DE102007020302A1 - Improved three-dimensional biocompatible scaffold structure that incorporates nanoparticles - Google Patents

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Zellkultursystem, das eine dreidimensionale biokompatible Gerüststruktur und biokompatible Nanopartikel umfasst, ein Verfahren zur Kultivierung von Zellen, die Bereitstellung von Zellen oder Zellprodukten und Geweben sowie von Zellen oder Zellprodukten und Geweben an sich mittels eines solchen Zellkultursystems.The invention relates to a cell culture system comprising a three-dimensional biocompatible scaffold structure and biocompatible nanoparticles, a method of culturing cells, providing cells or cell products and tissues and cells or cell products and tissues per se by means of such a cell culture system.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Zellkultursystem, das eine dreidimensionale biokompatible Gerüststruktur und Nanopartikel beinhaltet. Weiterhin umfasst die vorliegende Erfindung auch Verfahren zur Herstellung eines solchen Zellkultursystems sowie Verfahren zur Kultivierung von Zellen mittels dieses Zellkultursystems.The The present invention relates to a cell culture system comprising a three-dimensional biocompatible scaffold structure and nanoparticles. Furthermore, the present invention also includes methods of preparation of such a cell culture system as well as methods of cultivation of cells by means of this cell culture system.

Zellen werden in vivo von einer komplexen, dynamischen Mikroumwelt umgeben, die insbesondere aus der extrazellulären Matrix (ECM), Wachstumsfaktoren, Cytokinen und benachbarten Zellen besteht. Die extrazelluläre Matrix ist in allen vier Grundgewebetypen, nämlich Epithel-, Muskel-, Nerven- sowie Binde- und Stützgewebe vorhanden. Neben ihrer Funktion als Stützgerüst, die lange Zeit als Hauptaufgabe gesehen wurde, dient die ECM vor allem einem interaktiven Signalaustausch durch Transmembranrezeptoren der Zellen. Durch diese Form der Kommunikation wirkt sie sich auch auf die Regulation der Genexpression aus. Dies spielt eine wichtige Rolle bei essentiellen Zelleigenschaften, wie Adhäsion, Proliferation, Differenzierung, Migration, Apoptose und Umbauprozessen. Die ECM stellt kein statisches System dar, vielmehr befinden sich die Komponenten der ECM in einem „Fließgleichgewicht". Komponenten der ECM werden von Zellen in den Interzellularraum (der Raum zwischen den Zellen) sezerniert und synthetisiert, können aber auch gleichzeitig wieder von den Zellen abgebaut werden. Die extrazelluläre Matrix besteht aus drei Hauptkomponenten: Kollagenfasern, Ankerproteine und raumfüllende Kohlenhydrate. Die Basalmembran ist eine Proteinschicht, die als spezialisierte extrazelluläre Matrix angesehen werden kann. Sie stellt eine stabilisierende Schicht dar und grenzt Oberflächenepithelien gegenüber dem Bindegewebe ab. Da durch wird verhindert, dass die Zellen dieser Schichten auseinander gleiten.cell are surrounded in vivo by a complex, dynamic microenvironment, in particular from the extracellular matrix (ECM), Growth factors, cytokines and adjacent cells. The extracellular Matrix is present in all four basic tissue types, namely epithelial, Muscle, nerve and connective and supporting tissue available. In addition to its function as a scaffold, the long Time was seen as the main task, the ECM serves one thing above all interactive signal exchange through transmembrane receptors of the cells. By This form of communication also affects regulation gene expression. This plays an important role in essential Cell properties, such as adhesion, proliferation, differentiation, Migration, apoptosis and remodeling processes. The ECM does not provide static System, rather, the components of the ECM are in a "steady state". Components of the ECM are transferred from cells to the intercellular space (the Space between the cells) can be secreted and synthesized but at the same time be degraded by the cells again. The Extracellular matrix consists of three main components: Collagen fibers, anchor proteins and space-filling carbohydrates. The basement membrane is a protein layer that is considered specialized Extracellular matrix can be considered. She poses a stabilizing layer, bordering surface epithelia from the connective tissue. Because it prevents that the cells of these layers slide apart.

Eine Komponente der extrazellulären Matrix stellen faserbildende Proteine dar. Kollagene sind dabei die vorherrschende Proteinfamile der ECM. Sie bilden verschiedene Arten von Fasern und sind in fast jedem Gewebe vorhanden. Große Teile der ECM werden von dem fibrillären Kollagen Typ 1 gebildet, während in der Basalmembran Kollagen vom Typ IV eine wichtige Rolle spielt. Elastische Fasern setzen sich aus den Proteinen Fibrillin und Elastin zusammen. Innerhalb der ECM stellen Kohlenhydrate eine weitere wichtige Komponente dar. Darunter zählen auch Glycosaminoglykane (GAG). Glycosaminoglykane sind Proteine, die mit langkettigen Polysacchariden bestimmter Einzelbausteine assoziiert sind. Lagern sich Glycosaminoglykane zu größeren Makromolekülen zusammen, so entstehen Proteoglykane. Wesentliche Merkmale und Eigenschaften der ECM ergeben sich aus der Vielfalt und den Interaktionen von Proteinen, Glycosaminoglykanen und Proteoglykanen. Weitere Kohlenhydratkomponenten der ECM stellen Hyaluronsäure, Heparansulfat, Dermatansulfat, Chondroitinsulfat und Keratansulfat dar.A Component of the extracellular matrix constitute fiber-forming Proteins. Collagens are the predominant protein family the ECM. They form different types of fibers and are in almost every tissue available. Large parts of the ECM are from the fibrillar collagen type 1 is formed while in the basement membrane type IV collagen plays an important role. Elastic fibers consist of the proteins fibrillin and elastin together. Within the ECM, carbohydrates make another important Component. Among these include glycosaminoglycans (GAG). Glycosaminoglycans are proteins that are linked to long-chain polysaccharides certain individual modules are associated. Store glycosaminoglycans together to larger macromolecules, this is how proteoglycans are formed. Essential features and properties of ECM result from the diversity and interactions of proteins, Glycosaminoglycans and proteoglycans. Other carbohydrate components the ECM provide hyaluronic acid, heparan sulfate, dermatan sulfate, Chondroitin sulfate and keratan sulfate.

Eine weitere kennzeichnende Komponente der extrazellulären Matrix sind Adhäsionsproteine. Adhäsionsproteine, Adpaterproteine oder andere adhäsive Proteine können zum einen mit anderen Bestandteilen der Matrix, zum anderen aber auch mit weiteren Zellen durch Anheftung an bestimmte Zellrezeptoren interagieren. Beispiele für Adhäsionsproteine stellen die Proteinfamilie der Laminine, Vitronektin und Fibronektin dar.A another characteristic component of the extracellular matrix are adhesion proteins. Adhesion proteins, Adipater proteins or other adhesive proteins can, on the one hand with other components of the matrix, but also with other cells by attachment to specific cell receptors interact. Examples of adhesion proteins represent the protein family of laminins, vitronectin and fibronectin.

Die Basalmembran als spezialisierte extrazelluläre Matrix enthält verschiedene wesentliche Komponenten. Als erstes sind hierbei Kollagene vom Typ I bis IV zu nennen, wobei Typ IV eine besondere Bedeutung zukommt. Laminine stellen einen weiteren Bestandteil der Basalmembran dar. Sie besitzen eine schwertähnliche Form. Ihre Enden sind mit Zellrezeptoren besetzt, die hauptsächlich an Integrine binden. Laminin 1 ist die wichtigste Adhäsionskomponente, weiterhin kommt Laminin 5 als entscheidender Bestandteil der Basalmembran besondere Bedeutung zu. Eine besondere Bedeutung kommt Entactin (Nidogen) als weitere Komponente der Basalmembran zu, da es die Kollagenschichten mit den Lamininschichten verbindet. Schließlich werden durch Proteoglykane wie Perlecan die einzelnen Komponenten der Basalmembran verknüpft, da Perlecan in seiner Struktur Bindungsstellen für Kollagen, Laminin, Nidogen und sich selbst aufweist.The Basement membrane as a specialized extracellular matrix different essential components. First, here are collagens Type I to IV to call, with type IV is of particular importance. Laminins are another component of the basement membrane. They have a sword-like shape. Their ends are occupied with cell receptors, mainly integrins tie. Laminin 1 is the most important adhesive component, Furthermore, laminin 5 is a crucial component of the basement membrane special importance. Of particular importance is entactin (Nidogen) as another component of the basement membrane too, as it is the Collagen layers connects with the laminin layers. After all become the individual components by proteoglycans like Perlecan linked to the basement membrane, since Perlecan in its structure Binding sites for collagen, laminin, nidogen and itself itself has.

Zuletzt sind als weitere wichtige Elemente der extrazellulären Matrix Zellrezeptoren zu nennen. Zellmembranproteine wie die Integrinfamilie spielen in diesem Zusammenhang für die Zelladhäsion eine entscheidende Rolle. Integrine sind heterodimere Proteine, die aus verschiedenen alpha- und beta-Untereinheiten aufgebaut sein können. Je nach Zusammensetzung der alpha- beziehungsweise beta-Untereinheiten der Integrine können diese an die extrazelluläre Matrix, so zum Beispiel an Laminin, Vitronektin oder Fibronektin binden.Last are considered as more important elements of the extracellular Call matrix cell receptors. Cell membrane proteins such as the integrin family play in this context for cell adhesion a crucial role. Integrins are heterodimeric proteins, which may be composed of different alpha and beta subunits can. Depending on the composition of the alpha- or Beta subunits of the integrins can bind these to the extracellular Matrix, for example on laminin, vitronectin or fibronectin tie.

Für die Kultivierung von Zellen ist es ein Ziel, die extrazelluläre Matrix als natürliche Umgebung der Zellen möglichst genau nachzubilden. Neben den Bestandteilen der extrazellulären Matrix ist es auch wünschenswert, weitere biologisch bedeutsame Stoffe wie Wachstumsfaktoren gezielt in diese ECM-Strukturen einbringen zu können.For The cultivation of cells makes it an extracellular target Matrix as natural environment of the cells as possible to reproduce exactly. In addition to the components of extracellular Matrix also desires more biologically significant Introduce substances such as growth factors into these ECM structures to be able to.

Bisher findet die Kultivierung von primären Zellen, die aus Gewebe isoliert werden, häufig in mit Kunststoff beschichteten Zellkulturgefäßen statt. Diese Umgebung entspricht jedoch nicht den natürlichen, physiologischen Bedingungen der Zellen und führt deshalb sehr oft zum Funktionsverlust, zur Dedifferenzierung der Zellen und schlimmstenfalls zum Zelltod. Bisher bekannte Verbesserungen der Zellkulturgefäße bestehen darin, die Oberfläche mit einzelnen natürlichen Bestandteilen der extrazellulären Matrix wie Kollagenfasern oder Fibronektin zu beschichten. Diese werden jedoch nicht spezifisch an den Zelltyp angepasst und sind zudem undefiniert aufgetragen. Bekannt ist auch die Kultivierung von Zellen in wirkstoffhaltigen gelartigen Strukturen. Als nachteilig erweist sich unter anderem, dass die Wirkstoffe unkontrolliert bei einem gegebenenfalls erforderlich werdendem Mediumwechsel herausgewaschen werden.So far finds the cultivation of primary cells from tissue be isolated, often in plastic-coated Cell culture vessels instead. This environment corresponds but not the natural, physiological conditions cells and therefore often leads to loss of function, for dedifferentiation of the cells and in the worst case for cell death. Previously known improvements of cell culture vessels consist in the surface with individual natural Components of the extracellular matrix such as collagen fibers or to coat fibronectin. However, these are not specific adapted to the cell type and are also applied undefined. Also known is the cultivation of cells in active ingredient gel-like structures. A disadvantage is, inter alia, that the active ingredients may be uncontrolled if necessary be washed out the changing medium.

Des weiteren besteht die Möglichkeit, Zellen in Zellkulturmedien zu kultivieren, in denen die Wirkstoffe bereits in gelöster Form vorliegen. Die Wirkstoffe stehen somit zwar den Zellen unmittelbar zur Verfügung, jedoch besteht ein Nachteil darin, dass diese unter Umständen schnell verbraucht werden und ihre Konzentration den jeweiligen Differenzierungs- und Wachstumsphasen der kultivierten Zellen nicht kontrolliert angepasst werden können.Of There is also the possibility of using cells in cell culture media to cultivate in which the active ingredients are already dissolved in Form present. The active ingredients are therefore the cells directly available, but there is a disadvantage that These may be consumed quickly and theirs Concentration of the respective differentiation and growth phases the cultured cells can not be adjusted in a controlled manner.

Aus der DE 10144252 A1 und der DE 10031859 A1 sind Nanopartikel und deren Anwendung für Identifizierungs- und Screeningverfahren bekannt. Gemäß dieser Offenbarungen können die Nanopartikel auch bestimmte biologisch aktive Substanzen erkennen oder trägem.From the DE 10144252 A1 and the DE 10031859 A1 are known nanoparticles and their use for identification and screening methods. According to these disclosures, the nanoparticles may also recognize or be inert to certain biologically active substances.

Zur Herstellung von Nanopartikeln stellt die Emulsionspolymerisation ein Spezialverfahren der Polymerisation dar, bei dem wasserunlösliche Monomere mit Hilfe von Emulgatoren in Wasser emulgiert und unter Verwendung wasserlöslicher Initiatoren, zum Beispiel Kaliumpersulfat, polymerisiert werden. Die bei der Emulsionspolymerisation anfallenden Polymerdispersionen, zum Beispiel Latex-Dispersionen, können für eine Vielzahl von Anwendungen eingesetzt werden. Die US 4,521,317 und US 4,021,364 zeigen Möglichkeiten und Grenzen der Emulsionspolymerisation auf.For the preparation of nanoparticles, emulsion polymerization is a special method of polymerization in which water-insoluble monomers are emulsified in water with the aid of emulsifiers and polymerized using water-soluble initiators, for example potassium persulfate. The polymer dispersions obtained in the emulsion polymerization, for example latex dispersions, can be used for a large number of applications. The US 4,521,317 and US 4,021,364 show possibilities and limits of emulsion polymerization.

Im Rahmen von Emulsionspolymerisationen können grundsätzlich zwei Typen von Emulsionen eingesetzt werden: die Öl-in-Wasser-Emulsion und die Wasser-in-Öl-Emulsion, auch inverse Emulsion genannt. In beiden Fällen wird ein im Reaktionsmedium unlösliches Monomer unter Rühren mittels Emulgatorzugabe dispergiert und die Reaktion durch Zugabe eines Initiators gestartet.in the The scope of emulsion polymerizations can basically two types of emulsions are used: the oil-in-water emulsion and the water-in-oil emulsion, also called inverse emulsion. In both cases, an insoluble in the reaction medium Monomer dispersed with stirring by emulsifier and the reaction started by addition of an initiator.

Der vorliegenden Erfindung liegt das technische Problem zugrunde, ein Zellkultursystem bereitzustellen, das zum einen der nativen extrazellulären Matrix als natürliche Umgebung der Zellen sehr nahe kommt und zum anderen die kontrollierte Zufuhr von Wachstumsfaktoren und Cytokinen ermöglicht, um das Zellwachstum und die Zelldifferenzierung gezielt steuern und auch gewebespezifisch anpassen zu können. Weiterhin liegt der vorliegenden Erfindung das technische Problem zugrunde, Zellen, insbesondere auch Gewebe und Organe bereitzustellen, die für Transplantationen geeignet sind. Darüber hinaus besteht auch ein Bedarf an speziellen Geweben im Rahmen des sogenannten Tissue engineering sowie für Forschungszwecke.Of the The present invention is based on the technical problem To provide a cell culture system that is one of the native extracellular Matrix as the natural environment of the cells comes very close and secondly, the controlled intake of growth factors and cytokines allows for cell growth and cell differentiation to be able to control specifically and also to adapt tissue-specifically. Furthermore, the present invention is the technical problem to provide cells, especially tissues and organs, which are suitable for transplants. About that There is also a need for special fabrics in the context of the so-called tissue engineering as well as for research purposes.

Die vorliegende Erfindung löst das ihr zugrundeliegende technische Problem durch die Bereitstellung eines Zellkultursystems, das eine dreidimensionale biokompatible Gerüststruktur sowie biokompatible Nanopartikel umfasst, sowie durch ein Verfahren zur Kultivierung von Zellen, durch die Bereitstellung von Zellen oder Zellprodukten und Gewebe sowie von Zellen oder Zellprodukten und Gewebe an sich mittels eines solchen Zellkultursystems.The The present invention solves the underlying technical Problem by providing a cell culture system that has a three-dimensional biocompatible scaffold structure and biocompatible Nanoparticles includes, as well as by a method of cultivation of cells, by providing cells or cell products and tissues and cells or cell products and tissue per se by means of such a cell culture system.

Die vorliegende Erfindung stellt demgemäß ein Zellkultursystem bereit, das es ermöglicht, Zellen, insbesondere eukaryotische Zeilen, in besonders bevorzugter Ausführungsform tierische oder menschliche Zellen, unter Bedingungen zu kultivieren, die der in vivo-Situation oder einer erwünschten künstlich ausgerichteten Umgebung entspricht.The The present invention accordingly provides a cell culture system ready, which allows cells, especially eukaryotic Lines, in a particularly preferred embodiment animal or human cells, to cultivate under conditions that in vivo situation or a desired artificial aligned environment corresponds.

Die Erfindung beruht insbesondere darauf, dass ein Zellkultursystem bereitgestellt, welches gemeinsam mit einer dreidimensionalen biokompatiblen Gerüststruktur vorliegende biokompatible Nanopartikel aufweist. Ein derartiges System erlaubt es, die in ihm kultivierten Zellen Einflüssen und Bedingungen auszusetzen, die gezielt durch die Anwesenheit der Nanopartikel gesetzt werden und, je nach Zielsetzung der Kultivierung, die Zellen in ihrem biologischen Verhalten, z. B. Wachstums- oder Differenzierungsverhalten beeinflussen. In besonders bevorzugter Ausführungsform können die Nanopartikel Wirkstoffe aufweisen, zum Beispiel, indem sie diese auf der Oberfläche oder im Nanopartikel selbst eingeschlossen aufweisen. Selbstverständlich kann auch vorgesehen sein, dass die Wirkstoffe sowohl auf der Oberfläche als auch im Inneren der Nanopartikel vorliegen. Die auf diese Art und Weise mit den Nanopartikeln verbundenen Wirkstoffe werden im Verlauf des mit dem Zellkultursystem durchgeführten Zellkulturverfahrens kontrolliert und/oder reguliert, insbesondere zeitlich verzögert freigesetzt, und können so dosiert und über einen längeren Zeitraum hinweg kontrolliert den Zellen zugeführt werden. Durch die Kopplung der Nanopartikel mit beispielsweise Wachstumsfaktoren wird so eine gezielte Abgabe dieser Wachstumsfaktoren über einen definierten Zeitraum gewährleistet.In particular, the invention is based on the provision of a cell culture system which has biocompatible nanoparticles present together with a three-dimensional biocompatible scaffold structure. Such a system makes it possible to expose the cells cultivated in it influences and conditions that are set by the presence of the nanoparticles and, depending on the purpose of cultivation, the cells in their biological behavior, eg. B. influence growth or differentiation behavior. In a particularly preferred embodiment, the nanoparticles can comprise active substances, for example by having them enclosed on the surface or in the nanoparticle itself. Of course, it can also be provided that the active ingredients are present both on the surface and in the interior of the nanoparticles. In this way, the active ingredients associated with the nanoparticles are in the course controlled by the cell culture system carried out cell culture and / or regulated, in particular released delayed, and can be dosed and fed over a longer period of time controlled the cells. Coupling the nanoparticles with, for example, growth factors thus ensures targeted delivery of these growth factors over a defined period of time.

Es konnte gezeigt werden, dass Nanopartikel, zum Beispiel aus polymeren Material, als Träger von zum Beispiel Wachstumsfaktoren überraschende Vorteile aufweisen. So kontrollieren Nanopartikel, insbesondere polymere Nanopartikel, als Träger die kontrollierte, d. h. mit einer bestimmten, in der Regel verzögerten Freigabekinetik erfolgende Freigabe von Wirkstoffen, beispielsweise Cytokinen. Dieser Effekt wird auch als controlled release bezeichnet. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist vorgesehen, dass die Freigabe der Wirkstoffe vorbestimmbar in Abhängigkeit von der Zeit reguliert wird und so eine erwünschte und bestimmte Wirkstoff-Freigabe-Kinetik bereitgestellt wird. Erfindungsgemäß kann vorgesehen sein, dass eine erwünschte Wirkstoff-Freigabe-Kinetik durch Auswahl des Nanopartikel-Materials derart ausgestaltet ist, dass eine Freigabe des Wirkstoffs zellspezifisch erfolgt. Beispielsweise kann eine auf die gesamte Freigabedauer bezogene konstante Freisetzungsrate des Wirkstoffs erfolgen. Selbstverständlich kann auch vorgesehen sein, beispielsweise in einer ersten Phase eine zunächst initial geringe Wirkstofffreigaberate und eine nach einem bestimmten Zeitpunkt einsetzende erhöhte Freisetzungsrate vorzusehen. Die Erfindung sieht in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform auch vor, in einer initialen ersten Phase eine vergleichsweise hohe Freisetzungsrate des Wirkstoffes vorzusehen, die nach einem bestimmten Zeitpunkt von einer geringeren Freisetzungsrate abgelöst wird. Durch die Verwendung geeigneter Polymermaterialien zur Herstellung des Nanopartikels ist es erfindungsgemäß auch möglich, zu einem bestimmten Zeitpunkt im Rahmen eines Zellkulturverfahrens eine erwünschte hohe Konzentration eines Wirkstoffes aus dem Nanopartikel in Form eines burst-Effektes freizusetzen. Die Nanopartikel können in bevorzugter Ausführungsform eine solche Wirkstoffbeladung aufweisen, dass die Wirkstoffkonzentration in einem bevorzugten Bereich von 1 ng/ml bis 10 μg/ml nach der Freisetzung liegt.It could be shown that nanoparticles, for example, from polymeric Material, as a carrier of, for example, growth factors surprising Have advantages. So control nanoparticles, in particular polymeric nanoparticles, as the carrier which controlled, d. H. with a certain, usually delayed release rate successful release of active substances, for example cytokines. This Effect is also referred to as controlled release. In a preferred Embodiment of the present invention is provided that the release of the active ingredients predeterminable depending is regulated by the time and so a desired and certain drug release kinetics is provided. According to the invention be provided that a desired drug release kinetics by selecting the nanoparticle material in such a way, that a release of the active ingredient is cell-specific. For example can be a constant release rate related to the total release time of the active ingredient. Of course, also provided be, for example, in a first phase an initially initially low drug release rate and one after a certain Timing to provide increased release rate. The invention provides in a further preferred embodiment also, in an initial first phase, a comparatively high Release rate of the drug to be provided after a certain Time replaced by a lower release rate becomes. By the use of suitable polymer materials for the production of the nanoparticle, it is according to the invention also possible, at a given time in the context of a Cell culture process a desired high concentration an active substance from the nanoparticle in the form of a burst effect release. The nanoparticles can in a preferred embodiment have such a drug loading that the drug concentration in a preferred range of from 1 ng / ml to 10 μg / ml the release is.

Die Wirkstofffreigabe kann dabei sowohl durch Diffusion des Stoffes aus oder von den Nanopartikeln als auch durch Abbau des Nanopartikels selbst, zum Beispiel durch Hydrolyse des Polymeren, erfolgen.The Drug release can be achieved both by diffusion of the substance from or from the nanoparticles as well as by degradation of the nanoparticle itself, for example by hydrolysis of the polymer carried out.

Die Kombination von, insbesondere wirkstoffbeladenen, Nanopartikeln mit einer Gerüststruktur, insbesondere aus Komponenten der extrazellulären Matrix, zeigte weitere überraschende Vorteile. So ist es möglich, eine gezielte und gerichtete Differenzierung von Stammzellen zu erreichen durch Kultivierung der Zellen auf einer Gerüststruktur mit Nanopartikeln, insbesondere einer bestimmten Cytokinbeladung.The Combination of, in particular drug-loaded, nanoparticles with a framework structure, in particular of components The extracellular matrix showed more surprising Advantages. So it is possible to have a targeted and directed To achieve differentiation of stem cells through cultivation the cells on a framework structure with nanoparticles, in particular a specific cytokine loading.

Weiterhin konnte gezeigt werden, dass insbesondere primäre Zellen durch die Kultivierung in einer Matrix, enthaltend Nanopartikel, gekoppelt mit speziellen Wachstumsfaktoren, eine deutlich höhere Überlebensrate aufwiesen und somit auch eine Langzeitkultivierung dieser empfindlichen Zellen möglich wird.Farther could be shown that in particular primary cells by culturing in a matrix containing nanoparticles, coupled with specific growth factors, a significantly higher survival rate and thus also a long-term cultivation of these sensitive Cells becomes possible.

Überraschenderweise konnte gezeigt werden, dass durch die Kultivierung in dem erfindungsgemäßen Zellkultursystem eine gezielte und gerichtete Zellmigration induziert werden kann.Surprisingly could be shown that by culturing in the cell culture system according to the invention a targeted and directed cell migration can be induced.

Untersuchungen zeigten, dass insbesondere primäre Zellen, die in dem erfindungsgemäßen Zellkultursystem kultiviert wurden, überraschenderweise eine deutlich gesteigerte Proliferation aufwiesen. Darüber hinaus konnte eine deutlich verbesserte Adhäsionseigenschaft an den erfindungsgemäß modifizierten Oberflächen, das heißt dem Zellkultursystem festgestellt werden im Vergleich zu herkömmlichen Zellkulturgefäßen. Die Zellen behielten zudem ihre typischen morphologischen Eigenschaften auch nach mehrtägiger Kultivierung bei. Eine unerwünschte Dedifferenzierung der primären Zellen wird somit durch das erfindungsgemäße Zellkultursystem weitgehend verhindert.investigations showed that in particular primary cells, which are in the inventive Cell culture system were cultured, surprisingly had a significantly increased proliferation. Furthermore could have a significantly improved adhesion property the surfaces modified according to the invention, that is to say the cell culture system is established in comparison to conventional cell culture vessels. The Cells also retained their typical morphological properties even after several days of cultivation. An undesirable Dedifferentiation of the primary cells is thus accomplished the cell culture system of the invention largely prevented.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist unter dem Begriff „Zellkultursystem" ein System zur Kultivierung von Zellen zu verstehen, das insbesondere in Form der in ihm enthaltenden Gerüststruktur, Adhäsionsstellen für zu kultivierende Zellen, vorzugsweise in dreidimensional strukturiertem Aufbau, zum Beispiel als Matrix oder Hydrogel, bereitstellt. Üblicherweise ist ein solches Zellkultursystem bei seinem Gebrauch, vorzugsweise in vitro-Gebrauch, in künstlichen Behältern positioniert, die in der Lage sind, über das Zellkultursystem selbst auch die zu kultivierenden Zellen sowie ein Kulturmedium aufzunehmen.in the The scope of the present invention is defined by the term "cell culture system". to understand a system for cultivating cells, in particular in the form of the framework structure contained in it, Adhäsionsstellen for cells to be cultured, preferably in three dimensions structured structure, for example as a matrix or hydrogel provides. Usually is such a cell culture system in its use, preferably in vitro use, positioned in artificial containers, who are capable of using the cell culture system itself also to record the cells to be cultured and a culture medium.

Das Zellkultursystem der vorliegenden Erfindung ist daher insbesondere ein System zur Kultivierung von Zellen in vitro. Das erfindungsgemäße Zellkultursystem kann zur Kultivierung von Zellen in herkömmlichen Zellkulturgefäßen wie Petrischalen oder Zellkulturflaschen oder in irgendeiner anderen Form angewendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das Zellkultursystem zur Kultivierung von primären Zellen verwendet. In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass das erfindungsgemäße Zellkultursystem in vivo eingesetzt wird, z. B. in Tierexperimenten.The cell culture system of the present invention is therefore particularly a system for culturing cells in vitro. The cell culture system according to the invention can be used for culturing cells in conventional cell culture vessels such as petri dishes or cell culture bottles or in any other form. In a preferred embodiment of the present invention, the cell culture system becomes cultivated used by primary cells. In a further embodiment, it is provided that the cell culture system according to the invention is used in vivo, for. B. in animal experiments.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeutet „Gerüststruktur" eine Struktur zum Anheften von Zellen. Eine Gerüststruktur im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist insbesondere in bevorzugter Ausführung eine Struktur, die nicht allein ein oberflächliches Anhaften oder Adhärieren von Zellen gestattet, sondern darüber hinaus insbesondere auch ein Hineinwachsen oder Integrieren von Zellen in die Gerüststruktur selbst. Die Gerüststruktur stellt be vorzugt eine Matrix dar, vorzugsweise mit Poren oder Zwischenräumen. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthält diese Matrix eine oder mehrere Komponenten der extrazellulären Matrix wie Bestandteile der Basalmembran, Adhäsionsproteine, faserbildende Proteine, Kohlenhydrate, Proteoglykane oder Zellrezeptoren.in the Context of the present invention means "framework structure" a structure for attaching cells. A scaffold structure in the context of the present invention is in particular in a preferred embodiment a structure that is not just a superficial attachment or adhere cells, but above In addition, in particular, a growth or integration of Cells in the framework structure itself. The framework structure preferably represents a matrix, preferably with pores or spaces. In a preferred embodiment of the present invention contains this matrix one or more components of extracellular matrix such as constituents of the basal membrane, Adhesion proteins, fiber-forming proteins, carbohydrates, Proteoglycans or cell receptors.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ist unter einer „primären Zelle" eine eukaryotische Zelle humanen oder tierischen Ursprungs, die aus Organen oder aus einem Embryo gewonnen wird. Insbesondere ist vorzugsweise ein embryonale Stammzelle als primäre Zelle vorgesehen, vorzugsweise eine solche, die aus Nabelschnurblut gewonnen wird. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ist jedoch vorzugsweise nicht die Verwendung von humanen embryonalen Stammzellen vorgesehen. Die erfindungsgemäß eingesetzte Stammzelle kann eine totipotente, omnipotente oder pluripotente Zelle sein. Weiterhin bevorzugt ist die primäre Zelle eine adulte Stammzelle, z. B. eine tierische oder menschliche adulte Stammzelle.in the In connection with the present invention is under a "primary Cell "a eukaryotic cell of human or animal origin, which is obtained from organs or from an embryo. Especially is preferably an embryonic stem cell as primary Cell provided, preferably one consisting of umbilical cord blood is won. In the context of the present invention is however, preferably not the use of human embryonic Stem cells provided. The inventively used Stem cell can be a totipotent, omnipotent or pluripotent Be a cell. Further preferably, the primary cell is one adult stem cell, e.g. B. an animal or human adult Stem cell.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeutet „primäre Zelle" also eine eukaryotische Zelle humanen oder tierischen Ursprungs. Primäre Zellen können aus Organen, wie Haut, Niere oder Leber, oder aus ganzen Embryonen gewonnen werden. Ein Beispiel für eine erfindungsgemäß eingesetzte primäre Zelle ist ein Fibroblast. Die primäre Zelle ist bevorzugt omnipotent oder pluripotent. Eine primäre Zelle kann auch eine adulte Stammzelle sein. Die Zellen werden durch Behandlung mit Trypsin oder durch eine andere Protease behandelt und dadurch aus dem Gewebe isoliert und auch – durch Abbau von interzellulären Verbindungen wie Tight Junctions – vereinzelt. Primäre Zellkulturen von epithelialen Zellen sind ein weiteres Beispiel für primäre Zellen. Im Allgemeinen umkleiden Epithelien externe und interne Oberflächen von Geweben und Organen. Epithelzellen besitzen einen sehr hohen Differenzierungsgrad, der in der Polarisierung der Zellen mit einer apikalen und einer basolateralen Oberfläche zum Ausdruck kommt. Die verschiedenen Oberflächen nehmen unterschiedliche Funktionen wahr. So dient die apikale Oberfläche von Epithelzellen des Darms der Aufnahme von Nährstoffen, während die basolaterale Oberfläche diese Nährstoffe an das Blut weiterleitet und Verbindungen zu benachbarten Zellen sowie zur Basalmembran ausbildet. Primäre Zellen aus Blut, Knochenmark oder Milz adhärieren kaum, können jedoch dennoch in Suspension kultiviert werden. Nach der Behandlung mit Trypsin existieren darüber hinaus Methoden, um aus den isolierten primären Zellen einen gewünschten Subtyp weiter zu selektionieren. So besteht die Möglichkeit durch magnetische Zellseparierungsmethoden oder durch fluorescence activated cell sorting FACS beispielsweise aus dem Knochenmark B-Zellen als primäre Zelle zu isolieren.in the In the context of the present invention, "primary Cell "thus a eukaryotic cell of human or animal origin. Primary cells can be made up of organs, such as skin, kidney or liver, or from whole embryos. An example for an inventively used primary cell is a fibroblast. The primary Cell is preferably omnipotent or pluripotent. A primary Cell can also be an adult stem cell. The cells are going through Treatment with trypsin or treated by another protease and thereby isolated from the tissue and also - by degradation of intercellular connections such as tight junctions - isolated. Primary cell cultures of epithelial cells are another Example of primary cells. In general, clothing Epithelia external and internal surfaces of tissues and organs. Epithelial cells have a very high degree of differentiation, in the polarization of cells with an apical and a basolateral surface is expressed. The different Surfaces perceive different functions. So serves the apical surface of epithelial cells of the intestine the absorption of nutrients while the basolateral Surface passes these nutrients to the blood and forms connections to adjacent cells as well as to the basement membrane. Adhere primary cells from blood, bone marrow or spleen hardly, but can still be cultivated in suspension. After treatment with trypsin exist beyond that Methods to get a desired one out of the isolated primary cells Subtype continue to select. So there is the possibility by magnetic cell separation methods or by fluorescence activated cell sorting FACS for example from the bone marrow B cells to isolate as the primary cell.

Eine primäre Zelle kann auch eine, vorzugsweise nicht humane, embryonale Stammzelle sein, bevorzugt eine embryonale Stammzelle, die in besonders bevorzugter Ausführungsform aus Nabelschnurblut gewonnen wurde. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die embryonale Stammzelle ein Zelle, die aus einem Embryo isoliert wurde, der sich in einem Stadium bis zu acht Zellen befindet. Diese embryonale Stammzelle aus dem Achtzellstadium ist eine totipotente Zelle und lässt sich in alle Zellformen der Hauptgewebetypen also endodermal – wie Wandzellen des Verdauungstraktes –, mesodermal – wie Muskeln, Knochen, Blutzellen – und ektodermal – wie Hautzellen und Nervengewebe – differenzieren. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die embryonale Stammzelle eine Zelle, die aus einem Embryo isoliert wurde, der sich in dem Stadium der Blastozyste befindet. Diese embryonale Stammzelle aus dem Blastozystenstadium ist eine pluripotente Zelle und lässt sich in alle Arten von Körperzellen der Hauptgewebetypen, also endodermal, und ektodermal differenzieren, mit Ausnahme der Bildung von plazentalem Gewebe, das nicht mehr gebildet werden kann. Besonderes Kennzeichen von Stammzellen ist, dass diese Zellen fähig sind zum einen während der Zellteilung sich selbst zu replizieren, und damit den Pool an Stammzellen zu erhalten, und gleichzeitig eine differenzierte Zelle hervorzubringen, die dann ein geringeres Differenzierungspotential besitzt. Stammzellen grenzen sich durch sogenannte Marker von differenzierten Zellen ab. Marker können spezielle Proteine sein, die von Stammzellen verstärkt oder in geringerem Maße exprimiert werden. Für murine embryonale Stammzellen sind als Marker SSEA-1, stage-specific embryonic antigen-1, AP-Aktivität, alkalische Phosphatase-Aktivität sowie die Expression des Transkriptionsfaktors Oct-3/4 beschrieben. Die Expression der Markerproteine ist von der Herkunft der Stammzelle abhängig.A primary cell may also be one, preferably nonhuman, embryonic stem cell, preferably an embryonic stem cell, in a particularly preferred embodiment of umbilical cord blood was won. In a preferred embodiment the embryonic stem cell is a cell that is isolated from an embryo which is at one stage up to eight cells. These Embryonic stem cell from the eight-cell stage is a totipotent Cell and settles into all cell types of the main tissue types so endodermal - like wall cells of the digestive tract -, Mesodermal - like muscles, bones, blood cells - and ectodermal - such as skin cells and nerve tissue - differentiate. In a further preferred embodiment, the embryonic Stem cell a cell that has been isolated from an embryo, the is at the stage of the blastocyst. This embryonic stem cell from the blastocyst stage is a pluripotent cell and leaves into all types of body cells of the main tissue types, thus endodermal, and ectodermal differentiate, with the exception of Formation of placental tissue that can no longer be formed. Special characteristic of stem cells is that these cells are capable are to replicate themselves during cell division, and thus preserve the pool of stem cells, and at the same time to produce a differentiated cell, which then becomes a lesser Has differentiation potential. Stem cells border each other so-called markers of differentiated cells. Markers can be special proteins amplified by stem cells or to a lesser extent. For murine embryonic stem cells are SSEA-1 as marker, stage-specific embryonic antigen-1, AP activity, alkaline phosphatase activity and the expression of the transcription factor Oct-3/4 described. The expression of the marker proteins is of the origin of the stem cell dependent.

Die Erfindung betrifft jedoch auch Zellkulturverfahren und Mittel zu deren Durchführung, die nicht-embryonale Stammzellen betreffen, insbesondere verwenden. Eine adulte Stammzelle ist eine Zelle, die nach dem embryonalen Stadium entsteht. Adulte Stammzellen können aus Organen und Geweben, wie Knochenmark, Haut, Fettgewebe, Nabelschnur, Nabelschnurblut, Gehirn, Leber oder Bauchspeicheldrüse isoliert werden und sind in der Regel prädeterminiert, d. h. sie besitzen ein geringeres Differenzierungspotential und sind multi- oder unipotent. Gewöhnlich besitzen isolierte primäre Zellen aus einem Embryo oder einem adulten Säugetier nur eine sehr begrenzte Wachstumsfähigkeit. Bei humanen fetalen Zellen findet nach ihrer Isolierung und Kultivierung zunächst ein gutes Zellwachstum statt. Weiterhin können auch primäre Zellen aus Tumoren isoliert und kultiviert werden. Durch genetische Veränderungen, oncogene Transformationen, werden Regulationsmechanismen, wie Apoptose, außer Kraft gesetzt beziehungsweise positive Wachstumssignale, wie eine Überexpression von Wachstumsrezeptoren, verstärkt. Daher zeigen viele, insbesondere primäre Tumorzellen häufig ein nicht limitiertes Wachstum. Eine besondere Subpopulation von primären Zellen unter Tumorzellen stellen sogenannte Tumorstammzellen dar. Diese konnten als eine sehr kleine Zellfraktion innerhalb bestimmter Tumoren festgestellt werden. Tumorstammzellen sind aus Brustkrebstumoren isoliert und kultiviert worden. Kennzeichnende Markerproteine für diese Brustkrebsstammzellen sind eine hohe CD44-Expression, keine oder eine geringe CD24-Expression und die Abwesenheit von sogenannten Linienmarkern.However, the invention also relates to cell culture methods and means for carrying them out, the non-em concern bronchial stem cells, in particular use. An adult stem cell is a cell that arises after the embryonic stage. Adult stem cells can be isolated from organs and tissues such as bone marrow, skin, adipose tissue, umbilical cord, umbilical cord blood, brain, liver or pancreas and are usually predeterminable, ie they have a lower potential for differentiation and are multi- or unipotent. Usually isolated primary cells from an embryo or an adult mammal have only a very limited ability to grow. In human fetal cells, after their isolation and cultivation, first a good cell growth takes place. Furthermore, primary cells from tumors can be isolated and cultured. Genetic alterations, oncogenic transformations, override regulatory mechanisms such as apoptosis or potentiate positive growth signals such as overexpression of growth receptors. Thus, many, especially primary tumor cells, often show unrestricted growth. A special subpopulation of primary cells under tumor cells are so-called tumor stem cells. These could be detected as a very small cell fraction within certain tumors. Tumor stem cells have been isolated from breast cancer tumors and cultured. Characteristic marker proteins for these breast cancer stem cells are high CD44 expression, no or low CD24 expression and the absence of so-called line markers.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ist unter einer „adulten Stammzelle" insbesondere eine Zelle zu verstehen, die nach dem embryonalen Stadium entstanden ist, gegenüber ausdifferenzierten Zellen ein noch nicht ausgeschöpftes Differenzierungspotential aufweisen, prädeterminiert sind und insbesondere aus Epithelzellen, Endothelzellen, dendritischen Zellen, mesenchymalen Zellen, Adipocyten beziehungsweise insbesondere den entsprechenden Vorläuferzellen aus dem Herzen, der Muskulatur, des Fettgewebes, der Haut und dem Gehirn isoliert werden.in the In connection with the present invention is under an "adult Stem cell "in particular a cell to be understood after the embryonic Stage has emerged, compared to differentiated cells an untapped potential for differentiation have, are predeterminable and in particular epithelial cells, Endothelial cells, dendritic cells, mesenchymal cells, adipocytes or in particular the corresponding progenitor cells from the heart, the muscles, the fatty tissue, the skin and the Be isolated brain.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeutet „dreidimensional" eine räumliche Ausdehnung in alle drei Raumkoordinaten. Die Ausdehnung kann im Wesentlichen gleichmäßig in diesen drei Richtungen vorliegen, sodass zum Beispiel eine zylindrische Form, eine säulen-, quader- oder würfelförmige Matrixstruktur vorliegt. Es ist aber zum Beispiel auch möglich, dass die Ausdehnung in zwei Richtungen in größerem Ausmaß vorliegt, in die dritte Richtung jedoch nur in geringem Maße, so dass die dreidimensionale Struktur flächig wirkt, zum Beispiel eine Membran oder Schicht darstellt.in the Context of the present invention means "three-dimensional" a spatial extension into all three spatial coordinates. The expansion can be substantially uniform in these three directions, so for example, a cylindrical Shape, a columnar, cuboid or cube-shaped matrix structure is present. But it is also possible, for example, that the Expansion in two directions to a greater extent, in the third direction but only to a small extent, so that the three-dimensional structure has a planar effect, for example represents a membrane or layer.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung bedeutet der Begriff „biokompatibel", dass die Gerüststruktur und die Nanopartikel sowohl hinsichtlich ihrer Materialzusammensetzung als auch hinsichtlich ihrer Struktur in den Zellen, Geweben oder in einem Organismus, insbesondere eines Versuchstiers, keine toxische, apoptotische, unerwünschte immunologische oder sonstige unerwünschte Reaktion hervorruft und zelluläre und molekulare Prozesse auch nach einer möglichen Internalisierung der Nanopartikel oder einem Abbau der Nanopartikel und/oder Gerüststruktur nicht oder kaum stört.in the For the purposes of the present invention, the term "biocompatible" means that the framework structure and the nanoparticles both in terms of their material composition as well as their structure in the cells, tissues or in an organism, in particular one Test animals, no toxic, apoptotic, unwanted immunological or other undesirable reaction and cellular and molecular processes even after a possible Internalization of nanoparticles or degradation of nanoparticles and / or scaffolding structure does not or hardly disturbs.

Vorzugsweise sieht die Erfindung in einer besonderen Ausführungsform vor, dass die Nanopartikel bioabbaubar oder bioresorbierbar sind, das heißt durch biologische Einflüsse, insbesondere die Einwirkung der kultivierten Zellen, sukzessive abgebaut werden und dabei die vorzugsweise enthaltenen Wirkstoffe freisetzen können.Preferably sees the invention in a particular embodiment suggest that the nanoparticles are biodegradable or bioresorbable, that is, by biological influences, in particular the action of the cultured cells are gradually reduced and thereby can release the active ingredients preferably contained.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden unter Nanopartikeln Partikel verstanden, die einen Durchmesser von 1 bis 1000 nm aufweisen. Derartige Nanopartikel können aus verschiedenen Materialien aufgebaut sein, beispielsweise anorganischen oder organischen Substanzen. In bevorzugter Ausführungsform können deren Oberflächen chemisch reaktive funktionelle Gruppen umfassen, die mit komplementären funktionellen Gruppen von zu bindenden Wirkstoffen affine Bindungen, also kovalente und/oder nicht-kovalente Bindungen, eingehen und auf diese Weise die Wirkstoffe an ihren Oberflächen stabil fixieren können. Die vorliegende Erfindung sieht in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform vor, dass die Nanopartikel auch Bindungen mit der Gerüststruktur eingehen können. Derartige Bindungen sind bevorzugt elektrostatische Wechselwirkungen.in the Within the scope of the present invention, nanoparticles are particles understood, which have a diameter of 1 to 1000 nm. such Nanoparticles can be made up of different materials be, for example, inorganic or organic substances. In a preferred embodiment, their surfaces include chemically reactive functional groups that are complementary to one another functional groups of binding agents affine bonds, So covalent and / or non-covalent bonds, enter and in this way, the active ingredients on their surfaces stable can fix. The present invention is seen in a Another preferred embodiment, that the nanoparticles can also form bonds with the framework structure. Such bonds are preferably electrostatic interactions.

In einer bevorzugten Ausführungsform sieht die vorliegende Erfindung ein Zellkultursystem vor, in dem die Nanopartikel einen Durchmesser von 50 bis 1000 nm, vorzugsweise von 50 nm bis 900 nm, bevorzugt von 60 bis 600 nm, aufweisen. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sieht die vorliegende Erfindung ein Zellkultursystem vor, in dem die Nanopartikel einen Durchmesser von 80 bis 150 nm, bevorzugt von 50 bis 150 nm, aufweisen.In a preferred embodiment, the present sees Invention, a cell culture system in which the nanoparticles a Diameter from 50 to 1000 nm, preferably from 50 nm to 900 nm, preferably from 60 to 600 nm. In a further preferred Embodiment, the present invention provides a cell culture system in which the nanoparticles have a diameter of 80 to 150 nm, preferably from 50 to 150 nm.

In einer weiteren Ausführungsform ist es vorgesehen, dass das erfindungsgemäße Zellkultursystem Nanopartikel enthält, die aus anorganischen Substanzen, zum Beispiel Gold oder anderen Edelmetallen oder Metallen oder Metalloxiden, Calciumphosphat und Calciumhydrogensphosphat oder anderen Mischphosphaten, Siliziumbasierten oxidischen Materialien, wie Silicaten, Siliziumoxiden, wie Siliziumdioxid, aufgebaut sind. In bevorzugter Ausführung können die Nanopartikel auch DynaBeads sein.In a further embodiment, it is provided that the cell culture system according to the invention contains nanoparticles which consist of inorganic substances, for example gold or other noble metals or Metals or metal oxides, calcium phosphate and calcium hydrogen phosphate or other mixed phosphates, silicon-based oxidic materials, such as silicates, silicon oxides, such as silica, are constructed. In a preferred embodiment, the nanoparticles can also be DynaBeads.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, dass das erfindungsgemäße Zellkultursystem Nanopartikel enthält, die aus organischen Materialien, insbesondere organischen Polymeren, aufgebaut sind. Die Nanopartikel können bevorzugt im Wege der Emulsionspolymerisation hergestellt werden.In A preferred embodiment provides that the cell culture system according to the invention nanoparticles contains, which are made of organic materials, in particular organic polymers are constructed. The nanoparticles can preferably be prepared by way of emulsion polymerization.

Bevorzugt werden Nanopartikel in dem erfindungsgemäßen Zellkultursystem eingesetzt, die aus bioabbaubaren Polymeren aufgebaut sind. Weiterhin bevorzugt ist auch eine Verwendung von Nanopartikeln, die einen Durchmesser von 50 nm und eine bioabbaubare Matrix aufweisen.Prefers become nanoparticles in the cell culture system according to the invention used, which are composed of biodegradable polymers. Farther Also preferred is a use of nanoparticles containing a Diameter of 50 nm and a biodegradable matrix.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist es vorgesehen, dass das erfindungsgemäße Zellkultursystem Nanopartikel enthält, die aus Polylactiden (PLA), Poly(lactid-co-glycolid)en (PLGA), Poly caprolactonen (PCL), Polyglycoliden, Di- und Tri-Block-Polymeren bspw. PCL/PGA-Di-Block-Systemen, Polyorthoestern (POE), Polyanhydride, Polyhydroxyalkanoaten (PHA), Polypyrrolen (PPy), Polypropylencarbonat, Polyethylencarbonat, Polyalkylcyanonitril oder Polyethylenglycol aufgebaut sind.In a further preferred embodiment it is provided that the cell culture system according to the invention nanoparticles which consists of polylactides (PLA), poly (lactide-co-glycolide) s (PLGA), polycaprolactones (PCL), polyglycolides, di- and tri-block polymers eg PCL / PGA-Di-Block systems, polyorthoesters (POE), polyanhydrides, Polyhydroxyalkanoates (PHA), polypyrroles (PPy), polypropylene carbonate, polyethylene carbonate, Polyalkylcyanonitrile or polyethylene glycol are constructed.

Bevorzugt ist vorgesehen, dass die Nanopartikel je nach gewünschtem Freisetzungsprofil des Wirkstoffs Polymere mit unterschiedlichem Molekulargewicht und variabler Polarität aufweisen. Die Auswahl des für den Aufbau des Nanopartikels einzusetzenden Materials kann in bevorzugter Ausführungsform danach erfolgen, in welcher Form und Kinetik der Wirkstoff freigesetzt werden soll.Prefers is provided that the nanoparticles depending on the desired Release profile of the active ingredient polymers with different Having molecular weight and variable polarity. The Selection of the structure to be used for the nanoparticle Material can be done in a preferred embodiment after in which form and kinetics the active ingredient is to be released.

Insbesondere sieht die Erfindung eine bevorzugte Ausführungsform vor, gemäß der ein Nanopartikel aus verschiedenen Materialien, insbesondere verschiedenen Polymeren, aufgebaut ist, um so eine besonders hohe Variabilität bei der Steuerung des Freisetzungsprofils des freizusetzenden Wirkstoffs erzielen zu können. In einer weiteren Ausführungsform kann selbstverständlich auch vorgesehen werden, dass das erfindungsgemäße Zellkultursystem Nanopartikel aus verschiedenen Materialien aufweist, die in weiter bevorzugter Ausführung wiederum unterschiedliche Wirkstoffe aufweisen. Auch auf diese Art und Weise kann eine zeitlich und/oder räumlich spezifisch definierte Freisetzung von Wirkstoffen erfolgen.Especially the invention provides a preferred embodiment, according to a nanoparticles of different materials, In particular, various polymers, is constructed so as to a particularly high variability in the control of the release profile of the active ingredient to be released. In a another embodiment can of course also be provided that the inventive Cell culture system has nanoparticles of different materials, in turn, in a further preferred embodiment different Have active ingredients. Also in this way can be a time and / or Spatially specifically defined release of active substances respectively.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist also vorgesehen, dass die Nanopartikel Träger von mindestens einem Wirkstoff sind. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung werden unter Wirkstoffen solche Stoffe verstanden, die eine Wirkung auf die zu kultivierenden Zellen ausüben. Bevorzugt sind als derartige Wirkstoffe solche Stoffe, die an der Regulation von Wachstums- und Differenzierungsprozessen der zu kulti vierenden Zellen beteiligt sind, insbesondere kontrollieren, regulieren, determinieren, initiieren oder finalisieren diese Wirkstoffe Wachstums- und Differenzierungsprozesse. Derartige Wirkstoffe können auch an Migrations-, Invasions-, Redifferenzierungs- oder Teilungsvorgängen beteiligt sein. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind die Wirkstoffe solche, die in einer gewünschten und bestimmten besonderen Applikationskinetik den zu kultivierenden Zellen zugeführt werden sollen.In a particularly preferred embodiment of the present invention The invention is therefore intended that the nanoparticles carrier of at least one active substance. In the context of the present invention are understood as active ingredients such substances that have an effect on the cells to be cultivated. Preferred are as such active ingredients such substances that are involved in the regulation of Growth and differentiation processes of the cells to be cultivated involved, in particular to control, regulate, determine, These agents initiate or finalize growth and differentiation processes. Such agents may also be involved in migration, invasion, Redifferentiation or division processes involved. In In a particularly preferred embodiment, the active ingredients those that are in a desired and particular particular Application kinetics supplied to the cells to be cultivated should be.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist es vorgesehen, dass das Zellkultursystem Nanopartikel enthält, die in der Gerüststruktur eingeschlossene und/oder auf ihrer Oberfläche aufgebrachte Wirkstoffe aufweisen.In Another preferred embodiment of the present invention Invention, it is provided that the cell culture system nanoparticles contains the trapped in the framework structure and / or have applied to their surface active ingredients.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist vorgesehen, dass zum Einschluss von Wirkstoffen, beispielsweise Wachstumsfaktoren, die Wasser-in-Öl-in-Wasser-Technik als bevorzugtes Verfahren zur Herstellung von wirkstoffbeladenen Nanopartikeln, insbesondere PLA- und PLGA-Partikeln, eingesetzt wird.In Another preferred embodiment of the present invention The invention provides that for the inclusion of active ingredients, for example Growth factors, the water-in-oil-in-water technique as preferred process for the preparation of active ingredient-loaded nanoparticles, especially PLA and PLGA particles.

Weiterhin bevorzugt sieht die vorliegende Erfindung dabei ein Zellkultursystem vor, in dem die in die Nanopartikel eingeschlossenen Wirkstoffe Wachstumsfaktoren, Cytokine, Zelladhäsionsproteine wie Integrine, Farbstoffe wie Fluorescenamine, Chemokine, Vitamine, Mineralstoffe, Fette, Proteine, Nährstoffe, faserbildende Proteine, Kohlenhydrate, Adhäsionsproteine, Zellrezeptoren, Pharmazeutika, DNA, RNA, Aptamere, angiogene Faktoren, Lektine, Antikörper, Antikörperfragmente oder Inhibitoren sind.Farther The present invention preferably sees a cell culture system in which the active ingredients included in the nanoparticles Growth factors, cytokines, cell adhesion proteins such as Integrins, dyes such as fluoresceneamines, chemokines, vitamins, Minerals, fats, proteins, nutrients, fiber-forming Proteins, Carbohydrates, Adhesion Proteins, Cell Receptors, Pharmaceuticals, DNA, RNA, aptamers, angiogenic factors, lectins, Antibodies, antibody fragments or inhibitors are.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist vorgesehen, dass das Zellkultursystem Nanopartikel enthält, die Stabilisatoren aufweisen. Bevorzugt stellen dabei die Stabilisatoren Kohlenhydrate, zum Beispiel Trehalose, Proteine, Polyethylenglycole oder Detergentien dar.In a preferred embodiment of the present invention it is envisaged that the cell culture system contains nanoparticles, having the stabilizers. Preference is given to the stabilizers Carbohydrates, for example trehalose, proteins, polyethylene glycols or detergents.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist es vorgesehen, dass das Zellkultursystem Nanopartikel enthält, die durch Kopplung mit funktionellen Gruppen funktionalisiert worden sind. In besonders bevorzugter Ausführungsform ist vorgesehen, dass die Nanopartikel selbst funktionelle Gruppen auf ihrer Oberfläche aufweisen.In Another preferred embodiment of the present invention Invention, it is provided that the cell culture system nanoparticles containing functionalized by coupling with functional groups have been. In a particularly preferred embodiment provided that the nanoparticles themselves functional groups have their surface.

Die vorliegende Erfindung sieht insbesondere vor, dass auf der Oberfläche der Nanopartikel eine erste funktionelle Gruppe 1A aufgebracht ist, die mit einer komplementären Gruppe 2A eines zu immobilisierenden Wirkstoffs eine affine, bevorzugt kovalente Bindung eingehen kann.The in particular, the present invention provides that on the surface the nanoparticles have a first functional group 1A applied to them, those with a complementary group 2A of an active substance to be immobilized an affine, preferably covalent bond can enter.

Erfindungsgemäß ist vorgesehen, dass die erste funktionelle Gruppe 1A ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Aminogruppe, Carboxygruppe, Epoxygruppe, Maleinimidogruppe, Alkylketongruppe, Aldehydgruppe, Hydrazingruppe, Hydrazidgruppe, Thiolgruppe und Thioestergruppe.According to the invention provided that the first functional group 1A selected is selected from the group consisting of amino group, carboxy group, epoxy group, Maleimido group, alkyl ketone group, aldehyde group, hydrazine group, Hydrazide group, thiol group and thioester group.

Erfindungsgemäß ist vorgesehen, dass die funktionelle Gruppe 2A des Wirkstoffs ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Aminogruppe, Carboxygruppe, Epoxygruppe, Maleinimidogruppe, Alkylketongruppe, Aldehydgruppe, Hydrazingruppe, Hydrazidgruppe, Thiolgruppe und Thioestergruppe. Ein erfindungsgemäßer Nanopartikel weist also auf seiner Oberfläche eine erste funktionelle Gruppe 1A auf, die kovalent mit einer funktionellen Gruppe 2A des zu immobilisierenden Wirkstoffs verknüpft ist, wobei die funktionelle Oberflächen-Gruppe 1A eine andere Gruppe als die funktionelle Protein gruppe 2A ist. Die beiden miteinander in Bindung tretenden Gruppen 1A und 2A müssen komplementär zueinander sein, das heißt in der Lage sein, eine kovalente Bindung miteinander einzugehen.According to the invention provided that the functional group selected 2A of the active ingredient is selected from the group consisting of amino group, carboxy group, epoxy group, Maleimido group, alkyl ketone group, aldehyde group, hydrazine group, Hydrazide group, thiol group and thioester group. An inventive Nanoparticles thus has a first on its surface functional group 1A, which is covalently linked to a functional Group 2A linked to the drug to be immobilized wherein the functional surface group 1A is a other group than the functional protein group 2A. The two having to bond together groups 1A and 2A be complementary to each other, that is in the Be able to form a covalent bond with each other.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass die Oberfläche des erfindungsgemäßen Nanopartikels funktionelle Gruppen 1B und ein zu immoblisierender Wirkstoff die funktionellen Gruppen 1B bindende komplementäre Gruppen 2B aufweist, wobei die funktionellen Gruppen 1B und 2B erfindungsgemäß insbesondere eine nicht-kovalente Bindung eingehen können.In a further preferred embodiment of the invention is provided that the surface of the invention Nanoparticles functional groups 1B and one to immoblisierender Active ingredient the functional groups 1B binding complementary Groups 2B, wherein the functional groups 1B and 2B according to the invention in particular can form a non-covalent bond.

In bevorzugter Ausführungsform der Erfindung ist die zweite funktionelle Gruppe 1B der Oberfläche des Nanopartikels ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Oligohistidingruppe, Strep-Tag I, Strep-Tag II, Desthiobiotin, Biotin, Chitin, Chitinderivate, Chitinbindedomäne, Metallionenchelatkomplex, Streptavidin, Streptactin, Avidin und Neutravidin.In preferred embodiment of the invention is the second functional group 1B of the surface of the nanoparticle selected from the group consisting of oligohistidine group, Strep-Tag I, Strep-Tag II, Desthiobiotin, Biotin, Chitin, chitin derivatives, Chitin binding domain, metal ion chelate complex, streptavidin, streptactin, Avidin and neutravidin.

Erfindungsgemäß ist die funktionelle Gruppe 2B eines zu immobilisierenden Wirkstoffs ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Oligohistidingruppe, Strep-Tag I, Strep-Tag II, Desthiobiotin, Biotin, Chitin, Chitinderivate, Chitinbindedomäne, Metallionenchelatkomplex, Streptavidin, Streptactin, Avidin und Neutravidin. Ein erfindungsgemäßer Nanopartikel weist also in seiner Oberfläche eine funktionelle Gruppe 1B auf, die nicht-kovalent mit einer funktionellen Gruppe 2B eines Moleküls verknüpft ist, wobei die funktionelle Oberflächengruppe 1B des Nanopartikels eine andere Gruppe als die funktionelle Molekülgruppe 2B ist. Die beiden miteinander in nicht-kovalente Bindung tretenden Gruppen müssen komplementär zueinander sein, das heißt in der Lage sein, eine nicht-kovalente Bindung miteinander einzugehen.According to the invention the functional group 2B of an active substance to be immobilized selected from the group consisting of oligohistidine group, Strep-Tag I, Strep-Tag II, Desthiobiotin, Biotin, Chitin, chitin derivatives, Chitin binding domain, metal ion chelate complex, streptavidin, Streptactin, avidin and neutravidin. An inventive Nanoparticles thus has a functional in its surface Group 1B, which is noncovalent with a functional group 2B of a molecule is linked to the functional Surface group 1B of the nanoparticle another group when the functional molecule group is 2B. The two together Non-covalent bonding groups must be complementary be able to be a non-covalent one To bond with each other.

Selbstverständlich kann auch vorgesehen sein, dass die Oberfläche des erfindungsgemäßen Nanopartikels und die zu immobilisierenden Wirkstoffe gegebenenfalls sowohl funktionelle Gruppen 1A und 1B sowie 2A und 2B aufweisen.Of course can also be provided that the surface of the invention Nanoparticles and the active substances to be immobilized if necessary have both functional groups 1A and 1B and 2A and 2B.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist vorgesehen, dass die dreidimensionale Gerüststruktur eine oder mehrere der folgenden Komponenten enthält, nämlich faserbildende Proteine wie Kollagene, elastische Fasern bildende Fibrilline und/oder Elastine, Kohlenhydrate wie Glucosaminglykane, langkettige Polysaccharide, insbesondere Hyaluronsäure, Heparansulfat, Dermatansulfat, Chondroitinsulfat und Keratansulfat, Adhäsionsproteine, zum Beispiel Adapterproteine oder andere adhäsive Proteine, zum Beispiel Laminine, Vitronektin und Fibronektin, Bestandteile der Basalmembran wie Laminine, Entaktin und Proteoglycane sowie Zellrezeptoren für ECM-Komponenten wie Zellmembranproteine.In a particularly preferred embodiment of the present invention Invention is provided that the three-dimensional framework structure contains one or more of the following components, namely fiber-forming proteins such as collagens, forming elastic fibers Fibrillins and / or elastins, carbohydrates such as glucosaminoglycans, long-chain polysaccharides, in particular hyaluronic acid, Heparan sulfate, dermatan sulfate, chondroitin sulfate and keratan sulfate, Adhesion proteins, for example adapter proteins or others adhesive proteins, for example laminins, vitronectin and Fibronectin, components of the basement membrane such as laminins, entactin and proteoglycans and cell receptors for ECM components like cell membrane proteins.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist vorgesehen, dass die dreidimensionale Gerüststruktur Komponenten der extrazellulären Matrix enthält oder aus diesen besteht, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Laminine, Glycosaminoglykane (GAG), Proteoglykane, Elastin, Kollagene vom Typ I, II, III und IV, Entaktin (Nidogen), Vitronektin, Hyaluronsäure, Heparansulfat, Dermatansulfat, Chondroitinsulfat, Keratansulfat, Perlecan, Adhäsionsproteine und Fibronektin. In bevorzugter Ausführungsform der vorgehenden Erfindung kann die Gerüststruktur aus einer Gerüstgrundstruktur, zum Beispiel Kollagen, insbesondere Kollagenfasern, aufgebaut sein, wobei diese Gerüstgrundstruktur in vorteilhafter und optionaler Weise mit weiteren aus der vorgenannten Gruppe der die Gerüststruktur bildenden Komponenten ausgestaltet ist. So kann die Gerüstgrundstruktur, insbesondere die Kollagengerüststruktur, beispielsweise zusätzlich mit Komponenten ausgestattet sein, die Zelleigenschaften wie Adhäsion und Proliferation begünstigen, zum Beispiel Ankerproteine und/oder Kohlenhydrate.In a preferred embodiment of the present invention, it is provided that the three-dimensional framework structure contains or consists of components of the extracellular matrix selected from the group consisting of laminins, glycosaminoglycans (GAG), proteoglycans, elastin, collagens of type I, II, III and IV, entactin (nidogen), vitronectin, hyaluronic acid, heparan sulfate, dermatan sulfate, chondroitin sulfate, keratan sulfate, perlecan, adhesion proteins and fibronectin. In a preferred embodiment of the preceding invention, the framework structure can be constructed from a framework structure, for example collagen, in particular collagen fibers, this framework structure advantageously and optionally with further from the aforementioned group of the skeleton structure forming components is configured. Thus, the framework basic structure, in particular the collagen scaffold structure, for example, additionally be equipped with components that promote cell properties such as adhesion and proliferation, for example, anchor proteins and / or carbohydrates.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Zellkultursystems liegt die Gerüststruktur, insbesondere aus Kollagen, in Faserform und/oder in Netzform vor.In a preferred embodiment of the invention Cell culture system is the framework structure, in particular made of collagen, in fiber form and / or in mesh form.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, dass die Gerüststruktur, insbesondere aus Kollagen, in dreidimensional netzartig verzweigter Form vorliegt. Die Gerüststruktur kann in bevorzugter Ausführung in hydrogelartiger oder schwammartiger Form vorliegen.In a further preferred embodiment is provided that the framework structure, in particular of collagen, in three-dimensional network-like branched form is present. The framework structure can in a preferred embodiment in hydrogelartiger or spongy form present.

Bevorzugt stellt die dreidimensionale biokompatible Gerüststruktur in dem erfindungsgemäßen Zellkultursystem eine extrazelluläre Matrix dar.Prefers represents the three-dimensional biocompatible scaffold structure in the cell culture system according to the invention a extracellular matrix.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, dass die Konzentration von Wirkstoffen im Nanopartikel in einem Bereich von 1 ng/ml bis 10 μg/ml liegt.In A preferred embodiment provides that the concentration of active ingredients in the nanoparticle in one area from 1 ng / ml to 10 μg / ml.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist es vorgesehen, dass das Zellkultursystem Nanopartikel enthält, die in dem Zellkultursystem integral in der Gerüststruktur verteilt vorliegen. Die Nanopartikel können in bevorzugter Ausführung homogen in der Gerüststruktur verteilt vorliegen. Es kann in bevorzugter Ausführung aber auch eine heterogene, ungleichmäßige Verteilung der Nanopartikel vorliegen. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform liegen die Nanopartikel in Form mindestens einer Schicht ober- und/oder unterhalb der Gerüststruktur vor. In einer wei teren bevorzugten Ausführungsform liegen die Nanopartikel in Form mindestens einer Schicht oberhalb der Gerüststruktur vor.In Another preferred embodiment of the present invention Invention, it is provided that the cell culture system nanoparticles contained in the cell culture system integral in the framework structure distributed. The nanoparticles may be in a preferred Homogeneous distribution in the framework structure available. It may in a preferred embodiment but also a heterogeneous, uneven distribution of Nanoparticles are present. In a further preferred embodiment The nanoparticles are in the form of at least one layer top and / or below the framework structure. In a further preferred Embodiment, the nanoparticles are in the form of at least a layer above the framework structure.

Bevorzugt sind die Nanopartikel in dem erfindungsgemäßen Zellkultursystem in mehreren Schichten unterhalb der Gerüststruktur angeordnet.Prefers are the nanoparticles in the invention Cell culture system in several layers below the framework structure arranged.

Bevorzugt sind die Nanopartikel in dem erfindungsgemäßen Zellkultursystem in mehreren Schichten oberhalb der Gerüststruktur angeordnet.Prefers are the nanoparticles in the invention Cell culture system in several layers above the framework structure arranged.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der mittlere Durchmesser der Nanopartikel stets kleiner oder gleich wie die mittlere Dicke der Gerüststruktur. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist der mittlere Durchmesser aller Nanopartikel stets kleiner als die mittlere Dicke der Gerüststruktur. In einer bevorzugten Ausführungsform liegen bevorzugt alle Nanopartikel, bevorzugt überwiegend oder vollständig, in der Gerüststruktur eingebettet vor. Bevorzugt beträgt das Verhältnis der Abmessungen von Nanopartikel zur Dicke der Gerüststruktur 1:1 oder weniger, bevorzugt 1:10 oder weniger, werter bevorzugt 1:100 oder weniger, weiter bevorzugt 1:1000 oder weniger.In a preferred embodiment of the present invention the mean diameter of the nanoparticles is always smaller or same as the average thickness of the framework structure. In a Another preferred embodiment is the average diameter all nanoparticles always smaller than the average thickness of the framework structure. In a preferred embodiment, all are preferred Nanoparticles, preferably predominantly or completely, embedded in the framework structure. Preferred is the ratio of the dimensions of nanoparticles to the thickness the framework structure 1: 1 or less, preferably 1:10 or less, preferably 1: 100 or less, more preferably 1: 1000 Or less.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist vorgesehen, dass die Nanopartikel in dem erfindungsgemäßen Zellkultursystem in Form eines Gradienten innerhalb der Gerüststruktur vorliegen.In a preferred embodiment of the present invention is provided that the nanoparticles in the inventive Cell culture system in the form of a gradient within the framework structure available.

In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass der bevorzugt vorgesehene Wirkstoff in dem erfindungsgemäßen Zellkultursystem in Form eines Gradienten innerhalb der Gerüststruktur vorliegt.In A further embodiment provides that the preferred active ingredient in the inventive Cell culture system in the form of a gradient within the framework structure is present.

Im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung kann der Begriff „Gradient" also die Ausbildung verschiedener Konzentrationen an Nanopartikeln und/oder Wirkstoff innerhalb des erfindungsgemäßen Zellkultursystems, insbesondere der Gerüststruktur, bedeuten, insbesondere eine räumlich abgestufte, an- oder absteigende Konzentration an Nanopartikeln und/oder Wirkstoffen.in the Context of the present invention, the term "gradient" ie the formation of different concentrations of nanoparticles and / or active ingredient within the invention Cell culture system, in particular the framework structure, mean in particular, a spatially stepped, rising or falling Concentration of nanoparticles and / or active ingredients.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Wirkstoff-Gradient ausgebildet durch die Verwendung von Nanopartikeln, die unterschiedliche Konzentrationen an einem Wirkstoff aufweisen. Der Wirkstoff kann in dieser bevorzugten Ausführungsform in den Nanopartikeln in unterschiedlicher Konzentration eingeschlossen oder aufgebracht sein. Weiterhin kann der Wirkstoff auch in unterschiedlicher Konzentration durch Bindung über funktionelle Gruppen auf den Nanopartikeln aufgebracht sein. Je nach Anordnung dieser Nanopartikel mit unterschiedlicher Konzentration innerhalb der Gerüststruktur, z. B. eine homogene Verteilung, wird dadurch eine ansteigende Konzentration oder ein Konzentrationsgefälle des Wirkstoffs in dem Zellkultursystem erreicht. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist also vorgesehen, dass ein Wirkstoffgradient dadurch ausgebildet ist, dass Nanopartikel homogen verteilt innerhalb der Gerüststruktur vorliegen, wobei die Nanopartikel verschiedene Wirkstoffkonzentrationen aufweisen und so angeordnet sind, dass ein Wirkstoffgradient gebildet wird. Es ist in bevorzugter Ausführungsform auch vorgesehen, Nanopartikel mit unterschiedlichen Wirkstoffkonzentrationen in räumlich ungleichmäßiger Form, also heterogen, in der Gerüststruktur zu verteilen, insbesondere derartige Nanopartikel in Form eines Nanopartikelgradienten in die Gerüststruktur einzubringen.In a preferred embodiment of the present invention, an agent gradient is formed by the use of nanoparticles having different concentrations of an active agent. In this preferred embodiment, the active substance can be enclosed or applied in different concentrations in the nanoparticles. Furthermore, the active compound can also be applied to the nanoparticles in different concentrations by binding via functional groups. Depending on the arrangement of these nanoparticles with different concentrations within the framework structure, eg. As a homogeneous distribution, thereby an increasing concentration or a concentration gradient of the drug is achieved in the cell culture system. In a preferred embodiment of the present invention Thus, it is provided that a drug gradient is formed in that nanoparticles are homogeneously distributed within the framework structure, wherein the nanoparticles have different concentrations of active ingredient and are arranged so that a drug gradient is formed. It is also provided in a preferred embodiment to distribute nanoparticles with different concentrations of active substance in spatially uneven form, ie heterogeneously, in the framework structure, in particular to introduce such nanoparticles in the form of a nanoparticle gradient into the framework structure.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist vorgesehen, dass der Wirkstoff-Gradient in dem Zellkultursystem durch Ausbildung eines Nanopartikelgradienten ausgebildet wird, nämlich indem Nanopartikel, in denen eine bestimmte und in den verwendeten Nanopartikeln gleiche Konzentration eines Wirkstoffs eingeschlossen oder an deren Oberfläche aufgebracht ist, räumlich heterogen, das heißt unterschiedlich verteilt in der Gerüststruktur, vorliegen. So führt eine geringere Anzahl dieser Nanopartikel in zum Beispiel einem oberen Bereich der Gerüststruktur, gefolgt von einer höheren Anzahl dieser Nanopartikel in einem darunter liegenden Bereich der Gerüststruktur zu einem Konzentrationsanstieg innerhalb der Gerüststruktur nach unten hin. Umgekehrt führt eine höhere Anzahl dieser Nanopartikel in einem oberen Bereich der Gerüststruktur und eine geringere Anzahl dieser Nanopartikel in einem darunter liegenden Bereich der Gerüststruktur zu einer Konzentrationsabnahme innerhalb der Gerüststruktur nach unten hin.In Another preferred embodiment of the present invention Invention is provided that the drug gradient in the cell culture system is formed by forming a nanoparticle gradient, namely by using nanoparticles in which one particular and in the one used Nanoparticles included same concentration of an active ingredient or is applied to the surface, spatially heterogeneous, that is differently distributed in the framework structure, available. So results in a smaller number of these nanoparticles in, for example, an upper region of the framework structure, followed by a higher number of these nanoparticles in to an underlying area of the framework structure an increase in concentration within the framework structure downwards. Conversely, a higher number leads this nanoparticles in an upper region of the framework structure and a smaller number of these nanoparticles in one underneath lying region of the framework structure to a decrease in concentration within the framework structure downwards.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist es vorgesehen, dass in dem Zellkultursystem eine kontrollierte und verzögerte Wirkstofffreisetzung stattfindet, insbesondere durch die Verwendung bioabbaubarer Nanopartikel. Die erfindungsgemäß bevorzugte kontrollierte Freisetzung von Wirkstoffen kann zusätzlich oder alternativ auch durch Diffusion aus den Nanopartikeln in das umgebende Zellkultursystem, insbesondere in die faser- oder netzartige Gerüststruktur, gewährleistet sein.In Another preferred embodiment of the present invention The invention provides that in the cell culture system a controlled and delayed drug release takes place, in particular through the use of biodegradable nanoparticles. The inventively preferred controlled release of active ingredients may additionally or alternatively by diffusion from the nanoparticles into the surrounding cell culture system, especially in the fibrous or reticular Framework structure, be assured.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist vorgesehen, dass die Nanopartikel mit der Gerüststruktur verbunden sind. In bevorzugter Ausführung ist die Bindung so ausgeführt, dass ein Kulturmediumwechsel nicht zum Ablösen der Nanopartikel von der Gerüststruktur führt. In bevorzugter Ausführung ist die Bindung waschstabil, d. h. die Nanopartikel werden auch bei Wechsel des Kulturmediums und gegebenenfalls erfolgenden Waschschritten mit üblichen Waschmedien, wie Puffern, nicht von der Gerüststruktur abgelöst.In Another preferred embodiment of the present invention The invention provides that the nanoparticles with the framework structure are connected. In a preferred embodiment, the bond so executed that a culture medium change does not cause detachment the nanoparticle leads from the framework structure. In a preferred embodiment, the bond is wash stable, d. H. The nanoparticles are also when changing the culture medium and optionally washing steps with customary Wash media, such as buffers, not from the framework structure replaced.

Bevorzugt ist vorgesehen, dass die Nanopartikel über elektrostatische Wechselwirkungen mit der Gerüststruktur verbunden sind, insbesondere durch ionische Bindung.Prefers is provided that the nanoparticles via electrostatic Interactions are associated with the framework structure, in particular by ionic bonding.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist vorgesehen, dass die Nanopartikel durch UV-Crosslinking mit der Gerüststruktur verbunden sind.In Another preferred embodiment of the present invention Invention is provided that the nanoparticles by UV crosslinking connected to the framework structure.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist vorgesehen, dass das Zellkultursystem zur Durchführung von Migrationsversuchen, insbesondere Migrationsversuche in vivo, eingesetzt wird.In Another preferred embodiment of the present invention Invention is provided that the cell culture system for performing of migration tests, in particular migration experiments in vivo, is used.

Darüber hinaus betrifft die Erfindung auch ein Verfahren zur Herstellung eines Zellkultursystems, umfassend eine dreidimensionale biokompatible Gerüststruktur und biokompatible Nanopartikel, wobei die Gerüststruktur mit den Nanopartikeln, z. B. gemäß einer der folgenden Verfahren, in Kontakt gebracht wird.About that In addition, the invention also relates to a process for the preparation a cell culture system comprising a three-dimensional biocompatible Scaffold structure and biocompatible nanoparticles, wherein the Framework structure with the nanoparticles, z. B. according to a the following procedure.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Lehre ist es vorgesehen, dass das Zellkultursystem durch ein „kontaktloses Printverfahren" hergestellt wird.In a preferred embodiment of the present teaching it is envisaged that the cell culture system by a "contactless Print method "is produced.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeutet der Begriff „kontaktloses Printverfahren" ein Verfahren, in dem Nanopartikel ohne Kontakt mit der Oberfläche auf das Substrat übertragen werden. Es existieren unterschiedliche Möglichkeiten, um dies zu erreichen. In einer ersten bevorzugten Ausführungsform ist ein so genanntes Drop an demand mittels Ink Jet-Verfahren vorgesehen. In einer zweiten Ausführungsform ist ein Verfahren mittels Druckkopf oder einzelner Nadeln vorgesehen. In beiden Ausführungsformen werden ein oder mehrere Tropfen einer Suspension auf die gewünschte Stelle übertragen. Bevorzugt werden käufliche Maschinen der Firma Dimatix-FujiFilm- für Ink Jet-Verfahren verwendet. Weiterhin bevorzugt sind auch Maschinen der Firmen microdrop technologies, MicroFab TECHNOLOGIES, Scienion AG und GeSIM mbH, welche einzelne Nadeln besitzen und über einen Computer zur Abgabe von Tropfen punktgenau gesteuert werden können. Im Zusammenhang mit dem vorliegenden Verfahren bedeutet „punktgenau", dass eine Positionierungsgenauigkeit bei allen Verfahren von unter +/–25 μm angegeben wird. Im Rahmen der Positionierungsgenauigkeit ist auch das Tropfenvolumen zu berücksichtigen. Dieses kann mit mindestens 1 pL bei dem Gerät Dimatix DMC-11601 und mit mindestens 100 pL bei dem Gerät Nano-Plotter NP1.2 von Ge-SIM eingestellt werden. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist bevorzugt vorgesehen, dass die Abgabe der Nanopartikelsuspension über ein pneumatisches Verfahren, Vakuum-Verfahren oder über ein piezoelektrisches Verfahren erfolgt. Insbesondere ist bevorzugt vorgesehen, dass die Eindringtiefe der Nanopartikel in das Substrat, insbesondere in die Gerüststruktur des Zellkultursystems, durch das Tropfenvolumen oder die Tropfgeschwindigkeit in den jeweiligen Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens gesteuert wird. Das kontaktlose Printverfahren führt vorzugsweise zu einem schichtartigen Aufbringen der Nanopartikel innerhalb der Gerüststruktur.In the context of the present invention, the term "contactless printing process" means a process in which nanoparticles are transferred to the substrate without contact with the surface.There are various possibilities for achieving this In a first preferred embodiment, a so-called drop In a second embodiment, a method is provided by means of a print head or individual needles In both embodiments, one or more drops of a suspension are transferred to the desired location Also preferred are machines from the companies microdrop technologies, MicroFab TECHNOLOGIES, Scienion AG and GeSIM mbH, which have individual needles and can be precisely controlled by a computer for the delivery of drops Ren means "pinpoint" that a positioning accuracy is specified in all procedures of less than +/- 25 microns. Within the scope of the positioning accuracy, the drop volume must also be considered. This can take at least 1 pL at the device Dimatix DMC-11601 and set at least 100 pL on the Nano-Plotter NP1.2 device of Ge-SIM. In the context of the present invention, it is preferably provided that the delivery of the nanoparticle suspension takes place via a pneumatic method, vacuum method or via a piezoelectric method. In particular, it is preferably provided that the penetration depth of the nanoparticles into the substrate, in particular into the framework structure of the cell culture system, is controlled by the drop volume or the dropping speed in the respective embodiments of the method according to the invention. The contactless printing method preferably leads to a layer-like application of the nanoparticles within the framework structure.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Anmeldung ist ein Zellkultursystem vorgesehen, das durch Imprägnieren hergestellt wird, insbesondere, indem eine Gerüststruktur mit einer Nanopartikel-haltigen Suspension durchsetzt wird, zum Beispiel durch Tränken mit einer Nanopartikel-haltigen Suspension.In Another preferred embodiment of the present invention Registration is provided by a cell culture system by impregnation is made, in particular, by a framework structure is penetrated with a nanoparticle-containing suspension, for Example by impregnation with a nanoparticle-containing suspension.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Zellkultursystem vorgesehen, das durch ein Laser Induced Forward Transfer – LIFT-Verfahren hergestellt wird. Hierzu ist insbesondere vorgesehen, dass zu transportierendes Material, insbesondere einen oder mehrere Bestandteile der extrazellulären Matrix, durch Laserenergie ausgeschnitten und auf ein Zielmaterial aufgebracht wird.In Another preferred embodiment of the present invention Invention, a cell culture system is provided by a laser Induced Forward Transfer - LIFT procedure is established. For this purpose, it is provided in particular that the material to be transported, in particular one or more components of the extracellular Matrix, cut out by laser energy and onto a target material is applied.

Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sieht vor, dass das Zellkultursystem durch Elektrospinning (Spincoating) hergestellt wird. Durch Elektrospinning können vorzugsweise polymere Strukturen mit vorzugsweise einem Faserdurchmesser von bevorzugt 2 bis 20 μm, welche der natürlichen Umgebung der Zellen, nämlich der extrazellulären Matrix, sehr ähnlich sind, hergestellt werden.A another preferred embodiment of the present invention provides that the cell culture system by electrospinning (spincoating) will be produced. By electrospinning can preferably polymeric structures preferably having a fiber diameter of preferably 2 to 20 microns, which of the natural Surrounding the cells, namely the extracellular Matrix, very similar to be produced.

Die Erfindung betrifft also Verfahren zur Herstellung eines Zellkultursystems, wobei in besonders bevorzugter Ausführungsform vorgesehen ist, die biokompatiblen Nanopartikel beispielsweise im Wege der Lösungsmittelverdunstung der Spontanoues Emulsifaction Solvent Diffusion(SESD)-Methode, der Aussalzung, der Sprühtrocknung oder der Phasenseparation herzustellen.The The invention thus relates to methods for producing a cell culture system. being provided in a particularly preferred embodiment is the biocompatible nanoparticles, for example, in the way of Solvent evaporation of Spontanoues Emulsifaction Solvent diffusion (SESD) method, salting out, spray drying or the phase separation.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, die eingesetzten Nanopartikel im Wege der Lösungsmittelverdunstung, insbesondere der Wasser-in-Öl-in-Wasser-Technik, herzustellen. Gemäß dieses Verfahrens ist es erfindungsgemäß besonders bevorzugt möglich, auch die verschiedensten hydrophilen Wirkstoffe in die Nanopartikel einzuarbeiten. Der im Wasser befindliche Wirk stoff wird dabei in einer polymerhaltigen Ölphase emulgiert. Diese Mischung wird in einer weiteren Wasserphase emulgiert und das organische Lösungsmittel beispielsweise durch Reduzieren des Drucks entfernt. Gemäß einer weiteren Ausführungsform ist es auch möglich, eine Öl/Wasseremulsion (O/W) einzusetzen, insbesondere um hydrophobe Wirkstoffe einzuarbeiten. In dieser Ausführungsform wirkt die Ölphase gleichermaßen als Lösungsmittel für das Polymer wie als Wirkstoff.In a particularly preferred embodiment is provided the used nanoparticles by way of solvent evaporation, especially the water-in-oil-in-water technique. According to this method, it is particularly according to the invention preferably possible, even the most diverse hydrophilic To incorporate drugs into the nanoparticles. The one in the water Active substance is emulsified in a polymer-containing oil phase. This mixture is emulsified in a further water phase and the organic solvent, for example, by reducing removed from the pressure. According to another embodiment it is also possible to apply an oil / water emulsion (O / W) to use, in particular to incorporate hydrophobic agents. In this embodiment, the oil phase acts equally as a solvent for the polymer as well as an active ingredient.

In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, die erfindungsgemäßen Nanopartikel insbesondere durch die auf Lösungsmittelverdunstung basierende Spontanoues Emulification Sovent Diffsion SESD-Methode herzustellen. Hierzu ist vorgesehen sowohl das Polymer als auch den Wirkstoff in einer organischen Mischung, bevorzugt in Dichlormethan und Aceton, zu lösen und diese Lösung in eine wässrige Phase mit Stabilisator zu überführen und durch Rühren zu emulgieren. Insbesondere ist dabei vorgesehen, dass das hydrophile Lösungsmittel, bevorzugt Aceton, in die umgebende Wasserphase diffundiert und die erfindungsgemäßen Nanopartikel durch Rühren unter reduziertem Druck entstehen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, dass die Partikelgröße durch eine Erhöhung des Anteils an in Wasser mischbaren Lösungsmittel verringert wird.In a further embodiment is provided, the inventive Nanoparticles in particular by the solvent evaporation based Spontanoues Emulification Sovent Diffusion SESD method manufacture. For this purpose, provided is both the polymer and the active ingredient in an organic mixture, preferably in dichloromethane and acetone, and solve this solution in one to transfer aqueous phase with stabilizer and to emulsify by stirring. In particular, it is here provided that the hydrophilic solvent, preferred Acetone, diffused into the surrounding water phase and the inventive Nanoparticles are formed by stirring under reduced pressure. In a preferred embodiment it is provided that the particle size by increasing the proportion of water-miscible solvent is reduced becomes.

In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, die erfindungsgemäßen Nanopartikel insbesondere durch Aussalzung herzustellen. Insbesondere ist vorgesehen, bei dieser Herstellung auf die Verwendung von Lösungsmitteln zu verzichten. Zur Herstellung wird das Polymer, bevorzugt PVA, zu einer gesättigten Lösung, insbesondere von Magnesiumchlorid oder Magnesiumacetat, gegeben, um so ein viskoses Gel als wässrige Phase zu erhalten. Weiterhin ist insbe sondere vorgesehen, ein bioabbaubares Polymer mit einem Wirkstoff bevorzugt in Aceton als organische Phase zu lösen. Durch Mischen von wässriger und organischer Phase ist vorgesehen, dass die organische Phase im entstehenden Zwei-Phasen-System durch Rühren im Gel emulgiert wird. Bevorzugt ist vorgesehen, dass die erfindungsgemäßen Nanopartikel durch Zugabe von ausreichend Wasser und nach Diffusion von vorzugsweise Aceton in die wässrige Phase ausfallen.In a further embodiment is provided, the inventive Produce nanoparticles in particular by salting out. Especially is intended in this preparation to the use of solvents to renounce. For the preparation, the polymer, preferably PVA, to a saturated solution, in particular of Magnesium chloride or magnesium acetate, so as to give a viscous To obtain gel as an aqueous phase. Furthermore, it is special in particular provided, a biodegradable polymer with an active ingredient is preferred to dissolve in acetone as the organic phase. By mixing of aqueous and organic phase is provided that the organic phase in the resulting two-phase system by stirring emulsified in the gel. It is preferably provided that the inventive Nanoparticles by adding enough water and after diffusion of preferably acetone precipitate in the aqueous phase.

In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, die erfindungsgemäßen Nanopartikel insbesondere durch Sprühtrocknung herzustellen. Bevorzugt ist vorgesehen, dass durch Zerstäuben bzw. Atomisieren von Lösungen und Emulsionen, in denen bioabbaubare Polymere und Wirkstoffe gelöst sind, insbesondere unter Zuhilfenahme einer Zweistoffdüse in einem heißen Luftstrom erfindungsgemäße Nanopartikel hergestellt werden.In a further embodiment, the nanoparticles according to the invention are intended in particular re produce by spray drying. It is preferably provided that nanoparticles according to the invention are prepared by sputtering or atomizing solutions and emulsions in which biodegradable polymers and active substances are dissolved, in particular with the aid of a two-substance nozzle in a hot air stream.

In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, die erfindungsgemäßen Nanopartikel insbesondere durch Phasenseparation – Koazervation – hergestellt werden. Dazu ist insbesondere vorgesehen, bioabbaubaren Polymere in bevorzugt Dichlormethan zu lösen und einen Wirkstoff darin zu dispergieren bzw. zu emulgieren. Weiterhin ist vorgesehen, dass unter Rühren schrittweise bevorzugt Silikon-Öl, das sich nicht mit der organischen Polymerphase vermischt, zugegeben wird und sich eine Phasentrennung vollzieht. Diese Mischung wird unter Zugabe von bevorzugt Heptan weitergerührt, wobei erfindungsgemäße Nanopartikel gewonnen werden können.In a further embodiment is provided, the inventive Nanoparticles in particular by phase separation - coacervation - produced become. In particular, biodegradable polymers are provided for this purpose in preferably dichloromethane to dissolve and an active ingredient to disperse or emulsify in it. Furthermore, it is envisaged that with stirring stepwise preferably silicone oil, that does not mix with the organic polymer phase and a phase separation takes place. This mixture will with the addition of preferably heptane, wherein Nanoparticles according to the invention can be obtained can.

Bevorzugt betrifft das Verfahren zur Herstellung eines Zellkultursystems gemäß der vorliegenden Erfindung ein Zellkultursystem, das durch kontaktloses Printverfahren hergestellt wird.Prefers relates to the method of producing a cell culture system according to the present invention, a cell culture system by contactless Print method is produced.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Zellkultursystems, das durch Imprägnieren hergestellt wird.In Another preferred embodiment relates to The present invention provides a method of manufacturing a cell culture system. which is made by impregnation.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Zellkultursystems, das durch ein LIFT-Verfahren hergestellt wird.In Another preferred embodiment relates to The present invention provides a method of manufacturing a cell culture system. which is produced by a LIFT method.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Zellkultursystems, in dem das Zellkultursystem durch Elektrospinning (Spincoating) hergestellt wird.In Another preferred embodiment relates to The present invention provides a method of manufacturing a cell culture system. in which the cell culture system by electrospinning (spincoating) will be produced.

Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Kultivierung von Zellen, indem die Zellen in ein ein Zellkultursystem der vorliegenden Erfindung und ein geeignetes Nährmedium enthaltendes Zellkulturgefäß eingebracht werden und dort unter geeigneten Bedingungen, die eine Kultivierung ermöglichen, kultiviert werden.About that In addition, the present invention also relates to a method for Cultivation of cells by placing the cells in a cell culture system of the present invention and a suitable nutrient medium containing cell culture vessel are introduced and there under suitable conditions that allow cultivation, be cultivated.

Bevorzugt sind die kultivierten Zellen eukaryotische Zellen, insbesondere humanen oder tierischen Ursprungs. Weiter bevorzugt sind die kultivierten Zellen primäre Zellen.Prefers the cultured cells are eukaryotic cells, in particular of human or animal origin. More preferred are the cultivated Cells primary cells.

In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist vorgesehen, dass die zu kultivierende Zelle eine Tumorzelle ist, insbesondere eine Tumorzelllinie wie MCF-7, HeLa, HepG2, PC3, CT-26, A125, A549, MRC-5, CHO, MelJuso28, Nalm6 oder Jurkat.In another embodiment of the present invention it is envisaged that the cell to be cultivated is a tumor cell especially a tumor cell line such as MCF-7, HeLa, HepG2, PC3, CT-26, A125, A549, MRC-5, CHO, MelJuso28, Nalm6 or Jurkat.

In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist vorgesehen, dass die zu kultivierende Zelle eine adhärente Zelle, insbesondere ein etablierte Zelllinie wie HUVEC oder HaCaT ist.In another embodiment of the present invention it is envisaged that the cell to be cultivated will be an adherent Cell, in particular an established cell line such as HUVEC or HaCaT is.

In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft diese ein Verfahren zur Kultivierung von Zellen mittels des erfindungsgemäßen Zellkultursystems, wobei die zu kultivierende Zelle eine ausdifferenzierte Zelle ist.In another embodiment of the present invention this relates to a method for cultivating cells by means of the cell culture system according to the invention, wherein the cell to be cultivated is a differentiated cell.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren, insbesondere ein nicht-therapeutisches Verfahren, zur Herstellung differenzierter Zellen oder Zellverbände aus undifferenzierten Zellen, wobei die undifferenzierten Zellen in dem erfindungsgemäßen Zellkulturverfahren kultiviert und dadurch differenzierte Zellen oder Zellverbände gewonnen werden.In Another preferred embodiment relates to The present invention relates to a method, in particular a non-therapeutic Method for producing differentiated cells or cell aggregates from undifferentiated cells, with the undifferentiated cells cultured in the cell culture method according to the invention and thereby differentiated cells or cell aggregates obtained become.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren, insbesondere ein nicht-therapeutisches Verfahren, zur Aufrechterhaltung des Differenzierungsstadiums prädifferenzierter oder differenzierter Zellen, wobei die prädifferenzierten oder differenzierten Zellen in dem erfindungsgemäßen Zellkulturverfahren kultiviert werden. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein vorgenanntes, vorzugsweise nicht-therapeutisches Verfahren, wobei undifferenzierte Zellen in dem erfindungsgemäßen Zellkulturverfahren kultiviert und in diesem undifferenzierten Zustand gehalten werden.In Another preferred embodiment relates to The present invention relates to a method, in particular a non-therapeutic Method for maintaining the stage of differentiation more differentiated or differentiated cells, with the predifferentiated ones or differentiated cells in the invention Cell culture are cultivated. In a further preferred Embodiment relates to the present invention the aforesaid, preferably non-therapeutic method, wherein undifferentiated cells in the invention Cultivated cell culture and kept in this undifferentiated state become.

Bevorzugt ist vorgesehen, dass die Zellverbände Transplantate oder Testsysteme darstellen.Prefers is provided that the cell aggregates grafts or Represent test systems.

Weiterhin bevorzugt ist vorgesehen, dass die Zellverbände auch Organe, Organteile, insbesondere eine Trachea oder Teile davon sein können.Farther it is preferably provided that the cell aggregates also organs, Organ parts, in particular a trachea or parts thereof may be.

Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung differenzierte Zellen und Zellverbände, die nach erfindungsgemäßer Kultivierung von differenzierten oder undifferenzierten Zellen oder Zellverbänden gewonnen werden, zum Beispiel Transplantate, Testsysteme, Organe, Organteile, insbesondere eine Trachea, oder Teile davon.Farther the present invention relates to differentiated cells and cell aggregates, the according to inventive cultivation of differentiated or undifferentiated cells or cell aggregates are recovered, for example, grafts, test systems, organs, organ parts, in particular a trachea, or parts of it.

Die vorliegende Erfindung, insbesondere das vorliegende Zellkulturverfahren, ermöglicht die Langzeitkultivierung von Stamm- und Vorläuferzellen, die für vielfältige Einsatzgebiete verwendet werden können, beispielsweise für Transplantate und Testsysteme, aber auch in der Grundlagenforschung.The present invention, in particular the present cell culture method, allows the long-term cultivation of stem and progenitor cells, which are used for a variety of applications can, for example, for transplants and test systems, but also in basic research.

Die vorliegende Erfindung, insbesondere das vorliegende Zellkulturverfahren, ermöglicht die Proliferation funktioneller Zellen, insbesondere von primären Zellen.The present invention, in particular the present cell culture method, allows the proliferation of functional cells, in particular of primary cells.

Die vorliegende Erfindung, insbesondere das vorliegende Zellkulturverfahren, ermöglicht die gerichtete Differenzierung zu funktionellen Zellen und Geweben, beispielsweise bei der Transplantatherstellung oder auch für Testsysteme bei der Medikamentenentwicklung.The present invention, in particular the present cell culture method, allows directed differentiation to functional Cells and tissues, for example in transplant production or for test systems in drug development.

Die vorliegende Erfindung, insbesondere das vorliegende Zellkulturverfahren, ermöglicht die Herstellung von Transplantaten zur Heilung chronischer/diabetischer Wunden, beispielsweise mittels Zellmigration induziert durch Nanopartikel.The present invention, in particular the present cell culture method, allows the production of transplants for healing chronic / diabetic wounds, for example by cell migration induced by nanoparticles.

Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Herstellung von Expressionsprodukten einer Zelle, wobei die Zelle gemäß des erfindungsgemäßen Zellkulturverfahrens kultiviert werden und das Expressionsprodukt aus dieser Zellkultur gewonnen wird.About that In addition, the present invention also relates to a method for Production of expression products of a cell, wherein the cell according to the invention Cell culture process are cultivated and the expression product is obtained from this cell culture.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch Expressionsprodukte einer Zelle, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren kultiviert wird und deren Expressionsprodukte gewonnen werden.The The present invention also relates to expression products of a cell, which cultured by the method according to the invention and their expression products are obtained.

Weitere Ausführungsformen ergeben sich aus den Unteransprüchen.Further Embodiments emerge from the subclaims.

Ausführungsbeispieleembodiments

Die vorliegende Erfindung wird anhand der nachstehenden Beispiele und Figuren näher erläutert. Die Beispiele sind nicht beschränkend zu verstehen.The The present invention will become apparent from the following examples and Figures explained in more detail. The examples are not restricting to understand.

1 zeigt eine REM-Aufnahme von bioabbaubaren Nanopartikeln 1 shows an SEM image of biodegradable nanoparticles

2 zeigt das Freisetzungsergebnis der mit 8% BSA beladenen PLGA-Partikel aus Beispiel 1. 2 shows the release result of the 8% BSA loaded PLGA particles of Example 1.

3 zeigt Zellen auf einem mit PAH + Carboxy-Nanopartikel beschichteten Objektträger am Tag 1; A) gibt Versuch 1, B) Versuch 2 wieder. 3 shows cells on a PAH + carboxy nanoparticle coated slide on day 1; A) gives experiment 1, B) gives experiment 2 again.

4 zeigt Zellen, die zur Kontrolle in einer Zellkulturflasche kultivierte wurden, aus Versuch 2; A) am Tag 1 und B) am Tag 3. 4 shows cells cultured for control in a cell culture flask from experiment 2; A) on day 1 and B) on day 3.

5 zeigt Zellen, die auf Oberflächen mit Nanopartikeln mit Aminofunktionalisierung sowie anschließende Beschichtung mit Carboxy-Nanopartikeln mit planarer und globulärer Oberfläche kultiviert wurden; A) PAA, Tag 1, Versuch 1, B) PAH+Carboxy-Nanopartikel, Tag 1, Versuch 1, C) PAA, Tag 3, Versuch 2 D), PAH+Carboxy-Nanopartikel, Tag 3, Versuch 2 5 Figure 1 shows cells cultured on surfaces with amino functional nanoparticles and subsequent coating with carboxy nanoparticles with planar and globular surface; A) PAA, Day 1, Run 1, B) PAH + Carboxy Nanoparticles, Day 1, Run 1, C) PAA, Day 3, Run 2 D), PAH + Carboxy Nanoparticles, Day 3, Run 2

6 zeigt Zellen, die auf Oberflächen mit Nanopartikeln mit Aminofunktionalisierung sowie anschließende Beschichtung mit Carboxy-Nanopartikeln mit planarer und globulärer Oberfläche kultiviert wurden; A) PAH, Tag 1, Ansatz 3, B) PAA+Amino-Nanopartikel, Tag 1, Ansatz 3, C) PAH, Tag 3, Ansatz 2, D) PAA+Amino-Nanopartikel, Tag 3, Ansatz 2 6 Figure 1 shows cells cultured on surfaces with amino functional nanoparticles and subsequent coating with carboxy nanoparticles with planar and globular surface; A) PAH, Day 1, Approach 3, B) PAA + Amino Nanoparticles, Day 1, Approach 3, C) PAH, Day 3, Approach 2, D) PAA + Amino Nanoparticles, Day 3, Approach 2

Abkürzungen:Abbreviations:

  • PLGAPLGA
    = Poly(Lactid-co-glycolid)= Poly (lactide-co-glycolide)
    PLAPLA
    = Polylactid= Polylactide
    PCLPCL
    = Polycaprolacton= Polycaprolactone
    PGAPGA
    = Polyglycolid= Polyglycolide
    PAAPAA
    = Polyacrylsäure= Polyacrylic acid
    PAHPAH
    = Polyallylamin-hydrochlorid= Polyallylamine hydrochloride
    EGFEGF
    = Epidermal Growth Factor= Epidermal growth Factor
    BMPBMP
    = Bone Morphogenic Protein= Bone Morphogenic protein
    SESDSESD
    = Spontaneous emulsification solvent diffusion method= Spontaneous emulsification solvent diffusion method
    MESMES
    = Morpholinoethansulfonsäure= Morpholinoethanesulfonic acid

Beispiel 1:Example 1:

Herstellung von BSA-beladenen bioabbaubaren Nanopartikeln aus PLGA mittels Wasser-in-Öl-in-Wasser-Technik (W/O/W)Production of BSA-loaded biodegradable Nanoparticles from PLGA using water-in-oil-in-water technology (WOW)

Zuerst werden 120 mg Poly(Lactid-co-Glycolid) in 3,1 mL Dichlormethan gelöst (O-Phase). In dieser Phase wird eine wässrige Lösung des zu verkapselnden Proteins (Bovin Serum Albumin, BSA) mittels Ultraschallbehandlung emulgiert (W/O), dazu wurden 10 mg BSA in 100 μL PBS-Puffer pH 7,4 gelöst. Zum Schutz des Wirkstoffes können unterschiedliche Stabilisatoren, wie Zucker, Proteine, Polyethylenglycole und andere Detergentien, in die wässrige Lösung eingebaut werden. Die hergestellte W/O-Phase wird in einer weiteren Wasserphase (100 mL Wasser + 500 mg Polyvinylalkohol) mittels Ultraschall dispergiert, so dass eine W/O/W-Emulsion entsteht. Das organische Lösemittel der polymerhaltigen O-Phase wird durch Verdampfung entfernt und dadurch das Polymer als Nanopartikel ausgefällt. Die Größe der Partikel beträgt ca. 150 bis 350 nm. Der Einschluss an Wirkstoff liegt dabei bei 5–8 Gew.-%. Durch Einsatz einer größeren Menge an Wirkstoff kann auch eine höhere Beladung erzielt werden.First 120 mg of poly (lactide-co-glycolide) are dissolved in 3.1 mL of dichloromethane (O-phase). In this phase becomes an aqueous solution of the protein to be encapsulated (bovine serum albumin, BSA) by means of Ultrasound treatment emulsified (W / O), to which 10 mg of BSA in 100 μL PBS buffer pH 7.4 dissolved. To protect the Active ingredient can be different stabilizers, such as Sugars, proteins, polyethylene glycols and other detergents, in to incorporate the aqueous solution. The manufactured W / O phase is added in another water phase (100 mL water + 500 mg of polyvinyl alcohol) by means of ultrasound, so that a W / O / W emulsion arises. The organic solvent of the polymer-containing O phase is removed by evaporation and thereby the polymer precipitated as nanoparticles. The size the particle is about 150 to 350 nm. The inclusion at active ingredient is 5-8 wt .-%. By using a greater amount of active ingredient may also be higher Loading be achieved.

Beispiel 2:Example 2:

Herstellung von mit BMP-2 beladenen bioabbaubaren Nanopartikeln aus PLA mittels W/O/W-TechnikProduction of BMP-2 loaded biodegradable Nanoparticles from PLA using W / O / W technology

10 mg Polylactid werden in 300 μL Dichlormethan gelöst. Zu dieser Phase werden 10 μL einer wässrigen Lösung des BMP-2 (bone morphogenic protein-2, c = 200 mg/mL) mit 0,05% Lutrol F 68 zugegeben und darin mittels Ultraschall emulgiert.10 mg of polylactide are dissolved in 300 μL of dichloromethane. To this phase, 10 μL of an aqueous solution of BMP-2 (bone morphogenic protein-2, c = 200 mg / ml) with 0.05% Lutrol F 68 was added and emulsified therein by means of ultrasound.

Diese W1/O-Phase wird in einer zweiten wässrigen Phase (10 mL einer 0,5%igen PVA-Lösung) mittels Ultraschall dispergiert. Die Entfernung des Dichlormethan/Aceton-Gemischs der W1/O/W2-Emulsion erfolgt durch Verdampfung am Vakuum. Dabei fallen Nanopartikel mit einer Größe von 100–250 nm aus. Die Wirkstoffbeladung beträgt ca. 10–15 Gew.-% (1).This W1 / O phase is dispersed in a second aqueous phase (10 mL of a 0.5% PVA solution) by means of ultrasound. The removal of the dichloromethane / acetone mixture of the W1 / O / W2 emulsion is carried out by evaporation in vacuo. This precipitates nanoparticles with a size of 100-250 nm. The active ingredient loading is about 10-15% by weight ( 1 ).

Beispiel 3:Example 3:

Herstellung von BSA-beladenen PLA-Nanopartikeln mittels W/O/W-MethodePreparation of BSA-loaded PLA nanoparticles using W / O / W method

Zuerst werden 120 mg Polylactid in 3,1 mL Dichlormethan/Aceton (8/2) gelöst (O-Phase). In dieser Phase wird eine wässrige Lösung des zu verkapselnden Proteins (Bovin Serum Albumin, BSA) mittels Ultraschallbehandlung emulgiert (W/O), dazu wurden 10 mg BSA in 100 μL Wasser gelöst. Die hergestellte W/O-Phase wird in einer weiteren Wasserphase (100 mL Wasser mit 0,5% Polyvinylalkohol) mittels Ultraschall dispergiert und eine W/O/W-Emulsion entsteht. Das organische Lösemittel der polymerhaltigen O-Phase wird durch Verdampfung entfernt und dadurch das Polymer als Nanopartikel ausge fällt. Die Größe der Partikel beträgt ca. 150 bis 300 nm. Der Einschluss an Wirkstoff liegt dabei bei 7–8 Gew.-%.First 120 mg of polylactide are dissolved in 3.1 mL of dichloromethane / acetone (8/2) (O-phase). In this phase becomes an aqueous solution of the protein to be encapsulated (bovine serum albumin, BSA) by means of Ultrasound treatment emulsified (W / O), to which 10 mg of BSA in 100 μL of water dissolved. The produced W / O phase is in another water phase (100 mL of water with 0.5% polyvinyl alcohol) dispersed by means of ultrasound and a W / O / W emulsion is formed. The organic solvent of the polymer-containing O phase is passed through Evaporation removed and thereby the polymer precipitated out as nanoparticles. The size of the particles is about 150 to 300 nm. The inclusion of active ingredient is 7-8 Wt .-%.

Bestimmung der FreisetzungskinetikDetermination of the release kinetics

50 mg der mit BSA-beladenen Poly(Lactid-co-Glycolid)-Partikel (Resomer® 502 H) werden in 5 mL PBS-Puffer (pH 7,4) suspendiert und bei 37°C im Ölbad gerührt. Es werden pro Probenzug jeweils 300 μL entnommen und zentrifugiert. Das Pellet wurde erneut in PBS-Puffer suspendiert und dem Experiment zurückgeführt.50 mg of BSA-loaded poly (lactide-co-glycolide) particles (Resomer ® 502 H) are suspended in 5 mL PBS buffer (pH 7.4) and stirred at 37 ° C in oil bath. In each case, 300 μL are withdrawn per sample and centrifuged. The pellet was resuspended in PBS buffer and returned to the experiment.

Die quantitative Bestimmung des aus den Partikeln frei werdenden Wirkstoffs erfolgt mittels verschiedener Methoden, wie HPLC, verschiedenen Protein-Assays (Lowry- oder BCA-Assay), Elektronenspinresonanz (ESR) usw. (2).The quantitative determination of the drug released from the particles takes place by means of various methods, such as HPLC, various protein assays (Lowry or BCA assay), electron spin resonance (ESR), etc. ( 2 ).

Beispiel 4:Example 4:

Kopplung von Farbstoffen und Proteinen an die Nanopartikel-OberflächeCoupling of dyes and proteins to the nanoparticle surface

10 mg der hergestellten bioabbaubaren PLGA-Nanopartikel (aus Beispiel 1) werden in 0,4 mL 0,1 M MES-Puffer suspendiert. Hierzu werden 300 μL einer Lösung aus Fluoresceinamin (3 mg/mL) gegeben. Es können jedoch auch Proteine wie z. B. Integrine an die Partikeloberfläche gebunden werden. Tropfenweise wird 160 μL EDC-Lösung (c = 110 mg/mL) zugegeben und bei Raumtemperatur über Nacht geschüttelt. Die Suspension wird zentrifugiert und das Pellet in Puffer gewaschen. Es konnte eine Anbindung von 3 μmol Fluoresceinamin pro g Partikel erzielt werden.10 mg of biodegradable prepared PLGA nanoparticles (from Example 1) are suspended in 0.4 mL of 0.1 M MES buffer. To do this 300 μL of a solution of fluoresceinamine (3 mg / mL) given. However, it can also proteins such. B. integrins be bound to the particle surface. Dropwise will 160 μL EDC solution (c = 110 mg / mL) was added and shaken at room temperature overnight. The suspension is centrifuged and the pellet washed in buffer. It could a binding of 3 μmol fluoresceinamine per g particle be achieved.

Beispiel 5:Example 5:

Herstellung von oberflächenmodifizierten Silica-Nanopartikeln für das im Anschluss ausgeführte Beispiel mit ZellenProduction of surface-modified Silica nanoparticles for the following Example with cells

Synthese von Silica-Partikeln:Synthesis of silica particles:

Zu 200 ml Ethanol werden 12 mmol Tetraethoxysilan und 90 mmol NH3 gegeben. Dann wird 24 h bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend werden die Partikel durch mehrfache Zentrifugation gereinigt. Es resultieren 650 mg Silica-Partikel mit einer mittleren Partikelgröße von 125 nm.To 200 ml of ethanol are added 12 mmol tetraethoxysilane and 90 mmol NH 3 . Then it is stirred for 24 h at room temperature. Subsequently, the particles are cleaned by multiple centrifugation. This results in 650 mg of silica particles with an average particle size of 125 nm.

Aminofunktionalisierung von Silica-Partikeln:Aminofunctionalization of silica particles:

Eine 1 Gew.-% wässrige Suspension der Silica-Partikel wird mit 10 Vol.-% 25% Ammoniak versetzt. Dann werden 20 Gew.-% Aminopropyltriethoxysilan, bezogen auf die Partikel, zugegeben und es wird 1 h bei Raumtemperatur gerührt. Die Partikel werden durch mehrfache Zentrifugation gereinigt und tragen funktionelle Aminogruppen auf ihrer Oberfläche (Zeta-Potenzial in 0,1 M Acetat-Puffer: + 35 mV).A 1 wt .-% aqueous suspension of the silica particles is with 10 vol .-% 25% ammonia added. Then 20% by weight of aminopropyltriethoxysilane, based on the particles, and it is 1 h at room temperature touched. The particles are made by multiple centrifugation cleaned and carry functional amino groups on their surface (Zeta potential in 0.1 M acetate buffer: + 35 mV).

Carboxyfunktionalisierung von Silica-Partikeln:Carboxy Functionalization of Silica Particles:

10 ml einer 2 Gew.-% Suspension aminofunktionalisierter Nanopartikel werden in Tetrahydrofuran aufgenommen. Dazu werden 260 mg Bernsteinsäureanhydrid gegeben. Nach einer 5-minütigen Behandlung mit Ultraschall wird 1 h bei Raumtemperatur gerührt. Die Partikel werden durch mehrfache Zentrifugation gereinigt und tragen funktionelle Carboxygruppen auf ihrer Oberfläche (Zeta-Potenzial in 0,1 M Acetat-Puffer: – 35 mV). Die mittlere Partikelgröße beträgt 170 nm.10 ml of a 2% by weight suspension of amino-functionalized nanoparticles are taken up in tetrahydrofuran. This will be 260 mg of succinic anhydride given. After a 5-minute ultrasound treatment is stirred for 1 h at room temperature. The particles become purified by multiple centrifugation and carry functional Carboxy groups on their surface (zeta potential in 0.1 M acetate buffer: - 35 mV). The mean particle size is 170 nm.

Beispiel 6:Example 6:

Optimierte Zellkulturbedingungen durch Nanopartikel-modifizierte OberflächenOptimized cell culture conditions by nanoparticle-modified surfaces

Es werden vergleichende Untersuchungen zur Adhäsion, Proliferation, Migration und Differenzierung primärer epidermaler Zellen an den modifizierten Oberflächen durchgeführt. Die modifizierten Oberflächen umfassen neben den Nanopartikeln auch eine faserartige Gerüststruktur. In dieser faserartigen Gerüststruktur liegen die inokulierten Nanopartikel mit einem Abstand von 10 bis 1000 nm vor.It comparative studies on adhesion, proliferation, Migration and differentiation of primary epidermal cells performed on the modified surfaces. The modified surfaces include besides the nanoparticles also a fibrous framework structure. In this fibrous Framework structure are the inoculated nanoparticles with at a distance of 10 to 1000 nm.

Zur Oberflächenmodifikation werden Ojektträger (OT) zunächst mit einer 2% (v/v) Hellmanex II Lösung in einem Wasserbad bei 40°C gereinigt. Eine anschließende Hydroxylierung der Oberflächen erfolgt bei 70°C in einer 3:1 (v/v) NH3 (30%) und H2O2 (25%)-Lösung, um eine negative Ladung zu erzeugen. Vor oder nach der Hydroxylierung erfolgt eine Beschichtung mit beispielsweise einer Kollagenlösung, zum Beispiel Kollagen Typ I, in einer Konzentration von 0,1 bis 6 mg/ml, in an sich bekannter Weise.For surface modification, slides (OT) are first cleaned with a 2% (v / v) Hellmanex II solution in a 40 ° C water bath. Subsequent hydroxylation of the surfaces occurs at 70 ° C in a 3: 1 (v / v) NH 3 (30%) and H 2 O 2 (25%) solution to produce a negative charge. Before or after the hydroxylation is carried out a coating with, for example, a collagen solution, for example collagen type I, in a concentration of 0.1 to 6 mg / ml, in a conventional manner.

Die Polyelektrolyt-Beschichtung der Oberflächen entsteht durch die sog. Lager-by-Lager-Technik. Bei der Methode werden die frisch gereinigten und negativ geladenen OT zuerst in eine kationische Poly(allylamin-hydrochlorid)-Lösung (PAH-Lösung) (0,01 M; bezogen auf das Monomer) oder Poly(diallyl-dimethyl-ammoniumchlorid)-Lösung (PDADMAC-Lösung) (0,02 M; bezogen auf das Monomer) gelegt und mindestens 20 min bei Raumtemperatur inkubiert. Für die anschließende Beschichtung mit den Carboxy-Nanopartikeln ist die Ausbildung von nur einer kationischen PE-Schicht ausreichend. Für die Beschichtung mit den Amino-Nanopartikel ist es notwendig, die OT nach PAH-Beschichung 20 min in einer anionischen Polyacrylsäure-Lösung (PAA-Lösung) (0,01 M; bezogen auf das Monomer) zu inkubieren. Die Anbindung der Silica-Nanopartikel erfolgt über elektrostatische Anziehungskräfte. Die Carboxy-Nanopartikel werden von dem kationischen Polyelektrolyt PAH und die Amino-Nanopartikel von dem anionischen Polyelektrolyt PAA angezogen. Anschließend erfolgt die Sterilisation der Oberflächen mit 70% Ethanol.The polyelectrolyte coating of the surfaces is created by the so-called warehouse-by-warehouse technique. In the method, the freshly purified and negatively charged OTs are first made into a cationic poly (allylamine hydrochloride) solution (PAH solution) (0.01 M, based on the monomer) or poly (diallyl-dimethyl-ammonium chloride) solution (PDADMAC solution) (0.02 M, based on the monomer) and at least 20 min incubated at room temperature. For the subsequent coating with the carboxy nanoparticles, the formation of only one cationic PE layer is sufficient. For coating with the amino nanoparticles, it is necessary to incubate the OT after PAH coating for 20 minutes in an anionic polyacrylic acid solution (PAA solution) (0.01 M, based on the monomer). The binding of the silica nanoparticles takes place via electrostatic attraction forces. The carboxy nanoparticles are attracted by the cationic polyelectrolyte PAH and the amino nanoparticles by the anionic polyelectrolyte PAA. Subsequently, the surfaces are sterilized with 70% ethanol.

Die Ergebnisse sind für die unterschiedlichen Oberflächenmodifikationen ausführlich in Tabelle 1 dargestellt. Die Tabelle 1 zeigt Beobachtungen zu Morphologie humaner Keratinozyten auf den Carboxy- und Amino-Nanopartikel. Es wurden Versuche zu modifizierten Oberflächen mit Triplikaten mit jeweils n = 3 Proben durchgeführt. Es wurde sowohl die Koloniedichte und damit die adhärente Zellzahl und Proliferation, als auch die Morphologie und damit der Differenzierungszustand der primären Zellen bewertet. Auf den modifizierten Oberflächen mit faserartiger Gerüststruktur findet eine deutlich schnellere Adhäsion und Ausspreizen (3) der Keratinozyten im Gegensatz zur Kulturflasche (4) statt. Besonders die mit Nanopartikeln modifizierten Oberflächen induzieren ein schnelles Ausspreizen, die schon nach wenigen Stunden sichtbar ist.The results are shown in detail in Table 1 for the different surface modifications. Table 1 shows observations on the morphology of human keratinocytes on the carboxy and amino nanoparticles. Experiments on modified surfaces with triplicates with n = 3 samples each were carried out. Both the colony density and thus the adherent cell number and proliferation as well as the morphology and thus the differentiation status of the primary cells were evaluated. On the modified surfaces with a fibrous framework structure, a significantly faster adhesion and spreading ( 3 ) of the keratinocytes in contrast to the culture flask ( 4 ) instead of. In particular, the nanoparticle-modified surfaces induce rapid spreading, which is visible within a few hours.

Die Morphologie der primären epidermalen Zellen war auf diesen modifizierten Substraten vergleichbar mit der Zellkulturflasche. Des weiteren war eine schnellere Differenzierung der primären Zellen auf den aminofunktionalisierten Oberflächen (6) zu sehen, wohingegen die Differenzierung der Keratinozyten auf den carboxyoberflächen, denen der Kontrollen entsprach (5). Tabelle 1 Versuch Nr. Tag 1 Tag 2 Tag 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 Glasobjektträger mit PAH K = + M = + K = +(+) M = + K = +(+) M = 0 K = ++ M = (+) K = ++ M = + K = ++ M = 0 K = ++ M = – K = ++(+) M = + - Nanopartikel Carboxy-mit PAH und Glasobjektträger K = ++ M = (+) K = + M = + K = +(+) M = 0 Auf einem OT* K = ++(+) M = + Auf anderen OT* M = (0) K = ++ M = + K = ++(+) M = – K = ++(+) M = – K = ++(+) M = 0 - mit PAA Glasobjektträger K = ++ M = + K = ++ M = +(+) K = ++ M = 0 K = ++ M = 0 K = ++(+) M = +(+) K = ++ M = 0 K = ++ M = – K = ++(+) - Nanopartikel Amino-mit PAA und Glasobjektträger K = ++(+) M = +(+) K = ++ M = + K = ++ M = + K = ++ M = (+) K = +++ M = + K = ++(+) M = + K = ++(+) M = – Auf OT*1 M = – Auf OT*2 K = +++ M = +(+) Auf OT*3 M = – - Glasobjektträger K = + M = + K = (+) M = +(+) K = + M = 0 K = ++ M = + K = ++ M = +(+) K = ++ M = – K = ++ M = – K = ++ M = + - Zellkulturflasche (Greiner) K = 0 K = + M = ++ K = 0 K = + M = ++ K = + M = ++ K = + M = ++ K = ++ M = ++ K = ++ M = ++ -

  • K = Koloniedichte: 0: keine Kolonien oder weniger als 5 Zellen pro Kolonie, +: Kolonien < 20 Zellen pro Kolonie, ++: Kolonien > 20 Zellen pro Kolonie, +++: Zellrasen M = Morphologie: –: Zellen in sehr später Differenzierungsphase oder tote, nicht adhärente Zellen, 0: differenzierte Zellen, ausgestreckte Form, das Cytoplasma ist im Vergleich zum Kern groß, +: Zellen in früher Differenzierungsphase, einige später differenzierte, ++: alle Zellen in früher Differenzierungsphase, kubische Gestalt, Verhältnis Cytoplasma/Kern ausgewogen *OT = Objektträger
The morphology of the primary epidermal cells was comparable to the cell culture flask on these modified substrates. Furthermore, a faster differentiation of the primary cells on the amino-functionalized surfaces ( 6 ), whereas the differentiation of the keratinocytes on the carboxy surfaces corresponded to the controls ( 5 ). Table 1 Experiment No. day 1 day 2 Day 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 Glass slide with PAH K = + M = + K = + (+) M = + K = + (+) M = 0 K = ++ M = (+) K = ++ M = + K = ++ M = 0 K = ++ M = - K = ++ (+) M = + - Nanoparticles carboxy-containing PAH and glass slides K = ++ M = (+) K = + M = + K = + (+) M = 0 On an OT * K = ++ (+) M = + On other OT * M = (0) K = ++ M = + K = ++ (+) M = - K = ++ (+) M = - K = ++ (+) M = 0 - with PAA glass slide K = ++ M = + K = ++ M = + (+) K = ++ M = 0 K = ++ M = 0 K = ++ (+) M = + (+) K = ++ M = 0 K = ++ M = - K = ++ (+) - Nanoparticles amino with PAA and glass slides K = ++ (+) M = + (+) K = ++ M = + K = ++ M = + K = ++ M = (+) K = +++ M = + K = ++ (+) M = + K = ++ (+) M = - On OT * 1 M = - On OT * 2 K = +++ M = + (+) On OT * 3 M = - - Glass slides K = + M = + K = (+) M = + (+) K = + M = 0 K = ++ M = + K = ++ M = + (+) K = ++ M = - K = ++ M = - K = ++ M = + - Cell culture bottle (Greiner) K = 0 K = + M = ++ K = 0 K = + M = ++ K = + M = ++ K = + M = ++ K = ++ M = ++ K = ++ M = ++ -
  • K = colony density: 0: no colonies or less than 5 cells per colony, +: colonies <20 cells per colony, ++: colonies> 20 cells per colony, +++: cell lawn M = morphology: -: cells in very later Differentiation phase or dead, non-adherent cells, 0: differentiated cells, outstretched form, the cytoplasm is large compared to the nucleus, +: cells in early differentiation phase, some later differentiated, ++: all cells in early differentiation phase, cubic shape, cytoplasmic ratio / Core balanced * OT = slide

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Zitierte PatentliteraturCited patent literature

  • - DE 10144252 A1 [0010] - DE 10144252 A1 [0010]
  • - DE 10031859 A1 [0010] DE 10031859 A1 [0010]
  • - US 4521317 [0011] US 4521317 [0011]
  • - US 4021364 [0011] US 4021364 [0011]

Claims (60)

Zellkultursystem, umfassend eine dreidimensionale biokompatible Gerüststruktur und biokompatible Nanopartikel.Cell culture system comprising a three-dimensional biocompatible scaffold structure and biocompatible nanoparticles. Zellkultursystem nach Anspruch 1, wobei die Nanopartikel mindestens einen Wirkstoff aufweisen.The cell culture system of claim 1, wherein the nanoparticles have at least one active ingredient. Zellkultursystem nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Nanopartikel einen Durchmesser von 50 bis 1000 nm, vorzugsweise von 60 bis 600 nm aufweisen.A cell culture system according to claim 1 or 2, wherein said Nanoparticles have a diameter of 50 to 1000 nm, preferably from 60 to 600 nm. Zellkultursystem nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei die Nanopartikel einen Durchmesser von 80 bis 150 nm, vorzugsweise von 50 bis 150 nm aufweisen.A cell culture system according to claim 1, 2 or 3, wherein the nanoparticles have a diameter of 80 to 150 nm, preferably from 50 to 150 nm. Zellkultursystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Nanopartikel aus anorganischen Polymeren, Gold, Edelmetallen, Metallen, Metalloxiden, Calciumphosphaten, Calciumhydrogenphosphaten, Mischphosphaten, Siliziumbasierten oxidischen Materialen, wie Silicaten, Siliziumoxiden, Siliziumdioxid, aufgebaut sind.Cell culture system according to one of the preceding claims, wherein the nanoparticles of inorganic polymers, gold, precious metals, Metals, metal oxides, calcium phosphates, calcium hydrogen phosphates, Mixed phosphates, silicon-based oxidic materials, such as silicates, Silicon oxides, silicon dioxide, are constructed. Zellkultursystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Nanopartikel aus organischen Polymeren aufgebaut sind.Cell culture system according to one of the preceding claims, wherein the nanoparticles are composed of organic polymers. Zellkultursystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Nanopartikel aus bioabbaubaren Polymeren aufgebaut sind.Cell culture system according to one of the preceding claims, wherein the nanoparticles are composed of biodegradable polymers. Zellkultursystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Nanopartikel aus Polylactiden (PLA), Poly(lactid-co-glycolid)e (PLGA), Polycaprolactonen, Polyglycoliden (PCL), Di- und Tri-Block-Polymeren bspw. PCL/PGA-Di-Block-Systemen, Polyorthoestern (POE), Polyanhydride, Polyhydroxyalkanoaten (PHA) oder Polypyrrolen (PPy), Polypropylencarbonat, Polyethylencarbonat, Polyalkylcyanonitril oder Polyethylenglycol aufgebaut sind.Cell culture system according to one of the preceding claims, wherein the nanoparticles of polylactides (PLA), poly (lactide-co-glycolide) e (PLGA), polycaprolactones, polyglycolides (PCL), di- and tri-block polymers eg PCL / PGA-Di-Block systems, polyorthoesters (POE), polyanhydrides, Polyhydroxyalkanoates (PHA) or polypyrroles (PPy), polypropylene carbonate, Polyethylene carbonate, polyalkylcyanonitrile or polyethylene glycol are constructed. Zellkultursystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Nanopartikel eingeschlossene oder auf ihrer Oberfläche aufgebrachte Wirkstoffe aufweisen.Cell culture system according to one of the preceding claims, where the nanoparticles are trapped or on their surface have applied active ingredients. Zellkultursystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Nanopartikel aus Polymeren mit unterschiedlichem Molekulargewicht und unterschiedlicher Polarität aufgebaut sind, die ein bestimmtes Freisetzungsprofil des in den Nanopartikel eingeschlossenen Wirkstoffs gewährleisten.Cell culture system according to one of the preceding claims, wherein the nanoparticles of polymers of different molecular weight and different polarity are built, the one specific release profile of the nanoparticles enclosed Ensure active ingredient. Zellkultursystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Nanopartikel durch ein Emulsionspolymerisationsverfahren hergestellt sind.Cell culture system according to one of the preceding claims, wherein the nanoparticles by an emulsion polymerization process are made. Zellkultursystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Einschluss von Wirkstoffen in Nanopartikel durch Wasser-in-Öl-in-Wasser-Technik erfolgt.Cell culture system according to one of the preceding claims, the inclusion of drugs in nanoparticles by water-in-oil-in-water technique he follows. Zellkultursystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Wirkstoffe Wachstumsfaktoren, Cytokine, Chemokine, Vitamine, Mineralstoffe, Fette, Proteine, Nährstoffe, faserbildende Proteine, Kohlenhydrate, Adhäsionsproteine, Integrine, Zellrezeptoren, Pharmazeutika, DNA, RNA, Aptamere, angiogene Faktoren, Lektine, Antikörper, Antikörperfragmente, Farbstoffe, Fluoresceinamine oder Inhibitoren sind.Cell culture system according to one of the preceding claims, where the active ingredients are growth factors, cytokines, chemokines, vitamins, Minerals, fats, proteins, nutrients, fiber-forming Proteins, Carbohydrates, Adhesion Proteins, Integrins, Cell receptors, pharmaceuticals, DNA, RNA, aptamers, angiogenic factors, Lectins, antibodies, antibody fragments, dyes, Fluoresceinamine or inhibitors are. Zellkultursystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Nanopartikel Stabilisatoren aufweisen.Cell culture system according to one of the preceding claims, wherein the nanoparticles comprise stabilizers. Zellkultursystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Stabilisatoren Kohlenhydrate, Proteine, Polyethylenglycole oder Detergenzien sind.Cell culture system according to one of the preceding claims, the stabilizers being carbohydrates, proteins, polyethylene glycols or detergents. Zellkultursystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Nanopartikel durch Kopplung mit funktionellen Gruppen funktionalisiert sind.Cell culture system according to one of the preceding claims, where the nanoparticles by coupling with functional groups functionalized. Zellkultursystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei auf der Oberfläche der Nanopartikel eine erste funktionelle Gruppe 1A aufgebracht ist, die mit einer komplementären Gruppe 2A auf einem Wirkstoff eine affine Bindung, bevorzugt eine kovalente Bindung eingehen kann.Cell culture system according to one of the preceding claims, being on the surface of the nanoparticles a first functional Group 1A is applied with a complementary Group 2A on an active substance an affine bond, preferably a Covalent bond can enter. Zellkultursystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die erste funktionelle Gruppe 1A auf der Oberfläche der Nanopartikel und die komplementäre Gruppe 2A eines Wirkstoffs ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Aminogruppe, Carboxygruppe, Epoxygruppe, Maleinimidogruppe, Alkylketongruppe, Aldehydgruppe, Hydrazingruppe, Hydrazidgruppe, Thiolgruppe und Thioestergruppe.Cell culture system according to one of the preceding claims, wherein the first functional group 1A is on the surface the nanoparticles and the complementary group 2A of a Active substance selected from the group consisting of Amino group, carboxy group, epoxy group, maleimido group, alkyl ketone group, Aldehyde group, hydrazine group, hydrazide group, thiol group and thioester group. Zellkultursystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei auf der Oberfläche der Nanopartikel eine zweite funktionelle Gruppe 1B aufgebracht ist, die mit einer komplementären Gruppe 2B auf einem Wirkstoff eine affine Bindung, bevorzugt eine nicht-kovalente Bindung eingehen kann.Cell culture system according to one of the preceding claims, being on the surface of the nanoparticles a second functional Group 1B is applied with a complementary Group 2B on an active substance an affine bond, preferably a non-covalent bond. Zellkultursystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die zweite funktionelle Gruppe 1B auf der Oberfläche der Nanopartikel und die komplementäre Gruppe 2B eines Wirkstoffs ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Oligohistidingruppe, Strep-Tag I, Strep-Tag II, Desthiobiotin, Biotin, Chitin, Chitinderivate, Chitinbindedomäne, Metallionenchelatkomplex, Streptavidin, Streptactin, Avidin und Neutravidin.Cell culture system according to one of the preceding claims, wherein the second functional group 1B is on the surface the nanoparticles and the complementary group 2B one Active substance selected from the group consisting of Oligohistidine group, Strep-Tag I, Strep-Tag II, Desthiobiotin, Biotin, Chitin, chitin derivatives, chitin binding domain, metal ion chelate complex, Streptavidin, streptactin, avidin and neutravidin. Zellkultursystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die dreidimensionale Gerüststruktur ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Laminine, Glycosaminoglykane (GAG), Proteoglykane, Elastin, Kollagene vom Typ I bis IV, Entaktin (Nidogen), Vitronektin, Hyaluronsäure, Heparansulfat, Dermatansulfat, Chondroitinsulfat, Keratansulfat, Perlecan, Adhäsionsproteine und Fibronektin.Cell culture system according to one of the preceding claims, wherein the three-dimensional framework structure is selected is from the group consisting of laminins, glycosaminoglycans (GAG), Proteoglycans, elastin, type I to IV collagens, entactin (nidogen), Vitronectin, hyaluronic acid, heparan sulfate, dermatan sulfate, chondroitin sulfate, Keratan sulfate, perlecan, adhesion proteins and fibronectin. Zellkultursystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Gerüststruktur in Faserform vorliegt.Cell culture system according to one of the preceding claims, wherein the framework structure is in fiber form. Zellkultursystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Gerüststruktur in dreidimensional hydrogelartiger oder schwammartiger Form vorliegt.Cell culture system according to one of the preceding claims, wherein the framework structure in three-dimensional hydrogelartiger or spongy form. Zellkultursystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die dreidimensionale biokompatible Gerüststruktur eine extrazelluläre Matrix ist.Cell culture system according to one of the preceding claims, wherein the three-dimensional biocompatible scaffold structure is an extracellular matrix. Zellkultursystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Nanopartikel in dem Zellkultursystem integral verteilt oder in Schichtform vorliegen.Cell culture system according to one of the preceding claims, wherein the nanoparticles are distributed integrally in the cell culture system or in layer form. Zellkultursystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die in Schichtform vorliegenden Nanopartikel unterhalb der Gerüststruktur angeordnet sind.Cell culture system according to one of the preceding claims, wherein the layered nanoparticles below the Scaffold structure are arranged. Zellkultursystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Nanopartikel, insbesondere wirkstoffbeladene Nanopartikel, in Form eines Gradienten innerhalb der Gerüststruktur in auf- oder absteigender Menge verteilt vorliegen.Cell culture system according to one of the preceding claims, wherein the nanoparticles, in particular active substance-loaded nanoparticles, in the form of a gradient within the framework structure in distributed in ascending or descending quantities. Zellkultursystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei sich ein Wirkstoff-Gradient innerhalb der Gerüststruktur dadurch ausbildet, dass Nanopartikel mit jeweils gleicher Konzentration eines eingeschlossenen oder geträgerten Wirkstoffs innerhalb der Gerüststruktur in definierten Bereichen in unterschiedlicher Anzahl vorliegen.Cell culture system according to one of the preceding claims, wherein a drug gradient within the framework structure formed by the fact that nanoparticles each with the same concentration an enclosed or supported drug within the framework structure in defined areas in different Number present. Zellkultursystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei sich ein Wirkstoff-Gradient innerhalb der Gerüststruktur dadurch ausbildet, dass Nanopartikel homogen in der Gerüststruktur verteilt vorliegen, die unterschiedliche Konzentrationen eines eingeschlossenen oder geträgerten Wirkstoffs aufweisen.Cell culture system according to one of the preceding claims, wherein a drug gradient within the framework structure thereby forming that nanoparticles homogeneous in the framework structure distributed, the different concentrations of a trapped or supported drug. Zellkultursystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei sich ein Wirkstoff-Gradient innerhalb der Gerüststruktur dadurch ausbildet, dass Nanopartikel mit unterschiedlichen Konzentrationen eines eingeschlossenen oder geträgerten Wirkstoffs innerhalb der Gerüststruktur in definierten Bereichen in unterschiedlicher Anzahl vorliegen.Cell culture system according to one of the preceding claims, wherein a drug gradient within the framework structure by forming nanoparticles with different concentrations a trapped or supported drug within the Scaffolding structure in defined areas in different Number present. Zellkultursystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Zellkultursystem ein System mit kontrollierter, verzögerter Wirkstofffreisetzung ist.Cell culture system according to one of the preceding claims, the cell culture system being a controlled, delayed Drug release is. Zellkultursystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Nanopartikel mit der Gerüststruktur verbunden sind.Cell culture system according to one of the preceding claims, wherein the nanoparticles are connected to the framework structure are. Zellkultursystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei Nanopartikel durch elektrostatische Wechselwirkungen mit der Gerüststruktur verbunden sind.Cell culture system according to one of the preceding claims, being nanoparticles through electrostatic interactions with the Framework structure are connected. Zellkultursystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei Nanopartikel durch ionische Bindung mit der Gerüststruktur verbunden sind.Cell culture system according to one of the preceding claims, where nanoparticles are formed by ionic bonding with the framework structure are connected. Zellkultursystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei Nanopartikel durch UV-Crosslinking mit der Gerüststruktur verbunden sind.Cell culture system according to one of the preceding claims, being nanoparticles by UV crosslinking with the framework structure are connected. Zellkultursystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Zellkultursystem zur Durchführung von Migrationsversuchen, insbesondere von in vivo Migrationsversuchen eingesetzt wird.Cell culture system according to one of the preceding claims, the cell culture system being used to carry out migration experiments, is used in particular by in vivo migration experiments. Zellkultursystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Zellkultursystem durch ein kontaktloses Printverfahren hergestellt wird.Cell culture system according to one of the preceding claims, wherein the cell culture system by a contactless printing method will be produced. Zellkultursystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Zellkultursystem durch Imprägnieren hergestellt wird.Cell culture system according to one of the preceding claims, wherein the cell culture system is made by impregnation becomes. Zellkultursystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Zellkultursystem durch ein LIFT-Verfahren hergestellt wird.Cell culture system according to one of the preceding claims, wherein the cell culture system is made by a LIFT method becomes. Zellkultursystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Zellkultursystem durch Elektro-spinning (Spincoating) hergestellt wird.Cell culture system according to one of the preceding claims, wherein the cell culture system by electro-spinning (spincoating) will be produced. Verfahren zur Herstellung eines Zellkultursystems nach einem der Ansprüche 1 bis 40, wobei biokompatible Nanopartikel mit einer dreidimensionalen biokompatiblen Gerüststruktur in Kontakt gebracht werden.Process for the preparation of a cell culture system according to any one of claims 1 to 40, wherein biocompatible Nanoparticles with a three-dimensional biocompatible scaffold structure be brought into contact. Verfahren zur Herstellung eines Zellkultursystems nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Zellkultursystem durch ein kontaktloses Printverfahren hergestellt wird.Process for the preparation of a cell culture system according to any one of the preceding claims, wherein the cell culture system is produced by a contactless printing process. Verfahren zur Herstellung eines Zellkultursystems nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Zellkultursystem durch ein Imprägnieren einer dreidimensionalen Gerüststruktur mit Nanopartikeln hergestellt wird.Process for the preparation of a cell culture system according to any one of the preceding claims, wherein the cell culture system by impregnating a three-dimensional framework structure produced with nanoparticles. Verfahren zur Herstellung eines Zellkultursystems nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Zellkultursystem durch ein LIFT-Verfahren hergestellt wird.Process for the preparation of a cell culture system according to any one of the preceding claims, wherein the cell culture system produced by a LIFT method. Verfahren zur Herstellung eines Zellkultursystems nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Zellkultursystem durch Elektro-spinning (Spincoating) hergestellt wird.Process for the preparation of a cell culture system according to any one of the preceding claims, wherein the cell culture system produced by electro-spinning (spincoating). Verfahren zur Kultivierung von Zellen, wobei Zellen in ein ein Zellkultursystem nach einem der Ansprüche 1 bis 45 enthaltendes Zellkulturgefäß eingebracht und dort in einem Zellkulturmedium unter geeigneten Bedingungen, die eine Kultivierung ermöglichen, kultiviert werden.Method for cultivating cells, wherein cells in a cell culture system according to any one of claims 1 introduced to 45 containing cell culture vessel and there in a cell culture medium under suitable conditions, which allow a cultivation to be cultivated. Verfahren nach Anspruch 46, wobei die Zellen primäre Zellen sind.The method of claim 46, wherein the cells are primary Cells are. Verfahren nach einem Ansprüche 46 oder 47, wobei die primären Zellen embryonale Stammzellen sind, insbesondere aus dem Nabelschnurblut gewonnene omnipotente oder pluripotente Stammzellen.A method according to claims 46 or 47, wherein the primary cells are embryonic stem cells, especially from umbilical cord blood derived omnipotent or pluripotent stem cells. Verfahren nach einem der Ansprüche 46 oder 47, wobei die primären Zellen adulte Stammzellen, insbesondere Epithelzellen, dendritischen Zellen, Bindegewebszellen, Adipocyten, mesenchymale Zellen oder Knochenmarkszellen sind.Method according to one of claims 46 or 47, wherein the primary cells are adult stem cells, in particular Epithelial cells, dendritic cells, connective tissue cells, adipocytes, mesenchymal cells or bone marrow cells. Verfahren nach einem der Ansprüche 46 oder 47, wobei die Zellen Tumorzellen, insbesondere Tumorzelllinien wie MCF-7, HeLa, HepG2, PC3, CT-26, A125, A549, MRC-5, CHO, MelJuso28, Nalm6 oder Jurkat sind.Method according to one of claims 46 or 47, wherein the cells are tumor cells, in particular tumor cell lines such as MCF-7, HeLa, HepG2, PC3, CT-26, A125, A549, MRC-5, CHO, MelJuso28, Nalm6 or Jurkat are. Verfahren nach einem der Ansprüche 46 oder 47, wobei die Zellen adhärente Zellen, bevorzugt adhärente Zelllinien wie HUVEC oder HaCaT.Method according to one of claims 46 or 47, wherein the cells are adherent cells, preferably adherent Cell lines such as HUVEC or HaCaT. Verfahren nach einem der Ansprüche 46 oder 47, wobei die Zellen ausdifferenzierte Zellen sind.Method according to one of claims 46 or 47, wherein the cells are differentiated cells. Verfahren zur Herstellung von Expressionsprodukten einer Zelle, wobei die Zelle in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 46 bis 52 kultiviert und das Expressionsprodukt gewonnen wird.Process for the preparation of expression products of a cell, wherein the cell is in a process according to any one of claims 46 to 52 cultivated and the expression product is obtained. Verfahren zur Herstellung differenzierter Zellen oder Zellverbände, wobei undifferenzierte Zellen in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 46 bis 52 kultiviert und differenzierte Zellen oder Zellverbände gewonnen werden.Process for producing differentiated cells or cell aggregates, wherein undifferentiated cells in one Process according to one of claims 46 to 52 cultivated and differentiated cells or cell aggregates are obtained. Verfahren nach dem Anspruch 54, wobei die Zellverbände, Transplantate oder Testsysteme sind.The method of claim 54, wherein the cell aggregates, Grafts or test systems are. Verfahren nach Anspruch 54, wobei die Zellverbände Organe, Organteile, insbesondere eine Trachea sind.The method of claim 54, wherein the cell aggregates Organs, organ parts, especially a trachea are. Expressionsprodukte einer Zelle, hergestellt durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 46 bis 56.Expression products of a cell produced by the method according to any one of claims 46 to 56. Differenzierte Zellen oder Zellverbände, hergestellt durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 46 bis 56.Differentiated cells or cell aggregates, manufactured by the method according to one of the claims 46 to 56. Transplantate oder Testsysteme, hergestellt durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 46 bis 56.Grafts or test systems manufactured by the method according to any one of claims 46 to 56. Organe, Organteile, insbesondere Trachea, hergestellt durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 46 bis 56.Organs, parts of organs, especially trachea by the method according to any one of claims 46 to 56.
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