DE10217948B4

DE10217948B4 - Method and apparatus for preparing Raman and SER spectroscopic measurements of biological and chemical samples

Info

Publication number: DE10217948B4
Application number: DE10217948A
Authority: DE
Inventors: Wolfgang Kiefer; Juergen Popp; Ralph Gesner; Petra Roesch
Original assignee: Individual
Current assignee: Friedrich Schiller Universtaet Jena FSU
Priority date: 2002-04-22
Filing date: 2002-04-22
Publication date: 2007-04-05
Anticipated expiration: 2022-04-23
Also published as: DE10217948A1

Abstract

Verfahren zum Messen biologischer und/oder chemischer Probenparameter mittels spektroskopischer Verfahren, insbesondere mit Hilfe der Ramanspektroskopie, bei welchem
• eine Probe (3) mit Laserlicht (15) beleuchtet wird,
• die Probe (3) durch Wechselwirkung mit dem Laserlicht (15) Streustrahlung (16) emittiert,
• eine spektrale Zerlegung der Streustrahlung (16) erfolgt, und
• die von der Probe 3 emittierte Streustrahlung (16) von einer Detektionseinheit (10) detektiert wird
wobei
• zuerst ein als metallisch beschichtete Glasfaserspitze (4) ausgebildetes Ende einer Glasfaser (2) mittels einer Positioniereinrichtung (5) auf oder in die Probe (3) positioniert wird
• dann mittels eines Anregungslasers (1) eine Beleuchtung der Probe (3) mit Laserlicht (15) durch die erste Glasfaser (2) erfolgt, und
• die von der Probe (3) emittierte Streustrahlung (16) mit Hilfe eines abbildenden optischen Systems (7) fokussiert und in eine zweite Glasfaser (8) eingekoppelt wird
dadurch gekennzeichnet,
dass die Laserleistung...Method for measuring biological and / or chemical sample parameters by means of spectroscopic methods, in particular with the aid of Raman spectroscopy, in which
A sample (3) is illuminated with laser light (15),
The sample (3) emits scattered radiation (16) by interaction with the laser light (15),
• a spectral decomposition of the scattered radiation (16) takes place, and
• the scattered radiation (16) emitted by the sample 3 is detected by a detection unit (10)
in which
• First, an end of a glass fiber (2) designed as a metallically coated glass fiber tip (4) is positioned on or in the sample (3) by means of a positioning device (5)
Then, by means of an excitation laser (1), the sample (3) is illuminated with laser light (15) through the first glass fiber (2), and
The scattered radiation (16) emitted by the sample (3) is focused by means of an imaging optical system (7) and coupled into a second glass fiber (8)
characterized,
that the laser power ...

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 1 und eine Vorrichtung gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 8 zur spektroskopischen Untersuchung biologischer und/oder chemischer Proben, insbesondere mit Hilfe der Ramanspektroskopie.The The invention relates to a method according to the preamble of the claim 1 and a device according to the preamble of claim 8 for the spectroscopic examination of biological and / or chemical samples, in particular using Raman spectroscopy.

Bei der Ramanspektroskopie wird die inelastische Streuung von Photonen an Molekülen beobachtet. Bei der Streuung von Licht an Molekülen werden die meisten Photonen elastisch gestreut. Die gestreuten Photonen haben dann dieselbe Energie wie die eingestrahlten Photonen. Ein kleiner Teil des gestreuten Lichts wird jedoch inelastisch gestreut, so dass das Streulicht auch Frequenzen aufweist, die sich von der des eingestrahlten Lichts unterscheiden. Der Effekt, der zu dieser inelastischen Streuung führt, wird als Ramaneffekt bezeichnet. Die Energieänderungen bei der Ramanstreuung beruhen auf An- und/oder Abregungen von vibronischen Zuständen der bestrahlten Moleküle. Die Energiedifferenz von den eingestrahlten und den gestreuten Photonen ist die Energie die benötigt wird, um einen vibronischen Zustand an- oder abzuregen.at Raman spectroscopy is the inelastic scattering of photons on molecules observed. When scattering light to molecules, most photons become elastically scattered. The scattered photons will then have the same Energy like the irradiated photons. A small part of the scattered Light, however, is inelastically scattered, so that the stray light also has frequencies different from that of the incident light differ. The effect leading to this inelastic scattering leads, becomes referred to as Raman effect. The energy changes in Raman scattering are based on on and / or de-excitations of vibronic states of the irradiated molecules. The energy difference between the irradiated and the scattered photons is the energy needed is to to a vibronic state on or off.

Die Messung solcher Schwingungszustände durch Ramanspektroskopie erfolgt durch Bestrahlung der zu untersuchenden Probe mit Laserlicht. Das von der Probe gestreute Licht wird durch ein Mikroskopobjektiv gebündelt und anschließend dem Spektrometer zugeführt.The Measurement of such vibration states by Raman spectroscopy is performed by irradiation of the examined Sample with laser light. The light scattered by the sample is transmitted through a microscope objective bundled and subsequently supplied to the spectrometer.

Bei Mikro-Raman-Messungen erfolgt die Beaufschlagung der Probe mit Laserlicht mit Hilfe eines Raman-Mikroskops. Das gestreute Licht wird in 180°-Reflexion über das Mikroskop zum Spektrometer geleitet. Im Spektrometer findet eine spektrale Zerlegung der gestreuten Photonen statt. Die Auftragung der Intensität des Streulichtes gegen die Energiedifferenz zwischen eingestrahltem und gestreutem Licht bezeichnet man als Ramanspektrum.at For micro-Raman measurements, the sample is exposed to laser light with the help of a Raman microscope. The scattered light is in 180 ° reflection over the Microscope directed to the spectrometer. In the spectrometer finds a spectral decomposition of the scattered photons. The application the intensity the scattered light against the energy difference between irradiated and scattered light is called Raman spectrum.

Da jedoch nur ein kleiner Anteil der eingestrahlten Photonen inelastisch gestreut wird, ist die Intensität der Ramansignale sehr klein. Daher kommt es oft vor, dass die natürlich auftretende Fluoreszenz vieler Materialien die Ramansignale überdecken. Die Unterdrückung der Fluoreszenz wird im Allgemeinen durch Verwendung von SERS (Surface Enhanced Raman Scattering) -Substraten realisiert, welche ein SERS-aktives Material (z.B. Silber, Gold oder Kupfer) beinhalten. Durch die Bestrahlung des SERS-Substrats mit Licht einer Wellenlänge nahe der Plasmonwellenlänge des Metalls wird an der Metalloberfläche ein erhöhtes lokales elektrisches Feld ausgelöst. Dies beruht auf dem höheren elektromagnetischen Feld, welches sich an Spitzen einer rauen Oberfläche bildet und auf der Anregung einer kollektiven Schwingung der Leitungselektronen (Oberflächenplasmonen). Moleküle der zu untersuchenden Probe, die sich in der Nähe der Oberfläche befinden, erfahren daher ein starkes elektromagnetisches Feld, was wiederum eine Verstärkung der Ramansignale zur Folge hat. Diese Verstärkung kann einen Faktor von 10³–10⁶ betragen. Somit können mit dieser Methode kleinste Mengen adsorbierter Teilchen nachgewiesen werden.However, since only a small portion of the incident photons are inelastically scattered, the intensity of the Raman signals is very small. Therefore, it often happens that the naturally occurring fluorescence of many materials mask the Raman signals. The suppression of fluorescence is generally accomplished by using SERS (Surface Enhanced Raman Scattering) substrates that include a SERS active material (eg, silver, gold, or copper). By irradiating the SERS substrate with light of a wavelength near the plasmon wavelength of the metal, an increased local electric field is triggered at the metal surface. This is due to the higher electromagnetic field that forms at peaks of a rough surface and to the excitation of a collective oscillation of the conduction electrons (surface plasmons). Therefore, molecules of the sample under investigation that are near the surface experience a strong electromagnetic field, which in turn results in amplification of the Raman signals. This gain can be a factor of 10 ³ -10 ⁶ . Thus, with this method smallest amounts of adsorbed particles can be detected.

Als SERS-Substrat werden üblicherweise Metallkolloidlösungen verwendet, mit denen die zu untersuchenden Proben getränkt werden. Allerdings wird bei dieser Methode eine erhebliche Menge an Schwermetall irreversibel in die Probe eingebracht.When SERS substrate usually metal colloid solutions are used, with which the samples to be examined are soaked. However will In this method, a significant amount of heavy metal irreversible introduced into the sample.

Aus DE 196 36 355 A1 ist ein Verfahren zur Erhöhung der Intensität Raman-gestreuten Lichts mittels flächenhafter SERS-Substrate bekannt. Die Erhöhung der Intensität wird hier dadurch realisiert, dass dem Medium, in dem die Messung durchgeführt werden soll, Halogenide zugesetzt werden.Out DE 196 36 355 A1 For example, a method of increasing the intensity of Raman-scattered light by means of areal SERS substrates is known. The increase in intensity is realized here by adding halides to the medium in which the measurement is to be carried out.

Sowohl bei kolloidalen als auch bei flächenhaften SERS-Substraten besteht eine große Kontaktfläche zwischen dem SERS-aktiven Metall und der Probe. Dies kann zu Veränderungen in der Probe durch elektrochemische Reaktionen an der Metalloberfläche führen, welche besonders bei biologischen Proben zu großen Problemen führen. Oftmals sind solche Proben für weitere Messungen unbrauchbar.Either in colloidal as well as in areal SERS substrates has a large contact area between the SERS-active metal and the sample. This can change lead in the sample by electrochemical reactions on the metal surface, which especially with biological samples lead to big problems. often are such samples for further measurements unusable.

Ein weiteres Problem der konventionellen Ramanspektroskopie stellt die globale Bestrahlung der Probe dar, durch die lediglich über einen großen Bereich (einige mm²) gemittelte spektroskopische Daten ermittelt werden können. Bei Mikro-Raman-Messungen wird der Durchmesser des Messspots durch ein Raman-Mikroskop verringert. Die laterale Auflösung bei einer solchen Messung beträgt jedoch immer noch 1 μm bis 5 μm. Lokale Veränderungen, welche sich im Submikrometerbereich abspielen, können mit dieser Methode nicht detektiert werden. Dieses Problem ist aus anderen spektroskopischen Bereichen bekannt, und wird beispielsweise in der optischen Nahfeldmikroskopie (SNOM) dadurch gelöst, dass das anregende Licht durch eine Glasfaser, welche an dem der Probe zugewandten Ende als Spitze ausgebildet ist, auf die Probe geleitet wird.Another problem of conventional Raman spectroscopy is the global irradiation of the sample, which can only be used to obtain averaged spectroscopic data over a wide range (a few mm ² ). In micro-Raman measurements, the diameter of the measurement spot is reduced by a Raman microscope. However, the lateral resolution in such a measurement is still 1 micron to 5 microns. Local changes, which take place in the sub-micron range, can not be detected with this method. This problem is known from other spectroscopic fields, and is solved, for example, in near-field optical microscopy (SNOM) by passing the exciting light onto the sample through a glass fiber tip-formed at the end facing the sample.

Faseroptiken sind in der Ramanspektroskopie zum Beispiel für Wasseranalytik-Messungen bekannt. Bei dieser Methode wird eine Glasfaser, welche das Laserlicht des Anregungslasers leitet, in das zu untersuchende Medium getaucht. Damit wird zwar eine aufwendige Justage eines optischen Systems umgangen, welches Laserstrahlung auf die Probe lenkt, lokale Informationen mit einer Ortsauflösung im Submikrometerbereich können jedoch mit dieser Methode nicht erzielt werden.Fiber optics are known in Raman spectroscopy, for example for water analysis measurements. In this method, a glass fiber, which conducts the laser light of the excitation laser, immersed in the medium to be examined. Thus, although a complex adjustment of an optical system is bypassed, which laser radiation to the sample However, local information with sub-micron spatial resolution can not be obtained using this method.

Eine ungewollte Beeinflussung beziehungsweise Zerstörung der Probe kann auch aus der Bestrahlung der Probe durch das Laserlicht resultieren. Das Problem ist hierbei die hohe Leistung des Anregungslasers, welche notwendig ist, um eine brauchbare Intensität der Ramansignale zu erreichen.A unwanted influence or destruction of the sample may also be due the irradiation of the sample by the laser light result. The The problem here is the high power of the excitation laser, which is necessary to achieve a useful intensity of the Raman signals.

Aus US 5 864 397 A ist ein Verfahren sowie eine Vorrichtung zur Durchführung von spektralen Ramanuntersuchungen mit metallbeschichtetem Lichtleiter bekannt, wobei bei der in diesem Dokument offenbarten Vorrichtung ein Anregungslaser mit einer Laserleistung von 25 mW zum Einsatz kommt. Insbesondere durch die Metallbeschichtung des Lichtleiters kann zwar eine Kontamination der Probe, beispielsweise durch eine vollständige Metallbeschichtung der Probe, vermieden werden und somit zwar teilweise eine Beschädigung der Probe abgewandt werden, jedoch weist diese Vorrichtung den Nachteil auf, dass die verwendete Laserleistung insbesondere empfindliche Proben schädigen kann.Out US 5,864,397 A. discloses a method and an apparatus for performing spectral Raman investigations with metal-coated optical waveguide, wherein in the device disclosed in this document, an excitation laser with a laser power of 25 mW is used. Although contamination of the sample, for example by a complete metal coating of the sample, can be avoided in particular by the metal coating of the light guide and thus in some cases avoids damage to the sample, this device has the disadvantage that the laser power used damages sensitive samples in particular can.

Aus dem englischsprachigen Abstract der JP 61-194335 A ist eine Einrichtung zur Generierung und Detektion eines ortsaufgelösten Ramanspektrums bekannt. Dazu weist die Einrichtung einen schrittmotorgesteuerten Verschiebemechanismus auf.Out the English language abstract of JP 61-194335 A is a device for generating and detecting a spatially resolved Raman spectrum known. For this purpose, the device has a stepping motor-controlled displacement mechanism.

Die US 4 674 878 A , DE 198 82 224 T1 und DE 195 22 999 C1 beschreiben Vorrichtungen zur Aufnahme von Streuspektren, wobei jeweils leistungsstärkere Anregungslaser zum Einsatz kommen. So wird in US 4,674,878 A ein Laser mit einer Leistung von 50 mW, in DE 198 82 224 T1 ein Laser mit einer Leistung von 700 mW bis 1,2 W und in DE 195 22 999 C1 ein Laser mit einer Leistung von 0,5 W bis 1,0 W vorgeschlagen.The U.S. 4,674,878 . DE 198 82 224 T1 and DE 195 22 999 C1 describe devices for the acquisition of scattered spectra, whereby in each case more powerful excitation lasers are used. So will in US 4,674,878 A a laser with a power of 50 mW, in DE 198 82 224 T1 a laser with a capacity of 700 mW to 1.2 W and in DE 195 22 999 C1 a laser with a power of 0.5 W to 1.0 W is proposed.

Zudem ist es bislang notwendig, die Proben zur spektroskopischen Untersuchung in ein Labor zu transportieren. Dies hat den Nachteil, dass es bereits beim Transport der Proben vom ursprünglichen Standort zum Labor zu Veränderungen in der Zusammensetzung der Probe kommen kann, da sich die Umgebungsbedingungen ändern beziehungsweise die am Ort der Probensammlung gegebenen Bedingungen nicht aufrecht erhalten werden können.moreover So far, it has been necessary to use the samples for spectroscopic investigation to transport to a laboratory. This has the disadvantage that it is already at Transport of the samples from the original location to the lab for changes may come in the composition of the sample, since the environmental conditions change or the Not maintained at the site of the sample collection conditions can be.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren und eine Vorrichtung zur spektroskopischen Untersuchung biologischer und chemischer Proben, insbesondere mit Hilfe der Ramanspektroskopie, vorzuschlagen, bei dem bzw. der es möglich ist, eine Beschädigung der zu untersuchenden Probe, insbesondere durch das verwendete Laserlicht, zu minimieren.task It is the object of the present invention to provide a method and an apparatus for the spectroscopic examination of biological and chemical samples, in particular with the help of Raman spectroscopy, to suggest which it is possible to a damage the sample to be examined, in particular by the laser light used to minimize.

Die Lösung der Aufgabe erfolgt erfindungsgemäß durch das Verfahren gemäß Patentanspruch 1 beziehungsweise durch die Vorrichtung gemäß Patentanspruch 9.The solution The object is achieved according to the invention by the method according to claim 1 or by the device according to claim 9.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird die Zerstörung der zu untersuchenden Proben durch die Verwendung einer Glasfaserspitze einer ersten Glasfaser als Sonde, welche mit einem SERS-aktiven Material (z.B. Silber, Gold oder Kupfer) beschichtet ist, minimiert. Diese Glasfaserspitze wird durch ein Positionierungssystem auf oder in die Probe positioniert. Das Licht eines Anregungslasers wird nun in die erste Glasfaser eingekoppelt, welche an ihrem der Probe zugewandten Ende mit der Glasfaserspitze versehen ist. Durch Austritt aus der Glasfaserspitze trifft der Laserstrahl auf eine Probenoberfläche. Dort finden elastische und inelastische Streuprozesse statt, das heißt, Strahlung verschiedener Wellenlänge wird von der Probe emittiert (Streustrahlung). Ein abbildendes optisches System, zum Beispiel ein Mikroskopobjektiv, fokussiert diese Streustrahlung, welche anschließend in eine zweite Glasfaser eingekoppelt werden kann. Für diese Fokussierung kann auch ein Linsensystem verwendet werden. Die Glasfaser leitet die Streustrahlung in ein Spektrometer, in dem eine spektrale Zerlegung der Streustrahlung erfolgt. Die so nach Wellenlängen sortierten Signale werden anschließend von einer Detektionseinheit detektiert und können nun mit Hilfe eines Rechners verarbeitet und ausgewertet werden.at the method according to the invention will be the destruction the samples to be examined by using a glass fiber tip a first fiberglass probe which is SERS active Material (e.g., silver, gold or copper) is minimized. This glass fiber tip is opened by a positioning system positioned in the sample. The light of an excitation laser is now coupled into the first fiberglass, which at its the sample facing end is provided with the glass fiber tip. By leaving From the glass fiber tip, the laser beam strikes a sample surface. There Elastic and inelastic scattering processes take place, that is, radiation different wavelength is emitted from the sample (scattered radiation). An imaging optical System, for example a microscope objective, focuses this scattered radiation, which subsequently can be coupled into a second glass fiber. For this Focusing can also be used a lens system. The glass fiber directs the scattered radiation into a spectrometer, in which a spectral Disassembly of the scattered radiation takes place. The sorted by wavelengths Signals will follow detected by a detection unit and can now with the help of a computer processed and evaluated.

Durch die Verwendung einer metallbeschichteten Glasfaserspitze als SERS-Sonde findet eine Verstärkung der Ramansignale aufgrund des SERS-Effekts statt, ohne dass die Proben mit einer Metallkolloidlösung getränkt werden müssen. Das heißt, die Probe kommt lediglich an der Kontaktstelle von Spitze und Probe mit dem Metall in Berührung. Eventuelle Kontamination durch die Diffusion der Metallatome in die Probe sind somit lokal beschränkt. Die Probe kann daher für weitere Messungen verwendet werden.By the use of a metal-coated glass fiber tip as a SERS probe finds a reinforcement Raman signals due to the SERS effect, without the Samples with a metal colloid solution soaked Need to become. This means, the sample comes only at the contact point of tip and sample in contact with the metal. any Contamination by the diffusion of metal atoms in the sample are thus locally limited. The Sample can therefore be for additional measurements are used.

Vorteilhaft ist es, wenn die Detektion der Streustrahlung ortsaufgelöst erfolgt. Die Verstärkung der Ramansignale beschränkt sich bei Verwendung einer metallbeschichteten Glasfaserspitze auf die Moleküle, welche sich in der Nähe der Spitze befinden. Nur diese Signale werden also durch den SERS-Effekt verstärkt, wodurch die Signale einem bestimmten Ort auf der Probe zugeordnet werden können. Raman-Messungen können daher mit dieser Anordnung ortsaufgelöst erfolgen.Advantageous it is when the detection of scattered radiation is spatially resolved. The reinforcement of Raman signals limited when using a metal coated fiber tip the molecules, which are close by the top are located. Only these signals are so through the SERS effect strengthened whereby the signals are assigned to a specific location on the sample can be. Raman measurements can therefore be carried out with spatial resolution with this arrangement.

Dabei erweist es sich als besonders vorteilhaft, wenn die von dem Laserlicht bestrahlte Fläche der Probe weniger als 1 μm² beträgt. Eine Aufweitung des Laserstrahls, und damit eine unnötig ausgedehnte Bestrahlung der Probe, wird vermieden, indem die Glasfaserspitze sehr nahe an die Probenoberfläche gebracht werden kann, so dass das anregende Laserlicht einen minimalen Weg zwischen dem Glasfaserende und der Probenoberfläche zurücklegen muss. Vorzugsweise berührt die Glasfaserspitze die Probe, wodurch eine direkte Einleitung des anregenden Laserlichts in die Probe möglich ist. Die laterale Ortsauflösung ist im Falle eines unmittelbaren Kontakts zwischen der Glasfaserspitze und der Probenoberfläche lediglich durch den Durchmesser der Spitze bestimmt.It proves to be particularly advantageous when the area of the sample irradiated by the laser light is less than 1 μm ² . An expansion of the laser beam, and thus an unnecessarily extended irradiation of the sample is avoided by the glass fiber tip can be brought very close to the sample surface, so that the exciting laser light must cover a minimum distance between the glass fiber end and the sample surface. Preferably, the glass fiber tip touches the sample, allowing direct introduction of the exciting laser light into the sample. The lateral spatial resolution is determined only by the diameter of the tip in the case of direct contact between the glass fiber tip and the sample surface.

Die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens mit einer Laserleistung des Anregungslasers von 0,2–1,2mW ermöglicht eine besonders schonende Untersuchung der Proben. Durch die Ausnutzung des signalverstärkenden SERS-Effekts und die gleichzeitige Fokussierung des Laserlichts aufgrund der spitz zulaufenden Glasfaser sind für die Beobachtung der gewünschten Signale bereits wesentlich kleinere Laserleistungen ausreichend als bei den bisher bekannten Raman-spektroskopischen Verfahren. Dies ist besonders bei empfindlichen biologischen Proben wichtig, da an diesen oft schon während der Messung Strahlenschäden entstehen, welche die Zustände der Probe verändern und die Proben für weitere Messungen unbrauchbar machen. Dadurch wird die Reproduktion eines einmal gemessenen Ergebnisses erheblich erschwert. Durch die Reduzierung der Laserleistung um ca. zwei Größenordnungen wird die Möglichkeit geschaffen, empfindlichere Proben zu vermessen, die Messzeit zu verlängern, um eine Verbesserung der Mess-Statistik zu erreichen und wiederholte Messungen an ein und derselben Probe durchzuführen.The execution the method according to the invention with a laser power of the excitation laser of 0.2-1.2mW allows one particularly gentle examination of the samples. By exploitation of the signal amplifying SERS effect and the simultaneous focusing of the laser light due to The tapered glass fiber are for the observation of the desired Signals already much smaller laser powers sufficient as in the previously known Raman spectroscopic method. This is especially important for sensitive biological samples, because of these often already during measuring radiation damage arise, which the states change the sample and the samples for make further measurements useless. This will make the reproduction of a once measured result considerably more difficult. By the Reducing the laser power by about two orders of magnitude will be the possibility created to measure more sensitive samples, the measuring time too extend, to achieve an improvement in measurement statistics and repeated Perform measurements on one and the same sample.

Die Verwendung einer zweiten Glasfaser zur Leitung der Streustrahlung ermöglicht eine variable Einstellung der einzelnen Komponenten zueinander. Die Streustrahlung kann somit unter verschiedenen Winkeln detektiert werden. Wählt man den Winkel zwischen den beiden Glasfa sern so, dass er 90° beträgt, wird verhindert, dass die reflektierte und/oder die um 180° gestreute Laserstrahlung detektiert wird, was sich durch die hohe Intensität der Laserstrahlung störend auf die eigentlich zu beobachtenden Signale auswirken kann. Auch hinsichtlich der Verwendung verschiedener Probenaufnahmen ist die Flexibilität in der Anordnung der beiden Glasfasern zueinander von Vorteil.The Use of a second glass fiber for guiding the scattered radiation allows a variable adjustment of the individual components to each other. The Stray radiation can thus be detected at different angles become. Chooses you the angle between the two Glasfa fibers so that it is 90 °, is prevents the reflected and / or those scattered by 180 ° Laser radiation is detected, which interferes with the high intensity of the laser radiation which can actually be observed signals. Also regarding The use of different specimens is the flexibility in the Arrangement of the two glass fibers to each other advantageous.

Eine besonders vorteilhafte Variante des Verfahrens sieht vor, die Detektion der Streustrahlung winkelaufgelöst vorzunehmen, so dass das gestreute Licht unter vorher festgelegten Winkeln detektiert wird. Die Winkel sind dabei durch Variation der Lage der Probenaufnahme und der Glasfasern zueinander einstellbar.A particularly advantageous variant of the method provides, the detection the scattered radiation angle resolved so that the scattered light is below predetermined Angles is detected. The angles are thereby by variation of the Location of the sample holder and the glass fibers adjustable to each other.

Die Positionierung der Glasfaserspitze erfolgt vorzugsweise durch einen Mikromanipulator, welcher eine genaue Positionierung der Spitze gewährleistet.The Positioning of the glass fiber tip is preferably carried out by a Micromanipulator, which ensures accurate positioning of the tip guaranteed.

Bei einer weiteren Variante des Verfahrens kann zur Überwachung der Spitzenpositionierung ein Mikroskop oder eine CCD-Kamera verwendet werden.at Another variant of the method may be used to monitor tip positioning a microscope or a CCD camera can be used.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung zum Messen biologischer und/oder chemischer Probenparameter mittels Ramanspektroskopie nach Anspruch 9 umfasst einen Anregungslaser, eine Positioniereinrichtung, eine optische Koppeleinheit zur Beleuchtung der Probe mit Laserlicht und zur Fokussierung und Leitung des von der Probe emittierten Streulichts, ein optisches Spektrometer zur spektralen Zerlegung der Streustrahlung und eine lichtempfindliche Detektoreinrichtung.The inventive device for measuring biological and / or chemical sample parameters by means of Raman spectroscopy according to claim 9 comprises an excitation laser, a positioning device, an optical coupling unit for illumination the sample with laser light and for focusing and conduction of the sample emitted scattered light, an optical spectrometer for spectral decomposition of scattered radiation and a photosensitive Detector device.

Die optische Koppeleinheit weist eine Probenaufnahme, zwei Glasfasern und ein abbildendes optisches System auf und ermöglicht mittels dem als Spitze ausgebildeten Ende der ersten Glasfaser, aus der das Laserlicht ausgekoppelt wird, um auf die zu untersuchende Probe zu treffen, ortsaufgelöste Raman-Messungen. Da die Spitze mittels der Positionier einrichtung direkt auf, beziehungsweise in die Probe positionierbar ist, kann die bestrahlte Fläche der Probe auf die Querschnittsfläche der Austrittsöffnung der Glasfaserspitze beschränkt werden. Damit wird also eine lediglich lokale Beleuchtung der Probe mit Laserlicht ermöglicht.The optical coupling unit has a sample receptacle, two glass fibers and an imaging optical system, enabling by means of the as a tip formed end of the first optical fiber, from which the laser light is decoupled to hit the sample to be examined, spatially resolved Raman measurements. Since the tip device by means of positioning directly on, or can be positioned in the sample can the irradiated area of the Sample on the cross-sectional area the outlet opening limited the glass fiber tip become. Thus, so that only a local illumination of the sample with Laser light allows.

Die verwendete Glasfaserspitze ist mit einer Metallbeschichtung versehen. Als Metalle kommen SERS-aktive Materialien (z.B. Silber, Gold, Kupfer) in Frage. Durch die Metallbeschichtung kommt es durch den SERS-Effekt in der Nähe der Spitze zur Ausbildung eines erhöhten elektrischen Feldes, wodurch die Intensität der Ramansignale verstärkt wird. Des weiteren wird die natürlich auftretende Fluoreszenz welche bei vielen biologischen Proben auftritt gequencht, das heißt statt der austretenden Fluoreszenzstrahlung findet nun ein strahlungsloser Übergang statt. Diese durch die Metallbeschichtung der Spitze hervorgerufene Verstärkung der Ramansignale kombiniert mit der fokussierenden Wirkung der Glasfaserspitze ermöglicht es, die Leistung der anregenden Laserstrahlung um zwei Größenordnungen zu reduzieren und ermöglicht die zerstörungsfreie Vermessung empfindlicher biologischer Proben.The used glass fiber tip is provided with a metal coating. Metals include SERS active materials (e.g., silver, gold, copper) in question. The metal coating is the result of the SERS effect near the tip to form an increased electric field, thereby the intensity amplified the Raman signals becomes. Furthermore, that will be natural occurring fluorescence which occurs in many biological samples quenched, this means instead of the emerging fluorescence radiation now finds a radiationless transition instead of. This caused by the metal coating of the tip reinforcement Raman signals combined with the focusing effect of the glass fiber tip allows it, the power of the exciting laser radiation by two orders of magnitude too reduce and enable the non-destructive survey sensitive biological samples.

Durch die Verwendung einer metallbeschichteten Glasfaserspitze als SERS-Sonde wird die Metallkontamination stark verringert und erlaubt die Beobachtung von Schwingungsmoden, die bei Proben mit Kolloidlösung als SERS-Substrat auftreten. Diese Zustände konnten durch die Behandlung der Probe mit Kolloidlösung nicht angeregt werden.By using a metal-coated glass fiber tip as a SERS probe, the metal contamination is greatly reduced and allows the Be Consider vibrational modes that occur on samples with colloidal solution as SERS substrate. These conditions could not be stimulated by the treatment of the sample with colloid solution.

Zum Sammeln des Streulichts ist ein abbildendes optisches System vorgesehen, wobei als abbildendes optisches System vorzugsweise ein Mikroskopobjektiv verwendet wird. Es sind aber auch andere abbildende optische Systeme denkbar. Die zweite Glasfaser der optischen Koppeleinheit sorgt für die Leitung des so gebündelten Lichts zum Spektrometer in dem die spektrale Aufspaltung des Streulichts erfolgt, welches mit Hilfe einer Detektoreinrichtung detektiert wird.To the Collecting the scattered light is provided an imaging optical system, wherein as a imaging optical system preferably a microscope objective is used. But there are also other imaging optical systems conceivable. The second optical fiber of the optical coupling unit provides for the line of the so bundled Light to the spectrometer in which the spectral splitting of the scattered light takes place, which detects with the aid of a detector device becomes.

In einer bevorzugten Ausführung der Vorrichtung wird als Detektoreinrichtung eine CCD-Kamera verwendet. Es können aber auch andere lichtempfindliche Detektoren, wie z.B. Photomultiplier oder Photodiodenarrays verwendet werden.In a preferred embodiment The device is used as a detector device, a CCD camera. It can but also other photosensitive detectors, e.g. photomultiplier or photodiode arrays are used.

Beim Auskoppeln des Lichts auf die Probenoberfläche ist die Verwendung möglichst kleiner Glasfaserspitzen von Vorteil, um eine hohe Ortsauflösung zu erreichen. Die Spitze weist daher gemäß einer bevorzugten Ausführung einen Durchmesser nicht größer als 1 μm auf.At the Uncoupling the light on the sample surface is the use as possible Small fiber optic tips advantageous to a high spatial resolution to reach. The tip therefore according to a preferred embodiment has a Diameter not larger than 1 μm.

In einer besonders bevorzugten Ausführung der Vorrichtung weist die Oberflächenbeschichtung der Glasfaser Metallcluster mit Durchmesser < 100 nm auf, da in diesem Bereich eine optimale Anregung der Oberflächenplasmonen-Resonanzen gegeben ist.In a particularly preferred embodiment of Device has the surface coating of Fiberglass metal clusters with a diameter <100 nm, because in this area a optimal excitation of surface plasmon resonances given is.

In einer weiteren bevorzugten Ausführung der Vorrichtung ist für die optische Koppeleinheit zur Positionierung zumindest einer Glasfaser bzw. der Glasfaserspitze ein Mikromanipulator vorgesehen. Somit kann beispielsweise eine genaue Positionierung der Glasfaserspitze auf oder innerhalb der Probe erfolgen. In Kombination mit dem kleinen Durchmesser der Glasfaserspitze ist somit ein Abrastern der Probe mit kleinen Rastabständen möglich.In a further preferred embodiment of Device is for the optical coupling unit for positioning at least one glass fiber or the glass fiber tip provided a micromanipulator. Consequently For example, a precise positioning of the glass fiber tip on or within the sample. In combination with the small one Diameter of the glass fiber tip is thus a scanning of the sample with small rest distances possible.

Vorteilhaft ist es die Position zumindest einer Glasfaser durch ein geeignetes Positionierungssystem relativ zur Probenaufnahme variabel zu gestalten.Advantageous It is the position of at least one fiber by a suitable one Positioning system variable relative to the sample holder.

In einer besonderen Ausgestaltung der Vorrichtung wird die zweite Glasfaser derart gelagert, dass eine Winkelvariation zwischen der Längsachse der zweiten Glasfaser und der Probenaufnahme möglich ist. Wird als Positionierungssystem für die zweite Glasfaser beispielsweise ein Goniometer verwendet, ist eine genaue Einstellung dieses Winkels möglich. So können auch winkelaufgelöste Messungen realisiert werden.In a particular embodiment of the device is the second glass fiber mounted such that an angular variation between the longitudinal axis of second glass fiber and the sample holder is possible. Used as a positioning system for the second Fiberglass used for example a goniometer is an accurate one Adjustment of this angle possible. So can also angle resolved Measurements are realized.

Zusätzlich zur Glasfaser kann auch die Probenaufnahme verfahrbar ausgestaltet sein, damit der auf der Probe befindliche Laserspot in die Brennebene des abbildenden optischen Systems beziehungsweise des Mikroskopobjektivs gebracht werden kann.In addition to Glass fiber, the sample holder can also be designed to be movable, so that the laser spot on the sample in the focal plane of the imaging optical system or the microscope objective can be brought.

Gemäß einer besonders bevorzugten Ausgestaltung der Vorrichtung weist die Vorrichtung einen modularen Aufbau auf. Dabei bilden der Anregungslaser, das Spektrometer und die Detektoreinrichtung Komponenten eines separat handhabbaren Messmoduls, während die optische Koppeleinheit ein separat handhabbares optisches Koppelmodul bildet, wobei zumindest das Messmodul über eine Datenschnittstelleneinrichtung mit einer Computereinrichtung verfügt, und das Messmodul mit dem optischen Koppelmodul über eine optische Schnittstelleneinrichtung verbunden ist. Vorzugsweise haben die Module eine Größe, die es erlaubt die Module ohne großen Aufwand zu transportieren. Dieser modulare Aufbau ermöglicht es, die Messungen direkt am Probenfundort vorzunehmen.According to one Particularly preferred embodiment of the device, the device a modular design. The excitation laser, the Spectrometer and the detector device components of a separate manageable measuring module while the optical coupling unit a separately manageable optical coupling module forms, wherein at least the measuring module via a data interface device equipped with a computer device, and the measuring module with the optical coupling module via an optical interface device is connected. Preferably the modules have a size that it allows the modules without big To transport effort. This modular design makes it possible make the measurements directly at the sample location.

Zusätzlich kann für die Datenaufnahme und -verarbeitung ein Computer, sowie für die Ansteuerung elektronischer Geräte eine Steuerungselektronik vorgesehen sein, welche mit den Geräten der einzelnen Module verbunden werden können.In addition, can for the Data acquisition and processing a computer, as well as for the control electronic devices a control electronics be provided, which with the devices of individual modules can be connected.

In einer bevorzugten Ausführung sind für die Verbindungen der einzelnen Module Glasfaserkabel vorgesehen, wodurch der Justieraufwand nach dem Zerlegen und Transport der Vorrichtung auf ein Minimum beschränkt wird.In a preferred embodiment are for the connections of each module fiber optic cable provided whereby the adjustment effort after disassembly and transport of the device kept to a minimum becomes.

In einer weiteren Ausführung umfasst das Messmodul einen zusätzlichen Laser (Fallenlaser) und das optische Koppelmodul einen Piezokristall zur Ansteuerung für eine Partikelfalle. Mit dieser Vorrichtung ist es möglich Mikropartikel durch ein elektromagnetisches Muldenpotential lokal zu stabilisieren so dass die Mikropartikel in der Probe unabhängig vom Anregungslaser manipuliert werden können (Fallenmodus). Dazu wird das Licht des Fallenlasers von der Unterseite der Probe in die Objektiv ebene gestrahlt, so dass die Mikropartikel unabhängig vom Anregungslaser manipuliert werden können. Der Piezokristall des Koppelmoduls sorgt dabei für die Ansteuerung des Lasers.In another embodiment the measuring module includes an additional Laser (trap laser) and the optical coupling module to a piezoelectric crystal to Control for a particle trap. With this device, it is possible microparticles locally stabilized by an electromagnetic well potential such that the microparticles in the sample are manipulated independently of the excitation laser can be (trap mode). For this, the light of the falling laser is from the bottom of the sample blasted into the lens plane, so that the microparticles independent of the excitation laser can be manipulated. The piezoelectric crystal of the coupling module ensures the activation of the laser.

In einer weiteren Ausführung umfasst das optische Koppelmodul ein optisches Schnittstellenelement zur Verbindung mit dem Anregungslaser und ein weiteres Schnittstellenelement zur Verbindung mit dem Spektrometer.In another embodiment the optical coupling module comprises an optical interface element for connection to the excitation laser and another interface element for connection to the spectrometer.

Nachfolgend werden Varianten des Verfahrens sowie eine zur Durchführung des Verfahrens geeignete Vorrichtung anhand der Figuren beispielhaft erläutert.In the following, variants of the method and a device suitable for carrying out the method will be exemplified by means of the figures explained.

Es zeigen:It demonstrate:

1 eine Ausführungsform der Vorrichtung zur Durchführung Raman-spektroskopischer Messungen an biologischen und/oder chemischen Proben in schematischer Darstellung; 1 an embodiment of the apparatus for performing Raman spectroscopic measurements on biological and / or chemical samples in a schematic representation;

2 eine Ausführungsform einer optischen Koppeleinheit für konventionelle Mikro-Raman-Messungen in schematischer Darstellung; 2 an embodiment of an optical coupling unit for conventional micro-Raman measurements in a schematic representation;

3 eine Ausführungsform einer optischen Koppeleinheit für Messungen im Faser-Sonden-Modus in schematischer Darstellung; 3 an embodiment of an optical coupling unit for measurements in fiber-probe mode in a schematic representation;

4 ein SER-Spektrum eines ätherischen Öls in einer Mentha x piperita L. nm. citrata 4 an SER spectrum of an essential oil in a Mentha x piperita L. nm. citrata

5 eine schematische Darstellung einer Koppeleinheit für Messungen im Fallenmodus 5 a schematic representation of a coupling unit for measurements in the fall mode

1 zeigt einen schematischen Aufbau für eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens. Eine Glasfaser 2 leitet Laserlicht 15 eines Anregungslasers 1 auf eine Probe 3. Das Auskoppeln des anregenden Laserlichts 15 aus der Glasfaser 2 erfolgt über eine metallbeschichtete Glasfaserspitze 4. Diese Glasfaserspitze 4 kann durch eine Positioniereinrichtung 5, vorzugsweise ein Mikromanipulator, auf der Probe 3 justiert werden. 1 shows a schematic structure for an apparatus for performing the method. A fiberglass 2 conducts laser light 15 an excitation laser 1 on a sample 3 , The decoupling of the exciting laser light 15 from the fiberglass 2 via a metal-coated glass fiber tip 4 , This fiberglass tip 4 can by a positioning 5 , preferably a micromanipulator, on the sample 3 to be adjusted.

Die Probe 3 befindet sich auf einer Probenaufnahme 6, welche verfahrbar ausgestaltet sein kann. Das von der Probe 3 emittierte Streulicht (hier nicht dargestellt) wird durch ein abbildendes optisches System 7, z.B. eine Sammellinse, ein Mikroskop oder ähnliches, gebündelt und in eine zweite Glasfaser 8 eingekoppelt. Diese leitet das Streulicht zu einem Spektrometer 9, in dem eine spektrale Zerlegung des Streulichts stattfindet. Die Streusignale werden dann mit Hilfe einer Detektionseinheit, vorzugsweise einer CCD-Kamera detektiert. Zur weiteren Verarbeitung können diese Streusignale einem Computer zugeführt werden.The sample 3 is located on a sample holder 6 , which can be designed to be movable. That from the sample 3 emitted scattered light (not shown here) is by an imaging optical system 7 , For example, a converging lens, a microscope or the like, bundled and into a second optical fiber 8th coupled. This directs the scattered light to a spectrometer 9 , in which a spectral decomposition of the scattered light takes place. The scatter signals are then detected by means of a detection unit, preferably a CCD camera. For further processing, these scatter signals can be supplied to a computer.

In 1 ist auch die Möglichkeit einer modularen Ausbildung der Vorrichtung angedeutet. Dabei bilden der Anregungslaser 1, das Spektrometer 9 und die Detektionseinheit 10 ein Messmodul 11, während die Probenaufnahme 6 und das abbildende optische System 7 zu einem optischen Koppelmodul 12 zusammengefasst sind, das über die Glasfasern 2 und 8 mit dem Messmodul 11 verbunden ist. Die Module sind in 1 gestrichelt gekennzeichnet. Die einzelnen Komponenten der Module können jeweils auf einer Modulgrundplatte montiert sein. Bei Verwendung eines Festkörperlasers als Anregungslaser 1 und einer CCD-Kamera als Detektionseinheit 10 können die Abmessungen des Messmoduls 11 beispielsweise in der Größenordnung von 53cm × 47cm × 30cm, die des optischen Koppelmoduls 12 in der Größenordnung von 100cm × 60cm × 30cm liegen. Die einzelnen Module sind daher gut handhabbar und ohne großen Aufwand transportabel. Durch die Verbindung der einander zugeordneten Komponenten mit Glasfasern ist eine Remontage ohne großen Justieraufwand möglich.In 1 is also the possibility of a modular design of the device indicated. In this case, the excitation laser form 1 , the spectrometer 9 and the detection unit 10 a measuring module 11 while taking the sample 6 and the imaging optical system 7 to an optical coupling module 12 are summarized, that about the glass fibers 2 and 8th with the measuring module 11 connected is. The modules are in 1 dotted marked. The individual components of the modules can each be mounted on a module base plate. When using a solid-state laser as excitation laser 1 and a CCD camera as a detection unit 10 can change the dimensions of the measuring module 11 for example, in the order of 53cm × 47cm × 30cm, that of the optical coupling module 12 lie in the order of 100cm × 60cm × 30cm. The individual modules are therefore easy to handle and transportable without much effort. By connecting the associated components with glass fibers a reassembly is possible without much adjustment effort.

Zusätzlich zu den bisher aufgeführten Komponenten kann das Messmodul 11 einen Fallenlaser 13 aufweisen. Dieser kann über einen im optischen Koppelmodul 12 befindlichen Piezokristall 14 angesteuert werden und ermöglicht somit Messungen im Fallenmodus. Bei weiteren möglichen Komponenten der Vorrichtung, welche in der schematischen Darstellung nicht aufgeführt sind, handelt es sich beispielsweise um einen Computer für die Datenaufnahme und -verarbeitung sowie eine Elektronik für die Ansteuerung der CCD-Kamera am Spektrometer. Mit dieser modularen Vorrichtung können SERS-Messungen in den in 2, 3 und 5 beschriebenen Messmodi vor Ort, also direkt am Ort der Probenentnahme durchgeführt werden.In addition to the previously listed components, the measuring module 11 a trap laser 13 exhibit. This can be done via a in the optical coupling module 12 located piezocrystal 14 can be controlled and thus enables measurements in trap mode. In other possible components of the device, which are not listed in the schematic representation, it is, for example, a computer for data acquisition and processing and electronics for controlling the CCD camera on the spectrometer. With this modular device, SERS measurements can be made in the in 2 . 3 and 5 described measurement modes on site, so be carried out directly at the site of sampling.

2 zeigt eine schematische Darstellung einer optischen Koppeleinheit 19 für konventionelle Mikro-Raman-Messungen. Das anregende Laserlicht 15 wird durch die Glasfaser 8 auf das abbildende optische System 7, zum Beispiel ein Raman-Mikroskop, welches hier schematisch als Sammellinse dargestellt ist, geleitet. Durch das abbildende optische System 7 wird das anregende Laserlicht 15 auf die Probe 3 fokussiert. Eine von der Probe 3 emittierte Streustrahlung 16 wird durch das abbildende optische System 7 in die Glasfaser 8 eingekoppelt und zum Spektrometer geführt. In diesem Messmodus wird das anregende Laserlicht 15 in derselben Glasfaser 8 geführt wie die von der Probe emittierte Streustrahlung 16. Die Glasfaser 2 gemäß der in 1 dargestellten Ausführungsform des Koppelmoduls 12 kann entfallen oder lediglich außer Funktion sein, oder sich in einer zurückgefahrenen Position befinden, so dass die Mikro-Raman-Messungen durch die Glasfaserspitze 4 (1) nicht beeinflusst werden. 2 shows a schematic representation of an optical coupling unit 19 for conventional micro-Raman measurements. The exciting laser light 15 is through the glass fiber 8th on the imaging optical system 7 , For example, a Raman microscope, which is shown here schematically as a converging lens, passed. Through the imaging optical system 7 becomes the stimulating laser light 15 to the test 3 focused. One from the sample 3 emitted scattered radiation 16 is through the imaging optical system 7 in the glass fiber 8th coupled and guided to the spectrometer. In this measurement mode, the exciting laser light 15 in the same fiberglass 8th guided as the scattered radiation emitted by the sample 16 , The glass fiber 2 according to the in 1 illustrated embodiment of the coupling module 12 may be omitted or merely inoperative, or in a retracted position, so that the micro-Raman measurements through the glass fiber tip 4 ( 1 ) are not affected.

3 zeigt eine schematische Darstellung einer optischen Koppeleinheit 20 zur Durchführung des Verfahrens im Fasersonden-Modus. Das anregende Laserlicht 15 wird hierbei durch die Glasfaser 2 auf die Probe 3 geleitet. Die Auskopplung des anregenden Laserlichts 15 auf die Probe 3 erfolgt über die Glasfaserspitze 4, welche mit einem SERS-aktiven Material beschichtet ist. Die Einkopplung der von der Probe 3 emittierten Streustrahlung 16 in die Glasfaser 8 erfolgt auch hier über ein abbildendes optisches System 7. Die Glasfaserspitze der Glasfaser 2 und das Glasfaserende der Glasfaser 8 sind als Glasfaserteilstücke ausgebildet, die über Schnittstelleneinrichtungen 22 mit der Glasfaser 2 bzw. der Glasfaser 8 verbindbar sind. Schnittstelleneinrichtungen der gleichen Art können auch am Messmodul 11 ausgebildet sein. Die Positionierung der Glasfaserspitze 4 und der Glasfaser 8 kann jeweils über eine Positioniereinrichtung 5 erfolgen. Für die Positionierung der Glasfaserspitze 4 wird vorzugsweise ein Mikromanipulator verwendet, der elektronisch angesteuert werden kann. Um die vom anregenden Laserlicht 15 bestrahlte Fläche der Probe 3 in die Brennebene des abbildenden optischen Systems 7 zu bringen ist es vorteilhaft, wenn die Probenaufnahme 6 verfahrbar ausgestaltet ist. Auch hierfür kann eine Positionierungseinrichtung vorgesehen sein, die in der schematischen Darstellung allerdings nicht dargestellt ist. Durch den direkten Kontakt der Glasfaserspitze 4 mit der Probe 3 trifft das aus der Glasfaserspitze 4 austretende Laserlicht 15 unmittelbar auf die Probe 3, so dass keine Gefahr besteht, dass sich der Laserstrahl auf dem Weg zur Probe 3 aufweitet. Dies ermöglicht es, eine lediglich durch die Ausmaße der Glasfaserspitze 4 definierte Fläche der Probe 3 zu bestrahlen. Bei dem unter Bezugnahme auf 3 erläuterte Verfahren dient die Glasfaser 2 mit ihrer Glasfaserspitze 4 als Fasersonde (Fasersondenmodus) und ermöglicht eine lokale Beleuchtung der Probe mit Laserlicht und somit die Durchführung von ortsaufgelösten Raman-Messungen ohne Beeinflussung des umgebenden Gewebes. Gleichzeitig kann in diesem Modus die Leistung des Anregungslasers stark reduziert werden, so dass Veränderungen der Probe durch zu hohe Laserintensitäten vermieden werden. In Kombination mit der stark reduzierten Kontamination aufgrund der beschichteten als SERS-Substrat dienenden Glasfaserspitze, sind sowohl die Untersuchung von Proben mit sehr kleinem Probenvolumen als auch wiederholte Untersuchungen an ein und derselben Probe möglich. Des weiteren können mit dem Verfahren Zustände beobachtet werden, welche mit herkömmlichen Methoden nicht zugänglich sind. 3 shows a schematic representation of an optical coupling unit 20 for performing the method in the fiber probe mode. The exciting laser light 15 This is through the glass fiber 2 to the test 3 directed. The decoupling of the exciting laser light 15 to the test 3 via the glass fiber tip 4 which is coated with a SERS-active material. The coupling of the sample 3 emitted scattered radiation 16 in the glass fiber 8th also takes place here via an imaging optical system 7 , The fiberglass tip of the fiberglass 2 and the fiber end of the fiber 8th are formed as Glasfaserteilstücke via interface devices 22 with the fiberglass 2 or the glass fiber 8th are connectable. Interface devices of the same type can also be used on the measuring module 11 be educated. The positioning of the glass fiber tip 4 and the fiberglass 8th can each have a positioning device 5 respectively. For positioning the glass fiber tip 4 a micromanipulator is preferably used, which can be controlled electronically. To the stimulating laser light 15 irradiated area of the sample 3 into the focal plane of the imaging optical system 7 it is advantageous if the sample holder 6 is designed movable. For this purpose, a positioning device may be provided, which is not shown in the schematic representation. Due to the direct contact of the glass fiber tip 4 with the sample 3 that hits the glass fiber tip 4 emerging laser light 15 immediately to the test 3 so there is no danger of the laser beam moving towards the sample 3 expands. This allows one only by the dimensions of the fiber tip 4 defined area of the sample 3 to irradiate. With reference to 3 explained method is the glass fiber 2 with her glass fiber tip 4 As a fiber probe (fiber probe mode) and allows a local illumination of the sample with laser light and thus the performance of spatially resolved Raman measurements without affecting the surrounding tissue. At the same time, the power of the excitation laser can be greatly reduced in this mode, so that changes in the sample due to excessive laser intensities are avoided. In combination with the greatly reduced contamination due to the coated glass fiber tip serving as a SERS substrate, it is possible to examine samples with very small sample volumes as well as repeated tests on one and the same sample. Furthermore, states can be observed with the method, which are not accessible by conventional methods.

4 zeigt beispielhaft SERS-Spektren von einem ätherischen Öl einer Mentha X piperita L. nm. citrata. Spektrum A wurde mittels eines konventionellen Mikro-Raman-Aufbaus aufgenommen. Als SERS-Substrat diente dabei entsprechend dem Stand der Technik eine Silberkolloidlösung. Die Spektren B bis C wurden im Fasersondenmodus entsprechend der 3 aufgenommen. Hierfür wurde die Probe nicht mit einer Kolloidlösung behandelt, da die metallbeschichtete Glasfaserspitze als SERS-Substrat diente. Die unterschiedlichen Spektren B und C ergeben sich als Folge unterschiedlicher Eindringtiefe der Glasfaserspitze in die Probe. Obwohl die Laserleistung für die Messungen der Spektren B und C nur 0,2 mW betrugen, im Vergleich zu 60 mW bei der Messung des Spektrums A, sind die Spektren B und C von einer besseren Qualität als das Spektrum A. Zusätzlich zu der verbesserten Qualität der Spektren kann man bei den im Fasersondenmodus gemessenen Spektren B und C zwei Banden erkennen, welche im Spektrum A nicht vorhanden sind. Die beiden Banden sind in der 4 mit jeweils einer gestrichelten Linie gekennzeichnet. Das Fehlen dieser beiden Banden im Spektrum A kann auf die Kontamination der Probe durch die Silberkolloidlösung zurückgeführt werden, mit der die Probe anfangs behandelt wurde. Durch Messungen im Fasersondenmodus bei dem eine metallbeschichtete Glasfaserspitze als SERS-Sonde verwendet wird, können solche Kontaminationen durch Schwermetalle stark reduziert werden. 4 exemplifies SERS spectra of an essential oil of a Mentha X piperita L. nm. citrata. Spectrum A was recorded by means of a conventional micro-Raman setup. A silver colloid solution was used as the SERS substrate in accordance with the prior art. The spectra B to C were in the fiber probe mode according to the 3 added. For this, the sample was not treated with a colloid solution because the metal coated glass fiber tip served as the SERS substrate. The different spectra B and C arise as a result of different penetration depth of the glass fiber tip in the sample. Although the laser power for the measurements of spectra B and C was only 0.2 mW compared to 60 mW for the spectrum A, spectra B and C are of better quality than spectrum A. In addition to the improved quality The spectra can be seen in the spectra B and C measured in the fiber probe mode two bands, which are not present in the spectrum A. The two gangs are in the 4 each marked with a dashed line. The absence of these two bands in spectrum A can be attributed to the contamination of the sample by the silver colloid solution with which the sample was initially treated. Measurements in fiber probe mode using a metal-coated glass fiber tip as a SERS probe can greatly reduce such contamination by heavy metals.

5 zeigt eine Koppeleinheit 21 für Raman-spektroskopische Messungen im Fallenmodus. Im Fallenmodus wird das Laserlicht 15 des Anregungslasers 1 in ein abbildendes optisches System 7, vorzugsweise ein Raman-Mikroskop, eingekoppelt, welches das Laserlicht 15 des Anregungslasers 1 auf die Probe 3 fokussiert. Die Beleuchtung der Probe kann jedoch auch, wie im Fasersonden-Modus entsprechend 3, über eine Glasfaserspitze erfolgen. Das Laserlicht 18 eines weiteren Lasers (Fallenlaser 13, 1) wird durch eine weitere Glasfaser 17 von unterhalb der Probe 3 in die Objektivebene des abbildenden optischen Systems 7 gestrahlt, so dass die Mikropartikel in der Probe 3 unabhängig vom Anregungslaser 1 manipuliert werden können. Die Leitung des anregenden Laserlichts 15 und der Streustrahlung 16 kann wie bei Mikro-Raman-Messungen in einer gemeinsamen Glasfaser 8 realisiert werden. Es besteht aber auch die Möglichkeit, das anregende Laserlicht 15 und die Streustrahlung 16 entsprechend 3 in voneinander unabhängigen Glasfasern zu führen. 5 shows a coupling unit 21 for Raman spectroscopic measurements in trap mode. In trap mode, the laser light becomes 15 of the excitation laser 1 into an imaging optical system 7 , preferably a Raman microscope, which couples the laser light 15 of the excitation laser 1 to the test 3 focused. However, the illumination of the sample may also be as appropriate in the fiber probe mode 3 , via a glass fiber tip. The laser light 18 another laser (trap laser 13 . 1 ) is through another fiberglass 17 from below the sample 3 into the lens plane of the imaging optical system 7 blasted so that the microparticles in the sample 3 independent of the excitation laser 1 can be manipulated. The direction of the exciting laser light 15 and the scattered radiation 16 can be as in micro-Raman measurements in a common fiberglass 8th will be realized. But there is also the possibility of the exciting laser light 15 and the scattered radiation 16 corresponding 3 to lead in mutually independent glass fibers.

Claims

Method for measuring biological and / or chemical sample parameters by means of spectroscopic methods, in particular with the aid of Raman spectroscopy, in which • a sample ( 3 ) with laser light ( 15 ), • the sample ( 3 ) by interaction with the laser light ( 15 ) Scattered radiation ( 16 ), • a spectral decomposition of the scattered radiation ( 16 ), and • that of the sample 3 emitted scattered radiation ( 16 ) from a detection unit ( 10 ) is detected where: • first a metallic-coated fiberglass tip ( 4 ) formed end of a glass fiber ( 2 ) by means of a positioning device ( 5 ) on or in the sample ( 3 ) is positioned • then by means of an excitation laser ( 1 ) illumination of the sample ( 3 ) with laser light ( 15 ) through the first fiberglass ( 2 ), and • that of the sample ( 3 ) emitted scattered radiation ( 16 ) with the help of an imaging optical system ( 7 ) and into a second optical fiber ( 8th ) is characterized in that the laser power of the excitation laser ( 1 ) Is 0.2-1.2 mW.

Method according to claim 1, characterized in that the detection of scattered radiation ( 16 ) is carried out spatially resolved.

Method according to claim 1 or 2, characterized in that that of the laser light ( 15 ) irradiated area of the sample ( 3 ) is less than 1 micron ² .

Method according to one of the preceding claims, characterized in that the detection of scattered radiation ( 16 ) angle resolved takes place.

Method according to one of the preceding claims, characterized in that the positioning of the glass fiber tip ( 4 ) with the aid of a micromanipulator.

Method according to one of the preceding claims, characterized in that a monitoring of the positioning of the glass fiber tip ( 4 ) with the aid of a microscope.

Method according to one of the preceding claims, characterized in that a monitoring of the positioning of the glass fiber tip ( 4 ) with the aid of a CCD camera.

Device for carrying out the method according to one of the preceding claims comprising • an excitation laser ( 1 ) for excitation of vibronic states in the sample ( 3 ), • a positioning device ( 5 ) • an optical coupling unit for illuminating the sample ( 3 ) with laser light ( 15 ) and for focusing and guiding the sample ( 3 ) emitted scattered radiation ( 16 ) for further processing • an optical spectrometer ( 9 ), for the spectral decomposition of the scattered radiation ( 16 ), and • a detection unit having at least one light-sensitive detector ( 10 ) for detection of the sample 3 emitted scattered radiation ( 16 ) wherein the optical coupling unit is a sample holder ( 6 ), two glass fibers ( 2 ) and ( 8th ) and an imaging optical system ( 7 ), wherein the first optical fiber ( 2 ) with a metallic coated glass fiber tip ( 4 ) and the exciting laser light ( 15 ) to the test ( 3 ), and the imaging optical system ( 7 ) of the sample ( 3 ) emitted scattered radiation ( 16 ) and by coupling into a second optical fiber ( 8th ) to the spectrometer ( 9 ) characterized in that the device comprises an excitation laser ( 1 ) having a power in the range of 0.2 to 1.2 mW.

Apparatus according to claim 8, characterized in that as a detection unit ( 10 ) a CCD camera is used.

Apparatus according to claim 8 or 9, characterized in that the glass fiber tip ( 4 ) has a radius <1 μm.

Device according to one of claims 8 to 10, characterized in that the surface coating of the glass fiber tip ( 4 ) Has metal clusters with diameter <100nm.

Device according to one of claims 8 to 11, characterized that the optical coupling unit for positioning at least one Fiberglass is provided with a micromanipulator.

Device according to one of claims 8 to 12, characterized in that the relative position of at least one glass fiber with respect to the sample receiving ( 6 ) is changeable.

Device according to one of claims 8 to 13, characterized in that the positioning of the second glass fiber ( 8th ) such that the angle between the longitudinal axis of the second optical fiber ( 8th ) and the sample intake ( 6 ) is variable.

Device according to one of claims 8 to 14, characterized in that the optical coupling unit with a movable sample receiving ( 6 ) is provided.

Device according to one of claims 8 to 15, characterized in that the excitation laser ( 1 ), the spectrometer ( 9 ) and the detection unit ( 10 ) Components of a separately usable measuring module ( 11 ), and the optical coupling unit a separately manageable optical coupling module ( 12 ), wherein at least the measuring module ( 11 ) via a data interface device with a computer device and the measuring module ( 11 ) and the optical coupling module ( 12 ) via an optical interface device ( 22 ) are interconnected.

Device according to claim 16, characterized that provided for the connections of the individual modules fiber optic cable are.

Apparatus according to claim 16 or 17, characterized in that the measuring module ( 11 ) additionally a second laser ( 13 ) and the optical Coupling module ( 12 ) a piezocrystal ( 14 ) for controlling a particle trap and an interface device ( 22 ) for connecting the particle trap activation with the second laser ( 13 ).

Optical coupling module for a device according to one of claims 8 to 18, characterized in that the optical coupling module ( 12 ) an optical interface device ( 22 ) for connection to the excitation laser ( 1 ) and another interface device ( 22 ) for connection to the spectrometer ( 9 ).