CN1977050B

CN1977050B - 丙型肝炎病毒基因型的确定

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Publication number: CN1977050B
Application number: CN200580007156.1A
Authority: CN
Inventors: V·A·叶拉金; S·劳; B·希尔
Original assignee: Third Wave Technologies Inc
Current assignee: Third Wave Technologies Inc
Priority date: 2004-01-07
Filing date: 2005-01-07
Publication date: 2012-09-05
Anticipated expiration: 2025-01-07
Also published as: US20050196750A1; EP1716250A2; CA2552949C; CA2552949A1; HK1098512A1; US20090111092A1; US7473773B2; EP1716250B1; JP5138230B2; WO2005067643A3; CN1977050A; WO2005067643A8; EP1716250A4; JP2007517525A; WO2005067643A2; US8071750B2

Abstract

本发明提供了用于检测和表征HCV序列的组合物和方法。更特别地，本发明提供了使用侵入性切割结构分析(例如，INVADER分析)，来筛选例如，来自患者的核酸样品，以确定HCV基因型的组合物、方法和试剂盒。

Description

丙型肝炎病毒基因型的确定

本申请要求申请日为2004年01月07日的美国临时申请系列号No.60/534,618和申请日为2004年04月20日的美国临时申请系列号No.60/563,629的权利，二者以其全部内容引入这里作为参考。

发明领域

本发明提供了与用于基础研究，临床研究，以及用于临床检测分析开发的核酸检测分析相关的方法和组合物。特别地，本发明提供了用于确定丙型肝炎病毒基因型的方法。

背景

丙型肝炎病毒(HCV)几乎是所有非甲非乙型肝炎(NANBH)的病例的原因(Choo，Q.-L.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：2451-2455(1988))，而且是全世界持久性的健康威胁，每年报道的新病例超过一百万(Zein，N.N.Clin.Micro.Rev.13：223-235(2000))。HCV感染通常是慢性和持久性的。HCV感染最严重的后果是慢性肝病和死亡，在美国HCV感染是肝脏移植的主要推动力(Zein，出处同前)。

HCV是一种正链单链RNA病毒，长度大约为10kb，属于黄病毒(Flaviviridae)家族(Zein，出处同前)。在不同地理区域发现的分离物中存在相当多的异种。这些差异被分类为多种基因型和亚型。虽然各种不同的标准已经用于表征这些基因型，但是采用了2种主要的分类模式。Peter Simmonds创建了更广泛应用的模式，其使用阿拉伯数字来表示不同的基因型，使用拉丁字母表示亚型，例如，1a，1b，2a型，等等，(综述见Simmonds，P.Hepatology.二月；21(2)：570-83(1995)和Simmonds，P.J Hepatol.；31 Suppl 1：54-60(1999))。根据该体系，基因型1-3是在北美，欧洲和日本发现的普遍类型，其余类型以不同的频率在亚洲和非洲的部分地区发现。因此，在一些情况下，HCV基因型可能是流行病学重要的，例如在感染的病因学确定中。

已经采取了努力以阐明不同基因型的临床重要性。一些研究表明，1型感染，尤其是1b型，可能与更严重的疾病和较早地复发相关(Zein，N.N.等人，Liver Transplant.Surg.1：354-357(1995)；Gordon等人，Transplantation 63：1419-1423(1997))。某些研究也表明，除了1型(例如1a或1b)之外的基因型可能更有利地对各种治疗，例如干扰素产生应答(McHutchison，J.G.，等人，N.Engl.J.Med.，339：1485-1492(1998))。已经表明，HCV基因型的确定联合其它的诊断标记，如病毒负荷，可能在疾病预后(Zein，N.N.出处同前)和确定治疗的过程(National Institutes of HealthConsensus Development Conference Statement；Management ofHepatitis C：2002；六月，10-11，2002)中是重要的。

HCV基因组的不同区域用于确定基因型。HCV基因组包括相对保守的区域，如5′和3′非翻译区(UTR)，可变区(例如E1和非结构区(NS)5B)，以及高变区，如那些编码包膜蛋白的区域(Halfon，P.CLI，四月，2002)。已经对保守区域中特定序列的存在与可变区尤其是NS-5B中序列的相关性进行了研究(Stuyver，L.，等人，J.Clin.Micro.，34：2259-2266(1996))。作为这些研究的结果，基于保守区域尤其是5′UTR的基因分型分析，已经发展到简化任务为鉴定样品中存在哪种病毒型或哪些病毒型。假定存在商业可获得的病毒负荷分析，其依赖于扩增全部或部分5′UTR，根据该保守区域中分隔的序列差异确定HCV基因型的能力提供了一种方便的方法从单个扩增的核酸，例如RT-PCR或转录介导的扩增(TMA)扩增子，获得广泛的诊断信息。

各种分子生物学方法已经用于使用5′UTR确定HCV基因型的任务中。这些方法包括反向斑点印迹分析(例如，Inno LIPA，Innogenetics，Ghent，Belgium，如Stuyver，L.等人，J ClinMicrobiol.1996 Sep；34(9)：2259-66，美国专利号6495670和相关的美国与国际专利和未决申请中所述；直接DNA测序(例如，TRUEGENE HCV 5′NC基因分型试剂盒，Bayer Diagnostics，Berkeley，CA，如Germer，J.J.等人J Clin Microbiol.2003 Oct；41(10)：855-7中所述)，和焦磷酸测序(Pyrosequencing AB，Uppsala，Sweden，如美国专利号6258568与相关的美国和国际专利以及未决申请中所述)。

除了这些分子方法外，已经引入了血清方法用于确定基因型，例如，RIBA SIA测试(Chiron Corp.，Emeryville，CA) 和Murex HCV血清分型酶免疫分析(Murex Diagnostics Ltd，Dartford，UK)。一些研究表明，血清学分型可能在特异性和灵敏度方面有局限(Zein，出处同前)。

因此，需要一种快速、灵敏、精确和均一的方法，用于在临床样品例如血液或血液级分中准确地确定HCV基因型，而不需要电泳或斑点印迹技术。考虑到目前对分子方法的依赖，可能存在对确定HCV基因型的可规模化和可自动化方法的前进的和增加的需要。

发明概述

本发明提供了用于确定丙型肝炎病毒(HCV)基因型的组合物和方法。更特别地，本发明提供了使用侵入性切割结构分析(invasivecleavage structur eassays)，例如，从患者筛选包含HCV序列的核酸样品，以鉴定存在的病毒的基因型的组合物、方法和试剂盒。本发明可用于检测单一病毒感染或由不止一种HCV基因型组成的混合感染。

在其他的实施方案中，如例如，美国专利号6,291,187和6,323,009，以及PCT公开号No.WO 01/88190和WO 02/00934中提供的，使用纯化的聚合酶，在多引物基因组DNA的基础上，制备了适于与本发明的方法和组合物一起使用的合成DNA，每个都以其全部内容引入这里作为参考用于各种目的。在这些实施方案中，使用DNA聚合酶，如高持续合成的φ29聚合酶(如例如美国专利5,198,543和5,001,050所述，每个都以其全部内容引入这里作为参考用于各种目的)，联合抗核酸外切酶的随机引物，如六聚物，进行DNA如基因组DNA的扩增。

方法不受靶核酸性质的限制。在一些实施方案中，靶核酸是单链或双链DNA或RNA。在一些实施方案中，双链核酸在形成切割结构之前变成单链(例如，通过加热)。在一些实施方案中，靶核酸的来源包括含有基因组DNA的样品。样品包括，但是不局限于，组织切片、血液、血液级分(例如血浆、血清)唾液、大脑脊髓液、胸膜液、乳汁、淋巴、痰液和精液。

在一些实施方案中，靶核酸包括基因组DNA或mRNA。在其他的实施方案中，靶核酸包括合成DNA或RNA。在一些优选的实施方案中，样品中的合成DNA或RNA使用纯化的聚合酶产生。在一些优选的实施方案中，使用纯化的聚合酶产生合成DNA包括使用PCR。在一些尤其优选的实施方案中，产生的合成DNA包括HCV基因组的全部或部分5′UTR。在一些优选的实施方案中，合成DNA的产生伴随有使用纯化的逆转录酶，以在PCR之前产生cDNA。在一些特别优选的实施方案中，用商业的试剂盒如COBAS AMPLICOR或COBAS TAQMAN(RocheMolecular Systems)进行这种RT-PCR。该方法不局限于HCV基因组的特定区域。在一些优选的实施方案中，本发明的寡核苷酸涉及存在于5′UTR中的核苷酸。在其他的实施方案中，可检测适于基因型分析的备择区域，例如，NS-5A，NS-5B，核心区域或3′UTR。在一些优选的实施方案中，合成DNA的产生包括使用RNA-DNA复合引物进行扩增的方法和组合物 (例如，如美国专利号6,251,639中所述，以其全部内容引入这里作为参考)。在其他的优选实方案中，使用适于与本发明的方法一起使用的纯化的DNA聚合酶产生合成DNA，包括使用滚环扩增，(例如，如美国专利号6,210,884，6,183,960和6,235,502中所述，以其全部内容引入这里作为参考)。在其他的优选实施方案中，合成DNA的产生包括使用含有成环序列的核酸进行扩增，例如，如美国专利号6,410,278中所述，以其全部内容引入这里作为参考。在其他的实施方案中，RNA聚合酶用于产生RNA扩增子，例如通过如美国专利号5,554,516和相关的专利以及未决申请中所述的转录介导的扩增(TMA)，以其全部内容引入这里作为参考。

本发明提供的HCV基因分型分析可以包括，但不限于，酶错配裂解方法(例如，Variagenics，美国专利号No.6,110,684，5,958,692，5,851,770，以其全部内容引入这里作为参考)；聚合酶链式反应；分支的杂交方法(例如，Chiron，美国专利号5,849,481，5,710,264，5,124,246，和5,624,802，以其全部内容引入这里作为参考)；滚环复制(例如，美国专利号6,210,884，6,183,960和6,235,502，以其全部内容引入这里作为参考)；NASBA(例如，美国专利号5,409,818，以其全部内容引入这里作为参考)；分子信标技术(例如，美国专利号6,150,097，以其全部内容引入这里作为参考)；E-传感器技术(Motorola，美国专利号6,248,229，6,221,583，6,013,170和6,063,573，以其全部内容引入这里作为参考)；循环探针技术(例如，美国专利号5,403,711，5,011,769和5,660,988，以其全部内容引入这里作为参考)；Dade Behring信号放大方法(例如，美国专利号6,121,001，6,110,677，5,914,230，5,882,867和5,792,614，以其全部内容引入这里作为参考)；连接酶链式反应(Barnay Proc.Natl.Acad.Sci USA 88，189-93(1991))；以及夹心杂交方法(例如，美国专利号5,288,609，以其全部内容引入这里作为参考) 的检测分析组合使用。

在一些实施方案中，本发明提供了包括非扩增的寡核苷酸检测分析的试剂盒或组合物，其设计用于检测至少一种HCV基因型序列。在其它的实施方案中，非扩增的寡核苷酸检测分析包括第一和第二寡核苷酸，其设计形成侵入性切割结构(例如，INVADER分析)，其与包括所述至少一种HCV基因型序列的靶序列相联合。在特定的实施方案中，第一寡核苷酸包含5′部分和3′部分，其中3′部分设计成与靶序列杂交，其中5′部分设计成不与靶序列杂交。在其它的实施方案中，第二寡核苷酸包含5′部分和3′部分，其中5′部分设计成与靶序列杂交，其中3′部分设计成不与靶序列杂交。

在一些实施方案中，检测的HCV 5′UTR序列是在Genbank，NCBI，肝炎病毒数据库中可见的任何序列或其变体。应当理解，序列将随时间而变化，而且其它的HCV变种，现在已知的，或以后发现的，都可容易地适于本发明的方法和组合物，通过这里的描述。

在某些实施方案中，寡核苷酸检测分析选自测序分析、聚合酶链式反应分析、杂交分析、使用与突变互补的探针的杂交分析、微阵列分析、珠子阵列分析、引物延伸分析、酶错配裂解分析、分支的杂交分析、滚环复制分析、NASBA分析、分子信标分析、循环探针分析、连接酶链式反应分析、侵入性切割结构分析、ARMS分析和夹心杂交分析。

在一些实施方案中，本发明提供了确定HCV基因型的方法，包括：

a)提供：i)来自受试者的样品；ii)从HCV基因组产生双链DNA的方法；iii)包括寡核苷酸检测分析的组合物(例如，如这里所述的)；和b)使所述样品与所述组合物接触，以便确定存在或缺乏至少一种HCV基因型。在一些实施方案中，样品是血液样品或血液级分样品(例如，血浆、血清、红血球)、口腔拭子样品，例如，口腔细胞、子宫颈拭子样品、粪便、唾液样品或来自受试者的其他生物液体如胸膜液、痰液、尿、羊膜、脑脊髓液或汗液。

仍然在其他的实施方案中，本发明还提供了一种用于对包含HCV的样品进行基因分型的方法，其包括以下步骤：a)检测从所述HCV样品的5′UTR扩增的核酸中一种或多种(例如，2种或多种，5种或多种)单核苷酸多态性；b)根据来自步骤a的信息产生5′UTR基因型模式；而且，在一些实施方案中，对所述5′UTR基因型模式与预先确定的HCV信息矩阵进行比较，以便确定所述受试者的HCV基因型。在一些实施方案中，预先确定的HCV信息矩阵保存在计算机存储器中。在一些优选的实施方案中，该方法更进一步地包括在选择用于受试者的疗法中使用所述HCV基因型的步骤(例如，选择合适的药物，选择合适的药物剂量，避免某些药物，继续施用某种药物若干天等等)。

在一些实施方案中，本发明提供了包括侵入性切割检测分析的组合物，其中侵入性切割检测分析设计用于检测HCV的5′UTR序列选自-245，-167，-163，-155，-144，-118和-80的位置上的单核苷酸多态性。

在其他的实施方案中，本发明提供的方法包括以下步骤：a)提供：i)来自受试者的样品，其中该样品怀疑包含HCV，和ii)包括侵入性切割检测分析的组合物，其中侵入性切割检测分析设计用于检测HCV的5′UTR序列选自-245，-167，-163，-155，-144，-118和-80的位置上的单核苷酸多态性；和b)使该组合物与样品在能检测至少一种单核苷酸多态性的条件下接触。在某些实施方案中，该接触确定了碱基位置的同一性(例如，“G，”“C，”“A，”或“T”)。在其他的实施方案中，样品来自于受试者。

在某些实施方案中，侵入性切割分析包括第一寡核苷酸，其中该第一寡核苷酸包含5′部分和3′部分，其中该3′部分设计成与HCV的5′UTR序列杂交，而且其中该5′部分设计成不与HCV的5′UTR序列杂交。在其他的实施方案中，第一寡核苷酸是选自以下的序列：SEQ ID NO：2-4，7，8，10，14，16，17，19，22，24，26，30，33，34，36，42，43，45-47，49，50，55，57，59和63。

在特定的实施方案中，侵入性切割分析包括第二寡核苷酸，其中该第二寡核苷酸包含3′部分和3′部分，其中该5′部分设计成与HCV的5′UTR序列杂交，而且其中该3′部分设计成不与HCV的5′UTR序列杂交。在其他的实施方案中，第二寡核苷酸是选自以下的序列：1，5，6，9，11-13，15，18，20，21，23，25，29，31，32，35，37-41，44，48，51-54，56和58。

在一些实施方案中，HCV的5′UTR序列包括RNA(例如，可以检测HCV病毒的RNA，而不用转变为cDNA)。在某些实施方案中，HCV的5′UTR序列包括DNA(例如，在检测之前把HCV的RNA转变为cDNA)。

在一些实施方案中，本发明提供的方法包括以下步骤：a)提供：i)来自受试者的样品，其中该样品怀疑含有丙型肝炎病毒，和ii)多重寡核苷酸检测分析，其中每个寡核苷酸检测分析设计用于检测HCV的5′UTR序列中的单核苷酸多态性，和b)在至少能确定每个单核苷酸多态性的部分基因型信息的条件下，使样品与该多重寡核苷酸检测分析接触，从而产生5′UTR基因型模式，其中该5′UTR基因型模式足以对丙型肝炎病毒进行基因分型。

在某些实施方案中，该方法更进一步地包括c)根据该5′UTR基因型模式，将丙型肝炎病毒基因分型为如基因型I、II、III、IV、V或VI。在优选的实施方案中，基因分型把丙型肝炎病毒分类为如基因型I、IV或V。在其他的实施方案中，多重寡核苷酸检测分析包括侵入性切割结构类型分析。在特定的实施方案中，多重寡核苷酸检测分析包括至少一种以下类型的分析：TAQMAN分析，测序分析，聚合酶链式反应分析，杂交分析，使用与突变互补的探针进行的杂交分析，微阵列分析，珠子阵列分析，引物延伸分析，酶错配裂解分析，分支的杂交分析，滚环复制分析，NASBA分析，分子信标分析，循环探针分析，连接酶链式反应和夹心杂交分析。在特定的实施方案中，多重寡核苷酸检测分析包括非扩增的寡核苷酸类型检测分析。

在一些实施方案中，多重寡核苷酸检测分析中至少一个包括第一寡核苷酸，其中该第一寡核苷酸包含5′部分和3′部分，其中该3′部分设计成与HCV的5′UTR序列杂交，而且其中该5′部分设计成不与HCV的5′UTR序列杂交。在其他的实施方案中，多重寡核苷酸检测分析中至少一个包括第二寡核苷酸，其中该第二寡核苷酸包含3′部分和3′部分，其中该5′部分设计成与HCV的5′UTR序列杂交，而且其中该3′部分设计成不与HCV的5′UTR序列杂交。在另外的实施方案中，多重寡核苷酸检测分析包括当与5′UTR序列杂交时含有至少一个错配的寡核苷酸。

在其他的实施方案中，多重寡核苷酸检测分析包括至少两个寡核苷酸检测分析(例如，2或3)。在更进一步地实施方案中，多重寡核苷酸检测分析包括至少4个寡核苷酸检测分析(例如，4，5，6或7)。在一些实施方案中，多重寡核苷酸检测分析包括至少8个寡核苷酸检测分析(例如，8，9或10)。

在另外的实施方案中，HCV的5′UTR序列中的单核苷酸多态性位于以下位置中的至少两个位置：-245，-167，-163，-155，-144，-118和-80。在其他的实施方案中，5′UTR基因型模式表明：i)-163位置为“A”；ii)在-144位置处没有“C”；和任选地iii)在-167位置处没有“C”；或-167位置处为“T”；而且其中该方法更进一步地包括根据5′UTR基因型模式把丙型肝炎病毒基因分型为基因型I。

在某些实施方案中，5′UTR基因型模式表明：i)-163位置为“A”；ii)-80位置为“T”；和任选地iii)在-167位置处没有“C”；或-167位置处为“T”；而且其中该方法更进一步地包括根据5′UTR基因型模式把丙型肝炎病毒基因分型为基因型I。在更进一步地实施方案中，5′UTR基因型模式表明：i)-163位置为“A”；ii)-72位置为“C”；和任选地iii)在-167位置处没有“C”；或-167位置处为“T”；而且其中该方法更进一步地包括根据5′UTR基因型模式把丙型肝炎病毒基因分型为基因型I。

在其他的实施方案中，5′UTR基因型模式表明：i)-122位置为“A”；ii)在-144位置处没有“C”；和任选地iii)在-167位置处没有“C”；而且其中该方法更进一步地包括根据5′UTR基因型模式把丙型肝炎病毒基因分型为基因型I。在另外的实施方案中，5′UTR基因型模式表明：i)-122位置为“T”；ii)-80位置处为“T”；和任选地iii)在-167位置处没有“C”；而且其中该方法更进一步地包括根据5′UTR基因型模式把丙型肝炎病毒基因分型为基因型I。

在特定的实施方案中，5′UTR基因型模式表明：i)-122位置为“ T”；ii)-72位置处为“T”；和任选地iii)在-167位置处没有“C”；而且其中该方法更进一步地包括根据5′UTR基因型模式把丙型肝炎病毒基因分型为基因型I。在某些实施方案中，5′UTR基因型模式表明：i)-132位置为“A”；和任选地ii)在-163位置处为“G”；而且其中该方法更进一步地包括根据5′UTR基因型模式把丙型肝炎病毒基因分型为基因型II。

在更进一步地实施方案中，5′UTR基因型模式表明：i)-119位置为“Y”(“C”或“T”)；和任选地ii)在-167位置处没有“C”，或-167位置为“T”；而且其中该方法更进一步地包括根据5′UTR基因型模式把丙型肝炎病毒基因分型为基因型II。在一些实施方案中，5′UTR基因型模式表明：i)-245位置为“T”；和ii)-167位置为“C”；而且其中该方法更进一步地包括根据5′UTR基因型模式把丙型肝炎病毒基因分型为基因型IV。

在另外的实施方案中，5′UTR基因型模式表明：i)-245位置为“T”；和ii)-118位置为“A”；而且其中该方法更进一步地包括根据5′UTR基因型模式把丙型肝炎病毒基因分型为基因型IV。在某些实施方案中，5′UTR基因型模式表明：i)-167位置为“T”；ii)-163位置处为“G”；和iii)-155位置为“C”；而且其中该方法更进一步地包括根据5′UTR基因型模式把丙型肝炎病毒基因分型为基因型V。

在其他的实施方案中，5′UTR基因型模式表明：i)-122位置为“C”；和ii)-117位置为“G”；而且其中该方法更进一步地包括根据5′UTR基因型模式把丙型肝炎病毒基因分型为基因型V。在特定的实施方案中，5′UTR基因型模式表明：i)-117位置为“G”；和ii)-80位置为“C”；而且其中该方法更进一步地包括根据5′UTR基因型模式把丙型肝炎病毒基因分型为基因型VI。

在一些实施方案中，5′UTR基因型模式表明：i)-118位置为“A”；和ii)-80位置为“C”；而且其中该方法更进一步地包括根据5′UTR基因型模式把丙型肝炎病毒基因分型为基因型VI。在更进一步地实施方案中，5′UTR基因型模式表明：i)-122位置为“T”；和ii)-80位置为“C”；而且其中该方法更进一步地包括根据5′UTR基因型模式把丙型肝炎病毒基因分型为基因型VI。在其他的实施方案中，5′UTR基因型模式表明：i)-122位置为“T”；和ii)-72位置为“T”；而且其中该方法其他的包括根据5′UTR基因型模式把丙型肝炎病毒基因分型为基因型VI。

定义

为了便于理解本发明，许多术语和短语定义如下：

如这里使用的，术语“受试者”和“患者”指任何有机体包括植物，微生物和动物(例如，哺乳动物如狗、猫、家畜和人)。

如这里使用的，术语“INVADER分析试剂”指用于检测靶序列的一种或多种试剂，所述试剂包括在存在靶序列时能形成侵入性切割结构的寡核苷酸。在一些实施方案中，INVADER分析试剂更进一步地包括在存在侵入性切割结构时用于检测的试剂(例如，切割试剂)。在一些实施方案中，寡核苷酸包括第一和第二寡核苷酸，所述第一寡核苷酸包括与靶核酸的第一区域互补的5′部分，而且所述第二寡核苷酸包括3′部分和5′部分，所述的5′部分与第一部分下游和相邻第一部分的靶核酸的第二区域互补。在一些实施方案中，第二寡核苷酸的3′部分包括不与靶核酸互补的的3′末端核苷酸。在优选的实施方案中，第二寡核苷酸的3′部分由不与靶核酸互补的单核苷酸组成。

在一些实施方案中，INVADER分析试剂设计用于检测靶核酸序列，该靶核酸序列包括被包含双链区域的插入区分隔的第一和第二非连续单链区域。在优选的实施方案中，INVADER分析试剂包括能与靶核酸序列的所述第一和第二非连续单链区域结合的桥连寡核苷酸。在尤其优选的实施方案中，所述INVADER分析试剂的所述第一或所述第二寡核苷酸中的一个或二者是桥连寡核苷酸。

在一些实施方案中，INVADER分析试剂更进一步地包括固体支持物。例如，在一些实施方案中，分析试剂的一个或多个寡核苷酸(例如，第一和/或第二寡核苷酸，无论是桥连的或非桥连的)附着于所述固体支持物。在一些实施方案中，INVADER分析试剂更进一步地包括缓冲液。在一些优选的实施方案中，缓冲液包括二价阳离子的来源(例如，Mn²⁺和/或Mg²⁺离子)。共同组成INVADER分析试剂的单个成分(例如，寡核苷酸、酶、缓冲液、靶核酸)称为“INVADER分析试剂组分”。

在一些实施方案中，INVADER分析试剂更进一步地包括，与第一靶核酸的第一部分上游的靶核酸之第三部分互补的第三寡核苷酸。仍然在其他的实施方案中，INVADER分析试剂更进一步地包括靶核酸。在一些实施方案中，INVADER分析试剂更进一步地包括第二靶核酸。仍然在其他的实施方案中，INVADER分析试剂更进一步地包括含有与第二靶核酸的第一区域互补的5′部分的第三寡核苷酸。在一些特定的实施方案中，第三寡核苷酸的3′部分与第二靶核酸共价连接。在其他的特定实施方案中，第二靶核酸更进一步地包括5′部分，其中第二靶核酸的该5′部分是第三寡核苷酸。仍然在其他的实施方案中，INVADER分析试剂更进一步地包括ARRESTOR分子(例如，ARRESTOR寡核苷酸)。

在一些优选的实施方案中，INVADER分析试剂更进一步地包括用于检测核酸切割产物的试剂。在一些实施方案中，INVADER分析试剂中的一个或多个寡核苷酸包括标记。在一些实施方案中，所述第一寡核苷酸包括标记。在其他的优选实施方案中，所述第三寡核苷酸包括标记。在尤其优选的实施方案中，试剂包括用能产生荧光共振能量转移(FRET)作用的部分来标记的第一和/或第三寡核苷酸。

在一些实施方案中，一种或多种INVADER分析试剂可以预先配制的形式提供(也即，预先测量用于该过程的某个步骤，而不用再测量或再配制)。在一些实施方案中，选择的INVADER分析试剂组分同时进行混合并预先配制。在其他的实施方案中，在优选的实施方案中，预先配制的分析试剂组分被预先配制并提供于反应容器中(包括而不限于反应管或孔，如在例如微孔滴定板中)。在尤其优选的实施方案中，预先配制的INVADER分析试剂组分在反应容器中干燥(例如，脱干或冻干)。

在一些实施方案中，INVADER分析试剂作为试剂盒提供。如这里使用的，术语“试剂盒”指用于递送材料的任何递送体系。在反应分析的上下文中，这种递送体系包括允许从一个地方贮存，转运或递送反应试剂(例如，合适的容器中的寡核苷酸，酶等等)和/或支持材料(例如，缓冲液，用于执行分析的书面指导等等。)到另一个地方的体系。例如，试剂盒包括一个或多个含有相关的反应试剂和/或支持材料的封装体(例如，盒子)。如这里使用的，术语“分离试剂盒(fragmented kit)”指包括两个或多个分离的容器的递送体系，每个容器含有总试剂盒组分的一个亚部分。

容器可以同时或单独地递送给目的受体。例如，第一容器可包含用于分析的酶，而第二容器包含寡核苷酸。术语“分离试剂盒”指包括含有联邦食品药品和化妆品法案第520(e)项下规定的分析物特异性试剂(ASR)的试剂盒，但不限于此。甚至，任何包括两个或多个分离的容器的递送系统，其中每个都含有总试剂盒组分的一个亚部分，都包括在术语“分离试剂盒”中。相反，“组合试剂盒”指在一个容器(例如，一个盒子中装有每种所需的组分)含有反应分析的全部组分的递送体系。术语”试剂盒”包括分离和组合试剂盒。

在一些实施方案中，本发明提供了INVADER分析试剂试剂盒，其含有实施本发明所需的一种或多种组分。例如，本发明提供了用于储存或递送实践INVADER分析所需的酶和/或反应组分的试剂盒。试剂盒可包括分析必要的或所需的任何和所有组分，包括但不限于，试剂本身、缓冲液、对照试剂(例如，组织样品、阳性和阴性对照靶寡核苷酸等等)、固体支持物、标记、书面的和/或图示的指导和产品信息、抑制剂、标签和/或检测试剂、包装环境参数调节(例如，冰冻、干燥剂等等)等等。在一些实施方案中，试剂盒提供了部分所需的组分，其中期望用户提供剩余的组分。在一些实施方案中，试剂盒包括两个或多个分离的容器，其中每个容器装有部分待递送的组分。例如，第一个容器(例如，盒子)可包含酶(例如，处于合适的储存缓冲液和容器中的结构特异性裂解酶)，而第二个盒子可包含寡核苷酸(例如，INVADER寡核苷酸、探针寡核苷酸、对照靶寡核苷酸等等)。

如这里使用的术语“标记”指可用于提供可检测(优选可计量的)作用的任何原子或分子，而且其可附着于核酸或蛋白质。标记包括但不局限于染料；放射性标记如32P；结合部分如生物素；半抗原如地高辛配基；发光，磷光或荧光部分；质量标签；单独的荧光染料或与能通过荧光共振能量转移(FRET)抑制或改变发射光谱的部分组合。标记通过荧光、放射性、比色法、重量分析法、X-射线衍射或吸收、磁性、酶活性、质量特性或受质量影响的特性(例如，MALDI飞行时间质谱法)等等可提供可检测的信号。标记可以是带电荷的部分(正或负电荷)或者可选择地，可以是中性电荷。标记可以包括或由核酸或蛋白质序列组成，只要包括该标记的序列是可检测的。

如这里使用的，关于信号的术语“独特的”指能使一个区别于另一个的信号，例如，通过光谱特性如荧光发射波长、显色、吸光度、质量、大小、荧光偏振特性、电荷等等，或通过与另一个部分如与化学试剂、酶、抗体等等相互作用的能力。

如这里使用的，术语“互补的”或“互补性”用于指通过碱基配对规则相关的多核苷酸(也即，核苷酸如寡核苷酸或靶核酸的序列)。例如，对于序列“5′-A-G-T-3′”，与序列“3′-T-C-A-5′”是互补的。互补性可以是“部分的”，其中根据碱基配对规则仅仅一些核酸的碱基是匹配的。或者，核酸之间可以是“完全”或“全部”互补。核酸链之间互补的程度对核酸链之间杂交的效率和强度具有显著的影响。这在扩增反应，以及取决于核酸之间的结合的检测方法中尤其重要。该术语也可用于单个的核苷酸，尤其在多核苷酸的上下文中。例如，寡核苷酸内特定的核苷酸因为与另一个核酸链内核苷酸的互补或不互补而被注意，相反或者对余下的寡核苷酸与核酸链之间的互补性进行比较。

术语“同源性”与“同源”指同一性的程度。可以是部分同源或者完全同源。部分同源序列是一个序列与另一个序列的同一性小于100％。

如这里使用的，术语“杂交”用于指互补核酸的配对。杂交与杂交的强度(也即，核酸之间的相关强度)受这些因子的影响如核酸之间的互补程度，涉及的条件的严谨度，和形成的杂种的T_m。“杂交”方法包括一个核酸与另一个互补核酸也即具有互补的核苷酸序列的核酸退火。包含互补序列的核酸的两个聚合物找到彼此，并通过碱基配对相互作用退火的能力是熟知的现象。Marmur和Lane最早观察到“杂交”过程，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 46：453(1960)和Doty等人，Proc.Natl Acad.Sci.USA 46：461(1960)，接着把该过程改进成为现代生物学的必需工具。

如这里使用的核酸序列的互补，指一个寡核苷酸当其与某个核酸序列进行序列比对，以使一个序列的5′末端与另一个序列的3′末端配对时，其是“反向平行结合”的。某些在天然核酸中通常不能找到的碱基，可包括在本发明的核酸中，而且包括，例如，肌苷和7-脱氮鸟嘌呤。互补不必是最佳的；稳定的双螺旋可包含错配的碱基对或不匹配的碱基。核酸技术领域的熟练技术人员可以根据许多变量包括，例如，寡核苷酸的长度，寡核苷酸的碱基组成和序列，离子强度以及错配的碱基对发生率，凭经验确定双螺旋的稳定性。

如这里使用的，术语“T_m”用于指“解链温度”。解链温度是一群双链核酸分子半分离成单链的温度。用于计算核酸的T_m的几个等式是本领域熟知的。如标准参考文献表明，当核酸处于1M NaCl的水溶液中时，其T_m值的简单估计可通过以下等式计算：T_m＝81.5+0.41(％G+C)，(参见，例如，Anderson和Young，Quantitative FilterHybridization，Nucleic Acid Hybridization(1985)。其它的参考文献(例如，Allawi，H.T.& SantaLucia，J.，Jr.Thermodynamicsand NMR of internal G.T mismatches in DNA. Biochemistry 36，10581-94(1997)包括更多的复杂计算，其把结构和环境，以及序列特性考虑到T_m的计算中。

术语“基因”指DNA序列，其包括产生具有非编码功能的RNA(例如，核糖体或转运RNA)所需的调节和编码序列，多肽或前体。RNA或多肽可以由全长的编码序列或由编码序列的任何部分编码，只要其保留所需的活性或功能。

术语“野生型”指当从天然存在的来源分离时，具有该基因或基因产物的特性的基因或基因产物。野生型基因是在群体中最常观察到的基因，并因此主观地命名为该基因的“正常”或“野生型”形式。相反，术语“修饰的”、“突变体”或“多态的”指当与野生型基因或基因产物相比较时，其在序列或功能特性(也即，改变的特性)中显示修饰的基因或基因产物。应当注意，天然存在的突变体可以被分离；这些突变体可通过当与野生型基因或基因产物相比较时，它们具有改变的特性的事实来鉴定。

如这里使用的术语“重组DNA载体”，指包含所需的异源序列的DNA序列。例如，虽然该术语不局限于使用表达的序列或编码表达产物的序列，在一些实施方案中，异源序列是编码序列与编码序列在宿主有机体中复制，或可操作连接的编码序列在特定的宿主有机体中表达所需的合适的DNA序列。在原核生物中表达所需的DNA序列包括启动子，任选地操纵子序列，核糖体结合位点和可能其他的序列。真核细胞已知利用启动子，多腺苷酸化信号和增强子。

如这里使用的术语“寡核苷酸”定义为包括两个或多个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的分子，优选至少5个核苷酸，更优选至少大约10-15个核苷酸，更优选至少大约15到30个核苷酸。准确大小取决于许多因子，其依次取决于寡核苷酸的最终功能或使用。寡核苷酸可以任何方式产生，包括化学合成、DNA复制、反转录、PCR或其组合。

因为单核苷酸以使一个单核苷酸戊糖环的5′磷酸基通过磷酸二酯键附着于在一个方向与它邻近的单核苷酸戊糖环的3′氧的方式反应，来制备寡核苷酸，如果它的5′磷酸基没有与单核苷酸戊糖环的3′氧连接，寡核苷酸的一个末端称为“5′末端”，而且如果它的3′氧没有与随后的单核苷酸戊糖环的5′磷酸基连接，寡核苷酸的末端则称为“3′末端”。如这里使用的，核酸序列，即使较大寡核苷酸内部的，也可认为具有5′和3′末端。当沿着核酸链以5′到3′方向移动时，如果第一个区域的3′末端在第二个区域的5′末端前面，沿着核酸链的第一个区域认为是另一个区域的上游区。

当两个不同的、非重叠寡核苷酸退火为同样线性互补的核酸序列的不同区域，而且一个寡核苷酸的3′末端瞄准对着另一个寡核苷酸的5′末端时，前者可以被称为“上游”寡核苷酸，后者称为“下游”寡核苷酸。类似地，当两个重叠的寡核苷酸杂交成为相同的线性互补核酸序列，而且第一个寡核苷酸处于使它的5′末端位于第二个寡核苷酸的5′末端的上游，第一个寡核苷酸的3′末端位于第二个寡核苷酸的3′末端的上游的位置时，第一个寡核苷酸可以被称为“上游”寡核苷酸，第二个寡核苷酸可以被称为“下游”寡核苷酸。

术语“引物”指当置于其中启动引物延伸的条件下时，能充当合成的起始点的寡核苷酸。寡核苷酸“引物”可以天然存在，如在纯化的限制酶切消化中，或可合成产生。

选择的引物与模板的特定序列链“基本上”互补。引物必须充分互补以便与模板链杂交用于发生引物延伸。引物序列不必反映模板的确切序列。例如，不互补的核苷酸片段可附着于引物的5′末端，而引物序列的余下序列与模板链基本上互补。可以引入不互补的碱基或较长的序列到引物中，只要该引物序列能与模板序列足够互补以进行杂交，并从而形成模板引物复合物用于引物延伸产物的合成。

如这里使用的术语“切割结构”，指由至少一个探针寡核苷酸与靶核酸的相互作用形成的结构，形成包括双螺旋的结构，得到的结构通过切割单元是可切割的，包括但不限于酶。与核酸分子相反，切割结构是一种用于通过裂解方式特异性裂解的基质，核酸分子是一种用于通过试剂如磷酸二酯酶非特异性裂解的基质，磷酸二酯酶能裂解核酸分子而不考虑二级结构(也即，不需要形成双链结构)。

如这里使用的术语“裂解方式”或“切割试剂”，指能对切割结构进行切割的任何方式，包括但不限于酶。“结构特异性核酸酶”或“结构特异性酶”，是能识别核酸分子中的特异性二级结构并裂解这些结构的酶。本发明的裂解方式能切割对应于形成切割结构的核酸分子；裂解方式在切割结构内的任何特定位点都能对切割结构进行裂解是不必要的。

裂解方式可包括各种来源提供的核酸酶活性，包括裂解酶，FEN-1核酸内切酶(包括RAD2与XPG蛋白质)，Taq DNA聚合酶和大肠杆菌DNA聚合酶I。裂解方式可包括具有5′核酸酶活性的酶(例如，Taq DNA聚合酶(DNAP)，大肠杆菌DNA聚合酶I)。裂解方式还可包括具有5′核酸酶活性但是缺乏合成活性的修饰的DNA聚合酶。适于本发明的方法和试剂盒的裂解方式的例子提供于美国专利号5,614,402；5,795,763；5,843,669；6,090,606；PCT申请号WO 98/23774；WO 02/070755A2；和WO 0190337A2，每个都以其全部内容引入这里作为参考。

术语“热稳定的”当用于酶时，如5′核酸酶，指该酶在高温，也即在大约55℃或更高时具有功能或活性。

如这里使用的术语“切割产物”，指裂解方式与切割结构反应所产生的产物(也即，用裂解方式对切割结构进行处理)。

术语“靶核酸”指包含具有至少部分与至少一个探针寡核苷酸互补，同时可具有至少部分与INVADER寡核苷酸互补的序列的核酸分子。靶核酸可包括单链或双链DNA或RNA。

术语“非靶切割产物”指非来源于靶核酸的裂解反应的产物。如上所述讨论的，在本发明的方法中，切割结构的裂解通常发生于探针寡核苷酸内。通过这种靶核酸依赖的裂解所产生的探针寡核苷酸的片段是“非靶切割产物”。术语“探针寡核苷酸”指在存在或缺乏INVADER寡核苷酸时，与靶核酸相互作用以形成切割结构的寡核苷酸。当与靶核酸退火时，探针寡核苷酸与靶形成切割结构，而且裂解发生于探针寡核苷酸内。

术语“INVADER寡核苷酸”指在探针与靶核酸之间杂交的区域附近的位置与靶核酸杂交的寡核苷酸，其中INVADER寡核苷酸包括和探针与靶之间杂交的区域重叠的部分(例如，化学部分，或核苷酸-无论与靶互补与否)。在一些实施方案中，INVADER寡核苷酸包括其3′末端与探针寡核苷酸的5′末端的序列基本上相同的序列。

如这里使用的术语“表达盒”指设计用于在INVADER分析中对应于探针寡核苷酸的裂解，产生可检测信号的寡核苷酸或寡核苷酸的组合。在优选的实施方案中，表达盒与来自探针寡核苷酸裂解的非靶切割产物杂交，以形成另一个侵入性切割结构，如此表达盒然后可以被裂解。

在一些实施方案中，表达盒是包括发夹部分的单个寡核苷酸(也即，区域中表达盒寡核苷酸的一部分与相同寡核苷酸的另一部分在反应条件下杂交，以形成双螺旋)。在其它的实施方案中，表达盒包括含有在反应条件下能形成双螺旋的互补部分的至少两个寡核苷酸。在优选的实施方案中，表达盒包括标记。在尤其优选的实施方案中，表达盒包括能产生荧光共振能量转移(FRET)作用的标记部分。

术语“基本上单链”当用于核酸基质时，指与以通过链内碱基配对相互作用结合在一起的双链核酸存在的双链基质相反，该基质分子主要以单链核酸存在。

如这里使用的，短语“非扩增的寡核苷酸检测分析”，指设计用于检测没有被扩增(例如，通过PCR)，不产生靶序列拷贝的靶序列(例如，基因组DNA)中存在或缺乏特定多态性(例如，SNP，重复序列，等等)的检测分析。“非扩增的寡核苷酸检测分析”可，例如，扩增用于表明靶序列中存在或缺乏特定多态性的信号，只要该靶序列没有被拷贝。

如这里使用的，短语“非扩增寡核苷酸检测分析”，指设计用于检测靶序列(例如，基因组DNA，或扩增的或其他的合成DNA)中存在或缺乏特定多态性(例如，SNP，重复序列，等等)的检测分析，而不产生靶序列的拷贝。“非扩增寡核苷酸检测分析”可，例如，扩增用于表明靶序列中存在或缺乏特定多态性的信号，只要该靶序列没有被拷贝。

如这里使用的术语“序列变异”指两个核酸之间核酸序列中的差异。例如，野生型结构基因与该野生型结构基因的突变体形式，由于存在单个碱基取代和/或缺失或插入一个或多个核苷酸，可在序列方面有差异。结构基因的这两种形式被认为彼此在序列方面有差异。结构基因的另一种突变体形式可能存在。该另一种突变体形式被认为与野生型基因和该基因的第一种突变体形式在序列方面有差异。

如这里使用的术语“释放”，指在例如5′核酸酶的作用下，从较大的核酸片段如寡核苷酸释放核酸片段，以便释放的片段不再共价附着于寡核苷酸的剩余部分。

如这里使用的术语“K_m”，指酶的米-曼氏常数，定义为特定底物的浓度，即给定酶在酶催化反应中达到它的最大速度的一半时的浓度。

如这里使用的术语“核苷酸类似物”，指修饰的或非天然存在的核苷酸，包括但不限于具有改变的堆积相互作用如7-脱氮嘌呤(也即，7-脱氮脱氧腺苷三磷酸和7-脱氮-2-脱氧鸟苷三磷酸)的类似物；具有改变的氢键键合构象的碱基类似物(例如，如Iso-C和Iso-G以及S.Benner的美国专利6,001,983中描述的其它非标准的碱基配对)；非氢键键合类似物(例如，B.A.Schweitzer和E.T.Kool，J.Org.Chem.，1994，59，7238-7242，B.A.Schweitzer和E.T.Kool，J.Am.Chem.Soc.，1995，117，1863-1872所述的非极性的，芳香族的核苷类似物如2，4-二氟代甲苯)；“通用”碱基如5-硝基吲哚和3-硝基吡咯；以及通用嘌呤和嘧啶(分别如“K”和“P”核苷酸；P.Kong，等人，Nucleic Acids Res.，1989，17，10373-10383，P.Kong等人，Nucleic Acids Res.，1992，20，5149-5152)。核苷酸类似物包括脱氧核糖核苷酸以及核糖核苷酸的修饰形式。

术语“多态基因座”是群体中存在的基因座，其在群体的成员之间显示变异(例如，最常见的等位基因的频率小于0.95)。相反，“单态基因座”指在群体的成员之间很少或没有观察到变异的基因位点(通常指在该基因座中，最常见的等位基因在群体的基因库中的频率超过0.95)。

如这里使用的术语“微生物”指有机体太小而不能用肉眼观察到，而且包括但不限于细菌，病毒，原生动物，真菌和纤毛虫。

术语“微生物的基因序列”指来源于微生物的基因序列。

术语“细菌”指任何细菌种类包括真细菌和古细菌种类。

术语“病毒”指没有自主复制能力(也即，复制需要利用宿主细胞的工具)的专性，超显微的，胞内寄生物。

术语“多药抗性”或“多重药物抗性的”指微生物能抗超过一种用于处理所述微生物的抗生素或抗微生物剂。

说明书和权利要求中存在的术语“样品”以它的广义意义使用。一方面，它的意思包括样本或培养物(例如，微生物学的培养物)。另一方面，它的意思包括生物学和环境样品。样品可包括合成来源的样本。

生物样品可以是动物，包括人，液体，固体(例如，粪便)或组织，以及液体和固体食物和饲养产物和成分如乳品物品，蔬菜，肉和肉类加工副产品和废物。生物样品可以获自家畜，以及未驯服的或野生动物的所有不同家系，包括但不限于，这些动物如有蹄类、熊、鱼类、lagamorphs、啮齿类，等等。

环境样品包括环境材料如表面物质，土壤，水和工业样品，以及从食品和乳品加工仪器，装置，设备，用具等获得的样品，一次性用品以及非一次性用品。这些例子不认为是对适用于本发明的样品类型的限制。

术语“靶核酸的来源”指包含核酸(RNA或DNA)的任何样品。尤其优选的靶核酸来源是生物样品，包括但不限于血液，唾液，大脑脊髓液，胸膜液，乳汁，淋巴，痰液和精液。

如果寡核苷酸以高于另一个寡核苷酸(或靶核酸序列)的摩尔浓度存在，认为该寡核苷酸以相对于另一个寡核苷酸(靶核酸序列)“过量”存在。当寡核苷酸如探针寡核苷酸在裂解反应中以相对于互补的靶核酸序列的浓度过量存在时，该反应可用于表明存在的靶核酸的量。一般地，当过量存在时，探针寡核苷酸将以至少100倍摩尔过量存在；典型地，当靶核酸序列以大约10飞摩尔或更少存在时，每个探针寡核苷酸以至少1皮摩尔使用。

“怀疑包含”第一和第二靶核酸的样品，可包含两个靶核酸分子之一，二者或者都不包含。

术语“反应物”在这里以其广义意义使用。反应物可包括，例如，酶促反应物，化学反应物或光(例如，紫外光，尤其是短波长紫外光已知能打断寡核苷酸链)。能与寡核苷酸反应以缩短(也即，裂解)或者延伸寡核苷酸的任何试剂都包含在术语“反应物”内。

如这里使用的，术语“纯化的”或“纯化”指从样品除去污染物。例如，重组体CLEAVASE核酸酶在细菌宿主细胞中表达，通过除去宿主细胞蛋白质对核酸进行纯化；从而增加这些重组体核酸酶在样品中的百分比。

如这里使用的术语“部分”，当涉及蛋白质时(如在“给定蛋白质的部分”中)，指该蛋白质的片段。片段的大小可以从4个氨基酸残基到全部的氨基酸序列减去1个氨基酸(例如，4，5，6，…，，n-1)。

如这里使用的术语“核酸序列”指寡核苷酸，核苷酸或多核苷酸及其片段或部分，以及基因组或合成来源的DNA或RNA，其可以是单链或双链的，而且代表有义或反义链。类似地，如这里使用的“氨基酸序列”指肽或蛋白质序列。

如这里使用的，术语“纯化的”或“基本上纯化的”指从它们的天然环境移取的，分离的或分离的分子，核酸或氨基酸序列，而且其至少60％游离，优选75％游离，最优选90％游离于其天然缔合的其他的组分。“分离的多核苷酸”或“分离的寡核苷酸”因此是基本上纯化的多核苷酸。

如这里使用的术语“连续的核酸链”，指具有连续的，共价连接的主链结构，而没有缺口或其他的破坏的核酸链。每个核苷酸的碱基部分的特性，无论是碱基对，单链或错配，都不是连续链的定义中的成员。连续链的主链不局限于天然存在的，未修饰的核酸的核糖-磷酸或脱氧核糖-磷酸组合物。本发明的核酸可包括主链结构中的修饰，包括但不限于硫代磷酸酯残基，膦酸酯残基，2′取代的核糖残基(例如，2′-0-甲基核糖)和含有残基的备择的糖(例如，阿拉伯糖)。

如这里使用的术语“连续的双螺旋”，指双链核酸的区域，其中对在双螺旋内的碱基对的进展没有破坏(也即，沿着双螺旋的碱基对没有被扭曲而提供缺口，凸出或与连续双螺旋区域范围内错配)。如这里使用的，该术语仅仅涉及双螺旋内碱基对的排列，而不暗示核酸链的主链部分中的连续性。具有连续的碱基配对，但是在一条或两条链中有缺口的双螺旋核酸，在连续双螺旋的定义内。

术语“双螺旋”指其中一条链上的核苷酸的碱基部分通过氢键键合与另一条链上排列的它们的互补碱基结合的核酸状态。处于双螺旋形式的情况反映了核酸的碱基状况。根据碱基配对，核酸链还通常假定双螺旋的三级结构，具有大沟和小沟。螺旋状形式的假设在成为双螺旋时是绝对的。

术语“模板”指在其上通过模板依赖的核酸聚合酶活性，从核苷三磷酸生成互补的拷贝的核酸链。在双螺旋内，按照惯例，模板链被叙述和描述为“底”链。类似地，非模板链常常叙述和描述为“顶”链。

短语“5′UTR基因型模式”指从至少两种寡核苷酸检测分析得到的组合结果，该寡核苷酸检测分析设计用于检测丙型肝炎病毒5′UTR序列中的单核苷酸多态性，并提供每个单核苷酸多态性位置的至少部分基因型信息。5′UTR基因型模式不包含来自非5′UTR HCV序列的序列信息(例如，来自编码区的序列信息)。每个样品的5′UTR基因型模式的例子显示于图4，5C，6C和9中。在优选的实施方案中，5′UTR基因型模式足以对丙型肝炎病毒进行基因分型(例如，划分成基因型I、II、III、IV、V和VI)，而不需要来自丙型肝炎病毒非5′UTR序列的另外的序列信息。

如这里使用的，与特定的5′UTR HCV单核苷酸多态性有关的短语“部分基因型信息”，指被检测的特定碱基，显示使被检测的HCV的可能基因型具体化为标准的6个HCV基因型的2个至5个之间的信息(也即，部分基因型信息不提供准确的基因型，但是至少排除了6个HCV基因型中的至少1个，而且可能使它缩小至2个可能的基因型)。分析A提供了提供部分基因型信息的一个例子(检测位置-118)，其中的阳性结果(检测到“G”)表明可能存在基因型I、V或VI(参见图10中的位置-118，其表明仅仅基因型I，V和VI在该位置具有“G”)。如果一个特定的寡核苷酸检测分析提供了“至少”部分基因型信息，该分析至少排除了6个标准HCV基因型中的1个，而且通过这种单核苷酸多态性可提供准确的基因型(例如，图7中的分析H，如果检测，显示存在基因型VI；参见图10，其表明仅仅基因型VI在位置-144/5具有“C”[CA插入])。

附图简述

图1显示了用于在单个反应中检测2个不同的等位基因(例如，相差一个核苷酸)的INVADER寡核苷酸，探针寡核苷酸和FRET表达盒的示意图。

图2显示了在设计用于检测HCV序列的COBAS AMPLICOR病毒负荷分析产生的PCR扩增子上进行的侵入性切割分析的结果。

图3显示了在本发明的一些实施方案中检测分析组分的序列。探针的3′末端包含己二醇保护基。小写字母表明非互补的翼。

图4显示使用本发明的分析组分得到的HCV 5′UTR基因型模式的图解。

图5显示了在用COBAS AMPLICOR监控试剂产生的HCV的5′UTR的PCR扩增子上进行的侵入性切割分析的结果。11个样品中每个的5′UTR基因型模式显示于图5C中。

图6显示了在用COBAS TAQMAN试剂产生的HCV的5′UTR的PCR扩增子上进行的侵入性切割分析的结果。11个样品中每个的5′UTR基因型模式显示于图6C中。

图7显示了用设计用来检测HCV序列的COBAS AMPLICOR病毒负荷分析产生的PCR扩增子混合物上进行的侵入性切割分析的结果。

图8显示了在本发明的一些实施方案中检测分析组分的序列。探针的3′末端包含己二醇保护基。小写字母表明非互补的翼。

图9显示了在HCV的5′UTR的PCR扩增子上利用备择的寡核苷酸进行的侵入性切割分析的结果。11个样品中每个的5′UTR基因型模式显示于该图中。

图10显示了HCV的5′UTR区域的-274到-31中，6个HCV基因型中每个的共有序列的序列比对。来自6个基因型的每个序列标记如下：基因型I(SEQ ID NO：64)；基因型II(SEQ ID NO：65)；基因型III(SEQ ID NO：66)；基因型IV(SEQ ID NO：67)；基因型V(SEQ ID NO：68)；和基因型VI(SEQ ID NO：69)。并且，标记了不同的单核苷酸多态性位置，包括-245；-188(对照)；-167；-163；-155；-144/5；-118；和-80；其在本发明的某些实施方案中进行检测，以提供至少部分的基因型信息(其可通过参考该图来确定)。该图还显示了示例性引物的位置，其可用于扩增HCV的5′UTR区域。

发明描述

本发明提供了形成依赖于靶核酸的存在的核酸切割结构，并切割该核酸切割结构以便释放特异的切割产物的方法。5′核酸酶活性，例如，用于裂解该靶依赖的切割结构，而且得到的切割产物能指示样品中特异性靶核酸序列的存在。当核酸或寡核苷酸的两条链(都与靶核酸链杂交，)以致它们形成重叠的侵入性切割结构时，如下所述，可出现侵入性切割。通过切割试剂(例如，5′核酸酶)与上游寡核苷酸的相互作用，切割试剂可以产生特异片段的方式在内部位点裂解下游寡核苷酸。这种实施方案称为INVADER分析(Third WaveTechnologies)，并描述于美国专利号5,846,717，5,985,557，5,994,069，6,001,567，6,090,543，6,348,314和6,458,535，WO 97/27214和WO 98/42873，Lyamichev等人，Nat.Biotech.，17：292(1999)，Hall等人，PNAS，USA，97：8272(2000)，每个都以其全部内容引入这里作为参考用于各种目的)。

通过结构特异性酶对特异性结构的酶促裂解，INVADER分析能检测探针与靶的杂交(参见，例如，美国专利号5,846,717；6,090,543；6,001,567；5,985,557；5,994,069；6,090,543；6,348,314；6,458,535；美国专利公开号20030186238(系列号No.10/084839)；20030104378A1(系列号09/864636)；Lyamichev等人，Nat.Biotech.，17：292(1999)，Hall等人，PNAS，USA，97：8272(2000)，WO 97/27214和WO 98/42873，每个都以其全部内容引入这里作为参考用于各种目的)。

使用结构特异性酶(例如，FEN核酸内切酶)来裂解由重叠的寡核苷酸探针杂交形成的复合物，INVADER分析可检测特异性DNA和RNA序列(参见，例如，图1)。高温和一种探针过量，能使对于存在的每个靶序列的多重探针被裂解，而不需要温度循环。在一些实施方案中，这些裂解的探针然后指导另一个标记的探针的裂解。第二探针寡核苷酸可用荧光素进行5′末端标记，荧光素被内部染料猝灭。裂解之后，脱猝灭的荧光素标记产物可使用标准荧光平板读数器进行检测。

INVADER分析能检测未扩增的、以及扩增的RNA和DNA包括基因组DNA中的特异性序列、突变和SNP。在图1示意显示的实施方案中，INVADER分析使用2个级联步骤(初级和次级反应)都产生而且然后扩大了靶特异性信号。为了方便起见，下面讨论中的等位基因被称作野生型(WT)和突变体(MT)，尽管这些术语不能应用于所有的遗传变异。在初级反应中(图1，系列A)，WT初级探针和INVADER寡核苷酸先后与靶核酸杂交而形成重叠结构。WT初级探针的5′末端含有不成对的“翼”。结构特异性酶(例如，CLEAVASE酶，Third WaveTechnologies)能识别重叠、并裂解不成对的翼，释放它作为靶特异性产物。在次级反应中，该切割产物用作WT荧光共振能量转移(WT-FRET)探针上的INVADER寡核苷酸，又产生能被结构特异性酶识别的结构(系列A)。当通过裂解把单个FRET探针上的两个染料分开时(图1中的箭头所示)，就可产生高于背景荧光的可检测荧光信号。因此，这种二级结构的裂解导致荧光的增加，这表明WT等位基因的存在(或突变体等位基因，如果分析是设计用于突变体等位基因以产生可检测信号)。在一些实施方案中，具有不同标记的FRET探针(例如，通过发射或激发波长差异可分辨的，或通过时间分辨荧光检测可分辨的)，提供用于待检测的每个等位基因或基因座，以便可以在单个反应中检测不同的等位基因或基因座。在这些实施方案中，可以在单个分析中组合初级探针组和不同的FRET探针，以允许对来自相同样品的每个等位基因或基因座的信号进行比较。

如果初级探针寡核苷酸与靶核苷酸序列在裂解位点不匹配(例如，与MT主要探针和WT靶，图1，系列B)，不能形成重叠结构，而且裂解被抑制。使用的结构特异性酶(例如，CLEAVASE VIII酶，Third WaveTechnologies)，裂解重叠结构比非重叠结构更有效(例如，至少340倍)，以允许极好的等位基因的鉴别。

探针周转而不需要温度循环，以使每个靶产生许多信号(也即，线性信号放大)。类似地，每个靶特异性产物都能使许多FRET探针裂解。

初级INVADER分析反应是针对被检测的靶DNA(或RNA)。由于INVADER和初级探针以摩尔过量提供，靶DNA是第一次侵入性切割中的限制组分。在第二次侵入性切割中，释放的翼是限制性的。当这2个裂解反应相继进行时，来自组合反应的荧光信号相对于靶DNA的量线性积累。

在次级反应中，每个释放的5′-翼可用作荧光共振能量转移(FRET)表达盒中的INVADER寡核苷酸，以产生另一个可被CLEAVASE酶识别和裂解的重叠结构(图1)。当FRET表达盒被裂解时，荧光团(F)和猝灭剂(Q)被分开，产生可检测的荧光信号。与初始反应类似，释放的5′-翼和FRET表达盒循环，导致放大的荧光信号。初始和次级反应在同一个孔中同时进行。

二重形式的INVADER DNA分析，能在一个孔中同时检测2个DNA序列。最经常地，这涉及特定多态性的2个变体的检测。二重形式使用2个不同的有区别的初级探针，其中每个探针都具有独特的5′-翼，与2个不同的FRET表达盒，其每个表达盒都具有光谱不同的荧光团。有意地，释放的5′-翼将只与它们各自的FRET表达盒结合，以产生靶特异性信号。

在一些实施方案中，本发明提供了包含实施本发明所必需的一个或多个组分的试剂盒。例如，本发明提供了用于储存或递送本发明的酶，和/或实施裂解分析(例如，INVADER分析)所必需的反应组分的试剂盒。举例来说，而不是为了限制本发明的试剂盒到任何特定的结构或组分的组合，以下部分描述了用于实施本发明的试剂盒一个实施方案：

在一些实施方案中，本发明的试剂盒提供了以下试剂：

CLEAVASE酶(例如，初级寡核苷酸CLEAVASE X)

DNA反应缓冲液1 INVADER寡核苷酸

FRET表达盒1(例如，F)

FRET表达盒2(例如，R)

突变体DNA对照

野生型DNA对照

“无靶”空白对照

在一些实施方案中，本发明的试剂盒提供了以下试剂：

溶于210mM MgCl₂，40％甘油中的含有溶于25mM MOPS，

CLEAVASE酶混合物 pH7.5中以下组分的突变的

(例如，CLEAVASE X) 混合物：

初级寡核苷酸

INVADER寡核苷酸

FRET表达盒1(例如，F)

FRET表达盒2(例如，另

一个F表达盒)

FRET表达盒3(例如，R)

突变体DNA对照

内部DNA对照

“无靶”空白对照

图2，3和8中提供了适合用于本发明方法的初级寡核苷酸，次级寡核苷酸和FRET表达盒的例子。虽然这里所示的寡核苷酸可用于本发明的许多方法和变化中，但是发现这些INVADER分析寡核苷酸组尤其可用于本发明的试剂盒。图2，3和8中所示的寡核苷酸组可用作单独的组以检测单个靶DNA，或在二重或多重反应中组合用于在单个反应中检测两个或多个分析物或对照。

在某些实施方案中，利用易接近的位点设计的寡核苷酸和/或桥连寡核苷酸进行INVADER分析，或其它的核苷酸检测分析。这些方法，程序和组合物描述于美国专利6,194,149，WO 9850403和WO 0198537，其都以其全部内容特别地引入这里作为参考。

在某些实施方案中，靶核酸序列在检测之前进行扩增(例如，以便产生合成的核酸)。在一些实施方案中，靶核酸包括基因组DNA。在其它的实施方案中，靶核酸包括合成DNA或RNA在一些优选的实施方案中，使用纯化的聚合酶产生样品内的合成DNA。在一些优选的实施方案中，使用纯化的聚合酶产生合成DNA包括使用PCR。在其它的优选实施方案中，使用适合用于本发明方法的纯化DNA聚合酶产生合成DNA，包括使用滚环扩增，(例如，如美国专利号6,210,884，6,183,960和6,235,502，其都以其全部内容引入这里作为参考)。在其它的优选实施方案中，合成DNA的产生包括通过从基因组DNA样品上的多个位点引发，而拷贝基因组DNA。在一些实施方案中，从基因组DNA样品上的多个位点引发，包括使用短的寡核苷酸引物(例如，小于大约8个核苷酸)。在其它的实施方案中，从基因组DNA上的多个位点引发，包括在有缺口的，双链基因组DNA的3′末端的延伸(也即，通过破坏或裂解DNA双链区域的一条链，其中一个3′羟基可用于延伸)。在有缺口的基因组DNA上，使用纯化的聚合酶，其适合用于本发明的方法和组合物，制备合成DNA的一些例子提供于2000年09月12日公开的美国专利号6,117,634，和2001年03月06日公开的6,197,557，以及PCT公开号No.WO 98/39485，其都以其全部内容引入这里作为参考用于各种目的。

在一些实施方案中，本发明提供了用于检测靶序列的方法，包括：提供a)含有通过在有缺口的双链基因组DNA的3′末端延伸进行扩增的DNA的样品，所述基因组DNA怀疑含有所述靶序列；b)在存在所述靶序列时，能形成侵入性切割结构的寡核苷酸；和c)使样品暴露于该寡核苷酸和试剂。在一些实施方案中，试剂包括切割试剂。在一些尤其优选的实施方案中，本发明的方法更进一步地包括检测所述切割产物的步骤。

在一些优选的实施方案中，使样品暴露于寡核苷酸和试剂，包括如果所述靶序列存在于所述样品中，在其中所述靶序列于所述寡核苷酸之间形成侵入性切割结构的条件下，使样品暴露于寡核苷酸和试剂，其中通过所述切割试剂使所述侵入性切割结构裂解以形成切割产物。

在一些尤其优选的实施方案中，靶序列包括第一区域和第二区域，所述第二区域位于所述第一区域下游并且与所述第一区域相邻，所述的寡核苷酸包括第一和第二寡核苷酸，其中至少部分的所述第一寡核苷酸与所述靶序列的所述第一部分完全互补，而且其中所述第二寡核苷酸包括3′部分和5′部分，其中所述5′部分与所述靶核酸的所述第二部分完全互补。

在其它的实施方案中，适合用于本发明的方法和组合物的合成DNA，使用纯化的聚合酶在多引物的基因组DNA上制备，如例如美国专利号6,291,187和6,323,009，以及PCT公开号No.WO 01/88190和WO 02/00934中提供的，其都以其全部内容引入这里作为参考用于各种目的。在这些实施方案中，使用DNA聚合酶，如高持续合成的φ29聚合酶(如美国专利号5,198,543和5,001,050中所述，其以其全部内容引入这里作为参考用于各种目的)，联合抗核酸外切酶的随机引物，如六聚物，进行DNA如基因组DNA的扩增。

在一些实施方案中，本发明提供了用于检测靶序列的方法，包括：提供a)含有在基因组DNA上通过多引物延伸扩增的DNA的样品，所述基因组DNA怀疑含有所述靶序列；b)在存在所述靶序列时，能形成侵入性切割结构的寡核苷酸；和c)使样品暴露于该寡核苷酸和试剂。在一些实施方案中，试剂包括切割试剂。在一些优选的实施方案中，所述引物是随机引物。在尤其优选的实施方案中，所述引物是抗核酸外切酶的。在一些尤其优选的实施方案中，本发明的方法更进一步地包括检测所述切割产物的步骤。

在某些实施方案中，本发明提供了使用INVADER检测试剂(例如，初级探针，INVADER探针和FRET表达盒)，用于分析合并的样本(例如，合并的血液样品)的试剂盒。在优选的实施方案中，试剂盒更进一步地包括关于如何进行INVADER分析，和特别地如何把INVADER检测分析用于来自许多受试者的合并的样本，或用于来自单个受试者的许多细胞的“合并的”样品(例如，来自活组织切片检查样品)的指导。

本发明更进一步地提供了一些分析，其中靶核酸在与寡核苷酸探针多重杂交，以及探针裂解期间，重复使用或重复循环，而不需要使用温度循环(也即，用于靶核酸链的周期变性)或核酸合成(也即，用于靶或探针核酸链的基于聚合作用的取代)。当在其中探针在靶链上被连续置换的条件下(例如，通过探针-探针取代或通过探针/靶缔合与离解之间的平衡，或通过这些机制的组合，[寡核苷酸置换的动力学。Luis P.Reynaldo，Alexander V.Vologodskii，Bruce P.Neri和Victor l.Lyamichev.J.Mol.Biol.97：511-520(2000)]，进行裂解反应时，多个探针可与相同的靶杂交，允许多个裂解，并产生多个切割产物。

在一些实施方案中，本发明的检测分析设计用于检测一个或多个HCV序列。在一些实施方案中，HCV基因型由一个或多个检测分析的复合结果确定。在一些优选的实施方案中，对每个样品进行两个或更多个检测分析。仍然在其它的优选实施方案中，对每个样品进行两个或更多个检测分析，以产生5′UTR基因型模式。在一些实施方案中，8个检测分析用于产生5′UTR基因型模式。在一些尤其优选的实施方案中，进行1个分析来检测共有序列用作内部对照分析。仍然在其它的实施方案中，本发明还提供了用于对含有HCV的样品进行基因分型的方法，其包括以下步骤：a)检测从所述HCV样品的5′UTR扩增的核酸中一个或多个(例如，2个或以上，5个或以上)单核苷酸多态性；b)根据来源于步骤a的信息产生5′UTR基因型模式；和，在一些实施方案中，比较所述5′UTR基因型模式与预先确定的HCV信息矩阵，以便确定所述受试者的HCV基因型。在一些实施方案中，预先确定的HCV信息矩阵储存于计算机存储器中。在一些优选的实施方案中，该方法更进一步地包括在选择用于受试者的疗法中使用所述的HCV基因型(例如，选择合适的药物，选择药物的合适剂量，避免某些药物，继续施用某种药物某些天等等。)。

在一些实施方案中，用于检测分析的寡核苷酸与目的HCV靶序列完美互补。在其它的实施方案中，寡核苷酸包含与感兴趣的HCV靶序列的一个或多个不匹配。发现了不匹配的多个用途，包括但不限于，还原杂交效力的能力(其在一些探测分析形式中可能是要求的)，增加简并性的能力(例如，检测两个或更多个菌株或变体)，和补偿样品中存在的序列变异的能力。在一些实施方案中，在测试群体的一些成员中鉴定了位于特定核苷酸位置的变异，提供在该位置序列不同的多个寡核苷酸，以便检测该群体内的每个变体。下面的实施例部分提供了用于侵入性切割分析的示例性检测分析组分，用于HCV的某些基因型。应该注意，使用这里提供的反应设计和最佳化指南，这些探针组的设计(例如，寡核苷酸和/或它们的序列)，可以改变以用于RNA检测分析。

在一些实施方案中，本发明的试剂盒提供了由用户提供的一列附加组分(例如，试剂，供应品和/或设备)，以进行本发明的方法。例如，不是为了限制这些附加组分列表到任何特定的组分，这种列表的一个实施方案包括以下组分：

●澄清的CHILLOUT-14液体蜡(MJ Research)或无RNA酶，光学级矿物油(Sigma，Cat.No.M-5904)

●96孔聚丙烯微量培养板(MJ Research，Cat.No.MSP-9601)

●无菌的1.5ml或2.0ml微量离心管

●无菌的，无DNA酶/RNA酶一次性气雾剂障碍移液管吸头

●多通道移液管(0.5-10μl，2.5-20μl)

●热循环仪或其他的热源(例如，实验室烘箱或加热器)。

●繁杂的实验室设备(试管架，微量加液器，多通道移液管，微量离心机，涡旋搅拌机)。

·荧光微量培养板读数器(优选的平板读数器是具有以下特性的装备有光过滤器的高级读数器：

激发发射

(波长/带宽) (波长/带宽)

485nm/20nm 530nm/25nm

560nm/2Onm 620nm/40nm

在一些实施方案中，本发明的试剂盒提供了由用户提供的一列任选组分(例如，试剂，供应品和/或设备)，以便于进行本发明的方法。例如，不是为了限制这些任选组分列表到任何特定的组分，这种列表的一个实施方案包括以下组分：

·无菌的8管条或微量培养板(任选的)

·一次性塑料槽(任选的)

·平板密封带(任选的)

在一些实施方案中，本发明的试剂盒提供了由用户提供的一列需要的组分，以便于进行本发明的方法，对本发明的方法来说多种替换物是可接受的(例如，样品制备试剂盒)。例如，不是为了限制这些任选组分列表到任何特定的组分，这种列表的一个实施方案包括以下组分：

·QIAGEN

血液试剂盒

●Gentra Systems PUREGENE试剂盒

·Gentra Systems

产品

在试剂盒的一些实施方案中，提供了详细的方案。在优选的实施方案中，提供了用于组合INVADER分析反应的方案(例如，用于制备反应混合物的制剂和优选方法)。在尤其优选的实施方案中，用于组合反应混合物的方案包括计算或图解辅助法，以减少进行本发明方法中的错误风险(例如，便于计算多重反应所需试剂的量的表格，和帮助装配多孔分析平板以含有许多分析反应的平板设计指导)。举例来说，不是为了限制这种方案到任何特定的内容或形式，本发明的试剂盒可包括下列方案：

I.详细的DNA二重INVADER分析方案

1.确定待测试样品和对照的数量。

2.计划每轮实验的微量培养板设计(例如，样品，对照)。包括无靶对照(溶于缓冲的，无核酸酶水中的tRNA载体)对于有效的结果是需要的。

3.制备用于二重分析形式的INVADER DNA分析反应混合物。为了计算分析所需的反应组分的量(X体积)，1.25[X体积(μl)＝#反应x1.25]乘以反应的总数(样品和对照)。把最后的试剂添加到混合物中后不久，充分地涡旋INVADER DNA分析反应物。

INVADER DNA分析反应混合物

二重分析形式

反应组分	1X体积	X体积
			DNA反应缓冲液1	5.0μl
FRET F表达盒	1.0μl
			FRET R表达盒	1.0μl
初级探针	1.0μl
			INVADER寡核苷酸	1.0μl
CLEAVASE酶	1.0μl
			总混合物体积(1X)	10.0μl

4.添加10μl每个对照或DNA样品(≥150ng DNA)到合适的孔中，并通过上下抽吸1-2次进行混合。每个反应用20μl澄清的CHILLOUT或矿物油覆盖。用Thermaseal孔带密封微量培养板(任选的)。

5.反应物在热循环仪或烘箱中于98℃孵育10分钟。

6.在热循环仪中降温到63℃，或把平板转移到63℃加热器中，然后添加10μl INVADER DNA分析反应混合物到每个孔中，并通过上下抽吸3到5次对孔进行混合。8管条或微量培养板可用于使用多通道移液管方便添加INVADER DNA分析反应混合物。当添加INVADER DNA分析反应混合物时，添加混合物务必低于矿物油或Chill-out^TM 14液体蜡的水平。

7.用平板密封带覆盖微量培养板(任选的)，并63℃孵育4小时。

8.孵育4小时以后，把微量培养板置于荧光平板读数器的平板夹中。如果使用，除去平板密封带。

9.在2种不同的波长设置处对平板读数(相应于WT和Mut信号的染料不必与所有二重分析相同)。

10.应该设定结果以便对照4的读数对于每个扫描都在100与200之间。对于F与R染料扫描，对照4的值不必相等。

注意：在对微量培养板读数之前，除去微量培养板封条。

●该过程能收集多个数据组，以扩大分析的动态范围。在次级INVADER反应期间，直接在高读数荧光微量培养板读数器上对微量培养板进行读数。

注意：因为最佳结果设定在仪器之间可以变化，如果需要可调整结果以给出最好的信号/背景比率(样品原始信号除以无靶对照信号)或～100 RFU的无靶对照样品读数。使用氙气灯源的荧光微量培养板读数器通常产生较高的RFU。为了直接对微量培养板进行读数，荧光微量培养板读数器的探测高度，以及平板如何放置，可能需要根据制造商的建议进行调整。

比率计算和解释指南

在试剂盒的一些实施方案中，提供了使用2个荧光信号的比率来确定基因型的指南。例如，对于给定多态性的每个等位基因，净信号/背景，或高于零的净倍数(FOZ-1)，可以如下计算用每个染料获得的信号的值：

每个样品的2个FOZ值(也即内部对照与基因型特异性读数)用于如下计算分析输出率：

其中净FOZ＝FOZ-1

在一些实施方案中，提供了附加的文献，如用于辅助程序的方案，例如，用于附加试剂的制备，或用于本发明方法的样品制备。在优选的实施方案中，附加的文献包括提供以便于不熟练的或无经验的用户成功使用这些方法和试剂盒的指南和预防措施明细表。在尤其优选的实施方案中，附加的文献包括故障检修指南，例如，描述了用户会遇到的可能的问题，并提供建议的溶液或校正以打算帮助用户解决或避免这种问题的指南。

实施例

提供下列实施例以便证明和更进一步地举例说明本发明的某些优选的实施方案和方面，而不应认为是对本发明范围的限制。

在随后的实验描述中，下列缩写应用：N(正常)；M(摩尔)；mM(毫摩尔)；μM(微摩尔)；mol(摩尔)；mmol(毫摩尔)；μmol(微摩尔)；nmol(纳摩尔)；pmol(皮摩尔)；g(克)；mg(毫克)；μg(微克)；ng(纳克)；1或L(升)；ml(毫升)；μl(微升)；cm(厘米)；mm(毫米)；μm(微米)；nm(纳米)；DS(硫酸葡聚糖)；和℃(摄氏度)。

实施例1

设计检测多个HCV菌株的寡核苷酸

这些实验的目标是得到适合用于INVADER分析的寡核苷酸设计，以检测HCV 5′UTR中的特定序列。第一步，从Genbank(NCBI)和肝炎病毒数据库获得HCV DNA序列见于genes.nig.ac.jp)并使用Clustal W进行序列比对(DNA Star，Madison，WI)。组合合适的保守序列的区域，其具有基因型之间有限的序列差异，优选一个或几个核苷酸，被确定为INVADER分析的候选靶。通过搜索包括有限的不匹配的序列片段来设计候选的探针寡核苷酸。产生位于有义或者反义链上的几个序列的设计。合适的INVADER寡核苷酸设计用于伴随各自的探针寡核苷酸候选物。几个这种探针和INVADER寡核苷酸对，设计用于检测与HCV基因型1-6的每个相关的特异性序列。还在跨越分析的全部序列的高序列保存区域设计了一个探针组，用作5′UTR扩增子存在的阳性内部对照。

然后如下所述，通过Inno-LiPA分析，根据从患者样品产生的COBAS AMPLICOR病毒负荷PCR扩增子对候选的探针组进行评价，并表征为基因型。选择产生≥5FOZ和≤大约25-30FOZ信号的探针组，用于更进一步地用于扩增的DNA样品。

筛选候选探针组

INVADER分析在96孔MJ Skirted微量滴定板上进行。使用MJResearch PTC100热循环仪或ThermoHybaid PCR Express(Molecular Biology Instrumentation，Needham Heights，MA)孵育平板，并用Applied Biosystems CYTOFLUOR 4000系列多孔平板读数器进行读数。

通过使用7.5μl稀释模板和7.5μl INVADER主反应混合物，或10μl稀释模板和10μl INVADER主反应混合物，如上所述制备主要和次要反应主混合物，来建立用于确定探针组的FOZ的INVADER分析。图3提供了用于该实验的寡核苷酸。反应在微量滴定板中同时进行。主混合物如下配制：

添加的体积

4.67μL FRET缓冲液混合物(1.4μM每种FRET表达盒；10.8％PEG；43mM MOPS pH 7.4)

4.00μL PI混合物(3.5μM1°探针；0.35μM INVADER寡核苷酸)^*

1.33μL CLEAVASE X酶/MgCl₂(30ng/μL CLEAVASE X酶；210mMMgCl₂)

10μL主混合物浓缩物

FRET表达盒(每个)： 0.65μM

PEG(8000MW)： 5％

MOPS(pH7.4)： 20mM

1°探针： 1.4μM*

INVADER寡核苷酸： 0.14μM*

CLEAVASE X酶 40ng

MgCl₂： 28mM

*例外(10μL主混合物中的终浓度)

分析8T：每个探针为5X(7μM)

分析1C：INVADER寡核苷酸为10X(1.4μM)

分析2C：探针为5X(7μM)

可变浓度的7.5μl或10μl每种靶的等分试样(根据病毒负荷稀释的PCR产物，一般地COBAS AMPLICOR MONITOR或病毒负荷样品稀释1∶100，TAQMAN样品稀释1∶500)，置于微量滴定板的合适孔中，并用20μl矿物油覆盖；20μl的10ng/μl tRA用于无靶对照反应。靶于98℃加热变性10分钟，冷却到20℃，然后添加7.5μl或10μl初级混合物的等分试样到每个孔中(与靶的体积量相等的主混合物量被添加到每个反应中)。微量滴定板于63℃孵育60分钟。

设定每个染料的仪器结果，以便产生的无靶空白在50-150相对荧光单位(RFU)之间。

由于最佳结果设定在仪器之间可变化，如果需要可调整结果以确保产生的荧光信号在使用的特定仪器的线性范围内。使用氙气灯源的荧光微量培养板读数器通常产生较高的RFU。为了直接对微量培养板进行读数，荧光微量培养板读数器的探测高度，以及平板如何放置，可能需要根据制造商的建议进行调整。

装置/仪器产生的原始数据用于测量分析性能(实时或终点模式)。下面的等式提供了如何计算FOZ(高于零的倍数)，以及其它的值。下面等式中的NTC表示来自无靶对照的信号。

根据这些实验中产生的相对信号，来选择用于鉴定每个基因型的候选探针组。尤其，合乎需要的探针组显示了根据适当稀释的PCR产物的≥5的FOZ。图2呈现了从测试6个探针组获得的示例性数据，这6个探针组设计用于检测根据已知基因型样品的基因型3。对候选的探针组进行类似的实验，用于余下的基因型1，2，4-6。这些结果表明，使用5′UTR内多态性的选择亚型区别HCV基因型是可能的。产生足够的基因型特异性信号的探针组呈现于图3中。

实施例2

从AMPLICOR和TAQMAN扩增子确定基因型

总共8个独立的INVADER反应，认为是特异于1到4个不同的HCV基因型之间。图4呈现了根据从8个选择的探针组获得的结果，HCV基因型基质怎样用于鉴定基因型的示意图。第九个INVADER反应用作从5′UTR扩增的DNA存在的阳性对照。

使用10μl体积的稀释靶和INVADER反应主混合物，如实施例2所述的设置反应物。反应物于63℃孵育，而且30和60分钟以后如上所述的在荧光微量滴定板读数器中读数。图5中呈现了AMPLICORMONITOR样品的示例性数据，图6呈现了TAQMAN样品的示例性数据。在每种情况下，系列A表示从内部对照获得的FOZ数据(FAM信号)；系列B，来自基因型特异性探针组(RED信号)的FOZ数据；和系列C，RED与FAM信号的净FOZ(也即，FOZ-1)的比率。这些数据表明，这8个探针组可组合用于确定HCV样品的基因型。测试了总共115个样品，而且产生的基因型结果与用其它的基因分型方法(也即，Inno-LiPA反向斑点印迹或TruGene测序)获得的结果一致。总共3个样品提供的结果，看起来表明混合感染或不适当样品的可能性。在余下的样品中，总共4个产生了跨过测试的所有探针组的低信号。这些样品在无核酸酶的水中重新稀释到改变的程度，以确定它们的最佳稀释系数，并重新测试。根据重新测试，这些样品产生了与通过代替的基因分型方法获得的结果一致的可解释结果。

实施例3

在单个样品中进行2种HCV基因型的共同检测

有时候，样品包含超过一种HCV基因型是可能的，例如，由于多个菌株的共同感染。测试了INVADER分析辨别混合感染存在的能力，以及鉴定存在的基因型的能力。

从已知基因型的样品产生的AMPLICOR扩增子的等分试样以下列比率进行混合：

样品	基因型1	基因型2
			1234567	50％75％90％95％25％10％5％	50％25％10％5％75％90％95％

还使这些混合物联合来自基因型1与基因型3样品，以及基因型2与基因型3样品的扩增子。

用这些人工混合的样品如实施例2所述进行INVADER反应。示例性结果呈现于图7，而且其表明有时候辨别其中以1∶1或1∶3比率或更少存在的两种不同基因型的感染是可能的。

实施例4

设计检测多个HCV菌株的备择寡核苷酸

如实施例1，这些实验的目标是得到适合用于INVADER分析的寡核苷酸设计，以检测HCV的5′UTR中的特定序列。如实施例1所述的确定候选序列，并根据标准程序合成，而且通过HPLC进行纯化。然后如实施例1在COBAS AMPLICOR，AMPLICOR MONITOR中对候选的探针组进行评价，通过Inno-LiPA或TRUE-GENE HCV 5’NC基因分型试剂盒分析，从患者样品产生TAQMAN病毒负荷PCR扩增子，并表征为基因型。选择产生的基因型特异性信号≥25FOZ和大约45-50 FOZ的探针组，用于更进一步地用于扩增的DNA样品。

筛选候选的探针组

在96孔 MJ Skirted微量滴定板中进行INVADER分析。平板使用MJ Research PTC100热循环仪或ThermoHybaid PCR Express(Molecular Biology Instrumentation，Needham Heights，MA)进行孵育，用Applied Biosystems

4000系歹IJ多孑乙平板读数器或TECAN GENios FL纯微量培养板荧光计进行读数。

使用7.5μl稀释模板与7.5μl INVADER主反应混合物，或10μl稀释模板与10μl INVADER主反应混合物，如上所述制备初级与次级反应主混合物，建立用于确定探针组的FOZ的INVADER分析。图8提供了用于该实验的寡核苷酸。反应在微量滴定板中同时进行。主混合物如下配置：

添加的体积

5.O0μL FRET缓冲液混合物(3.33μM每种FRET表达盒；10nMMOPS pH 7.4)

4.O0μL PI混合物(3.51aL 1°探针；0.35μL INVADER寡核苷酸) *

1.00μL CLEAVASEX酶/Mgel₂ (30ng/μL CLEAVASE X酶；210mMMgCl₂)

10μL主混合物浓缩物

FRET表达盒(每种)： 0.65uM

PEG (8000MW)： 5％

MOPS(pH7.4)： 40mM

1° 探针： 1.4μM*

INVADER寡核苷酸： 0.14μM*

CLEAVASE X酶 40ng

MgC1₂： 56mM

*例外(1OμL主混合物中的终浓度)

分析6G：探针为5X(17.5 gμM)

分析ST：探针为0.5x(1.75μM)

分析3T：INVADER寡核苷酸为10X(3.5μM)

分析1C：探针为O.5x(1.75μM)；INVADER寡核苷酸为10X(3.5μM)

分析2C：探针为5x(17.5μM)

可变浓度的7.5μl或1Oμl每种样品扩增子的等分试样(稀释的PCR产物取决于病毒负荷，根据分析方法和HCV病毒负荷，一般地1：20—1：500稀释)，移液到微量滴定板的合适孔中，并用20μl矿物油覆盖；20μ1的10ng/μl tRNA用于无靶对照反应。靶于98℃加热变性10分钟，冷却到63℃，然后添加7.5lμl或10μl INVADER HCV基因分型寡核苷酸主混合物的等分试样到每个孔中(与靶的体积量相等的主混合物量被添加到每个反应中)。微量滴定板于63℃孵育60分钟，并在Applied Biosys tems4000系列多孔平板读数器中以30分钟和60分钟的间隔读数。

设定每个染料的仪器结果，以便无靶空白产生50-150之间的相对荧光单位(RFU)。数据如实施例1所述进行分析。

示例性结果显示于图9中，并证明了能够从8个探针组的反应获得的数据区分所有的6个HCV基因型。根据如上所述的这些实验中产生的相对信号，选择每个探针组。特别地，根据适当稀释的PCR产物，合乎需要的探针组显示≥5的基因型特异性FOZ，和≤5的非特异性FOZ。在图9中，综合“RED”和“FAM/RED比率”图表中的8个探针组，提供了从原始数据结果获得的基因型确定。应当注意，每个分析的阳性结果如下：分析A-检测位置-118的“G”；分析B-检测位置-163的“A”；分析C-检测位置-80的“C”；分析D-检测位置-80的“T”；分析E-检测位置-155的“T”；分析F-检测位置-245的“C”；分析G-检测位置-167的“C”；和分析H-检测位置-144/5的“C”(CA插入)。如图9中的图例说明所示，以及图10中所示的序列，当样品中存在下列基因型时，这8个分析产生了阳性信号：分析A-对于1，5和6型是阳性的；分析B-对于1和6型是阳性的；分析C-对于2和6型是阳性的；分析D-对于1，3，4和5型是阳性的；分析E-对于2型是阳性的；分析F-对于3型是阳性的；分析G-对于3和4型是阳性的；和分析H-对于6型是阳性的。

每个样品产生的结果显示了编码每个样品的5′UTR基因型模式(参见图9)，其仅仅根据检验HCV的5′UTR中的SNP，依次提供待确定的每个样品中存在的HCV基因型。例如，根据来自分析A(基因型1，5和6阳性)，分析B(基因型1和6阳性)和分析D(基因型1，3，4和5阳性)的阳性结果，样品1(图9所示)确定为基因型I，因为在这3个分析中共同具有的唯一基因型号是基因型I。分析C(基因型2和6阳性)，分析E(基因型2阳性)，分析F(基因型3阳性)，分析G(基因型3和4阳性)和分析H(基因型6阳性)中的阴性结果，证实了该样品包含基因型I的确定。换言之，这种大量分析的综合结果(例如，通过排除法)，可以确定该样品包含基因型I。通过检查图4中提供的基因型矩阵，以及下面表1中的碱基特异性基因型矩阵(以及在图10中检测的位置查看每个基因型中的碱基位置)，可简化该确定。同样的方法可用于图9中所示的剩余10个样品，以产生下列结果：样品2包含基因型1；样品3包含基因型4；样品4包含基因型2；样品5包含基因型2；样品6包含基因型4；样品7包含基因型6；样品8包含基因型3；样品9包含基因型3；样品10包含基因型5；和样品11包含基因型6。当然，其他的分析组合(除了全部的8个分析之外)可用于产生5′UTR基因型模式，其依次可用于给检测的HCV指定基因型。因此，5′UTR内多态性的选择亚型，能使探针组产生如图9所示的足够基因型特异性信号。

表1

实施例5

基因型特异性SNP组的鉴定

有时，鉴定5′UTR内单核苷酸多态性(SNP)的限定亚型是可能的，其可用于鉴定基因型。根据从公共数据库获得的大约200个序列的序列比对，表2中的下列SNP或SNP组确定为能足以鉴定标志的基因型。

表2

1型	A-163 AND无CA-144/5而且无C-167(或而且无T-167)
			A-163 AND T-80而且无C-167(T-167)
	A-163 ANDC-72而且无C-167(T-167)
			T-122 AND无CA-144/5而且无C-167
	T-122 AND T-80而且无C-167
			T-122 AND C-72而且无C-167

		2型
	-155T
			-132A和G-163
	-128T
			-119Y而且无C-167(T-167)
	-117C

3型
			-245C

		4型	-245T AND-167C
	-245T AND-118A

5型
			-167T AND-163G AND-155C
	-122C AND-117G

6型
			CA-144/5
	-117GAND-80C
			-118A AND-80C
	-122T AND-80C
			-122T AND-72T

上述说明书中提及的所有出版物和专利都引入这里作为参考，恰如这里清楚地陈述一样。对本发明所述的分析进行的各种修饰和改变对于本领域普通技术人员来说是显而易见的，不背离本发明的范围和精神。尽管已经结合特定的优选实施方案对本发明进行了描述，应当理解如要求保护的发明不应该不适当地局限于这些特定的实施方案。实际上，对用于实现本发明的所述模式进行对相关领域的普通技术人员显而易见的各种修饰，确定为在后面的权利要求的范围内。

Claims

1.一种包含用于多个侵入性切割分析的试剂的组合物，其中用于每一个所述侵入性切割分析的试剂包含探针组，所述探针组含有第一寡核苷酸和第二寡核苷酸，

所述第一寡核苷酸包含5′部分和3′部分，其中所述第一寡核苷酸的3′部分设计成与HCV的5′UTR序列杂交，而其中所述第一寡核苷酸的5′部分设计成不与HCV的所述5′UTR序列杂交，

所述第二寡核苷酸包含5′部分和3′部分，其中所述第二寡核苷酸的5′部分设计成与相邻于所述第一寡核苷酸的杂交区域的HCV的5′UTR序列杂交，而其中所述第二寡核苷酸的3′部分设计成与所述第一寡核苷酸和所述HCV的5′UTR序列之间的杂交区域重叠，从而当所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸都与HCV的5′UTR序列杂交时，形成重叠的侵入性切割结构，

所述组合物用于检测HCV的5′UTR序列位置上的至少两个单核苷酸多态性的有无，所述位置选自-245，-167，-163，-155，-144，-118和-80，其中所述位置见于如图10中所示的SEQ ID NO：64，65，66，67，68和69。

2.权利要求1的组合物，其中所述第一寡核苷酸是选自以下的序列：SEQ ID NO：2-4，7，8，10，14，16，17，19，22，24，26，30，33，34，36，42，43，45-47，49，50，55，57，59和63。

3.权利要求1的组合物，其中所述第二寡核苷酸是选自以下的序列：SEQ ID NO：1，5，6，9，11-13，15，18，20，21，23，25，29，31，32，35，37-41，44，48，51-54，56和58。

4.权利要求1的组合物，其中用于所述侵入性切割分析的所述试剂设计用于检测RNA形式的HCV的5′UTR序列。

5.权利要求1的组合物，其中用于所述侵入性切割分析的所述试剂设计用于检测DNA形式的HCV的5′UTR序列。

6.权利要求1-5中任一项的组合物在制备用于分析丙型肝炎病毒基因型的制剂中的用途。

7.权利要求1-5中任一项的组合物在制备用于产生丙型肝炎病毒的5′UTR基因型模式的制剂中的用途。

8.权利要求7的组合物的用途，其中所述5′UTR基因型模式选自基因型I、II、III、IV、V或VI。

9.权利要求7的组合物的用途，其中所述5′UTR基因型模式是基因型I、IV或V。