DE19521720A1 - Insulinanalogonformulierungen - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft monomere Human­ insulinanaloga. Genauer gesagt betrifft die vorliegende Erfindung einen Hexamerkomplex, der ein Insulinanalogon, Zink und ein Phe­ nolderivat umfaßt.

Seit der Einführung von Insulin in den zwanziger Jahren wurden laufend Fortschritte erzielt, um die Behandlung von Diabe­ tes mellitus zu verbessern. Die hauptsächlichen Fortschritte wur­ den in der Insulinreinheit und Verfügbarkeit erzielt. Verschiedene Formulierungen mit unterschiedlichen Wirkzeiten wurden ebenfalls entwickelt. Trotz dieser Verbesserungen kann die subkutane Injektionstherapie dem Patienten immer noch keine bequeme Regulie­ rung und normalisierte glykämische Kontrolle bieten. Häufige Abweichungen von den normalen glykämischen Spiegeln während des Lebens des Patienten führen zu Hyper- oder Hypoglykämie und Langzeitkomplikationen, die Retinopathie, Neuropathie, Nephropa­ thie und Mikro- und Makroangiopathie beinhalten.

Um zur Vermeidung von extremen glykämischen Spiegeln bei zu­ tragen, praktizieren Diabetiker oft eine Mehrfachinjektionsthera­ pie, wobei Insulin mit jeder Mahlzeit verabreicht wird. Jedoch wurde diese Therapie bis jetzt nicht optimiert. Das am schnellsten wirksame, im Handel erhältliche Insulin hat seine maximale Wirkung zu spät nach der Injektion und hält zu lange vor, um den Glukose­ spiegel optimal zu kontrollieren. Kürzlich wurde ein beträcht­ licher Aufwand unternommen, um Insulinformulierungen und Insulinanalogonformulierungen zu entwickeln, die die Kinetik des subkutanen Absorptionsprozesses verändern.

Da alle im Handel erhältlichen pharmazeutischen Insulinfor­ mulierungen Insulin im selbstassoziierten Zustand und vorwiegend in der Zinkhexamerform enthalten, dürfte der geschwindigkeitsbe­ schränkende Schritt für die Absorption des Insulins aus dem subku­ tanen Injektionsdepot in den Blutstrom die Dissoziation des selbstaggregierten Insulinhexamers sein. Brange et al. in Diabetes Care 13: 923-954 (1990). Um diesen Absorptionsprozeß zu beschleu­ nigen, wurden monomere Insulinanaloga entwickelt. Diese monomeren Analoga besitzen ein vergleichbar schnelleres Einsetzen der Akti­ vität als Insulin, während sie die biologische Wirkung des nativen Humaninsulins behalten. Sie stellen eine schnelle Absorption be­ reit, um die Injektionszeit und die maximale Wirkung von Insulin näher zur postprandialen Glukoseabweichung zu bringen, die mit der Reaktion auf die Mahlzeit zusammenhängt. Die Herstellung von ver­ schiedenen Monomeranaloga ist in Chance et al., EP-A 383 472 und Brange et al., EP-A 214 826 beschrieben.

Unglücklicherweise führen diese Modifizierungen beim Insu­ lin, die diese Analoga zu Monomeren werden lassen ebenfalls zu ei­ ner hohen Polymerbildungsrate in parenteralen Formulierungen. Da der Verfall von Insulinpräparationen eintritt, wenn Mengen von 1% Polymer erhalten werden (U.S. Pharmacopeia, 1990), ist die Mini­ mierung dieses Verfalltyps sehr wichtig bei der Reduzierung von unerwünschten Nebenwirkungen. Daher war es wünschenswert, Mono­ meranaloga so zu formulieren, daß das Analogon unter Bildung einer stabilen Konformation sich selbst assoziiert und trotzdem seine schnelle Absorption beibehält.

Die Zugabe von bestimmten Metallionen, vor allem Zink, er­ höht die chemische Stabilität, indem sie das Insulin zur Asso­ ziation und Bildung von Hexameren, speziell der Zn(II)-T₆ Konformation, veranlaßt. Ferner wurden bei phenolischen Substan­ zen gezeigt, daß sie spezifisch an das Insulinhexamer binden und eine allosterische Konformationsänderung induzieren, wobei die acht N-terminale Aminosäuren der B-Kette von der gestreckten Kon­ formation in eine Alphahelix umgewandelt werden. Derewenda et al., Nature 338: 594-596 (1989). Dieser Phenol bindende Konformations­ zustand ist als Zn(II)-R Zustand bekannt.

Im starken Gegensatz zu diesen gut bekannten Beobachtungen, daß Insulin leicht in Gegenwart von Zink unter Bildung einer gut definierten, stabilen Zn-Hexamerstruktur aggregiert, zeigten frühe Untersuchungen mit monomeren Insulinanaloga, daß jede Aggregation zwischen Zink und dem Insulinanalogon sich von der unterscheidet, die mit Insulin beobachtet wird. B.H. Frank, Kopien des Texts und der Dias des bei der Insulinkonferenz "Self-Association and Con­ formational Studies on Human Proinsulin and Insulin Analogs", Uni­ versity of York (29. August - 1. September 1989) gehaltenen Vor­ trags. Ferner wird der hochstabile Zn-Hexamerkomplex, wie er mit Insulin beobachtet wird, nicht mit Monomeranaloga beobachtet. Id. Brems et al. Protein Engeneering, 5: 6 527-533 (1992), be­ schreiben, daß monomeres Lys^B28Pro^B29-hI weniger zu einer Dimerisierung und Selbstassoziation zu Formen mit höherem Moleku­ largewicht neigt, wie Humaninsulin. Brems et al., behaupten wei­ ter, daß Asp^B28Pro^B29-hI, Ala^B28Pro^B29-hI und Lys^B28Pro^B29-hI eine geringe oder keine Zn-induzierte Assoziation zeigen und daß Pro^B29-Insulin, Lys^B28-Insulin, Asp^B28-Insulin und Ala^B28-Insulin eine Zn-induzierte Assoziation zeigen, aber weniger als Zn-Insu­ lin. Daraufhin legen unveröffentlichte experimentelle Beobachtun­ gen der vorliegenden Erfinder nahe, daß eine Assoziation mit Zink beobachtet wird, jedoch unterscheidet sich diese Assoziation zwi­ schen dem Analogon und dem Zink von der bei Insulin. Die Assozia­ tion, die mit diesen Analoga beobachtet wird, ist eine zu einer Unzahl an Formen mit höherem Molekulargewicht und unterscheidet sich von den überwiegenden, gut definierten Zn-Insulinhexameren. Daher ist es klar, daß monomere Insulinanaloga nicht die Zn(II)-T₆ Konformation auf analoge Weise zum Insulin bilden.

In Anbetracht der veröffentlichten Literatur ist es überra­ schend, daß die vorliegende Erfindung monomere Insulinanaloga in einem gut definierten, stabilen Zink-Phenol-Hexamerkomplex hervor­ bringt. Dieser Hexamerkomplex ist einzigartig unterschiedlich zu diesen Komplexen, die mit Insulin unter identischen Bedingungen erhalten werden. Insulinkomplexe mit Zink und Phenol liegen in ei­ ner Zn(II)-R₆ Konformation vor. Der Hexamerkomplex der vorliegen­ den Erfindung ist nicht mit dieser Konformation identisch. Eben­ falls ziemlich bemerkenswert ist, daß der Insulinanalogonhexamer­ komplex eine viel größere Neigung zur Dissoziation aufweist als Insulin. Diese Neigung zur Dissoziation führt zur gewünschten Ei­ genschaft der schnellen Wirksamkeit.

Brange et al. in Current Opinion in Structural Biology 1: 934-940 (1991) beschreiben verschiedene schnell wirkende stabile Insulinmonomere und behaupten, daß der offensichtliche Weg zur Entwicklung eines schnell-wirkenden Insulins der ist, eine Dimer- oder Hexamerbildung zu vermeiden. Ähnlich beschreiben Brange et al., in Diabetes Care 13: 923-954 (1990), daß bei einer Verabrei­ chung von Insulin als Hexamer das Hexamer zusätzlich zu dessen ge­ ringerer freien Diffusion während des Diffusionstransports in die Subkutis und/oder während seines Durchtritts durch die Kapillar­ membran sterisch behinderter sein muß als ein Monomer. Ferner dissoziiert die Zn(II)-R₆ Konformation bei einer subkutanen Injek­ tion nicht direkt, sondern muß sich zur Zn(II)-T₆ Konformation umwandeln. Diese Konformationsänderungen und die Dissoziation hieraus verzögern das Einsetzen der Wirkung. Daher glaubte ein Fachmann zum Erfindungszeitpunkt, daß Bemühungen zur chemischen Stabilisierung des monomeren Insulinanalogons mit Zink unter Bil­ dung eines gut definierten Hexamerkomplexes nicht erfolgreich sein würden, oder falls sie erfolgreich wären das schnelle Einsetzen der gewünschten Wirkung verhindern würden.

Die vorliegende Formulierung ist ein Zink-Phenol-induzier­ ter Hexamerkomplex, der schnell absorbiert wird. Die Absorptions­ geschwindigkeit für den Hexamerkomplex ist mindestens zweimal so schnell wie die, die mit Insulin beobachtet wird. Dabei ist bei einer Formulierung des Hexamerkomplexes dieser genauso stabil ge­ gen chemischen Abbau, wenn er mit Insulin verglichen wird. Daher ist es überraschend, daß die vorliegende Erfindung ein monomeres Insulinanalogon in einen gut definierten, stabilen Zink-Phenol-Hexamerkomplex umwandelt. Bemerkenswerterweise behält dieser Hexa­ merkomplex bei einer Formulierung die schnell-wirkenden Eigen­ schaften, die mit dem monomeren Insulinanalogon zusammenhängen. Demnach liefert die vorliegende Erfindung parenterale Formulierun­ gen des Insulinanalogonhexamerkomplexes, der stabil ist und schnell wirkt.

Die Erfindung liefert einen Humanisulinanalogonkomplex, der umfaßt: Sechs Moleküle eines Humaninsulinanalogons, zwei Zinkionen und mindestens drei Moleküle eines Phenolderivats, das aus der aus m-Kresol, Phenol oder einem Gemisch aus m-Kresol und Phenol beste­ henden Gruppe ausgewählt ist, so daß der Analogonkomplex ein Hexa­ mer ist. Die Erfindung liefert ferner parenterale Formulierungen, die den Hexamerkomplex umfassen.

Die Fig. 1 ist eine graphische Darstellung des Wirkprofils von Lys^B28Pro^B29-hI und Humaninsulin. Der Graph ist die mittlere Reaktionsrate auf die Glukoseinfusion. Die Figur zeigt die Vor­ teile der vorliegenden Erfindung.

Die Fig. 2 ist eine graphische Darstellung der Stabilität von Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin. Der Graph zeigt die Stabilität durch Messung der Polymerbildung des Insulinanalogons in der Hexa­ merassoziation verglichen mit monomerem Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin und Insulin. Die Figur zeigt die Vorteile der vorliegenden Erfin­ dung.

Die Fig. 3 ist eine graphische Darstellung der Dissozia­ tion von Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin in einem Hexamerkomplex. Der Graph ist die in vitro Dissoziation von formuliertem Insulin (o), von Lys^B28Pro^B29-hI als Hexamerkomplex formuliert (Δ), von nicht­ formuliertem Insulin () und von monomerem Lys^B28Pro^B29-hI (*), die durch statische Lichtstreuung bei 488 nm in einem 90° Winkel verfolgt wurde. Die formulierten Proben enthielten 0,5 mol Zn pro mol Protein, 1,25 mg/ml m-Kresol und 1,09 mg/ml Phenol, 7 mM Na­ triumphosphat und 16 mg/ml Glycerin. Die nicht-formulierten und monomeren Proben enthielten keine zusätzlichen Hilfsstoffe. Die Figur zeigt die Vorteile der vorliegenden Erfindung.

Wie oben erwähnt, liefert die Erfindung einen Hexamerkom­ plex eines monomeren Humaninsulinanalogons. Der Ausdruck "monomeres Insulinanalogon" oder "Humaninsulinanalogon" , wie er hierin verwendet wird, betrifft Humaninsulin, worin:

Pro an der Position B28 durch Asp, Lys, Leu, Val oder Ala ersetzt wurde und Lys an der Position B29 Lys in ist oder durch Prolin ersetzt wurde,
Des(B28-B30) oder
Des(B27)
Monomere Insulinanaloga sind in Chance et al., EP-A 383 472 und Brange et al., EP-A 214 826 beschrieben und werden hiermit einge­ führt. Monomere Insulinanaloga neigen weniger zur Dimerisierung oder Selbstassoziation als Insulin.

Der Fachmann würde erkennen, daß andere Modifizierungen möglich sind. Diese Modifizierungen sind in der Technik bekannt und beinhalten den Austausch des Histidinrests an der Position B10 durch Asparaginsäure, den Austausch des Phenylalaninrests an Posi­ tion B1 durch Asparaginsäure, den Austausch des Threoninrests an der Position B30 durch Alanin, den Austausch des Serinrests an der Position B9 durch Asparaginsäure, die Deletion von Aminosäuren an der Position B1 alleine oder in Kombination mit einer Deletion an der Position B2 und die Deletion des Threonins an Position B30.

Alle Aminosäureabkürzungen, die in der Beschreibung verwen­ det werden, sind die, die vom United States Patent & Trademark Of­ fice akzeptiert werden, wie dies in 37 C.F.R 1.822(b) (2) be­ schrieben ist. Ein besonders bevorzugtes monomeres Insulinanalo­ gion ist Lys^B28Pro^B29-Humanisulin (B28 ist Lys, B29 ist Pro).

Der Ausdruck "behandeln" beschreibt, wie er hierin verwen­ det wird, die Handhabung und die Pflege eines Patienten zur Bekämpfung der Krankheit, des Zustands oder der Störung und bein­ haltet die Verabreichung einer erfindungsgemäßen Verbindung, um das Einsetzen der Symptome oder Komplikationen zu verhindern, die Symptome oder Komplikationen zu lindern oder die Krankheit, den Zustand oder die Störung zu beheben.

Der Ausdruck "isotonisches Mittel" betrifft ein Agens, das physiologisch toleriert wird und der Formulierung eine geeignete Tonizität verleiht, um den Nettofluß des Wassers durch die Zellmembran zu verhindern. Verbindungen, wie Glycerin, werden ge­ wöhnlich für solche Zwecke in bekannten Konzentrationen verwendet.

Der Ausdruck "Phenolderivat" oder "phenolische Substanz" meint m-Kresol, Phenol oder ein Gemisch aus m-Kresol und Phenol. Vorzugsweise ist die phenolische Substanz m-Kresol.

Der Ausdruck "physiologisch tolerierter Puffer" ist in der Technik bekannt. Ein physiologisch tolerierter Puffer ist vor­ zugsweise ein Phosphatpuffer, wie Natriumphosphat. Andere physio­ logisch tolerierte Puffer sind unter anderem TRIS, Natriumacetat oder Natriumcitrat. Die Auswahl und die Konzentration des Puffers sind in der Technik bekannt.

Die erfindungsgemäßen Insulinanaloga komplexieren mit Zink­ ionen und einem Phenolderivat unter Bildung einer stabilen Hexa­ merkonformation. Sowohl das Zink wie auch das Phenolderivat sind entscheidend bei der Erlangung eines Komplexes, der stabil ist und zur schnellen Dissoziation und zum schnellen Einsetzen der Wirkung fähig ist. Der Hexamerkomplex besteht aus zwei Zinkionen pro Hexa­ mer Humaninsulinanalogon und mindestens drei Molekülen eines Phe­ nolderivats, das aus der aus m-Kresol, Phenol oder einem Gemisch aus m-Kresol und Phenol bestehenden Gruppe ausgewählt wird.

Das lösliche Monomeranalogon wird in den Hexamerkomplex durch Lösen des Monomeranalogons in einem Verdünnungsmittel, das das Phenolderivat enthält, bei einem pH von etwa 7,5 und einer Zinkzugabe umgewandelt. Zink wird vorzugsweise als Salz zugegeben. Repräsentative Beispiele von Zinksalzen beinhalten Zinkacetat, Zinkbromid, Zinkchlorid, Zinkfluorid, Zinkiodid und Zinksulfat. Der Fachmann erkennt, daß viele andere Zinksalze existieren, die ebenfalls im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden könnten. Vorzugsweise werden Zinkacetat oder Zinkchlorid verwendet, da diese Salze keine neuen chemischen Ionen in kommerziell annehmbare Prozesse zugeben.

Das Lösen des Analogons kann damit erleichtert werden, was gewöhnlich als Säurelösung bekannt ist, das heißt der pH wird auf etwa 3,0 bis 3,5 mit einer physiologisch tolerierten Säure ernied­ rigt, vorzugsweise HCl, um das Lösen des Monomeranalogons zu er­ leichtern. Andere physiologisch tolerierte Säuren sind unter an­ derem Essigsäure, Citronensäure und Phosphorsäure. Der pH wird dann mit einer physiologisch tolerierten Base, vorzugsweise Natri­ umhydroxid, auf etwa 7,4 bis 7,5 eingestellt. Andere physiologisch tolerierte Basen sind Kaliumhydroxid und Ammoniumhydroxid.

Der Hexamerkomplex kann zu stabilen schnell wirkenden parenteralen Formulierungen formuliert werden. Die Konzentration des Insulinanalogons beträgt in der Formulierung etwa 0,5 mg/ml bis etwa 20 mg/ml, vorzugsweise etwa 1,2 mg/ml bis etwa 17,5 mg/ml, vor allem etwa 3,5 mg/ml. Im allgemeinen beträgt die Zink­ konzentration beträgt in der Formulierung etwa 14 µg/ml bis etwa 35 µg/ml, wobei zwei Zinkionen an jedes Hexamer gebunden sind. Wenn er formuliert wird, bindet der Hexamerkomplex bis zu sieben phenolische Moleküle. Im allgemeinen sind bei einer Formulierung sechs phenolische Moleküle an das Hexamer gebunden. Demnach wird vorzugsweise ein Überschuß der phenolischen Substanz zur Formulie­ rung gegeben. Die phenolische Substanz wirkt auch als Konservie­ rungsstoff. Daher beträgt die bevorzugte Konzentration etwa 23 mM bis 35 mM, vor allem 29 mM. Die phenolische Substanz ist vorzugs­ weise m-Kresol.

Es kann ein isotonisches Mittel, vorzugsweise Glycerin, zur Formulierung gegeben werden. Die Konzentration des isotonischen Mittels liegt im Bereich, der in der Technik für Insulinformulie­ rungen bekannt ist, vorzugsweise 16 mg/ml. Der pH der Formulierung kann mit einem physiologisch tolerierten Puffer, vorzugsweise ei­ nem Phosphatpuffer, wie Natriumphosphat, gepuffert werden.

Zur Zeit der Erfindung legte die veröffentlichte Literatur nahe, daß der Fachmann die Aggregation vermeiden muß, um eine schnelle Absorption zu erzielen. Daher ist es ziemlich überra­ schend, daß das formulierte Hexameranalogon ein schnelles Einset­ zen der Wirkung bringt. Im Gegensatz zu Insulin beeinflußt die Bindung eines Insulinanalogonhexamerkomplexes die Zeit nicht nach­ teilig, die zum Erreichen der maximalen Serumkonzentration des In­ sulinanalogons erforderlich ist. Die Fig. 1 zeigt die mittlere Reaktionsgeschwindigkeit auf die Glucoseinfusion bei Patienten mit einer Formulierung, die monomeres Lys^B28Pro^B29-hI enthält (ohne Zink formuliert), mit einem formulierten Lys^B28Pro^B29-hI Hexamer und mit normalem Humaninsulin. Der formulierte Hexamerkomplex be­ hält die schnelle Wirkung von monomerem Lys^B28Pro^B29-hI. Die Ab­ sorptionsrate ist signifikant schneller als bei normalem Humanin­ sulin. Daher zeigen die Ergebnisse in Fig. 1: Erstens haben hexa­ meres Lys^B28Pro^B29-hI und monomeres Lys^B28Pro^B29-hI ähnliche Absorptionsraten, zweitens haben sowohl hexameres als auch mono­ meres Lys^B28Pro^B29-hI schnellere Absorptionsraten als Insulin.

Die den Insulinanalogonkomplex als Hexamer enthaltende For­ mulierung ist stabil. In vergleichenden Untersuchungen zeigt das monomere Lys^B28Pro^B29-hI die schnellste Abbaurate mit einer 1,63%igen Zunahme der Polymerbildung während der sechswöchigen Untersuchung. Nicht-formuliertes Humaninsulin weist eine lang­ samere Polymerbildungsrate von 0,61% pro Woche auf. Bei einer Formulierung wird jedoch die Bildungsrate von Polymeren mit hohem Molekulargewicht auf 0,095% pro Woche für Insulin reduziert. Formuliertes Lys^B28Pro^B29-hI zeigt als Hexamerkomplex eine verrin­ gerte Bildungsrate der Polymere mit höherem Molekulargewicht von 0,11% pro Woche, was mit der Rate vergleichbar ist, die bei for­ muliertem Insulin beobachtet wird. Diese Untersuchungen sind in Beispiel 1 beispielhaft dargestellt und in Fig. 2 gezeigt.

Das erfindungsgemäße Insulinanalogon kann durch jede einer Vielzahl an bekannten Peptidsynthesetechniken hergestellt werden, einschließlich klassischer Verfahren (Verfahren in Lösung), Festphasenverfahren, halbsynthetischer Verfahren und kürzlich auch rekombinanter DNA Verfahren. Beispielsweise beschreiben Chance et al., EP-A 383 472 und Brange et al., EP-A 214 826 die Herstellung von verschiedenen Monomeranaloga.

Die folgenden Beispiele und Präparationen werden lediglich zur weiteren Erläuterung der Herstellung der erfindungsgemäßen Insulinanaloga bereitgestellt. Der Schutzumfang der Erfindung be­ steht nicht nur aus den folgenden Beispielen.

Präparation 1 Proteinstammlösungspräparation

Nicht-formulierte Proben von Insulin und Lys^B28Pro^B29-hI werden mit 3,5 mg/ml in 7 mM Natriumphosphat und mit oder ohne 1,25 mg/ml m-Kresol, 1,09 mg/ml Phenol und 16 mg/ml Glycerin in Abhängigkeit vom durchgeführten Experiment präpariert. Proben von Lys^B28Pro^B29-hI als Hexamerkomplex werden auf identische Weise hergestellt, außer daß 19,7 µg/ml Zink zugegeben werden. Alle Pro­ ben werden durch einen Säureschritt auf pH 3,0 entnommen, wobei Zink zu den Formulierungschargen gegeben wird. Der pH wird dann auf 7,4 eingestellt. Die Proteinkonzentrationen werden vor der Zugabe der phenolischen Substanzen durch UV Absorptionsspektrosko­ pie mit einem AVIV Modell 14 DS Zweistrahlspektrophotometer be­ stimmt. Die Proteinkonzentrationen werden berechnet, wie es in B.H. Frank, A.H. Pekar und A.J. Veros (1972) Diabetes, 21 (Suppl. 2), 486-491 beschrieben wurde.

Beispiel 1 Chemische Stabilität

Der Abbau wird durch die Inkubation der formulierten und nicht-formulierten Präparationen des Insulins und des monomeren und hexameren Lys^B28Pro^B29-hI bei 30°C initiiert. Das formulierte Insulin und das Hexamer Lys^B28Pro^B29-hI enthalten: 3,5 mg/ml Pro­ tein, 16 mg/ml Glycerin, 7 mM dibasisches Natriumphosphatheptahy­ drat, 1,25 mg/ml m-Kresol, 1,09 mg/ml Phenol und 0,0245 mg/ml Zinkoxid bei einem pH von 7,3 bis 7,4. Das nicht-formulierte Insu­ lin und das monomere Lys^B28Pro^B29-hI enthalten: 3,5 mg/ml Protein, 16 mg/ml Glycerin, 7 mM dibasisches Natriumphosphatheptahydrat, 1,25 mg/ml m-Kresol und 1,09 mg/ml Phenol bei einem pH von 7,3 bis 7,4. In Intervallen von sieben Tagen werden Proben aus der 30°C Inkubation entnommen und auf die Bildung von Spezies mit hohem Mo­ lekulargewicht mittels Größenausschluß-HPLC untersucht. Die Ana­ lyse wird durch eine Injektion von 20 µl Proben in eine Dupont Zorbax GF-250 Special (9,4 × 250 nun) Säule mittels eines Gemisches aus 0,4 M Ammoniumbicarbonat und Acetonitril als Elutionslösung durchgeführt (Flußrate 0,5 ml/min bei Raumtemperatur und Detektion bei 214 nm). Die Polymerbildung in Prozent wird aus dem Verhältnis der hochmolekularen Peaks zur Gesamtfläche der Monomerpeaks und hochmolekularen Peaks bestimmt. Die Ergebnisse sind in Fig. 2 gezeigt.

Beispiel 2 Statische Lichtstreuung

Die in vitro Dissoziationseigenschaften von monomerem Lys^B28Pro^B29-hI, Lys^B28Pro^B29-hI als Hexamerkomplex und Insulin wurden mittels statischer Lichtstreuung untersucht.

Drei formulierte und nicht-formulierte Proteinstammlösungen werden wie beschrieben hergestellt, außer daß die nicht-formulier­ ten Proteinstammlösungen kein Zink, Glycerin oder Konservierungs­ stoffe enthalten. Unter Verwendung dieser 3,5 mg/ml Stammlösungen wird eine Verdünnungsreihe sowohl für Insulin als auch für Lys^B28Pro^B29-hI hergestellt, die den Proteinkonzentrationsbereich von 3,5 mg/ml bis 0,2 mg/ml abdeckt. Alle Verdünnungen werden auf ein Endvolumen von 10 ml mit 7 mM Natriumphosphatpuffer pH 7,4 hergestellt, um die subkutane Stelle nach der Injektion zu imitie­ ren. Alle Lösungen werden durch 0,2 µm Gelman Filter mit niedriger Proteinbindung filtriert, bevor man die SLS Messungen durchführt. Die Proteinkonzentration wird für diese Proben mittels Umkehrpha­ sen-HPLC bestimmt.

Zur Analyse der formulierten Proben werden proteinfreie Lö­ semittelnullwerte für jeden Satz an Proteinproben hergestellt. Die Nullwerte enthalten die Hilfsstoffe in der selben Konzentration, wie die entsprechenden Proteinprobensätze. Zur Analyse der nicht­ formulierten Proben wird ein einzelner Nullwert mit 7 mM Natrium­ phosphat verwendet. Die Verwendung dieser geeigneten Lösemittel­ nullwerte stellt sicher, daß die Daten nur die Streuung des gelö­ sten Stoffs widerspiegeln und nicht einen zusätzliche Beitrag auf­ grund von Lösemittelveränderungen.

Die statischen Lichtstreuungsexperimente (SLS) werden mit­ tels eines Brookhaven Instruments 2030AT Autokorrelators und Go­ niometers durchgeführt. Alle Messungen werden mit einem 1 mm Loch bei 90° Streuungswinkel mittels eines Lexel Model 3500 Argonionen­ lasers durchgeführt, der auf 488 nm eingestellt ist. Die Tempera­ tur wird durch ein Neslab RTE-110 Temperaturbad auf 25°C gehalten. Das Signal an der Photomultiplierröhre wird mittels 0,1 µM gefil­ tertem Toluol kalibriert.

Mittlere Molekulargewichte werden unter Verwendung der in C.R. Cantor und P.R. Schimmel, Biophysical Chemistry, W.H. Freeman and Company, New York, Seiten 838-843 (1982) berechnet. Die Fig. 3 zeigt die Ergebnisse der Lichtstreungsuntersuchung. Im in vitro Dissoziationsprofil ist Lys^B28Pro^B29-hI als Hexamerkomplex und Insulin ziemlich unterschiedlich. Die Insulinanalogonergeb­ nisse zeigen eine schnelle Dissoziation, die eine schnellere Ab­ sorption erlaubt, als Humaninsulin. Obwohl beide Präparationen he­ xamere Assoziierungszustände enthalten und die Formulierungen gleichermaßen gegen chemischen Abbau stabil sind zeigt das hexa­ mere Lys^B28Pro^B29-hI eine größere Neigung zur Dissoziation als In­ sulin.

Claims (7)

1. Humaninsulinanalogonkomplex, der umfaßt: Sechs Moleküle eines Humaninsulinanalogons, zwei Zinkionen und mindestens drei Mole­ küle eines Phenolderivats, das aus der aus m-Kresol, Phenol oder einem Gemisch aus m-Kresol und Phenol bestehenden Gruppe ausgewählt ist, so daß der Analogonkomplex ein Hexamer ist.

2. Parenterale pharmazeutische Formulierung, die den Humaninsu­ linanalogonkomplex nach Anspruch 1 umfaßt.

3. Parenterale pharmazeutische Formulierung nach Anspruch 2, die ferner ein isotonisches Mittel und einen physiologisch tole­ rierten Puffer umfaßt.

4. Parenterale pharmazeutische Formulierung nach Anspruch 3, worin das Humaninsulinanalogon Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin ist.

5. Parenterale pharmazeutische Formulierung nach Anspruch 4, die umfaßt: Etwa 3,5 mg/ml Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin, etwa 19,7 µg/ml Zink, etwa 7 mM Natriumphosphat, etwa 16 mg/ml Glycerin und etwa 29 mM m-Kresol.

6. Humaninsulinanalogonkomplex nach Anspruch 1, worin das Humanin­ sulinanalogon Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin ist.

7. Humaninsulinanalogonkomplex nach Anspruch 1, worin das Humanin­ sulinanalogon Asp^B28-Humaninsulin ist.