DE10004191A1

DE10004191A1 - Hochleistungs-Grossfeld-Rastermikroskop

Info

Publication number: DE10004191A1
Application number: DE10004191A
Authority: DE
Inventors: Yuri Osipchuk; Sasha Dromaretsky; Yuriy Roll; Stephen Smith
Original assignee: Axon Instruments Inc
Current assignee: Molecular Devices LLC
Priority date: 1999-02-05
Filing date: 2000-02-01
Publication date: 2000-12-07
Anticipated expiration: 2020-02-02
Also published as: US6628385B1; US6833916B2; DE10004191B4; US20040042007A1

Abstract

Ein optisches Fluoreszenz-Abbildungssystem (10) erzeugt zwei getrennte Punkte (S¶1¶ und S¶2¶) auf einer Probe (12) durch zwei Anregungslaserstrahlen (B¶1¶ und B¶2¶), die durch einen ersten und einen zweiten Laser (L¶1¶ und L¶2¶) erzeugt werden. Die Anregungslaserstrahlen (B¶1¶ und B¶2¶) gelangen in leicht unterschiedlichen Winkeln zuerst durch eine Apertur (15) eines 45 DEG -Umlenkspiegels (13) und dann durch ein Objektivelement (14). Dadurch werden Emissionslichtstrahlen (16, 18) von jedem beleuchteten Punkt (S¶1¶ und S¶2¶) erzeugt, und vom Spiegel (13) reflektiert und durch eine zweite Linse (19) gerichtet, bevor sie einen der beiden Detektoren (PMT 1 und PMT 2) erreichen. Der Emissionsstrahl (16) wird von einem zweiten 45 DEG -Spiegel (22) reflektiert, bevor er den Detektor (PMT 1) erreicht, während der Emissionsstrahl (18) direkt zum Detektor (PMT 2) gelangt. Gegebenfalls können optische Trennelemente (24) wie zum Beispiel dichroitische Filter, Prismen oder Gitter vor dem jeweiligen Detektor (PMT 1 und PMT 2) angebracht werden. Beim optischen Fluoreszenz-Abbildungssystem (10) kann ein Abtastsytem (17) zum Beleuchten und Abbilden des gesamten Bereichs der Probe (12) verwendet werden.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf optische Fluoreszenz- Abbildungssysteme und ein entsprechendes Verfahren und ins besondere auf ein nicht konfokales Fluoreszenz-Abbildungs system zur großflächigen Abbildung relativ großer Proben.

Die Erfindung bezieht sich auf das simultane Abbilden von zwei oder mehr fluoreszierend markierte Proben in einem opti schen Rastermikroskop. Das bei diesem System erhaltene Bild feld ist wesentlich größer als das herkömmlicher Fluoreszenz mikroskope, bei denen das Bildfeld typischerweise durch die optische Konstruktion der Objektivlinse eingeschränkt ist. Die Erfindung kann auf Proben wie zum Beispiel DNA-Mikrofelder oder Gewebe-Mikrofelder angewendet werden, ist darauf aber nicht beschränkt, wobei eine kurze Tiefenschärfe nicht benö tigt wird, die nämlich die Systemleistung beeinträchtigen würde (Cheung, V. G., M. Morley, F. Aguilar, A. Massimi, R. Kucherlapati and G. Childs, "Making and reading microarrays" ("Herstellen und Abtasten von Mikrofeldern") Nature Genetics Supplement 21: 15-19 (1999)). Sie ist außerdem für Proben geeignet, die fluoreszente Markierungen mit kleinen Stokes- Verschiebungen und/oder sich überlagernden Absorptions- und Emissionsspektren verwenden.

Schwierigkeiten können bei der Fluoreszenzmikroskopie auftreten, wenn mehrere Fluore mit nahe beieinanderliegenden Spektraleigenschaften abgebildet werden. Es kann sich aufgrund der Überlagerung von Absorptionsspektren oder der Spektral bandbreite der Quelle als unpraktikabel herausstellen, nur einen Fluor mit einem Quellenstrahl (z. B. einem Laserstrahl) anzuregen. Die Spektralemissionsbereiche mehrerer Fluore können sich überlagern, was es schwierig macht, die Emission vom jeweiligen Fluor effizient und ohne Störungen zu einem einzigen Detektor zu leiten. Selbst wenn sich die Emissions bereiche nicht überlagern, können sie so nahe beieinander liegen, daß es schwierig wird, eine wirksame optische Kom ponente (z. B. Filter, Gitter oder Prisma) zu deren Trennung herzustellen. Eine Lösung besteht darin, jede Wellenlänge unabhängig abzutasten und dann ein Kompositbild aus mehreren Abtastungen zusammenzusetzen. Hier werden dann jedoch die Geschwindigkeit und die Bilddeckung ein Thema.

US-Patent Nr. 5,304,810 (Amos) offenbart ein konfokales Rastermikroskop, bei dem zwei oder mehr Quellenstrahlen mit unterschiedlichen Winkelausrichtungen zwei getrennte Punkte beleuchten, die sich auf einer Probe in der Objektebene eines Mikroskopobjektivs befinden. Das dabei entstehende reflektier te oder fluoreszierende Licht wird durch eine gleiche Anzahl beabstandeter Detektoren aufgefangen, wobei jeder Licht von einem einzigen beleuchteten Punkt empfängt. Bei diesem System ist der Bereich, aus dem Licht vom jeweiligen Detektor gesam melt wird (sein "Blickfeld), räumlich auf fast die gleiche Ausdehnung wie die Anregungspunktgröße beschränkt.

Ein Vorteil des Amos-Systems ist, daß damit eine hohe räumliche Ausdehnung bei jedem einzelnen auf dem Muster be leuchteten Punkt erreicht wird, was für viele Anwendungsberei che höchst erwünscht ist. Bei anderen Anwendungsbereichen reicht jedoch auch eine geringere Auflösung.

Shalon, D., S. Smith und P. O. Brown beschreiben in "A DNA micro-array system for analyzing complex DNA samples using two-color fluorescent probe hybridization" ("DNA-Mikrofeldsy stem zum Analysieren komplexer DNA-Proben unter Verwendung einer zweifarbigen Fluoreszenzprobenhybridisierung", Genome Research 6: 639-645 (1996), einen Scanner zur Zwei-Wellenlän gen-Fluoreszenzerfassung von DNA-Mikrofeldern, die Punkte beträchtlicher Größe auf der Probe beleuchten. Dies geschieht durch ein absichtliches Unterfüllen der Objektiv-Eingangs pupille (d. h. der Rückapertur), was durch ein Verringern der numerischen Apertur (NA) des konvergierenden Strahls die durch Diffraktion eingeschränkte Punktgröße in der Brennebene ver größert. Hierbei ist zu bemerken, daß ein beträchtliches Unterfüllen der Objektivapertur mit einem Einzel-Quermoden- Laserstrahl mit großer Wahrscheinlichkeit zu einer Gauß'schen Intensitätsverteilung in der Brennebene führt, während ein Überfüllen der Objektivapertur, wie das oft in der Laser- Rastermikroskopie geschieht, eine Verteilung in der Brennebene erzeugt, die einer Airy-Funktion angenähert ist.

Wie auf diesem Gebiet allgemein bekannt, ist es möglich, bei einem optischen Mikroskop die axiale Auflösung zu verbes sern (die Tiefenschärfe zu verringern), indem man es als kon fokales Mikroskop konstruiert. Der wesentliche Vorteil eines konfokalen Mikroskops ist, daß Licht aus unscharfen Ebenen abgestoßen wird, wodurch dicke Proben ohne Verschwimmen abge bildet werden können (Corle, T. und G. Kino, Confocal Scanning Optical Microscopy and Related Imaging Systems, Academic Press, San Diego 1996). Cheung et al. (1999) haben festge stellt, daß eine konfokale Konfiguration das Signal-Rauschen- Verhältnis tatsächlich verringerte und daher beim Abtasten von Mikrofeldern nicht vorteilhaft war. Außerdem ist die in einem konfokalen System mit hoher numerischer Apertur erzeugte Tiefenschärfe wesentlich geringer als die typische Dicke eines Mikroskop-Objektträgers. Dies kann auch bei einem nicht kon fokalen System mit hoher NA zum Thema werden, kann jedoch leichter überwunden werden. Zum Beispiel werden bei der vor liegenden Erfindung Quellenstrahlen mit niedriger NA mit großflächigen Detektoren kombiniert, um so die Empfindlichkeit gegenüber Unschärfen zu verringern.

Im US-Patent Nr. 5,459,325 (Heuton und Van Gelder) ist ein Hochgeschwindigkeits-Fluoreszenzscanner offenbart, bei dem ein leichtgewichtiger, eine Linse und einen Spiegel enthalten der Abtastkopf verwendet wird. Diese Konstruktion hat den Vorteil, daß das Sichtfeld verstellt werden kann. Es muß dabei jedoch eine Spektraldispersionsvorrichtung verwendet werden, die die Anregungs- und Emissionsstrahlen trennt. Wie oben erörtert, gibt es praktische Hindernisse bei der spektralen Strahltrennung, die in manchen Anwendungsgebieten die Flexi bilität beschränken.

Es besteht daher ein Bedarf nach einem Mehrwellenlängen- Abtastsystem zur Messung von Proben ohne strenge Tiefenunter scheidung. Außerdem sollte es die Einschränkungen spektraler Strahlteilung überwinden, damit verfügbare Fluore frei einge setzt werden können. Ferner besteht ein Bedarf nach einem entsprechenden Verfahren. Die vorliegende Erfindung ist auf die Lösung dieses Problems gerichtet.

Das erfindungsgemäße optische Fluoreszenz-Abbildungs system, das ursprünglich zum Zweck der Abbildung hybridis ierter DNA-Chips konzipiert war, bietet eine reiche Auswahl potentieller Fähigkeiten. Ein erster Aspekt des erfindungs gemäßen Abbildungssystems weist eine optische Quelle auf zum Erzeugen von mindestens zwei Anregungsstrahlen mit räumlicher Trennung zum Beleuchten von mindestens zwei voneinander ge trennten Punkten auf einer Probe, die einen vorbestimmten Ab stand voneinander haben, wobei die beleuchteten Punkte minde stens zwei Emissionsstrahlen erzeugen, die räumlich oder im Winkel getrennt sind, einen Detektor zum Empfangen des jewei ligen Emissionsstrahls und ein Objektivelement zum Richten des Anregungsstrahls auf die Probe. Jeder Detektor hat ein Blick feld (empfängt Licht von einem Bereich) auf der Probe, das größer als der beleuchtete Punkt ist, jedoch nur einen ein zigen beleuchteten Punkt umfaßt.

Nach einem Aspekt der Erfindung weist das Objektivelement einen Abtastmechanismus zum Richten der Anregungsstrahlen auf einen Bereich der Probe auf. Vorzugsweise weist der Abtastme chanismus eine Einrichtung zum Bewegen des Objektivelements in eine erste Richtung auf. Bei dieser Ausführungsform weist das System weiter eine Einrichtung zum Bewegen der Probe in eine zweite, typischerweise dazu im rechten Winkel verlaufende Richtung auf. Datenverarbeitungssteuerungen und geeignete Abbildungsverfahren werden zum Herstellen eines Bilds einer abgetasteten Probe verwendet.

Nach einem weiteren Aspekt der Erfindung erzeugen die optische Quelle und das Objektivelement die beleuchteten Punkte in der Weise, daß Punkte erzeugt werden, die relativ große Punkte sind, wenn man sie mit diffraktionsbegrenzten Punkten eines Mikroskopobjektivs mit einer mittleren bis hohen numerischen Apertur (NA) vergleicht, wie sie typischerweise bei einem konfokalen Mikroskop verwendet werden. Dies ist ein wichtiges Merkmal eines Aspekts der Erfindung und wird im einzelnen weiter unten erörtert.

Nach einem weiteren Aspekt der Erfindung besteht zwischen den beiden Anregungsstrahlen eine räumliche Trennung. Vorzugs weise sind die Anregungsstrahlen zueinander winkelversetzt. Außerdem weist das System weiter eine Einrichtung zum räumli chen Trennen der Emissionsstrahlen und zum Umlenken der Emis sionsstrahlen auf, wobei jeder zu seinem entsprechenden Detek tor geleitet wird. Die räumliche Trennung der Anregungs- und Emissionsstrahlen geschieht vorzugsweise über einen Spiegel mit einem kleinen optischen Loch. Es sind jedoch auch andere Konstruktionen denkbar, wie zum Beispiel ein kleiner Spiegel, der kleiner als der Emissionsstrahl ist, oder ein Prisma.

Nach einem weiteren Aspekt der Erfindung ist jeder Detek tor von einem Brennpunkt seines entsprechenden Emissions strahls versetzt. Hierdurch wird ein gewisser Grad der Un schärfe erzeugt, die, wie hier noch erörtert, breitere Ab bildungsverfahren zuläßt.

Ein zweiter Aspekt des erfindungsgemäßen Abbildungssy stems weist eine optische Quelle zum Erzeugen eines Anregungs strahls auf, der auf eine Probe gerichtet wird, die in einer Weise abgebildet werden soll, bei der ein Emissionsstrahl von der Probe erzeugt wird, einen Detektor zum Empfangen des Emissionsstrahls von der Probe, ein Objektivelement zwischen der optischen Quelle und der Probe zum Richten des Anregungs strahls auf die Probe und zum Empfangen des Emissionsstrahls von der Probe in einer Weise, bei der der Anregungsstrahl und der Emissionsstrahl zumindests teilweise den gleichen Raum einnehmen, und ein optisches Element zum geometrischen Trennen des Anregungsstrahls vom Emissionsstrahl und zum Richten des Emissionsstrahls auf den Detektor. Am Trennungspunkt der beiden Strahlen nimmt der Anregungsstrahl teilweise den Emis sionsstrahl ein.

Nach einem Aspekt dieser Ausführungsform des Abbildungs systems nimmt der Anregungsstrahl einen Teil des Objektiv elements ein und der Emissionsstrahl nimmt im wesentlichen das gesamte Objektivelement ein. Vorzugsweise ist das Objektiv element eine Linse, es kann jedoch auch ein Parabolspiegel verwendet werden, sowie eine Anzahl dioptrischer, katoptischer und katadioptrischer Abbildungssysteme.

Nach einem weiteren Aspekt der Erfindung weist das opti sche Element einen Spiegel mit einem kleinen Loch auf. Alter native Konstruktionen für das optische Element, das hier auch als Strahlteiler bezeichnet wird, sind ein kleiner Spiegel, der kleiner ist als der Emissionsstrahl, ein Prisma und mehre re andere unten beschriebene Konstruktionen.

Nach einem weiteren Aspekt der Erfindung nimmt der Anre gungsstrahl einen kleinen Prozentsatz des vom Emissionsstrahl eingenommenen Raums ein.

Nach noch einem weiteren Aspekt der Erfindung ist die optische Quelle so konstruiert, daß sie einen ersten und einen zweiten Anregungsstrahl erzeugt, die durch das Objektivelement in einer Weise auf die Probe gerichtet werden, daß ein erster und ein zweiter Emissionstrahl entstehen. Vorzugsweise sind der erste und der zweite Anregungsstrahl zueinander winkelver setzt. Alternativ dazu können jedoch der erste und der zweite Anregungsstrahl parallel zueinander verlaufen. Bei dieser alternativen Konstruktion kann das Objektivelement eine erste und eine zweite Objektivlinse aufweisen für jeden Anregungs strahl eine.

Des weiteren wird die oben genannte Aufgabe erfindungs gemäß durch Verfahren nach den Ansprüchen 26 und 36 gelöst. Vorteilhafte und bevorzugte Weiterbildungen des erfindungs gemäßen Verfahrens nach Anspruch 26 sind Gegenstand der An sprüche 27 bis 35. Vorteilhafte und bevorzugte Weiterbildungen des erfindungsgemäßen Verfahrens nach Anspruch 36 sind Gegen stand der Ansprüche 37 bis 43.

Diese und weitere Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus der folgenden detaillierten Beschreibung der Erfindung ersichtlich, die anhand der Zeichnungen erfolgt.

Es zeigt:

Fig. 1 eine schematische Darstellung des erfindungsgemäßen optischen Abbildungssystems,

Fig. 2 ein Schema, bei dem die Anregungspunktgröße und das Emissionsbildfeld des optischen Abbildungssystems von Fig. 1 kontrastiert werden,

Fig. 3 eine schematische Darstellung einer ersten prakti schen Ausführungsform des optischen Abbildungssy stems von Fig. 1,

Fig. 4 eine schematische Darstellung wie Fig. 3 einer zwei ten praktischen Ausführungsform, bei der der Spiegel und die Objektivlinse durch einen Parabolspiegel ersetzt wurden,

Fig. 5 ein Schema einer Ausführungsform einer weiteren alternativen Ausführungsform eines Parallel-Zwei strahl-Abbildungssystems,

Fig. 6 eine vergrößerte schematische Darstellung des Strahlteilers von Fig. 1,

Fig. 7-13 alternative Konstruktionen für Strahlteiler.

Die bevorzugten Ausführungsformern der Erfindung werden nun im einzelnen beschrieben, von denen Beispiele in den Zeichnungen dargestellt sind. Die Erfindung wird zwar anhand bevorzugter Ausführungsformen beschrieben, doch versteht es sich, daß die beschriebenen Ausführungsformen nicht als spezi fische Einschränkung der Erfindung auf diese Ausführungsformen gedacht sind. Vielmehr soll die Erfindung sich auch auf Alter nativen, Modifikationen und Äquivalente erstrecken, die im Geist und im Umfang der Erfindung, wie er durch die nachfol genden Ansprüche definiert ist, beinhaltet sein können.

Die hier gebotene Offenbarung ist als allgemeine Be schreibung des Systems gedacht, wobei solche Eigenschaften wie Bildfeld, Auflösung, Vergrößerung, Ausleuchtungsleistung und Abbildungsmodi erörtert werden. Mehrere potentielle Variatio nen des Systems werden auch beschrieben.

1. Systembeschreibung

Gemäß Fig. 1 ist das erfindungsgemäße optische Fluores zenz-Abbildungssystem 10 hier zur Verwendung in einem opti schen Rastermikroskop offenbart, es hat jedoch weitere Anwen dungsmöglichkeiten, wie noch erörtert wird. Zwei voneinander getrennte Punkte S₁ und S₂ werden auf einer Probe 12 durch ein Paar Anregungslaserstrahlen B₁ und B₂ beleuchtet, die durch einen ersten und einen zweiten Laser L₁ und L₂ erzeugt werden. Jede der Laserquellen L₁ und L₂ enthält dabei tatsächlich mehrere Komponenten (z. B. einen Frequenzverdopplungskristall zum Erzeugen eines 532-nm-Strahls). Die Anregungs-Laserstrah len B₁ und B₂ gelangen in geringfügig verschiedenen Winkeln zuerst durch eine Apertur 15 eines 45°-Umlenkspiegels 13 und dann durch ein Objektivelement 14, das in Fig. 1 als Linse dargestellt ist. Dadurch werden Emissionslichtstrahlen S₁ und S₂ relektiert und durch den Spiegel 13 umgelenkt und durch eine zweite Linse 19 geleitet, bevor sie einen der beiden Detektoren PMT 1 oder PMT 2 erreichen. Der Emissionsstrahl 16 wird an einem zweiten 45°-Spiegel 22 reflektiert, bevor er den Detektor PMT 1 erreicht, während der Emissionsstrahl 18 direkt zum PMT 2 gelangt. Gegebenenfalls können optische Trennelemen te 24, wie zum Beispiel dichroitische Filter, Prismen oder Gitter vor jedem Detektor PMT 1 und PMT 2 positioniert werden. Es versteht sich, daß die optimale relative Position optischer Trennelemente 24 und ihrer entsprechenden Detektoren, PMT 1 und PMT 2, etwas anders sein kann, als in Fig. 1 gezeigt.

Das optische Fluoreszenz-Abbildungssystem 10 kann ein Abtastsystem verwenden, das durch die Referenznummer 17 all gemein in Phantomdarstellung angedeutet ist, das zum Beleuch ten und Abbilden des gesamten Bereichs der Probe 12 dient. Vorzugsweise verwendet das Abtastsystem 17 einen Objektivlin senscanner für eine Achse und einen Proben-(Tisch-)Scanner für die andere, darauf senkrecht stehende Achse. Das Abtastsystem 17 ist anhand von Fig. 3 eingehender beschrieben.

Es können unterschiedliche Verfahren zum Erzeugen einer Winkelversetzung, wie sie durch den Winkel θ angegeben ist, für die Anregungsstrahlen B₁ und B₂ verwendet werden. Einer der Strahlen B₁ und B₂ kann durch einen 45°-Umlenkspiegel 20 gerichtet werden, so daß die Strahlen B₁ und B₂ mit einer leichten Winkelversetzung ihrer Propagationsrichtungen in das optische Abtastsystem eintreten. Bei dieser Konstruktion sind die Anregungsstrahlen selbst kollimiert oder annähernd kolli miert.

Die Größe des beleuchteten Bereichs der Punkte S₁ und S₂ auf der Probe 12 wird durch die Anregungsstrahldurchmesser, die Brennweite F₁ der Objektivlinse 14 und den Grad der Defo kussierung der Probe bestimmt. Vorzugsweise sind die Anre gungsstrahldurchmesser viel kleiner als die Eingangspupille der Objektivlinse. Die Eingangspupille ist die Abbildung der Aperturblende der Linse aus der Sicht der Quelle und der Detektoren (und nicht der Probe).

Das Objektivelement 14 ist eine asphärische Einzellinse. Der nominelle Probenbrennpunkt liegt auf halbem Weg zwischen den Brennpunkten der beiden Anregungsstrahlen (wobei die Brennpunkte aufgrund axialer chromatischer Aberration axial voneinander getrennt sind). Bei der aktuellen Anwendungsweise haben die Beleuchtungspunkte S₁ und S₂ einen Durchmesser in der Größenordnung von 5-10 µm. Die erwünschte Punktgröße und axiale Trennung kann dadurch eingestellt werden, daß einer oder alle beide Anregungsstrahlen B₁ und B₂ leicht konver gierend oder divergierend und nicht kollimiert sind. Die seitliche Versetzung zwischen den beiden Punkten wird durch den Winkel θ der Anregungsstrahlen und die Brennweite der Objektivlinse bestimmt. Wie noch erörtert wird, kann das Objektivelement 14 alternativ auch anders konstruiert sein.

Das optische Fluoreszenz-Abbildungssystem 10 verwendet zwei Detektoren PMT 1 und PMT 2, von denen jeder Licht von einem der zwei beleuchteten Punkte S₁ und S₂ auffängt. Durch den 45°-Umlenkspiegel 22, der den Emissionsstrahl 16 umlenkt, wird verhindert, daß die Detektoren PMT 1 und PMT 2 Licht vom falschen Beleuchtungspunkt empfangen, wodurch die Probe in zwei Bereiche aufgeteilt wird, von denen jeder von einem einzigen Detektor "gesehen" wird. Die Detektoren PMT 1 und PMT 2 können PMT (photomultiplier tubes/Photovervielfacherröh ren), Photodioden, Lawinen-Photodioden, CCD-Elemente und andere optische Detektoren enthalten.

Gemäß Fig. 2 "sieht" jeder Detektor einen von zwei (oder mehr, im allgemeinen Fall) sich nicht überlagernde Bereiche R₁ und R₂ der Probe, wobei eine Grenze 25 zwischen diesen Berei chen verläuft, die durch die Position des Spiegels 22 im Verhältnis zur zweiten Linse 19, wie in Fig. 1 gezeigt, be stimmt wird. Bei einer bevorzugten Ausführungsform haben die Anregungspunkte S₁ und S₂ einen Durchmesser in der Größen ordnung von 5-10 µm. Die Größe dieser Punkte wird durch die Durchmesser und Wellenlängen der eintreffenden Laserstrahlen B₁ und B₂ und dadurch bestimmt, daß diese Strahlen nicht die ganze Apertur der Objektivlinse 14 ausfüllen. Vorzugsweise ist die Entfernung zwischen diesen Punkten ungefähr 70 µm. Im Gegensatz dazu ist bei einem konfokalen Mikroskop eine typi sche Anregungspunktgröße in der Größenordnung von 1 µm oder weniger, was daran liegt, daß der Punkt durch die diffrak tionsbegrenzte Punktgröße einer Mikroskoplinse mit einer mittleren bis hohen NA bestimmt wird.

Zum Erreichen der erwünschten Größe der beleuchteten Punkte S₁ und S₂ der vorliegenden Erfindung wird die Eingangs pupille der Objektivlinse 14 unterfüllt, indem die Laserstrah len B₁ und B₂ direkt in die Linse gerichtet und nicht auf den Durchmesser der Eingangspupille expandiert werden. Diese Anordnung vermeidet die Verwendung eines dichroitischen Spie gels zum Trennen des Anregungslichts und des Emissionslichts, wie das sonst bei konfokalen Mikroskopen und anderen optischen Abtastsystemen normalerweise getan wird. Stattdessen ist ein (idealerweise) 100%-reflektierender Spiegel 13 mit einem 1 mm großen Loch 15 in dessen Mitte vorgesehen. Das Loch kann kreisförmig, elliptisch oder schlitzförmig sein. Die Anre gungslichtstrahlen (typischerweise mit einem Durchmesser von 0,8 mm) gelangen durch das Loch, während das Fluoreszenz- Emissionslicht vom Spiegel reflektiert wird und, falls nötig, durch ein Sperrfilter, durch das gestreutes Anregungslicht herausgefiltert wird, und durch die zweite Linse 19 zu den Lichtdetektoren PMT 1 und PMT 2.

Das Blickfeld der Detektoren PMT 1 und PMT 2 unterschei det sich auch vom Blickfeld der Detektoren eines typischen konfokalen Mikroskops. Hier ist zu bemerken, daß das Blickfeld sich in diesem Zusammenhang auf das Bild des Detektors oder der Detektorapertur auf der Probe und nicht die Gesamtgröße des abgetasteten Bereichs bezieht. Wie in Fig. 2 gezeigt, ist das gesamte Blickfeld der Detektoren bei der vorliegenden Erfindung der Bereich 26, der beide Anregungspunkte S₁ und S₂ umfaßt. Es ist in Fig. 2 zwar als Kreis gezeigt, doch versteht es sich, daß der Bereich 26 auch andere Formen annehmen kann. Zum Beispiel kann das Blickfeld bei der Probe 12 eine Quer abmessung von 200 mm haben. Der vor die Detektoren PMT 1 und PMT 2 geschaltete Spiegel 22 teilt das Blickfeld in zwei Hälften 28 und 30, so daß jeder Detektor ungefähr die Hälfte des gesamten Blickfelds "sieht". Dagegen ist das Blickfeld eines konfokalen Mikroskops räumlich auf 1 µm oder weniger beschränkt, was fast die gleiche Größe wie der Anregungspunkt ist, was zum Maximieren der höhen seitlichen Auflösung nötig ist. Das Blickfeld wird bei einem konfokalen Mikroskop typi scherweise durch eine vor den Detektor geschaltete Apertur beschränkt.

Ein zusätzlicher Unterschied zwischen dem vorliegenden System und einem konfokalen System hängt mit der Tiefenschärfe (axialen Auflösung) zusammen. Bei, einem typischen hoch ver größernden konfokalen Mikroskop beschränkt die Verwendung einer Detektorapertur zum Abweisen von unscharfem Licht die Tiefenschärfe auf 1 mm oder weniger. Da das erfindungsgemäße optische System nicht aktiv unscharfes Licht mit Detektoraper turen oder kleinen Detektoren abweist, ist die Tiefenschärfe wesentlich größer als bei einem konfokalen Mikroskop.

Wie bei allen optischen Rastermikroskopen erzeugt das Abbildungssystem 10 ein Bild durch ein sequentielles Erfassen von Pixeldaten (z. B. Fluoreszenz) und Konstruieren eines Bilds durch bekannte Computergraphikverfahren. Bei zwei Anregungs strahlen mit einer kleinen seitlichen Versetzung zwischen ihren Testorten auf der Probe bildet das vorliegende System zwei komplette Bilder mit einer bekannten seitlichen Verset zung dazwischen. Die Abtastung erfolgt in den beiden lateralen Richtungen.

Bei einer ersten praktischen Ausführungsform des Systems, wie es in Fig. 3 gezeigt ist, werden zwei Abtastmechanismen verwendet, jeder in der Form eines Translationstisches 40, 42. Der Translationstisch 40 ist mit einer linearen Kodierein richtung 43 kombiniert. In einer ersten Abtastrichtung, die durch den Pfeil 44 angezeigt ist, gelangen die Anregungsstrah len B₁ und B₂ in den Abtasttischbereich in einer ungefähr horizontalen Richtung, werden durch einen Umlenkspiegel 46 nach oben zur Probe 12 reflektiert, und dann durch eine Objek tivlinse 14 auf die Probe 12 fokussiert. Die Bewegung des Translationstischs 40 in der Richtung des Pfeils 44 ergibt die Bewegung in einer ersten Richtung, bei der der Meßort auf der Probe durch die optische Achse des Objektivelements 14 be stimmt wird. Die Langsam-Achsen-Abtastung wird durch ein Bewegen der Probe 12 über den Translationstisch 42 in einer zweiten Richtung im rechten Winkel zur ersten Abtastrichtung bewerkstelligt, wobei die zweite Richtung, wie gezeigt, senk recht auf der Seite steht.

Fig. 3 zeigt auch eine alternative Zwei-Wellenlängen- Version des erfindungsgemäßen Abbildungssystems. Zusätzliche dichroitische Strahlteiler 44, 50 und Bandpaßfilter 54, 56 werden zum Zusammenmischen von Licht aus mehreren Lasern (zwei Laser sind gezeigt) und zum Trennen fluoreszierenden Emis sionslichts auf mehrere Bänder verwendet. Diese Anordnung kann zum simultanen Abtasten mit mehreren Quellen- und Erfassungs wellenlängen verwendet werden. Wie unten bezüglich des in Fig. 10 gezeigten Strahlteilers erörtert, kann die Leistung dieser Konstruktion durch die Eigenschaften der dichroitischen Strahlteiler eingeschränkt sein.

2. Alternative Konstruktionsformen

Kleinere Abänderungen der Konstruktion des vorliegenden Systems können daraus ein Allzweckmikroskop machen oder es auf spezifische Verwendungsweisen zuschneiden. Diese Abänderungen beziehen sich auf die Strahlquelle oder -quellen und die Strahlteilungs-, Erfassungs- und Abtastungseigenschaften, wie hier erörtert.

A) Strahlquellen

Eine Anzahl alternativer Anregungslichtquellenkonfigura tionen kann bei dem vorliegenden System verwendet werden. Der einfachste Fall ist die Verwendung eines einfachen axialen Laserstrahls. Der Probenort liegt dann am Brennpunkt der Objektivlinse (wenn man einen kollimierten Laserstrahl an nimmt). Der Teil der Linse, durch den der Strahl gelangt ändert sich nicht mit der Abtastposition. Dies ist etwas einfacher als die in Fig. 1 gezeigte allgemeine Anwendung, bei der die finiten Winkel, die die beiden Anregungsstrahlen mit der optischen Achse bilden, die Auswirkung haben, daß sie sich während der Abtastbewegung der Linse zur Mitte der Objektiv linse und von ihr weg bewegen. Hierdurch entstehen sich leicht verändernde Beleuchtungsbedingungen während des Abtastung, was nicht passiert, wenn die Strahlen mit der Linsenachse koaxial verlaufen. Es ist auch möglich, zwei oder mehr koaxiale Quel lenstrahlen zu verwenden. In diesem Fall beleuchten sie den gleichen Punkt auf der Probe (wenn die chromatische Aberration vernachlässigt wird).

Außerdem ist es möglich, getrennte Beleuchtungspunkte zu erhalten, indem parallele Strahlen verwendet werden, von denen jeder einen Teil der Objektivlinsenapertur ausleuchtet. Die einzelnen Strahlen konvergieren als getrennte Lichtkegel und sind in der Brennebene der Linse koinzident (wenn man annimmt, daß kollimierte Quellenstrahlen auf die Objektivlinse auf treffen). Ein Nachteil bei diesem Verfahren im Vergleich zu den in einem Winkel verlaufenden Strahlen ist, daß sich der Abstand zwischen den zwei konvergierenden Strahlen mit einer Unschärfe der Probe verändert, und es wirkt sich ein vertika ler Lauffehler (Unschärfe) während der Abtastung auf sie aus. Wenn die Probe dem Brennpunkt der Linse näherkommt, nähern sich die beiden Beleuchtungspunkte einander. In dem Fall der Winkelversetzung der vorliegenden Konstruktion ist dieser Effekt wesentlich weniger stark ausgeprägt (die beiden Punkte liegen nie übereinander, wenn man annimmt, daß sich die beiden Strahlen vor der Objektlinse und nicht zwischen der Linse und der Probe überkreuzen). Die Auswirkungen eines Lauffehlers auf den Abstand zwischen den Beleuchtungspunkten können bei der vorliegenden Erfindung minimiert werden, indem man die beiden Beleuchtungsstrahlen sich am oder nahe dem vorderen Brennpunkt der Objektivlinse kreuzen läßt.

Mehrere Strahlen können von einer oder mehr Quellen kommen und können unterschiedliche Spektraleigenschaften haben oder nicht. Außerdem ist es möglich, einen oder beide Quellen strahlen über der Probe (also von gegenüber der Objektivlinse) einstrahlen zu lassen. Dies ist unten im Abschnitt über Durch leuchtungsmöglichkeiten bei den alternativen Abbidungsmodi beschrieben.

Kleinere Beleuchtungspunkte können dadurch erreicht wer den, daß der Durchmesser der Quellenstrahlen erhöht wird (z. B. indem die Strahlen durch ein Raumfilter/einen Strahlaufweiter geleitet werden) und die Eingangspupille der Objektivlinse überfüllt wird. Das Raumfilter besteht aus einer positiven Linse zum Fokussieren des Strahls und einer Lochblende, das zum Durchlassen von lediglich der mittleren Keule des Bre chungsmusters (Airy-Musters) gedacht ist. Der Strahl expan diert jenseits der Lochblende und wird durch eine weitere Linse kollimiert. Dieser Strahl wird dann durch die Objektiv linse auf die Probe fokussiert, wodurch ein diffraktionsbe schränkter Beleuchtungspunkt erzeugt wird. Bei dieser Anwen dungsform sind die durch zwei im Winkel zueinander stehende Quellenstrahlen nur im Zwischenbereich des Brennpunkts vonein ander getrennt, und es kann eine gut korrigierte Objektivlinse nötig sein, um eine angemessene Leistung zu erzielen.

Fig. 4 zeigt eine Abänderung der Konstruktion von Fig. 3. Bei dieser Ausführungsform wird ein einziger außeraxialer Parabolspiegel 60 anstelle der Kombination der Objektivlinse und des 45°-Spiegels verwendet. Der Parabolspiegel 60 hat viele Funktionen. Er lenkt die Achse der eintreffenden Laser strahlen B₁ und B₂ um 90° ab; er fokussiert die Strahlen zu Einschnürungen, die auf die Probenoberfläche 12 fallen; er sammelt und rekollimiert Fluoreszenzemissionen und lenkt die Emissionstrahlen um 90° um.

Fig. 5 veranschaulicht ein gespaltenes paralleles Zwei strahlsystem. Die Anregungslichtstrahlen B₁ und B₂ werden durch getrennte Laser L₁ und L₂ in paralleler Ausrichtung erzeugt. Ein Spiegel 64 mit zwei Löchern 66, 68 ist im Pfad der Anre gungsstrahlen B₁ und B₂ zum Richten der Strahlen auf zwei nebeneinanderliegende Objektivlinsen 70, 72 vorgesehen. Ein Paar beleuchteter Punkte S₁ und S₂ wird erzeugt, von denen Fluoreszenzemissionen durch die Objektivlinsen 70, 72 als Emissionsstrahlen 76, 78 kollimiert werden. Der Spiegel 64 lenkt die Emissionsstrahlen 76, 78 in räumlich getrennter Weise zu den Detektoren PMT 1 und PMT 2 um, wobei ein 45°- Spiegel 80 für den Emissionsstrahl 78 vorgesehen ist. Diese optische Anordnung braucht keine zweite Linse, die aber, wenn das von Vorteil ist, natürlich auch mit eingebaut werden kann.

B) Strahlteiler

Das erfindungsgemäße optische System verwendet eine neue Konstruktion für einen Strahlteiler, die in Fig. 1 in der Form eines Spiegels mit einem kleinen Loch dargestellt ist. Eine vergrößerte Darstellung dieser Konstruktion ist in Fig. 6 gezeigt. Die Anregungsstrahlen B₁ und B₂ (zwei beim gezeigten System, in allgemeinen Fällen jedoch auch einer oder mehr) gelangen durch das Loch 15 in der Mitte des Spiegels 13. Die Objektivseite des Spiegels 13 weist eine reflektierende Be schichtung 84 zum Umlenken der Emissionslichtstrahlen 16, 18 auf.

Das von der Probe ausgestrahlte fluoreszente Emissions licht 16, 18 kehrt entlang der gleichen Richtung zurück, jedoch mit einem viel größeren Durchmesser als die Anregungs strahlen B₁ und B₂. Insbesondere haben die Anregungsstrahlen B₁ und B₂ einen kleineren Durchmesser als die Eingangspupille der Objektivlinse, während das gesammelte Emissionslicht 16, 18 den Durchmesser der Objektivpupille hat (wenn kollimierte Emissionsstrahlen angenommen werden). Aufgrund des großen Mißverhältnisses zwischen den Durchmessern der Anregungs- und der Emissionsstrahlen wird durch das Loch 15 in der Mitte des Spiegels 13 nur eine geringe Menge Emissionslicht verloren, wodurch ein wirksamer Strahlteiler entsteht.

Die Strahlen B₁ und B₂ von Fig. 6 sowie in Fig. 7-13 sind aus Gründen der Veranschaulichung koaxial. In der Praxis können sie koaxial sein oder auch nicht.

Wie in Fig. 7 gezeigt, kann das Loch in der Mitte des Spiegels dadurch erzeugt werden, daß eine reflektierende Beschichtung 86 auf der einen Oberfläche eines optischen Fensters 88 angebracht wird, wobei ein kleiner Bereich 90 in der Mitte unbeschichtet bleibt (oder antireflektierend be schichtet wird).

Die reflektierende Beschichtung kann durch eine total reflektierende Innenoberfläche ersetzt werden, wie in Fig. 8 gezeigt. In diesem Fall werden ein kleines Prisma 85 und ein großes Prisma 87 so kombiniert, daß die Beleuchtungsstrahlen B₁, B₂ in das kleine Prisma eintreten, durch die Schnittstelle zwischen den Prismen hindurchtreten und aus dem großen Prisma heraustreten. Die Emissionsstrahlen 16, 18, die einen viel größeren Durchmesser als die Beleuchtungsstrahlen haben, treten in das große Prisma 87 ein, gelangen jedoch nicht zum kleinen Prisma 85 hindurch, außer an der Stelle, an der die beiden Prismen in Kontakt sind. Stattdessen wird der Großteil des Strahls innen total reflektiert und tritt auf der anderen Fläche des großen rechtwinkligen Prismas wieder aus.

Ein weiteres Beispiel ist in Fig. 9 gezeigt, bei dem ein transparentes Spiegelsubstrat 90 (optisches Fenster) eine teilreflektierende Beschichtung 92 auf einer Oberfläche hat. Bei dieser Ausführungsform gelangt ein Teil der Emissions strahlen 16' und 18' zurück durch das optische Fenster 90.

Bei dieser Konstruktion bewirkt die teilweise reflektie rende Beschichtung, daß ein Teil (z. B. 50%) eines auf sie auftreffenden Strahls reflektiert wird und der verbleibende Teil hindurchgelassen wird (wenn man die Absorption vernach lässigt). Dies ist eine gebräuchliche Konstruktion für ver gleichbare Beleuchtungs-Anregungs-) und Erfassungs-(Emis sions-)Strahldurchmesser. Es gehen dabei jedoch mindestens 75% verloren (der Beleuchtungsstrahl wird durch den Strahlteiler hindurchgelassen und der Erfassungsstrahl von ihm reflektiert oder umgekehrt). Beim vorliegenden System, bei dem der Durch messer des Anregungsstrahls wesentlich kleiner ist als der des Emissionsstrahls, ist dieser Verlust unnötig hoch, und aus diesem Grund handelt es sich hierbei nicht um eine bevorzugte Ausführungsform. Ein Platten-Strahlteiler ist in Fig. 9 ge zeigt, doch kann diese Art von Strahlteiler auch in anderen Formen, wie zum Beispiel als Kubus oder als Membran, verwirk licht werden.

Eine Abänderung der in Fig. 9 gezeigten Konstruktion verwendet einen Polarisierungs-Strahlteiler und ein Viertel wellenplättchen zum Verbessern des Wirkungsgrads des Systems. In diesem Fall reflektiert der Strahlteiler linear polarisier tes Licht, das dann durch das Viertelwellenplättchen in zirku lär polarisiertes Licht umgewandelt wird. Nach der Reflexion von der Probe wird der Rückstrahl durch das Viertelwellen plättchen wieder in linear polarisiertes Licht zurückverwan delt, nun jedoch mit der richtigen Polarisierung, die vom Polarisierungsstrahlteiler hindurchgelassen wird. Die Reihen folge von Reflexion und Transmission durch den polarisierenden Strahlteiler kann auch umgekehrt sein. Dieses Polarisierungs verfahren wird aufgrund der Beibehaltung der Polarisierung typischerweise bei der Reflexion, nicht bei der Fluoreszenz verwendet.

Ein weiteres Beispiel für einen Strahlteiler ist in Fig. 10 gezeigt, wo ein dichroitischer Strahlteiler 94 verwendet wird, der eine dichroitische Beschichtung 96 aufweist. Bei der dichroitischen Strahlteilerkonstruktion wird eine Strahlteil erbeschichtung verwendet, die einen oder mehrere Wellenlängen bereiche reflektiert (oder hindurchläßt), während sie andere Wellenlängenbereiche hindurchläßt (bzw. reflektiert). Dies ist eine effiziente Lösung im fluoreszierenden Betrieb, wo zwi schen den Beleuchtungswellenlängen und den Emissionswellenlän gen eine spektrale Verschiebung besteht. Die praktischen Einschränkungen von dünnen Beschichtungen und die Überlagerung zwischen dem Absorptions- und dem Emissionsspektrum fluores zierender Farbstoffe verhindern, daß dies eine ideale Lösung in der Fluoreszenzmikroskopie ist.

Noch ein weiteres Beispiel für einen Strahlteiler ist in Fig. 11 gezeigt. Ein kleiner Spiegel 95 reflektiert die Anre gungsstrahlen B₁ und B₂, während die Emissionsstrahlen 16, 18 hauptsächlich am Spiegel vorbeigehen. Fig. 11 zeigt im wesent lichen den umgekehrten Fall von Fig. 6. Hier werden nicht die Anregungsstrahlen durch ein kleines Loch im Spiegel hindurch gelassen, der den Erfassungsstrahl reflektiert, wie das beim Strahlteiler von Fig. 6 geschieht, vielmehr werden die Strah len von einem kleinen Spiegel 95 reflektiert, während die Emissionsstrahlen 16, 18 um den Spiegel herum durchgelassen werden. Der kleine Spiegel kann auch dadurch hergestellt werden, daß eine reflektierende Beschichtung auf lediglich einen kleinen Teil eines optischen Fensters aufgebracht wird, wobei der Rest des Fensters unbeschichtet bleibt (oder mit einer Antireflexionsbeschichtung beschichtet wird). Alternativ dazu könnte der Spiegel die Anregungsstrahlen zusätzlich zum Reflektieren auch noch kollimieren (oder sonst abbilden). Dies könnte für eine von der Seite des Strahls eingebrachte Faser quelle geeignet sein.

Fig. 12 zeigt ein weiteres Beispiel, bei dem eine Faser quelle 99 mit einer Linse 98 einen kollimierten Anregungs strahl B₁ auf das Objektivelement richtet. Der Emissionsstrahl 16 geht an der Linse 98 und der Faserquelle 99 vorbei zum Detektor.

Außerdem ist es möglich, den Strahlteiler mit einer Fokussierfähigkeit zu versehen. In Fig. 13 lenkt ein außer axiales Parabolspiegelsegment 100 mit einem Loch 102 in der Mitte Emissionsstrahlen 16, 18 um und fokussiert sie auf die Detektoren. Der in Fig. 13 gezeigte Parabolspiegel ermöglicht es, den Anregungs- und den Emisssionstrahl zu kombinieren, wie das auch beim Strahlteiler von Fig. 6 geschieht, gleichzeitig wird jedoch der Emissionsstrahl fokussiert. Auf die zum Fokus sieren des Lichts auf die Detektoren verwendete Abbildungs linse kann nun verzichtet werden, weil ihre Funktion vom Parabolspiegel übernommen wird. Ein Parabolspiegel leistet eine perfekte (aberrationsfreie) Abbildung eines kollimierten, axialen Eingangsstrahls. Die Abbildungsleistung des Parabol spiegels läßt jedoch bei der außeraxialen Abbildung schnell nach, und unterschiedlich geformte Linsen sind in bestimmten Fällen wohl zu bevorzugen.

C. Detektoren

Ein einziger Detektor wird derzeit zum Sammeln von Licht vom jeweiligen Beleuchtungsbereich auf der Probe verwendet.

Zwei oder mehr Detektoren können zum Sammeln von Licht vom jeweiligen Punkt verwendet werden, wobei zum Beispiel spek trale oder räumliche Unterschiede zwischen dem von den Detek toren empfangenen Licht bestehen. Die Emission von der Probe kann zum Beispiel von einem dichroitischen Strahlteiler, einem dispersiven Element, wie zum Beispiel einem Prisma, oder einem anderen Brechungselement, wie zum Beispiel einem Gitter in zwei oder mehr spektrale Bereiche aufgeteilt werden.

Bei dem bevorzugten Erfassungsverfahren wird ein Spiegel zum Ablenken von Licht von einem der beiden beleuchteten Punkte zu einem der Detektoren verwendet, während Licht von dem anderen beleuchteten Punkt ungestört zum anderen Detektor hindurchgelassen wird. In gewissem Sinn wird die Kante dieses Spiegels auf die Probe projiziert, wodurch diese in zwei sich nicht überlagernde "Erfassungs"-Bereiche aufgeteilt wird.

Es ist möglich, die Größe dieser Erfassungsbereiche zu verringern, indem Aperturen vor einem oder vor mehr Detektoren angebracht werden. Das Anbringen von solchen Aperturen macht aus dem vorliegenden System kein konfokales Mikroskop. Bei einem konfokalen Mikroskop ist eine dreidimensionale Abbildung möglich, weil Licht von unscharfen Bereichen der Probe abge wiesen wird. Dies geschieht durch gleichzeitiges diffraktions begrenztes Abbilden einer Punktquelle und eines Punktdetektors auf den gleichen Punkt auf der Probe; diese Bedingungen sind beim vorliegenden System nicht erfüllt.

4. Abbildungsmodi

Das vorliegende System ist zwar nominell für eine Epi- Beleuchtungs-Fluoreszenz-Abbildung konstruiert, doch sind auch eine Anzahl anderer Betriebsarten möglich. Diese Modi sind zum Beispiel Transillumination (Durchleuchtung), Dunkelfeld-, Hellfeld-, konfokale, interferometrische, Polarisations und Differenz-Interferenz-Kontrast-Beleuchtung (DIC-Beleuchtung), sind auf diese jedoch nicht beschränkt.

Bei einem Epi-Beleuchtungssystem beleuchten die Quellen strahlen die Probe durch die gleiche Linse, die auch zum Sammeln des Lichts zur Erfassung verwendet wird. Das vorlie gende System kann in ein Durchleuchtungssystem verändert werden, indem die Probe von oben beleuchtet wird, während die Objektivlinse das resultierende Fluoreszenzlicht unterhalb der Probe sammelt. In gleicher Weise kann die Probe auch von unten beleuchtet werden, während die Sammellinse über der Probe angebracht ist. Beim Durchleuchtungs-Fluoreszenzbetrieb kann der Teil des Beleuchtungsstrahls, der von der Probe durch gelassen wird, zu den Detektoren weitergelangen. Eine Trennung der Quellen- und Fluoreszenzsingale wird allgemein durch Spektralfilter erreicht, und Fehler in diesen Filtern (d. h. finite Sperrbereichs-Durchleuchtung) verringern dann das Signal-Rauschen-Verhältnis des Systems. Das vorliegende System verwendet einen neuartigen Strahlteiler mit einem kleinen Loch zum Hindurchlassen der Beleuchtungsstrahlen, während die einen größeren Durchmesser aufweisenden Erfassungsstrahlen haupt sächlich reflektiert werden. Bei einem Durchleuchtungssystem kann ein ähnliches Loch in einen Umlenkspiegel im Erfassungs pfad angebracht werden, wodurch verhindert wird, daß hindurch gelassene Quellenstrahlen zu den Detektoren gelangen.

Das vorliegende System ist zum Untersuchen fluoreszenter Eigenschaften von DNA-Chips geeignet, wie zum Beispiel Bildern mit geringer Tiefenauflösung, womit bestimmt werden kann, welche Sequenz von Nukleotiden in der DNA-Probe vorhanden ist oder welche Gene über- oder unterexprimiert sind, was einfach dadurch geschieht, daß bestimmt wird, welcher Bereich des komplementäre DNA-Sequenzen enthaltenden DNA-Chips fluoreszent ist. Das vorliegende System kann aber auch einfach zum Unter suchen der Streueigenschaften dieser oder anderer Proben eingesetzt werden. Im Epi-Beleuchtungsmodus erlaubt eine Entfernung der Spektralfilter im Erfassungspfad (in den Erfas sungspfaden) das Sammeln von Licht, das von der Probe reflek tiert wurde (wenn auch Sorgfalt darauf verwendet werden muß, daß die reflektierten Quellenstrahlen auch wirklich zu den Detektoren gelangen und nicht durch das Loch im Strahlteiler entweichen). Dies ist auch bei der Durchleuchtung möglich, wobei die Hindurchlassung und das Vorwärtsstreuen des Lichts gemessen wird.

Mehrere andere Abbildungsmodi sind bei Modifikationen des vorliegenden Systems möglich. Wie oben erörtert, führt das Anbringen von kleinen Aperturen vor den Detektoren zusammen mit verkleinerten Beleuchtungspunkten zu einem konfokalen System. Hierdurch wird eine Abbildung dicker Objekte und eine dreidimensionale Abbildung möglich. Eine weitere Möglichkeit besteht in der Verwendung als Interferenzmikroskop (eine nicht fluoreszierende Verwendung), wobei die Objektivlinse dann einen Strahlteiler und eine Referenzoberfläche aufweisen muß. Hierdurch wird eine dreidimensionale Abbildung reflektierender Gegenstände möglich mit einer axialen Auflösung, die unter der Wellenlänge liegt. Es sind auch Polarisations- und DIC-Ab bildungsmodi denkbar, wenn diese auch zusätzliche Komponenten des Systems benötigen würden.

Claims

1. Optisches Fluoreszenz-Abbildungssystem (10), gekennzeich net durch

- eine optische Quelle (L₁, L₂) zum Erzeugen von mindestens zwei Anregungsstrahlen (B₁, B₂) mit räumlicher Trennung zum Beleuchten auf einer Probe (12) von mindestens zwei vonein ander getrennten Punkten (S₁, S₂), die einen vorbestimmten Abstand voneinander haben, wobei die beleuchteten Punkte mindestens zwei Emissionsstrahlen (16, 18) erzeugen, die räum lich getrennt sind,
- einen Detektor zum Empfangen des jeweiligen Emissions strahls und
- ein Objektivelement zum Richten des Anregungsstrahls auf die Probe, und dadurch, daß
- jeder Detektor ein Blickfeld (28, 30) der Probe hat, das größer als ein beleuchteter Punkt (S₁, S₂) ist.

2. Optisches Fluoreszenz-Abbildungssystem (10) nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Objektivelement einen Abtastmechanismus zum Richten der Anregungsstrahlen (B₁, B₂) auf einen Bereich der Probe (12) aufweist.

3. Optisches Fluoreszenz-Abbildungssystem (10) nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Abtastmechanismus eine Ein richtung (40) zum Bewegen des Objektivelements in eine erste Richtung und weiter eine Einrichtung (42) zum Bewegen der Probe (12) in eine zweite, dazu im rechten Winkel verlaufende, Richtung aufweist.

4. Optisches Fluoreszenz-Abbildungssystem (10) nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die optische Quelle (L₁, L₂) und das Objektivelement die beleuchteten Punkte (S₁, S₂) in einer Weise erzeugen, daß die Punkte im Vergleich zu diffraktions begrenzten Punkten eines Objektivelements eines konfokalen Mikroskops relativ groß sind.

5. Optisches Fluoreszenz-Abbildungssystem (10) nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Anregungs- (B₁, B₂) und Emissionsstrahlen (16, 18) durch das Objektivelement hindurch gelangen und daß es weiter eine räumliche Trennung der Anre gungs- und Emissionsstrahlen aufweist.

6. Optisches Fluoreszenz-Abbildungssystem (10) nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Anregungsstrahlen (B₁, B₂) einen Teil des Objektivelements und die Emissionsstrahlen (16, 18) im wesentlichen das gesamte Objektivelement einnehmen.

7. Optisches Fluoreszenz-Abbildungssystem (10) nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Anregungsstrahlen (B₁, B₂) zueinander winkelversetzt sind.

8. Optisches Fluoreszenz-Abbildungssystem (10) nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß es weiter eine Einrichtung zum räumlichen Trennen der Emissionsstrahlen und zum Umlenken der Emissionsstrahlen jeweils zu ihrem eigenen Detektor (PMT 1, PMT 2) aufweist.

9. Optisches Fluoreszenz-Abbildungssystem (10) nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß jeder Detektor von einem Brenn punkt seines jeweiligen Emissionsstrahls versetzt ist.

10. Optisches Fluoreszenz-Abbildungssystem (10) nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die räumliche Trennung der Anregungs- und Emissionsstrahlen mittels eines Spiegels (13) mit einem kleinen optischen Loch bewerkstelligt wird.

11. Optisches Fluoreszenz-Abbildungssystem (10) nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die räumliche Trennung der Anregungs- und Emissionsstrahlen mittels eines kleinen Spie gels (95), der kleiner als der ein Emissionsstrahl ist, be werkstelligt wird.

12. Optisches Fluoreszenz-Abbildungssystem (10) nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die räumliche Trennung der Anregungs- und Emissionsstrahlen mittels eines Prismas (87) bewerkstelligt wird.

13. Optisches Fluoreszenz-Abbildungssystem (10) nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß jeder Detektor ein Blickfeld (28, 30) der Probe (12) hat, das auch kleiner als der Abstand zwischen zwei Punkten (S₁, S₂) ist.

14. Optisches Fluoreszenz-Abbildungssystem (10) nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Objektivelement eine Linse (14) ist.

15. Optisches Fluoreszenz-Abbildungssystem (10) nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Objektivelement entweder ein Parabolspiegel (60), ein dioptrisches, ein katoptisches oder ein katadioptrisches Abbildungssystem sein kann.

16. Optisches Fluoreszenz-Abbildungssystem (10), gekennzeich net durch

- eine optische Quelle zum Erzeugen eines Anregungsstrahls, der auf eine Probe (12) gerichtet wird, die in der Weise abge bildet werden soll, daß ein Emissionsstrahl von der Probe erzeugt wird,
- einen Detektor zum Empfangen des Emissionsstrahls von der Probe,
- ein Objektivelement zwischen der optischen Quelle und der Probe zum Richten des Anregungsstrahls auf die Probe und zum Empfangen des Emissionsstrahls von der Probe in einer Weise, bei der der Anregungsstrahl und der Emissionsstrahl mindestens teilweise den gleichen Raum einnehmen,
- ein optisches Element zum geometrischen Trennen des Anregungsstrahls vom Emissionsstrahl zum Richten des Emis sionsstrahls auf den Detektor, und dadurch, daß
- der Anregungsstrahl am Trennungspunkt der beiden Strahlen teilweise den Emissionsstrahl einnimmt.

17. Optisches Fluoreszenz-Abbildungssystem (10) nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß der Anregungsstrahl einen Teil des Objektivelements einnimmt und der Emissionsstrahl im wesentlichen das gesamte Objektivelement einnimmt.

18. Optisches Fluoreszenz-Abbildungssystem (10) nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß das Objektivelement eine Linse (14) ist.

19. Optisches Fluoreszenz-Abbildungssystem (10) nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß das Objektivelement entweder ein Parabolspiegel (60), ein dioptrisches, ein katoptisches oder ein katadioptrisches Abbildungssystem (10) sein kann.

20. Optisches Fluoreszenz-Abbildungssystem (10) nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß das optische Element einen kleinen Spiegel (95) aufweist, der kleiner als ein Emissions strahl ist.

21. Optisches Fluoreszenz-Abbildungssystem (10) nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß das optische Element ein Prisma (87) aufweist.

22. Optisches Fluoreszenz-Abbildungssystem (10) nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß der Anregungsstrahl einen kleinen Prozentsatz des Raums einnimmt, der vom Emissions strahl eingenommen wird.

23. Optisches Fluoreszenz-Abbildungssystem (10) nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die optische Quelle (L₁, L₂) so ausgebildet ist, daß sie einen ersten und einen zweiten Anre gungsstrahl (B₁, B₂) erzeugt, die vom Objektivelement derart auf die Probe (12) gerichtet werden, daß dabei ein erster und ein zweiter Emissionsstrahl (16, 18) entsteht.

24. Optisches Fluoreszenz-Abbildungssystem (10) nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß der erste und der zweite Anregungsstrahl (B₁, B₂) zueinander winkelversetzt sind.

25. Optisches Fluoreszenz-Abbildungssystem (10) nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß der erste und der zweite Anregungsstrahl (B₁, B₂) zueinander parallel sind und das Objektivelement eine erste und eine zweite Ojektivlinse (70, 72) aufweist, von denen jeweils eine für einen Anregungsstrahl (B₁, B₂) gedacht ist.

26. Verfahren zu optischen Fluoreszenzabbildung, gekennzeich net durch die folgenden Schritte:

- Erzeugen von mindestens zwei Anregungsstrahlen (B₁, B₂) mit räumlicher Trennung zum Beleuchten auf einer Probe (12) von mindestens zwei voneinander getrennten Punkten (S₁, S₂), die einen vorbestimmten Abstand voneinander haben, wobei die beleuchteten Punkte (S₁, S₂) mindestens zwei räumlich getrennte Emissionsstrahlen (16, 18) erzeugen,
- Richten der Anregungsstrahlen auf die Probe (12),
- Erfassen jedes Emissionsstrahls (16, 18) mit einem Detek tor (PMT 1, PMT 2), der ein Blickfeld der Probe (12) hat, das größer als ein beleuchteter Punkt (S₁, S₂) ist.

27. Verfahren nach Anspruch 26, gekennzeichnet durch den folgenden Schritt: Scannen der Anregungsstrahlen über die Probe zum Erzeugen eines Abbilds eines Bereichs der Probe.

28. Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß der Schritt des Scannens den folgenden Schritt aufweist: Bewe gen des Objektivelements in einer ersten Richtung und Bewegen der Probe in einer zweiten, dazu rechtwinkligen Richtung.

29. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß die beleuchteten Punkte in einer Weise erzeugt werden, daß die Punkte im Vergleich zu diffraktionsbegrenzten Punkten eines Objektivelements eines konfokalen Mikroskops relativ groß sind.

30. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß die Anregungs- und die Emissionsstrahlen durch ein Objektiv element gelangen und es weiter den folgenden Schritt aufweist: räumliches Trennen der Anregungs- und der Emissionsstrahlen.

31. Verfahren nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß die Anregungsstrahlen einen Teil des Objektivelements ein nehmen und die Emissionsstrahlen im wesentlichen das gesamte Objektivelement einnehmen.

32. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß die Anregungsstrahlen zueinander winkelversetzt sind.

33. Verfahren nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, daß es weiter den folgenden Schritt aufweist: räumliches Trennen der Emissionsstrahlen und umlenken der Emissionsstrahlen jeweils zu ihren eigenen Detektoren.

34. Verfahren nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß der Schritt des räumlichen Trennens der Anregungs- und der Emissionsstrahlen dadurch bewerkstelligt wird, daß die Anre gungsstrahlen durch einen Spiegel (13) mit einem kleinen optischen Loch gerichtet werden und die Emissionsstrahlen vom Spiegel reflektiert werden.

35. Verfahren nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß der Schritt des räumlichen Trennens der Anregungs- und der Emissionsstrahlen dadurch bewerkstelligt wird, daß die Anre gungsstrahlen von einem kleinen Spiegel (95), der kleiner als ein Emissionsstrahl ist, reflektiert werden und die Emissions strahlen am Spiegel vorbeigelassen werden.

36. Verfahren zum optischen Fluoreszenzabbilden mit den folgenden Schritten:

- Erzeugen eines Anregungsstrahls, der auf eine Probe gerichtet wird, die so abgebildet werden soll, daß ein Emis sionsstrahl von der Probe erzeugt wird,

- Erfassen des Emissionsstrahls von der Probe,
- Richten des Anregungsstrahls durch ein Objektivelement und auf die Probe und Richten des Emissionsstrahls durch das Objektivelement in einer Weise, bei der der Anregungsstrahl und der Emissionsstrahl mindestens teilweise den gleichen Räum einnehmen, und
- geometrisches Trennen des Anregungsstrahls vom Emissions strahl und Richten des Emissionsstrahls auf den Detektor, dadurch gekennzeichnet, daß
- der Anregungsstrahl am Trennungspunkt der beiden Strahlen teilweise den Emissionsstrahl einnimmt.

37. Verfahren nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, daß der Anregungs- und der Emissionsstrahl durch das Objektiv element in der Weise gerichtet werden, daß der Anregungsstrahl einen Teil des Objektivelements einnimmt und der Emissions strahl im wesentlichen das gesamte Objektivelement einnimmt.

38. Verfahren nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, daß der Schritt des geometrischen Trennens des Anregungs- und des Emissionsstrahls die Verwendung eines Spiegels (13) mit einem kleinen Loch einschließt.

39. Verfahren nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, daß der Schritt des geometrischen Trennens des Anregungs- und des Emissionsstrahls die Verwendung eines kleinen Spiegels (95), der kleiner als ein Emissionsstrahl ist, einschließt.

40. Verfahren nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, daß der Anregungsstrahl einen kleinen Prozentsatz des vom Emis sionsstrahl eingenommenen Raums einnimmt.

41. Verfahren nach Anspruch 40, dadurch gekennzeichnet, daß der erste und der zweite Anregungsstrahl (B₁, B₂) durch ein Objektivelement in einer Weise auf die Probe gerichtet wird, daß ein erster und eine zweiter Emissionsstrahl gebildet werden.

42. Verfahren nach Anspruch 41, dadurch gekennzeichnet, daß der erste und der zweite Anregungsstrahl (B₁, B₂) zueinander winkelversetzt sind.

43. Verfahren nach Anspruch 42, dadurch gekennzeichnet, daß der erste und der zweite Anregungsstrahl (B₁, B₂) parallel zueinander sind und das Objektivelement eine erste und ein zweite Objektivlinse (70, 72) aufweist, für jeden Anregungs strahl (B₁, B₂) eine.