CN1955283B - 突变的核酸内切酶 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及不显示非特异的核酸切割活性但具有特异活性的新型突变的核酸内切酶V；编码该核酸内切酶V的基因；含有该基因的重组DNA；含有该重组DNA的转化体或转导体；以及生产核酸内切酶V的方法。本发明还涉及利用核酸内切酶V切割核酸的方法；以及检测或修饰含有该核酸内切酶V的核酸或基因的试剂盒。
Description
发明领域
本发明涉及不显示非特异的核酸切割活性但具有特异的核酸切割活性的突变核酸内切酶V，编码该核酸内切酶V的基因，含有该基因的重组DNA，含有该重组DNA的转化体或转导体，以及生产该核酸内切酶V的方法。本发明还涉及利用核酸内切酶V切割核酸的方法，以及涉及用于检测或修饰含有该核酸内切酶V的核酸或基因的试剂盒。
发明背景
核酸内切酶V[EC 3.1.21.7]可称作脱氧肌苷3’-核酸内切酶，其识别DNA链中的脱氧肌苷的碱基(次黄嘌呤)，和水解碱基周围的磷酸二酯键(主要是被识别碱基3’端上的第2个磷酸二酯键)。除该酶的脱氧肌苷-特异的切割活性之外，还识别DNA链中的多种DNA结构，包括脱氧尿苷碱基(尿嘧啶)，AP位点(无嘌呤/无嘧啶位点或无碱基位点)，碱基错配，碱基插入/缺失，襟翼结构(flap strucfure)，假-Y结构，因此具有切割各种DNA链的活性。此外，该酶具有非特异的核酸切割活性。核酸内切酶V或其编码基因已在许多生物物种中发现或分离，尤其是，源自大肠杆菌(E.coli)和海栖热袍菌(Thermotoga maritima)的那些核酸内切酶V或其编码基因已相对精确地研究了其性质(非专利文献1-11)。
核酸内切酶V的酶活适用于多种检查技术，诊断技术和基因工程技术，包括分析，检测，降解，合成和修饰核酸分子(例如，非专利文献12-16，和专利文献1-12)。
然而，如上所述，核酸内切酶V不仅具有特异的活性而且具有非特异的核酸切割活性。例如，除用于随机切口DNA链的情形(例如，专利文献7)之外，非特异的切割活性是在利用该酶特异活性的几乎所有应用中结果不良的原因。因此，核酸内切酶V的非特异的核酸切割活性实质上阻碍了该酶的工业实用性。
为了克服上述问题，例如，本发明公开的方法包括通过使用连接酶，重组已被核酸内切酶非特异性切割的DNA链(例如，非专利文献13-15，和专利文献9)。
然而，迄今在本领域还没有报道涉及基本上解决核酸内切酶V具有非特异的核酸切割活性的问题自身的方法。
发明概述
本发明的主要目的是基本解决核酸内切酶V具有非特异的核酸切割活性的问题自身。更具体而言，本发明的主要目的是获得不显示非特异的核酸切割活性但具有特异活性的新型突变的内切酶V。
在一些生物物种中，包括大肠杆菌和海栖热袍菌，至今已分离和鉴定了编码核酸内切酶V的基因；并且也已阐述了野生型核酸内切酶V的氨基酸序列。但是，对何种突变可应用于野生型核酸内切酶V的氨基酸序列从而减少或去除该酶的非特异的核酸切割活性同时保留其原有特异的活性一直一无所知。
海栖热袍菌核酸内切酶V(Tma EndoV)的晶体结构已被siljkovic等(例如，非专利文献6)阐述，给出的信息提示Tma EndoV的催化机制及其与底物DNA的相互作用。然而，Tma EndoV与底物DNA的复合体结构并不清楚，也未对通过Tma EndoV参与底物识别的氨基酸显示决定性证据。而且，没有获得有关核酸内切酶V的非特异性核酸切割活性的知识。
比较不同生物物种彼此之间核酸内切酶V的氨基酸序列，物种间高度保守的氨基酸序列得以确认，其中在酶活中起重要作用的部分氨基酸序列一定程度上被认定。Huang等通过在其氨基酸序列的任一氨基酸处使野生型Tma EndoV突变而制备了一些突变的Tma EndoV，并研究了其性质(例如，非专利文献8)。结果他们获得了一些突变的TmaEndoV，其中野生型核酸内切酶V的特异底物切割活性完全或部分缺失。然而，他们未获得本发明人想得到的任何知识，用于获得不显示非特异的核酸切割活性但具有特异活性的突变核酸内切酶V。
本发明人进行了广泛的研究，结果发现不显示非特异的核酸切割活性但具有特异活性的突变的核酸内切酶V可解决上述问题。更具体而言，我们发现，当野生型内切酶V的氨基酸序列中两个特定位点处的氨基酸被其他氨基酸取代时，可获得不显示非特异的核酸切割活性但具有特异活性的突变的核酸内切酶V，而且该突变的核酸内切酶V解决了上述问题。
具体而言，本发明提供了：
<1>突变的底物特异性核酸内切酶V，其不显示非特异的核酸切割活性但显示特异的核酸切割活性。
<2>上述<1>的底物特异性核酸内切酶V，其中特异的核酸切割活性是脱氧肌苷特异的核酸切割活性。
<3>上述<1>或<2>的底物特异性核酸内切酶V，其中在野生型核酸内切酶V的氨基酸序列中，(a)第80位氨基酸或等同于海栖热袍菌(Thermotoga maritima)核酸内切酶V第80位氨基酸位点处的氨基酸被突变为另一氨基酸X1，以及(b)第105位氨基酸或等同于海栖热袍菌(Thermotoga maritima)核酸内切酶V第1 05位氨基酸位点处的氨基酸被突变为另一氨基酸X2。
<4>上述<3>的底物特异性核酸内切酶V，其中氨基酸X1为Ala，Gly，Leu，Ile，Val，Phe和Met中的任一种，而氨基酸X2为Ala，Gly，Asn，Gln，Ser，Thr和His中的任一种。
<5>上述<3>的底物特异性核酸内切酶V，其中氨基酸X1和X2均为Ala。
<6>上述<3>至<5>中任一项的底物特异性核酸内切酶V，其中野生型核酸内切酶V源自嗜热细菌或嗜热古菌(thermophilic archaea)。
<7>上述<3>至<6>中任一项的底物特异性核酸内切酶V，其中野生型核酸内切酶V源自海栖热袍菌。
<8>上述<3>至<7>中任一项的底物特异性核酸内切酶V，其中野生型核酸内切酶V的氨基酸序列为SEQ ID NO：11。
<9>上述<1>至<8>中任一项的底物特异性核酸内切酶V，其是热稳定性的。
<10>上述<1>至<5>中任一项的底物特异性核酸内切酶V，其氨基酸序列为SEQ ID NO：1。
<11>底物特异性核酸内切酶V基因，其编码上述<1>至<10>中任一项的核酸内切酶V。
<12>上述<11>的底物特异性核酸内切酶V基因，其包括碱基序列SEQ ID NO：2。
<13>重组DNA，其包括载体DNA和插入其中的上述<11>或<12>的底物特异性核酸内切酶V基因。
<14>转化体或转导体，其包括上述<13>的重组DNA。
<15>生产底物特异性核酸内切酶V的方法，其包括在培养基中培养上述<14>的转化体或转导体，并且从培养物中收集底物特异性核酸内切酶V。
<16>核酸切割方法，其包括利用上述<1>至<10>中任一项的底物特异性核酸内切酶V。
<17>检测或修饰核酸或基因的试剂盒，其至少含有上述<1>至<10>中任一项的底物特异性核酸内切酶V。
本发明提供不显示非特异的核酸切割活性但具有特异活性的突变的核酸内切酶V；编码该核酸内切酶V的基因；含有该基因的重组DNA；含有该重组DNA的转化体或转导体；以及生产核酸内切酶V的方法。本发明还提供利用核酸内切酶V切割核酸的方法；以及检测或修饰含有该核酸内切酶V的核酸或基因的试剂盒。本发明突变的底物特异性核酸内切酶V适用于多种检查技术，诊断技术和基因工程技术，包括分析，检测，降解，合成和修饰核酸分子。
附图简述
通过实施例，以及为了使说明更为清楚，参照下列附图，其中：
图1显示野生型核酸内切酶V的核酸切割活性。
图2显示突变的核酸内切酶V的核酸切割活性。
发明详述
本发明详述如下。
本发明的“核酸内切酶V”表示根据生化和分子生物学国际联合会(IUBMB)的酶命名法被分类成EC 3.1.21.7的酶。该酶可称为脱氧肌苷3’-核酸内切酶。在过去的分类中，该酶可被指定成EC 3.1.22.3或EC 3.1.-.-。巧合的是，噬菌体T4-衍生的DNA修复酶，T4核酸内切酶V也类似如此命名，但该酶被划分在E.C.3.1.25.1中，并区别于本发明所述的核酸内切酶V。
本发明核酸内切酶V的“特异的核酸切割活性”意思是指该酶识别核酸分子中所含的特异核苷酸或碱基或特异结构的酶活性，例如，脱氧肌苷或其碱基(次黄嘌呤)，脱氧尿苷或其碱基(尿嘧啶)，AP位点(无嘌呤/无嘧啶位点或无碱基位点)，碱基错配，碱基插入/缺失，襟翼结构，假Y结构，或任一完整碱基(腺嘌呤，胸腺嘧啶，尿嘌呤，胞嘧啶)的衍生物或含有该衍生物的核苷酸残基，并且切割被识别位点附近的磷酸二酯键。这并非决定性地说明该酶必须具备所有这些活性，但说明该酶必须具备其中至少一种活性。核酸内切酶V的“脱氧肌苷-特异的核酸切割活性”意思是指其对上述特异的核酸切割活性的脱氧肌苷或其碱基(次黄嘌呤)特异性识别相关的核酸切割活性。
本发明核酸内切酶V的“非特异的核酸切割活性”意思是指未落入上述特异的核酸切割活性范围内的酶的核酸切割活性。例如，其包括对DNA链的随机切口活性。
在本发明中，酶“显示活性”的措辞表示酶在特异反应组成和特异反应条件下，或其特异性范围内，显示活性。这包括酶在最适反应组成和最适反应条件下显示活性的情形。
在本发明中，酶“不显示活性”的措辞不限于酶完全失活的情形，但包括酶活不被检测的情形，和酶活较小并如此之低以致可被基本忽视的情形。
获得编码本发明突变的底物特异性核酸内切酶V的基因的一个优选方法包括获得野生型核酸内切酶V基因及其重组DNA，和使其序列突变。
待用于获得本发明底物特异的核酸内切酶V基因的野生型核酸内切酶V基因可源自任意生物或病毒。例如，该基因可选自细菌衍生的或古菌-衍生的基因。具体而言，该基因可选自那些衍生自大肠杆菌(Escherichia coli)，鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)，海栖热袍菌(Thermotoga maritima)，嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)，嗜酸热原体(Thermoplasma acidophilum)，Thermoplasma volcanium，敏捷气热菌(Aeropyrum pernix)，Pyrococcus abyssi，Pyrococcus horikoshii，Sulfolobus tokodaii，烁古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)的基因。本发明更优选的基因源自嗜热细菌或嗜热古菌，甚至更优选源自海栖热袍菌(Thermotoga maritima)。
这些基因可通过公知方法制备。例如，根据非专利文献5中所述的方法，可制备源自大肠杆菌的野生型核酸内切酶V基因。例如，根据非专利文献7和专利文献8中所述的方法，可制备源自海栖热袍菌(Thermotoga maritima)的野生型核酸内切酶V。例如，根据非专利文献9中所述的方法，可制备源自Archaeoglobus fulgidus的野生型核酸内切酶V基因。例如，根据非专利文献11中所述的方法，可制备源自鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)的野生型核酸内切酶V基因。利用公知的生化和基因工程方法，任何本领域技术人员可制备除在此列举之外的其他任一野生型核酸内切酶V。
除从生物衍生的材料中制备野生型核酸内切酶V基因的方法之外，根据化学合成方法或酶学合成方法，或根据这些方法的合适组合，在现成的野生型核酸内切酶V的核苷酸序列信息基础上，还可直接生产所需的野生型核酸内切酶V基因。
在本发明中，“在等同于海栖热袍菌核酸内切酶V第80位氨基酸位点处的氨基酸”和“在等同于海栖热袍菌核酸内切酶V第105位氨基酸位点处的氨基酸”表示，当现成的核酸内切酶V氨基酸序列与海栖热袍菌核酸内切酶V氨基酸序列(例如，GenBank登录号AAD36927)相比时，该氨基酸分别对应于海栖热袍菌核酸内切酶V的第80位氨基酸或第105位氨基酸。
通过比较各核酸内切酶V的氨基酸序列和海栖热袍菌核酸内切酶V的氨基酸序列之间的同源性，可容易地鉴定氨基酸的位点。为此，例如，可用的有公知软件的氨基酸同源性分析函数(例如，GENETYX(Software Development)。例如，酪氨酸为等同于第80位氨基酸位点处的氨基酸，而天冬氨酸为等同于第105位氨基酸位点处的氨基酸，但是本发明并不限于此。
例如，在大肠杆菌核酸内切酶V的氨基酸序列(GenBank登录号AAC76972)中，第75位酪氨酸和第100位天冬氨酸为相应位点的氨基酸。
例如，在鼠伤寒沙门氏菌核酸内切酶V的氨基酸序列(GenBank登录号AAL22996)中，第73位酪氨酸和第98位天冬氨酸为相应位点的氨基酸。
例如，在嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)核酸内切酶V的氨基酸序列(GenBank登录号BAD71170)中，第80位酪氨酸和第105位谷氨酸为相应位点的氨基酸。
例如，在嗜酸热原体(Thermoplasma acidophilum)核酸内切酶V的氨基酸序列(GenBank登录号CAC11602)中，第183位酪氨酸和第204位天冬氨酸为相应位点的氨基酸。
例如，在Thermoplasma volcanium核酸内切酶V的氨基酸序列(GenBank登录号NP_111300)中，第178位酪氨酸和第199位苏氨酸为相应位点的氨基酸。
例如，在敏捷气热菌(Aeropyrum pernix)核酸内切酶V的氨基酸序列(GenBank登录号NP_147286)中，第43位酪氨酸和第68位天冬氨酸为相应位点的氨基酸。
例如，在Pyrococcus abyssi核酸内切酶V的氨基酸序列(GenBank登录号NP_127057)中，第67位酪氨酸和第90位天冬氨酸为相应位点的氨基酸。
例如，在Pyrococcus horikoshii核酸内切酶V的氨基酸序列(GenBank登录号O58394)中，第67位酪氨酸和第90位天冬氨酸为相应位点的氨基酸。
例如，在Sulfolobus tokodaii核酸内切酶V的氨基酸序列(GenBank登录号Q974T1)中，第70位酪氨酸和第93位天冬氨酸为相应位点的氨基酸。
例如，在趋磁磁螺菌(Magnetospirillum magnetotacticum)核酸内切酶V的氨基酸序列(GenBank登录号ZP 00051831)中，第81位酪氨酸和第106位天冬氨酸为相应位点的氨基酸。
在所示位点处氨基酸被突变的情形下，取代的氨基酸可以是任意氨基酸。取代野生型核酸内切酶V氨基酸序列第80位氨基酸或者等同于海栖热袍菌核酸内切酶V第80位氨基酸位点处的氨基酸的氨基酸X1的优选例子包括Ala，Gly，Leu，Ile，Val，Phe，Met。其中一个优选例子为Ala。取代野生型核酸内切酶V氨基酸序列第105位氨基酸或者等同于海栖热袍菌核酸内切酶V第105位氨基酸位点处的氨基酸的氨基酸X2的优选例子包括Ala，Gly，Asn，Gln，Ser，Thr，His。其中一个优选例子为Ala。
通过多种公知方法，本领域任何技术人员可在野生型核酸内切酶V基因的所需位点处合适地选择使编码该氨基酸的密码子突变，从而获得本发明底物特异的核酸内切酶V基因的方法。这些方法包括，例如，硫代磷酸酯方法(Eckstein方法)[例如，Taylor JW，Schmidt W，CosstickR，Okruszek A，Eckstein F(1985)，Nucleic Acids Res，13，8749-64；和Taylor JW，Ott J，Eckstein F(1985)Nucleic Acid Res.，13，8765-85]；缺口双链体方法(Kramer方法)[例如，Kramer W，Drutsa V，Jansen HW，Kramer B，Pflugfelder M，Fritz HJ，(1984)Nucleic Acid Res.，12，9441-56；和Kramer W，Fritz HJ，(1987)Methods Enzymol，154，350-67]；和Kunkel方法[例如，Kunkel TA.(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82，488-92；和Kunkel TA，Roberts JD，Zakour RA，(1987)Methods Enzymol.，154，367-82]。此外，例如，也可采用非专利文献8中所述的方法，以及本发明实施例中公开的方法。
作为获得编码本发明突变核酸内切酶V的基因的另一优选方法，除上述基因重组方法之外，还可采用有机合成方法，酶合成方法及其组合来合成所需的突变核酸内切酶V基因。
获得本发明突变核酸内切酶V的一个优选方法包括生产含有本发明突变核酸内切酶V基因作为其重组DNA的转化体或转导体，本发明突变核酸内切酶V基因的获得方式如上常用方法，然后以常用方法在培养基中培养所得转化体或转导体，并且从培养物中收集底物特异的核酸内切酶V。
根据如上方法，突变核酸内切酶V基因可插入至载体，诸如噬菌体，粘粒或质粒，用于转化真核细胞或原核细胞，由此以常用方式可转化或转导对应于各自重组载体的宿主。
通过连接(插入)本发明基因至合适载体，可获得本发明重组DNA。不特别限定，本发明基因插入的载体可以是任何一种能够在宿主中复制的载体，包括，例如，质粒DNA和噬菌体DNA。质粒DNA包括大肠杆菌衍生的质粒(例如，pBR322，pBR325，pUC8，pUC9，pUC118，pUC119，pET(Novagen)，pGEX(Amersham Biosciences)，pQE(QIAGEN)，pMAL(New England Biolabs))；枯草杆菌(Bacillussubtilis)衍生的质粒(例如，pUB110，pTP5)；酵母衍生的质粒(例如，YEp13，YEp24，YCp50)。噬菌体DNA包括λ噬菌体。此外，也可采用动物病毒载体，诸如逆转录病毒，牛痘病毒；和昆虫病毒载体，诸如杆状病毒。
为了使本发明基因插入载体，例如，在此可用的方法包括以合适的切割核酸内切酶切割含有本发明纯化基因的DNA，接着将所得片段插入合适载体的限制性核酸内切酶位点或多克隆位点，从而连接至载体。除启动子和与其结合的本发明基因之外，增强子顺式元件以及剪接信号，polyA添加信号，选择性标记和核糖体结合序列(SD序列)可任选连接至载体。选择性标记的例子为二氢叶酸还原酶基因，氨苄青霉素抗性基因，新霉素抗性基因。编码标签序列，诸如GST标签或组氨酸标签的序列可添加至本发明基因，旨在利于随后对本发明突变核酸内切酶V的纯化或检测，或者旨在防止表达的突变核酸内切酶V在细胞中不溶[例如，Terpe K(2003)，Appl.Microbiol.Biotechnol.，60，523-533]。
通过导入本发明重组载体至宿主，可获得本发明转化体/转导体，目的在于所需基因可在其中表达。在此所用的宿主不特别限定，只要其能表达本发明基因。例如，宿主包括属于下列属的细菌，埃希氏菌(例如，大肠杆菌)，假单胞菌(例如，恶真假单胞菌(pseudomonas putida)，杆菌(例如，枯草杆菌)，根瘤菌(例如，苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)；酵母，诸如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，粟洒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；动物细胞，诸如COS细胞，CHO细胞；以及昆虫细胞，诸如秋天行军虫(fall armyworm)细胞(例如，Sf9，Sf21)和蚕细胞(例如，BmN4)。
在细菌诸如大肠杆菌用作宿主的情形下，合意的重组载体在细菌中是自我复制的，同时其包含启动子，核糖体结合序列，本发明基因以及转录终止序列。此外，其还可含有启动子控制基因。大肠杆菌宿主包括，例如，大肠杆菌K12，DH1，BL21(DE3)。启动子可以是任何能够在宿主，诸如大肠杆菌中表达的启动子，为此，例如，在此可用的启动子为大肠杆菌或噬菌体衍生的启动子，诸如trp启动子，lac启动子，T7启动子，PL启动子，PR启动子，tac启动子。
在本发明转化体/转导体以如上方式获得后，通过本领域普通技术人员公知的酶收集方法，本发明突变的底物特异性核酸内切酶V可从其培养物中收集。在本发明突变的核酸内切酶V在细菌内或胞内生产的情形下，细菌或细胞可破碎以从中抽提出酶。例如，细菌被超声破碎或研磨，或以溶菌酶等裂解细菌的酶处理，从而从中抽提出本发明的酶；或者细菌振荡或原样留置在自溶用的甲苯等中，由此从细菌中排出本发明的酶。
在本发明突变核酸内切酶V为热稳定性的情形下，在热条件下处理可有利地实现分离。在原始野生型核酸内切酶V为热稳定性酶的情形下，一般而言，基于野生型酶氨基酸序列生成的本发明突变核酸内切酶V的热稳定性水平与野生型酶相同或近乎相同。在本发明突变核酸内切酶V细菌外或胞外产生的情形下，可直接获得培养物原样——含有酶的溶液。
在本发明中，酶是“热稳定的”措辞表示酶活的最适温度高于常温范围(20-40℃)，例如，其表示酶活的最适温度在中高温度范围内(45-65℃)，高温范围内(60-80℃)，或超高温范围内(80℃或更高，或90℃或更高)。
从以上述方式获得并含有本发明突变的核酸内切酶V的制剂中，纯化本发明的突变核酸内切酶V，获得纯酶产品，为此可采用本领域技术人员为蛋白分离和纯化通常采用的任何生化方法。例如，在此可采用的有硫酸铵沉淀，凝胶层析，离子交换层析，亲和层析，这些方法可单独或以任何所需方式组合使用，以从上述酶溶液中分离和纯化本发明突变的核酸内切酶V。
在本发明突变的核酸内切酶V以诸如添加其上的GST标签或组氨酸标签的标签序列表达的情形下，附加序列在酶的纯化过程中或之后可通过本领域技术人员公知的合适酶法处理而去除，或者在酶中保留原样，只要附加序列不背离本发明突变的核酸内切酶V的特征，即具有特异的活性但不具有非特异的核酸切割活性。
获得野生型海栖热袍菌核酸内切酶V的重组体的方法公开在例如非专利文献7中；本领域任何技术人员例如根据此文献中所述的相似方法，通过利用本发明突变的核酸内切酶V基因代替野生型核酸内切酶V基因，可获得本发明突变的核酸内切酶V基因。作为获得本发明突变的核酸内切酶V的方法的优选例子，可采用的有公开在本发明实施例中的方法或其相似方法。
在提供上述本发明底物特异的核酸内切酶V的方法中，通过选择热稳定的野生型核酸内切酶V作为原始野生型核酸内切酶V，可提供本发明热稳定的突变核酸内切酶V。
以此方式，可获得本发明任何所需的突变的底物特异性核酸内切酶V，由此可提供用于生产本发明突变的底物特异性核酸内切酶V的方法。
利用本发明突变的底物特异性核酸内切酶V，提供利用该酶切割核酸的方法。例如，在利用非专利文献12-16和专利文献1-6和8-12中公开的野生型核酸内切酶V的方法或其相似方法中，本发明的底物特异的核酸内切酶V可用于替代野生型核酸内切酶V。切割本发明核酸的方法并不限于这些实施例，本发明的底物特异性核酸内切酶V适用于任一切割核酸方法，其中利用核酸内切酶V的特异活性。本发明切割核酸的方法尤其利于利用核酸内切酶V的特异活性但其非特异的核酸切割活性(如果有的话)可引起一些不利结果的情形。
在利用本发明底物特异的核酸内切酶V用于切割核酸的方法中，对该酶有利的反应组成和反应条件可与原始野生型核酸内切酶V的有利反应组成和有利反应条件相同或近乎相同。反应组成和反应条件公开在例如，非专利文献1-5和7-16，或专利文献1-12中。如果需要，本领域技术人员可合适地修饰这些公开的反应组成和反应条件，或可重新确定对本发明的酶更有利的反应组成和反应条件。
在本发明切割核酸的方法中，可使用核酸内切酶V的任何特异性核酸切割活性，但尤其优选使用该酶的脱氧肌苷特异的核酸切割活性。
在本发明切割核酸的方法中，本发明突变的核酸内切酶V的脱氧肌苷特异性核酸切割活性可用于替代脱氧尿苷特异的核酸切割活性。例如，识别位于DNA位点中的脱氧尿苷以切割DNA链的方法可被识别位于DNA位点中的脱氧肌苷以切割DNA链的方法所替换。在此情形下，例如，底物DNA可如此计划，以致脱氧肌苷能存在其中代替脱氧尿苷。根据公知的化学DNA合成方法可制备该类底物。此外，根据公知酶法可制备该类底物。例如，在DNA链通过DNA聚合酶活性而模板依赖性地加以合成的情形下，已知在某些条件下以dUTP替代dTTP和以dITP替代dGTP可包含在新生成的DNA链中。利用此，有可能使脱氧肌苷位于DNA所需位点，代替DNA目的位点的脱氧尿苷。另一方面，例如，一种DNA加工方法，其中存在或缺乏脱氧尿苷不清楚，或脱氧尿苷假定位于其中，基于存在或缺乏切割，或基于切割模式，通过核酸检测或分析用的脱氧尿苷特异的核酸切割反应，可被另一种DNA加工方法所替代，其中存在或缺乏脱氧肌苷不清楚或脱氧肌苷假定位于其中，基于存在或缺乏切割或基于切割模式，通过核酸检测或分析用的脱氧肌苷特异的核酸切割反应。
本发明底物特异的核酸内切酶V，或者利用核酸切割用的底物特异性核酸内切酶V的本发明方法如上所述提供在此，以及由此核酸或基因检测或修饰用、至少含有底物特异性核酸内切酶V的试剂盒提供在此。
本发明的试剂盒至少含有本发明的底物特异性核酸内切酶V作为其组成元件。而且，本发明的试剂盒含有预先制备的酶反应液，反应液制备中的基础缓冲液，底物或底物溶液，一种或多种除核酸内切酶V之外的附加酶，预先制备的附加酶反应液，或附加酶反应液制备中的基础缓冲液，附加酶的底物或底物溶液，以及金属离子供体，诸如镁离子供体作为其任选组成元件，用于帮助操作者实施利用底物特异性核酸内切酶V切割核酸的本发明方法。为方便用户，这些组成元件可提供成其溶液形式，所述溶液的浓度可有利地实施本发明方法，或比刚好有利的浓度增加预定倍数(例如，是刚好有利浓度的10倍)。同样，为方便用户，这些组成元件可保持在一个容器中，如同分别组合在一个剂量用于一次反应，或组合在多个剂量用于多次反应。
如果需要，实施利用底物特异性核酸内切酶V切割核酸的本发明方法的方案及其实施例的记录介质也可以是本发明试剂盒的附加组成元件。
本发明试剂盒的一个优选实施方案含有对实施利用底物特异性核酸内切酶V切割核酸的本发明方法必需的全部物质，或除部分之外的全部物质，作为其组成元件。
[实施例]
参照下列实施例更详细描述本发明。然而，本发明不应解释为限制于此。
<野生型核酸内切酶V基因的制备>
海栖热袍菌(Thermotoga maritima)ATCC 43589细胞购自日本微生物保藏中心(JCM)(JCM No.10099)。海栖热袍菌细胞在厌氧条件下，80℃静态培养在预定培养基中48小时。20ml培养物以13,000×g离心5分钟，并将沉淀细胞悬浮在1ml超纯水中。悬浮液超声破碎，13,000×g离心5分钟，收集上清液。该方法给出含有海栖热袍菌染色体DNA的破碎上清液。
根据下述PCR方法，扩增海栖热袍菌(Thermotoga maritima)核酸内切酶V基因。1μl海栖热袍菌(Thermotoga maritima)破碎上清液加至反应液(50μl总体积)作为模板。1.0单位KOD-plus(Toyobo)加至反应液作为DNA聚合酶。随附KOD-plus产品的5μl 10-倍浓度反应缓冲液(10×KOD-PCR缓冲液)加至反应液。SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4寡核苷酸用作引物，分别以终浓度0.3μM加至反应液中。终浓度为0.2mM的dNTP和终浓度为1mM的MgSO4加至反应液。
利用热循环仪GeneAmp PCR System 9600(Perkin Elmer)，反应液在94℃热处理2分钟一次，然后热循环处理35次：94℃，15秒；57℃，30秒和68℃，1分钟。利用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)，纯化PCR-扩增产物，并用50μl超纯水洗脱。依据纯化试剂盒所附说明书进行纯化处理。
通过常用方法，将所得扩增产物插入具有His-标签序列的大肠杆菌重组蛋白表达载体pET16b(Novogen)。利用DNA测序仪，将所得重组DNA(下文称作pET16TmaEV)中的核酸内切酶V基因的碱基序列解码，证实该序列与已知海栖热袍菌核酸内切酶V基因的碱基序列(GenBank登录号AE001823)相同。该方法给出野生型核酸内切酶V基因。
<突变的核酸内切酶V基因的形成>
首先制备核酸内切酶V基因，其中编码野生型核酸内切酶V氨基酸序列第80位酪氨酸的碱基序列被编码丙氨酸的碱基序列替代(Y80A突变)。利用Quikchange II位点定点突变试剂盒(Stratagene)，位点特异的突变导入所需的碱基序列。该试剂盒利用DpnI消化甲基化DNA的性质。反应液总量为51μl，而以上述方式生产的50ng pET16TmaEV用作模板。反应液组成和操作方案参见试剂盒中随附的说明书。作为Y80A突变导入引物，使用寡核苷酸SEQ ID NO 5和SEQ ID NO 6。该方法给出含有突变核酸内切酶基因的重组DNA，其中导入Y80A突变(下文称作pET16TmaEVM1)。
接着，以如上同样方式，由pET16TmaEVM1编码的突变核酸内切酶V氨基酸序列第105位天冬氨酸的编码碱基序列替换以编码丙氨酸的碱基序列(D105A突变)。作为D105A突变导入的引物，采用寡核苷酸SEQID NO 7和SEQ ID NO 8。该方法给出含有突变的核酸内切酶基因的重组DNA，其中导入两位点突变Y80A和D105A(下文称作pET16TmaEVM2)。核酸内切酶V基因在pET16TmaEVM2中的碱基序列以DNA测序仪解码，证实存在所需碱基替换。除突变位点之外的其他碱基序列与已知海栖热袍菌(Thermotoga maritima)核酸内切酶V基因的碱基序列(GenBank登录号AE001823)相同。该方法给出突变的核酸内切酶V基因。
<野生型和突变核酸内切酶V的表达和纯化>
利用大肠杆菌重组蛋白表达系统，根据下述方法，表达野生型核酸内切酶V和突变核酸内切酶V。首先，利用如上方式制备的pET16TmaEV或pET16TmaEVM2，以常用方式转化宿主大肠杆菌BL21(DE3)(Novogen)。将所得转化体接种至8 ml含有氨苄青霉素(终浓度50μg/ml)的LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母浸出物5g/L，NaCl 10g/L)中，并在37℃下以振荡培养方式温育，直到OD600达到0.6。然后，将所得培养物接种至800ml含有氨苄青霉素(终浓度50μg/ml)的LB培养基，并进一步在37℃下以振荡培养方式温育，直到OD600达到0.6。接着，将异丙基-β-硫代半乳糖吡喃糖苷以终浓度1mM加至培养物中，由此诱导所需蛋白的表达，以振荡培养方式在30℃下温育5小时。所得培养物13,000×g离心10分钟。沉淀细胞悬浮在30ml含有蛋白酶抑制剂鸡尾酒(Sigma)的缓冲液[20mM HEPES(pH7.4)，1mM EDTA(pH8.0)，0.1mM DTT，50mM NaCl]中。30ml悬浮液超声破碎，13,000×g离心10分钟，收集上清液。所得上清液75℃下加热15分钟，从而使上清液中的大肠杆菌衍生的蛋白变性。
如此热处理液以13,000×g离心10分钟，收集上清液。所得上清液通过孔径为0.2μm的过滤器过滤。然而，利用His-标签融合蛋白纯化柱HisTrap HP(Amersham Biosciences)，纯化野生型核酸内切酶V或突变的核酸内切酶V。该步中，使用真空脱气的缓冲液A[50mM HEPES(pH7.4)，1mM EDTA(pH8.0)，0.1mM DTT，50mM NaCl，20mM咪唑]和缓冲液B[50mM HEPES(pH7.4)，1mM EDTA(pH8.0)，0.1mM DTT，50mM NaCl，500mM咪唑]逐步洗脱。所得洗脱液级分进行SDS-PAGE，其中单个蛋白条带显示对应于预测分子量。该方法给出野生型核酸内切酶V和突变的核酸内切酶V。
<底物DNA的生产>
用于评价核酸内切酶V的核酸切割活性的底物DNA根据下述方法生产。大肠杆菌DNA通过PCR扩增，因此预定比例的脱氧肌苷在扩增产物中获得。PCR反应液的体积为100μl，其中加入2×104cfu(菌落形成单位)大肠杆菌(JCM No.1649)染色体DNA作为模板。作为PCR引物，寡核苷酸SEQ ID NO 9和SEQ ID NO 10添加至反应液，终浓度分别为0.2mM。这些寡核苷酸为引物组，用于扩增585 bp DNA片段，靶向大肠杆菌mai基因区(GenBank登录号J01648)。作为DNA聚合酶，5单位TaKaRa Taq(Takara Bio)加至反应液。使用随附DNA聚合酶产品的PCR反应缓冲液。作为底物，dATP，dTTP，dGTP和dCTP加至反应液，终浓度分别为0.2mM。而且，向其中以终浓度为0.02mM或0.2mM添加dITP。利用热循环仪GeneAmp PCR System 9600(Perkin Elmer)，反应液进行热循环处理30次：94℃，30秒；63℃，30秒和72℃，30秒。除此之外，制备另一反应液，其中不添加dITP，并以上述同样方式进行PCR。如此获得的PCR-扩增产物利用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)单独纯化，并以70μl超纯水洗脱。根据随附纯化试剂盒的说明书进行纯化处理。测量波长260nm处洗脱液的吸光度，从而确定洗脱液中所含PCR扩增产物的核酸浓度。该方法给出55.0ng/μl无脱氧肌苷PCR-扩增产物(下文称作底物S-N)；52.5ng/μl在0.02mM dITP存在下扩增的产物(下文称作底物S-I1)；和32.5ng/μl在0.2mM dITP存在下扩增的产物(下文称作底物S-I2)。经确认，这些产物在琼脂糖凝胶电泳中分别显示单一条带，对应于预测DNA片段长度(585bp)。最后，每个洗脱液中核酸浓度控制至32.5ng/μl。该方法给出核酸内切酶V的三种底物DNA(S-N，S-I1和S-I2)。
<比较例1：野生型核酸内切酶V的核酸切割活性>
利用这些底物DNAs(S-N，S-I1和S-I2)，分析以上述方式生产的野生型核酸内切酶V的核酸切割活性。反应缓冲液的组成包括10mMHEPES(pH7.4)，5mM MgCl2和1mM DTT。核酸内切酶V和底物DNA添加至反应液中，使得其终浓度分别为1.9μM和11nM。除此之外，制备没有添加酶的样品作为阴性对照。如此制备的反应液在65℃下保温2小时，预定时间段(10分钟，30分钟和1小时)后，对此取样。反应后，10μl各反应液进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，并在UV灯下，基于存在或缺乏底物DNA条带的点和密度(如果有的话)，彼此比较。电泳图示于图1。
在图1中，道1和道17显示100bp DNA梯度标记。没有酶的底物S-N样品和反应时间10分钟，30分钟，1小时和2小时后的样品分别位于道2，5，8，11和14。没有酶的底物S-I1样品和反应时间10分钟，30分钟，1小时和2小时后的样品分别位于道3，6，9，12和15。没有酶的底物S-I2样品和反应时间10分钟，30分钟，1小时和2小时后的样品分别位于道4，7，10，13和16。
如这些结果所示，与没有酶反应的条带(道3和4)比较，反应时间10分钟后，由于酶的核酸切割活性，含有脱氧肌苷的底物DNA(S-I1和S-I2)的条带(道6和7)显示明显提升的降解水平。与底物S-I1(道6)比较，含有大量脱氧肌苷的底物S-I2(道7)导致更高的降解。
在底物S-I1中，由于底物降解，随着反应时间10分钟，30分钟和1小时，条带以此顺序变细(分别为道6，9和12)，以及反应时间2小时后，条带几乎完全消失(道15)。在底物S-I2中，反应10分钟后，条带几乎完全消失(道7)，以及其后(道10，13，16)，无条带出现。这证实野生型核酸内切酶V切割含有脱氧肌苷DNA的活性。
另一方面，甚至在无脱氧肌苷的底物DNA(S-N)中，与没有酶反应的条带(道2)比较，由于降解，随着反应时间10分钟，30分钟和1小时(道5，8和11)，条带以此顺序逐渐变细。反应时间2小时后，由于底物降解，条带几乎完全消失(道14)。这说明野生型核酸内切酶V另具有非特异的核酸切割活性。
上述结果证实，野生型核酸内切酶V不仅具有切割含有脱氧肌苷的底物DNA的活性，而且具有非特异的DNA切割活性。
<实施例1：突变核酸内切酶V的核酸切割活性>
利用这些底物DNA(S-N，S-I1和S-I2)，分析以上述方式生产的突变核酸内切酶V的核酸切割活性。反应液组成和反应条件与比较例1中的那些相同。反应后，将10μl各反应液进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，以溴化乙锭染色，并在UV灯下，基于存在或缺乏底物DNA条带的点和密度(如果有的话)，彼此比较。电泳图示于图2。
在图2中，道1和道17显示100bp DNA梯度标记。没有酶的底物S-N样品和反应时间10分钟，30分钟，1小时和2小时后的样品分别位于道2，5，8，11和14。没有酶的底物S-I1样品和反应时间10分钟，30分钟，1小时和2小时后的样品分别位于道3，6，9，12和1 5。没有酶的底物S-I2样品和反应时间10分钟，30分钟，1小时和2小时后的样品分别位于道4，7，10，13和16。
如这些结果所示，由于该酶的核酸切割活性，随着时间的流逝，含有脱氧肌苷的底物(S-I1)的降解继续，与没有酶反应的条带(道3)比较，2小时后的条带(道15)明显变细。含有大量脱氧肌苷的底物(S-I2)显示更快的降解。反应10分钟后S-I2的条带(道7)与没有酶反应的条带(道4)比较，明显变细；而反应30分钟后以及更稍后时间(道10，13和16)，条带完全消失。这证实突变核酸内切酶V具有切割含有脱氧肌苷的DNA的活性。
另一方面，在无脱氧肌苷底物DNA(S-N)中，与没有酶反应的条带(道2)比较，没有发现反应时间10分钟，30分钟，1小时和2小时(道5，8，11和14)的条带变化。这证实，突变核酸内切酶V不显示非特异的核酸切割活性。
从上可理解，在此生产的突变核酸内切酶V为一种底物特异的核酸内切酶V，其不显示野生型核酸内切酶V具有的非特异核酸切割活性，但具有脱氧肌苷特异的核酸切割活性。此外，已清楚的是，在与野生型核酸内切酶V相同的反应组成和相同的反应条件下，突变的核酸内切酶V显示其酶活性。而且，已经证实的是，突变核酸内切酶V的热稳定性水平与野生型核酸内切酶V相同。
尽管本发明参照其具体实施方案已详细描述，但对本领域技术人员而言，显而易见的是在不背离本发明范围的条件下可发生多种变化和修饰。
该申请基于于2005年10月24日提交的日本专利申请No.2005-308533，其全部内容在此引作参考。
参考文献
专利文献1：WO 2004/003232
专利文献2：WO 02/36821
专利文献3：WO 2004/067765
专利文献4：WO 2004/067726
专利文献5：WO 2004/022701
专利文献6：WO 03/080645
专利文献7：WO 2004/046383
专利文献8：WO 99/42595
专利文献9：WO 02/44335
专利文献10：美国专利公报2005/136417
专利文献11：美国专利公报2005/123956
专利文献12：WO2004/015105
非专利文献1：Yao M，Hatahet Z，Melamede RJ，Kow YW：纯化和表征来自大肠杆菌的新型脱氧肌苷特异性酶，脱氧肌苷3’核酸内切酶(Purification and characterization of a novel deoxyinosine-specificenzyme，deoxyinosine 3′endonuclease，from Escherichia coli).J BiolChem，269，16260-8(1994).
非专利文献2：Yao M，Kow YW：通过来自大肠杆菌的脱氧肌苷3’-核酸内切酶对含有错配的DNA进行链特异性切割(Strand-specificcleavage of mismatch-containing DNA by deoxyinosine 3′-endonucleasefrom Escherichia coli).J Biol Chem，269，31390-6(1994).
非专利文献3：Yao M，Kow YW：来自大肠杆菌的脱氧肌苷3’-核酸内切酶与含有脱氧肌苷的DNA相互作用(Interaction of deoxyinosine3′-endonuclease from Escherichia coli with DNA containingdeoxyinosine).J Biol Chem，270，28609-16(1995).
非专利文献4：Yao M，Kow YW：通过来自大肠杆菌的脱氧肌苷3’-核酸内切酶切割插入/缺失错配，襟翼和假-Y DNA结构(Cleavage ofinsertion/deletion mismatches，flap and pseudo-Y DNA structures bydeoxyinosine 3′-endonuclease from Escherichia coli).J Biol Chem，271，30672-6(1996).
非专利文献5：Yao M，Kow YW：进一步表征大肠杆菌核酸内切酶V，对DNA中的脱氧肌苷，脱氧尿苷和碱基错配识别的机制(Furthercharacterization of Escherichia coli endonuclease V.Mechanism ofrecognition for deoxyinosine，deoxyuridine，and base mismatches inDNA).J Biol Chem，272，30774-9(1997).
非专利文献6：Zvonimir Siljkovic：来自海栖热袍菌的DNA修复酶核酸内切酶V的晶体结构(Crystal structure of the DNA repair enzymeendonuclease V from Thermotoga maritima).硕士论文，PurdueUniversity，Thesis 46615 MS(2000).
非专利文献7：Huang J，Lu J，Barany F，Cao W：来自海栖热袍菌的核酸内切酶V的多切割活性：识别和链切口机制(Multiple cleavageactivities of endonuclease V from Thermotoga maritima：recognition andstrand nicking mechanism).Biochemistry，40，8738-48.(2001).
非专利文献8：Huang J，Lu J，Barany F，Cao W：来自海栖热袍菌的核酸内切酶V的突变分析(Mutational analysis of endonuclease V fromThermotoga maritima).Biochemistry，41，8342-50(2002).
非专利文献9：Liu J，He B，Qing H，Kow YW：来自高嗜热烁古生球菌的脱氧肌苷特异的核酸内切酶：大肠杆菌核酸内切酶V的同源物(Adeoxyinosine specific endonuclease from hyperthermophile，Archaeoglobus fulgidus：a homolog of Escherichia coli endonuclease V).Mutat Res，461，169-77(2000).
非专利文献10：Hitchcock TM，Gao H，Cao：通过细菌核酸内切酶V切割含有deoxyoxanosine的寡脱氧核糖核苷酸(Cleavage ofdeoxyoxanosine-containing oligodeoxyribonucleotides by bacterialendonuclease V).Nucleic Acids Res，32，4071-80(2004).
非专利文献11：Feng H，Klutz AM，Cao W：来自鼠伤寒沙门氏菌的核酸内切酶V的活性位点塑性(Active Site Plasticity of EndonucleaseV from Salmonella typhimurium).Biochemistry，44，675-83(2005)
非专利文献12：Van Ness J，Van Ness LK，Galas DJ：用于寡核苷酸扩增的等温反应(Isothermal reactions for the amplification ofoligonucleotides).Proc Natl Acad Sci USA，100，4504-9(2003).
非专利文献13：Huang J，Kirk B，Favis R，Soussi T，Paty P，Cao W，Barany F：尤其适于分析赘生性组织的基于核酸内切酶/连接酶的突变扫描方法(An endonuclease/ligase based mutation scanning methodespecially suited for analysis of neoplastic tissue).Oncogene，21，1909-21(2002).
非专利文献14：Favis R，Huang J，Gerry NP，Culliford A，Paty P，Soussi T，Barany F：协调的微阵列/突变扫描分析未切开结肠直肠肿瘤中的TP53突变(Harmonized microarray/mutation scanning analysis ofTP53 mutations in undissected colorectal tumors).Hum Mutat，24，63-75(2004).
非专利文献15：Pincas H，Pingle MR，Huang J，Lao K，Paty PB，Friedman AM，Barany F：通过实时连接酶校正的高灵敏度核酸内切酶V突变扫描(High sensitivity EndoV mutation scanning through real-timeligase proofreading).Nucleic Acids Res.32，e148(2004).
非专利文献16：Miyazaki K：以核酸内切酶V对DNA随机片段化：应用于DNA改组(Random DNA fragmentation with endonuclease V：application to DNA shuffling).Nucleic Acids Res，30，e139(2002).
序列表
<110>西川橡胶工业株式会社(Nishikawa Rubber Co.，Ltd.)
<120>突变的核酸内切酶(Mutant Endonuclease)
<130>SPI064284-47
<160>10
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>225
<212>PRT
<213>Artifical
<400>1
Met Asp Tyr Arg Gln Leu His Arg Trp Asp Leu Pro Pro Glu Glu Ala
1 5 10 15
Ile Lys Val Gln Asn Glu Leu Arg Lys Lys Ile Lys Leu Thr Pro Tyr
20 25 30
Glu Gly Glu Pro Glu Tyr Val Ala Gly Val Asp Leu Ser Phe Pro Gly
35 40 45
Lys Glu Glu Gly Leu Ala Val Ile Val Val Leu Glu Tyr Pro Ser Phe
50 55 60
Lys Ile Leu Glu Val Val Ser Glu Arg Gly Glu Ile Thr Phe Pro Ala
65 70 75 80
Ile Pro Gly Leu Leu Ala Phe Arg Glu Gly Pro Leu Phe Leu Lys Ala
85 90 95
Trp Glu Lys Leu Arg Thr Lys Pro Ala Val Val Val Phe Asp Gly Gln
100 105 110
Gly Leu Ala His Pro Arg Lys Leu Gly Ile Ala Ser His Met Gly Leu
115 120 125
Phe Ile Glu Ile Pro Thr Ile Gly Val Ala Lys Ser Arg Leu Tyr Gly
130 135 140
Thr Phe Lys Met Pro Glu Asp Lys Arg Cys Ser Trp Ser Tyr Leu Tyr
145 150 155 160
Asp Gly Glu Glu Ile Ile Gly Cys Val Ile Arg Thr Lys Glu Gly Ser
165 170 175
Ala Pro Ile Phe Val Ser Pro Gly His Leu Met Asp Val Glu Ser Ser
180 185 190
Lys Arg Leu Ile Lys Ala Phe Thr Leu Pro Gly Arg Arg Ile Pro Glu
195 200 205
Pro Thr Arg Leu Ala His Ile Tyr Thr Gln Arg Leu Lys Lys Gly Leu
210 215 220
Phe
225
<210>2
<211>675
<212>DNA
<213>Artifical
<400>2
atggattaca ggcagcttca cagatgggat cttcctccgg aggaagcgat aaaagtgcag 60
aacgaactca gaaagaagat aaaactcact ccatacgaag gagagcccga gtacgtggcg 120
ggagtggacc tttcgtttcc gggaaaagaa gaagggctcg cggtgatagt ggtactcgaa 180
tatccttctt tcaaaatatt agaggtcgtt tctgaaaggg gagagataac ttttcccgca 240
attccggggc tccttgcttt cagagaagga cctctgttct tgaaggcctg ggaaaagctg 300
agaacgaaac ccgcagttgt ggtcttcgat ggtcagggac tggcacatcc cagaaaactt 360
gggatagcct cccacatggg actcttcata gagatcccga ccattggtgt ggcaaaatcc 420
agactgtatg gaacgttcaa aatgcctgaa gataaaaggt gttcctggag ttatctctac 480
gacggcgagg agataatagg ctgtgtgatc agaacaaagg aaggaagtgc tcctatcttc 540
gtgtctccgg gccatctcat ggacgttgaa agttcgaaaa gactgatcaa ggcttttacc 600
ttacccggaa gaaggatacc ggaacccacc agactggcac acatctacac acaacggctc 660
aaaaaaggcc ttttc 675
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ggagggaatc atatggatta caggcagctt caca 34
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gacctcggtt tagttcacag a 21
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cacacgctga cgctgacca 19
<210>11
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<212>DNA
<213>Thermotoga maritima
<400>11
Met Asp Tyr Arg Gln Leu His Arg Trp Asp Leu Pro Pro Glu Glu Ala
1 5 10 15
Ile Lys Val Gln Asn Glu Leu Arg Lys Lys Ile Lys Leu Thr Pro Tyr
20 25 30
Glu Gly Glu Pro Glu Tyr Val Ala Gly Val Asp Leu Ser Phe Pro Gly
35 40 45
Lys Glu Glu Gly Leu Ala Val Ile Val Val Leu Glu Tyr Pro Ser Phe
50 55 60
Lys Ile Leu Glu Val Val Ser Glu Arg Gly Glu Ile Thr Phe Pro Tyr
65 70 75 80
Ile Pro Gly Leu Leu Ala Phe Arg Glu Gly Pro Leu Phe Leu Lys Ala
85 90 95
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100 105 110
Gly Leu Ala His Pro Arg Lys Leu Gly Ile Ala Ser His Met Gly Leu
115 120 125
Phe Ile Glu Ile Pro Thr Ile Gly Val Ala Lys Ser Arg Leu Tyr Gly
130 135 140
Thr Phe Lys Met Pro Glu Asp Lys Arg Cys Ser Trp Ser Tyr Leu Tyr
145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
Lys Arg Leu Ile Lys Ala Phe Thr Leu Pro Gly Arg Arg Ile Pro Glu
195 200 205
Pro Thr Arg Leu Ala His Ile Tyr Thr Gln Arg Leu Lys Lys Gly Leu
210 215 220
Phe
225
Claims (10)
1.突变的底物特异的核酸内切酶V，其为氨基酸序列为SEQ IDNO：11的野生型海栖热袍菌核酸内切酶V的突变体，不显示非特异的核酸切割活性，但显示脱氧肌苷特异的核酸切割活性；其中，
构成所述突变体的氨基酸序列与构成野生型海栖热袍菌核酸内切酶V的氨基酸序列SEQ ID NO：11一致，除了在该野生型氨基酸序列的(a)第80位氨基酸位点处的氨基酸被突变为Ala，以及(b)第105位氨基酸位点处的氨基酸被突变为Ala。
2.权利要求1所述的特异的核酸内切酶V，其是热稳定性的。
3.权利要求1所述的特异的核酸内切酶V，其氨基酸序列为SEQ IDNO：1。
4.特异的核酸内切酶V基因，其编码权利要求1所述的核酸内切酶V。
5.权利要求4所述的特异的核酸内切酶V基因，其碱基序列由SEQID NO：2构成。
6.重组DNA，其包括载体DNA和插入其中的权利要求4或5所述的特异的核酸内切酶V基因。
7.转化体或转导体，其包括权利要求6所述的重组DNA。
8.生产特异的核酸内切酶V的方法，其包括在培养基中培养权利要求7所述的转化体或转导体，并且从培养物中收集特异的核酸内切酶V。
9.核酸切割方法，其包括利用权利要求1所述的特异的核酸内切酶V。
10.检测或修饰核酸或基因的试剂盒，其至少含有权利要求1所述的特异的核酸内切酶V。
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|---|---|---|---|---|
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| Hong Feng et al.Defining amino acid residues involved in DNA-protein interactions and revelation of 3"-exonuclease acitivity in endonuclease V.《Biochemistry》.2005,Vol.44(No.34),11486-11495. * |
| HongFengetal.DefiningaminoacidresiduesinvolvedinDNA-proteininteractionsandrevelationof3"-exonucleaseacitivityinendonucleaseV.《Biochemistry》.2005 Vol.44(No.34) |
| Jianmin Huang et al.Mutational analysis of endonuclease V from Thermotoga maritima.《Biochemistry》.2002,Vol.41(No.26),8342-8350. * |
| JianminHuangetal.MutationalanalysisofendonucleaseVfromThermotogamaritima.《Biochemistry》.2002 Vol.41(No.26) |
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