DE19622458C2 - Enzymatisch-elektrochemischer Einschritt-Affinitätssensor zur quantitativen Bestimmung von Analyten in wäßrigen Medien und Affinitätsassay - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft einen enzymatisch-elektrochemischen Affinitätssensor und einen Einschritt-Affinitätsassay zur quantitativen Bestimmung von Analyten in wäßrigen Medien. Die Erfindung bezieht sich insbesondere auf ein enzyma­ tisch-elektrochemisches Signalamplifizierungssystem zur hochsensitiven Indikation von Affinitätsreaktionen und ist vor allem in Form eines Einschritt-Affinitätssensors zur Vor-Ort-Analytik geeignet. Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung von Phenoloxidase als Markerenzym für die affinen Bindungspartner in einem elektrochemischen Affinitätssensor- bzw. assay sowie die Verwendung eines phenolische Verbindungen hydrolysierenden Enzyms als Markerenzym für die affinen Bindungspartner in Kombination mit einer Phenoloxidase als Katalysator für die Amplifizierungsreaktion in einem elektrochemischen Affinitätsassay.

Zum Nachweis immunochemischer Reaktionen bzw. generell von Affinitätsreaktionen sind eine Reihe elektrochemischer bzw. enzymatisch-elektrochemischer Indikationssysteme bekannt, die auf der Indikation eines elektrochemisch aktiven Mark­ ers (Heinemann & Halsall, Anal. Chem., 57 (1985), pp. 1321A-1331A; Patentschrift DE 42 16 696; Le Gal La Salle, J. Electroanal. Chem., 350 (1993), 329-335) oder elektro­ chemisch aktiven Produkts des Markerenzyms beruhen. Als Markerenzym dient vor allem alkalische Phosphatase (Doyle et al., Anal. Chem. 56 (1984), pp. 2355-2360; McNeil, et al., Biosensors 3 (1987), pp. 199-209; Duan et. al., Anal. Chem. 66 (1995), pp. 1369-1377; Meusel et al. Biosens. & Bio­ electron. 10 (1995), pp. 577-586) oder Galactosidase (Màsson et al., Anal. Chim. Acta, 304 (1995), pp. 353-359). Eine Vielzahl anderer enzymatisch-elektrochemischer Indi­ kationssysteme basiert auf der zyklischen Regenerierung redoxaktiver Reaktionspartner.

Am häufigsten beschrieben sind dabei Assays, die entweder ein Redoxenzym oder einen Redoxmediator als Marker für ein Antigen oder einen Antikörper verwenden. Nach entsprechen­ der immunochemischer Reaktion wird durch den Marker in Anwesenheit des Enzymsubstrats eine enzymatische Redox­ reaktionssequenz komplettiert, bei der ein Redoxmediator, eine redoxaktive prosthetische Gruppe des Enzyms oder ein redoxaktiver enzymatischer Cofaktor bzw. ein redoxaktives Cosubstrat reduziert oder oxidiert wird. Mittels einer am­ perometrischen Redoxelektrode wird das Redoxsystem direkt oder via Mediator regeneriert. Der daraus resultierende Strom ist abhängig von der Analytkonzentration. D.h., das analytabhängig aus der Immunoreaktion nur in geringer Kon­ zentration verfügbare redoxaktive Konjugat verursacht eine zyklische enzymatisch-elektrochemische Regenerierungs­ reaktion, die eine amplifizierende Signalbildung mit einem entsprechend hohen Meßstrom zur Folge hat. Der Redoxmarker kann Bestandteil eines homogenen oder eines heterogenen Immunoassays bzw. eines Immunoassays nach dem Konkurrenz-, Titrations- oder Verdrängungsprinzip sein.

Durch Weber und Purdy (Anal. Letters 12 (1979), pp. 1-9) wurde erstmals ein homogenes Immunoassay unter Verwendung von Ferrocen als redoxaktives Label eines Antigens realisiert und die direkte Oxidation des Ferrocenkonjugats bei -500 mV (vs. SCE) detektiert.

In einem enzymatisch-elektrochemischen Immunoassay (diGleria et al., Anal. Chem. 58 (1986), pp. 1203-1206) wird ebenfalls Ferrocen als Antigenlabel verwendet, wobei Glucoseoxidase zur mediierten Indikatorreaktion des Anti­ gen-Ferrocenkonjugats dient, das bei Anwesenheit von Ana­ lyten aus der Bindungsstelle des Antikörpers verdrängt wird und damit den Elektronentransfer zwischen der Oxidase und der Elektrode übernehmen kann.

Die Vervollkommnung dieses enzymatisch-elektrochemischen Immunoassays wird in der Patentschrift EP 125 139 be­ schrieben. Als Label für das Antigen bzw. den Antikörper dient wieder ein Redoxmediator. In der Publikation von Suzawa et. al. (Anal. Chem., 66 (1994), pp. 3889-3894) wird Ferrocen als Mehrfachlabel in Kombination mit Glucose­ oxidase genutzt. Ein anderes bekanntes Immunoassay (Gyss and Bourdillon, Anal. Chem., 59 (1987), pp. 2350-2355) ver­ wendet Glucoseoxidase als Marker, wobei als Mediator Benzochinon dient.

Die Steigerung der Empfindlichkeit amperometrischer Indi­ kationssysteme auf der Basis von Redoxenzym-Mediator-Se­ quenzen in Immunoassays hat die Patentschrift EP 241 309 zum Ziel. Dabei wird ein zweiter Elektronenakzeptor (Ferricyanid, Polyvinylferrocen oder Berliner Blau) in die Meßlösung eingebracht bzw. zur Modifizierung der Elektro­ denoberfläche verwendet und via Hapten-Ferrocenkonjugat zur Akkumulierung von Reduktionsäquivalenten aus der enzymatischen Glucoseoxidation verwendet. Nach einer An­ reicherungszeit erfolgt die amperometrische Messung des in dieser Anreicherungsphase reduzierten Elektronenakzeptors.

In der Patentschrift EP 223 541 werden Redoxmediatoren ver­ wendet, die durch das Ankoppeln einer Phosphatgruppe bzw. eines Phenolderivats in ihrem formalen Potential in nega­ tive Richtung verschoben sind, so daß im Unterschied zu ihrer nicht derivatisierten Form kein Elektronentransfer von Glucoseoxidase via Mediator auf die Elektrodenober­ fläche erfolgen kann. Als Mediator dient Ferrocen oder Dichlorphenolindophenol. In Anwesenheit eines Hapten­ konjugats, das alkalische Phosphatase als Markerenzym auf­ weist und aus einer Konkurrenzreaktion mit dem Analyten re­ sultiert, erfolgt eine Abspaltung der derivatisierenden Gruppe, so daß der Mediator die Elektronenübertragung zwi­ schen Glucoseoxidase und der Redoxelektrode übernehmen kann. In Abhängigkeit von der Konzentration des verfügbaren Markerenzym-Antigen/Antikörperkonjugats tritt ein anodischer Meßstrom auf.

Weiterhin ist ein Meßsystem bekannt (PCT 86/03837), bei dem das Markerenzym selbst nicht die indizierende Redoxreaktion katalysiert, sondern eine redoxaktive "Triggersubstanz" erzeugt; letztere ist entweder direkt amperometrisch detek­ tierbar oder komplettiert aufgrund ihres reversiblen Re­ doxverhaltens eine enzymatisch-elektrochemische Signalamplifizierungssequenz. Als Markerenzym dient alkali­ sche Phosphatase oder β-Galactosidase. Im Fall der alkali­ schen Phosphatase wird als "Triggersubstrat" NADP⁺ verwen­ det, das durch Abspaltung einer Phosphatgruppe zu NAD⁺ hy­ drolysiert wird und als Cofaktor in einer Etha­ nol/Alkoholdehydrogenase/Diaphorase-, Ethanol/Al­ koholdehydrogenase/Ferricyanid- oder Ethanol/Al­ koholdehydrogenase/Ferrocen/Ferricyanid-Redoxelektroden-Se­ quenz zur Vervollständigung dieser Redoxkaskade führt. In analoger Weise sind auf der Basis der direkten oder mediatorgekoppelten Indikation des Cofaktors NADH elektrochemisch-enzymatische Assays von Eggers et. al. (Clin. Chem., 28/9 (1982), pp. 1848-1851) und Cardosi et. al. (Electroanalysis, 1 (1989), 297-304) beschrieben. Al­ ternativ kann das Markerenzym alkalische Phosphatase zur Abspaltung der Phosphatgruppe einer SH-haltigen Verbindung dienen, so daß diese als Elektronendonator für eine Glutathionreduktase oder Diaphorase fungiert und kathodisch regeneriert wird. Außerdem wird in dieser Patentschrift die Verwendung von β-Galactosidase als Markerenzym beschrieben, das p-Hydroxyphenyl-β-galactosid hydrolysiert. Das gebildete p-Hydroxychinon dient als Substrat für die Laccase und wird wiederum kathodisch regeneriert, so daß der resultierende Reduktionsstrom proportional zur Konzen­ tration des Antikörper/Enzymkonjugats ist.

Aus der Patentschrift PCT 86/04926 ist ein enzymatisch- elektrochemisches Indikationssystem für immunochemische Reaktionen bekannt, das räumlich voneinander durch ein Polymer getrennt ein Depolymerase/Ligandkonjugat und eine Redoxsequenz, bestehend aus Oxidoreduktase, Mediator und Redoxelektrode aufweist, oder das eine der genannten Redox­ komponenten polymergebunden bzw. in ein Polymer einge­ schlossen enthält. Als Polymer wird vorzugsweise ein Poly­ saccharid oder eine Liposomenmatrix, als Depolymerase Amyloglucosidase, α-Amylase oder Phospholipase, als Media­ tor Ferrocen oder ein Ferrocenderivat und als Redoxenzym Glucoseoxidase oder Glucosedehydrogenase verwendet.

Durch die als Markerenzym genutzte Depolymerase werden von einem Polymer Monomere abgespalten, die als Substrat für eine Oxidoreduktase dienen oder als mediatorgekoppelte Monomere diffusionsfähig werden, so daß in beiden Fällen eine enzymatisch-elektrochemische Reaktion generiert wird. Andere mögliche Depolymerasereaktionen bewirken das Frei­ setzen des in Liposomen eingeschlossenen Redoxenzyms oder die Penetrierung einer Polymermembran, die zuvor den Media­ tor vom Redoxenzym getrennt hat. Der aus der Redoxsequenz resultierende amperometrische Strom ist wiederum proportional zur Markerenzym-Ligandkonjugatkonzentration.

Schließlich werden Peroxidase-gekoppelte elektrochemisch­ enzymatische Immunoassays beschrieben. In einem bekannten homogenen elektrochemisch-enzymatischen Immunoassay (J. P. O′Daly et. al., Enzyme Microb. Technol., 14 (1992) 4, pp. 299-302), dient ein Ferrocenderivat als Label für ein Hapten, das durch Bindung des Konjugats an den Antikörper zunächst elektrochemisch inaktiv ist. Bei Anwesenheit des Analyten erfolgt eine Verdrängungsreaktion und der als Haptenlabel verwendete Mediator vervollständigt eine Peroxidase-katalysierte Redoxreaktion, die einen der Analytkonzentration proportionalen Reduktionsstrom generiert. In umgekehrter Arbeitsweise (Pritchard et. al., Anal. Chim. Acta, 310 (1995) pp. 251-256) wurde Peroxidase zum Markieren von Antikörpern verwendet, wobei nach einem Mehrschrittverfahren der Label via Ferrocenmonocarbonsäure kathodisch detektiert wird. Für einen Einwegimmunosensor, der in einem kompetitiven Mehrschritt-Assay dem Nachweis eines niedermolekularen Analyts dient (Kàlab und Sklàdar, Anal Chim Acta, 304 (1995), pp. 361-368), wurde Peroxidase als Enzymlabel des Antikörperkonjugats verwendet, das nach kompetitiver Reaktion innerhalb einer definierten Inkubationszeit zwischen dem Analyten und dem Hapten, das an der Elektrodenoberfläche immobilisiert war, und nach einem Spülschritt mittels Hydrochinon an der Elektrode nachgewiesen wurde. In einer anderen bekannten Arbeit (Wright et al., Biosens. & Bioelectron., 10 (1995), pp. 495-500) wird Glucoseoxidase als Enzymlabel verwendet, des­ sen Reaktionsprodukt (Wasserstoffperoxid) bei der eigent­ lichen Indikationsreaktion über eine mediatorfreie im Sieb­ druck hergestellte Peroxidase-Kohlenstoffelektrode erfolgt. Diese bekannten elektrochemisch-enzymatischen Indikations­ systeme immunochemischer Reaktionen bzw. von Affinitäts­ reaktionen weisen jedoch den allgemeinen Nachteil auf, daß sie entweder zu aufwendig oder zu unempfindlich für reale Applikationen sind.

US-Patent 4,963,245 beschreibt einen multiplen Elektroden-Sen­ sor zur Bestimmung von Analyten im Serum oder in Blutproben sowie Vorrichtungen zu seiner Verwendung. Der Sensor ist zur Messung bekannter Redoxreaktionen vorgesehen, wie z. B. der Oxidation von Glucose mit Glucoseoxidase oder der Oxidation von NADH zu AND. Die Konstruktion des Sensors umfaßt den Sensor-tragenden Teil sowie wenigstens eine Elektrodenanordnung, die sich auf dem Sensor-tragenden Teil befindet, wobei die Elektrodenanordnung Sensor-aktivierende Chemikalien enthält. In einer bevorzugten Ausführung ist das den Sensor-tragende Teil planar und weist eine Vielzahl von Vertiefungen auf. Die Elektrodenanordnung kann sich sowohl in einer Vertiefung als auch, wenn keine Vertiefungen vorhanden sind, an der Oberfläche des Sensor-tragenden Teils befinden. Die Elektrodenanordnung besteht aus drei Graphit-Elektroden. In der Mitte ist eine kreisförmige Arbeitselektrode angeordnet, die auf einer Seite von der Gegenelektrode und auf der anderen Seite von der Referenzelektrode umgeben ist. Wenn der Sensor mit Vertiefungen ausgestattet ist, sind die Elektroden sowohl horizontal wie auch vertikal getrennt. Dieser Elektroden-Sen­ sor ist jedoch ebenfalls zu unempfindlich für reale Applikationen.

Der Erfindung lag deshalb die Aufgabe zugrunde, ein Affinitätsassay zu schaffen, das sich durch eine hohe Empfindlichkeit, einfache Handhabung und eine elektrische Quantifizierung des Meßsignals auszeichnet. Es soll insbe­ sondere in Form eines Einschritt-Affinitätssensors zur Vor- Ort-Analytik in wäßrigen Medien geeignet sein.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe mittels eines enzymatisch- elektrochemischen Einschritt-Affinitätssensors gemäß An­ spruch 1 und der bevorzugten Ausführungsvarianten der Un­ teransprüche 2 bis 18 sowie mittels eines Affinitätsassays gemäß Anspruch 19 und der dazugehörigen Ausführungs­ varianten der Unteransprüche 20 bis 25 gelöst.

Insbesondere ist der erfindungsgemäße Sensor bzw. Assay zum Nachweis niedermolekularer Substanzen wie Pestiziden, PAKs, PCBs, Chlorphenolen, Schwermetallionen, Pharmaka und hochmolekularen Substanzen wie Peptiden, Hormonen, Proteinen, Nukleinsäuren, Glykoproteinen, Zellbotenstoffen sowie zum Nachweis von Mikroorganismen und Viren geeignet.

Die Erfindung ist also insbesondere auf den Gebieten der Umweltanalytik, der medizinischen Diagnostik, Lebensmittelanalytik und zur Kontrolle biotechnologischer Prozesse einsetzbar.

Im Sinne der Erfindung bedeuten Ligand oder Rezeptor die affinen Bindungspartner, zum Beispiel im Falle eines Immu­ noassays Antigen und Antikörper. Die enzymmarkierten Bin­ dungspartner werden als Konjugate bezeichnet, die Enzyme als Markerenzyme. Die Komplexe zwischen Ligand und Rezeptor werden als Affinitätskomplexe bezeichnet bzw. als komplexierte Konjugate, wenn einer der affinen Bindungs­ partner des Komplexes enzymmarkiert ist.

Das der Erfindung zugrundeliegende signalamplifizierende enzymatisch-elektrochemische System zum Nachweis von Affinitätsreaktionen beruht auf der Verwendung entweder ei­ nes mit Phenoloxidase markierten Liganden, der mit Rezep­ toren eine affine Reaktion eingeht, oder eines mit Phenol­ oxidase markierten Rezeptors, der mit modifiziertem Ligan­ den oder dem Analyten eine affine Reaktion eingeht. Das in der kompetitiven Reaktion nicht an einen immobilisierten Rezeptor oder Liganden gebundene, oder während der kompetitiven Reaktion verdrängte Phenoloxidase-Rezeptor­ konjugat oder Phenoloxidase-Ligandenkonjugat oder der nach einer pseudohomogenen Bindungsreaktion zwischen Analyt und Phenoloxidase-Rezeptorkonjugat gebildete Komplex diffun­ diert durch nacheinander angeordnete Festphasen, die aus diffusionsfähigem oder immobilisiertem Phenoloxidase-Li­ gandkonjugat oder diffusionsfähigem oder immobilisiertem Phenoloxidase-Rezeptorkonjugat und darauffolgenden Diffu­ sionsbarrieren bestehen, zu einer räumlich entfernten Redoxelektrode (3). In unmittelbarer Oberflächennähe wird ein vorgespeichertes Enzymsubstrat der Phenoloxidase durch die Phenoloxidase des Konjugats bzw. des komplexierten Konjugats zu einem elektroaktiven Produkt oxidiert, das via reversibel reduziertem Elektronenmediator katodisch zu ei­ nem Ausgangssubstrat der Phenoloxidase reduziert wird. Die resultierende zyklische Substratregenerierung führt zu ei­ ner chemischen, mittels voltammetrischer Methoden quan­ tifizierbaren analytproportionalen Stromsignalverstärkung Bei einem in analoger Weise als Markerenzym verwendeten hydrolysierenden Enzym, vorzugsweise einer Phosphatase oder Galactosidase, wird in unmittelbarer Elektrodenoberflächen­ nähe Phenoloxidase als Schicht 21 fixiert und ein Edukt, das aus der Hydrolyse eines in Schicht 20 vorgespeicherten Hydrolasesubstrats resultiert, durch die als katalytische Schicht genutzte Phenoloxidase zu einem elektroaktiven Pro­ dukt oxidiert und wiederum via reversibel reduziertem Elek­ tronenmediator kathodisch zu einem Ausgangssubstrat der Phenoloxidase reduziert. Die resultierende zyklische Substratregenerierung führt zu einer chemischen, mittels voltammetrischer Methoden quantifizierbaren, analytpro­ portionalen Stromsignalverstärkung.

Als Rezeptor werden im Sinne der Erfindung monoklonale oder polyklonale Antikörper, Antikörperfragmente, Lektine, Pro­ tein A und G, Nucleinsäuren, biologische Rezeptoren oder Gemische davon verwendet. Als Ligand gegen den Rezeptor dienen affine Haptene, Peptide, Schwermetallionenkomplexe, Nucleinsäuren, Kohlenhydrate, Proteine, Mikroorganismen, Viren oder Teile von Mikroorganismen oder Viren.

Als Phenoloxidase wird vorzugsweise Tyrosinase eingesetzt. Als hydrolisierendes Enzym ist alkalische Phosphatase be­ sonders bevorzugt. Geeignete Enzymsubstrate der Phenol­ oxidase, die zu einer starken Signalbildung führen, sind vorzugsweise Phenol, m-Kresol, p-Kresol, 2,4-Xylenol, p-Chlorphenol oder Catechol.

Als Elektronenmediator in der enzymatisch elektrochemischen Indikationsreaktion dient ein chinoider Redoxfarbstoff, ein Chinon, redoxaktive Komplexverbindungen des Eisens, Ruthe­ niums, Osmiums, Cobalts oder Wolframs, ein Metallocen, Phthalocyanin oder ein elektrisch leitfähiges Redoxpolymer wie Polyanilin, Polypyrrol, Poly-o-phenylendiamin oder Polyacetylen.

Eine erste erfindungsgemäße Ausführungsform nutzt das Ver­ drängungsprinzip. Es beruht auf der Verwendung eines ent­ weder Phenoloxidase-Ligandkonjugats oder Phenoloxidase-Rezep­ torkonjugats, das zum Absättigen der Bindungsstellen eines entsprechenden immobilisierten Rezeptors oder immobi­ lisierten Liganden dient. Dabei wird entweder die Phenol­ oxidase mit einem Liganden konjugiert, der im Vergleich zum eigentlichen Analyten eine wesentlich geringere Affinität gegen den Rezeptor aufweist, oder es wird ein Ligand zur Immobilisierung verwendet, zu dem der Phenoloxidase- markierte Rezeptor eine im Vergleich zum eigentlichen Ana­ lyten wesentlich geringere Affinität aufweist. Als Ligand dient ein dem Analyten strukturell verwandtes Molekül. Bei Anwesenheit von Analyt erfolgt durch diesen eine Verdrängung des Phenoloxidase-Ligandkonjugats von den Bin­ dungsstellen des immobilisierten Rezeptors oder eine Ver­ drängung des immobilisierten Liganden durch den Analyten von den Bindungsstellen des mit Phenoloxidase konjugierten Rezeptors. Das verdrängte Phenoloxidase-Ligandkonjugat bzw. das mit Analyt komplexierte Phenoloxidase-Rezeptorkonjugat diffundiert zur räumlich entfernten Elektrodenoberfläche und geht bei Anwesenheit eines Phenoloxidase-Substrats sowie eines Redoxmediators eine signalamplifizierende enzymatisch-elektrochemische Redoxreaktion ein, die ein analytproportionales, voltammetrisches Meßsignal generiert.

Eine zweite erfindungsgemäße Ausführungsform basiert auf einer (quasi) homogenen Affinitätsreaktion. Lokal getrennt von einem immobilisierten modifizierten Liganden erfolgt zunächst eine affine Reaktion des Analyten mit Phenol­ oxidase-konjugiertem Rezeptor, der im Überschuß vorliegt. Beim Diffundieren zur räumlich entfernten Redoxelektrode passieren die mit dem Phenoloxidase-konjugierten Rezeptor komplexierten Analytmoleküle und der überschüssige Phenol­ oxidase-konjugierte Rezeptor einen Abschnitt mit immo­ bilisiertem Liganden, an dem der unkomplexierte Anteil ge­ bunden wird, so daß an der Elektrodenoberfläche bei Anwe­ senheit eines Phenoloxidase-Substrates sowie eines Redox­ mediators ausschließlich der analytkomplexierte Phenol­ oxidase-konjugierte Rezeptoranteil eine signal­ amplifizierende enzymatisch-elektrochemische Redoxreaktion eingeht.

Eine dritte erfindungsgemäße Ausführungsform geht zunächst von einer affinen Konkurrenzreaktion zwischen Analyt und Phenoloxidase-Ligandkonjugat um die Bindungsstellen eines immobilisierten Rezeptors aus. Der Anteil des Phenol­ oxidase-Ligandkonjugats, der aufgrund der Analytkom­ plexierung mit dem Rezeptor nicht gebunden wurde, diffun­ diert zur räumlich entfernten Redoxelektrode und geht bei Anwesenheit eines Phenoloxidase-Substrats sowie eines Re­ doxmediators eine signalamplifizierende enzymatisch- elektrochemische Redoxreaktion ein.

Eine vierte, erfindungsgemäß besonders bevorzugte Aus­ führungsform sieht anstelle der Phenoloxidase in den oben beschriebenen erfindungsgemäßen Ausführungen als Marker­ enzym ein hydrolysierendes Enzym, vorzugsweise eine Phosphatase oder Galactosidase, vor. Die Phenoloxidase hingegen wird direkt auf der Redoxelektrodenoberfläche in Form einer katalytisch aktiven Schicht immobilisiert, die dann in der Lage ist, die als Markerenzym verwendete Hydro­ lase über eines ihrer Hydrolyseprodukte, das gleichzeitig ein effizientes Enzymsubstrat der Phenoloxidase ist, bei Anwesenheit eines Redoxmediators signalamplifizierend in die enzymatisch-elektrochemische Detektion einzubringen.

Letztlich wird entweder die als Markerenzym genutzte Phenoloxidase direkt oder als vermittelnde katalytische Schicht bei Anwesenheit eines geeigneten Enzymsubstrats so­ wie eines Redoxmediators zur eigentlichen Indikationsreak­ tion an einer kathodisch polarisierten Redoxelektrode ge­ nutzt. Dabei setzt die Phenoloxidase bestimmte Enzym­ substrate, vorzugsweise Phenol, m-Kresol, p-Kresol, 2,4-Xylenol, p-Chlorphenol oder Catechol zu einem elektro­ chemisch aktiven Produkt um, das wiederum voltammetrisch mittels eines reversiblen reduzierten chinoiden Redox­ farbstoffes, Chinons, redoxaktiven Metallkomplexes oder elektrisch leitfähigen redoxaktiven Polymers zu einem Aus­ gangssubstrat für Phenoloxidase reduziert wird. D.h., das regenerierte Ausgangssubstrat steht zusätzlich für die en­ zymatische Oxidationsreaktion zur Verfügung. Überraschen­ derweise führt diese zyklische Substratregenerierung bzw. chemische Signalamplifizierung im Vergleich zu bekannten amperometrischen Detektionssystemen zu einer um ca. drei Größenordnungen niedrigeren Nachweisgrenze.

Der erfindungsgemäße enzymatisch-elektrochemische Ein­ schritt-Affinitätssensor besteht entweder aus einer auf ei­ nem planaren Trägerstreifen 1 aufgedruckten voltamme­ trischen Meßkette 22 oder aus zwei in unmittelbarer Nähe auf einem gemeinsamen Trägerstreifen aufgedruckten Iden­ tischen voltammetrischen Meßketten 22, 23, die in beiden Ausführungen mit einer Folge von jeweils mit unterschied­ lichen für das erfindungsgemäße Affinitätsassay erforder­ lichen Reagenzien imprägnierten Schichten bedeckt sind. In der zweifachen Ausführungsform dient einer der beiden Teil­ sensoren auf dem gemeinsamen Trägersubstrat als eigent­ liches Indikationssystem, während der andere Teilsensor als Funktionstest dient.

Die voltammetrische Meßkette der Sensoren besteht jeweils aus einer Redoxelektrode 3, deren Oberfläche durch einen chinoiden Redoxfarbstoff, ein Chinon, einen redoxaktiven Komplex des Eisens, Rutheniums, Cobalts, Osmiums, Mangans oder Wolframs, ein Metallocen, ein Phthalocyanin oder ein elektrisch leitfähiges Redoxpolymer wie Polyanilin, Polypyrrol, Poly-o-phenylendiamin oder Polyacetylen modi­ fiziert ist und einer sie umgebenden Ag/AgCl-Pseudo­ referenzelektrode 4. Die Elektroden einschließlich ihrer Kontaktbahnen 2 für den Anschluß an einen Potentiostaten bzw. ein Handmeßgerät sowie die erforderliche Isolierungs­ schicht 5 zwischen den Kontaktbahnen werden mittels Sieb­ druck auf den planaren Trägerstreifen aufgebracht. Die modifizierte Redoxelektrode ist gegen die Pseudoreferenz­ elektrode katodisch polarisiert.

Unmittelbar über den Elektroden werden in engem Kontakt mehrere aufeinanderfolgende Schichten mittels eines fle­ xiblen Fixierrahmens 6, 7 aus Kunststoff auf die Elektroden gedrückt, die durch die Verwendung entsprechender poröser Materialien bzw. deren Modifizierung zielgerichtet die Diffusion oder Kapillarkräfte begünstigen oder zeitbegrenzt behindern. Als diffusionsbegünstigende bzw. die Kapillarkräfte fördernde Materialen, die auch mit ent­ sprechenden Puffersubstanzen versehen sind, werden vorzugs­ weise Zellulose, Polysilikate, linear vernetzte Hydrogele oder eine Mischung der genannten Materialien verwendet, die gegebenenfalls mit zusätzlichen hydrophilen Komponenten, vor­ zugsweise mit einem Polysaccharid, Polyalkohol, Polyetheralkohol oder anorganischem Salz versehen werden. Als Diffusionsbarriereschicht, die zeitlich begrenzt als solche wirken soll, dient vorzugsweise ein hydrophobiertes Papier. Um einen effizienten Anreicherungseffekt zu er­ zielen, sind in einer bevorzugten Ausführungsform die Flächen der Schichten zur Elektrodenoberfläche hin so ge­ staltet, daß sie sich in ihrer Fläche verringern.

Zum Meßmedium hin werden die Schichten durch eine wasserundurchlässige Folie 9 bzw. Membran, vorzugsweise aus PTFE, Polycarbonat oder einer Kautschukverbindung teilweise bedeckt, die mittels eines ringförmigen porösen Spacers 10 gegen die Abdeckung 8 eines Fixierrahmens distanziert ist. Der Fixierrahmen 6, 7, der einen zylindrischen Hohlraum zur Aufnahme der Schichten enthält und diese gegen ein seit­ liches Eindringen des Meßmediums schützt, weist in seiner Abdeckung 8 eine kreisförmige Fläche auf. Letztere weist vorzugsweise regelmäßig angeordnete Öffnungen zum Eintritt des Meßmediums auf und ist in ihrem Durchmesser kleiner als die Folie. Unmittelbar nach der Folie, deren Durchmesser wiederum kleiner als der des zylindrischen Hohlraums des Fixierrahmens ist, ist eine Probeaufnahme-und Reservoirschicht 11 angeordnet, die aus einem schnell wasseraufnehmenden und gut quellbaren Material, vorzugsweise aus einer Zelluloseschicht besteht, die mit einem natürlichen oder synthetischen Hydrogel wie Agar, Gelatine, Pektin, Dextrin, Polyacrylamid oder Polyurethan imprägniert ist. Bei der Aufgabe einer wäßrigen Probe erfolgt durch die Öffnungen der Fixierrahmenabdeckung 8 und den ringförmigen Spacer 10 die Diffusion der Probe in die Probeaufnahme- und Reservoirschicht 11, bis diese aufgrund ihrer Quellung und der damit einhergehenden Volumen­ vergrößerung die Folie 9 auf die Eintrittsöffnungen der Fixierrahmenabdeckung 8 drückt, so daß die Probenachführung unterbunden wird. Auf diese Weise wird ein definiertes Pro­ bevolumen geschaffen.

Der Probeaufnahme- und Reservoirschicht 11 folgt eine Schicht 12, die entweder mit frei diffusionsfähigem Phenol­ oxidase-Rezeptorkonjugat oder mit Phenoloxidase-kon­ jugiertem modifizierten Liganden versehen ist, und der sich eine diffusionshemmende Schicht 13 anschließt.

Im Fall des diffusionsfähig vorliegenden Phenoloxidase- Rezeptorkonjugats erfolgt eine affine Reaktion mit dem Ana­ lyten, während im Fall des diffusionsfähig vorliegenden Phenoloxidase-Ligandkonjugats lediglich eine homogene Ver­ teilung des Analyten in dieser Schicht angestrebt wird. Die Inkubationsdauer wird in beiden Fällen von der Zeitdauer bestimmt, die zum Durchbrechen der nachfolgenden Diffu­ sionsbarriere 13 erforderlich ist.

Die darauffolgende Schicht 14 enthält entsprechend der bei­ den unterschiedenen Fälle an die Festphase immobilisiert entweder einen Liganden oder einen Rezeptor, der wiederum eine Diffusionsbarrierenschicht 15 folgt. Im ersten Fall wird der Anteil des Phenoloxidase-Rezeptorkonjugats, das in der vorangegangen affinen Reaktion keinen Analyten binden konnte, an dem immobilisierten Liganden gebunden, während das mit Analyt komplexierte Phenoloxidase-Rezeptorkonjugat durch diese Schicht hindurch diffundiert, sobald die Diffsionsbarriere durchbrochen wird. Im zweiten Fall kon­ kurrieren Analyt und das Phenoloxidase-Ligandkonjugat um die Bindungsstellen des immobilisierten Rezeptors. Aufgrund der höheren Affinität des Analyten und der begrenzten Menge an Rezeptor wird analytproportional der überschüssige Anteil des Phenoloxidase-Ligandkonjugats nach dem Durchbrechen der Diffusionsbarriere 15 weiterdiffundieren.

In der sich anschließenden letzten Schicht 16 ist zur An­ reicherung entweder ein Rezeptor gegen das mit Analyt kom­ plexierte Phenoloxidase-Rezeptorkonjugat oder ein Rezeptor gegen das Phenoloxidase-Ligandkonjugat an der Festphase im­ mobilisiert. Diese Schicht 16 befindet sich unmittelbar vor der Elektrodenoberfläche und wird umgeben von einer kreis­ förmigen, durch eine Diffusionsbarriere 17 getrennten, das Phenoloxidase-Substrat enthaltenden Schicht 18. Nach einer Inkubationszeit, die zur Anreicherung entweder des mit Ana­ lyt komplexierten Phenoloxidase-Rezeptorkonjugats oder des mit Analyt komplexierten Phenoloxidase-Ligandkonjugats er­ forderlich ist, dringt das Substrat nach dem Durchbrechen der Diffusionsbarriere 17 in die elektrodennahe Schicht 16 ein, und es wird die eigentliche enzymatisch-elektro­ chemische Indikationsreaktion via Redoxmediator, der an der Elektrodenoberfläche 3 durch Adsorption, physikalischen Einschluß oder kovalent gebunden wird, an der kathodisch polarisierten Redoxelektrode 3 erfolgen.

Eine zweite erfindungsgemäße Ausführungsform des enzy­ matisch elektrochemischen Einschritt-Affinitätssensors weist unmittelbar nach der Probeaufnahme- und Reservoir­ schicht 11 eine Schicht 19 mit Rezeptor oder modifiziertem Liganden auf, der an der Festphase immobilisiert und ent­ weder mit Phenoloxidase-Ligandkonjugat oder Phenoloxidase-Re­ zeptorkonjugat komplexiert ist. Nach der Diffusion der Probeflüssigkeit aus der Probeaufnahme- und Probereser­ voirschicht 11 erfolgt eine Verdrängungsreaktion durch den Analyten, so daß entweder der Analyt am immobilisierten Re­ zeptor anbindet und das Phenoloxidase-Ligandkonjugat ver­ drängt oder der Analyt mit dem zuvor am immobilisierten Liganden gebundenen Phenoloxidase-Rezeptorkonjugat komple­ xiert. Der daraus resultierende diffusionsfähige Anteil an entweder Phenoloxidase-Ligandkonjugat oder an analyt­ komplexiertem Phenoloxidase-Rezeptorkonjugat diffundiert nach Durchbrechen der Diffusionsbarriere 13 wiederum in die elektrodennahe Schicht 16, die wie bereits oben beschrieben aufgebaut ist.

Eine dritte erfindungsgemäße Ausführungsform des enzyma­ tisch elektrochemischen Einschritt-Affinitätssensors sieht anstelle der Phenoloxidase als Markerenzym die Verwendung eines hydrolysierenden Enzyms vor und weist im Unterschied zu den oben beschriebenen Ausführungsformen als elektrodennahe Schicht eine direkt auf der Elektrodenober­ fläche immobilisierte Phenoloxidaseschicht 21 zusätzlich auf.

Die mit dem enzymatisch-elektrochemischen Affinitätsassay sowie dem dazugehörigen enzymatisch-elektrochemischen Ein­ weg- und Einschritt-Affinitätssensor erzielten Vorteile be­ stehen insbesondere darin, daß eine äußerst sensitive, elektrisch quantifizierbare Detektion, insbesondere auch kleiner Analytmoleküle erfolgen kann, wobei das reagenz- und separationsfreie Einschritt-Meßsystem eine einfache Handhabung ermöglicht.

Einen weiteren Vorteil bietet die Verwendung zweier iden­ tischer und eng benachbarter Teilsensoranordnungen auf dem selben Trägersubstrat. Aufgrund der definierten dif­ fusionsfähigen Analytkonzentration, die die Probeaufnahme- und Reservoirschicht 11 der Funktionstestanordnung im Un­ terschied zu der eigentlichen Indikationsanordnung enthält, wird der kathodische Meßstrom dieses Teilsensors gegenüber dem Indikationsteilsensor um einen definierten Dif­ ferenzbetrag höher sein. Damit kann neben der eigentlichen Analytbestimmung gleichzeitig während des Meßvorgangs eine Funktionskontrolle vorgenommen und die Zuverlässigkeit der Messung erhöht werden.

Die Erfindung wird in den nachfolgenden Beispielen 1-3 zur Bestimmung des Modellanalyten 2,4 Dinitrophenol (DNP) und im Beispiel 4 zur Bestimmung von IgA sowie anhand der Fig. 1 bis 5b näher erläutert ohne sie darauf zu be­ schränken; es zeigen:

Fig. 1 eine perspektivisch dargestellte Ausführungsform des erfindungsgemäßen enzymatisch-elektrochemi­ schen Einschritt-Affinitätssensors

Fig. 2 eine Schnittdarstellung entlang der Linie A-A′ in Fig. 1 durch eine Variante des erfindungsgemäßen en­ zymatisch-elektrochemischen Einschritt-Affini­ tätssensors gemäß Anspruch 7

Fig. 3 eine perspektivisch dargestellte Ausführungsform des erfindungsgemäßen enzymatisch-elektrochemi­ schen Einschritt-Affinitätssensors mit einem zwei­ ten identischen Sensorkanal auf dem Support zur Ka­ librier- und Funktionskontrolle

Fig. 4 eine Schnittdarstellung entlang der Linie A-A′ in Fig. 1 durch eine Variante des erfindungsgemäßen en­ zymatisch-elektrochemischen Einschritt-Affini­ tätssensors gemäß Anspruch 8

Fig. 5a eine Schnittdarstellung entlang der Linie A-A′ in Fig. 1 durch eine Variante des erfindungsgemäßen en­ zymatisch-elektrochemischen Einschritt-Affini­ tätssensors gemäß Anspruch 9

Fig. 5b eine Schnittdarstellung entlang der Linie A-A′ in Fig. 1 durch eine Variante des erfindungsgemäßen en­ zymatisch-elektrochemischen Einschritt-Affini­ tätssensors gemäß Anspruch 10

Beispiel 1 (Fig. 1, 2)

Mittels polymerer Dickschichtpasten werden auf ein Glas­ faser-Epoxidharz-Support 1 nacheinander Kohlenstoffkontakt­ bahnen 2, eine N-Methylphenazinium-Reineckat-modifizierte Kohlenstoffarbeitselektrode 3, eine Silber/Silberchlorid (Ag/AgCl)-Referenzelektrode 4, die in Form eines quadrati­ schen Bandes die Arbeitselektrode 3 umgibt, und eine Iso­ lierschicht 5, die außer den Flächen der Arbeits- und Refe­ renzelektrode sowie Steckkontaktflächen den Support be­ deckt, gedruckt und bei 90°C gehärtet. Unmittelbar auf der Meßfensterfläche, in der die Arbeitselektrode 3 und Refe­ renzelektrode 4 angeordnet sind, wird ein Fixierrahmen aus Kunststoff 6, 7 durch entsprechende Ausformungen auf dem Support 1 aufgeklemmt. Der Fixierrahmen enthält einen zy­ linderförmigen Hohlraum und weist in seiner oberen Abdec­ kung 8 auf einer begrenzten Kreisfläche von 1,5 mm im Durchmesser regelmäßig angeordnete Öffnungen mit Durch­ messern von 0.1 mm auf. Der Fixierrahmen wird mit einer Folge unterschiedlicher Schichten dicht bepackt: Unmittel­ bar unter der perforierten Kreisfläche der Fixierrahmen­ abdeckung 8 befindet sich eine Siloprenfolie 9 (⌀ 3 mm), die mit einem ringförmigen Spacer 10 (⌀_A 3 mm, ⌀_I 2 mm) aus Filterpapier gegen die Abdeckung auf Distanz gehalten wird. Die Siloprenfolie wurde durch entsprechende Katalysator­ zugabe (Vernetzer KA-1, Bayer AG) zum Silopren K1000 (Fluka) auf einer PTFE-Unterlage zu einer Folie polykondensiert und als Blättchen ausgestanzt. Der Siloprenfolie folgt eine quellbare Schicht 11 mit einem Durchmesser von 5 mm, die aus einem mit ®SANWET IM 3900 G (Hoechst AG) beschichteten Filterpapier besteht und als Probeaufnahme- und Reservoirschicht dient.

Diese wie auch die nachfolgenden Filterpapierschichten wur­ den aus Blauband-Rundfilterpapier (Schleicher & Schüll 589/3) die zuvor mit einer wäßrigen Lösung aus 2 Vol-% Dextran, MG 70.000 (Sigma), 10 Vol-% Glycerol und 0.1 M Phosphatpuffer, pH 6,8 imprägniert wurden, hergestellt.

Das Rundfilterpapier hatte einen Durchmesser von 55 mm und wurde nach den jeweiligen Modifizierungsprozeduren passend zu dem jeweiligen Durchmesser des zylindrischen Hohlraums des Fixierrahmens (5 mm - 1 mm) ausgestanzt.

An die Probeaufnahme- und Reservoirschicht schließt sich eine Filterpapierschicht 12 (⌀ 3 mm) an, die frei diffu­ sionsfähiges DNP-L-Lysin-Tyrosinasekonjugat enthält. ε- 2,4 DNP -L-Lysin (Sigma) wurde analog der gemischten Anhy­ dridmethode nach Jung et. al., J. Agric. Food Chem., 37 (1989), 1183 an Tyrosinase, 2000 U/mg (Sigma) gekoppelt. Unmittelbar darunter ist eine mit Silikon leicht hydro­ phobierte Papierschicht 13 (⌀ 3 mm) als Diffusionsbarriere angeordnet, der eine Filterpapierschicht 14 (⌀ 1 mm) mit gerichtet immobilisierten Fängerantikörpern folgt. Zur Her­ stellung letztgenannter Schicht wurde das Filterpapier zu­ nächst einer Hydrolysierungsprozedur unterzogen. Die resultierenden OH-Gruppen wurden mit Carbonyldiimidazol akti­ viert und mittels Bernsteinsäuredihydrazid an die zuvor mit Perjodat oxidierten Kohlenhydrate des Fc-Teils der Anti­ körper (2 ml) kovalent gebunden. Zur Präparierung wurden die bekannten Prozeduren, wie in M. B. Wilson und P. K. Nakane: "Immunofluorescence and Releted Staining Techniques", Elsevier, North Holland Biomedical Press, S. 215-224, und in G. T. Hermanson, A. K. Mallia und P. K. Smith: Immobilized Affinity Ligand Techniques, Academic press, San Diego, CA, 1992 beschrieben, genutzt. Als Anti­ körper dienten kommerziell verfügbare polyklonale anti-DNP Antikörper aus Kaninchen (Sigma). Zur Minimierung der un­ spezifischen Bindung wurde die Immobilisierungsmatrix mit einer 1%igen Casein-Phosphatpuffer/KCI-Lösung abgeblockt.

Daran schließt sich wieder eine hydrophobierte Papier­ schicht 15 (⌀ 1 mm) und nochmals die gleiche mit Antikör­ pern immobilisierte Filterpapierschicht 16 (⌀ 1 mm) an, die dann unmittelbar auf der Arbeitselektrodenoberflächen auf­ liegt. Diese Filterpapierschicht 16 bildet gleichzeitig den elektrodennahen Raum und wird von einem mit 0,1 mM Catechol imprägnierten Filterpapierring 18 (⌀_A 2 mm, ⌀_I 1 mm) umgeben, dessen Innendurchmesser mit Silikon imprägniert ist und damit eine Diffusionsbarriere 17 schafft.

Bei Aufgeben eines wäßrigen Probetropfens auf die perfo­ rierte Fixierrahmenabdeckung 8 diffundiert die Probe­ flüssigkeit via Spacer 9 zunächst in die Probeaufnahme- und Reservoirschicht 11. Die dadurch verursachte Quellung der Probeaufnahme- und Reservoirschicht 11 führt dazu, daß die Siloprenfolie 9 an die perforierte Fixierrahmenabdeckung 8 gedrückt wird und diese verschließt. Die wäßrige Probe diffundiert durch die darauffolgende Dinitrophenol-Tyro­ sinasekonjugat enthaltende Filterpapierschicht 12 und mobilisiert das Konjugat. Nach dem Durchbrechen der als Diffusionsbarriere dienenden hydrophobierten Papierschicht 13 gelangt sowohl das Konjugat als auch der Analyt in eine weitere Filterpapierschicht 14, die den darin immobili­ sierten Fängerantikörper enthält. In der heterogenen Immunoreaktion konkurrieren nun das mit Tyrosinase konjugierte Hapten und das Dinitrophenol um die Bindungsstellen der gerichtet immobilisierten Antikörper. Aufgrund der höheren Affinität der Analytmoleküle gegenüber dem Konjugat wird die Komplexierung des Analyten bevorzugt. Je mehr Analyt sich in der Probe befindet, um so weniger DNP-L-Lysin-Tyrosinasekonjugat wird abgebunden. Durch die nachfolgend angeordnete hydrophobe Papierschicht 15 wird eine ausreichende Inkubationszeit für die kompetitive Immunoreaktion gesichert. Nach dem Überwinden dieser Diffusionsbarriere gelangt das nicht gebundene Hapten-Enzym­ konjugat in die elektrodennahe Schicht 16, die wiederum mit immobilisierten Antikörpern gegen DNP versehen ist, und wird über die Bindung an die Antikörper direkt vor der Elektrodenoberfläche 3 angereichert. Aufgrund der wäßrigen Probe wird das als Enzymsubstrat verwendete Catechol aus dem Filterpapierring 18, der die elektrodennahe Schicht umschließt, herausgelöst und initiiert seine enzymkatalysierte Umsetzung. Die Oxidation des Catechols erfolgt zu o-Chinon, das durch das kathodisch reduzierte N-Methylphenazinium auf der Elektrodenoberfläche 3 wieder zu Catechol reduziert wird. Der aus dieser zyklischen enzymatisch-elektrochemischen Substratregenerierung resultierende kathodische Meßstrom, der mittels Square-Wave-Voltammetrie bei -160 mV vs. die interne Ag/AgCl-Pseudoreferenzelektrode 4 als Peakstrom de­ tektiert wird, ist der DNP-Konzentration proportional. Der Meßbereich dieses Einschritt-Immunosensors liegt für DNP zwischen 0.5 und 20 µg/l.

Beispiel 2 (Fig. 5a)

Das zweite Ausführungsbeispiel basiert auf dem gleichen Sensoraufbau wie in Beispiel 1 beschrieben, verwendet je­ doch alkalische Phosphatase 150 U/mg (Sigma) zum Markieren des Haptens (DNP-L-Lysin). Dementsprechend wird der Filter­ papierring 20 mit 1 mM Phenylphosphat imprägniert und zwi­ schen der elektrodennahen Schicht 16 und der Arbeitselek­ trodenoberfläche 3 eine zusätzliche Schicht 21, die Tyro­ sinase, 2000 U/mg (Sigma) in einer PUR-Hydrogelschicht immobilisiert (Kotte et. al., Anal. Chem., 67 (1995), 65) enthält, eingebracht. Die immunochemische Reaktion ist ana­ log Beispiel 1, wobei die eigentliche Indikationsreaktion über die Zwei-Enzymsequenz alkalische Phosphatase- Tyrosinase erfolgt: Das nicht gebundene Phosphatase-DNP-L- Lysin Konjugat, das in die elektrodennahe Schicht 16 ge­ langt und durch die darin immobilisierten anti-DNP-Anti­ körper gebunden und damit angereichert wird, hydrolysiert das aus dem umgebenden Filterpapierring ausdiffundierende Phenylphosphat zu Phenol. Das Phenol wird schließlich durch die nachfolgende Tyrosinaseschicht zu o-Chinon oxidiert, das durch das kathodisch reduzierte N-Methylphenazinium auf der Elektrodenoberfläche 3 wieder zu Catechol reduziert wird. Der aus dieser zyklischen enzymatisch-elektrochemi­ schen Substratregenerierung resultierende kathodische Meß­ strom, der mittels Square-Wave-Voltammetrie bei -160 mV vs. die interne Ag/AgCl-Pseudoreferenzelektrode 4 als Peakstrom detektiert wird, ist der DNP-Konzentration proportional. Der Meßbereich dieses Einschritt-Immunosensors liegt für DNP zwischen 0.1 und 10 µg/l.

Beispiel 3 (Fig. 3)

Dieses Beispiel beschreibt die Verwendung zweier auf einem Support nacheinander angeordneter Immunosensorsysteme 22, 23, die wie im Beispiel 1 beschrieben aufgebaut sind. Von den unabhängig voneinander funktionierenden "Teilsensoren" bildet einer das eigentliche Indikationssystem 22, während der andere als Referenz- und Funktionstestsystem 23 dient. Das Referenz- und Funktionstestsystem unterscheidet sich vom Indikationssystem dadurch, daß seine Probe- und Reser­ voirschicht mit einer definierten Analytkonzentration von 1 µg/l imprägniert ist, so daß man nach Aufgabe eines ent­ sprechenden Probetropfens bzw. durch Eintauchen des Sensors in die Probe am Referenz- und Kontrolltestsystem 22 auf­ grund des vorrätigen Analyten einen definierten "Mindestsignalstrom" erwarten kann zu dem sich der eigent­ liche Meßstrom addiert. In Abwesenheit von Analyt in der Probe beträgt dieser 5. . .8 nA. Der Meßstrom des Indika­ tionssystems 22, der analytabhängig zwischen 0.1 und 20 nA liegt, fällt um diesen Mindestsignalstrombetrag geringer aus. Auf diese Weise kann zum einen die Sensorfunktion während des Meßvorganges selbst kontrolliert und zum ande­ ren durch die Verrechnung beider Meßströme bei der Signal­ auswertung die Zuverlässigkeit der Messung erhöht werden.

Beispiel 4 (Fig. 2)

Dieses Beispiel beschreibt einen Affinitätssensor auf der Grundlage des Lektins Jacalin, einem Glycoprotein (Kumar, G. S., et. al., Biosci., 4 (1982), 257-61), als selektive af­ fine Komponente zur Bestimmung von IgA im Blutplasma (Kondoh, H., et al., Immunol. Meth., 88 (1986), 171-73). Der prinzipielle Sensoraufbau basiert auf dem Aufbau, der in Beispiel 1 beschrieben ist. Allerdings wurde in Schicht 12 frei diffusionsfähiges IgA-Tyrosinase Konjugat verwen­ det. Die Tyrosinase (Sigma) wurde analog der in Beispiel 1 verwendeten Methode an menschliches (Plasma) IgA (CALBIOCHEM) gekoppelt. Außerdem wurde in den Schichten 14 und 16 anstelle des Fängerantikörpers Jacalin (Pierce) im­ mobilisiert. Dazu wurde Blauband-Rundfilterpapier (Schleicher & Schüll 589/3, Durchmesser: 55 mm), mittels Carbonyldiimidazol aktiviert (Hissey, P. H., et al., Immunol. Meth. 78 (1985), 211-16), so daß das Jacalin via NH₂-Gruppen kovalent gebunden wurde. Für eine Filter­ papierfläche von ca. 23 cm² wurden 3 mg Jacalin in einem Milliliter 0.1 M Boratpuffer (pH 8,5) verwendet. Zur kova­ lenten Bindung wurde das CDA-aktivierte Filterpapier über 24 Stunden bei 8°C mit der Jacalinlösung inkubiert und da­ nach mit 0,1 M Phosphatpufferlösung (pH 6,8), die 2 Vol-% Dextran MG 70.000 (Sigma), 10 Vol-% Glycerol (Sigma) ent­ hielt, gespült und getrocknet. Danach wurde das Papier mit einer 1%igen Casein-Phosphatpuffer/KCl-Lösung (0,1 M) be­ handelt, getrocknet und mit einem Durchmesser von 1 mm aus­ gestanzt und wie in Beispiel 1 beschrieben als Schichten 14 und 16 verwendet.

Bei Aufgeben eines Blutplasmatropfens auf die perforierte Fixierrahmenabdeckung 8 diffundiert die Probeflüssigkeit via Spacer 9 zunächst in die Probeaufnahme- und Reservoir­ schicht 11. Die dadurch verursachte Quellung der Probeauf­ nahme- und Reservoirschicht 11 führt dazu, daß die Siloprenfolie 9 an die perforierte Fixierrahmenabdeckung 8 gedrückt wird und diese verschließt. Die wäßrige Probe dif­ fundiert durch die darauffolgende IgA-Tyrosinasekonjugat enthaltende Filterpapierschicht 12 und mobilisiert das Konjugat.

Nach dem Durchbrechen der als Diffusionsbarriere dienenden hydrophobierten Papierschicht 13 gelangt sowohl das Konju­ gat als auch der Analyt in eine weitere Filterpapierschicht 14, die das darin immobilisierte Jacalin enthält. In der heterogenen Immunoreaktion konkurrieren nun das mit Tyro­ sinase markierte IgA und das IgA der Probe um die Bindungsstellen des immobilisierten Lektins. Aufgrund der Gleichgewichtsreaktion erfolgt die Komplexierung analyt­ proportional. Je mehr Analyt sich in der Probe befindet, um so weniger IgA-Tyrosinasekonjugat wird abgebunden. Durch die nachfolgend angeordnete hydrophobe Papierschicht 15 wird eine ausreichende Inkubationszeit für die kompetitive Immunoreaktion gesichert.

Nach dem Überwinden dieser Diffusionsbarriere gelangt das nicht gebundene IgA-Enzymkonjugat in die elektrodennahe Schicht (16), die identisch zu Schicht 14 immobilisiertes Lektin aufweist, so daß das in Schicht 14 nicht abgebundene IgA-Tyrosinasekonjugat nun durch das immobilisierte Jacalin gebunden und damit vor der Elektrodenoberfläche 3 angerei­ chert wird. Aufgrund der wäßrigen Probe wird das als En­ zymsubstrat verwendete Catechol aus dem Filterpapierring 18, der die elektrodennahe Schicht umschließt, herausgelöst und initiiert seine enzymkatalysierte Umsetzung. Die Oxi­ dation des Catechols erfolgt zu o-Chinon, das durch das ka­ thodisch reduzierte N-Methylphenazinium auf der Elektroden­ oberfläche 3 wieder zu Catechol reduziert wird. Der aus dieser zyklischen enzymatisch-elektrochemischen Substratre­ generierung resultierende kathodische Meßstrom, der mittels Square-Wave-Voltammetrie bei -160 mV vs. die interne Ag/AgCl-Pseudoreferenzelektrode 4 als Peakstrom detektiert wird, ist der IgA-Konzentration proportional.

Bezugszeichenliste

1 Träger
2 Kontaktbahnen der Elektroden
3 mediatormodifizierte Redoxelektrode
4 Pseudoreferenzelektrode
5 Isolierschicht
6 Fixierrahmen
7 Fixierrahmen
8 obere Abdeckung des Fixier­ rahmens mit perforierter Fläche
9 Folie
10 Spacer
11 Probeaufnahme- und Reservoirschicht
12 Schicht, die frei diffu­ sionsfähigen Phenol­ oxidase- oder Hydrolase­ markierten Liganden oder Rezeptor enthält
13 Diffusionsbarriereschicht
14 Schicht, enthaltend einen immobilisierten Liganden oder Rezeptor
15 Diffusionsbarriereschicht
16 elektrodennahe Schicht, enthaltend einen immobi­ lisierten Liganden oder Rezeptor
17 Diffusionsbarriereschicht
18 Enzymsubtratschicht, ent­ haltend ein Substrat für die Phenoloxidase
19 Schicht, die Pheno­ loxidase- oder Hydrolase­ markierte immobilisierte Rezeptor/Ligand-Komplexe enthält
20 Enzymsubstratschicht, enthaltend ein Substrat für die Hydrolase
21 elektrodennahe Schicht, ent­ haltend immobilisierte Phe­ noloxidase
22 Meßsystem (identisch zu 23)
23 Meßsystem (identisch zu 22)

Claims (30)

1. Enzymatisch-elektrochemischer Einschritt-Affinitäts­ sensor zur quantitativen Bestimmung von Analyten in wäßrigen Medien bestehend aus einem Träger (1), auf dem ein Meßsystem (22) oder zwei nebeneinanderliegende, identisch aufgebaute Meßsysteme (22 und 23) und deren Kontaktbahnen (2) aufgebracht sind, wobei jedes Meßsystem jeweils aus mehreren, aufeinanderfolgenden, über einer mit einem Elektronenmediator modifzierten Redoxelektrode (3) und ihrer Pseudoreferenzelektrode (4) angeordneten Schichten besteht, die mittels eines Fixierrahmens (6) seitlich flüssigkeitsdicht verkapselt sind und dessen obere Abdeckung (8) eine Fläche aufweist, die Öffnungen zur Aufnahme der zu messenden Probe besitzt, wobei die Schichten

• a) für den Fall, daß das Markerenzym der affinen Bindungspartner Phenoloxidase ist, eine Schicht (18) mit einem Phenoloxidase-Substrat umfassen oder
• b) für den Fall, daß das Markerenzym der affinen Bindungspartner eine Hydrolase ist, eine Schicht (20) mit einem Hydrolasesubstrat und eine zusätzliche elektrodennahe Schicht (21) mit immobilisierter Phenoloxidase umfassen,

neben einer Probeaufnahme- und Reservoirschicht (11), einer elektrodennahen Schicht (16), den Schichten (12) und (14), die affine Bindungspartner enthalten oder einer Schicht (19), die entsprechende immobilisierte Affinitätskomplexe beinhaltet.

2. Sensor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß im Fall zweier Meßsysteme (22, 23) das eine Meßsystem das eigentliche Indikationssystem darstellt und das andere Meßsystem zur Kalibrier- und Funktionskontrolle dient.

3. Sensor nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Redoxelektrode, die vorzugsweise eine mediatormodifizierte Kohlenstoffelektrode ist, gegen die Pseudoreferenzelektrode, die vorzugsweise eine Ag/AgCl-Elektrode ist, eine Polarisationsspannung zwischen -300 mV und 100 mV aufweist.

4. Sensor nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Elektronenmediator der modifizierten Redox­ elektrode durch Adsorption, physikalischen Einschluß, kovalente Bindung oder in Form eines Redoxpolymers auf der Elektrodenoberfläche fixiert ist.

5. Sensor nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Elektronenmediator ein chinoider Redox­ farbstoff, ein Chinon, redoxaktive Komplexverbindungen des Eisens, Rutheniums oder Wolframs, ein Metallocen, Phthalocyanin oder ein elektrisch leitfähiges Redoxpolymer wie Polyanilin, Polypyrrol, Poly-o- phenylendiamin oder Polyacetylen ist.

6. Sensor nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß unter der oberen Abdeckung (8) des Fixierrahmens (6) eine, die Perforationen der Abdeckung überlappende, wasserundurchlässige Folie (9) angeordnet ist, die mit einem Spacer (10) auf Distanz zur Abdeckung (8) gehalten wird, und sich nach der Folie (9) die Probeaufnahme- und Reservoirschicht (11) anschließt.

7. Sensor nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß nach der Probeaufnahme- und Reservoirschicht (11) eine Schicht (12) angeordnet ist, die entweder einen frei diffusionsfähigen, Phenoloxidase-markierten Liganden oder einen frei diffusionsfähigen Phenoloxidase-markierten Rezeptor enthält, anschließend eine Diffusionsbarriereschicht (13) folgt, danach eine Schicht (14) mit einem immobilisierten Liganden oder einem immobilisierten Rezeptor angeordnet ist, anschließend eine zweite Diffusionsbarriereschicht (15) folgt und danach sich als letzte Schicht die elektrodennahe Reaktionsschicht (16) anschließt, an der entweder Ligand oder Rezeptor immobilisiert sind, und die von einer durch eine Diffusionsbarriere (17) getrennten Enzymsubstratschicht (18), die ein Substrat für die Phenoloxidase enthält, umschlossen wird.

8. Sensor nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß nach der Probeaufnahme- und Reservoirschicht (11) eine Schicht (19) angeordnet ist, die entweder einen immobilisierten Rezeptor, der mit einem Phenoloxidase- markierten Liganden komplexiert ist, oder einen immobilisierten Liganden, der mit einem Phenoloxidase- markierten Rezeptor komplexiert ist, enthält, danach eine Diffusionsbarriereschicht (13) folgt, und anschließend sich als letzte Schicht die elektrodennahe Reaktionsschicht (16) anschließt, an der entweder Ligand oder Rezeptor immobilisiert sind, und die von einer durch eine Diffusionsbarriere (17) getrennten Enzymsubstratschicht (18), die ein Substrat für die Phenoloxidase enthält, umschlossen wird.

9. Sensor nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß nach der Probeaufnahme- und Reservoirschicht (11) eine Schicht (12) angeordnet ist, die entweder einen frei diffusionsfähigen, Hydrolase-markierten Liganden oder einen frei diffusionsfähigen Hydrolase-markierten Rezeptor enthält, anschließend eine Diffusionsbarriereschicht (13) folgt, danach eine Schicht (14) mit einem immobilisierten Liganden oder einem immobilisierten Rezeptor angeordnet ist, anschließend eine zweite Diffusionsbarriereschicht (15) folgt, danach sich die elektrodennahe Reaktionsschicht (16) anschließt, an der entweder Ligand oder Rezeptor immobilisiert ist, und die von einer durch eine Diffusionsbarriere (17) getrennten Enzymsubstratschicht (20), die ein Substrat für die Hydrolase enthält, umschlossen wird und zwischen Schicht (16) und Redoxelektrode (3) eine zusätzliche elektrodennahe Schicht (21) angeordnet ist, die immobilisierte Phenoloxidase enthält.

10. Sensor nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß nach der Probeaufnahme- und Reservoirschicht (11) eine Schicht (19) angeordnet ist, die entweder einen immobilisierten Rezeptor, der mit einem Hydrolase­ markierten Liganden komplexiert ist, oder einem immo­ bilisierten Liganden, der mit einem Hydrolase-mar­ kierten Rezeptor komplexiert ist, enthält, danach eine Diffusionsbarriereschicht (13) folgt, danach sich die elektrodennahe Reaktionsschicht (16) anschließt, an der entweder Ligand oder Rezeptor immobilisiert ist, und die von einer durch eine Diffusionsbarriere (17) getrennten Enzymsubstratschicht (20), die ein Substrat für die Hydrolase enthält, umschlossen wird, und zwischen Schicht (16) und Redoxelektrode (3) eine zusätzliche, elektrodennahe Schicht (21) angeordnet ist, die immobilisierte Phenoloxidase enthält.

11. Sensor nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die wasserundurchlässige Folie (9) eine Membran, vorzugsweise aus PTFE, Polyethylen, Polycarbonat oder Kautschukverbindungen ist.

12. Sensor nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Probeaufnahme- und Reservoirschicht (11) quellbar ist und ein natürliches oder synthetisches Hydrogel enthält, vorzugsweise aus Agar, Gelatine, Pektin, Dextrin, Polyacrylat oder Polyurethan.

13. Sensor nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß als Diffusionsbarriereschicht (13, 15 oder 17) ein hydrophobiertes Papier dient.

14. Sensor nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß die die affinen Bindungspartner enthaltenden Schichten (12, 14 oder 16), die enzymsubstratenthalten­ den Schichten (18 oder 20), die Phenoloxidaseschicht (21) oder die die enzymmarkierten immobilisierten Affi­ nitätskomplexe enthaltende Schicht (19) aus einem, eine hydrophile Komponente enthaltenden, saugfähigen Mate­ rial besteht, vorzugsweise einer Zellulose, einem Po­ lysilikat, einem linear vernetzten Hydrogel oder einer Mischung der genannten Materialien.

15. Sensor nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß als hydrophile Komponente ein Polysaccharid, Polyalkohol, Polyetheralkohol, ein anorganisches Salz oder eine Mischung der genannten Komponenten dient.

16. Sensor nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß als Phenoloxidase Tyrosinase eingesetzt wird.

17. Sensor nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß als Enzymsubstrat der Tyrosinase Phenol, m-Kresol, p-Kresol, 2,4-Xylenol, p-Chlorphenol oder Catechol eingesetzt wird.

18. Sensor nach einem der Ansprüche 1 bis 6 oder 9 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß als hydrolisierendes Enzym eine alkalische Phosphatase, saure Phosphatase, oder β-Galactosidase eingesetzt wird.

19. Enzymatisch-elektrochemisches Einschritt-Affi­ nitätsassay zur quantitativen Bestimmung von Analyten in wäßrigen Medien, dadurch gekennzeichnet, daß auf die perforierte Fläche der Fixierrahmenabdeckung (8) eines Sensors gemäß den Ansprüchen 1 bis 18, der an einen Potentiostaten oder ein potentiostatisch aufgebautes Handmeßgerät angeschlossen ist, die Probeflüssigkeit aufgetragen wird und zunächst via Spacer (10) in die Probeaufnahme- und Reservoirschicht (11) diffundiert, diese Schicht quillt und dadurch die Folie (9) an die Fixierrahmenabdeckung (8) gedrückt wird, diese verschließt und danach der zu bestimmende Analyt in der Probeflüssigkeit beim Durchlaufen der Schichten des Sensors gemäß den Ansprüchen 1 bis 18 eine affine Bindungsreaktion eingeht, indem,

• a) ein Phenoloxidase-markierter Rezeptor, ein Phenoloxidase-markierter Ligand oder der entsprechende Phenoloxidase-markierte Affinitätskomplex mit dem Analyten zur mediatormodifizierten Elektrodenoberfläche (3) diffundiert und die Phenoloxidase ein geeignetes Phenoloxidase-Substrat in Schicht (18) in unmittelbarer Elektrodenoberflächennähe zu einem elektroaktiven Produkt oxidiert, das via reversibel reduziertem Elektronenmediator kathodisch zu einem Ausgangssubstrat der Phenoloxidase reduziert wird oder
• b) Phenoloxidase auf der Redoxelektrode (3) als Schicht (21) fixiert wird und ein Edukt, das aus der Reaktion eines in gleicher Weise wie in a) als Marker verwendeten hydrolisierenden Enzyms mit einem geeigneten Hydrolasesubstrat in Schicht (20) resultiert, durch die als katalytische Schicht (21) genutzte Phenoloxidase in unmittelbarer Elektrodenoberflächennähe zu einem elektroaktiven Produkt oxidiert wird, das via reversibel reduziertem Elektronenmediator kathodisch zu einem Ausgangsubstrat der Phenoloxidase reduziert wird, wobei die in beiden Fällen a) oder b) generierte zyklische Substratregenerierung zu einem chemisch amplifizierten, analytproportionalen kathodischen Strom führt, der mit an sich üblichen voltammetrischen Methoden quantifiziert wird.

20. Assay nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß der zu bestimmende Analyt den Phenoloxidase- markierten Liganden oder Rezeptor in Schicht (12) mobi­ lisiert, eine pseudohomogene Bindungsreaktion zwischen dem Analyten und dem diffusionsfähigen Phenoloxidase- markierten Rezeptor oder Phenoloxidase-markierten Liganden erfolgt, der nichtgebundene Anteil des Rezep­ tor- oder Ligandkonjugats nach Überwindung der Diffu­ sionsbarriereschicht (13) in Schicht (14) mit immo­ bilisiertem Liganden oder immobilisiertem Rezeptor ge­ bunden wird, und der Analyt-Rezeptorkonjugat-Komplex oder Analyt-Ligandkonjugat-Komplex nach Überwindung der Diffusionsbarriereschicht (15) in die elektrodennahe Reaktionsschicht (16) gelangt, an einen immobilisierten Rezeptor oder Liganden gebunden wird, und die Marker- Phenoloxidase nach der Mobilisierung des Phenoloxidase- Substrats in der Substratschicht (18) und seines Durch­ dringens der Diffusionsbarriereschicht (17) in die elektrodennahe Reaktionsschicht (16) hinein eine Ampli­ fizierungsreaktion zwischen Phenoloxidase-Substrat und modifizierter Elektrodenoberfläche (3) katalysiert, die ein analytproportionales voltammetrisches Stromsignal liefert.

21. Assay nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß der zu bestimmende Analyt in der Probeflüssigkeit den Phenoloxidase-markierten Liganden oder Rezeptor in Schicht (12) mobilisiert, Analyt und Phenoloxidase- markierter Ligand oder Phenoloxidase-markierter Rezeptor nach Überwindung der Diffusionsbarriereschicht (13) in Schicht (14) mit immobilisiertem Liganden oder Rezeptor um die verfügbaren Bindungsstellen konkurrieren, und der nichtgebundene Phenoloxidase- markierte Ligand oder Phenoloxidase-markierte Rezeptor nach Überwindung der weiteren Diffusionsbarriereschicht (15) in die elektrodennahe Reaktionsschicht (16) gelangt, an den immobilisierten Rezeptor oder Liganden in Schicht (16) gebunden wird, und die Marker- Phenoloxidase nach der Mobilisierung des Phenoloxidase-Sub­ strats in der Substratschicht (18) und seines Durchdringens der Diffusionsbarriereschicht (17) in die elektrodennahe Reaktionsschicht (16) hinein eine Amplifizierungsreaktion zwischen Phenoloxidase-Substrat und modifizierter Elektrodenoberfläche (3) katalysiert, die ein analytproportionales voltammetrisches Stromsignal liefert.

22. Assay nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß der zu bestimmende Analyt in der Probeflüssigkeit die Schicht (19) erreicht, die immobilisierten Liganden oder Rezeptor enthält, deren Bindungsstellen mit Phenoloxidase-Rezeptorkonjugat oder Phenoloxidase- Ligandkonjugat, respektive, abgesättigt sind, der Analyt einen Teil des Phenoloxidase-Ligandkonjugats oder des Phenoloxidase-Rezeptorkonjugats verdrängt, und das mit dem Analyten komplexierte Phenoloxidase- Ligandkonjugat oder das mit dem Analyten komplexierte Phenoloxidase-Rezeptorkonjugat nach Überwindung der Diffusionsbarriereschicht (13) in die elektrodennahe Reaktionsschicht (16) gelangt, an den dort immobiliserten Rezeptor oder Liganden gebunden wird, und die Marker-Phenoloxidase nach der Mobilisierung des Phenoloxidase-Substrats in der Substratschicht (18) und seines Durchdringens der Diffusionsbarriereschicht (17) in die elektrodennahe Reaktionsschicht (16) hinein eine Amplifizierungsreaktion zwischen Phenoloxidase- Substrat und modifizierter Elektrodenoberfläche (3) katalysiert, die ein analytproportionales voltammetrisches Stromsignal liefert.

23. Assay nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß der zu bestimmende Analyt in der Probeflüssigkeit den Hydrolase-markierten Rezeptor oder Liganden in Schicht (12) mobilisiert, eine pseudohomogene Bin­ dungsreaktion zwischen dem Analyten und dem diffu­ sionsfähigen Hydrolase-markierten Rezeptor oder Li­ ganden erfolgt, der nichtgebundene Anteil des Rezeptor- Konjugats oder Ligand-Konjugats nach Überwindung der Diffusionsbarriereschicht (13) in Schicht (14) mit immobilisiertem Liganden oder Rezeptor gebunden wird, und der Analyt-Rezeptorkonjugat-Komplex oder Analyt- Ligandkonjugat-Komplex nach Überwindung der Diffusionsbarriereschicht (15) in die elektrodennahe Reaktionsschicht (16) gelangt, an einen immobilisierten Rezeptor oder Liganden gebunden wird und die Marker- Hydrolase nach der Mobilisierung des Hydrolase- Substrates in der Substratschicht (20) und seines Durchdringens der Diffusionsbarriereschicht (17) in die elektrodennahe Reaktionsschicht (16) hinein ein Edukt hydrolisiert, das in die zusätzlich vor der Elektrodenoberfläche (3) angeordnete Schicht (21), die immobilisierte Phenoloxidase enthält, eindringt, und als Substrat der Phenoloxidase eine von der Phe­ noloxidase katalysierte Amplifizierungsreaktion zwi­ schen Phenoloxidase-Substrat und modifizierter Elek­ trodenoberfläche (3) auslöst, die ein analyt­ proportionales voltammetrisches Stromsignal liefert.

24. Assay nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß der zu bestimmende Analyt in der Probeflüssigkeit den Hydrolase-markierten Rezeptor oder Liganden in Schicht (12) mobilisiert, Analyt und Hydrolase­ markierter Ligand oder Rezeptor nach Überwindung der Diffusionsbarriereschicht (13) in Schicht (14) mit immobilisiertem Liganden oder immobilisiertem Rezeptor um deren Bindungsstellen konkurriert, und der nichtgebundene Anteil an Hydrolase-markiertem Liganden oder Hydrolase-markiertem Rezeptor nach Überwindung der Diffusionsbarriereschicht (15) in die elektrodennahe Reaktionsschicht (16) gelangt, an den immobilisierten Rezeptor oder Liganden in Schicht (16) gebunden wird, und die Marker-Hydrolase nach der Mobilisierung des Hydrolasesubstrat in der Substratschicht (20) und seines Durchdringens der Diffusionsbarriereschicht (17) in die elektrodennahe Reaktionsschicht (16) hinein ein Edukt hydrolisiert, das in die zusätzlich vor der Elektrodenoberfläche (3) angeordnete Schicht (21), die immobilisierte Phenoloxidase enthält, eindringt, und als Phenoloxidase-Substrat eine von der Phenoloxidase katalysierte Amplifizierungsreaktion zwischen Phenol­ oxidase-Substrat und modifizierter Elektrodenoberfläche (3) auslöst, die ein analytproportionales voltammetrisches Stromsignal liefert.

25. Assay nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß der zu bestimmende Analyt in der Probeflüssigkeit die Schicht (19) erreicht, die immobilisierten Liganden oder Rezeptor enthält, deren Bindungsstellen mit Hydrolase-Rezeptorkonjugat oder Hydrolase-Ligand­ konjugat, respektive, abgesättigt sind, der Analyt einen Teil des Hydrolase-Ligandkonjugats oder des Hydrolase-Rezeptorkonjugats verdrängt und das mit dem Analyten komplexierte Hydrolase-Ligangkonjugat oder das mit dem Analyten komplexierte Hydrolase-Re­ zeptorkonjugat nach Überwindung der Diffusions­ barriereschicht (13) in die elektrodennahe Reaktions­ schicht (16) gelangt, an den dort immobilisierten Re­ zeptor oder immobilisierten Liganden gebunden wird, und die Marker-Hydrolase nach der Mobilisierung des Hydrolase-Substrats in der Substratschicht (20) und seines Durchdringens der Diffusionsbarriereschicht (17) in die elektrodennahe Reaktionsschicht (16) hinein ein Edukt hydrolisiert, das in die zusätzlich vor der Elektrodenoberfläche (3) angeordnete Schicht (21), die immobilisierte Phenoloxidase enthält, eindringt, und als Phenoloxidase-Substrat eine von der Phenoloxidase katalysierte Amplifizierungsreaktion zwischen Phenoloxidase-Substrat und modifizierter Elektrodenoberfläche (3) auslöst, die ein analyt­ proportionales voltammetrisches Stromsignal liefert.

26. Verwendung einer Phenoloxidase, vorzugsweise Tyro­ sinase, als Markerenzym für die affinen Bindungspartner in einem elektrochemischen Affinitätssensor.

27. Verwendung einer Phenoloxidase, vorzugsweise Tyro­ sinase, als Markerenzym für die affinen Bindungspartner in einem elektrochemischen Affinitätsassay.

28. Verwendung eines hydrolisierenden Enzyms in Kombination mit einer Phenoloxidase in einem elektrochemischen Affinitätsassay, wobei das hydrolisierende Enzym als Markerenzym für die affinen Bindungspartner eingesetzt wird und die Phenoloxidase als Katalysator für die Amplifizierungsreaktion zwischen Phenoloxidase-Substrat und Redoxmediator dient.

29. Verwendung nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß als hydrolisierendes Enzym eine Phosphatase oder Galactosidase und als Phenoloxidase Tyrosinase einge­ setzt werden.