CN1960756A - 细胞介导的细胞毒作用证明细胞膜表面表达cd63 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及应用肿瘤性疾病可修饰性抗体(CDMAB)7BD－33－11A治疗人体肿瘤，以及分离和确定表达CD63抗原部分的肿瘤细胞。能与该抗原部分结合的7BD－33－11A单抗(ATCC登录号PTA－4890)对表达CD63抗原部分的细胞具有细胞毒性作用。7BD－33－11A单抗能够有助于延缓人体肿瘤的进展。

Description

细胞介导的细胞毒作用证明细胞膜表面表达CD63
技术领域
本发明涉及肿瘤性疾病的诊断和治疗，特别是肿瘤细胞毒作用的介导最主要是涉及肿瘤性疾病可修饰性抗体(cancerous diseasemodifying antibodies，CDMAB)的应用，可选择地，结合一种或多种化疗药物，作为诱发肿瘤细胞毒性反应的手段。本发明还涉及了利用当前已有的CDMAB进行的结合试验。
背景技术
CD63属于四次跨膜超家族中的三型膜蛋白，该家族目前共20个成员，特点是均具有四个跨膜结构。几个工作组通过将抗体分别加入预先活化的血小板、中性粒细胞和黑色素瘤细胞样品内的方法，各自独立地确定了细胞膜上CD63的表达。对这组同源糖蛋白抗原的cDNA进行克隆后证明这些不同细胞上的抗原为同一种分子。1996年，第六次国际白细胞分型研讨会(The Sixth InternationalWorkshop on Leukocyte Typing)将该抗体归类为CD63抗体。在此之前，CD63曾被称为：黑色素瘤1抗原、眼黑色素瘤相关抗原、黑色素瘤相关抗原ME491、溶酶体相关膜糖蛋白3、guanulophysin、黑色素相关抗原MLA1，这些命名往往和导致发现其部分特性以及抗原识别的抗体有关。因此，CD63也曾经被指定为ME491抗原(MAbME491)、神经腺(neuroglandular)抗原(MAbs LS59，LS62，LS76，LS113，LS140，LS152)、血小板gp40(MAbs H5C6，H4F8和H5D2)、人类骨髓基质细胞抗原(MAb 12F12)、骨原细胞特异性标志物(MAbHOP-26)和整合素相关蛋白(MAb 6H1)。目前发现其他能够与人体CD63产生交叉反应的抗体有8-1H，8-2A(与ME491产生交叉反应)、NKI/C-3和NKI/black-13(Vannegoor and Rumke，1986；Demetricket al.，1992；Wang et al.，1992)。
研究人员用人体黑色素瘤细胞众多抗体的一种，即MAb ME491，从黑色素瘤细胞的互补DNA文库中最先克隆出了CD63。人体黑色素瘤活检研究表明：MAb ME491的活性似与黑色素瘤的进展呈负相关。在正常黑色素细胞中，MAb ME491活性低，在黑色素瘤早期进展阶段(包括发育不良痣和放射生长期(radial growth phase，RGP)肿瘤)抗体活性升高，黑色素瘤继续进展，例如垂直生长期(vertialgrowth phase，VGP)和转移性肿瘤，MAb ME491活性则下降甚至丧失活性。
研究人员应用MAb2.28(抗活化血小板抗体)，发现了人体血小板表面特征性CD63的表达，并进行了部分定性，检测到了该抗体依赖于血小板膜糖蛋白(53kDa)的活性作用。此血小板膜糖蛋白也与未活化血小板内部颗粒膜成分有关。同一研究中，MAb2.28也用于标记巨核细胞和内皮细胞的内部颗粒，在颗粒上同时集聚有组织蛋白酶D抗体，后者为公认的溶酶体抗体。接下来关于抗体簇聚集和克隆表达的研究，证明CD63与溶酶体膜相关蛋白LAMP1和LAMP2共同表达于溶酶体膜上。分子克隆鉴定该分子确为CD63，属于四次跨膜超家族。
许多不同组织和细胞上都能够检测到CD63表达。在细胞水平，人们发现其与细胞膜有关，也和细胞内后期形成包涵体的囊状结构有关。某些情况下，细胞活化导致细胞内储备的CD63向细胞膜表面移动。在生理上，CD63与B淋巴细胞的MHC-II类分子有关，主要是通过在内体、外体以及排泌小泡的表达参与MHC-II复合物转运到细胞表面的过程。人们还发现CD63与其他四次跨膜超家族分子之间存在相互作用，例如CD9、CD81、CD11(integrin chainl αM，L，X)、CD18(integrin chain β2)、CD49c(VLA-3或integrin chain α3)、CD49d(integrin chain α4)、CD49f(VLA-6或integrin chain α6)和CD29(integrin chain β1)，B、T淋巴细胞，中性粒细胞，乳腺癌和黑色素瘤细胞等很多类型细胞中均可见到这种相互作用。
CD63在肿瘤性疾病中的作用还不是很清楚。尽管最初由几个相互独立的工作组发现CD63参与血小板和中性粒细胞活化、MHC-II类抗原提呈、整合素依赖性细胞粘附和运动以及某些肿瘤的恶性进展，但其功能还有待进一步充分阐述。虽然目前有证据支持CD63在各种细胞生理事件中的作用，可是还不清楚的是：在CD63参与的各种事件过程中，它所起的作用是互相独立的还是具有潜在的共同细胞学机制？
几个工作组已经研究了CD63和某些类型肿瘤进展之间的关系，特别是与黑色素瘤进展之间的关系。除Mab ME491之外，还研发了多种抗CD63单克隆抗体(以下简称单抗)应用于对不同进展阶段肿瘤患者的肿瘤标本进行免疫组化(immunohistochemical，IHC)染色。研究人员观察到：着色浅通常提示CD63低表达，并与肿瘤进展和转移性有关。更近期一项研究也描述了包括CD63在内的几个四次跨膜超家族成员(mRNA定量)表达水平明显下调与几种乳腺癌衍生的细胞体外侵袭性的显著相关关系。另外一项研究通过差异显示法证实培养的乳腺癌细胞在雌激素减少情况下，癌细胞表达CD63。这说明CD63的表达受到激素水平的调节，并由此改变CD63量和/或功能而影响乳腺癌的进展。
与之相比，MAb FC-5.01抗CD63单抗的研究揭示了其活性表位在不同正常组织上表达不同。尽管该抗体能识别CD63，但并不能区分早期和进展期黑色素瘤，包括转移性黑色素瘤(这点与MAb ME491不同)，这表明CD63抗原曾经在这些进展程度较高的肿瘤细胞上表达，但是在肿瘤的不同进展阶段，在细胞内，其某些表位被掩盖了。可能原因是改变了CD63核心多肽的翻译后修饰，或是由于CD63和其他分子的相互作用，影响了抗体识别和特异性结合所需的特殊表位。这些研究结果支持1993年Si和Hersey所报告的观察结果，他们用MAb NKI-C3抗CD63单抗进行染色，结果在组织切片上不能区分不同进展阶段的黑色素瘤，例如早期，放射生长期和垂直生长期，以及转移性黑色素瘤。1998年Adachi和Huang等研究分析从乳腺癌和非小细胞性肺癌细胞中提取的mRNA，通过PCR定量，发现四次跨膜分子超家族中的两个成员，包括CD9和CD82，它们的表达水平与肿瘤进展和患者预后存在明显的相关关系，CD63在所有的样本中表达都是相似的，因此不存在这种相关关系。由于上述试验结果存在明显矛盾，因此并无有力和一致的数据资料能够明确证明CD63和肿瘤之间的关系。
到目前为止，很少数体内研究试验试图建立一种CD63与该分子可能存在的对晚期肿瘤的抑制作用之间的联系。其中一项研究中，人CD63过度表达的H-RAS转化的NIH-3T3细胞经皮下和腹腔注射给无胸腺小鼠，与亲代CD63非过度表达小鼠细胞比较，结果显示前者肿瘤体积缩小，生存期延长，潜在的转移性下降，产生了肿瘤趋恶性/发生性均降低的小鼠表型。这表明经过转基因的细胞，CD63的表达能够抑制人体肿瘤细胞的恶性行为。更近期研究工作中，利用转基因小鼠模型表达人CD63，诱导小鼠对人CD63产生耐受，再给予注射人CD63-MHC-I类分子(H-2Kb)共转染鼠黑色素瘤细胞，肿瘤细胞的生长能够被抑制，小鼠生存期延长；基于此项研究，可以用痘病毒融合人CD63进行免疫接种。该研究作者指出：由于肿瘤生长的抑制作用仅仅存在于CD63-MHC-I类分子共转染细胞，而不是CD63单独转染细胞，所以这种治疗作用是T淋巴细胞依赖性的，内源性抗CD63单抗似乎并未参与保护作用。预先经人CD63免疫的野生型动物，产生抗CD63抗体支持这种解释，因为免疫动物并没有产生对肿瘤细胞生长的保护性抑制作用。1995年，Radford等用人CD63转染KM3细胞(最初认为是人源，后来定性为鼠源)，表明当皮内注射肿瘤细胞至无胸腺小鼠时，与未转染的KM3亲代细胞比较，该种蛋白的表达减慢了肿瘤细胞生长和恶性化进程，尽管在体外试验中，各种转染和未转染细胞生长率并无显著性差异。这些观察说明CD63的潜在作用和其他已知的肿瘤抑制基因在体内和体外对肿瘤细胞的作用不相同。此外，1997年Radford等发现，在体外试验中，抗CD63单抗ME491对同种细胞的作用是通过减少细胞随机运动，而不是影响细胞生长速度。
这项研究还描述了如下观察：在细胞外基质(ECM)衍生的趋化因子作用下，CD63能刺激细胞运动，这些趋化因子包括：层粘连蛋白、纤维连接蛋白、胶原和玻璃粘连蛋白。CD63的这种功能可能由β1整合素介导，尽管整合素抗体并不能够阻断这种作用。然而，玻璃粘连蛋白介导的信号传导(已知为整合素αvβ5的配体)，似乎与CD63转染细胞上ECM成分包括层粘连蛋白、纤维连接蛋白合胶原所介导的信号传导作用之间存在相互拮抗作用。这提示在ECM同时存在的特殊条件下，CD63的表达能导致细胞迁移能力下降，这种迁移能力主要依赖于细胞粘附和运动之间的平衡。另一项研究中，抗CD63单抗(MAb 710F)提高了经过PMA处理后HL-60细胞的粘附性和伸展性，抗CD63单抗(Mab 2.28)能刺激产生类似作用，只是受刺激细胞所占比例小，而且需要加入的抗体量更多。这些结果说明：尽管目前已经研发了多种抗CD63抗体，但是它们的功能可能存在很大区别。
四次跨膜超家族可能也参与了细胞增殖。1990年，Oren等描述了鼠MAb 5A6通过识别淋巴细胞CD81(TAPA-1)而产生抗增殖作用。另一个研究中，通过将抗体和人类T淋巴细胞CD37连接阻断了CD37诱导的细胞增殖。在更为近期的一项通过CD37基因敲除获得的CD37缺失小鼠动物模型研究中，比较缺失小鼠和野生鼠分别对刀豆蛋白A激活后产生的增殖反应，以及CD3受体参与的T淋巴细胞反应，显示基因敲除小鼠T淋巴细胞高度增殖。因此提出：四次跨膜超家族可能具有参与细胞生长和增殖的共同特性。最近关于肝母细胞癌和肝细胞癌研究中显示，如果在上述癌细胞中加入抗CD81单抗能活化Erk/MAP激酶途径。已经证实此信号转导途径参与细胞生长和增殖过程。平行研究中也表明，经过转染过度表达人CD81的细胞和模拟转染对照组比较显示出增殖下降。因此相关证据已经指出，四次跨膜超家族分子，尤其是CD63在细胞生长和增殖、粘附和运动过程中起着重要的作用。这两类细胞事件是目前研究的重要靶点，因其在肿瘤进展和转移过程中起着中心作用。
目前为止，还没有报导抗CD63抗体或者其它药物能够特异性针对CD63表达的细胞，同时影响人体肿瘤细胞体内和体外生长特性，或是影响肿瘤细胞生长动物模型的生存期。
氨基酸序列测定和分析未能揭示四次跨膜超家族与其它蛋白质家族或任何以前已经定性的功能分子之间的同源性，也未能显示其具有目前任何已知酶活性。结果，人们很难研究该蛋白质家族分子在信号转导途径中的调节作用。不管怎样，有证据说明，应用四次跨膜超家族特异性药物能改变细胞生理过程，这一改变和信号转导途径存在密切的依赖关系，表明了四次跨膜超家族具有信号转导特性。CD63在生理和/或功能上均显示出与本身是酶并且参与次级信号转导，或者一系列与在生理和/或功能上有相似功能的酶有关分子之间的联系。
中性粒细胞和内皮细胞之间的相互作用是炎症反应的起始步骤之一，研究其相互作用机制的试验表明，预先经过抗CD63单抗(AHN-16、AHN-16.1、AHN-16.2、AHN-16.3和AHN-16.5)处理，能刺激中性粒细胞对培养内皮细胞层的粘附。这种作用具有强钙离子依赖性，众所周知，钙离子是多种细胞间信号转导途径的调节因子，它作用于抗体刺激细胞后的特定阶段。经过与抗体较长时间的相互作用，中性粒细胞对内皮细胞的粘附作用开始对后来加入的钙离子敏感，提示这是动态一过性的调节。此外，在生理上CD63和CD11/CD18复合物相互作用，特异性靶向作用于此复合物的药物也能介导信号转导。这项研究中还发现，在生理上，CD63和酪氨酸激酶Lck和Hck有关，或者其本身就是该酶的一部分。酪氨酸激酶是一类蛋白质的组成成员，这些激酶在细胞表面受体活化后，参与介导调节细胞间信号传导，因其特殊的细胞生理改变。另一项研究也表明，四次跨膜超家族(包括CD63)的配体和单抗结合后，能够增强MDA-MB-231乳腺癌细胞对胶原底物的磷酸化和FAK(focal adhesionkinase)激酶活性。这指出了CD63以及其它四次跨膜超家族成员在整合素介导的酪氨酸激酶信号转导途径中的直接调节作用。其它在功能上与CD63结合抗CD63单抗MAb 710F后能产生交叉作用的信号转导通路是PKC(protein kinase C，蛋白激酶C)调节的磷酸化途径，这也是另外一个人们已经很熟知的细胞内信号通路。在本文内，MAb 710F作用于HL-60，骨髓细胞的粘附性增强以及形态学改变均依赖于对细胞所进行的PMA(phorbol myristate acetate，豆蔻酸-佛波醇-乙酸酯)预处理，但PKC的一过性参与作用并没有能够得到最终证实。尽管如此，后来一独立工作组的研究中证明了PMA诱导的HL-60分化是PKC活性依赖性的，其原因是Ro31-8220为PKC的抑制因子，阻断了PMA的作用。
进一步的证据也支持CD63以及其它四次跨膜超家族和信号转导通路的关系，这些证据来源于CD63(和CD53)分子本身直接或是做为超分子复合物的一部分与酪氨酸磷酸化激酶活性之间的生理关系研究工作。研究中，利用抗CD63抗体分离的免疫沉积复合物与酪氨酸磷酸酶活性有关，研究者无法识别CD63有关的磷酸酶，CD53则与酪氨酸磷酸酶CD45有关，在这点上两者存在不同。最近研究发现，几个四次跨膜超家族的成员与II型PI4-K(phosphatidylinositol4-kinase(磷脂酰肌醇4激酶)，Berditchevski et al.，1997)有关。这种相互作用似乎很特别，因为仅仅在CD9、CD63、CD81、CD151和A15/TALLA中得到了证实，在CD37、CD52、CD82和NAG-2中并没有发现。另外，由于PI4-K复合物仅限于个别四次跨膜超家族成员，所以四次跨膜超家族成员和PI4-K之间的作用似乎是互相排斥的。特别的，CD63-PI4-K复合物，和其它四次跨膜超家族成员不同，该复合物几乎完全位于细胞内具有脂阀样结构域的小体上。这一观察说明CD63与PI4-K的相互作用可能参与了细胞内的特殊事件(Claas，C，et al.，2001)，这些事件与磷酸肌醇的生物合成途径有关或依赖于其合成，众所周知，磷酸肌醇除了是重要的次级信号传导分子外，还参与细胞膜转运(内吞和胞吐)以及细胞骨架的重组过程(Martin，T.，1998)。
到目前为止发现的和CD63有直接相关关系的酶，以及酶在信号转导通路中的调节作用，提供了更进一步的证据来支持CD63在信号转导通路中的调节作用；CD63既可以调节酶活性也可以做为酶的下游效应分子。
由于很多观察结果的矛盾性，努力去详细阐述肿瘤进展的机制非常困难和复杂，因此很少有人能够把试验观察结果成功的转化成临床治疗方案。鉴于目前已知的关于CD63和肿瘤进展和转移以及信号转导机制之间的关系人们有可能在肿瘤细胞内改变CD63的功能。
研发一种抗原特异性肿瘤细胞毒药物具有极大的好处，因为该药物能够做为肿瘤性疾病的诊断工具和潜在治疗方法。这种药物能够通过本身或者是结合其它分子后识别并结合细胞上表达的抗原，产生细胞或体内的生理活性，从而抑制肿瘤细胞生长、进展和转移，同时对正常人体细胞则无明显的损伤作用。
在先专利US05296348介绍了选择特异性识别肿瘤细胞表面内化抗原的单抗，以及识别在细胞代谢中具有对抗转录和/或复制的单抗的方法。其中举例为：ME491抗体在W9、WM35和WM983黑色素瘤细胞以及SW948结直肠癌细胞能被内化。此外该抗体还能减慢SW948细胞转录和细胞增殖。专利申请US20030211498A1(以及相关申请包括WO0175177A3、WO0175177A2、AU0153140A5)确定了一种方法，通过抗体结合卵巢癌标志性多肽抑制肿瘤的生长和转移，这种多肽由一组包括CD63抗原基因的基因组编码。应用卵巢癌基因表达序列分析法对卵巢癌的标志基因进行检测结果发现CD63抗原基因包含于其中。专利申请WO02055551A1(以及相关申请CN1364803A)确定了一种新型多肽，即人CD63抗原56.87。专利申请CN1326962A确定了人CD63抗原15.07。专利CN1351054A确定了人CD63抗原11.11。这些专利和专利申请均确定了CD63抗原和抗体，但是未说明目前研究中分离出的单抗的用途。
发明内容
目前已经获得授权的美国专利6,180,357号的发明人，把命名为“病人个体化特异性抗肿瘤抗体”直接应用于选择个体化常规抗肿瘤抗体，这种抗肿瘤抗体有助于治疗肿瘤性疾病。就本文来说，“抗体”和“单抗”可以互相交换使用，都是指由杂交瘤细胞(例如人或鼠)产生的完整的免疫球蛋白，免疫结合物，更确切的说是由上述免疫球蛋白衍生的免疫球蛋白片断和重组蛋白，例如嵌合体和人源化免疫球蛋白、F(ab’)和F(ab’)2片断、抗体单链、重组免疫球蛋白可变区(Fv)s和融合蛋白等。从文献中已知，多肽中的某些氨基酸序列改变不引起蛋白质结构和功能显著变化。在抗体的分子重组过程中，免疫球蛋白骨架区核苷酸或氨基酸的修饰通常能够被耐受，修饰包括替代(首选保守替代)、缺失和插入，但并不局限于这三种方式。此外，使用目前研发的CDMAB结合标准化疗方法例如放射性核素法也属于此项发明范围，因此上述化疗方法的使用也是治疗关注的焦点。CDMAB还能结合毒素、半毒素、酶(例如生物素结合酶)和血细胞，形成抗体结合物。本专利申请应用专利’357中介绍的分离能够产生可修饰性肿瘤性疾病单抗的杂交瘤细胞的方法，用以生产病人特异性抗肿瘤抗体。这些抗体可以特异性应用于一种肿瘤或者可能成为肿瘤治疗的常规方法。在本专利申请中，抗肿瘤抗体的特性是具有杀死细胞的细胞毒性作用或者细胞生长抑制作用，两者都是指细胞毒作用。这些抗体可用于肿瘤分期和诊断，亦可治疗转移性肿瘤。
这种个体化抗肿瘤治疗前景将会改变目前肿瘤患者的治疗模式。可能的临床状况是，在肿瘤患者初次就诊时即采取肿瘤标本并贮存于标本库中。利用该标本，应用系列预先储存的可修饰性抗体，能对该患者肿瘤进行分型。可以按经典方法对患者进行分期，但是应用抗体则能对其进一步分期。患者在就诊后可立即接受预成抗体和/或对肿瘤细胞敏感的系列抗体治疗。抗体获得方法包括这里列举的方法或者通过结合筛选法(screening methods)应用于噬菌体展示库的方法。有一种可能性，即经过治疗后的肿瘤表位可能会被具相同表位的其他肿瘤细胞所耐受，因此产生的全部抗体均应加入抗肿瘤细胞抗体库。通过这种方法产生的抗体对于任何能与抗体结合的任何肿瘤性疾病患者可能均有效。
按照US 6,180,357的方法步骤，如同在S.N.10/348,231中介绍的那样，应用乳腺癌患者的肿瘤组织活检所获得的肿瘤细胞免疫小鼠能够获得鼠7BD-33-11A单抗。7BD-33-11A抗原广泛表达在人体内不同来源组织细胞表面。体外试验中，在乳腺癌细胞MCF-7和前列腺癌细胞PC-3均对7BD-33-11A的细胞毒性作用存在易感性。
7BD-33-11A对乳腺癌和前列腺癌培养细胞的细胞毒性作用进一步扩展应用于它在体内可能存在的抗肿瘤活性(如美国申请.10/348,231号和10/603,006号中介绍)。前期临床异种移植肿瘤模型明确提示治疗有效。
如同在美国申请10/348,284和10/603,006号中介绍的那样，7BD-33-11A在体内人乳腺癌肿瘤模型中具有抑制肿瘤生长、减轻肿瘤负荷的作用。治疗后连续观察300天，7BD-33-11A没有加重肿瘤进展，在瘤细胞植入后9月治疗组存活率为87.5％。相反地，同种型对照组在试验第72天时(给药后第23天)死亡率为100％。因此认为7BD-33-11A能够延长乳腺癌肿瘤动物模型的生存期，并且能抑制肿瘤生长(延缓肿瘤进展)。
美国申请10/348,284和10/603,006还列举并描述如下：建立人乳腺癌体内试验模型，7BD-33-11A具有显著抑制肿瘤生长和延缓肿瘤进展的作用。在试验第80天(给药后第23天)，7BD-33-11A治疗组和缓冲液对照组小鼠比较，治疗组比对照组肿瘤体积小83％(p＝0.001)；用存活率判断疗效，给药第60天时，治疗组的死亡危险仅为对照组的16％。同种型对照组在给药后第50天死亡率为100％。与之相比，给药后第130天，7BD-33-11A治疗组小鼠存活率为60％。这些数据结果说明7BD-33-11A治疗组和对照组比较，前者显示对延长生存期和延缓肿瘤进展的有益作用。7BD-33-11A治疗是安全的，因为并没有导致任何包括体重下降和临床精神抑郁等毒性副作用；7BD-33-11A治疗也是有效的，因为在人乳腺癌体内动物试验模型中，和对照组比较，它能够减慢肿瘤生长和延长生存期。
通过两个不同的乳腺癌异种移植模型试验来判定比较单独使用化疗药顺铂以及顺铂联合7BD-33-11的治疗效果。MDA-MB-231(MB-231)模型中，结果显示，试验第69天(给药后第5天)，7BD-33-11A治疗组肿瘤生长比缓冲液对照组慢76％(p＜0.001)。顺铂治疗组和顺铂联合7BD-33-11A治疗组与缓冲液对照组比较，前两组小鼠肿瘤体积分别缩小了79％和86％(p＜0.001)。MDA-MB-468(MB-468)模型中，于试验第55天(给药后第5天)，顺铂治疗组和顺铂联合7BD-33-11A治疗组分别显示出最好的肿瘤缩小效果，两组分别为95％(p＝0.024)和97％(p＝0.17)。7BD-33-11A治疗组在试验第55天时与缓冲液对照组比较，显示肿瘤体积缩小了37％。MB-231和MB-468模型中，测量试验小鼠体重并进行比较，7BD-33-11A比顺铂治疗后显示出更好的生存状态。试验结果表明MB-231模型中，7BD-33-11A和顺铂比较，前者更容易被耐受，7BD-33-11A治疗几乎没有体重下降等副反应，显示出更好的疗效，而顺铂在两种乳腺癌模型中均引起明显体重下降。
为了明确7BD-33-11A的最佳有效剂量，研究人员应用乳腺癌异种移植模型进行了药物剂量反应试验。在试验第55天(给药后第5天)，0.2mg/kg治疗组为同种型对照组肿瘤生长的85％。同一时间，2.0mg/kg和20mg/kg治疗组没有肿瘤生长。试验第125天(给药后第75天)呈现类似的结果，此时20mg/kg治疗组仍旧没有肿瘤生长，但2.0mg/kg治疗组可见早期肿瘤生长。7BD-33-11A治疗也证明其具有延长动物生存期的作用。同种型对照组小鼠在试验第104天(给药后第54天)全部死亡，然而0.2mg/kg治疗组全部存活直到第197天(给药后第147天)。2.0kg/kg和20mg/kg治疗组显示出对于生存期更好的作用，试验第290天(给药后第240天)2.0mg/kg治疗组只有50％小鼠死亡，20mg/kg治疗组则无一例死亡。因此不同剂量7BD-33-11A三个治疗组均表现出良好的减慢肿瘤生长和延长生存期的作用，20mg/kg治疗组具最佳疗效。
7BD-33-11A除了在乳腺癌肿瘤细胞体内试验模型中显示出有益作用外，在前列腺癌体内动物试验模型中(S.N.10/603,006)，也显示了其对PC-3细胞的抗瘤活性。与同种型对照抗体组比较，7BD-33-11A在治疗开始后不久即表现出显著抑制肿瘤细胞生长的作用(p＝0.001)。在治疗期末，7BD-33-11A治疗组小鼠肿瘤体积仅为同种型对照组的31％。对PC-3重症联合免疫缺陷异种移植动物模型而言，体重可用做疾病进展的替代指标。试验第52天，7BD-33-11A治疗组与同种型对照组比较显著预防其体重下降54％(p＝0.002)。监测小鼠的生存期，治疗开始后11天，同型对照组和缓冲液对照组小鼠死亡率为100％。与之相反，7BD-33-11A治疗组在治疗开始后第38天死亡率才达100％，生存时间为对照组的三倍。因此7BD-33-11A治疗是有效的，因为在人前列腺癌试验模型中，和同种型对照组比较7BD-33-11A能同时减慢肿瘤生长，预防体重下降和延长存活期。
除了在上述前列腺癌体内肿瘤模型中的预防作用外，人们在体内肿瘤模型试验中也证明了7BD-33-11A对PC-3细胞的抗瘤活性(S.N.10/603,006)。在治疗开始后立即测量肿瘤平均体积，7BD-33-11A治疗组与同种型对照组比较，治疗组肿瘤体积显著小于同型对照组(p＜0.024)。治疗组与同种型对照组比较显示前者肿瘤抑制达36％。7BD-33-11A在几个不同的肿瘤模型中所表现除的抗瘤活性，使其成为一个颇具吸引力的抗肿瘤药物。
正常人体组织表达的7BD-33-11A已经预先确定(S.N.10/603,006)，为了确定7BD-33-11A做为药物其作用靶点表位。通过将其与商业化抗CD63抗体(RFAC4和H5C6)进行比较使得该方面研究得以进展。组织染色结果表明7BD-33-11A限制性结合于不同细胞类型，其中包括浸润巨噬细胞、淋巴细胞和成纤维细胞。RFAC4和H5C6抗体比较，染色图像结果相类似。然而RFAC4和H5C6的染色图像和7BD-33-11A比较则完全不同。特别地，RFAC4和H5C6抗体均广泛结合于正常组织，在7BD-33-11A染色同时阳性的组织，它们的染色更强。RFAC4和H5C6不仅仅结合于浸润巨噬细胞、淋巴细胞和成纤维细胞，也结合于大多数组织中的内皮细胞。
对7BD-33-11A抗原进行定位，确定其在人群中的表达率，例如在乳腺癌患者中的表达率，这对评价7BD-33-11A的疗效以及设计更好的临床试验很重要。为了定位乳腺癌患者肿瘤细胞上7BD-33-11A抗原表达的部位，预先筛选了50例乳腺癌患者的肿瘤组织标本用于定位7BD-33-11A的表达部位(S.N.10/603,006)。目前的研究工作比较了7BD-33-11A与RFAC4和H5C6、抗Her2抗体(c-erbB-2)的染色特点。其结果与之前的研究相类似，显示有36％的肿瘤组织标本7BD-33-11A抗原染色阳性，H5C6和RFAC4则分别为94％和85％。由于7BD-33-11A染色局限于恶性细胞上因此考虑它是肿瘤细胞特异性的。此外，在乳腺癌患者的10份正常组织标本染色中7BD-33-11A均为阴性，H5C6和RFAC4则分别有7份和8份标本染色阳性。乳腺癌细胞表达7BD-33-11A的部位位于恶性细胞的细胞膜上和胞浆内，因此使CD63成为肿瘤治疗中较具吸引力的靶点。人们在乳腺癌细胞雌激素和黄体酮受体表达水平的基础上进一步评估了7BD-33-11A的表达，这些激素受体的表达在乳腺癌的发展、治疗以及预后方面起着重要的作用。在上述激素受体和7BD-33-11A的表达之间存在轻微相关关系，有受体表达的组织7BD-33-11A表达有轻度升高。如果在肿瘤分期和进展程度方面进行分析，结果是肿瘤进展程度越高则7BD-33-11A表达越强。类似结果也见于RFAC4。H5C6虽然显示出和激素受体表达之间的轻微相关关系，但是和肿瘤进展阶段无明显相关。然而对于三种抗体来说，结果都受到样本量小的限制。与c-erbB-2比较7BD-33-11A显示出完全不同的染色图像7BD-33-11A阳性标本中有一半Her-2表达阴性，这提示乳腺癌患者靶向治疗需要未被完全满足。两者染色都阳性的肿瘤组织切染色强度上仍旧存在不同。在一份正常乳腺组织切片c-erbB-2染色也为阳性。
在前列腺癌患者中定位7BD-33-11A的表达部位以及确定人群表达率也是很重要的，主要是用于评估7BD-33-11A对于前列腺癌患者的免疫治疗效果和设计有效的临床试验。预先筛选51例前列腺癌患者的肿瘤组织标本用以定位7BD-33-11A的表达部位。研究结果显示88％组织标本7BD-33-11A染色阳性。尽管7BD-33-11A在正常组织也有高表达，但是和正常组织比较，肿瘤组织标本上细胞膜染色强度较高。一例胚胎横纹肌肉瘤组织7BD-33-11A抗原染色阴性。似乎在肿瘤进展阶段和7BD-33-11A抗原表达之间并不存在直接相关关系。但是该结果仍受到样本量小的限制。
为了进一步扩展了解7BD-33-11A的潜在治疗作用，人体不同肿瘤组织中该抗原出现频率和部位均经过预先确定(S.N.10/603,006)。除了乳腺癌和前列腺癌之外，其它部位的不同类型肿瘤也表达7BD-33-11A，染色阳性的人类肿瘤组织类型包括皮肤(1/2)，肺(3/4)，肝(2/3)，胃(4/5)，甲状腺(2/2)，子宫(4/4)和肾脏(3/3)。某些肿瘤不表达抗原，其中包括卵巢(0/3)，睾丸(0/1)，脑(0/2)和淋巴结(0/2)。和人乳腺癌和前列腺癌肿瘤组织一样，7BD-33-11A同时表达在肿瘤细胞膜上和胞浆内。因此，7BD-33-11A抗体除了在体外能够结合在肿瘤细胞上，也有证据说明抗原能够在人体多种类型的肿瘤细胞上表达。
如下所列举，另有生物化学数据也支持7BD-33-11A识别的抗原是CD63。研究表明，两种抗CD63单抗(RFAC4和H5C6)，通过免疫沉淀法确定了7BD-33-11A识别并结合的蛋白。另外，细菌表达研究进一步阐明了7BD-33-11A结合CD63细胞外loop2部位。7BD-33-11A表位为构象依赖性。这些免疫组化染色和生物化学结果证实了7BD-33-11A结合于CD63抗原。因此有大量的证据表明7BD-33-11A介导的抗肿瘤作用是通过和CD63上独特的构想表位相连接有关。对于本文而言，表位指的是CD63抗原的一部分，其特点是能够和7BD-33-11A杂交瘤细胞产生的单抗结合，也可与抗原结合片断或者抗体结合物相结合。
总的来说，上述数据结果证明了7BD-33-11A抗原是肿瘤相关抗原，在人体中表达，病理学上相应的是肿瘤治疗靶点。同时也证明7BD-33-11A抗体与人体肿瘤组织相结合，合理应用于检验能够辅助诊断、早期治疗和判断预后。此外，该抗原在细胞膜上的表达部位能提示瘤细胞状态，因为多数非恶性细胞均不表达此抗原。这种观察结果有助于应用此抗原，及其基因以及衍生物，蛋白质或者是变异成分，用于肿瘤性疾病的诊断，早期治疗和预后判断。
本文介绍了7BD-33-11A的进展和应用，这是美国专利6,180,357所介绍内容的进一步发展，内容包括7BD-33-11A识别，作用了解以及细胞毒试验，已建立或未建立的肿瘤生长动物模型以及肿瘤性疾病生存期观察。该发明代表了肿瘤治疗领域的新进展，首次描述了一种能够特异性与表达在肿瘤细胞上的靶分子CD63表位相结合的药物，同时介绍了其在体外对恶性肿瘤细胞而不是正常细胞的细胞毒性特点，该药物在人肿瘤体内模型中能够直接抑制肿瘤生长，延长生存期。说这是一项发明进展是由于之前任何关于抗CD63抗体的描述均无类似特点。它第一次清楚的证明了CD63在某些类型肿瘤中参与其生长和进展过程。它还提出了肿瘤治疗的一个潜在发展，即在人类肿瘤患者中它也具有类似的抗肿瘤特性。更深一层意义，将此抗体加入抗肿瘤抗体库，将会增加一种可能性，这种可能性是指针对肿瘤细胞表达的不同抗原标志物，来确定不同肿瘤细胞的适合抗体，以便能发现最有效针对抑制肿瘤生长和进展的抗体。
总的来说，本发明介绍了应用7BD-33-11A抗原做为药物治疗的靶抗原，使用后能够减轻哺乳动物肿瘤因表达该肿瘤抗原所引起的肿瘤负荷，延长接受治疗动物的生存期。本发明还介绍了CDMAB(7BD-33-11A)及其衍生物、抗原结合片断的使用，具有与7BD-33-11A相同的作用。此外，本发明还介绍了肿瘤细胞内7BD-33-11A的检测能够用于哺乳动物中表达此抗原的肿瘤性疾病的诊断、早期治疗和预后判断。
如果患者在治疗后病情难以控制或者肿瘤进展，那么在肿瘤治疗过程中产生的肿瘤特异性抗体能够重复用于肿瘤再次治疗阶段。而且，可以将患者或者是适合的供者红细胞和抗肿瘤抗体相连接，再次注入肿瘤转移患者体内。转移性肿瘤几乎没有有效的治疗方案，一旦转移则通常预示最终死亡的不良结局。然而，转移性肿瘤通常具有良好的血液供应，利用红细胞运送抗肿瘤抗体能够使抗体集中作用于肿瘤部位。即使在没有转移情况下，多数肿瘤细胞存活也需要依赖于患者的血液供应，因此红细胞结合抗体对于原位肿瘤也是有效的。抗体也可以连接于其他血细胞上，例如淋巴细胞、巨噬细胞、单核细胞、自然杀伤细胞等。
抗体分为五类，每种抗体由于其重链不同而具有不同的功能。通常认为，肿瘤细胞的杀伤是通过抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(ADCC)或者是补体依赖的细胞毒作用(CDC)。例如，鼠IgM和IgG2a抗体和补体C1结合能活化补体系统经典途径引起肿瘤细胞溶解。人类抗体中，IgM和IgG1具有较强的补体激活作用。鼠IgG2a和IgG3同种型能够招募携带Fc受体的细胞毒细胞，并由此介导单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和某些淋巴细胞的肿瘤细胞杀伤作用。人IgG1和IgG3同种型能够介导ADCC。
另外一个抗体介导肿瘤细胞杀伤作用的可能机制为使用具有催化作用的抗体催化细胞膜上各种化学键以及相关糖蛋白和糖脂的水解，这种抗体称为催化抗体。
另外两个广泛接受的抗体介导肿瘤细胞杀伤作用的可能机制为：第一，利用抗体作为疫苗诱导机体产生针对肿瘤细胞上的可能存在抗原的免疫反应；第二，利用抗体攻击肿瘤生长相关受体，影响或下调其功能，甚至使其功能丧失。
抗肿瘤药物的临床应用基础是药物对疾病有效且危险因素在患者能够接受的范围内。在肿瘤治疗中，不管抗肿瘤作用在延长寿命之外还具备多少公认的益处，延长生存期是最致力追求的目标。除了不影响生存期，其它的益处包括减轻症状，保护和防止不良事件的发生，延长肿瘤复发时间和无症状生存期，延缓肿瘤进展。人们通常接受上述标准，也体现了美国食品与药品管理局(Food and DrugAdministration，F.D.A.)认可的药物所具备的有益作用(Hirschfeld et al.Critical Reviews in Oncology/Hematolgy42：137-1432002)。众所周知，除了这些标准之外，还有其他方面可以提示这些益处。部分的说，美国F.D.A对该药的迅速批准，认可了预示对患者有益的替代药物的存在。2003年底，已经有16种用该方法生产的药物，其中4种已经完全通过批准，后续的研究已经证实了预测的药物对患者的有益作用。对实体瘤的药物治疗效果的评定很重要的一个方面是测定肿瘤对治疗的反应，看肿瘤对患者的影响作用(Therasse et al.Journal of the National CancerInstitute 92(3)：205-216 2000)。肿瘤国际专家小组Solid TumorsWorking Group发布了一个临床肿瘤治疗反应评估标准即RECIST标准。依据该标准对肿瘤患者药物治疗反应进行客观评估，证明了药物对肿瘤患者的有益作用。在临床前期可以直接进行评估和记录。进入临床期后，药物在临床前期模型中所表现的延长生存期作用显示出了最大的预期临床效果。与临床药物治疗效果相类似，在临床前期能够减轻肿瘤负担的药物能够对疾病产生显著直接的影响。尽管抗肿瘤药物治疗临床结果最致力寻求的是延长存活期，但还有其它临床价值，很明确的是能够减轻肿瘤负荷，这点和延迟疾病进展，延长生存期有关，由此产生对临床有益的直接影响(Eckhardt et al.Developmental Therapeutics：Successes and Failures ofClinical Trial Designs of Targeted Compounds；ASCO EducationalBook，39th Annual Meeting，2003，pages 209-219)。
相应的，本发明的目的是介绍一种方法，该方法由某些特殊个体衍生的细胞合成肿瘤性疾病可修饰性抗体，此抗体对肿瘤细胞具有细胞毒性作用，同时对非肿瘤细胞相对没有毒性。分离杂交瘤细胞以及其编码产生的相应的单抗和抗原结合片断是这种方法的主要目的。
本发明的另外一个目的是介绍CDMAB及其抗原结合片断。
本发明更进一步的目的是合成通过ADCC和CDC介导的肿瘤细胞毒性的CDMAB。
本发明的另外一个目的是合成CDMAB，其细胞毒作用在于它能够催化水解细胞化学键。
本发明的另外一个目的是合成CDMAB，应用于结合试验，辅助肿瘤疾病的诊断、预后判断和病情监测。
通过本文下述的说明和例证，和本发明的某些具体描述，其它相关目的和好处将更加明了。
附图说明
本专利或申请文件包含了至少一页彩图。使用带有彩图的本专利申请需具备正式官方申请以及支付必要费用。
图1：采用7BD-33-11A(图A)或同种型对照(图B)做为探针，对MDA-MB-231细胞溶解物(泳道1)或细胞膜(泳道2和3)进行免疫印迹试验。左侧为分子量标志。
图2：采用7BD-33-11A做为探针，对MDA-MB-231细胞膜进行免疫印迹试验。泳道1：还原条件下。泳道2：非还原条件下。左侧为分子量标志。
图3：去糖基化在7BD-33-11A与MDA-MB-231细胞膜结合中的作用。MDA-MB-231细胞膜分别经糖肽酶F(PNGase F；泳道1)、O-glycanase(泳道2)、唾液酸酶(泳道3)、PNGase F、O-glycanase和唾液酸酶(泳道4)，PNGase F、O-glycanase、唾液酸酶、半乳糖苷酶和氨基葡糖苷酶(泳道5)以及缓冲液对照(泳道6)处理。左侧为分子量标志。
图4：7BD-33-11A免疫沉淀MDA-MB-231膜蛋白SDS-PAGE(图A)和Western blot(图B)。泳道A：同种型对照免疫沉淀蛋白，泳道B：7BD-33-11A免疫沉淀蛋白，泳道TM：MDA-MB-231膜蛋白。矩形框标示泳道B的SDS-PAGE和泳道TM的Western blot。左侧为分子量标志。
图5：Profound搜索结果。
图6：MASCOT搜索结果。
图7a：以7BD-33-11A(图A)、抗CD63(RFAC4克隆，图B)、IgG2a同种型对照(图C)和IgG1同种型对照(图D)为探针的蛋白质Western blots。泳道A：MDA-MB-231总膜蛋白；泳道B：7BD-33-11A免疫沉淀蛋白；泳道C：抗CD63(RFAC4)免疫沉淀蛋白；泳道D：IgG2a同种型对照免疫沉淀蛋白；泳道E：IgG1同种型对照免疫沉淀蛋白。左侧为分子量标志。
图7b：以7BD-33-11A(图A)、抗CD63(H5C6克隆，图B)、IgG2a同种型对照(图C)和IgG1同种型对照(图D)为探针的蛋白质免疫印迹试验。泳道A：MDA-MB-231膜蛋白；泳道B：7BD-33-11A免疫沉淀蛋白；泳道C：抗CD63(H5C6)免疫沉淀蛋白；泳道D：IgG2a同种型对照免疫沉淀蛋白；泳道E：IgG1同种型对照免疫沉淀蛋白。左侧为分子量标志。
图8：以7BD-33-11A(图A)、抗CD63(RFAC4克隆，图B)、抗CD63(H5C6克隆，图C)、IgG2a同种型对照(图D)和IgG1同种型对照(图E)为探针的蛋白质免疫印迹试验。泳道1-5：7BD-33-11A免疫沉淀蛋白；泳道6-10：IgG2a同种型对照免疫沉淀蛋白。泳道1和6：不含NaCl；泳道2和7：150mM NaCl；泳道3和8：500mM NaCl；泳道4和9：2000mM NaCl；泳道5和10：RIPA缓冲液。
图9：以7BD-33-11A(图A)、抗CD63(RFAC4克隆，图B)、抗CD63(H5C6克隆，图C)、IgG2a同种型对照(图D)为探针的蛋白质免疫印迹试验以及考马斯胶蓝蛋白染色(图E)。左侧为分子量标志。泳道1：非诱导型vector；泳道2：非诱导型GST-EC1；泳道3：非诱导型GST-EC2；泳道4：诱导型vector；泳道5：诱导型GST-EC1；泳道6：诱导型GST-EC2。
图10：7BD-33-11A，同种型对照和抗EGFR抗不同肿瘤细胞和非肿瘤细胞的典型流式细胞仪图谱。
图11：7BD-33-11A(A)，同种型阴性对照(B)，抗CD63(RF AC4)抗体或抗CD63(H5C6)抗体(D)与正常人结肠组织结合典型组织切片显微照片。7BD-33-11A，RFAC4和H5C6在固有层中的巨噬细胞和淋巴细胞呈现强染色，RFAC4和H5C6在粘膜上皮也为强染色。放大倍数为200×。
图12：7BD-33-11A(A)，同种型阴性对照(B)，抗CD63(RF AC4)抗体(C)或抗CD63(H5C6)抗体(D)与人乳腺浸润性导管癌组织结合典型组织切片显微照片。7BD-33-11A与RFAC4或H5C6比较，前者在肿瘤细胞染色呈弱阳性。放大倍数为200×。
图13：7BD-33-11A(A)或抗Her2(c-erbB-2)抗体(B)与人乳腺浸润性导管癌组织结合典型组织切片显微照片。7BD-33-11A在肿瘤细胞内染色为强阳性，抗Her2抗体染色为阴性。放大倍数为200×。
图14：7BD-33-11A与前列腺癌(A)或正常前列腺组织(B)结合典型组织切片显微照片。7BD-33-11A在前列腺癌细胞膜上染色强阳性，在正常前列腺组织腺上皮细胞的胞膜和胞浆内均阳性。放大倍数为200×。
图15：MDA-MB-231乳腺癌模型中，肿瘤生长对7BD-33-11A和同种型对照抗体的剂量反应。箭号线表示抗体给予时间，数据点代表+/-SEM均值。
图16：MDA-MB-231异种移植模型研究，给予不同剂量7BD-33-11A和同种型对照抗体后的剂量反应。
图17：MDA-MB-231乳腺癌模型中，7BD-33-11A，顺铂，7BD-33-11A+顺铂和缓冲液对照对肿瘤生长的影响。矩形框内表示抗体给予时间，数据点代表+/-SEM均值。
图18：MDA-MB-231乳腺癌模型中，7BD-33-11A，顺铂，7BD-33-11A+顺铂和缓冲液对照对体重的影响。
图19：MDA-MB-468乳腺癌模型中，7BD-33-11A，顺铂，7BD-33-11A+顺铂和缓冲液对照对肿瘤生长的影响。箭号线表示抗体给予时间，数据点代表+/-SEM均值。
图20：MDA-MB-468乳腺癌模型中，7BD-33-11A，顺铂，7BD-33-11A+顺铂和缓冲液对照对体重的影响。
具体实施方式
例1
免疫印迹试验法确认抗体结合蛋白
为了能够确定7BD-33-11A抗体识别的抗原，细胞膜预先需经过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，然后转膜。然后利用7BD-33-11A抗体探针检测其所识别的抗原蛋白。
1.细胞溶解，细胞膜碎片预处理。
1.1.细胞溶解
首先分离MDA-MB-231(MB-231)细胞，细胞经流式细胞仪检测证实为能与7BD-33-11A抗体结合的乳腺癌细胞。应用细胞溶解物和预处理后的细胞膜进行抗原识别和定性。获得MB-231细胞溶解物步骤如下：MB-231细胞株(1.5g)置入2ml缓冲液中进行细胞悬浮，该缓冲液组成包括：20mM Tris，pH7.4，150mM NaCl，1％(v/v)TritonX-100，0.02％(w/v)叠氮化钠(sodium azide)，2mM原钒酸钠(sodiumorthovanadate)，50mM氟化钠(sodium fluoride)和鸡尾酒蛋白酶抑制剂(protease inhibitor cocktail)(Roche Diagnostics；Manheim，Germany)。然后用玻璃匀浆器进行均一化处理，4℃搅拌并孵育1小时，4℃离心(20,000g)15分钟，洗涤除去不能溶解的物质。采集上清，等分，-80℃保存。BCA(bicinchoninic acid)测定法检测细胞溶解物蛋白质浓度(Pierce；Rockford，IL.)。
1.2.细胞膜碎片预处理
细胞膜来源于融合培养的MB-231乳腺癌细胞。首先用PBS(phosphate buffered saline)洗涤细胞，除去细胞间介质。然后细胞解离：加入解离缓冲液(Gibco-BRL；Grand Island，NY)37℃平板振荡器上振荡20分钟。采集细胞，4℃离心(900g)10分钟。PBS再次洗涤细胞，重复4℃离心(900g)10分钟。-80℃保存。备膜首先需溶解细胞，然后在均质缓冲液中(内含1 tablet/50ml完整的鸡尾酒蛋白酶抑制剂(Roche；Laval QC))以3ml缓冲液/1g细胞的比例进行再悬浮，利用置于冰面上的多向振荡器使细胞悬液均一化以助细胞溶解。细胞匀浆置4℃离心(15,000g)10分钟去除细胞核微粒。采集上清，分装于不同试管，4℃离心(75,600g)90分钟。小心移除上清，膜沉淀物置入5ml均质缓冲液中再悬浮。全部试管采集的膜沉淀物混和并重新等分，4℃下离心(75,600g)90分钟。仔细采集并移除上清，测量沉淀物重量。含有1％Triton X-100的增溶溶解缓冲液按照3ml/1g沉淀物的比例加入缓冲液。置于冰面上平板振荡器300rpm振荡1小时，使膜沉淀物增溶。得到的混悬液再次离心(75,600g)，以沉淀不溶物质。仔细移除含有可溶膜蛋白成分的上清液，测定蛋白质浓度，-80℃保存。
2.1-维SDS-PAGE和免疫印迹试验
MB-231细胞经上述步骤获得的膜蛋白，需经1-维SDS-PAGE(1DSDS-PAGE)进行分离，堆积胶和分离胶浓度分别为5％和10％。然后4℃过夜电转印至PVDF膜(Millipore；Billerica，MA)。转印的完全性主要取决于预先加入到膜上面分子标志物的分子量。接下来将膜放入含5％(w/v)脱脂奶的TBST液，室温下(RT)1小时。两个相同的样本用探针检测如下：样斑一使用7BD-33-11A抗体(5μg/ml，溶剂为含5％脱脂奶的TBST)探针，样斑二使用IgG2a同种型对照抗体(5μg/ml，溶剂为含5％脱脂奶的TBST)探针。样斑均在TBST溶液中洗涤三次，每次10分钟，然后在辣根过氧化物酶结合的羊抗鼠IgG(Fc)溶液中孵育(Bio-Rad Laboratories；Hercules，CA)，室温下1小时。TBST洗涤三次，每次10分钟。然后按照生产厂家的说明书将样斑放入TBM过氧化酶底物试剂盒中培养(VectorLaboratories；Burlingame，CA)。用清水漂洗样斑，利用凝胶记录系统获得图像结果(图1和图2)(Bio-Rad；Hercules，CA)。样斑图像是在照相机聚焦，光圈和影像获得时间同样条件下留取的。在图1中，7BD-33-11A抗体结合的蛋白条带分子量范围是20-80kd，其蛋白活性在细胞溶解物和膜碎片中能够检测到。同种型对照中未发现抗体结合于MB-231细胞溶解物和膜碎片成分的任何蛋白，这表明了7BD-33-11A的结合是特异性的。图2证明了在Western blot中，还原剂对7BD-33-11A结合的影响。该抗体的活性仅仅在无还原剂存在的条件下才能够被检测到(泳道2)。还原剂例如DTT和β-巯基乙醇能使抗体和抗原不能完全结合(泳道1)，提示了7BD-33-11A对天然蛋白抗原表位的识别和结合依赖于二硫键的存在。
为确定在Western blot中检测到的抗原分散特性是否由于异源性糖基化的作用，给予膜片段不同糖苷酶(糖肽酶F、o-glycanase、唾液酸酶、半乳糖苷酶和氨基葡糖苷酶)处理，这些酶能够去除特殊的碳水化合物基团。处理后的样品进行1D SDS-PAGE和Westernblot。预期结果是如果某些酶移除了某些碳水化合物基团，这些基团又和7BD-33-11A抗体识别大量的抗原有关，那么在SDS-PAGE上就会出现差异。图3显示了糖苷酶处理后的来源于MB-231细胞的膜片段，结果提示抗体识别抗原量明显减少。这说明7BD-33-11A抗体识别抗原至少和一种糖苷酶有关。显著抗原活性仅仅出现在几种酶同时作用条件下的事实表明，至少有某些碳水化合物成分形成了N连接碳水化合物。尽管经过糖苷酶处理的细胞膜在重量上有改变，但并未减轻抗原结合强度。这说明抗体首先结合在抗原糖蛋白的多肽部分。
例2
7BD-33-11A抗体结合抗原的识别
1.MB-231细胞膜碎片抗原免疫沉淀
细胞膜提取物(蛋白质总量为5mg)，加入适量1x lysis缓冲液(50mM Tris pH 7.4，150mM NaCl，1％聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)，0.02％ NaN3，2mM原钒酸钠(sodium orthovanadate)，50mM氟化钠和鸡尾酒蛋白酶抑制剂(Roche Diagnostics，Manheim，Germany))稀释至蛋白质浓度1mg/ml。再加入适量2x RIPA缓冲液(50mM.三氨基甲烷盐酸缓冲液(Tris)pH 7.4，150mM NaCl，1.0％胆酸钠(sodium cholate)，0.2％SDS，1％Triton X-100和0.02％NaN3)，最终获得1xRIPA缓冲液浓度。向提取物中预先加入G-琼脂糖凝胶珠(G-Sepharose beads)(Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)，4℃预洁2小时。移出膜提取物，加入库存BSA(10mg/ml)稀释至浓度为0.5mg/ml。在预洁阶段，加入1mL BSA(0.5mg/ml)，封闭抗体连接G-琼脂糖凝胶珠。封闭后，将抗体连接G-琼脂糖凝胶珠加入含有BSA的膜提取物中，置于端对端旋转器(end-over-endrotator)上4℃孵育3小时。4℃离心(20,000g)10秒钟，移出并弃去未结合碎片。1ml RIPA缓冲液洗涤去除G-琼脂糖凝胶珠，共洗涤3次，每次5分钟。再次用PBS洗涤一次去除G-琼脂糖凝胶珠。分别对7BD-33-11A抗体结合G-琼脂糖凝胶珠试验组和IgG2a结合G-琼脂糖凝胶珠对照组两组样品进行免疫沉淀(BD Biosciences，San Diego，CA)。该实验步骤是为了评估蛋白对免疫结合物的非特异性结合。完全去除PBS，G-琼脂糖凝胶珠在40μL非还原性缓冲液液样品中煮沸，部分样品进行1D SDS-PAGE，继以免疫印迹试验，剩余样品以考马斯胶蓝染色。40μL样品中，8μL用于SDS-PAGE和免疫印迹试验，32μL用考马斯胶蓝进行蛋白质染色，保留过夜。用于免疫印迹试验的样本于320mA，2小时转膜到PVDF膜上，然后以去离子水漂洗，含5％脱脂奶的TBST室温下封闭1小时，然后加入7BD-33-11A，4℃孵育过夜。TBST洗涤三次去除杂质，每次洗涤10分钟。然后加入HRP连接Fc特异性羊抗鼠IgG(1∶5000)，在含5％脱脂奶的TBST内，室温下孵育1小时。洗涤三次去除杂质，每次10分钟。然后依据HRP底物TMB的标准过程进行培养发育。如图4所见，用分子量标记作为参考，免疫印迹试验和考马斯胶蓝染色的凝胶为线形排列。考马斯胶蓝染色最强的条带和免疫印迹中与7BD-33-11A产生反应的条带相对应。这一部分在图4中显示尤为突出(矩形框内)。
2.肽图和质谱法识别抗原
通过上面的试验，切下考马斯胶蓝染色和免疫印迹试验中活性最强部分相平行的条带，然后使用胰蛋白酶商业试剂盒(Pierce，Rockford，IL)进行水解。完全水解部分在SELDI-TOF赛弗吉PBSIIc阅读器(Ciphergen PBSIIc reader)(Ciphergen Biosystems Inc.，Freemont，CA)上进行质谱分析。简单来说，就是将能够完全水解消化的部分人工放在H4芯片上(Ciphergen Biosystems Inc.，Freemont，CA)。干燥，加入CHCA基质(α-cyano 4-hydroxycinnaminic acid；Ciphergen Biosystems Inc.，Freemont，CA)，再次干燥。PBSIIc阅读器进行样品分析。从同种型对照组以及空白组和试验组相平行区域取类似大小的条带并与7BD-33-11A免疫沉淀凝胶进行衔接处理，以便能够检测出7BD-33-11A免疫沉淀抗原水解后产生的特殊肽段。大量的特殊肽段经PROFOUND搜索。PROFOUND是应用质谱分析得到的信息，搜索蛋白质序列的数据库公共在线工具。样品经过7BD-33-11A免疫沉淀水解后产生的特殊肽段在QSTAR(Applied Biosystems，Foster City，CA)上进行MS/MS分析。QSTAR安装了一个接口，因此能对前面经过PBSIIc阅读器分析的相同样斑进行分析。MS/MS数据然后进行MASCOT分析，MASCOT也是一个公共在线工具，它利用来源于MS/MS波谱的信息来查找蛋白质数据库。图5是从Profound搜索的结果。唯一能够显示做为候选蛋白，而又具有显著可信程度的是CD63。图6是从MASCOT搜索的结果。经过识别唯一可能性最大的蛋白是CD63，支持以前用肽图法检测确证的结果。
3.免疫沉淀法确定7BD-33-11A抗原
通过检测已知抗人CD63单抗(RFAC4和H5C6)能否与经过7BD-33-11A免疫沉淀识别的抗原产生活性反应，以确定7BD-33-11A假定抗原的存在，反之亦然。更进一步确认方法是通过用谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合的人CD63细胞外结构域部分转染诱导型或非诱导型细菌，对细胞溶解所得到的产物进行免疫印迹试验。MB-231细胞膜事先分别给予7BD-33-11A抗体、RFAC4(Cymbus BiotechnologyLTD，Hants，UK)、H5C6(BD Biosciences，San Diego，CA)、IgG2a和IgG1(BD Biosciences，San Diego，CA)同种型对照处理，免疫沉淀后行1D SDS-PAGE，接下来进行免疫印迹试验。等量免疫复合物样品置于相同凝胶上进行分析。电转印转膜至PVDF膜，用7BD-33-11A单抗、RFAC4、H5C6以及IgG2a和IgG1同种型对照探针检测。图7a显示：交叉免疫电泳试验，抗体7BD-33-11A和RFAC4分别进行免疫沉淀，继以免疫印迹试验。图7b显示：交叉免疫电泳试验，抗体7BD-33-11A和H5C6分别进行免疫沉淀，继以免疫印迹试验。这三种抗体和7BD-33-11A免疫沉淀反应识别的相似抗原存在交叉反应。此外，7BD-33-11A在Western blot中也与RFAC4和H5C6经过免疫沉淀识别的相似抗原存在交叉反应，抗原分子量为20-80kDa，但是不能够和同种型对照抗体形成的免疫复合物产生交叉反应。同种型对照抗体探针检测样斑结果为完全阴性。这些数据说明7BD-33-11A抗体识别的表位包含于CD63抗原内。
为了确定交叉反应的存在是否是由于抗体识别的是同种分子，或者是否是由于具有相似分子量的分子相互作用的存在，研究人员提高了缓冲液的限制性(50mM Tris，pH7.4，1％Triton X-100，不同浓度NaCl：0，150，500和2000mM；RIPA缓冲液内含500mMNaCl)，用7BD-33-11A进行免疫沉淀。结果得到的免疫复合物分别加入7BD-33-11A，H5C6和RFAC4以及IgG2a和IgG1同种型对照进行免疫印迹试验。图8显示在改变了免疫沉淀条件的限制性之后没有对免疫复合物的产生引起任何可以检测到的影响，这也说明了7BD-33-11A抗体识别的分子也同样被抗CD63单抗识别，反之亦然。
为了进一步确定7BD-33-11A直接结合于人CD63抗原，通过免疫印迹试验利用大肠杆菌表达人CD63细胞外结构域(loops EC1 andEC2)的重组融合肽，对大肠杆菌溶解产物进行免疫印迹试验，进一步评估抗体活性。为完成此工作，通过亚克隆合适的cDNA片断加入细菌表达载体PGEX-4T-2(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)上，获得CD63细胞外环状结构域(loop 1和loop 2-EC1和EC2)分别和GST的融合片断。多聚合酶链反应(PCR)获得cDNA片断编码的环状结构，利用足够长度的人cDNA做为模板(clone MGC-8339，American Type Culture Collection Manassas，VA)。cDNA编码的EC1 loop通过下面PCR引物获得：
5’引物(EC1_5’)，5’GCCGTGGGATCCGGGGCACAGCTTGTCCTGS’3’
3’引物(EC1_3’)，5’GATGACGAATTCTCACAGAGAGCCAGGGGTAGC3’。
cDNA编码的EC2 loop通过下面PCR引物获得：
5’引物(EC2_5’)，55’GGCTATGGATCCAGAGATAAGGTGATG3’和
3’引物(EC2_3’)，5’TACCAGAATTCAATTTTTCCTCAGCCAGCC3’。
PCR反应条件如下：2μL的5’引物(25pmol/μL)，2μL的3’引物(25pmol/μL)，0.2μL的DNA模板(pOTB-CD63，0.76mg/mL)，45.8μL的PCR SuperMix High Fidelity(Invitrogen，Burlington，ON)。PCR步骤如下：94℃加热5分钟，然后对如下过程做30个循环：94℃解链30秒钟，55℃退火30秒钟，72℃拉伸1分钟。
在亚克隆之后，只含有PGEX-4T-2载体的阴性对照组(其中不含有cDNA片断)，其结构成分被转移至大肠杆菌(BL-21株)。每次转化过程中只有抗氨苄西林菌落能够生长，对各自插入的cDNAs进行测序。在确定cDNA序列的正确性后，每一克隆被移植到液体培养基中，加入1mM IPTG(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)(Gibco-BRL；Rockville，MD)诱导GST融合体的表达。孵育2小时，细菌培养物在室温下离心(2,000g)5分钟。弃去上清，细菌沉淀物在非还原性的SDS-PAGE缓冲液样品中煮沸。然后如前所述进行SDS-PAGE(聚丙烯酰胺堆积胶和分离胶浓度分别为5％和12％)以及免疫印迹试验。样斑进行7BD-33-11A、H5C6、RFAC4和IgG2a同种型对照探针检测。图9显示研究结果为：7BD-33-11A特异性识别人CD63的loop 2(108-202位氨基酸)(泳道6)，不识别loop 1(34-52位氨基酸)。这种抗体特异性识别细菌溶解物的观察进一步证明了两个已经定性的抗人CD63抗体(RFAC4和H5C6)也能够识别相似蛋白质，该蛋白质条带仅仅位于诱导的大肠杆菌溶解物所表达的EC2融合多肽区。上述全部结果均证明7BD-33-11A能识别并直接结合人CD63，抗原特异性识别区域位于细胞外108-202位氨基酸。
例3
如S.N.10/348,231中所述，根据布达佩斯条约，杂交瘤细胞7BD-33-11A被存放于美国标准培养收集所(American Type CultureCollection，10801 University Blvd.，Manassas，VA 20110-2209on Juanuary 8，2003)，保藏编号为PTA-4890。依据37 CFR 1.808，存放者确保公众使用存放物的所有限制权不被取缔，使用权属于被授予专利者。
抗体生产：
7BD-33-11A单抗由CL-1000细颈瓶(BD Biosciences，Oakville，ON)培养的杂交瘤细胞产生，每周采集并重新接种两次。抗体经过标准抗体纯化过程进行纯化，纯化采用Protein GSepharose 4 Fast Flow(Amersham Biosciences，Baie d’Urfe，QC)。
如前美国专利10/348,231中所述，(表2)将7BD-33-11A与细胞毒试验阳性(抗Fas(EOS9.1，IgM，kappa，20ugs/mL，eBioscience，San Diego，CA)、抗Her2/neu(IgG1，kappa，10ug/mL，Inter Medico，Markham，ON)、抗EGFR(C225，IgG1，kappa，5ug/mL，Cedarlane，Hornby，ON)、环己酰亚胺(Cycloheximide)(100umol，Sigma，Oakville，ON)、NaN3(0.1％，Sigma，Oakville，ON))以及阴性对照相比较(107.3(抗TNP，IgG1，kappa，20ug/mL，BDBiosciences，Oakville，ON)、G155-178(抗TNP，IgG2a，kappa，20ug/mL，BD Biosciences，Oakville，ON)、MPC-11(抗原特异性未知，IgG2b，kappa，20ug/mL)、J606(抗果聚糖，IgG3，kappa，20ug/mL)和IgG缓冲液(2％))。乳腺癌(MDA-MB-231(MB-231)，MDA-MB-468(MB-468)，MCF-7)、结肠癌(HT-29，SW1116，SW620)、肺癌(NCI H460)、卵巢癌(OVCAR)、前列腺癌(PC-3)和非肿瘤细胞(CCD 27sk，Hs888 Lu)经过检测(全部来源于ATCC，Manassas，VA)。利用分子探针进行活体或者死亡细胞毒试验(Eugene，OR)。进行试验主要依据生产厂家指南，如有更改在此说明。试验之前按照预定密度铺细胞板。两天后，纯化抗体和对照均进行稀释，取100μL加入细胞板，CO2浓度5％孵育5天，翻转倒空细胞板，干燥样斑。取含有MgCl2和CaCl2的DPBS稀释后的钙绿荧光素染色剂50μL，加入每一试验孔内，CO2浓度5％，37℃孵育30分钟，翻转倒空细胞板，干燥样斑。室温下用多通道速挤瓶将含有MgCl2和CaCl2的DPBS加入到试验孔内，轻叩三次，翻转倒空平板，干燥样斑。荧光多孔板高效阅读器(Perkin-Elmer HTS7000 fluorescence plate reader)读取试验结果，获得的数据用Microsoft Excel进行分析，结果见表1。数据代表了四组试验的均值，按照如下细胞毒性试验的界限三倍方法表示定量：在细胞毒性程度方面，4/4试验(+++)，3/4试验(++)，2/4试验(+)。表1内未标志细胞代表结果矛盾或者细胞毒性小于界限值。试验证实了7BD-33-11A抗体对乳腺癌和前列腺癌细胞的选择性细胞毒性作用，而对于未转化的正常细胞无影响。试验证实了7BD-33-11A比抗Fas抗体阳性对照组对前列腺癌更强的杀伤活性。化学性细胞毒药物产生了预期的细胞毒作用，但是用于比较的许多诱导产生的其它抗体在提供限制条件的生物细胞试验中显示了预期的效果。总的来说，7BD-33-11A抗体似乎对许多肿瘤细胞类型均有细胞毒性。抗体在其活性方面的选择性在于不是所有的瘤细胞都有易感性。更进一步来说，抗体的功能特异性证据还在于它对非癌细胞产生不毒性作用，这在治疗中是很重要的因素。
  表1   乳腺   结肠   肺   卵巢   前列腺   正常
  MB-231   MB-468   MCF-7   HT-29   SW1116   SW620   NCI460   OVCAR   PC-3   CCD27sk   Hs888Lu
  7BD-33-11A   -   -   +   -   -   -   -   -   ++   -   -
  阳性对照   抗Fas   +   -   +++   -   -   -   -   +++   +   -   +
  抗Her2   -   -   +   -   -   -   -   +   -   -   -
  抗EGFR   -   +++   +   -   +++   -   -   +   -   +   -
CHX(100μM) +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
  NaN3(0.1％)   +++   +++   +++   +++   -   -   +++   +++   +++   -   -
  对照   IgG1   +++   +
 IgG2a  +++  +
 IgG2b  +++
 IgG3
 IgG Buffer  +
用流式细胞仪(flow cytometry，FACS)检测将7BD-33-11A结合于上述肿瘤组织细胞以及正常细胞或者其他另外的肿瘤细胞：结肠(LOVO)、胰腺(BxPC-3)、卵巢(ES-2，OCC-I)和前列腺(DU-145)以及下述其他正常细胞(CCD-112)。细胞经过流式细胞仪前，首先要经过DPBS(不含Ca++ and Mg++)洗涤细胞单层。然后加入细胞解离缓冲液(INVITROGEN，Burlington，ON)，37℃使细胞从培养板上脱离。离心并采集细胞，然后置入Dulbecco’s phosphate bufferedsaline，内含MgCl2，CaCl2再悬浮，2％和25％FBS(fetal bovineserum)，4℃洗脱并计数，分散成细胞密度适合的细胞簇，接下来在染色剂(DPBS，内含MgCl2和CaCl2+/- 2％FBS)中再悬浮，加入20μg/mL7BD-33-11A或者对照抗体(同种型对照或抗EGFR)冰面上放置30分钟。在加入Alexa Fluor 488-结合次级抗体之前，细胞用洗脱液进行洗涤。然后加入含有Alexa Fluor 488结合次级抗体的染色液保留20-30分钟。最后一次洗涤细胞，染色液中再悬浮，该染色液中含有1μg/mL碘化丙啶(propidium iodide)和1.5％多聚甲醛，(paraformaldehyde)。样品通过流式细胞仪检测获得的细胞流计数应用CellQuest software(BD Biosciences)分析。细胞前向运动(FSC)和侧向分散(SSC)通过调整FSC和SSC探测器上的电压振幅决定。三个荧光通道的探测器(FL1、FL2和FL3)的调整是通过让经过纯化的同种型对照抗体染色的细胞和Alexa Fluor 488结合次级抗体先后流过，这些细胞具有相同的峰值和约1-5u的中位荧光强度。细胞流经FSC后即可获得所需的活性细胞和碘化丙啶排除物(propidium iodide exclusion)(被采用时)。每一份样品，需要约10,000活性细胞进行分析，结果见表2。表2显示了在同种型对照基础上平均荧光强度倍增特点，定性表示为：＜5(-)；5 to 50(+)；50 to 100(++)；＞100(+++)，括号内为细胞染色的百分比。
图9为具有代表性的7BD-33-11A组织学图像。7BD-33-11A在如下肿瘤细胞结合特点相似乳腺癌(MB-231和MCF-7)、结肠癌(HT-29，SW1116和SW520)、肺癌、卵巢癌、胰腺癌和前列腺癌(PC-3)；但在另一种乳腺癌(MB-468)、结肠癌(LOVO)和前列腺癌(DU-145)中结合特点不同。7BD-33-11A还能结合于非肿瘤细胞，但是这种结合不产生细胞毒性。这进一步证明了抗体与其抗原配体的结合并不一定是提示预后的因素，这是不明显的发现。这表明抗体在不同细胞上的不同配体是决定细胞毒性的因素，而不是抗体结合本身。
  表2   乳腺   结肠   肺   卵巢   胰腺   前列腺   正常
  抗体   同种型   MB-231   MB-468   MCF-7   HT-29   LOV0   SW1116   SW620   NCIH460   Es-2   OCC-1   OVCAR   BxPC-3   DU-145   PC-3   CCD27sk   CCD-112   Hs888Lu
  7BD33-11A   IgG2a，κ + - + + - + + + + + + + - + + + +
  抗EGFR   IqGI，κ ++ ++ - + - + - + + + + + + + + + +
例4
正常人体组织染色
免疫组化染色法曾用于了解7BD-33-11A抗原在人体的分布(S.N.10/603,006)。目前研究比较了7BD-33-11A和另外两个抗CD63抗体(RF AC4和H5C6)的分布特点，在前面通过生物化学方法进行的研究中证实7BD-33-11A抗原是CD63。把抗体与来源于人体正常器官组织谱(Clinomics，Watervliet，NY)的24例正常人组织结合。任意单位抗体(7BD-33-11A；RFAC4(Cymbus Biotechnology Ltd.，Hants，UK)和H5C6抗CD63(BD PharMingen，Oakville，ON)；鼠IgG1阴性对照(Dako，Toronto，ON))置于抗体稀释缓冲液(Dako，Toronto，ON)中稀释至浓度5μg/ml，此浓度为经过前述试验步骤后被认为是最佳浓度。阴性对照组抗体经过生产者验证对哺乳动物组织结合试验均为阴性。免疫组化染色步骤如下：
25例组织切片先经烤箱58℃去石蜡化1小时，然后将标本浸入二甲苯染色缸内5次脱蜡，每次4分钟。接下来依次通过系列浓度梯度乙醇(100％-75％)冲洗切片进行再次水化。将玻片浸入pH 6的10mM柠檬酸缓冲液(Dako，Toronto，Ontario)，然后以微波烘烤，高、中和低火条件下各5分钟，最后浸入冷PBS液中。取出玻片放入3％过氧化氢溶液内，6分钟后用PBS洗涤三次，每次5分钟，干燥，置常用封闭缓冲液(Dako，Toronto，Ontario)中孵育，室温下5分钟。7BD-33-11A、鼠抗CD63单抗(Cymbus Biotechnology Ltd.，Hants，UK or Dako，Toronto，Ontario)或者同种型对照抗体(针对黑曲霉素葡糖氧化酶，该酶在哺乳动物体内既不表达也不能通过诱导产生；Dako，Toronto，Ontario)在抗体稀释缓冲液中均稀释至5μg/mL，室温下放置1小时后孵育过夜。然后用PBS液洗涤玻片三次，每次5分钟。接下来加入HRP结合的次级抗体(Dako EnvisionSystem，Toronto，Ontario)，室温下30分钟，以检测或观察原始抗体的免疫活性。继续加入DAB(3，3’-diaminobenzidinetetrahydrachloride，Dako，Toronto，Ontario)显色底物进行免疫过氧化酶染色，室温下放置10分钟。Meyer’s苏木精(SigmaDiagnostics，Oakville，ON)对比染色，继以梯度乙醇(75-100％)进行脱水处理，二甲苯洗涤。加封固剂后以盖玻片覆盖，置Axiovert200(Zeiss Canada，Toronto，ON)显微镜下观察，获得数字影像，利用Northern Eclipse Imaging Software(Mississauga，ON)进行存储。其结果由病理医生进行读取、评分和说明。
表3是对7BD-33-11A、RFAC4和H5C6抗CD63抗体正常组织染色试验图谱结果的总结。7BD-33-11A的染色结果和前面所描述的相类似(S.N.10/603,006)。需要再次指出的是7BD-33-11A除了与浸润巨噬细胞、淋巴细胞和成纤维细胞结合外，还限制性的结合于不同类型细胞。RFAC4和H5C6抗体的染色图像结果相似。但是两者的染色结果和7BD-33-11A完全不同。特别的，两者能够与更广泛的正常组织结合，在7BD-33-11A染色同样为阳性的区域，RFAC4和H5C6染色通常更强，且不仅与浸润巨噬细胞、淋巴细胞和成纤维细胞结合，还可与大部分组织上皮细胞结合(图11)。
7BD-33-11A染色阳性的组织RFAC4和H5C6抗CD63抗体染色也为阳性(往往前者强度较后两者弱)。7BD-33-11A阴性的组织则RFAC4和H5C6抗CD63抗体染色则通常并非也为阴性。这些结果证明7BD-33-11A识别的组织仅仅是RFAC4和H5C6识别组织中的一小部分，在这些组织中，7BD-33-11A染色的强度通常较弱。这些结果也表明了7BD-33-11A结合的抗原并不是广泛表达在正常组织上的，而是特异性的存在于人体部分组织中。这些结果同样支持关于7BD-33-11A直接结合于CD63表位的生物化学试验证据即使其识别的表位与RFAC4和H5C6所识别的用于这些免疫组化染色的CD63表位完全不同。
表3 RFAC4和H5C6抗CD63抗体与7BD-33-11A在人体正常组织IHC结果比较
  切片   组织   7BD-33-11A   RFAC4   H5C6
  Aa3   乳腺   -   +(导管上皮细胞和基质成纤维细胞)   +++(导管上皮细胞和基质成纤维细胞)
  Aa4   乳腺   +/-(2-3基质成纤维细胞，*导管上皮细胞染色阴性)   +/-(导管上皮细胞和基质成纤维细胞)   +++(基质成纤维细胞)+/-(导管上皮细胞)
  Ab3   肺   +++(肺叶隔的巨噬细胞和成纤维细胞)   +++(肺叶隔的巨噬细胞和成纤维细胞)   +++(肺泡上皮和巨噬细胞)
  Ab4   肺   +++(肺叶隔的巨噬细胞和成纤维细胞)   +++(肺叶隔的巨噬细胞和成纤维细胞)   +++(肺叶隔的巨噬细胞和成纤维细胞)
  Ab5   肺   +/-(肺叶隔的巨噬   +++(肺叶隔的巨噬   +++(肺叶隔的巨噬
  细胞和成纤维细胞)   细胞和成纤维细胞)   细胞和成纤维细胞)
 Ac1   结肠   +++(粘膜固有层的淋巴细胞和巨噬细胞)*粘膜上皮染色阴性   +++(粘膜上皮，粘膜固有层的淋巴细胞和巨噬细胞)   +++(粘膜上皮，粘膜固有层的淋巴细胞和巨噬细胞)
 Ac3   结肠   -   -   +/-(粘膜固有层淋巴细胞)
 Ac4   结肠   +++(粘膜固有层巨噬细胞和成纤维细胞)+(粘膜上皮)   +++(粘膜固有层巨噬细胞和成纤维细胞)+(粘膜上皮)   +++(粘膜上皮，粘膜固有层的淋巴细胞和巨噬细胞)
 Ac5   结肠   +/-(粘膜固有层的淋巴细胞和巨噬细胞)   +++(粘膜固有层巨噬细胞和成纤维细胞)+(粘膜上皮)   +++粘膜固有层巨噬细胞和成纤维细胞)
 Ad1   前列腺   +++(前列腺上皮)   +++(前列腺上皮)   +++(前列腺上皮)
 Ad2   前列腺   +++(前列腺上皮)   +++(前列腺上皮)   +++(前列腺上皮)
 Ad4   前列腺   ++(前列腺上皮)   +++(前列腺上皮)
 Ad5   前列腺   +++(前列腺上皮)   +++(前列腺上皮)   +++(前列腺上皮)
 Ae1   肾脏   -   +(肾小管上皮)   ++(肾小管上皮)
 Ae2   肾脏   +/-(2-3间质细胞)*肾小管上皮染色阴性   ++(肾小管上皮)   ++(肾小管上皮)
 Ae3   肾脏   +/-(2-3间质细胞)   ++(肾小管上皮)   ++(肾小管上皮)
 Ae4   肝脏   ++(肝细胞和肝窦)   +++(肝细胞肝窦和胆管)   +++(肝细胞、肝窦和胆管)
 Af1   肝脏   -   ++(肝窦和胆管上皮)   ++(肝窦和胆管上皮)
 Af2   肝脏 -   +/-(肝细胞和肝窦)   ++(网状细胞)
 Af3   淋巴结   -   ++(网状细胞)   ++(网状细胞)
 Ag1   甲状腺   -   +/-(滤泡细胞)   +/(滤泡细胞)
 Ag2   甲状腺   +++(滤泡细胞)   +++(滤泡细胞)   +++(滤泡细胞)
 Ah1   胎盘   -   +++(合体滋养层细胞与绒毛膜)   +++(合体滋养层细胞与绒毛膜)
 Ah2   胎盘   -   +++(合体滋养层细胞与绒毛膜)   +++(合体滋养层细胞与绒毛膜)
例5
人体乳腺癌组织染色
应用免疫组化染色以确定肿瘤和7BD-33-11A抗原的关系，以及是否7BD-33-11A抗体能够识别肿瘤(S.N.10/603,006)。目前对RFAC4和H5C6抗CD63抗体，c-erbB-2抗Her2抗体进行了比较。乳腺癌组织样品来源于50例乳腺癌患者，10例样品来源于乳腺癌患者非肿瘤乳腺组织(Imgenex Corporation，San Diego，CA)。收集每个患者如下信息：年龄、性别、AJCC(American Joint Committee onCancer)肿瘤分期、淋巴结、雌激素受体以及黄体酮受体数据资料。按照例4中介绍的步骤进行免疫组化染色。稀释任意单位抗体至5μg/mL，抗Her2抗体稀释至1.5μg/mL。
表4、表5、表6和表7列出了7BD-33-11A、RFAC4和H5C6抗CD63抗体乳腺癌组织染色的结果。总的来说，50例标本中7BD-33-11A染色阳性占36％，RFAC4和H5C6抗CD63抗体分别为85％和94％，在7BD-33-11A和RFAC4或H5C6染色均为阳性的组织，97％的样品对RFAC4和H5C6比7BD-33-11A染色强(图12)。在乳腺癌患者的正常乳腺组织染色中，7BD-33-11A(0/10)，RFAC4和H5C6抗CD63抗体(7/8，2份样品表现不典型)染色阳性。在雌激素和黄体酮受体表达与7BD-33-11A抗原表达之间存在轻微相关性；任何一种受体表达阳性的组织7BD-33-11A表达均轻度增高。根据肿瘤分期和进展程度进行分析，结果显示随肿瘤分期增高7BD-33-11A有染色增强的趋势。RFAC4存在类似的结果。H5C6也显示出和雌激素和黄体酮受体表达的很轻微的相关关系，但是和肿瘤分期之间没有明确相关。但是对于三种抗体来说，检测结果均受到样本量的限制。
表4：人体乳腺癌7BD-33-11A免疫组化染色结果
  结合分数
 合计#   -   +/-   +   ++  +++   阳性合计   阳性百分率％
  患者   肿瘤  50   32   10   4   3  1   18   36％
  样品   正常  10   10   0   0   0  0   0   0％
  雌激素受体   +  28   16   9   1   2  1   12   43％
  -  22   15   3   2   1  1   7   32％
  未知  0   0   0   0   0  0   0   0％
  黄体酮受体   +  19   9   6   2   2  1   10   53％
  -  30   20   6   2   1  1   10   33％
  未知  1   1   0   0   0  0   0   0％
  AJCC肿瘤分期   T1  4   4   0   0   0  0   0   0％
  T2  21   14   3   2   1  1   7   33％
  T3  20   11   6   2   1  1   9   45％
  T4  5   1   3   0   1  1   4   80％
表5：人体乳腺癌RFAC4免疫组化染色结果
  结合分数
 合计#   -   +/   +   ++  +++   阳性合计   阳性百分率％
  患者   肿瘤  47   7   3   47   16  14   40   85％
  样品   正常  8   1   1   0   2  4   7   87.50％
  雌激素受体   +  27   1   2   3   15  6   26   96％
  -  20   6   1   3   4  6   14   70％
  未知  0   0   0   0   0  0   0   0％
  黄体酮受体   +  18   0   1   2   9  6   18   100％
  -  28   7   2   4   9  6   21   75％
  未知  1   0   0   0   1  0   1   100％
  AJCC肿瘤分期   T1  4   2   0   1   1  0   2   50％
  T2  20   4   2   3   6  5   16   80％
  T3  18   1   1   2   7  7   17   94％
  T4  5   0   0   1   2  2   5   100％
表6：人体乳腺癌H5C6免疫组化染色结果
  结合分数
 合计#   -   +/-   +   ++  +++   阳性合计   阳性百分率
  患者   肿瘤  47   3   4   8   15  17   44   94％
  样品   正常  8   1   1   0   2  4   7   87.50％
  雌激索受体   +  27   1   1   6   8  11   26   96％
  -  20   2   3   2   8  5   18   90％
  未知  0   0   0   0   0  0   0   0％
  黄体酮受体   +  18   0   0   4   4  10   18   100％
  -  28   3   4   4   11  6   25   89％
  未知  1   0   0   0   1  0   1   100％
  AJCC肿瘤分期   T1  4   0   0   1   2  1   4   100％
  T2  20   2   4   3   7  4   18   90％
  T3  18   1   0   3   4  10   17   94％
  T4  5   0   0   1   2  2   5   100％
7BD-33-11A对肿瘤细胞特异性染色阳性，正常细胞染色阴性。细胞染色图像定位发现7BD-33-11A抗原位于细胞膜和胞浆内。抗CD63抗体RFAC4和H5C6在肿瘤组织细胞的染色也呈现相似的结果。另外这两种抗体在正常乳腺组织标本染色也为阳性但7BD-33-11A染色为阴性。
与c-erbB-2比较，7BD-33-11A显示出完全不同的染色图像，18例7BD-33-11A染色阳性的标本中9例Her2表达阴性，这提示肿瘤患者靶向治疗的需要并没有得到完全满足(表8，图13)。即使7BD-33-11A和Her2染色均阳性的乳腺癌肿瘤组织切片，在染色强度方面两者也存在不同；一些乳腺癌组织切片7BD-33-11A显示强阳性，但Her2仅为弱阳性，这反过来说明7BD-33-11A能够特异性靶向治疗不同乳腺癌肿瘤患者。c-erbB-2抗体在一例正常乳腺组织切片染色也呈阳性。
这些结果表明了7BD-33-11A抗原大约在2/3的乳腺癌患者表达，其中有一半患者Her2完全阴性。染色结果表明在患者样品中，抗体能与恶性细胞特异性结合，7BD-33-11A抗原在细胞膜上表达，因此成为具有吸引力的药物治疗靶点。尽管7BD-33-11A与RFAC4或H5C6抗-CD63抗体比较，7BD-33-11A染色具有更多局限性，但再次证明7BD-33-11A抗原表位是CD63上更局限的表位可能性。
表7：人体乳腺癌和正常乳腺组织RFAC4和H5C6抗CD63与7BD-33-11A的免疫组化染色结果
  数据   RFAC4   H5C6   7BD-33-11A
  切片号   性别   年龄   诊断   评分   评分   评分
  1   F   28   浸润性导管癌   +++   +++   ++
  2   F   71   实体乳头状癌   +++   +++   +/-
  3   F   26   浸润性导管癌   ++   +   -
  4   F   43   浸润性导管癌   ++   ++   +/-
  5   F   39   浸润性导管癌   NR   NR   +/-
  6   F   46   导管原位癌   +   +   +/-
  7   F   47   浸润性导管癌   +++   +++   +
  8   M   67   浸润性导管癌   +++   +++   +
  9   F   33   浸润性导管癌   +++   +++   -
  10   F   47   浸润性导管癌   ++   ++   -
  11   F   49   侵袭性小叶癌   -   -   -
  12   F   46   浸润性导管癌   ++   ++   -
  13   F   39   浸润性导管癌   ++   ++   -
  14   F   43   浸润性小叶癌   +++   +++   +/-
  15   F   54   浸润性小叶癌   ++   ++   +/-
  16   F   58   浸润性导管癌   +   ++   +/-
  17   F   37   浸润性导管癌   +++   ++   -
  18   F   43   浸润性导管癌   +++   +++   +++
  19   F   51   浸润性导管癌   +++   +++   +
  20   F   80   髓样癌   ++   ++   -
  21   F   36   浸润性导管癌   NR   NR   -
  22   F   59   浸润性导管癌   +   +   -
  23   F   34   导管原位癌   +++   +++   -
  24   F   54   浸润性导管癌   ++   +++   +/-
  25   F   47   浸润性导管癌   +++   +++   ++
  26   F   53   浸润性导管癌   ++   ++   -
  27   F   59   浸润性导管癌   +   +   -
  28   F   60   浸润性导管癌   F   F   -
  29   F   37   浸润性导管癌   +++   +++   ++
  30   F   46   浸润性导管癌   ++   ++   +/-
  31   F   35   浸润性导管癌   -   -   -
  32   F   47   浸润性导管癌   ++   ++   -
  33   F   54   浸润性导管癌   +   +   -
  34   F   47   浸润性导管癌   -   +/-   -
  35   F   41   浸润性导管癌   +++   +++   -
  36   F   38   浸润性导管癌   +++   +++   -
  37   F   55   浸润性导管癌   -   +/   -
  38   F   65   浸润性导管癌   +/-   +/   -
  39   M   66   浸润性导管癌   -   +   -
  40   F   44   浸润性导管癌   ++   +++   -
  41   F   53   淋巴结恶性转移瘤   ++   ++   -
  42   F   32   淋巴结恶性转移瘤   +/-   +   -
  43   F   58   淋巴结恶性转移瘤   ++   +++   +/-
  44   F   52   淋巴结恶性转移瘤   ++   ++   -
  45   F   58   淋巴结恶性转移瘤   -   -   -
  46   F   38   淋巴结恶性转移瘤   ++   +++   -
  47   F   45   淋巴结恶性转移瘤   -   ++   -
  48   F   45   淋巴结恶性转移瘤   ++   ++   -
  49   F   29   淋巴结恶性转移瘤   +/   +/-   -
  50   F   61   淋巴结恶性转移瘤   +   ++   -
  51   F   46   乳头   ++   ++   -
  52   F   47   乳头   NR   NR   -
  53   F   40   正常乳腺   +/-   +/-   -
  54   F   43   正常乳腺   +++   +++   -
  55   F   40   正常乳腺   ++   +++   -
  56   F   40   正常乳腺   +++   ++   -
  57   F   45   正常乳腺   NR   NR   -
  58   F   44   正常乳腺   -   -   -
  59   F   37   正常乳腺   +++   +++   -
  60   F   51   正常乳腺   +++   +++   -
注：NR：样品不具有代表性；F：切片标本有折叠
表8：人体乳腺肿瘤和正常乳腺组织中c-erbB-2抗Her2与7BD-33-11A免疫组化染色结果
  数据   c-erbB-2   7BD-33-11A
  切片号   性别   年龄   诊断   评分   评分
  1   F   28   浸润性导管癌   +   ++
  2   F   71   实体乳头状癌   -   +/-
  3   F   26   浸润性导管癌   +/-   -
  4   F   43   浸润性导管癌   +/-   +/-
  5   F   39   浸润性导管癌   NR   +/-
  6   F   46   导管原位癌   -   +/-
  7   F   47   浸润性导管癌   +++   +
  8   M   67   浸润性导管癌   -   +
  9   F   33   浸润性导管癌   +++   -
  10   F   47   浸润性导管癌   ++   -
  11   F   49   侵袭性小叶癌   PD   -
  12   F   46   浸润性导管癌   -   -
  13   F   39   浸润性导管癌   +++   -
  14   F   43   浸润性小叶癌   -   +/-
  15   F   54   浸润性小叶癌   -   +/-
  16   F   58   浸润性导管癌   -   +/-
  17   F   37   浸润性导管癌   +++   -
  18   F   43   浸润性导管癌   -   +++
  19   F   51   浸润性导管癌   +   +
  20   F   80   髓样癌   -   -
  21   F   36   浸润性导管癌   NR   -
  22   F   59   浸润性导管癌   -   -
  23   F   34   导管原位癌   +++   +
  24   F   54   浸润性导管癌   +   +/-
  25   F   47   浸润性导管癌   -   ++
  26   F   53   浸润性导管癌   +++   -
  27   F   59   浸润性导管癌   +   -
  28   F   60   浸润性导管癌   -   -
  29   F   37   浸润性导管癌   +++   ++
  30   F   46   浸润性导管癌   -   +/-
  31   F   35   浸润性导管癌   -   -
  32   F   47   浸润性导管癌   +++   -
  33   F   54   浸润性导管癌   -   -
  34   F   47   浸润性导管癌   +++   -
  35   F   41   浸润性导管癌   -   -
  36   F   38   浸润性导管癌   ++   -
  37   F   55   浸润性导管癌   +/-   -
  38   F   65   浸润性导管癌   -   -
  39   M   66   浸润性导管癌   -   -
  40   F   44   浸润性导管癌   -   -
  41   F   53   淋巴结恶性转移瘤   -   -
  42   F   32   淋巴结恶性转移瘤   -   -
  43   F   58   淋巴结恶性转移瘤   ++   +/-
  44   F   52   淋巴结恶性转移瘤   +++   -
  45   F   58   淋巴结恶性转移瘤   -   -
  46   F   38   淋巴结恶性转移瘤   +++   -
  47   F   45   淋巴结恶性转移瘤   -   -
  48   F   45   淋巴结恶性转移瘤   -   -
  49   F   29   淋巴结恶性转移瘤   -   -
  50   F   61   淋巴结恶性转移瘤   -   -
  51   F   46   乳头   -   -
  52   F   47   乳头   -   -
  53   F   40   正常乳腺   -   -
  54   F   43   正常乳腺   -   -
  55   F   40   正常乳腺   +/-   -
  56   F   40   正常乳腺   -   -
  57   F   45   正常乳腺   -   -
  58   F   44   正常乳腺   -   -
  59   F   37   正常乳腺   -   -
  60   F   51   正常乳腺   -   -
例6
人体前列腺组织染色
为了确定7BD-33-11A是否表达于除乳腺癌之外的其它人体肿瘤，使用7BD-33-11A(S.N.10/603,006；Imgenex，San Diego，CA)探针对多种人体肿瘤组织进行检测。在进一步研究中，7BD-33-11A在人体前列腺癌中的染色图像已经确定(Imgenex Corporation，SanDiego，CA)。染色步骤见例4。抗体浓度为5μg/mL。
如表9所示，88％人体前列腺癌7BD-33-11A染色阳性。尽管7BD-33-11A在正常组织切片染色也呈强阳性，但是和正常组织相比，肿瘤组织标本中细胞膜染色更强。一例胚胎横纹肌肉瘤7BD-33-11A染色为阴性。在肿瘤的分期与7BD-33-11A抗原表达之间未发现直接相关关系。但是这些结果同样受到样本量小的影响。7BD-33-11A在前列腺癌组织样品中的着色部位仍旧为细胞膜上和细胞浆内。与乳腺癌组织样品比较，7BD-33-11A在前列腺癌组织细胞膜染色强度有所增加(图14)。对于正常前列腺组织标本来说，并没有观察到这种细胞膜染色强度的增加。
表9：人体前列腺癌7BD-33-11A免疫组化染色结果
  结合分数
 合计#   -   +/-   +   ++   +++   阳性合计   阳性百分率％
  患者样品   肿瘤  51   6   6   6   7   2617   45   88％
  正常  3   0   0   0   1   2   3   100％
  肿瘤亚型   腺癌  50   5   6   6   7   26   44   88％
  胚胎横纹肌肉瘤  1   1   0   0   0   0   0   0％
  肿瘤分期   I  1   1   0   0   0   0   0   0％
  II  1   0   0   0   0   1   1   100％
  III  2   1   0   0   0   1   1   100％
  IV  32   6   5   5   3   13   26   81％
因此，7BD-33-11A抗原不仅表达于乳腺癌细胞膜上，也同样表达于前列腺癌细胞膜上。这些结果说明了7BD-33-11A对于除乳腺癌之外其它肿瘤类型也可做为潜在的治疗药物。
有大量证据说明7BD-33-11A介导的抗肿瘤作用是通过其和变化的CD63构象型表位相结合完成的。在例2中已经说明7BD-33-11A抗体能够用于从表达抗原的细胞如MDA-MB-231免疫沉淀其所连接的抗原。进一步，利用流式细胞仪、细胞酶联免疫吸附试验和免疫组化染色技术，能够显示7BD-33-11A检测到的CD63上特异性结合于抗体的抗原部分。
因此，免疫沉淀7BD-33-11A抗原后能够抑制利用流式细胞仪、细胞酶联免疫吸附试验和免疫组化染色技术所显示的7BD-33-11A结合于该类细胞及组织的作用。所以与7BD-33-11A一样，其它抗CD63抗体也能够通过免疫沉淀技术分离CD63抗原的其它构型，应用同样的试验方法，抗原也能够用于抑制其它抗体与表达同种抗原的细胞或组织结合。
例7
体内MDA-MB-231肿瘤预防性抗体剂量反应试验
参考图15和图16的结果，挑选6到8周的雌性重症联合免疫缺陷小鼠，种植500万MDA-MB-231人体乳腺癌细胞。肿瘤细胞放在100μL盐水中于小鼠颈部经皮下注射入体内。所有小鼠随机分成4组，每组10只。肿瘤细胞种植后当天腹腔内分别注射0.2，2.0或20mg/kg 7BD-33-11A，以及20mg/kg IgG同种型对照抗体，抗体固体凝集物均经稀释液(2.7mM KCl，1mM KH2PO4，137mM NaCl和20mM Na2HPO4)稀释至300μL。每周重复注射一次。使用测径器每七天测量一次肿瘤直径直到有小鼠到达CCAC终点。研究过程中记录小鼠体重。在治疗终点(第55天)，0.2mg/kg治疗组小鼠肿瘤体积是同种型对照组的15％。经过配对t检验，其体积和对照组比较体积减小85％，具有显著性差异(p＜0.0001)。2.0或20mg/kg治疗组小鼠在治疗终点时仍无肿瘤生长。这种趋势持续到超过治疗期后。使用7BD-33-11A抗体治疗，在不同的剂量组，和对照组相比均使小鼠生存期延长。对照组小鼠于试验第104天(给药后第54天)全部死亡。与之相反，0.2mg/kg治疗组则一直存活至第197天(给药后第147天)，2.0mg/kg治疗组中50％小鼠直到第290天仍旧存活(给药后第240天)，此时20mg/kg治疗组全部存活。因此三种不同剂量7BD-33-11A治疗后，均明显减少了肿瘤负荷，和同种型对照抗体组比较，延长了小鼠生存期。最高剂量治疗组显示出对肿瘤生长最大抑制效果(100％)和对生存期的最大延长(无死亡小鼠)。所以，7BD-33-11A是一种潜在的抗肿瘤抗体，其药理和药效学方面的好处表明该抗体可用于治疗包括人在内的哺乳动物肿瘤性疾病。
例8
体内MDA-MB-231肿瘤联合化疗试验
参照图17和图18，挑选6到8周雌性重症联合免疫缺陷小鼠，种植500万MDA-MB-231人体乳腺癌细胞，肿瘤细胞放在100μL盐水中于小鼠颈部经皮下注射入体内。使用测径器每七天测量一次肿瘤直径。于第41天，大多数小鼠肿瘤体积达到100mm3(48-122mm3)，经过种植的8只小鼠被随机分成4个治疗组。7BD-33-11A抗体，顺铂(化疗药)，7BD-33-11A和顺铂，以及缓冲液对照，分别经小鼠腹腔注射入体内，其中7BD-33-11A和顺铂浓度分别为10mg/kg和9mg/kg。抗体固体凝集物及顺铂均经过稀释液(2.7mM KCl，1mMKH2PO4，137mM NaCl和20mM Na2HPO4)稀释至300μL。7BD-33-11A或缓冲液每周注射三次，在种植后第64天总量为10剂，。分别于第1、3和9天注射顺铂。每七天使用测径器测量肿瘤直径直到种植后第125天或者是有小鼠达到CCAC终点。研究过程中记录小鼠体重。研究结束根据CCAC指南对所有小鼠实行安乐死。
应用配对t检验，7BD-33-11A、顺铂以及两者联合治疗后肿瘤负荷均减少(图16)。试验第69天(给药后第5天)，三个组和缓冲液对照组比较均显示肿瘤体积缩小，三组分别为对照组的76％(p＜0.001)、79％(p＜0.001)和86％(p＜0.001)。体重用于评价小鼠生存状态。尽管顺铂和7BD-33-11A显示相似的肿瘤抑制作用，但是在体重下降程度方面，两者并不相同。7BD-33-11A和缓冲液对照组比较在各时间观测点上体重并无明显差别，事实上，两组在治疗阶段体重均有轻微增加。与之相反，顺铂治疗组小鼠出现体重下降，且在最后一次药物注射后更为明显。在种植后第55天，即最后一次注射顺铂后第4天，顺铂治疗组显示体重下降24-30％。由此，在一个公认的人体乳腺癌模型中7BD-33-11A和顺铂治疗组与缓冲液对照组比较前两者均能够减少肿瘤负荷。但7BD-33-11A治疗组和顺铂治疗组小鼠在体重比较后显示前者具有更好的生存状态。这些结果显示了7BD-33-11A抗体对于包括人在内的哺乳动物肿瘤治疗的药理学、药效学以及生活质量方面的好处。
例9
体内MDA-MB-468肿瘤联合化疗试验
参照图19和图20，挑选6到8周雌性重症联合免疫缺陷小鼠，种植200万MDA-MB-468人体乳腺癌细胞。肿瘤细胞放在100μL盐水中于小鼠颈部经皮下注射入体内。使用测径器每七天测量一次肿瘤直径。当大多数小鼠肿瘤体积达到100mm3(11-119mm3)时，种植后第27天将8只小鼠随机分成4组，分别将7BD-33-11A抗体、顺铂、7BD-33-11A和顺铂，以及缓冲液对照经小鼠腹腔注射入小鼠体内，7BD-33-11A与顺铂浓度分别为10mg/kg和6mg/kg。抗体固体凝集物和顺铂均经稀释液(2.7mM KCl，1mM KH2PO4，137mM NaCl和20mMNa2HPO4)稀释为300μL。7BD-33-11A和缓冲液对照第一周注射四次，然后每周注射三次，在种植后第50天达到总量11剂。分别于第1、6、11和16天注射顺铂。每七天使用测径器测量肿瘤直径，直到种植后第66天或者是有小鼠达到CCAC终点。研究过程中记录小鼠体重。研究结束根据CCAC指南对所有小鼠实行安乐死。
应用配对t检验，7BD-33-11A、顺铂以及两者联合治疗后肿瘤负荷均减少(图18)。试验第55天(给药后第5天)，三个组和缓冲液对照组比较均显示肿瘤体积缩小，三组分别为对照组的37％(p＜0.3958)、95％(p＜0.024)和97％(p＜0.017)。体重用于评价小鼠的生存状态。尽管顺铂和7BD-33-11A在很大程度上显示了相似的肿瘤抑制作用，但是在体重下降程度方面，两者并不相同。7BD-33-11A和缓冲液对照组比较在各时间观测点上体重并无明显差别，事实上，两组在治疗阶段体重均有轻微增加。与之相反，顺铂治疗组出现体重下降，且在最后一次注射后更为明显。在种植后第48天，即最后一次注射顺铂后第4天，顺铂治疗组显示体重下降20％。由此，在另一个公认的人体乳腺癌模型中7BD-33-11A和顺铂治疗组和缓冲液对照组比较前两者均能够减少肿瘤负荷。但是7BD-33-11A治疗组和顺铂组动物在体重比较提示前者有更好的生存状态。总的来说，在多种人肿瘤模型的试验结果中7BD-33-11A具有显著有益作用(延长生存期，和对照组比较能减轻肿瘤负荷，和化疗药比较更好的耐受性)。这些结果显示了7BD-33-11A抗体对于包括人在内的哺乳动物肿瘤治疗的药理学、药效学以及生活治疗方面的好处。
大量的证据表明7BD-33-11A通过结合CD63的细胞外loop 2介导抗肿瘤作用。例2中表明7BD-33-11A能用于免疫沉淀MDA-MB-231细胞表达的结合抗原。进一步应用流式细胞仪、细胞酶联免疫吸附试验和免疫组化染色技术，能够显示7BD-33-11A所检测的CD63上表达的特异性结合于抗体的抗原部分。
因此，免疫沉淀7BD-33-11A抗原后能够抑制利用流式细胞仪、细胞酶联免疫吸附试验和免疫组化染色技术显示的7BD-33-11A结合于该类细胞或组织作用。所以和7BD-33-11A一样，其它抗CD63抗体也能够应用免疫沉淀技术分离CD63抗原的其它构型，应用同样的试验方法，抗原也能够用于抑制其它抗体结合于表达同种抗原的细胞或组织。
本专利说明书中任何专利和专利申请都提示了该项发明所属的专业技术水平。在此所引用的全部专利和专利申请做为整体用于参考时和单个明确的专利相同。
人们可以理解，当解释某一发明时，不受到这里描述和显示的特别形式和安排部分的限制。对于那些在这方面的专业人员来说，虽然有不同的变化但是均不会离开该发明的范围；本发明也不仅仅局限于在此专利说明范围内。一个专业人员很容易理解目前这项发明易于施行，并且获得上述好处和结果，这是其本身所固有的特点。任何在此提到的寡核苷酸、肽、多肽、生物相关复合物、方法、步骤和技术都是目前所推荐的最具代表性的，具有可重复性，不仅局限于本发明范围。其中的任何改变以及其它用途均参考该领域内的专业人员意见，之前他们需要理解本发明的主旨，这些改变均定义在附加声明内。尽管本文前面描述本发明被特别优先收录，但是人们应该能够理解，如权利要求中所讲，本发明并不过分局限于该特别收录。事实上对于专业人员来说，明显的对于前文所介绍的用于进行本发明研究的各种模型的多种调整都在下面权利要求范围内。

Claims (40)

1.一种用于肿瘤患者的治疗方法，其中包括：
给肿瘤患者使用抗肿瘤抗体或抗体片断治疗，抗体片断的生产与生产对治疗肿瘤性疾病的抗体方法一致；上述抗体和片断的特点是具有对肿瘤细胞的细胞毒作用，本质上对非肿瘤细胞是良性的；
将上述抗体或片断与其在药理上能接受的佐剂制成混和制剂，然后以有效剂量用于介导上述肿瘤性疾病的治疗；
上述抗体做为单独的单抗或者是抗原结合片断结合在肿瘤组织表达的抗原部分上，该部分特点是能被具有明确特性的抗体识别，这种抗体是由储存在ATCC的PTA-4890克隆所编码的。
2.如权利要求1所述的用于肿瘤患者的治疗方法，其中抗体或片断为人源化或嵌合型。
3.如权利要求1所述的用于肿瘤患者的治疗方法，包括：
用以结合抗体或者抗原结合片断形成抗体结合物的毒素、酶、放射性化合物以及血细胞；
给上述肿瘤患者使用抗体结合物或者片断结合物；
将上述抗体或片断结合物和药理上能接受的佐剂制成混和制剂，然后以有效剂量用于介导上述肿瘤性疾病的治疗。
4.如权利要求3所述的用于肿瘤患者的治疗方法，所述的抗体或片断为人源化或嵌合型。
5.如权利要求1所述的用于肿瘤患者的治疗方法，其中：
抗体或片断的细胞毒性指的抗体依赖细胞介导的细胞毒性作用。
6.如权利要求1所述的用于肿瘤患者的治疗方法，其中：
抗体或片断的细胞毒性指的是补体依赖的细胞毒性作用。
7.如权利要求1所述的用于肿瘤患者的治疗方法，其中：
抗体或片断的细胞毒性是通过催化水解细胞化学键而介导。
8.如权利要求1所述的用于肿瘤患者的治疗方法，其中：
抗体或片断的细胞毒性是通过对肿瘤细胞上公认的抗原产生免疫反应而介导。
9.如权利要求1所述的用于肿瘤患者的治疗方法，其中：
抗体或片断的细胞毒性是通过干扰细胞膜表面的膜蛋白功能而介导。
10.如权利要求1所述的用于肿瘤患者的治疗方法，其中：
抗体或片断的细胞毒性是通过产生细胞内蛋白构象改变启动细胞死亡信号而介导。
11.如权利要求1所述的用于肿瘤患者的治疗方法，其中：
上述试验方法所使用的组织样品包括从特定个体上获得的肿瘤或者是非肿瘤细胞。
12.一种用于肿瘤患者的治疗方法，包括：
给肿瘤患者使用抗肿瘤抗体或抗原结合片断治疗，抗体及其片断生产和所述方法一致，即生产治疗肿瘤性疾病的抗体方法，上述抗体和片断特性是具有对肿瘤细胞的细胞毒作用，对非肿瘤细胞具有良性作用；
其中抗体是分离的由储存于ATCC的PTA-4890克隆所编码的单抗或者抗原结合片断，将抗体或片断与药理上能够接受的佐剂制成混和制剂，然后以有效剂量用于介导上述肿瘤疾病的治疗。
13.如权利要求12所述的用于肿瘤患者的治疗方法，其中抗体或片断为人源化或者嵌合型。
14.如权利要求12所述的用于肿瘤患者的治疗方法，包括：
用以结合抗体或者抗原结合片断形成抗体结合物的毒素、酶、放射性化合物以及血细胞；给上述肿瘤患者使用抗体结合物或者片断结合物；
将其中所指抗体或片断结合物与药理上能够接受的佐剂制成混和制剂，然后以有效剂量
用于介导上述肿瘤疾病的治疗。
15.如权利要求12所述的用于肿瘤患者的治疗方法，所述的抗体或从所述亚类中选择的片断为人源化或者嵌合型。
16.如权利要求12所述的用于肿瘤患者的治疗方法，其中：
抗体或片断的细胞毒性指的是抗体依赖细胞介导的细胞毒性作用。
17.如权利要求12所述的用于肿瘤患者的治疗方法，其中：
抗体或片断的细胞毒性指的是补体依赖的细胞毒性作用。
18.如权利要求12所述的用于肿瘤患者的治疗方法，其中：
抗体或片断的细胞毒性是通过催化水解细胞化学键而介导。
19.如权利要求12所述的用于肿瘤患者的治疗方法，其中：
抗体或片断的细胞毒性是通过对肿瘤细胞上公认的抗原产生免疫反应而介导。
20.如权利要求12所述的用于肿瘤患者的治疗方法，其中：
抗体或片断的细胞毒性是通过干扰细胞膜表面的膜蛋白功能而介导。
21.如权利要求12所述的用于肿瘤患者的治疗方法，其中：
抗体或片断的细胞毒性是通过产生细胞内蛋白构象改变启动细胞死亡信号而介导。
22.如权利要求12所述的用于肿瘤患者的治疗方法，其中：
上述试验方法所使用的组织样品包括从特定个体上获得的肿瘤或者是非肿瘤细胞。
23.一种在细胞表面表达cd63抗原部分的人体肿瘤细胞的细胞毒性介导方法，包括：
用单抗或抗原结合片断接触上述肿瘤细胞，所指抗体或抗原结合片断是单独的抗体或者抗原结合片断，能够CD63抗原部分结合，CD63抗原部分特性是能与抗体结合，这种抗体是确定的由储存于ATCC的PTA-4890克隆编码的单抗，上述抗原与抗体或抗原结合片断结合后结果会出现细胞毒性作用。
24.如权利要求23所述的细胞毒性介导方法，所述的单独的抗体或抗原结合片断为人源化或者嵌合型。
25.如权利要求23所述的细胞毒性介导方法，所述的单独的抗体或抗原结合片断与细胞毒素、酶合放射性化合物以及血细胞结合，由此可形成抗体结合物。
26.如权利要求23所述的细胞毒性介导方法，所述的单独的抗体或抗原结合片断为人源化或嵌合型。
27.如权利要求23所述的细胞毒性介导方法，所述的单独的抗体或抗原结合片断为鼠源型。
28.如权利要求23所述的细胞毒性介导方法，所述的肿瘤组织样品来源于一组包括结肠癌、卵巢癌、肺癌、前列腺癌和乳腺癌的肿瘤组织。
29.一种储存在ATCC的PTA-4890克隆编码的单独抗体或者抗原结合片断能特异性结合于CD63抗原确定表达CD63抗原的细胞结合试验，包括：
提供细胞样品；
提供单独的单抗或者抗原结合片断，并且能够和上述表达的CD63抗原部分结合，该部分的特性是能够被被抗体识别，而此抗体是由储存在ATCC的PTA-4890克隆编码的；
单独的单抗或者抗原结合片断和上述细胞样品相互作用；
确定表达能与单独的单抗或抗原结合片断相结合的CD63抗原部分的细胞的存在。
30.如权利要求29中所述的结合试验，所述的细胞样品是从患有结肠癌、卵巢癌、肺癌、前列腺癌或者乳腺癌的患者肿瘤组织中获得。
31.一种从表达CD63抗原部分的样品中分离或者筛选方法能够特异性结合单独的单抗或者抗原结合片断的细胞的分离或者筛选方法，其中所述的抗原部分特性是能够被被抗体识别，而此抗体是由储存在ATCC的PTA-4890克隆编码的，该方法包括：
提供细胞样品；
提供单独的单抗或者抗原结合片断，并且能够和上述表达的CD63抗原部分结合，该抗原部分的特性是能够被抗体识别，而此抗体是由储存在ATCC的PTA-4890克隆编码的；
单独的单抗或者抗原结合片断和上述细胞样品相互作用；
确定上述单独的单抗或者抗原结合片断和上述细胞样品相互作用；
由此CD63抗原部分能够特异性结合于储存在ATCC的PTA-4890克隆所编码的单独的单抗或者抗原结合片断，这样就能明确细胞样品中能够表达该CD63抗原部分的细胞。
32.如权利要求31所述的分离或者筛选方法，所述的细胞样品是从患有包括结肠癌、卵巢癌、肺癌、前列腺癌或者乳腺癌的肿瘤患者肿瘤组织中获得。
33.一种延长生存期和/或延缓疾病进展的方法，其通过治疗哺乳动物体内人体肿瘤，其中肿瘤表达特异性结合于单抗或者是抗原结合片断的抗原，抗体和抗原结合片断是由储存在ATCC的PTA-4890克隆编码，本方法包括给哺乳动物使用有效剂量的单抗以减少肿瘤负荷，延缓肿瘤进展和/或延长生存期。
34.如权利要求33所述的方法，所述的抗体与细胞毒性部分相结合。
35.如权利要求33所述的方法，所述的细胞毒性部分是指放射性表位。
36.如权利要求33所述的方法，所述的抗体能激活补体。
37.如权利要求33所述的方法，所述的抗体能介导抗体依赖的细胞毒性作用。
38.如权利要求33所述的方法，所述的抗体为鼠源型抗体。
39.如权利要求33所述的方法，所述的抗体为人源化抗体。
40.如权利要求33所述的方法，所述的抗体为嵌合型抗体。
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