DE19549049A1

DE19549049A1 - Agglutinationstestplatte und Verfahren zu ihrer Herstellung

Info

Publication number: DE19549049A1
Application number: DE19549049A
Authority: DE
Inventors: Tsuneo Hiraide; Tetsuro Ogawa; Ayumi Mitoh; Tadahiko Kitano; Mikio Nakayama
Original assignee: Asahi Kogaku Kogyo Co Ltd
Current assignee: KITANO TADAHIKO HACHIOJI JP; NAKAYAMA, MIKIO, NARASHINO, CHIBA, JP; Pentax Corp
Priority date: 1994-12-28
Filing date: 1995-12-28
Publication date: 1996-07-04
Also published as: JPH08182657A; US5736099A

Description

Die Erfindung betrifft eine Testplatte zur Verwendung bei ei nem Agglutinationstest, der z. B. zur Diagnostizierung von Krankheiten eingesetzt werden kann und auf der bei einer An tigen-Antikörper-Reaktion ablaufenden Agglutinationsreaktion beruht.

Agglutinationsreaktionsverfahren werden eingesetzt, um die Menge bzw. die Konzentration bestimmter in einem Testfluid, z. B. einem Serum, einer Körperflüssigkeit etc. enthaltener Antikörper zu bestimmen. Bei diesem Verfahren werden als Testmedium agglutinierende Kompositteilchen z. B. Teilchen aus Gelatine, Kaolin, einem synthetischen Polymer oder ande ren Materialien, die mit einem vorbestimmten Antigen beladen sind, verwendet.

Zur Verwendung dieser agglutinierenden Kompositteilchen wird eine Testplatte mit Vertiefungen hergestellt, die zur Beur teilung der Agglutinationsreaktion dient. In die Vertiefungen wird eine Testflüssigkeit gefüllt, so daß man eine Verdün nungsreihe der Testflüssigkeit erhält. Die Beurteilung der Agglutinationsreaktion erfolgt anhand des Zustands des Agglu tinationsprodukts in den Vertiefungen. Tritt eine Agglutina tionsreaktion ein, d. h., ist die Reaktion positiv, so findet sich ein Agglutinationsbild, nämlich ein mattenartiges Agglu tinationsprodukt, das gleichmäßig an einer Seitenfläche der Vertiefungen anhaftet. Tritt keine Agglutination auf, d. h., ist die Reaktion negativ, so haftet das Reaktionsprodukt nicht an der Seitenwand der Vertiefungen an, sondern gleitet von der Seitenwand zum Boden der Vertiefungen und bildet dort ein rundes, knopfartiges Aggregat.

Agglutinationstestplatten nach dem Stand der Technik zeigen eine Reihe von Nachteilen, z. B. die Bildung eines unklaren Agglutinationsbildes, das sich nicht eindeutig als "positive" oder "negative" Reaktion beurteilen läßt. Ferner können bei Anwendung des Agglutinationsreaktionsverfahrens Probleme auf treten, wenn z. B. die Vertiefungen in der Testplatte nicht geeignet geformt sind. Ein weiterer Nachteil liegt in der ge ringeren Empfindlichkeit im Vergleich zu anderen Nachweisver fahren.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Agglutina tionstestplatte und ein Verfahren zu deren Herstellung anzugeben, die es erlaubt, das bei einem Agglutinationstest entstehende Bild eindeutig entweder als Agglutinations- oder als Nicht-Agglutinationsbild zu identifizieren, und die eine hohe Nachweisempfindlichkeit hat.

Die Erfindung löst diese Aufgabe durch die in Anspruch 1 oder 2 angegebenen Merkmale. Vorteilhafte Weiterbildungen sind in Anspruch 3 und 4 angegeben.

Gemäß einem Aspekt der Erfindung wird eine Testplatte für ei nen Agglutinationstest mit einer Vielzahl von in der Platte ausgebildeten Vertiefungen bereitgestellt, die jeweils an ei ner Oberfläche der Vertiefung anhaftendes Protein A und/oder Protein G haben.

Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung einer Testplatte für einen Agglutinationstest angegeben. Das Verfahren enthält die folgenden Schritte:
Bereitstellen einer Testplatte mit einer Vielzahl von darin ausgebildeten Vertiefungen,
Einbringen einer geringen Menge einer Proteinlösung, die Pro tein A und/oder Protein G enthält, in jede der Vertiefungen der Platte,
Entfernen der eingebrachten Proteinlösung aus den Vertiefun gen, und
Trocknen der Platte, so daß man eine Testplatte mit Vertie fungen erhält, die jeweils an einer Oberfläche der Vertiefung anhaftendes Protein A und/oder Protein G haben.

Die Erfindung wird im folgenden unter Bezugnahme auf die bei gefügten Zeichnungen ausführlich beschrieben. Es zeigen:

Fig. 1 eine schematische Ansicht einer Test platte, die bei der Erfindung verwen det wird,

Fig. 2A einen Querschnitt der Testplatte ge mäß Fig. 1 mit Vertiefungen mit ei nem gewölbten unteren Bereich, und

Fig. 2B einen Querschnitt der Testplatte ge mäß Fig. 1 mit Vertiefungen mit ei nem V-förmigen unteren Bereich.

Fig. 1 zeigt eine Testplatte 11 für einen Agglutinations test, die dadurch gekennzeichnet ist, daß in ihr eine Viel zahl von Vertiefungen 12; 13, im dargestellten Fall 96 Ver tiefungen (8×12) ausgebildet sind. In der in die Vertiefun gen eingebrachten Lösung kann entweder nur Protein A oder nur Protein G oder eine Kombination beider Proteine enthalten sein. Protein A und/oder Protein G lassen sich ohne Schwie rigkeiten auf eine Innenfläche der Vertiefungen der Agglu tinationstestplatte 11 aufbringen, und schon eine geringe Menge an der Oberfläche anhaftendes Protein A und/oder Pro tein G reicht aus, um ein Agglutinationsbild hervorzurufen, das eine eindeutige Beurteilung der Agglutinationsreaktion als positive oder negative Reaktion erlaubt.

Ferner ist das Verfahren zur Herstellung der Agglutinations testplatte dadurch gekennzeichnet, daß eine geringe Menge ei ner Protein A und/oder Protein G enthaltenden Lösung in jede der Vertiefungen 12; 13 der Testplatte eingeträufelt wird und man die Testplatte nach Entfernen der Proteinlösung aus den Vertiefungen trocknen läßt.

Bei der praktischen Anwendung bestehen keine Beschränkungen hinsichtlich der Art der Platte, die als Testplatte gewählt wird. Diese kann eine beliebige Form haben und aus einem be liebigen geeigneten Material hergestellt sein. Die Fig. 2A und 2B zeigen Schnittansichten der Testplatte 11 mit U-förmi gen Vertiefungen 12 bzw. V-förmigen Vertiefungen 13, wobei der Schnitt entlang der Linie II-II in Fig. 1 verläuft. Die Platte kann aus einem beliebigen Kunststoffmaterial wie z. B. Polystyrol, Polypropylen, Polyvinylchlorid und dergleichen oder gegebenenfalls aus Metall oder Keramik hergestellt sein. Ferner sind die Zahl und die Anordnung der in der Testplatte 11 ausgebildeten Vertiefungen nicht auf das in Fig. 1 darge stellte Ausführungsbeispiel begrenzt. Zahl und Anordnung der Vertiefungen sind vielmehr beliebig und können abhängig vom jeweils durchzuführenden Test in geeigneter Weise gewählt werden.

Selbst wenn nach dem Einbringen einer geringen Menge der Pro tein A und/oder Protein G enthaltenden Lösung in die Vertie fungen und dem anschließenden Entfernen der Lösung nur Spuren des eingebrachten Protein A und/oder Protein G an der Ober fläche der Vertiefungen zurückbleiben, so reicht dies aus, um eine Agglutinationsreaktion mit hinreichender Sicherheit als positive oder negative Reaktion identifizieren zu können.

Im allgemeinen ist als Menge der in jede Vertiefung einzu bringenden Proteinlösung diejenige Menge ausreichend, die ei nen V-förmigen unteren Bereich 13 oder einen gewölbten unte ren Bereich 12 der Vertiefung in der Testplatte füllt. Fassen die Vertiefungen z. B. 0,3 ml, so ist als Menge der in die Vertiefungen einzubringenden Protein A und/oder Protein G enthaltenden Lösung eine Menge von etwa 0,05 ml ausreichend.

Die bei der Erfindung verwendete Protein A und/oder Protein G enthaltende Lösung enthält Protein A und/oder Protein G, das in einem Lösungsmittel wie z. B. Wasser, physiologischer ge pufferter Salzlösung (phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) oder dergleichen), physiologischer Kochsalzlösung usw. gelöst ist. Die Konzentration des in der Lösung enthaltenen Protein A und/oder Protein G unterliegt keiner Beschränkung und kann abhängig von einer Vielzahl verschiedener Faktoren sehr unterschiedlich sein. Vorzugsweise liegt die Proteinkon zentration jedoch bei 1,0×10^-6 mg/ml oder darüber, wobei ein besonders bevorzugter Bereich bei 1,0×10^-3 mg/ml bis 1,0×10^-1 mg/ml liegt. Zu beachten ist, daß die oben angege bene Konzentration sich auf die Gesamtmenge an enthaltenem Protein A und Protein G bezieht, falls beide Proteine in der selben Lösung enthalten sind.

Zur Herstellung der Agglutinationstestplatte wird vorzugs weise eine Protein A und/oder Protein G enthaltende Lösung in die Vertiefungen der Testplatte eingeträufelt. Man beläßt die Proteinlösung eine vorbestimmte Zeit lang in den Vertiefun gen, vorzugsweise während einiger Minuten oder länger, bevor man sie entfernt. Die Zeitspanne, während der die Proteinlö sung in den Vertiefungen belassen wird, kann unterschiedlich lang sein und hängt von der Konzentration von Protein A und/oder Protein G in der Proteinlösung ab, d. h. von einer Protein A-Konzentration, einer Protein G-Konzentration oder einer Gesamtkonzentration der gleichzeitig in derselben Lö sung enthaltenen Proteine A und G. Diese Zeitspanne kann sich bis auf Null verkürzen, wenn Protein A und/oder Protein G in einer höheren Konzentration (1,0×10^-3 mg/ml oder mehr) in der Proteinlösung enthalten sind.

Ferner wird vorzugsweise nach dem Einträufeln der Protein A und/oder Protein G enthaltenden Lösung in jede Vertiefung der Platte die Lösung aus den Vertiefungen abgeschüttet und an schließend die Platte mit Wasser, physiologischer Salzlösung, physiologischer Kochsalzlösung oder dergleichen gespült, um überschüssiges ungebundenes Protein A und/oder Protein G (d. h. Protein, das nicht an den Vertiefungen anhaftet) aus den Vertiefungen zu entfernen. Die gespülte Platte wird dann getrocknet, um so eine Testplatte für den Agglutinationstest herzustellen.

Das Trocknen der Platte geschieht entweder durch natürliche Lufttrocknung oder auch unter Hitzeeinwirkung, um die Verdun stung der Flüssigkeit von der Plattenoberfläche zu beschleu nigen.

Bei der so hergestellten Agglutinationstestplatte haftet Pro tein A und/oder Protein G gleichmäßig an einer Oberfläche je der Vertiefung der Platte. Das anhaftende Protein ist über einen längeren Zeitraum hinweg bei Zimmertemperatur lagerfä hig. Beispielsweise kann die Testplatte mit dem daran anhaf tenden Protein bei Lagerung bei einer Temperatur zwischen 4 und 25°C noch nach bis zu sieben Tagen oder mehr für einen Agglutinationstest verwendet werden, ohne daß irgendeine Be einträchtigung der Funktionssicherheit auftritt.

Protein A und Protein G binden sich spezifisch z. B. an die Fc-Fragmente des menschlichen Immunglobulin G (IgG). Wird ei ne Testflüssigkeit, die einen derartigen Antikörper enthält, in die Vertiefungen der Testplatte eingebracht, so kommt es zu einer spezifischen Bindung zwischen den Fc-Fragmenten der Antikörper in der Testflüssigkeit und dem gleichmäßig an ei ner Oberfläche der Vertiefungen anhaftenden Protein A und/oder Protein G. Der Antikörper in der spezifischen Bin dung erzeugt bei der Reaktion mit einem Antigen, das an schließend in die Vertiefungen eingeträufelt wird, um eine Agglutination hervorzurufen, ein mattenartiges Agglutina tionsbild, das sich über die Wandfläche der Vertiefungen er streckt.

Das in der oben erwähnten Antigen-Antikörper-Reaktion verwen dete Antigen kann in einer beliebigen herkömmlichen Form ver wendet werden, jedoch liegt es zur leichteren Durchführung der Reaktion und zur besseren Reproduzierbarkeit derselben vorzugsweise in Form von mit dem Antigen besetzten aggluti nierenden Kompositteilchen vor. Als Träger der agglutinieren den Kompositteilchen eignen sich z. B. Kompositteilchen aus Keramik/Polymer, oder Teilchen aus Latex, Gelatine, Kaolin, synthetischen Polymeren und anderen Materialien. Beispiels weise lassen sich agglutinierende Kompositteilchen wie die Keramik/Polymerkompositteilchen mit dem daran gekoppelten An tigen herstellen, indem man eine Oberfläche der Polymerteil chen mit einer Calciumphosphatverbindung beschichtet, um so ein keramisch beschichtetes Polymer-Kompositteilchen herzu stellen, wobei die Polymerteilchen oder das gesamte Komposit teilchen gefärbt sein können. Ein Antigen wird an das Poly mer-Kompositteilchen adsorbiert und fixiert, und die Stellen des Polymer-Kompositteilchens, an denen kein Antigen adsor biert wurde, werden mit einem Abdeckmittel behandelt, wie es z. B. in der japanischen Patentanmeldung 5-249506 beschrieben ist. Vorzugsweise wird hierbei ein Polymer-Kompositteilchen verwendet, das hergestellt wird, indem man die Calciumphos phatverbindungsteilchen mit den Polymerteilchen kollidieren läßt und so an einer Oberfläche der Polymerteilchen eine Be schichtung aus der Calciumphosphatverbindung bildet.

Die Erfindung ermöglicht es, bei der Diagnostizierung von Krankheiten mit Hilfe der auf der Antigen-Antikörper-Reaktion beruhenden Agglutinationsreaktion eindeutig festzustellen, ob sich aufgrund der Agglutinationsreaktion ein Agglutinations bild gebildet hat oder nicht. Darüber hinaus läßt sich die Agglutinationstestplatte leicht herstellen und hat eine hohe Empfindlichkeit. Da sie ferner sehr gut lagerfähig ist, be hält die Agglutinationstestplatte selbst bei einer Lagerung bei Zimmertemperatur ihre wesentlich verbesserten Eigen schaften über einen längeren Zeitraum hinweg bei.

Die Erfindung wird im folgenden unter Bezugnahme auf einige Arbeitsbeispiele beschrieben.

Beispiel 1 (Bezugsbeispiel) Herstellung antigenbesetzter agglutinierender Kompositteil chen A. Herstellung von Polymer-Kompositteilchen

50 g Nylonperlen mit einem durchschnittlichen Teilchendurch messer von 5 µm und einer Dichte von 1,03 g/cm³, die mit ei nem Anthrachinon-Dispersionsfarbstoff (MITSUI ML Colors ML rot VF-2; vertrieben von Mitsui Toatsu Senryou) gefärbt wa ren, und 7,5 g Hydroxylapatit-Teilchen mit einem Ca/P-Ver hältnis von 1,67, einem durchschnittlichen Teilchendurchmes ser von 5 µm, einer spezifischen Oberfläche von 45 m²/g, ei ner Schüttdichte von 1,8 g/cm³ und einer Porengröße von 600 Å wurden in eine Hybridisierungsvorrichtung (Nara Hybridization System NHS-1 mit einer Nennleistung von 5,5 kW und einem Nennstrom von 23 A, vertrieben von Nara Kikai Seisakusho) ge geben. Die Hybridisierungsvorrichtung wurde bei 8000 Umdre hungen pro Minute (U/min) bei einer Temperatur zwischen 32 und 50°C 5 min lang betrieben. Auf diese Weise erhielt man Nylonperlen, die an einer Oberfläche mit Hydroxylapatit be schichtet waren. Die so erhaltenen Kompositteilchen hatten einen durchschnittlichen Teilchendurchmesser von 5,8 µm, eine Dichte von 1,13 g/cm³ und eine Porengröße von 600 Å.

B. Herstellung der antigenbesetzten agglutinierenden Kompo sitteilchen

10 ml einer Viren enthaltenden Flüssigkeit mit 2000 Titer In fluenzavirus Typ A wurden zu 0,1 g Kompositteilchen, die im oben angegebenen Verfahrensschritt hergestellt worden waren, gegeben. Nach gründlichem Umrühren wurde die Mischung zentri fugiert, um überschüssige Influenzaviren zu entfernen. An schließend gab man der Mischung 10 ml 0,1%-ige Glutaraldehyd lösung zu, um die an die Kompositteilchen adsorbierten Viren zu fixieren. Nach der Fixierung der Viren wurden der Mischung 5 ml eines Kasein enthaltenden Abdeckmittels, das unter der Handelsbezeichnung "Block Ace" von Snow Brands Milk Products Co., Ltd. vertrieben wird, zugefügt. Nach gründlichem Umrüh ren wurde die Mischung zentrifugiert, um überschüssiges "Block Ace" zu entfernen. Anschließend wurden 20 ml physiolo gische gepufferte Salzlösung (PBS) zugefügt. Auf diese Weise wurden Kompositpartikel mit daran gekoppelten Influenzaviren hergestellt.

Beispiel 2 (Bezugsbeispiel) Herstellung antigenbesetzter agglutinierender Kompositteil chen A. Herstellung von Polymerkompositteilchen

50 g Nylonperlen mit einem durchschnittlichen Teilchendurch messer von 5 µm und einer Dichte von 1,03 g/cm³, die mit ei nem Anthrachinon-Dispersionsfarbstoff (MITSUI ML Colors ML blau VF; vertrieben von Mitsui Toatsu Senryou) gefärbt waren, und 7,5 g Hydroxylapatit-Teilchen mit einem Ca/P-Verhältnis von 1,67, einem durchschnittlichen Teilchendurchmesser von 5 µm, einer spezifischen Oberfläche von 45 m²/g, einer Schütt dichte von 1,8 g/cm³ und einer Porengröße von 600 Å wurden in eine Hybridisierungsvorrichtung (Nara Hybridization System NHS-1 mit einer Nennleistung von 5,5 kW und einem Nennstrom von 23 A, vertrieben von Nara Kikai Seisakusho) gegeben. Die Hybridisierungsvorrichtung wurde bei 8000 Umdrehungen pro Mi nute (U/min) bei einer Temperatur zwischen 32 und 50°C 5 min lang betrieben. Auf diese Weise erhielt man Nylonperlen, die an einer Oberfläche mit Hydroxylapatit beschichtet waren. Die so erhaltenen Kompositteilchen hatten einen durchschnittli chen Teilchendurchmesser von 5,8 µm, eine Dichte von 1,13 g/cm³ und eine Porengröße von 600 Å.

B. Herstellung antigenbesetzter agglutinierender Komposit teilchen

10 ml einer Viren enthaltenden Flüssigkeit mit 4000 Titer ja panische B-Encephalitis-(JBE-)Virus wurden zu 0,1 g Komposit teilchen, die im oben angegebenen Verfahrensschritt herge stellt worden waren, gegeben. Nach gründlichem Umrühren wurde die Mischung zentrifugiert, um überschüssige Viren zu entfer nen. Anschließend gab man der Mischung 10 ml 0,1%-ige Glut araldehydlösung zu, um die an die Kompositteilchen adsorbier ten Viren zu fixieren. Nach der Fixierung der Viren wurden der Mischung 5 ml eines Kasein enthaltenden Abdeckmittels, das unter der Handelsbezeichnung "Block Ace" von Snow Brands Milk Products Co., Ltd. vertrieben wird, zugefügt. Nach gründlichem Umrühren wurde die Mischung zentrifugiert, um überschüssiges "Block Ace" zu entfernen. Anschließend wurden 20 ml physiologische gepufferte Salzlösung (PBS) zugefügt. Auf diese Weise wurden Kompositpartikel mit daran gekoppelten JBE-Viren hergestellt.

Beispiel 3 A. Herstellung der Agglutinationstestplatte

Es wurde eine Polystyrolplatte mit 96 U-förmigen Vertiefun gen, die jeweils ein Fassungsvermögen von 0,3 ml hatten, be reitgestellt. In jede Vertiefung der Polystyrolplatte gab man 0,05 ml einer PBS-Lösung, die Protein A in einer Konzentra tion von 1,0×10^-6 mg/ml enthielt. Nach 20 h wurde die PBS- Lösung aus den Vertiefungen der Platte abgeschüttet. Dann gab man 0,05 ml einer frischen PBS-Lösung in jede Vertiefung und schüttete die Lösung wieder ab, um überschüssiges nicht ge bundenes Protein A von den Wandflächen der Vertiefungen zu entfernen. Man ließ die Platte trocknen und erhielt so eine Testplatte mit daran anhaftendem Protein A.

Die oben geschilderte Vorgehensweise wurde wiederholt, wobei man PBS-Lösungen mit anderen Protein-A-Konzentrationen ver wendete. Die weiterhin verwendeten Protein-A-Konzentrationen waren: 1,0×10^-5 mg/ml, 1,0×10^-4 mg/ml, 1,0×10^-3 mg/ml, 1,0×10^-2 mg/ml, 1,0×10^-1 mg/ml und 1,0 mg/ml. Es wurden somit insgesamt sieben Arten von Testplatten mit daran anhaftendem Protein A hergestellt.

B. Agglutinationstest

In die Vertiefungen jeder der mit Protein A beladenen Test platten, die im oben beschriebenen Verfahrensschritt herge stellt worden waren, wurde ein Kaninchen-Antiserum gegen den im Schritt B des Beispiels 1 verwendeten Influenzavirus, Ka ninchen-Antiseren gegen andere Viren und ein Serum eines nicht virusinfizierten Kaninchens gegeben, so daß jede Ver tiefung 0,05 ml des Antiserums bzw. der Serumlösung nach Ver dünnung mit PBS enthielt. Die Verdünnung mit PBS wurde wie derholt, so daß nach jedem Verdünnungsschritt die doppelte Menge Antiserum bzw. Serumlösung vorhanden war. Nach 30 min gab man 0,05 ml der PBS-Lösung der agglutinierenden Komposit teilchen mit dem daran gekoppelten Influenzavirus-Antigen, die in Schritt B von Beispiel 1 hergestellt worden waren, in jede Vertiefung. In keiner der mit Protein A beladenen Test platten, die die Kaninchen-Antiseren gegen andere Viren oder das Serum des nicht virusinfizierten Kaninchens enthielten, wurde in den Vertiefungen ein Agglutinationsbild beobachtet. Dagegen beobachtete man in der mit Protein A beladenen Test platte, die das Kaninchen-Antiserum gegen Influenzavirus in den Vertiefungen enthielt, ein eindeutiges Agglutinationsbild in den Vertiefungen, bis das Kaninchen-Antiserum so weit mit PBS verdünnt wurde, daß eine 32000-fache Verdünnung erreicht war. Man stellte jedoch kein Agglutinationsbild fest, als das Kaninchen-Antiserum auf eine 64000-fache Verdünnung oder ei nen noch höheren Verdünnungsgrad verdünnt wurde.

Beispiel 4 A. Herstellung der Agglutinationstestplatte

Es wurden eine Polypropylenplatte mit 96 U-förmigen Vertie fungen, jeweils mit einem Fassungsvermögen von 0,3 ml, eine Polystyrolplatte mit 96 V-förmigen Vertiefungen, jeweils mit einem Fassungsvermögen von 0,3 ml, und eine Polyvinylchlorid platte mit 96 U-förmigen Vertiefungen, jeweils mit einem Fas sungsvermögen von 0,2 ml, bereitgestellt. In die Vertiefungen jeder dieser Platten gab man jeweils 0,05 ml einer PBS-Lö sung, die Protein A in einer Konzentration von 1,0×10^-3 mg/ml enthielt. Nach 60 min wurde die PBS-Lösung aus den Ver tiefungen der Platte abgeschüttet. Dann gab man jeweils 0,05 ml einer frischen PBS-Lösung in die Vertiefungen und schüt tete die Lösung wieder ab, um das überschüssige ungebundene Protein A von der Wandoberfläche der Vertiefungen zu entfer nen. Man ließ die Platte trocknen, um eine mit Protein A be ladene Testplatte herzustellen.

B. Agglutinationstest

Unter Verwendung der im oben beschriebenen Verfahrensschritt hergestellten mit Protein A beladenen Testplatten wurde der Agglutinationstest ähnlich wie bei Schritt B in Beispiel 3 beschrieben durchgeführt. Man erzielte befriedigende Ergeb nisse, die im wesentlichen denen entsprachen, die in Beispiel 3 erhalten worden waren.

Beispiel 5 A. Herstellung der Agglutinationstestplatte

Es wurde eine Polystyrolplatte mit 96 V-förmigen Vertiefun gen, jeweils mit einem Fassungsvermögen von 0,3 ml, bereitge stellt. In die Vertiefungen der Polystyrolplatte gab man je weils 0,05 ml einer PBS-Lösung, die Protein A in einer Kon zentration von 1,0×10^-3 mg/ml enthielt. Nach 1 min wurde die PBS-Lösung aus den Vertiefungen der Platte abgeschüttet. Dann gab man jeweils 0,05 ml einer frischen PBS-Lösung in die Vertiefungen und schüttete die Lösung wieder ab, um das über schüssige ungebundene Protein A von der Wandoberfläche der Vertiefungen zu entfernen. Man ließ die Platte trocknen, um eine mit Protein A beladene Testplatte herzustellen.

Die oben beschriebenen Schritte wurden wiederholt, wobei man anstelle einer Einwirkzeit von 1 min Einwirkzeiten von 10 min, 30 min, 1 h, 3 h bzw. 20 h wählte. Auf diese Weise wur den sechs verschiedene mit Protein A beladene Testplatten hergestellt.

B. Agglutinationstest

In die Vertiefungen jeder der im oben beschriebenen Verfah rensschritt hergestellten mit Protein A beladenen Testplatten gab man ein Kaninchen-Antiserum gegen den Virus der japani schen B-Encephalitis, der in Schritt B in Beispiel 2 verwen det wurde, Kaninchen-Antiseren gegen andere Viren und ein Se rum eines nicht virusinfizierten Kaninchens, so daß jede Ver tiefung 0,05 ml des Antiserums bzw. der Serumlösung nach Ver dünnung mit PBS enthielt. Die Verdünnung mit PBS wurde wie derholt, so daß nach jedem Verdünnungsschritt die doppelte Menge Antiserum bzw. Serumlösung vorhanden war. Nach 30 min gab man 0,05 ml der PBS-Lösung der agglutinierenden Komposit teilchen mit dem daran gekoppelten JBE-Virus-Antigen, die in Schritt B von Beispiel 2 hergestellt worden waren, in jede Vertiefung. In keiner der mit Protein A beladenen Testplat ten, die die Kaninchen-Antiseren gegen andere Viren oder das Serum des nicht virusinfizierten Kaninchens enthielten, wurde in den Vertiefungen ein Agglutinationsbild beobachtet. Dage gen beobachtete man in der mit Protein A beladenen Test platte, die das Kaninchen-Antiserum gegen den Virus der japa nischen B-Encephalitis in den Vertiefungen enthielt, ein ein deutiges Agglutinationsbild in den Vertiefungen, bis das Ka ninchen-Antiserum so weit mit PBS verdünnt wurde, daß eine 8000-fache Verdünnung erreicht war. Man stellte jedoch kein Agglutinationsbild fest, als das Kaninchen-Antiserum auf eine 16000-fache Verdünnung oder einen noch höheren Verdünnungs grad verdünnt wurde.

Beispiel 6 A. Herstellung der Agglutinationstestplatte

Es wurden zwei Polyvinylchloridplatten mit 96 U-förmigen Ver tiefungen, jeweils mit einem Fassungsvermögen von 0,2 ml, be reitgestellt. In die Vertiefungen dieser beiden Platten gab man jeweils 0,05 ml einer PBS-Lösung, die Protein A in einer Konzentration von 1,0×10^-3 mg/ml enthielt. Nach 10 min wurde die PBS-Lösung aus den Vertiefungen der Platte abge schüttet. Dann gab man jeweils 0,05 ml einer frischen PBS-Lö sung in die Vertiefungen und schüttete die Lösung wieder ab, um das überschüssige ungebundene Protein A von der Wandober fläche der Vertiefungen zu entfernen. Man ließ die Platte trocknen, um eine mit Protein A beladene Testplatte herzu stellen.

Eine der Testplatten wurde sieben Tage lang bei 4°C gelagert, die andere sieben Tage lang bei 25°C.

B. Agglutinationstest

Unter Verwendung der im oben beschriebenen Verfahrensschritt hergestellten mit Protein A beladenen Testplatten wurde der Agglutinationstest ähnlich wie bei Schritt B in Beispiel 5 beschrieben durchgeführt. Man erzielte sowohl bei der Test platte, die sieben Tage lang bei 4°C gelagert worden war, als auch bei der Testplatte, die sieben Tage lang bei 25°C gela gert worden war, befriedigende Ergebnisse, die im wesentli chen denen entsprachen, die in Beispiel 5 erhalten worden wa ren.

Beispiel 7 A. Herstellung der Agglutinationstestplatte

Es wurde eine Polystyrolplatte mit 96 V-förmigen Vertiefun gen, jeweils mit einem Fassungsvermögen von 0,3 ml, bereitge stellt. In die Vertiefungen der Polystyrolplatte gab man je weils 0,05 ml einer PBS-Lösung, die Protein G in einer Kon zentration von 1,0×10^-6 mg/ml enthielt. Nach 9 h wurde die PBS-Lösung aus den Vertiefungen der Platte abgeschüttet. Dann gab man 0,05 ml einer frischen PBS-Lösung in die Vertiefungen und schüttete die Lösung wieder ab, um das überschüssige un gebundene Protein G von der Wandoberfläche der Vertiefungen zu entfernen. Man ließ die Platte trocknen, um eine mit Pro tein G beladene Testplatte herzustellen.

B. Agglutinationstest

In die Vertiefungen der im oben beschriebenen Verfahrens schritt hergestellten mit Protein G beladenen Testplatte gab man ein Kaninchen-Antiserum gegen den Virus der japanischen B-Encephalitis, der in Schritt B von Beispiel 2 verwendet wurde, Kaninchen-Antiseren gegen andere Viren und ein Serum eines nicht virusinfizierten Kaninchens, so daß jede Vertie fung 0,05 ml des Antiserums bzw. der Serumlösung nach Verdün nung mit PBS enthielt. Die Verdünnung mit PBS wurde wieder holt, so daß nach jedem Verdünnungsschritt die doppelte Menge Antiserum bzw. Serumlösung vorhanden war. Nach 30 min gab man 0,05 ml der PBS-Lösung der agglutinierenden Kompositteilchen mit dem daran gekoppelten JBE-Virus-Antigen, die in Schritt B von Beispiel 2 hergestellt worden waren, in jede Vertiefung. In keiner der mit Protein G beladenen Testplatten, die die Kaninchen-Antiseren gegen andere Viren oder das Serum des nicht virusinfizierten Kaninchens enthielten, wurde in den Vertiefungen ein Agglutinationsbild beobachtet. Dagegen beob achtete man in der mit Protein G beladenen Testplatte, die das Kaninchen-Antiserum gegen den Virus der japanischen B-En cephalitis in den Vertiefungen enthielt, ein eindeutiges Ag glutinationsbild in den Vertiefungen, bis das Kaninchen-Anti serum so weit mit PBS verdünnt wurde, bis eine 8000-fache Verdünnung erreicht war. Man stellte jedoch kein Agglutinati onsbild fest, als das Kaninchen-Antiserum auf eine 16000-fa che Verdünnung verdünnt wurde.

Beispiel 8 A. Herstellung der Agglutinationstestplatte

Es wurden zwei Polyvinylchloridplatten mit jeweils 96 U-för migen Vertiefungen, jede Vertiefung mit einem Fassungsvermö gen von 0,2 ml, bereitgestellt. In die Vertiefungen der Plat ten gab man jeweils 0,05 ml einer PBS-Lösung, die Protein A in einer Konzentration von 1,0×10^-5 mg/ml und Protein G in einer Konzentration von 1,0×10^-5 mg/ml enthielt. Nach 10 min wurde die PBS-Lösung aus den Vertiefungen der Platte ab geschüttet. Dann gab man 0,05 ml einer frischen PBS-Lösung in die Vertiefungen und schüttete die Lösung wieder ab, um das überschüssige ungebundene Protein A und Protein G von der Wandoberfläche der Vertiefungen zu entfernen. Man ließ die Platte trocknen, um eine mit Protein A und Protein G beladene Testplatte herzustellen.

Eine Testplatte wurde sieben Tage lang bei 4°C gelagert, wäh rend die andere Testplatte sieben Tage lang bei 25°C gelagert wurde.

B. Agglutinationstest

Unter Verwendung der im oben beschriebenen Verfahrensschritt hergestellten mit Protein A und Protein G beladenen Testplat ten wurde der Agglutinationstest ähnlich wie bei Schritt B in Beispiel 5 beschrieben durchgeführt. Man erzielte befriedi gende Ergebnisse, die im wesentlichen den Ergebnissen von Beispiel 5 entsprachen, sowohl für die sieben Tage lang bei 4°C gelagerten Testplatten als auch für die sieben Tage lang bei 25°C gelagerten Testplatten.

Vergleichsbeispiel 1

In die Vertiefungen einer Polystyrolplatte mit 96 V-förmigen Vertiefungen, jeweils mit einem Fassungsvermögen von 0,3 ml, gab man ein Kaninchen-Antiserum gegen den Influenzavirus, der im Schritt B in Beispiel 1 verwendet worden war, Kaninchen- Antiseren gegen andere Viren und ein Serum eines nicht virus infizierten Kaninchens, so daß jede Vertiefung 0,05 ml Anti serum oder Serumlösung nach Verdünnung mit PBS enthielt. Die Verdünnung mit PBS wurde wiederholt, so daß nach jedem Ver dünnungsschritt die doppelte Menge Antiserum bzw. Serumlösung vorhanden war. Nach 30 min gab man 0,05 ml der PBS-Lösung der agglutinierenden Kompositteilchen mit dem daran gekoppelten Influenzavirus-Antigen, die in Schritt B von Beispiel 1 her gestellt worden waren, in jede Vertiefung. In keiner der Testplatten, die die Kaninchen-Antiseren gegen andere Viren oder das Serum des nicht virusinfizierten Kaninchens enthiel ten, wurde in den Vertiefungen ein Agglutinationsbild beob achtet. Dagegen beobachtete man bei der Testplatte, die das Kaninchen-Antiserum gegen Influenzavirus in den Vertiefungen enthielt, ein eindeutiges Agglutinationsbild in den Vertie fungen, bis das Kaninchen-Antiserum so weit mit PBS verdünnt wurde, daß eine 4000-fache Verdünnung erreicht war. Man beob achtete jedoch ein unklares, nicht eindeutiges Bild, als das Kaninchen-Antiserum auf eine 8000-fache bis 32000-fache Ver dünnung verdünnt wurde. Bei einer 64000-fachen Verdünnung des Kaninchen-Antiserums oder einem noch höheren Verdünnungsgrad wurde kein Agglutinationsbild beobachtet.

Vergleichsbeispiel 2 A. Herstellung der Agglutinationstestplatte

Es wurde eine Polystyrolplatte mit 96 V-förmigen Vertiefun gen, jeweils mit einem Fassungsvermögen von 0,3 ml, bereitge stellt. In die Vertiefungen der Polystyrolplatte gab man je weils 0,05 ml einer PBS-Lösung, die Protein A in einer Kon zentration von 1,0×10^-7 mg/ml enthielt. Nach 20 h wurde die PBS-Lösung aus den Vertiefungen der Platte abgeschüttet. Dann gab man 0,05 ml einer frischen PBS-Lösung in die Vertiefungen und schüttete die Lösung wieder ab, um das überschüssige un gebundene Protein A von der Wandoberfläche der Vertiefungen zu entfernen. Man ließ die Platte trocknen, um eine mit Pro tein A beladene Testplatte herzustellen.

B. Agglutinationstest

In die Vertiefungen der im oben beschriebenen Verfahrens schritt hergestellten mit Protein A beladenen Testplatte gab man ein Kaninchen-Antiserum gegen den Virus der japanischen B-Encephalitis, der in Schritt B in Beispiel 2 verwendet wor den war, Kaninchen-Antiseren gegen andere Viren und ein Serum eines nicht virusinfizierten Kaninchens, so daß jede Vertie fung 0,05 ml des Antiserums bzw. der Serumlösung nach Verdün nung mit PBS enthielt. Die Verdünnung mit PBS wurde wieder holt, so daß nach jedem Verdünnungsschritt die doppelte Menge Antiserum bzw. Serumlösung vorhanden war. Nach 30 min gab man 0,05 ml der PBS-Lösung der agglutinierenden Kompositteilchen mit dem daran gekoppelten JBE-Virus-Antigen, die in Schritt B von Beispiel 2 hergestellt worden waren, in jede Vertiefung. In keiner der mit Protein A beladenen Testplatten, die die Kaninchen-Antiseren gegen andere Viren oder das Serum des nicht virusinfizierten Kaninchens enthielten, wurde in den Vertiefungen ein Agglutinationsbild beobachtet. Bei der mit Protein A beladenen Testplatte, die das Kaninchen-Antiserum gegen den Virus der japanischen B-Encephalitis in den Vertie fungen enthielt, wurde ein eindeutiges Agglutinationsbild in den Vertiefungen beobachtet, bis das Kaninchen-Antiserum so weit mit PBS verdünnt wurde, daß eine 500-fache Verdünnung erreicht war. Dagegen beobachtete man ein unklares, nicht eindeutiges Bild, welches somit nicht sicher als Agglutina tionsbild oder Nicht-Agglutinationsbild identifiziert werden konnte, als das Kaninchen-Antiserum auf eine 2000-fache bis 4000-fache Verdünnung verdünnt wurde. Bei einer 8000-fachen Verdünnung des Kaninchen-Antiserums oder einem noch höheren Verdünnungsgrad wurde kein Agglutinationsbild beobachtet.

Claims

1. Testplatte für einen Agglutinationstest, die eine Viel zahl von darin ausgebildeten Vertiefungen (12; 13) hat, dadurch gekennzeichnet, daß jede Vertiefung (12; 13) an einer Oberfläche anhaftendes Protein A und/oder Protein G hat.

2. Verfahren zur Herstellung einer Testplatte für einen Ag glutinationstest, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte:
Bereitstellen einer Testplatte (11) mit einer Vielzahl von darin ausgebildeten Vertiefungen (12; 13),
Einbringen einer geringen Menge einer Proteinlösung, die Protein A und/oder Protein G enthält, in die Vertiefungen der Platte,
Entfernen der eingefüllten Proteinlösung aus den Vertie fungen, und
Trocknen der Platte, um eine Testplatte mit Vertiefungen herzustellen, die jeweils an einer Oberfläche anhaftendes Protein A und/oder Protein G haben.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Gesamtkonzentration des in der Proteinlösung enthal tenen Protein A und/oder Protein G mindestens 1,0×10^-6 mg/ml beträgt.

4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, gekennzeichnet durch das Ruhenlassen der Platte während eines vorbestimmten Zeitraumes nach dem Einbringen der Proteinlösung und vor dem Entfernen der Lösung aus den Vertiefungen.