DE10239739A1 - Vorrichtung und Verfahren zur Durchführung von immunolosichen Markierungstechniken für Gewebedünnschnitte - Google Patents
Vorrichtung und Verfahren zur Durchführung von immunolosichen Markierungstechniken für Gewebedünnschnitte Download PDFInfo
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Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung und ein Verfahren zur optimierten und automatisierten Durchführung von immunologischen Markierungstechniken für Gewebedünnschnitte (2b). Dabei wird eine durch eine computergesteuerte Transportvorrichtung (20) automatisch bewegliche Trägerplatte (1), auf der mehrere Gewebedünnschnitte (2b) auf Metallnetzchen (2) positioniert sind, wie ein Stempel in eine Flüssigkeit aus Wasch- oder Markierungslösung (6) getaucht, die sich in mehreren Vertiefungen (5) in einem ebenfalls automatisch beweglichen Objektträger (4) befinden.
Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Behandlung von Gewebedünnschnitten auf einer Trägerplatte mit mindestens einer Behandlungsflüssigkeit.
- Ferner betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Behandlung von Gewebedünnschnitten auf einer Trägerplatte mit mindestens einer Behandlungsflüssigkeit.
- Um die Struktur von biologischen Proben, wie Geweben oder Zellen im Elektronenmikroskop untersuchen zu können, werden Ultradünnschnitte von nur wenigen nm Größe angefertigt, die auf Objektträgernetze aus Metall (im folgenden als Metallnetzchen bezeichnet), bevorzugt aus dem Metall Nickel aufgebracht werden. Für die elektronenmikroskopische Untersuchung werden die Schnitte kontrastiert oder durch spezielle oder cytochemische Verfahren einzelne Bestandteile der Probe markiert. Häufig beruhen diese cytochemischen Verfahren auf dem Prinzip der Ligandenpaarbildung, wobei ein erster Ligand in der biologischen Probe enthalten sein kann und der zweite Ligand dann, wenn er mit dieser Probe in Kontakt kommt, als Bindungspartner an den ersten Ligand bindet. Beispiele für Ligandenpaare auf biologischer Basis stellen Antigen/Antikörper-Bindungspaare, Enzym/Substrat- Bindungspaare, Lektine/Zucker, Hormon/Rezeptor-Systeme, DNA/DNA- und DNA/RNA-Paare dar.
- Im Stand der Technik sind zahlreiche Verfahren bekannt, bei denen das Antigen/Antikörper-Bindungspaar beteiligt ist, sie werden unter dem Begriff der Immunhisto- und Immuncytochemie zusammengefasst (im folgenden als immunologische Markierungstechniken bezeichnet). Das US-Patent 5,143,714 offenbart beispielsweise ein Verfahren, das ein Antigen aus einer flüssigen Probe in einer pelletierbaren Gelsubstanz adsorbiert. Das Gelpellet wird mit einer Diffusionsbarriere umgeben, als Block in eine ausgestanzte Gelmatrix integriert und im Folgenden wie eine Gewebeprobe immunologischen Markierungstechniken unterzogen. Die
DE 38 78 167 T2 beschreibt die Verwendung von kolloidalen Goldteilchen zur Markierung von Liganden in der Immunogold Staining Technique. Ein stark verbessertes Verfahren, das die qualitative und quantitative Auswertung eines Antigens in einer Probe erlaubt, offenbart das US-Patent 5,079,172 mit einem Sandwich-Assay, indem der das Antigen bindende erster Antikörper mit einem Gold markierten zweiten Antikörper, der den ersten Antikörper bindet, markiert wird. Im elektronenmikroskopischen Auswerteverfahren kann anhand der Menge der Goldpartikel das Antigen der Probe qualitativ und quantitativ ermittelt werden. - Vielen Protokollen der Immunhisto- und Immuncytochemie zur immunologischen Markierung von Gewebedünnschnitten ist gemeinsam, dass sie meist aus 10 bis 20 einzelnen Verfahrensschritten bestehen. Zu einem Großteil bestehen die Verfahrenschritte aus Waschvorgängen der zu untersuchenden Probe mit Puffer- oder Markierungslösung.
- Diese Waschvorgänge werden derzeit in einem aufwendigen Prozess manuell durchgeführt, wobei mit einer Pipette einzelne Tropfen der wässrigen Puffer- oder Markierungslösung auf eine hydrophobe Unterlage (z.B. Parafilm®, Parlodion®, Colloidion oder Formfan®) aufgebracht werden. Die Metallnetzchen mit den Gewebedünnschnitten werden nach unten einzeln darauf gelegt, um mit der Behandlungsflüssig keit zu reagieren. Wegen des geringen Gewichts des Metallnetzchens und der Oberflächenspannung des Flüssigkeitstropfen, schwimmt das Metallnetzchen dabei auf der Tropfenoberfläche. Nach einer bestimmten Verweildauer für diesen Schritt (häufig 5-10 min) wird das Metallnetzchen mit einer Pinzette zum nächsten Tropfen weiter transportiert. Dieser Vorgang wird bis zur letzen Position des Standardprotokolls fortgeführt und bindet eine Arbeitskraft bis zu mehreren Stunden pro immunologischer Markierungsreaktion.
- Es ist leicht ersichtlich, dass dieser manuelle Prozess kontinuierliche Aufmerksamkeit des Arbeitspersonals fordert und durch den großen Zeitaufwand hohe Arbeitskosten mit sich bringt. Die Zahl der gleichzeitig zu bearbeitenden Proben ist stark limitiert und Fehler seitens des Arbeitspersonals beim exakten Pipettieren und Positionieren der Flüssigkeitstropfen mit kleinsten Volumina nicht auszuschließen. Das manuelle Verfahren kann eine Verwechslung der Proben nach der langen Behandlungszeit während der immunologischen Markierung nicht ausschließen, dies könnte durch Verwendung eines Probenträgers mit Kennzeichnung in Form eines Chips oder Barcodes, wie es in dem Gebrauchsmuster
DE 299 06 382 U1 dargestellt ist, verhindert werden. - Zusätzlich stellt die Verdunstung der Flüssigkeitstropfen bei länger dauernden Standardprotokollen ein großes Problem dar.
- Zwar offenbart das Gebrauchsmuster
DE 298 17 912 U1 eine Vorrichtung zum Waschen von mikroskopierbaren Präparaten auf Trägern nach immunocytochemischer Behandlung, allerdings handelt es sich hierbei um eine Waschbox in der eine größere Menge an Waschlösung mit einer gewissen Strömungsgeschwindigkeit über Präparat und Träger hindurchströmt. Für die Durchführung von immunologischen Markierungstechniken selber ist diese Vorrichtung nicht geeignet, da die verwendeten antikörperhaltigen Markierungslösungen sehr teuer sind und daher nur in möglichst geringen Volumina eingesetzt werden. - Bisher ist kein Gerät und kein Verfahren bekannt, das den Vorgang der Durchführung von immunologischen Markierungstechniken für Gewebedünnschnitte zufriedenstellend automatisiert.
- Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, eine geeignete Vorrichtung zur Behandlung von Gewebedünnschnitten bereitzustellen, die es erlaubt effektiv, annähernd automatisch und zeitsparend mehrere Gewebedünnschnitte in reproduzierbarer Qualität gleichzeitig zu bearbeiten.
- Die Aufgabe wird erfindungsgemäß mit einer Vorrichtung gelöst, die die Merkmale Anspruchs 1 umfasst.
- Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es ein Verfahren zur Behandlung von Gewebedünnschnitten für die Durchführung von immunologischen Markierungstechniken bereitzustellen, das es erlaubt effektiv, annähernd automatisch und zeitsparend mehrere Gewebedünnschnitte in reproduzierbarer Qualität gleichzeitig zu bearbeiten.
- Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß mit einem Verfahren gelöst, das Merkmale des Anspruchs 22 umfasst.
- Die erfindungsgemäße Vorrichtung besteht im wesentlichen aus zwei Teilen, einer Trägerplatte, auf der Metallnetzchen platziert und mittels Magnet gehalten werden und einem Objektträger der Vertiefungen (sogenannte „wells") enthält, die mit mindestens einer Flüssigkeit (Behandlungsflüssigkeiten zur immunologischen Markierung oder Waschlösungen jeweils nach dem Stand der Technik) gefüllt werden können. Die Positionen der Vertiefungen entsprechen dabei in ihrer Anordnung gegenüberliegend den Positionen der Metallnetzchen auf der Trägerplatte. Beide Teile der Vorrichtung können in einer Anordnung in eine Transportvorrichtung mit steuerbarer Hebe- und Senkfunktion so eingelegt werden, dass die Trägerplatte mit den Metallnetzchen von oben wie ein Stempel mit den Flüssigkeitstropfen in den Vertiefungen des Objektträgers in Berührung kommt. Dieser Vorgang ermöglicht eine Automatisierung von immunologischen Markierungsverfahren für Gewebedünnschnitte für elektronenmikroskopische Untersuchung. Mehrere Objektträger können automatisch einer Behandlungsposition zugeordnet werden und auf einer einzelnen Trägerplatte können eine Vielzahl von Metallnetzchen angebracht sein, so dass sich die Anzahl der gleichzeitig zu bearbeitenden Proben deutlich erhöht. Die Vorrichtung zur Behandlung von Gewebedünnschnitten besitzt mindestens eine Trägerplatte, wobei die Gewebedünnschnitte mit mindestens einer Behandlungsflüssigkeit behandelt werden. Gegenüberliegend zu der Trägerplatte ist mindestens ein Objektträger in einer Behandlungsposition angeordnet. Mehrere der Objektträger sind in diese Behandlungsposition automatisch überführbar. Die Trägerplatte definiert eine Unterseite, an der markierte Positionen ausgezeichnet sind, an denen Metallnetzchen mit Gewebedünnschnitten positioniert sind. Ebenso definiert die trägerplatte eine Oberseite, in der mehrere Bohrungen ausgebildet sind, in denen jeweils ein Magnet steckt. Die Bohrungen sind derart angebracht, dass sie den markierten Positionen gegenüberliegen. Der Objektträger definiert eine Oberseite, die freie Vertiefungen enthält, die zur Aufnahme von Behandlungsflüssigkeit ausgebildet sind.
- Die Erfindung wird im folgenden anhand der in den Figuren schematisch dargestellten Beispiele verdeutlicht. Dabei zeigen:
-
1 : eine perspektivische Ansicht einer Trägerplatte, die Metallnetzchen trägt; -
2 : eine perspektivische Ansicht eines Objektträgers mit Vertiefungen, die mit mindestens einer Behandlungsflüssigkeit gefüllt werden können; -
3 eine Detailansicht der Trägerplatte und des Objektträgers im Querschnitt; -
4 : eine Draufsicht einer Ausführungsform eines Objektträgers, -
5 eine perspektivische Ansicht der Transportvorrichtung zum Aufbringen der Trägerplatte auf den Objektträger; -
6 eine schematische Darstellung der Trägerplatte, die durch die Transportvorrichtung annähernd in Kontakt mit einem Objektträger ist; -
7 eine schematische Darstellung der Kammer als Verdunstungsschutz der Flüssigkeitstropfen auf den Objektträgern; und -
8 eine schematische Darstellung einer anderen Ausführungsform der Kammer als Verdunstungsschutz der Flüssigkeitstropfen auf den Objektträgern. -
1 zeigt eine erfindungsgemäße Trägerplatte1 , die eine Oberseite1a und eine Unterseite1b definiert. Auf der Unterseite1b besitzt die Trägerplatte1 markierte Positionen, an denen Metallnetzchen2 mit Gewebedünnschnitten (hier nicht dargestellt) positioniert sind. Bevorzugter weise sind die Positionen der Metallnetzchen2 auf der Trägerplatte1 erhöht. Damit wird verhindert, dass beim Kontakt mit den Flüssigkeitstropfen Flüssigkeitsbrücken zwischen den einzelnen Metallnetzchen2 entstehen. An der Oberseite1a der Trägerplatte1 befinden sich entgegengesetzt zu den Positionen der Metallnetzchen2 Bohrungen3a (siehe3 ), in denen Magnete3 z. B. Permanentmagnete stecken. Sie bewirken, dass die Metallnetzchen2 auf der Unterseite1b der Trägerplatte1 durch magnetische Kraft auf ihrem Platz gehalten werden. Der Abstand zwischen Metallnetzchen2 und Magnet3 soll möglichst gering (Abstand < 2 mm) gehalten werden. Die Trägerplatte1 besteht vorzugsweise aus formstabilem, nicht magnetischen Material, vorzugsweise aus Aluminium, Messing, faserverstärkte Kunststoffe und ist vor teilhafter weise auf der Unterseite1b , die die Metallnetzchen2 trägt, hydrophob beschichtet (z.B. mit einer Teflondruckbeschichtung). Es ist für einen Fachmann selbstverständlich, dass für Form der Trägerplatte1 , sowie die Anordnung der Metallnetzchen2 auf der Trägerplatte1 zahlreiche Ausführungsformen möglich sind. In der hier dargestellten Ausführungsform sind auf einer rechteckigen Platte mit den Maßen ca. 76 × 26mm (3 × 1 Inch; Objektträgergröße) beispielsweise 10 × 3 Metallnetzchen2 untergebracht, die einen Durchmesser von 3 mm aufweisen. Entscheidend ist, dass die Positionen der Metallnetzchen2 auf der Unterseite1b der Trägerplatte1 den Bohrungen für die Magnete3 auf der Oberseite1a der Trägerplatte1 gegenüberliegen und vorzugsweise auch den Positionen mindestens eines Flüssigkeitstropfens6 auf der Oberseite4a eines Objektträgers4 (siehe2 ) gegenüberliegen. - In einem weiteren Ausführungsbeispiel werden die Metallnetzchen
2 auf der Unterseite1b der Trägerplatte1 durch Elektromagnete (nicht dargestellt) gehalten. -
2 zeigt eine perspektivische Ansicht des erfindungsgemäßen Objektträgers4 , der eine Oberseite4a und eine Unterseite4b definiert. Der Objektträger4 besitzt auf der Oberseite4a mehrere Vertiefungen5 (sogenannte „wells"), die in der gezeigten Ausführungsform in Reihe angeordnet und mit jeweils einem Flüssigkeitstropfen6 gefüllt sind. Der Flüssigkeitstropfen6 besteht aus einer Wasch- oder Behandlungslösung wie sie im Stand der Technik offenbart ist. Es ist vorgesehen, dass sich in den einzelnen Vertiefungen5 auch unterschiedliche Flüssigkeiten befinden (z.B. eine Reihe von Vertiefungen5 gefüllt mit Waschlösung, die nächste Reihe von Vertiefungen5 gefüllt mit Markierungslösung). Der Objektträger4 ist vorteilhafter weise transparent und besteht aus formstabilem Material. Vorzugsweise ist der Objektträger4 aus Glas oder Kunststoff und ist auf der Oberseite4a , die die Vertiefungen5 trägt, und in den Vertiefungen5 selber hydrophob beschichtet (z.B. mit einer Teflondruckbeschichtung5a ). Die Vertiefung5 ist ident mit der Dicke D (siehe3 ) der Teflonbeschichtung5a . Die Vertiefung5 beträgt vorzugsweise etwa 50μm. Die Vertiefungen5 tragen ein Flüssigkeitsvolumen, das bei Waschlösung etwa 50μl, bei Antikörpern und Goldlösungen etwa 5μl beträgt. Die Teflondruckbeschichtung ist für verschiedene Tropfengrößen gleich. Durch die hydrophobe Randschicht wölben sich die Flüssigkeitstropfen6 mehr oder weniger nach oben. Um die Netzchen mit diesen Tropfen in Berührung zu bringen, ist es für den Ablauf unbedingt notwendig die Tropfengröße zu kennen, da die Tropfengröße eine unterschiedliche Position für die Absenkbewegung der Metallnetzchen2 ergibt. - Die räumliche Beziehung des Objektträgers
4 und der Trägerplatte1 zueinander sind in3 als Teilansicht im Querschnitt dargestellt. Die Teilansicht des Querschnitts ist z.B. in2 durch die gestrichelte Linie32 definiert. In dem hier gezeigten Ausführungsbeispiel ist auf dem Objektträger4 eine hydrophobe Beschichtung5a aufgebracht, die eine Dicke D aufweist. In der Trägerplatte1 sind Bohrungen3a für Magnete3 vorgesehen. Auf der Unterseite1b der Trägerplatte1 sind markierte Positionen2a vorgesehen, von denen jeweils eine ein Metallnetzchen2 trägt. Das Metallnetzchen2 ist durch die den markierten Positionen2a zugeordneten Magnete3 gehaltert. Die gestrichelt-gepunktete Linie29 in3 verdeutlicht, dass die Trägerplatte1 und der Objektträger4 derart angeordnet sind, dass jeweils eine markierte Positionen2a mit Metallnetzchen2 einer Vertiefung5 gegenüberliegt. -
4 zeigt den Objektträger4 in der Draufsicht. Dabei ist eine weitere Ausführungsform des Objektträgers4 dargestellt. Zur Kennzeichnung besitzt der Objektträger4 vorteilhafter weise eine Kennzeichnung, wie es z.B. in dem GebrauchsmusterDE 299 06 382 U1 dargestellt ist. Die Kennzeichnung4c ist auf der Oberfläche4a des Objektträgers4 angebracht und kann in Form eines Barcodes oder eines Chips ausgestaltet sein. Dem Fachmann ist ersichtlich, dass es die für Größe und Form des Objektträgers4 , sowie die Anordnung der Vertiefungen5 auf der Oberseite4a des Objektträgers4 zahlreiche Ausführungsmöglichkeiten gibt. Auf einer rechteckigen Fläche mit den Maßen 76 mm × 26 mm können beispielsweise 10 × 3 Vertiefungen5 einer Größe von 2 mm bis 3 mm enthalten sein. Entscheidend ist, dass die Positionen der Flüssigkeitstropfen6 auf der Oberseite4a des Objektträgers4 in ihrer Anordnung den Positionen der Metallnetzchen2 auf der Unterseite1a der Trägerplatte1 gegenüberliegen (siehe Darstellung3 ). -
5 zeigt die erfindungsgemäße Trägerplatte1 in einer Transportvorrichtung20 mit steuerbarer Hebe- und Senkfunktion. Die Transportvorrichtung20 ist derart ausgestaltet, dass mehrere Objektträger4 mit der Trägerplatte1 nacheinander in Kontakt gebracht werden können. Die Transportvorrichtung20 wird derart gesteuert, dass die Positionen der Vertiefungen5 des Objektträgers4 mit den darin befindlichen Flüssigkeitstropfen6 exakt den Positionen der Metallnetzchen2 auf der Unterseite1b der Trägerplatte1 gegenüberliegen. Dabei wird die Trägerplatte1 mittels eines Motors21 der Transportvorrichtung20 von oben parallel und seitlich zentriert, bis die Positionen von Metallnetzchen2 und der Flüssigkeitstropfen6 gegenüberliegend übereinstimmen. Die Transportvorrichtung20 nähert dann die Trägerplatte1 an den Objektträger4 an. Hierzu ist an der Transportvorrichtung20 eine Schiene22 vorgesehen, die die in einem Haltekopf23 der Transportvorrichtung20 über eine Halterung9 eingespannte Trägerplatte1 , linear auf den Objektträger4 absenkt. Die Objektträger4 sind z.B. auf einer Fördereinrichtung24 aufgelegt, die die Objektträger4 in geeigneter Weise zu der Transportvorrichtung20 bewegt. Die Transportvorrichtung20 und die Fördereinrichtung24 werden über eine Computereinheit25 und entsprechendes Computerprogramm gesteuert und geregelt. -
6 zeigt eine schematische Darstellung der erfindungsgemäßen Trägerplatte1 , die sich durch die Transportvorrichtung20 (siehe5 ), annähernd in Kontakt mit einem Objektträger4 befindet. Auf der Unterseite1b besitzt die Trägerplatte1 markierte Positionen2a , an denen in erhöhter Position Metallnetzchen2 mit Gewebedünnschnitten2b positioniert sind. An der Oberseite1a der Trägerplatte1 befinden sich entgegengesetzt zu den Positionen der Metallnetzchen2 Bohrungen3a , in denen Magnete3 stecken, um die Metallnetzchen2 auf der Unterseite1b der Trägerplatte1 durch magnetische Kraft auf ihrem Platz zu halten. - Bei einem bestimmten geringen Abstand zwischen der Unterseite
1b der Trägerplatte1 und der Oberseite4a des Objektträgers4 benetzen die Flüssigkeitstropfen6 die Gewebedünnschnitte2b auf den Metallnetzchen2 . Der Abstand ist dabei vom Volumen des Flüssigkeitstropfen6 abhängig und variiert von 0,5 mm bis 4 mm. Der Transport der Trägerplatte1 und des Objektträgers4 wird mit einer Linearführung mit Schrittmotorantrieb (nicht dargestellt) durchgeführt. Die Positionen des Objektträgers4 und der Trägerplatte1 werden mit Positionssensoren7 überwacht und entsprechend gesteuert. Zur Steuerung werden die Signale der verschiedenen Positionssensoren7 verwendet. In der hier dargestellten Ausführungsform sind parallel angeordnete, vertikale Führungsschienen8 vorgesehen, über die der Haltekopf23 (siehe5 ) zusammen mit der in einer Halterung9 eingespannten Trägerplatte1 auf den Objektträger4 abgesenkt werden kann. Die Halterung30 fixiert die Trägerplatte1 und jeweils einen Objektträger4 zueinander in einer Behandlungsposition14 (siehe5 ). Dabei sind die Metallnetzchen2 , die einen Gewebedünnschnitt2b tragen, in Kontakt mit den Flüssigkeitstropfen6 auf der Oberseite4a des Objektträgers4 . Nach Ablauf einer eingestellten Inkubationszeit wird automatisch der Wechsel der Trägerplatte1 zum nächsten Arrangement von Flüssigkeitstropfen6 auf demselben Objektträger4 oder einem nächsten Objektträger4 bewirkt. Die Trägerplatte1 wird dazu automatisch angehoben und der Objektträger4 um eine Stellung weiter transportiert. Dabei ist in6 mit dem Pfeil A die vertikale Transportrichtung der Trägerplatte1 und mit dem Pfeil B die horizontale Transportrichtung des Objektträgers4 gekennzeichnet. - Der Ablauf des Transports der Objektträger
4 ist im weiteren nicht detailliert beschrieben und kann auf verschiedene Weise realisiert werden. Dem Fachmann sind beispielsweise folgende Anordnungen bekannt: Die Objektträger4 sind auf einer linearen Fördereinrichtung24 aufgelegt, die durch eine Motor26 bewegt wird. Alternativ befinden sich die Objektträger4 auf einer kreisförmigen Fördereinrichtung24 gelegt, die ebenfalls mit einem Motor angetrieben wird. - Um eine Volumenreduktion der Flüssigkeitstropfen
6 durch Verdampfen zu vermeiden sind die Objektträger4 auf der Fördereinrichtung24 mit einer Abdeckung10 versehen, so dass dadurch eine Kammer11 entsteht. In dieser Kammer11 wird z.B. durch eingelegtes feuchtes Filterpapier13 auf einer Halterung12 eine hohe Luftfeuchtigkeit erreicht und die Verdampfung der Flüssigkeitstropfen6 gering gehalten.7 zeigt in eine schematische Darstellung der Kammer11 als Verdunstungsschutz der Flüssigkeitstropfen6 auf dem Objektträger4 . In der Kammer befindet sich auf einer Halterung12 ein Stapel feuchtes Fließpapier13 . Vor dem Kontakt der Flüssigkeitstropfen6 mit den Metallnetzchen2 wird die Abdeckung10 automatisch zumindest teilweise geöffnet. -
8 zeigt eine schematische Darstellung einer anderen Ausführungsform der Kammer10 als Verdunstungsschutz der Flüssigkeitstropfen6 auf den Objektträgern4 . Die Kammer4 als Verdunstungsschutz sieht in einer anderen Ausführungsform z.B. derart aus, dass sich das feuchte Filterpapier13 in der Kammer10 unterhalb des Objektträgers4 befindet. Bei dieser Ausführungsform sind mehrere Kammern10 überein ander gestapelt. Dabei ist die nächste Kammer auf der darunter liegenden Kammer platziert und schließt somit diese ab. Die Feuchtigkeit des Filterpapiers13 dringt von unten seitlich am Objektträger4 vorbei in die Kammer10 . Der Objektträger4 steht sozusagen auf Stelzen28 im Sumpf. Die oberste Kammer10 ist schließlich mit einem Deckel27 abgeschlossen. Die Objektträger4 werden in geeigneter Weise zu der Behandlungsposition14 transportiert. In der Behandlungsposition wird die Trägerplatte1 mit dem Objektträger in Kontakt gebracht. - Die erfindungsgemäße Vorrichtung ist so angepasst, dass sie folgende Schritte eines bereits bestehenden Standardprotokolls zur immunologischen Markierung von Gewebedünnschnitten automatisch ausführt: Absättigen unspezifischer Bindungen, Antikörper-Inkubation, diverse Waschschritte mit verschiedenen Waschlösungen.
- In einer weiteren Ausführungsform ist an der Behandlungsposition die Anbringung einer Wärmequelle beispielsweise in Form einer kleinen elektrischen Widerstandsheizvorrichtung oder einer Kühleinheit vorgesehen, um die optimale Reaktionstemperatur des Objektträgers
4 und der Flüssigkeitstropfen6 einzustellen. Diese ist so ausgebildet, dass ein elektrischer Kontakt des Objektträgers die Heiz- bzw. Kühlvorrichtung dieses Objektträgers auslöst. Die Steuerung der Wärmequelle bzw. der Kühleinheit erfolgt per Temperaturfühler am Objektträger4 oder in der Nähe des Flüssigkeitstropfens und wird durch die angeschlossene Computereinheit25 und ein entsprechendes Computerprogramm reguliert. Die Erwärmung oder Kühlung der Objektträger4 kann auch durch Kontakt der Objektträger4 mit einer temperaturgeregelten, metallischen Platte31 erfolgen. - Gegenstand der Erfindung ist darüber hinaus ein Verfahren, mit dem unter Nutzung der beschriebenen Vorrichtung mehrere Metallnetzchen
2 mit darauf befindlichen Gewebedünnschnitten2b auf einer Trägerplatte1 zur Behandlung, im besonderen zur Durchführung von immu nologischen Markierungen und/oder Waschschritten in reproduzierbarer Qualität gleichzeitig effektiv und zeitsparend bearbeitet werden. Der automatisierte Arbeitsablauf reduziert die Fehlerquelle „Mensch". - Das Verfahren optimiert die Behandlung, im besonderen die Durchführung von immunologischen Markierungen und /oder Waschschritten von Gewebedünnschnitten für elektronenmikroskopische Proben, die einzelnen Protokolle bezüglich Art der Flüssigkeit und Inkubationszeit sind dabei dem Stand der Technik zu entnehmen.
- Anstelle die Metallnetzchen
2 mit einer Pinzette von einem Flüssigkeitstropfen6 zum nächsten zu transportieren, werden die Gewebedünnschnitte2b auf Metallnetzchen2 positioniert und auf die erfindungsgemäße Trägerplatte1 , die markierte und erhöhte Positionen2a aufweist und die auf der Unterseite1b vorteilhafter weise hydrophob beschichtet ist, platziert. Die an der Oberseite1a der Trägerplatte1 befindlichen Magnete3 halten die Metallnetzchen2 durch magnetische Kraft auf ihrem Platz (siehe6 ). - Die Trägerplatte
1 wird mittels einer Transportvorrichtung20 mit steuerbarer Hebe- und Senkfunktion (siehe5 ) gehaltert und auf die jeweiligen Objektträger4 abgesenkt. - Mit einer Mikroliterpipette werden Flüssigkeitstropfen
6 exakten Volumens in die Vertiefungen5 des erfindungsgemäßen Objektträgers4 , eingefüllt. Die Positionen der Flüssigkeitstropfen6 am Objektträger4 liegen in der Behandlungsposition14 den Positionen der Metallnetzchen2 auf der Trägerplatte1 genau gegenüber (siehe6 ). - Der Objektträger
4 ist auf der Fördereinrichtung24 der Transportvorrichtung20 aufgelegt. Die Einstellung einer bestimmten Temperatur des Objektträgers4 und der Flüssigkeitstropfen6 wird per Computereinheit25 durch eine Wärmequelle bzw. eine Kühleinheit (nicht darge stellt) die durch elektrischen Kontakt des Objektträgers ausgelöst werden gesteuert. - Die Transportvorrichtung
20 und die Fördereinrichtung24 arbeiten derart zusammen, dass die Trägerplatte1 mit den Metallnetzchen2 parallel und seitlich bezüglich dem Objektträger4 zentriert ist. Dabei stimmen die Positionen der Metallnetzchen2 und die der Flüssigkeitstropfen6 exakt gegenüberliegend überein. Die Abdeckung10 , die die Flüssigkeitstropfen6 in einer Kammer11 mit feuchtem Fließpapier13 vor Verdunstung und dadurch bedingter Volumenreduktion schützt, wird automatisch zumindest teilweise geöffnet. Bei einem bestimmten geringen Abstand zwischen der Trägerplatte1 und dem Objektträger4 benetzen die Flüssigkeitstropfen6 die Metallnetzchen2 . Diese Position wird nun für die jeweils programmierte Inkubationszeit konstant gehalten. Der Abstand ist vom Tropfenvolumen abhängig und variiert von 0,5 mm bis 4 mm. Die motorbetriebene Transportmechanik der Fördereinrichtung24 und die Transportvorrichtung20 werden per Computereinheit25 , Computerprogramm und Positionssensoren7 gesteuert. - Nach Ende der eingestellten Inkubationszeit erfolgt automatisch der Wechsel der Trägerplatte 1 zum nächsten Flüssigkeitstropfen
6 . Die Trägerplatte1 wird automatisch mit der Transportvorrichtung20 und Sensorsteuerung7 angehoben und der Objektträger4 automatisch um eine Position weitertransportiert oder ein nächster Objektträger4 mit Flüssigkeitstropfen6 automatisch aus einer Linearführung mit mehreren Objektträgern einem Karussell, einer Kassette oder einem Stapel eingeführt. - Mit diesem Verfahren werden folgende Schritte eines Standardprotokolls zur immunologischen Markierung von Gewebedünnschnitten aus dem Stand der Technik mit mehreren Metallnetzchen
2 und darauf befindlichen Gewebedünnschnitten2b gleichzeitig automatisch und reproduzierbar ausführt: Absättigen unspezifischer Bindungen, Antikör per-Inkubation, diverse Waschschritte mit verschiedenen Waschlösungen. - Die Erfindung wurde in Bezug auf eine besondere Ausführungsform beschrieben. Es ist einem Fachmann jedoch klar, das Abwandlungen und Modifikationen durchgeführt werden können, ohne den Schutzbereich der Ansprüche zu verlassen.
-
- 1
- Trägerplatte
- 1a
- Oberseite der Trägerplatte
- 1b
- Unterseite der Trägerplatte
- 2
- Metallnetzchen
- 2a
- markierte Positionen auf der Trägerplatte
- 2b
- Gewebedünnschnitte
- 3
- Magnete
- 3a
- Bohrungen für Magnete
- 4
- Objektträger
- 4a
- Oberseite des Objektträgers
- 4b
- Unterseite des Objektträgers
- 4c
- Kennzeichnung am Objektträger
- 5
- Vertiefungen („wells")
- 5a
- Teflonbeschichtung
- 6
- Flüssigkeitstropfen
- 7
- Positionssensoren
- 8
- vertikale Führungsschiene der Transportvorrichtung
- 9
- Halterung für Trägerplatte
- 10
- Abdeckung des Objektträgers
- 11
- Kammer
- 12
- Halterung für Fließpapier
- 13
- Stapel feuchtes Fließpapier
- 14
- Behandlungsposition
- 20
- Transportvorrichtung
- 21
- Motor der Transportvorrichtung
- 22
- Führungsschiene der Transporteinrichtung
- 23
- Haltekopf
- 24
- Fördereinrichtung
- 25
- Computereinheit
- 26
- Motor der Fördereinrichtung
- 27
- Deckel
- 28
- Stelze
- 29
- gestrichelt-gepunktete Linie
- 30
- Halterung der Transporteinrichtung
- 31
- temperaturgeregelte Platte
- 32
- gestrichelte Linie
- A
- Pfeil vertikale Transportrichtung
- B
- Pfeil horizontale Transportrichtung
- D
- Dicke
Claims (36)
- Vorrichtung zur Behandlung von Gewebedünnschnitten (
6 ) auf einer Trägerplatte (1 ) mit mindestens einer Behandlungsflüssigkeit dadurch gekennzeichnet, dass der Trägerplatte (1 ) gegenüberliegend ein Objektträger (4 ) in einer Behandlungsposition (14 ) zugeordnet ist, und dass mehrere Objektträger in diese Behandlungsposition (14 ) automatisch überführbar sind. - Vorrichtung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet dass die Trägerplatte (
1 ) eine Unterseite (1b ) definiert, an der markierte Positionen (2a ) ausgezeichnet sind, an denen Metallnetzchen (2 ) mit Gewebedünnschnitten (2b ) positioniert sind und eine Oberseite (1a ) definiert, in der mehrere Bohrungen (3a ) ausgebildet sind, in denen jeweils ein Magnet (3 ) steckt, wobei die Bohrungen (3a ) den markierten Positionen (2a ) gegenüberliegen. - Vorrichtung gemäß Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet dass, die Positionen (
2a ) für Metallnetzchen (2 ) auf der Unterseite (1b ) der Trägerplatte (1 ) als Erhöhung ausgebildet sind. - Vorrichtung gemäß Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet dass, die Magnete (
3 ) in den Bohrungen (3a ) auf der Oberseite (1a ) der Trägerpatte (1 ) Permanentmagnete oder Elektromagnete sind. - Vorrichtung gemäß Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet dass, die Trägerplatte (
1 ) aus formstabilem Material, vorzugsweise aus Aluminium, Messing, faserverstärkten Kunststoffen, besteht. - Vorrichtung gemäß Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet dass, die Trägerplatte (
1 ) auf der Unterseite (1b ), die die Metallnetzchen (2 ) trägt hydrophob beschichtet ist. - Vorrichtung gemäß Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet dass, die Anordnung der markierten Positionen (
2a ) auf der Unterseite (1b ) der Trägerplatte (1 ) auf denen die Metallnetzchen (2 ) sitzen, den Positionen der Vertiefungen (5 ) mit Flüssigkeitstropfen (6 ) auf der Oberseite (4a ) des Objektträgers (4 ) gegenüberliegen. - Vorrichtung gemäß Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet dass, die Trägerplatte (
1 ) über eine Halterung (9 ) am Haltekopf (23 ) an einer Transporteinrichtung (20 ) mit motorbetriebener Hebe- und Senk-Funktion angebracht ist. - Vorrichtung gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet dass die Transporteinrichtung (
20 ) über eine angeschlossene Computereinheit (25 ) und Positionssensoren (7 ) automatisch gesteuert wird. - Vorrichtung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet dass der Objektträger (
4 ) eine Oberseite (4a ) definiert, die freie Vertiefungen (5 ) enthält, die zur Aufnahme von Behandlungsflüssigkeit (6 ) ausgebildet sind. - Vorrichtung gemäß Anspruch 1 und 10, dadurch gekennzeichnet dass, der Objektträger (
4 ) aus transparentem formstabilem Material, vorzugsweise aus Glas oder faserverstärkten Kunststoff besteht. - Vorrichtung gemäß Anspruch 1 und 10, dadurch gekennzeichnet dass, der Objektträger (
4 ) auf der Oberseite (4a ), die die Vertiefungen (5 ) enthält hydrophob beschichtet ist. - Vorrichtung gemäß Anspruch 1 und 10, dadurch gekennzeichnet dass, die Tiefe der Vertiefungen (
5 ) auf der Oberseite (4a ) des Objektträgers (4 ) mit der Schichtdicke der Beschichtung übereinstimmt. - Vorrichtung gemäß Anspruch 1 und 10, dadurch gekennzeichnet dass, das Flüssigkeitsvolumen der Vertiefungen (
5 ) des Objektträgers (4 ) 50 μl vorzugsweise 5 μl beträgt. - Vorrichtung gemäß Anspruch 1 und 10, dadurch gekennzeichnet dass, die Behandlungsflüssigkeit eine Markierungs- und/oder Waschlösung zur Durchführung von immunologischen Markierungstechniken für Gewebedünnschnitte ist.
- Vorrichtung gemäß Anspruch 1 und 10, dadurch gekennzeichnet dass, der Objektträger (
4 ) zur Kennzeichnung eine Speichereinrichtung (4c ) in Form eines Barcodes und/oder Chips aufweist. - Vorrichtung gemäß Anspruch 1 und 10 dadurch gekennzeichnet dass, die Positionen der Vertiefungen (
5 ) mit den Flüssigkeitstropfen (6 ) auf der Oberseite (4a ) des Objektträgers (4 ) in ihrer Anordnung den Positionen der Metallnetzchen (2 ) auf der Unterseite (1b ) der Trägerplatte (1 ) gegenüberliegen. - Vorrichtung gemäß Anspruch 1 und 10, dadurch gekennzeichnet dass, sich der Objektträger (
4 ) auf einer Fördereinrichtung (24 ) befindet, die über eine Führungsschiene (22 ) und einen Motor (26 ) eine Behandlungsposition einstellt. - Vorrichtung gemäß Anspruch 1 und 10, dadurch gekennzeichnet dass, die Steuerung der Fördereinrichtung (
24 ) über eine angeschlossene Computereinheit (25 ) und Positionssensoren (7 ) automatisch erfolgt. - Vorrichtung gemäß Anspruch 1 und 10 dadurch gekennzeichnet dass der Objektträger (
4 ) auf der Fördereinrichtung (24 ) mit einer automatisch wenigstens teilweise zu öffnenden Abdeckung (10 ) versehen ist, so dass dadurch eine Kammer (11 ) entsteht. - Vorrichtung gemäß Anspruch 20 dadurch gekennzeichnet dass die Kammer (
11 ) eine Halterung (12 ) aufweist, in die feuchtes Fließpapier (13 ) eingelegt wird, so dass in der Kammer (11 ) eine hohe Luftfeuchtigkeit entsteht und die Verdampfung der Flüssigkeitstropfen (6 ) auf den Objektträgern (4 ) gering ist. - Verfahren zur Behandlung von Gewebedünnschnitten auf einer Trägerplatte (
1 ) mit mindestens einer Behandlungsflüssigkeit, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte: Befüllen mindestens eines Objektträgers (4 ), auf dem sich Vertiefungen (5 ) befinden, mit einer Behandlungsflüssigkeit (6 ); Verbringen des Objektträgers (4 ) in eine Behandlungsposition; Absenken und die Trägerplatte (1 ) auf den Objektträger (4 ), wobei ein Kontakt zwischen der Behandlungsflüssigkeit (6 ) und den Gewebedünnschnitten (2b ) hergestellt wird und automatisches Wechseln der Objektträger (4 ) zu einer nächsten Behandlungsposition. - Verfahren gemäß Anspruch 22 gekennzeichnet dadurch dass die Behandlung der Gewebedünnschnitte (
2b ) immunologische Markierungsreaktionen und /oder Waschschritte darstellt. - Verfahren gemäß Anspruch 22 gekennzeichnet dadurch dass die Behandlung der Gewebedünnschnitte (
2b ) automatisch durchgeführt wird. - Verfahren gemäß Anspruch 22 gekennzeichnet dadurch dass sich die Gewebedünnschnitte (
2b ) auf Metallnetzchen (2 ) befinden, die auf markierten und erhöhten Positionen (2a ) der Unterseite (1b ) der erfindungsgemäßen Trägerplatte (1 ) sitzen und durch Magnete (3 ) an der Oberseite (1a ) der Trägerplatte (1 ) auf ihrem Platz gehalten werden. - Verfahren gemäß Anspruch 22 gekennzeichnet dadurch dass die Trägerplatte (
1 ) mittels einer Halterung (9 ) an einem Haltekopf (23 ) einer Transportvorrichtung (20 ) mit automatischer Hebe- und Senkfunktion befestigt wird. - Verfahren gemäß Anspruch 22 gekennzeichnet dadurch, dass die Vertiefungen (
5 ), die sich auf der Oberseite (4a ) des Objektträgers (4 ) befinden, mit einer Markierungs- und/oder Waschlösung zur Durchführung von immunologischen Markierungstechniken für Gewebedünnschnitte gefüllt sind. - Verfahren gemäß Anspruch 22 gekennzeichnet dadurch, dass die Transportvorrichtung (
20 ) mit automatischer Hebe- und Senkfunktion den Objektträger (4 ) in eine Behandlungsposition bringt, in der die Flüssigkeitstropfen (6 ) in den Vertiefungen (5 ) auf der Oberseite (4a ) des Objektträgers (4 ) exakt den Gewebedünnschnitten (2b ) auf den Metallnetzchen (2 ) auf der Unterseite (1b ) der Trägerplatte (1 ) gegenüberliegen. - Verfahren gemäß Anspruch 22 gekennzeichnet dadurch, dass sich der Objektträger (
4 ) auf einer Fördereinrichtung (24 ) befindet, die über eine Führungsschiene (22 ) und einen Motor (26 ) in eine Behandlungsposition bewegt wird. - Verfahren gemäß Anspruch 22 gekennzeichnet dadurch dass die Steuerung der Transportvorrichtung (
20 ) über eine Computereinheit (25 ) und Positionssensoren (7 ) erfolgt. - Verfahren gemäß Anspruch 22 gekennzeichnet dadurch dass die Steuerung der Transportvorrichtung (
20 ) so eingestellt ist, dass die Trägerplatte (1 ) an den Objektträger (4 ) annähert wird und die Gewebedünnschnitte (2b ) auf den Metallnetzchen (2 ) in Kontakt mit den Flüssigkeitstropfen (6 ) auf dem Objektträger (4 ) kommen. - Verfahren gemäß Anspruch 22 gekennzeichnet dadurch dass vor dem Kontakt der Gewebedünnschnitte (
2b ) auf der Trägerplatte (1 ) mit den Flüssigkeitstropfen (6 ) auf dem Objektträger (4 ) die Abdeckung (10 ) der Objektträger (4 ) automatisch zumindest teilweise geöffnet wird. - Verfahren gemäß Anspruch 22 gekennzeichnet dadurch dass der Kontakt der Gewebedünnschnitte (
2b ) auf der Trägerplatte (1 ) mit den Flüssigkeitstropfen (6 ) auf dem Objektträger (4 ) über eine beliebige Inkubationszeit gehalten wird. - Verfahren gemäß Anspruch 22 gekennzeichnet dadurch dass nach Ablauf der Inkubationszeit die Trägerplatte (
1 ) automatisch entlang der Führungsschienen (8 ) gehoben wird und der Objektträger (4 ) auf der Fördereinrichtung (24 ) über eine motorbetriebene Führungsschiene (22 ) automatisch in eine andere Behandlungsposition wechselt. - Verfahren gemäß Anspruch 22, gekennzeichnet dadurch, dass die Trägerplatte (
1 ) eine Unterseite (1b ) definiert, an der markierte Positionen (2a ) ausgezeichnet sind, an denen Metallnetzchen (2 ) mit Gewebedünnschnitten (2b ) positioniert sind und eine Oberseite (1a ) definiert, in der mehrere Bohrungen (3a ) ausgebildet sind, in denen jeweils ein Magnet (3 ) steckt, wobei die Bohrungen (3a ) den markierten Positionen (2a ) gegenüberliegen. - Verfahren gemäß Anspruch 22, gekennzeichnet dadurch, dass der Objektträger (
4 ) eine Oberseite (4a ) definiert, die freie Vertiefungen (5 ) enthält, die zur Aufnahme von Behandlungsflüssigkeit (6 ) ausgebildet sind.
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