DE10133844A1 - Verfahren und Vorrichtung zur Detektion von Analyten - Google Patents

Verfahren und Vorrichtung zur Detektion von Analyten

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein ein Verfahren sowie eine Vorrichtung zur optophysikalischen Detektion von Analyten. Insbesondere betrifft die Erfindung die Miniaturisierung vorbekannter Systeme, bei denen die Detektion eines Analyten durch Lumineszenzmessung erfolgt.

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein ein Verfahren sowie eine Vorrichtung zur optophysikalischen Detektion von Analyten. Insbesondere betrifft die Erfindung die Miniaturisierung vorbekannter Systeme, bei denen die Detektion eines Analyten durch Lumineszenzmessung erfolgt.
  • Zum qualitativen und/oder quantitativen Nachweis des Vorhandenseins von bestimmten Substanzen wie z. B. Biomolekülen in einer zu analysierenden Probe ist die Verwendung von im wesentlichen planaren Systemen bekannt, welche in der Fachwelt als Biosensoren bzw. Biochips bezeichnet werden. Diese Biochips bilden einen Träger, auf dessen Oberfläche i. d. R. eine Vielzahl von zumeist rasterartig angeordneten Detektionsbereichen ausgebildet ist, wobei sich die einzelnen Bereiche bzw. Bereichsgruppen jeweils durch ihre Spezifität gegenüber einem bestimmten nachzuweisenden Analyten voneinander unterscheiden. Im Falle von nachzuweisenden DNA- Analyten befinden sich innerhalb der einzelnen Bereiche der Trägeroberfläche - direkt oder indirekt immobilisiert - spezifische Nukleinsäuresonden wie z. B. Oligonukleotide oder cDNA in zumeist einzelsträngiger Form, deren jeweilige Spezifität gegenüber der nachzuweisenden Nukleinsäure im wesentlichen durch die Sequenzabfolge (Sondendesign) vorgegeben ist. Die auf diese Weise funktionalisierte Chipoberfläche wird im Rahmen eines entsprechenden Nachweisverfahrens mit der die nachzuweisenden DNA-Analyten möglicherweise enthaltenden Probe unter Bedingungen in Kontakt gebracht, welche im Falle des Vorhandenseins der zuvor nachweisbar markierten Zielnukleinsäure(n) deren Hybridisierung mit den immobilisierten Sondenmolekülen gewährleisten. Die qualtitative und ggf. quantitative Detektion eines bzw. mehrer spezifisch gebildeter Hybridisierungskomplexe erfolgt anschließend zumeist durch optophysikalische Lumineszenzmessung und Zuordnung der erhaltenen Daten zu den jeweiligen Detektionsbereichen, wodurch die Bestimmung der Anwesenheit des bzw. der DNA-Analyten in der Probe und ggf. deren Quantifizierung ermöglicht wird.
  • Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird darauf hingewiesen, dass die zugrundeliegende Technologie selbstverständlich auch für die Detektion anderer nachweisbar markierter Analyte wie insbesondere proteinöse Substanzen (Peptide, Proteine, Antikörper, funktionelle Fragmente derselben) eingesetzt werden kann, sofern die Nachweisreaktion auf der Messung von Lumineszenzdaten beruht. Mit anderen Worten betrifft die vorliegende Erfindung jedweden lumineszenzgestützten Nachweis eines aus einem nachweisbar markierten Liganden (Komponente aus der zu analysierenden Probe) und Rezeptor (immobilisierte Trägerkomponente) gebildeten Komplexes, wobei erfindungsgemäß auch solche Systeme umfasst sind, bei denen sich der Ligand bereits durch eine nachweisbare Eigenfluoreszenz auszeichnet und daher keiner weiteren Markierung bedarf. So ist beispielsweise bekannt, dass die Aminosäure Tyrosin eine Eigenfluoreszenz aufweist, deren Halbwertszeit nach einer Anregung bei ca. 260 nm eine erfindungsgemäße Anwendung ermöglicht, und zwar auch ohne zusätzliche Markierung einer Tyrosin-Reste aufweisenden proteinösen Substanz. So können erfindungsgemäß durch Verwendung von Peptiden als Rezeptoren proteinöse Substanzen wie z. B. Antikörper oder Fragmente derselben als Liganden nachgewiesen werden, und zwar auch ohne diese zuvor mit einem erfindungsgemäß geeigneten Luminophor markiert zu haben.
  • Ferner kann die Erfindung auf die Messung von Schadstoffen wie polyzyklische Kohlenwasserstoffe oder andere organische Substanzen angewendet werden. Es ist bekannt, dass zahlreiche Vertreter der Gruppe der polyzyklischen Kohlenwasserstoffe eine Fluoreszenzhalbwertszeit von bis zu 450 ns aufweisen und demgemäß als Liganden für das erfindungsgemäße Verfahren - auch ohne zusätzliche Markierung - ausgewählt werden können (Pyren bei Anregung mit 336 nm)(s. z. B. Patterson et al., Chem. Phys. Letters 7: 612-614 (1970)). Diese polyzyklischen Kohlenwasserstoffe können somit erfindungsgemäß nachgewiesen werden, indem sie als Liganden an speziell produzierte Antikörper binden und nach geeigneter Anregung ein Lumineszenzsignal liefern. Dabei spielt vor allem die Wahl der geeignten Anregungswellenlänge zur Erreichung einer ausreichenden Lumineszenzausbeute eine große Rolle (s. z. B. Löhmannsröben und Roch, in Analytikertaschenbuch 15, Springer Verlag, Heidelberg (1997)).
  • Unter dem Begriff "Lumineszenz" werden erfindungsgemäß sämtliche, durch eine Anregungsquelle hervorgerufene Lichtemissionen (im weiteren Sinne auch die Aussendung von ultravioletter und infraroter Strahlung) von gasförmigen, flüssigen und festen Stoffen zusammengefasst, die nicht durch hohe Temperaturen, sondern durch vorangegangene Energieabsorption und Anregung verursacht wird. Die Lumineszenz zeigenden Stoffe werden Luminophore genannt. Auch wenn die vorliegende Erfindung z. T. unter Verwendung der Begriffe "Fluoreszenz" und "Fluorophore" näher erläutert wird, kennzeichnen diese Begriffe lediglich bevorzugte Ausführungsformen des erfinderischen Grundgedankens und stellen somit keine Beschränkung der Erfindung dar.
  • Wie dem Fachmann bekannt ist, kann eine Lumineszenz hervorgerufen werden durch Bestrahlung aus einer Anregungsquelle mit Licht (vorzugsweise kürzerwelliges Licht sowie Röntgenstrahlen, Photolumineszenz), mit Elektronen (Kathodolumineszenz), Ionen (Ionolumineszenz), Schallwellen (Sonolumineszenz) oder mit radioaktiven Stoffen (Radiolumineszenz), durch elektrische Felder (Elektroumineszenz), durch chemische Reaktionen (Chemolumineszenz) oder mechanische Vorgänge (Tribolumineszenz). Demgegenüber handelt es sich bei der Thermolumineszenz um durch Erwärmung ausgelöste oder verstärkte Lumineszenz. Alle diese Prozesse unterliegen den allgemeinen Grundsätzen der Quantenmechanik und bewirken eine Anregung der Atome und Moleküle, die anschließend unter Emission von Licht, welches erfindungsgemäß detektiert wird, in den Grundzustand zurückkehren. Die Auswahl und ggf. unterschiedliche Ausführung geeigneter Anregungsquellen ist demnach davon abhängig, welche(r) Typ(en) der Lumineszenzerzeugung angewendet werden soll(en). Folglich kann die Anregungsquelle z. B. in Form von Elektroden, Leuchtdioden, Ultraschallschwingern etc. vorgesehen sein.
  • Die auf lumineszenzgestützten Nachweis basierenden und im Stand der Technik bekannten Systeme umfassen neben dem eigentlichen Biochip bzw. Sensorchip insbesondere Vorrichtungen zur Erfassung, Weiterleitung und Auswertung der lumineszenzbedingten Signale. Die am Markt befindlichen Produkte sind jedoch aufgrund der Anzahl der erforderlichen Systemkomponenten sowie einer damit verbundenen hohen Komplexität relativ teuer und können im wesentlichen nicht mehr weiter miniaturisiert werden. Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist daher die Bereitstellung neuer Vorrichtungen der zuvor beschriebenen Art, mit denen die Nachteile der im Stand der Technik bekannten Systeme überwunden werden.
  • Gegenüber den vorbekannten Nachweissystemen, bei denen der lumineszenzgestütze Nachweis des Vorhandenseins eines Analyten (Liganden) in einer zu analysierenden Probe über die spezifische Bindung desselben an einen direkt oder indirekt an einer festen Phase immobilisierten Rezeptor und die nachfolgende Messung der vom Rezeptor/Liganden-Komplex emittierten Lichtintensität durch Verwendung komplexer Abbildungsoptiken wie CCD-Kameras erfolgt, basiert die vorliegende Erfindung darauf, dass diese aufwändigen Abbildungsoptiken durch integrierte Mittel für ein direktes Bildaufnahmeverfahren ersetzt werden.
  • Seit langem ist bekannt, dass die Sensitivität und damit die untere Nachweisgrenze entsprechender Systeme durch eine den Werkstoffkomponenten inhärente Eigenfluoreszenz sowie durch systembedingte Lichtstreuungen eingeschränkt werden. Bestrebungen der Technik, das hierdurch verursachte Hintergrundrauschen zu minimieren bzw. ein optimiertes Verhältnis zwischen Signal und Rauschen zu erhalten, haben u. a. zur Technologie der zeitaufgelösten bzw. zeitverzögerten (timeresolved) Fluoreszenzmessung geführt, welche in verschiedenen Anwendungsgebieten bereits mit Erfolg angewendet wird.
  • Das allgemeine Prinzip der zeitaufgelösten fluorimetrischen Messung ist wie folgt: Im Falle der Anregung einer Mischung von Fluoreszenzverbindungen mit einem kurzen Lichtpuls aus einem Laser oder aus einer Blitzlichtlampe emittieren die angeregten Moleküle eine entweder kurz- oder langandauernde Fluoreszenz. Obgleich beide Typen der Fluoreszenzabnahme exponentiell verlaufen, klingt die kurzlebige Fluoreszenz innerhalb weniger Nanosekunden auf einen vernachlässigbaren Wert ab. Sofern Messungen während dieser kurzen Dauer nach erfolgter Anregung im wesentlichen unterbleiben, werden sämtliche Hintergrundsignale aus der kurzlebigen Fluoreszenz sowie sämtliche durch Streuung bedingten Strahlungsimpulse eliminiert, wodurch die lang andauernden Fluoreszenzsignale mit sehr hoher Sensitivität gemessen werden können.
  • Die für diese Erfindung besonders geeigneten Luminophore sind solche, deren Halbwertszeit deutlich über 5 ns liegt, so dass diese Luminophore nach dem Abklingen des sog. Fluoreszenzhintergrundes (s. o.) noch messbar sind. Am meisten bevorzugt sind Luminophore, deren Halbwertzeiten im µs- bis ms-Bereich, insbesondere im Bereich zwischen 100 µs und 2000 µs liegen. Dementsprechend werden die Messungen im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens im allgemeinen nach Verstreichen einer Zeitdauer von ca. 5 ns nach erfolgter Anregung durchgeführt. Nach einer bevorzugten Ausführungsform liegt das Messfenster im µs- bis ms-Bereich, wobei der Bereich zwischen 100 µs und 2000 µs besonders bevorzugt ist.
  • Organische Luminophore weisen meist nur eine kurze Halbwertszeit des angeregten Zustandes auf. Dieser, Fluoreszenz i. e. S. genannte Effekt beruht auf der durch die Energie der Anregungsquelle verursachten Anhebung eines Elektrons auf eine höhere Vibrationsenergieebene, den sog. angeregten Singulettzustand. Dieser Zustand weist eine Stabilität von nur wenigen ns auf (z. B. 2,6 ns für Tryptophan). Beim Rückfall des Elektrons aus dem angeregten Singulettzustand in den Grundzustand wird dabei die Anregungsenergie in Form von Licht frei. Die Emissions- Wellenlänge ist dabei in der Regel größer als diejenige der Anregungsquelle. Die Differenz zwischen Anregungswellenlänge und Emissionswellenlänge nennt man Stokes-Verschiebung. Bei einigen Luminophoren findet dagegen ein Übergang des angeregten Singulettzsutandes in den sog. Triplettzustand statt. In diesem Falle kommt es zu einer Stabilisierung des angeregten Zustandes und zu einer Vergrößerung der Stokes- Verschiebung. Dieser Tripelttzustand befindet sich in der Regel auf einem Energieniveau unmittelbar unter demjenigen des angeregten Singulettzustandes. Im Triplettzustand liegt keine Spinpaarung des Elektons mit dem Grundzustand des Elektrons mehr vor. Somit handelt es sich bei dem Übergang vom Triplettzustand in den Grundzustand um einen quantenmechanisch verbotenen Übergang. Dadurch wird die Lebensdauer des anegeregten Zustandes stabilisiert. Dieser Effekt wird Phosphoreszenz genannt und weist Halbwertszeiten bis zu 10 ms auf. Klassische Luminophore mit langer Halbwertzeit sind z. B. Verbindungen von Selten Erden Metallen (SEE) oder Aktinidenverbindungen, wobei letztere jedoch wegen ihrer Radioaktivität nur noch eine untergeordnete Rolle spielen. In der Biologie werden SEE-Metallionen meist als Chelatorkomplexe verwendet, da durch die Wahl eines geeigneten organischen Bindungspartners die Lumineszenzausbeute drastisch erhöht werden kann. Solche Verbindungen sind kommerziell als sogenannte "Microspheres" mit einem Durchmesser von mehreren Hundert nm erhältlich (z. B. FluoSpheres® Europium Luminescent Microspheres, Molecular Probes).
  • Weiterhin zur erfindungsgemäßen Verwendung bevorzugt geeignet sind Nanokristalle von Halbleitern, da sie neben ihren Lumineszenzeigenschaften insbesondere eine relativ kleine Größe (wenige nm) und eine hohe Stabilität (kein Photobleaching) aufweisen. Die Halbwertszeit kann hier in Abhängigkeit von dem gewählten Halbleitermaterial und der Dotierung in einem weiten Bereich von mehreren Hundert ns bis hin in den Millisekundenbereich eingestellt werden. Entsprechende Nanopartikel können vom Fachmann leicht mit z. B. Silanen beschichtet (s. z. B. Bruchez et. al., Science 281, 2013-2016 (1998)) und anschließend an organische Moleküle wie z. B. Nukleinsäuren oder Antikörper gekoppelt werden. Geeignete Halbleiter sind Halbleiter der Klassen II-VI (MgS, MgSe, MgTe, CaS, CaSe, CaTe, SrS, SrSe, SrTe, BaS, BaSe, BaTe, ZnSe, ZnTe, CdS, CdSe, CdTe, HgS, HgSe, HgTe), III-V (GaAs, InGaAs, InP, InAs), und IV (Ge, Si). Derart beschaffene Halbleiterkristalle weisen Halbwertzeiten im Bereich von ca. 200 ns oder mehr auf. Nanokristalle der Klasse II-VI sind z. B. als sogenannte "Quantum Dots®" (Quantum Dot Corp., Kalifornien, USA) erhältlich. Das jeweilige Absorptionsspektum von Nanokristallen innerhalb einer Klasse ist identisch, die jeweiligen Emissionsspektren unterscheiden sich jedoch in Abhängigkeit der gegebenen Partikelgröße, sodass bei der Verwendung von Filteroptiken mehrere parallele Markierungen unter Verwendung einer Anregungswellenlänge gemessen werden können. Die Eigenschaften einiger Nanokristalle ergeben sich aus Tabelle 1. Tabelle 1

  • Weitere, im Rahmen der vorliegenden Erfindung geeignete Substanzen mit ausgeprägter Lumineszenz sind Kristalle aus Cadmiumselenid, Cadmiumsulfid oder Zinksulfid, die mit Mangan, Kupfer bzw. Silber dotiert sind. Die diesen Substanzen eigene Lumineszenz wird durch Störungen im Kristallgitter hervorgerufen. Durch die Auswahl verschiedener Metallionen zur Dotierung (Ag, Cu, Mn) können unterschiedliche Emissionsspektren erzeugt werden. Da die genannten Substanzen wasserunlöslich sind, werden sie erfindungsgemäß bevorzugt in Form sogenannter Mikropartikel ("microparticles") eingesetzt (s. z. B. Murase et al., J. Phys. Chem. B, 103 : 754-760 (1999)). Die Eigenschaften einiger Vertreter dieser Substanzgruppe werden anhand der obigen Tabelle 1 am Beispiel von Mn2+ dotiertem ZnS verdeutlicht.
  • Weitere erfindungsgemäß geeignete Luminophore sind Erdalkalihalogenide mit Gitterfehlstellen, wie sie z. B. durch Dotierungen (Fremdionen) oder radioaktive Strahlung hergestellt werden können. Beispielsweise zeigen Partikel aus Calciumfluorid (CaF) durch eine entsprechende Dotierung mit z. B. Europium eine deutliche Lumineszenz. Bei radioaktiv verursachten Gitterfehlern kann es z. B. im Falle von CaF auch zur Thermolumineszenz kommen, wobei bereits Temperaturen um 40 Grad Celsius ausreichen, um eine Lumineszenz auszulösen.
  • Die im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Verwendung bevorzugt vorgesehenen fluoreszierenden Selten-Erden Metallverbindungen bzw. Chelate wie insbesondere die Europium- Chelate wurden aufgrund bestimmter Vorteile gegenüber herkömmlichen Fluorophoren als Marker für die zeitaufgelöste Fluorometrie ausgewählt. Die fluoreszierenden Europium-Chelate weisen große "Stokes-Verschiebungen" (ca. 290 nm) ohne eine Überlappung zwischen den Exzitations- und Emissionsspektren auf und sind durch ein sehr enges (10 nm Bandbreite) Emissionsspektrum bei ca. 615 nm gekennzeichnet. Ferner gestatten ihre langen Fluoreszenz-Halbwertszeiten (600-1000 µs für Eu3+ im Vergleich zu 5-20 ns für herkömmliche Fluorophore) die Anwendung zeitaufgelöster Fluoreszenzmessungen im Mikro- bis Millisekundenbereich, wodurch die oben erwähnten Hintergrundsignale wirksam reduziert werden können. Tabelle 2

  • Die Verwendung von Europium-Chelaten als Marker im Rahmen einer zeitaufgelösten Fluorimetrie ist bereits seit längerem aus immunologischen Assays sowie aus Southern- und Western- Blot-Anwendungen bekannt. Die entsprechende Markierung des in einer zu untersuchenden Probe ggf. vorhandenen Biomoleküls (Ligand) kann anhand etablierter Protokolle entweder mit Eu3+ oder einem Eu3+-Chelatbildner erfolgen (s. z. B. E. P. Diamandis und T. K. Christopoulos, "Europium chelate labels in timeresolved fluorescence immunoassays and DNA hybridization assays", Anal. Chem. 62: 1149 A-1157A (1990)). Nach einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens kann der Analyt (Ligand) alternativ biotinyliert sein und die Detektion unter Verwendung von Eu3+ oder einem Eu3+- Chelatbildner erfolgen, welche an Streptavidin gekoppelt sind. Besonders bevorzugt hierbei ist die Verwendung sogenannter "Beads", welche mit den entsprechend ausgewählten Selten-Erden Metallverbindungen beladen sind und auf diese Weise eine sehr hohe Dichte an Lumineszenz emittierenden Molekülen gewährleisten. Aus empirischen Versuchen ist bekannt, dass die Nachweisgrenze derartig optimierter Fluorimetrie-Systeme bei ca. 1 bis 5 pg Protein oder DNA liegt.
  • Die aus der EP-A-0 881 490 bekannte Messeinrichtung zur Messung bestimmter physiologischer wie auch morphologischer Parameter mindestens einer zu untersuchenden lebenden Zelle kann für den erfindungsgemäßen Einsatz nach entsprechender Modifikation verwendet werden. Die beschriebene Einrichtung weist bereits eine Vielzahl von Sensoren auf, die integraler Bestandteil einer Trägereinrichtung sind, auf welcher das zu untersuchende Material immobilisiert ist.
  • Die Trägereinheit der erfindungsgemäßen Vorrichtung besteht im wesentlichen aus einem Halbleitermaterial mit einer integrierten, vorzugsweise mehrere Detektoren umfassenden optischen Detektorschicht, wobei als Detektoren vorzugsweise Photodioden eingearbeitet sind. Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Signalverarbeitung zumindest teilweise innerhalb des Biosensors.
  • Nach einem Aspekt der vorliegenden Erfindung kann die zeitaufgelöste Fluoreszenz beispielsweise direkt auf dem Chip mit analogen Schaltungen ausgewertet werden, indem man nach Abschalten der Anregungsquelle z. B. jede Nanosekunde einen Wert aufnimmt, der dann z. B. auch mit einem Referenzwert einer zuvor durchgeführten Messung, welcher ebenfalls auf dem Chip gespeichert wurde, verglichen wird. Darüber hinaus wird auf diese Weise ermöglicht, dass man unspezifische Störsignale wie z. B. die Eigenfluoreszenz von gegebenenfalls anwesenden Systemkomponenten herausrechnen kann (s. auch Fig. 2). Geht man davon aus, dass man mittlerweile auch bis in den GHZ Bereich (< 1 ns) auflösen kann, so kann die Eigenfluoreszenz von der künstlichen Fluoreszenz unterschieden werden.
  • Sofern die Sensoroberfläche das Design einer Microarray- Anordnung aufweist, bei der eine Vielzahl von Detektionsfeldern auszuwerten sind, kann die Detektion der Messfeld- bzw. -punktsignalwerte sequentiell erfolgen, indem z. B. ganze Zeilen oder Spalten der Sensoroberfläche bzw. Teile derselben nacheinander detektiert werden (Multiplexanwendung).
  • Beispielsweise können die elektronischen Ausgangssignale der Detektoren mittels geeigneter Schaltungseinrichtungen nach einer Analog-Digitalumsetzung einer externen Auswerteeinrichtung zugeführt werden. Als erfindungsgemäß geeignete optische Detektoren bzw. Sensoren kommen neben der Photodiode (pn, p-i-n, avalanche) CCD-Sensoren oder Photoleiter in Betracht, die vorzugsweise in Form einer Zeilen- oder Arrayanordnung in das Halbleitersubstrat der Vorrichtung monolithisch eingearbeitet sind. Photodioden können vorteilhaft im Rahmen einer zeitaufgelösten Lumineszenzmessung eingesetzt werden, da sie im Vergleich zu Photomultipliern eine geringe Detektionsfläche aufweisen.
  • Nach einem besonders bevorzugten Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Anregungsquelle integraler Bestandteil des Messinstruments und wird durch den Detektor selbst bereitgestellt. Die Wahl einer pn-Diode aus direktem Halbleitermaterial ermöglicht folgendes: Im ersten Fall bedeutet die Aktivierung die Anlegung einer Spannung, wodurch ein Lichtsignal (pn-Diode wird als LED benutzt) ausgesendet wird, welches je nach Art und Beschaffenheit der pn-Diode in einem bestimmten Emissionswellenlängenband liegt und die Anregung eines im Bereich dieser pn-Diode gebundenen Liganden bewirkt. Nach Deaktivierung der pn-Diode (pn-Diode wird als Photodiode benutzt) und nach Verstreichen einer gewissen Karenzzeit wird sie dann noch einmal aktiviert, um die gewünschte(n) Messung(en) durchzuführen.
  • Dadurch, dass die Anregungsstrahlung in der zuvor beschriebenen Ausführungsform über dieselbe Komponente eingekoppelt wird, mit der auch die Lumineszenzstrahlung aufgefangen wird, kann erreicht werden, dass selektiv ein sehr kleiner Bereich der Sensoroberfläche bzw. des Detektorfeldes bestrahlt wird und von diesem Bereich ausgehende Lumineszenzstrahlung ausgewertet wird. Durch diese Vorgehensweise ist das untersuchte Detektorfeld sehr genau abzubilden und eine Störung der Messung durch Lumineszenz von außerhalb des untersuchten Bereichs kann verhindert werden.
  • Selbstverständlich können die Detektoren zusätzlich in Gruppen angeordnet sein, wodurch einzelne Detektionsfelder geschaffen werden, deren Eingangssignale ein zuverlässigeres Ergebnis gewährleisten als es bei einer Einzelbelegung pro Detektionsbereich der Fall wäre.
  • Durch eine Mehrfachbelegung pro Detektionsfeld kann auch eine messtechnische Zentrierung des Liganden-Bindungsereignisses gewährleistet werden, was im Wege der Signalaufbereitung zu einer deutlichen Sensitivitätssteigerung beitragen kann.
  • Die Herstellung eines erfindungsgemäßen Sensors kann unter Anwendung des an sich bekannten CMOS(complementary metal-oxide semiconductor)-Verfahrens erfolgen, weshalb alle Schaltungsbibliotheken für die Integration von Signalkonditionierung und Auswertung ohne Modifikationen verfügbar sind und im Rahmen der vorliegenden Erfindung implementiert werden können. Erfindungsgemäß ebenfalls geeignete Herstellungsverfahren sind z. B. NMOS-Prozesse oder Bipolar-Prozesse (s. z. B. S. Wolf, Silicon Processing for the VLSI ERA Vol. 1, Lattice Press, Sunset Beach (1986)). Ferner besteht die insbesondere nach Kostengesichtspunkten interessante Möglichkeit der Herstellung eines erfindungsgemäßen Biosensors auf der Basis von organischen Halbleitern (s. z. B. EP-A-1 085 319).
  • Nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind die einzelnen Detektionspunkte oder -felder voneinander in der Weise getrennt, dass im wesentlichen keine Lichtemission eines Punktes oder Feldes von dem oder den Detektoren eines anderen Punktes oder Feldes empfangen werden kann. So können die einzelnen Detektionsorte in jeweiligen Vertiefungen angeordnet sein, wie sie zum Beispiel von üblichen Mikrotiterplatten bekannt sind. Bevorzugt sind erfindungsgemäß muldenartige Vertiefungen und solche, deren seitlichen Wandungen im wesentlichen senkrecht zur Oberfläche des Sensorchips angeordnet sind. Die jeweiligen Abmessungen einer solchen Vertiefung kann der Fachmann in Kenntnis des Anwendungsbereichs frei wählen, solange sich der bzw. die Luminophoren des zu erwartenden Liganden/Rezeptor-Komplexes innerhalb der Vertiefung befinden und im wesentlichen kein Emissionslicht in benachbarte Vertiefungen eindringen kann. Eine besonders bevorzugte Vertiefung ist um mindestens 100 nm in die Oberfläche der erfindungsgemäßen Vorrichtung eingesenkt. Der gleiche Effekt kann alternativ erzielt werden, indem auf der im wesentlichen planaren Detektoroberfläche senkrecht nach oben gerichtete Trennmittel angeordnet sind, deren Abmessungen vom Fachmann in Kenntnis des gewünschten Anwendungsbereiches und der räumlichen Abmessung eines antizipierten Rezeptor/Liganden-Komplexes leicht ausgewählt werden kann. Die Anbringung entsprechend geeigneter Trennmittel kann beispielsweise durch anodisches Bonden oder durch sogenannte Flip-Chip-Verfahren erfolgen. Ein derartiges System ermöglicht erfindungsgemäß ein sensorgestütztes elektrooptisches Bildaufnahmeverfahren.
  • In einer bevorzugten Ausführung sind auf dem Detektorchip Kanäle aufgebracht, sodass auf einem Chip parallel mehrere verschiedene Analyte gemessen werden können. Die Kanäle können z. B. Reihen von Sensorelementen versorgen, auf denen die Arrays der Rezeptoren gebunden sind. So ließen sich z. B. Kalibrationsmessungen durchführen. In einer weitern bevorzugten Ausführungsform wird eine Parallelmessung von n identischen Arrays durchgeführt, um so die Kosten pro Analyse drastisch zu senken. Dazu wird der Chip durch Mikrokanäle in beispielsweise 8 identische Kompartimente unterteilt.
  • Für den Fachmann ist klar, dass die Wahl des Detektors bzw. des Materials von der zu detektierenden Emissionswellenlänge des Farbstoffes abhängt. Grundsätzlich ist zu sagen, dass der Detektor aufgrund des sogenannten "Halbleiterbandgaps" je nach Materialwahl (z. B. Silizium oder Germanium) unterschiedliche Empfindlichkeiten bezüglich der Wellenlänge hat. Im bevorzugten Falle der Verwendung einer Silizium-Photodiode wird daher ein Empfindlichkeitsbereich geschaffen, der vom infraroten bis in das ultraviolette Wellenspektrum reicht, wobei die Empfindlichkeit zwischen diesen Bereichen am größten ist (s. z. B. B. Streetman, Prentice-Hall, Inc., "Solid State Electronic Devices", ISBN 0-13-436379-5, S. 201-227 (1995)).
  • Wenn man als Trägereinrichtung für die Rezeptoren und die Ausbildung der Sensoren ein monolithisch integrierbares Halbleitermaterial verwendet, lässt sich auch eine monolithisch integrierte Schaltung auf dem selben Substrat herstellen, wodurch in unmittelbarer Nähe zum Untersuchungsobjekt (Rezeptor/Liganden-Komplex) eine Vorverarbeitung der elektronischen Sensor-Ausgangssignale erfolgen kann. Somit handelt es sich bei dieser bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung um eine "intelligente" Sensoreinrichtung, die wesentlich mehr leistet, als rein passive Sensoren. Beispielsweise können die Ausgangssignale der elektrooptischen Sensoren durch eine mitintegrierte Schaltung so aufbereitet werden, dass sie über Ausgangsschaltungen und Anschlusskontakte relativ problemlos nach außen geführt werden können. Ferner kann die Vorverarbeitung aus der Digitalisierung der analogen Sensorsignale und ihre Umwandlung in einen geeigneten Datenstrom bestehen. Des weiteren kann das signal-to-noise ratio (Signal-Rausch-Verhältnis) durch die in der erfindungsgemäßen Vorrichtung verwirklichten Nähe des Detektors zum Ort der Signalverarbeitung aufgrund kurzer Signalwege sehr stark verbessert werden. Darüber hinaus sind auch weitere Verarbeitungsschritte möglich, mit denen z. B. die Datenmenge reduziert werden kann oder die der externen Verarbeitung und Darstellung dienen. Damit ist es möglich, dass die verbleibende Auswertung der optischen Signale und ihre Darstellung über einen Personal Computer (PC) erfolgen kann. Ferner kann die erfindungsgemäße Vorrichtung so ausgestaltet sein, dass die vorzugsweise verdichteten bzw. aufbereiteten Daten über Infrarot- oder Funkverbindung an entsprechend ausgestattete Empfangsstationen übermittelt werden können.
  • Die Steuerung der zugehörigen Einrichtungen auf dem Substrat kann über Steuersignale aus einer Steuereinrichtung erfolgen, die vorzugsweise ebenfalls ganz oder teilweise auf dem Substrat ausgebildet sein kann oder extern angeschlossen wird.
  • Die mögliche Auswertung der optischen/elektrischen Signale im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens über einen handelsüblichen Computer hat den weiteren Vorteil, dass über geeignete Programme eine weitgehende Automatisierung der Datenauswertung sowie -speicherung möglich ist, so dass man im Rahmen der Datenanalyse durch die Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung keinerlei Einschränkungen gegenüber mit Hilfe herkömmlicher externer Abbildungsoptiken generierter Daten unterliegt.
  • Das direkte Erfassen der Lumineszenzen auf der erfindungsgemäßen Vorrichtung wird dadurch realisiert, dass sich die für einen spezifischen Nachweis erforderlichen Rezeptormoleküle - direkt oder z. B. über einen üblichen Abstandshalter (Spacer) bzw. eine Kopplungsmatrix - auf der Oberfläche eines optischen Detektors befinden, welcher als integraler Bestandteil der erfindungsgemäßen Vorrichtung ausgestaltet ist.
  • Nach einer bevorzugten Ausführungsform wird der optische Detektor in Form mindestens einer Photodiode bereitgestellt, wobei die Gegenwart einer Vielzahl dieser Photodioden u. a. zum parallelen bzw. sequentiellen Nachweis mehrerer unterschiedlicher Analyten (Liganden) besonders bevorzugt ist. Aber auch bei Verwendung nur eines Farbstoffes bietet die Mehrfachanordnung den Vorteil, dass man durch mehrere Detektoren pro Detektionsfeld Profile aufnehmen kann, mit deren Hilfe sich die ortsspezifische Zuordnung eines Bindungsereignisses von Rezeptor und Ligand im Wege der Zentrierung verbessern lässt. Im Rahmen dieser speziell auf die als solche bekannten Mikroarray-Anordnungen gerichteten Ausführungsformen können die einzelnen Photodioden vorteilhafterweise zu definierten Detektionsgruppen bzw. Messfeldern zusammengefasst sein, wodurch die Sensitivität der nachfolgenden Lumineszenzmessung sowie die Reproduzierbarkeit und Verlässlichkeit der hierdurch erhaltenen Messdaten signifikant erhöht werden.
  • Nach einer bevorzugten Ausführungsform besteht die ggf. freigelegte Oberfläche einer jeden Photodiode aus SiO2 oder Si3N4. Weiterhin können bestimmte Verfahrensparameter der Rezeptor/Liganden-Bindung und der Detektion durch Wahl des Oberflächenmaterials für den Sensorchip positiv beeinflusst werden. Beispielsweise kann an manchen Stellen Si3N4, an anderen dagegen SiO2 (oder z. B. Al2O3) oder ein Edelmetall aufgebracht sein, wodurch auf dem Sensorchip oder sogar im Detektionsfeld für die Biomoleküle oder Spacer bevorzugte Bereiche mit z. B. eher hydrophoben bzw. eher hydrophilen Eigenschaften bereitgestellt werden können, um das Aufbringen von z. B. DNA-Rezeptoren ortsgerichtet zu fördern oder zu verhindern. Des weiteren können durch Aufbringen von ansteuerbaren Edelmetallelektroden erfindungsgemäß bevorzugte Vorrichtungen geschaffen werden, bei denen z. B. durch Anlegen ggf. pro Detektionspunkt- bzw. feld unterschiedlicher Spannungen Hybridisierungsereignisse beschleunigt oder eine Fluoreszenz ausgehend von elektrisch anregbaren Farbstoffen ausgelöst werden kann.
  • Die Anregungsquelle, wie sie z. B. in Form einer oder mehrerer Weißlichtlampen, LED's, (Halbleiter)Laser, UV-Röhren, sowie durch Piezoelemente (Ultraschall) bzw. durch Lichtenergie abgebende Gase und/oder Flüssigkeiten (chemische Anregung) bereitgestellt werden kann, sollte ausreichend leistungsstark und vorzugsweise mit hoher Frequenz repetierbar sein. Letztere Eigenschaft ist dann gegeben, wenn die Lichtquelle sowohl kurzzeitig aktiviert als auch gelöscht werden kann. Im Falle der Verwendung einer optischen Anregungsquelle sollte diese so abschaltbar sein, dass nach dem Abschalten im wesentlichen keine weiteren Photonen (wie z. B. durch Nachglühen) auf den Detektor treffen. Dies kann erforderlichenfalls beispielsweise durch Verwendung von mechanischen Verschlußblenden (engl. "shutter"), sowie durch Auswahl von LED's oder Lasern als optische Anregungsquelle gewährleistet werden.
  • Vorzugsweise ist die Anregungsquelle mit der Vorrichtung optisch und mechanisch derartig mit den optischen Detektoreinheiten gekoppelt, dass ein Strahlungsfeld in Richtung der Optosensoren erzeugt wird, wobei der räumliche Abstand der Anregungsquelle zur Detektionsebene möglichst klein ist. Der Abstand muss jedoch ausreichend sein, damit die für den bestimmungsgemäßen Einsatz erforderlichen Reaktionen zwischen Ligand und Rezeptor nicht beeinträchtigt werden. Dabei kann es zweckmäßig sein, dass die Anregungsquelle - entsprechend der Vielzahl vorgesehener Detektionsbereiche auf dem Substrat - aus einer Vielzahl von punktförmigen Strahlungsquellen besteht, die mittels der Steuereinrichtung einzeln oder in Gruppen aktivierbar sind. Die Bestrahlung kann direkt, d. h. ohne eine zwischengeschaltete Optik erfolgen, wenn der von der Anregungsquelle ausgesandte Lichtstrahl bereits ausreichend stark fokussiert ist, um den insbesondere im Rahmen der Verwendung sogenannter Mikroarrays sehr kleinen Detektionsbereich zu gewährleisten. Alternativ kann der Strahlungsgang aus der Anregungsquelle aber auch durch Verwendung geeigneter Linsen fokussiert werden, sofern dies z. B. durch eine sehr enge Belegung von Rezeptoren auf der Sensoroberfläche angezeigt ist. Dem Fachmann ist klar, dass hierdurch ein weiteres Mittel zur Verringerung unspezifischer Störsignale wie z. B. Eigenfluoreszenz bereitgestellt wird.
  • Die Anordnung der punktförmigen Strahlungsquellen, die z. B. aus gebündelten Lichtleiterfasern oder aus miniaturisierten LED (Light Emitting Diode) bestehen oder auf andere Weise realisiert sind, ist zweckmäßigerweise zeilen- oder feldförmig und damit der Anordnung der Rezeptoren auf der Sensoroberfläche funktional angepasst. Für die Verwendung im Rahmen von Analysen unter Einsatz unterschiedlicher Selten-Erde Chelate kann es vorteilhaft sein, dass die Anregungsquellen hinsichtlich der von ihnen abzugebenen Wellenlänge durchstimmbar sind oder Anregungsquellen für unterschiedliche Wellenlängen vorhanden sind. Des weiteren kann es für bestimmte Anwendungszwecke vorteilhaft sein, wenn die Anregungsquelle frequenzmoduliert wird. Hierbei wird intensitätsmoduliertes Anregungslicht eingesetzt, wobei die Modulation bei der Messung von Halbwertzeiten im Nanosekunden-Bereich mit mehreren MHz erfolgt. Das dem Fachmann unter der Bezeichnung FLIM (engl. "Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy") bekannte Verfahren ist daher im Rahmen einer weiteren erfindungsgemäß bevorzugten Ausführungsform eingeschlossen. Den vorhergehenden Ausführungen entspricht, dass auf der Sensorseite unterschiedliche oder durchstimmbare Sensoren für die Erfassung der aus einem Rezeptor/Liganden-Komplex emittierten Lichtenergie vorhanden sein können. Sofern es sich hierbei um Photodioden handelt, werden entweder wellenlängenspezifische Photoelemente oder aber herkömmliche Photodioden ausgewählt, die mit aufgelegten, aufgebrachten, aufgedampften oder integrierten Wellenlängenfiltern ausgestattet sind. So ist z. B. bekannt, dass Siliziumnitrid im Gegensatz zu Siliziumoxid UV-Licht nicht durchläßt, und dass Polysilizium UV-Strahlung absorbiert (s. z. B. V. P. Iordanov et al., Integrated high rejection filter for NADH fluorescence measurements, Sensors 2001 Proceedings, Vol. 1, 8-10 Mai, S. 106-111, AMA-Service (2001)). Daher kann auf die Gateoxidschicht im Rahmen des üblichen CMOS-Prozesses Nitrid oder Polysilizium deponiert werden, wodurch auf der Photodiode entsprechende Filter geschaffen werden. So hat z. B. NADH (Nicotinamid Adenine Dinucleotid) eine Anregungswellenlänge von 350 nm und eine Emissionswellenlänge von 450 nm. Durch Aufbringung eines Filters, der 350 nm ausfiltert, kann daher die Sensitivität erhöht werden. Erfindungsgemäß kann dieser Effekt genutzt werden, um bei paralleler Verwendung von z. B. zwei unterschiedlichen Luminophoren, von denen beispielsweise nur einer Licht im UV-Bereich emittiert, eine differentielle Detektion zu ermöglichen, da die hierfür vorgesehenen Detektoren UV-sensitiv ausgestaltet sind oder nicht. Ferner bietet dieser Effekt die Möglichkeit, gegebenenfalls störende Eigenfluoreszenzen anwesender Materialien mit bekannter Emissionswellenlänge durch Bereitstellung entsprechender Filter aus dem Messverfahren herauszunehmen. Ein Beispiel hierfür ist die parallele Verwendung von Europium-Chelaten (Emission bei ca. 620 nm) und mit Kupfer dotiertem Zinksulfid (Emission bei ca. 525 nm), die durch hinreichend voneinander verschiedenen Emissionswellenlängenbereichen eine Zweifarbdetektion ermöglichen, z. B. innerhalb eines Bereichs eines Detektorpunktes bzw. -feldes, indem z. B. die eine Hälfte der Sensoren eines Detektorpunktes bzw. -feldes mit einem Tiefpassfilter und die andere Hälfte der Sensoren des gleichen Punktes oder Feldes mit einem Hochpassfilter ausgestattet ist.
  • Zusätzlich oder alternativ können unterschiedliche Luminophoren parallel eingesetzt werden, sofern ihre physikalischen bzw. optischen Eigenschaften hinreichend voneinander abweichen. Beispielsweise werden erfindungsgemäß die unterschiedlichen Anregungswellenlängen zweier zu verwendender Luminophore A und B und/oder deren unterschiedlichen Halbwertzeiten genutzt. Dies kann z. B. durch Bereitstellung von zwei unterschiedlich dotierten Nanokristallen erfolgen.
  • Um mit dieser Schicht aus Optosensoren eine Rezeptor- /Liganden-spezifische Detektion durchführen zu können, kann sie nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform mit einer kopplungsfähigen Substanz beschichtet werden. Typischerweise werden hierzu die Sensor-Chip-Oberflächen aus Metall- bzw. Halbmetalloxiden, wie z. B. Aluminiumoxid, Quarzglas, Glas, in eine Lösung von bifunktionellen Molekülen (sog. "Linker"), die beispielsweise eine Halogensilan- (z. B. Chlorsilan-) oder Alkoxysilangruppe zur Kopplung an die Trägeroberfläche aufweisen, getaucht, so daß sich eine sich selbst organisierende Monoschicht (SAM) bildet, durch welche die kovalente Bindung zwischen Sensoroberfläche und Rezeptor erzeugt wird. Beispielsweise kann mit Glycidyltriethoxysilan beschichtet werden, was z. B durch Eintauchen in eine Lösung von 1% Silan in Toluol, langsames Herausziehen und Immobilisieren durch "Backen" bei 120°C erfolgen kann. Eine auf diese Weise geschaffene Beschichtung weist im allgemeinen eine Dicke von wenigen Ångström aus. Die Kopplung zwischen Linker und Rezeptormoleküle(n) erfolgt über eine geeignete weitere funktionelle Gruppe, beispielsweise eine Amino- oder Epoxygruppe. Geeignete bifunktionelle Linker für die Kopplung einer Vielzahl von unterschiedlichen Rezeptor-Molekülen, insbesondere auch biologischen Ursprungs, an eine Vielzahl von Trägeroberflächen sind dem Fachmann gut bekannt, vgl. beispielsweise "Bioconjugate Techniques" von G. T. Hermanson, Academic Press 1996.
  • Sofern es sich bei den zu detektierenden Biomolekülen um Nukleinsäuren handelt, können anschließend geeignete DNA- Sonden mittels gängiger Druckgeräte aufgebracht und immobilisiert werden.
  • Auf derart hergestellten Biosensoren können nun unter Anwendung etablierter Verfahren Hybridisierungen mit z. B. biotinylierter DNA durchgeführt werden. Diese kann z. B. mittels PCR und den Einbau von Biotin-dUTP erzeugt werden. Beim Hybridsieren bindet nun die biotinylierte DNA an den auf dem Sensor vorhandenen Gegenstrang (sofern vorhanden). Positive Hybridisierungsereignisse können nun durch Zugabe von Farbstoffkonjugaten (Streptavidin /Avidin- Konjugate) nachgewiesen werden. Als Farbstoffkonjugate sind erfindungsgemäß besonders geeignet: Europium-, Terbium- und Samarium- Chelate, Microspheres ("Beads"), die z. B. über Avidin- /Streptavidin mit Eu-, Sm-, Tb-Chelaten beladen sind, wobei sich die genannten Chelate durch ihre Eigenschaft auszeichnen, bei geeigneter Anregung Lumineszenzlicht mit einer Halbwertszeit des angeregten Zustandes von über 5 ns abzugeben. Besonderes geeignet sind hierbei lumineszierende Microspheres, wie z. B. FluoSpheres Europium (Molecular Probes F-20883), da sie in der Lage sind, eine große Zahl von Fuorochromen mit einem Bindungsereignis zu immobilisieren. Erfindungsgemäß ferner geeignet sind Nanokristalle, wie sie z. B. von der Quantum Dot Corp. unter der Bezeichnung "Quantum-Dots®" angeboten werden.
  • Nach dem Waschen zum Entfernen nicht gebundener markierter Liganden bzw. frei flottierender Lumineszenzfarbstoffe erfolgt die Messung der Bindung über eine geeignete Anregung und die Messung der zeitaufgelösten Fluoreszenz bei ausgeschalteter Anregungslichtquelle.
  • Erfindungsgemäß werden die Zeitdauer der Anregung mit T1, die Zeitdauer zwischen der Anregung und der Messung mit T2, und die Zeitdauer der Messung mit T3 bezeichnet.
  • Das Zeitfenster T3 für eine jeweilige, ggf. mehrfache Messung der Abklingzeit der Fluoreszenz sollte hierbei im Bereich von 5 ns bis 2 ms ausgewählt werden. Über die Auswahl von verschiedenen Selten-Erden Metallverbindungen mit jeweils unterschiedlich langen Abklingzeiten kann im Wege einer differenzierten Auswertung auch eine Zweifarbdetektion durchgeführt werden, was einer weiteren bevorzugten Ausführungsform entspricht.
  • Die Signale des Detektors werden durch eine Aufnahmeeinheit aufgenommen. Eine Aufnahmeeinheit besitzt einen sehr schnellen Konverter zur Umwandlung analoger Detektorsignale in digitale Werte, die gespeichert werden. Eine Auswertung der digitalen Werte wird vorzugsweise in Echtzeit vorgenommen, kann jedoch auch zeitlich verzögert erfolgen. Zur Auswertung der digitalen Werte kann ein gewöhnlicher Mikroprozessor verwendet werden.
  • Für den Fall, dass das Lumineszenzsignal für eine eindeutige Detektion zu schwach ist, kann im Rahmen einer bevorzugten Ausführungsform der Detektion eine Erhöhung der Nachweissensitivität über eine Integration mehrerer Einzelmessungen erreicht werden. Dabei erfolgt eine identische Messung mehrfach und die Messergebnisse werden aufaddiert. Dies kann sowohl direkt auf dem Sensorchip als auch nach der Messung über geeignete Software erfolgen. Eine Einzelmessung sieht beispielsweise folgendermaßen aus: Während der Anregungszeit T1 ist die Photodiode als Detektor in einem gegenüber dem Anregungszustand unempfindlichen Modus. Die Anregungsquelle ist während dieser Zeit aktiv. Während der Zeitdauer T2 sind sowohl die Anregungsquelle als auch die Photodiode inaktiv. Während dieser Zeit kann die Hintergrundlumineszenz abklingen. Während der Zeitdauer T3 ist die Photodiode aktiv und detektiert ein bis mehrere einfallende Photonen der Luminophore. Durch Rücksetzen der Photodiode in den inaktiven Modus kann der Vorgang der Detektion wiederholt werden. Die jeweiligen Zeitintervalle können beispielsweise mit 2 ms (T1), 5 ns (T2), und 2 ms (T3) ausgewählt werden. Das Zeitintervall T3 kann bei entsprechender Signalstärke auch deutlich kleiner als die Halbwertszeit des angeregten Zustandes des bzw. der eingesetzten Luminophore sein.
  • Nach einer besonders bevorzugten Ausführungsform der repetitiven Anregung werden die im Zeitintervall T3 erhaltenen Detektorwerte, gegebenenfalls nach Digitalisierung und weiterer elektronischer Bearbeitung, in Speicherzellen abgelegt, die einzelnen Zeitintervallen zugeordnet sind. Ein derartiger Speicher besitzt beispielsweise 100 oder mehr Speicherzellen, die aufeinanderfolgenden Zeitintervallen zugeordnet sind. Ein solches Zeitintervall liegt vorzugsweise im Bereich von 1 bis 100 Nanosekunden. Findet die Detektion eines Lumineszenzprozesses beispielsweise 5 Nanosekunden nach Anregung statt, so wird für die Speicherzelle, die eine Zerfallszeit von 5 Nanosekunden mit umfasst, ein Wert gespeichert. Besonders bevorzugt kann das vom Detektor erhaltene Signal auch bezüglich der Signalintensität analysiert und festgestellt werden, von wievielen Einzelmolekülen (Anzahl der Rezeptor/Liganden-Komplexe) das Signal ausgegangen ist, wodurch nicht nur eine qualitative sondern auch eine quantitative Analyse ermöglicht wird. In der Speicherzelle wird nunmehr das der Luminophorzahl entsprechende Vielfache des Einheitswertes abgespeichert.
  • Der zuvor beschriebene Speicherprozess erfolgt für jede Einzelmessung erneut, wobei eine Summation vorgenommen wird, sofern eine repetitive Anregung gewünscht ist. Das heißt, der nach einer Messung in einer bestimmten Speicherzelle abgespeicherte Einheitswert, oder ggf. ein Vielfaches davon, wird dem in der Zelle bereits vorhandenen Wert zugeschlagen. Die Summenkurve, die auf diese Weise mit den Messungen für ein bestimmtes Detektorfeld erhalten wird, kann ausgewertet werden, um zu ermitteln, welche lumineszierenden Liganden im Detektorfeld gebunden sind. Auf die Summenkurven können prinzipiell solche Auswerteverfahren angewandt werden, wie sie auch für Signalkurven eingesetzt werden, die mit einer Vielzahl von unterschiedlichen Liganden erhalten wurden. Eine absolute Erfassung der Lumineszenzereignisse auf wenige Picosekunden genau erlaubt eine globale Analyse der Photonenstatistik. Es können charakteristische Häufungen oder Pausen in der globalen Photonenverteilung erkannt und ermittelt werden. Es wird dadurch die Messung der Triplettdauer eines Systems sowie die Ermittlung von Reaktionskinetiken möglich. Ebenso lassen sich auf diese Weise Diffusionszeiten durch das Detektionsvolumen messen, die einen Rückschluss auf die Größe des Ligandenmoleküls ermöglichen. Mit einem solchen System kann eine Gesamt-Photonensammeleffizienz von 5 bis 10% bezogen auf die eingestrahlte Photonenzahl erreicht werden. Dies ergibt sich aus einer Absorptionseffizienz der Lumineszenzfarbstoffe von etwa 80%, einer Emissionswahrscheinlichkeit von etwa 90% und einer Detektorempfindlichkeit von bis zu 70%.
  • Die Steuereinheit ist bei dieser Anwendung vorzugsweise darauf ausgelegt, die Anregungsquelle für ein Zeitintervall T1 zu aktivieren und nach Verstreichen eines Zeitintervalls T2 den Detektor für ein Zeitintervall T3 zu aktivieren. Eine derartige Steuereinheit ist geeignet, eine zeitaufgelöste Lumineszenzmessung zu ermöglichen. Das Zeitintervall T1, zu dem die Anregungsquelle aktiviert ist, dient dazu, Ligandenmoleküle in einen angeregten Zustand zu überführen, aus dem sie unter Aussendung von Lumineszenzlicht in einen energetisch tieferen Zustand übergehen. Die Zeit T1 liegt vorzugsweise im Bereich von 1 ns bis 2 ms. Die Karenzzeit T2 dient dazu, spontane Lumineszenz der Probe, die nicht von den zu detektierenden Molekülgruppen ausgeht, aus der Messung auszuschließen. Vorzugsweise liegt die Zeit T2 im Bereich zwischen 1 und 5 ns. Während des Zeitintervalls T3 ist der Detektor aktiviert und empfängt vom Rezeptor/Liganden-Komplex Lumineszenzstrahlung. Die Zeit T3 wird vorzugsweise zwischen 5 ns und 2 ms gewählt. Während dieser Zeit T3 werden die Detektorsignale bezüglich Signalhöhe und Zeitpunkt durch eine Aufnahmeeinheit aufgenommen. Sofern die Messung an einzelnen oder zumindest sehr wenigen Molekülen durchgeführt wird, erhält man im Zeitintervall T3 keine klassische Abklingkurve der Lumineszenz, sondern im Falle z. B. eines einzelnen Moleküls einen Signalpeak, der den Zeitpunkt bzw. das Zeitintervall, in dem das individuelle Molekül Strahlung aussendet, kennzeichnet. Dadurch, dass die Messung wiederholt durchgeführt wird, kann eine statistische Auswertung erfolgen, aus der die Lumineszenzlebensdauer ermittelt werden kann.
  • Im Rahmen einer statistischen Auswertung können die Intensitäten summiert werden, die in einem bestimmten Zeitintervall innerhalb T3 erhalten worden sind. Dem Fachmann ist klar, wie er die Methode anwendet. Ergänzend wird auf die Ausführungen der WO 98/09154 hingewiesen.
  • Die Erfindung und vorteilhafte Ausgestaltungen werden nun anhand der Figuren der Zeichnung näher erläutert:
  • Fig. 1 zeigt schematisch einen funktionellen Teilbereich einer erfindungsgemäßen Vorrichtung (1), welche im Rahmen eines CMOS-Prozesses hergestellt worden ist. Der optische Detektor, z. B. eine pn-Diode (2), ist überdeckt mit einem Isolator (z. B. Feldoxid), und kann zusätzlich mit einem Filter (4) versehen sein. Der Kratzschutz (3) ist im Bereich des optischen Detektors bzw. des Detektorfeldes entweder scharfkantig oder stufenweise heruntergeätzt, so dass die Rezeptormoleküle (z. B. DNA-Sonden) (6) in einem vertieften Bereich angeordnet sind. Die nicht der eigentlichen Detektion dienenden Kratzschutz-Oberflächen des Sensorchips können durch Aufbringung von z. B. Edelmetall oder hydrophoben/hydrophilen Materialien (5) modifiziert sein.
  • Fig. 2 zeigt, dass man auf dem Sensorchip (1) erfindungsgemäß auch Detektoren bzw. Detektorfelder (2) vorsehen kann, die, wie im linken Teil der Darstellung angedeutet ist, nicht mit Rezeptoren wie z. B. DNA-Sonden (6) bedruckt oder beschichtet sind. Das dient dazu, um Störsignale, wie sie z. B. durch die Eigenfluoreszenz der Systemkomponenten verursacht werden können, aus dem spezifischen Detektionssignal von der hybridisierten DNA (rechter Teil der Darstellung) herauszurechnen.
  • In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, dass die Signale der noch nicht hybridisierten DNA und/oder des freien Detektors (Hintergrundlumineszenz) und/oder der hybridisierten DNA ohne Fluoreszenzfarbstoff als Referenz- bzw. Kontrollwerte gespeichert werden, um dann beim eigentlichen Detektionsereignis mit Fluoreszenzfarbstoff die Möglichkeit zu haben, die aufgenommenen "Störsignale" aus dem Detektionssignal herauszurechnen.
  • Fig. 3 zeigt, dass der erfindungsgemäße Sensorchip (1) mit mehreren Photodioden (2) pro Detektionsfeld ausgestattet sein kann, wobei jeder einzelne Detektor dieses Feldes denselben Rezeptor aufweist. Hierdurch ergibt sich die Möglichkeit einer Mehrfachmessung für einen gegebenen Ligand/Rezeptor-Komplex, aus der eine statistische Abschätzung des spezifischen Messsignals abgeleitet werden kann. Beispielsweise wird hierdurch ermöglicht, dass zwischen unspezifischen und spezifischen Signalen differenziert werden kann.
  • Fig. 4 zeigt ein über mehrere Detektionsereignisse ausgedehntes Detektorarray (2), mit Hilfe dessen Ungleichheiten bei der Bedruckung der Oberflächen der erfindungsgemäßen Vorrichtung (1) mit den unterschiedlichen DNA-Sonden (6) ausgeglichen werden können, indem die unterschiedlichen Detektionsereignisse über Intensitätsverteilungen gruppiert werden.
  • Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend anhand von Beispielen näher erläutert.
    • Herstellung eines erfindungsgemäßen Sensorchips
  • Der Sensor wird unter Verwendung von 6'' (Inch) Wafern mit einem 0.5 µm CMOS-Prozeß gefertigt. Jede pn-Photodiode wird in einer n-Wanne auf p-Substrat angeordnet. Nach der Feldoxidation folgen die Definition der p-Gebiete der Photodiode und die Aufbringung der 10 nm dicken Gateoxidschicht. Gewünschtenfalls kann man an dieser Stelle zusätzlich noch strukturiertes Nitrid (z. B. LPCVD oder PECVD) als UV-Filter aufbringen. Dann erfolgt die Auflagerung und Strukturierung einer Siliziumdioxid-Schicht. Anschließend werden die weiteren üblichen CMOS-Schritte durchgeführt, wie z. B. das Aufbringen einer Verdrahtungsschicht und die Oberflächenpassivierung (Kratzschutz).
    • Beschichtung des CMOS-Sensors
  • Der wie oben hergestellte CMOS-Sensor wird durch Tauchen in eine Lösung von 1% GOPS (Glycidoxypropyltriethoxysilan) und 0,1% Triethylamin in Toluol für eine Zeitdauer von ca. 2 Stunden mit dem Silan beschichtet. Anschließend wird der Chip aus der Lösung entnommen und nach kurzem Abtropfen bei 120°C für eine Zeitdauer von etwa 2 Stunden im Trockenschrank fixiert.
  • Gewünschtenfalls kann der so beschichtete Chip bis zur Biokonjugation unter Feuchtigkeitsausschluß gelagert werden.
    • Biokonjugation mit Oligonukleotidsonden
  • Unter Anwendung herkömmlicher Techniken wird der wie oben beschichtete Chip mit 5'-aminomodifizierten Oligonukleotidsonden kontaktlos bedruckt. Die Oligonukleotidsonden werden hierfür in einer Konzentration von 5 µM in PBS-Puffer gelöst bereitgestellt. Nach dem Bedrucken wird die Kopplungsreaktion bei 50°C in einer feuchten Kammer fortgesetzt. Anschließend werden die Chips mit destilliertem Wasser gespült und sodann zum Trocknen mit Methanol gewaschen. Etwaige verbleibende Lösungsmittelreste werden abschließend durch Verdunsten unter dem Abzug entfernt.
    • Probengewinnung
  • Aus humanen DNA-Isolaten werden mittels PCR Fragmente des Haemochromatosegens amplifiziert. Bei der Amplifikation werden geeignete Primersequenzen verwendet, wie sie z. B. im US-Patent 5,712,098 beschrieben sind.
  • Im Reaktionsmix befinden sich folgende Standardreagenzien (Primer: 0,5 µM, dATP, dCTP, dGTP: 0,1 mM, dTTP 0,08 mM, PCR- Puffer, MgCl2: 4 mN, HotStarTaq (Perkin Elmer) 2 Einheiten/50 µl) plus zusätzlich Biotin-11-dUTP (0,06 mM). Bei der PCR- Reaktion (35 Zyklen, 5 min 95°C, 30 sek 95°C, 30 sek 60°C, 30 sek 72°C, 7 min 72°C) wird das Biotin-dUTP in die neu zu synthetisierende DNA eingebaut. Anschließend wird durch Zugabe von T7 Gen6-Exonuklease (100 Einheiten/ 50 µl PCR-Ansatz) und Erhitzten des Ansatzes (30 min 37°, 10 min 85°) Einzelstrang- DNA generiert.
    • Hybridisierung
  • Der obige Reaktionsansatz wird in einem Puffer 5 × SSPE, 0,1% SDS (12 µl) unter einem Deckglaschen für eine Zeitdauer von 2 Stunden bei 50° C in der feuchten Kammer auf dem Chip hybridisiert. Anschließend wird mit 2 × SSPE 0,1% SDS gespült und der Chip durch Waschen in Wasser gereinigt.
    • Markierung
  • Auf den Chip wird zur Färbung eine Markierungslösung gegeben, welche aus 5% BSA, 0,2% Tween 20 und 4 × SSC-Puffer besteht und in welcher 0,001% feste Microspheres (Europium Luminescence Microsperes, Neutravidin-beschichtet 0,04 µM, Molecular Probes F20883) suspendiert sind. Die Reaktion wird für eine Zeitdauer von 30 Minuten unter Agitation mittels Taumler durchgeführt. Anschließend werden gegebenenfalls vorhandene, nicht gebundene Microspheres durch Waschen in 2 × SSC, 0,1 % SDS aus dem Ansatz entfernt.
    • Herstellung Anti-Digoxigenin-IgG beschichteter Micropsheres
  • 0,04 µM Fluospheres Platinum Luminescent Microspheres (F20886) werden mit einem monoklonalen Anti-Digoxigenin- IgG-Antikörper (Goat) nach der Vorschrift des Herstellers (Molecular Probes) der Microspheres modifiziert. Die beschichtenen Microspheres werden anschließend in einem Dialyseschlauch mit einer Ausschlussgröße von 300 000 Daltons mit fünf Pufferwechseln gegen PBS dialysiert.
    • Zweifarbdetektion auf dem Sensorchip
  • Es werden - wie oben beschrieben - zwei PCR-Produkte erstellt, wobei bei dem einen Produkt das Biotin-11-dUTP gegen Digoxigenin-dUTP äquimolar ersetzt ist. Beide Reaktionsansätze werden in gleicher Weise behandelt und dann in einem 1 : 1 Gemisch auf dem Chip hybridisiert. Die Markierung erfolgt mit einem 1 : 1 Gemisch aus den obigen festen Microspheres (Europium Luminescence Microsperes, Neutravidin-beschichtet 0,04 µM, Molecular Probes F20883) und den Antikörpermodifizierten Spheres in dem dort beschriebenen Markierungspuffer. Die Anregung der Platinumspheres erfolgt bei 400 nm (Lichtquelle: Xenonlampe und Monochromator), während diejenige der Europiumspheres bei 370 nm durchgeführt wird (Xenonlampe und Monochromator). Die Ausleuchtung des Chips erfolgt über einen Lichtleiter und die Lumineszenzspektren der Farbstoffe werden getrennt aufgenommen. Anschließend wird mit UV-LED's belichtet (ohne Filter) und die Lumineszenzen beider Farbstoffe werden aufgenommen und anschließend über den Verlauf der Lumineszenzabklingkinetik ausgewertet.

Claims (7)

1. Vorrichtung zur ortsspezifischen Detektion des Vorhandenseins eines Rezeptor/Liganden-Komplexes in einer zu analysierenden Probe auf der Grundlage der Messung zeitaufgelöster bzw. zeitverzögerter Lumineszenz, bestehend aus
a) mindestens einem an der Oberfläche der Vorrichtung direkt oder indirekt immobilisierten Rezeptor,
b) mindestens einem optischen Detektor mit einer dem mindestens einem Rezeptor aus (a) zugewandten Oberfläche, sowie
c) mindestens einer Anregungsquelle,
dadurch gekennzeichnet, dass die Oberflächen aus (a) und (b) identisch sind.
2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Rezeptor aus der Gruppe bestehend aus Oligonukleotiden, einzel- oder doppelsträngigen Polynukleotiden, cDNA-Sonden, Peptiden und Antikörpern sowie funktionellen Fragmenten derselben ausgewählt ist.
3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Rezeptor - direkt oder indirekt - durch kovalente Bindung an der Oberfläche immobilisiert ist.
4. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der optische Detektor eine Photodiode ist.
5. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass der optische Detektor eine Vielzahl einzelner Detektoren umfasst, welche bevorzugt unter Ausbildung einzelner Nachweisfelder bzw. -raster in die Vorrichtung eingearbeitet sind.
6. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der mindestens eine Rezeptor innerhalb einer Vertiefung der Oberfläche gemäß Anspruch 1(a) und vorzugsweise rechtwinklig zu ihr immobilisiert ist, wobei der hierdurch geschaffene Rezeptor-Bindungsbereich gegenüber den Oberflächenbereichen ohne Rezeptor- Bindungsbereich um mindestens 100 nm eingesenkt ist.
7. Verfahren zur ortsspezifischen Detektion des Vorhandenseins eines Rezeptor/Liganden-Komplexes in einer zu analysierenden Probe auf der Grundlage der Messung zeitverzögerter Lumineszenz, bei dem die Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6 in an sich bekannter Weise eingesetzt wird.
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