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Die
Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines ultradünnen Filmreaktors
mit immobilisiertem Protein, der Substratmoleküle zu chemischen Reaktionen,
insbesondere enzymatischen Reaktionen, an dem ultradünnen Film
aus Protein, der auf dem festen Träger vorhanden ist, veranlaßt.
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Bei
Bioreaktionen werden im allgemeinen hocheffiziente und hochselektive
physikalische und chemische Verfahren durch eine einzige oder kooperative
Funktionalität
oder durch gebundene Funktionen von Proteinen, wie einem Enzym,
durchgeführt.
Zur künstlichen
Imitation dieser Funktionen, d.h. zur Entwicklung einer neuen Molekularvorrichtung,
wie eines Enzymreaktors oder eines Biosensors, ist es erforderlich,
eine mehrschichtige Proteinstruktur, welche auf geeignete Art zusammengefügt wurde,
zu verwenden. Verfahren zur Immobilisierung von Proteinmolekülen auf
einem festen Träger
werden grob wie folgt klassifiziert: i) das Protein wird direkt
auf einem Substrat mittels Adsorption oder Gießen immobilisiert; ii) das
Protein wird als dünner
Film von der Oberfläche
einer Flüssigkeit,
beispielsweise gemäß dem Langmuir-Blodgett-Verfahren
(LB-Verfahren), übertragen;
und iii) das Protein wird durch alternierende Adsorption mit anderen
Komponenten immobilisiert.
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Bei
Anwendung des Verfahrens, bei dem ein Protein direkt an einem Substrat
adsorbiert wird, ist die Dicke der Proteinschicht auf den Bereich
beschränkt,
in dem die Wechselwirkung mit dem festen Substrat stattfindet. Es
ist daher schwierig, die Adsorption von Protein unter Verwendung
dieses Verfahrens zu wiederholen, und der Zusammenbau von Proteinfilmen
mit mehreren Komponenten mit vorgegebener Reihenfolge ist immer
noch nicht möglich.
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Bei
dem Gießverfahren
wird entweder eine wäßrige Lösung aus
dem Protein selbst oder ein Gemisch aus einer wäßrigen Lösung des Proteins und einem
Biomolekül
gegossen. Die Lipidschicht wird auf einen festen Träger unter
Immobilisierung der Proteinmoleküle
gegossen, und das Lösungsmittel
wird dann verdampft. Gemäß diesem
Verfahren ist es ebenfalls schwierig, mehrere Spezies von Protein
in einer gewünschten
Reihenfolge zu immobilisieren.
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Als
genaues präparatives
Verfahren zum Zusammenfügen
dünner
molekularer Filmschichten in vorbestimmter Reihenfolge wird das
LB-Verfahren vielfach verwendet. Dieses Verfahren ist wie folgt
charakterisiert. Eine Substanz, die eine hohe Löslichkeit besitzt, wie ein
Lipid, wird in einem organischen Lösungsmittel gelöst, und
die Lösung
wird über
die Oberfläche
von Wasser ausgespreitet. Dann wird der dünne Film auf ein festes Substrat übertragen.
Die Reihenfolge der zusammengetragenen Filme und ihre Dicke kann
kontrolliert werden. Da jedoch ein typisches Protein die Tendenz
hat, zu denaturieren und die Aktivität an der Luft-Wasser-Grenzfläche zu verlie ren,
wird dieses Verfahren für
die meisten Spezies von Protein nicht häufig verwendet. Bei diesem
Verfahren gehen Proteine leicht durch Zerstreuen in der Wasserphase
verloren. Es ist daher ein wirtschaftlich nicht zufriedenstellendes-Verfahren,
insbesondere wenn teure Proteine verwendet werden. Da das LB-Verfahren
weiterhin Schwierigkeiten, wie eine geringe Produktivität, besitzt
und teure Instrumente und Vorrichtungen erforderlich sind und es
schwierig zu handhaben ist, ist dieses Verfahren nicht als allgemeines
Verfahren zur Immobilisierung von Proteinen anerkannt.
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Kürzlich wurde
zur Minimierung der Denaturierung von Protein das folgende Verfahren
vorgeschlagen: Ein Enzym, beschichtet mit einem Lipid oder einem ähnlichen
Material, wird in einem organischen Lösungsmittel gelöst, und
dann wird die erforderliche Menge auf Wasser ausgespreitet. Ein
Merkmal der gemäß diesem
Verfahren erhaltenen Filme ist die dichte Packung der Lipidmoleküle, welche
die Substratdiffusion in den Film stört. Daher ist dieses Verfahren
für die
Verwendung in einem enzymatischen Reaktionssystem ungeeignet. Es
gibt einen Bericht, in dem angegeben wird, daß, wenn ein LB-Film zur Immobilisierung
von Glucoseoxidase (GOD) verwendet wird, die Schwierigkeit der Diffusion
der Substrate oder Produkte das Fortschreiten des Reaktionsvorganges
stört.
LB-Filmzusammenbauten sind im allgemeinen auf einen flachen und
nichtporösen
Träger
beschränkt,
und dieses Verfahren wird nicht als geeignetes Verfahren zur Immobilisierung
von Proteinen auf unterschiedlichen Arten von Trägern mit verschiedenen Funktionen
angesehen.
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Es
ist jetzt möglich
geworden, verschiedene Spezies von Protein in vorbestimmter Reihenfolge
zu immobilisieren, indem das Protein alternierend mit der anderen
Komponente adsorbiert wird und indem das Protein Schicht für Schicht
immobilisiert wird. Kürzlich
wurden verschiedene konkrete Bei spiele gemäß diesem Verfahren berichtet.
Die Akkumulierung von mehreren (zwei) Spezies von Protein unter
Verwendung eines spezifischen Liganden, wie Biotin/Avidin, ist gut
bekannt als ein konkretes Beispiel dieses Verfahrens. Dies erfordert
jedoch, daß das
Protein mit beachtlichem Aufwand markiert werden muß, und da
dieses Verfahren nur für
beschränkte
Kombinationen von Proteinen verwendet werden kann, ist es kein häufig angewendetes
Verfahren. Weiterhin wurde ein Verfahren zur alternierenden Adsorption
von Protein durch elektrostatische Wechselwirkung mit Rutheniumphosphat
oder Bolaamphiphilen vorgeschlagen. Da jedoch die Verbindungskomponenten
zwischen dem Protein bei diesem Verfahren zu starr sind, ist die
Zahl der Schichten, die aufgebaut werden können, auf einige beschränkt, und
die Proteine, die verwendet werden können, sind auf spezifische
Spezies beschränkt.
Gemäß diesem
Verfahren ist es schwierig, die erforderlichen Spezies von Protein
in vorbestimmter Reihenfolge zu immobilisieren. Diese Verfahren
sind daher zur Herstellung enzymatischer Reaktionssysteme, bei denen
mehrere Spezies von Protein verwendet werden, ungeeignet.
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In
einem weiteren, kürzlich
publizierten Bericht wird ein Verfahren zur Immobilisierung von
Protein unter Verwendung eines Produkts beschrieben, das durch Bindung
einer starren Substanz des grenzflächenaktiven Typs mit dem Namen
Boladication (welches an beiden Enden kationisch ist und mit einem
anionischen Protein binden kann) gebildet wurde (J. Chem. Soc.,
Chem. Commun., 1994, 1297-1298). Da Boladication zu starr ist, kann
das Substrat nicht leicht in die Proteinmatrix penetrieren. Daher
wird dieses Verfahren als mit Nachteilen behaftet angesehen. Erstens
besitzen die gebildeten Reaktoren eine sehr langsame Reaktionsgeschwindigkeit
mit einem reaktiven Substrat, und zweitens ist das Protein, welches
unter Verwendung von Boladication immobilisiert werden kann, auf
das anionische Protein beschränkt.
- Chemistry Letters, S. 2323-2326, 1994 betrifft die schichtweise
Zusammensetzung von alternierend aufgebrachten ultradünnen Protein-/Polyion-Filmen.
Als Träger
werden feste Substrate mit einer negativ geladenen planaren Oberfläche verwendet.
- J. Am. Chem. Soc. 1995, 117, S. 6117-6123 beschreibt ebenfalls
die Zusammensetzung von Multikomponenten-Proteinfilmen durch elektrostatische
Absorption der einzelnen Schichten. Als Träger werden Silber-QCM-Resonatoren
auf einem Quarzplättchen
oder Siliciumwaver genannt.
- J. Chem. Soc., Chem. Commun., 1994, S. 1297-1298 beschreibt
die Immobilisierung eines zweischichtigen Enzymfilms zur Glucoseisomerisierung
auf einem porösen
Träger,
jedoch nicht unter Verwendung von Polyionen bzw. Polyelektrolyten.
Dabei werden Aggregate eines niedermolekulargewichtigen Bipyridiniumsalzes (vgl.
S. 1297, Formel 1 und 1)
als Träger
verwendet.
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Die
benannten Erfinder haben ausgedehnte Untersuchungen durchgeführt, um
die Nachteile der bekannten Verfahren zu beseitigen und ein Verfahren
zur Immobilisierung und zum Zusammenbau mehrerer Spezies unterschiedlicher
Proteine in einer gewünschten
Reihenfolge ohne damit einhergehende Denaturierung der molekularen
Proteinschicht zu finden und wobei eine chemische Reaktion mit den
Substratmolekülen initiiert
werden kann. Als Ergebnis wurde die vorliegende Erfindung vollendet.
Die Erfinder haben gefunden, daß ein
ultradünner
Proteinfilm, zusammengefügt
in vorbestimmter Reihenfolge, unabhängig von dem Spezies des Proteins
erhalten werden kann, wenn das Protein unter solchen Bedingungen
zusammengetragen wird, bei denen das Protein geladen ist, beispielsweise
bei pH-Bedingungen weit weg von dem isoelektrischen Punkt. Der vorliegenden
Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung
eines ultradünnen
Filmreaktors mit immobilisiertem Protein zur Verfügung zu
stellen, mit dem chemische Reaktionen von Substratmolekülen, insbesondere
enzymatische Reaktionen, initiiert werden können. Erfindungsgemäß soll weiterhin
ein Verfahren zur chemischen Reaktion unter Verwendung des erfindungsgemäß hergestellten ultradünnen Filmreaktors
mit immobilisiertem Protein zur Verfügung gestellt werden.
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Gegenstand
der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines ultradünnen Filmreaktors
mit immobilisiertem Protein, umfassend Eintauchen eines festen Trägers alternierend
in eine wäßrige Lösung aus
Protein und in eine wäßrige Lösung aus
organischen Polyionen, die entgegengesetzt zu dem Protein geladen
sind, und Herstellung eines strukturell kontrollierten ultradünnen Proteinfilms
mit molekularem Präzisionsgehalt
auf einem festen porösen
Träger.
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur Herstellung
eines ultradünnen
Filmreaktors mit immobilisiertem Protein, umfassend die Stufen:
Eintauchen eines festen porösen Trägers mit
elektrisch geladener Oberfläche
in eine wäßrige Lösung aus
entgegengesetzt zu dem Träger
geladenen Polyionen oder entgegengesetzt zu dem Träger geladenem
Protein zur Umkehrung der Oberflächenladung
durch Neutralisation und Wiedersättigung;
dann Eintauchen des festen porösen
Trägers
mit der elektrisch geladenen Oberfläche in eine wäßrige Lösung von
neuen, entgegengesetzt zu dem Träger
geladenen Polyionen oder entgegengesetzt zu dem Träger geladenem
Protein zur Umkehrung der Oberflächenladung durch
Neutralisation und Wiedersättigung;
Wiederholung der Stufen; und Herstellung eines ultradünnen Films, in
dem mindestens zwei Proteine zusammengefügt sind.
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Die
Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur chemischen Reaktion
von Substratmolekülen,
umfassend die Stufen: Herstellung eines ultradünnen Filmreaktors mit immabilisiertem
Protein, zusammengesetzt aus mehreren Schichten aus Protein, auf
einem festen porösen
Träger
unter Verwendung der oben beschriebenen Verfahren; und Initiierung
einer chemischen Änderung
von Substratmolekülen
unter Verwendung des erhaltenen ultradünnen Filmreaktors mit immobilisiertem
Protein. Die Erfindung betrifft ebenfalls ein Verfahren zur chemischen
Reaktion von Substratmolekülen,
umfassend die Immobilisierung eines dünnen Proteinfilms auf einem
Träger,
der eine Trennfunktion besitzt, unter Verwendung der Verfahren nach
den Ansprüchen
1 und 2 und Abtrennung des Substrats und der Produkte der chemischen
Reaktion. Bevorzugt ist bei dem Verfahren das Protein ein Enzym.
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Anhand
der folgenden Beschreibung bevorzugter erfindungsgemäßer Beispiele
und der beigefügten Zeichnungen
wird die Erfindung näher
erläutert.
Es zeigen:
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1 eine
graphische Darstellung, wo die Frequenzänderungen von einer Quarzkristall-Mikrowaage, bezogen
auf das Fortschreiten der Zeit, der Proteinadsorption von Beispiel
1 dargestellt sind;
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2 eine
graphische Darstellung, wo die Frequenzänderungen einer Quarzkristall-Mikrowaage,
bezogen auf das Fortschreiten der Zeit, der Proteinadsorption der
Beispiele 3 und 4 dargestellt sind;
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3 eine
schematische Ansicht einer Meßvorrichtung
von Beispiel 5;
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4 eine
graphische Darstellung des UV-Spektrums von Beispiel 5;
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5 eine
graphische Darstellung, wo die Adsorptionsänderungen der Beispiele 6 bis
10 angegeben sind;
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6 eine
graphische Darstellung der Änderungen
bei der Umwandlung der Beispiele 10 bis 15;
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7 eine
graphische Darstellung der Änderungen
bei der Umwandlung der Beispiele 16 und 17;
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8 eine
graphische Darstellung der UV-Spektren der Beispiele 20 bis 22;
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9 eine
graphische Darstellung der in den Beispielen 23 bis 25 gebildeten
Menge an Glucose und H2O2.
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Erfindungsgemäß ist es
möglich,
einen ultradünnen
Film aus Proteinmolekülen
mit einer vorbestimmten Anzahl von Schichten und molekularer Gehaltsdicke
herzustellen, wobei die ursprüngliche
Aktivität
erhalten bleibt. Die Herstellung des ultradünnen Films beruht auf der folgenden
Theorie. Wenn ein fester poröser Träger, der
die entgegengesetzte Ladung des Proteins trägt, in eine wäßrige Proteinlösung eingetaucht
wird, wird das Protein an der Oberfläche des festen porösen Trägers durch
elektrostatische Wechselwirkungen adsorbiert. Bei dieser Gelegenheit
neutralisiert das Protein nicht nur die geladene Oberfläche des
Trägers,
sondern wird auch übermäßig adsorbiert,
und dann wird die Oberfläche
entgegengesetzt geladen. Dann wird diese in eine wäßrige Lösung mit
entgegengesetzt geladenen Polyionen, bezogen auf das Protein, eingetaucht. Als
Folge erscheint die neue entgegengesetzte Ladung auf der Oberfläche durch
Neutralisation und übermäßige Adsorption
der Polyionen. Dieses Verfahren der alternierenden Adsorption von
Protein und Polyionen kann unbegrenzt wiederholt werden. Die Menge
an überschüssiger Adsorption
bei jeder Stufe ist durch Sättigung
der Ladung beschränkt.
So kann eine konstante Menge an Protein oder organischen Polyionen
bei jeder Stufe immobilisiert werden.
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Wie
es eindeutig aus der oben erwähnten
Herstellungstheorie hervorgeht, ist es möglich, eine Proteinlösung in
ihrem natürlichen
Zustand zu verwenden, wobei die Degeneration des Proteins vermieden
werden kann. Unter Beachtung, daß die üblichen, gut bekannten Verfahren
zur Immobilisierung von Proteinen gelegentlich eine Degenerierung
des Proteins bewirken, wodurch die Proteinaktivität behindert
wird, kann ausgeführt
werden, daß das
erfindungsgemäße Verfahren
zur Immobilisierung von Protein ein ausgezeichnetes Verfahren zur
Herstellung eines enzymatischen reaktiven Systems ist.
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Da
die Adsorption des Proteins auf elektrostatischen Wechselwirkungen
beruht und jedes Protein eine Oberflächenladung besitzt, ist dieses
Verfahren ein Verfahren, welches vielfach mit wasserlöslichen
Proteinen durchgeführt
werden kann. Da die Oberflächenladung
der Proteine durch den pH-Wert der Lösung kontrolliert werden kann,
indem eine wäßrige Lösung von
Protein mit geeignetem pH-Wert und geeignete Polyionen der entgegengesetzten
Ladung ausgewählt
werden, ist die Immobilisierung von vielen Spezies von Protein möglich. Dies
bedeutet, daß die
vorliegende Erfindung nicht auf die Herstellung enzymatischer Reaktionssysteme für spezielle
Reaktionen beschränkt
ist, sondern vielfach bei üblichen
Reaktionen verwendet werden kann.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung ist es möglich,
viele Spezies von Protein in vorbestimmter Reihenfolge zu immobilisieren
und ein enzymatisches Verbund-Reaktionssystem mit ausgezeichneter
Reaktivität durch
Kombination verschiedener Proteinfunktionalitäten herzustellen.
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Da
die weichen Polyionen, die zur Immobilisierung des Proteins verwendet
werden, ihre Konformation ändern
können
und sich der Form der Proteinmoleküle anpassen können, ist
die Diffusion des Substrats oder der Produkte in den Film sehr leicht,
verglichen mit dem Fall, wo starre Komponenten, wie ein Lipid, verwendet werden.
Dies ist ein weiterer bemerkenswerter Vorteil der vorliegenden Erfindung,
verglichen mit den Fällen, wo
starre bzw. harte Komponenten verwendet werden.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
zur Herstellung des dünnen
Proteinfilms wird in kurzer Zeit gemäß einem einfachen Verfahren
durchgeführt,
das dadurch gekennzeichnet ist, daß nur ein Träger in eine
wäßrige Lösung von
Protein oder von organischen Polyionen eingetaucht wird, und es
ist nicht erforderlich, Spezialvorrichtungen zu verwenden. Es können daher
viele unterschiedliche Arten von festen porösen Trägern ausgewählt werden, und zusätzliche
Funktionen, wie eine Trennfunktion, können dem enzymatischen Reaktionssystem
zugefügt
werden.
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Die
vorliegende Erfindung wird im folgenden näher erläutert. Bei der vorliegenden
Erfindung bedeutet das organische Poly ion ein Polymeres mit elektrisch
geladenen funktionellen Gruppen in seiner Haupt- oder Seitenkette.
Im allgemeinen besitzen die polyanionischen Verbindungen eine funktionelle
Gruppe, die negativ geladen ist. Beispielsweise können-Sulfonsäuren, Schwefelsäuren und
Carbonsäuren
erwähnt
werden, und als konkrete Beispiele können Natriumpolystyrolsulfonat
(PSS), Natriumpolyvinylsulfat bzw. -sulfonat (PVS), Natriumdextransulfat
bzw. -sulfonat, Natriumchondroitinsulfat bzw. -sulfonat, Polyacrylsäure (PAA),
Polymethacrylsäure
(PMA), Polymaleinsäure
und Polyfumarsäure
verwendet werden. Als polykationische Verbindungen mit einer funktionellen
Gruppe, die positiv geladen ist, können beispielsweise quaternäre Ammoniumgruppen
und Aminogruppen erwähnt
werden, und als konkrete Beispiele können Polyethylenimin (PEI),
Polyacrylaminhydrochlorid (PAH), Polydiallyldimethylammoniumchlorid
(PDDA), Polyvinylpyridin (PVP) und Polylysin verwendet werden. Alle
diese organischen Polyionen sind dadurch charakterisiert, daß sie wasserlöslich sind oder
daß sie
in einem Gemisch aus Wasser und einem organischen Lösungsmittel
löslich
sind. Es ist weiterhin möglich,
elektrisch leitfähige
Polymere, funktionelle Polyionen, wie Poly(anilin-N-propansulfonsäure) (PAN), verschiedene
Arten von Biopolymeren der Desoxyribonucleinsäuren (DNA) und Ribonucleinsäuren (RNA)
und geladene Polysaccharid-Biopolymere, wie Pectin, zu verwenden.
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Da
die Oberfläche
von irgendeinem wasserlöslichen
Protein elektrisch ladbar ist, können
sie erfindungsgemäß, unabhängig von
anderen Eigenschaften, verwendet werden. Beispielsweise können Glucoseoxidase
(GOD; Molekulargewicht: 186.000, isoelektrischer Punkt: 4,2), Peroxidase
(POD; Molekulargewicht• 42.000,
isoelektrischer Punkt: 7,2), Glucoamylase (GA; Molekulargewicht:
100.000, isoelektrischer Punkt: 4,2), Alkohol-Dehydrogenase (ADH; Molekulargewicht:
100.000, isoelektrischer Punkt: 9), Diaphorase (DA; Molekulargewicht:
700.000, isoelektrischer Punkt: 4), Cytochrom (Cyt; Molekulargewicht• 12.400,
isoelektrischer Punkt: 10,1), Lysozym (Lys; Molekulargewicht: 14.000,
isoelektrischer Punkt: 11), Histon f3 (His; Molekulargewicht: 15.300,
isoelektrischer Punkt: 11), Myoglobin (Mb; Molekulargewicht: 17.800,
isoelektrischer Punkt: 7,0) und Hämoglobin (Hb; Molekulargewicht• 64.000,
isoelektrischer Punkt: 6,8) verwendet werden.
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Als
fester Träger
können
eine Substanz, deren Oberfläche
elektrisch ladbar ist, wie Silber (anionische Oberfläche), Glas,
Quarz (anionische Oberfläche)
und ein an der Oberfläche
geladener Polymerfilm, oder eine Substanz, die elektrisch geladen
werden kann, wie Gold (die elektrische Ladung kann auf die Oberfläche durch Adsorption
von Mercaptopropionsäure
oder anderen eingeführt
werden), und verschiedene Arten von Elektroden verwendet werden.
Da dieses Verfahren theoretisch auf einfacher Adsorption beruht,
ist es nicht erforderlich, daß der
feste Träger
für die
Immobilisierung flach bzw. eben ist, und verschiedene Materialien
können
als feste Träger
verwendet werden, wobei zusätzlich
zu einem flachen festen Substrat ein poröses festes Substrat, wie ein
Filter, Pulver aus Silicagel oder Harzkugeln bzw. -perlen, verwendet
wird.
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Grundsätzlich werden
das Protein und die Polyionen in wäßriger Lösung verwendet. Es können jedoch auch
organische Lösungsmittel
in verschiedenen Verhältnissen
beigemischt werden. Die Konzentration jeder Lösung hängt von der Löslichkeit
des Proteins und der organischen Polyionen ab, und da das Adsorptionsverfahren
auf der Neutralisation und Wiedersättigung der immobilisierten
Ladung beruht, ist es nicht erforderlich, eine genaue Konzentration
zu verwenden. Typische Konzentrationen sind 1 mg/ml für die Proteinlösung und 1
bis 3 mg/ml für
die Lösung
aus organischen Polyionen. Dieser Bereich soll jedoch keine Beschränkung darstellen.
Die pH-Werte der Lösung
werden auf pH-Werte eingestellt, bei denen das Protein oder die
Polyionen ausreichend geladen sind, indem wäßrige HCl zugegeben wird oder
indem ein Puffer verwendet wird.
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Bei
der ersten Stufe wird ein fester poröser Träger, dessen Oberfläche elektrisch
geladen ist, alternierend in die Lösung der beiden Arten von organischen
Polyionen (Polykation und Polyanion) eingetaucht. Dabei wird eine
flexible dünne
Schicht aus Polyionen an der Oberfläche des festen porösen Trägers immobilisiert. Wenn
dieses Immobilisierungsverfahren für die dünne Schicht der Polyionen weggelassen
wird, ist die folgende Herstellung des ultradünnen Proteinfilms nicht immer
möglich.
Der dünne
Film aus Polyionen ist entgegengesetzt zu dem Protein geladen, welches
das letzte adsorbierte Material ist, welches an der äußersten
Oberfläche
immobilisiert wird. Dann wird das Material in eine wäßrige Lösung aus
Proteinen eingetaucht, mit Wasser gewaschen, und dann wird das Eintauchen
in eine wäßrige Lösung aus
Polyionen und das Waschen mit Wasser wiederholt, und ein ultradünner Film
aus einer Protein-Mehrfachschicht wird erhalten. Die übliche Eintauchzeit
beträgt
etwa 10 bis 20 Minuten. Da jedoch bei diesem Verfahren ein Adsorptions-Gleichgewicht
erhalten wird, ist das strikte Einhalten der Eintauchzeit nicht
erforderlich.
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Wenn
der gemäß diesem
Verfahren hergestellte ultradünne
Proteinfilm in einem enzymatischen Reaktionssystem verwendet wird,
ist es erforderlich, den festen porösen Träger, auf dem der dünne Film
immobilisiert ist, in eine wäßrige Lösung einzutauchen,
die das Substrat enthält.
Spezielle Vorrichtungen für
die Herstellung bzw. Durchführung
des Verfahrens sind nicht erforderlich. Die Reaktion kann initiiert
werden, indem eine wäßrige Lösung des
Substrats durch einen porösen
Träger,
an dem der dünne
Proteinfilm immobilisiert ist, geleitet wird.
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Die
folgenden Beispiele erläutern
die Erfindung, ohne sie zu beschränken.
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Vergleichsbeispiele 1
und 2
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Als
Vergleichsbeispiele 1 und 2 wurden Immobilisierungsversuche durchgeführt, um
zu bestätigen, daß die Proteinschichten
wiederholt und konstant Schicht um Schicht immobilisiert werden.
Auf die Oberfläche einer
Quarzkristall-Mikrowaage, die mit einer Silberelektrode beschichtet
worden war, wurde ein ultradünner Proteinfilm
immobilisiert. Die Quarzkristall-Mikrowaage ist gut als Mikrowaage
bekannt, und es ist eine Vorrichtung, mit der die immobilisierte
Masse auf eine Präzision
von 10–9 g
mittels Meßfrequenzverlagerungen
bestimmt werden kann. Die Oberfläche
der Silberelektrode (die Oberflächenfläche beträgt etwa
0,2 cm2) ist negativ geladen, bedingt durch
Partialoxidation. Bei der ersten Stufe werden einige Vorstufenschichten
aus Polykation und Polyanion alternierend auf der Silberelektroden-Quarzkristall-Mikrowaage
immobilisiert, und dann wird ein Protein auf der Oberfläche absorbiert.
Bei Vergleichsbeispiel 1 wird die Masse in der alternierenden Adsorption
von PSS und POD geschätzt,
und die von PEI und GOD wird in Beispiel 2 geschätzt. In 1 sind die
Frequenzänderungen
der Quarzkristall-Mikrowaage aufgrund der Adsorption von Beispiel
1 dargestellt. Wie aus 1 hervorgeht, ist die Adsorptionsmasse
von jeder Schicht bei wiederholter Adsorption fast konstant, ausgenommen
für die
ersten paar Schichten. Das heißt,
dieses Ergebnis zeigt, daß erfindungsgemäß die Adsorption
von Protein mit konstanter Masse bei jeder Immobilisierung erhalten
wird. Die Masse des adsorbierten Proteins bei jeder Immobilisierungsstufe
wird berechnet, und sie entspricht der Adsorption einer einzigen
Molekularschicht aus Protein. Aus 1 ist erkennbar,
daß diese
alternierenden Adsorptionsverfahren wieder und wieder wiederholt
werden können,
bis die Anzahl der Schichten der entspricht, die für ein enzymatisches
Reaktionssystem erforderlich ist.
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Vergleichsbeispiele 3
und 4
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Gemäß den Vergleichsbeispielen
3 und 4 wurden mehrere Proteinspezies als ein dünner Film immobilisiert. In
Beispiel 3 wurde ein dünner
Film, zusammengesetzt aus alternierenden Schichten von PEI und GOD,
auf einer Vorstufenschicht hergestellt. Dann wurden PSS und POD
alternierend auf diesem dünnen
Film absorbiert. Bei Vergleichsbeispiel 4 wurden die beiden Spezies
von Protein von Vergleichsbeispiel 3 in umgekehrter Reihenfolge
angeordnet. Das heißt,
bei Vergleichsbeispiel 4 wurde ein dünner Film, der durch alternierende
Adsorption von PSS und POD erhalten wurde, auf einer Vorstufenschicht
hergestellt, dann wurden PEI und GOD alternierend darauf absorbiert.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in 2 dargestellt.
Wie aus dieser Figur eindeutig hervorgeht, wird das Verfahren zur
Herstellung von jeder Proteinschicht nicht durch das Verfahren zur
Herstellung einer anderen Proteinschicht beeinflußt, und
die Frequenzänderung
des entstehenden Teils von Vergleichsbeispiel 3 und 4 ist gleich.
Diese Tatsache zeigt, daß die
Proteinschichten unabhängig
hergestellt werden können,
was anzeigt, daß die
Proteinschichten in vorbestimmter Reihenfolge aufgebaut werden können. Dies
ist eine wesentliche Erkenntnis für die Bereitstellung eines
ausgezeichneten enzymatischen Reaktionssystems, welches hohe Reaktivität gegenüber einer
kontinuierlichen chemischen Änderung
zeigt.
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Vergleichsbeispiel 5
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Gemäß Vergleichsbeispiel
5 wurde ein dünner
Proteinfilm, zusammengesetzt aus einer einzigen GOD-Einfachschicht,
hergestellt. Dieser dünne
Film wurde in eine wäßrige Lösung, welche Glucose,
POD und Redox-Farbstoff DA67 enthielt, eingetaucht, und eine enzymatische
Reaktion wurde initiiert. Die chemischen Reaktionen sind in dem
folgenden Reaktionsschema angegeben, und die schematische Darstellung
des Meßsystems
ist in 3 erläutert.
Beim Fortschreiten der Reaktion wird DA67 oxidiert, und eine Adsorptionserhöhung wird
bei 607 nm und 665 nm nachgewiesen. In 4 sind die
Spektraländerungen
dieses Beispiels dargestellt. Im Verlauf der Zeit nehmen diese Adsorptionspeaks
schnell zu, was anzeigt, daß die
Reaktion glatt im Medium durch die Aktivität von GOD, immobilisiert in
dem dünnen
Film, abläuft,
und was ebenfalls anzeigt, daß GOD
seine Aktivität
beibehält.
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Vergleichsbeispiele 6
bis 9
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Gemäß den Vergleichsbeispielen
6 bis 9 wurde ein GOD-immobilisierter dünner Film (einschichtiger Film)
auf ähnliche
Weise, wie in Vergleichsbeispiel 5 beschrieben, hergestellt. Dieser
dünne Film
wurde in verschiedene Arten von Lösungen eingetaucht, und es
wurde bestätigt,
daß die
Spektraländerungen,
die in 4 dargestellt sind, auf der Reaktion beruhen,
die durch immobilisiertes GOD katalysiert wird. Diese Ergebnisse sind
in 5 zusammengefaßt. In 5 sind die
Meßergebnisse
der Adsorption, gemessen bei 665 nm, angegeben. In Vergleichsbeispiel
6 wurde eine Lösung
aus POD (0,0004 mg/ml) und DA67 (0,0001 mg/ml) während 5 Minuten inkubiert (5,
von Stufe 0 bis A). Während
dieser Zeit wurde keine Adsorptionserhöhung nachgewiesen, und es wurde
bestätigt,
daß die
spontane Oxidation von DA67 die Adsorptionserhöhung nicht beeinflußt. Dann
wurde ein GOD-immobilisierter dünner
Film in die Lösung
eingetaucht (Vergleichsbeispiel 7, 5, von Stufe
A bis Stufe B). Bei diesen Stufen konnte ebenfalls keine Adsorptionserhöhung nachgewiesen werden,
was anzeigt, daß die
spontane Oxidation von DA67 ignoriert werden kann. Dies wird durch
die Abwesenheit von Glucose bestätigt,
die ein Substrat von GOD in der Lösung ist. Es ist eindeutig
erkennbar, daß die gesamte
Reaktion (3) nicht initiiert werden kann,
sofern nicht die Oxidation von Glucose durch GOD initiiert wird.
Bei der nächsten
Stufe wurden nach Entfernung des GOD-immobilisierten dünnen Films
aus der Lösung
(5, Stufe B) 0,01 mg/ml Glucose zu der Lösung (Vergleichsbeispiel
8, 5, Stufe C) zugegeben. Eine Absorptionserhöhung wird
zu dieser Zeit kaum nachgewiesen (5, Stufe
C bis D) wegen der Abwesenheit von GOD in der Lösung. Diese Ergebnisse zeigen,
daß die
GOD-Moleküle
nicht in die Lösung
während der
ersten Eintauchstufe des GOD-immobilisierten dünnen Films (Vergleichsbeispiel
7) migrieren, was die Stabilität
des immobilisierten GOD in dem dünnen
Film beweist. Als Vergleichsbeispiel 9 wird der GOD-immobilisierte
dünne Film
in eine wäßrige Lösung (aus
Glucose, POD und DA67) eingetaucht. Dieses Verfahren wird zweimal
wiederholt. Das heißt,
bei der Stufe D der 5 wird der dünne Film eingetaucht und bei
der Stufe E entfernt. Es ist eindeutig aus der Beobachtung von 5 erkennbar,
daß die
Adsorptionserhöhung
nur in An wesenheit des dünnen
GOD-Films nachgewiesen werden kann, und wenn der dünne Film
aus der Lösung
entfernt wird, findet keine Adsorptionserhöhung statt. Diese Tatsache
erläutert
eindeutig, daß die
beobachtete Adsorptionserhöhung
auf der katalysierten Reaktion durch GOD beruht. Dieser Versuch
wird zweimal wiederholt, und die Ergebnisse zeigen eine ähnliche
Adsorptionserhöhung.
Dementsprechend wird die Möglichkeit
für die Recyclisierung
des dünnen
GOD-Films geklärt.
Schließlich
wird gemäß Vergleichsbeispiel
10 ein GOD-immobilisierter dünner
Film (doppelschichtiger Film) getrennt hergestellt und in die gleiche
wäßrige Lösung aus
Substrat (5, Stufe F) eingetaucht. In
diesem Fall wird eine Geschwindigkeit, die doppelt so hoch ist wie
sie bei dem einschichtigen Film von Vergleichsbeispiel 9 beobachtet
wurde, erhalten, was anzeigt, daß die Reaktionsgeschwindigkeit
der Anzahl der Schichten aus GOD in dem dünnen Film proportional ist.
Dieses Ergebnis zeigt ebenfalls an, daß das GOD, immobilisiert in
der innersten Schicht und weit weg von der Oberfläche des
Trägers,
an der Reaktion teilnimmt.
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Vergleichsbeispiele 10
bis 15
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Die
folgenden Versuche wurden als Vergleichsbeispiele 10 bis 15 durchgeführt. Ein
einschichtiger GOD-immobilisierter dünner Film (Vergleichsbeispiel
10 und 11), ein doppelschichtiger GOD-immobilisierter dünner Film
(Vergleichsbeispiele 12 und 13) und ein dreischichtiger GOD-immobilisierter
dünner
Film (Vergleichsbeispiele 14 und 15) wurden in eine wäßrige Lösung aus
Glucose (0,01 mg/ml), POD (0,0004 mg/ml) und DA67 (0,004 mg/ml)
eingetaucht, und die Reaktionsgeschwindigkeit wurde gemessen. Die
Ergebnisse sind in 6 dargestellt, wo die Umwandlung
auf der vertikalen Koordinate dargestellt ist. Zwei Versuche wurden
bei den gleichen Bedingungen wiederholt, um die gute Reproduzierbarkeit
der Vergleichsbeispiele 10 und 11, der Vergleichsbeispiele 12 und
13 und der Vergleichsbeispiele 14 und 15 zu zeigen. Diese gute Reproduzierfähig keit
zeigt an, daß,
wenn dieser dünne
Proteinfilm als Sensor verwendet wird, ein präzises Ansprechen erhalten wird.
Die Reaktionsgeschwindigkeit wird offensichtlich im Verhältnis zu
der Erhöhung
der Anzahl der Schichten erhöht,
wenn Proben mit unterschiedlichen Anzahlen von Schichten verglichen
werden. Diese Tatsache zeigt, daß GOD, welches in der innersten
Schicht des dünnen
Films immobilisiert ist, voll an der Reaktion teilnimmt, wie es
aus Vergleichsbeispiel 9 hervorgeht. Diese Tatsache zeigt ebenfalls
an, daß die
Diffusion der Substratmoleküle
oder der Produktmoleküle
die Geschwindigkeit nicht beschränkt.
Wenn Proteine durch unterschiedliche Methoden immobilisiert werden,
gibt es viele Berichte, in denen beschrieben wird, daß die Diffusion
der Substratmoleküle
in einem Film die Reaktivität
beschränkt.
Der Grund, weshalb diese Schwierigkeit bei der Verwendung eines
dünnen
Proteinfilms, der gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren
immobilisiert wurde, gelöst
wird, wird wie folgt erklärt.
Da die Ionen aus den Polyionen, welche das Protein immobilisieren, flexibel
sind, bilden sie keine hochdichte Struktur, und sie besitzen fast
molekulare Dickengröße. Dadurch
kann die Entfernung für
die Diffusion der Substratmoleküle
im wesentlichen ignoriert werden.
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Vergleichsbeispiel 16
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Gemäß Vergleichsbeispiel
16 wurde ein dünner
POD-Film (einschichtiger Film) hergestellt und in eine Substratlösung (0,2
Gew.-% H2O2 und
0,08 mg/ml DA67) eingetaucht. Das Fortschreiten der Reaktion ist
in 7(a) dargestellt. Das Umwandlungsverhältnis erhöht sich
mit der Zeit, und die Aktivität
von POD geht nicht verloren. Es ist offensichtlich, daß diese
Reaktion durch eine POD-katalysierte H2O2-Reduktionsreaktion initiiert wird.
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Vergleichsbeispiel 17
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Gemäß Vergleichsbeispiel
17 wurde ein dünner
Film, zusammengefügt
aus mehreren Proteinkomponenten, aus GOD (doppelschichtiger Film),
laminiert an einen dünnen
POD-Film (doppelschichtiger Film), hergestellt und in eine wäßrige Lösung aus
Glucose (0,01 mg/ml) und DA67 (0,008 mg/ml) eingetaucht. Das Fortschreiten
der Reaktion ist in 7(b) dargestellt,
und bei Beobachtung dieser Figur ist erkennbar, daß die Umwandlung
sich im Laufe der Zeit erhöht.
Diese Tatsache zeigt an, daß eine
Reaktion initiiert werden kann, wenn sowohl GOD als auch POD an
dem dünnen
Film immobilisiert sind, selbst wenn komplexe enzymatische Reaktionen
ablaufen, wie in 3 gezeigt. Das heißt, diese
Tatsache erläutert,
daß aufeinanderfolgende
enzymatische Reaktionen in einem dünnen Film stattfinden können, in
dem mehrere Proteinspezies immobilisiert sind.
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Vergleichsbeispiele 18
und 19
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Gemäß den Vergleichsbeispielen
18 und 19 wurden dünne
Filme, wie in Vergleichsbeispiel 5 beschrieben, hergestellt. Einer
wurde bei Atmosphärenbedingungen
gelagert, und der andere wurde in einer wäßrigen Lösung aus Puffer bei pH 7 während 2
Monaten konserviert. Nach 2 Monaten wurde die Aktivität des Proteins auf ähnliche
Weise, wie in Vergleichsbeispiel 5 beschrieben, gemessen. Die erhaltenen
Ergebnisse zeigen, daß das
Protein fast 100% Aktivität
bei den beiden oben erwähnten
Lagerungsbedingungen beibehält.
Diese Ergebnisse zeigen die lange Stabilität des ultradünnen Films
aus Protein bei der Reaktion.
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Beispiele 20 bis 22
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Gemäß Beispiel
20 wurde ein dünner
GOD-Film (vierschichtiger Film) auf einem porösen Filter immobilisiert, und
1 ml einer 10 gew.-%igen wäßrigen Lösung aus
Glucose wurde durch ihn hindurchfiltriert. Dann wurde POD/DA67 zu
dem Filtrat gegeben, und das Ultraviolett-Absorptionsspektrum wurde
gemessen. Das Ergebnis ist in 8 dargestellt.
Die UV-Absorption, die das Fortschreiten der Reaktion anzeigt, wird
gemessen. Das heißt,
in diesem Beispiel wird erläutert,
daß ein
poröser
Filter als fester Träger
für ein
enzymatisches Reaktionssystem verwendet werden kann. Gemäß Beispiel
21 wurde ein poröser
Filter direkt in eine wäßrige GOD-Lösung eingetaucht,
ohne daß Polyionen
verwendet wurden. Gemäß Beispiel
22 wurde ein poröser
Filter ohne irgendwelche Modifizierung hergestellt, und die Versuche
wurden bei den gleichen Bedingungen, wie in Beispiel 20 beschrieben,
durchgeführt.
Die Ergebnisse, die in 8 dargestellt sind, zeigen,
daß die
Reaktion nicht in allen Fällen
der Beispiele 21 und 22 verläuft.
Es ist erkennbar, daß GOD
nicht auf dem porösen
Filter bei den Verfahren der Beispiele 21 oder 22 immobilisiert
wurde, und daher läuft
die Reaktion nicht ab.
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Beispiele 23 bis 25
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Gemäß Beispiel
23 wurde ein dünner
Multikomponenten-Film aus Glucoamylase (GA) und GOD auf einem porösen Filter
immobilisiert, und eine 0,25%ige wäßrige Stärkelösung wurde durch den Filter
filtriert. Die Menge an Glucose und H2O2, die gebildet wurde, wurde geprüft (9).
GA ist ein Enzym, welches Stärke
in Glucose verwandelt, welche ein Substrat für GOD ist. Gemäß Beispiel
23 wurden zehn Schichten aus alternierendem PEI/PSS-Aufbau auf der
Oberfläche
eines Filters, laminiert mit einer dünnen GOD-Film-Vorstufe, zusammengefügt, und
ein dünner
GA-Film wurde als äußerste Schicht
immobilisiert. Beispiel 24 war ähnlich
wie Beispiel 23, aber die Reihenfolge des Zusammenfügens von
GOD und GA war umgekehrt, d.h. GA war als innerste Schicht auf dem
Filter lokalisiert, und die GOD-Schicht
wurde als äußerste Oberfläche immobilisiert. Gemäß Beispiel
25 wurde ein dünner
Film, bei dem GOD und GA gleichzeitig in einer Schicht immobilisiert waren,
hergestellt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in 9 zusammengefaßt, und
aus dieser Figur ist offensichtlich, daß die Reaktion wirksam nur
in einem Reaktor initiiert werden kann, der gemäß dem Verfahren von Beispiel
23 hergestellt worden ist, der eine GA-Schicht auf seiner äußersten Oberfläche aufweist.
Diese Tatsache wird wie folgt erklärt. Stärke, die das Substrat von GA
ist, kommt in Kontakt mit der GA-Schicht, und es wird Glucose gebildet.
Die Glucose wird dann durch GOD, lokalisiert in der inneren Schicht,
oxidiert. Im Gegensatz besitzt bei dem dünnen Film von Beispiel 24 die
GA, deren Substrat Stärke
ist und die in der innersten Schicht lokalisiert ist, nicht die
Möglichkeit,
die Stärke
zu kontaktieren, und die gesamte aufeinanderfolgende, enzymatische
Reaktion wird nicht initiiert. Bei Beispiel 25 hat nur ein Spezies
des Proteins bei dem Immobilisierungsverfahren Priorität, und die
aufeinanderfolgende Reaktion, welche zwei Spezies von Protein erfordert, wird
nicht initiiert.
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Diese
Ergebnisse zeigen, daß das
Zusammenfügen
der dünnen
Proteinfilme entsprechend der Reihenfolge der Reaktionen zur Herstellung
eines wirksamen, aufeinanderfolgenden, enzymatischen Reaktionssystems
unverzichtbar ist. Das Verfahren zur Immobilisierung der Proteine
wird durch die vorliegende Erfindung zur Verfügung gestellt, wobei die Reihenfolge
des Zusammenfügens
der Proteine kontrolliert wird. Das erfindungsgemäße Verfahren
unterscheidet sich wesentlich von dem bekannten Protein-Immobilisierungsverfahren.
Bei dem bekannten Verfahren ist die Kontrolle der Protein-Immobilisierungsreihenfolge
schwierig. Das Filtrat, das gemäß den Beispielen
23 bis 25 erhalten wurde, wird gemäß der Iod-Stärke-Reaktion
analysiert, und die Ergebnisse zeigen, daß das Stärkesubstrat in dem Filtrat
nicht nachgewiesen werden kann, unabhängig vom Fortschreiten der
Reaktion. Dieses Ergebnis zeigt, daß das Stärkesubstrat-Polymere nicht
in das Filtrat durch den porösen
Filter, welcher als fester Träger
verwendet wird, ausgetreten ist. Das heißt, in diesem System werden
die Produkte von dem Substrat direkt nach der Reaktion abgetrennt.
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Die
oben beschriebenen Beispiele sind derzeit bevorzugte erfindungsgemäße Beispiele.
Die chemische Änderung
des Substratmoleküls,
die für
ein Protein charakteristisch ist, wird mit einem dünnen Proteinfilm als
Katalysator, immobilisiert gemäß einem
alternierenden Adsorptionsverfahren, durchgeführt. Es ist möglich, eine
komplexe enzymatische Reaktion in einem dünnen Film durchzuführen, wobei
ein dünner
Film verwendet wird, bei dem mehrere Spezies aus Protein immobilisiert
sind. Die Reaktionsprodukte können
von dem Substrat direkt nach der Reaktion abgetrennt werden, wobei
ein poröser
Filter als fester Träger
verwendet wird. Das erfindungsgemäße Verfahren ist für die Immobilisierung
einer großen
Anzahl von Proteinen geeignet, und dementsprechend ist es möglich, künstliche
Reaktoren mit verschiedenen Kombinationen, bei denen enzymatische
Systeme imitiert werden, zu entwickeln oder neue Sensorsysteme,
die auf Enzymreaktionen beruhen, zu entwickeln.
