DE19913862A1 - Biotransformation of compound with poor solubility in water, especially terfenadine, involves reaction in aqueous medium in bioreactor and in situ substrate and product separation - Google Patents
Biotransformation of compound with poor solubility in water, especially terfenadine, involves reaction in aqueous medium in bioreactor and in situ substrate and product separationInfo
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Abstract
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Umsetzung von in Wasser schwer löslichen Verbindungen in einem wäßrigen Milieu mittels eines Biokatalysators.The invention relates to a process for the reaction of sparingly soluble in water Compounds in an aqueous medium by means of a biocatalyst.
Die Umsetzung schlecht wasserlöslicher Substrate mit biologischen Systemen ist im einfachen Satzreaktor meist unökonomisch, wenn aufgrund geringer Wasserlöslichkeit nur geringe Substratkonzentrationen vorgelegt und damit geringe Produktkonzentrationen erreicht werden. Dies gilt gleichermaßen für eine Umsetzung mit einem zellfreien System, wobei die Umsetzung mit reinen Enzymen durchgeführt wird, als für eine Umsetzung mit bestimmten ausgesuchten Zellen.The implementation of poorly water-soluble substrates with biological systems is simple Sampling reactor usually uneconomical, if due to low water solubility only small Substrate concentrations submitted and thus low product concentrations can be achieved. This applies equally to an implementation with a cell-free system, the implementation is carried out with pure enzymes, as for an implementation with certain selected Cells.
Eine erste Verbesserung sieht vor, das Verfahren kontinuierlich mit Rückhaltung des Katalysators im Reaktionsraum durchzuführen. Diese Ausführung führt zu einer Verbesserung der Produktivität durch eine entsprechende Erhöhung der Raum-Zeit-Ausbeute und dadurch zu einer Verringerung der Kapitalkosten. Die Produktkonzentration im Reaktionsraum bleibt jedoch weiterhin niedrig. Darüberhinaus muß unter Umständen noch eine Abtrennung des nicht umgesetzten Restsubstrates vom Produkt erfolgen.A first improvement provides for the process to be continuous with retention of the Perform catalyst in the reaction chamber. This embodiment leads to an improvement productivity by a corresponding increase in the space-time yield and thereby a reduction in the cost of capital. The product concentration in the reaction space remains but still low. In addition, may still have a separation of not Reacted residual substrate made of the product.
Daher sieht eine weitere Verbesserung vor, dem Reaktionssystem üblicherweise eine organische Phase als zweite nichtmischbare Flüssigphase zuzusetzen. Diese organische Flüssigphase wird so gewählt, daß aufgrund des Verteilungskoeffizienten des Substrates zwischen organischer Phase und Wasserphase keine Übersättigung der wäßrigen Phase eintreten kann, in der die Reaktion stattfindet. Die organische Phase stellt also ein Substratreservoir dar. Gleichzeitig dient diese nicht mischbare organische Phase zur Extraktion des bei der Reaktion gebildeten Produktes. Durch eine "Mixer-Settler"-Anordnung wird die organische Phase nach Ablauf der Reaktion von der wäßrigen Phase mit dem Biokatalysator getrennt. In der organischen Phase können damit hohe Produktkonzentrationen erreicht werden. Der Auswahl der organischen Phase ist dabei selbstverständlich nicht frei, sondern wird durch das Löslichkeitsverhalten der umzusetzenden Verbindung vorgegeben.Therefore, a further improvement, the reaction system usually provides a Add organic phase as the second immiscible liquid phase. This organic Liquid phase is chosen so that due to the distribution coefficient of the substrate between organic phase and water phase no supersaturation of the aqueous phase can occur in which the reaction takes place. So the organic phase stops Substrate reservoir. At the same time serves this immiscible organic phase for extraction of the product formed in the reaction. Through a "mixer-settler" arrangement is the organic phase after the reaction of the aqueous phase with the biocatalyst separated. High product concentrations can be achieved in the organic phase become. The selection of the organic phase is of course not free, but is dictated by the solubility behavior of the compound to be reacted.
Die Verwendung einer organischen Phase, die ideale Verteilungskoeffizienten für Substrat und Produkt ermöglicht, führt jedoch oft zu einer Zerstörung des biologischen Katalysators in der wäßrigen Phase. Sowohl Proteine als auch intakte Zellen reagieren sehr empfindlich auf das Vorhandensein nicht-physiologischer Komponenten in ihrem Umfeld und bereits relativ geringe Mengen organischer Lösungsmittel können eine Denaturierung der Proteine oder eine Abnahme der Vitalität der Zellen hervorrufen. Zur Lösung dieses Problems wird deswegen versucht, durch den Einsatz von Membranverfahren einen direkten Kontakt zwischen Biokatalysator und organischer Phase zu verhindern. Die Bereitstellung einer großen Phasentrennfläche ist jedoch umständlich und scheidet dadurch sogar völlig aus, wenn das Verfahren in größerem Maßstab betrieben werden soll.The use of an organic phase, the ideal distribution coefficients for substrate and Product allows, but often leads to destruction of the biological catalyst in the aqueous phase. Both proteins and intact cells are very sensitive to this Presence of non-physiological components in their environment and already relatively low Amounts of organic solvents may denature the proteins or a Decrease the vitality of the cells. To solve this problem is why attempts to establish direct contact between them through the use of membrane techniques Biocatalyst and prevent organic phase. The provision of a large Phase separation surface is cumbersome and thus excretes even completely, if the Process should be operated on a larger scale.
Ein anderer Ansatz zur Bereitstellung von schlecht wasserlöslichem Substrat ist die Suspendierung des Substrates als mikrokristalliner Feststoff im wäßrigen Reaktionsmedium ("mikrokristalline Feststoff-Fermentation"). Das während der Reaktion gebildete Produkt fällt in der Regel ebenfalls im Reaktor aus, so daß nach vollständigem Umsatz lediglich eine Fest- Flüssig- und eine Fest-Fest-Trennung durchgeführt werden muß, um das Produkt zu erhalten. Dieses Verfahren ist jedoch nicht anwendbar, wenn das gebildete Produkt bei Konzentrationen unterhalb der Sättigungsgrenze für den Biokatalysator toxisch ist und ist auch wenig praktikabel, wenn bei der Reaktion eine Produkthemmung eintritt.Another approach to providing poorly water-soluble substrate is the Suspension of the substrate as a microcrystalline solid in the aqueous reaction medium ("microcrystalline solid fermentation"). The product formed during the reaction falls into usually also in the reactor, so that after complete Liquid and a solid-solid separation must be performed to obtain the product. However, this method is not applicable if the product formed at concentrations below the saturation limit for the biocatalyst is toxic and is also low practicable if product inhibition occurs during the reaction.
Es steht somit kein befriedigendes Verfahren zur Verfügung, um schlecht in Wasser lösliche Verbindungen mit Einsatz biologischer Hilfsmittel umzusetzen. Ein solches Verfahren wird jedoch als sehr wünschenswert angesehen, da die rein chemischen Umsetzungen, die selbstverständlich unter Einsatz sämtlicher verfügbarer organischer Lösungsmittel durchgeführt werden können, häufig nicht die gewünschte Reaktionsselektivität besitzen, was z. B. bei stereoselektiven Synthesen einen großen Nachteil darstellen kann. Außerdem wird man in solchen Fällen, wo das Produkt der Umsetzung an Versuchstieren oder Menschen verabreicht werden soll, sicherlich ein Herstellverfahren, das ohne Einsatz möglicherweise toxischer Lösungsmittel auskommt, bevorzugen.There is thus no satisfactory method available to poorly soluble in water Implement compounds using biological aids. Such a procedure will However, considered as very desirable because the purely chemical reactions, the of course using all available organic solvents often can not have the desired reaction selectivity, which z. B. at stereoselective syntheses can be a major disadvantage. You will also be in such cases where the product is administered to experimental animals or humans certainly, a manufacturing process that may be more toxic without use Solvents get along, prefer.
Es war die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Umsetzung einer ersten, schlecht in Wasser löslichen Verbindung (Substrat) in eine zweite Verbindung (Produkt) verfügbar zu stellen, das unter Einsatz biologischer Hilfsmittel abläuft und zu einer akzeptablen Ausbeute führt. Das Verfahren soll insbesondere geeignet sein, in technischem Maßstab benutzt zu werden. Außerdem soll das Verfahren sich zur Herstellung von jeglichen Produkten eignen, wobei es z. B. keine Rolle spielt, ob diese Produkte mehr oder weniger toxisch für den Biokatalysator sind.It was the object of the present invention to provide a method for implementing a first, poorly water-soluble compound (substrate) in a second compound (product) available using biological aids and becoming acceptable Yield leads. The method should be particularly suitable, on an industrial scale to be used. In addition, the process is intended to produce any Products are suitable, it being z. B. does not matter if these products more or less toxic to the biocatalyst.
Die Aufgabe wird dadurch gelöst, daß eine Trennung der Bestandteile des Verfahrens vorgenommen wird, wobei die erste Verbindung und der Biokatalysator in dem Bioreaktor verbleiben und die zweite Verbindung aus dem Bioreaktor ausgeschieden wird.The object is achieved in that a separation of the components of the process is made, wherein the first compound and the biocatalyst in the bioreactor remain and the second compound is eliminated from the bioreactor.
Ausgangspunkt im erfindungsgemäßen Verfahren ist die Umsetzung von schlecht in Wasser löslichen Verbindungen. Dabei ist keine Grenze zur Löslichkeit der ersten Verbindung in Wasser anzugeben. Es ist offensichtlich, daß bei Durchführung des Verfahrens in großtechnischem Maßstab bereits eine relativ geringfügige Einschränkung der Ausbeute durch verminderte Löslichkeit nicht hinnehmbar ist, wohingegen im Labormaßstab eine solche Einschränkung u. U. noch toleriert werden kann.The starting point in the process according to the invention is the conversion of poorly into water soluble compounds. There is no limit to the solubility of the first compound in Indicate water. It is obvious that when carrying out the process in on a large scale already a relatively small reduction in the yield decreased solubility is unacceptable, whereas laboratory scale one Restriction u. U. can still be tolerated.
Die in Wasser schlecht löslichen Verbindungen sind als Gruppe nicht in irgendeiner Weise eingeschränkt. Sämtliche Verbindungen kommen im erfindungsgemäßen Verfahren grundsätzlich in Betracht. Bedarf kann in einer Reihe von theoretisch denkbaren Umständen angenommen werden. Es gibt viele Fälle, wo die reine Chemie zur Umsetzung einer ersten Verbindung in eine bestimmte weitere Verbindung versagt, weil aus irgendwelchen Gründen die Reaktion eine zu geringe Ausbeute aufweist, oder im Bioreaktor eine Mischung von Produkten und/oder Ausgangsverbindungen entsteht, welche sich unter Einsatz üblicher Verfahren und Hilfsmittel einer Aufreinigung verschließt. Es ist insbesondere bei Herstellungen die eine ganz bestimmte Konfiguration des Moleküls ansteuern, wie z. B. bei einer stereoselektiven Herstellung, manchmal ein unlösbares Problem, eine solche Herstellung befriedigend ablaufen zu lassen. Außerdem ist immer zu beachten, daß ein Verfahren gebraucht wird, das auch industriell anwendbar ist und deswegen keine unnötig aufwendigen und komplizierten Schritte aufweisen soll. The poorly water-soluble compounds are not in any way as a group limited. All compounds come in the process of the invention basically considered. Need can come in a number of theoretically conceivable circumstances be accepted. There are many cases where pure chemistry to implement a first Connection to a certain other connection fails because of some reasons the reaction has too low a yield, or in the bioreactor a mixture of Products and / or starting compounds is formed, which is using conventional Closes procedure and tools of a purification. It is especially at Preparations that drive a very specific configuration of the molecule, such. B. at a stereoselective preparation, sometimes an unsolvable problem, such a production to run satisfactorily. Also, always keep in mind that a procedure is needed, which is also industrially applicable and therefore no unnecessarily expensive and to have complicated steps.
Es besteht desweiteren ein praktischer Bedarf, Metabolite von Arzneimitteln herstellen zu können. Solche Metabolite können z. B. dann von Interesse sein, wenn man sich von diesen Metaboliten eine andere therapeutische Wirkung oder eine Verbesserung der therapeutischen Breite verspricht oder wenn durch Anwendung der Metabolite eine Verbesserung der Aufnahme im Körper des Patienten bewirkt werden kann. Neben diesen Möglichkeiten, wo im Grunde der Metabolit selbst als Arzneimittel untersucht und weiterentwickelt werden soll, gibt es noch einen weiteren Bedarf, wo es sich um gezielte pharmakokinetische und toxikologische Untersuchungen innerhalb der Arzneimittelentwicklung handelt. Fragen nach besondere Eigenschaften der Metaboliten gehören allmählich zum Standardpaket einer Arzneimittelentwicklung und es ist eine ganz besondere Anforderung an einer Entwicklungsabteilung, die gewünschten Mengen der Metabolite bereitzustellen. Insbesondere solche Fragestellungen können im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens wesentlich einfacher und mit weniger Aufwand aufgegriffen werden.There is also a practical need to produce metabolites of drugs can. Such metabolites may, for. B. then be of interest, if one of these Metabolites have a different therapeutic effect or an improvement in the therapeutic Width promises or if by using the metabolites an improvement of the Intake can be effected in the body of the patient. Besides these possibilities, where in the Because the metabolite itself is to be studied and developed as a drug There is another need, where it is targeted pharmacokinetic and toxicological Studies within the drug development is. Questions about special Properties of the metabolites are gradually becoming a standard package Drug development and it is a very special requirement of one Development Department to provide the desired levels of metabolites. In particular Such issues can be essential in the context of the method according to the invention be taken easier and with less effort.
Die erste, schlecht in Wasser lösliche Verbindung liegt im Bioreaktor in teilweise festem Zustand vor. Dies ist logischerweise bedingt durch seine Eigenschaft der schlechten Löslichkeit in Wasser und durch die Tatsache, daß das erfindungsgemäße Verfahren eine solche Ausführungsform aufweist, daß eine Berührung mit organischen Lösungsmitteln weitgehend ausgeschlossen ist. Die Möglichkeit, im Bioreaktor oder in einer dem Bioreaktor zugeordneten Anordnung eine zweite flüssige Phase vorzulegen, welche eine flüssige Phase auf der Grundlage eines organischen Lösungsmittels ist, wird im erfindungsgemäßen Verfahren bewußt umgangen. Es ist jedoch offensichtlich, daß eine Vorgehensweise, wo dem Bioreaktor die erste Verbindung einfach zugesetzt wird, dann zu weniger ansprechenden Ergebnissen führt, wenn lediglich eine äußerst niedrige Konzentration im wäßrigen Milieu erzielt wird. Aus diesem Grund sieht eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens vor, daß die erste Verbindung im wäßrigen Milieu in mikrokristalliner Form vorliegt. Als Mikrokristalle werden üblicherweise feste Partikel bezeichnet, die eine Korngröße im Bereich von 1 bis 30 µm aufweisen. Wenn die erste Verbindung im wäßrigen Milieu eine Korngröße in diesem Bereich aufweist, wird überraschenderweise beobachtet, daß die Umsetzung der ersten Verbindung in die zweite Verbindung wesentlich schneller und mit einer größeren Ausbeute abläuft. The first, poorly soluble in water compound is in the bioreactor in some solid Condition before. This is logically conditioned by its quality of the bad Solubility in water and by the fact that the inventive method a such embodiment has that contact with organic solvents is largely excluded. The possibility in the bioreactor or in the bioreactor associated arrangement to present a second liquid phase, which is a liquid phase the basis of an organic solvent, is in the process according to the invention consciously bypassed. However, it is obvious that a procedure where the bioreactor the first compound is simply added, then less appealing results leads, if only an extremely low concentration in the aqueous medium is achieved. Out For this reason, a preferred embodiment of the method according to the invention provides that the first compound is present in an aqueous medium in microcrystalline form. When Microcrystals are usually called solid particles that have a particle size in the range from 1 to 30 microns. If the first compound in the aqueous medium, a particle size in has this range, it is surprisingly observed that the implementation of the first Connection to the second compound much faster and with a higher yield expires.
Die im vorgehenden Absatz erwähnte bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens sieht konkret vor, daß die erste schlecht in Wasser lösliche Verbindung mikrokristallin in dem wäßrigen Milieu mit dem Biokatalysator suspendiert wird. Die Herstellung einer solchen Suspension kann mit geläufigen Methoden durchgeführt werden. Eine vorteilhafte Art der Zugabe des Substrates in einen Reaktor kann die Verwendung eines vollständig mit Wasser mischbaren Lösungsmittels darstellen, in dem die erste Verbindung gut lösbar ist. Durch Zugabe eines kleinen Lösungsmittelpulses mit dem gelösten Substrat in einen Bereich höchster Turbulenz im Reaktor wird das mit Wasser vollständig mischbare Lösungsmittel schlagartig verteilt. Dabei fällt das zuvor gelöste Substrat im Reaktor mikrokristallin aus. Diese Zugabe, welche manuell oder gemäß einer bevorzugten Ausführungsform rechnergesteuert durchgeführt werden kann, hat sich als sehr effektiv und gut durchführbar erwiesen. Es widerspricht zwar dem Ziel des erfindungsgemäßen Verfahrens, um ohne organische Lösungsmittel auszukommen, aber es hat sich gezeigt, daß die erforderliche Menge des organischen Lösungsmittels gering ist und die schlagartige Verteilung in dem wäßrigen Milieu zu einer äußerst niedrigen Konzentration des organischen Lösungsmittels in dem wäßrigen Milieu führt. Aus diesem Grund stellt die Anwesenheit des organische Lösungsmittels keine Belastung des Verfahrens dar. Sollte trotzdem im Rahmen eines bestimmten Prozesses für die Herstellung der mikrokristallinen Suspension eine größere Menge eines unverträglichen Lösungsmittels erforderlich sein, hat der Fachmann immerhin die Möglichkeit zunächst die Suspension der mikrokristallinen ersten Verbindung herzustellen und im zweiten Schritt, also bevor der Biokatalysator zugefügt wird, das organische Lösungsmittel zu entfernen oder zumindest seine Konzentration auf einem akzeptablen Niveau zu reduzieren. Da dieser Schritt das Verfahren jedoch kompliziert, sieht diese bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens jederzeit vor, zur Herstellung der mikrokristallinen Suspension eine Lösung der ersten Verbindung in einem verträglichen Lösungsmittel vorzulegen.The mentioned in the preceding paragraph preferred embodiment of the invention Specifically, the method provides that the first poorly water-soluble compound microcrystalline in the aqueous medium with the biocatalyst is suspended. The Preparation of such a suspension can be carried out by common methods. An advantageous way of adding the substrate to a reactor can be the use of a fully water-miscible solvent in which the first compound is good is solvable. By adding a small solvent pulse with the dissolved substrate in one The area of highest turbulence in the reactor becomes completely miscible with water Solvent distributed suddenly. The previously dissolved substrate falls in the reactor microcrystalline. This addition, which manually or according to a preferred Embodiment can be performed computer-controlled, has proven to be very effective and proved well feasible. Although it contradicts the objective of the method according to the invention, to do without organic solvents, but it has been shown that the required amount of the organic solvent is low and the sudden distribution in the aqueous medium to an extremely low concentration of the organic Solvent in the aqueous medium leads. For this reason, the presence of the organic solvent is not a burden of the process. Should still be in the context a certain process for the production of microcrystalline suspension a larger The amount of an incompatible solvent required, the expert has the least Possibility to first prepare the suspension of the microcrystalline first compound and in the second step, ie before the biocatalyst is added, the organic solvent to remove or at least reduce its concentration to an acceptable level. However, as this step complicates the process, this preferred embodiment provides the method according to the invention at any time before, for the production of microcrystalline Suspension a solution of the first compound in a compatible solvent required.
Die Umsetzung der ersten schlecht in Wasser löslichen Verbindung wird im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens mit einem biologischen System (Biokatalysator) durchgeführt. Der Biokatalysator kann ein bestimmtes Enzym oder eine Kombination mehrerer Enzyme sein. Diese meist einfache Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ohne Anwesenheit von Ganzzellen hat viele praktische Vorteile, wird jedoch häufig nicht zum gewünschten Erfolg führen, wenn es mehr komplizierte Umsetzungen betrifft. Ein solcher Biokatalysator kann im Rahmen der Erfindung ebenfalls ein System sein, das bestimmte Zellen umfaßt. Dabei wird die Auswahl der Zellen sich nach der Fragestellung richten. Wenn das Verfahren mit Mikroorganismen durchführbar ist, wie z. B. mit Bakterien, Pilzen oder Hefen, wird es viele Vorteile haben, diese Variante zu wählen. Es gibt jedoch genausogut die Überlegung zur Durchführung des Verfahrens pflanzliche Zellen oder Zellen tierischen Ursprungs zu wählen. Es wurde bereits vorstehend erwähnt, daß eine Anwendung zur Herstellung von Metaboliten von Arzneimitteln im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens naheliegt. Eine solche Herstellung kann naturgemäß hervorragend mit den natürlichen metabolisierenden Zellen, wie z. B. Leberzellen von Mensch oder Tier, durchgeführt werden.The implementation of the first poorly water-soluble compound is under the method according to the invention with a biological system (biocatalyst) performed. The biocatalyst may be a particular enzyme or a combination of several enzymes. This usually simple embodiment of the method according to the invention without presence of whole cells has many practical advantages, but often does not become the desired success lead, if it concerns more complicated implementations. Such a biocatalyst can be used in the The invention also provides a system comprising certain cells. Here is the Selection of cells depends on the question. If the procedure with Microorganisms is feasible, such. B. with bacteria, fungi or yeasts, it will be many Have advantages to choose this variant. However, there is just as much the consideration for Implementation of the procedure to select plant cells or cells of animal origin. It has already been mentioned above that an application for the production of metabolites of drugs in the context of the method according to the invention is obvious. Such Naturally, production can be excellent with natural metabolizing cells, such as z. B. liver cells of humans or animals.
Es ist außerdem davon auszugehen, daß die Verbesserung der gentechnologischen Verfahren zu weiteren Möglichkeiten des erfindungsgemäßen Verfahrens führen wird.It is also assumed that the improvement of genetic engineering will lead to further possibilities of the method according to the invention.
Die erste, in Wasser schwer lösliche Verbindung wird durch den Biokatalysator in eine zweite Verbindung umgesetzt. Die Art der Umsetzung ist im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens nicht in irgendwelcher Weise eingeschränkt. Es kann sich somit um jede mit Biokatalysatoren durchführbare Reaktion handeln. Da das erfindungsgemäße Verfahren als Merkmal aufweist, daß eine in Wasser schwer lösliche Verbindung umgesetzt wird, wird die zweite Verbindung häufig eine mehr polare Verbindung sein, welche durch einen oxidativen Reaktionsvorgang aus der ersten Verbindung entstanden ist. Es sind jedoch ebenfalls Reaktionen denkbar, wo die zweite Verbindung die gleiche Polarität wie die erste Verbindung aufweist und die Löslichkeit in Wasser sich u. U. nicht verändert hat. Es wird im Rahmen der Beschreibung des erfindungsgemäßen Verfahrens von einer ersten, schwer in Wasser löslichen Verbindung gesprochen, welche das Ausgangsprodukt im Verfahren darstellt und somit auch als Substrat bezeichnet werden kann. Diese erste Verbindung wird durch den Biokatalysator in eine zweite Verbindung umgesetzt. Diese zweite Verbindung ist die Verbindung, welche am Ende des Verfahrens aus dem Bioreaktor gewonnen wird. Es ist demnach nicht erforderlich, daß die zweite Verbindung in einem einzelnen Schritt aus der ersten Verbindung entstanden ist, es ist in vielen Fällen sogar bekannt, daß die Umsetzung eine Kette von einzelnen Schritten umfaßt, wobei die erste Verbindung demnach zunächst in eine andere Verbindung umgesetzt wird bevor am Ende des Verfahrens die zweite Verbindung gebildet wird. Auch solche Reaktionen werden jedoch ausdrücklich vom erfindungsgemäßen Verfahren umfaßt.The first, sparingly soluble in water compound is the biocatalyst in a second Connection implemented. The type of implementation is within the scope of the invention Procedure not limited in any way. It can thus be any with Biocatalysts feasible reaction act. Since the inventive method as Characteristic that a sparingly soluble in water compound is reacted, the second compound is often a more polar compound, which is oxidative Reaction process has arisen from the first connection. It is, however, too Reactions conceivable where the second compound is the same polarity as the first compound and the solubility in water u. U. has not changed. It will be part of the Description of the process of the invention of a first, difficultly soluble in water Spoken connection, which is the starting product in the process and thus also can be referred to as a substrate. This first compound is through the biocatalyst in implemented a second connection. This second compound is the compound which is on the At the end of the process, it is recovered from the bioreactor. It is therefore not necessary that the second compound originated in a single step from the first compound, In many cases it is even known that the implementation is a chain of individual steps comprising, wherein the first compound thus initially converted into another compound is before the second connection is formed at the end of the process. Even such However, reactions are expressly included in the process of the invention.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird in einem Bioreaktor durchgeführt. Als Bioreaktor werden die Behältnisse bezeichnet, in denen biologische Umsetzungen mit Biokatalysatoren durchgeführt werden. Bioreaktoren sind speziell entworfen, um die erforderlichen optimalen Bedingungen für die Umsetzung herzustellen. Jeder Biokatalysator benötigt sehr spezifische Bedingungen hinsichtlich Temperatur, pH-Wert und Nährstoffkonzentration und der Bioreaktor ist mit solchen Hilfsmitteln ausgestattet, um diese Bedingungen optimal erfüllen zu können. Der Bioreaktor ist üblicherweise mit einem Rührsystem ausgestattet, um eine gute Vermischung der Bestandteile zu gewährleisten, mit einem Wärmetransportsystem um die optimale Temperatur einstellen zu können und mit Mitteln um Nährstoffe und Sauerstoff zuzuführen. Außerdem kann es erforderlich sein, den Bioreaktor mit Hilfsmitteln auszustatten, welche es ermöglichen, das Verfahren steril durchzuführen, was insbesondere bei Verfahren die mit Ganzzellsystemen durchgeführt werden, üblicherweise eine Anforderung sein wird. Auch der Auswahl des Trennverfahrens spielt eine Rolle bei der genauen Ausgestaltung des Bioreaktors.The process according to the invention is carried out in a bioreactor. As bioreactor the containers are referred to, in which biological reactions with biocatalysts be performed. Bioreactors are specially designed to provide the optimal ones Conditions for the implementation. Each biocatalyst needs very specific Conditions regarding temperature, pH and nutrient concentration and the Bioreactor is equipped with such tools to meet these conditions optimally can. The bioreactor is usually equipped with a stirring system to a good To ensure mixing of the components, with a heat transport system around the to be able to set the optimum temperature and with resources for nutrients and oxygen supply. In addition, it may be necessary to equip the bioreactor with auxiliaries, which make it possible to carry out the process sterile, which in particular in procedures the be performed with whole cell systems, will usually be a requirement. Also The selection of the separation process plays a role in the exact design of the Bioreactor.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird naturgemäß in einem wäßrigen Milieu durchgeführt werden. Ein wäßriges Milieu kann demineralisiertes Wasser, destilliertes Wasser, Leitungswasser oder gepuffertes Wasser sein, üblicherweise jedoch wird im Rahmen der Erfindung eine Nährlösung benutzt werden, die Wasser als flüssige Phase aufweist, aber ein Reihe von Komponenten aufweist, die zur optimalen Funktion der Zellen erforderlich sind. Zur Instandhaltung einer gleichbleibenden Produktivität einer Zellkultur wird es erforderlich sein, dem Milieu, welches die Zellen enthält, eine konstante Zusammensetzung zu verschaffen. Dabei ist auf einen pH-Wert innerhalb eines bestimmten kleinen Rahmens zu achten, sowie auf die permanente Anwesenheit ausreichender Mengen an Grundstoffen, und es ist ebenfalls zu gewährleisten, daß bestimmte Stoffwechselprodukte ständig aus dem Milieu entfernt werden. Verfahren und Mittel, um konstante Bedingungen im Verfahren einzuhalten, sind dem Biotechnologen bekannt und werden nicht weiter erörtert werden.The process according to the invention is naturally carried out in an aqueous medium become. An aqueous environment may include demineralised water, distilled water, Tap water or buffered water, but is usually under the Invention, a nutrient solution can be used, which has water as a liquid phase, but a Having a set of components that are required for the optimal functioning of the cells. To maintain a consistent productivity of a cell culture, it becomes necessary be to give the environment containing the cells a constant composition. It is important to pay attention to a pH within a certain small frame, as well as on the permanent presence of sufficient quantities of precursors, and it is also too ensure that certain metabolic products are constantly removed from the environment. Methods and means for maintaining constant conditions in the process are Biotechnologists known and will not be discussed further.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur biokatalysierten Umsetzung schlecht wasserlöslicher Substanzen zeichnet sich dadurch aus, daß das Substrat in dem wäßrigen Reaktionsmedium mit dem Biokatalysator suspendiert wird und eine Trennung der Bestandteile im Verfahren vorgenommen wird. Die erste, in Wasser schlecht lösliche Verbindung und der Biokatalysator verbleiben im Bioreaktor, während die zweite Verbindung aus dem Bioreaktor ausgeschieden wird. Diese Maßnahme stellt eine überraschende Verbesserung der bekannten Verfahren dar und führt zu erheblich höheren Ausbeuten der gebildeten zweiten Verbindung. Es ist an sich keine unbekannte Maßnahme im Rahmen biotechnologischer Prozesse, Endprodukte aus dem Reaktor zu entfernen, wie z. B. bei der Herstellung von Produkten, die selber eine negative Auswirkung auf den Reaktionsablauf haben. Bei diesen bekannten Verfahren liegt die Notwendigkeit und der Vorteil der Entfernung der zweiten Verbindung primär in der Eigenschaft dieser zweiten Verbindung, einen Einfluß auf die Reaktion im Reaktor auszuüben. Demgegenüber läßt sich der Vorteil der Abtrennung der zweiten Verbindung beim erfindungsgemäßen Verfahren bei solchen Umsetzungen feststellen, die von einer ersten, schlecht in Wasser löslichen Verbindung ausgehen.The inventive method for biocatalyzed reaction poorly water-soluble Substances is characterized in that the substrate in the aqueous reaction medium with the biocatalyst is suspended and a separation of the components in the process is made. The first, poorly soluble in water compound and the biocatalyst remain in the bioreactor, while the second compound is eliminated from the bioreactor becomes. This measure represents a surprising improvement of the known methods and leads to significantly higher yields of the second compound formed. It is in itself no unknown measure in the context of biotechnological processes, end products from the Remove reactor such. B. in the manufacture of products, which itself a negative Have an effect on the reaction process. In these known methods is the Necessity and the advantage of removing the second compound primarily in the Property of this second compound to exert an influence on the reaction in the reactor. In contrast, the advantage of the separation of the second compound in process according to the invention in such reactions, which depend on a first, poorly soluble in water compound go out.
Die Trennung der im Bioreaktor vorliegenden Bestandteile ist ein wesentlicher Bestandteil der vorliegenden Erfindung. Dabei ist vorgesehen eine Trennung der zweiten Verbindung von den weiteren Bestandteilen im Bioreaktor, insbesondere von dem Biokatalysator und der ersten Verbindung vorzunehmen. Die Trennung bietet daraufhin die Möglichkeit, die zweite Verbindung aus dem Bioreaktor auszuscheiden. Die erste Verbindung und der Biokatalysator verbleiben weiterhin in dem Bioreaktor. Es spricht von selber, daß diese Ausführungsform des Verfahrens sich am besten eignet, in einem kontinuierlichen Prozeß angewandt zu werden. Die umgekehrte Vorgehensweise, wobei die erste Verbindung und der Biokatalysator aus dem Bioreaktor ausgeschieden werden, kommt zwar grundsätzlich ebenso in Betracht, eignet sich jedoch weniger für eine kontinuierliche Durchführung. Das Verfahren kann jedoch jederzeit als einen einzigen Ansatz durchgeführt werden und bei Versuchsvorhaben, welche lediglich eine einmalige Herstellung einer bestimmten zweiten Verbindung vorsehen, gibt es auch keinen Grund, das Verfahren nicht als einziger Ansatz durchzuführen, aber es wird doch vermutet, daß die Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens sich am ehesten bei einer Anwendung in einem kontinuierlichen Prozeß zeigen werden.The separation of the components present in the bioreactor is an essential part of the present invention. It is provided a separation of the second compound of the other components in the bioreactor, in particular of the biocatalyst and the first Make connection. The separation then offers the opportunity, the second Excrete compound from the bioreactor. The first compound and the biocatalyst remain in the bioreactor. It goes without saying that this embodiment of the Method is best suited to be used in a continuous process. The reverse procedure, wherein the first compound and the biocatalyst from the Bioreactor eliminated, is indeed considered in principle, is suitable but less for continuous implementation. However, the procedure can be anytime be carried out as a single approach and in pilot projects which only There is no one-off production of a particular second compound Reason not to use the procedure as the only approach, but it is that the advantages of the method according to the invention are most likely in an application in to show a continuous process.
Durch die Ausscheidung der ersten Verbindung aus dem Bioreaktor wird ihre Konzentration auf einem ständig niedrigen Niveau gehalten, was für den Ablauf der Reaktion äußerst günstig ist. Es ist im Rahmen einer bevorzugten Ausführungsform vorgesehen, dem Bioreaktor mit einem Erfassungssystem auszustatten, damit die Konzentration der zweiten Verbindung ständig überwacht werden kann. Es ist eine mehr bevorzugte Ausführungsform, dieses Erfassungssystem so auszubilden, daß die Erfassung on-line durchgeführt werden kann und die Regelung der Trennung automatisch gesteuert wird. Die on-line-Erfassung der zweiten Verbindung kann beliebig durchgeführt werden, bevorzugt wird ein apparativ einfaches Vorgehen, wie z. B. eine spektrophotometrische Erfassung der Konzentration der zweiten Verbindung. Kompliziertere Systeme sind jedoch ebenfalls denkbar und dem Fachmann stehen in der Literatur eine Reihe von Maßnahmen zur Verfügung.The excretion of the first compound from the bioreactor becomes its concentration kept at a constantly low level, which is extremely favorable for the course of the reaction is. It is provided in a preferred embodiment, the bioreactor with equip a detection system, so that the concentration of the second compound constantly can be monitored. It is a more preferred embodiment, this Forming detection system so that the detection can be performed on-line and the Control of separation is controlled automatically. Online capture of the second Compound can be carried out arbitrarily, preferably a simple apparatus Procedure, such. B. a spectrophotometric detection of the concentration of the second Connection. However, more complicated systems are also conceivable and are available to the person skilled in the art in the literature a number of measures available.
Die Art der Trennung kann beliebig ausgestaltet werden. Sie wird praktisch dadurch bedingt sein, wie sich im speziellen Fall die Eigenschaften der zweiten Verbindung von jenen der ersten Verbindung und dem Biokatalysator unterscheiden. Eine relativ einfache Trennung kann durchgeführt werden, wenn die zweite Verbindung ein verändertes Löslichkeitsprofil in Wasser zeigt, wobei dieses veränderte Löslichkeitsprofil im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens häufig eine Erhöhung der Löslichkeit in Wasser sein wird. Da die erste Verbindung in Wasser lediglich in sehr geringen Mengen vorliegt, kann für die Trennung der ersten Verbindung von der zweiten Verbindung ein Filtrationsverfahren gewählt werden, wobei das Filtrat in gelöster Form die zweite Verbindung aufweist und die Oberfläche des Filtermittels die dispergierten Teilchen der ersten Verbindung zurückhält. Auch wenn das Verfahren gemäß der vorher beschriebenen bevorzugten Ausführungsform die erste Verbindung als Mikrokristalle vorsieht, kann die Trennung mittels eines Filtrationsverfahrens durchgeführt werden, wobei lediglich eine ausreichende Filtrationsleistung des Filtermittels zu beachten ist. Ob bei dem Trennvorgang, insbesondere bei einem Filtrationsvorgang, der Biokatalysator ebenfalls mit der ersten Verbindung zusammen abgetrennt wird, wird dadurch bedingt ob dieser ebenfalls wie die erste Verbindung abtrennbar ist. Liegt der Biokatalysator als Mikroorganismus oder als Zellen vor, so wird er einfach mit der ersten Verbindung von der flüssigen Phase abgetrennt werden. Sogar wenn der Biokatalysator ein Enzym umfaßt, welches nicht an feste Partikel gebunden ist, sondern frei gelöst in dem wäßrigen Milieu vorliegt, scheidet eine Abtrennung durch Filtration nicht aus, muß jedoch eine spezielle Methode selektiert werden. Es müssen dann Filtermittel (Membrane) eingesetzt werden, die eine Trenngrenze unterhalb der Größe der eingesetzten Enzyme haben, wie Ultrafiltrationsmembrane mit einem entsprechenden cut-off, im Gegensatz zu Mikrofiltrationsmembranen. Entsprechendes gilt, wenn der Biokatalysator mehr als ein Enzym umfaßt.The type of separation can be configured as desired. It is practically conditioned by it how, in the special case, the properties of the second compound differ from those of the first Compound and biocatalyst differ. A relatively simple separation can be performed when the second compound has a modified solubility profile in water shows, wherein this altered solubility profile in the context of the invention The process will often be an increase in solubility in water. Because the first connection is present in water only in very small quantities, can for the separation of the first Connection of the second compound to be selected a filtration process, wherein the Filtrate in dissolved form has the second compound and the surface of the filter means the retains dispersed particles of the first compound. Even if the method according to of the preferred embodiment previously described, the first compound as Provides microcrystals, the separation can be carried out by means of a filtration process be, with only a sufficient filtration performance of the filter medium is observed. Whether in the separation process, especially in a filtration process, the biocatalyst is also separated with the first compound together, is determined by whether this is also like the first connection can be separated. Is the biocatalyst as Microorganism or as cells before, it becomes easy with the first connection of the separated liquid phase. Even if the biocatalyst contains an enzyme, which is not bound to solid particles, but freely dissolved in the aqueous medium is present, separates a separation by filtration is not sufficient, but must be a special Method can be selected. It then filter media (membrane) must be used, the have a cutoff below the size of the enzymes used, such as Ultrafiltration membrane with a corresponding cut-off, as opposed to Microfiltration membranes. The same applies if the biocatalyst more than one enzyme includes.
Eine Filtration stellt sicherlich im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine bevorzugte Ausführungsform zur Abtrennung der zweiten Verbindung dar. Filtrationsverfahren stellen generell in der Technik und insbesondere auch in biotechnologischen Verfahren eine gut bekannte und bevorzugte Methode dar und werden in vielen denkbaren Fällen als Mittel der Wahl angesehen werden. Die Ausführung der Filtration kann dabei als Oberflächenfiltration ausgestaltet sein, wobei allerdings die Bildung eines Filterkuchens im Rahmen eines kontinuierlichen Prozesses häufig keinen Vorteil darstellen wird, weshalb hier bevorzugt die Querstromfiltration angewandt wird, wobei eine Strömung parallel zur Filteroberfläche erzeugt wird und sich keinen Filterkuchen bildet. Es stellt ebenfalls eine bevorzugte Ausführungsform dar, als Filtrationsprinzip ein Rotationsfilter zu verwenden.Filtration certainly constitutes a preferred within the scope of the present invention Embodiment for separating the second compound. Filtration method Generally good in engineering and especially in biotechnological processes known and preferred method and are used in many conceivable cases as a means of Election. The execution of the filtration can be used as surface filtration However, the formation of a filter cake in the context of a continuous process is often not an advantage, which is why preferred here Cross-flow filtration is applied, wherein a flow generated parallel to the filter surface and no filter cake forms. It also constitutes a preferred embodiment dar to use as a filtration principle, a rotary filter.
Die Ausgestaltung des Bioreaktors wird durch das ausgewählte Trennverfahren stark beeinflußt werden. Bei einer Ausgestaltung als Filtration wird der Filtrationsvorgang üblicherweise in einem dem Bioreaktor zugeordneten Bypass durchgeführt werden. Bei der bevorzugten Querstrom-Fltration wird die wäßrige Suspension an dem Filter in einem solchen Bypass vorbeigeführt. Demgegenüber kann ein Rotationsfilter direkt in der Flüssigphase des Bioreaktors installiert werden und wird die Anordnung des Bioreaktors keinen Bypass enthalten. Sieht das Verfahren ein Rotationsverfahren vor, so kann der Bioreaktor selbst als drehbare Zentrifuge ausgestaltet sein. Diese Anordnung des Bioreaktors enthält ebenfalls keinen Bypass.The design of the bioreactor is strong by the selected separation method to be influenced. In one embodiment as a filtration, the filtration process Usually be performed in a bioreactor associated bypass. In the preferred crossflow filtration is the aqueous suspension on the filter in such a way Bypass bypassed. In contrast, a rotary filter directly in the liquid phase of Bioreactor will be installed and the arrangement of the bioreactor will not bypass contain. If the method provides a rotation method, then the bioreactor itself as rotatable centrifuge be configured. This arrangement of the bioreactor also contains no bypass.
Die Abtrennleistung der Fest-Flüssig-Trennung muß mit Hilfe des Volumenstroms des abgetrennten wäßrigen Reaktionsmediums mit dem gelösten Produkt so eingestellt werden, daß weder eine toxische Konzentration der zweiten Verbindung im Reaktor überschritten wird, noch eine Ausfällung des Produktes im Reaktor erfolgt.The separation performance of the solid-liquid separation must be determined by means of the volume flow of the separated aqueous reaction medium can be adjusted with the dissolved product, that neither a toxic concentration of the second compound in the reactor is exceeded, nor a precipitation of the product takes place in the reactor.
Eine Regelung des Volumenstroms des abgetrennten wäßrigen Reaktionsmediums mit der gelösten zweiten Verbindung kann durch die online-Messung der Produktkonzentration im wäßrigen Reaktionsmedium ermöglicht werden: Bei Überschreitung einer vorgegeben Grenzkonzentration wird der Volumenstrom des abgetrennten wäßrigen Reaktionsmediums erhöht. Bei Unterschreitung wird dieser Volumenstrom reduziert. A control of the volume flow of the separated aqueous reaction medium with the dissolved second compound can be determined by the online measurement of product concentration in the be allowed aqueous reaction medium: When exceeding a predetermined Limit concentration is the volume flow of the separated aqueous reaction medium elevated. When falling below this volume flow is reduced.
Um eine sichere kontinuierliche Abtrennung von Biokatalysator und mikrokristallinem Substrat zu erreichen, müssen die physikalischen Eigenschaften auf denen die gewählte Fest-Flüssig- Trennung beruht, zwischen Biokatalysator und dem Substrat möglichst ähnlich sein.To ensure safe continuous separation of biocatalyst and microcrystalline substrate the physical properties on which the selected solid-liquid Separation, as similar as possible between biocatalyst and the substrate.
Wird eine Querstromfiltration zur kontinuierlichen Abtrennung eingesetzt, müssen die Partikelgrößen von Biokatalysator und Substrat oberhalb der Porengröße der verwendeten Membran liegen.If a cross-flow filtration is used for continuous separation, the Particle sizes of biocatalyst and substrate above the pore size of the used Membrane lie.
Wird ein Zentrifugalseparator, Sedimenter oder Dekanter zur kontinuierliche Abtrennung eingesetzt, müssen die Sinkgeschwindigkeiten von Biokatalysator und Substrat größer als die notwendige (Grenzsinkgeschwindigkeit sein.Used as a centrifugal separator, sediment or decanter for continuous separation used, the sinking rates of biocatalyst and substrate must be greater than that necessary (limit sinking speed.
Die aufkonzentrierten Feststoffe (Biokatalysator und Substrat) werden nach der Fest-Flüssig- Trennung in den Suspensionsreaktor zurückgeführt.The concentrated solids (biocatalyst and substrate) are removed after the solid-liquid Separation returned to the slurry reactor.
Das abgetrennte wäßrige Reaktionsmedium mit dem gelösten Produkt wird kontinuierlich abgeführt.The separated aqueous reaction medium with the dissolved product becomes continuous dissipated.
Um ein gewünschtes Reaktionsvolumen aufrecht zu erhalten, wird gleichzeitig ein entsprechender Volumenstrom Wasser für die Biokatalyse in den Suspensionsreaktor dosiert, wobei dem Wasser gegebenenfalls Nährstoffe oder Cosubstrate zugesetzt sein können.In order to maintain a desired reaction volume, at the same time corresponding volume flow of water for biocatalysis is metered into the suspension reactor, where appropriate, nutrients or co-substrates may be added to the water.
Das erfindungsgemäße Verfahren ruft eine Reihe von Verbesserungen hervor. Nicht nur eignet sich das Verfahren zur Durchführung der Umsetzung von schlecht in Wasser löslichen Verbindungen, ebenfalls wird es möglich sein, das Verfahren einzusetzen, wenn eine erste Verbindung umgesetzt werden soll, welche stark toxische Eigenschaften besitzt, was bei der Anwendung von Mikroorganismen oder Zellen als Biokatalysator einen großen Nachteil darstellt. Bei einer solchen toxischen ersten Verbindung ist demnach das Problem nicht, daß keine höhere Konzentrationen im wäßrigen Milieu erreichbar sind, sondern daß solche höhere Konzentrationen im Hinblick auf einen dauerhaften Betrieb der Umsetzung zu vermeiden sind. Auch bei einer solchen toxischen Verbindung kann die bevorzugte Ausführungsform des Verfahrens gewählt werden, wobei die erste Verbindung in mikrokristalliner Form in der wäßrigen Lösung vorgelegt wird und hierdurch auf geschickter Weise unerwünschte hohe Konzentrationen der Verbindung vermieden werden.The process of the invention produces a number of improvements. Not only suitable the process for carrying out the reaction of poorly soluble in water Compounds, it will also be possible to use the method when a first Compound is to be implemented, which has strong toxic properties, resulting in the Application of microorganisms or cells as a biocatalyst is a big disadvantage represents. Accordingly, the problem with such a toxic first compound is that no higher concentrations in the aqueous medium can be achieved, but that such higher Concentrations are to be avoided with a view to a permanent operation of the reaction. Even with such a toxic compound, the preferred embodiment of the Be selected method, wherein the first compound in microcrystalline form in the aqueous solution is presented and thereby skillfully unwanted high Concentrations of the compound should be avoided.
Ein weiterer Aspekt des erfindungsgemäßen Verfahrens stellt die Möglichkeit dar, relativ gut in Wasser lösliche Substrate vor der Umsetzung in eine schwer lösbare Form zu überführen, um diese kristallin im Reaktor zurückzuhalten. Eine Möglichkeit ist die Komplexierung gut in Wasser löslicher Substrate mit Cyclodextrinen. Ein solcher Komplex ist schwer in Wasser löslich. Das Verfahren wird in der Technik bereits eingesetzt, um in der Umwelttechnik toxische Verbindungen für Mikroorganismen verfügbar zu machen (siehe z. B. A. Schwartz, R. Bar; Appl. Environ. Microbiol. 61, 7(1995): 2727-2731).Another aspect of the method according to the invention represents the possibility of being relatively good to convert water-soluble substrates into a difficult to dissolve form before the reaction, to retain this crystalline in the reactor. One way is the complexation well in Water-soluble substrates with cyclodextrins. Such a complex is heavy in water soluble. The method is already used in technology to be used in environmental engineering make toxic compounds available to microorganisms (see, for example, A. Schwartz, R. Bar; Appl. Environ. Microbiol. 61, 7 (1995): 2727-2731).
Auch die Möglichkeit, die das erfindungsgemäße Verfahren bietet, gleichzeitig den Biokatalysator und sein Substrat im Bioreaktor zurückzuhalten, ist sehr vorteilhaft.Also, the possibility that provides the inventive method, at the same time the Retaining the biocatalyst and its substrate in the bioreactor is very advantageous.
Insbesondere im Rahmen eines kontinuierlichen Verfahrens, wobei es das Ziel ist, über längere Zeiträume eine bestimmte Umsetzung vorzunehmen, wobei während des Verfahrens die Ausscheidung des Reaktionsprodukts vorgenommen wird, macht es keinen Sinn, ein Trennverfahren zu wählen, das auch eine Trennung von Biokatalysator und erster Verbindung hervorruft, weil diese beide Bestandteile im Verfahren ohnehin später wieder zusammengeführt werden müssen. Das Verfahren so auszugestalten, daß nur abgetrennt, was abgetrennt werden muß und zusammen läßt, was zusammen bleiben soll, entspricht nicht nur dem Logik des Verfahrenstechnikers, sondern es vermeidet auch jegliche unnötige Verschwendung von Aufwand und Ressourcen.In particular, in the context of a continuous process, where the aim is to be longer Periods to carry out a specific implementation, during the process the Elimination of the reaction product is made, it makes no sense Separation method, which also includes a separation of biocatalyst and first compound causes, because these two components in the process anyway later brought together again Need to become. To design the process so that only separated, what are separated must and together, what should remain together, not only corresponds to the logic of Process engineer, but it also avoids any unnecessary waste of Effort and resources.
Wenn bei einer Umsetzung eine toxische zweite Verbindung gebildet wird, hat das erfindungsgemäße Verfahren den großen Vorteil, auf einfacher Weise diese toxische Verbindung aus dem Bioreaktor abtrennen zu können. Es ist kein Problem, das Verfahren so auszugestalten, daß die Konzentration der toxischen zweiten Verbindung durch eine angepaßte Regelung des Trennvorgangs, welcher, wie vorstehend ausgeführt, geschickterweise durch eine on-line-Überwachung gesteuert wird, unterhalb eines vorgegebenen niedrigen Wertes zu halten. Es ist offensichtlich, daß dabei diese ausgesprochen nützliche Möglichkeit sogar angewandt werden kann, wenn sowohl erste wie zweite Verbindung wasserlöslich sind, da es in diesem Fall sehr vorteilhaft ist, die erste Verbindung durch entsprechende Vorbereitung als Mikrokristalle im Bioreaktor vorzulegen. Durch diese Anpassung der Korngröße der ersten Verbindung, welche bei dieser besonders bevorzugten Ausführungsform wasserlöslich sein kann, wird die einfache Möglichkeit der Abtrennung der toxischen zweiten Verbindung im Verfahren auf künstlicher Weise hergestellt.If, in one reaction, a toxic second compound is formed, that has inventive method the great advantage, in a simple way this toxic To disconnect compound from the bioreactor. It's not a problem, the procedure is so to design that the concentration of the toxic second compound by a matched Control of the separation process, which, as stated above, cleverly by an on-line monitoring is controlled, below a preset low value hold. It is obvious that this very useful option even can be used when both the first and second compounds are water-soluble, as it is In this case it is very advantageous to prepare the first compound by appropriate preparation Microcrystals in the bioreactor. By this adjustment of the grain size of the first Compound which is water-soluble in this particularly preferred embodiment can, is the easy way of separating the toxic second compound in the Method manufactured in an artificial way.
Daß das erfindungsgemäße Verfahren außerdem auf sehr vorteilhafter Weise die Anwendung von einer zusätzlichen organischen flüssigen Phase vermeidet, ist im Anbetracht der vorstehenden Beschreibung nunmehr offensichtlich. Dieses Vermeiden ist in mehrerer Hinsicht vorteilhaft. Nicht nur wird eine Kostenerhöhung bedingt durch die Anschaffung solcher Lösungsmittel vermieden, am Ende wird auch eine weitere finanzielle Konsequenz vermieden, wenn es um die Entsorgung solcher Lösungsmittel geht. Auch hier kann angemerkt werden, daß bereits relativ geringe Kostenvorteile im industriellen Maßstab eine große Bedeutung erhalten können.That the inventive method also in a very advantageous manner the application from an additional organic liquid phase is avoided, given the above description now obvious. This avoidance is in several ways advantageous. Not only is a cost increase due to the acquisition of such Avoiding solvents, and at the end a further financial consequence is avoided, when it comes to the disposal of such solvents. Again, it can be noted that already relatively low cost advantages on an industrial scale is of great importance can receive.
Da das erfindungsgemäße Verfahren auf geschickter und überraschender Weise verschiedene Aspekte eines Umsetzungsverfahrens vereint, kann mit dem Verfahren eine hohe Raum-Zeit- Ausbeute erzielt werden.Since the inventive method in a clever and surprising way different Aspects of a process of implementation, the process can achieve a high space-time Yield can be achieved.
Die folgenden Anwendungsgebiete bieten sich für das erfindungsgemäße Verfahren an: eine biotechnologische Produktion von Pharmazeutika in der Pharmaindustrie, eine biotechnologische Produktion von Feinchemikalien in der Chemieindustrie und eine biotechnologische Produktion von Aromastoffen in der Lebensmittelindustrie.The following fields of application are suitable for the process according to the invention: a biotechnological production of pharmaceuticals in the pharmaceutical industry, a biotechnological production of fine chemicals in the chemical industry and a biotechnological production of flavorings in the food industry.
Die Erfindung wird anhand der folgenden Abbildungen näher erläutert:The invention is explained in more detail with reference to the following figures:
Fig. 1 stellt die schematische Abbildung eines Bioreaktors zur Durchführung des Verfahrens dar, Fig. 1 shows the schematic illustration of a bioreactor for performing the method,
Fig. 2 ist die Darstellung der regioselektiven Oxidation von Terfenadin im Rührreaktor. Fig. 2 is the representation of the regioselective oxidation of terfenadine in the stirred reactor.
Die Abb. 1 zeigt einen Bioreaktor 1, welcher sich zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens eignet. Der Bioreaktor 1 besteht im wesentlichen aus einem Behältnis aus rostfreiem Stahl, das von einem Mantel 2, welcher Heiz- bzw. Kühlmittel zur Einhaltung der optimalen Temperatur aufweist, umgeben wird. Im Bioreaktor 1 befindet sich die Reaktionslösung 6, welche eine wäßrige Lösung ist. Der Bioreaktor 1 ist mit einer Leitung 3 zum Zufuhr von Sauerstoff oder Luft (oder ein anderes Sauerstoff haltendes Gasgemisch) ausgestattet. Ein Motor 4 treibt ein Rührmittel 5 an. Eine Anfuhrleitung 7 führt die erste Verbindung zum Reaktor, wird diese erste Verbindung als Mikrokristalle im System gewünscht, wird über dieser Anfuhrleitung die Lösung der ersten Verbindung in einem organischen Lösungsmittel in die wäßrige Lösung 6 geschossen. Eine weitere Zufuhrleitung 8 führt die wäßrige Lösung an, welche wäßrige Lösung gegebenenfalls Cosubstrat oder weitere im Prozeß benötigte Hilfsstoffe enthält. Über noch eine weitere Zufuhrleitung 9 kann ein eventuell erforderliches Korrekturmittel zugeführt werden, was z. B. eine Chemikalie zur Einstellung des richtigen pH-Wertes sein kann. Über eine Leitung 10 kann ein Teil der Gasphase entfernt werden. Dem Bioreaktor 1 ist ein Bypass zugeordnet, welcher ein Filter 13 und eine Leitung 12 stromaufwärts und eine Leitung 14 stromabwärts des Filters umfaßt. In der Leitung 12 befindet sich eine Pumpe 11. Fig. 1 shows a bioreactor 1, which is suitable for carrying out the method according to the invention. The bioreactor 1 consists essentially of a container made of stainless steel, which is surrounded by a jacket 2, which has heating or cooling means to maintain the optimum temperature. In the bioreactor 1 is the reaction solution 6, which is an aqueous solution. The bioreactor 1 is equipped with a conduit 3 for supplying oxygen or air (or another oxygen-containing gas mixture). A motor 4 drives a stirring means 5. A feed line 7 leads the first connection to the reactor, if this first compound is desired as microcrystals in the system, the solution of the first compound in an organic solvent is shot into the aqueous solution 6 via this feed line. Another feed line 8 leads to the aqueous solution, which aqueous solution optionally contains co-substrate or other auxiliaries needed in the process. Via a further supply line 9, a possibly required correction means can be supplied, which z. B. may be a chemical to adjust the correct pH. Via a line 10, a part of the gas phase can be removed. The bioreactor 1 is associated with a bypass which comprises a filter 13 and a conduit 12 upstream and a conduit 14 downstream of the filter. In line 12 is a pump 11th
Nicht dargestellt in der Abbildung sind Mittel um die Konzentration der zweiten Verbindung in der wäßrigen Lösung zu bestimmen. Solche Mittel werden zweckmäßig in der Leitung 12 angeordnet. Für eine automatische Steuerung des Verfahrens werden solche Mittel in einem ebenfalls nicht dargestellten Rechnersystem integriert werden, das zur Regelung der Filterleistung die Wirkung der Pumpe 11 steuert.Not shown in the figure are means around the concentration of the second compound in to determine the aqueous solution. Such funds will be useful in the line 12th arranged. For an automatic control of the method, such means are in one also not shown computer system are integrated, which is to control the Filter performance controls the action of the pump 11.
Wenn das erfindungsgemäße Verfahren in einer Anlage wie in der Abb. 1 dargestellt durchgeführt wird, wird die wäßrige Reaktionslösung 6, welche das wäßrige Milieu, den Biokatalysator und die erste Verbindung sowie die zweite Bindung enthält durch die Wirkung der Pumpe 11 durch das Filter 13 gepumpt. Das Filter 13 kann gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens ein Querstrommikrofilter sein.When the process according to the invention is carried out in a plant as shown in FIG. 1, the aqueous reaction solution 6, which contains the aqueous medium, the biocatalyst and the first compound and the second bond, is pumped through the filter 13 by the action of the pump 11 , The filter 13 may be a cross-flow microfilter according to a preferred embodiment of the method.
Durch die Filterwirkung wird eine Trennung erzielt, wobei sich in der Leitung 14 eine aufkonzentrierte Suspension befindet, welche die erste, schlecht in Wasser lösliche Verbindung und den Biokatalysator aufweist und das Filtrat 15 das abgetrennte wäßrige Milieu mit der gelösten zweiten Verbindung darstellt. Die aufkonzentrierte Suspension wird über die Leitung 14 in den Bioreaktor zurückgeführt. Das Filtrat mit der gelösten zweiten Verbindung wird kontinuierlich abgeführt.By the filter effect a separation is achieved, wherein in the line 14 a concentrated suspension, which is the first, poorly water-soluble compound and the biocatalyst and the filtrate 15, the separated aqueous medium with the represents dissolved second compound. The concentrated suspension is passed over the line 14 returned to the bioreactor. The filtrate with the dissolved second compound is continuously dissipated.
In einer nicht gezeigten Anordnung wird die Isolierung der zweiten Verbindung aus dem Filtrat vorgenommen. Diese Isolierung kann mit gängigen Mitteln vorgenommen werden. Nach Entfernung der zweiten Verbindung aus dem Filtrat kann dieses wieder im Verfahren benutzt werden, um ein gewünschtes Reaktionsvolumen aufrecht zu erhalten. Sollte im Verfahren nicht vorgesehen werden, das Filtrat nach der Isolierung der zweiten Verbindung wiederzuverwenden, muß durch eine andere Maßnahme gewährleistet sein, daß das Volumen im gesamten System konstant bleibt.In an arrangement, not shown, the isolation of the second compound from the filtrate performed. This isolation can be done by common means. To Removal of the second compound from the filtrate can be used again in the process to maintain a desired reaction volume. Should be in the process can not be provided, the filtrate after isolation of the second compound reuse, must be ensured by another measure that the volume remains constant throughout the system.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird anhand eines Ausführungsbeispiels erläutert werden. Dieses Beispiel betrifft die regioselektive Oxidation von Terfenadin. The inventive method will be explained with reference to an embodiment. This example relates to the regioselective oxidation of terfenadine.
Bei Terfenadin handelt es sich um ein Antihistaminikum, welches aufgrund seiner nicht sedativen Wirkung seit seiner Markteinführung im Jahre 1985 bis ca. 1991 den Markt dominiert hat. Wegen seiner Nebenwirkungen (Herzrhythmusstörungen bei Überdosierung bzw. bei bestimmten Kombinationen mit weiteren Medikamenten) hat es seit 1991 stetig an Marktanteil verloren und lag Ende 1996 bei ca. 18% (Medical Sci. Bull. 1996,19(2), 3).Terfenadine is an antihistamine, which due to its not Sedative effect since its market launch in 1985 to about 1991 the market dominated. Because of its side effects (cardiac arrhythmia in case of overdose or in certain combinations with other drugs) has been steadily increasing since 1991 Market share lost and was at the end of 1996 at about 18% (Medical Sci. Bull. 1996, 19 (2), 3).
Genauere Untersuchungen der Wirkung von Terfenadin ergaben, daß es in der Leber durch Cytochrome P450 (CYP3A4) zu Fexofenadin oxidiert wird (J. E.: Coutant, Journal of Chromatography 1991, 570, 139-148).More detailed studies of the effects of terfenadine revealed that it was transmitted through the liver Cytochrome P450 (CYP3A4) is oxidized to fexofenadine (J.E .: Coutant, Journal of Chromatography 1991, 570, 139-148).
Erst dieses Oxidationsprodukt ist pharmakologisch wirksam. Von großem Interesse war dabei, daß die Nebenwirkungen aber durch das nicht-oxidierte Terfenadin erzeugt werden.Only this oxidation product is pharmacologically active. It was of great interest however, the side effects are produced by the non-oxidized terfenadine.
Aus diesem Grund wurde 1998 der Wirkstoff Fexofenadin als verschreibungspflichtiges Antihistaminikum in Deutschland eingeführt, um die Nebenwirkungen von Terfenadin zu umgehen.For this reason, in 1998 the active ingredient fexofenadine was given as a prescription Antihistamine in Germany introduced to the side effects of terfenadine too bypass.
Zur Synthese von Fexofenadin sind inzwischen verschiedene Wege veröffentlicht (S. H. Kawei, Journal of org. Chem. 1994, 59, 2620-2622; S. Patel, Synthetic Communication, 1996, 4699- 4710; Schwartz et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. (1996) 44, 731-734).In the meantime, various routes have been published for the synthesis of fexofenadine (S. H. Kawei, Journal of org. Chem. 1994, 59, 2620-2622; S. Patel, Synthetic Communication, 1996, 4699- 4710; Schwartz et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. (1996) 44, 731-734).
Von offensichtlichen Interesse ist jedoch eine Syntheseroute, bei der man auf den bestehenden
Produktionskapazitäten von Terfenadin aufbauen könnte und somit nur den letzten Schritt,
also die regioselektive Oxidation zusätzlich durchführt. Dies ist mit rein chemischen Methoden
in guten Ausbeuten nicht durchführbar.
Of obvious interest, however, is a synthetic route that could build on Terfenadin's existing production capacity and thus only make the final step, that is, regioselective oxidation. This is not feasible with pure chemical methods in good yields.
Alternativen bietet hier die Möglichkeit der Biotransformation mit ganzen Zellen. So ist die prinzipielle Fähigkeit der Oxidation von Terfenadin-ähnlichen Substanzen durch den Pilz Cunninghamella blakesleeana durch Schwartz et al. (Schwartz et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. (1996) 44, 731-734) gezeigt worden. Das Reaktionsschema zeigt die Umsetzung von Terfenadin I in seine Carbonsäure III über den Alkohol II.Alternatives offer the possibility of biotransformation with whole cells. That's how it is principal ability of the oxidation of terfenadine-like substances by the fungus Cunninghamella blakesleeana by Schwartz et al. (Schwartz et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. (1996) 44, 731-734). The reaction scheme shows the reaction of terfenadine I in its carboxylic acid III via the alcohol II.
Es war im Rahmen der Erfindung das Ziel, eine Aktivierung der tertiären Butylgruppe zu erzielen. Eine Umsetzung der Ausgangsverbindung 1 in den Alkohol II stellt eine erhebliche Verbesserung dar, weil die weitere Umsetzung des Alkohols II in das eigentliche Fexofenadin - also die Carbonsäure III - ohne große Probleme durchführbar ist.It was within the scope of the invention the goal to activate the tertiary butyl group achieve. Reaction of the starting compound 1 in the alcohol II represents a considerable Improvement because the further conversion of the alcohol II into the actual fexofenadine So the carboxylic acid III - is feasible without great problems.
Ein 1.2 l Rührkesselreaktor mit Querstrom-Mikrofiltration (Microdyn MD020TP2N, Porengröße 0.2 µm, 3 Rohre mit einem Innendurchmesser von 5.5 mm und einer Länge von 0.75 m aus Polypropylen, Membranfläche 0.036 m2) im Bypass, der mit 1.8 l sterilem Medium (siehe Tab. 1) gefüllt ist, wird mit einer 4 Tage alten sporulierten Agar-Kultur nach Homogenisation per Ultra-Turrax (30000 rpm, 30 s) beimpft. Der Bypassvolumenstrom wird auf 2.0 l/min eingestellt.A 1.2 l stirred tank reactor with cross-flow microfiltration (Microdyn MD020TP2N, pore size 0.2 μm, 3 tubes with an inner diameter of 5.5 mm and a length of 0.75 m made of polypropylene, membrane area 0.036 m 2 ) in the bypass, which is mixed with 1.8 l of sterile medium (see Tab 1) is inoculated with a 4-day-old sporulated agar culture after homogenization by Ultra-Turrax (30,000 rpm, 30 s). The bypass flow rate is set to 2.0 l / min.
Es wird eine Reaktionstemperatur von 30°C und ein pH zwischen 6.5-7.2 im Reaktor eingeregelt. Der pO2 wird mit der Begasungsrate als Stellgröße (20-1000 ml/min) auf 60% geregelt (Rührerdrehzahl: 1200 rpm). Nach Verbrauch der vorgelegten Glucosemenge (off-line überprüft durch Glucosemessung) werden jeweils 20 g/l Glucosemonohydrat zudosiert, bis eine Gesamtmenge von 60 g/l Glucosemonohydrat erreicht ist. Danach werden 6 g/(l d) Glycerin zudosiert. It is adjusted a reaction temperature of 30 ° C and a pH between 6.5-7.2 in the reactor. The pO 2 is controlled to 60% with the gassing rate as control variable (20-1000 ml / min) (stirrer speed: 1200 rpm). After consumption of the presented amount of glucose (checked off-line by glucose measurement) 20 g / l glucose monohydrate are added in each case until a total amount of 60 g / l glucose monohydrate is reached. Thereafter, 6 g / (ld) of glycerol are added.
Die Löslichkeit von Terfenadin ist sehr gering (21 mg/l bei pH 7.5 in Wasser). Um eine möglichst holze Umsetzungsgeschwindigkeit im Rührreaktor zu erreichen, muß sichergestellt sein, daß zumindest die Löslichkeitsgrenze zu jedem Zeitpunkt im Rührreaktor erreicht wird. Daher wurde die Reaktion als "mikrokristalline Fermentation" durchgeführt: Hierzu wird Terfenadin in einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel wie z. B. Methanol, Dimethylformamid (DMF) oder Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst und in den Rührreaktor eingetragen. Wenn sich das Lösungsmittel im wäßrigen Medium verteilt, kristallisiert Terfenadin aus. Um eine möglichst feine Dispergierung des Eduktes, und damit eine große Feststoffoberfläche im Reaktor zu erreichen, erfolgte der Eintrag der Terfenadinlösung an der Stelle im Rührreaktor mit höchster lokaler Energiedissipation.The solubility of terfenadine is very low (21 mg / l at pH 7.5 in water). To one To achieve as far as possible conversion rate in the stirred reactor, must be ensured be that at least the solubility limit is reached at any time in the stirred reactor. Therefore, the reaction was carried out as "microcrystalline fermentation" Terfenadine in a water-miscible organic solvent such. Methanol, Dissolved dimethylformamide (DMF) or dimethyl sulfoxide (DMSO) and in the stirred reactor entered. When the solvent is distributed in the aqueous medium, it crystallizes Terfenadin off. To a very fine dispersion of the educt, and thus a large To achieve solid surface in the reactor, the entry of Terfenadinlösung took place at the Place in the stirred reactor with highest local energy dissipation.
Die Terfenadinzugabe wurde automatisiert, indem rechnergesteuert definierte Mengen einer alkoholischen Terfenadinlösung mit Druckluftimpulsen (4 bar) in den Rührreaktor "geschossen" wurden.The addition of terfenadine was automated by using computer-aided defined quantities of a alcoholic terfenadine solution with compressed air pulses (4 bar) "shot" into the stirred reactor were.
Es wurde mit Beginn der Glycerindosierung ein Filtratvolumen-strom von 50 ml/h aus dem Rührreaktor mit Querstrom-Mikrofiltration im Bypass entnommen (siehe Abb. 1). Die Ergebnisse einer mikrokristallinen Fermentation zur regioselektiven Oxidation von Terfenadin in diesem Rührreaktor mit Querstrom-Mikrofiltration sind in Abb. 2 dargestellt.At the beginning of the glycerol dosing, a filtrate volume flow of 50 ml / h was withdrawn from the stirred reactor with cross-flow microfiltration in the bypass (see FIG. 1). The results of a microcrystalline fermentation for the regioselective oxidation of terfenadine in this stirred reactor with cross-flow microfiltration are shown in Fig. 2.
In dieser Abb. 2 stellen die rechteckigen Symbole die real gemessenen Werte der Konzentration des Alkohols II im Verfahren dar, während die kreisförmigen Symbole fiktive Werte sind, welche die Konzentration des Alkohols II in dem Bioreaktor darstellen, welche ohne Abtrennung durch Filtration theoretisch in dem Bioreaktor realisiert wären.In this Fig. 2, the rectangular symbols represent the real measured values of the concentration of the alcohol II in the process, while the circular symbols are fictitious values representing the concentration of the alcohol II in the bioreactor, which without separation by filtration theoretically in the bioreactor would be realized.
Man erkennt, daß durch Einstellung des Filtratvolumenstroms auf 50 ml/h die Konzentration des Alkohola II im Reaktor auf ca 200 mg/l begrenzt werden konnte. Die insgesamt erzeugte Produktmenge übersteigt mit (bilanzierten) 900 mg/l die bei der mikrokristallinen Fermentation ohne Mikrofiltration nach 200 h maximal erzeugte Menge um 50%. It can be seen that by adjusting the filtrate volume flow to 50 ml / h, the concentration of the alcohol II in the reactor to about 200 mg / l could be limited. The total generated Product amount exceeds 900 mg / l (balanced) in microcrystalline fermentation without microfiltration after 200 h maximum amount generated by 50%.
Darüberhinaus ist es möglich, den gebildeten Alkohol II mit einem Adsorptionsverfahren (XAD-4 Adsorberharz) selektiv aus dem Filtratstrom zu entfernen und in einem Schritt um den Faktor 10 zu konzentrieren (Eluation mit Methanol, Ausbeute: 95%).Moreover, it is possible to form the alcohol II formed by an adsorption process (XAD-4 adsorbent resin) selectively removed from the filtrate stream and in one step to the Factor 10 to concentrate (elution with methanol, yield: 95%).
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