DE19816550A1 - Universell verwendbarer Aufbau eines Analysenelements und dessen Einsatz zur Analytbestimmung - Google Patents
Universell verwendbarer Aufbau eines Analysenelements und dessen Einsatz zur AnalytbestimmungInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Analysenelement zur Bestimmung eines Analyts enthaltend in oder
auf Material, das einen Flüssigkeitstransport zwischen Zonen ermöglicht, eine Probenauftrags
zone und eine hierzu flußabwärts gelegene Nachweiszone, wobei die Nachweiszone einen
Partner 1 eines spezifischen Bindungspaares 1 so immobilisiert enthält, daß er in der Lage ist,
mit Partner 2 des spezifischen Bindungspaares 1, der nicht der Analyt ist, eine Bindung einzu
gehen, wenn dieser ihn kontaktiert sowie ein Verfahren zur Bestimmung eines Analyts mittels
spezifischer Bindungspaare. Die Erfindung betrifft außerdem einen Kit zur Bestimmung eines
Analyts enthaltend ein Analyseelement.
Aus dem Stand der Technik sind Analysenelemente bekannt, die die zur Bestimmung eines
Analyts erforderlichen Reagenzien in oder auf Trägermaterialien vorliegen haben. Als Beispiele
seien hier genannt: US-Patent 4,861,711, US-Patent 5,591,645 und EP-A-0 291194. Den in
diesen Schriften beschriebenen Analysenelementen ist gemeinsam, daß sie speziell für die
Durchführung immunologischer Nachweisverfahren geeignet sind. Sie beinhalten eine Proben
auftragszone und eine hierzu flußabwärts gelegene Nachweiszone. Eine flüssige Probe durch
wandert aufgrund von Kapillarkräften innerhalb eines porösen Trägermaterials verschiedene
Zonen zwischen Probenaufgabe- und Nachweiszone und nimmt dabei die für den Nachweis des
Analyts erforderlichen Reagenzien auf und bringt sie mit dem Analyt in der Probe zur Reak
tion.
In der Nachweiszone ist ein Bindungspartner immobilisiert, der in der Lage ist, spezifisch den
zu bestimmenden Analyt zu binden. Dies erfordert, daß bei unterschiedlichen Analyten unter
schiedliche Bindungspartner für den Analyt auf einer Festphase immobilisiert werden müssen.
Aus US-Patent 4,861,711 ist aus Fig. 1 in Verbindung mit der Beschreibung, beispielsweise
in Spalte 5, Zeile 57 bis Spalte 6, Zeile 48 auch bekannt, in der Nachweiszone einen Partner 1
eines spezifischen Bindungspaares 1 zu immobilisieren, der nicht den Analyt bindet, sondern
dort universell einsetzbar ist, weil er ein Epitop als Partner 2 des spezifischen Bindungspaares
1 bindet, das auf einer Substanz vorhanden ist, die den Analyt spezifisch bindet. So wird der
bewegliche Komplex aus Analyt und diesen bindender Substanz im Verlauf der Nachweis
reaktion in der Nachweiszone fixiert und von unkomplexierten beweglichen Reaktions
komponenten abgetrennt.
Eine markierte, für den Analyt spezifische Substanz spielt eine sehr wesentliche Rolle, weil nur
deren Bindung an den Analyt und die spätere Immobilisierung des gebildeten Komplexes aus
Analyt und gegen den Analyt gerichtete markierte Substanz in der Nachweiszone sowie das
Entfernen der beweglichen unreagierten Reaktionskomponenten aus der Nachweiszone das
Vorliegen von Analyt in der flüssigen Probe zu zeigen vermag. Die aus dem Stand der Technik
bekannten markierten Substanzen sind für den Analyt spezifisch, das heißt, im Falle von
Sandwich-Assays handelt es sich um markierte Substanzen, wie Antikörper oder Antigene, die
spezifisch mit dem zu bestimmenden Analyt (Antigen oder Antikörper) reagieren. Dies erfor
dert jedoch, daß je nach Analyt unterschiedliche markierte, spezifische Bindungspartner für den
Analyt hergestellt werden müssen.
Als Markierung ist eine Vielzahl von Substanzen aus dem Stand der Technik bekannt.
Während früher radioaktive Markierungen mit allen ihren Nachteilen benutzt wurden, wurden
diese Markierungen später vor allem durch Enzymmarkierungen abgelöst. Heute werden in
Analysenelementen, wie sie in den zuvor beschriebenen Schriften des Standes der Technik be
schrieben sind, vor allem partikuläre Markierungen, insbesondere Gold- oder Latexpartikel
eingesetzt. Die Herstellung von Konjugat aus Markierung und spezifisch an den Analyt bin
dender Substanz ist aufwendig und muß, wenn unterschiedliche Analyten bestimmt werden
sollen, für jeden einzelnen analytspezifischen Bindungspartner optimiert werden. Außerdem
muß bei Analysenelementen das Material, auf dem dieses Konjugat vorliegt und transportiert
wird, optimal den Erfordernissen von Fall zu Fall angepaßt werden. Vor allem Stabilitäts
probleme sind hierbei oft zu lösen.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es deshalb, einen universell verwendbaren Aufbau
eines Analysenelementes zur Verfügung zu stellen, der unabhängig von dem zu bestimmenden
Analyt immer verwendet werden kann, sofern dieser Analyt oder eine vom Analyt abgeleitete
und diesen repräsentierende Substanz durch spezifische Paarbindung nachweisbar ist.
Diese Aufgabe wird durch den Gegenstand der Erfindung gelöst, wie er in den Ansprüchen
dargestellt ist.
Gegenstand der Erfindung ist insbesondere ein Analyseelement zur Bestimmung eines Analyts
enthaltend in oder auf Material, das einen Flüssigkeitstransport zwischen Zonen ermöglicht,
eine Probenauftragszone und eine hierzu flußabwärts gelegene Nachweiszone, wobei die
Nachweiszone Partner 1 eines spezifischen Bindungspaares 1 so immobilisiert enthält, daß er in
der Lage ist, mit Partner 2 des spezifischen Bindungspaares 1, der nicht Analyt ist, eine Bin
dung einzugehen, wenn er ihn kontaktiert, dadurch gekennzeichnet, daß flußaufwärts der
Nachweiszone ein markierter Partner 1 eines spezifischen Bindungspaares 2 auf einem Material
durch Flüssigkeit ablösbar imprägniert vorliegt und in der Lage ist, mit Partner 2 des spezi
fischen Bindungspaares 2, der nicht der Analyt ist, eine Bindung einzugehen, wenn dieser ihn
kontaktiert, wobei Partner 2 des spezifischen Bindungspaares 1 und Partner 2 des spezifischen
Bindungspaares 2 spezifisch an den zu bestimmenden Analyt gebunden oder durch Reaktion
unter Beteiligung des zu bestimmenden Analyts Teile einer von vom Analyt abgeleiteten und
diesen repräsentierenden Substanz sind.
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Kit zur Bestimmung eines Analyts enthaltend ein
Analyseelement, wie es vorstehend charakterisiert worden ist, sowie weiter enthaltend mindes
tens einen Partner aus der Gruppe Partner 2 des spezifischen Bindungspaares 1 und Partner 2
des spezifischen Bindungspaares 2.
Schließlich ist Gegenstand der Erfindung auch ein Verfahren zur Bestimmung eines Analyts
mittels spezifischer Bindungspaare dadurch gekennzeichnet, daß eine von Analyt abgeleitete
und diesen repräsentierende Substanz, die Partner 2 eines spezifischen Bindungspaares 1 und
Partner 2 eines spezifischen Bindungspaares 2 beinhaltet in einem erfindungsgemäßen
Analyseelement zur Bestimmung eines Analyts mit markiertem Partner des spezifischen Bin
dungspaares 2 in Kontakt gebracht, durch Flüssigkeitstransport in dem Analysenelement in
Richtung der flußabwärts der Probenauftragszone gelegenen Nachweiszone bewegt, in der
Nachweiszone an Partner 1 des spezifischen Bindungspaares 1 gebunden und anhand der
Markierung des Partners 1 des spezifischen Bindungspaares 2 bestimmt wird.
Wesentlich für das erfindungsgemäße Analysenelement ist, daß sich Flüssigkeit innerhalb des
Analysenelementes in Richtung auf die Nachweiszone bewegen kann. Ein solcher Flüssigkeits
fluß ist beispielsweise in einem entsprechend hergerichteten Hohlkörper durch Schwerkraft
möglich. Vorrichtungen, die einen Flüssigkeitstransport durch Zentrifugalkraft als einer Form
der Schwerkraft ermöglichen, sind beispielsweise aus EP-B 0 052 769 bekannt. Bevorzugt
enthalten erfindungsgemäße Analysenelemente jedoch saugfähige Materialien, die Flüssigkeit
durch Kapillarkraft zu bewegen vermögen. Die Materialien der einzelnen Zonen des erfin
dungsgemäßen Analysenelementes können hierbei gleich oder auch verschieden sein. Häufig
wird es so sein, daß unterschiedliche Zonen aus unterschiedlichen Materialien bestehen, wenn
diese optimal ihre Aufgabe erfüllen sollen.
Als mögliche saugfähige, kapillaraktive Materialien kommen grundsätzlich alle solche in Frage,
die generell in sogenannten "Trockentesten", wie sie beispielsweise in US-A 4,861,711, US-A
5,591,645 oder EP-A-0 291194 beschrieben sind, zur Flüssigkeitsaufnahme eingesetzt werden
können. Als vorteilhaft haben sich hierfür beispielsweise poröse Materialien, wie Membranen,
beispielsweise Nitrocellulosemembranen erwiesen. Es können jedoch auch faserige, saugfähige
Matrixmaterialien wie Vliese, Gewebe oder Gewirke eingesetzt werden. Vliese sind besonders
bevorzugt. Faserige Matrixmaterialien können Glas, Cellulose, Cellulosederivate, Polyester,
Polyamid, aber auch Viskose, Zellwolle und Polyvinylalkohol enthalten. Vliese aus Fasern auf
der Basis von Cellulose, Polymerisatfasern auf Basis von Polyester und/oder Polyamid und
einem organischen Bindemittel, das OH- und/oder Estergruppen aufweist, wie sie aus EP-B-0
326 135 bekannt sind, sind beispielsweise erfindungsgemäß einsetzbar. Vliesmaterialien, ent
haltend schmelzbare Copolyesterfasern neben Glasfasern, Polyesterfasern, Polyamidfasern,
Cellulosefasern oder Cellulosederivatefasern, wie sie in der europäischen Patentanmeldung 0
571 941 beschrieben sind, können auch in dem erfindungsgemäßen Analysenelement eingesetzt
werden. Papiere, wie beispielsweise Teebeutelpapier, sind ebenfalls gut einsetzbar.
Zur Verbesserung der Handhabung des erfindungsgemäßen Analysenelementes kann sich das
saugfähige kapillaraktive Material oder können sich unterschiedliche saugfähige, kapillaraktive
Materialien auf einem steifen Trägermaterial angeordnet befinden, welches seinerseits für
Flüssigkeit nicht durchlässig ist, den Flüssigkeitsfluß im Matrixmaterial nicht negativ beeinflußt
und sich in Bezug auf die im Analysenelement ablaufenden Reaktionen inert verhält. Bevor
zugtes Trägermaterial kann beispielsweise Polyester-Folie sein, auf der das den Flüssigkeits
transport ermöglichende Matrixmaterial befestigt ist.
In dem erfindungsgemäßen Analysenelement können die einzelnen Zonen übereinander, neben
einander oder teils übereinander und teils nebeneinander auf dem Trägermaterial angeordnet
sein. Besonders bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Analysenelement, bei dem sich Proben
auftrags- und Nachweiszone nebeneinander auf dem Trägermaterial angeordnet befinden.
Nebeneinander bedeutet in diesem Zusammenhang, daß sich diese Zonen nebeneinander in
direktem Kontakt miteinander befinden oder aber durch andere Zonen getrennt im wesent
lichen in einer Ebene angeordnet sind.
Die Probenauftragszone ist der Bereich des erfindungsgemäßen Analysenelementes, auf den die
Probe aufgegeben wird, in der bestimmt werden soll, ob ein bestimmter Analyt oder eine vom
Analyt abgeleitete und diesen repräsentierende Substanz anwesend, gegebenenfalls in welcher
Menge er bzw. sie anwesend ist.
Die Nachweiszone ist der Bereich des erfindungsgemäßen Analysenelementes, in dem die Be
stimmung erfolgt, ob der untersuchte Analyt bzw. die vom Analyt abgeleitete und diesen
repräsentierende Substanz in der auf das Analysenelement gegebenen Probe vorhanden war.
Diese Bestimmung kann qualitativ, halb quantitativ oder quantitativ sein. Halb quantitativ be
deutet hierbei, daß für den Analyt bzw. die vom Analyt abgeleitete und diesen repräsentierende
Substanz kein konkreter Konzentrationswert, sondern ein Konzentrationsbereich ermittelt
wird, in dem sich die Analytkonzentration befindet.
In der Nachweiszone befindet sich Partner 1 eines spezifischen Bindungspaares 1 so immobili
siert, daß er in der Lage ist, mit Partner 2 des spezifischen Bindungspaares 1, der nicht der
Analyt ist, eine Bindung einzugehen, wenn dieser ihn kontaktiert. Die Immobilisierung kann
durch chemische Reaktion, das heißt, durch Ausbildung einer kovalenten Bindung, erzeugt
worden sein. Sie kann aber auch durch adsorptive Kräfte erfolgen, welche alle Möglichkeiten
außer der Ausbildung kovalenter Bindungen einschließt. Häufig wird für die Nachweiszone
eine Nitrocellulosemembran verwendet, an die Proteine, aber auch Nukleinsäuren bei Impräg
nieren fest binden, ohne jedoch eine kovalente Bindung einzugehen.
Erfindungsgemäß muß sich außer Partner 1 eines spezifischen Bindungspaares 1 auch ein
markierter Partner 1 eines spezifischen Bindungspaares 2 in dem Analysenelement befinden.
Dieser Partner darf nicht immobilisiert sein, sondern muß durch Flüssigkeit ablösbar
imprägniert vorliegen, das heißt, dieser markierte Partner muß in Richtung der Nachweiszone
durch Flüssigkeit transportabel sein. Vorteilhafterweise muß dieser markierte Partner durch
möglichst wenig Flüssigkeit von dem Matrixmaterial, auf dem er imprägniert vorliegt, voll
ständig, das heißt, quantitativ, abgelöst werden können. Als Matrixmaterial haben sich hierfür
Vliese als besonders geeignet erwiesen, wie sie beispielsweise in EP-B-0 326 135 beschrieben
sind.
Spezifische Bindungspaare sind aus dem Stand der Technik bekannt und umfassen beispiels
weise Paare wie Hapten und Antikörper, Antigen und Antikörper, Lectin und Zucker oder
Saccharid, Avidin oder Streptavidin und Biotin sowie Nukleinsäure und Nukleinsäure, Ligand
und Rezeptor. Ein Antigen kann hierbei jedes Molekül sein, gegen das man experimentell in
der Lage ist, Antikörper zu erzeugen. Auch ein Antikörper oder eine bestimmte Stelle eines
Antikörpers, die als Epitop bezeichnet wird, kann ein Antigen sein und von einem Antikörper
spezifisch erkannt und gebunden werden. Unter Nukleinsäuren sollen alle möglichen Formen
von Nukleinsäuren verstanden werden, die in der Lage sind, Bindungen über komplementäre
Basen einzugehen. Speziell, aber nicht als abschließende Liste seien DNA, RNA, aber auch
Nukleinsäureanaloga, wie Peptidnukleinsäuren (PNA, siehe beispielsweise in WO 92/20702),
genannt. Ligand und Rezeptor bezeichnen ganz allgemein eine spezifische Bindungswechsel
wirkung zwischen zwei Partnern, wie beispielsweise zwischen Hormon und Hormonrezeptor.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Analysenelementes ist Partner
1 eines spezifischen Bindungspaares 1 ein Antikörper, der ein Epitop auf einem anderen Anti
körper, der gegen den Analyt gerichtet ist, erkennt. Das Epitop, gegen das der Antikörper ge
richtet ist, entspricht dann Partner 2 des spezifischen Bindungspaares 1. Ganz besonders be
vorzugt wird als Partner 1 des spezifischen Bindungspaares 1 jedoch Avidin oder Streptavidin
verwendet, welches eine spezifische Bindung mit Biotin einzugehen in der Lage ist. Biotin
bildet dann Partner 2 des spezifischen Bindungspaares 1.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Analysenelementes ist Partner
1 des spezifischen Bindungspaares 2 ein Antikörper gegen Partner 2 des spezifischen Bin
dungspaares 2. Dieser Partner 2 des spezifischen Bindungspaares 2 ist erfindungsgemäß bevor
zugt ein Hapten, vorteilhafterweise ein in der zu untersuchenden Probe nicht vorhandenes
Hapten. Ganz besonders bevorzugt wird Digitoxigenin, Digitoxin, Digoxigenin oder Digoxin
als Hapten eingesetzt.
Als Markierung des Partners 1 des spezifischen Bindungspaares 2 sind grundsätzlich alle Mar
kierungen möglich, die für Immunoassays aus dem Stand der Technik bekannt sind. Dies sind
insbesondere radioaktive Markierungen oder Enzymlabel wie beispielsweise Peroxidase, alka
lische Phosphatase oder Galaktosidase oder Fluorophore. Besonders bevorzugt werden jedoch
sogenannte Direktlabel eingesetzt, das heißt, Markierungen, die ohne weitere Handhabungs
schritte mit dem Auge durch ihre Farbe erkennbar sind. Vorteilhafte Markierungen dieser Art
sind beispielsweise in Wasser unlösliche Partikel wie Metall- oder Latexpartikel, aber auch
Pigmente wie Silicat, Ruß oder Selen. Insbesondere Metallpartikel werden erfindungsgemäß
bevorzugt als Markierung eingesetzt. Kolloidales Gold ist als Markierung besonders bevor
zugt. Die Markierung kann an Partner 1 des spezifischen Bindungspaares 2 kovalent oder auch
adsorptiv gebunden sein, wobei adsorptiv alle Möglichkeiten außer kovalenter Bindung ein
schließt. Im Falle farbiger Latexpartikel als Direktmarkierung liegt bevorzugt eine kovalente
Bindung vor. Bei kolloidalen Metallen als Direktmarkierungen, insbesondere bei kolloidalem
Gold werden vorzugsweise adsorptive Bindungen genutzt.
Die Herstellung von Antikörper-Gold-Konjugaten ist beispielsweise aus Roth, J. "The colloidal
gold marker system for light and electron microscopic cytochemistry", in Bullock, G.R. and
Petrusz, P. eds, "Techniques in Immunocytochemistry", Vol. 2., New York, Academic Press,
1983, S. 216-284 bekannt.
Der markierte Partner 1 des spezifischen Bindungspaares 2 kann sich an unterschiedlichen
Stellen des erfindungsgemäßen Analysenelementes befinden. Dies ist abhängig beispielsweise
von der beabsichtigten Reaktionsführung, von der Menge an zur Verfügung stehender Probe
bzw. abhängig von der Analytkonzentration, wenn das Analysenelement zur Bestimmung
flüssiger Proben bestimmt ist.
So kann sich der markierte Partner 1 des spezifischen Bindungspaares 2 in der Probenauftrags
zone befinden, er kann stromabwärts der Probenauftragszone zwischen Probenauftragszone
und Nachweiszone angeordnet sein oder er kann sich auch stromaufwärts der Probenauftrags
zone befinden. Zumindest der letzte Fall setzt voraus, daß das erfindungsgemäße Analysen
element außer der Probenauftragszone auch noch eine Elutionsmittelauftragszone besitzt. Eine
solche Elutionsmittelauftragszone befindet sich dann entweder stromaufwärts des Bereiches, an
dem sich der markierte Partner 1 des spezifischen Bindungspaares 2 befindet oder dieser Be
reich, wo der markierte Partner 1 des spezifischen Bindungspaares 2 vorliegt, ist identisch mit
der Elutionsmittelauftragszone. Insofern kann eine Elutionsmittelauftragszone stromaufwärts
der Probenauftragszone oder an der Stelle der Probenauftragszone auf dem erfindungs
gemäßen Analyseelement vorliegen. Eine solche Elutionsmittelauftragszone wird unabhängig
davon, wo sich der markierte Partner 1 des spezifischen Bindungspaares 2 befindet, bevorzugt
immer dann vorgesehen sein, wenn die zu untersuchende Probe nicht flüssig ist oder nicht so
viel Flüssigkeit darstellt, daß sie für die Bestimmung des Analyten, das heißt, für den Transport
des Analyten und der benötigten Reagenzien bis in die Nachweiszone, ausreicht.
Ein wie vorstehend beschriebener Aufbau eines erfindungsgemäßen Analyseelements ist uni
versell für die Bestimmung jedes Analyt geeignet, der durch spezifische Paarbindung nach
weisbar ist. Hierfür muß lediglich eine von Analyt abgeleitete und diesen repräsentierende Sub
stanz, die Partner 2 eines spezifischen Bindungspaares 1 und Partner 2 eines spezifischen Bin
dungspaares 2 beinhaltet in einem erfindungsgemäßen Analysenelement mit markiertem Partner
1 des spezifischen Bindungspaares 2 in Kontakt gebracht werden, durch Flüssigkeitstransport
in dem Analysenelement in Richtung der flußabwärts der Probenauftragszone gelegenen
Nachweiszone bewegt, in der Nachweiszone an Partner 1 des spezifischen Bindungspaares 1
gebunden und anhand der Markierung des Partners 1 des spezifischen Bindungspaares 2 be
stimmt werden. Für diese Bestimmung ist es besonders vorteilhaft, wenn bewegliche, nicht in
der Nachweiszone immobilisierte Reaktionskomponenten durch Flüssigkeit aus der Nachweis
zone entfernt werden. Wenn im Falle einer flüssigen Probe die Probenflüssigkeit zur Ent
fernung der beweglichen, nicht immobilisierten Reaktionskomponenten aus der Nachweiszone
nicht ausreicht, kann zusätzliche Flüssigkeit auf das Analysenelement aufgegeben werden,
wobei diese Aufgabe auf die Probenaufgabezone oder eine spezifische Elutionsmittelaufgabe
zone erfolgen kann.
Die den Analyt repräsentierende Substanz kann auf unterschiedliche Art und Weise erzeugt
werden. Im Falle eines Antigens als Analyt ist es beispielsweise möglich, daß der Analyt mit
zwei Antikörpern umgesetzt wird, die an den Analyt binden. Einer der beiden Antikörper trägt
hierbei Partner 2 des spezifischen Bindungspaares 1, der andere Antikörper trägt Partner 2 des
spezifischen Bindungspaares 2. Wenn der Analyt beispielsweise ein bestimmtes Epitop mehr
fach enthält, ist es möglich, daß die beiden Antikörper identisch sind. Erfindungsgemäß ist es
nicht unbedingt notwendig, daß die Mischung aus Analyt, Antikörper mit Partner 2 des spezifi
schen Bindungspaares 1 und Antikörper mit Partner 2 des spezifischen Bindungspaares 2 erst
dann mit Partner 1 des spezifischen Bindungspaares 2 auf dem erfindungsgemäßen Analysen
element in Kontakt gebracht wird, wenn der Sandwich-Komplex zwischen den beiden Anti
körpern und Analyt vollständig ausgebildet ist. Wichtig ist letztendlich, daß in der Nachweis
zone im Zeitpunkt der Bestimmung des Analysenergebnisses ein Sandwich-Komplex an
Partner 1 des spezifischen Bindungspaares 1 gebunden vorliegt. Diese Sandwich-Bildung kann
bereits bei Aufgabe der Mischung aus Analyt und den beiden Sandwich bildenden Antikörpern
auf das erfindungsgemäße Analysenelement abgeschlossen sein, sie kann sich aber auch noch
während des Flüssigkeitstransportes der Reagenzien zwischen Progenauftragszone und Nach
weiszone vollziehen. Im äußersten Fall findet die Vervollständigung der Sandwich-Reaktion in
der Nachweiszone statt. Der Begriff "von Analyt abgeleitete und diesen repräsentierende Sub
stanz" umfaßt deshalb auch eine Mischung der eine solche Substanz erzeugenden Komponen
ten, sofern diese Komponenten zumindest in der Nachweiszone die von Analyt abgeleitete und
diesen repräsentierende Substanz ergeben.
Im Falle der Bestimmung eines Antikörpers als Analyt können in Analogie zu der vorbeschrie
benen Reaktion statt der beiden Antikörper Antigene oder das Antigenepitop repräsentierende
Oligopeptide verwendet werden, wobei ein Teil der Antigenmoleküle Partner 2 des
spezifischen Bindungspaares 1 trägt und der andere Teil der Antigenmoleküle Partner 2 des
spezifischen Bindungspaares 2. Zur Bestimmung wird ein Doppelantigen-Sandwich-Komplex
aus zu bestimmenden Antikörper und je einem Antigen mit Partner 2 des spezifischen
Bindungspaares 1 und einem Antigen mit Partner 2 des spezifischen Bindungspaares 2 gebildet,
für den das zuvor für die Antigenbestimmung ausgeführte analog gilt.
Der Aufbau des erfindungsgemäß universell einsetzbaren Analysenelementes ist auch für die
Bestimmung von Nukleinsäuren hervorragend geeignet. Hierzu muß die zu bestimmende
Nukleinsäure oft vervielfältigt werden, um ausreichende Mengen für einen Nachweis zur Ver
fügung zu haben. Dies kann beispielsweise mittels der dem Fachmann bekannten Polymerase
Chain Reaction (PCR) oder Ligase Chain Reaction (LCR) erfolgen. Bei einer Vervielfältigung
mittels PCR, bei der ausgehend von einem als Primer eingesetzten Oligonukleotid Nukleotide
zu einer zu der zu bestimmenden Nukleinsäure komplementären Nukleinsäure verknüpft und
an den Primer angeknüpft werden, kann beispielsweise Partner 2 des spezifischen Bindungs
paares 1 oder Partner 2 des spezifischen Bindungspaares 2 gebunden an ein solches Nukleotid
oder einen Primer in die Kopie der Nukleinsäure eingebaut werden. Wird das so erhaltene
Amplifikationsprodukt mit Nukleinsäure hybridisiert, die Partner 2 desjenigen Bindungspaares
trägt, den die komplementäre vervielfältigte Nukleinsäure nicht aufweist, steht eine vom Analyt
abgeleitete und diesen repräsentierende Substanz zur Verfügung, die auf dem erfindungs
gemäßen Analysenelement an den in der Nachweiszone immobilisierten Partner 1 des
spezifischen Bindungspaares 1 fixiert und mit dem markierten Partner des spezifischen Bin
dungspaares 2 bestimmbar gemacht worden ist.
Desweiteren ist es möglich bei ausreichenden Nukleinsäuremengen auf eine Vervielfältigung zu
verzichten oder die Vervielfältigung der Nukleinsäure ohne Partner 2 der spezifischen Bin
dungspaare 1 oder 2 durchzuführen. Anschließend wird die den Analyt repräsentierende Sub
stanz durch Hybridisierung zweier Sonden, die jeweils Partner 2 des spezifischen Bindungs
paares 1 und Partner 2 des spezifischen Bindungspaares 2 tragen, erzeugt.
Besonders bevorzugt wird für eine Vervielfältigung von zu bestimmender Nukleinsäure ein
Partner 2 des spezifischen Bindungspaares 1 oder Partner 2 des spezifischen Bindungspaares 2
tragendes Nukleotid gemischt mit unmarkierten Nukleotiden verwendet und die vervielfältigte
Partner 2 des spezifischen Bindungspaares 1 oder Partner 2 des spezifischen Bindungspaares 2
tragende Nukleinsäure mit einer Nukleinsäure hybridisiert, die Partner 2 desjenigen
spezifischen Bindungspaares trägt, das nicht in der für die Vervielfältigung benutzten Nukleo
tidmischung vorhanden war. So wird ein Nukleinsäuredoppelstrang erhalten, in dem jeder
Strang unterschiedliche Partner von spezifischen Bindungspaaren trägt. Statt eines Partner 2
des spezifischen Bindungspaares 1 oder Partner 2 des spezifischen Bindungspaares 2 tragende
Nukleotids kann auch ein eben diesen Partner tragendes Oligonukleotid als Primer zusammen
mit unmarkierten Nukleotiden verwendet werden. Als Partner 2 des spezifischen Bindungs
paares 1 wird besonders bevorzugt Biotin und als Partner 2 des spezifischen Bindungspaares 2
ein Hapten, wie beispielsweise Fluorescein, Rhodamin, Digoxin oder ganz bevorzugt Digoxi
genin verwendet. Als besonders vorteilhaft bei der Verwendung von Primern haben sich solche
erwiesen, die biotinyliert sind.
Dadurch, daß biotinylierte Nukleotide und Primer kommerziell erhältlich sind oder Kits erhält
lich sind, mit denen solche Substanzen wie Hapten, beispielsweise Fluorescein, Rhodamin,
Digoxin oder besonders Digoxigenin tragende Nukleinsäuren oder Nukleinsäurefragmente her
zustellen sind, ist es für den Fachmann sehr leicht möglich, insbesondere für Forschungs
zwecke, von zu bestimmenden Nukleinsäuren abgeleitete und diese repräsentierende Sub
stanzen zu erhalten und mittels des erfindungsgemäßen Analysenelementes schnell und einfach
nachzuweisen.
Für die Bestimmung von Analyten ist es natürlich auch möglich, einen Kit zur Verfügung zu
stellen, der nicht nur das erfindungsgemäße, universell einsetzbare Analysenelement aufweist,
sondern auch Partner 2 des spezifischen Bindungspaares 1 oder Partner 2 des spezifischen Bin
dungspaares 2 oder beide Partner. Diese Partner sind beispielsweise an ein Nukleotid, Oligo
nukieotid, eine Nukleinsäure, einen Antikörper, ein Hapten oder ein Antigen bzw. ein Epitop
oder an ein Lectin oder an einen Rezeptor für einen Liganden konjugiert. Diese Substanzen
haben die bereits früher erläuterte Bedeutung. So ist es möglich, dem Interessierten neben dem
universell einsetzbaren Analysenelement Teile oder auch alle benötigten weiteren Reagenzien
für die Bestimmung eines speziellen Analyts zur Verfügung zu stellen. Hierbei ist es im
wesentlichen unerheblich, ob sich die Partner 2 des spezifischen Bindungspaares 1 und Partner
2 des spezifischen Bindungspaares 2 in getrennten Behältnissen oder zusammen in einem Be
hältnis befinden. Dies trifft insbesondere für solche Systeme zu, bei denen der zu bestimmende
Analyt mittels zwei Antikörpern oder mittels Antigenen über einen Sandwich-Komplex nach
gewiesen wird. Soll ein Kit zur Bestimmung einer Nukieinsäure zusammengestellt werden, ist
es vorteilhaft, daß Partner 2 des spezifischen Bindungspaares 1 oder Partner 2 des spezifischen
Bindungspaares 2 tragende Nukleotide oder Primer getrennt aufbewahrt werden von einer der
zu bestimmenden Nukleinsäure komplementären Nukleinsäure die Partner 2 desjenigen
spezifischen Bindungspaares trägt, der von dem Partner, der mit dem Nukleotid bzw. dem
Primer konjugiert ist, verschieden ist.
Das beschriebene erfindungsgemäße, universell einsetzbare Analysenelement bietet vor allem
Vorteile bei Analytbestimmungen in Forschung und Entwicklung, wo der Analyt sehr unter
schiedlich sein kann. Besonders vorteilhaft ist das erfindungsgemäße Analysenelement insbe
sondere für die Bestimmung von Nukleinsäuren einsetzbar. Nukleotide und Oligonukleotide,
die mit Partnern 2 eines spezifischen Bindungspaares 1 bzw. Partner 2 eines spezifischen Bin
dungspaares 2 konjugiert sind, sind in einer breiten Vielfalt kommerziell erhältlich. Das gleiche
trifft auch für Partner 2 eines spezifischen Bindungspaares 1 oder Partner 2 eines spezifischen
Bindungspaares 2 tragende Nukleinsäuresonden zu, die leicht mit kommerziell erhältlichen Kits
hergestellt werden können. Insbesondere Biotin und/oder Digoxin bzw. Digoxigenin tragende
Nukleinsäuresonden sind so leicht erhältlich.
Der universell einsetzbare Aufbau des erfindungsgemäßen Analysenelementes ist auch deshalb
vorteilhaft, weil üblicherweise bei Immunoassays mit markierten Bindungspartnern des Analyts
der markierte Bindungspartner eine kritische Komponente darstellt. Bisher war es üblich, je
nach Analyt einen entsprechenden markierten Bindungspartner herzustellen, für den dann auf
dem Analysenelement optimale Bedingungen für Reaktion und Lagerung geschaffen werden
mußten. Dies erforderte in der Vergangenheit einen hohen Aufwand. Mit dem erfindungs
gemäßen Analysenelement wird jetzt ein Element zur Verfügung gestellt, das universell an
wendbar ist. Die spezifischen Reagenzien können kurzfristig und zu niedrigen Kosten als
Flüssigreagenzien hergestellt werden. Optimierungsarbeit insbesondere in Bezug auf die Lager
fähigkeit solcher Reagenzien auf Analysenelementen entfällt.
Darüberhinaus ist es aber auch möglich, falls dies gewünscht wird, das erfindungsgemäße
Analysenelement nicht nur als universelles Analysenelement zusammen mit den spezifischen
Reagenzien als Flüssigreagenzien zu verwenden, sondern, ausgehend von dem erfindungs
gemäßen Analysenelement ein Analyseelement zu erzeugen, das die für den spezifischen
Nachweis eines Analyts erforderliche Gesamtheit aller Reagenzien enthält. Für einen Antigen
nachweis mittels Sandwichkomplexbildung können so beispielsweise die erforderlichen Anti
körper, sofern der eine mit Partner 2 eines spezifischen Bindungspaares 1, der andere mit
Partner 2 eines spezifischen Bindungspaares 2 konjugiert ist, auf einem erfindungsgemäßen
Analysenelement integriert vorliegen. Gleiches gilt auch für ein erfindungsgemäßes
Analysenelement, das für den Nachweis eines Antikörpers mittels Sandwichkomplexbildung
bestimmt ist. Hier liegt ein Teil des erforderlichen Antigens konjugiert mit Partner 2 eines
spezifischen Bindungspaares 1 und der andere Teil des Antigens konjugiert mit Partner 2 eines
spezifischen Bindungspaares 2 auf dem Analysenelement integriert vor. Solche Konjugate
können in einer gemeinsamen Zone oder in benachbarten, übereinander oder nebeneinander
angeordneten Zonen des erfindungsgemäßen Analysenelements angeordnet sein. Hierbei
können dann beide Konjugate in der Probenauftragszone oder eines der Konjugate in der
Probenauftragszone und das andere in einer Zone zwischen Probenauftrags- und Nachweis
zone oder beide Konjugate getrennt oder zusammen in einer Zone zwischen Probenauftrags- und
Nachweiszone untergebracht sein. Im Falle einer stromaufwärts der Probenauftragszone
angeordneten Elutionsmittelzone gibt es außer den zuvor aufgeführten Möglichkeiten auch
noch die, daß die die Partner 2 der spezifischen Bindungspaare 1 und 2 tragenden Antigene
oder Antikörper zwischen Elutionsmittel- und Probenauftragszone getrennt oder zusammen
angeordnet sind. Solche, alle erforderlichen Reagenzien zur Bestimmung eines Analyts ent
haltenden Analysenelemente beinhalten die Vorteile des erfindungsgemäßen einfachen und uni
versellen Aufbaus und sind für den Benutzer enorm einfach zu handhaben, da nur eine Probe
aufgegeben werden muß, ansonsten aber keine Handhabungsschritte mehr erforderlich sind,
bevor in der Nachweiszone das Ergebnis abgelesen wird.
Ein erfindungsgemäßes Analysenelement ist auch zur Bestimmung mindestens eines von
mehreren Analyten einsetzbar. Beispielsweise gilt es heute bei der Untersuchung von Proben
auf eine HIV-Infektion festzustellen, ob einer von mehreren möglichen Antikörpertypen,
nämlich Antikörper gegen HIV 1, gegen HIV 2 oder gegen HIV 1 Subtyp O vorhanden ist.
Die Anwesenheit von Antikörpern gegen einen Typus reichen aus, eine Probe als positiv zu
bewerten. Gegen welchen Typus die gefundenen Antikörper genau gerichtet sind, ist zumindest
bei Screeningverfahren, erst von nachgeordneter Bedeutung. Ein erfindungsgemäßes
Analysenelement, das für eine solche Bestimmung geeignet ist, enthält jeweils ein Paar von
Antigenkonjugaten gegen jeden Antikörper, auf den hin eine Probe untersucht werden soll.
Jedes Paar enthält Antigen konjuguert mit Partner 2 des spezifischen Bindungspaares 1 und
Antigen konjugiert mit Partner 2 des spezifischen Bindungspaares 2, wobei das Antigen spezi
fisch an einen bestimmten Antikörpertypus bindet. Die Antigenkonjugate können jeweils ge
trennt vorliegen. Es ist aber auch möglich, daß alle Antigenkonjugate gemischt sind und zu
sammen in einer Zone untergebracht sind. Für die Lokalisierung solcher Konjugate in einem
erfindungsgemäßen Analysenelement gelten die zuvor ganz allgemein für Konjugate von
Antigenen oder Antikörpern mit Partnern 2 von spezifischen Bindungspaaren 1 und 2 ge
machten Ausführungen.
Ein analoges Analysenelement für die Bestimmung von Influenza kann das Vorliegen von
Influenzaviren A und/oder Influenzaviren B nachweisen. Hierzu werden Konjugate von Anti
körpern gegen Influenza A-Viren mit Partnern 2 von spezifischen Bindungspaaren 1 und 2
sowie Konjugate von Antikörpern gegen Influenza-Viren B mit Partnern 2 der spezifischen
Bindungspaare 1 und 2 eingesetzt. Bei Vorliegen mindestens eines der beiden Virentypen zeigt
das erfindungsgemäße Analysenelement in der Nachweiszone einen positiven Befund an.
Darüberhinaus ist es möglich, daß ein erfindungsgemäßes Analysenelement auch noch weitere
funktionelle Zonen enthält. Beispielsweise hat es sich als vorteilhaft erwiesen für die Unter
suchung von Vollblut in dem erfindungsgemäßen Analysenelement eine Zone vorzusehen, in
der Plasma bzw. Serum als klare Flüssigkeit von Vollblut abgetrennt wird und Blutzellen zu
rückgehalten werden. Nur die klare Flüssigkeit wird dann bis in die Nachweiszone transpor
tiert. Für die Trennung von Plasma bzw. Serum aus Vollblut sind beispielsweise Glasfaservliese
geeignet, wie sie in EP-A-0 045 476 beschrieben sind. Ein solches für die Abtrennung von
Plasma bzw. Serum aus Vollblut geeignetes Medium kann beispielsweise in der Probenauf
tragszone oder zwischen Probenauftragszone und Nachweiszone angeordnet sein.
Ausgehend von dem universell einsetzbaren Aufbau des erfindungsgemäßen Analysen
elementes ist die Entwicklung von Analysenelementen, die alle Reagenzien zum Nachweis
eines oder mehrerer Analyte tragen, im Hinblick auf den bisherigen Entwicklungsaufwand
wesentlich vereinfacht und Entwicklungszeiten können so verkürzt werden.
Zwei besonders bevorzugte erfindungsgemäße Analysenelemente sind in Fig. 1 und 2 abgebil
det.
Fig. 1 zeigt ein erfindungsgemäßes universell einsetzbares Analysenelement, das auf einer
Trägerfolie (6),
eine Elutionsmittelaufgabezone (4),
eine Zone mit markiertem Partner 1 des spezifischen Bindungspaares 2 (3),
eine Probenaufgabezone (1),
eine Nachweiszone (2) mit einem farblosen Nachweisstrich (7), enthaltend immobilisierten Partner 1 des spezifischen Bindungspaares 1 und einem farblosen Kontrollstrich (8), der einen Antikörper gegen Partner 1 des spezifischen Bindungspaares 2 enthält,
sowie eine Flüssigkeitssammelzone (5) besitzt. Die Zonen sind nebeneinander, im wesentlichen in einer Ebene, auf der Trägerfolie (6) angeordnet, wobei "nebeneinander" hier jeweils eine leichte Überlappung der in Flüssigkeitstransportrichtung vorhergehenden mit der nachfolgen den Zone mit einschließt, damit der Flüssigkeitsübergang von einer Zone in die andere gewähr leistet ist.
eine Elutionsmittelaufgabezone (4),
eine Zone mit markiertem Partner 1 des spezifischen Bindungspaares 2 (3),
eine Probenaufgabezone (1),
eine Nachweiszone (2) mit einem farblosen Nachweisstrich (7), enthaltend immobilisierten Partner 1 des spezifischen Bindungspaares 1 und einem farblosen Kontrollstrich (8), der einen Antikörper gegen Partner 1 des spezifischen Bindungspaares 2 enthält,
sowie eine Flüssigkeitssammelzone (5) besitzt. Die Zonen sind nebeneinander, im wesentlichen in einer Ebene, auf der Trägerfolie (6) angeordnet, wobei "nebeneinander" hier jeweils eine leichte Überlappung der in Flüssigkeitstransportrichtung vorhergehenden mit der nachfolgen den Zone mit einschließt, damit der Flüssigkeitsübergang von einer Zone in die andere gewähr leistet ist.
Das erfindungsgemäße Analyseelement, das in Fig. 2 dargestellt ist, ist ein vollintegriertes
Analysenelement, das heißt, es besitzt alle für die Durchführung einer Analytbestimmung not
wendigen Reagenzien. Es ist außerdem für die Untersuchung von Vollblut geeignet. Auf einer
Trägerfolie (6) sind
eine Probenaufgabezone (1),
eine Zone mit den Partnern 2 der spezifischen Bindungspaare 1 und 2 (9),
eine Zone mit markiertem Partner 1 des spezifischen Bindungspaares 2 (3),
eine Plasma- bzw. Serumabtrennzone (10),
eine Nachweiszone (2) mit einem farblosen Nachweisstrich (7), enthaltend immobilisierten Partner 1 des spezifischen Bindungspaares 1, und einem farblosen Kontrollstrich (8), der einen Antikörper gegen Partner 1 des spezifischen Bindungspaares 2 enthält sowie eine Flüssigkeitssammelzone (5) nebeneinander angeordnet.
eine Probenaufgabezone (1),
eine Zone mit den Partnern 2 der spezifischen Bindungspaare 1 und 2 (9),
eine Zone mit markiertem Partner 1 des spezifischen Bindungspaares 2 (3),
eine Plasma- bzw. Serumabtrennzone (10),
eine Nachweiszone (2) mit einem farblosen Nachweisstrich (7), enthaltend immobilisierten Partner 1 des spezifischen Bindungspaares 1, und einem farblosen Kontrollstrich (8), der einen Antikörper gegen Partner 1 des spezifischen Bindungspaares 2 enthält sowie eine Flüssigkeitssammelzone (5) nebeneinander angeordnet.
Die Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele näher erläutert.
Es wurde ein Teststreifen gemäß Fig. 1 hergestellt. Auf einer 5 mm breiten und 10 cm langen
Trägerfolie (6) aus Polyester (Melinex®, 350 µm dick von Imperial Chemistry Industries,
Großbritannien) wurden mit Schmelzkleber (Dynapol® S 1358 von Hüls AG, Deutschland)
- - ein 1,5 mm dickes und 1,5 cm langes Vlies aus 100 Teilen Glasfasern (Durchmesser 0,49 bis 0,58 µm, Länge 1000 µm) und 5 Teilen Polyvinylalkoholfasern (Kuralon ®VPB 105-2 von Kuraray) mit einem Flächengewicht von 180 g/m2 als Flüssigkeitsammelzone (5),
- - eine 1,5 cm lange Cellulosenitrat-Membran (Typ CN 11301 von Sartorius, Deutschland) als Nachweiszone (2),
- - ein 8 mm langes Vlies enthaltend 80 Teile Polyesterfasern, 20 Teile Zellwolle und 20 Teile Polyvinylalkohol mit einer Dicke von 0,32 mm und einem Flächengewicht von 80 g/m2, dessen Herstellung in Beispiel 1 der europäischen Patentschrift 0 326 135 beschrieben ist als Probenaufgabezone (1),
- - ein 8 mm langes Vlies aus 80 Teilen Polyesterfasern, 20 Teilen Zellwolle und 20 Teilen Polyvinylalkoholfasern, einer Dicke von 0,32 mm und einem Flächengewicht von 80 g/m2, dessen Herstellung in der europäischen Patentschrift 0 326 135, Beispiel 1 beschrieben ist, enthaltend Goldkonjugat als Zone mit markiertem Partner des spezifischen Bindungspaares 2 (3) und
- - ein 30 mm langes Vlies (Typ Binzer TI 05 von Binzer, Deutschland) als Elutionsmittel aufgabezone (4) leicht überlappend nebeneinander befestigt.
Auf die zuvor beschriebene Zellulosenitratmembran wurden durch Strichdosierung eine
wässrige StreptavidinIösung (7 mg/ml) aufgebracht. Hierzu wurde die Dosierung so gewählt,
daß ein Strich mit einer Breite von ca. 0,5 mm entsteht. Dieser Strich (7) dient zum Nachweis
des zu bestimmenden Analyts. Die Membran wurde anschließend luftgetrocknet.
In einem Abstand von etwa 4 mm von dem Streptavidinstrich wurde durch Strichdosierung
eine wässrige Lösung eines polyklonalen Antikörpers aus Kaninchen-IgG gegen Maus IgG
(Bezugsquelle: DAKO Diagnostica GmbH, Hamburg, Deutschland) (0,5 mg/ml) aufgebracht.
Auch hier wurde die Dosierung so gewählt, daß ein Strich mit einer Breite von ca. 0,5 mm
entsteht. Dieser Strich (8) dient zur Funktionskontrolle des Teststreifens. Die Membran wurde
anschließend luftgetrocknet.
Zum Goldkonjugatvlies (3):
- - Goldsol mit einem mittleren Partikeldurchmesser von ca. 40 nm wurde nach der Methode von Frens (Frens, G., "Preparation of gold dispersions of varying particle size: controlled nucleation for the regulation of the particle size in monodisperse gold suspensions" in Nature: Physical Science 241(1973), 20-22) durch Reduktion einer 0,01 Gewichtsprozentigen Tetrachlorgoldsäurelösung unter Kochen mittels Trinatriumcitrat hergestellt.
- - Die Antikörper-Goldkonjugat-Herstellung erfolgte in Anlehnung an die Methode von Roth, J. "The colloidal gold marker system for light and electron microscopic cytochemistry" in Bullock, G.R. and Petrusz, P., eds., "Techniques in Immunocytochemistry", Vol. 2, New York, Academic Press, 1983, 216-284.
Nach dem Abkühlen der wie zuvor beschriebenen Goldsollösung auf Raumtemperatur wurde
der pH-Wert des Goldsols mit 0,2 M K2CO3 so eingestellt, daß er um 0,5 bis 1,0 pH-Einheiten
über dem isoelektrischen Punkt des Antikörpers lag. Die optische Dichte (OD) des Goldsols
(Extinktion bei 525 nm und 1 cm Lichtweg) betrug typischerweise 1,0. Zum Goldsol wurde
eine dialysierte Lösung eines monoklonalen IgG-Antikörpers gegen Digoxygenin (MAK
<Digoxygenin< IgG) (Bezugsquelle Boehringer Mannheim GmbH, Deutschland) zugegeben.
Die Menge an Antikörperlösung wurde so gewählt, daß dessen Konzentration in der Goldsol
lösung typischerweise bei 2 µg/ml lag. Nach 30 Minuten Rühren bei Raumtemperatur wurde
das Goldkonjugat durch Zugabe einer hochkonzentrierten Rinderserumalbumin-Lösung (End
konzentration in der Konjugatlösung: 1 mg/ml) abgesättigt.
Das Goldkonjugat wurde durch Ultrafiltration gegen einen 20 mM Tris-Puffer pH 8,0 auf eine
optische Dichte von typischerweise 20 aufkonzentriert. Die Konjugatlösung wurde ab
schließend auf 100 µM Brij® und 0,05 Gew.-% NaN3 aufgestockt.
- - Das so hergestellte Goldkonjugat (optische Dichte, OD = 20) wurde mit einem Tränkpuffer
in einem Volumenverhältnis 1 : 1 auf eine optische Dichte, OD = 10 eingestellt. Der Tränkpuffer
enthielt die nachfolgenden Komponenten:
1 Gew.-% Sacharose
200 mM HEPES
100 mM NaCl
140 mM Harnstoff
6 mM N-Acetylcystein
2 mM EDTA
0,1 Gew.-% Tween® 20.
Das Polyester-Zellwoll-Polyvinylalkohol-Mischvlies wurde mit einer konstanten Geschwindig
keit zunächst durch eine die Tränklösung enthaltende Wanne gezogen, anschließend durch
zwei in einem Abstand von 250 µm angeordnete Edelstahlwalzen abgequetscht und an
schließend mittels eines Umluftrockners getrocknet. Unter den beschriebenen Bedingungen be
trägt die Tränkaufnahme des Vlieses typischerweise etwa 270 ml/m2.
Ein Fragment des kryptischen Plasmides (7,5 Kb) von Chlamydia trachomatis mit 143 Basen
paaren wurde amplifiziert. Hierzu wurden die Primer des Chlamydia trachomatis Primer and
Capture Probe Set (Boehringer Mannheim, Deutschland) verwendet (Primer 1 : 20-mer, Posi
tion 274-295; Primer 2 : 24-mer, Position 393-416 rev.).
- - Markierung erfolgte mit DIG-11-dUTP (DIG steht für Digoxygenin) und einer 5'-biotin markierten Fangsonde (Boehringer Mannheim GmbH, Deutschland)
- - Der PCR-Mastermix enthielt 2,5 U Taq-Polymerase, 10 µl 10-fachen PCR-Puffer einschließ lich 25 mmolar Magnesiumchlorid, 0,2 µ molar beide Primer, 0,1 mmolar jedes Desoxynucleotid und 0,02 mmolar DIG-11-dUTP. Hieraus ergibt sich eine Markierungs stöchiometrie von 1 : 5 DIG-11-dUTP zu Desoxynnukleotide. Der Mastermix wurde durch Hinzupipettieren von 10 µl einer Lösung, die ca. 100 Kopien/µl des kryptischen Plasmid fragmentes enthielt und destilliertem Wasser auf 100 µl aufgefüllt. Der Mastermix wurde 10 min. bei 94°C geschmolzen und durchlief 35 mal einen Zyklus, bei dem er jeweils 40 Sekunden bei 94°C gehalten wurde, 30 Sekunden bei 52°C und 45 Sekunden bei 720°C. Das PCR-Pro dukt wurde in einem 2,5% Agarose-Gel kontrolliert, welches mit Ethidiumbromid gefärbt wurde.
- - Zur Hybridisierung wurde 1 µl einer 5'-biotinmarkierten Fangsonde (Position 354-374) in einer Konzentration von 30 µmolar zu 50 µl des Amplifikationsproduktes gegeben. Die mar kierte Fangsonde lag so in einer Konzentration von 0,6 µ molar vor. Die Probe wurde danach für 5 Minuten bei 95°C aufgeschmolzen und anschließend für 15 Minuten bei 37°C hybridi siert.
- - Zur Bestimmung der Nukleinsäure auf dem zuvor beschriebenen Teststreifen gemäß Fig. 1 wurden 5 µl des Hybridisierungsproduktes auf die Probenaufgabezone (1) gegeben. Danach wurde der Teststreifen mit der Elutionsmittelaufgabezone (4) für 5 Sekunden in einen Chroma tographiepuffer getaucht, wobei darauf geachtet wurde, daß die Zone (3) mit dem Gold konjugat nicht in die Flüssigkeit getaucht wurde. Der Chromatographiepuffer hatte die folgende Zusammensetzung: 0,9 Gew.-% Kochsalz, 50 mM Kaliumphosphat, 0,09 Gew.-% Natriumazid, 2 Gew.-% Rinderplasmaalbumin und 0,25 Gew.-% Tween® 20.
Nach 10 Minuten war der Chromatographiepuffer aus der Elutionsmittelaufgabezone (4) bis in
die Flüssigkeitssammelzone (5) gewandert. In der Nachweiszone (2) waren 2 rote Striche
deutlich sichtbar, wobei der rote Nachweisstrich (enthaltend Streptavidin) einen positiven
Befund signalisiert und der rote Kontrollstrich (enthaltend PAK <MAUS Fcγ<) die ordnungs
genmäße Funktion des Analysenelementes.
Es wurde ein Teststreifen gemäß Fig. 1 hergestellt. Die Bestandteile des Analysenelementes
waren bis auf den Kontrollstrich in der Nachweiszone (2) identisch mit den in Beispiel 1 be
schriebenen. Für den Kontrollstrich war hier eine Lösung eines polyklonalen Antikörpers aus
Kaninchen-IgG gegen Maus-IgG verwendet worden (Bezugsquelle: DAKO Diagnostica
GmbH, Hamburg, Deutschland).
Antikörper zum Nachweis des Nukleoproteins von Influenza A- und Influenza B-Viren wurden
erhalten von Fitzgerald Industries Int., Concord, Massachusetts, USA.
- - Zur Herstellung eines biotinmarkierten monoklonalen Antikörpers aus Maus-IgG gegen das Nukleoprotein von Influenza A wurde zu einer Lösung von 20 mg/ml Antikörper in 0,1 M Kaliumphosphat pH 8,5 ein Succinimidesterderivat des Biotins in einem 6-fachen molaren Überschuß zugegeben. Der Ansatz wurde für 90 Minuten bei 25°C unter Rühren inkubiert. Die Reaktion wurde durch Aufstockung der Lösung mit Lysin auf eine Endkonzentration von 10 mM abgestoppt. Das überschüssige Biotinylierungsreagenz wurde durch Dialyse entfernt und die Lösung eingefroren.
- - Für die Herstellung eines biotinylierten monoklonalen Antikörpers gegen das Nukleoprotein von Influenza B wurde analog vorgegangen.
- - Zur Herstellung eines digoxigenylierten monoklonalen Antikörpers gegen das Nukleoprotein von Influenza A wurde zu einer Lösung von 10 mg/ml des monoklonalen Antikörpers in 0,1 M Kaliumphosphat ein in Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöstes Succinimidester-Derivat des Digoxigenins in einem 4-fachen molaren Überschuß so zugegeben, daß die Endkonzentration an DMSO in der Lösung 5 Vol.% betrug. Der Ansatz wurde für 60 Minuten bei 25°C unter Rühren inkubiert. Die Reaktion wurde danach durch Zugabe einer 1 molaren wässrigen Lysin lösung abgestoppt, so daß die Endkonzentration an Lysin 10 mM war. Das überschüssige Digoxigenylierungsreagenz wurde mittels Dialyse gegen einen 20 mM Kaliumphosphatpuffer pH 8,0 entfernt und die Lösung bis zur Benutzung eingefroren.
- - Die Herstellung eines digoxigenylierten monoklonalen Antikörpers gegen das Nukleoprotein von Influenza B erfolgte analog zu der vorbeschriebenen Digoxigenylierung des monoklonalen Antikörpers gegen das Nukleoprotein von Influenza A.
Die verwendeten Influenza A- und Influenza B-Antikörper sind typspezifisch, das heißt, der
Influenza A-Antikörper erkennt lediglich das Nukleoprotein aus Influenza A-Viren, während
der monoklonale Influenza B-Antikörper lediglich das Nukleoprotein aus Influenza B-Viren
erkennt. Die Antikörper sind jedoch nicht Subtyp-spezifisch, das heißt, der monoklonale Anti
körper gegen Influenza A erkennt alle Influenza A-Subtypen.
Als Probenmaterial zum Beleg der Sensitivität des erfindungsgemäßen Analysenelements
wurden verdünnte Viruskulturüberstände verwendet. Die Viruskultivierung erfolgte auf
MDCK-Zellen, einem permanenten Hundenierenzellstamm. Die Bebrühtung erfolgte im
üblichen Kulturmedium für etwa 7 Tage bei 33°C. Als Vertreter für Influenza A wurde der
Subtpy H3N2 (Stamm Beijing 32/92), als Vertreter für Influenza B der Stamm B/Harbin7/94
kultiviert. Die Kulturüberstände wurden mit Kulturmedium in Zweierschritten verdünnt.
Von jeder unterschiedlichen Verdünnung wurden 65 µl Kulturüberstand, 15 µl Lysepuffer (6%
Zwittergent® 3-10 in Rinderserumalbumin enthaltender physiologischer Kochsalzlösung) und
jeweils 5 µl einer Lösung von biotinyliertem monoklonalen Antikörper gegen Influenza A und
digoxigenylierten monoklonalen Antikörper gegen Influenza A zum Nachweis von Influenza A
bzw. je 5 µl einer Lösung von biotinyliertem monoklonalen Antikörper gegen Influenza B und
digoxigenyliertem monoklonalen Antikörper gegen Influenza B in ein Eppendorf-Gefäß
pipettiert (die Konzentration der Antikörperkonjugatstammlösungen betrug jeweils 20 µg/ml).
Die lysierte Probe wurde kurz durch Schütteln homogenisiert und anschließend 80 µl auf
das Goldkonjugatvlies (3) des Teststreifens gemäß Fig. 1 pipettiert. Anschließend wurden die
Teststreifen für ca. 5 Sekunden mit der Elutionsmittelaufgabezone (4) in den Chromato
graphiepuffer (0,9 Gew.-% Kochsalz, 50 mM Kaliumphosphat, 0,09 Gew.-% Natriumazid, 2
Gew.-% Rinderplasmaalbumin und 0,25 Gew.-% Tween® 20) getaucht. Das Testergebnis
wurde nach 10 Minuten in der Nachweiszone (2) abgelesen.
Beim Influenza A-Kulturüberstand konnte bis zu einer Kulturverdünnung von 1 : 64 ein roter
Nachweisstrich zum Zeichen eines positiven Befundes erkannt werden. Beim Influenza B-Kultur
überstand wurden die Verdünnungen bis zur Stufe 1 : 128 positiv erkannt. Der Kontroll
strich zeigte durch seine rote Farbe in allen Fällen die ordnungsgemäße Funktion des Test
streifens an.
Es wurde ein Teststreifen gemäß Fig. 2 hergestellt. Auf einer 4 mm breiten und 10 cm langen
Trägerfolie (6) aus Polyester (Melinex®, 350 µm dick von Imperial Chemistry Industries,
Großbritannien) wurden mit Schmelzkleber (Dynapol® S 1358 von Hüls AG, Deutschland)
- - ein 0,9 mm dickes und 1,4 cm langes Vlies aus 100 Teilen Glasfasern (Durchmesser 0,49 bis 0,58 µm, Länge 1000 µm) und 5 Teilen Polyvinylalkoholfasern (Kuralon ®VPB 105-2 von Kuraray) mit einem Flächengewicht von 100 g/m2 als Flüssigkeitsammelzone (5),
- - eine 1,5 cm lange Cellulosenitrat-Membran (Typ CN 11301 von Sartorius, Deutschland) als Nachweiszone (2),
- - ein 1,2 cm langes Vlies aus 100 Teilen Glasfasern (Durchmesser 0,49 bis 0,58 µm, Länge 100 µm) und 5 Teilen Polyvinylalkoholfasern ((Kuralon ®VPB 105-2 von Kuraray) mit einem Flächengewicht von 100 g/m2, das mit Brij® (1 Gew.-%ig) imprägniert ist als Plasma- bzw. Serumtrennzone (10),
- - ein 12 mm langes Vlies aus 80 Teilen Polyesterfasern, 20 Teilen Zellwolle und 20 Teilen Polyvinylalkoholfasern, einer Dicke von 0,32 mm und einem Flächengewicht von 80 g/m2, dessen Herstellung in der europäischen Patentschrift 0 326 135, Beispiel 1 beschrieben ist, ent haltend Goldkonjugat als Zone mit markiertem Partner des spezifischen Bindungspaares 2 (3),
- - ein 12 mm langes Vlies aus 80 Teilen Polyesterfasern, 20 Teilen Zellwolle und 20 Teilen Poylvinylalkoholfasern, einer Dicke von 0,32 mm und einem Flächengewicht von 80 g/m2, dessen Herstellung in der europäischen Patentschrift 0 326 135, Beispiel 1, beschrieben ist, enthaltend digoxigenylierte und biotinylierte HIV-Antigene als Zone mit den Partnern 2 der spezifischen Bindungspaare 1 und 2 (9) und
- - ein 8 mm langes Polyestergewebe (PE 280 HC von Seidengaze Thal, Schweiz) mit Netzmittel imprägniert als Probenaufgabezone (1) leicht überlappend nebeneinander befestigt.
Zur Nachweiszone (2):
Auf die zuvor beschriebene Zellulosenitratmembran wurden durch Strichdosierung eine wässrige Streptavidinlösung (4 mg/ml) aufgebracht. Hierzu wurde die Dosierung so gewählt, daß ein Strich mit einer Breite von ca. 0,4 mm entsteht. Dieser Strich dient zum Nachweis von HIV-Antikörpern. Die Membran wurde anschließend luftgetrocknet.
Auf die zuvor beschriebene Zellulosenitratmembran wurden durch Strichdosierung eine wässrige Streptavidinlösung (4 mg/ml) aufgebracht. Hierzu wurde die Dosierung so gewählt, daß ein Strich mit einer Breite von ca. 0,4 mm entsteht. Dieser Strich dient zum Nachweis von HIV-Antikörpern. Die Membran wurde anschließend luftgetrocknet.
In einem Abstand von etwa 4 mm von dem Streptavidinstrich wurde durch Strichdosierung
eine wässrige Lösung eines polyklonalen Antikörpers aus Kaninchen-IgG gegen Maus-IgG
(Bezugsquelle: DAKO Diagnostica GmbH, Hamburg, Deutschland) (0,5 mg/ml) aufge
bracht. Auch hier wurde die Dosierung so gewählt, daß ein Strich mit einer Breite von ca. 0,4
mm entsteht. Dieser Strich (8) dient zur Funktionskontrolle des Teststreifens. Die Membran
wurde anschließend luftgetrocknet.
Zum Goldkonjugatvlies (3):
- - Goldsol mit einem mittleren Partikeldurchmesser von ca. 40 nm wurde, wie in Beispiel 1a beschrieben, hergestellt.
- - Auch die Antikörper-Goldkonjugat-Herstellung erfolgte wie in Beispiel 1a beschrieben.
Das so hergestellte Goldkonjugat (optische Dichte, OD = 20) wurde mit einem Tränkpuffer
auf eine optische Dichte, OD = 3 (Extinktion bis 525 nm und 1 cm Lichtweg) eingestellt. Der
Tränkpuffer enthielt die nachfolgenden Komponenten:
100 mM HEPES, pH 7,5
50 mM NaCl
0,5 Gew.-% Saccharose
70 mM Harnstoff
3 mM N-Acetylcystein
1 mM EDTA und
0,1 Gew.-% Tween® 20.
100 mM HEPES, pH 7,5
50 mM NaCl
0,5 Gew.-% Saccharose
70 mM Harnstoff
3 mM N-Acetylcystein
1 mM EDTA und
0,1 Gew.-% Tween® 20.
Das Polyester-Zellwoll-Polyvinylalkohol-Mischvlies wurde mit einer konstanten Geschwindig
keit zunächst durch eine die Tränklösung enthaltende Wanne gezogen, anschließend durch
zwei in einem Abstand von 250 µm angeordnete Edelstahlwalzen abgequetscht und an
schließend mittels eines Umluftrockners getrocknet. Unter den beschriebenen Bedingungen be
trägt die Tränkaufnahme des Vlieses typischerweise etwa 270 ml/m2.
Zum Vlies (9) enthaltend digoxigenylierte und biotinylierte HIV-Antigene:
Die Herstellung digoxigenylierter Peptide bzw. biotinylierter Peptide aus dem Bereich gp 41 von HIV I sind in der internationalen Patentanmeldung PCT/EP 95/02921 in Beispiel 1 be schrieben. Die jeweiligen Peptide kamen jeweils paarweise als Digoxigenin- und Biotinderivate zum Einsatz. Ihre Ansatzkonzentrationen in der Tränklösung lagen zwischen 0,7.10-7 Mol/l und 3.10-7 Mol/l. Die Tränklösung enthielt darüber hinaus
100 mM MES-Puffer, pH 6,0
50 mM NaCl
2 Gew.-% Saccharose
1 Gew.-% Rinderserumalbumin
3 mM N-Acetylcystein
0,06 Gew.-% Tween® 20
1 mM EDTA.
Die Herstellung digoxigenylierter Peptide bzw. biotinylierter Peptide aus dem Bereich gp 41 von HIV I sind in der internationalen Patentanmeldung PCT/EP 95/02921 in Beispiel 1 be schrieben. Die jeweiligen Peptide kamen jeweils paarweise als Digoxigenin- und Biotinderivate zum Einsatz. Ihre Ansatzkonzentrationen in der Tränklösung lagen zwischen 0,7.10-7 Mol/l und 3.10-7 Mol/l. Die Tränklösung enthielt darüber hinaus
100 mM MES-Puffer, pH 6,0
50 mM NaCl
2 Gew.-% Saccharose
1 Gew.-% Rinderserumalbumin
3 mM N-Acetylcystein
0,06 Gew.-% Tween® 20
1 mM EDTA.
Das Polyester-Zellwoll-Polyvinylalkohol-Mischvlies wurde in dieser Tränklösung imprägniert
und anschließend mittels eines Umlufttrockners getrocknet. Die Trankaufnahme beträgt
typischerweise etwa 270 ml/m2.
Auf die Probenaufgabezone (1) des zuvor beschriebenen Teststreifens gemäß Fig. 2 wurden
etwa 60 µl Probenvolumen (Plasma bzw. Serum) aufgegeben. Nach 15 minütiger Wartezeit
wurde die Nachweiszone (2) visuell ausgewertet. Ein rotvioletter Strich in der Position der
Kontrollinie (8) bedeutet nichtreaktive Probe (keine HIV-Infektion nachweisbar). Zwei rot
violette Striche, einer in der Position der Kontrollinie (8) und einer in der Position der Nach
weislinie (7) bedeuten reaktive Probe (HIV-Infektion nachweisbar).
Claims (26)
1. Analyseelement zur Bestimmung eines Analyts enthaltend in oder auf Material, das einen
Flüssigkeitstransport zwischen Zonen ermöglicht, eine Probenauftragszone und eine hierzu
flußabwärts gelegene Nachweiszone, wobei die Nachweiszone Partner 1 eines spezifischen
Bindungspaares 1 so immobilisiert enthält, daß er in der Lage ist, mit Partner 2 des spezi
fischen Bindungspaares 1, der nicht Analyt ist, eine Bindung einzugehen, wenn er ihn
kontaktiert,
dadurch gekennzeichnet, daß
flußaufwärts der Nachweiszone ein markierter Partner 1 eines spezifischen Bindungs
paares 2 auf einem Material durch Flüssigkeit ablösbar imprägniert vorliegt und in der
Lage ist, mit Partner 2 des spezifischen Bindungspaares 2, der nicht der Analyt ist, eine
Bindung einzugehen, wenn dieser ihn kontaktiert.
2. Analyseelement gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zusammengehörige
Partner von spezifischen Bindungspaaren ausgewählt sind aus der Gruppe Hapten und
Antikörper, Antigen und Antikörper, Lectin und Zucker/Saccharid, Ligand und
Rezeptor, Avidin/Streptavidin und Biotin, Nukleinsäure und Nukieinsäure.
3. Analyseelement gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Partner 1 des spezifi
schen Bindungspaares 1 Avidin oder Streptavidin ist.
4. Analyseelement gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Partner 1 des spezifi
schen Bindungspaares 2 ein Antikörper gegen Partner 2 des spezifischen Bindungspaares 2
ist.
5. Analyseelement gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß Partner 1 des spezifi
schen Bindungspaares 2 ein Antikörper gegen Digoxigenin oder Digoxin ist.
6. Analyseelement gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Partner 1 des spezifi
schen Bindungspaares 2 mit einem Enzym- oder Direktlabel markiert ist.
7. Analyseelement gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß als Direktlabel Metall- oder
Latexpartikel verwendet werden.
8. Analyseelement gemäß einem der Ansprüche 1-7, dadurch gekennzeichnet, daß sich der
markierte Partner 1 des spezifischen Bindungspaares 2 in der Probenauftragszone ange
ordnet befindet.
9. Analyseelement gemäß einem der Ansprüche 1-7, dadurch gekennzeichnet, daß der mar
kierte Partner 1 des spezifischen Bindungspaares 2 in einer Zone flußaufwärts der Proben
auftragszone angeordnet ist, wenn sich flußaufwärts der Zone mit diesem markierten
Partner noch eine Elutionsmittelauftragszone befindet oder die Zone mit dem markierten
Partner auch eine Elutionsmittelauftragszone ist.
10. Analyseelement gemäß einem der Anspruch 1-7, dadurch gekennzeichnet, daß die Proben
auftragszone auch eine Elutionsmittelauftragszone ist.
11. Analyseelement gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß sich der markierte
Partner 1 des spezifischen Bindungspaares 2 stromabwärts der Probenauftrags- und Elu
tionsmittelauftragszone befindet.
12. Analyseelement gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß sich der markierte
Partner 1 des spezifischen Bindungspaares 2 in der Probenauftrags- und Elutionsmittelauf
tragszone befindet.
13. Analyseelement gemäß einem der Ansprüche 1-12, dadurch gekennzeichnet, daß es zu
sätzlich Konjugat von Antikörper gegen ein zu bestimmendes Antigen oder Hapten mit
Partner 2 des spezifischen Bindungspaares 1 und Konjugat von Antikörper gegen das
gleiche Antigen oder Hapten mit Partner 2 des spezifischen Bindungspaares 2 enthält.
14. Analyseelement gemäß einem der Ansprüche 1-12, dadurch gekennzeichnet, daß es zu
sätzlich Konjugat von Antigen, Hapten oder Oligopeptid gegen einen zu bestimmenden
Antikörper mit Partner 2 des spezifischen Bindungspaares 1 und Konjugat von Antigen,
Hapten oder Oligopeptid gegen den gleichen zu bestimmenden Antikörper mit Partner 2
des spezifischen Bindungspaares 2 enthält.
15. Verfahren zur Bestimmung eines Analyts mittels spezifischer Bindungspaare,
dadurch gekennzeichnet, daß
eine von Analyt abgeleitete und diesen repräsentierende Substanz, die Partner 2 eines
spezifischen Bindungspaares 1 und Partner 2 eines spezifischen Bindungspaares 2 bein
haltet in einem Analyseelement zur Bestimmung eines Analyts gemäß Patentansprüchen 1-14
mit markiertem Partner des spezifischen Bindungspaares 2 in Kontakt gebracht, durch
Flüssigkeitstransport in dem Analysenelement in Richtung der flußabwärts der Probenauf
tragszone gelegenen Nachweiszone bewegt, in der Nachweiszone an Partner 1 des spezifi
schen Bindungspaares 1 gebunden und anhand der Markierung des Partners 1 des spezifi
schen Bindungspaares 2 bestimmt wird.
16. Verfahren gemäß Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß für die Herstellung der von
Analyt abgeleiteten und diesen repräsentierenden Substanz Analyt mit Antikörpern ver
setzt wird, die an den Analyt binden, wobei ein Teil der Antikörper Partner 2 des
spezifischen Bindungspaares 1 und der andere Teil der Antikörper Partner 2 des
spezifischen Bindungspaares 2 trägt.
17. Verfahren gemäß Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß für die Herstellung der von
Analyt abgeleiteten und diesen repräsentierenden Substanz Analyt mit Antigenen,
Haptenen oder Oligopeptiden versetzt wird, wobei ein Teil der Antigene, Haptene oder
Oligopeptide Partner 2 des spezifischen Bindungspaares 1 und der andere Teil der
Antigene, Haptene oder Oligopeptide Partner 2 des spezifischen Bindungspaares 2 trägt.
18. Verfahren gemäß Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß der Analyt eine Nuklein
säure ist, die vervielfältigt wird, hierbei Partner 2 des spezifischen Bindungspaares 1 oder
Partner 2 des spezifischen Bindungspaares 2 gebunden an ein Nukleotid oder ein Oligo
nukieotid in die Kopie der Nukleinsäure eingebaut und das Amplifikationsprodukt mit
Nukleinsäure hybridisiert wird, die Partner 2 desjenigen Bindungspaares trägt, den die
komplementäre Nukleinsäure nicht aufweist.
19. Verfahren gemäß Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß der Analyt eine Nuklein
säure ist, die mit 2 Nukleinsäuresonden hybridisiert wird, wobei die eine Partner 2 des
spezifischen Bindungspaares 1 und die andere Partner 2 des spezifischen Bindungspaares 2
enthält.
20. Kit zur Bestimmung eines Analyts enthaltend ein Analyseelement gemäß Patentansprüche
1-14 und mindestens einen Partner aus der Gruppe Partner 2 des spezifischen Bindungs
paares 1 und Partner 2 des spezifischen Bindungspaares 2.
21. Kit gemäß Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß sich Partner 2 des spezifischen Bin
dungspaares 1 und Partner 2 des spezifischen Bindungspaares 2 in getrennten Behältnissen
befinden.
22. Kit gemäß Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß Partner 2 des spezifischen Bin
dungspaares 1 und Partner 2 des spezifischen Bindungspaares 2 zusammen in einem Be
hältnis aufbewahrt werden.
23. Kit gemäß einem der Ansprüche 20-22, dadurch gekennzeichnet, daß Partner 2 des spezi
fischen Bindungspaares 1 an ein Nukleotid, Oligonukleotid, eine Nukleinsäure, einen Anti
körper, ein Hapten oder Antigen bzw. ein Antigen repräsentierendes Epitop oder ein
Lectin oder einen Rezeptor für einen Liganden konjugiert ist.
24. Kit gemäß Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß Partner 2 des spezifischen Bin
dungspaares 1 Biotin ist.
25. Kit gemäß einem der Ansprüche 20-22, dadurch gekennzeichnet, daß Partner 2 des spezi
fischen Bindungspaares 2 an ein Nukleotid, Oligonukleotid, eine Nukleinsäure, einen Anti
körper, ein Hapten oder Antigen bzw. ein Antigen repräsentierendes Epitop oder ein
Lectin oder einen Rezeptor für einen Liganden konjugiert ist.
26. Kit gemäß Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß Partner 2 des spezifischen Bin
dungspaares 2 ein Hapten, bevorzugt Digoxigenin oder Digoxin ist.
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