如用mAb423能检测在Glu-391末端截短的Tau片段与在Ala-390末端截短的相似片段之间的结合，后者不能被Ab423识别(图8)。
这些抗体或其片段能应用于本学科已知的任一免疫检测系统，包括但不仅限于：放射免疫检测、“夹心”检测法，酶联免疫吸附测定(ELISA)、荧光免疫测定、蛋白A免疫检测等方法。
以下tau-tau结合检测的构型属优选(图10)：将tau片段特别是重组tau片段(相应于核心PHF截短的tau单位)在不会促进tau-tau结合的缓冲液条件下结合到固相物质板上，例如传统的ELISA板上。该截短的tau蛋白与固相的结合优选的是被动结合，这是因为在串联重复区内有高亲和力的tau-tau结合位点。所用的固相物质通常为聚氯乙烯。也可以是纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯或聚丙烯等聚合物。固相支持物可以采用管、珠、盘、微板形式或其他适合于检测方法的表面，它在被动结合tau蛋白时暴露高亲和力的捕获位点。结合后，清洗该固相抗体结合物作为测试样品。
确定适当的缓冲液条件，使核心PHF截短的tau单位与固相结合时不存在自身结合，也不干扰串联重复区内高亲和力的捕获位点。图8建立的检测系统中，Ala-390截短的核心tau单位首先与固相基体结合，然后与Glu-391末端截短的tau单位共孵育。只有后者能检测mAb423的免疫反应性。图9显示了该检测方法的特性，其中只有在预期有tau-tau结合的条件下才能显示mAb423的免疫活性。碱性缓冲液(碳酸钠，tris等)pH值范围优选9-10，例如选用碳酸钠缓冲液(50mM，pH9.6)可忽略核心tau单位的自身结合(图9)。因此，被动结合到固相上的核心tau单位板就是在这种缓冲液中制备的。如果需要，解聚的微管蛋白制剂或在相同缓冲液中的微管制剂也能用平板培养法来测定tau-微管蛋白结合的被动结合。用以阻断多余结合位点的合适试剂有牛奶提取物、牛血清蛋白、明胶等。将结合了核心tau单位的固相转至生理性缓冲液中并与全长tau一起孵育为标准的结合鉴定形式(图10)后，可以显示极高亲和力捕获的正常全长tau蛋白。在固相板上未预先铺上核心tau单位的未见到全长tau的结合。当两者共存时，结合依赖于两种tau蛋白的浓度。当固相或液相都饱和时，另一种类tau蛋白的结合常数依据所测tau蛋白同型体的不同在8-25nm之间变化(图11)。tau-tau结合缓冲液的条件应包括适当的盐浓度及适当的pH值(图12，13)，该浓度优选50-400nm的氯化钠，更优选100-200nM氯化钠或有相当离子强度的相应的盐或盐的混合物，例如PBS(137mMNaCl、1.47mM KH2PO4、8.1mMNCl2HPO4，2.68mM KCl)。pH值应在4-10范围，优选5-8。为了饱和过剩的结合位点并避免非特异结合，固相应与阻断剂一起孵育，例如牛奶提取物、小牛血清或明胶(优选)。将被动结合的核心tau单位转移到生理性缓冲液中后，能够显示正常全长tau蛋白极高捕获亲和力(缓冲液Kd＝8-25nM，依据测试的具体tau种类而定)。
含有tau蛋白(该tau蛋白能结合到固相tau蛋白上)的液相，与被测物一起加到固相tau蛋白上，放置片刻使其充分结合，然后将结合的tau复合物在加有抗体的制剂中清洗，该抗体选择性检测二次结合的tau蛋白，而不是最初的固相tau蛋白，抗体与作为指示的分子结合，用以显示第二种tau蛋白的结合的信号。
或者，应用能与第一种未标记的tau特异抗体结合的第二种抗体也能检测结合的情况，在这种情况下，该二抗与报告分子结合。
“报告分子”在本说明书中是指这样一种分子：依据其化学特性能提供一种可供分析检测的标记，该标记能检测抗原限制性抗体。检测必须至少能相对定量，即能按绝对单位计算或与一包含有已知正常抗原水平的标准(或标准系列)对照来确定样品中抗原的数量。
本检测方法中最常用的报告分子为酶或荧光团。在酶免疫测定时，经常通过戊二醛或过碘酸盐将酶接到第二抗体上。这种标记很容易识别，有多种不同的接合技术均是专业人员已知的。通常所用的酶有辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶和碱性磷酸酶等。
结合了特异性酶的基质一般可以进行选择生产，经相应酶水解后，产物发生可检测的颜色变化。例如对硝基苯磷酸盐适合于用碱性磷酸酶偶联物，对于过氧化酶偶联物，常用于标记1，2-苯二胺或四甲基联苯胺。也可用荧光度物标记，此时将产生一种荧光性产物而不是上述的显色底物。在所有情况下，酶标抗体加到相应的tau-tau蛋白复合物上，能再结合其它复合物，然后将过剩的反应物洗掉。将含有适当底物的溶液(过氧化氢)加到三级复合物抗体-抗原-标记物上。该底物与结合到抗体上的酶反应，产生定性的可见信号，它可通过分光光度计定量评价血清样本中抗原的量。
或者，荧光化合物如荧光素，或若丹明，也可经化学方法标记到抗体上而不改变抗体的结合能力。当用特定波长的光激活后，荧光标记抗体吸附光能，使分子处于激活状态，发出特定的较长波长的光。应用光显微镜可以观察到这种发光的特定颜色。在酶免疫测定(EIA)时，荧光标记的抗体可与一级抗体-tau蛋白-肽复合物结合。洗去未结合反应物后，将保留下的三体(ternary)复合物暴露在适当波长的光下，荧光观察显示抗原的存在。
在本发明另一优选实施方案中：与受测物一起加到液相中的第二种tau蛋白可以与前面提到的报告分子结合，该第二种tau蛋白可以直接被修饰(例如用放射性或酶促方法标记)或在该分子的一个区内(例如N-末端区)被接合(例如与一荧光团接合)，例如该N末端区段，它不包含高亲和力的tau-tau结合位点，因此其本身的作用是可以作为tau-tau结合测定中的配体，也可作为报告分子。
本发明的特别优选方案在实施例1中作了详细说明。
本发明方法中应用的抗体及其片段可用传统技术制备，即对tau抗原决定簇选择性的单克隆抗体可采用Kohler和Milstein的方法获得。相对于tau抗原决定簇的适当单克隆抗体可用已知的方法修饰以获取Fab片段或(Fab′)2片段、嵌合的、人源化的或单链的抗体结构。
应用单克隆抗体测定tau-tau相互作用中的结合亲合力并显示体外实验中的结合与人脑中发生的结合之间免疫化学关系的实施例如下：
识别N-末端或C-末端tau决定簇的单抗能测定截短的与全长的tau蛋白之间的结合。能识别人类特异抗原决定簇的抗体是特别有用的抗体。一种单抗(标记为AK999)能识别在tau蛋白的Gly-16和Gln26之间的人特异性抗原决定簇，因此也能测定全长tau蛋白之间的结合，若其是由非人源化产生的话(Lai(1995)“tau蛋白的异常磷酸化在阿尔茨海默氏病的神经原纤维病理发展中的作用”，博士论文，(剑桥大学)。抗体342能识别位于Ser-208和Asn-265之间的一种非特异性的普通tau抗原决定簇(图21，SEQ ID NO：4)，该抗原决定簇在tau-tau相互作用中将会部分地被阻挡(Lai，出处同前)。
其它有用的抗体已有报道：抗体423识别在Glu-391处C-末端截短的tau蛋白(Novak等，(1993)，出处同前)。这种截断作用自然发生在AD病例中PHF团形成的过程(Mena等，(1995)(1996)，出处同前；Novak等，(1993)，出处同前；Mena等，(1991)，出处同前)。相同的C-末端截断在体外实验中得到证实：全长tau结合到Ala-390截短的tau片段后，该片段不能被mAb423识别(Novak等(1993)同前)，接着用广谱蛋白酶(链霉蛋白酶)消化(图16)。在这一过程中mAb423免疫反应性的唯一可能来源是结合的全长tau蛋白发生消化作用，这可以用浓度依赖法通过增加链霉蛋白酶浓度来显示(图18)。以上表明在体外产生tau-tau结合的分子构型与脑中产生的构型能确切地相对应，因此在体外实验中显示的对tau-tau结合的选择性抑制同样也能应用于人脑。
抗体7.51识别一种位于tau蛋白的倒数第三个重复结构的普通tau蛋白抗原决定簇(Novak等(1991)美国国家科学院汇刊，88，5837-5841)。当tau结合到与PHF类似的免疫化学构型时，该tau抗原决定簇被阻塞，但用甲酸处理后可以再暴露(Harrington等(1990)(1991)，出处同前；Wischik等(1995a)出处同前)。正常可溶性tau或结合微管的tau能用mAb7.51检测而无需甲酸处理(Harrington等(1991)，出处同前；Wischik等(1995a)，出处同前)。在tau-tau结合的测定中全长tau的结合与mAb7.51抗原决定簇的不完全阻断有关。
本发明应用的吩噻嗪在Ki为98-108nM(图19)时发生了结合的抑制作用，其与tau蛋白摩尔比为1∶1时显示20％的抑制，进一步的抑制作用在摩尔比达10∶1时大致呈线性，这与以下假说相一致：tau-tau结合是由有限数量的饱和结合位点决定的，因此具有特异性；而无协同性，即一个tau分子的结合不影响另一tau分子在发生抑制的位点进行结合；结合是可逆的，处于动态平衡状态，在平衡时结合仅由tau浓度和结合的亲和力决定。
考虑到tau串联重复区作为微管蛋白结合区的正常功能，同时在相同的分子区也含有用于PHF集合的捕获位点，如果更细微的分子差异能在两种类型的结合间显示，则只有药物干预才可能阻止tau的病理性结合，这将会选择性抑制病理性tau-tau结合而不抑制正常tau-微管蛋白的结合，因为许多正常的细胞作用过程，特别是突触小泡的轴突迁移(Okabe，Hirokaua(1990)自然343，479-482)，都是依赖于细胞在聚合状态时维持微管蛋白的能力。前面的实验显示了两者间免疫化学的差异(在tau-tau结合时阻挡(occlusion)mAb7.51抗原决定簇而在tau-微管蛋白结合时不阻挡；Harrington等(1991)，出处同前；Novak等(1991)，出处同前)和分子差异(相对于微管蛋白结合区的正常区段/连接物区段，在类似PHF构型中结合的tau显示出14/16氨基酸残基的移码，这可由特征性N-，C-末端蛋白水解断裂位点来证明；Novak等(1993)，出处同前图3)。使人惊奇的是，这些差异也是在现有的药物分类中应用小分子进行药物鉴别的基础。特别是那些能抑制病理性tau-tau结合的吩噻嗪对正常tau-微管蛋白的结合是否有抑制作用，对此也做了试验。可以看出，tau摩尔比高达1000∶1基本上不抑制结合。尽管如此，tau的过多磷酸化(这已表明了对tau微管蛋白的抑制作用)，在tau-微管蛋白结合测定中也能产生类似的抑制作用(Lai，出处同前)。因此，本发明提供的化合物抑制病理性tau-tau结合而不抑制tau与微管蛋白的正常结合。这是本发明的关键所在，因为这表明了在这里所述的筛选系统基础上本发明化合物的技术可行性，该筛选系统可以用药物来鉴别PHF串联重复区的病理性结合和正常的tau-微管蛋白的结合。
到目前为止唯一的PHF核心微管结合蛋白是tau蛋白。尽管如此，但PHGs均积聚在躯体的树突间隙(somatodendritic compartment)中，该间隙中MAP2是主要的微管结合蛋白(Matus，A，微管(Hyams，Lloyd编)，155-165页，John Voley & Sons纽约)。MSP2同型体的串联重复区几乎与tau蛋白相同，但两者在N-末端区的序列和范围都有显著差异(图25，26，SEQ ID NO：9，10)。正如在实施例3中所示，在串联重复区的聚集不是选择性针对特异性tau核心氨基酸序列，并且吩噻嗪抑制剂(如硫堇)的抑制活性也不依赖tau的特有序列。
另外，本发明也涉及相应的体内方法，这些方法用于筛选能调节或抑制病理性tau-tau结合的药物。该tau-tau结合的特征是用tau蛋白或其含有tau核心片段的衍生物或者用表达tau蛋白或含有tau核心片段衍生物的载体转染的细胞株，与一种推测能调节或抑制tau-tau结合的制剂接触，然后检测该细胞株的活性和/或形态。
实施例4和5显示，当表达转基因的全长tau蛋白以及该蛋白的细胞骨架分布不受潜在的tau-tau结合抑制剂培养细胞的干扰时，成纤维细胞是完全存活的，吩噻嗪硫堇未显示明显内在毒性。但当PHF的转基因核心tau单位表达时，成纤维细胞死亡或呈现全形态异常。转染物的存活频率和截短的tau的表达水平，受转染后硫堇中细胞的生长而按剂量依赖方式增加。表达截短的tau的活性转染子依赖于硫堇，并伴随提取后的低存活性而逆转为异常形式。
这些发现是本发明在无神经元的细胞系统中的具体体现，即证实了：细胞中高水平的PHF核心单位具有毒性；这种毒性可被病理性tau-tau结合作用的选择性抑制剂化合物逆转；这些化合物不干扰正常tau与微管蛋白在体外的正常结合。这些发现同时适用于其它实验模型，包括可诱导的转染系统及有截短的tau蛋白的细胞直接转染。
尽管前述结果都支持tau-tau结合抑制剂在逆转被截短的tau单位毒性时的应用，但还需要建立这些过程的神经元模型。一般说来，成神经细胞瘤细胞株在分化过程中经受了复杂的细胞骨架改变，该分化过程依赖于微管网络的发育和神经丝网络的相应发育之间的平衡。更高分子量的微管结合蛋白(MAPIA，MAPIB)被认为是在这些细胞骨架系统之间的横桥(Schoenfied等(1989)，神经科学杂志，9，1712-1730)。用解聚剂(Wisniewski，Terry实验研究，17，577-587)或铝(Langui等(1988)，脑研究，438，67-76)直接干扰微管系统会导致中间微丝断裂并在细胞质中形成特征螺环(WishcidcCrowther(1986)英国医学通报，42，51-56)。相同的神经丝细胞骨架聚集可在未发生分化的成神经细胞瘤细胞株中自发产生。MAPS在这些聚集体形成时的作用目前尚不清楚。但这些聚集体的形成、促染(accentuation)和抑制表明了微管细胞骨架连结和转运神经系细胞骨架至新生轴突的能力。
实施例6和7表明硫堇等吩噻嗪抑制剂在浓度为2μm时，对神经细胞株不产生毒性，硫堇也不干扰转基因tau蛋白加入到内源性微管网络。随着表达截短的tau质粒稳定的转染，活性神经细胞株的产生，需要有吩噻嗪的存在。而且截短的tau蛋白的结构表达促进了pNFH聚集体的形成，而后者又能被全长tau蛋白的表达所抑制。细胞质pNFH聚集体的形成被吩噻嗪(如硫堇)抑制，而且pNFH免疫反应性在神经元进程中的体现也由这些化合物促进。
这些发现表明神经元细胞株稳定的转染截短的tau具有固有毒性，通过生存细胞中微管系统的去稳定，导致神经丝聚集体的形成，该聚集体不能被运送到正在生成的轴突上。这些作用能被体外具有阻断tau-tau聚集能力的化合物所抑制，并且这种作用可受内源性tau或其它稳定微管所需的MAPs的表达作用的影响。硫堇等吩噻嗪竟然也具有阻断未转染细胞中神经丝聚集体的能力，这是由于促进神经元分化或直接抑制神经丝聚集体的形成所发挥的作用。除了它们在预防AD中tau聚集的用途之外，这些化合物在治疗以病理性神经丝聚集为特征的疾病(例如运动神经元疾病，路易体疾病)时还有潜在的作用。现已发现，过度表达神经丝亚单位的转基因小鼠在退化的大运动神经元中选择性地发育神经丝，致使肌肉萎缩(Cote等，(1993)，细胞73，35-46；Xu等，(1993)，细胞，73，23-33)。其它的神经元退行性紊乱，如皮克病和进行性神经核上麻痹，在齿状回和新大脑皮层的卫星锥体细胞中出现截短的tau的聚集。前述的化合物也在这些神经退行性紊乱中起作用。
因此，本发明特别涉及上述的体内方法，在这种方法中优选细胞株为成纤维细胞或神经元细胞株，更优选成纤维细胞3T3、PC-12或NIE-115细胞株。这些细胞株优选用至少包含有核心tau单位的截短的tau蛋白转染，tau蛋白的表达可按结构或在可诱导的调控下进行，或者这种tau蛋白也可或直接转染。
本发明也涉及由上述任一方法获得的能调节或抑制tau-tau结合的化合物。
根据上述结果，本发明也提供了式I吩噻嗪及其药用盐的应用，
Figure A20061010066100201
其中：R1、R3、R4、R6、R7和R9可独立地选自氢、卤素、羟基、羧基、取代或未取代的烷基、卤烷基或烷氧基；R2，R8可独立地选自氢或
或
Figure A20061010066100212
R5选自氢，羟基、羧基、取代或未取代的烷基，卤烷基、烷氧基或单键；R10和R11可独立地选自氢、羟基、羧基、取代或未取代的烷基、卤烷基、烷氧基或单键；
它们用于生产预防和治疗病理性tau-tau或病理性神经丝聚集的药物组合物，特别是用于预防和治疗阿尔茨海默氏病、运动神经元疾病或路易体疾病的药物组合物。
这里所用的“烷基”一词是指直链或支链基团，优选有1-8个，更优选1-6个碳原子。例如“烷基”可以是甲基、乙基、正丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、叔戊基、己基、异己基等。本发明应用的烷基合适的取代基包括巯基、硫醚、硝基、氨基、芳氧基、卤素、羟基和羰基团，也包括芳基、环烷基和无芳基的杂环基团。
“烷氧基”是指上面提到的烷基团同时携带氧原子，该氧原子间隔于烷基和其结合的基本残基之间。
“卤烷基”代表一种具有3-4个碳原子与1、2或3个卤素原子结合的直链或支链烷基。典型的卤烷基团有氯甲基、2-溴甲基、1-氯异丙基、3-氟丙基、2，3-二溴丁基、3-氯异丁基、碘-叔-丁基、三氟甲基等。
“卤素”是指氟，氯，溴或碘。
本发明的一些化合物具有1个或多个不对称取代的碳原子，因此存在外消旋的和光学活性的形式，本发明旨在包括外消旋形式的化合物及其任何的光学活性形式。
药用酸加成盐是分子式(I)的基本化合物与无机酸(例如氢卤酸如氢氯酸和氢溴酸)、硫酸，硝酸，磷酸等)或有机酸(例如乙酸、柠檬酸、马来酸、富马酸、酒石酸、甲磺酸、对甲苯磺酸等)形成的化合物。
本发明优选实施方案中提供了上述吩噻嗪及其药用盐，其中R1，R3，R4，R6，R7和R9各自选自-H、-CH3、-C2H5或-C3H7；R2和R8各自选自
Figure A20061010066100221
或
Figure A20061010066100222
其中R10和R11各自选自单键，-H、-CH3、-C2H5或-C3H7；R5为单键，-H、-CH3、-C2H5或-C3H7。
特别优选的是以下一些吩噻嗪：
a)甲苯胺蓝O
Figure A20061010066100223
b)硫堇
Figure A20061010066100224
c)天蓝A
Figure A20061010066100225
d)天蓝B
Figure A20061010066100226
e)1，9-二甲基亚甲兰
能阻断病理性tau-tau结合的化合物，优选吩噻嗪(图23，24)，其特征是结合系数小于0.4，对tau-微管蛋白结合没有抑制，其与tau摩尔浓度比优选1000∶1。
本发明中应用的吩噻嗪是本领域已知的，并能通过标准方法制备(例如Merck Manual，Houben-Weyl，BeilsteinE III/IV 27，1214ff，杂环化学杂志，21，613(1984)等)。
具有上述分子式的化合物、其药用盐或其它具有测定中所需特性的化合物，在进一步毒性试验后能被用作药物(例如以药物制剂的形式)。亚甲兰在以前的广谱适应症中的药剂作用包括治疗正铁血红蛋白血症和预防躁狂抑郁精神病(Naylor(1986)生物精神病学21，915-920)及系统性给药后的中枢神经系统(CNS)穿透(Muller(1992)解剖学报，144，39-44)。天蓝A和B是亚甲兰的正常代谢降解产物(Disanto和Wagner(1972a)药学科学杂志，61，598-602；Disanto和Wagner(1972b)药物科学杂志，61，1086-1094)。这些药物的用法可采用肠胃外给药例如口服(以片剂、糖衣片剂、糖衣丸、硬或软胶囊、溶液剂、乳剂、悬浮剂的形式)或鼻腔吸入(例如以鼻喷雾形式)或从直肠给药(例如栓剂)。但肠胃外给药也可采用肌注或静脉点滴(例如以注射液的形式)。
具分子式(I)的化合物及其药用酸加成盐在制备片剂、糖衣片剂、糖衣丸、硬胶囊过程中可加入药用惰性的无机或有机赋形剂。可以用乳糖、玉米淀粉或其衍生物、滑石粉、硬脂酸或其盐等作为片剂、糖衣丸、硬胶囊的赋形剂。
软胶囊中适合的赋形剂可以是植物油、蜡、脂肪、半固态或液态多元醇等，
溶液剂和糖浆制品的适合赋形剂可以是水、多元醇、糖精、转化糖、葡萄糖等。
注射液的适合赋形剂可以是水、酒精、多元醇、甘油、植物油等。
栓剂中合适赋形剂是天然油或硬化油、腊、脂肪、半液态或液态多元醇等。
此外，这些药物制剂中也可含有防腐剂、增溶剂、增粘剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂、甜味剂、色素、香味素，用以改变渗透压的盐类、缓冲液、包衣剂或抗氧化剂。它们也可含有具有其它疗效的物质。
根据本发明，具有上述分子式的化合物及其药用盐可用于治疗或预防阿尔茨海默氏病，特别用于阻断、调节，和抑制病理性tau-tau结合。剂量可在较宽的限度内变化，但要适合每一具体病例的个体要求。一般说来，口服给药时日剂量约50mg-约700mg应当是足够的，优选约150mg-约300mg，优选分成1到3单位剂量服用，例如，每单位剂量相同。但如果需要也可超出上面给出的上限。
本发明包括：
项1.一种用于调节或抑制tau-tau蛋白结合的制剂的筛选方法，包括使
a)一种tau蛋白或其含有tau核心片段的衍生物与
b)一种推测能调节或抑制tau-tau结合的制剂和
c)一种能结合tau蛋白的标记的tau蛋白或其标记的衍生物接触，或和一种有别于a)中tau蛋白的并能结合tau蛋白的tau蛋白或其衍生物进行接触，以及
d)检测tau-tau结合
项2.项1的方法，其特征在于通过将一种解聚的微管蛋白制剂或微管蛋白制剂与b)和c)中定义的化合物接触，然后检测tau-微管蛋白的结合情况，以确定tau与微管蛋白的结合。
项3.项1-2的方法，其特征在于步骤a)的蛋白是结合到固相的。
项4.项3的方法，其特征在于与固相的结合是在一种pH值为9-10的碱性缓冲液中进行。
项5.项3的方法，其特征在于tau蛋白或其片段结合后剩余的结合位点由一阻断剂阻断。
项6.项1-2中的方法，其特征在于步骤b)中的制剂和c)中的tau蛋白在液相中与步骤a)中的蛋白一起孵育。
项7.项1-6中的方法，其特征在于tau-tau结合是在50-400mM氯化钠或有类似的离子强度的一种盐或盐的混合物中和在pH值4-10范围内进行。
项8.项1-7中的方法，其特征在于步骤c)中的tau蛋白的免疫学特性不同于a)中的tau蛋白。
项9.项8中的方法，其特征在于tau蛋白结合用抗体检测。
项10.项1-7中的方法，其特征在于步骤c)中的tau蛋白用放射性或酶检测标记来标记。
项11.项1-10中任一项的方法，包括一种用来检测tau-tau结合和tau-微管蛋白结合的ELISA测定，其特征在于
a)将一种对应于核心片段并具Ala-390的截短的tau蛋白，在不利于tau-tau结合的缓冲液条件下，铺在固相上，
b)在相同缓冲液条件下将微管蛋白铺在固相上，
c)将一种全长tau蛋白与一种推测能调节或抑制病理性tau-tau结合而不干扰tau-微管蛋白结合的制剂一起加到液相中，以及
d)用一种能识别全长tau蛋白N-末端片段的抗体按免疫化学法检测tau-tau结合。
项12.一种能调节或抑制tau-tau结合制剂的筛选方法，包括将
a)用一种tau蛋白或其含有tau核心片段的一种衍生物或一种能表达tau蛋白或其含有核心片段衍生物的载体转染的细胞株，与
b)一种推测能调节或抑制tau-tau结合的制剂进行接触，以及
c)检测该细胞株活性和/或细胞株形态。
项13.项12的方法，其中所述的细胞株是成纤维细胞株或神经元细胞株。
项14.项13的方法，其中所述的细胞株是成纤维细胞3T3、PC-12或NIE-115细胞株。
项15.项12-14的方法，其中所述的tau蛋白是一种截短的tau蛋白。
项16.项15的方法，其中该截短的tau蛋白是核心tau单位。
项17.项12-16的方法，其中该tau蛋白的表达是在组成型调控下进行的。
项18.项12至16的方法，其中该tau蛋白的表达是在可诱导调控下进行的。
项19.调节或抑制tau-tau结合的化合物，可根据项1-18中任一项的方法获得。
项20.下式吩噻嗪及其药用盐的应用
Figure A20061010066100261
其中R1、R3、R4、R6、R7和R9各自选自氢、卤素、羟基、羧基、取代或未取代的烷基、卤烷基或烷氧基；R2和R8各自选自氢或
Figure A20061010066100262
或
R5选自氢、羟基、羧基、取代或未取代的烷基、卤烷基、烷氧基或单键；
R10和R11各自选自氢、羟基、羧基、取代或未取代的烷基、卤烷基、烷氧基或单键用于制备一种预防和治疗病理性tau-tau结合或病理性神经丝聚集的药物组合物。
项21.项20中吩噻嗪的应用，其中所述吩噻嗪选自以下这组：其中
R1，R3，R4，R6，R7，和R9各自选自-H、-CH3、-C2H5或-C3H7；
R2和R8各自选自
或
其中R10和R11各自选自单键，-H、-CH3、-C2H5或-C3H7；和
R5为一单键，-H、-CH3、-C2H5或-C3H7；以及它们的药用盐。
项22.项21的应用，其中所述的吩噻嗪选自甲苯胺蓝O，硫堇、天蓝A，天蓝B或1，9-二甲胺亚甲兰。
项23.项20-22中所定义的吩噻嗪在制备用于预防或治疗阿尔茨海默氏病(Alzheimer’s disease)、运动神经元疾病、路易体疾病(Lewy body disease)、皮克氏体病(Pick’s disease)以及进行性核上麻痹(progressive supranuclearpalsy)的药物组合物中的应用。
项24.项20中所定义的化合物在制备用于阻断病理性tau-tau结合制剂中的应用，其特征在于该化合物结合的系数小于0.4，在其与tau摩尔浓度的摩尔比为1000∶1时不能抑制tau-微管蛋白的结合。
项25.用于治疗病理性tau-tau结合的药物组合物，其包括治疗有效量的项20中所定义的化合物和治疗上惰性的载体物质。
项26.一种治疗病理性tau-tau结合的方法，其包括服用项20中定义的吩噻嗪。
参考附图可以更好的理解本发明：
图1：tau蛋白与微管结合(Butner，Kirschner(出处同前)之后作了修改)。
图2：tau蛋白同型体的示意结构，与图21所示的氨基酸和cDNA序列相对应。N-末端区的252个残基中包含1或2个由58个残基组成的插入子(“1”，“2”)，后接93-125个残基组成的串联重复区包括3或4个串联重复，以及一个由64个残基组成的C-末端结尾。从富含抗蛋白酶PHF核心的制剂中分离出的tau片段被命名为“F5.5”，由来自3-和4-重复同型体两者衍生的各种混合物，但包括93-95个残基，相当于3-重复，相对于串联重复区的正常组织的衔接而言是由14-16个残基移码的。所有种类的F5.5和正常tau蛋白都可被mAb7.51识别，但mAb423只能识别那些以Glu-391为结尾的F5.5片段。该图也显示了mAb499、AT8和342抗原决定簇的位置。
图3：对来自核心PHF制剂的12kDa的F5.5片段的N-末端序列进行分析，揭示了存在6种不同的肽，可以归为3对由3-重复或4-重复的同型体组成的组，即：3-重复同型体(A：重复1-3；SEQ ID NO：1)；或4-重复同型体(B：重复1-3；SEQ ID NO：2，或C：重复2-4；SEQ ID NO：3)的同型体(Jakes等，出处同前)。mAb423的免疫反应性可用于确定Glu-391的C-末端界限(箭头所示，Noak等，(1993)，出处同前)。N-和C-末端的界限又能用来确定PHF核心内串联重复区的相(shasing)，该PHF核相对于该序列同源重复，存在14-16个残基的位移。这个最小的抗蛋白酶核心PHF tau单位长93或95个残基，相当于3个重复结构。该单位的界限相对于Butner和Kirschner(同前)所提出的微管蛋白结合区(下线显示)而言也是在相之外。
图4：对照组和AD组中的全部tau蛋白的含量。正常可溶性tau(白色)形式在对照组中占优势，而在AD组中该优势的tau聚合成PHF的形式(黑色)。
图5：在AD的早期，可溶性tua、磷酸化tau及缠结数的变化(Lai等，(1995)出处同前)。横坐标显示PHF-tau蛋白聚积。伴随有正常可溶性tau的相对丧失。磷酸化tau的首次出现与缠结的首次出现密切相关。但是，这两者只有在tau蛋白从可溶性变为聚合相的再分配发生后才出现。
图6：AD早期新生tau转变成可溶性tau池(a)的转化率(计算值)与可溶性tau形成PHF池的转化率(Lai等，(1995)，出处同前)。当可溶性tau水平低于580pmo/g时，需要不断形成更多的新tau以赶上PHF的合成速度，并以负反馈的形式调整周围可溶性tau水平(a)，可溶性tau转化为PHFs的转化速率与周围PHF-tau水平(b)呈几何等级关系。
图7：AD中tau蛋白转化为PHF的假说情况。一旦tau蛋白被固定并截断，就暴露高亲合力的病理性tau捕获位点。当另一tau分子被捕获时，只可能产生部分的蛋白水解，因为高亲合的tau-tau结合区受到保护不发生水解，剩余的另一高亲合tau捕获位点可以再捕获另一tau分子。该tau蛋白池从可溶性到截短的PHF结合相的再分配是由重复进行高亲合性tau捕获和不完全水解所引起的自催化过程。
图8：测定两个截短的tau单位结合的构型。首先将Ala-390截短的tau蛋白(“a”)涂到ELISA板上(碳酸钠缓冲液：30mM，pH9.6)。然后第二个Glu-391截短的tau蛋白(“e”)在图9所示的多种缓冲液条件下孵育。因为只有“e”这种tau能被mAb423识别，因此mAb423免疫反应性只测定在第二次孵育期间结合的tau蛋白。
图9：“e”种tau蛋白(0或20μg/ml)与“a”种tau蛋白(0或10μg/ml)在磷酸盐缓冲的生理盐水(“nomal”)、蒸馏水(“water”)及碳酸钠缓冲液(“Carbonate”50mM，pH9.6)中的结合。纵坐标表示mAb免疫反应性，当单独涂“a”时，没有免疫反应性，因为mAb423不能识别“a”。当“e”不首先与“a”板孵育时，也无免疫反应性。这是因为阻断了所用的防止“e”非特异性结合到ELISA板上的条件。只有当“a”和“e”都存在的条件下免疫反应性才能显示，这是只对结合有“a”的“e”的特定检测的结果。当“e”加到Na2CO3缓冲液中时无结合发生。因此该条件代表当初用“a”涂板的最佳条件，因为在此条件下自身聚集最少。
图10：全长tau(“t”)与原先已被动结合到固相上(“a”)的截短的核心tau单位进行结合所测定的标准构型。将对应于核心PHF的截短的tau单位的重组tau片段(“a”)在不利于tau-tau结合的条件下(图9)在一块ELISA板上铺成不同的浓度。锁定后，在允许选择性测定tau-tau结合的条件下将全长重组tau(“t”)铺到板上。应用一种适当的抗体(该抗体能识别全长tau的“N-末端附近的抗原决定基)检测结合情况。这种抗体不能识别“a”。
图11：确定全长tau(“T40”)与Ala-390处终止的截短的核心tau单位进行结合的Kd值，用mAb499测定结合的全长人类tau。上图横坐标表示T40的浓度，纵坐标表示mAb499的免疫反应性。每一结合曲线都是在所示的“a”的涂板浓度下获得的。没有“a”就不发生结合，证明在所用的测定条件下不存在T40的非特异性结合。结合既依赖于T40的浓度也依赖于“a”的浓度。下图表示对应于每一“a”涂板浓度时计算得到的Kd值。随着“a”浓度的增加，曲线逐渐接近饱和状态，该图显示使T40与截短的核心tau单位结合的饱和KCl值为22.8nM。
图12：按图10所示的标准测定方案，将以10μg/ml铺板的“a”并加如图所示浓度(0-50μg/ml)的T40，在恒定的pH(pH＝7.4)值而氯化钠浓度不同的条件下测定结合情况。在生理性盐浓度为137mM附近有一高峰。在中等盐浓度下结合减少，但在极低盐浓度下变得更易结合。
图13：与图12所示的实验相似，保持氯化钠浓度为137mM，但pH值在0-10间改变，在磷酸盐缓冲的生理盐水(；PBS”pH＝7.4)中进行结合并作比较。结果显示，在极端pH值时的结合降低。所示的结合可用mAb499和342检测。
图14：这两条曲线表示在固相中使用截短的核心tau单位“a”，并应用Biernet等(1992，欧洲分子生物学学会杂志，11，1593-1597)的方法在体外孵育全长tau蛋白，包括磷酸化的(T40P)和未磷酸化的tau蛋白(T40)，由此测得的典型的结合情况。在本实验中进行磷酸化使Kd值降低了10倍，但在水相和固相中的磷酸化状态不同，磷酸化对结合阻抑作用的总体影响平均为20倍。尽管有人提出胎儿状态(fetal state)的磷酸化对确定病理性tau-tau结合很重要，但胚胎大鼠tau(“POTr”)引入水相时不能与核心tau单位发生病理性结合。
图15：与图14相反，胚胎tau被动结合到固相后，能结合全长非磷酸化的tau。在A中显示一组典型的结合曲线，全长tau(T40)浓度和胚胎tau(“POTau”)的浓度在如图所示的范围内变化。B中显示了Kd的渐近曲线。伴随全长tau与截短的核心tau单位的结合，全长tau与固定的胚胎tau的结合有相同的Kd值，大约为20nM。因此，简单地通过被动聚结到固相上，可将胚胎tau转变为tau结合形式，该胚胎tau当存在于水相时不与tau发生结合(图14)。因此说明tau与固相基质的被动结合暴露高亲和的tau捕获位点。
图16：用含水相或固相的几种tau蛋白测定ta-tau结合时的Kd值比较。水相中全长重组tau的磷酸化可使其结合作用抑制10倍，胚胎或新生鼠的tau不发生结合，如图14所示。当固相中用新生tau时，T40以相同的亲和力结合截短的tau核心PHF单位。T40在水相中的磷酸化对结合产生30倍的抑制作用。新生tau在固相中的高磷酸化也有相当程度的抑制作用，在该两种相中高磷酸化均可产生30倍抑制作用。因此与磷酸化假说相反，磷酸化抑制了本测定的所有情况下tau蛋白的病理性自身聚集。
图17：聚集的全长tau蛋白水解消化过程。(A)全长tau(20μg/ml)与dGA(20μg/ml)在PBS中结合，清洗，并与链霉蛋白酶在水中按图所示浓度孵育5分钟。免疫反应性用mAb342(▲)、499(○)和423(·)测定。(B)全长tau(10μg/ml)(该tau在固相中没有dGA存在时产生自身聚集)经简单消化后用mAb342(▲)和423(·)测定其免疫反应性。在上述两种情况下，mAb’s499或(和)342的蛋白酶浓度依赖性的免疫反应性丢失，同时得到mAb423免疫反应性。(c)简略描述了A的结果。先将截短的dGA涂在孵育过的固相上，与具有高亲和力的全长tau经重复区的相互作用发生结合。两种蛋白在消化前都缺乏mAb423抗原决定簇。蛋白水解消化的复合物(点线)去除了全长tau蛋白的N-末端部分，丢失了所示位置的mAb499和342抗原决定簇。mAb423免疫反应性的获得表示全长tau在Glu-391处截断。蛋白水解稳定的复合物在N-末端的确切范围尚不清楚，但可确定其不包括紧邻重复区的mAb342抗原决定簇，而应包括tau结合区。
图18：通过重复tau捕获积累截短的tau蛋白。以固相中截短的tau蛋白片段(dGA 20μg/ml)开始，结合全长重组人类tau(20μg/ml)，用链霉蛋白酶(lng/ml)消化5分钟，洗脱，然后再与另一全长tau(20μg/ml)一起孵育，再次消化。该结合/消化的循环重复四次；前后各测定mAb499的免疫反应性，每次用链霉蛋白酶消化后测定mAb423活性。(A)伴随每一消化循环而发生的复合物链霉蛋白酶消化作用，与Glu-391截短的蛋白在固相中积累增加的关系。(B)通过显示N-末端tau(mAb499)免疫反应性检测全长tau的结合，经链霉蛋白酶消化后这样的结合完全消除。随后的孵育循环中，在水相恒定浓度中孵育的全长tau结合能力增加。循环后剩余的免疫反应性不能解释mAb499免疫活性的增加。因此经链霉蛋白酶消化后的蛋白水解稳定的复合物保持了与其它tau结合的能力，并且这种结合能力随截短的tau在固相的聚积而增加。
图19：原形抑制性吩噻嗪浓度增加时(横坐标)相对的tau-tau结合情况(纵轴)。这种抑制作用用标准竞争抑制模式表示，计算值Ki为98-108nM。这些近似值之间的相关系数为0.99，这一系数在统计学上是很高的(如图所示)。
图20：硫堇对tau-tau结合的选择性抑制。如图实圈所示在液相和固相测定中各用489nM的截短的tau蛋白。在该tau-微管蛋白测定中，用解聚的微管蛋白以200nM(浓度)铺板(空圈)，tau在400nM浓度下孵育。结合的数据用数学上的标准模式描述，该模式假定在高亲和力的tau俘获位点存在竞争性抑制。Ki值用Kd值来计算。Kd值是用全长tau时从相应的结合情况获得。图上的各点数据代表四次重复测定结果的平均值。
图21：人类tau蛋白同型体的核苷酸和预测的氨基酸序列(SEQ IDNO：4)。该序列从人类tau40(htau40)cDNA克隆推测，与前面确定的三重复形式(Goedert等(1988)，出处同前)不同的是：该序列在氨基末端区(下划线)插入额外58个氨基酸重复结构，以及一个前述(Goedert等(1989欧洲分子生物学学会杂志，8，393-399))的31个氨基酸组成的额外重复结构(下划线)，核酸按5’→3’方向编码。htau40cDNA克隆(Goedert等(2989b)，神经元，3，519-526)包含的上述这一序列是插入一个Ndel位点(5’端)和一个3’端的EcoRl位点到该克隆的终止(***)。
图22：氨基酸和cDNA序列的PHF核心tau单位(SEQ ID NO：6；Novak等(1993)，出处同上)，以及构成优选的核心tau单位所用的引物(SEQ ID NO：7和8)。
图23：化合物抑制tau-tau相互结合的等级。该等级以相对于不同化合物时所显示的标准结合为基础来划分，取浓度为1或10μg/ml时的平均值。该等级中“1”相当于无该化合物存在时的结合情况，而“0.2”表示聚结降至被测物浓度为1μg/ml和10μg/ml时结合被抑制20％的平均值。因此该值越低表明化合物对于e和a两种结合的抑制越有效。如图所示，前5种吩噻嗪标准结合系数低于0.4，也就是说1-10μg/ml范围内的结合比在无该化合物存在时的结合少40％。
图24：根据图23的标准结合所测试的这些化合物的化学结构。
图25：代表tau蛋白、MAP2(成人形式)、MAP2C(青少年形式)及高分子量tau(在外周神经系统和神经细胞瘤细胞株中发现的)的简图。这些蛋白都具有相似的微管结合区，但N-末端区的序列和范围有显著不同。青少年形式的tau与MAP2只有3个串联重复结构。MAP2中也存在4-重复形式。
图26：人类tau(上线，SEQ ID NO：9)与人MAP2(下线，SEQ ID NO：10)的串联重复区的序列差别。纵箭头显示Glu-391末端的截短的PHF核心片段的界线。微管蛋白结合区用下划线表示。
图27：pIF2表达载体是以SV40为基础的真核细胞表达载体(pSV2neo；Sambrook等，(1989)，出处同前；SEQ ID NO：11和12经修饰后包含一个启动外源DNA表达的β-珠蛋白启动子(M.N.Neuberger)。该载体具有遗传霉素选择用的抗新霉素标记。
图28：转染PIF2::740的小鼠成纤维细胞3T3，表达全长人类tau蛋白(T40)，用mAb7.51(上图)和mAb499(下图)进行免疫标记。细胞形成细长的过程，能看到tau免疫反应性在核周质内有细胞骨架的分配。
图29：转梁PIF::dGAE的小鼠成纤维细胞3T3，表达Glu-391截短的PHF核心tau片段，用mAb7.51作免疫标记。早期转染细胞株在无硫堇下生长。细胞总体异常、多核、形成空泡、胞质中含有tau蛋白聚集。
图30：脂质转染/tau蛋白转移至PIF2:T40转染的3T3细胞内。显示不含(无阴影)或含(阴影)3.5μM硫堇时，加入大约等摩尔浓度的全长tau(T40，220nM)和截短的tau(dGAE，300nM)时的相对细胞存活情况(相对于不用蛋白处理的脂质转染后正常细胞计数)，如图所示。截短的tau比全长tau毒性更大(p＝0.02)，尽管摩尔浓度相同，但全长tau比截短的tau的总蛋白重大3倍。
图31：(A)截短的tau毒性的逆转：截短的tau的毒性经脂质转染转移至表达全长tau的3T3细胞，这种毒性是具有浓度依赖性的。与无硫堇(虚线)相比，硫堇(实线)存在时所有三种截短的tau浓度下的毒性显著逆转。(B)在类似的实验中将全长tau经脂质转染转至表达全长tau的3T3细胞中。tau毒性和硫堇的作用都大大降低。
以下实施例用以解释本发明的具体细节，并非由此而限制本发明。
实施例
实施例1：tau-tau结合的测定
本测定是在一个96孔的PVC微量滴定板上进行的，所加溶液及取得的读数均按各个孔而定。
a)将50μl纯化的截短的tau肽，以50mM碳酸钠缓冲液(pH9.6)中的0-50μg/ml(0，1，5，10，50μg/ml)不同浓度加到各孔并在37℃下孵育1小时，
b)用水(含或不含0.05％吐温)清洗微量滴定板的孔3次。
c)将200μl2％的牛奶提取物溶液(“Marvel”)与磷酸盐缓冲生理盐水(“PBS”，137mM氯化钠，1.47mM磷酸二氢钾，8.1mM磷酸氢二钠，2.68mM氯化钾)混和加到各孔并在37℃下孵育1小时。
d)如b)所示清洗加样板。
e)将50μl全长重组tau在1％明胶、0.05％吐温的PBS中的溶液按上面a)中相同的浓度范围加到各个孔中，并在37℃下孵育1小时。
f)如b)所示清洗加样板。
g)将50μl单抗499(mAb499)以1/2稀释的组织培养上清液与含2％牛奶提取物(“Marvel”)的PBS一起加到各孔，并在37℃孵育1小时。
h)如b)所示清洗加样板。
i)将50μl二抗(用印记法亲和纯化的山羊抗小鼠IgG(H+L)与辣根过氧化物酶-Biorad分类号170-6516结合)与1/1000稀释的含0.05％吐温的PBS一起加到各孔中，37℃孵育1小时。
j)用0.05％吐温水溶液洗3次板，再用水洗一次。
k)显色溶液的配制如下：在二甲基亚砜中溶解10-15mg3，3’，5’，5’-四甲基联胺(TMB，BCL分类号784 974)至终浓度为10mg/ml(TMB溶液)。加10mL乙酸钠的基料(0.5M，pM5.0)至90mL水中，搅拌并慢慢加1mL TMB溶液，再加10μl过氧化氢。
1)将50μlTMB溶液加入各孔使其发生过氧化物酶显色反应，应用动力学L1 softmax软件包在650nm处，用分子微量板读数仪显示，显色速度超过2分钟。
实施例2：重组tau片段的制备
Tau-cDNA是用标准方法(Sombrook等，出处同前)由死后3小时的AD患者脑组织中分离的mRNA制备的。应用合成的17个单元聚合的寡核苷酸探针检测cDNA文库，该探针来自部分PHF核心蛋白序列(Goedert等，(1988)，出处同前)。全长cDNA的克隆被亚克隆到M13mp18的EcoRI位点并用定位诱变并在启动密码子邻近介入Ndel位点。将NdeI和EcoRI切割后产生的cDNA片段在T7RNA聚合酶启动子下游亚克隆到NdeI/EcoRI切割表达质粒pBK172中(Mcleod等(1987)，欧洲分子生物学学会杂志，6，729-736)。pRK172来自pBR322，这是在大肠杆菌中以高拷贝数增殖以便消除pBR322拷贝数控制区。该质粒携带抗氨苄青霉素基因，可用于选择重组克隆。
编码截短的tau的结构来自Novak等所述的mRNA(1993，出处同前)。用该mRNA作为PCR模板进行聚合酶链反应(PCR)，应用特定的寡核苷酸作引物。有义引物含有一个NdeI位点和反义引物含有EcoRI切点。将PCR扩增片段亚克隆到上述pRK172中。用于扩增dGAE的引物序列由图22给出。用于表达全部DNA片段的真实性由双股全长序列确定。
构建htau40(T40)cDNA的具体细节在Goedert等的文章(1989，出处同前)中有报道，该序列是中枢神经系统中发现的最大形式的tau序列并且它编码tau蛋白，该tau蛋白的N-末端各含29个氨基酸的插入子和在微管蛋白结合区含31个氨基酸构成的额外重复结构。该DNA序列及其预测的氨基酸序列见图21(SEQ ID NO：4)。
重组质粒用以转染大肠杆菌BL21(DE3)，一种用于原核生物表达的菌株。该质粒携带有一个在lacUV5启动子调控下的噬菌体T7RNA聚合酶基因的染色体拷贝(Studier，Mofft(1986)，分子生物学杂志，189，113-130)。呈指数生长的培养基用IPTG(异丙基硫半乳糖苷)诱导3小时。
大规模纯化(1升细胞培养基)tau片段可用Goedert和Jakes所述的方法进行(1990，欧洲分子生物学学会杂志，9，4225-4230)，可略作调整。在液氮中速冻细胞团以破裂细胞，该细胞团悬浮在含50mM PIPES及1mMDTT(pH6.8)的缓冲液中。热稳定蛋白在上清液中用PIPES/DTT透析，然后加到一在相同的缓冲液中平衡过的磷酸纤维素柱中。用含氯化钠(0-0.5M)的上述缓冲液洗脱tau蛋白，用SDS-PAGE和Coomassie染色法及免疫杂交法分析洗脱后的各级分，将这些含有tau的级分混合后用25mM MES、1mMDTT(pH6.25)透析，并以约5mg/ml的浓度存放在-20℃，蛋白浓度用Lowry法测定(Harrington(1990)，出处同前)。
实施例3：胚胎MAP2C与截短的或全长tau进行结合
PHFs中缺乏MAP2的一个可能解释为MAP2在PHFs中不能与PHF的核心tau单位结合，因为它们在重复区的序列不同。这已用标准结合测定法用2种组成成分进行了实验检测：在固相中的截短的tau与在液相中的胚胎MAP2C，以及固相中的MAP2C与液相中的全长tau。这两种情况都出现了结合，硫堇可以阻断tau/MAP2结合。因此，在串联重复区的聚集不是选择tau，吩噻嗪抑制剂(例如硫堇)的抑制活性不依赖于tau序列。MAPs为什么不存在于PHFs的确切原因目前尚不清楚，可能包括如下因素：成人型MAP2中发现的长N-末端区的构成；细胞内腔隙的差异；或MAP2分子形成过程中的其它差异。
实施例4：人类tau蛋白转染小鼠3T3细胞
在β-珠蛋白启动子控制下，用含有全长或截短的tau蛋白的真核生物表达载体转染小鼠成纤维细胞3T3。该载体含有抗新霉素基因，可以作为选择性标记(PSV2neo；Sambrook等(1989)，出处同前，M.N.Neuberger改进)。细胞培养在含抗微生物制剂和10％小牛胚胎血清的DMEM中进行，37℃含5％CO2的环境。用标准磷酸钙配方或脂质转染(生产手册，Gibco BRL)来转染质粒DNA。具有完整质粒DNA的细胞用含遗传霉素(Geneticin)(0.5mg/ml；Southern和Berg(1982)，分子遗传学与应用遗传学杂志，1，327)的培养基筛选。
表达全长tau蛋白的稳定转染3T3成纤维细胞很容易制备。蛋白的表达可以用一般的(mAb7.51)和人类特异性的(mAB499)抗tau抗体来显示(图28)，或通过细胞提取物免疫杂交法(未表示)显示。用携带截短的核心tau单位的相同载体转染后可形成2个活的细胞株。截短的tau在组织学上被证实存在于这些细胞中，但这些细胞的形态异常与表达全长tau的细胞有所不同(图29)。该细胞异常包括细胞发育过程停止、大而园的细胞形成、细胞质中聚集tau、胞质出现空泡。但这些细胞是不稳定的，若无遗传霉素存在，易逆转为非tau蛋白表达的形式。截短的tau的毒性可用细胞中毒性tau-tau结合或截短的tau与内源性小鼠MAPs结合来解释，该内源性MAPs是细胞所必需的。
实施例5：tau转染的细胞在吩噻嗪抑制剂中的生长
如果原形吩噻嗪抑制剂能在体内阻断自身聚集，截短的核心tau单位的毒性可以部分的逆转。只有当该化合物在锁定tau-tau结合所需的浓度下不具有内源性毒性时才可能实现毒性逆转。对3T3细胞毒性最低的抑制剂是硫堇和吖啶黄。当3T3细胞延长暴露于这些化合物时(其浓度显著超出Ki值(100nM)时在体外抑制tau-tau结合)，仍能存活。实际上，3T3细胞在2μM硫堇中能存活数月。
通过在一定浓度范围的硫堇中培养转染了全长tau蛋白的3T3成纤维细胞，可以检测硫堇在体内对tau-微管蛋白结合的影响，在浓度为4-8μM时，可以见到tau免疫反应性的正常细胞骨架分布与体外实验中已知的抑制tau-微管蛋白结合的Ki具有可比性(8μM)，但在3T3转染细胞的常规培养浓度范围(0.5-2μM)内不产生作用。这些发现表明在原形抑制剂存在的情况下培养转染的细胞株而不损伤细胞活性和全长tau蛋白正常细胞骨架分布的可能性。
转染细胞在tau-tau结合抑制剂存在时的生长，以剂量依赖性的形式增加了转染截短的tau细胞的活性。当细胞生长在高浓度硫堇环境中时转染了截短的tau的活性细胞株数量增加，而且截短的tau表达的强度(可用免疫组化法以半定量的方式测定)也有所增加。
当在硫堇存在下转染细胞株时，3T3细胞的形态及截短的tau蛋白的分布很少发生异常，截短的tau蛋白的出现与内生的微管蛋白网络一致，但该tau蛋白染色比全长tau更易被破坏。当去除硫堇后，截短的tau高表达的细胞与细胞胞质碎片形成聚集物，这与缺乏硫堇时转染的细胞的最初表现一致。
实施例6：未转染的神经元细胞系
神经元细胞株(N2A，NIE-115)在含有2％或10％小牛胎胚血清和5％马血清的DMEM中，在涂有胶原的组织培养板上培养，5％CO2、37℃。转染之前先对神经元细胞株进行免疫组化研究，以明确胞质与mAb423的聚集免疫反应性，经用二丁酰环腺苷酸(db-cAMP在组织培养中来自分化的神经细胞瘤细胞)简单处理后，该mAb423在未分化的神经母细胞(N2A细胞)的胞质和PC-12细胞中产生。这些结构与识别神经丝蛋白的抗体具有免疫反应性(NFH；SMI-31，Sternberger等(1985)，美国国家科学院汇刊，82，4274-4276)，与MAP1A识别抗体具有更少的免疫反应性，该识别抗体可与神经丝结合。分化过程中内源性mAb423免疫反应性由细胞质转移到轴突。从这些细胞的mAb423免疫反应性发生免疫沉淀作用导致有230KDa的凝胶活动性tau种类的识别，该tau可被SMI-31识别。这些结果提示在啮齿类神经原细胞株中可被mAb423识别的结构包括高分子量聚集状态的神经丝蛋白，但也不排出除包含有变态MAPs的可能性，因此我们称之为假定的NFH聚集(PNFH)。PNFH在胞质中聚集的剂量依赖性抑制作用可在未转染的PC-12细胞中通过硫堇显示。
实施例7：用全长和截短的tau蛋白转染神经元细胞株及tau聚集抑制剂的效用
A.PC-12细胞
PC-12细胞用PIF2载体转染，该载体包含有Glu-391截短的PHF-核心tau片段或全长tau蛋白。与3T3成纤维细胞一样，转染后若不在硫堇中生长，将无转染的截短的tau的活性细胞存在。将稳定转染的细胞株在有或无db-cAMP和有或无硫堇的情况下进行分析，检测两个终点：胞质PNFH聚结的形成及PNFH免疫反应性分布到轴突。
与db-cAMP简单孵育可使细胞中神经丝聚集的含量从9％增加至37％(P＜0.001)，在截短的tau转染的细胞也可见到这种效应(由10％对照47％，P＜0.001)，而截短的tau本身的鉴别效果很明显(P＝0.005)。相对于db-cAMP来说，用截性tau转染促进了PNFH聚集的形成。
db-cAMP处理后抽出硫堇能使细胞PNFH聚集的频率加倍。(由27％对照49％，P＝0.05)，这用效应可见于用全长tau转染的细胞(16％到32％)和截短的tau转染的细胞(36％对照60％)。另一效应是硫堇依赖性的PNFH免疫反应性转至轴突。这种情况在转染有截短的tau而非转染有全长tau蛋白的PC-12细胞或未转染细胞中特别明显(pNFH-轴突指数在有或无硫堇时分别为0.49对0.04，P＝0.07)。
B.NIE-115细胞
一般说来，在N2A细胞质中所见的pNFH聚集不发生在未转染的NIE细胞中，而pNFH免疫反应性在分化过程中通常体现在成长期轴突中，尽管在早期的核周弧(perinuclear-arc stage)中也能见到。NIE细胞用含有全长或截短的tau蛋白的pIF2载体转染，并在硫堇中生长。然后，检测有或无硫堇时加入db-cAMP的效应。
与PC-12细胞一样，NIE细胞在缺乏硫堇时，无截短的tau转染的稳定NIE细胞存在。转染截短的tau的细胞与转染全长tau的细胞相比，在胞质中pNFH聚集显著升高(由9％对26％，P＜0.001)。与db-cAMP一起孵育时可在转染截短的tau的细胞中产生pNFH聚集而不在转染全长tau的细胞中产生(0％对36％P＜0.001)。
在全长tau转染的细胞中硫堇的存在不干扰转基因tau蛋白进入微管细胞骨架，包括微管形成中心，分散的胞质分布并扩散至轴突。在转染全长tau的细胞中撤回硫堇可增加pNFH聚积的含量(7％对16％，P＝0.03)。在转染截短的tau的细胞中撤出硫堇可导致特定细胞株中pNFH的聚积增加(如NIE-ND6，14％对44％P＝0.07)，并抑制分化。这种现象以前只在未分化N2A细胞中出现而不在NIE细胞中出现。
与PC-12细胞一样，pNFH进入轴突的硫堇依赖性体现能在特定细胞中(例如NIE-ND1，pNFH-轴突指数在有无硫堇时分别为0.1对0.66，P＝0.01)用db-cAMP处理后显示。pNFH转至轴突的硫堇依赖性转运可被定量地看作是有硫堇存在时转染的细胞中胞质和轴突神经丝NHF免疫反应性之间关系的回复。(有或无硫堇时分别为r＝-0.52对r＝+0.52，P＝0.01及0.02)。
序列表
(1)一般信息：
(i)申请人：
(A)：姓名：HOFFMANN-LAROCHE AG
(B)街道：Grenzacherstrasse 124
(C)城市：Basle
(D)洲：BS
(E)国家：瑞士
(F)邮编：(ZIP)：CH-4070
(G)电话：061-6885108
(H)传真：061-6881395
(I)电报：962292/965542 hlr ch
(ii)发明题目：Tau-Tau蛋白结合的抑制
(iii)序列数：12
(iv)计算机可读形式：
(A)媒介形式：软盘
(B)计算机：相容的IBMPC
(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
(D)软件：Patent In Release#1.0，版本号：1.30(EPO)
(2)SEQ ID NO：1的序列信息：
(i)序列特征：
(A)长度：109个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)股形：
(D)拓朴结构：线型
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：
Asp Leu Lys Asn Val Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys
1               5                   10                  15
His Gln Pro Gly Gly Gly Lys Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp
            20                  25                  30
Leu Ser Lys Val Thr Ser Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His
        35                  40                  45
Lys Pro Gly Gly Gly Gln Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe
    50                  55                  60
Lys Asp Arg Val Gln Ser Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His
65                  70                  75                   80
Val Pro Gly Gly Gly Asn Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr Phe
                85                  90                  95
Arg Glu Asn Ala Lys Ala Lys Thr Asp His Gly Ala Glu
            100                 105
(2)SEQ ID NO：2的序列信息：
(i)序列特征：
(A)长度：108个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)股形：
(D)拓朴结构：线型
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：
Asp Leu Lys Asn Val Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys
1               5                   10                  15
His Gln Pro Gly Gly Gly Lys Val Gln Ile Ile Asn Lys Lys Leu Asp
            20                  25                  30
Leu Ser Asn Val Gln Ser Lys Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys His
        35                  40                  45
Val Pro Gly Gly Gly Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp Leu
    50                  55                  60
Ser Lys Val Thr Ser Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His Lys
65                  70                  75                  80
Pro Gly Gly Gly Gln Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys
                85                  90                  95
Asp Arg Val Gln Ser Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn
            100                 105
(2)SEQ ID NO：3的序列信息：
(i)序列特征：
(A)长度：109个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)股形：
(D)拓朴结构：线型
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：
Asp Leu Ser Asn Val Gln Ser Lys Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys
1               5                   10                  15
His Val pro Gly Gly Gly Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp
            20                  25                  30
Leu Ser Lys Val Thr Ser Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His
        35                  40                  45
Lys Pro Gly Gly Gly Gln Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe
    50                  55                  60
Lys Asp Arg Val Gln Ser Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His
65                  70                  75                  80
Val Pro Gly Gly Gly Asn Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr Phe
                85                  90                  95
Arg Glu Asn Ala Lys Ala Lys Thr Asp His Gly Ala Glu
            100                 105
(2)SEQ ID NO：4的序列信息：
(i)序列特征：
(A)长度：1326个碱基对
(B)类型：核酸
(C)股形：单股
(D)拓朴结构：线型
(ii)分子类型：cDNA
(ix)特征
(A)名称/关键词：CDS
(B)位置：1-1326
(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：
ATG GCT GAG CCC CGC CAG GAG TTC GAA GTG ATG GAA GAT CAC GCT GGG  48
Met Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly
  1               5                  10                  15
ACG TAC GGG TTG GGG GAC AGG AAA GAT CAG GGG GGC TAC ACC ATG CAC  96
Thr Tyr Gly Lau Gly Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His
             20                  25                  30
CAA GAC CAA GAG GGT GAC ACG GAC GCT GGC CTG AAA GAA TCT CCC CTG   144
Gln Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Glu Ser Pro Leu
         35                 40                  45
CAG ACC CCC ACT GAG GAC GGA TCT GAG GAA CCG GGC TCT GAA ACC TCT   192
Gln Thr Pro Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly Ser Glu Thr Ser
     50                  55                  60
GAT GCT AAG AGC ACT CCA ACA GCG GAA GAT GTG ACA GCA CCC TTA GTG   240
Asp Ala Lys Ser Thr Pro Thr Ala Glu Asp Val Thr Ala Pro Leu Val
 65                  70                  75                  80
GAT GAG GGA GCT CCC GGC AAG CAG GCT GCC GCG CAG CCC CAC ACG GAG   288
Asp Glu Gly Ala Pro Gly Lys Gln Ala Ala Ala Gln Pro His Thr Glu
                 85                  90                  95
ATC CCA GAA GGA ACC ACA GCT GAA GAA GCA GGC ATT GGA GAC ACC CCC   336
Ile Pro Glu Gly Thr Thr Ala Glu Glu Ala Gly Ile Gly Asp Thr Pro
            100                 105                 110
 AGC CTG GAA GAC GAA GCT GCT GGT CAC GTG ACC CAA GCT CGC ATG GTC  384
 Ser Leu Glu Asp Glu Ala Ala Gly His Val Thr Gln Ala Arg Met Val
         115                 120                 125
 AGT AAA AGC AAA GAC GGG ACT GGA AGC GAT GAC AAA AAA GCC AAG GGG  432
 Ser Lys Ser Lys Asp Gly Thr Gly Ser Asp Asp Lys Lys Ala Lys Gly
     130                 135                 140
 GCT GAT GGT AAA ACG AAG ATC GCC ACA CCG CGG GGA GCA GCC CCT CCA  480
 Ala Asp Gly Lys Thr Lys Ile Ala Thr Pro Arg Gly Ala Ala Pro Pro
 145                 150                 155                 160
 GGC CAG AAG GGC CAG GCC AAC GCC ACC AGG ATT CCA GCA AAA ACC CCG  528
 Gly Gln Lys Gly Gln Ala Asn Ala Thr Arg Ile Pro Ala Lys Thr Pro
                 165                 170                 175
 CCC GCT CCA AAG ACA CCA CCC AGC TCT GGT GAA CCT CCA AAA TCA GGG   576
 Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly Glu Pro Pro Lys Ser Gly
             180                 185                 190
 GAT CGC AGC GGC TAC AGC AGC CCC GGC TCC CCA GGC ACT CCC GGC AGC   624
 Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser
         195                 200                 205
 CGC TCC CGC ACC CCG TCC CTT CCA ACC CCA CCC ACC CGG GAG CCC AAG   672
 Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg Glu Pro Lys
     210                 215                 220
 AAG GTG GCA GTG GTC CGT ACT CCA CCC AAG TCG CTG TCT TCC GCC AAG   720
 Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro Lys Ser Leu Ser Ser Ala Lys
 225                 230                 235                 240
 AGC CGC CTG CAG ACA GCC CCC GTG CCC ATG CCA GAG CTG AAG AAT GGC   768
 Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met Pro Asp Leu Lys Asn Gly
                 245                 250                 255
 AAG TCC AAG ATC GGC TCC ACT GAG AAC CTG AAG CAC CAG CCG GGA GGC   816
 Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys His Gln Pro Gly Gly
             260                 265                 270
 GGG AAG GTG CAG ATA ATT AAT AAG AAG CTG GAT CTT AGC AAC GTC CAG   864
 Gly Lys Val Gln Ile Ile Asn Lys Lys Leu Asp Leu Ser Asn Val Gln
         275                 280                 285
TCC AAG TGT GGC TCA AAG GAT AAT ATC AAA CAG GTC CCG GGA GGC GGC  912
Ser Lys Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys Gln Val Pro Gly Gly Gly
    290                 295                 300
AGT GTG CAA ATA GTC TAC AAA CCA GTT GAC CTG AGC AAG GTG ACC TCC  960
Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp Leu Ser Lys Va1 Thr Ser
305                 310                 315                 320
AAG TGT GGC TCA TTA GGC AAC ATC CAT CAT AAA CCA GGA GGT GGC CAG  1008
Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His Lys Pro Gly Gly Gly Gln
                325             330                     335
GTG GAA GTA AAA TCT GAG AAG CTT GAC TTC AAG GAC AGA GTC CAG TCG  1056
Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg Val Gln Ser
            340                 345                 350
AAG ATT GGG TCC CTG GAC AAT ATC ACC CAC GTC CCT GGC GGA GGA AAT  1104
Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His Val Pro Gly Gly Gly Asn
        355                 360                 365
AAA AAG ATT GAA ACC CAC AAG CTG ACC GTC CGC GAG AAC GCC AAA GCC  1152
Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr Val Arg Glu Asn Ala Lys Ala
    370                 375                 380
AAG ACA GAC CAC GGG GCG GAG ATC GTG TAC AAG TCG CCA GTG GTG TCT  1200
Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro Val Val Ser
385                 390                 395                 400
GGG GAC ACG TCT CCA CGG CAT CTC AGC AAT GTC TCC TCC ACC GGC AGC  1248
Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser Asn Val Ser Ser Thr Gly Ser
                405                 410                 415
ATT GAC ATG GTA GAC TCG CCC CAG CTC GCC ACG CTA GCT GAC GAG GGG  1296
Ile Asp Met Val Asp Ser Pro Gln Leu Ala Thr Leu Ala Asp Glu Gly
            420                 425                 430
TCT GCC TCC CTG GCC AAG CAG GGT TTG TGA                          1326
Ser Ala Ser Leu Ala Lys Gln Gly Leu
        435                 440
(2)SEQ ID NO：5的序列信息：
(i)序列特征：
(A)长度：442个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓朴结构：线型
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列描述：SEQ ID NO：5：
Met Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly
  1               5                  10                  15
Thr Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His
             20                  25                 30
Gln Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Glu Ser Pro Leu
         35                  40                  45
Gln Thr Pro Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly Ser Glu Thr Ser
     50                  55                  60
Asp Ala Lys Ser Thr Pro Thr Ala Glu Asp Val Thr Ala Pro Leu Val
 65                  70                  75                 80
Asp Glu Gly Ala Pro Gly Lys Gln Ala Ala Ala Gln Pro His Thr Glu
                 85                  90                  95
Ile Pro Glu Gly Thr Thr Ala Glu Glu Ala Gly Ile Gly Asp Thr Pro
            100                 105                 110
Ser Leu Glu Asp Glu Ala Ala Gly His Val Thr Gln Ala Arg Met Val
        115                 120                 125
Ser Lys Ser Lys Asp Gly Thr Gly Ser Asp Asp Lys Lys Ala Lys Gly
    130                 135                 140
Ala Asp Gly Lys Thr Lys Ile Ala Thr Pro Arg Gly Ala Ala Pro Pro
145                 150                 155                 160
Gly Gln Lys Gly Gln Ala Asn Ala Thr Arg Ile Pro Ala Lys Thr Pro
                165                 170                 175
Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly Glu Pro Pro Lys Ser Gly
            180                 185                 190
Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser
        195                 200                 205
Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg Glu Pro Lys
    210                 215                 220
Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro Lys Ser Leu Ser Ser Ala Lys
225                 230                 235                 240
Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met Pro Asp Leu Lys Asn Gly
                245                 250                 255
Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys His Gln Pro Gly Gly
            260                 265                 270
Gly Lys Val Gln Ile Ile Asn Lys Lys Leu Asp Leu Ser Asn Val Gln
        275                 280                  285
Ser Lys Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys Gln Val Pro Gly Gly Gly
    290                 295                 300
 Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp Leu Ser Lys Val Thr Ser
 305                 310                 315                 320
 Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His Lys Pro Gly Gly Gly Gln
                 325                 330                 335
 Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg Val Gln Ser
             340                 345                 350
 Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His Val Pro Gly Gly Gly Asn
         355                 360                 365
Lys Lys lle Glu Thr His Lys Leu Thr Val Arg Glu Asn Ala Lys Ala
    370                 375                 380
Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro Val Val Ser
385                 390                 395                 400
Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser Asn Val Ser Ser Thr Gly Ser
                405                 410                 415
Ile Asp Met Val Asp Ser Pro Gln Leu Ala Thr Leu Ala Asp Glu Gly
            420                 425                 430
Ser Ala Ser Leu Ala Lys Gln Gly Leu
        435                 440
(2)SEQ ID NO：6的序列信息：
(i)序列特征：
(A)长度：291个碱基对
(B)类型：核酸
(C)股形：单股
(D)拓朴结构：线型
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：6：
ATCAAACACG TCCCGGGAGG CGGCAGTGTG CAAATAGTCT ACAAACCAGT TGACCTGAGC  60
AAGGTGACCT CCAAGTGTGG CTCATTAGGC AACATCCATA AACCAGGAGG TGGCCAGGTG 120
GAAGTAAAAT CTGAGAAGCT TGACTTCAAG GACAGAGTCC AGTCGAAGAT TGGGTCCCTG 180
GACAATATCA CCCACGTCCC TGGCGGAGGA AATAAAAAGA TTGAAACCCA CAAGCTGACC 240
TTCCGCGAGA ACGCCAAAGC CAAGACAGAC CACGGGGCGG AGTGAGAATT C          291
(2)SEQ ID NO：7的序列信息：
(i)序列特征：
(A)长度：48个碱基对
(B)类型：核酸
(C)股形：单股
(D)拓朴结构：线型
(ii)分子类型：cDNA
(xi)序列描述：SEQ ID NO：7：
GCCCGGGCCC CATAGATCAA ACACGTCCCG GGAGGCGGCA GTGTGCAA    48
(2)SEQ ID NO：8的序列信息：
(i)序列特征：
(A)长度：47个碱基对
(B)类型：核酸
(C)股形：单股
(D)拓朴结构：线型
(ii)分子类型：cDNA
(xi)序列描述：SEQ ID NO：8：
AGATTACAGA ATTCTCACTC CGCCCCGTGG TCTGTCTTGG CTTTGGC 47
(2)SEQ ID NO：9的序列信息：
(i)序列特征：
(A)长度：140个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)股形：
(D)拓朴结构：线型
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：9：
Asp Leu Lys Asn Val Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys
1               5                   10                  15
His Gln Pro Gly Gly Gly Lys Val Gln Ile Ile Asn Lys Lys Leu Asp
            20                  25                  30
Leu Ser Asn Val Gln Ser Lys Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys His
        35                  40                  45
Val Pro Gly Gly Gly Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp Leu
    50                  55                  60
Ser Lys Val Thr Ser Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His Lys
65                  70                  75                  80
Pro Gly Gly Gly Gln Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys
                85                  90                  95
Asp Arg Val Gln Ser Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His Val
            100                 105                 110
Pro Gly Gly Gly Asn Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr Phe Arg
        115                 120                 125
Glu Asn Ala Lys Ala Lys Thr Asp His Gly Ala Glu
    130                 135                 140
(2)SEQ ID NO：10的序列信息：
(i)序列特征：
(A)长度：140个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)股形：
(D)拓朴结构：线型
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：10：
Asp Leu Lys Asn Val Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Asp Asn Ile Lys
1               5                   10                  15
Tyr Gln Pro Lys Gly Gly Gln Val Arg Ile Leu Asn Lys Lys Ile Asp
            20                  25                  30
Phe Ser Lys Val Gln Ser Arg Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys His
        35                  40                  45
Ser Ala Gly Gly Gly Asn Val Gln Ile Val Thr Lys Lys Ile Asp Leu
    50                  55                  60
Ser His Val Thr Ser Lys Cys Gly Ser Leu Lys Asn Ile Arg His Arg
65                  70                  75                  80
Pro Gly Gly Gly Arg Val Lys Ile Glu Ser Val Lys Leu Asp Phe Lys
                85                  90                  95
Glu Lys Val Gln Ala Lys Val Gly Ser Leu Asp Asn Ala His His Val
            100                 105                 110
Pro Gly Gly Gly Asn Val Lys Ile Asp Ser Gln Lys Leu Asn Phe Arg
        115                 120                 125
Glu His Ala Lys Ala Arg Val Asp His Gly Ala Glu
    130                 135                 140
(2)SEQ ID NO：11的序列信息：
(i)序列特征：
(A0长度：34个碱基对
(B)类型：核酸
(C)股形：单股
(D)拓朴结构：线型
(ii)分子类型：cDNA
(xi序列描述：序列号：11：
CGCGACGCGT ATGATCAAAC ACGTCCCGGG AGGC    34
(2)SEQ ID NO：12的序列信息：
(i)序列特征：
(A)长度：37个碱基对
(B)类型：核酸
(C)股形：单股
(D)拓朴结构：线型
(ii)分子类型：cDNA
(xi)序列描述：SEQ ID NO：12：
CGGCTTTGTC TGGTGCCCCG CCTCACTCCT AGGGCGC    37

Claims (7)

1.一种能调节或抑制tau-tau结合但不抑制tau-微管蛋白结合的制剂在制备药物中的应用，所述药物用于预防或治疗阿尔茨海默氏病(Alzheimer’sdisease)，运动神经元疾病，路易体疾病(Lewy body disease)，皮克氏体病(Pick’s disease)，或进行性核上麻痹(progressive supranuclear palsy)，其中所述药物包含选自具有以下通式之吩噻嗪和它们的可药用盐的制剂：
Figure A2006101006610002C1
其中：
R1，R3，R4，R6，R7和R9各自选自卤素、羟基、羧基、取代的烷基、卤烷基或烷氧基；
R5，每一个R10和每一个R11各自选自羟基、羧基、取代的烷基、卤烷基或烷氧基。
2.权利要求1的应用，用于治疗阿尔茨海默氏病。
3.权利要求1的应用，其中所述吩噻嗪具有上述通式(1)。
4.权利要求3的应用，其中R5是氢。
5.权利要求1的应用，其中所述制剂以治疗有效量出现在含有治疗上惰性的载体物质的药用组合物中。
6.权利要求1的应用，其中所述制剂在1-10μg/ml的范围内具有的标准化tau结合系数小于0.4，且当其相对于tau的摩尔浓度比高达1000∶1时不抑制tau-微管蛋白的结合。
7.用于治疗病理性tau-tau结合的药用组合物，其在治疗上惰性的载体物质中含有治疗有效量的在权利要求1中限定的化合物。
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