DE102004039762A1

DE102004039762A1 - Substrat, Verfahren zu seiner Herstellung und Verwendung für die Bildung von Kulturen aus organischen Zellen

Info

Publication number: DE102004039762A1
Application number: DE200410039762
Authority: DE
Inventors: Alexander Walter; Udo Leuschner; Erich Prof. Dr. Dr. Wintermantel
Original assignee: Wilden AG
Current assignee: Wilden AG
Priority date: 2004-08-17
Filing date: 2004-08-17
Publication date: 2006-03-02
Also published as: US20080107853A1; EP1778832A1; US8105684B2; DE202004021077U1; WO2006018298A1

Abstract

Ein Substrat zur Bildung von Kulturen aus organischen Zellen weist die folgenden Merkmale auf: DOLLAR A - einen räumlichen Körper, DOLLAR A - der Querschnitt des Körpers umfasst eine Vielzahl von wenigstens ersten Poren, von denen die Mehrzahl eine Porengröße 1000 mum, vorzugsweise von 10 bis 500 mum, weiter vorzugsweise 10 bis 200 mum, höchstvorzugsweise 10 bis 100 mum, hat, DOLLAR A - die ersten Poren stehen in Fluidverbindung miteinander, DOLLAR A - wenigstens diejenigen ersten Poren mit einer Porengröße im Bereich von 10 bis 500 mum haben zellwachstumsfördernde Eigenschaft, DOLLAR A - wenigstens ein Teil der nahe wenigstens einer freien Oberfläche des Körpers angeordneten ersten Poren sind zur Außenumgebung offen. DOLLAR A Vorzugsweise handelt es sich bei dem Substrat um einen offenporigen Schaumstoffkörper aus einem Kunststoffmaterial. Das Substrat erlaubt die Bildung von räumlichen Zellkulturen.

Description

Die Erfindung betrifft ein Substrat, Verfahren zu seiner Herstellung und Verwendung für die Bildung von Kulturen aus organischen Zellen.

Eine herkömmliche Praxis bei der Vermehrung von organischen Zellen, wie sie für Untersuchungen verschiedenster Art auf medizinischem oder nicht-medizinischem Gebiet erforderlich sind, sieht die Schaffung einer Zellkultur auf ebenen, ggf. mit Proteinen beschichteten Deckgläsern in sogenannten Petrischalen vor. Es entsteht dabei auf den Deckgläsern eine Zellkultur in Gestalt einer Monoschicht. Es wurde schon vorgeschlagen (WO 97/08291), ein Wachstumsgefäss mit einer rauhen oder unebenen Wachstumsfläche auszugestalten, so dass darin Vertiefungen bis zu 1 mm entstehen. Hierdurch soll ein Zellwachstum mit grösserer Ausbeute und Geschwindigkeit erzielbar sein. Mikro-oberflächenstrukturierte Zellwachstumsgefässe, deren Oberflächen regelmässig oder unregelmässig angeordnete Erhebungen von weniger als 100 μm haben, sind zum Beispiel aus der WO 99/45096 bekannt. Gemeinsam ist den bekannten Vorgehensweisen, dass die erhaltene Zellkultur durch eine im Wesentlichen flächige Konfiguration mit nur geringer Ausdehnung in Dickenrichtung gekennzeichnet ist.

Der Erfindung liegt demgegenüber die Aufgabe zugrunde, ein Substrat zur Bildung grundsätzlich uneingeschränkt räumlicher Zellkulturen sowie Verfahren zu seiner Herstellung bereitzustellen

Ein Substrat gemäss der Erfindung zeichnet sich durch die Merkmale des Patentanspruches 1 aus. Ein Merkmal der Erfindung ist, dass das Substrat in Gestalt eines drei dimensionalen Körpers mit offenporiger Querschnittsstruktur ausgestaltet ist. Insbesondere ist die Querschnittsstruktur durch erste Poren einer bestimmten Abmessung (lichte Weite) gekennzeichnet, die in Fluidverbindung miteinander stehen und von denen diejenigen, die nahe einer freien Oberfläche des Körpers liegen, zur Aussenumgebung offen sind bzw. ausmünden.

Der Begriff „Poren", wie er hier verwendet wird, ist nicht auf oberflächenseitige Vertiefungen bzw. Kavitäten eingeschränkt, sondern umfasst insbesondere auch im Inneren des Substrates vorhandene Zellen oder Leerräume mit regelmässiger oder unregelmässiger Umrisskonfiguration. Die Verteilung der Poren kann über den Querschnitt des Substrates gleichmässig oder ungleichmässig sein.

Die Zellen einer in Berührung mit der freien Oberfläche eines erfindungsgemässen Substrates gebrachten Zellsuspension können in die Poren einwachsen, so dass allmählich die gesamte offenporige Struktur des Substrates mit Zellen belegt und eine der Konfiguration des Substrates entsprechende räumliche Zellkultur gebildet wird. Das Durchwachsen des Substrates mit Zellen wird erfindungsgemäss dadurch gefördert, dass wenigstens diejenigen Poren, deren Porengrösse in einem bestimmten Grössenbereich von 10 μm bis 500 μm liegt, zellwachstumsfördernde Eigenschaft aufweisen. Es versteht sich, dass eventuell vorhandene grössere Poren ebenfalls diese Eigenschaft haben können.

Die zellwachtumsfördernde Eigenschaft kann dadurch bewirkt werden, dass die Porenwände hydrophile Eigenschaft aufweisen. Hierzu kann man im Wege einer Plasmabehandlung, wie sie dem Fachmann grundsätzlich bekannt ist, so dass sich eine nähere Erläuterung erübrigt, ein ionisiertes gasförmiges Medium in das Substrat eindringen lassen, um an den Porenoberflächen die Oberflächenergie auf ein geeignetes Mass, z.B. 60 mN/m heraufzusetzen. Bei dem gasförmigen Medium kann es sich z.B. um ionisierte Luft, die unter einem geeigneten Überdruck in die Poren eingeführt werden kann, oder O₂N₂ handeln. Letzteres wird vorzugsweise durch Unterdruckwirkung in die Poren eindringen gelassen. Wegen der bestehenden Fluidverbindung zwischen den Poren kann das Gas den gesamten Substratquerschnitt beaufschlagen. Die Erfindung ist auf die genannten speziellen Gase nicht beschränkt. Wenn erwüncht, können auch andere geeignete Gase zum Einsatz kommen.

Eine Alternative zur Schaffung von Poren mit zellwachstumsfördernder Eigenschaft sieht eine Hydrophilisierung der Porenoberflächen mittels einer Beschichtung durch Eintrag einer hydrophilen Beschichtungslösung, z.B. Polylysin, Fibronectin, Kollagene, Gelatine sowie deren Kombination vor. Derartige Lösungen sind dem Fachmann gleichfalls grundsätzlich bekannt. Zu näheren Details kann z.B. auf Lindl, Zell- und Gewebekultur, Spektrum Verlag, Berlin, 2000, Seiten 33 ff. sowie E. Wintermantel, Medizintechnik mit biokompatiblen Werkstoffen und Verfahren, Springer Verlag, Berlin, 2002, Seiten 73 ff. verwiesen werden, welche Literaturstellen damit in die vorliegende Offenbarung einbezogen ist.

Eine weitere Alternative sieht die Bereitstellung des Substrates aus einem hydrophilen Kunststoffmaterial vor, bei dem es sich z.B. um ein Copolymer mit hydrophilen Gruppen, z.B. Polyether-Polyuretan-Hydrogele handeln kann.

Versuche, die im Rahmen der Erfindung durchgeführt wurden, haben ferner gezeigt, dass Poren, die Unstetigkeiten, wie Ecken, Knicke, Kantungen enthalten, ein Zellwachstum verhindern oder zu einem unzureichenden Füllen mit Zellen führen können. Gemäss einer Weiterbildung der Erfindung ist daher vorgesehen, dass die Wände wenigstens einer Mehrzahl der ersten Poren im Wesentlichen stetig gekrümmt sind, d.h. die Wandoberfläche im Wesentlichen frei von Ecken, Knicken, Kantungen und dergleichen ist, so dass die Wandoberfläche ein Kontinuum darstellt.

Eine bevorzugte Weiterbildung der Erfindung sieht zusätzlich zu den ersten Poren zweite Poren vor, die jedoch nicht für das Zellwachstum zur Verfügung stehen, sondern dazu dienen, gewisse Wirkstoffe aufzunehmen, die das Zellwachstum in den ersten Po ren fördern bzw. vor schädlichen Einflüssen schützen können. Diese Wirkstoffe, bei denen es sich beispielsweise um Zellnährmittel, Zellwachstumsförderer, Medikamente etc. handeln kann, können an die ersten Poren durch Diffusion weitergegeben werden. In diesem Fall können die zweiten Poren geschlossen sein. Oder die zweiten Poren stehen über Durchgänge geringer Durchlassweite in Fluidverbindung mit den angrenzenden ersten Poren. Diese zweiten Poren haben eine Porengrösse, die wesentlich kleiner als diejenige der ersten Poren ist, vorzugsweise « 10 μm. Jeweils wenigstens eine zweite Pore ist nahe bei oder angrenzend an einer ersten Pore von wenigstens einer Vielzahl solcher ersten Poren vorgesehen.

Zwar wird das Substrat im Allgemeinen, nachdem es von Zellen durchwachsen ist, als mechanische Stütze für die gebildete Zellkultur belassen, doch kann gemäss einer Weiterbildung der Erfindung auch vorgesehen sein, dass das Substrat aus einem biologisch abbaubaren Material bestehen kann. Geeignete Materialien sind z.B. Polymilchsäure, Polyglycolsäure sowie deren Copolymer.

Obschon ein Substrat mit der erfindungsgemässen Porenstruktur aus anderen Materialen, z.B. einem Schichtwerkstoff (übereinandergestapelte strukturierte Schichten mit regelmässig oder unregelmässig angeordneten Durchbrechungen) bestehen könnte, stellt es vorzugsweise wegen der vorteilhaften Herstellung im Spritzgiessverfahren einen offenporigen Schaumstoffkörper aus einem geeigneten Kunststoffmaterial, wie thermoplastisches Polyurethan oder Polystyrol, dar. Zudem lässt sich dadurch der Körper in jeder beliebigen Gestalt, z.B. plattenförmig oder als Zellkulturgefäss ausbilden. Zwar sind offenporige, dimensionsstabile Schaumstoffkörper ( DE 4 304 085 A ) bekannt, bei denen die einzelnen Poren durch Passagen geringer Durchlassweite miteinander verbunden sind, doch dienen diese Schaumstoffkörper als Filter, Isolationsmaterial oder Leichtbaustoff. In der Druckschrift wird ferner ein Verfahren zur Herstellung eines offenporigen Schaumstoffkörpers mit weiteren Details beschrieben.

Gemäss einem anderen Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eines Substrates der vorgenannten Art bereitgestellt, das sich dadurch auszeichnet, dass man in einem ersten Schritt durch Schäumen eines Kunststoffmaterials ein offenporiges Schaumstoffmaterial mit einer Vielzahl von wenigstens ersten Poren, von denen die Mehrzahl eine Porengrösse ≤ 1000 μm, vorzugsweise von 10 bis 500 μm, weiter vorzugsweise 10 bis 200 μm, höchstvorzugsweise 10 bis 100 μm hat, wobei die ersten Poren in Fluidverbindung miteinander stehen, und in einem zweiten Schritt das Schaumstoffmaterial einer Hydrophilisierungsbehandlung unterzieht. Geeignete Hydrophilisierungsbehandlungen wurden eingangs beschrieben; sie können entweder alleine oder in Kombination zum Einsatz kommen.

Ein Mikroquerschnitt eines Zellwachstumssubstrates nach der Erfindung in Gestalt eines offenporigen Schaumstoffkörpers aus einem Polyurthan-Kunststoffmaterial ist nachfolgend gezeigt.
Wie dargestellt, umfasst das Substrat eine Vielzahl von Poren, in denen sich das Zellwachstum abspielen kann, wobei deren Porengrösse variieren kann, jedoch ≤ 1000 μm betragen soll. Die Porengrösse unterliegt einer statistischen Verteilung. Bei der gezeigten Ausführungsform haben statistisch in der Minderzahl vorhandene Poren 1 eine Porengrösse von z.B. 400-500 μm, während die Mehrzahl von Poren, wie bei 2 angedeutet ist, wesentlich kleiner ist und ihre Grösse z.B. nur 10 -100 μm beträgt. Bei dem gezeigten Beispiel beträgt der Anteil der kleinen Poren 2 zu den grösseren Poren 1 zwischen 80 und 90 %. Die grosse Anzahl von mit zellwachstumsfördernder Eigenschaft versehenen kleineren Poren 2 ist vorteilhaft, da sich hierdurch eine erhebliche Oberflächenvergrösserung erzielen lässt.
Wie zu erkennen ist, hat die überwiegende Anzahl der Poren 1, 2 Wände, die frei von Knicken, scharfen Ecken oder Kantungen sind und daher im Wesentlichen ein Kontinuum darstellen.
Bei 3 sind Durchgänge (schwarz gezeigt) in den Porenwänden angedeutet, die eine Fluidverbindung zwischen benachbarten Poren 1,2 bilden.
Bei dem Kunststoffmaterial handelt es sich um ein im Spritzgiessverfahren geschäumtes thermoplastisches Polyurethan. Ein geeignetes Schäumverfahren ist in der EP 952 908 B1 beschrieben, so dass darauf Bezug genommen werden kann.
Nicht dargestellt sind ggf. in den Zwischenräumen zwischen benachbarten Poren 1, 2 oder innerhalb dieser Poren angesiedelte zweite Poren zur Aufnahme von gewissen Wirkstoffen der vorgenannten Art. Hierzu können z.B. Kapseln, die den Wirkstoff enthalten, dem thermoplastischen Ausgangsmaterial vor dem Schäumvorgang zugemengt werden.

Claims

Substrat, die folgenden Merkmale aufweisend: – einen räumlichen Körper, – der Querschnitt des Körpers umfasst eine Vielzahl von wenigstens ersten Poren, von denen die Mehrzahl eine Porengrösse ≤ 1000 μm, vorzugsweise von 10 bis 500 μm, weiter vorzugsweise 10 bis 200 μm, höchstvorzugsweise 10 bis 100 μm hat; – die ersten Poren stehen in Fluidverbindung miteinander; – wenigstens diejenigen ersten Poren mit einer Porengrösse im Bereich von 10 bis 500 μm( haben zellwachstumsfördernde Eigenschaft, – wenigstens ein Teil der nahe wenigstens einer freien Oberfläche des Körpers angeordneten ersten Poren sind zur Aussenumgebung offen.
Substrat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die zellwachstumsfördernde Eigenschaft hydrophile Eigenschaft der Porenwände umfasst.
Substrat nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Wände wenigstens einer Mehrzahl der ersten Poren im Wesentlichen stetig gekrümmt sind.
Substrat nach Anspruch 1, 2 oder 3, gekennzeichnet durch zweite Poren zur Aufnahme von ein oder mehreren Wirkstoffen aus der Gruppe der Zellnährmittel, Zellwachstumsförderer, Medikamente, wobei die zweiten Poren eine Porengrösse, die klei ner als diejenige der ersten Poren ist, vorzugsweise « 10 μm, ist, wobei jeweils wenigstens eine zweite Pore nahe bei oder angrenzend an einer ersten Pore von wenigstens einer Vielzahl von ersten Poren vorgesehen ist.
Substrat nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die zweiten Poren geschlossen sind, wobei ein Fluidaustausch zu den benachbarten ersten Poren durch Diffusion ermöglicht wird.
Substrat nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die zweiten Poren in Fluidverbindung mit den benachbarten ersten Poren stehen.
Substrat nach einem der Ansprüche 4 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Körper sowohl geschlossene als auch in Fluidverbindung stehende zweite Poren umfasst.
Substrat nach einem der Ansprüche 4 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die zweiten Poren in den ersten Poren eingelagert sind.
Zellwachstumssubstrat nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass dieses aus einem polymeren Material gebildet ist.
Substrat nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass das polymere Material biologisch abbaubar ist.
Substrat nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Körper plattenförmig ausgebildet ist.
Substrat nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass der Körper als Zellkulturgefäss ausgebildet ist
Verfahren zur Herstellung eines Substrates nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man in einem ersten Schritt durch Schäumen eines Kunststoffmaterials ein offenporiges Schaumstoffmaterial mit einer Vielzahl von wenigstens ersten Poren, von denen die Mehrzahl eine Porengrösse ≤ 1000 μm, vorzugsweise von 10 bis 500 μm, weiter vorzugsweise 10 bis 200 μm, höchstvorzugsweise 10 bis 100 μm hat, wobei die ersten Poren in Fluidverbindung miteinander stehen, bildet und in einem zweiten Schritt das Schaumstoffmaterial einer Hydrophlisierungsbehandlung unterzieht.
Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass man zur Hydrophilisierung ein ionisiertes gasförmiges Medium in das Schaumstoffmaterial eindringen lässt.
Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass man zur Hydrophilisierung die Porenoberflächen mit einer hydrophilen Beschichtung aus einem hydrophilen Beschichtungsmaterial versieht.
Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass das hydrophile Beschichtungsmaterial aus der Gruppe der Polylysin, Fibronectin, Kollagene, Gelatine sowie deren Kombination umfassenden Substanzen besteht.
Verfahren zur Herstellung eines Substrates nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ein offenporiges Schaumstoffmaterial mit einer Vielzahl von wenigstens ersten Poren, von denen die Mehrzahl eine Porengrösse ≤ 1000 μm, vorzugsweise von 10 bis 500 μm, weiter vorzugsweise 10 bis 200 μm, höchstvorzugsweise 10 bis 100 μm hat, wobei die ersten Poren in Fluidverbindung miteinander stehen, aus einem Kunststoffmaterial mit hydrophiler Eigenschaft gebildet wird.
Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass das Kunststoffmaterial ein Copolymer, insbesondere Polyether-Polyurethane-Hydrogel umfasst.
Verwendung eines offenporigen Schaumstoffmaterials mit einer Vielzahl von wenigstens ersten Poren, von denen die Mehrzahl eine Porengrösse ≤ 1000 μm, vorzugsweise von 10 bis 500 μm, weiter vorzugsweise 10 bis 200 μm, höchstvorzugsweise 10 bis 100 μm hat, wobei die ersten Poren in Fluidverbindung miteinander stehen, zur Bildung von Kulturen aus organischen Zellen.