DE10100586C1 - Verfahren zur Hemmung der Expression eines Ziegens - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Hemmung der Expression eines Zielgens in einer Zelle, umfassend die folgenden Schritte: DOLLAR A Einführen mindestens eines Oligoribonukleotids (dsRNA I) in einer zur Hemmung der Expression des Zielgens ausreichenden Menge, DOLLAR A wobei das Oligoribonukleotid (dsRNA I) eine doppelsträngige aus höchstens 49 aufeinanderfolgenden Nukleotidpaaren gebildete Struktur aufweist, und wobei ein Strang (S1) oder zumindest ein Abschnitt des Strangs (S1) der doppelsträngigen Struktur komplementär zum Zielgen ist, DOLLAR A und wobei zumindest ein Ende (E1) des Oligoribonukleotids (dsRNA I) einen aus 1 bis 4 Nukleotiden gebildeten einzelsträngigen Abschnitt aufweist.
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren, eine Verwendung, ein
Oligoribonukleotid und einen Kit zur Hemmung der Expression
eines Zielgens.
Aus der WO 99/32619 sowie der WO 00/44895 sind Verfahren zur
Hemmung der Expression von medizinisch oder biotechnologisch
interessanten Genen mit Hilfe eines doppelsträngigen Oligori
bonukleotids (dsRNA) bekannt. Die bekannten Verfahren sind
nicht besonders effektiv.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, die Nachteile nach
dem Stand der Technik zu beseitigen. Es sollen insbesondere
ein möglichst wirksames Verfahren, eine möglichst wirksame
Verwendung, ein Oligoribonukleotid und ein Kit angegeben wer
den, mit denen eine noch effizientere Hemmung der Expression
eines Zielgens erreichbar ist.
Diese Aufgabe wird durch die Merkmale der Ansprüche 1, 36 und
71 gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen ergeben sich aus den
Merkmalen der Ansprüche 2 bis 35, 37 bis 70 und 72 bis 98.
Mit den erfindungsgemäß beanspruchten Merkmalen wird überra
schender Weise eine drastische Erhöhung der Effektivität der
Hemmung der Expression eines Zielgens erreicht. Die genauen
Umstände dieses Effekts sind noch nicht geklärt. Es wird an
genommen, dass durch die besondere Ausbildung zumindest eines
Endes des Oligoribonukleotids die Stabilität desselben erhöht
wird. Durch die Erhöhung der Stabilität wird die wirksame
Konzentration in der Zelle erhöht. Die Effektivität ist ge
steigert.
Die Effektivität kann weiter gesteigert werden, wenn zumin
dest ein Ende zumindest ein nicht nach Watson & Crick gepaar
tes Nukleotid aufweist. Es können auch beide Enden ungepaarte
Nukleotide aufweisen. Eine besondere Erhöhung der Stabilität
des erfindungsgemäßen Oligoribonukleotids ist beobachtet wor
den, wenn das Ende das 3'-Ende eines Strangs der doppelsträn
gigen Struktur ist.
Nach einem weiteren Ausgestaltungsmerkmal wird die Effektivi
tät des Verfahrens erhöht, wenn zumindest ein weiteres, vor
zugsweise ein entsprechend dem erfindungsgemäßen Oligoribonu
kleotid ausgebildetes, Oligoribonukleotid in die Zelle einge
führt wird, wobei ein Strang oder zumindest ein Abschnitt des
Strangs der doppelsträngigen Struktur des Oligoribonukleotids
komplementär zu einem ersten Bereich des Zielgens ist, und
wobei ein Strang oder zumindest ein Abschnitt des Strangs der
doppelsträngigen Struktur des weiteren Oligoribonukleotids
komplementär zu einem zweiten Bereich des Zielgens ist. Die
Hemmung der Expression des Zielgens ist in diesem Fall deut
lich gesteigert.
Es hat sich weiter als vorteilhaft erwiesen, wenn das weitere
Oligoribonukleotid eine doppelsträngige, aus mindestens 49
aufeinanderfolgenden Nukleotidpaaren gebildete Struktur auf
weist. Nach einem weiteren Ausgestaltungsmerkmal kann das
Oligoribonukleotid und/oder das weitere Oligoribonukleotid
auch eine doppelsträngige aus weniger als 25 aufeinanderfol
genden Nukleotidpaaren gebildete Struktur aufweisen.
Der erste und der zweite Bereich können abschnittsweise über
lappen, aneinandergrenzen oder auch voneinander beabstandet
sein.
Insbesondere hinsichtlich der Tumortherapie wird eine weitere
Steigerung der Effizienz dann beobachtet, wenn die Zelle vor
dem Einführen des/der Oligoribonukleotid/e mit Interferon be
handelt wird.
Die erfindungsgemäßen Oligoribonukleotide können dann beson
ders einfach in die Zelle eingeschleust werden, wenn sie in
micellare Strukturen, vorteilhafterweise in Liposomen, einge
schlossen werden. Es ist auch möglich das/die Oligoribonu
kleotid/e in virale natürliche Kapside oder in auf chemischem
oder enzymatischem Weg hergestellte künstliche Kapside oder
davon abgeleitete Strukturen einzuschließen.
Das Zielgen kann nach einem weiteren Ausgestaltungsmerkmal
eine der in dem anhängenden Sequenzprotokoll wiedergegebenen
Sequenzen SQ001 bis SQ140 aufweisen. Es kann auch aus der
folgenden Gruppe ausgewählt sein: Onkogen, Cytokin-Gen, Id-
Protein-Gen, Entwicklungsgen, Priongen.
Das Zielgen wird zweckmäßiger Weise in pathogenen Organismen,
vorzugsweise in Plasmodien, exprimiert. Es kann Bestandteil
eines Virus oder Viroids, insbesondere eines humanpathogenen
Virus oder Viroids, sein. Das Virus oder Viroid kann auch ein
tier- oder pflanzenpathogenes Virus oder Viroid sein.
Nach einem weiteren Ausgestaltungsmerkmal ist vorgesehen,
dass die ungepaarten Nukleotide durch Nukleosidthiophosphate
substituiert sind.
Die doppelsträngige Struktur der erfindungsgemäßen Oligoribo
nukleotide kann weiter durch eine chemische Verknüpfung der
beiden Stränge stabilisiert werden. Die chemische Verknüpfung
kann durch eine kovalente oder ionische Bindung, eine Wasser
stoffbrückenbindung, hydrophobe Wechselwirkungen, vorzugswei
se van-der-Waals- oder Stapelungswechelwirkungen, oder durch
Metall-Ionenkoordination gebildet werden. Es hat sich weiter
als zweckmäßig und die Stabilität erhöhend erwiesen, wenn die
chemische Verknüpfung in der Nähe des einen oder in der Nähe
der beiden Enden des erfindungsgemäßen Oligoribonukleotids
gebildet ist. Weitere vorteilhafte Ausgestaltungen hinsicht
lich der chemischen Verknüpfung können den Merkmalen der An
sprüche 23 bis 29 entnommen werden, ohne dass es dafür einer
näheren Erläuterung bedarf.
Zum Transport der erfindungsgemäßen Oligoribonukleotide hat
es sich ferner als vorteilhaft erwiesen, dass diese an minde
stens ein von einem Virus stammendes, davon abgeleitetes oder
ein synthetisch hergestelltes virales Hüllprotein gebunden,
damit assoziiert oder davon umgeben werden. Das Hüllprotein
kann vom Polyomavirus abgeleitet sein. Das Hüllprotein kann
insbesondere das Virus-Protein 1 und/oder das Virus-Protein 2
des Polyomavirus enthalten. Nach einer weiteren Ausgestaltung
ist vorgesehen, dass bei Bildung eines Kapsids oder kapsidar
tigen Gebildes aus dem Hüllprotein die eine Seite zum Inneren
des Kapsids oder kapsidartigen Gebildes gewandt ist. Ferner
ist es von Vorteil, dass das/die Oligoribonukleotid/e zum
primären oder prozessierten RNA-Transkript des Zielgens kom
plementär ist/sind. Die Zelle kann eine Vertebratenzelle oder
eine menschliche Zelle, wobei eine menschliche embryonale Stammzelle oder
eine menschliche Keimzelle ausgeschlossen sind, sein.
Erfindungsgemäß ist weiterhin die Verwendung eines Oligoribo
nukleotids mit den vorgenannten Merkmalen zur Hemmung der Ex
pression eines Zielgens in einer Zelle vorgesehen. Es wird
insoweit auf die vorangegangenen Ausführungen verwiesen.
Nach weiterer Maßgabe der Erfindung wird die Aufgabe gelöst
durch ein Oligoribonukleotid mit einer doppelsträngigen, aus
höchstens 49 aufeinanderfolgenden Nukleotidpaaren gebildeten
Struktur, wobei ein Strang oder zumindest ein Abschnitt des
Strangs der doppelsträngigen Struktur komplementär zu einem
Zielgen ist, wobei zumindest ein Ende des Oligoribonukleotids
zumindest einen aus 1 bis 4 Nukleotiden gebildeten einzel
strängigen Abschnitt aufweist, und wobei die Sequenz des
Zielgens eine der im anhängenden Sequenzprotokoll wiedergege
benen Sequenzen SQ001 bis SQ140 ist.
Wegen der weiteren vorteilhaften Ausgestaltung des Oligoribo
nukleotids wird auf die vorangegangenen Ausführungen verwie
sen.
Nach weiterer Maßgabe der Erfindung wird die Aufgabe außerdem
gelöst durch einen Kit mit einem erfindungsgemäßen Oligoribo
nukleotid und einem weiteren doppelsträngigen Oligoribonu
kleotid, wobei das weitere Oligoribonukleotid eine doppel
strängige aus mindestens 49 aufeinanderfolgenden Nukleo
tidpaaren gebildete Struktur aufweist, wobei ein Strang oder
zumindest ein Abschnitt eines Strangs der doppelsträngigen
Struktur komplementär zum Zielgen ist, und/oder Interferon.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand der Zeichnungen bei
spielhaft erläutert. Es zeigen:
Fig. 1a-c schematisch ein erstes, zweites und drittes
Oligoribonukleotid und
Fig. 2 schematisch ein Zielgen.
Die in den Fig. 1a bis c gezeigten Oligoribonukleotide dsRNA
I, dsRNA II und dsRNA III weisen jeweils ein erstes Ende E1
und ein zweites Ende E2 auf. Das erste Oligoribonukleotid
dsRNA I und das dritte Oligoribonukleotid dsRNA III weisen an
ihren Enden E1 und E2 einzelsträngige aus etwa 1 bis 4 unge
paarten Nukleotiden gebildete Abschnitte auf. Beim zweiten
Oligoribonukleotid dsRNA II handelt es sich um ein langes
Oligoribonukleotid mit mehr als 49 Nukleotidpaaren.
In Fig. 2 ist schematisch ein auf einer DNA befindliches
Zielgen gezeigt. Das Zielgen ist durch einen schwarzen Balken
kenntlich gemacht. Es weist einen ersten Bereich B1, einen
zweiten Bereich B2 und einen dritten Bereich B3 auf.
Jeweils ein Strang S1, S2 und S3 des ersten dsRNA I, zweiten
dsRNA II und dritten Oligoribonukleotids dsRNA III ist kom
plementär zum entsprechenden Bereich B1, B2 und B3 auf dem
Zielgen.
Die Expression des Zielgens wird dann besonders wirkungsvoll
gehemmt, wenn die kurzkettigen ersten dsRNA I und dritten
Oligoribonukleotide dsRNA III an ihren Enden E1, E2 einzel
strängige Abschnitte aufweisen. Die einzelsträngigen Ab
schnitte können sowohl am Strang S1, S3 als auch am Ge
genstrang oder am Strang S1, S3 und am Gegenstrang ausgebil
det sein. Es hat sich weiter gezeigt, dass ab einer bestimm
ten Länge der Oligoribonukleotide, z. B. ab einer Länge von
mehr als 49 Nukleotidpaaren, eine einzelsträngige Ausbildung
der Enden E1, E2 weniger stark zur Unterdrückung der Expres
sion des Zielgens beiträgt. Bei langen Oligoribonukleotiden,
hier beim zweiten Oligoribonukleotid dsRNA II, ist eine ein
zelsträngige Ausbildung an den Enden E1, E2 nicht unbedingt
erforderlich.
Die Bereiche B1, B2 und B3 können, wie in Fig. 2 gezeigt, von
einander beabstandet sein. Sie können aber auch an einander
grenzen oder überlappen.
Im Falle der einzelsträngigen Ausbildung der Enden E1, E2
sind alle denkbaren Permutationen möglich, d. h. es können ein
Ende oder beide Enden des Strangs S1, S2, S3 oder ein Ende
oder beide Enden des Gegenstrangs überstehen. Der einzel
strängige Abschnitt kann 1 bis 4 gepaarte Nukleotide aufwei
sen. Es ist auch möglich, dass ein Ende oder beide Enden E1,
E2 mindestens ein nicht nach Watson & Crick gepaartes Nukleo
tidpaar aufweisen.
Es wurden aus Sequenzen des Grün-fluoreszierenden Proteins
(GFP) der Alge Aequoria victoria abgeleitete doppelsträngige
RNAs (dsRNAs) hergestellt und zusammen mit dem GFP-Gen in Fi
broblasten mikroinjiziert. Anschließend wurde die Fluores
zenzabnahme gegenüber Zellen ohne dsRNA ausgewertet.
Mittels eines RNA-Synthesizer (Typ Expedite 8909, Applied
Biosystems, Weiterstadt, Deutschland) und herkömmlicher che
mischer Verfahren wurden die aus den Sequenzprotokollen SQ141
und SQ142 ersichtlichen RNA-Einzelstränge und die zu ihnen
komplementären Einzelstränge (bei SQ142 mit zwei Nukleotiden
langen überstehenden Einzelstrangenden) synthetisiert. Die
Hybridisierung der Einzelstränge zum Doppelstrang erfolgte
durch Aufheizen des stöchiometrischen Gemischs der Einzel
stränge in 10 mM Natriumphosphatpuffer, pH 6,8, 100 mM NaCl,
auf 90°C und nachfolgendes langsames Abkühlen über 6 Stunden
auf Raumtemperatur. Anschließend erfolgte Reinigung mit Hilfe
der HPLC. Die so erhaltenen dsRNAs wurden in die Testzellen
mikroinjiziert.
Als Testsystem für diese in vivo-Experimente diente die muri
ne Fibroblasten-Zellinie NIH/3T3. Mit Hilfe der Mikroinjekti
on wurde das GFP-Gen in die Zellen eingebracht. Die Expressi
on des GFP wurde unter dem Einfluß gleichzeitig mittransfi
zierter sequenzhomologer dsRNA untersucht. Die Auswertung un
ter dem Fluoreszenzmikroskop erfolgte 3 Stunden nach Injekti
on anhand der grünen Fluoreszenz des gebildeten GFP.
Die Zellen wurden in DMEM mit 4,5 g/l Glucose, 10% fötalem
Rinderserum unter 7,5% CO2-Atmosphäre bei 37°C in Kultur
schalen inkubiert und vor Erreichen der Konfluenz passagiert.
Das Ablösen der Zellen erfolgte mit Trypsin/EDTA. Zur Vorbe
reitung der Mikroinjektion wurden die Zellen in Petrischalen
überführt und bis zu Bildung von Mikrokolonien weiter inku
biert.
Die Kulturschalen wurde zur Mikroinjektion für ca. 10 Minuten
aus dem Inkubator genommen. Es wurde in ca. 50 Zellen pro An
satz innerhalb eines markierten Bereiches unter Verwendung
des Mikroinjektionssystems FemtoJet der Firma Eppendorf,
Deutschland, einzeln injiziert. Anschließend wurden die Zel
len weitere drei Stunden inkubiert. Für die Mikroinjektion
wurden Borosilikat-Glaskapillaren der Firma Eppendorf mit ei
nem Spitzeninnendurchmesser von 0,5 µm verwendet. Die Mikro
injektion wurde mit dem Mikromanipulator 5171 der Firma Ep
pendorf durchgeführt. Die Injektionsdauer betrug 0,8 Sekun
den, der Druck ca. 80 hPa. Die in die Zellen injizierten Pro
ben enthielten 0,01 µg/µl pGFP-C1 (Clontech Laboratories
GmbH, Heidelberg, Deutschland) sowie an Dextran-70000 gekop
peltes Texas-Rot in 14 mM NaCl, 3 mM KCl, 10 mM KPO4, pH 7,5.
Zusätzlich wurden in ca. 100 pl folgende dsRNAs zugegeben:
Ansatz 1: 10 µM dsRNA (Sequenzprotokoll SQ141); Ansatz 2: 10 µM dsRNA (Sequenzprotokoll SQ142); Ansatz 3: ohne RNA. Die Zellen wurden bei Anregung mit Licht der Anregungswellen länge von Texas-Rot, 568 nm, bzw. von GFP, 513 nm, mittels eines Fluoreszenzmikroskops untersucht. Die Fluoreszenz aller Zellen im Gesichtsfeld wurde bestimmt und in Relation zur Zelldichte (ausgedrückt durch deren Gesamtproteinkonzentrati on) gesetzt.
Ansatz 1: 10 µM dsRNA (Sequenzprotokoll SQ141); Ansatz 2: 10 µM dsRNA (Sequenzprotokoll SQ142); Ansatz 3: ohne RNA. Die Zellen wurden bei Anregung mit Licht der Anregungswellen länge von Texas-Rot, 568 nm, bzw. von GFP, 513 nm, mittels eines Fluoreszenzmikroskops untersucht. Die Fluoreszenz aller Zellen im Gesichtsfeld wurde bestimmt und in Relation zur Zelldichte (ausgedrückt durch deren Gesamtproteinkonzentrati on) gesetzt.
Bei einer Gesamtkonzentration von 10 µM dsRNA konnte beim
Einsatz der dsRNA mit den an beiden 3'-Enden um je zwei Nu
kleotide überstehenden Einzelstrangbereichen (Sequenzproto
koll SQ142) eine merklich erhöhte Hemmung der Expression des
GFP-Gens in Fibroblasten beobachtet werden im Vergleich zur
dsRNA ohne überstehende Einzelstrangenden (Tabelle 1).
Die Verwendung von kurzen (20-25 Basenpaare enthaltenden)
dsRNA-Molekülen mit Überhängen aus wenigen, vorzugsweise ein
bis drei nicht-basengepaarten, einzelsträngigen Nukleotiden
ermöglicht somit eine vergleichsweise stärkere Hemmung der
Genexpression in Säugerzellen als mit dsRNAs derselben Anzahl
von Basenpaaren ohne die entsprechenden Einzelstrangüberhänge
bei jeweils gleichen RNA-Konzentrationen.
Die Symbole geben den relativen Anteil an nicht
oder schwach fluoreszierende Zellen an (+++< 90%; ++60-90%;
+30-60%; -< 10%).
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Claims (99)
1. Verfahren zur Hemmung der Expression eines Zielgens in
einer Zelle umfassend die folgenden Schritte:
Einführen mindestens eines Oligoribonukleotids (dsRNA I) in einer zur Hemmung der Expression des Zielgens ausreichenden Menge,
wobei das Oligoribonukleotid (dsRNA I) eine doppelsträngige aus höchstens 49 aufeinanderfolgenden Nukleotidpaaren gebil dete Struktur aufweist, und wobei ein Strang (S1) oder zumin dest ein Abschnitt des Strangs (S1) der doppelsträngigen Struktur komplementär zum Zielgen ist,
und wobei zumindest ein Ende (E1) des Oligoribonukleotids (dsRNA I) einen aus 1 bis 4 Nukleotiden gebildeten einzel strängigen Abschnitt aufweist.
Einführen mindestens eines Oligoribonukleotids (dsRNA I) in einer zur Hemmung der Expression des Zielgens ausreichenden Menge,
wobei das Oligoribonukleotid (dsRNA I) eine doppelsträngige aus höchstens 49 aufeinanderfolgenden Nukleotidpaaren gebil dete Struktur aufweist, und wobei ein Strang (S1) oder zumin dest ein Abschnitt des Strangs (S1) der doppelsträngigen Struktur komplementär zum Zielgen ist,
und wobei zumindest ein Ende (E1) des Oligoribonukleotids (dsRNA I) einen aus 1 bis 4 Nukleotiden gebildeten einzel strängigen Abschnitt aufweist.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei zumindest ein Ende (E1,
E2) zumindest ein nicht nach Watson & Crick gepaartes Nukleo
tid aufweist.
3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei
beide Enden (E1, E2) ungepaarte Nukleotide aufweisen.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei
das Ende (E1) das 3'-Ende eines Strangs der doppelsträngigen
Struktur ist.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei
zumindest ein weiteres, vorzugsweise entsprechend dem Oligo
ribonukleotid (dsRNA I) nach einem der vorhergehenden Ansprü
che ausgebildetes, Oligoribonukleotid (dsRNA II) in die Zelle
eingeführt wird,
wobei ein Strang (S1) oder zumindest ein Abschnitt des Strangs (S1) der doppelsträngigen Struktur des Oligoribonu kleotids (dsRNA I) komplementär zu einem ersten Bereich (B1) des Zielgens ist,
und wobei ein Strang (S2) oder zumindest ein Abschnitt des Strangs (S2) der doppelsträngigen Struktur des weiteren Oli goribonukleotids (dsRNA II) komplementär zu einem zweiten Be reich (B2) des Zielgens ist.
wobei ein Strang (S1) oder zumindest ein Abschnitt des Strangs (S1) der doppelsträngigen Struktur des Oligoribonu kleotids (dsRNA I) komplementär zu einem ersten Bereich (B1) des Zielgens ist,
und wobei ein Strang (S2) oder zumindest ein Abschnitt des Strangs (S2) der doppelsträngigen Struktur des weiteren Oli goribonukleotids (dsRNA II) komplementär zu einem zweiten Be reich (B2) des Zielgens ist.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei
das weitere Oligoribonukleotid (dsRNA II) eine doppelstängige
aus mindestens 49 aufeinanderfolgenden Nukleotidpaaren gebil
dete Struktur aufweist.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das
Oligoribonukleotid (dsRNA I) und/oder das weitere Oligoribo
nukleotid (dsRNA II) eine doppelsträngige aus weniger als 25
aufeinanderfolgenden Nukleotidpaaren gebildete Struktur auf
weist/en.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei
der erste (B1) und der zweite Bereich (B2) abschnittsweise
überlappen oder aneinandergrenzen.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei
der erste (B1) und der zweite Bereich (B2) voneinander beab
standet sind.
10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei
die Zelle vor dem Einführen des/der Oligoribonukleotids/e
(dSRNA I, dsRNA II) mit Interferon behandelt wird.
11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei
das/die Oligoribonukleotid/e (dsRNA I, dsRNA II) in micellare
Strukturen, vorzugsweise in Liposomen, eingeschlossen
wird/werden.
12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei
das/die Oligoribonukleotid/e (dsRNA I, dsRNA II) in virale
natürliche Kapside oder in auf chemischem oder enzymatischem
Weg hergestellte künstliche Kapside oder davon abgeleitete
Strukturen eingeschlossen wird/werden.
13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei
das Zielgen eine der Sequenzen SQ001 bis SQ140 des Sequenzprotokolls aufweist.
14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei
das Zielgen aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist: Onkogen,
Cytokin-Gen, Id-Protein-Gen, Entwicklungsgen, Priongen.
15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei
das Zielgen in pathogenen Organismen, vorzugsweise in Plasmo
dien, exprimiert wird.
16. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei
das Zielgen Bestandteil eines Virus oder Viroids ist.
17. Verfahren nach Anspruch 16, wobei das Virus ein humanpa
thogenes Virus oder Viroid ist.
18. Verfahren nach Anspruch 17, wobei das Virus oder Viroid
ein tier- oder pflanzenpathogenes Virus oder Viroid ist.
19. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei
ungepaarte Nukleotide durch Nukleosidthiophosphate substitu
iert sind.
20. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei
die doppelsträngige Struktur durch eine chemische Verknüpfung
der beiden Stränge stabilisiert wird.
21. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei
die chemische Verknüpfung durch eine kovalente oder ionische
Bindung, eine Wasserstoffbrückenbindung, hydrophobe Wechsel
wirkungen, vorzugsweise van-der-Waals- oder Stapelungswech
selwirkungen, oder durch Metall-Ionenkoordination gebildet
wird.
22. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei
die chemische Verknüpfung in der Nähe des einen oder in der
Nähe der beiden Enden (E1, E2) gebildet ist.
23. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei
die chemische Verknüpfung mittels einer oder mehrerer Verbin
dungsgruppen gebildet wird, wobei die Verbindungsgruppen vorzugsweise
Poly-(oxyphosphinicooxy-1,3-propandiol)- und/oder
Polyethylenglycol-Ketten sind.
24. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei
die chemische Verknüpfung durch Purinanaloga gebildet wird.
25. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei
die chemische Verknüpfung durch Azabenzoleinheiten gebildet
wird.
26. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei
die chemische Verknüpfung durch anstelle von Nukleotiden be
nutzte verzweigte Nukleotidanaloga gebildet wird.
27. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei
zur Herstellung der chemischen Verknüpfung mindestens eine
der folgenden Gruppen benutzt wird: Methylenblau; bifunktio
nelle Gruppen, vorzugsweise Bis-(2-chlorethyl)-amin; N-
acetyl-N'-(p-glyoxyl-benzoyl)-cystamin; 4-Thiouracil; Psora
len.
28. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei
die chemische Verknüpfung durch in der Nähe der Enden (E1,
E2) des doppelsträngigen Bereichs angebrachte Thiophosphoryl-
Gruppen gebildet wird.
29. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei
die chemische Verknüpfung durch in der Nähe der Enden (E1,
E2) befindliche Tripelhelix-Bindungen hergestellt wird.
30. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei
das/die Oligoribonukleotid/e (dsRNA I, dsRNA II) an minde
stens ein von einem Virus stammendes, davon abgeleitetes oder
ein synthetisch hergestelltes virales Hüllprotein gebunden,
damit assoziiert oder davon umgeben wird/werden.
31. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei
das Hüllprotein vom Polyomavirus abgeleitet ist.
32. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei
das Hüllprotein das Virus-Protein 1 (VP1) und/oder das Virus-
Protein 2 (VP2) des Polyomavirus enthält.
33. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei
bei Bildung eines Kapsids oder kapsidartigen Gebildes aus dem
Hüllprotein die eine Seite zum Inneren des Kapsids oder kap
sidartigen Gebildes gewandt ist.
34. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei
das/die Oligoribonukleotid/e (dsRNA I, dsRNA II) zum primären
oder prozessierten RNA-Transkript des Zielgens komplementär
ist/sind.
35. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei
die Zelle eine Vertebratenzelle oder eine menschliche Zelle
ist.
36. Verwendung eines Oligoribonukleotids (dsRNA I) zur Hem
mung der Expression eines Zielgens in einer Zelle, wobei das
Oligoribonukleotid (dsRNA I) eine doppelsträngige aus höch
stens 49 aufeinanderfolgenden Nukleotidpaaren gebildete
Struktur aufweist, wobei ein Strang (S1) oder zumindest ein
Abschnitt des Strangs (S1) der doppelsträngigen Struktur kom
plementär zum Zielgen ist, und wobei zumindest ein Ende (E1)
des Oligoribonukleotids (dsRNA I) einen aus 1 bis 4 Nukleoti
den gebildeten einzelsträngigen Abschnitt aufweist.
37. Verwendung nach Anspruch 36, wobei zumindest ein Ende
(E1, E2) zumindest ein nicht nach Watson & Crick gepaartes
Nukleotid aufweist.
38. Verwendung nach einem der Ansprüche 36 oder 37, wobei
beide Enden (E1, E2) ungepaarte Nukleotide aufweist.
39. Verwendung nach einem der Ansprüche 36 bis 38, wobei das
Ende (E1) das 3'-Ende eines Strangs der doppelsträngigen
Struktur ist.
40. Verwendung nach einem der Ansprüche 36 bis 39, wobei zu
mindest ein weiteres, vorzugsweise entsprechend dem Oligori
bonukleotid (dsRNA I) nach einem der vorhergehenden Ansprüche
ausgebildetes, Oligoribonukleotid (dsRNA II) in die Zelle
eingeführt wird, wobei ein Strang (S1) oder zumindest ein Ab
schnitt des Strangs (S1) der doppelsträngigen Struktur des
Oligonukleotids komplementär zu einem ersten Bereich (B1) des
Zielgens ist, und wobei ein Strang (S2) oder zumindest ein
Abschnitt des Strangs (S2) der doppelsträngigen Struktur des
weiteren Oligonukleotids (dsRNA II) komplementär zu einem
zweiten Bereich (B2) des Zielgens ist.
41. Verwendung nach einem der Ansprüche 36 bis 40, wobei das
weitere Oligoribonukleotid eine doppelstängige aus mindestens
49 aufeinanderfolgenden Nukleotidpaaren gebildete Struktur
aufweist.
42. Verwendung nach einem der Ansprüche 36 bis 40, wobei das
Oligoribonukleotid und/oder das weitere Oligoribonukleotid
eine doppelstängige aus weniger als 25 aufeinanderfolgenden
Nukleotidpaaren gebildete Struktur aufweist/en.
43. Verwendung nach einem der Ansprüche 36 bis 42, wobei der
erste (B1) und der zweite Bereich (B2) abschnittsweise über
lappen oder aneinandergrenzen.
44. Verwendung nach einem der Ansprüche 36 bis 43, wobei der
erste (B1) und der zweite Bereich (B2) voneinander beabstan
det sind.
45. Verwendung nach einem der Ansprüche 36 bis 44, wobei die
Zelle vor dem Einführen des/der Oligoribonukleotids/e mit In
terferon behandelt wird.
46. Verwendung nach einem der Ansprüche 36 bis 45, wobei
das/die Oligoribonukleotid/e (dsRNA I, dsRNA II) in micellare
Strukturen, vorzugsweise in Liposomen, eingeschlossen
wird/werden.
47. Verwendung nach einem der Ansprüche 36 bis 46, wobei
das/die Oligoribonukleotid/e (dsRNA I, dsRNA II) in virale
natürliche Kapside oder in auf chemischem oder enzymatischem
Weg hergestellte künstliche Kapside oder davon abgeleitete
Strukturen eingeschlossen wird/werden.
48. Verwendung nach einem der Ansprüche 36, bis 47, wobei das
Zielgen eine der Sequenzen SQ001 bis SQ140 des Sequenzprotokolls aufweist.
49. Verwendung nach einem der Ansprüche 36 bis 48, wobei das
Zielgen aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist: Onkogen,
Cytokin-Gen, Id-Protein-Gen, Entwicklungsgen, Priongen.
50. Verwendung nach einem der Ansprüche 36 bis 49, wobei das
Zielgen in pathogenen Organismen, vorzugsweise in Plasmodien,
exprimiert wird.
51. Verwendung nach einem der Ansprüche 36 bis 50, wobei das
Zielgen Bestandteil eines Virus oder Viroids ist.
52. Verwendung nach Anspruch 51, wobei das Virus ein hu
manpathogenes Virus oder Viroid ist.
53. Verwendung nach Anspruch 52, wobei das Virus oder Viroid
ein tier- oder pflanzenpathogenes Virus oder Viroid ist.
54. Verwendung nach einem der Ansprüche 36 bis 53, wobei un
gepaarte Nukleotide durch Nukleosidthiophosphate substituiert
sind.
55. Verwendung nach einem der Ansprüche 36 bis 54, wobei die
doppelsträngige Struktur durch eine chemische Verknüpfung der
beiden Stränge stabilisiert wird.
56. Verwendung nach einem der Ansprüche 36 bis 55, wobei die
chemische Verknüpfung durch eine kovalente oder ionische Bin
dung, eine Wasserstoffbrückenbindung, hydrophobe Wechselwirkungen,
vorzugsweise van-der-Waals- oder Stapelungswechsel
wirkungen, oder durch Metall-Ionenkoordination gebildet wird.
57. Verwendung nach einem der Ansprüche 36 bis 56, wobei die
chemische Verknüpfung in der Nähe des einen oder in der Nähe
der beiden Enden (E1, E2) gebildet ist.
58. Verwendung nach einem der Ansprüche 36 bis 57, wobei die
chemische Verknüpfung mittels einer oder mehrerer Verbin
dungsgruppen gebildet wird, wobei die Verbindungsgruppen vor
zugsweise Poly-(oxyphosphinicooxy-1,3-propandiol)- und/oder
Polyethylenglycol-Ketten sind.
59. Verwendung nach einem der Ansprüche 36 bis 58, wobei die
chemische Verknüpfung durch Purinanaloga gebildet ist.
60. Verwendung nach einem der Ansprüche 36 bis 59, wobei die
chemische Verknüpfung durch Azabenzoleinheiten gebildet ist.
61. Verwendung nach einem der Ansprüche 36 bis 60, wobei die
chemische Verknüpfung durch anstelle von Nukleotiden benutzte
verzweigte Nukleotidanaloga gebildet ist.
62. Verwendung nach einem der Ansprüche 36 bis 61, wobei zur
Herstellung der chemischen Verknüpfung mindestens eine der
folgenden Gruppen benutzt wird: Methylenblau; bifunktionelle
Gruppen, vorzugsweise Bis-(2-chlorethyl)-amin; N-acetyl-N'-
(p-glyoxyl-benzoyl)-cystamin; 4-Thiouracil; Psoralen.
63. Verwendung nach einem der Ansprüche 36 bis 62, wobei die
chemische Verknüpfung durch in der Nähe der Enden des doppelsträngigen
Bereichs angebrachte Thiophosphoryl-Gruppen gebil
det wird.
64. Verwendung nach einem der Ansprüche 36 bis 63, wobei die
chemische Verknüpfung durch in der Nähe der Enden (E1, E2)
befindliche Tripelhelix-Bindungen gebildet ist.
65. Verwendung nach einem der Ansprüche 36 bis 64, wobei
das/die Oligoribonukleotid/e (dsRNA I, dsRNA II) an minde
stens ein von einem Virus stammendes, davon abgeleitetes oder
ein synthetisch hergestelltes virales Hüllprotein gebunden,
damit assoziiert oder davon umgeben ist.
66. Verwendung nach einem der Ansprüche 36 bis 65, wobei das
Hüllprotein vom Polyomavirus abgeleitet ist.
67. Verwendung nach einem der Ansprüche 36 bis 66, wobei das
Hüllprotein das Virus-Protein 1 (VP1) und/oder das Virus-
Protein 2 (VP2) des Polyomavirus enthält.
68. Verwendung nach einem der Ansprüche 36 bis 67, wobei bei
Bildung eines Kapsids oder kapsidartigen Gebildes aus dem
Hüllprotein die eine Seite zum Inneren des Kapsids oder kap
sidartigen Gebildes gewandt ist.
69. Verwendung nach einem der Ansprüche 36 bis 68, wobei
das/die Oligoribonukleotid/e (dsRNA I, dsRNA II) zum primären
oder prozessierten RNA-Transkript des Zielgens komplementär
ist.
70. Verwendung nach einem der Ansprüche 36 bis 67, wobei die
Zelle eine Vertebratenzelle oder eine menschliche Zelle ist.
71. Oligoribonukleotid (dsRNA I) mit einer doppelsträngigen
aus höchstens 49 aufeinanderfolgenden Nukleotidpaaren gebil
deten Struktur, wobei ein Strang (S1) oder zumindest ein Ab
schnitt des Strangs (S1) der doppelsträngigen Struktur kom
plementär zu einem Zielgen ist, wobei zumindest ein Ende (E1)
des Oligoribonukleotids (dsRNA I) einen aus 1 bis 4 Nukleoti
den gebildeten einzelsträngigen Abschnitt aufweist, und wobei
die Sequenz des Zielgens eine der Sequenzen SQ001 bis SQ140 des Sequenzprotokolls
ist.
72. Oligoribonukleotid nach Anspruch 71, wobei zumindest ein
Ende (E1, E2) zumindest ein nicht nach Watson & Crick gepaar
tes Nukleotid aufweist.
73. Oligoribonukleotid nach einem der Ansprüche 71 und 72,
wobei beide Enden (E1, E2) ungepaarte Nukleotide aufweisen.
74. Oligoribonukleotid nach einem der Ansprüche 71 bis 73,
wobei das Ende (E1) das 3'-Ende eines Strangs oder beider
Stränge der doppelsträngigen Struktur ist.
75. Oligoribonukleotid nach einem der Ansprüche 71 bis 74,
wobei das Zielgen aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist:
Onkogen, Cytokin-Gen, Id-Protein-Gen, Entwicklungsgen, Prion
gen.
76. Oligoribonukleotid nach einem der Ansprüche 71 bis 75,
wobei das Zielgen in pathogenen Organismen, vorzugsweise in
Plasmodien, exprimiert wird.
77. Oligoribonukleotid nach einem der Ansprüche 71 bis 76,
wobei das Zielgen Bestandteil eines Virus oder Viroids ist.
78. Oligoribonukleotid nach Anspruch 77, wobei das Virus ein
humanpathogenes Virus oder Viroid ist.
79. Oligoribonukleotid nach Anspruch 17, wobei das Virus
oder Viroid ein tier- oder pflanzenpathogenes Virus oder Vi
roid ist.
80. Oligoribonukleotid nach einem der Ansprüche 71 bis 79,
wobei ungepaarte Nukleotide durch Nukleosidthiophosphate sub
stituiert sind.
81. Oligoribonukleotid nach einem der Ansprüche 71 bis 80,
wobei die doppelsträngige Struktur durch eine chemische Ver
knüpfung der beiden Stränge stabilisiert ist.
82. Oligoribonukleotid nach einem der Ansprüche 71 bis 81,
wobei die chemische Verknüpfung durch eine kovalente oder io
nische Bindung, eine Wasserstoffbrückenbindung, hydrophobe
Wechselwirkungen, vorzugsweise van-der-Waals- oder Stape
lungswechselwirkungen, oder durch Metall-Ionenkoordination
gebildet ist.
83. Oligoribonukleotid nach einem der Ansprüche 71 bis 82,
wobei die chemische Verknüpfung in der Nähe des einen oder in
der Nähe der beiden Enden gebildet ist.
84. Oligoribonukleotid nach einem der Ansprüche 71 bis 83,
wobei die chemische Verknüpfung mittels einer oder mehrerer
Verbindungsgruppen gebildet wird, wobei die Verbindungsgrup
pen vorzugsweise Poly-(oxyphosphinicooxy-1,3-propandiol)-
und/oder Polyethylenglycol-Ketten sind.
85. Oligoribonukleotid nach einem der Ansprüche 71 bis 84,
wobei die chemische Verknüpfung durch Purinanaloga gebildet
ist.
86. Oligoribonukleotid nach einem der Ansprüche 71 bis 85,
wobei die chemische Verknüpfung durch Azabenzoleinheiten ge
bildet ist.
87. Oligoribonukleotid nach einem der Ansprüche 71 bis 86,
wobei die chemische Verknüpfung durch anstelle von Nukleoti
den benutzte verzweigte Nukleotidanaloga gebildet ist.
88. Oligoribonukleotid nach einem der Ansprüche 71 bis 87,
wobei zur Herstellung der chemischen Verknüpfung mindestens
eine der folgenden Gruppen benutzt wird: Methylenblau; bi
funktionelle Gruppen, vorzugsweise Bis-(2-chlorethyl)-amin;
N-acetyl-N'-(p-glyoxyl-benzoyl)-cystamin; 4-Thiouracil;
Psoralen.
89. Oligoribonukleotid nach einem der Ansprüche 71 bis 88,
wobei die chemische Verknüpfung durch in der Nähe der Enden
(E1, E2) des doppelsträngigen Bereichs angebrachte Thiophos
phoryl-Gruppen gebildet ist.
90. Oligoribonukleotid nach einem der Ansprüche 71 bis 89,
wobei die chemische Verknüpfung durch in der Nähe der Enden
(E1, E2) befindliche Tripelhelix-Bindungen hergestellt ist.
91. Oligoribonukleotid nach einem der Ansprüche 71 bis 90,
wobei die Oligoribonukleotid (dsRNA I, dsRNA II) an minde
stens ein von einem Virus stammendes, davon abgeleitetes oder
ein synthetisch hergestelltes virales Hüllprotein gebunden,
damit assoziiert oder davon umgeben ist.
92. Oligoribonukleotid nach einem der Ansprüche 71 bis 91,
wobei das Hüllprotein vom Polyomavirus abgeleitet ist.
93. Oligoribonukleotid nach einem der Ansprüche 71 bis 92,
wobei das Hüllprotein das Virus-Protein 1 (VP1) und/oder das
Virus-Protein 2 (VP2) des Polyomavirus enthält.
94. Oligoribonukleotid nach einem der Ansprüche 71 bis 93,
wobei bei Bildung eines Kapsids oder kapsidartigen Gebildes
aus dem Hüllprotein die eine Seite zum Inneren des Kapsids
oder kapsidartigen Gebildes gewandt ist.
95. Oligoribonukleotid nach einem der Ansprüche 71 bis 94,
wobei die Oligoribonukleotid (dsRNA I, dsRNA II) zum primären
oder prozessierten RNA-Transkript des Zielgens komplementär
ist.
96. Oligoribonukleotid nach einem der Ansprüche 71 bis 95,
wobei das/die Oligoribonukleotid/e (dsRNA I, dsRNA II) in
micellare Strukturen, vorzugsweise in Liposomen, eingeschlos
sen ist.
97. Oligoribonukleotid nach einem der Ansprüche 71 bis 96,
wobei das/die Oligoribonukleotid/e (dSRNA I, dsRNA II) in vi
rale natürliche Kapside oder in auf chemischem oder enzymati
schem Weg hergestellte künstliche Kapside oder davon abgelei
tete Strukturen eingeschlossen wird/werden.
98. Kit umfassend
mindestens ein Oligoribonukleotid (dsRNA I) nach einem der vorhergehenden Ansprüche und
mindestens ein weiteres Oligoribonukleotid (dsRNA II) mit ei ner doppelsträngigen aus mindestens 49 aufeinanderfolgenden Nukleotidpaaren gebildeten Struktur, wobei ein Strang oder zumindest ein Abschnitt des Strangs der doppelsträngigen Struktur komplementär zum Zielgen ist,
und/oder
Interferon.
mindestens ein Oligoribonukleotid (dsRNA I) nach einem der vorhergehenden Ansprüche und
mindestens ein weiteres Oligoribonukleotid (dsRNA II) mit ei ner doppelsträngigen aus mindestens 49 aufeinanderfolgenden Nukleotidpaaren gebildeten Struktur, wobei ein Strang oder zumindest ein Abschnitt des Strangs der doppelsträngigen Struktur komplementär zum Zielgen ist,
und/oder
Interferon.
99. Kit nach Anspruch 98, wobei zumindest ein Ende (E1) des
weiteren Oligoribonukleotids (dsRNA II) zumindest einen aus 1
bis 4 Nukleotiden gebildeten einzelsträngigen Abschnitt auf
weist.
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