CN86100913A - 用链球菌发酵制造高分子量透明质酸钠的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及兽疫链球菌新突变体HA-116，它用来生产大量高分子透明质酸，以及制取该微生物的方法。本发明还涉及生产透明质酸的方法，即在培养基中以适宜的条件培养链球菌，微生物产生并排泄到培养基中的透明质酸钠，用包括沉淀，再溶解和再沉淀的方法提纯。透明质酸钠的组合物的特征在于无致热性和不刺激皮肤。

Description

本申请是1985年1月18日提出的美国专利申请号692，692的部分继续申请，为便于参考该申请的内容编入本申请中。
本发明涉及用链球菌属微生物大规模发酵制造高分子量透明质酸钠的方法。
透明质是天然存在的由分子量为50，000-13，000，000道尔顿的线性高聚物组成的葡糖聚糖。它是由葡糖醛酸和N-乙酰基-葡糖胺重复单元用1-3和1-4键交替键合组成的多糖类。
透明质酸存在于各种动物的结缔组织中，象表皮和软骨。一些器官特别富有透明质酸，如脐带、滑膜液、（眼球的）玻璃体液和鸡冠。另外，透明质酸也可由各种微生物，象A型和C型链球菌来制取。
在表皮和软骨内，透明质酸的作用是结合水、保持肌肉的正常张力和组织的弹性。在关节液内，粘性的透明质酸溶液作为润滑剂，对细胞提供一个保护环境。从鸡冠中提取超纯的透明质酸溶液作为静脉注射用营养液，在眼外科中已应用了几年。见E.A.Balazs的美国专利No.4，141，973（1979）。类似的制剂已表明有利于治疗竞赛马的发炎膝关节。透明质酸另一个用途是由于它的高亲水性，使之成为用在化妆品中增湿洗剂的理想组分，见E.Balazs的美国专利No.4，303，676（1981）。
如上所述，透明质酸已经从包含细菌培养液的各种生物源中分离出来。下列文献所述：透明质酸的离析和特性：Meyer等，J.Biol.CHem.107，629（1934）;J.Biol.Chem.114，689（1936），最近在Methods    in    Enzymol.28，73（1972）中已有综述文章。透明质酸的结构已由Weissman等阐明，J.Am.Chem.Soc.76，1753（1954）;Meyer，Fed.Proc.17，1075（1958）。
用链球菌制造透明质酸最先由Forrest等发表在J.Biol.Chem.118，61（1937），各研究者进一步详述有：Roseman等，J.Biol.Chem.203，213（1953），Pierce和White，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.87，50（1954），G.H.Warren的美国专利No.2，975，104（1961）和Sunghara等，J.Biol.Chem.254，6252（1979），论证来源于动物和微生物的透明质酸的本性。以小型至中型规模对A型链球菌的分批发酵以及对透明质酸的分离，已经公布的程序有：Thonard等J.Biol.Chem.239，726（1964）;Holmstrom和Ricica，Appl.Microbio.15，1409（1967）;Kjems和Lebech，Acta    Path.Microbiol.Scand.84，162（1976）。这些过程包括病原菌的厌氧发酵，得到分子量等于或小于700，000的透明质酸，其收率为0.4-1克/升。
其它生产过程涉及链球菌喜氧发酵生产透明质酸，如日本公开专利No.58-056692，公布于1983年4月4日，发明者Akasaka    H，等。其它文献E.A.Balazs的美国专利No.4，141，973，1979年2月27日，涉及以动物结缔组织为来源制造和提纯透明质酸。但是在先有技术公开的透明质酸的制造和纯化的过程，未能产出平均分子量大于2.0×106道尔顿的透明质酸。这在很大程度上是由于在透明质酸组合物中存在的金属离子或杂质能催化反应中的剪切或氧化而促使透明质酸降解。
此处描述的分子量从约1×106到约4.0×106道尔顿的制造透明质酸的新工艺，厌氧发酵，产量约2克/升;喜氧发酵，产量约4-6克/升。这一点由于产生链球菌（Streptococcus zooepidemicus）的C型突变菌株HA-116，ATCC39920而成为可能。该菌株是透明质酸的高产者，而且溶血素阴性，即很小的致病性。动物流行性链球菌（Streptococcus zooepidemicus），HA-116，ATCC 39920的喜氧发酵以及随后的透明质酸盐的纯化实现了平均分子量大于3.5×106道尔顿透明质酸钠的（分批）生产。本发明是第一个用细菌发酵生产和纯化高分子量透明质酸钠的方法。无致热性和无刺激性的透明质酸钠可以采用本发明提供的方法制取。
其他属于本发明范围的方法，也可用于制造超纯的，适合在临床应用的非炎症性透明质酸。
本发明涉及动物流行性链球菌种微生物HA-116，ATCC    39920，和从中取得的突变体，该突变体能够用发酵来制造透明质酸钠并将它排泄到周围培养基中。
本发明还涉及在适宜的培养基中，在适当的条件下，剧烈搅拌培育链球菌属微生物，得到透明质酸钠的方法。该培养基含有作为碳源的糖组分，在实际上不变的浓度约0.2和10克/升之间，在实际上不变的pH约6.5到7.5之间，还含有实际上不变的镁离子浓度大于约0.05克/升。微生物制造透明质酸钠，并将它排泄到培养基中。然后从培养基中回收透明质酸钠。
从培养基中回收透明质酸钠采用的方法包括：处理包含微生物的培养基中沉淀出透明质酸钠，即用有机溶剂沉淀，回收沉淀物。然后可进行磨碎和干燥。用本法制造的透明质酸钠组合物具有无致热性和无发炎活性的特征。
本发明还涉及选择能高产透明质酸并不具溶血活性的微生物的方法。该方法包括，用适宜的诱变剂处理制造透明质酸的微生物以产生其突变体，在适宜的固体培养基上培育该突变体。鉴别类粘蛋白菌落并回收之。回收的菌落在血琼脂培养基上培育，于是就选择到不溶鲜血红蛋白的菌落。
本发明涉及从链球菌属的微生物，即兽疫链球菌（Streptoco-ccus    zooepidemicus）和类马链球菌（S.equisi-millis），制取高分子量透明质酸钠的方法，该方法为在适宜的条件和适当的营养培养基中，借助剧烈搅拌，培育链球菌属微生物。培养基含有作为碳源的糖组分，在实际上不变的浓度约0.2和10克/升之间，含有镁离子实际上不变的浓度在约0.05克/升以上，培养基实际上不变的pH值约6.5和7.5之间。微生物制造透明质酸钠，并将它排泄到培养基中。然后从培养基中回收透明质酸钠。
任何一种能制造透明质酸的链球菌均可用于实现本发明，例如兽疫链球菌，类马链球菌，酿脓链球菌。优越的菌种是兽疫链球菌HA-116    ATCC    39920菌株，它是突变型的菌株，是按照本发明的方法中为了得到能制造加大量的透明质酸的微生物而生产的。
在厌氧或喜氧条件下，培育链球菌属可以得到透明质酸钠。在本发明优选的实施方案中，适宜的培育条件是培养基的曝气速度为每单位体积的培养基、每分钟空气体积大于0.5（vvm）。曝气速度一般都采用1-2vvm，更大的曝气速度会更合乎需要。在此优选的实施方案中，适宜的营养培养基每升中含有：酪蛋白水介物约10-30克，酵母提取物约5-15克，NaCl约2克，MgSO4·7H2O约0.5克以上，K2HPO4约2.5克，以及葡萄糖约2-15克。
用过滤法或离心分离法处理培养基中所含的微生物，以除去培养基中的微生物和其它不溶物，能够回收透明质酸钠。然后从培养基中沉淀并回收透明质酸钠。沉淀磨碎到大小均匀的粒度并进行干燥。
在本发明的一个实施方案中，透明质酸钠可以按下述条件回收：调节含有微生物培养基的pH到约5.0，然后在约80-95℃下，在一段适当的时间内加热培养基，即在90℃时加热20分钟，或者在80℃加热40分钟更好。加热后除去微生物和其它不溶物。较好的除去方法是带有助滤剂如硅藻土的过滤法。
往培养基中加入第一种有机溶剂，如异丙醇，能从培养基或滤液中沉淀出透明质酸钠。沉淀再溶解在3%的醋酸钠水溶液中。用第二种有机溶剂如乙醇进行再沉淀。第二次沉淀又再溶解在3%醋酸钠水溶液中，加入活性炭形成悬浮物。过滤悬浮物并加入第三种有机溶剂如丙酮，生成透明质酸钠沉淀。第一、第二、第三种有机溶剂可以分别为异丙醇、乙醇和丙酮。另外，透明质酸盐也可在各步骤中用相同的有机溶剂进行沉淀，这就是说：在所有三个沉淀步骤中都可以用异丙醇从培养基中沉淀出透明质酸钠。
在本发明另一实施方案中，在处理培养基除去微生物之前，含有微生物的培养基的pH调节到7.0，培养基温度冷却到约4°到15℃之间，最好为4-20℃之间。然后用3%醋酸钠水溶液稀释培养基到随后的处理所需的程度，即稀释3-4倍。
本发明的一个实施方案为透明质酸钠沉淀再溶解在0.15摩尔NaCl水溶液中，加入氯化十六烷基-吡啶鎓，以生成透明质酸的十六烷基-吡啶鎓盐。十六烷基吡啶鎓盐溶解在NaCl和15%乙醇的水溶液内，即至少1摩尔浓度NaCl，而透明质酸钠的回收是采用加入有机溶剂如乙醇，沉淀出透明质酸钠。
这种透明质酸钠沉淀可再溶解在0.15摩尔NaCl水溶液中。再次加入氯化十六烷基-吡啶鎓生成透明质酸的十六烷基-吡啶鎓盐。透明质酸盐溶解在NaCl至少为1摩尔的乙醇水溶液中。加入有机溶剂回收透明质酸钠。沉淀溶解在无菌1摩尔NaCl水溶液中后，得到的溶液与硅酸镁吸附剂，即硅酸镁载体接触，以除去杂质和残余的十六烷基-吡啶鎓离子。然后对该溶液进行灭菌，加入无菌的有机溶剂，如无菌异丙醇，沉淀出透明质酸钠。所制得的透明质酸钠在无菌条件下用空气干燥。
在本发明的另一个实施方案中，发酵和加热培养基以后，而在除去微生物之前，用第一种有机溶剂处理培养基。回收沉淀出来的透明质酸钠，再溶解在3%醋酸钠水溶液中，然后加入活性炭形成悬浮液。悬浮液用硅藻土作助滤剂过滤，并加入有机溶剂制得透明质酸钠沉淀。然后磨碎和干燥。
本发明另一个实施方案中，将含有微生物培养基的pH调到约7.0，在处理之前，先将培养基冷却到4°到20℃。
本发明优选的实施方案中，把乙醇之类的有机溶剂加到含微生物的培养基中，冷却沉淀物并用有机溶剂充分洗涤。将透明质酸钠沉淀物再溶解在0.15摩尔NaCl水溶液中，并加入活性炭。得到的悬浮液用硅藻土作助滤剂过滤，以除去活性炭、微生物和其它不溶物。然后用氯化十六烷基-吡啶鎓盐处理清静的滤液，形成不溶的透明质酸十六烷基-吡啶鎓盐。收集此十六烷基-吡啶鎓盐，将其溶解在含有10%（体积/体积）乙醇的NaCl水溶液中，即至少1摩尔NaCl，加入有机溶剂，如乙醇，从中回收到透明质酸钠。
该透明质酸钠沉淀能再溶解于0.15摩尔的NaCl水溶液中。加入氯化十六烷基-吡啶鎓，再次形成透明质酸十六烷基-吡啶鎓盐。该透明质酸盐溶解于含有10%乙醇的NaCl（最少约1摩尔）溶液中，加入有机溶剂回收透明质酸钠。沉淀溶解于无菌的1摩尔NaCl水溶液后，所得溶液与吸附剂硅酸镁，即硅酸镁载体接触，以除去杂质和残余的十六烷基-吡啶鎓离子。然后溶液用过滤法灭菌，然后加入无菌的有机溶剂乙醇沉淀出透明质酸钠。这样制得的透明质酸钠在无菌条件下用空气干燥。
透明质酸钠适合于供化妆品级和临床级的透明质酸钠和其它适当的载体如甘油、聚丙二醇、山梨糖醇、胶原蛋白、聚乙二醇配成的组合物里使用。
采用本发明提供的方法制造的透明质酸钠化妆品级组合物，具有对皮肤无刺激的特性。它含有分子量约700，000到1，500，000道尔顿的透明质酸钠约87%至91%（重量）的组成，其葡糖醛酸对N-乙酰基-葡糖胺之比为1∶1，还含有约8%到12%（重量）的水、4%到5%的钠离子（重量）、小于0.1%（重量）的蛋白质、小于0.05%（重量）的硫酸盐以及小于0.5%（重量）的核酸。
由本发明提供方法制造的透明质酸钠临床级组合物具有无致热性和发炎活性的特征。其透明质酸钠的含量约在88%和92%（重量）之间，透明质酸钠的平均分子量约2-3.5×106道尔顿，其葡糖醛酸对N-乙酰基-葡糖胺之比为1∶1，还含有约8%到12%（重量）的水、约4%到6%（重量）的钠离子、小于0.01%（重量）的蛋白质、小于0.001%（重量）的硫酸盐、小于0.02%（重量）的核酸以及小于0.2%（重量）的中性糖。
用本发明的方法制造的透明质酸钠的超纯组合物的特征为：最小极限粘度数约3.5米3/千克，最小平均分子量约3.5×106道尔顿，在25℃、436纳米波长的旋光度约155°到165°，蛋白质的含量小于约1毫克/克，在波长257纳米的吸收率小于约0.5纳克/毫升，内毒素小于约0.05纳克/毫升，铁小于约0.2毫克/克，铜小于约0.2毫克/克，将1%该组合物的生理缓冲溶液1毫升，注入枭面猴眼球的玻璃体液中，当置换出约一半原有玻璃体液时，每立方毫米的枭面猴眼球玻璃体液的浸润小于约200个白血细胞。
应用本发明提供的方法还制出不同纯度等级的、平均分子量大于3.5×106道尔顿高分子量的透明质酸钠组合物。
在枭面猴眼球内的玻璃体试验，主要按照E.A.Balazs    1979年在美国专利No.4，141，973中叙述的方法进行的。
本发明还涉及兽疫链球菌微生物HA-116    ATCC    No.39920或从中产生的突变体。用选择细菌的方法，获得这种制造大量的透明质酸和没有溶血活性的微生物。这个方法包括以下过程：用适当的能够产生生物突变体的诱变剂如亚硝基胍，来处理生产透明质酸。如链球菌属微生物。突变体在适当的固态培养基（如Todd-Hewit琼脂）上进行培育，鉴定类粘蛋白菌落，这些菌落能从固态培养基中回收并在血琼脂培养基上培育。然后选择不溶解血红蛋白的菌落，并按照本发明的方法来制造透明质酸。
细菌的选择和突变
亚硝基胍（化学）诱变生成
链球菌属的细菌在pH6.0的三-马来酸缓冲溶液中，用100毫克/毫升的N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基-胍处理40分钟，然后使之分离，选择高产量的细菌时，在Todd-Hewitt琼脂板上进行分离;而选择溶血素阴性细菌时，在血琼脂板上进行分离。细菌的生存率通常约0.1%。从医院收集得来的各种C型链球菌按上述方法处理。
高产量的选择
菌落的表观评定于多量类粘蛋白菌落的选择。从C型类马链球菌变异体HA-100）分离得到的一个菌落，该菌落已被以色列卫生部的国家链球菌谘询中心确定。随后的试验是链球菌属菌种的鉴别试验，是以“API    20链球菌”试验为基础（API系统，S.A.FRANCE）。试验结果指出，HA-100更接近于兽疫链球菌。
溶血素阴性突变体的选择
菌种HA-100须经上述诱变生成过程。溶血素阴性〔hem.（一）〕的菌落从两方面检验，一个是溶血素活性，一个是在试管发酵中产生的透明质酸，选择一种〔hem.（一）〕突变体，也是透明质酸的高产者，它被用于大规模地生产透明质酸。这个突变体命名为HA-116。“API    20链球菌”试验指出，HA-116是兽疫链球菌的菌种。兽疫链球菌HA-116已储在布达佩斯条约所指定的国际专利程序微生物保藏中心，美国样板培养物收集中心，并且储在号为39920。
发酵过程
除了采用选定的突变体HA-116之外，我们已设计了几种用微生物发酵和缩短发酵时间以增加透明质酸的产量和其分子量的独特的方法。这包括（ⅰ）维持镁离子浓度的高含量;（ⅱ）采用高速曝气和剧烈搅拌实现喜氧发酵。
在本发明的最佳实施方案中，发酵培养基的组成如下：
组分    浓度（克/升）
酪蛋白水解液    20
酵母提取物    10
NaCl    2
MgSO4·7H2O 1.5
K2HPO42.5
葡萄糖    5
本发明的最佳实施方案为：发酵培养基中MgSO4·7H2O培养基中是1.0克/升，葡萄糖的浓度是10克/升，其它组分的浓度同上。
借助pH控制器连续加入5当量浓度的NaOH使培养基的pH保持在约7.0。同时，用平行连接到pH控制器上的泵加入等体积的50%（重量/体积）的葡萄糖。
细菌的培养能以曝气或不曝气进行。在两种情况中，最好都用剧烈的搅拌进行培养。最好的曝气速度为每分钟、每单位体积的培养基约1-2体积的空气。不曝气发酵桶产生平均分子量约1.5-2×106的透明质酸钠，产量为约2-3克/升。曝气发酵能产生平均分子量约2.2-3.3×106的透明质酸钠，产量约为4-6克/升。平均分子量是由粘度测量确定的，此测量是用已知的通用技术。在两种情况中，细菌的培养时间为12小时，当细菌的接种物为5%（体积/体积）时，应用660纳米波长处，测量得为2.0-2.5光密度单位。当发酵结束时，生物量的密度等于8-13光密度单位的混浊度。
透明质酸的离析和提纯
透明质酸可以用三种不同的过程提纯，即过程Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ。
提纯过程Ⅰ
提纯过程Ⅰ可以分成A和B两个步骤。步骤A的产品是一种“化妆品级”的透明质酸钠;而步骤B为将步骤A制得的“化妆品级”进一步提纯，制得没有刺激性适合临床应用的高纯产品。
步骤A
本步骤包括过滤除去细菌和其它不溶物质，依次用异丙醇三步沉淀，并用活性炭处理。
当仅制备化妆品级物料时，发酵培养液在约90℃加热20分钟，过滤前的pH约5.0。在此期间不必稀释。为制备临床级的高分子量物料，用冰冷却发酵培养液到约10°到15℃，用3%醋酸钠冲稀3到4倍，调节pH约为7.0，然后将其过滤。用硅藻土型助滤剂（即硅藻土FW-14    0.5克/升，俄亥俄州、辛辛那提Eagle-Picker工业有限公司）连同真空或压力过滤器，加入1体积异丙醇后，透明质酸钠从滤液中沉淀出来。沉淀再溶解于等体积的3%醋酸钠中，再用异丙醇沉淀。第二次沉淀再溶解于3%醋酸钠中，然后按1克/升加入活性炭，混合物搅拌约1小时，过滤悬浮液，加入异丙醇后，透明质酸钠重新沉淀出来，用异丙醇洗涤，最后磨碎，用空气干燥，得到“化妆品级”的产品。
步骤B
用透明质酸的十六烷基-吡啶鎓盐的两个连续沉淀法来纯化化妆品级的透明质酸钠盐。随后用硅酸镁吸附杂质，即硅酸镁载体柱。硅酸镁载体（Florisil）是西弗吉尼亚州伯克利斯柏林Floridin公司的注册商标。
氯化十六烷基-吡啶（CPC）沉淀
从步骤A制得的化妆品级物料溶解在0.15摩尔NaCl，得到浓度约0.25%的透明质酸盐溶液。1体积10%CPC于0.15M    NaCl中的液体加到约8体积的0.25%透明质酸盐溶液中。十六烷基-吡啶鎓盐用倾析或离心过滤法分离出来，用0.15摩尔NaCl洗涤，然后重新溶解在含有15%乙醇的2摩尔NaCl中，得到约0.2%透明质酸盐溶液。加入1体积异丙酮，透明质酸钠沉淀出来。透明质酸钠颗粒用异丙醇洗涤，重新溶解在上述的0.15摩尔NaCl中，重复该CPC沉淀工艺。从第二次CPC沉淀得到的异丙醇沉淀，重新溶解在1摩尔NaCl，以便用硅酸镁载体处理。硅酸镁载体吸附：约0.25%透明质酸钠的不含致热质的1摩尔NaCl溶液，通过一个30-60目的活化的硅酸镁柱子，即每十升溶液200克硅酸镁。然后将该溶液通过0.2微米过滤器进行无病菌过滤。透明质酸钠用过滤灭菌的异丙醇（1体积）沉淀出来。然后用无菌的分析纯乙醇洗涤，沉淀最后用无菌空气流干燥。
在这过程中透明质酸的产率约60-70%。
纯化过程Ⅱ和Ⅲ
两个独立的纯化方法可任选其一，用来得到化妆品级和临床级的透明质酸钠。这些过程被推荐来制备透明质酸钠。过程Ⅱ生产低分子量的化妆品级的透明质酸钠，过程Ⅲ生产高纯度、高分子量的、无刺激性、适合临床应用的透明质酸钠。
过程Ⅱ
发酵完毕，将发酵培养液加热到约90℃，调节pH到约5.0，在80℃下保持40分钟。这一过程用调节pH到7.0和冷却到20℃来终止。这个加热过程引起透明质酸钠的分子量下降到约1-1.5×106道尔顿。
向发酵混合物中加入1.5体积的乙醇，沉淀出透明质酸钠。沉淀进一步用乙醇洗涤，除掉大部分微生物。这一粗物料重新溶解在含有0.1%对羟基苯甲酸甲酯的3%醋酸钠水溶液中。体积调整到每升含2-3克透明质酸盐。每升1克活性炭和每升40克硅藻土型助滤剂，（即Celatom    FW-1，Eagle-Picker工业有限公司，俄亥俄州，辛辛那提）加入溶液中，至少搅拌1小时。该混合物通过助滤剂块过滤，加入1.5体积的乙醇，沉淀出透明质酸钠。沉淀重新溶解在等体积的3%醋酸钠中，这个溶液通过细孔棉滤筒进行过滤，然后用1.5体积的乙醇处理。碾磨沉淀的并纯化的透明质酸钠，最后用空气干燥得到“化妆品级”的产品。
过程Ⅲ
在这个过程中，发酵终止后，立即用1.5体积乙醇处理发酵液。沉淀的透明质酸钠用乙醇洗涤除去大部分微生物后，重新溶解在含有0.1%的对羟基苯甲酸甲酯的0.15摩尔NaCl水溶液中，将体积调整到每升含1到2克透明质酸钠。溶液中加入按每升1克活性炭和每升40克硅酸镁载体FW-14，混合物搅拌1小时。该悬浮物通过助滤剂块进行过滤。
氯化十六烷基-吡啶鎓盐（CPC）沉淀法
把10%于0.15M    NaCl中的溶液加入到干净的透明质酸盐溶液中。计算CPC溶液的加入量为透明质酸重量的5倍。沉淀物十六烷基-吡啶鎓盐用倾析法或离心过滤法分离。然后重新溶解在含10%（体积）乙醇的1摩尔NaCl中，得到约含1-2克/升的溶液。加入1.5体积乙醇后沉淀出透明质酸钠。
该沉淀物重新溶解在0.15摩尔NaCl中后，重复上节所述的CPC沉淀过程。第二次CPC以后，得到的乙醇沉淀物，进行最后一步纯化。
硅酸镁载体吸附
约0.1-0.15%透明质酸钠的无菌和无致热原的1摩尔NaCl溶液，通过30-60目、活性硅酸镁载体的柱子，即每升溶液20克Florisil。该溶液通过0.2微米的过滤器进行无菌过滤。用1.5体积乙醇沉淀出透明质酸钠，接着用分析纯乙醇洗涤。沉淀最后用无菌氮气流干燥。
透明质酸钠产品的性质
Ⅰ级透明质酸钠
Ⅰ级透明质酸钠是“化妆品级”透明质酸钠，它是由过程Ⅰ或过程Ⅱ的纯化步骤A得到的。其性质描述如下：
a.透明质酸钠的含量：87-91%，是用改进的咔唑法分析测定。此方法由Bitter和Muir发表在Anal.Biochem.4，330（1962）用Ⅰ型σ透明质酸，目录＃H1751，作为参考标准。
b.平均分子量：约700，000到1，500，000道尔顿，用特性粘度数计算，基本是按Laurent等在Biochem.Biophys.Acta    42，476（1960）所述进行。典型的特性粘度和分子量的计算表示如下。特性粘度和分子是：透明质酸钠（NaHA）溶液的粘度用毛细管粘度计测量。分别测量样品和纯溶剂的流出时间（t），加以比较。
粘度计：Cannon-Ubbelohde稀释粘度计大小100（Cannon仪器公司）。
溶液：0.1%透明质酸钠于0.2摩尔氯化钠中
温度：25℃±0.01
特性粘度的计算：
ηrel.-相对粘度表示溶液粘度相对于纯溶剂粘度的变化
ηrel.- (η样品)/(η参考) ＝ (ρ样品×t样品)/(ρ参考×t参考)
ρ-密度
t-流出时间（以秒计）
ηsp-比粘度    测量粘度的增长量（超过1的数量）
ηsp- (t样品-t参考)/(t样品) ＝ηrel.-1
ηsp/C-粘度数（比浓粘度）
C-浓度以克/100毫升计
（η）-极限粘度数（特性粘度）
（η）＝lim    ηsp/C
C＝0
极限粘度数（η）的测定：
分别测定0.1%透明质酸钠溶液和将它稀释二倍、三倍和四倍各溶液的粘度。透明质酸钠溶液的浓度用卡唑法测定。画出sp/C对C的关系曲线得到的直线外推到C＝0和y轴的交点即是（η）。
分子量的测定：
从Mark-Houwink关联的经验公式即可计算透明质酸钠的分子量
（η）＝0.0403·M0.775
式中M是分子量，以道尔顿为单位
用上述关联式测定各种NaHA产品的分子量，利用该关联式的结果见表Ⅰ。
表Ⅰ
〔η〕，毫升/克    分子量，道尔顿
800    350，000
1，200    590，000
1，600    860，000
2，000    1，145，000
2，600    1，600，000
3，200    2，100，000
c.葡糖醛酸与N-乙酰基葡糖胺（NAG）之比：为1/1;NAG
用Morgan和Elson改进的方法测定，方法在Carbohydrate    Chemisty    8，89（1980）。
d.含水量：10%±2%
e.蛋白质：小于0.1%，用Bradford的考马斯兰方法测定，Anal.Bichem.72，248（1976）
f.钠离子：5%±1%，用火焰光谱法测定。
g.硫酸盐含量：小于0.05%，盐酸水解作用后，用比浊法测定。Roden等，Methods    Enzymol.28，73（1972）。
h.核酸：小于0.5%，在波长260纳米，光线通过1%溶液，测量光的吸收率。
i.不刺激皮肤：用1%的溶液进行下述试验
（ⅰ）在兔子身上，Draize皮肤刺激试验Draize，J.H.在“食品、药品和化妆品内化学品安全性的鉴定”Associa-tion    of    Food    and    Drug    Officials    of    the    United    States，Austin，Texas，pp.46-49（1959）;
（ⅱ）在豚鼠身上延迟接触过敏性试验Magnusson    and    Kligman，J.Invest.Dermatol.52，268（1969）。
Ⅱ级透明质酸钠
Ⅱ级透明质酸钠是“临床级”透明质酸钠，它是通过过程Ⅰ步骤B或过程Ⅲ提纯以后获得的。Ⅱ级透明质酸钠的性质描述如下：
a.透明质酸钠含量：88-92%
b.平均分子量：大于7×105道尔顿，由过程Ⅰ步骤B提纯得到的NaHA通常在约2-3.5×106道尔顿范围内。得到的NaHA分子量在约2-4.4×106道尔顿范围内。这些分子量范围是从上述特性粘度数计算得到的。
c.葡糖醛酸与N-乙酰葡糖胺之比：1/1。
d.含水量：10%±2%
e.蛋白质：不能检测（小于0.01%）
f.钠离子：5%±10%
g.硫酸盐含量：不能检测（小于0.001%）
h.核酸：不能检测（小于0.02%）
i.中性糖：不能检测（小于0.2%）将样品水解后再测定中性糖在2当量浓度三氟乙酸内在120℃水解1小时后，接着真空干燥，在硅胶薄层板（0.2毫米）上进行薄层色谱分析，用0.02摩尔浓度的醋酸钠予处理。样品的水解液与参考标准一道装填，补进丙酮水溶液，丙酮∶水为90∶10。糖的斑点用硫酸碳化来测定。
j.致热性：阴性。致热性的测量是将1%的溶液注射到兔子体内后，用本行业熟知的标准方法测定。
k.无发炎活性：这个性质是用老鼠灵敏测定法来测定的。此法是基于将发炎剂注入腹膜后，主要为多形核白细胞和巨噬细胞的白血球细胞发生迁移。这些细胞被发炎过程产生的超氧自由基敏化，用下述方法测定迁移和敏化作用：将1毫升样品注射到2到3群老鼠的腹膜内，24小时以后，用Earle培养基5毫升洗涤每只动物的腹膜三次，将每群老鼠的洗涤液合在一起，细胞在1500转/分的离心机中沉淀十分钟。为了便于计算，重新悬浮在1毫升介质中。样品的体积调整到含4×106个细胞/毫升。0.25毫升为一批，与0.5毫升含量为2毫克C/毫升的细胞色素和分次量的肉豆蔻酸乙酸佛波醇酯（PMA）（0、2、10和最后为20毫克），进行约90分钟的培养，PMA为氧化突发系统的活化剂，培养基在1500转/分离心15分钟。上层清液用55纳米的光测定吸收强度，发炎性由腹膜细胞数的增加和对PMA起反应的最大能力和细胞色素C的减少来确定。发炎指数指的是从一只老鼠得到的白血球细胞的全部活性（以形成的超氧自由基的纳摩尔来计算）。假若与单独注射盐水的老鼠相比发炎指数不是相当高，那么就认为这个试样是非炎性的。

Claims (48)

1、兽疫链球菌微生物(Streptococcuszooepidemicus)HA-116ATCC39920号以及从中获得突变体。
2、获得透明质酸钠的方法，该法包括在适宜的条件下，在适当的营养培养基中，在剧烈的搅拌下，培养兽疫链球菌属微生物生长，该培养基中包含作为碳源的糖组分实际上不变的浓度约0.2到10克/升，实际上不变化pH值约6.5到7.5之间，实际上不变的镁离子浓度约0.05克/升以上，这样微生物生产透明质酸钠并将它排泄到培养基中，然后从培养基中回收透明质酸钠。
3、根据权利要求2的方法，其中微生物是兽疫链球菌。
4、根据权利要求3的方法，其中微生物是兽疫链球菌HA-116  ATCC  39920。
5、根据权利要求2的方法，其中所述的适当条件包括培养基曝气，速度为每分钟每单位体积培养基大于约0.5体积的空气。
6、根据权利要求2的方法，其中适当的营养培养基包含以下的组分，浓度以克/升培养基计：
组分  浓度
酪蛋白水解液  约10-30
酵母提取物  约5-15
NaCl  约2
MgSO4·7H2O 约0.5以上
K2HPO4约2.5
葡萄糖  约2-15。
7、根据权利要求2的方法，其中透明质酸钠的回收包括：处理含微生物的培养基，以便除去微生物和其它的不溶物，透明质酸钠从培养基中沉淀，然后回收沉淀。
8、根据权利要求7的方法还包括该沉淀的磨碎和干燥。
9、根据权利要求7的方法还包括：调节含微生物的培养基的pH至约5.0，在除去培养基中的微生物之前在适宜的一段时间内将培养基加热到80°-95℃。
10、根据权利要求9的方法，其中在约90℃加热培养基约20分钟。
11、根据权利要求9的方法，其中培养基在约80℃加热培养基约40分钟。
12、根据权利要求7的方法，其中的处理包括过滤。
13、根据权利要求12的方法，其中的过滤包括在硅藻土上进行的过滤。
14、根据权利要求7的方法，其中沉淀法包括在培养基中加入第一种有机溶剂，生成沉淀，该沉淀再溶解在3%醋酸钠水溶液中，加入第二种有机溶剂生成沉淀，沉淀再溶解于3%醋酸钠水溶液中，加入活性炭形成悬浮液，过滤悬浮液并在滤液中加入第三种有机溶剂生成透明质酸钠沉淀。
15、根据权利要求14的方法，其中第一、第二和第三种有机溶剂各自是异丙醇、乙醇或丙酮。
16、根据权利要求15的方法，其中第一、第二和第三种有机溶剂都是异丙醇。
17、根据权利要求7的方法，还包括调节含微生物的培养基的pH到约7.0，冷却培养基到约4°到15℃之间，在处理培养基除去微生物之前，用3%醋酸钠水溶液稀释培养基。
18、根据权利要求7的方法，还包括调节含微生物的培养基的pH到约7.0，培养基冷却到4°到20℃之间，在处理培养基除去微生物之前，用3%醋酸钠水溶液稀释培养基。
19、根据权利要求14的方法，还包括调节含微生物的培养基的pH到约7.0，培养基冷却到约4°到15℃之间，在处理培养基除去微生物之前用3%醋酸钠水溶液稀释。
20、根据权利要求19的方法，还包括将沉淀再溶解在0.15摩尔的NaCl水溶液中，加入氯化十六烷基吡啶鎓盐，形成透明质酸的十六烷基吡啶鎓盐，将该盐溶解在NaCl水溶液和乙醇中（NaCl至少1摩尔），加入有机溶剂和回收透明质酸钠。
21、根据权利要求20的方法，还包括将回收的透明质酸钠再溶解在0.15摩尔的NaCl水溶液中，加入氯化十六烷基吡啶鎓盐，再形成透明质酸的十六烷基吡啶鎓盐，将该盐溶解在NaCl（至少约1摩尔）和10%乙醇水溶液中，用有机溶剂沉淀出透明质酸钠，该钠盐溶解于NaCl溶液中，将得到的溶液接触硅酸镁吸附剂，除去残余的十六烷基吡啶鎓离子和其它杂质，溶液灭菌，加入无菌的有机溶剂从溶液中沉淀出透明质酸钠。
22、根据权利要求21的方法，其中有机溶剂是异丙醇。
23、根据权利要求21的方法，还包括透明质酸钠沉淀在无菌条件下进行空气干燥。
24、根据权利要求21的方法，其中硅酸镁吸附剂是硅酸镁载体（Florisil）。
25、根据权利要求2的方法，其中透明质酸钠的回收包括以下步骤：培养基中加入第一种有机溶剂，产生沉淀，用额外的有机溶剂洗涤沉淀，将沉淀再溶解在适当的水溶液中，加入活性炭形成悬浮液，过滤该悬浮液以除去残余的微生物和其它不溶物。
26、根据权利要求25的方法，还包括调节含有微生物培养基的pH到5.0左右，在加入第一种有机溶剂之前，在温度约80°和95℃之间一段适宜的时间内加热培养基。
27、根据权利要求26的方法，其中适宜的时间是指在温度为80℃时加热40分钟。
28、根据权利要求25的方法，其中过滤法包括在硅藻土上进行过滤的。
29、根据权利要求25的方法，其中适当的水溶液是3%醋酸钠溶液。
30、根据权利要求25的方法，还包括滤液中加入第二种有机溶剂产生沉淀，该沉淀再溶解在3%醋酸钠水溶液中，过滤该溶液并向滤液中加入第三种有机溶剂以产生透明质酸钠沉淀。
31、根据权利要求30的方法，其中第一、第二、第三种有机溶剂分别为异丙醇、乙醇或丙酮。
32、根据权利要求30的方法，其中第一、第二、第三种有机溶剂都是乙醇。
33、根据权利要求30的方法，还包括对第三种有机溶剂中析出的沉淀的磨碎、然后干燥。
34、根据权利要求25、26或30的方法，还包括调节含微生物培养基的pH到7左右，在加入第一种有机溶剂之前，冷却培养基到约4℃和20℃之间。
35、根据权利要求25的方法，其中适当的水溶液是指含0.1%对羟基苯甲酸甲酯的0.15摩尔的NaCl水溶液。
36、根据权利要求35的方法，还包括向透明质酸盐溶液中，加入氯化十六烷基吡啶鎓的0.15摩尔NaCl溶液，生成透明质酸的十六烷基吡啶鎓盐，将此盐再溶解在含有10%乙醇的NaCl（至少约1摩尔）水溶液中，加入有机溶剂来回收透明质酸钠。
37、根据权利要求36的方法，还包括再溶解回收的透明质酸钠到0.15摩尔NaCl水溶液中，加入氯化十六烷基吡啶鎓，再生成透明质酸的十六烷基吡啶鎓盐，再溶解十六烷基吡啶鎓盐到含10%乙醇的NaCl水溶液中，（NaCl至少为约1摩尔）。加入有机溶剂沉淀出透明质酸钠，再溶解到无菌的1摩尔NaCl水溶液中，用硅酸镁吸附剂处理所得的溶液，以除去残余的十六烷基吡啶鎓离子和杂质，使溶液灭菌加入无菌的有机溶剂从溶液中沉淀出透明质酸钠。
38、根据权利要求37的方法，其中有机溶剂是乙醇。
39、根据权利要求37的方法，还包括在无菌条件下用氮气干燥透明质酸钠。
40、用权利要求2、7、13、17、19、25、30、34、36或37中的任何一项的方法制造的透明质酸钠。
41、一种透明质酸钠组合物，其特征在于，对皮肤没有刺激性，其中含有分子量大约为700，000到1，500，000道尔顿之间的透明质酸钠约87%到91%之间，葡糖醛酸与N-乙酰葡糖胺之比为1∶1，含水约8%到12%，（重量），含钠离子约4%到5%（重量），蛋白质小于0.1%（重量），硫酸盐小于0.05%（重量），核酸小于0.5%（重量）。
42、透明质酸钠组合物，其特征在于无致热性和无发炎活性包括平均分子量约2到3.5×106道尔顿透明质酸钠，含量约88%和92%（重量）之间葡糖醛酸与N-乙酰基葡糖胺之比为1∶1，含约8%到12%（重量）的水，4%到6%（重量）的钠离子，小于0.01%（重量）的蛋白质，小于0.001%（重量）的硫酸盐，小于0.02%（重量）的核酸，小于0.2%（重量）的中性糖。
43、一种透明质酸钠组合物，特征在于无致热性和无发炎活性，它包含平均分子量为2到4.4×106道尔顿的透明质酸钠、含量约为88%和92%之间（重量），葡糖醛酸与N-乙酰基葡糖胺之比为1∶1，约含有8%到12%（重量）的水，4%到6%（重量）的钠离子，小于0.01%（重量）的蛋白质，小于0.001%（重量）的硫酸盐，小于0.02%（重量）的核酸以及小于0.2%（重量）的中性糖。
44、含权利要求41、42或43的透明质酸钠和适宜的载体的组合物。
45、高分子量透明质酸钠组合物，其特征在于，最小极限粘度数约3.5立方米/千克，最小平均分子量约3.5×106道尔顿，在25℃用波长436纳米测量的比旋光度约155°到165°，蛋白质含量小于1毫克/克，257纳米波长光吸收率小于约0.5纳克/毫升，含内毒素小于约0.05纳克/毫升，铁含量小于约0.2毫克/克，铜含量小于约0.2毫克/克，当将1毫升1%该组合物溶液溶解在生理缓冲液后，注入枭面猴眼球的玻璃体液中，置换出原有玻璃体液的一半时，每立方毫米玻璃体液的浸润小于约200个白血球细胞。
46、具有权利要求41、42或45的透明质酸钠组合物，其中平均分子量大于3.5×106道尔顿。
47、具有权利要求41、43或45的透明质酸钠组合物，其中平均分子量大于4.4×106道尔顿。
48、生产大量的和没有溶血活性的透明质酸钠的微生物的选择方法，包括用适当的诱变剂处理生产透明质酸的微生物以得到其突变体，在适宜的固态培养基上培养突变体，鉴别类粘蛋白菌落，回收这些菌落，在血琼脂培养基上培养回收到的菌落，选择不溶解血红蛋白的微生物菌落。
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