DE102004063980A1

DE102004063980A1 - Vorrichtung und Verfahren zur Rastersondenmikroskopie

Info

Publication number: DE102004063980A1
Application number: DE102004063980A
Authority: DE
Inventors: Jens Dr. Struckmeier; Karl Dr. Schlagenhauf
Original assignee: Nambition GmbH
Current assignee: Nambition GmbH
Priority date: 2004-10-07
Filing date: 2004-10-07
Publication date: 2006-08-10
Also published as: US7810166B2; US20080072665A1; WO2006040025A1; EP1797567A1; JP2008516207A; CN101040346A

Abstract

Vorrichtung zur Rastersondenmikroskopie, mit einer rastersondenmikroskopischen Messeinrichtung (2), die eine Messsonde (4) für rastersondenmikroskopische Messungen und einen Probenträger zur Anordnung einer rastersondenmikroskopisch zu vermessenden Probe umfasst, einer Steuereinrichtung (40), die systemintegriert mit der rastersondenmikroskopischen Messeinrichtung (2) verbunden ist, wobei die Steuereinrichtung (40) eingerichtet ist, die Messeinrichtung (2) zur Durchführung einer rastersondenmikroskopischen Messung gemäß vorgegebener Steuerungparameter automatisch zu steuern, und/oder einer Auswerteeinrichtung (42), die systemintegriert mit der rastersondenmikroskopischen Messeinrichtung (2) verbunden ist, wobei die Auswerteeinrichtung eingerichtet ist, Messungen mittels der rastersondenmikroskopischen Messeinrichtung (2) gemäß vorgegebener Auswertungsparameter automatisch auszuwerten.

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen Vorrichtungen und Verfahren zur Untersuchung biologischer Systeme und insbesondere solche, die rastersondenmikroskopische und im Speziellen kraftspektroskopische Untersuchungen ermöglichen.
Hintergrund der Erfindung
Biologische Systeme und darin ablaufende Prozesse beruhen auf molekularen Wechselwirkungen. Molekulare Kräfte in biologischen Systemen unterscheiden sich von anderen Molekularsystemen, insbesondere hinsichtlich chemischer Reaktionen und physikalischer Änderungen eines Gesamtsystems. Aussagen über molekulare Wechselwirkungen in biologischen Systemen stellen aber die Voraussetzung dar, um derartige Systeme zu analysieren und weiterführende Aussagen machen zu können.
Zur Messung molekularer Wechselwirkungen in biologischen Systemen werden unter anderem rastersondenmikroskopische Ansätze verwendet, um Oberflächentopografien mit hoher lateraler und vertikaler Auflösung zu bestimmen. Unter lateraler Auflösung ist hierbei die Auflösung in einer Ebene einer zu untersuchenden Oberfläche eines biologischen Systems zu verstehen, während die Auflösung senkrecht zu dieser Ebene als vertikale Auflösung bezeichnet wird.

Beispiele für rastersondenmikroskopische Ansätze umfassen rasterkraftmikroskopische Ansätze, wie zum Beispiel die Rasterkraftmikroskopie (SFM, engl.: scanning force microscopy oder AFM, engl.: atomic force microscopy).

Mit solchen rasterkraftmikroskopischen Ansätzen können neben der Topologie einer Oberfläche einer biologischen Probe auch deren Elastizität oder dort wirkende Adhäsionskräfte erfasst werden. Die Rasterkraftmikroskopie, in diesem Falle üblicherweise als "Kraftspektroskopie" bezeichnet, ermittelt molekulare Kräfte einer Probe mittels einer Sonde, mit der die Probe abgetastet wird, um z.B. Wechselwirkungen zwischen einzelnen Molekülen quantitativ zu charakterisieren. Üblicherweise umfasst die Sonde eine an einem freitragenden Ausleger oder Messbalken, der auch als Cantilever bezeichnet wird, befestigte Spitze. Zur Untersuchung der Probe wird z.B. die Sonde über die Oberfläche der Probe gerastert, wobei die lateralen und vertikalen Positionen und/oder Auslenkungen der Sonde aufgezeichnet werden. Bewegungen der Sonde relativ zu der Probe sind aufgrund der elastischen Eigenschaften der Sonde und insbesondere des Cantilever möglich. Auf der Grundlage erfasster lateraler und vertikaler Positionen und/oder Auslenkungen der Probe werden molekulare Kräfte seitens der Probe und daraus deren Oberflächentopografie ermittelt.

Üblicherweise werden Bewegungen der Probe mittels optischer Messeinrichtungen ermittelt, die Auflösungen im Bereich von 0,1 nm haben und eine Detektion von Kräften von einigen pN ermöglichen.

Um die Oberflächentopografie einer biologischen Probe zu ermitteln, werden die Oberflächen der Probe und die Sonde eines Rasterkraftmikroskops derart miteinander in Kontakt gebracht, dass eine zwischen diesen wirkende Kraft auf einen vorbestimmten Wert (z.B. 50–100 pN) festgelegt wird. Danach werden die Probe die Sonde relativ zu einander lateral so bewegt, dass eine gerasterte Abtastung der Oberflächenprobe durch die Sonde erfolgt. Dabei werden die Probe und/oder die Sonde auch vertikal bewegt, um die zwischen wirkende Kraft auf dem vorgegebenen Wert zu halten. Bewegungen der Probe und der Sonde relativ zu einander können durch eine Piezokeramik umfassende Anordnung bewirkt.

Ein Vorteil der Rasterkraftmikroskopie besteht darin, dass biologische Proben in Pufferlösungen bei physiologisch relevanten Temperaturen (z.B. zwischen 4° C und 60° C) untersucht werden können.

1 veranschaulicht vereinfachend dass Prinzip eines Rasterkraftmikroskops. Zur Untersuchung der Oberfläche einer biologischen Probe BP wird eine Sonde S verwendet. Die Sonde S kann als eine Sondenspitze Sp umfassend betrachtet werden, die an einer Feder C "aufgehängt" ist. Bei Bewegungen der Sonde S und der Probe BP relativ zu einander (beispielsweise längs des Wegs W) werden in Abhängigkeit der jeweiligen Oberflächentopografie die Sonde S und die Probe BP relativ zu einander in vertikaler Richtung so bewegt, dass die Auslenkung der Feder C konstant ist.

Derzeit stellt aber die Rastersondenmikroskopie immer noch ein zeitaufwändiges und personalintensives Vorgehen dar ist. Angesichts der hohen Anzahl von Messungen, die für eine fundierte Analyse, vor allem bei biologischen Systemen, erforderlich sind, stellen derzeitige Ansätze zur Rastersondenmikroskopie aufgrund der geringen Anzahl von Messungen pro Zeiteinheit (z.B. 1 Tag) keine befriedigende Vorgehensweise dar. Auch die eingeschränkten Möglichkeiten der Analyse, Auswertung und Weiterverwendung der Messdaten stellen bedeutsame Nachteile dar.

Aufgabe der Erfindung

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Mittel bereit zu stellen, um die Nachteile bekannter rastersondenmikroskopischer Ansätze, insbesondere hinsichtlich Personalaufwand und Zeitaufwand, zu beseitigen und insbesondere die für eine fundierte Untersuchung biologischer Proben erforderlichen Messungen bereitzustellen. Des Weiteren soll es die vorliegende Erfindung ermöglichen, bei rastersondenmikroskopischen Messungen erhaltene Daten verglichen mit dem Stand der Technik in verbesserter Weise nutzen zu können.

Zur Lösung der obigen Aufgabe stellt die vorliegende Erfindung eine Vorrichtung zu Rastersondenmikroskopie sowie ein Verfahren zur Durchführung einer rastersondenmikroskopischen Messung gemäß den unabhängigen Ansprüchen 1 bzw. 26 bereit. Weitere Aspekte der Erfindung ergeben sich aus den anhängigen Ansprüchen, der nachfolgenden Beschreibung und den Zeichnungen.

Danach umfaßt die erfindungsgemäße Vorrichtung zur Rastersondenmikroskopie eine rastersondenmikroskopische Messeinrichtung, die eine Messsonde für rastersondenmikroskopische Messungen und einen Probenträger zur Anordnung einer rastersondenmikroskopisch zu vermessenden Probe umfasst. Ferner ist eine Steuereinrichtung und/oder eine Auswerteeinrichtung vorgesehen.

Die Steuereinrichtung ist systemintegriert, d.h. als integraler Bestandteil der erfindungsgemäßen Vorrichtung mit der rastersondenmikroskopischen Messeinrichtung verbunden, und eingerichtet, die Messeinrichtung zur Durchführung einer rastersondenmikroskopischen Messung gemäß vorgegebener Steuerungsparameter automatisch zu steuern.

Die Auswerteeinrichtung ist ebenfalls systemintegriert mit der rastersondenmikroskopischen Messeinrichtung verbunden, bildet also einen integralen Bestandteil der erfindungsgemäßen Vorrichtung, und ist eingerichtet, Messungen mittels der rastersondenmikroskopischen Messeinrichtung gemäß vorgegebner Auswertungsparameter automatisch auszuwerten.

Mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung wird eine Plattform bereitgestellt, Untersuchungen biologischer Proben mittels Rastersondenmikroskopie automatisiert durchzuführen und/oder zu analysieren. Des Weiteren ermöglicht es die erfindungsgemäße Vorrichtung, Messungen auf die jeweils zu untersuchende biologische Probe bzw. deren System anzupassen, indem entsprechende Steuerungsparameter und/oder Auswertungsparameter verwendet werden. Ein Vorteil besteht beispielsweise darauf basierend darin, dass derartige Messungen im Wesentlichen ohne Personal ganztägig durchgeführt und gleichzeitig analysiert werden können.

Ferner ist die Steuereinrichtung und/oder die Auswerteeinrichtung eingerichtet, Messungen der Mess- und/oder Auswerteeinrichtung angebende Daten zur Bestimmung von Eingangsparametern oder Parametersätzen der Messung zu identifizieren. Dieses Merkmal kann auch als Rückführung von Messungen der Mess- und/oder Auswerteeinrichtung angebenden Daten als Steuerungs- und/oder Auswertungsparameter bezeichnet werden. Die Identifikation von Parametern bzw. Parametersätzen kann unter Verwendung iterativer Suchalgorithmen ausgeführt werden. Des Weiteren ist es vorzugsweise möglich, dass wenigstens hinsichtlich dieses Merkmals die Steuereinrichtung und die Auswerteeinrichtung logisch miteinander verbunden sind. Bei einem Ausführungsbeispiel analysiert die Auswerteeinrichtung die kraftspektroskopischen Daten während eines Experiments. Bei Erreichen einer signifikanten Anzahl von Daten werden die nächsten experimentellen Parameter eingestellt und das Experiment fortgeführt. Die experimentellen Parameter können dabei so verändert werden, dass beispielsweise bestimmte Veränderungen der gemessenen Kräfte (und die daraus bestimmten Energien und Bindungskonstanten) genauer untersucht werden. So wird es z.B. möglich, automatisch die für den Benutzer interessanten Bereiche molekularer Interaktionen zu untersuchen.

Diese Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung ermöglicht es, wie im Folgenden näher ausgeführt, Messungen und Proben zu klassifizieren, Messungen an einer Probe miteinander zu vergleichen, optimierte Messstrategien zu entwickeln und/oder zu verwenden sowie verwendete Messstrategien zu optimieren.

Vorzugsweise umfasst die Vorrichtung eine Datenspeichereinrichtung zur Speicherung der von der Auswerteeinrichtung er zeugten Daten, die aus einer Auswertung von Messungen mittels der rastersondenmikroskopischen Messeinrichtung resultieren. Diese Ausführungsform ermöglicht beispielsweise den Aufbau einer Datenbank mit Informationen über Messungen an rastersondenmikroskopisch zu vermessenden Proben, auf die vor, während und nach einer laufenden Messung zurückgegriffen werden können. Die Datenspeichereinrichtung kann auch für zurückgeführte Messergebnisse verwendet werden, wobei auch Vergleiche mit bereits in der Datenspeichereinrichtung vorhandenen Informationen vorgesehen ist.

Vorzugsweise ist die Datenspeichereinrichtung ausgelegt, die vorgegebenen Steuerungsparameter und/oder die vorgegebenen Auswertungsparameter und/oder bei der jeweiligen Messung vorliegenden Messbedingungen so zu speichern, dass eine eindeutige Zuordnung zu den entsprechenden, von der Auswerteeinrichtung erzeugten Daten erreicht wird.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Messsonde eine federelastische Einheit.

Die federelastische Einheit kann insgesamt federelastisch ausgestaltet sein oder einen federelastischen Bereich aufweisen. Als federelastische Einheit kann beispielsweise ein (freitragender) Ausleger oder Messbalken (Cantilever) verwendet werden. Bei dieser Ausführungsform ist es ferner vorgesehen, dass die Messeinrichtung Kräfte, die auf die Messsonde wirken, auszuwerten vermag.

Bei einer Weiterbildung der Ausführungsform mit federelastischer Einheit ist es vorgesehen, dass die Messeinrichtung Wechselwirkungen der Messsonde mit der Probe und daraus resultierende, auf die Messsonde wirkende Kräfte unter Verwendung eines optischen Messsystems (z.B. Laser-Beam-Deflection-System, Beam Bouncing) und/oder über piezoelektrische Effekte und/oder über magnetische Wechselwirkungen zu erfassen vermag.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann auch eine Einheit zur Erzeugung eines auf die Messsonde wirkenden Lichtfeldes und/oder elektrischen Feldes und/oder magnetischen Feldes umfassen. Das bzw. die Felder können statische oder dynamische Felder sein, wobei auch ein wechselweiser Betrieb zwischen statisch und dynamisch vorgesehen ist.

Vorzugsweise ist als federelastisches Element eine Feder, die vorzugsweise eine Länge im Bereich zwischen 1 und 400 Mikrometer aufweist, und/oder ein elastischer Ausleger (Cantilever) vorgesehen.

Des Weiteren ist es vorgesehen, dass die Steuereinrichtung die federelastische Einheit so zu steuern vermag, dass die Messsonde mit einer vorgegebenen Amplitude in Schwingung versetzt wird. Beispielsweise sind Amplituden im Bereich zwischen 0,1 und 2000 Nanometern vorgesehen.

Ferner kann die erfindungsgemäße Vorrichtung eine Krafterzeugungseinheit umfassen, die der Messeinrichtung und/oder der Steuereinrichtung zugeordnet sein kann.

Dabei ist es vorgesehen, dass die Steuereinrichtung die Krafterzeugungseinheit automatisch so zu steuern vermag, dass Änderungen eines für die Messsonde wirksamen Qualitätsfaktors (Q-Faktors) erreicht werden können, indem entsprechende Kräfte an das federelastische Element angelegt werden.

Die Verwendung der Krafterzeugungseinheit ist insbesondere dann bevorzugt, wenn die Messsonde in Schwingung versetzt werden soll. Zur Erfassung von Schwingungsänderungen der Messsonde, kann die Auswerteeinrichtung eingerichtet sein, solche Änderungen in Form von Resonanzverschiebungen und/oder Amplitudenänderungen und/oder Phasenänderungen zu detektieren.

Bei einer weiteren Ausführungsform umfasst die Messeinrichtung eine Sondenpositioniereinheit, um die Messsonde in allen Translations- und/oder Rotationsachsen des Raums zu positionieren. Dabei ist es vorgesehen, dass die Steuereinrichtung die Messsonde durch Steuerung der Positioniereinheit gemäß vorgegebener Sondenpositionierungsparameter automatisch zu positionieren und/oder zu bewegen vermag.

Bei Verwendung einer Sondenpositioniereinheit ist es vorgesehen, Sondenpositionierungsparameter zu verwenden, die umfassen:

– Bewegungen der Messsonde zur gerasterten Abtastung einer auf dem Probenträger anzuordnenden Probe, wobei derartige Bewegungen laterale Bewegungen und/oder Bewegungen im Bereich zwischen 0,1 Nanometern und einige Millimeter, vorzugsweise im Bereich zwischen 0,1 Nanometern und 500 Mikrometern, umfassen,
– Bewegungen der Messsonde in vertikaler Richtung, wobei es vorgesehen ist, dass derartige Bewegungen im Bereich zwischen 0,01 Nanometer und 50 Mikrometer liegen können,
– Bewegungen der Messsonde in vertikaler Richtung in Abhängigkeit von einem vorgegebenen minimalen Abstand zwischen der Messsonde und der Probe, wobei es möglich ist, eine Abstandsregelung, beispielsweise einen PID und/oder eine Phase-Logic-Regelung, zur Bewegungssteuerung zu verwenden,
– eine maximale Zeitdauer für einen Kontakt der Messsonde mit einer auf dem Probenträger anzuordnenden Probe,
– eine maximale Kontakthäufigkeit von Kontakten der Messsonde mit einer auf dem Probenträger anzuordnenden Probe,
– eine maximale und/oder eine minimale Messsondengeschwindigkeit für Bewegungen der Messsonde relativ zu einer auf dem Probenträger anzuordnenden Probe,
– ein maximaler und/oder ein minimaler Abstand zwischen der Messsonde und einer auf dem Probenträger anzuordnenden Probe,
– eine vorgegebene, zwischen der Messsonde und einer auf dem Probenträger anzuordnenden Proben konstant zu haltenden Kraft, die beispielsweise im Bereich zwischen 0,1 und 3000 pN liegen kann,
– eine maximale und/oder eine minimale Zugkraft der Messsonde auf eine auf dem Probenträger anzuordnende Probe,
– eine maximale und/oder eine minimale Druckkraft der Mess sonde auf eine auf dem Probenträger anzuordnende Probe,
– eine maximale und/oder eine minimale Zugkraftänderungsrate für von der Messsonde auf eine auf dem Probenträger anzuordnenden Probe wirkende Zugkräfte,
– eine maximale und/oder eine minimale Druckkraftänderungsrate für von der Messsonde auf eine auf dem Probenträger anzuordnenden Probe wirkende Druckkräfte,
– eine maximale und/oder eine minimale Scherkraft der Messsonde auf eine auf dem Probenträger anzuordnende Probe, und/oder
– eine maximale und/oder eine minimale Scherkraftänderungsrate für von der Messsonde auf eine auf dem Probenträger anzuordnenden Probe wirkende Scherkräfte.

Bei einer Ausführungsform ist eine erste Detektoreinheit vorgesehen, die Positionen der Messsonde und/oder Bewegungen der Messsonde, bevorzugt auch deren Auslenkung, und/oder auf die Messsonde wirkende Kräfte regelmäßig, z.B. repetitiv mit einer Frequenz von einigen zehn oder einigen hundert kHz, zu erfassen vermag. Dabei ist die Steuereinrichtung vorzugsweise eingerichtet, die erste Detektoreinheit gemäß vorgegebener Detektionsparameter automatisch zu steuern.

Vorzugsweise umfasst die erste Detektoreinheit Positionssensoren zur Positions- und/oder Bewegungsdetektion der Messsonde. Beispielsweise können LVDT-Sensoren, Dehnungsmessstreifen, optische Sensoren, interferometrische Sensoren, kapazitive Sensoren hierfür verwendet werden. Besonders bevorzugt ist ein optischer Strahlablenkungsdetektor zum Erfassen der Auslenkung der Messsonde vorgesehen.

Ferner ist es bevorzugt, dass auf der Grundlage von der ersten Detektoreinheit bereitgestellter Daten die Positionssteuerung und/oder die Bewegungssteuerung der Messsonde und/oder der Probe unter Verwendung eines oder mehrerer geschlossener Regelkreise erfolgt. Hierfür ist es vorgesehen, dass die erste Detektoreinheit wenigstens in dieser Hinsicht mit der Steuer einrichtung verbunden ist.

Des Weiteren ist es vorgesehen, dass die Steuereinrichtung die erste Detektoreinheit gemäß vorgegebener Detektionsparameter zu steuern vermag, die umfassen,

– eine vorgegebene Detektionsrate hinsichtlich einzelner, mehrerer und/oder aller zu erfassender Größen, und/oder
– eine Häufigkeit, mit der die erste Detektoreinheit Positions-, Bewegungs- und/oder Kraftmessungen durchführen soll.

Vorzugsweise vermag die Auswerteeinrichtung von der ersten Detektoreinheit erfasste Größen automatisch auszuwerten. Dies kann analytisch und/oder statistisch erfolgen.

Die Auswerteeinrichtung kann so eingerichtet sein, dass von der ersten Detektoreinheit erfasste Größen klassifiziert werden. Dabei ist bevorzugt, dass klassifizierte Größen bzw. diese angebende Daten der Auswerteeinrichtung, wie oben ausgeführt, in den Messprozess zurück geführt werden, beispielsweise um spezielle Parametersätze der Messung zu identifizieren.

Bei einer weiteren Ausführungsform umfasst die Messeinrichtung eine Probenträgerpositioniereinheit, um Positionierungen des Probenträgers zu ermöglichen. Dabei kann die Steuereinrichtung so ausgeführt sein, dass der Probenträger mittels Steuerung der Probenträgerpositioniereinheit gemäß vorgegebener Probenträgerpositionierungsparameter automatisch positioniert und/oder bewegt werden kann.

Vorzugsweise werden als Probenträgerpositionierungsparameter solche verwendet, die umfassen:

– Bewegung des Probenträgers zur gerasterten Abtastung einer auf dem Probenträger anzuordnenden Probe durch die Messsonde, wobei Bewegungen lateral erfolgen können und/oder im Bereich zwischen 0,1 und 500 Mikrometer liegen können,
– eine maximale Zeitdauer für einen Kontakt einer auf dem Probenträger anzuordnenden Probe mit der Messsonde,
– eine maximale Kontakthäufigkeit von Kontakten einer auf dem Probenträger anzuordnenden Probe mit der Messsonde,
– eine maximale und/oder eine minimale Probenträgergeschwindigkeit für Bewegungen des Probenträgers relativ zu der Messsonde,
– ein maximaler und/oder ein minimaler Abstand zwischen einer auf dem Probenträger anzuordnenden Probe und der Messsonde,
– eine vorgegebene, zwischen einer auf dem Probenträger anzuordnenden Probe und der Messsonde konstant zu haltende Kraft, die beispielsweise im Bereich zwischen 0,1 und 3000 pN liegen kann,
– eine maximale und/oder eine minimale Zugkraft auf eine auf dem Probenträger anzuordnende Probe durch die Messsonde,
– eine maximale und/oder eine minimale Druckkraft auf eine auf dem Probenträger anzuordnende Probe durch die Messsonde,
– eine maximale und/oder eine minimale Zugkraftänderungsrate für auf eine auf dem Probenträger anzuordnenden Probe wirkende Zugkräfte durch die Messsonde,
– eine maximale und/oder eine minimale Druckkraftänderungsrate für auf eine auf dem Probenträger anzuordnenden Probe wirkende Druckkräfte durch die Messsonde,
– eine maximale und/oder eine minimale Scherkraft für auf eine auf dem Probenträger anzuordnenden Probe wirkende Zugkräfte durch die Messsonde, und/oder
– eine maximale und/oder eine minimale Scherkraftänderungsrate für auf eine auf dem Probenträger anzuordnenden Probe wirkende Scherkräfte durch die Messsonde.

Vorzugsweise umfasst die Probenträgerpositioniereinheit einen piezoelektrischen Aktuator und/oder einen Linearantrieb, der beispielsweise ein Voice-Coil-Antrieb (Schwingspulenantrieb) sein kann.

Die oben genannten Ausführungsformen der Probenträgerpositioniereinheit sorgen für eine sehr exakte Positionierung und/oder Bewegungen des Probenträgers. Die Probenträgerpositioniereinheit kann zusätzlich so ausgeführt sein, dass "gro be" Positionierungen und/oder -bewegungen des Probenträgers ermöglicht werden, beispielsweise im Bereich zwischen 100 nm und 30 cm. Der Vorteil einer solchen Probenträgerpositioniereinheit mit Grobpositionierung besteht darin, dass Vorabpositionierungen und größere Bewegungen schnell durchgeführt werden können. Exakte Positionierungen und Bewegungen können sich dann anschließen.

Vorzugsweise sind der Probenträgerpositioniereinheit Positions- und/oder Bewegungserfassungssensoren zugeordnet, die, beispielsweise unter Verwendung eines geschlossenen Regelkreises, Informationen zur Steuerung der Probenträgerpositioniereinheit bereitstellen. Dabei können die oben genannten Positionssensoren und/oder weitere Sensoren verwendet werden.

Vorzugsweise umfasst die Messeinrichtung eine Probenkammer, in der ein Fluid aufgenommen werden kann, mit dem eine auf dem Probenträger anzuordnende Probe umgeben werden soll. Hierbei ist unter "umgeben" zu verstehen, dass wenigstens der Bereich der Probe, der untersucht werden soll, von Fluid umgeben ist, beispielsweise eine bestimmte Oberfläche der Probe. Dabei kann die Steuereinrichtung ausgeführt sein, für das jeweilig verwendete Fluid vorgegebene Fluidparameter zu überwachen und, falls erforderlich, einzustellen.

Als Fluidparameter sind beispielsweise solche vorgesehen, die umfassen:

– eine vorgegebene Temperatur,
– einen vorgegebenen Temperaturverlauf,
– einen vorgegebenen pH-Wert,
– einen vorgegebenen pH-Wertverlauf
– einen vorgegebenen Elektrolytgehalt,
– einen vorgegebenen Elektrolytgehaltverlauf,
– einen vorgegebenen Volumenstrom,
– eine vorgegebene Volumenstromänderung,
– einen vorgegebenen Fluidpegel, und/oder
– eine vorgegebene Menge an biologischen und/oder chemischen Markern.

Bei Verwendung einer vorgegebenen Menge an biologischen und/oder chemischen Markern als Fluidparameter können Mengen für Fluoreszenzmarker und/oder radioaktive Marker vorgegeben sein. Vorzugsweise werden Marker eingesetzt, die chemisch und/oder biologisch funktionalisiert sind, also hinsichtlich der jeweils zu untersuchenden Probe selektive Eigenschaften aufweisen.

Bei einer weiteren Ausführungsform ist eine Zufuhreinheit vorgesehen, mit der der Probenkammer zuzuführendes Fluid (z.B. Pufferlösung(en), Reagenz(ien)) bereitgestellt werden kann. Hierbei kann die Steuereinrichtung derart ausgelegt sein, dass die Zufuhreinheit überwacht und gegebenenfalls so gesteuert wird, dass für das jeweilige Fluid vorgegebene Randbedingungen, vorzugsweise auch deren Zusammensetzung, in der Probenkammer eingehalten werden. Beispielsweise werden automatisch bestimmte Reagenzien miteinander vermischt, um Fluidparameter wie ph-Wert, etc. einzustellen.

Vorzugsweise erlaubt die Zufuhreinheit eine Zufuhr von Fluid zu dem Probenträger in den Bereich, in dem bei Messungen Proben anzuordnen sind. Ferner ist bevorzugt, dass die Zufuhreinheit von der Steuereinrichtung automatisch gesteuert wird.

Die Zufuhreinheit kann eine Pumpe und/oder eine Multikanalpumpe umfassen.

Zur Überwachung von Fluid in der Probenkammer und/oder für das jeweilige Fluid vorgegebenen Randbedingungen eine zweite Detektoreinheit vorgesehen sein, die einen aktuellen Fluidpegel in der Probenkammer zu erfassen vermag. Dabei kann die Steuereinrichtung so ausgeführt sein, dass in Antwort auf von der zweiten Detektoreinheit erfasste Fluidpegel die erste Zufuhreinheit automatisch gesteuert wird.

Vorzugsweise ist eine Temperaturkammer vorgesehen, die wenigstens die Messsonde und den Probenträger umgibt. Ferner ist vorgesehen, dass die Temperaturkammer auch weitere Bestandteil der Messeinrichtung umgibt, wie zum Beispiel, sofern vorhanden, die Krafterzeugungseinheit, die Sondenpositioniereinheit, die Probenträgerpositioniereinheit, die Probenkammer, die erste Zufuhreinheit und/oder die im Folgenden genannte zweite Zufuhreinheit. Hierbei ist es bevorzugt, dass die Steuerung der Temperaturkammer durch die Steuereinrichtung gemäß vorgegebener Temperaturparameter erfolgt.

Vorzugsweise ist es dabei vorgesehen, dass die Steuereinrichtung die Temperaturkammer so zu steuern vermag, dass eine vorgegebene Temperatur beibehalten wird und/oder wenigstens ein vorgegebener Temperaturverlauf erreicht wird. Beispielsweise ist es möglich, dass die Steuerung der Temperaturkammer so erfolgt, dass sich konstante Temperaturzeiträume mit Zeiträumen abwechseln, in denen Temperaturänderungen erfolgen.

Insbesondere ist es bevorzugt, dass die rastersondenmikroskopische Messeinrichtung eine kraftmikroskopische Messeinrichtung ist, vorzugsweise zum Erfassen von Kraftabstandskurven. Hieraus lassen sich Erkenntnisse über Wechselwirkungen und Bindungskräfte von einzelnen Molekülen gewinnen.

Des Weiteren ist bevorzugt, dass die Messeinrichtung außerdem eine optische Detektionseinheit, vorzugsweise eine auf Fluoreszenz- und/oder Durchlichtmikroskopietechnik (z.B. DIC und/oder Phasenkontrast, Hellfeld und/oder Dunkelfeld) basierende Einheit umfasst.

Die obige Aufgabe wird auch durch das erfindungsgemäße Verfahren zur Durchführung einer rastersondenmikroskopischen Messung gelöst. Das erfindungsgemäße Verfahren sowie bevorzugte Ausführungsformen derselben sind in den Verfahrensansprüchen definiert.

Kurzbeschreibung der Zeichnungen
In der folgenden Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen wird auf die beigefügten Zeichnungen Bezug genommen, von denen zeigen:
1 eine schematische Darstellung des Prinzip eines Rasterkraftmikroskops (AFM),
2 veranschaulicht schematisch eine Ausführungsform 1 der erfindungsgemäßen Vorrichtung zur Rastersondenmikroskopie, und
3 zeigt eine Abbildung einer Messsondenanordnung zur Verwendung bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung.
Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen
Wie in 2 gezeigt, umfasst die Ausführungsform 1 eine rastersondenmikroskopische Messeinrichtung 2, wie etwa eine atomare kraftmikrokopische Messeinrichtung (AFM), die eine Messsonde 4 für rasterkraftmikroskopische bzw. kraftmikroskopische Messungen und einen Probenträger 6 umfasst, auf dem zur Durchführung einer Messung eine biologische Probe 8 angeordnet ist.
Die Messsonde 4 ist als Cantilever aufgebaut, der als federelastische Einheit der Messsonde 4 dient und an seinem freien Ende baueinheitlich integriert oder damit verbunden eine Sondenspitze (nicht bezeichnet) aufweist. Die Darstellung von 2 zeigt lediglich eine Messsonde. Allerdings ist es vorgesehen, mehr als eine Messsonde 4 in der Messeinrichtung 2 zu verwenden.
Insbesondere kann die Messeinrichtung 2 zwei, vier, sechs, acht und bis zu hundert und mehr Messsonden 4 aufweisen. Zum Aufbau mehrerer in der Messeinrichtung 2 zu verwendenden Messsonden können beispielsweise sogenannte Cantilever-Chips verwendet werden.
3 zeigt eine elektronenmikroskopische Aufnahme eines Cantilever-Chips, der acht federelastische Einheiten 4₁ , ... 4₈ in Form von Cantilever aufweist. Unter Verwendung nanotechnologischer Ansätze sind derartige Chips mit hundert und mehr Cantilever möglich.
In Abhängigkeit von einer zu analysierenden Probe und in Abhängigkeit der jeweiligen Analyse kann es erforderlich sein, die Messsonde 4 in Schwingungen mit einer vorgegebenen Amplitude zu versetzen. Hierfür umfasst die Messeinrichtung eine mit der Messsonde 4 und insbesondere mit deren federelastischen Einheit zusammenwirkende Krafterzeugungseinheit (nicht gezeigt) auf. Die Krafterzeugungseinheit ermöglicht es beispielsweise, die Messsonde 4 derart zu bewegen, dass ein für eine Messung gewünschter Qualitätsfaktor (Q-Faktor) erreicht wird.
Ferner weist die Messeinrichtung eine Sondenpositioniereinheit (nicht gezeigt) auf, um die Messsonde 4 relativ zu der Probe 8 zu positionieren. Abhängig von der zu analysierenden Probe und der jeweiligen Analyse kann mittels der Sondenpositioniereinheit die Messsonde 4 entsprechend positioniert und bewegt werden.
Mittels einer ersten Detektoreinheit 12, die von der Messeinrichtung 2 umfasst ist oder dieser zugeordnet ist, können Positionen und Bewegungen der Messsonde 4, insbesondere relativ zu der Probe 8 erfasst werden. Die erste Detektoreinheit 12 ist als optischer Detektor aufgebaut und umfasste eine Strahlungsquelle 14, beispielsweise eine Laserlicht abgebende Strahlungsquelle, und einen Empfänger 16, der Licht der Strahlungsquelle 14 nach Wechselwirkung mit der Messsonde 4 empfängt. Die Strahlungsquelle 14 bestrahlt die Messsonde 4 beispielsweise im Bereich ihres freien Endes. Wechselwirkungen, insbesondere Reflexionen des Lichts von der Strahlungsquelle 14 werden von dem Empfänger 16 erfasst, um nach Auswertung auf Positionen und Bewegungen der Messsonde 4 zu schließen.
Die Messeinrichtung 2 weist ferner eine Probenträgerpositioniereinheit 10 auf, die den Probenträger baueinheitlich integriert bereitstellen oder ein Bestandteil desselben sein kann. Der Probenträger 6 und die Probenträgerpositioniereinheit 18 können auch als separate Komponenten ausgeführt sein.
Die hier vorgesehene Probenträgerpositioniereinheit 18 verwendet einen piezoelektrischen Aktuator, der Bewegungen und Positionierungen des Probenträgers 6 und damit der darauf angeordneten Probe 8 im Raum ermöglicht.
Eine Probenkammer 20 umgibt die Messsonde 4 und die Probe 8 oder wenigstens den zu untersuchenden Bereich der Probe 8, beispielsweise deren obere Oberfläche. Die Probenkammer 20 ist abgesehen von den im Folgenden beschriebenen Zu- und Ableitungen fluiddicht verschlossen und stellt somit einen gegenüber umgebenden Bereichen abgeschlossenen Raum bereit. Die Probenkammer 20 kann insgesamt zur Aufnahme von Fluid dienen oder, wie in 2 dargestellt, hierfür eine Fluidkammer 22 aufweisen, die so ausgestaltet ist, dass die Messsonde 4 und die Probe 8 oder deren zu analysierender Bereich von Fluid umgeben sind.
Mittels einer zweiten Detektoreinheit 24 kann ein Fluidpegel in der Probenkammer 20 erfasst werden. Die zweite Detektoreinheit 24 ist hier als optische Messeinheit ausgeführt, die eine Lichtquelle 26, beispielsweise in Form einer Laserlicht abgebenden Lichtquelle, und einen Empfänger 28 umfasst, der Licht von der Lichtquelle 26 nach Wechselwirkung mit Fluid in der Probenkammer 20 erhält. Aussagen über den Fluidpegel in der Probenkammer 20 sind auf der Grundlage des Lichts möglich, das der Empfänger 28 erhält.
Die Probenkammer 20 ist mit einer Zufuhrleitung 30 verbunden, über die Fluid der Probenkammer 20 zugeführt werden kann. Über eine Abfuhrleitung 32 kann Fluid von der Probenkammer 20 entfernt werden.
Die Zufuhrleitung 30 ist eingangsseitig mit einer Zufuhreinheit 34 verbunden, über die einzelne, mehrere, gemischte und vermengte Fluide der Zufuhrleitung 30 und damit der Probenkammer 20 zugeführt werden können. Die Zufuhreinheit 34 umfasst hierfür eine oder mehrere Pumpen oder Multikanalpumpen und Einrichtungen (nicht gezeigt), um Fluide zu vermischen und zu vermengen. Über Speiseleitung 36₁ ... 36_n erhält die Zufuhreinheit 34 aus Fluidreservoirs (nicht dargestellt) unterschiedliche Fluide. Bei der Ausführungsform 1 werden über die Zufuhreinheit 34 beliebige, bei einer Analyse der Probe 8 gewünschte und/oder erforderliche Fluide zugeführt, wie zum Beispiel Pufferlösungen und Reagenzstoffe.
Die Messeinrichtung 2 und die weiter oben beschriebenen Komponenten der Ausführungsform 1 abgesehen von den mit den Speiseleitungen 36₁ , ... 36_n verbundenen Fluidquellen und Teilen der Speiseleitungen 36₁ , ..., 36_n sind von einer Temperaturkammer 38 umgeben. Die Temperaturkammer 38 sorgt für einen wenigstens hinsichtlich der Temperatur dichten Abschluss gegenüber der Umgebung.
Die Ausführungsform 1 weist ferner eine Steuereinrichtung 40 und eine Auswerteeinrichtung 42 auf.
Die Steuereinrichtung 40 dient zur Steuerung der in der Temperaturkammer 38 angeordneten Komponenten sowie der Temperaturkammer 38 selbst. In 2 sind stellvertretend für hierfür erforderliche Verbindungen Verbindungen 44 und 46 zwischen der Steuereinrichtung 40 und der Zufuhreinheit 34 bzw. der Probenträgerpositioniereinheit 18 dargestellt.
Die Auswerteeinrichtung 42 erhält von allen von der Temperaturkammer 38 umschlossenen Komponenten, soweit dafür ausgelegt, und von der Temperaturkammer 38 selbst Daten, Messsignale und dergleichen, um den jeweiligen aktuellen Betriebszustand bzw. aktuelle Messergebnisse ermitteln und auswerten zu können. Stellvertretend für hierfür erforderliche Verbindungen sind in 2 Verbindungen 48. 50 und 52 zwischen der Auswerteeinrichtung 42 und der Zufuhreinheit 34, der Probenträgerpositioniereinheit 18 und der zweiten Detektoreinheit 24 gezeigt.
Des Weiteren umfasst die Ausführungsform 1 eine Datenspeichereinrichtung 54, die mit der Steuereinrichtung 40 und der Auswerteeinrichtung 42 verbunden ist. Die Datenspeichereinrichtung 54 dient zur Speicherung aktueller von der Auswerteeinrichtung 42 erhaltener Daten, Messsignale und dergleichen, aktueller von der Auswerteeinrichtung 42 bereitgestellter Daten, Parameter, die von der Steuereinrichtung 40 zur Steuerung der Ausführungsform 1 verwenden werden können sowie weitere, im Folgenden beschriebene Daten.
Insbesondere ist die Datenspeichereinrichtung 54 so eingerichtet, dass sie als Datenbank verwendet wird, in der mit der Ausführungsform 1 erfasste, ausgewertete Daten und Daten Dritter gespeichert werden können.
Bei Durchführung einer rastersondenmikroskopischen Messung steuert die Steuereinrichtung 40 neben dem eigentlichen kraftspektroskopischen Experiment auch alle experimentellen Bedingungen, wie Temperatur, den für die Probe 8 wirksamen pH-Wert, das oder die mit der Probe 8 zusammenwirkende Elektrolyte sowie die Zugabe pharmazeutischer, biochemischer und chemischer Reagenzien. Des Weiteren überprüft die Steuereinrichtung 40 zu vorbestimmten Zeitpunkten, in vorbestimmten Zeitintervallen oder laufend für die Messung wirksame Parameter und Randbedingungen und steuert die Messung derart, dass Vorgaben für die Messung eingehalten werden.
Die Auswerteeinrichtung 42 analysiert die bei der Messung mittels der Messsonde 4 erfassten Kraftspektren hinsichtlich der Probe 8 und kann die Kraftspektren analysieren. In Abhängig keit davon ist es möglich, beispielsweise beim Erreichen eines Sollwerts, die laufende Messung zu beenden und eine neue Messung mit geänderten Vorgaben (z.B. Umgebungsbedingungen) einzuleiten. Die Steuereinrichtung 40 und die von der Auswerteeinrichtung 42 bereitgestellten Daten ermöglichen es auch, iterative Messzyklen durchzuführen, um Randbedingungen zu ermitteln, die bestimmte Wechselwirkungen begünstigen.
Während der Messung wird die Messsonde 4 über die Probe 8 gerastert, wobei anhand von Wechselwirkungen zwischen der Messsohne 4 und der Probe 8 (biologische) Moleküle auf der Oberfläche der Probe 8 detektiert werden können. In Abhängigkeit der Ausgestaltung der Messsonde 4 und der Art der Probe 8 sind bestimmte Kontaktzeiten und/oder Kontakthäufigkeiten zwischen der Messsonde 4 und der Probe erforderlich. Diese Parameter werden von der Steuereinrichtung 40 eingestellt, überwacht und gegebenenfalls korrigiert. Hierbei kann es vorteilhaft sein, insbesondere um eine vollständig automatisierte Messung durchzuführen, die Probe 8 optimiert zu präparieren. Nähere Ausführungen hierzu finden sich im Folgenden.
Während der Messung steuert die Steuereinrichtung 40 sämtliche relevanten experimentellen Bedingungen, wie zum Beispiel maximale und/oder minimale Druck- und/oder Zugkräfte zwischen der Messsonde 4 und der Probe 8, Geschwindigkeiten, mit der Bewegungen relativ zwischen der Messsonde 4 und der Probe 8 erfolgen, die Anzahl von Messpunkten (Auflösung) und maximale und/oder minimale Abstände zwischen der Messsonde 4 und der Probe 8.
Dabei ist es möglich, Messungen durchzuführen, bei denen einzelne, mehrere oder alle experimentellen Bedingungen konstant gehalten und/oder systematisch und/oder chaotisch verändert werden. So ist es beispielsweise möglich, eine Messung durchzuführen, bei der abgesehen von der Zuggeschwindigkeit der Messsonde 4 alle experimentellen Bedingungen konstant gehalten werden.
Sobald beispielsweise eine vorgegebne Anzahl (z.B. tausend) an Messungen an einer einzelnen Probe aufgenommen sind, können die erhaltenen Daten einem Datensatz zugeordnet werden. Weitere Datensätze können dann bei geänderten experimentellen Bedingungen erstellt und miteinander verglichen werden. Dies ermöglicht es, unterschiedliche biologische und/oder medizinisch relevante experimentelle Bedingungen hinsichtlich ihres Einflusses auf molekulare Wechselwirkungen zu analysieren.
Eine Größe, die Analysen von biologischen Proben beeinflussen können, sind thermische Änderungen. Um insbesondere die thermische Drift bei Änderungen experimenteller Bedingungen, wie zum Beispiel Änderungen hinsichtlich mit der Probe 8 zusammenwirkender Pufferlösungen, zu minimieren, ist die Temperaturkammer 38 vorgesehen. Des Weiteren kann ein Heiz- bzw. Kühlelement (z.B. Peltier-Element) verwendet werden, um die Temperatur der Probe 8 selbst zu steuern. Ein solches Heiz- bzw. Kühlelement kann beispielsweise unter dem Probenträger 6 angeordnet sein.
Biomolekulare Wechselwirkungen hängen in der Regel stark von. den vorherrschenden physiologischen Umgebungsbedingungen ab. Diese sollten daher während einer Messung kontrolliert und so gesteuert werden, dass gewünschte Umgebungsbedingungen eingehalten bzw. native Zustände der Probe 8 stimuliert werden. So ist es beispielsweise vorgesehen, während einer Messung den Pegel einer in der Probenkammer 20 vorhandenen Pufferlösung mittels des zweiten Detektorsystems 24 zu vorbestimmten Zeitpunkten, in vorgegeben Zeitintervallen oder laufend zu kontrollieren und gegebenenfalls die Zufuhreinheit 34 so zu betreiben, dass ein gewünschter Pegel aufrecht erhalten oder erreicht wird. Auf diese Weise ist es beispielsweise möglich, während einer Messung eine Verringerung des Pufferpegels aufgrund von Verdunstung zu kompensieren; auch pH-Schwankungen sowie Änderungen hinsichtlich verwendeter Elektrolyte und anderer mit der Probe 8 zusammenwirkender Stoffe können so kon trolliert und gegebenenfalls gesteuert werden. Durch eine geeignete Steuerung von Pufferlösungen in der Probenkammer 20 kann auch ein Austrocknen und Entsalzen verhindert werden.
Bei der Steuerung von in der Probenkammer 20 vorliegenden Pufferlösungen kann es zu Fluidbewegungen, beispielsweise Wirbel, führen, die die Messung beeinflussen können. Beispielsweise können Fluidbewegungen in der Probenkammer 20 Schwingungen der Messsonde 4 bewirken. Um dies zu verhindern, ist es vorgesehen, dass die Steuereinrichtung 40 eine laufende Messung unterbricht, wenn mit derartigen Störungen zur rechnen ist und/oder derartige Störungen von der Auswerteinrichtung 42 detektiert oder vorhergesagt werden.
Die Geschwindigkeit, mit der eine Messung durchgeführt werden kann, spielt eine wesentliche Rolle. Allerdings können schnellere Messungen deren Qualität beeinflussen. Um eine hohe Messqualität bei hoher Messgeschwindigkeit zu erreichen, erlaubt die Erfindung, die Messsonde 4 mit größeren Geschwindigkeiten zu bewegen und/oder zu positionieren. Dabei ist es vorgesehen, während einer Messung an unterschiedlichen und/oder gleichen Messpunkten unterschiedliche Geschwindigkeiten zur Bewegung und/oder Positionierung der Messsonde 4 zu verwenden. Dies ermöglicht es beispielsweise aus bei unterschiedlichen Geschwindigkeiten erfassten Kraftspektren (z.B. Kraftabstandskurven) detailliertere Aussagen über molekulare Wechselwirkungen zu machen. Ferner können Messungen optimiert werden, indem die Auflösung, mit der Kraftspektren erfasst werden, erhöht wird. Dies kann dadurch erreicht werden, dass die kleinste Kraft, die von der Messsonde 4 detektiert werden kann, minimiert wird. Die kleinste detektierbare Kraft hängt unter anderem von der federelastischen Eigenschaft der Messsonde 4 ab. Um möglichst kleine detektierbare Kräfte zu erreichen, ist es daher vorgesehen, Messsonden zu verwenden, die möglichst weiche federelastische Eigenschaften aufweisen und eine hohe Resonanzfrequenz aufweisen.
Eine weitere Möglichkeit besteht darin, die Ziehgeschwindigkeiten der Messsonde, zu erhöhen. Hohe Geschwindigkeiten können insbesondere hydrodynamische Strömungen und daraus resultierende unerwünschte Bewegungen der Messsonde 4 verursachen. Im Ergebnis können bei hohen Zielgeschwindigkeiten erhöhte Rauschanteile in den Messdaten auftreten, wodurch die Sensitivität hinsichtlich geringer Kräfte zwischen Messsonde 4 und Probe 8 verschlechtert wird. Dies kann durch die Verwendung von Messsonden vermieden werden, die eine möglichst kurze Länge insgesamt oder einen möglichst kurzen elastischen Bereich aufweisen. Derartige Messsonden zeigen ein gegenüber herkömmlichen Messsonden deutlich verbessertes hydrodynamisches Verhalten und erlauben deutlich erhöhte Ziehgeschwindigkeiten. Allerdings werden derartige Messsonden geringer ausgelenkt. Daher wird bei der Erfindung als Detektorsystem 12 ein möglich hochauflösendes optisches Detektorsystem mit spezieller Optik verwendet.
Um neben statischen auch dynamische rastersondenmikroskopische Messungen durchzuführen, wird die Messsonde 4 während einer Messung in Schwingungen mit geringer Amplitude (z.B. 0,1–10 nm) versetzt. Eine Schwierigkeit bei dynamischen rastersondenmikroskopischen Messungen besteht darin, dass die von Pufferfluid umgebenen Messsonden üblicherweise niedrige Qualitätsfaktoren (Q-Faktoren) haben. Üblicherweise werden molekulare Wechselwirkungen über Resonanzverschiebungen bzw. Resonanzmaxima der Messsonde erfasst. Resonanzeigenschaften der Messsonde sind proportional zum Q-Faktor, wobei ein geringer Q-Faktor zu einem breiten Resonanzmaximum führt. Daher ist die Sensitivität der Kraftdetektion bei geringem Q-Faktor gering. Des Weiteren beeinflussen dissipative Wechselwirkungen, beispielsweise hervorgerufen durch hydrodynamische Strömungen von einem die Messsonde umgebenden Fluids, federelastische Eigenschaften der Messsonde (z.B. Dämpfungskonstante). Bei der Ausführungsform 1 ist es vorgesehen, den Q-Faktor dadurch zu erhöhen, dass mittels einer positiven Rückkopplungsschleife eine externe Kraft an die Messsonde 4 angelegt wird. Dadurch kann der Q- Faktor um drei und mehr Größenordnungen verbessert werden, wobei die Kraftsensibilität im Bereich von wenigen pN liegt.
Für eine automatisierte Analyse von Messergebnissen ist es vorgesehen, während einer Messung einzelne Kraftkurven unter Verwendung der Auswerteeinrichtung 42 zu analysieren. Zur statistischen Analyse kann dabei wie folgt vorgegangen werden:
Zunächst werden die Kraftkurven so verarbeitet, dass sie miteinander verglichen werden können. Dies kann beispielsweise durch Festlegung einer gemeinsamen Nulllinie (Referenzwerte) und einer entsprechenden Verschiebung und/oder Streckung der einzelnen Kraftkurven erfolgen.
Danach kann die gesamte Messung statistisch analysiert werden, um beispielsweise bei gefalteten Proteinen Einblick in die Wahrscheinlichkeitsverteilung einzelner Entfaltungsvorgänge und für Entfaltungen erforderliche Kräfte zu erhalten.
Ferner können die Kraftkurven klassifiziert, einander zu überlagert und gemittelt werden. Zur Klassifizierung von Kraftkurven kann beispielsweise die Länge der jeweiligen Kraftkurve und die Anzahl und Position dort vorhandener Kraftmaxima herangezogen werden. Die Länge einer Kraftkurve gibt an, über welchen Bereich Wechselwirkungen auftreten. Die Anzahl und Position von Kraftmaxima erlaubt Aussagen über kollektive und/oder singuläre Wechselwirkungsvorgänge. Über eine Klassifizierung von Kraftkurven können Informationen, insbesondere grafisch visualisierbare Informationen, über unterschiedliche Wechselwirkungsprozesse erhalten werden.
Durch Mittelung von einer Klasse zugeordneten Kraftspektren wird das Rauschen der einzelnen Kraftkurven reduziert. Dadurch werden die eigentlichen Wechselwirkungsvorgänge, die durch die Kraftkurven jeweils für sich betrachtet beschrieben werden, ersichtlich. Ferner können Aussagen über mögliche Variationen der Wechselwirkungsvorgänge auf der Grundlage von Standardab weichungen gemittelter Kraftspektren gemacht werden.
Eine Klassifikation von Kraftkurven, die Mittelung von Kraftkurven einer gemeinsamen Klasse und damit von einander verwandten oder untereinander vergleichbaren Wechselwirkungsvorgängen sowie eine nachfolgende statistische Analyse erlauben Vergleiche von Wechselwirkungsvorgängen verschiedener Proben bei gleichen experimentellen Bedingungen und gleichen oder vergleichbaren Proben bei gleichen experimentellen Bedingungen. So können mit der Ausführungsform 1 beispielsweise drei Mutanten desselben Rezeptors, die sich in einer Punktmutation unterscheiden, anhand ihrer Wechselwirkungsspektren identifiziert und mit einander verglichen werden. Auch können Aussagen über den Einfluss von Mutationen auf lokale Wechselwirkungen eines Proteins sowie des Proteins mit anderen Molekülen gemacht werden.
Mittels der Datenspeichereinrichtung 54 ist es möglich, eine Datenbank für Kraftspektren zu erstellen, um beispielsweise typische Wechselwirkungsvorgänge unterschiedlicher Proben und unterschiedlicher experimenteller Bedingungen zu charakterisieren. Für Zugriffe auf eine Datenbank der Datenspeichereinrichtung 54 ist es vorgesehen, unterschiedliche Suchstrategien zu verwenden. Beispielsweise können Strukturdaten eines entfalteten Proteins verwendet werden, um strukturell verwandte Proteine zu lokalisieren und deren Entfaltungswege zu vergleichen. Um unterschiedliche Entfaltungsspektren zu vergleichen, ist es möglich, mittels der Auswerteeinrichtung 42 auch Daten der Datenspeichereinrichtung auszuwerten, um beispielsweise verschiedene Kraftspektren zu überlagern und zu vergleichen. Dies erlaubt es, Aussagen über Abhängigkeiten von Wechselwirkungsvorgängen von experimentellen Bedingungen zu machen. Auch können Wechselwirkungsvorgänge unterschiedlicher Proben dahingehend beurteilt werden, ob deren Wechselwirkungsvorgänge auf vergleichbare, ähnliche oder gleiche Eigenschaften der Proben hindeuten.
Des Weiteren ist es vorgesehen, Datenbankzugriffe in Abhängigkeit von Kräften, physiologischen Abhängigkeiten, Wechselwirkungsspektren und experimentellen Bedingungen zu ermöglichen.

Claims

Vorrichtung zur Rastersondenmikroskopie, mit: – einer rastersondenmikroskopischen Messeinrichtung (2), die eine Messsonde (4) für rastersondenmikroskopische Messungen und einen Probenträger zur Anordnung einer rastersondenmikroskopisch zu vermessenden Probe umfasst, – einer Steuereinrichtung (40), die systemintegriert mit der rastersondenmikroskopischen Messeinrichtung (2) verbunden ist, wobei die Steuereinrichtung (40) eingerichtet ist, die Messeinrichtung (2) zur Durchführung einer rastersondenmikroskopischen Messung gemäß vorgegebener Steuerungsparameter automatisch zu steuern, und/oder – einer Auswerteeinrichtung (42), die systemintegriert mit der rastersondenmikroskopischen Messeinrichtung (2) verbunden ist, wobei die Auswerteeinrichtung (42) eingerichtet ist, Messungen mittels der rastersondenmikroskopischen Messeinrichtung (2) gemäß vorgegebener Auswertungsparameter automatisch auszuwerten, – wobei die Steuer- und/oder Auswerteeinrichtung eingerichtet ist/sind, um Messungen der Steuer- und/oder Auswerteeinrichtung angebende Daten zu erhalten und diese zur Bestimmung von Steuerungs- und/oder Auswertungsparametern in eine laufende Messung zurückzuführen.
Vorrichtung nach Anspruch 1, mit – einer Datenspeichereinrichtung zur Speicherung der von der Auswerteeinrichtung (42) durch Auswertung von Messungen mittels der rastersondenmikroskopischen Messeinrichtung (2) erzeugten Daten.
Vorrichtung nach Anspruch 2, bei der – die Dateneinspeichereinrichtung zur Speicherung der vorgegebenen Steuerungsparameter und/oder von bei der Messung vorliegenden Messbedingungen in Zuordnung zu den entsprechenden von der Auswerteeinrichtung (42) erzeugten Daten ausgelegt ist.
Vorrichtung nach einem der vorherigen Ansprüche, bei der – die Messsonde (4) eine federelastische Einheit umfasst, und – die Auswerteeinrichtung (42) eingerichtet ist, auf die Messsonde (4) wirkende Kräfte auszuwerten.
Vorrichtung nach Anspruch 4, bei der – die Messeinrichtung (2) eingerichtet ist, Wechselwirkungen zwischen der Messsonde (4) und der Probe mittels eines optischen Messsystems und/oder über piezoelektrische Effekte und/oder magnetische Wechselwirkungen zu erfassen.
Vorrichtung nach Anspruch 4, mit – einer Einheit zur Erzeugung eines auf die Messsonde (4) wirkenden Lichtfeldes und/oder elektrischen Feldes und/oder magnetischen Feldes.
Vorrichtung nach Anspruch 6, bei der die Felderzeugungseinheit statische und/oder dynamische Felder zu erzeugen vermag.
Vorrichtung nach mindestens einem der Ansprüche 4 bis 7, bei der – die federelastische Einheit eine Feder und/oder einen Ausleger umfasst.
Vorrichtung nach mindestens einem der Ansprüche 4 bis 8, bei der – die Steuereinrichtung (40) eingerichtet ist, die federelastische Einheit so zu steuern, dass die Messsonde (4) mit einer vorgegebenen Amplitude in Schwingung versetzt wird.
Vorrichtung nach mindestens einem der Ansprüche 4 bis 9, mit – einer mit der federelastischen Einheit zusammenwirkenden Krafterzeugungseinheit, wobei – die Steuereinrichtung (40) eingerichtet ist, die Krafter zeugungseinheit automatisch so zu steuern, dass eine zur Änderung eines für die Messsonde (4) wirksamen Q-Faktors geeignete Kraft an das federelastische Element angelegt wird.
Vorrichtung nach Anspruch 9 oder 10, bei der – die Auswerteeinrichtung (42) eingerichtet ist, Schwingungsänderungen in Form von Resonanzverschiebungen und/oder Amplitudenänderungen der Messsonde (4) zu erfassen.
Vorrichtung nach einem der vorherigen Ansprüche, bei der – die Messeinrichtung (2) eine Sondenpositioniereinheit zur Positionierung der Messsonde (4) in allen Translations- und Rotationsachsen des Raumes umfasst, und – die Steuereinrichtung (40) eingerichtet ist, die Messsonde (4) durch Steuerung der Positioniereinheit gemäß vorgegebener Sondenpositionierungsparameter automatisch zu positionieren und/oder zu bewegen.
Vorrichtung nach Anspruch 12, bei der die Steuereinrichtung (40) eingerichtet ist, die Sondenpositioniereinheit gemäß vorgegebener Sondenpositionierungsparameter der Steuerungsparametergruppe zu steuern, die umfasst: – Bewegungen der Messsonde (4) zur gerasterten Abtastung einer auf dem Probenträger anzuordnenden Probe, – Bewegungen der Messsonde (4) in vertikaler Richtung, – Bewegungen der Messsonde (4) in vertikaler Richtung in Abhängigkeit von einem vorgegebenen minimalen Abstand zwischen Messsonde (4) und Probe, – eine maximale Zeitdauer für einen Kontakt der Messsonde (4) mit einer auf dem Probenträger anzuordnenden Probe, – eine maximale Kontakthäufigkeit von Kontakten der Messsonde (4) mit einer auf dem Probenträger anzuordnenden Probe, – eine maximale und/oder eine minimale Messsondengeschwindigkeit für Bewegungen der Messsonde (4) relativ zu einer auf dem Probenträger anzuordnenden Probe, – eine konstante Messsondengeschwindigkeit, – eine konstante Messsondengeschwindigkeitsänderung, – ein maximaler und/oder ein minimaler Abstand zwischen der Messsonde (4) und einer auf dem Probenträger anzuordnenden Probe, – eine vorgegebene, zwischen der Messsonde (4) und einer auf dem Probenträger anzuordnenden Probe konstant zu haltende Kraft, – eine maximale und/oder eine minimale Zugkraft der Messsonde (4) auf eine auf dem Probenträger anzuordnende Probe, – eine maximale und/oder eine minimale Druckkraft der Messsonde (4) auf eine auf dem Probenträger anzuordnende Probe, – eine maximale und/oder eine minimale Zugkraftänderungsrate für von der Messsonde (4) auf eine auf dem Probenträger anzuordnenden Probe wirkende Zugkräfte, – eine maximale und/oder eine minimale Druckkraftänderungsrate für von der Messsonde (4) auf eine auf dem Probenträger anzuordnenden Probe wirkende Druckkräfte, – eine maximale und/oder eine minimale Scherkraft der Messsonde (4) auf eine auf dem Probenträger anzuordnende Probe, und/oder – eine maximale und/oder eine minimale Scherkraftänderungsrate für von der Messsonde (4) auf eine auf dem Probenträger anzuordnenden Probe wirkende Scherkräfte.
Vorrichtung nach einem der vorherigen Ansprüche, mit – einer ersten Detektoreinheit zur Detektion von Positionen der Messsonde (4) und/oder Bewegungen der Messsonde (4) und/oder auf die Messsonde (4) wirkenden Kräften, wobei – die Steuereinrichtung (40) eingerichtet ist, die erste Detektoreinheit gemäß vorgegebener Detektionsparameter automatisch zu steuern.
Vorrichtung nach Anspruch 14, bei der – die erste Detektoreinheit Positionssensoren zur Detektion von Positionen und/oder Bewegungen der Messsonde (4) umfasst.
Vorrichtung nach Anspruch 14 oder 15, bei der – die Steuereinrichtung (40) eingerichtet ist, die erste De tektoreinheit gemäß vorgegebener Detektionsparameter der Steuerungsparametergruppe zu steuern, die umfasst: – eine vorgegebene Detektionsrate, und/oder – eine Häufigkeit, mit der Detektionen für Positionen der Messsonde (4) und/oder Bewegungen der Messsonde (4) und/oder auf die Messsonde (4) wirkende Kräfte durchzuführen sind.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 14 bis 16, bei der – die Auswerteeinrichtung (42) eingerichtet ist, von der ersten Detektoreinheit erfasste Positionen und/oder Bewegungen und/oder Kräfte automatisch auszuwerten.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 14 bis 17, bei der – die Auswerteeinrichtung (42) eingerichtet ist, von der ersten Detektoreinheit erfasste Positionen und/oder Bewegungen und/oder Kräfte zu klassifizieren.
Vorrichtung nach einem der vorherigen Ansprüche, bei der – die Messeinrichtung (2) eine Probenträgerpositioniereinheit zur Positionierung des Probenträgers umfasst, und – die Steuereinrichtung (40) eingerichtet ist, den Probenträger mittels Steuerung der Probenträgerpositioniereinheit gemäß vorgegebener Probenträgerpositionierungsparameter automatisch zu positionieren und/oder zu bewegen.
Vorrichtung nach Anspruch 19, bei der die Steuereinrichtung (40) eingerichtet ist, die Probenträgerpositioniereinheit gemäß vorgegebener Probenträgerpositionierungsparameter der Steuerungsparametergruppe zu steuern, die umfasst: – Bewegungen des Probenträgers zur gerasterten Abtastung einer auf dem Probenträger anzuordnenden Probe durch die Messsonde (4), – eine maximale Zeitdauer für einen Kontakt einer auf dem Probenträger anzuordnenden Probe mit der Messsonde (4), – eine maximale Kontakthäufigkeit von Kontakten einer auf dem Probenträger anzuordnenden Probe mit der Messsonde (4), – eine maximale und/oder eine minimale Probenträgergeschwin digkeit für Bewegungen des Probenträgers relativ zu der Messsonde (4), – ein maximaler und/oder ein minimaler Abstand zwischen einer auf dem Probenträger anzuordnenden Probe und der Messsonde (4), – eine vorgegebene, zwischen einer auf dem Probenträger anzuordnenden Probe und der Messsonde (4) konstant zu haltende Kraft, – eine maximale und/oder eine minimale Zugkraft auf eine auf dem Probenträger anzuordnende Probe durch die Messsonde (4), – eine maximale und/oder eine minimale Druckkraft auf eine auf dem Probenträger anzuordnende Probe durch die Messsonde (4), – eine maximale und/oder eine minimale Zugkraftänderungsrate für auf eine auf dem Probenträger anzuordnenden Probe wirkende Zugkräfte durch die Messsonde (4), – eine maximale und/oder eine minimale Druckkraftänderungsrate für auf eine auf dem Probenträger anzuordnenden Probe wirkende Druckkräfte durch die Messsonde (4), – eine maximale und/oder eine minimale Scherkraft für auf eine auf dem Probenträger anzuordnenden Probe wirkende Zugkräfte durch die Messsonde (4), und/oder – eine maximale und/oder eine minimale Scherkraftänderungsrate für auf eine auf dem Probenträger anzuordnenden Probe wirkende Scherkräfte durch die Messsonde (4).
Vorrichtung nach Anspruch 19 oder 20, bei der – die Probenträgerpositioniereinheit einen piezoelektrischen Aktuator und/oder einen Linearantrieb umfasst.
Vorrichtung nach einem der vorherigen Ansprüche, mit – einer die Messsonde (4) und den Probenträger umgebendenden Temperaturkammer, wobei – die Steuereinrichtung (40) eingerichtet ist, die Temperaturkammer gemäß vorgegebener Temperaturparameter zu steuern.
Vorrichtung nach Anspruch 22, bei der – die Steuereinrichtung (40) eingerichtet ist, die Temperaturkammer so zu steuern, dass eine vorgegebene Temperatur beibehalten wird oder wenigstens ein vorgegebener Temperaturverlauf erreicht wird.
Vorrichtung nach einem der vorherigen Ansprüche, bei der – die rastersondenmikroskopische Messeinrichtung (2) eine rasterkraftmikroskopische Messeinrichtung (2) ist.
Vorrichtung nach einem der vorherigen Ansprüche, bei der – die Messeinrichtung (2) eine optische Detektionseinheit umfasst.
Verfahren zur Durchführung einer rastersondenmikroskopischen Messung, mit folgenden Schritten: – Vorgeben von Steuerungsparametern und/oder Auswertungsparametern für die rastersondenmikroskopische Messung, – Anordnen einer rastersondenmikroskopisch zu vermessenden Probe auf einem von einer Messeinrichtung (2) umfassten Probenträger und Durchführen der rastersondenmikroskopischen Messung unter Verwendung einer von der Messeinrichtung (2) umfassten Messsonde (4), – wobei die Messeinrichtung (2) zur Durchführung der rastersondenmikroskopischen Messung gemäß den vorgegebenen Steuerungsparametern von einer Steuereinrichtung (40) automatisch gesteuert wird, und/oder die rastersondenmikroskopische Messung gemäß den vorgegebenen Auswertungsparametern von einer Auswerteeinrichtung (42) automatisch ausgewertet wird, und – Messungen der Mess- und/oder Auswerteeinrichtung (42) angebende Daten in das Messverfahren zurückgeführt werden, um Steuerungs- und/oder Auswertungsparameter für das Verfahren zu ermitteln.
Verfahren nach Anspruch 26, bei dem – durch Auswertung von der Auswerteeinrichtung (42) erzeugte Daten automatisch in einer Datenspeichereinrichtung gespeichert werden.
Verfahren nach Anspruch 27, bei dem – die vorgegebenen Steuerungsparameter und/oder von bei der rastersondenmikroskopischen Messung vorliegende Messbedingungen in Zuordnung zu den entsprechenden von der Auswerteeinrichtung (42) erzeugten Daten automatisch in der Datenspeichereinrichtung gespeichert werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 26 bis 28, bei dem – auf die Messsonde (4) wirkende Kräfte von der Auswerteeinrichtung (42) ausgewertet werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 26 bis 29, bei dem – die Messsonde (4) unter Steuerung der Steuereinrichtung (40) mit einer vorgegebenen Amplitude in Schwingung versetzt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 26 bis 30, bei dem – eine zur Änderung eines für die Messsonde (4) wirksamen Q-Faktors geeignete Kraft unter Steuerung der Steuereinrichtung (40) der Messsonde (4) zugeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 30 oder 31, bei dem – für die Messsonde (4) wirksame Schwingungsänderungen mittels der Auswerteeinrichtung (42) erfasst werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 26 bis 32, bei dem – die Messsonde (4) gemäß vorgegebener Sondenpositionierungsparameter von der Steuereinrichtung (40) automatisch positioniert und/oder bewegt wird.
Verfahren nach Anspruch 33, bei dem die Positionierung und/oder Bewegung der Messsonde (4) gemäß vorgegebener Sondenpositionierungsparameter der Steuerungsparametergruppe durchgeführt wird, die umfasst: – Bewegungen der Messsonde (4) zur gerasterten Abtastung einer auf dem Probenträger anzuordnenden Probe, – Bewegungen der Messsonde (4) in vertikaler Richtung, – eine maximale Zeitdauer für einen Kontakt der Messsonde (4) mit einer auf dem Probenträger anzuordnenden Probe, – eine maximale Kontakthäufigkeit von Kontakten der Messsonde (4) mit einer auf dem Probenträger anzuordnenden Probe, – eine maximale und/oder eine minimale Messsondengeschwindigkeit für Bewegungen der Messsonde (4) relativ zu einer auf dem Probenträger anzuordnenden Probe, – eine konstante Messsondengeschwindigkeit, – eine konstante Messsondengeschwindigkeitsänderung, – ein maximaler und/oder ein minimaler Abstand zwischen der Messsonde (4) und einer auf dem Probenträger anzuordnenden Probe, – eine vorgegebene, zwischen der Messsonde (4) und einer auf dem Probenträger anzuordnenden Probe konstant zu haltende Kraft, – eine maximale und/oder eine minimale Zugkraft der Messsonde (4) auf eine auf dem Probenträger anzuordnende Probe, – eine maximale und/oder eine minimale Druckkraft der Messsonde (4) auf eine auf dem Probenträger anzuordnende Probe, – eine maximale und/oder eine minimale Zugkraftänderungsrate für von der Messsonde (4) auf eine auf dem Probenträger anzuordnenden Probe wirkende Zugkräfte, und/oder – eine maximale und/oder eine minimale Druckkraftänderungsrate für von der Messsonde (4) auf eine auf dem Probenträger anzuordnenden Probe wirkende Druckkräfte.
Verfahren nach einem der Ansprüche 26 bis 34, bei dem – Positionen der Messsonde (4) und/oder Bewegungen der Messsonde (4) und/oder auf die Messsonde (4) wirkende Kräfte mittels einer ersten Detektoreinheit detektiert werden, und – die erste Detektoreinheit gemäß vorgegebener Detektionsparameter von der Steuereinrichtung (40) automatisch gesteuert wird.
Verfahren nach Anspruch 35, bei dem das Detektieren von Positionen der Messsonde (4) und/oder Bewegungen der Messsonde (4) und/oder auf die Messsonde (4) wirkenden Kräften gemäß vorgegebener Detektionsparameter der Steuerungsparametergruppe durchgeführt wird, die umfasst: – eine vorgegebene Detektionsrate, und/oder – eine Häufigkeit, mit der Detektionen für Positionen der Messsonde (4) und/oder Bewegungen der Messsonde (4) und/oder auf die Messsonde (4) wirkende Kräfte durchzuführen sind.
Verfahren nach Anspruch 35 oder 36, bei dem – detektierte Positionen und/oder Bewegungen und/oder Kräfte automatisch von der Auswerteeinrichtung (42) ausgewertet werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 26 bis 37, bei dem – detektierte Positionen und/oder Bewegungen und/oder Kräfte automatisch von der Auswerteeinrichtung (42) klassifiziert werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 26 bis 38, bei dem – der Probenträger mittels Steuerung einer Probenträgerpositioniereinheit durch die Steuereinrichtung (40) gemäß vorgegebener Probenträgerpositionierungsparameter automatisch positioniert und/oder bewegt wird.
Verfahren nach Anspruch 39, bei dem die Steuerung der Probenträgerpositioniereinheit gemäß vorgegebener Probenträgerpositionierungsparameter der Steuerungsparametergruppe durchgeführt wird, die umfasst: – Bewegungen des Probenträgers zur gerasterten Abtastung einer auf dem Probenträger anzuordnenden Probe durch die Messsonde (4), – eine maximale Zeitdauer für einen Kontakt einer auf dem Probenträger anzuordnenden Probe mit der Messsonde (4), – eine maximale Kontakthäufigkeit von Kontakten einer auf dem Probenträger anzuordnenden Probe mit der Messsonde (4), – eine maximale und/oder eine minimale Probenträgergeschwindigkeit für Bewegungen des Probenträgers relativ zu der Mess sonde (4), – ein maximaler und/oder ein minimaler Abstand zwischen einer auf dem Probenträger anzuordnenden Probe und der Messsonde (4), – eine vorgegebene, zwischen einer auf dem Probenträger anzuordnenden Probe und der Messsonde (4) konstant zu haltende Kraft, – eine maximale und/oder eine minimale Zugkraft auf eine auf dem Probenträger anzuordnende Probe durch die Messsonde (4), – eine maximale und/oder eine minimale Druckkraft auf eine auf dem Probenträger anzuordnende Probe durch die Messsonde (4), – eine maximale und/oder eine minimale Zugkraftänderungsrate für auf eine auf dem Probenträger anzuordnenden Probe wirkende Zugkräfte durch die Messsonde (4), und/oder – eine maximale und/oder eine minimale Druckkraftänderungsrate für auf eine auf dem Probenträger anzuordnenden Probe wirkende Druckkräfte durch die Messsonde (4).
Verfahren nach einem der Ansprüche 26 bis 40, bei dem – eine die Messsonde (4) und den Probenträger umgebendende Temperaturkammer von der Steuereinrichtung (40) gemäß vorgegebener Temperaturparameter gesteuert wird.
Verfahren nach Anspruch 41, bei dem – die Temperaturkammer so gesteuert wird, dass eine vorgegebene Temperatur beibehalten wird oder wenigstens ein vorgegebener Temperaturverlauf erreicht wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 26 bis 42, bei dem – als rastersondenmikroskopische Messung eine rasterkraftmikroskopische Messung durchgeführt wird.