DE20023745U1

DE20023745U1 - Regulierung von endogenen Genen

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Publication number: DE20023745U1
Application number: DE20023745U
Authority: DE
Original assignee: Sangamo Biosciences Inc
Current assignee: Sangamo Therapeutics Inc
Priority date: 1999-01-12
Filing date: 2000-01-06
Publication date: 2006-02-23
Anticipated expiration: 2010-01-07
Also published as: US20100261271A1; US20100279406A1; WO2000041566A1; US7163824B2; JP5490971B2; DK1061805T3; CA2323086A1; AU2847000A; WO2000041566A9; ATE304792T1; US6979539B2; US6933113B2; US20060078878A1; DE60022705T2; JP2002534104A; JP2011207893A; US6534261B1; US7985887B2; AU745844B2; US20060276427A1

Abstract

Isolierte Zelle, umfassend ein mikrobielles oder virales Gen, das Teil eines die Zelle infizierenden natürlich vorkommenden mikrobiellen oder viralen Genoms ist, wobei der Zelle verabreicht worden ist:
(i) ein erstes Protein, umfassend eine erste Zinkfinger-Domäne und eine regulatorische Domäne, wobei die erste Zinkfinger-Domäne so konstruiert ist, dass sie eine erste Zielstelle in dem mikrobiellen oder viralen Gen erkennt und eine K_d von weniger als 25 nM aufweist, oder
(ii) eine Nukleinsäure, umfassend das erste Protein codierende Sequenzen in operativer Verknüpfung mit einem Promotor, so dass das erste Protein in der Zelle exprimiert ist.

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt eine isolierte Zelle sowie eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Regulation der Genexpression von endogenen Genen unter Verwendung von rekombinanten Zinkfingerproteinen bereit.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Viele pathophysiologische Prozesse sind das Ergebnis einer aberrierenden Genexpression. Beispiele umfassen die fehlerhafte Aktivierung der proinflammatorischen Cytokine bei rheumatoider Arthritis, die Unterexpression des hepatischen LDL-Rezeptors bei der Hypercholesterinämie, die Überexpression von proangiogenetischen Faktoren und die Unterexpression von antiangiogenetischen Faktoren bei solidem Tumorwachstum. Würden therapeutische Verfahren zur Kontrolle der Genexpression existieren, könnten viele dieser Pathologien besser behandelt werden. Andererseits könnten entwicklungsgemäß stille oder anderweitig inaktive Gene aktiviert werden, um einen bestimmten Krankheitszustand zu behandeln. Inaktive Gene werden durch verschiedene Mechanismen, umfassend die Chromatinstruktur, spezifische cis-wirkende Repressoren und die DNA-Methylierung (Travers, Cell 96: 311 (1996); Beato & Eisfeld, Nucleic Acids Res. 25: 3559 (1997); Wolffe et al., PNAS 96: 5894 (1999)), reprimiert. Beispiele des therapeutischen Nutzens der Expression solcher Gene umfassen die Aktivierung von entwicklungsgemäß stillen fetalen Hämoglobin-Genen, um die Sichelzellkrankheit zu behandeln, und die Aktivierung von Eutrophin, um Muskeldystrophie zu behandeln. Zudem könnten pathogene Organismen, wie Viren, Bakterien, Pilze und Protozoen, durch eine Veränderung der Genexpression kontrolliert werden. Es besteht daher ein klarer, bisher ungedeckter Bedarf an therapeutischen Ansätzen, welche auf einer sequenzspezifischen Regulation von Genen, die mit einer Krankheit in Beziehung stehen, basieren.
Zusätzlich zu dem direkten therapeutischen Nutzen, der durch die Möglichkeit der Manipulation der Genexpression bereitgestellt wird, kann die Manipulation der Genexpression experimentell verwendet werden, um die Funktion eines Gens von Interesse zu bestimmen. Ein bekanntes existierendes Verfahren zur experimentellen Bestimmung der Funktion eines neu entdeckten Gens beruht auf der Klonierung von dessen cDNA in einen Expressionsvektor, der durch einen starken Promotor gesteuert wird, und der Messung der physiologischen Auswirkung von dessen Überexpression in einer transfizierten Zelle. Dieses Verfahren ist arbeitsintensiv und befasst sich nicht mit den physiologischen Auswirkungen der Abregulierung eines Zielgens. Einfache Verfahren, welche die selektive Über- und Unterexpression von nicht charakterisierten Genen ermöglichen würden, wären von großem Nutzen für die wissenschaftliche Gemeinschaft. Verfahren, welche die Regulation von Genen in Zellmodellsystemen, transgenen Tieren und transgenen Pflanzen ermöglichen würden, würden in akademischen Laboratorien, pharmazeutischen Unternehmen, Genomikunternehmen und in der biotechnologischen Industrie weit verbreitet Anwendung finden.
Eine zusätzliche Verwendung von Verfahren, welche die Manipulation der Genexpression ermöglichen, besteht in der Erzeugung von kommerziell verwendbaren biologischen Produkten. Zelllinien, transgene Tiere und transgene Pflanzen könnten konstruiert werden, um ein nützliches Proteinprodukt zu überexprimieren. Die Erzeugung von Erythropoetin durch solch eine erzeugte Zelllinie dient als Beispiel dafür. Ähnlich könnte die Erzeugung über metabolische Wege durch die selektive Auf- oder Abregulierung eines Gens, welches für ein kritisches Enzym codiert, verändert oder verbessert werden. Ein Beispiel dafür stellt die Erzeugung von Pflanzen mit veränderten Fettsäuresättigungsgraden dar.
Derzeit existieren im Stand der Technik Verfahren, welche eine Veränderung der Expression eines gegebenen Gens, z.B. durch Verwendung von Ribozymen, Antisense-Technologie, Kleinmolekülregulatoren, Überexpression von cDNA-Klonen und Gen-Knockouts, ermöglichen. Diese Verfahren haben sich bislang als im Allgemeinen unzureichend für viele Anwendungen erwiesen und zeigten üblicherweise in vivo weder eine hohe Wirksamkeit noch eine hohe Spezifität für ihr Ziel. Für geeignete experimentelle Ergebnisse und therapeutische Behandlungen sind solche Merkmale jedoch erwünscht.
Die Genexpression wird üblicherweise durch Veränderungen der Funktion von sequenzspezifischen DNA-Bindungsproteinen, sogenannten Transkriptionsfaktoren, kontrolliert. Diese binden im Allgemeinen in der Nähe (obwohl gelegentlich auch mit großem Abstand) des Transkriptionsinitiationspunkts eines Gens. Durch ihre Wirkung wird die Bildungseffizienz oder die Funktion eines Transkriptionsinitiationskomplexes an dem Promotor beeinflusst. Transkriptionsfaktoren können auf eine positive Weise (Transaktivierung) oder auf eine negative Weise (Transrepression) wirken.
Die Transkriptionsfaktorfunktion kann konstitutiv (immer "an") oder konditional sein. Eine konditionale Funktion kann einem Transkriptionsfaktor durch eine Vielzahl von Mitteln verliehen werden, wobei die Mehrzahl dieser regulatorischen Mechanismen jedoch von der Maskierung des Faktors in dem Cytoplasma und der induzierbaren Freisetzung und der nachfolgenden Kerntranslokation, der DNA-Bindung und DNA-Transaktivierung (oder DNA-Repression) abhängt. Beispiele von Transkriptionsfaktoren, welche auf diese Art und Weise funktionieren, umfassen Progesteronrezeptoren, SREBPs (Sterol-Response-Element-Binding-Proteins) und NF-kappa B. Es gibt Beispiele von Transkriptionsfaktoren, die auf eine Phosphorylierung oder auf Kleinmolekülliganden durch Veränderung ihrer Fähigkeit, ihre verwandte DNA-Erkennungssequenz (Hou et al., Science 256: 1701 (1994); Gossen & Bujard, PNAS 89: 5547 (1992); Oligino et al., Gene Ther. 5: 491–496 (1998); Wang et al., Gene Ther. 4: 432-441 (1997); Neering et al., Blood 88: 1147–1155 (1996); und Rendahl et al., Nat. Biotechnol. 16: 757–761 (1998)) zu binden, reagieren. Dieser Mechanismus ist Prokaryoten gemein, kommt jedoch weniger häufig in Eukaryoten vor.
Zinkfingerproteine ("ZFPs") sind Proteine, die auf eine sequenzspezifische Art und Weise an DNA binden. Zinkfinger wurden zu allererst in dem Transkriptionsfaktor TFIIIA aus den Oozyten des afrikanischen Krallenfrosches, Xenopus laevis, identifiziert. ZFPs sind in eukaryotischen Zellen weit verbreitet. Ein beispielhaftes Motiv, das eine Klasse dieser Proteine (C₂H₂-Klasse) kennzeichnet, ist -Cys-(X)_2-4-Cys-(X)₁₂-His-(X)_3-5-His (wobei X jede Aminosäure sein kann). Eine einzelne Fingerdomäne ist etwa 30 Aminosäuren lang und zahlreiche strukturelle Studien haben gezeigt, dass sie eine alpha-Helix enthält, welche die zwei invarianten, durch Zink mit den zwei Cysteinresten eines einzelnen beta-Turns koordinierten Histidinreste enthält. Bislang wurden über 10.000 Zinkfingersequenzen in mehreren Tausend bekannten oder putativen Transkriptionsfaktoren identifiziert. ZFPs sind nicht nur in die DNA-Erkennung involviert, sondern auch in die RNA-Bindung und die Protein-Protein-Bindung. Momentane Schätzungen gehen davon aus, dass diese Klasse von Molekülen etwa 2 aller humanen Gene darstellt.
Die Röntgenkristallstruktur von Zif268, einer Drei-Finger-Domäne aus einem murinen Transkriptionsfaktor, wurde im Komplex mit seiner verwandten DNA-Sequenz gelöst und zeigt, dass jeder Finger durch eine periodische Rotation und Translation des Fingers entlang der Haupt-DNA-Achse mit dem nächsten Finger überlagert werden kann. Die Struktur schlägt vor, dass jeder Finger unabhängig über drei Basenpaarintervalle mit der DNA wechselwirkt, wobei die Seitenketten an den Positionen –1, 2, 3 und 6 jeder Erkennungshelix Wechselwirkungen mit entsprechenden DNA-Tripletunterstellen eingehen. Der Aminoterminus von Zif268 befindet sich an dem 3'-Ende seiner DNA-Erkennungsunterstelle. Einige Zinkfinger können in einem Zielsegment an eine vierte Base binden. Die vierte Base befindet sich auf dem gegenüberliegenden Strang in Bezug auf die anderen drei durch den Zinkfinger erkannten Basen und ist komplementär zu der Base, die sich unmittelbar 3' der Drei-Basen-Unterstelle befindet.
Die Struktur des Zif268-DNA-Komplexes legt auch nahe, dass die DNA-Sequenzspezifität eines ZFP durch die Einführung von Aminosäuresubstitutionen an den vier Helixpositionen (–1, 2, 3 und 6) auf einer Zinkfingererkennungshelix verändert werden kann. Phage-Display-Experimente unter Verwendung von kombinatorischen Zinkfingerbibliotheken, um diese Beobachtung zu untersuchen, wurden in einer Reihe von Veröffentlichungen im Jahre 1994 publiziert (Rebar et al., Science 263: 671–673 (1994); Jamieson et al., Biochemistry 33: 5689–5695 (1994); Choo et al., PNAS 91: 11163–11167 (1994)). Kombinatorische Bibliotheken mit randomisierten Seitenketten, entweder in dem ersten oder dem mittleren Finger von Zif268, wurden konstruiert und nachfolgend mit einer veränderten Zif268-Bindungsstelle, bei der die entsprechende DNA-Unterstelle durch ein verändertes DNA-Triplet ersetzt war, selektioniert. Eine Korrelation zwischen der Art der eingeführten Mutation und der resultierenden Veränderung der Bindungsspezifität führte zu einer unvollständigen Reihe von Substitutionsregeln für den rationellen Design von ZFPs mit veränderten Bindungsspezifitäten.
Greisman & Pabo, Science 275: 657–661 (1997) haben eine Ausarbeitung eines Phage-Display-Verfahrens diskutiert, bei dem jeder Finger eines Zinkfingerproteins nacheinanderfolgend einer Randomisierung und Selektion unterzogen wird. Diese Veröffentlichung berichtet von der Selektion von ZFPs für ein Kernhormonantwortelement, eine p53-Zielstelle und eine TATA-Box-Sequenz.
Es wurde berichtet, dass rekombinante ZFPs die Fähigkeit besitzen, die Genexpression von transient exprimierten Reportergenen in kultivierten Zellen zu regulieren (siehe z.B. Pomerantz et al., Science 267: 93–96 (1995); Liu et al., PNAS 94: 5525-5530 (1997); und Beerli et al., PNAS 95: 14628–14633 (1998)).
Pomerantz et al., Science 267: 93–96 (1995) haben beispielsweise von einem Versuch berichtet, ein neues DNA-Bindungsprotein durch Fusion von zwei Fingern aus Zif268 mit einer Homeodomäne von Oct-1 zu entwickeln. Das Hybridprotein wurde dann für die Expression als chimäres Protein entweder mit einer Transkriptionsaktivatordomäne oder einer Transkriptionsrepressordomäne fusioniert. Es wurde berichtet, dass das chimäre Protein an eine Zielstelle bindet, die ein Hybrid der Unterstellen seiner zwei Komponenten darstellt. Die Autoren erzeugten dann einen Reportervektor, der ein operativ mit einem Promotor verknüpftes Luciferase Gen und eine Hybridstelle für das chimäre DNA-Bindungsprotein in der Nähe des Promotors enthielt. Die Autoren haben berichtet, dass ihr chimäres DNA-Bindungsprotein die Expression des Luciferase Gens aktivieren oder reprimieren kann.
Liu et al., PNAS 94: 5525–5530 (1997) haben von der Erzeugung eines gemischten ZFP durch Verwendung eines Peptidspacers, um zwei ZFP-Komponenten, die jeweils drei Finger aufwiesen, zu verknüpfen, berichtet. Das gemischte Protein wurde dann ferner mit Transkriptionsaktivatordomänen oder Transkriptionsrepressordomänen verbunden. Es wurde berichtet, dass das resultierende chimäre Protein an eine Zielstelle bindet, die durch die Zielsegmente, welche von den zwei ZFP-Komponenten gebunden werden, gebildet wird. Es wurde ferner berichtet, dass das chimäre ZFP die Transkription eines Reportergens aktivieren oder reprimieren kann, wenn seine Zielstelle in ein Reporterplasmid in der Nähe eines mit dem Reporter operativ verknüpften Promotors eingebracht wird.
Beerli et al., PNAS 95: 14628–14633 (1998) haben von der Erzeugung eines chimären Sechs-Finger-ZFP berichtet, das entweder mit einer KRAB-, ERD- oder SID-Transkriptionsrepressordomäne oder der VP16- oder VP64-Transkriptionsaktivatordomäne fusioniert ist. Dieses chimäre ZFP wurde zur Erkennung einer 18 bp-Zielstelle in der 5'-untranslatierten Region des humanen erbB-2-Gens entwickelt. Die Autoren dieser Studie haben in Bezug auf dieses Konstrukt sowohl von einer Aktivierung als auch einer Repression eines transient exprimierten Reporter-Luciferase-Konstrukts berichtet, das mit dem erbB-2-Promotor verknüpft ist.
Zusätzlich wurde von einem rekombinanten ZFP berichtet, das die Expression eines integrierten Plasmidkonstrukts, das für ein bcr-abl-Oncogen codierte (Choo et al., Nature 372: 642–645 (1994); und WO 96/06166), reprimieren kann. Das Zielsegment, an welches das ZFP bindet, ist eine Sequenz aus neun Basen, GCA GAA GCC, die so ausgewählt wurde, dass sie die durch eine spezifische oncogene Translokation, welche die bcr und abl codierenden Gene fusioniert, erzeugte Verbindungsstelle überlappt. Ziel war es, dass ein für diese Zielstelle spezifisches ZFP an das Oncogen bindet, ohne an die abl- oder bcr-Gene zu binden. Die Autoren verwendeten Phage-Display, um eine ZFP-Variante auszuwählen, die an dieses Zielsegment bindet. Es wurde berichtet, dass die so isolierte ZFP-Variante die Expression eines stabil transfizierten bcr-abl-Konstrukts in einer Zelllinie reprimieren kann.
Bislang fokussierten diese Verfahren auf die Regulation von transient exprimierten Genen oder auf die Regulation von exogenen Genen, die in das Genom integriert wurden. Die durch Pomerantz et al., Liu et al. und Beerli et al. beschriebenen transient exprimierten Gene sind episomal und liegen nicht, wie chromosomale Gene, in Chromatin verpackt vor. Überdies ist selbst das durch Choo et al. beschriebene stabil exprimierte Gen zufällig in das Genom integriert und kommt verglichen mit einem endogenen Gen nicht in einer nativen Chromatinumgebung vor. Ganz im Gegenteil konnte die spezifische Regulation eines endogenen zellulären Gens in seiner nativen Chromatinumgebung unter Verwendung eines ZFP bislang im Stand der Technik nicht gezeigt werden.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft in einem ersten Aspekt eine isolierte Zelle, umfassend ein endogenes Gen, wobei der Zelle verabreicht worden ist:

(i) ein erstes Protein, umfassend eine erste Zinkfinger-Domäne und eine regulatorische Domäne, wobei die erste Zinkfinger-Domäne so konstruiert ist, dass sie eine erste Zielstelle in dem endogenen Gen erkennt und eine K_d von weniger als 25 nM aufweist, oder
(ii) eine Nukleinsäure, umfassend das erste Protein codierende Sequenzen in operativer Verknüpfung mit einem Promotor, so dass das erste Protein in der Zelle exprimiert wird.

Erfindungsgemäß handelt es sich bei dem endogenen Gen um ein mikrobielles oder virales Gen, das Teil eines die Zelle infizierenden natürlich vorkommenden mikrobiellen oder viralen Genoms ist. Insbesondere dient die erfindungsgemäße Zelle zur Modulation der Expression des endogenen Gens.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine therapeutische Zusammensetzung, umfassend ein Protein bereit, wobei das Protein eine Zinkfinger-Domäne und eine regulatorische Domäne umfasst, wobei die Zinkfinger-Domäne

(i) so konstruiert ist, dass sie eine erste Zielstelle in einem endogenen Gen erkennt, und
(ii) eine K_d von weniger als 25 nM aufweist.

Erfindungsgemäß handelt es sich bei dem endogenen Gen um ein mikrobielles oder virales Gen, das Teil eines natürlich vorkommenden mikrobiellen oder viralen Genoms in einer mikrobiell oder viral infizierten Zelle ist. Vorzugsweise dient die pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung eines Krankheitszustands ausgewählt aus einer Viren-, Pilz-, Protozoen- oder Bakterieninfektion.
Ferner stellt die vorliegende Erfindung in einem weiteren Aspekt eine therapeutische Zusammensetzung, umfassend ein Nukleinsäuremolekül bereit, wobei das Nukleinsäuremolekül eine ein Protein codierende Sequenz in operativer Verknüpfung mit einem Promotor umfasst, wobei das Protein eine Zinkfinger-Domäne und eine regulatorische Domäne umfasst, wobei die Zinkfinger-Domäne

Erfindungsgemäß handelt es sich bei dem endogenen Gen um ein mikrobielles oder virales Gen, das Teil eines natürlich vorkommenden mikrobiellen oder viralen Genoms in einer mikrobiell oder viral infizierten Zelle ist. Vorzugsweise dient die pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung eines Krankheitszustands ausgewählt aus einer Viren-, Pilz-, Protozoen- oder Bakterieninfektion.
Die der vorliegenden Erfindung zugrunde liegenden Aspekte basieren auf der Entwicklung von Verfahren zur Regulation endogener zellulärer Genexpression, wobei die endogenen Gene im Gegensatz zu Genen, die in einer Zelle transient exprimiert werden, oder Genen, die exogen in das Genom integriert wurden, in ihrer nativen Chromatinumgebung vorliegen. Mit Hilfe dieser Verfahren ist es erstmals möglich, ein entwicklungsgemäß stilles endogenes Gen zu aktivieren. Die Regulationsverfahren verwenden chimäre ZFPs mit einer K_d von weniger als etwa 25 nM, um die Gentranskription zu aktivieren oder reprimieren. Die erfindungsgemäßen ZFPs können daher verwendet werden, um die Transkription eines endogenen zellulären Gens um 20 % oder mehr zu reprimieren und können verwendet werden, um die Transkription eines endogenen zellulären Gens um das etwa 1,5-Fache oder mehr zu aktivieren. Demzufolge finden die in Zusammenhang mit den entwickelten Verfahren beschriebenen Ausführungsformen auch analog auf die oben beschriebenen Aspekte der vorliegenden Erfindung Anwendung.
Die entwickelten Verfahren zur Regulation der endogenen zellulärer Genexpression dienen dabei im wesentlichen zur Modulation der Expression eines endogenen Gens in einer isolierten Zelle, wie eines mikrobiellen oder viralen Gens, das Teil eines natürlich vorkommenden mikrobiellen oder viralen Genoms in einer mikrobiell oder viral infizierten isolierten Zelle ist, wobei die Verfahren den Schritt des Inkontaktbringens der Zelle mit:

(i) einem ersten Protein, umfassend eine erste Zinkfinger-Domäne und eine regulatorische Domäne, wobei die Zinkfinger-Domäne so konstruiert ist, dass sie eine erste Zielstelle in dem endogenen Gen, wie dem mikrobiellen oder viralen Gen, erkennt und eine K_d von weniger als 25 nM aufweist, oder
(ii) einer Nukleinsäure, umfassend das erste Protein codierende Sequenzen in operativer Verknüpfung mit einem Promotor, so dass das erste Protein in der Zelle exprimiert wird,

Gemäß den entwickelten Verfahren kann die Expression eines endogenen zellulären Gens in einer Zelle durch Inkontaktbringen einer ersten Zielstelle in dem endogenen zellulären Gen mit einem ersten Zinkfingerprotein inhibiert werden, wobei die K_d des Zinkfingerproteins weniger als etwa 25 nM beträgt. So wird die Expression des endogenen zellulären Gens um wenigstens etwa 20 % inhibiert.
Ferner kann die Expression eines endogenen Gens in einer Zelle durch Inkontaktbringen einer Zielstelle in dem endogenen Gen mit einem Zinkfingerfusionsprotein, umfassend sechs Finger und eine regulatorische Domäne, inhibiert werden, wobei die K_d des Zinkfingerproteins weniger als etwa 25 nM beträgt. So kann die Expression des endogenen zellulären Gens um wenigstens etwa 20 % inhibiert werden.
Gemäß einer Ausführungsform wird die Expression des endogenen zellulären Gens um wenigstens etwa 75 % bis 100 % inhibiert. Gemäß einer anderen Ausführungsform verhindert die Inhibierung der Genexpression eine Genaktivierung.
Zudem kann die Expression eines endogenen zellulären Gens mit Hilfe der entwickelten Verfahren durch Inkontaktbringen einer ersten Zielstelle in dem endogenen zellulären Gen mit einem ersten Zinkfingerprotein aktiviert werden, wobei die K_d des Zinkfingerproteins weniger als etwa 25 nM beträgt. So kann die Expression des endogenen zellulären Gens um wenigstens etwa 150 % aktiviert werden.
Des Weiteren kann die Expression eines endogenen zellulären Gens durch Inkontaktbringen einer Zielstelle in dem endogenen zellulären Gen mit einem Zinkfingerfusionsprotein, umfassend sechs Finger und eine regulatorische Domäne, aktiviert werden, wobei die K_d des Zinkfingerproteins weniger als etwa 25 nM beträgt. So kann die Expression des endogenen zellulären Gens um wenigstens etwa 150 % aktiviert werden.
Gemäß einer Ausführungsform der entwickelten Verfahren wird die Expression des endogenen zellulären Gens um wenigstens etwa 200 % bis 500 % aktiviert. Gemäß einer anderen Ausführungsform verhindert die Aktivierung der Genexpression eine Repression der Genexpression.
Die entwickelten Verfahren sehen auch vor, dass die Expression eines endogenen zellulären Gens in einer Zelle durch Inkontaktbringen einer ersten Zielstelle in dem endogenen zellulären Gen mit einem ersten Zinkfingerprotein moduliert werden kann, wodurch die Expression des endogenen zellulären Gens moduliert wird.
Gemäß einer Ausführungsform weist das Zinkfingerprotein zwei, drei, vier, fünf oder sechs Finger auf.
Auch kann die Expression eines endogenen zellulären Gens in einer Zelle durch Inkontaktbringen einer Zielstelle in dem endogenen zellulären Gen mit einem Zinkfingerfusionsprotein, umfassend sechs Finger und eine regulatorische Domäne, moduliert werden, wodurch die Expression des endogenen zellulären Gens moduliert wird.
Zudem können die entwickelten Verfahren den Schritt des Inkontaktbringens einer zweiten Zielstelle in dem endogenen zellulären Gen mit einem zweiten Zinkfingerprotein umfassen. Gemäß einer anderen Ausführungsform sind die erste Zielstelle und die zweite Zielstelle benachbart. Gemäß einer anderen Ausführungsform sind das erste Zinkfingerprotein und das zweite Zinkfingerprotein kovalent verbunden. Gemäß einer anderen Ausführungsform ist das erste Zinkfingerprotein ein Fusionsprotein, umfassend eine regulatorische Domäne. Gemäß einer anderen Ausführungsform ist das erste Zinkfingerprotein ein Fusionsprotein, umfassend wenigstens zwei regulatorische Domänen. Gemäß einer anderen Ausführungsform sind das erste Zinkfingerprotein und das zweite Zinkfingerprotein Fusionsproteine, wobei jedes eine regulatorische Domäne umfasst. Gemäß einer anderen Ausführungsform sind das erste Zinkfingerprotein und das zweite Zinkfingerprotein Fusionsproteine, wobei jedes wenigstens zwei regulatorische Domänen umfasst.
Das endogene zelluläre Gen ist beispielsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus VEGF, Erα, IGF-I, c-myc, c-myb, ICAM, Her2/Neu, FAD2-1, EPO, GM-CSF, GDNF und LDL-R. Gemäß einer anderen Ausführungsform ist das endogene zelluläre Gen ein entwicklungsgemäß stilles oder anderweitig inaktives Gen, z.B. EPO, GATA, Proteine der Interleukin-Familie, GM-CSF, MyoD, Eutrophin und fetales Hämoglobin-Gamma und -Delta. Gemäß einer anderen Ausführungsform ist die regulatorische Domäne ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Transkriptionsrepressor, einem Transkriptionsaktivator, einer Endonuklease, einer Methyltransferase, einer Histonacetyltransferase und einer Histondeacetylase.
Ferner ist die Zelle beispielsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer Tierzelle, einer Pflanzenzelle, einer Bakterienzelle, einer Protozoenzelle oder einer Pilzzelle. Gemäß einer anderen Ausführungsform ist die Zelle eine Säugetierzelle. Gemäß einer anderen Ausführungsform ist die Zelle eine menschliche Zelle.
Die entwickelten Verfahren können ferner den Schritt des ersten Verabreichens eines Transportvehikels, umfassend das Zinkfingerprotein, an die Zelle umfassen, wobei das Transportvehikel ein Liposom oder ein Membrantranslokationspolypeptid umfasst.
Es ist auch vorgesehen, dass das Zinkfingerprotein durch eine in operativer Verknüpfung mit einem Promotor vorliegende Nukleinsäure für ein Zinkfingerprotein codiert wird und die Verfahren ferner den Schritt des ersten Verabreichens der Nukleinsäure an die Zelle in einem Lipid:Nukleinsäure-Komplex oder als nackte Nukleinsäure umfassen. Gemäß einer anderen Ausführungsform wird das Zinkfingerprotein durch einen Expressionsvektor, umfassend eine in operativer Verknüpfung mit einem Promotor vorliegende Nukleinsäure für ein Zinkfingerprotein, codiert und die Verfahren umfassen ferner den Schritt des ersten Verabreichens des Expressionsvektors an die Zelle. Gemäß einer anderen Ausführungsform ist der Expressionsvektor ein viraler Expressionsvektor. Gemäß einer weiteren Ausführungsform ist der Expressionsvektor ein retroviraler Expressionsvektor, ein adenoviraler Expressionsvektor, ein DNA-Plasmid-Expressionsvektor oder ein AAV-Expressionsvektor.
Gemäß einer Ausführungsform wird das Zinkfingerprotein durch eine in operativer Verknüpfung mit einem induzierbaren Promotor vorliegende Nukleinsäure codiert. Gemäß einer anderen Ausführungsform wird das Zinkfingerprotein durch eine in operativer Verknüpfung mit einem schwachen Promotor vorliegende Nukleinsäure codiert.
Zudem sehen die entwickelten Verfahren vor, dass die Zelle weniger als etwa 1,5×10⁶ Kopien des Zinkfingerproteins umfasst.
Gemäß einer Ausführungsform ist die Zielstelle stromaufwärts einer Transkriptionsinitiationsstelle des endogenen zellulären Gens. Gemäß einer anderen Ausführungsform ist die Zielstelle benachbart zu einer Transkriptionsinitiationsstelle des endogenen zellulären Gens. Gemäß einer anderen Ausführungsform ist die Zielstelle benachbart zu einer RNA-Polymerase-Pausenstelle stromabwärts einer Transkriptionsinitiationsstelle des endogenen zellulären Gens.
Gemäß einer anderen Ausführungsform umfasst das Zinkfingerprotein ein SP-1-Grundgerüst. Gemäß einer anderen Ausführungsform umfasst das Zinkfingerprotein eine regulatorische Domäne und ist humanisiert.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1: PCR-Amplifikationsschema zur Erzeugung von ZFP-codierenden synthetischen Genen.
2: Expression und Reinigung von typischen ZFPs. 2A: Nichtfusioniertes ZFP vor der Induktion (Bahn 1), nach der Induktion (Bahn 2) und nach der Aufreinigung (Bahn 3). 2B: MBP-VEGF-Expression vor der Induktion (Bahn 1), nach der Induktion (Bahn 2) und nach einer French-Press Lyse (Bahn 3). 2C: Reinigung von MBP-VEGF durch Amyloseaffinitätschromatographie, wobei die Durchflussfraktion (FT) und die anfänglichen Fraktionen (1–4) gezeigt sind. Fraktion 2 wurde für einen elektrophoretischen Mobilitätsshiftassay ("EMSA") verwendet. M, Molekulargewichtsmarker.
3: Ein typisches EMSA-Experiment mit MBP-fusioniertem ZFP. MBP-VEGF1-Protein wurde wie in der Beschreibung beschrieben an eine markierte Duplex-DNA gebunden. Eine dreifache Proteinverdünnungsserie wurde erstellt. Jeder Punkt stellt den geshifteten prozentualen Anteil an der bestimmten Proteinkonzentration dar, die in einem Semi-log-Diagramm aufgetragen ist. Eine Quantifizierung erfolgte durch einen Phosphorimager. In diesem Fall betrug die Proteinkonzentration, die 50 % des maximalen Shifts (das apparente K_d) ergab, 2 nM.
4: Off-Raten-Experiment, das VEGF1 mit VEGF3a/1 vergleicht. Protein-DNA-Komplexe wurden erzeugt und mit einem 1000-fachen Überschuss an unmarkierten Oligonukleotiden inkubiert. Die Proben wurden bei verschiedenen Zeiten elektrophoretisch untersucht und die Menge des geshifteten Produkts wurde durch einen Phosphorimager untersucht. Ein Kurvenfitting wurde verwendet, um die angegebenen Komplexhalbwertszeiten zu berechnen.
5: Ein typischer Expressionsvektor, der für eine transiente ZFP-Expression in Säugetierzellen verwendet wurde.
6: Cotransfektionsdaten, die die Repression der Luciferase-Reporteraktivität aufgrund einer VEGF-KRAB-Proteinexpression zeigen. Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichungen von dreifachen Transfektionen. pGL3-C (Reportervektorkontrolle); pVFR1-4x (VEGF-Reporterplasmid); VEGF1 (VEGF1-KRAB); VEGF3a (VEGF3a-KRAB); VEGF3a/1 (VEGF3a/1-KRAB).
7: Cotransfektionsdaten, die die Aktivierung der Luciferase-Reporteraktivität aufgrund einer VEGF-VP16-Proteinexpression zeigen. Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichungen von dreifachen Transfektionen. pGL3-P (Reporter mit keinem VEGF-Ziel); pcDNA (leere Effektorvektorkontrolle); pVFR3-4x (VEGF-Reporterplasmid); VEGF1 (VEGF1-VP16); VEGF3a (VEGF3a-VP16); VEGF3a/1 (VEGF3a/1-VP16).
8: VEGF-ELISA-Daten, die die Repression der endogenen VEGF- Genexpression aufgrund einer Transfektion eines VEGF-ZFP-KRAB-Effektorplasmids zeigen. DFX behandelt (nicht transfizierte Dfx-behandelte Kontrollzellen; kein ZFP (pcDNA-Kontrolle)), VEGF 1 (VEGF1-KRAB), VEGF 3a/1 (VEGF3a/1-KRAB), CCR5 (CCR5-KRAB); Mock nicht induziert (Mocktransfizierte Zellen, nicht behandelt mit DFX). Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichungen von zweifachen Transfektionen.
9: VEGF-ELISA-Daten, welche die Aktivierung der endogenen VEGF-Genexpression aufgrund einer Transfektion eines VEGF-ZFP-VP16-Effektorplasmids zeigen. Mock (Mock-transfizierte Zellen); kein ZFP (NVF-Kontrolle), VEGF 1 (VEGF1-VP16), VEGF 3a/1 (VEGF3a/1-VP16). Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichungen von zweifachen Transfektionen.
10: RNase-Schutzassay, der die Veränderungen der VEGFspezifischen mRNA durch VEGF-spezifische ZFPs anzeigt. Panel A: Aktivierung der VEGF-mRNA, NVF-Kontrolle (kein ZFP), VEGF1-NVF (VEGF1-VP16), CCR5-5-NVF (CCR5-VP16), CCR5-3-NVF (CCR5-VP16). Panel B: Repression der VEGF-mRNA, KNF-Kontrolle (kein ZFP), VEGF1-NKF (VEGF1-KRAB), VEGF3a/1-NKF (VEGF3a/1-KRAB), CCR5-3-NKF (CCR5-KRAB). Die Größe der 148 Nukleotide entsprechenden spezifischen VEGF-Bande ist durch einen Pfeil angedeutet. Die VEGF-spezifische Sonde wurde durch ein humanes Angiogenese-Multisondentemplatset (Pharmigen) synthetisiert. Als Kontrolle sind die Signale von den Housekeeping-Genen L32 und GAPDH (Pfeile) gezeigt.
11a–b: 11a zeigt die Aktivierung der endogenen EPO-Genexpression durch Messen der EPO-Erzeugung in Hep3B- und 293-Zellen, wie unter Verwendung eines ELISA bestimmt. 11b zeigt die Aktivierung der endogenen EPO-Genexpression in Hep3B-Zellen und 293-Zellen, wie durch Messen der mRNA-Expression bestimmt.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Einleitung
Die vorliegende Anmeldung zeigt das erste Mal, dass ZFPs verwendet werden können, um die Expression eines endogenen zellulären Gens, das in seiner nativen Chromatinumgebung vorliegt, zu regulieren. Die vorliegende Erfindung stellt demzufolge Zinkfinger-DNA-Bindungsproteine bereit, die so konstruiert sind, dass sie endogene zelluläre Gene mit hoher Wirksamkeit spezifisch erkennen. Die hierin beschriebenen Experimente zeigen, dass ein Drei-Finger-ZFP mit einer Zielstellenaffinität von weniger als etwa 10 nM (VEGF1) verwendet werden kann, um die Aktivität eines endogenen Gens wirksam zu aktivieren oder reprimieren. Ferner wird auch gezeigt, dass ein Sechs-Finger-ZFP (VEGF3a/1) die Aktivität eines endogenen Gens wirksam reprimieren kann. Schließlich kann ein Drei-Finger-ZFP verwendet werden, um endogenes EPO, ein entwicklungsgemäß inaktives Gen, zu aktivieren. Die erfindungsgemäßen ZFPs zeigen eine hohe Affinität gegenüber ihren Zielstellen mit K_d's von weniger als etwa 25 nM oder weniger.
Demzufolge können die erfindungsgemäßen ZFPs verwendet werden, um eine endogene Genexpression sowohl durch Aktivierung als auch durch Repression der endogenen Gentranskription zu regulieren. Die ZFPs sind mit regulatorischen Domänen verknüpft, wodurch chimäre Transkriptionsfaktoren erzeugt werden, um die Transkription zu aktivieren oder zu reprimieren. Die entwickelten Regulationsverfahren verwenden ZFPs mit einer K_d von weniger als etwa 25 nM, um eine Gentranskription zu aktivieren oder reprimieren. Die erfindungsgemäßen ZFPs können daher verwendet werden, um die Transkription eines endogenen zellulären Gens um 20 % oder mehr zu reprimieren und können verwendet werden, um die Transkription eines endogenen zellulären Gens um etwa das 1,5-Fache oder mehr zu aktivieren. Solche Verfahren zur Regulation der Genexpression ermöglichen neue therapeutische Anwendungen beim Menschen und Säugetier, z.B. eine Behandlung von genetischen Erkrankungen, Krebs, einer Pilz-, Protozoen- oder Bakterieninfektion, Ischämie, einer Gefäßerkrankung, Arthritis oder einer immunologischen Erkrankung, etc., und stellen Mittel für funktionelle Genassays und Mittel zur Entwicklung von Pflanzen mit veränderten Phänotypen, was eine Resistenz gegenüber Erkrankungen, ein Reifwerden von Früchten, die Zucker- und Ölzusammensetzung, die Ausbeute und die Farbe einschließt, bereit.
Wie hierin beschrieben, können die ZFPs so konstruiert werden, dass sie jede geeignete Zielstelle für eine Regulation der Expression jedes möglichen endogenen Gens erkennen. Beispiele von endogenen Genen, welche für eine Regulation geeignet sind, umfassen VEGF, CCR5, Era, Her2/Neu, Tat, Rev, HBV C, S, X und P, LDL-R, PEPCK, CYP7, Fibrinogen, ApoB, ApoE, Apo(a), Renin, NF-kB, 1-kB, TNF-α, den FAS-Liganden, das Amyloid-Vorläuferprotein, den atrio-natriuretischen Faktor, Ob-Leptin, ucp-1, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-12, G-CSF, GM-CSF, Epo, PDGF, PAF, p53, Rb, fetales Hämoglobin, Dystrophin, Eutrophin, GDNF, NGF, IGF-1, die VEGF-Rezeptoren flt und flk, Topoisomerase, Telomerase, bcl-2, Cycline, Angiostatin, IGF, ICAM-1, STATS, c-myc, c-myb, TH, PTI-1, Polygalacturonase, EPSP-Synthase, FAD2-1, Delta-12-Desaturase, Delta-9-Desaturase, Delta-15-Desaturase, Acetyl-CoA-Carboxylase, Acyl-ACP-Thioesterase, ADP-Glucosepyrophosphorylase, Stärkesynthase, Cellulosesynthase, Sucrosesynthase, mit dem Altern assoziierte Gene, Schwermetallchelatoren, Fettsäurehydroperoxidlyase, virale Gene, Protozoengene, Pilzgene und bakterielle Gene. Im Allgemeinen umfassen regulierbare geeignete Gene Cytokine, Lymphokine, Wachstumsfaktoren, mitogene Faktoren, chemotaktische Faktoren, Onco-aktive Faktoren, Rezeptoren, Kaliumkanäle, G-Proteine, Signaltransduktionsmoleküle und andere Gene, die mit einer Krankheit verbunden sind. Bevorzugte entwicklungsgemäß inaktive Gene umfassen EPO, GATA, Proteine der Interleukin-Familie, GM-CSF, MyoD, Eutrophin und fetales Hämoglobin-Gamma und -Delta.
In Bezug auf die Funktion eines Transkriptionsfaktors lässt sich im Allgemeinen Folgendes sagen: eine einfache Bindung und eine ausreichende Nähe zu dem Promotor ist alles, was im Allgemeinen erforderlich ist. Das exakte Positionieren in Bezug auf den Promotor, die Orientierung und bis zu einem gewissen Grad der Abstand sind für die Modulierung der Expression durch ein ZFP nicht von großer Bedeutung. Diese Eigenschaften ermöglichen eine beträchtliche Flexibilität bei der Wahl von Stellen zur Konstruktion von artifiziellen Transkriptionsfaktoren. Die durch das ZFP erkannte Zielstelle kann daher jede geeignete Stelle in dem Zielgen sein, die eine Aktivierung oder Repression der Genexpression durch ein mit einer regulatorischen Domäne verbundenes ZFP ermöglicht. Bevorzugte Zielstellen umfassen Regionen benachbart, stromabwärts oder stromaufwärts der Transkriptionsinitiationsstelle. Zudem können die Zielstellen auch in Enhancerregionen, an Repressorstellen, an RNA-Polymerase-Pausestellen und an spezifischen Regulatorstellen (z.B. SPS-1-Stellen, Hypoxie-Antwortelementen, Kernrezeptorerkennungselementen, p53-Bindungsstellen), an Stellen in der cDNA codierenden Region oder in einer eine EST(Expressed-Sequence-Tag)-Sequenz codierenden Region lokalisiert sein. Wie unten beschrieben, erkennt jeder Finger üblicherweise 2–4 Basenpaare, wobei ein Zwei-Finger-ZFP an eine Zielstelle mit 4 bis 7 Basenpaaren bindet, ein Drei-Finger-ZFP an eine Stelle mit 6 bis 10 Basenpaaren bindet und ein Sechs-Finger-ZFP an zwei benachbarte Zielstellen bindet, wobei jede Zielstelle 6–10 Basenpaare aufweist.
Wie hierin beschrieben, können zwei ZFPs an eine Zelle verabreicht werden, wobei die ZFPs entweder das gleiche endogene zelluläre Zielgen oder verschiedene endogene zelluläre Zielgene erkennen. Das erste ZFP ist gegebenenfalls mit dem zweiten ZFP entweder kovalent oder nicht kovalent verbunden. Die Erkennung von benachbarten Zielstellen entweder durch verbundene oder einzelne ZFPs kann verwendet werden, um eine kooperative Bindung der ZFPs zu erzeugen, was zu einer Affinität führt, die größer ist als die Affinität der ZFPs, wenn diese einzeln an ihre Zielstelle binden.
Gemäß einer Ausführungsform werden zwei ZFPs als Fusionsprotein erzeugt, wobei die ZFPs durch einen Aminosäurelinker verbunden sind, und das resultierende Sechs-Finger-ZFP erkennt eine Zielstelle mit etwa 18 Basenpaaren (siehe z.B. Liu et al., PNAS 94: 5525–5530 (1997)). Es wird davon ausgegangen, dass eine Zielstelle mit 18 Basenpaaren eine Spezifität in dem humanen Genom bereitstellt, da eine Zielstelle dieser Größe nur einmal alle 3×10¹⁰ Basenpaare auftritt und die Größe des humanen Genoms etwa 3,5×10⁹ Basenpaare beträgt (siehe z.B. Liu et al., PNAS 94: 5525–5530 (1997)). Gemäß einer anderen Ausführungsform sind die ZFPs durch einen Leucin-Zipper, eine N-terminale Domäne des STAT-Proteins oder das FK506-Bindungsprotein (siehe z.B. O'Shea, Science 254: 539 (1991); Barahmand-Pour et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 211: 121–128 (1996); Klemm et al., Annu. Rev. Immunol. 16: 569–592 (1998); Ho et al., Nature 382: 822–826 (1996)) nicht kovalent verbunden.
Das ZFP ist, wie unten beschrieben, mit wenigstens einer oder mehreren regulatorischen Domänen verbunden. Bevorzugte regulatorische Domänen umfassen Transkriptionsfaktorrepressordomänen oder Transkriptionsfaktoraktivatordomänen, wie KRAB und VP16, Corepressordomänen und Coaktivatordomänen, DNA-Methyltransferasen, Histonacetyltransferasen, Histondeacetylasen und Endonukleasen, wie Fok1. Zur Repression der Genexpression wird die Expression des Gens üblicherweise um etwa 20 % (d.h. 80 % nicht-ZFP-modulierte Expression), mehr bevorzugt etwa 50 % (d.h. 50 % nicht-ZFP-modulierte Expression), mehr bevorzugt etwa 75-100 % (d.h. 25 bis 0 % nicht-ZFP-modulierte Expression) reduziert. Für eine Aktivierung der Genexpression wird die Expression üblicherweise um etwa das 1,5-Fache (d.h. 150 % nicht-ZFP-modulierte Expression), vorzugsweise das 2-Fache (d.h. 200 % nicht-ZFP-modulierte Expression), mehr bevorzugt das 5- bis 10-Fache (d.h. 500–1000 % nicht-ZFP-modulierte Expression) und bis zu wenigstens das 100-Fache oder mehr aktiviert.
Die Expression von konstruierten ZFP-Aktivatoren und -Repressoren kann auch durch Systeme, wie z.B. die tet-regulierten Systeme und das RU-486-System (siehe z.B. Gossen & Bujard, PNAS 89: 5547 (1992); Oligino et al., Gene Ther. 5: 491–496 (1998); Wang et al., Gene Ther. 4: 432–441 (1997); Neering et al., Blood 88: 1137–1155 (1996); und Rendahl et al., Nat. Biotechnol. 16: 757–761 (1998)) kontrolliert werden. Diese Systeme bewirken eine Kleinmolekülkontrolle auf die Expression der ZFP-Aktivatoren und -Repressoren und bewirken somit eine Kleinmolekülkontrolle auf das Zielgen (die Zielgene) von Interesse. Dieses vorteilhafte Merkmal kann in Zellkulturmodellen, bei der Gentherapie und bei transgenen Tieren und Pflanzen verwendet werden.
Definitionen
Wie hierin verwendet, weisen die folgenden Bezeichnungen die folgenden ihnen zugeschriebenen Bedeutungen auf, sofern nichts Anderes angegeben ist.
Die Bezeichnung "Zinkfingerprotein" oder "ZFP" bezeichnet ein Protein mit DNA-Bindungsdomänen, die durch Zink stabilisiert werden. Die einzelnen DNA-Bindungsdomänen werden üblicherweise als "Finger" bezeichnet. Ein Zinkfingerprotein weist wenigstens einen Finger, üblicherweise zwei Finger, drei Finger, vier Finger, fünf Finger oder sechs Finger oder mehr auf. Jeder Finger bindet zwei bis vier Basenpaare DNA, üblicherweise drei oder vier Basenpaare DNA. Ein Zinkfingerprotein bindet eine als Zielstelle oder Zielsegment bezeichnete Nukleinsäuresequenz. Jeder Finger umfasst üblicherweise eine 30 Aminosäure lange, Zink-koordinierte DNA-Bindungsunterdomäne. Ein beispielhaftes Motiv, das eine Klasse dieser Proteine (Cys₂His₂-Klasse) kennzeichnet, ist Cys-(X)_2-4-Cys-(X)₁₂-His-(X)_3-5-His (wobei X jede Aminosäure sein kann). Durch Studien konnte gezeigt werden, dass ein einzelner Zinkfinger dieser Klasse aus einer alpha-Helix besteht, die die zwei Invarianten Histidinreste enthält, welche wiederum durch Zink mit den zwei Cysteinresten eines einzelnen beta-Turns koordiniert sind (siehe z.B. Berg E. & Shi, Science 271: 1081–1085 (1996)).
Eine "Zielstelle" ist die durch ein Zinkfingerprotein erkannte Nukleinsäuresequenz. Eine einzelne Zielstelle weist üblicherweise etwa 4 bis etwa 10 oder mehr Basenpaare auf. Typischerweise erkennt ein Zwei-Finger-Zinkfingerprotein eine vier bis sieben Basenpaar lange Zielstelle, ein Drei-Finger-Zinkfingerprotein eine sechs bis zehn Basenpaar lange Zielstelle, ein Sechs-Finger-Zinkfingerprotein zwei benachbarte neun bis zehn Basenpaar lange Zielstelle, Proteine mit mehr als sechs Fingern usw. Die Zielstelle befindet sich in jeder möglichen Position, die eine Regulierung der Genexpression ermöglicht, z.B. benachbart, stromauf- oder stromabwärts der Transkriptionsinitiationsstelle, in der Nähe eines Enhancers oder von anderen Transkriptionsregulationselementen, wie eines Repressors (z.B. SP-1-Bindungsstellen, Hypoxie-Antwortelemente, Kernrezeptorerkennungselemente, p53-Bindungsstellen, etc.), RNA-Polymerase-Pausestellen und Intron/Exon-Grenzen. Die Bezeichnung "benachbarte Zielstellen" bezeichnet nicht überlappende Zielstellen, die durch null bis etwa 5 Basenpaare getrennt sind.
"K_d" bezeichnet die Dissoziationskonstante für die Verbindung, d.h. die Konzentration einer Verbindung (z.B. eines Zinkfingerproteins), welche die halbe maximale Bindung der Verbindung an deren Ziel (d.h. dass die Hälfte der Verbindungsmoleküle an das Ziel gebunden sind) unter gegebenen Bedingungen (d.h., wenn [Ziel] ≪ K_d), wie unter Verwendung eines gegebenen Assaysystems bestimmt (siehe z.B. das U.S. Patent Nr. 5,789,538), ergibt. Das zur Messung der K_d verwendete Assaysystem sollte so ausgewählt sein, dass es die genaueste Messung der aktuellen K_d des ZFP ermöglicht. Gemäß einer Ausführungsform wird die K_d der erfindungsgemäßen ZPFs unter Verwendung eines elektrophoretischen Mobilitätsshiftassays ("EMSA"), wie in Beispiel 1 und auf Seite 14 der vorliegenden Beschreibung beschrieben, gemessen. Vorausgesetzt, dass keine Anpassung in Bezug auf die ZFP-Reinheit oder -Aktivität vorgenommen wird, führen die K_d-Berechnungen, welche unter Verwendung des Verfahrens von Beispiel I durchgeführt wurden, zu einer Unterschätzung der wahren K_d für ein gegebenes ZFP. Die K_d eines ZFP, das zur Modulation der Transkription eines endogenen zellulären Gens verwendet wird, ist kleiner als etwa 25 nM.
Ein "endogenes Gen" bezeichnet ein mikrobielles oder virales Gen, das Teil eines natürlich vorkommenden mikrobiellen oder viralen Genoms in einer mikrobiell oder viral infizierten Zelle ist. Das mikrobielle oder virale Genom kann extrachromosomal oder in dem Wirtschromosom integriert vorliegen. Die Bezeichnung umfasst auch die unten beschriebenen endogenen zellulären Gene.
Ein "endogenes zelluläres Gen" bezeichnet ein Gen, das in einer Zelle nativ vorkommt, das in seiner normalen Gen- und Chromatinumgebung vorliegt und das zu der Zelle nicht heterolog ist. Solche zellulären Gene umfassen z.B. Tiergene, Pflanzengene, Bakteriengene, Protozoengene, Pilzgene, Mitochondriengene und Chloroplastengene.
Eine "native Chromatinumgebung" bezeichnet die natürlich vorkommende, strukturelle Beziehung von genomischer DNA (d.h. Bakterien-, Tier-, Pilz-, Pflanzen-, Protozoen-, Mitochondrien- und Chloroplasten-DNA) und DNA-Bindungsproteinen (z.B. Histonen und bakterielles DNA-Bindungsprotein II), welche zusammen die Chromosomen bilden. Das endogene zelluläre Gen kann in einem transkriptionell aktiven oder inaktiven Zustand in der nativen Chromatinumgebung vorliegen.
Ein "entwicklungsgemäß stilles Gen" oder ein "inaktives Gen" bezeichnet ein Gen, dessen Expression in einigen Zelltypen während bestimmter Entwicklungsstufen eines Zelltyps oder während bestimmter Zeitdauern in einem Zelltyp reprimiert oder nicht aktiviert, d.h. abgeschaltet, ist. Beispiele von entwicklungsgemäß inaktiven Genen umfassen EPO, GATA, Proteine der Interleukin-Familie, GM-CSF, MyoD, Eutrophin und fetales Hämoglobin- Gamma und -Delta.
Die Bezeichnung "benachbart zu einer Transkriptionsinitiationsstelle" bezeichnet eine Zielstelle, die innerhalb von 50 Basen, entweder stromaufwärts oder stromabwärts, einer Transkriptionsinitiationsstelle liegt. "Stromaufwärts" einer Transkriptionsinitiationsstelle bezeichnet eine Zielstelle, die mehr als etwa 50 Basen 5' der Transkriptionsinitiationsstelle (d.h. in der nicht transkribierten Region des Gens) liegt.
Die Bezeichnung "RNA-Polymerasen-Pausenstelle" ist in Uptain et al., Annu. Rev. Biochem. 66: 117–172 (1997) beschrieben.
"Humanisiert" bezeichnet eine nicht humane Polypeptidsequenz, die so modifiziert wurde, dass die Immunreaktivität in Menschen verringert ist, üblicherweise durch Veränderung der Aminosäuresequenz, um existierende menschliche Sequenzen nachzuahmen, wobei die Funktion der Polypeptidsequenz im Wesentlichen nicht verändert wird (siehe z.B. Jones et al., Nature 321: 522–525 (1986); und die veröffentlichte UK-Patentanmeldung Nr. 8707252). Gerüstsequenzen für die ZFPs werden vorzugsweise aus den existierenden humanen C₂H₂-ZFPs (z.B. SP-1) ausgewählt. Funktionelle Domänen werden bevorzugt aus den existierenden humanen Genen (z.B. die Aktivierungsdomäne der p65-Untereinheit von NF-kB) ausgewählt. Falls möglich, werden die Erkennungshelixsequenzen aus den Tausenden von existierenden ZFP-DNA-Erkennungsdomänen, die durch die Sequenzierung des humanen Genoms bereitgestellt wurden, ausgewählt. Falls möglich, werden Domänen als Einheiten von denselben existierenden Proteinen kombiniert. All diese Schritte verringern das Einbringen von neuen Grenzflächenepitopen in die chimären ZFPs und machen die konstruierten ZFPs weniger immunogen.
Die 'Verabreichung" eines Expressionsvektors, einer Nukleinsäure, eines ZFP oder eines Transportvehikels an eine Zelle umfasst Transduktions-, Transfektions-, Elektroporations-, Translokations-, Fusions-, Phagozytose-, Schuss- oder ballistische Verfahren, etc., d.h. jedes Mittel, durch welches ein Protein oder eine Nukleinsäure durch eine Zellmembran und vorzugsweise in den Kern einer Zelle transportiert werden kann.
Ein "Transportvehikel" bezeichnet eine Verbindung, z.B. ein Liposom, Toxin oder Membrantranslokationspolypeptid, die verwendet werden kann, um ein ZFP zu verabreichen. Transportvehikel können auch verwendet werden, um ZFP-codierende Nukleinsäuren, z.B. einen Lipid:Nukleinsäure-Komplex, einen Expressionsvektor, ein Virus und dgl., zu verabreichen.
Die Bezeichnungen "Modulation der Expression", "Inhibierung der Expression" und "Aktivierung der Expression" eines Gens bezeichnen die Fähigkeit eines ZFP, die Transkription eines Gens zu aktivieren oder zu inhibieren. Eine Aktivierung umfasst eine Verhinderung der Transkriptionsinhibierung (d.h. eine Verhinderung der Repression der Genexpression) und eine Inhibierung umfasst eine Verhinderung der Transkriptionsaktivierung (d.h. eine Verhinderung der Genaktivierung).
Eine "Aktivierung der Genexpression, welche die Repression der Genexpression verhindert" bezeichnet die Fähigkeit eines Zinkfingerproteins, die Bindung eines Repressormoleküls zu blockieren oder zu verhindern.
Eine "Inhibierung der Genexpression, welche eine Genaktivierung verhindert" bezeichnet die Fähigkeit eines Zinkfingerproteins, die Bindung eines Aktivatormoleküls zu blockieren oder zu verhindern.
Die Modulation kann durch die Bestimmung jeglichen Parameters, der indirekt oder direkt durch die Expression des Zielgens betroffen ist, untersucht werden. Solche Parameter umfassen z.B. Veränderungen der RNA- oder Protein-Gehalte, Veränderungen der Proteinaktivität, Veränderungen der Produktgehalte, Veränderungen der stromabwärts gelegenen Genexpression, Veränderungen der Reportergentranskription (Luciferase, CAT, β-Galactosidase, β-Glucuronidase, GFP (siehe z.B. Mistili & Spector, Nature Biotechnology 15: 961–964 (1997)), Veränderungen der Signaltransduktion, die Phosphorylierung und Dephosphorylierung, Rezeptor-Liganden-Wechselwirkungen, die Konzentrationen von sekundären Botenstoffen (z.B. cGMP, cAMP, IP3 und Ca²⁺), das Zellwachstum und die Neovaskularisierung. Diese Assays können in vitro-, in vivo- und ex vivo-Assays sein. Solche funktionellen Effekte können durch jedes dem Fachmann bekannte Mittel gemessen werden, z.B. durch Messung der RNA- oder Proteingehalte, Messung der RNA-Stabilität, Identifizierung von stromabwärts gelegener Genexpression oder Reportergenexpression, z.B. durch Chemilumineszenz, Fluoreszenz, colorimetrische Reaktionen, Antikörperbindung, induzierbare Marker, Ligandenbindungsassays, Veränderungen der intrazellulären sekundären Botenstoffe, wie cGMP und Inositoltriphosphat (IP3), Veränderungen des intrazellulären Calciumgehalts, Cytokinfreisetzung und dgl.
Um das Ausmaß der durch ZFP modulierten Genexpression zu bestimmen, werden mit ZFPs in Kontakt gebrachte Zellen mit Kontrollzellen, z.B. ohne das Zinkfingerprotein oder mit einem nicht spezifischen ZFP, verglichen, wodurch das Ausmaß der Inhibierung oder Aktivierung untersucht werden kann. Kontrollproben wird ein relativer Genexpressionsaktivitätswert von 100 % zugewiesen. Eine Modulation/Inhibierung der Genexpression wird erreicht, wenn der Genexpressionsaktivitätswert in Bezug auf die Kontrolle etwa 80 %, vorzugsweise 50 % (d.h. 0,5× die Aktivität der Kontrolle), mehr bevorzugt 25 %, mehr bevorzugt 5–0 % beträgt. Eine Modulation/Aktivierung der Genexpression wird erreicht, wenn der Genexpressionsaktivitätswert in Bezug auf die Kontrolle 110 %, mehr bevorzugt 150 % (d.h. 1,5× die Aktivität der Kontrolle), mehr bevorzugt 200–500 %, mehr bevorzugt 1000–2000 % oder mehr beträgt.
Ein "Transkriptionsaktivator" und ein "Transkriptionsrepressor" bezeichnet Proteine oder Effektordomänen von Proteinen, welche die Fähigkeit zur Modulation der Transkription, wie oben beschrieben, haben. Solche Proteine umfassen z.B. Transkriptionsfaktoren und -cofaktoren (z.B. KRAB, MAD, ERD, SID, die Untereinheit p65 des Kernfaktors kappa B, der frühe Wachstumsantwortfaktor 1 und Kernhormonrezeptoren, VP16, VP64), Endonukleasen, Integrasen, Rekombinasen, Methyltransferasen, Histonacetyltransferasen, Histondeacetylasen, etc. Aktivatoren und Repressoren umfassen Coaktivatoren und Corepressoren (siehe z.B. Utley et al., Nature 394: 498–502 (1998)).
Eine "regulatorische Domäne" bezeichnet ein Protein oder eine Proteindomäne, mit einer Transkriptionsmodulationsaktivität, wenn dieses/diese mit einer DNA-Bindungsdomäne, d.h. einem ZFP, verbunden ist. Üblicherweise ist eine regulatorische Domäne kovalent oder nicht kovalent mit einem ZFP verbunden, um eine Transkriptionsmodulation zu bewirken. Alternativ dazu kann ein ZFP alleine ohne eine regulatorische Domäne wirken, um eine Transkriptionsmodulation zu bewirken.
Die Bezeichnung "heterolog" ist eine relative Bezeichnung, die in Bezug auf Teile einer Nukleinsäure angibt, dass die Nukleinsäure zwei oder mehr Untersequenzen umfasst, die in derselben Beziehung zueinander in der Natur nicht vorgefunden werden. Beispielsweise besitzt eine rekombinant erzeugte Nukleinsäure üblicherweise zwei oder mehrere Sequenzen von nicht verwandten Genen, die synthetisch so angeordnet wurden, dass sie eine neue funktionelle Nukleinsäure, z.B. einen Promotor aus einer Quelle und eine codierende Region aus einer anderen Quelle, erzeugen. Die zwei Nukleinsäuren sind dann in diesem Zusammenhang demzufolge heterolog zueinander. Werden die rekombinanten Nukleinsäuren zu einer Zelle zugegeben, sind die rekombinanten Nukleinsäuren auch heterolog zu den endogenen Genen der Zelle. Demzufolge umfasst eine heterologe Nukleinsäure in einem Chromosom eine nicht native (nicht natürlich vorkommende) Nukleinsäure, die in das Chromosom integriert wurde, oder eine nicht native (nicht natürlich vorkommende) extrachromosomale Nukleinsäure. Im Gegensatz dazu wird ein natürlich translokierter Teil eines Chromosoms im Zusammenhang mit dieser Patentanmeldung nicht als heterolog betrachtet, da er eine endogene Nukleinsäuresequenz umfasst, die in Bezug auf die mutierte Zelle nativ ist.
Ähnlich bezeichnet ein heterologes Protein ein Protein, das zwei oder mehr Untersequenzen umfasst, die in diesem Zusammenhang nicht in der Natur vorgefunden werden (z.B. ein "Fusionsprotein", bei dem zwei Untersequenzen durch eine einzelne Nukleinsäuresequenz codiert werden). Siehe z.B.: Ausubel, supra, für eine Einführung in rekombinante Techniken.
Die Bezeichnung "rekombinant" bedeutet in Bezug auf z.B. eine Zelle oder eine Nukleinsäure, ein Protein oder einen Vektor, dass die Zelle, die Nukleinsäure, das Protein oder der Vektor durch das Einbringen einer heterologen Nukleinsäure oder eines heterologen Proteins oder durch Veränderung einer nativen Nukleinsäure oder eines nativen Proteins modifiziert wurde, oder dass die Zelle von einer so modifizierten Zelle erhalten wurde. Demzufolge exprimieren rekombinante Zellen Gene, die in der nativen (natürlich vorkommenden) Form der Zelle nicht vorgefunden werden, oder exprimieren eine zweite Kopie eines nativen Gens, das anderenfalls normal oder abnormal exprimiert, unterexprimiert oder überhaupt nicht exprimiert wird.
Ein "Promotor" ist definiert als eine Anordnung von Nukleinsäurekontrollsequenzen, welche die Transkription steuern. Wie hierin verwendet, umfasst ein Promotor üblicherweise notwendige Nukleinsäuresequenzen nahe der Initiationsstelle der Transkription, wie im Falle einiger RNA-Polymerase-II-artigen Promotoren, ein TATA-Element, einen Enhancer, eine CCAAT-Box, eine SP-1-Stelle etc. Wie hierin verwendet, umfasst ein Promotor gegebenenfalls auch distale Enhancer- oder Repressorelemente, die mehrere Tausend Basenpaare von der Transkriptionsinitiationsstelle entfernt vorliegen können. Die Promotoren weisen häufig ein Element auf, das auf eine Transaktivierung durch eine DNA-Bindungseinheit, wie ein Polypeptid, z.B. ein Kernrezeptor, Gal4, der lac-Repressor und dgl., anspricht.
Ein "konstitutiver" Promotor ist ein Promotor, der unter den am häufigsten auftretenden Umgebungs- und Evolutionsbedingungen aktiv ist. Ein "induzierbarer" Promotor ist ein Promotor, der unter bestimmten Umgebungs- oder Evolutionsbedingungen aktiv ist.
Ein "schwacher Promotor" bezeichnet einen Promotor, der in etwa die gleiche Aktivität aufweist wie ein WiId-Typ Herpes-Simplex-Virus("HSV")-Thymidinkinase("tk")-Promotor oder ein mutierter HSV-tk-Promotor, wie in Eisenberg & McKnight, Mol. Cell. Biol. 5: 1940–1947 (1985) beschrieben.
Die Bezeichnung "in operativer Verknüpfung" bezeichnet eine funktionelle Verbindung zwischen einer Nulkeinsäureexpressionskontrollsequenz (wie einem Promotor oder einer Anordnung von Transkriptionsfaktorbindungsstellen) und einer zweiten Nukleinsäuresequenz, wobei die Expressionskontrollsequenz die Transkription der der zweiten Sequenz entsprechenden Nukleinsäure lenkt.
Ein "Expressionsvektor" ist ein rekombinant oder synthetisch erzeugtes Nukleinsäurekonstrukt mit einer Reihe von genau festgelegten Nukleinsäureelementen, welche eine Transkription einer bestimmten Nukleinsäure in einer Wirtszelle und gegebenenfalls eine Integration oder Replikation des Expressionsvektors in einer Wirtszelle ermöglichen. Der Expressionsvektor kann Teil eines Plasmids, eines Virus oder eines Nukleinsäurefragments von viralem oder nicht viralem Ursprung sein. Üblicherweise umfasst der Expressionsvektor eine "Expressionskassette", die eine zu transkribierende Nukleinsäure in operativer Verknüpfung mit einem Promotor umfasst. Die Bezeichnung Expressionsvektor umfasst auch in operativer Verknüpfung mit einem Promotor vorliegende nackte DNA.
Eine "Wirtszelle" bezeichnet eine Zelle, die ein ZFP oder einen Expressionsvektor oder eine Nukleinsäure, der/die ein ZFP codiert, enthält. Die Wirtszelle unterstützt üblicherweise die Replikation oder Expression des Expressionsvektors. Wirtszellen können prokaryotische Zellen, wie E. coli, oder eukaryotische Zellen, wie Hefe-, Pilz-, Protozoon-, höhere Pflanzen-, Insekten- oder Amphibienzellen oder Säugetierzellen, wie CHO, HeLa, 293, COS-1 und dgl., z.B. kultivierte Zellen (in vitro), Explantate und primäre Kulturen (in vitro und ex vivo) und Zellen in vivo, sein.
Eine "Nukleinsäure" bezeichnet Desoxyribonukleotide oder Ribonukleotide und Polymere davon sowohl in einzelsträngiger als auch doppelsträngiger Form. Die Bezeichnung umfasst Nukleinsäuren, die bekannte Nukleotidanaloga oder modifizierte Gerüstreste oder Verbindungen synthetischer, natürlich vorkommender und nicht natürlich vorkommender Art enthalten, die ähnliche Bindungseigenschaften wie die Vergleichsnukleinsäure aufweisen und die auf eine ähnliche Art und Weise wie die Vergleichsnukleinsäure metabolisiert werden. Beispiele solcher Analoga umfassen Phosphorthioate, Phosphoramidate, Methylphosphonate, chirale Methylphosphonate, 2-O-Methylribonukleotide, Peptidnukleinsäuren (PNAs), sind jedoch nicht darauf beschränkt.
Sofern nicht anders angegeben, umfasst eine bestimmte Nukleinsäuresequenz implizit auch konservativ modifizierte Varianten davon (d.h. Substitutionen mit degenerierten Codons) und komplementäre Sequenzen als auch die genau bezeichnete Sequenz. Insbesondere können Substitutionen mit degenerierten Codons durch Erzeugung von Sequenzen erzielt werden, bei denen die dritte Position von einem oder mehreren ausgewählten (oder allen) Codons durch verschiedene Basen- und/oder Desoxyinosinreste substituiert ist (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19: 5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260: 2605–2608 (1985); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8: 91–98 (1994)). Die Bezeichnung Nukleinsäure wird austauschbar mit Gen, cDNA, mRNA, Oligonukleotid und Polynukleotid verwendet.
Die Bezeichnungen "Polypeptid", "Peptid" und "Protein" werden hierin austauschbar verwendet, um ein Polymer aus Aminosäureresten zu bezeichnen. Die Bezeichnungen sind auch auf Aminosäurepolymere, bei denen eine oder mehrere Aminosäurereste eine artifizielle chemische Nachahmung einer entsprechenden natürlich vorkommenden Aminosäure sind, als auch natürlich vorkommende Aminosäurepolymere und nicht natürlich vorkommende Aminosäurepolymere anwendbar.
Die Bezeichnung "Aminosäure" bezeichnet natürlich vorkommende und synthetische Aminosäuren als auch Aminosäureanaloga und Aminosäurenachahmungen, die auf eine ähnliche Art und Weise wie die natürlich vorkommenden Aminosäuren wirken. Natürlich vorkommende Aminosäuren sind die durch den genetischen Code codierten Aminosäuren als auch diejenigen Aminosäuren, die später modifiziert werden, z.B. Hydroxyprolin, γ-Carboxyglutamat und O-Phosphoserin. Aminosäureanaloga bezeichnet Verbindungen, welche die gleiche chemische Grundstruktur wie eine natürlich vorkommende Aminosäure, d.h. ein α-Kohlenstoffatom, das mit einem Wasserstoff, einer Carboxylgruppe, einer Aminogruppe und einer R-Gruppe verbunden ist, aufweisen, z.B. Homoserin, Norleucin, Methioninsulfoxid, Methioninmethylsulfonium. Solche Analoga weisen modifizierte R-Gruppen (z.B. Norleucin) oder modifizierte Peptidgerüste auf, behalten jedoch die gleiche chemische Grundstruktur wie eine natürlich vorkommende Aminosäure bei. Aminosäurenachahmungen bezeichnet chemische Verbindungen, die eine Struktur aufweisen, die zu der allgemeinen chemischen Struktur einer Aminosäure unterschiedlich ist, die jedoch auf eine ähnliche Art und Weise wie eine natürlich vorkommende Aminosäure wirken.
Die Aminosäuren werden hierin entweder durch ihre allgemein bekannten Dreibuchstabensymbole oder durch die von der IUPAC-IUB Biochemischen Nomenklaturkommission empfohlenen Einbuchstabensymbole bezeichnet. Ähnlich werden Nukleotide durch ihre allgemein anerkannten Einbuchstabencodes bezeichnet.
"Konservativ modifizierte Varianten" bezeichnet sowohl Aminosäure- als auch Nukleinsäuresequenzen. In Bezug auf bestimmte Nukleinsäuresequenzen bezeichnet konservativ modifizierte Varianten diejenigen Nukleinsäuren, die identische oder im Wesentlichen identische Aminosäuresequenzen, oder wenn die Nukleinsäure keine Aminosäuresequenz codiert, im Wesentlichen identische Sequenzen codieren. Aufgrund der Degeneration des genetischen Codes codiert eine Vielzahl von funktionell identischen Nukleinsäuren jedes gegebene Protein. Beispielsweise codieren die Codons GCA, GCC, GCG und GCU alle die Aminosäure Alanin. Demzufolge kann das Codon an jeder Position, an der ein Alanin durch ein Codon gekennzeichnet wird, durch jedes der beschriebenen korrespondierenden Codons ausgetauscht werden, ohne das codierte Polypeptid zu verändern. Solche Nukleinsäurevariationen sind "stille Variationen", welche eine Art von konservativ modifizierten Variationen darstellen. Jede hierin beschriebene Nukleinsäuresequenz, die für ein Polypeptid codiert, beschreibt auch jede mögliche stille Variation der Nukleinsäure. Ein Fachmann wird erkennen, dass jedes Codon in einer Nukleinsäure (außer AUG, das gewöhnlich das einzige Codon für Methionin ist, und TGG, das üblicherweise das einzige Codon für Tryptophan ist) modifiziert werden kann, um funktionell identische Moleküle zu erzeugen. Demzufolge wird jede stille Variation einer Nukleinsäure, die für ein Polypeptid codiert, implizit durch jede beschriebene Sequenz beschrieben.
In Bezug auf Aminosäuresequenzen, wird ein Fachmann erkennen, dass einzelne Substitutionen, Deletionen oder Additionen in einer Nukleinsäure-, Peptid-, Polypeptid- oder Proteinsequenz, welche eine einzelne Aminosäure oder einen kleinen Anteil von Aminosäuren in der codierten Sequenz verändern, hinzufügen oder deletieren, eine "konservativ modifizierte Variante" erzeugen, bei der die Veränderung eine Substitution einer Aminosäure mit einer chemisch ähnlichen Aminosäure darstellt. Konservative Substitutionstabellen, welche funktionell ähnliche Aminosäuren bereitstellen, sind im Stand der Technik gut bekannt. Solche konservativ modifizierten Reste sind ergänzend zu polymorphen Varianten, Interspezieshomologen und Allelen der Erfindung und schließen diese nicht aus.
Die folgenden acht Gruppen enthalten jeweils Aminosäuren, die konservative Substitutionen füreinander darstellen:

1) Alanin (A), Glycin (G);
2) Asparaginsäure (D), Glutaminsäure (E);
3) Asparagin (N), Glutamin (Q);
4) Arginin (R), Lysin (K);
5) Isoleucin (I), Leucin (L), Methionin (M), Valin (V);
6) Phenylalanin (F), Tyrosin (Y), Tryptophan (W);
7) Serin (S), Threonin (T); und
8) Cystein (C), Methionin (M) (siehe z.B. Creighton, Proteins (1984)).

Konstruktion von ZFPs
Die erfindungsgemäßen ZFPs sind so konstruiert, dass sie eine ausgewählte Zielstelle in dem gewählten endogenen Gen erkennen. Üblicherweise dient ein Grundgerüst aus jedem geeigneten C₂H₂-ZFP, wie SP-1, SP-1C oder Zif268, als Gerüst für die konstruierten ZFPs (siehe z.B. Jakobs, EMBO J. 11: 4507 (1992); Desjarlais & Berg, PNAS 90: 2256–2260 (1993)). Mehrere Verfahren können dann verwendet werden, um ein ZFP mit hoher Affinität für sein Ziel (z.B. vorzugsweise mit einer K_d von weniger als etwa 25 nM) zu konstruieren und auszuwählen. Wie oben beschrieben, kann ein ZFP so konstruiert und ausgewählt werden, dass es jede mögliche Zielstelle in dem endogenen Zielgen mit hoher Affinität bindet. Die coschwebende Patentanmeldung USSN 09/229,007, die am 12. Januar 1999 eingereicht wurde, beschreibt Verfahren zur Entwicklung, Konstruktion und Expression von ZFPs für verschiedene Zielstellen.
Jedes im Stand der Technik bekannte geeignete Verfahren kann verwendet werden, um ZFP codierende Nukleinsäuren zu entwickeln und zu konstruieren, z.B. Phage-Display, zufällige Mutagenese, kombinatorische Bibliotheken, Computer/rationeller Design, Affinitätsauswahl, PCR, Klonierung aus cDNA- oder Genbibliotheken, synthetische Konstruktion und dgl. (siehe z.B. U.S. Pat. Nr. 5,786,538; Wu et al., PNAS 92: 344–348 (1995); Jamieson et al., Biochemistry 33: 5689–5695 (1994); Rebar & Pabo, Science 263: 671–673 (1994); Choo & Klug, PNAS 91: 11163–11167 (1994); Choo & Klug, PNAS 91: 11168–11172 (1994); Desjarlais & Berg, PNAS 90: 2256–2260 (1993); Desjarlais & Berg, PNAS 89: 7345–7349 (1992); Pomerantz et al., Science 267: 93–96 (1995); Pomerantz et al., PNAS 92: 9752–9756 (1995); und Liu et al., PNAS 94: 5525–5530 (1997); Griesman & Pabo, Science 275: 657–661 (1997); Desjarlais & Berg, PNAS 91: 11099–11103 (1994)).
Eine bevorzugte Ausführungsform stellt Verfahren bereit, die ein Zielgen auswählen und ein Zielgen innerhalb des eine bis sechs (oder mehr) D-fähige Stellen (siehe Definition unten) enthaltenden Gens identifizieren. Unter Verwendung dieser Verfahren kann ein ZFP synthetisiert werden, das die zuvor ausgewählte Stelle bindet. Diese Verfahren der Zielstellenauswahl basieren teilweise auf der Erkenntnis, dass die Anwesenheit einer oder mehrerer D-fähiger Stellen in einem Zielsegment einem ZFP, das ausgewählt oder konstruiert wurde, um an diese Stelle zu binden, in Bezug auf ZFPs, die an Zielstellen ohne D-fähige Stellen (siehe unten) binden, eine höhere Bindungsaffinität verleiht.
Eine D-fähige Stelle oder Unterstelle ist eine Region in einer Zielstelle, die es einem genau konstruierten Zinkfinger ermöglicht, an vier Basen anstelle von drei Basen der Zielstelle zu binden. Solch ein Zinkfinger bindet ein Basentriplet auf einem Strang eines doppelsträngigen Zielsegments (Zielstrang) und eine vierte Base auf dem anderen Strang. Die Bindung eines einzelnen Zinkfingers an ein Zielsegment aus vier Basen legt eine Beschränkung sowohl auf die Sequenz des Zielstrangs als auch auf die Aminosäuresequenz des Zinkfingers auf. Die Zielstelle innerhalb des Zielstrangs sollte das Motiv der "D-fähigen" Stelle 5'-NNGK-3' enthalten, bei dem N und K den herkömmlichen IUPAC-IUB-Codons entsprechen. Ein an eine solche Stelle bindender Zinkfinger sollte einen Argininrest an Position –1 und einen Asparaginsäurerest (oder weniger bevorzugt einen Glutaminsäurerest) an Position +2 enthalten. Der Argininrest an Position –1 wechselwirkt mit dem G-Rest in der D-fähigen Stelle. Der Asparaginsäurerest (oder Glutaminsäurerest) an Position +2 des Zinkfingers wechselwirkt mit der Base des gegenüberliegenden Strangs, die komplementär zu der K-Base in der D-fähigen Stelle ist. Es ist die Wechselwirkung zwischen der Asparaginsäure (Symbol D) und der Base des gegenüberliegenden Stranges (vierte Base), welche den Namen D-fähige Stelle verleiht. Wie aus der Formel für die D-fähige Stelle ersichtlich ist, existieren zwei Unterarten von D-fähigen Stellen: 5'-NNGG-3' und 5'-NNGT-3'. Für die erstere Stelle wechselwirkt die Asparaginsäure oder Glutaminsäure an Position +2 eines Zinkfingers mit einem C auf dem gegenüberliegenden Strang der D-fähigen Stelle. Bei der zweiten Stelle wechselwirkt die Asparaginsäure oder Glutaminsäure an Position +2 eines Zinkfingers mit einem A auf dem gegenüberliegenden Strang der D-fähigen Stelle. Im Allgemeinen ist NNGG gegenüber NNGT bevorzugt.
Bei der Entwicklung eines ZFP mit drei Fingern sollte eine Zielstelle ausgewählt werden, bei der wenigstens ein Finger des Proteins und gegebenenfalls zwei oder alle drei Finger die Fähigkeit zur Bindung einer D-fähigen Stelle aufweisen. Dies kann erreicht werden, wenn eine Zielstelle aus einem größeren Zielgen mit der Formel 5'-NNx aNy bNzc-3' ausgewählt wird, wobei
jede der Gruppen (x, a), (y, b) und (z, c) entweder (N, N) oder (G, K) sind; wenigstens eine der (x, a), (y, b) und (z, c) (G, K) ist; und N und K den IUPAC-IUB-Codons entsprechen.
Mit anderen Worten bedeutet das, dass die erste Position der Gruppe G ist und die zweite Position G oder T ist, wenn wenigstens eine der drei Gruppen (x, a), (y, b) und (z, c) die Gruppe (G, K) ist. Diejenigen der drei Gruppen (wenn überhaupt eine), die nicht (G, K) sind, sind (N, N), was bedeutet, dass die erste Position der Gruppe mit jedem Nukleotid besetzt sein kann, und die zweite Position der Gruppe mit jedem Nukleotid besetzt sein kann. Z.B. kann die Gruppe (x, a), (G, K) sein und die Gruppen (y, b) und (z, c) können beide (N, N) sein.
In der Formel 5'-NNx aNy bNzc-3' stellen die Triplets NNx aNy und bNzc die Basentriplets auf dem Zielstrang dar, die durch die drei Finger in einem ZFP gebunden werden. Ist nur eines der x, y und z ein G und ist dieses G von einem K gefolgt, umfasst die Zielstelle eine einzelne D-fähige Unterstelle. Ist beispielsweise nur x G und a ist K, liest sich die Stelle 5'-NNG KNy bNzc-3', wobei die D-fähige Unterstelle hervorgehoben ist. Sind sowohl x und y, jedoch nicht z G und a und b sind K, dann weist die Zielstelle zwei überlappende D-fähige Unterstellen wie folgt auf: 5'-NNG KNG KNz c-3' wobei die eine Stelle durch Fettschrift und die andere durch Kursivschrift gekennzeichnet ist. Sind alle drei x, y und z G und a, b und c sind K, dann umfasst das Zielsegment drei D-fähige Unterstellen wie folgt: 5'-NNG KNG KNG K-3', wobei die D-fähigen Unterstellen durch Fettschrift, Kursivschrift und durch Unterstreichung dargestellt sind.
Diese Verfahren arbeiten demzufolge durch Auswahl eines Zielgens und durch systematisches Suchen innerhalb der möglichen Untersequenzen des Gens für Zielstellen, die der oben beschriebenen Formel 5'-NNx aNy bNzc-3' entsprechen. Bei einigen Verfahren wird jede mögliche Untersequenz aus 10 benachbarten Basen auf jedem Strang eines potenziellen Zielgens bewertet, um zu bestimmen, ob sie der obigen Formel entspricht und, falls sie dies tut, wie viele D-fähige Stellen vorliegen. Üblicherweise wird solch ein Vergleich mithilfe eines Computers durchgeführt und eine Liste von Zielstellen, welche der obigen Formel entsprechen, wird ausgegeben. Gegebenenfalls können solche Zielstellen gemäß ihrer Anzahl von vorliegenden D-fähigen Stellen in verschiedenen Untergruppen ausgegeben werden.
Gemäß einer Abwandlung identifizieren die Verfahren erste und zweite Zielsegmente, wobei jedes Zielsegment unabhängig voneinander der obigen Formel entspricht. In solchen Verfahren sind die zwei Zielsegmente einer Beschränkung unterworfen, um benachbart oder nahe einander (d.h. innerhalb von etwa 0–5 Basen) in dem Zielgen vorzuliegen. Die der Auswahl von nahen Zielsegmenten zugrundeliegende Strategie ist es, die Entwicklung eines ZFP zu ermöglichen, das durch Verbindung von zwei ZFP-Komponenten spezifisch für das erste Zielsegment bzw. das zweite Zielsegment gebildet wird. Diese Grundsätze können ausgedehnt werden, um Zielstellen auszuwählen, die durch ZFPs mit jeglicher Anzahl von Fingerbestandteilen gebunden werden. Eine geeignete Zielstelle für ein Neun-Finger-Protein hätte beispielsweise drei Segmentkomponenten, wobei jede Segmentkomponente der obigen Formel entspricht.
Die durch die obigen Verfahren identifizierten Zielstellen können Gegenstand weiterer Beurteilungen durch andere Kriterien sein oder können direkt für die Entwicklung oder Selektion (falls notwendig) und Erzeugung eines für solch eine Stelle spezifischen ZFPs verwendet werden. Ein weiteres Kriterium zur Beurteilung von potenziellen Zielstellen ist ihre Nähe zu bestimmten Regionen innerhalb eines Gens. Wird ein ZFP verwendet, um ein zelluläres Gen selbst zu reprimieren (d.h. ohne dass das ZFP an eine Repressoreinheit gebunden ist), dann scheint eine optimale Lokalisation bei oder innerhalb von 50 Basenpaaren stromabwärts oder stromaufwärts der Transkriptionsinitiationsstelle zu sein, um die Bildung des Transkriptionsinitiationskomplexes zu stören (Kim & Pabo, J. Biol. Chem. 272: 29795–29680 (1997)) oder mit einem wichtigen Enhancerbindungsprotein zu konkurrieren. Wird ein ZFP jedoch mit einer funktionellen Domäne, wie der KRAB-Repressordomäne oder der VP16-Aktivatordomäne fusioniert, ist die Lokalisation der Bindungsstelle erheblich flexibler und kann außerhalb bekannter Regulatorregionen liegen. Eine KRAB-Domäne kann beispielsweise die Transkription an einem Promotor reprimieren, der bis zu wenigstens 3 kbp von der Stelle, an der das KRAB gebunden ist, entfernt liegt (Margolin et al., PNAS 91: 4509-4513 (1994)). Demzufolge können Zielstellen ausgewählt werden, die nicht notwendigerweise Segmente von nachweislich biologischer Bedeutung für Zielgene, wie Regulatorsequenzen, enthalten oder mit diesen überlappen. Andere Kriterien zur weiteren Beurteilung von Zielsegmenten umfassen die Verfügbarkeiten von ZFPs, die solche Segmente oder verwandte Segmente binden, und/oder die Einfachheit der Entwicklung neuer ZFPs, die ein gegebenes Zielsegment binden.
Nachdem ein Zielsegment ausgewählt wurde, kann ein an das Segment bindendes ZFP durch eine Vielzahl von Ansätzen bereitgestellt werden. Der einfachste Ansatz ist die Bereitstellung eines zuvor charakterisierten ZFP aus einer bestehenden Sammlung, von dem bereits bekannt ist, dass es die Zielstelle bindet. In vielen Fällen existieren solche ZFPs jedoch nicht. Ein alternativer Ansatz kann auch verwendet werden, um neue ZFPs zu entwickeln, wobei der Ansatz die Information einer Datenbank von existierenden ZFPs und ihren entsprechenden Bindungsaffinitäten verwendet. Ein weiterer Ansatz ist die Entwicklung eines ZFP basierend auf den oben diskutierten Substitutionsregeln. Ein weiterer Ansatz besteht darin, ein ZFP mit einer Spezifität für ein gegebenes Ziel durch ein empirisches Verfahren, wie Phage-Display, auszuwählen. Bei einigen dieser Verfahren wird jede Fingerkomponente eines ZFP unabhängig von den anderen Fingerkomponenten entwickelt und ausgewählt. Beispielsweise kann jeder Finger aus einem unterschiedlichen bereits existierenden ZFP erhalten werden oder jeder Finger kann einer getrennten Randomisierung und Selektion unterzogen werden.
Wurde einmal ein ZFP für ein gegebenes Zielsegment ausgewählt, konstruiert oder auf eine andere Art und Weise bereitgestellt, wird das ZFP oder die dieses ZFP codierende DNA synthetisiert. Beispielhafte Verfahren zur Synthetisierung und Expression von Zinkfinger-codierender DNA werden unten beschrieben. Das ZFP oder ein das ZFP codierendes Polynukleotid kann dann zur Modulation der Expression oder Analyse des Zielgens, welches die Zielstelle, an das das ZFP bindet, enthält, verwendet werden.
Expression und Reinigung der ZFPs
ZFP-Polypeptide und -Nukleinsäuren können unter Verwendung von Routineverfahren auf dem Gebiet der rekombinanten Genetik hergestellt werden. Grundlagentexte, welche die allgemeinen Verfahren, die gemäß dieser Erfindung verwendet werden können, offenbaren, umfassen Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Ed. (1989); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990); und Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., Eds., 1994)). Zudem kann im Wesentlichen jede Nukleinsäure einzeln bei einer Vielzahl von kommerziellen Quellen bestellt werden. Ähnlich können Peptide und Antikörper bei einer Vielzahl von kommerziellen Quellen bestellt werden.
Zwei alternative Verfahren werden üblicherweise verwendet, um die für die Expression von neu entwickelten DNA-Bindungsproteinen erforderlichen codierenden Sequenzen zu erzeugen. Ein Protokoll ist ein PCR-basiertes Zusammenbauverfahren, das sechs überlappende Oligonukleotide verwendet (1). Drei Oligonukleotide (Oligos 1, 3 und 5 in 1) entsprechen "universalen" Sequenzen, welche Teile der DNA-Bindungsdomäne zwischen den Erkennungshelices codieren. Diese Oligonukleotide verbleiben für alle Zinkfingerkonstrukte konstant. Die anderen drei "spezifischen" Oligonukleotide (Oligos 2, 4 und 6 in 1) werden so entwickelt, dass sie die Erkennungshelices codieren. Diese Oligonukleotide enthalten vorwiegend Substitutionen an den Positionen –1, 2, 3 und 6 der Erkennungshelices, wodurch diese spezifisch für jede der unterschiedlichen DNA-Bindungsdomänen gemacht werden.
Die PCR-Synthese wird in zwei Schritten durchgeführt. Zunächst wird ein doppelsträngiges DNA-Templat durch Kombination der sechs Oligonukleotide (der drei universellen Oligonukleotide und der drei spezifischen Oligonukleotide) in einer Vier-Zyklen-PCR-Reaktion mit einem Annealingschritt bei niedriger Temperatur, bei dem die Oligonukleotide annealen, um ein DNA-"Gerüst" zu bilden, erzeugt. Die Lücken in dem Gerüst werden durch eine hochgenaue thermostabile Polymerase aufgefüllt, wobei die Kombination von Taq- und Pfu-Polymerase auch ausreichend ist. Im zweiten Schritt wird das Zinkfingertemplat durch externe Primer amplifiziert, die so entwickelt wurden, dass sie Restriktionsstellen an jedem Ende einführen, um eine Klonierung in einen Shuttle-Vektor oder direkt in einen Expressionsvektor zu ermöglichen.
Ein alternatives Verfahren zur Klonierung der neu entwickelten DNA-Bindungsproteine basiert auf dem Annealen von komplementären Oligonukleotiden, welche die spezifischen Regionen des gewünschten ZFP codieren. Dieser spezielle Ansatz erfordert, dass die Oligonukleotide vor dem endgültigen Ligationsschritt phosphoryliert werden. Dies wird üblicherweise vor dem Ansetzen der Annealingreaktionen durchgeführt. Eine Kinasebehandlung kann jedoch auch nach dem Annealen durchgeführt werden. Kurz gesagt, werden die "universellen" Oligonukleotide, welche die konstanten Regionen des Proteins codieren (Oligos 1, 2 und 3 oben), mit ihren komplementären Oligonukleotiden annealed. Zudem werden die "spezifischen" Oligonukleotide, welche die Fingererkennungshelices codieren, mit ihren entsprechenden komplementären Oligonukleotiden annealed. Diese komplementären Oligos werden so entwickelt, dass sie die Bereiche, die gemäß dem oben beschriebenen Verfahren durch Polymerasen aufgefüllt wurden, ausfüllen. Die komplementären Oligos zu dem Oligo 1 und Finger 3 werden so entwickelt, dass überhängende Sequenzen spezifisch für die für die Klonierung in den Vektor der Wahl verwendeten Restriktionsstellen verbleiben. Das zweite Zusammenbauprotokoll unterscheidet sich von dem ersten Protokoll in den folgenden Gesichtspunkten: Das "Gerüst", das das neu entwickelte ZFP codiert, besteht vollständig aus synthetischer DNA, wodurch der Polymeraseauffüllschritt eliminiert wird. Zusätzlich erfordert das in den Vektor zu klonierende Fragment keine Amplifikation. Zuletzt beseitigt die Entwicklung von verbleibenden sequenzspezifischen Überhängen die Notwendigkeit für Restriktionsenzymverdaue des zu insertierenden Fragments.
Das resultierende neu entwickelte ZFP codierende Fragment wird in einen Expressionsvektor ligiert. Herkömmlich verwendete Expressionsvektoren umfassen einen modifizierten bakteriellen pMAL-c2-Expressionsvektor (New England Biolabs, "NEB") oder einen eukaryotischen Expressionsvektor, pcDNA (Promega), sind jedoch nicht darauf beschränkt.
Jedes dem Fachmann bekannte Verfahren zur Proteinaufreinigung kann verwendet werden, um die erfindungsgemäßen ZFPs aufzureinigen (siehe Ausubel, supra, Sambrook, supra). Zudem kann jeder geeignete Wirt, z.B. Bakterienzellen, Insektenzellen, Hefezellen, Säugetierzellen und dgl., verwendet werden.
Gemäß einer Ausführungsform ermöglicht die Expression eines an ein Maltose-Bindungsprotein gebundenen ZFP (MBP-ZFP) in dem Bakterienstamm JM109 eine einfache Aufreinigung durch eine Amylosesäule (NEB). Hohe Expressionsraten können für die Chimären Zinkfingerproteine erreicht werden, indem mit IPTG induziert wird, da das MBP-ZFP-Fusionsprotein in dem pMal-c2-Expressionsplasmid unter der Kontrolle des IPTG-induzierbaren taq-Promotors (NEB) steht. Bakterien, welche die MBP-ZFP-Fusionsplasmide enthalten, werden in 2xYT-Medium, das 10 μM ZnCl₂, 0,02 % Glucose und 50 μg/ml Ampicillin enthält, inokuliert und bei 37 °C geschüttelt. Bei einem mittleren exponentiellen Wachstum wird IPTG bis zu einer Konzentration von 0,3 mM zugegeben und die Kulturen werden weiter geschüttelt. Nach 3 Stunden werden die Bakterien durch Zentrifugation geerntet, durch Ultraschall aufgeschlossen und dann wird das unlösliche Material durch Zentrifugation entfernt. Die MBP-ZFP-Proteine werden auf einem Amylose-gebundenen Harz festgehalten, ausgiebig mit Puffer, enthaltend 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 200 mM NaCl, 5 mM DTT und 50 μM ZnCl₂, ausführlich gewaschen und dann mit Maltose in im Wesentlichen demselben Puffer eluiert (die Aufreinigung basiert auf Standardprotokollen von NEB). Die aufgereinigten Proteine werden quantifiziert und für eine biochemische Analyse gelagert.
Die biochemischen Eigenschaften der aufgereinigten Proteine, z.B. die K_d, können durch jeden geeigneten Assay bestimmt werden. Gemäß einer Ausführungsform wird die K_d durch einen elektrophoretischen Mobilitätsshiftassay ("EMSA") (Buratowski & Chodosh, in Current Protocols in Molecular Biology, S. 12.2.1–12.2.7 (Ausubel Ed., 1996)) bestimmt. Die Affinität wird durch Titration des aufgereinigten Proteins gegen eine geringe festgelegte Menge eines markierten doppelsträngigen Oligonukleotidziels bestimmt. Das Ziel umfasst die natürliche Bindungsstellensequenz (9 oder 18 bp), die durch die in der natürlichen Sequenz vorgefundenen drei Basenpaare flankiert ist. Außerhalb der Bindungsstelle und der flankierenden Sequenz befindet sich eine konstante Sequenz. Die annealten Oligonukleotidziele weisen einen 1 by langen 5'-Überhang auf, der eine effiziente Markierung des Ziels mit T4-Phage-Polynukleotidkinase ermöglicht. Für den Assay wird das Ziel in einer Konzentration von 40 nM oder geringer (die aktuelle Konzentration ist um wenigstens das 10-fache niedriger als die niedrigste Proteinverdünnung) zugegeben und die Reaktion wird für wenigstens 45 Minuten äquilibriert. Zudem enthält die Reaktionsmischung auch 10 mM Tris (pH 7,5), 100 mM HCl, 1 mM MgCl₂, 0,1 mM ZnCl₂, 5 mM DTT, 10 % Glycerin, 0,02 % BSA (Poly(dldC) oder Poly (dAdT) (Pharmacia) kann auch bei 10–100 μg/ul zugegeben werden).
Die äquilibrierten Reaktionen werden auf ein 10 %-Polyacrylamidgel geladen, das zuvor für 45 Minuten in einem Tris/Glycin-Puffer gelaufen war, und dann werden gebundene und ungebundene markierte Ziele durch Elektrophorese bei 150 V aufgelöst (alternativ dazu können 10–20 % Tris-HCl-Gradienten-Gele, die einen 4 % Polyacrylamideintrag enthalten, verwendet werden). Die getrockneten Gele werden durch Autoradiographie oder Phosphorimaging sichtbar gemacht und die apparente K_d wird durch Berechnung der Proteinkonzentration, welche die halbe maximale Bindung ergibt, bestimmt.
Ähnliche Assays können auch das Bestimmen von aktiven Fraktionen in den Proteinpräparationen umfassen. Aktive Fraktionen werden durch stöchiometrische Gelshifts bestimmt, bei denen Proteine gegen eine hohe Konzentration der Ziel-DNA titriert werden. Die Titrationen werden bei 100 %, 50 % und 25 % des Ziels (im Üblichen im Mikromolarbereich) durchgeführt.
Gemäß einer anderen Ausführungsform können Phage-Display-Bibliotheken verwendet werden, um ZFPs mit hoher Affinität für eine ausgewählte Zielstelle auszuwählen. Dieses Verfahren unterscheidet sich grundlegend von dem Verfahren des direkten Designs, da es die Erzeugung von diversen Bibliotheken von mutierten ZFPs gefolgt von der Isolation von Proteinen mit den gewünschten DNA-Bindungseigenschaften unter Verwendung von Affinitätsselektionsverfahren beinhaltet. Um dieses Verfahren zu verwenden, gehen die Forscher üblicherweise wie folgt vor.
Zunächst wird ein Gen eines ZFP mutiert, um eine Diversität in Bereiche, die für die Bindungsspezifität und/oder -affinität wichtig sind, einzubringen. Gemäß einem typischen Vorgehen wird dies durch Randomisierung eines einzelnen Fingers an den Positionen –1, +2, +3 und +6 und gegebenenfalls an zusätzlichen Positionen wie +1, +5, +8 oder +10 erreicht.
Dann wird das mutierte Gen in einen Phagen oder einen Phagemidvektor als Fusionskonstrukt mit z.B. dem Gen III des filamentösen Phagen, welches das Hüllprotein pIII codiert, kloniert. Das Zinkfingergen wird zwischen den Segmenten des Gen III insertiert, welche das Membranexportsignalpeptid und den Rest von pIII codieren, sodass das ZFP als aminoterminaler Bereich des Fusionsproteins zusammen mit pIII in dem reifen prozessierten Protein exprimiert wird. Werden Phagemid-Vektoren verwendet, kann das mutierte Zinkfingergen auch an eine trunkierte Version des Gen III, welche wenigstens die C-terminale Region, welche für den Zusammenbau von pIII in dem Phagenpartikel erforderlich ist, codiert, fusioniert sein.
Die resultierende Vektorbibliothek wird in E. coli transformiert und wird verwendet, um den filamentösen Phagen, der die ZFP-Varianten auf seiner Oberfläche als Fusionskonstrukt mit dem Hüllprotein pIII exprimiert, zu erzeugen (wird ein Phagemidvektor verwendet, erfordert dieser Schritt eine Überinfektion mit einem Helferphagen). Die Phagenbibliothek wird dann mit der DNA-Zielstelle inkubiert und Affinitätsselektionsverfahren werden verwendet, um Phagen aus der Gesamtmenge der Phagen zu isolieren, welche das Ziel mit hoher Affinität binden. Üblicherweise wird das DNA-Ziel auf einem festen Träger immobilisiert, der dann unter Bedingungen gewaschen wird, die ausreichend sind, um alle, jedoch nicht den Phagen mit der festesten Bindung, zu entfernen. Nach dem Waschen wird jeder auf dem Träger verbleibende Phage durch Elution unter Bedingungen zurückgewonnen, die die Zinkfinger-DNA-Bindung vollständig zerstören.
Die rückgewonnenen Phagen werden zur Infektion von frischen E. coli verwendet, welche dann amplifiziert und zur Erzeugung einer neuen Charge von Phagenpartikeln verwendet werden. Die Bindungs- und Rückgewinnungsschritte werden dann solange wie erforderlich wiederholt, um den Phagenpool mit festen Bindemolekülen anzureichern, sodass diese unter Verwendung von Sequenzier- und/oder Screeningverfahren identifiziert werden können.
Regulatorische Domänen
Die erfindungsgemäßen ZFPs sind mit regulatorischen Domänen zur Modulation der Genexpression verbunden. Das ZFP kann kovalent oder nicht kovalent mit einer oder mehreren regulatorischen Domänen, alternativ dazu zwei oder mehreren regulatorischen Domänen, verbunden sein, wobei die zwei oder mehr Domänen zwei Kopien derselben Domäne oder zwei unterschiedliche Domänen darstellen. Die regulatorischen Domänen können kovalent mit dem ZFP, z.B. über einen Aminosäurelinker als Teil eines Fusionsproteins, verbunden sein. Die ZFPs können auch mit einer regulatorischen Domäne über eine nicht kovalente Dimerisierungsdomäne, z.B. einen Leucin-Zipper, die N-terminale Domäne des STAT-Proteins oder ein FK506-Bindungsprotein, verbunden sein (siehe z.B. O'Shea, Science 254: 539 (1991); Barahmand-Pour et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 211: 121–128 (1996); Klemm et al., Annu. Rev. Immunol. 16: 569–592 (1998); Klemm et al., Annu. Rev. Immunol. 16: 569–592 (1998); Ho et al., Nature 382: 822–826 (1996); und Pomeranz of al., Biochem. 37: 965 (1998)). Die regulatorische Domäne kann mit dem ZFP an jeder geeigneten Position, umfassend den C- oder N-Terminus des ZFP, verbunden sein.
Herkömmliche regulatorische Domänen zur Verknüpfung mit dem ZFP umfassen z.B. Effektordomänen von Transkriptionsfaktoren (Aktivatoren, Repressoren, Coaktivatoren, Corepressoren), Silencern, Kernhormonrezeptoren, onkogenen Transkriptionsfaktoren (z.B. die Mitglieder der myc-, jun-, fos-, myb-, max-, mad-, rel-, ets-, bel-, mos-Familie, etc.); DNA-Reparaturenzyme und deren assoziierte Faktoren und Modifikatoren; DNA-Rearrangementenzyme und deren assoziierte Faktoren und Modifikatoren; Chromatin-assoziierte Proteine und deren Modifikatoren (z.B. Kinasen, Acetylasen und Deacetylasen); und DNA-modifizierende Enzyme (z.B. Methyltransferasen, Topoisomerasen, Helicasen, Ligasen, Kinasen, Phosphatasen, Polymerasen, Endonukleasen) und deren assoziierte Faktoren und Modifikatoren.
Transkriptionsfaktorpolypeptide, aus denen man eine regulatorische Domäne erhalten kann, umfassen diejenigen Transkriptionsfaktorpolypeptide, die in die regulierte und basale Transkription verwickelt sind. Solche Polypeptide umfassen Transkriptionsfaktoren, deren Effektordomänen, Coaktivatoren, Silencer, Kernhormonrezeptoren (siehe z.B. Goodrich et al., Cell 84: 82530 (1996) für einen Übersichtsartikel über Proteine und Nukleinsäureelemente, die in die Transkription verwickelt sind; Transkriptionsfaktoren im Allgemeinen sind in Barnes & Adcock, Clin. Exp. Allergy 25 Supp. 2: 46–9 (1995); und Roeder, Methods Enzymol. 273: 165–71 (1996) wiedergegeben). Datenbanken von Transkriptionsfaktoren sind bekannt (siehe z.B. Science 269: 630 (1995)). Kernhormonrezeptortranskriptionsfaktoren sind beispielsweise in Rosen et al., J. Med. Chem. 38: 4855–74 (1995) beschrieben. Die C/EBP-Familie von Transkriptionsfaktoren wird in Wedel et al., Immunobiology 193: 171–85 (1995) zusammengefasst. Coaktivatoren und Corepressoren, welche eine Transkriptionsregulation durch Kernhormonrezeptoren vermitteln, sind beispielsweise in Meier, Eur. J. Endocrinol. 143(2): 158–9 (1996); Kaiser et al., Trends Biochem. Sci. 21: 342–5 (1996); und Utley et al., Nature 394: 498–502 (1998)) zusammengefasst. GATA-Transkriptionsfaktoren, die in die Regulation der Hämatopoese verwickelt sind, sind beispielsweise in Simon, Nat. Genet. 11: 9–11 (1995); Weiss et al., Exp. Hematol. 23: 99–107 beschrieben. TATA-Box-Bindungsproteine (TBP) und deren assoziierte TAF-Polypeptide (welche TAF30, TAF55, TAF80, TAF110, TAF150 und TAF250 umfassen) sind in Goodrich & Tjian, Curr. Opin. Cell Biol. 6: 403–9 (1994); und Hurley, Curr. Opin. Struct. Biol. 6: 69–75 (1996) beschrieben. Die STAT-Familie von Transkriptionsfaktoren ist beispielsweise in Barahmand-Pour et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 211: 121–8 (1996) zusammengefasst. Transkriptionsfaktoren, welche mit Krankheiten assoziiert sind, sind in Aso et al., J. Clin. Invest. 97: 1561–9 (1996) zusammengefasst.
Gemäß einer Ausführungsform wird die KRAB-Repressordomäne des humanen KOX-1-Proteins als Transkriptionsrepressor verwendet (Thiesen et al., New Biologist 2: 363–374 (1990); Margolin et al., PNAS 91: 4509-4513 (1994); Pengue et al., Nucl. Acids Res. 22: 2908–2914 (1994); Witzgall et al., PNAS 91: 4514–4518 (1994); siehe auch Beispiel III). Gemäß einer anderen Ausführungsform wird KAP-1, ein KRAB-Corepressor, mit KRAB verwendet (Friedman et al., Genes Dev. 10: 2067–2078 (1996)). Alternativ dazu kann KAP-1 alleine zusammen mit einem ZFP verwendet werden. Andere bevorzugte Transkriptionsfaktoren und Transkriptionsfaktordomänen, welche als Transkriptionsrepressoren wirken, umfassen MAD (siehe z.B. Sommer et al., J. Biol. Chem. 273: 6632–6642 (1998); Gupta et al., Onkogene 16: 1149–1159 (1998); Queva et al., Onkogene 16: 967–977 (1998); Larsson et al., Onkogene 15: 737–748 (1997); Laherty et al., Cell 89: 349–356 (1997); und Cultraro et al., Mol. Cell. Biol. 17: 2353–2359 (1997)); FKHR (Forkhead-Transkriptionsfaktor in dem Rhapdosarkoma-Gen; Gensberg et al., Cancer Res. 15: 3542–3546 (1998); Epstein et al., Mol. Cell. Biol. 18: 4118–4130 (1998)); EGR-1 (Early-Growth-Response-Genprodukt-1; Yan et al., PNAS 95: 8298–8303 (1998); und Liu et al., Cancer Gene Ther. 5: 3–28 (1998)); die ets2-Repressorfaktorrepressordomäne (ERD; Sgouras et al., EMBO J. 14: 4781–4793 (1995)); und die MAD smSIN3-Wechselwirkungsdomäne (SID; Ayer et al., Mol. Cell. Biol. 16: 5772–5781 (1996)).
Gemäß einer Ausführungsform wird die HSV VP16-Aktivierungsdomäne als Transkriptionsaktivator verwendet (siehe z.B. Hagmann et al., J. Virol. 71: 5952–5962 (1997)). Andere bevorzugte Transkriptionsfaktoren, welche Aktivierungsdomänen liefern können, umfassen die VP64-Aktivierungsdomäne (Seipel et al., EMBO J. 11: 4961–4968 (1996)); die Kernhormonrezeptoren (siehe z.B. Torchia et al., Curr. Opin. Cell. Biol. 10: 373-383 (1998)); die p65-Untereinheit des Kernfaktors kappa B (Bitco & Barik, J. Virol. 72: 5610-5618 (1998); und Doyle & Hunt, Neuroreport 8: 2937-2942 (1997)); und EGR-1 (Early-Growth-Response-Genprodukt-1; Yan et al., PNAS 95: 8298–8303 (1998); und Liu et al., Cancer Gene Ther: 5: 3–28 (1998)).
Kinasen, Phosphatasen und andere Proteine, welche in die Genregulation involvierte Polypeptide modifizieren, sind auch als regulatorische Domänen für ZFPs geeignet. Solche Modifikatoren sind häufig in das An- oder Abschalten der durch beispielsweise Hormone vermittelten Transkription verwickelt. In die Transkriptionsregulation verwickelte Kinasen sind in Davis, Mol. Reprod. Dev. 42: 459–67 (1995); Jackson et al., Adv. Second Messenger Phosphoprotein Res. 28: 279-86 (1993); und Boulikas, Crit. Rev. Eukaryot. Gene Expr. 5: 1–77 (1995) zusammengefasst, während Phosphatasen beispielsweise in Schonthal & Semin, Cancer Biol. 6: 239–48 (1995) zusammengefasst sind. Nukleare Tyrosinkinasen sind in Wang, Trends Biochem. Sci. 19: 373–6 (1994) beschrieben.
Geeignete Domänen können wie beschrieben auch aus den Genprodukten von Oncogenen (z.B. die Mitglieder der myc-, jun-, fos-, myb-, max-, mad-, rel-, ets-, bcl-, mos-Familie) und deren assoziierte Faktoren und Modifiaktoren erhalten werden. Oncogene sind beispielsweise in Cooper, Onkogenes, 2nd. Ed., The Jones and Bartlett Series in Biology, Boston, MA, Jones und Bartlett Publishers, 1995 beschrieben. Die ets-Transkriptionsfaktoren sind in Waslylk et al., Eur. J. Biochem. 211: 7–18 (1993); und Crepieux et al., Crit. Rev. Oncog. 5: 615-38 (1994) zusammengefasst. Myc-Oncogene sind beispielsweise in Ryan et al., Biochem. J. 314: 713–21 (1996) zusammengefasst. Die jun- und fos-Transkriptionsfaktoren sind beispielsweise in The Fos and Jun Families of Transcription Factors, Angel & Herrlich, Eds. (1994) beschrieben. Das max-Oncogen ist in Hurlin et al., Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 59: 109–16 zusammengefasst. Die myb-Genfamilie ist in Kanei-Ishii et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 211: 89–98 (1996) zusammengefasst. Die mos-Familie ist in Yew et al., Curr. Opin. Genet. Dev. 3: 19–25 (1993) zusammengefasst.
ZFPs können regulatorische Domänen umfassen, welche von DNA-Reparaturenzymen und deren assoziierten Faktoren und Modifikatoren erhalten wurden. DNA-Reparatursysteme sind beispielsweise in Vos, Curr. Opin. Cell Biol. 4: 385–95 (1992); Sancar, Ann. Rev. Genet. 29: 69–105 (1995); Lehmann, Genet. Eng. 17: 1–19 (1995); und Wood, Ann. Rev. Biochem. 65: 135-67 (1996) zusammengefasst. DNA-Rearrangementenzyme und deren assoziierte Faktoren und Modifikatoren können auch als regulatorische Domänen verwendet werden (siehe z.B. Gangloff et al., Experientia 50: 261–9 (1994); Sadowski, FASEB J. 7: 760–7 (1993)).
Ähnlich können regulatorische Domänen von DNA-modifizierenden Enzymen (z.B. DNA-Methyltransferasen, Topoisomerasen, Helicasen, Ligasen, Kinasen, Phosphatasen, Polymerasen) und deren assoziierte Faktoren und Modifikatoren abgeleitet werden. Helicasen sind in Matson et al., Bioessays 16: 13-22 (1994) zusammenfasst und Methyltransferasen sind in Cheng, Curr. Opin. Struct. Biol. 5: 4–10 (1995) beschrieben. Chromatinassoziierte Proteine und deren Modifikatoren (z.B. Kinasen, Acetylasen und Deacetylasen), wie Histondeacetylase (Wolffe, Science 272: 371–2 (1996)), sind auch als Domänen für eine Verbindung mit dem ZFP der Wahl geeignet. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist die regulatorische Domäne eine DNA-Methyltransferase, die als Transkriptionsrepressor wirkt (siehe z.B. Vand den Wyngaert et al., FEBS Lett. 426: 283–289 (1998); Flynn et al., J. Mol. Biol. 279: 101–116 (1998); Okano et al., Nucleic Acids Res. 26: 2536–2540 (1998); und Zardo und Caiafa, J. Biol. Chem. 273: 16517–16520 (1998)). Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform werden Endonukleasen, wie Fok1, als Transkriptionsrepressoren, die über eine Genspaltung wirken, verwendet (siehe z.B.: WO95/09233 und PCT/US94/01201).
Faktoren, welche Chromatin und die DNA-Struktur, die Bewegung und Lokalisierung kontrollieren, und deren assoziierte Faktoren und Modifikatoren, aus Mikroben abgeleitete Faktoren (z.B. Prokaryoten, Eukaryoten und Viren) und Faktoren, welche mit diesen assoziiert sind oder diese modifizieren, können auch verwendet werden, um Chimäre Proteine zu erhalten. Gemäß einer Ausführungsform werden Rekombinasen und Integrasen als regulatorische Domänen verwendet. Gemäß einer Ausführungsform wird Histonacetyltransferase als Transkriptionsaktivator verwendet (siehe z.B. Jin & Scotto, Mol. Cell. Biol. 18: 4377–4384 (1998); Wolffe, Science 272: 371–372 (1996); Taunton et al., Science 272: 408–411 (1996); and Hassig et al., PNAS 95: 3519–3524 (1998)). Gemäß einer anderen Ausführungsform wird eine Histondeacetylase als Transkriptionsrepressor verwendet (siehe z.B. Jin & Scotto, Mol. Cell. Biol. 18: 4377–4384 (1998); Syntichaki & Thireos, J. Biol. Chem. 273: 24414–24419 (1998); Sakaguchi et al., Genes Dev. 12: 2831–2841 (1998); und Martinez et al., J. Biol. Chem. 273: 23781–23785 (1998)).
Linkerdomänen zwischen Polypeptiddomänen, z.B. zwischen zwei ZFPs oder zwischen einem ZFP und einer regulatorischen Domäne, können eingeschlossen sein. Solche Linker sind üblicherweise Polypeptidsequenzen, wie Polyglycinsequenzen von etwa 5 bis 200 Aminosäuren. Bevorzugte Linker sind üblicherweise flexible Aminosäureuntersequenzen, die als Teil eines rekombinanten Fusionsproteins synthetisiert werden. Gemäß einer Ausführungsform wird beispielsweise der Linker DGGGS verwendet, um zwei ZFPs zu verbinden. Gemäß einer anderen Ausführungsform ist der flexible Linker, der zwei ZFPs verbindet, eine Aminosäureuntersequenz umfassend die Sequenz TGEKP (siehe z.B. Liu et al., PNAS 5525–5530 (1997)). Gemäß einer anderen Ausführungsform wird der Linker LRQKDGERP verwendet, um zwei ZFPs zu verbinden. Gemäß einer anderen Ausführungsform werden die folgenden Linker verwendet, um zwei ZFPs zu verbinden: GGRR (Pomerantz et al., 1995, supra), (G4S)_n (Kim et al., PNAS 93, 1156–1160 (1996), und GGRRGGGS, LRQRDGERP, LRQKDGGGSERP, LRQKD(G3S) ₂ERP. Alternativ dazu können flexible Linker unter Verwendung von Computerprogrammen, welche zum Modeling von DNA-Bindungsstellen und den Peptiden selbst fähig sind (Desjarlais & Berg, PNAS 90: 2256–2260 (1993); PNAS 91: 11099–11103 (1994)), oder durch Phage-Display-Verfahren rationell entwickelt werden.
Gemäß einer anderen Ausführungsform wird ein chemischer Linker verwendet, um synthetisch oder rekombinant erzeugte Domänensequenzen zu verbinden. Solche flexiblen Linker sind dem Fachmann gut bekannt. Poly (ethylenglycol)-Linker sind beispielsweise von Shearwater Polymers, Inc., Huntsville, Alabama, erhältlich. Diese Linker weisen gegebenenfalls Amidbindungen, Sulfhydrylbindungen oder heterofunktionale Bindungen auf. Zusätzlich zu einer kovalenten Verbindung von ZFPs mit regulatorischen Domänen können nicht kovalente Verfahren verwendet werden, um Moleküle aus mit regulatorischen Domänen assoziierten ZFPs zu erzeugen.
Zusätzlich zu regulatorischen Domänen wird das ZFP häufig als Fusionsprotein, beispielsweise mit dem Maltosebindungsprotein ("MBP"), der Glutathion-S-Transferase (GST), einem Hexahistidin-, dem c-myc- und dem FLAG-Epitop, für ein erleichtertes Aufreinigen, Überwachen der Expression oder Überwachen der zellulären und subzellulären Lokalisierung exprimiert.
Expressionsvektoren für ZFP-codierende Nukleinsäuren
Die das ZFP der Wahl codierende Nukleinsäure wird üblicherweise in Zwischenvektoren für eine Transformation in prokaryotische oder eukaryotische Zellen für eine Replikation und/oder Expression, z.B. für die Bestimmung der K_d, kloniert. Zwischenvektoren sind üblicherweise prokaryotische Vektoren, z.B. Plasmide oder Shuttlevektoren, oder Insektenvektoren und dienen der Lagerung oder Manipulation der das ZFP codierenden Nukleinsäure oder der Erzeugung des Proteins. Die ein ZFP codierende Nukleinsäure wird üblicherweise in einen Expressionsvektor für eine Verabreichung an eine Pflanzenzelle, Tierzelle, vorzugsweise eine Säugetierzelle oder eine humane Zelle, eine Pilzzelle, eine Bakterienzelle oder eine Protozoonzelle kloniert.
Um eine Expression eines klonierten Gens oder einer klonierten Nukleinsäure zu erhalten, wird das ZFP üblicherweise in einen Expressionsvektor, der einen Promotor zur direkten Transkription enthält, subkloniert. Geeignete bakterielle und eukaryotische Promotoren sind im Stand der Technik gut bekannt und sind z.B. in Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2nd Ed. 1989); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990); und Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., Eds., 1994) beschrieben. Bakterielle Expressionssysteme zur Expression der ZFPs sind z.B. E. coli, Bacillus sp. und Salmonella (Palva et al., Gene 22: 229–235 (1983)). Kits für solche Expressionssysteme sind kommerziell erhältlich. Eukaryotische Expressionssysteme für Säugetierzellen, Hefe und Insektenzellen sind im Stand der Technik gut bekannt und sind auch kommerziell erhältlich.
Der zur Steuerung der Expression einer ZFP-Nukleinsäure verwendete Promotor hängt von der jeweiligen Anwendung ab. Üblicherweise wird z.B. ein starker konstitutiver Promotor für die Expression und Aufreinigung von ZFPs verwendet. Im Gegensatz dazu kann in Abhängigkeit von der jeweiligen Verwendung des ZFP entweder ein konstitutiver oder ein induzierbarer Promotor verwendet werden, wenn ein ZFP in vivo zur Genregulation verabreicht wird. Zudem kann ein bevorzugter Promotor zur Verabreichung eines ZFP ein schwacher Promotor, wie HSV TK oder ein Promotor mit ähnlicher Aktivität, sein. Der Promotor kann üblicherweise auch Elemente umfassen, welche empfindlich gegenüber einer Transaktivierung sind, wie z.B. Hypoxie-Antwortelemente, Gal4-Antwortelemente, lac-Repressorantwortelemente und Kleinmolekülkontrollsysteme, wie das tet-regulierte System und das RU-486-System (siehe z.B. Gossen & Bujard, PNAS 89: 5547 (1992); Oligino et al., Gene Ther. 5: 491–496 (1998); Wang et al., Gene Ther. 4: 432–441 (1997); Neering et al., Blood 88: 1147–1155 (1996); und Rendahl et al., Nat. Biotechnol. 16: 757–761 (1998)).
Zusätzlich zu dem Promotor enthält der Expressionsvektor üblicherweise eine Transkriptionseinheit oder Expressionskassette, die die für die Expression der Nukleinsäure in der Wirtszelle, entweder einer prokaryotischen oder eukaryotischen Zelle, erforderlichen zusätzlichen Elemente enthält. Eine typische Expressionskassette enthält demnach einen in operativer Verknüpfung z.B. mit der das ZFP codierenden Nukleinsäuresequenz vorliegenden Promotor und die z.B. für eine effiziente Polyadenylierung des Transkripts, eine Transkriptionstermination, Ribosebindungsstellen oder eine Translationstermination erforderlichen Signale. Zusätzliche Elemente der Kassette können z.B. Enhancer und heterologe gesplicte Intronsignale umfassen.
Der für den Transport der genetischen Information in die Zelle verwendete spezielle Expressionsvektor wird in Bezug auf die beabsichtigte Verwendung des ZFP, z.B. zur Expression in Pflanzen, Tieren, Bakterien, Pilzen, Protozoen etc. ausgewählt (siehe die oben beschriebenen Expressionsvektoren und die Beispiele). Bakterielle Standardexpressionsvektoren umfassen Plasmide, wie pBR322-basierte Plasmide, pSKF, pET23D und kommerziell erhältliche Fusionsexpressionssysteme, wie GST und LacZ. Ein bevorzugtes Fusionsprotein ist das Maltosebindungsprotein, "MBP". Solche Fusionsproteine werden zur Aufreinigung der ZFP verwendet. Expressionstags können auch an rekombinante Proteine angefügt werden, um geeignete Verfahren zur Isolation, zur Überwachung der Expression und zur Überwachung der zellulären und subzellulären Lokalisierung bereitzustellen, z.B. c-myc oder FLAG.
Expressionsvektoren, welche regulatorische Elemente von eukariotischen Viren enthalten, werden häufig als eukaryotische Expressionsvektoren verwendet, wie z.B. die SV40-Vektoren, die Papillomavirus-Vektoren und die von dem Epstein-Barr-Virus abgeleiteten Vektoren. Andere beispielhafte eukariotische Vektoren umfassen pMSG, pASV009/A+, pMTO10/A+, pMAMneo-5, Baculovirus pDSVE und jeden anderen Vektor, der die Expression von Proteinen unter der Kontrolle des frühen SV40-Promotors, des späten SV40-Promotors, des Metallothioninpromotors, des murinen Brusttumorviruspromotors, des Rous-Sarcoma-Viruspromotors, des Polyhedrinpromotors ermöglicht, oder andere Promotoren, die sich für die Expression in eukariotischen Zellen als wirksam erweisen.
Einige Expressionssysteme weisen Marker zur Selektion von stabil transfizierten Zelllinien, wie Thymidinkinase, Hygromycin-B-Phosphotransferase und Dihydrofolatreduktase, auf. Expressionssysteme mit hoher Ausbeute sind auch geeignet, wie die Verwendung eines Baculovirus-Vektors in Insektenzellen, wobei sich eine ZFP-codierende Sequenz unter der Kontrolle des Polyhedrinpromotors oder eines anderen starken Baculovirus-Promotors befindet.
Die typischerweise in Expressionsvektoren enthaltenen Elemente umfassen auch einen Replikationsursprung, der in E. coli arbeitet, ein Gen codierend für eine Antibiotikaresistenz, um eine Selektion der Bakterien, welche die rekombinanten Plasmide beinhalten, zu ermöglichen, und Restriktionsstellen in unwesentlichen Regionen des Plasmids, um eine Insertion der rekombinanten Sequenzen zu ermöglichen.
Standardtransfektionsverfahren werden zur Erzeugung der Bakterien-, Säugetier-, Hefe- oder Insektenzelllinien verwendet, welche große Mengen Protein exprimieren, das dann unter Verwendung von Standardverfahren aufgereinigt wird (siehe z.B. Colley et al., J. Biol. Chem. 264: 17619–17622 (1989); Guide to Protein Purification, in Methods in Enzymology, Vol. 182 (Deutscher, Ed., 1990)). Die Transformation von eukaryotischen und prokaryotischen Zellen wird gemäß Standardverfahren durchgeführt (siehe z.B. Morrison, J. Bact. 132: 349–351 (1977); Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology 101: 347–362 (Wu et al., Eds., 1983).
Jedes der gut bekannten Verfahren zur Einbringung von fremden Nukleinsäuresequenzen in Wirtszellen kann verwendet werden. Diese umfassen die Verwendung der Calciumphosphattransfektion, von Polybren, der Protoplastenfusion, der Elektroporation, von Liposomen, der Mikroinjektion, von nackter DNA, von Plasmidvektoren, von viralen Vektoren, sowohl episomal als auch integrativ, und jedes andere bekannte Verfahren zur Einbringung von klonierter genomischer DNA, cDNA, synthetischer DNA oder jedem anderen fremden genetischen Material in eine Wirtszelle (siehe z.B. Sambrook et al., supra). Es ist nur erforderlich, dass das speziell verwendete genetische Engineeringverfahren zur erfolgreichen Einbringung wenigstens eines Gens in die Wirtszelle, welche zur Expression des Proteins der Wahl fähig ist, fähig ist.
Assays zur Bestimmung der Regulation der Genexpression durch ZFPs
Eine Vielzahl von Assays kann verwendet werden, um das Ausmaß der Regulation der Genexpression durch ZFPs zu bestimmen. Die Aktivität eines bestimmten ZFP kann unter Verwendung einer Vielzahl von in vitro- und in vivo-Assays durch Messen von z.B. der Protein- oder mRNA-Gehalte, Produktgehalte, der Enzymaktivität, des Tumorwachstums, der Transkriptionsaktivierung oder -repression eines Reportergens, der Gehalte von sekundären Botenstoffen (z.B. cGMP, cAMP, IP3, DAG, Ca²⁺), des Ausmaßes der Cytokin- und Hormonerzeugung, und der Neovaskularisierung unter Verwendung von z.B. Immunoassays (z.B. ELISA und immunohistochemische Assays mit Antikörpern), Hybridisierungsassays (z.B. RNase-Schutz-, Northern-, in situ-Hybridisierungs- oder Oligonukleotidarraystudien), colorimetrischen Assays, Amplifikationsassays, Enzymaktivitätsassays, Tumorwachstumsassays, phänotypischen Assays und dgl. bestimmt werden.
ZFPs werden üblicherweise zunächst auf deren Aktivität in vivo hin untersucht, indem kultivierte Zellen, z.B. 293-Zellen, CHO-Zellen, VERO-Zellen, BHK-Zellen, HeLa-Zellen, COS-Zellen und dgl. verwendet werden. Vorzugsweise werden humane Zellen verwendet. Das ZFP wird häufig zunächst unter Verwendung eines transienten Expressionssystems mit einem Reportergen untersucht und dann wird die Regulation des endogenen Zielgens in Zellen und in Tieren, sowohl in vivo als auch ex vivo, untersucht. Das ZFP kann rekombinant in einer Zelle, rekombinant in in ein Tier transplantierten Zellen oder rekombinant in einem transgenen Tier exprimiert werden und kann auch als Protein einem Tier oder einer Zelle unter Verwendung eines oben beschriebenen Transportvehikels verabreicht werden. Die Zellen können immobilisiert sein, in Lösung vorliegen, einem Tier injiziert worden sein oder natürlich in einem transgenen oder nicht transgenen Tier vorkommen.
Die Modulation der Genexpression wird unter Verwendung von einem oder mehreren der hierin beschriebenen in vitro- oder in vivo-Assays untersucht. Die Proben und Assays werden mit einem ZFP behandelt und mit Kontrollproben ohne die Testverbindung verglichen, um das Ausmaß der Modulation zu bestimmen. Wie oben beschrieben, weist das ZFP zur Regulation der endogenen Genexpression üblicherweise eine K_d von 200 nM oder weniger, mehr bevorzugt 100 nM oder weniger, mehr bevorzugt 50 nM, am meisten bevorzugt 25 nM oder weniger auf.
Die Auswirkungen der ZFPs können durch Bestimmung jedes der oben beschriebenen Parameter untersucht werden. Jede geeignete Veränderung der Genexpression, des Phänotyps oder jede geeignete physiologische Veränderung kann verwendet werden, um den Einfluss eines ZFP zu bestimmen. Wird die funktionelle Bedeutung unter Verwendung von intakten Zellen oder Tieren bestimmt, kann man auch eine Vielzahl von Auswirkungen, wie das Tumorwachstum, die Neovaskularisierung, die Hormonfreisetzung, Transkriptionsveränderungen im Hinblick auf bekannte und bislang nicht bekannte Genmarker (z.B. Northern Blots oder Oligonukleotidarraystudien), Veränderungen des Zellmetabolismus, wie des Zellwachstums oder pH-Änderungen, und Änderungen der intrazellulären sekundären Botenstoffe, wie cGMP, bestimmen.
Bevorzugte Assays für die Regulation der endogenen Genexpression durch ZFPs können in vitro durchgeführt werden. Gemäß einem bevorzugten in vitro-Assayformat wird die Regulierung der endogenen Genexpression in kultivierten Zellen durch ZFPs durch eine Bestimmung der Proteinerzeugung unter Verwendung eines ELISA-Assays gemessen (siehe Beispiele VI und VII). Die Testprobe wird mit Kontrollzellen, die mit einem leeren Vektor oder einem nicht verwandten ZFP, das auf ein anderes Gen gerichtet ist, behandelt wurden, verglichen.
Gemäß einer anderen Ausführungsform wird die Regulation der endogenen Genexpression durch ZFPs in vitro durch Bestimmung des Ausmaßes der Zielgen-mRNA-Expression bestimmt. Das Ausmaß der Genexpression wird unter Verwendung einer Amplifikation, z.B. unter Verwendung von PCR-, LCR- oder Hybridisierungsassays, z.B. Northern-Hybridisierung, RNase-Schutz, Dot-Blotting, bestimmt. RNase-Schutz wird gemäß einer Ausführungsform verwendet (siehe Beispiele VIII und 10). Der Protein- oder mRNA-Gehalt wird unter Verwendung von direkt oder indirekt markierten Nachweisagenzien, z.B. Fluoreszenz- oder radioaktiv markierten Nukleinsäuren, radioaktiv oder enzymatisch markierten Antikörpern und dgl., wie hierin beschrieben, bestimmt.
Alternativ dazu kann ein Reportergensystem unter Verwendung des in operativer Verknüpfung mit einem Reportergen, wie Luciferase, grünfluoreszierendes Protein, CAT oder β-Gal, vorliegenden Zielgenpromotors konstruiert werden. Das Reporterkonstrukt wird üblicherweise in eine kultivierte Zelle cotransfiziert. Nach der Behandlung mit dem ZFP der Wahl wird das Ausmaß der Reportergentranskription, Translation oder Aktivität nach dem Fachmann bekannten Standardverfahren bestimmt.
Ein anderes Beispiel eines bevorzugten Assayformats, das zur Überwachung der Regulation der endogenen Genexpression durch ZFPs geeignet ist, wird in vivo durchgeführt. Dieser Assay ist insbesondere zur Untersuchung der ZFPs geeignet, die die Expression von Tumorunterstützenden Genen, von Genen, die in die Unterstützung eines Tumors verwickelt sind, wie Neovaskularisierung (z.B. VEGF), oder Genen, die ein Tumorsuppressorgen, wie p53, aktivieren, inhibieren. Gemäß diesem Assay werden kultivierte Tumorzellen, welche das ZFP der Wahl exprimieren, subkutan in eine Maus mit einem beeinträchtigten Immunsystem, wie eine athymische Maus, eine bestrahlte Maus oder eine SCID-Maus, injiziert. Nach einer geeigneten Zeitdauer, vorzugsweise 4–8 Wochen, wird das Tumorwachstum, z.B. durch Bestimmung des Volumens oder durch Bestimmung der zwei längsten Dimensionen, bestimmt und mit der Kontrolle verglichen. Tumore mit einer statistisch signifikanten Reduktion (unter Verwendung von z.B. des Student's T-Tests) zeigen ein inhibiertes Wachstum. Alternativ dazu kann auch das Ausmaß der Tumorneovaskularisierung bestimmt werden. Immunoassays unter Verwendung von Endothelzell-spezifischen Antikörpern werden verwendet, um eine Vaskularisierung des Tumors und die Anzahl der Gefäße in dem Tumor zu bestimmen. Tumore, welche eine statistisch signifikante Reduktion der Anzahl von Gefäßen (unter Verwendung von z.B. des Student's T-Tests) zeigen, inhibieren eine Neovaskularisierung.
Transgene und nicht transgene Tiere werden auch gemäß einer bevorzugten Ausführungsform zur Bestimmung der Regulation der endogenen Genexpression in vivo verwendet. Transgene Tiere exprimieren üblicherweise das ZFP der Wahl. Alternativ dazu können Tiere, welche das ZFP der Wahl transient exprimieren, oder welchen das ZFP durch ein Transportvehikel verabreicht wurde, verwendet werden. Die Regulation der endogenen Genexpression kann unter Verwendung jedes der hierin beschriebenen Assays untersucht werden.
ZFP-codierende Nukleinsäuren und Gentherapie
Herkömmliche virale und nicht virale Gentransferverfahren können verwendet werden, um Nukleinsäuren, welche für die konstruierten ZFPs codieren, in Säugetierzellen oder Zielgewebe einzubringen. Solche Verfahren können verwendet werden, um ZFP-codierende Nukleinsäuren an Zellen in vitro zu verabreichen. Vorzugsweise werden die ZFP-codierenden Nukleinsäuren für in vivo- oder ex vivo-Gentherapiezwecke verabreicht. Nicht virale Transportvektorsysteme umfassen DNA-Plasmide, nackte Nukleinsäuren und mit einem Transportvehikel, wie einem Liposom, komplexierte Nukleinsäuren. Virale Vektortransportsysteme umfassen DNA- und RNA-Viren, die nach der Zufuhr zu der Zelle entweder episomale oder integrierte Genome aufweisen. Für einen Übersichtsartikel über Gentherapieverfahren siehe Anderson, Science 256: 808–813 (1992); Nabel & Felgner, TIBTECH 11: 211–217 (1993); Mitani & Caskey, TIBTECH 11: 162–166 (1993); Dillon, TIBTECH 11: 167–175 (1993); Miller, Nature 357: 455–460 (1992); Van Brunt, Biotechnology 6(10): 1149–1154 (1988); Vigne, Restorative Neurology and Neuroscience 8: 35–36 (1995); Kremer & Perricaudet, British Medical Bulletin 51(1): 31–44 (1995); Haddada et al., in Current Topics in Microbiology and Immunology, Doerfler und Böhm (Eds) (1995); und Yu et al., Gene Therapy 1: 13–26 (1994).
Verfahren zur nicht viralen Zufuhr von Nukleinsäuren, die für konstruierte ZFPs codieren, umfassen die Lipofektion, die Mikroinjektion, ballistische Verfahren, Virosomen, Liposomen, Immunoliposomen, Polykation- oder Lipid:Nukleinsäure-Konjugate, nackte DNA, artifizielle Virionen und die durch Agenzien verstärke Aufnahme von DNA. Die Lipofektion ist beispielsweise in US 5,049,386 , US 4,946,787 und US 4,897,355 beschrieben und Lipofektionsreagenzien werden kommerziell vertrieben (z.B. Transfectam^TM und Lipofectin^TM). Kationische und neutrale Lipide, die für eine wirksame Rezeptor-Erkennungs-Lipofektion von Polynukleotiden geeignet sind, umfassen diejenigen von Felgner, WO 91/17424, WO 91/16024. Die Zufuhr kann an Zellen (ex vivo-Verabreichung) oder Zielgewebe (in vivo-Verabreichung) erfolgen.
Die Herstellung von Lipid-Nukleinsäure-Komplexen, umfassend beladene Liposomen, wie Immunolipidkomplexe, ist dem Fachmann gut bekannt (siehe z.B. Crystal, Science 270: 404–410 (1995); Blaese et al., Cancer Gene Ther. 2: 291–297 (1995); Behr et al., Bioconjugate Chem. 5: 382–389 (1994); Remy et al., Bioconjugate Chem. 5: 647–654 (1994); Gao et al., Gene Therapy 2: 710–722 (1995); Ahmad et al., Cancer Res. 52: 4817–4820 (1992); U.S. Pat. Nrn. 4,186,183, 4217,344, 4,235,871, 4,261,975, 4,485,054, 4,501,728, 4,774,085, 4,837,028 und 4,946,787).
Die Verwendung von viralen RNA- oder DNA-Systemen zur Zufuhr von Nukleinsäuren, die konstruierte ZFPs codieren, basiert auf hochentwickelten Verfahren, um ein Virus gegen spezifische Zellen in dem Körper zu richten und den viralen Anteil in den Kern zu leiten. Virale Vektoren können einem Patienten direkt verabreicht werden (in vivo) oder sie können verwendet werden, um Zellen in vitro zu behandeln und die modifizierten Zellen werden dem Patienten verabreicht (ex vivo). Herkömmliche virale Systeme zur Zufuhr der ZFPs können retrovirale, lentivirale, adenovirale, adenoassoziierte und Herpes-Simplex-Virus-Vektoren zum Gentransfer umfassen. Virale Vektoren stellen derzeit das effizienteste und vielseitigste Verfahren zum Gentransfer in Zielzellen und Gewebe dar. Eine Integration in das Wirtsgenom ist mit den retroviralen, lentiviralen und adeno-assoziierten Virusgentransferverfahren möglich, was häufig zu einer Langzeitexpression des insertierten Transgens führt. Zudem wurden in mehreren unterschiedlichen Zelltypen und Zielgeweben hohe Transduktionseffizienzen beobachtet.
Der Tropfismus eines Retrovirus kann durch Einbringen fremder Hüllproteine verändert werden, was die potenzielle Zielpopulation der Zielzellen vergrößert. Lentivirale Vektoren sind retrovirale Vektoren, die zur Transduktion oder Infektion von nicht teilenden Zellen fähig sind und üblicherweise hohe virale Titer erzeugen. Die Auswahl eines retroviralen Gentransfersystems hängt daher von dem Zielgewebe ab. Retrovirale Vektoren bestehen aus cis-wirkenden langen terminalen Sequenzwiederholungen (LTRs) mit Verpackungskapazitäten von bis zu 6–10 kb für fremde Sequenzen. Die minimalen cis-wirkenden LTRs sind für eine Replikation und Verpackung der Vektoren, die dann verwendet werden, um die therapeutischen Gene in die Zielzellen zu integrieren, um eine permanente Transgenexpression zu erzeugen, ausreichend. Häufig verwendete retrovirale Vektoren umfassen diejenigen Vektoren, die auf dem murinen Leukämievirus (MuLV), dem Gibbonaffenleukämievirus (GaLV), dem Affenimmunodefizienzvirus (SIV), dem humanen Immunodefizienzvirus (HIV) und Kombinationen davon basieren (siehe z.B. Buchscher et al., J. Virol. 66: 2731–2739 (1992); Johann et al., J. Virol. 66: 1635–1640 (1992); Sommerfelt et al., Virol. 176: 58–59 (1990); Wilson et al., J. Virol. 63: 2374–2378 (1989); Miller et al., J. Virol. 65: 2220–2224 (1991); PCT/US94/05700).
Bei Anwendungen, bei denen eine transiente Expression des ZFP bevorzugt ist, werden üblicherweise adenovirale Systeme verwendet. Adenovirale Vektoren sind zu sehr hohen Transduktionseffizienzen in vielen Zelltypen fähig und erfordern keine Zellteilung. Mit solchen Vektoren wurden höhere Titer und Expressionsgrade erhalten. Diese Vektoren können in großen Mengen in einem relativ einfachen System erzeugt werden. Adenoassoziierte Virus ("AAV")-Vektoren werden auch verwendet, um Zellen mit Zielnukleinsäuren zu transduzieren, z.B. bei der in vivo-Erzeugung von Nukleinsäuren und Peptiden und bei in vivo- und ex vivo- Gentherapieverfahren (siehe z.B. West et al., Virology 160: 38–47 (1987); U.S. Patent Nr. 4,797,368; WO 93/24641; Cotin, Human Gene Therapy 5: 793–801 (1994); Muzyczka, J. Clin. Invest. 94: 1351 (1994)). Die Konstruktion von rekombinanten AAV-Vektoren ist in einer Vielzahl von Publikationen, umfassend das U.S. Pat. Nr. 5,173,414; Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 5: 3251–3260 (1985); Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 4: 2072–2081 (1984); Hermonat & Muzyczka, PNAS 81: 6466–6470 (1984); und Samulski et al., J. Virol. 63: 3822–3828 (1989), beschrieben.
Es sind insbesondere wenigstens sechs Ansätze basierend auf viralen Vektoren zum Gentransfer in klinischen Studien verfügbar, wobei retrovirale Vektoren bei weitem das am häufigsten verwendete System darstellen. Alle diese vitalen Vektoren verwenden Ansätze, welche eine Vervollständigung von unvollständigen Vektoren durch in Helferzellllinien insertierte Gene umfassen, um das Transduktionsmittel zu erzeugen.
pLASN und MFG-S sind Beispiele für retrovirale Vektoren, die in klinischen Versuchen verwendet wurden (Dunbar et al., Blood 85: 3048–305 (1995); Kohn et al., Nat. Med. 1: 1017–102 (1995); Malech et al., PNAS 94:22 12133–12138 (1997)). PA317/pLASN war der erste therapeutische Vektor, der in Gentherapieversuchen verwendet wurde (Blaese et al., Science 270: 475–480 (1995)). Transduktionseffizienzen von 50 % oder mehr wurden für MFG-S-verpackte Vektoren beobachtet (Ellem et al., Immunol. Immunother. 44(1): 10–20 (1997); Dranoff et al., Hum. Gene Ther. 1: 111–2 (1997)).
Rekombinante adeno-assoziierte Virusvektoren (rAAV) sind ein vielversprechendes alternatives Gentransportsystem, das auf dem unvollständigen und nicht pathogenen adeno-assoziierten Parvovirus Typ 2 (Parvovirus-Adeno-Associated-Type-2-Virus) basiert. Alle Vektoren werden von einem Plasmid erhalten, das nur die AAV 145 bp invertierten terminalen Sequenzwiederholungen, welche die Transgenexpressionskassette flankieren, beibehält. Ein effizienter Gentransfer und eine stabile Transgenzufuhr aufgrund der Integration in das Genom der transduzierten Zellen sind Schlüsselfaktoren für dieses Vektorsystem (Wagner et al., Lancet 351: 9117 1702–3 (1998); Kearns et al., Gene Ther. 9: 748–55 (1996)).
Replikationsdefiziente rekombinante adenovirale Vektoren (Ad) werden überwiegend in der Dickdarmkrebsgentherapie verwendet, da sie mit einem hohen Titer erzeugt werden können und leicht mehrere unterschiedliche Zelltypen infizieren. Die meisten Adenovirusvektoren werden so konstruiert, dass ein Transgen die Ad E1a-, E1b- und E3-Gene ersetzt. Anschließend wird der replikationsdefiziente Vektor in humanen 293-Zellen vermehrt, welche die deletierte Genfunktion in trans liefern. Ad-Vektoren können verschiedene Gewebearten in vivo transduzieren, was nicht teilende differenzierte Zellen als auch die in dem Leber-, Nieren- und Muskelsystemgewebe vorgefundenen Zellen umfasst. Herkömmliche Ad-Vektoren besitzen eine große Ladekapazität. Ein Beispiel für die Verwendung eines Ad-Vektors in einem klinischen Versuch umfasst die Polynukleotidtherapie für eine Antitumorimmunisierung mit intramuskulären Injektionen (Sterman et al., Hum. Gene Ther. 7: 1083–9 (1998)). Zusätzliche Beispiele für die Verwendung von Adenovirusvektoren für einen Gentransfer in klinischen Versuchen umfassen Rosenecker et al., Infection 24:1 5–10 (1996); Sterman et al., Hum. Gene Ther. 9:7 1083–1089 (1998); Welsh et al., Hum. Gene Ther. 2: 205–18 (1995); Alvarez et al., Hum. Gene Ther. 5: 597–613 (1997); Topf et al., Gene Ther. 5: 507–513 (1998); Sterman et al., Hum. Gene Ther. 7: 1083–1089 (1998).
Verpackungszellen werden verwendet, um Viruspartikel zu bilden, die zur Infektion einer Wirtszelle fähig sind. Solche Zellen umfassen 293-Zellen, die ein Adenovirus verpacken und ψ2-Zellen oder PA317-Zellen, die ein Retrovirus verpacken. In der Gentherapie verwendete virale Vektoren werden üblicherweise durch Produktionszelllinien erzeugt, welche einen Nukleinsäurevektor in ein Viruspartikel verpacken. Diese Vektoren enthalten üblicherweise die minimalen Virussequenzen, die für ein Verpacken und eine nachfolgende Integration in einen Wirt erforderlich sind, wobei andere Virussequenzen durch eine Expressionskassette für das zu exprimierende Protein ersetzt sind. Die fehlenden Virusfunktionen werden in trans durch die Verpackungszelllinie geliefert. In der Gentherapie verwendete AAV-Vektoren besitzen üblicherweise nur ITR-Sequenzen des AAV-Genoms, die zur Verpackung und Integration in das Wirtsgenom erforderlich sind. Virus-DNA wird in eine Zelllinie verpackt, die ein die anderen AAV-Gene, nämlich rep und cap, codierendes Helferplasmid enthält, der jedoch die ITR-Sequenzen fehlen. Die Zelllinie wird auch mit einem Adenovirus als Helfer infiziert. Das Helfervirus unterstützt die Replikation des AAV-Vektors und die Expression der AAV-Gene des Helferplasmids. Das Helferplasmid wird mehrheitlich nicht verpackt aufgrund des Fehlens der ITR-Sequenzen. Eine Kontamination mit einem Adenovirus kann durch z.B. Hitzebehandlung, gegenüber der ein Adenovirus empfindlicher ist als AAV, verringert werden.
Für zahlreiche Gentherapieanwendungen ist es günstig, wenn der Gentherapievektor mit einer hohen Spezifität an einen bestimmten Gewebetyp geliefert wird. Ein viraler Vektor wird üblicherweise so modifiziert, dass er eine Spezifität für einen gegebenen Zelltyp aufweist, indem ein Ligand als Fusionsprotein mit einem viralen Hüllprotein auf der äußeren Oberfläche der Viren exprimiert wird. Der Ligand wird so ausgewählt, dass er eine Affinität für einen Rezeptor, der nachweislich auf dem Zelltyp von Interesse vorkommt, aufweist. Han et al., PNAS 92: 9747–9751 (1995) berichten beispielsweise, dass das murine Moloney-Mäuse-Leukämievirus so modifiziert werden kann, dass es gp70 fusioniertes humanes Heregulin exprimiert und der rekombinante Vektor infiziert bestimmte humane Brustkrebszellen, welche den humanen epidermalen Wachstumsfaktorrezeptor exprimieren. Dieses Prinzip kann auf andere Paare von Viren, die ein Ligandenfusionsprotein exprimieren, und Zielzellen, die einen Rezeptor exprimieren, ausgeweitet werden. Der filamentöse Phage kann beispielsweise so konstruiert werden, dass er Antikörperfragmente (z.B. Fab oder Fv) mit einer spezifischen Bindungsaffinität für im Wesentlichen jeden möglichen zellulären Rezeptor zeigt. Obwohl die obige Beschreibung vorwiegend auf virale Vektoren Anwendung findet, können dieselben Prinzipien auch auf nicht virale Vektoren angewendet werden. Solche Vektoren können so konstruiert werden, dass sie spezifische Aufnahmesequenzen, von denen ausgegangen wird, dass sie die Aufnahme durch spezifische Zielzellen begünstigen, enthalten.
Gentherapievektoren können in vivo durch Verabreichung an einen einzelnen Patienten, üblicherweise durch systemische Verabreichung (z.B. intravenöse, intraperitoneale, intramuskuläre, subdermale oder intragraniale Infusion) oder topische Verabreichung, wie unten beschrieben, zugeführt werden. Alternativ dazu können Vektoren Zellen ex vivo, wie beispielsweise aus einem einzelnen Patienten explantierte Zellen (z.B. Lymphozyten, Knochenmarkaspirata, Gewebebiopsie) oder universelle hämatopoetische Donorstammzellen, zugeführt werden, was von einer Reimplantation der Zellen in einen Patienten üblicherweise nach der Selektion der Zellen, welche den Vektor inkorporiert haben, gefolgt ist.
Die ex vivo-Zelltransfektion für diagnostische Zwecke, für Forschungszwecke oder für die Gentherapie (z.B. durch Reinfusion der transfizierten Zellen in den Wirtsorganismus) ist dem Fachmann gut bekannt. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform werden Zellen aus dem Organismus einer Versuchsperson isoliert, mit einer ZFP-Nukleinsäure (Gen oder cDNA) transfiziert und zurück in den Organismus der Versuchsperson (z.B. Patient) reinfusioniert. Verschiedene, für die ex vivo-Transfektion geeignete Zelltypen sind dem Fachmann gut bekannt (siehe z.B. Freshney et al., Culture of Animal Cell, A Manual of Basic Technique (3. Ed., 1994) und die darin zitierten Literaturstellen für eine Diskussion über die Art und Weise der Isolation und Kultivierung von Zellen aus Patienten).
Gemäß einer Ausführungsform werden Stammzellen in ex vivo-Verfahren zur Zelltransfektion und Gentherapie verwendet. Der Vorteil der Verwendung von Stammzellen besteht darin, dass diese in vitro in andere Zelltypen differenziert werden können oder in ein Säugetier (z.B. den Spender der Zellen) eingebracht werden können, wo sie sich in das Knochenmark einfügen können. Verfahren zur in vitro-Differenzierung von CD34+-Zellen in klinisch wichtige Immunzelltypen unter Verwendung von Cytokinen, wie GM-CSF, IFN-γ und TNF-α, sind bekannt (siehe Inaba et al., J. Exp. Med. 176: 1693–1702 (1992)).
Stammzellen werden für eine Transduktion und Differenzierung unter Verwendung von bekannten Verfahren isoliert. Beispielsweise werden Stammzellen aus den Knochenmarkszellen isoliert, indem die Knochenmarkszellen mit Antikörpern, die unerwünschte Zellen, wie CD4+ und CD8+ (T-Zellen), CD45+ (panB-Zellen), GR-1 (Granulocyten) und lad (differenzierte Antigen-präsentierende Zellen), binden, in Kontakt gebracht werden (siehe Inaba et al., J. Exp. Med. 176: 1693–1702 (1992)).
Vektoren (z.B. Retroviren, Adenoviren, Liposomen etc.), welche therapeutische ZFP-Nukleinsäuren enthalten, können auch direkt an den Organismus für eine Transduktion von Zellen in vivo verabreicht werden. Alternativ dazu kann nackte DNA verabreicht werden. Die Verabreichung kann durch üblicherweise für das Inkontaktbringen eines Moleküls mit Blut oder Gewebezellen verwendete Verfahren erfolgen. Geeignete Verfahren zur Verabreichung solcher Nukleinsäuren sind verfügbar und dem Fachmann gut bekannt, und, obwohl mehr als eine Route zur Verabreichung einer bestimmten Zusammensetzung verwendet werden kann, kann eine bestimmte Route häufig eine sofortigere und effektivere Reaktion als eine andere Route hervorrufen.
Pharmazeutisch verträgliche Träger werden teilweise durch die bestimmte zu verabreichende Zusammensetzung als auch durch das für die Verabreichung der Zusammensetzung verwendete bestimmte Verfahren bestimmt. Demzufolge besteht eine Vielzahl von geeigneten Formulierungen für die unten beschriebenen erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen (siehe z.B. Remington's Pharmaceutical Sciences, 17. Ed., 1989).
Transportvehikel für ZPFs
Ein wichtiger Faktor bei der Verabreichung von Polypeptidverbindungen, wie den ZFPs, ist, sicherzustellen, dass das Polypeptid die Fähigkeit besitzt, die Plasmamembran einer Zelle oder die Membran eines intrazellulären Kompartiments, wie des Zellkerns, zu durchqueren. Zelluläre Membranen sind aus Lipid-Protein-Doppelschichten aufgebaut, die für kleine, nicht ionische, lipophile Verbindungen frei permeabel und von Natur aus für polare Verbindungen, Makromoleküle und therapeutische und diagnostische Agenzien impermeabel sind. Proteine und andere Verbindungen, wie Liposomen, wurden jedoch beschrieben, die die Fähigkeit besitzen, Polypeptide, wie die ZFPs, durch eine Zellmembran zu schleusen.
"Membrantranslokationspolypeptide" weisen beispielsweise amphiphile oder hydrophobe Aminosäureuntersequenzen auf, die die Fähigkeit besitzen, als Membrantranslokationsträger zu wirken. Gemäß einer Ausführungsform weisen die Homeodomänenproteine die Fähigkeit auf, durch die Zellmembran zu gelangen. Das kürzeste, zur Translokation fähige Peptid eines Homeodomänenproteins, Antennapedia, besteht aus der dritten Helix des Proteins von den Aminosäurepositionen 43 bis 58 (siehe z.B. Prochiantz, Current Opinion in Neurobiology 6: 629–634 (1996)). Eine andere Untersequenz, die h(hydrophobe)-Domäne des Signalpeptids, zeigt ähnliche Zellmembrantranslokationseigenschaften (siehe z.B. Lin et al., J. Biol. Chem. 270:14255-14258 (1995)).
Beispiele von Peptidsequenzen, die mit einem erfindungsgemäßen ZFP verbunden werden können, um die Aufnahme des ZFP in Zellen zu erleichtern, umfassen ein 11 Aminosäure langes Peptid des tat-Proteins von HIV, eine 20 Reste lange Peptidsequenz, die den Aminosäuren 84–103 des p16-Proteins entspricht (siehe Fahraeus et al., Current Biology 6: 84 (1996)), die dritte Helix der 60 Aminosäure langen Homeodomäne von Antennapedia (Derossi et al., J. Biol. Chem. 269: 10444 (1994)), die h- Region eines Signalpeptids, wie die Kaposi-Fibroblasten-wachstumsfaktor (K-FGF)-h-Region (Lin et al., supra), oder die VP22-Translokationsdomäne von HSV (Elliot & O'Hare, Cell 88: 223–233 (1997)), sind jedoch nicht darauf beschränkt. Andere geeignete chemische Einheiten, welche eine verstärkte zelluläre Aufnahme ermöglichen, können auch mit den ZFPs chemisch verbunden werden.
Toxinmoleküle zeigen auch die Fähigkeit, Polypeptide durch Zellmembranen zu transportieren. Häufig sind solche Moleküle aus wenigstens zwei Teilen (als "binäre Toxine" bezeichnet) aufgebaut: einer Translokations- oder Bindungsdomäne oder einem Translokations- oder Bindungspolypeptid und einer separaten Toxindomäne oder einem separaten Toxinpolypeptid. Üblicherweise bindet die Translokationsdomäne oder das Translokationspolypepitd an einen zellulären Rezeptor und dann wird das Toxin in die Zelle transportiert. Verschiedene Bakterientoxine, umfassend das Clostridium perfringens iota-Toxin, das Diphtherie-Toxin (DT), das Pseudomonas Exotoxin A (PE), das Perussistoxin (PT), das Bacillus anthracis Toxin und die Pertussisadenylatcyclase (CYA), wurden in Versuchen verwendet, Peptide als interne oder aminoterminale Fusionsbestandteile an das Zellcytosol zu liefern (Arora et al., J. Biol. Chem. 268: 3334–3341 (1993); Perelle et al., Infect. Immun. 61: 5147–5156 (1993); Stenmark et al., J. Cell Biol. 113: 1025-1032 (1991); Donnelly et al., PNAS 90: 3530–3534 (1993); Carbonetti et al., Abstr. Annu. Meet. Am. Soc. Microbiol. 95: 295 (1995); Sebo et al., Infect. Immun. 63: 3851–3857 (1995); Klimpel et al., PNAS U.S.A. 89: 10277-10281 (1992); und Novak of al., J. Biol. Chem. 267: 17186–17193 (1992)).
Solche Untersequenzen können verwendet werden, um ZFPs durch eine Zellmembran zu leiten. ZFPs können herkömmlich mit solchen Sequenzen fusioniert oder derivatisiert sein. Üblicherweise wird die Translokationssequenz als Teil eines Fusionsproteins bereitgestellt. Gegebenenfalls kann ein Linker verwendet werden, um das ZFP mit der Translokationssequenz zu verbinden. Jeder geeignete Linker kann verwendet werden, z.B. ein Peptidlinker.
Das ZFP kann auch in eine Tierzelle, vorzugsweise eine Säugetierzelle, über ein Liposom oder über Liposomenderivate, wie Immunoliposome, eingebracht werden. Die Bezeichnung "Liposom" bezeichnet aus einem oder mehreren konzentrisch angeordneten Lipiddoppelschichten, welche eine wässrige Phase einschließen, aufgebaute Vesikel. Die wässrige Phase enthält üblicherweise die der Zelle zuzuführende Verbindung, d.h. ein ZFP.
Das Liposom fusioniert mit der Plasmamembran, wodurch die Droge in das Cytosol freigesetzt wird. Alternativ dazu wird das Liposom phagocytosiert oder durch die Zelle in ein Transportvesikel aufgenommen. Liegt das Liposom einmal in dem Endosom oder Phagosom vor, baut es sich ab oder fusioniert mit der Membran des Transportvesikels und setzt seine Inhaltsstoffe frei.
Bei herkömmlichen Verfahren zur Drogenzufuhr durch Liposome wird das Liposom schließlich permeabel und lässt die eingeschlossene Verbindung (in diesem Fall ein ZFP) in dem Zielgewebe oder der Zielzelle frei. Für eine systemische und gewebespezifische Zufuhr kann dies beispielsweise auf eine passive Art und Weise erfolgen, wobei sich die Liposomdoppelschicht mit der Zeit durch die Einwirkung verschiedener Agenzien des Körpers abbaut. Alternativ dazu umfasst eine aktive Drogenfreisetzung die Verwendung eines Mittels, um eine Permeabilitätsveränderung in dem Liposomenvesikel zu erzeugen. Liposomenmembranen können so aufgebaut sein, dass sie destabilisiert werden, wenn die Umgebung in der Nähe der Liposomenmembran sauer wird (siehe z.B. PNAS 84: 7851 (1987); Biochemistry 28: 908 (1989)). Werden Liposomen beispielsweise durch eine Zielzelle endocytosiert, werden sie destabilisiert und setzen ihre Inhaltsstoffe frei. Die Destabilisierung wird als Fusogenese bezeichnet. Dioleoylphosphatidylethanolamin (DOPE) stellt einen Grundbestandteil vieler "fusogener" Systeme dar.
Solche Liposomen umfassen üblicherweise ein ZFP und eine Lipidkomponente, z.B. ein neutrales und/oder kationisches Lipid, und enthalten gegebenenfalls ein Rezeptorerkennungsmolekül, wie einen Antikörper, der an einen zuvor bestimmten Zelloberflächenrezeptor oder -liganden (z.B. ein Antigen) bindet. Eine Vielzahl von Verfahren zur Herstellung von Liposomen sind verfügbar und sind beispielsweise beschrieben in Szoka et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9: 467 (1980); den U.S. Pat. Nrn. 4,186,183, 4,217,344, 4,235,871, 4,261,975, 4,485,054, 4,501,728, 4,774,085, 4,837,028, 4,235,871, 4,261,975, 4,485,054, 4,501,728, 4,774,085, 4,837,028, 4,946,787; der PCT-Veröffentlichung Nr. WO 91117424; Deamer & Bangham, Biochim. Biophys. Acta 443: 629–634 (1976); Fraley et al., PNAS 76: 3348–3352 (1979); Hope et al., Biochim. Biophys. Acta 812: 55–65 (1985); Mayer et al., Biochim. Biophys. Acta 858: 161–168 (1986); Williams et al., PNAS 85: 242–246 (1988); Liposomes (Ostro (Ed.), 1983, Kapitel 1); Hope et al., Chem. Phys. Lip. 40: 89 (1986); Gregoriadis, Liposome Technology (1984); und Lasic, Liposomes: from Physics to Applications (1993). Geeignete Verfahren umfassen beispielsweise Ultraschall, Extrusion, Hochdruckhomogenisierung, Mikrofluidisation, Detergenziendialyse, calciuminduzierte Fusion von kleinen Liposomenvesikeln und Ether-Fusionsverfahren, von denen alle im Stand der Technik gut bekannt sind.
Gemäß einiger Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ist es wünschenswert, die Liposomen unter Verwendung von Zieleinheiten, die für einen bestimmten Zelltyp, ein bestimmtes Gewebe und dgl. spezifisch sind, zu richten. Das Richten von Liposomen unter Verwendung einer Vielzahl von Zieleinheiten (z.B. Liganden, Rezeptoren und monoklonale Antikörper) wurde zuvor bereits beschrieben (siehe z.B. die U.S. Patent Nrn. 4,957,773 und 4,603,044).
Beispiele von Zieleinheiten umfassen monoklonale Antikörper, die für mit dem Neoplasma assoziierte Antigene, wie das Prostatakrebs-spezifische Antigen und MAGE, spezifisch sind. Tumore können auch durch Nachweisen von Genprodukten, die aus der Aktivierung oder Überexpression von Oncogenen, wie ras oder c-erbB2, herrühren, diagnostiziert werden. Zudem exprimieren viele Tumore Antigene, die üblicherweise in fetalem Gewebe exprimiert werden, wie das Alphafetoprotein(AFP)-Antigen und das karzinoembryonale Antigen (CEA). Die Virusinfektionsstellen können durch verschiedene vitale Antigene, wie die Hepatitis B Core- und Oberflächen-Antigene (HBVc, HBVs), die Hepatitis C Antigene, die Epstein-Barr-Virus Antigene, die humanes Immunodefizienzvirus Typ-1 (HIV1) und Papillomavirus Antigene, diagnostiziert werden. Entzündungen können unter Verwendung von Molekülen nachgewiesen werden, die spezifisch durch Oberflächenmoleküle, welche an Entzündungsstellen exprimiert werden, wie Integrine (z.B. VCAM-1), Selectinrezeptoren (z.B. ELAM-1) und dgl., erkannt werden.
Standardverfahren zur Kupplung von Zielagenzien an Liposome können verwendet werden. Diese Verfahren umfassen im Allgemeinen den Einbau in Liposomen-Lipid-Kompartimente, z.B. Phosphatidylethanolamin, die für eine Anlagerung von Zielagenzien aktiviert werden können, oder in derivatisierte lipophile Verbindungen, wie lipidderivatisiertes Bleomycin. Auf Antikörper gerichtete Liposome können unter Verwendung von beispielsweise Liposomen erzeugt werden, die Protein A inkorporiert haben (siehe Renneisen et al., J. Biol. Chem. 265: 16337–16342 (1990); und Leonetti et al., PNAS 87: 2448–2451 (1990)).
Dosierung der ZPFs
Für die therapeutische Verwendung von ZFPs sollte die im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung an einen Patienten verabreichte Dosis ausreichend sein, um mit der Zeit eine vorteilhafte therapeutische Antwort in dem Patienten zu bewirken. Zudem können besondere Dosisregime für die Bestimmung von phänotypischen Veränderungen in einem experimentellen Ansatz, z.B. in funktionellen Genstudien und in Zell- oder Tiermodellen, geeignet sein. Die Dosis wird durch die Wirksamkeit und die K_d des bestimmten verwendeten ZFPs, das Kernvolumen der Zielzelle und den Zustand des Patienten als auch das Körpergewicht und den zu behandelnden Oberflächenbereich des Patienten bestimmt. Die Größe der Dosis wird auch durch das Vorliegen, die Art und das Ausmaß jeglicher nachteiliger Nebeneffekte, welche durch die Verabreichung einer bestimmten Verbindung oder eines Vektors an einen bestimmten Patienten begleitet sind, bestimmt.
Die maximale therapeutisch wirksame Dosis eines ZFP für eine ungefähr 99 %ige Bindung an die Zielstellen wird so berechnet, dass sie im Bereich von weniger als etwa 1,5×10⁵ bis 1,5×10⁶ Kopien des spezifischen ZFP-Moleküls pro Zelle liegt. Die Anzahl der ZFPs pro Zelle für diesen Bindungsgrad wird wie folgt unter Verwendung des Volumens eines HeLa-Zellkerns (etwa 1000 μm³ oder 10^–12 l; Cell Biology (Altmann & Katz, Eds. (1976)) bestimmt. Da der HeLa-Kern relativ groß ist, wird dieser Dosiswert unter Verwendung des Volumens des Zielzellkerns erneut berechnet. Diese Berechnung berücksichtigt auch nicht den Wettbewerb um eine ZFP-Bindung durch andere stellen. Diese Berechnung geht auch davon aus, dass im Wesentlichen die gesamten ZFPs in dem Kern vorliegen. Ein Wert von 100×K_d wird verwendet, um eine ungefähr 99 %ige Bindung für die Zielstelle zu berechnen und ein Wert von 10×K_d wird verwendet, um eine ungefähr 90% ige Bindung für die Zielstelle zu berechnen. Für dieses Beispiel ist K_d = 25 nM.
ZFP + Zielstelle ↔ Komplex
d.h. DNA + Protein ↔ DNA:Protein-Komplex
Wenn 50 % des ZFP gebunden ist, dann ist K_d = [Protein]
Wenn [Protein] = 25 nM und das Kernvolumen 10^–12 l ist
[Protein] = (25×10⁹ mol/l) (10^–12 l/Kern) (6×10²³ Moleküle/mol) = 15.000 Moleküle/Kern für eine 50 %ige Bindung.
Wenn 99 % des Ziels gebunden ist, dann ist 100×K_d = [Protein]
100×K_d = [Protein] = 2,5 μM
(2,5×10^–6 mol/l) (10^–12 l/Kern) (6×10²³ Moleküle/mol) = etwa 1.500.000 Moleküle/Kern für eine 99 %ige Bindung der Zielstelle.
Die geeignete Dosis eines ein ZFP codierenden Expressionsvektors kann auch berechnet werden, indem die durchschnittliche ZFP-Expressionsrate des Promotors und die durchschnittliche Rate des ZFP-Abbaus in der Zelle berücksichtigt wird. Vorzugsweise wird ein schwacher Promotor, wie Wild-Typ oder mutierter HSV TK, wie oben beschrieben, verwendet. Die Dosis des ZFP in Mikrogramm wird berechnet, indem das Molekulargewicht des bestimmten verwendeten ZFPs berücksichtigt wird.
Bei der Bestimmung der wirksamen Menge des zu verabreichenden ZFPs bei der Behandlung und Prophylaxe von Krankheiten berücksichtigt der Arzt die zirkulierende Plasmakonzentrationen des ZFP oder der ZFPcodierenden Nukleinsäure, die möglichen ZFP-Toxizitäten, das Fortschreiten der Krankheit und die Erzeugung von Anti-ZFP-Antikörpern. Die Verabreichung kann durch Einzel- oder Teildosen erfolgen.
Pharmazeutische Zusammensetzungen und Verabreichung
ZFPs und ZFP codierende Expressionsvektoren können dem Patienten direkt für eine Modulation der Genexpression oder für therapeutische oder prophylaktische Anwendungen, z.B. bei Krebs, Ischämie, diabetischer Retinopathie, makularen Veränderungen, rheumatoider Arthritis, Psoriasis, einer HIV-Infektion, Sichelzellanämie, Alzheimerkrankheit, muskulärer Dystrophie, neurodegenerativen Erkrankungen, Gefäßerkrankungen, zystischer Fibrose, Schlaganfall und dgl., verabreicht werden. Beispiele für Mikroorganismen, die durch eine ZFP-Gentherapie inhibiert werden können, umfassen pathogene Bakterien, z.B. Chlamydien, Rickettsia-Bakterien, Mycobakterien, Staphylococcen, Streptococcen, Pneumococcen, Meningococcen und Gonococcen, Klebsiella-, Proteus-, Serratia-, Pseudomonas-, Legionella-, Diphtheria-, Salmonella-, Bacilli-, Cholera-, Tetanus-, Botulismus-, Anthrax-, Pest-, Leptospirose- und Lyme-Krankheit-Bakterien; infektiöse Pilze, z.B. Aspergillus-, Candida-Spezies; Protozoen, wie Sporentierchen (z.B. Plasmodia), Wurzelfüßler (z.B. Entamoeba) und Geißeltierchen (Trypanosoma, Leishmania, Trichomonas, Giardia, etc.); virale Erkankungen, z.B. Hepatitis (A, B oder C), Herpes-Virus (z.B. VZV, HSV-1, HSV-6, HSV-II, CMV und EBV), HIV, Ebola, Adenovirus, Influenzavirus, Flaviviren, Echovirus, Rhinovirus, Coxsackivirus, Cornovirus, Respiratory-Syncytial-Virus, Mumpsvirus, Rotavirus, Masernvirus, Rubellavirus, Parvvovirus, Vacciniavirus, HTLV-Virus, Denguevirus, Papillomavirus, Poliovirus, Tollwutvirus und arboviraler Enzephalitisvirus, etc.
Die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge kann durch jede Route erfolgen, die üblicherweise zum Inkontaktbringen des ZFP mit dem zu behandelnden Gewebe verwendet wird. Die ZFPs werden auf jede geeignete Art und Weise verabreicht, vorzugsweise mit pharmazeutisch verträglichen Trägern. Geeignete Verfahren zur Verabreichung solcher Modulatoren sind verfügbar und dem Fachmann gut bekannt, und, obwohl mehr als eine Route zur Verabreichung einer bestimmten Zusammensetzung verwendet werden kann, ruft eine bestimmte Route häufig eine sofortigere und wirksamere Reaktion als eine andere Route hervor.
Die pharmazeutisch verträglichen Träger werden teilweise durch die zu verabreichende bestimmte Zusammensetzung als auch durch das für die Verabreichung der Zusammensetzung verwendete bestimmte Verfahren bestimmt. Demzufolge existiert eine Vielzahl von geeigneten Formulierungen von erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen (siehe z.B. Remington's Pharmaceutical Sciences, 17. Ed. 1985).
Die ZFPs können alleine oder in Kombination mit anderen geeigneten Komponenten in Form einer Aerosolformulierung (d.h. sie können "versprüht" werden) hergestellt werden, damit sie durch Inhalation verabreicht werden können. Aerosolformulierungen können in unter Druck stehende, verträgliche Treibmittel, wie Dichlordifluormethan, Propan, Stickstoff und dgl., eingebracht werden.
Für eine parenterale Verabreichung geeignete Formulierungen, wie beispielsweise durch intravenöse, intramuskuläre, intradermale und subkutane Routen, umfassen wässrige und nicht wässrige isotonische sterile Injektionslösungen, die Antioxidationsmittel, Puffer, bakteriostatische Mittel und gelöste Stoffe, welche die Formulierung isotonisch mit dem Blut des beabsichtigten Empfängers machen, enthalten können, und wässrige und nicht wässrige sterile Suspensionen, die Suspensionsmittel, Aufschlussmittel, Verdickungsmittel, Stabilisatoren und Konservierungsmittel enthalten können. Im Rahmen der Durchführung dieser Erfindung können die Zusammensetzungen beispielsweise durch intravenöse Infusion, oral, topikal, intraperitoneal, intravesikal und intrathekal verabreicht werden. Die Formulierungen der Verbindungen können in verschlossenen Einzeldosisbehältern oder Mehrtachdosisbehältern, wie Ampullen und Vials, angeboten werden. Injektionslösungen und -suspensionen können aus sterilen Pulvern, Granulaten und Tabletten der zuvor beschriebenen Art hergestellt werden.
Regulation der Genexpression in Pflanzen
ZFPs können zur Erzeugung von Pflanzen mit Merkmalen, wie eine verbesserte Resistenz gegenüber Krankheiten, eine Modifikation von strukturellen und Speicherpolysacchariden, von Geschmacksstoffen, von Proteinen und von Fettsäuren, des Reifwerdens von Früchten, der Farbe, der Ausbeute, des Nährwerts, eine verbesserte Lagerfähigkeit und dgl., verwendet werden. Insbesondere ist die Entwicklung von Getreidespezies für eine verbesserte Ölerzeugung, z.B. die Modifikation von in Ölsamen erzeugten Fettsäuren, von Interesse.
Samenöle bestehen vorwiegend aus Triacylglycerolen (TAGs), die Glycerinester von Fettsäuren sind. Die kommerzielle Herstellung dieser Pflanzenöle begründet sich vorwiegend auf sechs Hauptölgetreidesorten (Sojabohne, Ölpalme, Rapssamen, Sonnenblume, Baumwollsamen und Ernuss). Pflanzenöle werden vorwiegend (90 %) für den menschlichen Verbrauch als Margarine, Shortening, Salatöle und Frittieröle verwendet. Die verbleibenden 10 % werden für Nichtnahrungsmittelanwendungen, wie für Schmierstoffe, Ölprodukte, Biotreibstoffe, Detergenzien, und für andere industrielle Anwendungen verwendet.
Die gewünschten Eigenschaften der in jeder dieser Anwendungen verwendeten Öle variieren stark, insbesondere im Hinblick auf die Kettenlänge und die Anzahl der Doppelbindungen in den Fettsäuren, aus welchen die TAGs bestehen. Diese Eigenschaften werden durch die Pflanze beeinflusst, um die Membranfluidität und Temperatursensitivität zu kontrollieren. Die gleichen Eigenschaften können unter Verwendung von ZFPs kontrolliert werden, um Öle mit verbesserten Merkmalen für die Verwendung als Nahrungsmittel und für industrielle Anwendungen herzustellen.
Die primären Fettsäuren in den TAGs von Ölsamengetreide sind 16 bis 18 Kohlenstoffatome lang und enthalten 0 bis 3 Doppelbindungen. Palmitinsäure (16:0 [16 Kohlenstoffatome:0 Doppelbindungen]), Ölsäure (18:1), Linolsäure (18:2) und Linolensäure (18:3) liegen vorwiegend vor. Die Anzahl der Doppelbindungen oder der Sättigungsgrad bestimmen die Schmelztemperatur, die Reaktivität, die Kocheigenschaften und die Gesundheitsattribute des resultierenden Öls.
Das für die Umwandlung von Ölsäure (18:1) in Linolsäure (18:2) (das dann der Vorläufer für eine 18:3-Bildung ist) verantwortliche Enzym ist Δ12-Oleatdesaturase, die auch als Omega-6-desaturase bezeichnet wird. Eine Blockierung dieses Schrittes des Fettsäureentsättigungswegs sollte zu einer Akkumulation von Ölsäure auf Kosten von mehrfach ungesättigten Verbindungen führen.
Gemäß einer Ausführungsform werden ZFPs verwendet, um die Expression des FAD2-1-Gens in Sojabohne zu regulieren. Zwei Gene, die mikrosomale Δ6-Desaturasen codieren, wurden kürzlich aus Sojabohne kloniert und wurden als FAD2-1 und FAD2-2 bezeichnet (Heppard et al., Plant Physiol. 110: 311–319 (1996)). FAD2-1 (Delta12-desaturase) scheint einen Großteil der Ölsäureentsättigung in Sojabohnensamen zu kontrollieren. ZFPs können daher verwendet werden, um die Genexpression von FAD2-1 in Pflanzen zu modulieren. Insbesondere können ZFPs verwendet werden, um die Expression des FAD2-1-Gens in Sojabohne zu inhibieren, um die Akkumulation von Ölsäure (18:1) in den Ölsamen zu verstärken. Überdies können ZFPs verwendet werden, um die Expression jedes anderen Pflanzengens, wie Delta-9-desaturase, Delta-12-desaturase aus anderen Pflanzen, Delta-15-desaturase, Acetyl-CoA-Carboxylase, Acyl-ACP-Thioesterase, ADP-Glucosepyrophosphorylase, Stärkesynthetase, Cellulosesynthetase, Sucrosynthetase, mit dem Altern verbundene Gene, Schwermetallchelatoren, Fettsäurehydroperoxidlyase, Polygalacturonase, EPSP-Synthase, pflanzliche Virusgene, pflanzliche pathogene Pilzgene und pflanzliche pathogene Bakteriengene, zu modulieren.
Rekombinante DNA-Vektoren, die für eine Transformation von Pflanzenzellen geeignet sind, werden auch verwendet, um das erfindungsgemäße ZFP in die Pflanzenzelle zu transportieren. Transformationsverfahren für eine Vielzahl von höheren Pflanzenspezies sind gut bekannt und in der technischen und wissenschaftlichen Literatur beschrieben (siehe z.B. Weising et al., Ann. Rev. Genet. 22: 421–477 (1988)). Eine das gewünschte ZFP codierende DNA-Sequenz wird mit regulatorischen Transkriptions- und Translationsinitüerungssequenzen, welche die Transkription des ZFP in dem beabsichtigten Gewebe der transformierten Zelle lenken, kombiniert.
Beispielsweise kann ein Pflanzenpromotorfragment verwendet werden, das die Expression des ZFP in allen Geweben einer regenerierten Pflanze lenkt. Solche Promotoren werden hierin als "konstitutive" Promotoren bezeichnet und sind unter den meisten Umgebungsbedingungen und Entwicklungsstufen oder Zelldifferenzierungen aktiv. Beispiele von konstitutiven Promotoren umfassen die Blumenkohl-Mosaikvirus (CaMV)-35S-Transkriptionsinitiationsregion, den aus der T-DNA von Agrobacterium tumefaciens abgeleiteten 1'- oder 2'-Promotor und andere Transkriptionsinitiationsregionen aus verschiedenen im Stand der Technik bekannten Pflanzengenen.
Alternativ dazu kann der Pflanzenpromotor die Expression des ZFP in einem bestimmten Gewebe lenken oder kann anderenfalls unter einer genaueren Umwelt- oder Evolutionskontrolle stehen. Solche Promotoren werden hierin als "induzierbare" Promotoren bezeichnet. Beispiele von Umweltbedingungen, welche die Transkription durch einen induzierbaren Promotor beeinflussen können, umfassen anaerobe Bedingungen oder die Gegenwart von Licht.
Beispiele von Promotoren, die sich unter einer Umweltkontrolle befinden, umfassen Promotoren, welche die Transkription nur in bestimmten Geweben, wie Früchten, Samen oder Blüten, initiieren. Beispielsweise kann die Verwendung eines Polygalacturonasepromotors die Expression des ZFP in der Frucht lenken, während ein CHS-A(Chalconsynthase A aus Petunie)-Promotor die Expression des ZFP in der Blüte einer Pflanze lenken kann.
Der die ZFP-Sequenzen umfassende Vektor umfasst üblicherweise ein Markergen, das einer Pflanzenzelle einen selektierbaren Phänotyp verleiht. Beispielsweise kann der Marker für eine Biozidresistenz, insbesondere eine Antibiotikaresistenz, wie eine Resistenz gegenüber Kanamycin, G418, Bleomycin, Hygromycin, oder eine Herbizidresistenz, wie eine Resistenz gegenüber Chlorosluforon oder Basta, codieren.
Solche DNA-Konstrukte können in das Genom des gewünschten Pflanzenwirts durch eine Vielzahl von herkömmlichen Verfahren eingebracht werden. Beispielsweise kann das DNA-Konstrukt direkt in die genomische DNA der Pflanzenzelle unter Verwendung von Verfahren, wie Elektroporation und Mikroinjektion von Pflanzenzellprotoplasten, eingebracht werden, oder das DNA-Konstrukt kann direkt in das Pflanzengewebe unter Verwendung von ballistischen Verfahren, wie DNA-Partikelbombardement, eingebracht werden. Alternativ dazu kann das DNA-Konstrukt mit geeigneten T-DNA-flankierenden Regionen kombiniert werden und in einen herkömmlichen Agrobacterium tumefaciens Wirtsvektor eingebracht werden. Die Virulenzfunktionen des Agrobacterium tumefaciens Wirts werden die Insertion des Konstrukts und der benachbarten Marker in die Pflanzenzell-DNA lenken, wenn die Zelle durch das Bakterium infiziert wird.
Mikroinjektionstechniken sind im Stand der Technik bekannt und in der wissenschaftlichen und Patentliteratur gut beschrieben. Die Einbringung von DNA-Konstrukten unter Verwendung von Polyethylenglycolpräzipitation ist in Pazkowski et al., EMBO J. 3: 2717–2722 (1984) beschrieben. Elektroporationsverfahren sind in Fromm et al., PNAS 82: 5824 (1985) beschrieben. Ballistische Transformationsverfahren sind in Klein et al., Nature 327: 70–73 (1987) beschrieben.
Agrobacterium tumefaciens vermittelte Transformationsverfahren sind in der wissenschaftlichen Literatur gut beschrieben (siehe z.B. Horsch et al., Science 233: 496–498 (1984); und Fraley et al., PNAS 80: 4803 (1983)).
Transformierte Pflanzenzellen, die durch jedes der oben beschriebenen Transformationsverfahren erhalten wurden, können kultiviert werden, um eine vollständige Pflanze aufzubauen, welche den transformierten Genotyp und demzufolge den gewünschten ZFP-kontrollierten Phänotyp aufweist. Solche Aufbauverfahren basieren auf der Manipulation von bestimmten Phytohormonen in einem Gewebekulturwachstumsmedium und basieren üblicherweise auf einem Biozid- und/oder Herbizidmarker, der zusammen mit den ZFP-Nukleotidsequenzen eingebracht wurde. Der Aufbau von Pflanzen aus kultivierten Protoplasten ist in Evans et al., Protoplasts Isolation and Culture, Handbook of Plant Cell Culture, S. 124–176 (1983); und in Binding, Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, S. 21–73 (1985) beschrieben. Ein Aufbau kann auch mit Pflanzenknochensubstanzen, Explantaten, Pflanzenorganen oder Teilen davon erfolgen. Solche Aufbauverfahren sind allgemein in Klee et al., Ann. Rev. of Plant Phys. 38: 467–486 (1987) beschrieben.
Funktioneller Genassay
ZFPs finden auch in Assays Anwendung, um die phänotypischen Auswirkungen und die Funktion der Genexpression zu bestimmen. Die neuerlichen Fortschritte bei den analytischen Verfahren, gekoppelt mit den Bemühungen auf dem Gebiet der Massensequenzierung, erzeugten die Möglichkeit, vielmehr molekulare Ziele zu charakterisieren, als bislang verfügbar waren. Diese neue Information über Gene und deren Funktionen beschleunigt das biologische Grundverständnis und stellt viele neue Ziele für therapeutische Eingriffe bereit. In einigen Fällen konnte die analytische Ausrüstung nicht mit der Erzeugung von neuen Daten mithalten. Ein Beispiel wird durch die neuerlichen Fortschritte in der Messung der globalen differenziellen Genexpression bereitgestellt. Diese Verfahren, welche durch Genexpressionsmikroarrays, differenzielle cDNA-Klonierungsfrequenzen, subtraktive Hybridisierung und differenzielle Displayverfahren versinnbildlicht werden, können Gene, die in unterschiedlichen Geweben oder infolge einer Antwort auf spezifische Stimuli auf- oder abreguliert werden, sehr schnelle identifizieren. Zunehmend werden solche Verfahren verwendet, um biologische Prozesse, wie die Transformation, das Turmorwachstum, die Antwort auf Entzündungsprozesse, neurologische Störungen, etc., zu untersuchen. Man kann nun sehr leicht lange Listen von differenziell exprimierten Genen erzeugen, die mit einem gegebenen physiologischen Phänomen korrelieren, es ist jedoch immer noch schwierig, eine kausale Beziehung zwischen einem einzelnen differenziell exprimierten Gen und dem Phänomen zu zeigen. Bislang konnten einfache Verfahren zur Bestimmung der Funktion von differenziell exprimierten Genen nicht mit der Fähigkeit zur Überwachung der differenziellen Genexpression Schritt halten.
Unter Verwendung von herkömmlichen molekularen Ansätzen kann eine Überexpression eines Kandidatengens durch Klonierung einer vollständigen cDNA, Subklonierung derselben in einen Säugetierexpressionsvektor und Transfektion des rekombinanten Vektors in eine geeignete Wirtszelle erreicht werden. Dieser Ansatz ist unkompliziert, jedoch arbeitsintensiv, insbesondere wenn das anfängliche Kandidatengen durch eine einfache EST(Expressed-Sequence-Tag)-Sequenz verkörpert wird. Eine Unterexpression eines Kandidatengens durch "herkömmliche" Verfahren ist bislang problematischer. Antisense-Verfahren und Verfahren, welche auf Zielribosomen basieren, sind unzuverlässig und gelingen nur mit einem geringen Teil der ausgewählten Ziele. Ein Gen-Knockout durch homologe Rekombination funktioniert in rekombinogenen Stammzellen ziemlich gut, jedoch ist er in somatisch abgeleiteten Zelllinien relativ unwirksam. In jedem Fall sollten für eine effiziente Rekombination viele Klone aus syngener genomischer DNA (im Bereich von 10 kb) isoliert werden.
Die ZFP-Technologie kann verwendet werden, um differenzielle Genexpressionsstudien schnell zu analysieren. Konstruierte ZFPs können leicht verwendet werden, um jedes endogene Zielgen auf- oder abzuregulieren. Nur eine sehr geringe Sequenzinformation wird benötigt, um eine Gen-spezifische DNA-Bindungsdomäne zu erzeugen. Dies macht die ZFP-Technologie ideal für eine Analyse langer Listen von schlecht charakterisierten differenziell exprimierten Genen. Man kann einfach eine Zinkfinger-basierte DNA-Bindungsdomäne für jedes Kandidatengen konstruieren und Chimäre auf- und abregulierende artifizielle Transkriptionsfaktoren erzeugen und die Folgen der Auf- oder Abregulierung auf den untersuchten Phänotyp untersuchen, indem die Kandidatengene nacheinander in einem Modellsystem an- oder abgeschaltet werden.
Dieses spezifische Beispiel zur Verwendung von konstruierten ZFPs, um Gendaten eine funktionelle Information zu geben, ist nur beispielhaft. Jede experimentelle Situation, welche aus der spezifischen Auf- oder Abregulierung eines Gens oder von Genen einen Nutzen ziehen könnte, kann einen Nutzen aus der Zuverlässigkeit und der leichten Verwendung der konstruierten ZFPs ziehen.
Zudem können die ZFPs eine größere experimentelle Kontrolle vermitteln als durch herkömmlichere Verfahren erreicht werden kann. Dies beruht darauf, dass die Erzeugung und/oder Funktion eines konstruierten ZFP unter eine Kleinmolekülkontrolle gestellt werden kann. Beispiele für diesen Ansatz sind das Tet-On-System, das Ecdyson-regulierte System und ein System, welches einen chimären Faktor, umfassend einen mutierten Progesteronrezeptor, umfasst. Diese Systeme sind alle zur indirekten Vermittlung einer Kleinmolekülkontrolle auf ein endogenes Gen von Interesse oder jegliches Transgen fähig, indem die Funktion und/oder Expression eines ZFP-Regulators unter eine Kleinmolekülkontrolle gestellt wird.
Transgene Mäuse
Eine weitere Anwendung der ZFP-Technologie stellt die Manipulation der Genexpression in transgenen Tieren dar. Wie bei den Zelllinien ist die Überexpression eines endogenen Gens oder das Einbringen eines heterologen Gens in ein transgenes Tier, wie eine transgene Maus, ein relativ unkompliziertes Verfahren. Die ZFP-Technologie stellt in Bezug auf diese Verfahren eine Verbesserung dar, da man die Notwendigkeit der Erzeugung von vollständigen cDNA-Klonen des zu untersuchenden Gens umgeht.
Ähnlich wie bei den Zell-basierten Systemen ist die herkömmliche Abregulierung der Genexpression in transgenen Tieren von technischen Schwierigkeiten heimgesucht. Ein Gen-Knockout durch homologe Rekombination ist das momentan am häufigsten verwendete Verfahren. Dieses Verfahren erfordert einen relativ langen genomischen Klon des auszuknockenden Gens (ca. 10 kb). Üblicherweise wird ein selektierbarer Marker in ein Exon des Gens von Interesse eingeführt, um die Zerstörung des Gens zu bewirken, und ein zweiter gegenselektierbarer Marker wird außerhalb der Homologieregion bereitgestellt, um homologe gegenüber nicht homologen Rekombinanten zu selektieren. Dieses Konstrukt wird in embryonale Stammzellen transfiziert und Rekombinanten werden in Kultur ausgewählt. Rekombinante Stammzellen werden mit chimären Tieren, die Embryonen in einem sehr frühen Stadium erzeugen, kombiniert. Wenn sich der Chimärismus auf die Keimbahn erstreckt, können homozygote Knockout-Tiere durch Rückkreuzung isoliert werden. Wird das Verfahren erfolgreich angewandt, können Knockout-Tiere in etwa einem Jahr erzeugt werden. Unglücklicherweise verhindern zwei bekannte Probleme häufig eine erfolgreiche Anwendung der Knockout-Technologie: die Embryonensterblichkeit und die Entwicklungskompensation. Die Embryonensterblichkeit wird dadurch verursacht, dass das auszuknockende Gen eine wesentliche Rolle in der Entwicklung spielt. Dies zeigt sich durch das Fehlen eines Chimärismus, durch das Fehlen einer Keimbahntransmission oder die Unfähigkeit, homozygote Rückkreuzungen zu erzeugen. Während der Entwicklung zu einem erwachsenen Tier können Gene signifikant unterschiedliche physiologische Rollen erfüllen. Daher stellt eine Embryonensterblichkeit keinen Grund für das Verwerfen eines Zielgens als Gen, das für therapeutische Eingriffe bei Erwachsenen geeignet sein kann, dar. Die Embryonensterblichkeit bedeutet häufig lediglich, dass das Gen von Interesse nicht einfach in einem Mausmodell unter Verwendung von herkömmlichen Verfahren untersucht werden kann.
Die Entwicklungskompensation stellt die Substitution eines verwandten Genprodukts für das ausgeknockte Genprodukt dar. Gene liegen häufig in sehr großen Familien vor. Die Selektion oder Induktion während des Entwicklungsablaufs kann in einigen Fällen die Substitution eines Familienmitglieds durch ein anderes mutiertes Mitglied auslösen. Diese Art der funktionellen Substitution ist in erwachsenen Tieren nicht möglich. Ein typisches Ergebnis der Entwicklungskompensation stellt das Fehlen eines Phänotyps in einer Knockout-Maus dar, wenn die Ablation der Funktion des Gens in einem Erwachsenen andererseits eine physiologische Veränderung hervorrufen würde. Dies ist eine Art falsch negatives Ergebnis, das häufig die Interpretation von herkömmlichen Knockout-Maus-Modellen stört.
Ein paar neue Verfahren wurden entwickelt, um die Embryonensterblichkeit zu verhindern. Diese Verfahren werden durch einen Ansatz versinnbildlicht, der die cre-Rekombinase und die Iox-DNA-Erkennungselemente verwendet. Die Erkennungselemente werden in ein Gen von Interesse unter Verwendung von homologer Rekombination (wie oben beschrieben) eingebracht und die Expression der Rekombinase in erwachsenen Mäusen wird nach der Entwicklung induziert. Dies verursacht die Deletion eines Teils des Zielgens und verhindert entwicklungsbedingte Komplikationen. Das Verfahren ist arbeitsintensiv und zeigt einen Chimärismus aufgrund einer nicht einheitlichen Induktion der Rekombinase.
Die Verwendung von konstruierten ZFPs, um die Genexpression zu manipulieren, kann durch Verwendung der im vorigen Abschnitt beschriebenen, durch Kleinmoleküle regulierten Systeme auf erwachsene Tiere beschränkt werden. Die Expression und/oder Funktion eines Zinkfinger-basierten Repressors kann während der Entwicklung abgeschaltet und nach Belieben in dem erwachsenen Tier angeschaltet werden. Dieser Ansatz basiert lediglich auf der Hinzufügung des ZFP-exprimierenden Moduls. Eine homologe Rekombination wird nicht erfordert. Da die ZFP-Repressoren trans dominant sind, hat die Keimbahntransmission oder die Homozygosität keine Bedeutung. Diese Probleme wirken sich dramatisch auf die benötigte Zeit und Arbeit aus, um von einem schlecht charakterisierten Kandidatengen (einem cDNA- oder EST-Klon) zu einem Mausmodell zu gelangen. Dieses Können kann verwendet werden, um Zielgene für einen therapeutischen Eingriff schnell zu identifizieren und/oder zu validieren, um neue Modellsysteme zu erzeugen und die Analyse komplexer physiologischer Phänomene (Entwicklung, Hämatopoese, Transformation, Nervenfunktion etc.) zu ermöglichen. Chimäre Zielmäuse können gemäß Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual (1988); Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, Robertson, Ed., (1987); und Capecchi et al., Science 244: 1288 (1989) erhalten werden.
Beispiele
Die folgenden Beispiele dienen lediglich der Illustration der Erfindung und sollen diese nicht beschränken. Der Fachmann wird leicht erkennen, dass mit einer Vielzahl von nicht kritischen Parametern, die verändert oder modifiziert werden können, im Wesentlichen ähnliche Ergebnisse erzielt werden können.
Beispiel I: Entwicklung und Untersuchung von auf das humane VEGF-Gen gerichteten ZFPs
Dieses erste Beispiel zeigt die Konstruktion von ZFPs, die entwickelt wurden, um DNA-Sequenzen enthaltend den Promotor des Gens des humanen vaskulo-endothelialen Wachstumsfaktors (VEGF) zu erkennen. VEGF ist ein etwa 46 kDa großes Glykoprotein, das ein durch Hypoxie induziertes endothelzellspezifisches Mitogen darstellt. VEGF wurde mit der mit Krebs im Zusammenhang stehenden Angiogenese, verschiedenen Retinopathien und anderen schweren Erkrankungen in Verbindung gebracht. Die ausgewählte DNA-Zielstelle war eine Region um die Transkriptionsinitiationsstelle des Gens herum. Die ausgewählten zwei 9 Basenpaar (bp) langen Stellen befinden sich in der Sequenz agcGGGGAGGATcGCGGAGGCTtgg , wobei die Großbuchstaben die tatsächlichen 9 bp langen Ziele darstellen. Das Protein, welches gegen das stromaufwärts gelegene 9 bp lange Ziel gerichtet ist, wird VEGF1 genannt, und das Protein, das gegen das stromabwärts gelegene 9 bp lange Ziel gerichtet ist, wird VEGF3a genannt. Die Hauptinitiationsstelle der Transkription von VEGF befindet sich an dem T an dem 3'-Ende des ersten 9 bp langen Ziels, das in der obigen Sequenz durch Unterstreichung gekennzeichnet ist.
Der humane SP-1-Transkriptionsfaktor wurde als Vorläufermolekül zur Konstruktion der entwickelten ZFPs verwendet. SP-1 weist eine Drei-Finger-DNA-Bindungsdomäne auf, die mit dem gut untersuchten murinen Zif268 verwandt ist (Christy et al., PNAS 85: 7857–7861 (1988)). Ortsgerichtete Mutageneseexperimente unter Verwendung dieser Domäne haben gezeigt, dass die vorgeschlagenen "Erkennungsregeln", die bei Zif268 arbeiten, verwendet werden können, um SP-1 an andere DNA-Zielsequenzen anzupassen (Desjarlais & Berg, PNAS 91: 11099-11103 (1994)). Die zur Konstruktion der Zinkfingerklone verwendete SP-1-Sequenz entspricht den Aminosäuren 533 bis 624 in dem SP-1-Transkriptionsfaktor.
Die Auswahl von Aminosäuren in den Erkennungshelices der zwei entwickelten ZFPs, VEGF1 und VEGF3a, ist in Tabelle 1 zusammengefasst.
Tabelle 1 Die für die Erkennungshelices der VEGF erkennenden ZFPs ausgewählten Aminosäuren
Codierende Sequenzen wurden erzeugt, um diese Peptide unter Verwendung eines PCR-basierten Zusammenbauverfahrens, das sechs überlappende Oligonukleotide (1) verwendet, zu exprimieren. Drei Oligonukleotide (Oligos 1, 3 und 5 in 1) entsprechen den "universellen" Sequenzen, welche Teile der DNA-Bindungsdomäne zwischen den Erkennungshelices codieren. Diese Oligonukleotide verbleiben für jedes Zinkfingerkonstrukt konstant. Die anderen drei "spezifischen" Oligonukleotide (Oligos 2, 4 und 6 in 1) wurden so entwickelt, dass sie die Erkennungshelices codieren. Diese Oligonukleotide enthalten Substitutionen an den Positionen –1, 2, 3 und 6 der Erkennungshelices, um diese spezifisch für jede der unterschiedlichen DNA-Bindungsdomänen zu machen. Codon-Bias wurden ausgewählt, um eine Expression sowohl in Säugetierzellen als auch in E. coli zu ermöglichen.
Die PCR-Synthese wurde in zwei Schritten durchgeführt. Zunächst wurde das doppelsträngige DNA-Templat durch Kombination der sechs Oligonukleotide (der drei universellen und der drei spezifischen Oligonukleotide) erzeugt und eine Vier-Zyklen-PCR-Reaktion mit einem Annealingschritt bei einer niedrigen Temperatur (25 °C) wurde verwendet. Bei dieser Temperatur verbinden sich die sechs Oligonukleotide, um ein DNA-"Gerüst" zu bilden. Die Lücken in dem Gerüst wurden durch eine Kombination aus Taq- und Pfu-Polymerase aufgefüllt. In der zweiten Konstruktionsphase wurde das Zinkfingertemplat in dreißig Zyklen durch externe Primer, die entwickelt wurden, um Restriktionsstellen zur Klonierung in pUC19 einzufügen, amplifiziert. Die Genauigkeit der Klone der VEGF-ZFPs wurde durch DNA-Sequenzierung überprüft. Die DNA-Sequenzen der beiden Konstrukte sind unten aufgeführt.
VEGF1:
VEGF1-Translation:
VEGF3a:
VEGF3a-Translation:
Die Fähigkeit der entwickelten ZFPs, an ihre Zielstellen zu binden, wurde durch Expression und Aufreinigung des rekombinanten Proteins aus E. coli und Durchführen eines elektrophoretischen Mobilitätsshiftassays (EMSAs) überprüft. Die Expression der ZFPs wurde in zwei unterschiedlichen Systemen durchgeführt. Zum einen wurden die DNA-Bindungspeptide in E. coli exprimiert, indem sie in den kommerziell erhältlichen pET15b-Vektor (Novagen) eingebracht wurden. Dieser Vektor enthält eine T7-Promotorsequenz, um die Expression des rekombinanten Proteins zu steuern. Die Konstrukte wurden in E. coli BL21/DE3 (lacI^q)-Zellen eingebracht, welche eine IPTG-induzierbare T7-Polymerase enthalten. Die Kulturen wurden mit 50 μM ZnCl₂ ergänzt, bei 37 °C bis zu einer OD bei 600 nm von 0,5–0,6 kultiviert und die Proteinproduktion wurde durch IPTG für 2 Stunden induziert. Die ZFP-Expression erfolgte in sehr großem Ausmaß, etwa 30 % des zellulären Gesamtproteins (2). Diese Proteine wurden als "nicht fusionierte" ZFPs bezeichnet.
Teilweise aufgereinigte, nicht fusionierte ZFPs wurden wie folgt erzeugt (angepasst an Desjarlais & Berg, Proteins: Structure, Function and Genetics 12: 101–104 (1992)). Ein gefrorenes Zellpellet wurde in 1/50-tel Volumen 1 M NaCl, 25 mM Tris-HCl (pH 8,0), 100 μM ZnCl₂, 5 mM DTT resuspendiert. Die Proben wurden für 10 min gekocht und für 10 min bei ~3.000x g zentrifugiert. Zu diesem Zeitpunkt war das ZFP-Protein in dem Überstand zu > 50 % rein, was durch Anfärben von SDS-Polyacrylamid-Gelen durch Coomassie-Blau abgeschätzt wurde, und das Produkt wanderte bei seinem vorausgesagten Molekulargewicht von etwa 11 kDa (2).
Das zweite Verfahren zur Erzeugung von ZFPs bestand darin, diese als Fusionsprotein zusammen mit dem E. coli Maltose-Bindungsprotein (MBP) zu exprimieren. Eine N-terminale MBP-Fusion an die ZFPs wurde durch PCR-Amplifikation der pET15b-Klone und Insertion in den Vektor pMal-c2 unter der Kontrolle des Tac-Promotors (New England Biolabs) erzeugt. Die Fusion ermöglichte eine einfache Aufreinigung und einen einfachen Nachweis des rekombinanten Proteins. Es wurde zuvor bereits berichtet, dass Zinkfinger-DNA-Bindungsproteine von diesem Vektor in löslicher Form in hohen Konzentrationen in E. coli exprimiert werden können und ohne Rückfaltung effizient an das entsprechende DNA-Ziel binden können (Liu et al., PNAS 94: 5525–5530 (1997)). Die Erzeugung von MBP-Fusionsproteinen wurde, wie vom Hersteller (New England Biolabs) beschrieben, durchgeführt.
Die Transformanten wurden in LB-Medium, das mit Glucose und Ampicillin ergänzt war, herangezogen und es wurde mit IPTG für 3 Stunden bei 37 °C induziert. Die Zellen wurden durch French-Press aufgeschlossen, dann einem Agarose-basierten Amyloseharz ausgesetzt, der spezifisch an die MBP-Einheit band und dadurch als Affinitätsharz für dieses Protein diente. Das MBP-Fusionsprotein wurde mit 10 mM Maltose (2C) eluiert, wodurch das ZFP mit einer Reinheit von >50 % freigesetzt wurde. In einigen Fällen wurden die Proteine weiter unter Verwendung einer Centricon 30-Filtereinheit (Amicon) aufkonzentriert.
Teilweise aufgereinigte, unfusionierte und MBP-fusionierte ZFPs wurden durch EMSA untersucht, um die Bindung an ihre Ziel-DNA-Sequenzen zu bewerten. Die Proteinkonzentrationen in den Präparationen wurden durch einen Bradford-Assay (BioRad) bestimmt. Da SDS-Polyacrylamid-Gele für jedes Aufreinigungsverfahren eine Homogenität von >50 % zeigten, wurde keine Korrektur der ZFP-Reinheit in die Berechnungen miteinbezogen. Zudem konnten erhebliche Mengen an inaktivem Protein in den Präparationen vorliegen. Daher stellen die durch EMSA erzeugten, unten aufgeführten Daten eine Unterbewertung der wahren Affinität der Proteine für deren Ziele dar(d.h. Überbewertung der K_d's). Zwei getrennte Präparationen wurden für jedes Protein durchgeführt, um auf Unterschiede in der ZFP-Aktivität hin zu untersuchen.
Die VEGF-DNA-Zielstellen für die EMSA-Experimente wurden durch Einbringung der 9 bp langen Bindungsstellen in 29 bp lange doppelsträngige Oligonukleotide erzeugt. Die Sequenzen des Erkennungsstrangs ("oberer" Strang) und des komplementären Strangs ("unterer" Strang), die in den Assays verwendet wurden, sind wie folgt:
Die VEGF-DNA-Zielstellen sind unterstrichen. Die 3 bp auf jeder Seite der 9 bp langen Bindungsstellen wurden auch von der tatsächlichen VEGF-DNA-Sequenz abgeleitet. Der obere Strang jeder Zielstelle wurde mit Polynukleotidkinase und γ-³²P-dATP markiert. Der obere und der untere Strang wurden in einer Reaktion, die jedes Oligonukleotid bei 0,5 μM, 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA und 50 mM NaCl enthielt, annealed. Der Mix wurde auf 95 °C für 55 min erhitzt und langsam auf 30 °C über einen Zeitraum von 60 min abgekühlt. Die Duplexbildung wurde durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese bestätigt. Freie Marker und ssDNA, die in den Zielpräprationen verblieben, schienen die Bindungsreaktionen nicht zu stören.
Die Bindung der ZFPs an die Zieloligonukleotide wurde durch Titration des Proteins gegen eine feste Menge des Duplexsubstrats bestätigt. Zwanzig Mikroliter Bindungsreaktionen enthielten 10 fmol (0,5 nM) 5'-³²P-markierte doppelsträngige Ziel-DNA, 35 mM Tris-HCl (pH 7,8), 100 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 1 mM Dithiothreitol, 10 % Glycerin, 20 μg/ml Poly-dl-dC (optional), 200 μg/ml Rinderserumalbumin und 25 μM ZnCl₂. Ein Fünftel Volumen Protein aus einer Verdünnungsserie, die in 200 mM NaCl, 20 mM Tris (pH 7,5), 1 mM DTT hergestellt wurde, wurde zugegeben. Die Bindung erfolgte für 30 min bei Raumtemperatur. Eine Polyacrylamid-Gelelektrophorese wurde bei 4 °C unter Verwendung von vorgefertigten 10 % oder 10–20 % Tris-HCl-Gelen (BioRad) und Tris-Glycin-Standardlaufpuffer, der 0,1 mM ZnCl₂ enthielt, durchgeführt.
Die Ergebnisse eines typischen EMSA unter Verwendung eines MBP-fusionierten ZFP sind in 3 gezeigt. In diesem Fall wurde eine 3-fache Verdünnungsserie des MBP-VEGF1-Proteins verwendet. Das bewegte Produkt wurde mit einem Phosphorimager (Molecular Dynamics) quantifiziert und das relative Signal (Prozent des Plateauwerts) wurde gegen den logo der Proteinkonzentration in nM aufgetragen. Die apparente K_d wurde durch Bestimmung der Proteinkonzentration, welche eine halbe maximale Bindung von MBP-VEGF1 an dessen Zielstelle ergab und in diesem Experiment etwa 2 nm betrug, bestimmt.
Die bestimmten Bindungsaffinitäten für die VEGF-Proteine können wie folgt zusammengefasst werden. VEGF1 zeigte die stärkere DNA-Bindungsaffinität. In mehrfachen EMSA-Analysen wurde die durchschnittliche apparente K_d auf etwa 10 nM bestimmt, wenn VEGF1 an die VEGF-Stelle 1 band. VEGF3a band seine Zielstelle sehr gut, jedoch mit einer höheren apparenten K_d als VEGF1. Die durchschnittliche K_d für VEGF3a betrug etwa 200 nM. In beiden Fällen banden die MBP-fusionierten und unfusionierten Versionen des Proteins mit ähnlichen Affinitäten. Die K_d's wurden auch unter diesen Bedingungen für das MBP-fusionierte Wild-Typ Zif268-ZFP und das MBP-fusionierte Wild-Typ SP-1-ZFP bestimmt, die Ka's von 60 bzw. 65 nM ergaben. Diese Ergebnisse sind ähnlich zu den in der Literatur für Zif268 berichteten Bindungskonstanten von etwa 2–30 nM (siehe z.B. Jamieson et al., Biochemistry 33: 5689–5695 (1994)). Die Ka's für die synthetischen VEGF-ZFPs entsprechen daher sehr vorteilhaft denjenigen, die für die natürlich vorkommenden DNA-Bindungsproteine bestimmt wurden.
Kurz gesagt, zeigt dieses Beispiel die Erzeugung von zwei neuen DNA-Bindungsproteinen, die auf spezifische Ziele nahe der Transkriptionsinitiationsstelle des VEGF-Gens gerichtet sind. Diese Proteine binden mit ähnlichen Affinitäten wie die natürlich vorkommenden Transkriptionsfaktoren an ihre Ziele.
Beispiel II: Verbindung von ZFPs, um ein 18-bp langes Ziel in dem humanen VEGF-Gen zu binden
Ein wichtiger Gesichtspunkt bei der Entwicklung der ZFPs ist die Länge des DNA-Ziels. Für zufällige DNA geht man davon aus, dass eine Sequenz aus n Nukleotiden einmal alle 0,5×4ⁿ Basenpaare auftritt. Demzufolge würden DNA-Bindungsdomänen, die entwickelt wurden, um lediglich 9 bp DNA zu erkennen, alle 130.000 bp Bindungsstellen vorfinden und könnten daher an mehrfachen Stellen in einem komplexen Genom binden (im Bereich von 20.000 Stellen bei dem humanen Genom). Putative 9 bp lange Repressor-Bindungssequenzen wurden in der 5'-UTR, wo sie direkt die Transkription stören können, für VEGF ausgewählt. Für den Fall, dass Zinkfingerdomänen, welche 9 bp lange Stellen erkennen, die notwendige Affintät oder Spezifität fehlt, wenn diese innerhalb von Zellen exprimiert werden, wurde eine längere Domäne konstruiert, die 18 bp erkennt, indem einzelne Drei-Finger-Domänen durch eine Linkersequenz verbunden wurden, wodurch ein Sechs-Finger-Protein erzeugt wurde. So sollte sichergestellt werden, dass der Repressor die entsprechenden Sequenzen spezifisch erkennt, insbesondere unter Bedingungen, bei denen nur geringe Mengen des Repressors erzeugt werden. Die 9 bp langen Zielstellen in VEGF wurden so ausgewählt, dass sie benachbart zueinander vorlagen, sodass die Zinkfinger verbunden werden konnten, um eine 18 bp lange Sequenz zu erkennen. Der Linker DGGGS wurde ausgewählt, da er eine Bindung der ZFPs an zwei 9 bp lange Stellen, welche durch ein Nukleotid getrennt waren, wie es im Fall der VEGF1- und VEGF3a-Stellen war (siehe auch Liu et al., PNAS 5525-5530 (1997)), ermöglichte.
Die Sechs-Finger-VEGF3a/1-Protein codierende Sequenz wurde wie folgt erzeugt. VEGF3a wurde unter Verwendung der Primer SPE7 (5'-GAGCAGAATTCGGCAAGAAGAAGCAGCAC) und SPEamp12 (5'-GTGGTCTAGACAGCTCGTCACTTCGC) durch PCR amplifiziert, wodurch EcoRI- und Xbal-Restriktionsstellen an den Enden (Restriktionsstellen unterstrichen) erzeugt wurden. VEGF1 wurde unter Verwendung der Primer SPEamp13 (5'-GGAGCCAAGGCTGTGGTAAAGTTTACGG) und SPEamp11 (5'-GGAGAAGCTTGGATCCTCATTATCCC), wodurch Styl- und HindIII-Restriktionsstellen an den Enden (Restriktionsstellen unterstrichen) erzeugt wurden, durch PCR amplifiziert. Unter Verwendung von synthetischen Oligonukleotiden wurde die folgende Sequenz zwischen die Xbal- und Styl-Stellen ligiert, wobei Xbal und Styl unterstrichen sind: TCT AGA CAC ATC AAA ACC CAC CAG AAC AAG AAA GAC GGC GGT GGC AGC GGC AAA AAG AAA CAG CAC ATA TGT CAC ATC CAA GG. Dies brachte die Sequenz DGGGS zwischen die zwei SP-1-Domänen ein. Das Ligationsprodukt wurde mit den Primern SPE7 und SPEamp11 reamplifiziert und in pUC19 unter Verwendung der EcoRI- und HindIII-Stellen einkloniert. Die verbundenen ZFP-Sequenzen wurden dann mit den Primern

(1) GB19: GCCATGCCGGTACCCATACCTGGCAAGAAGAAGCAGCAC
(2) GB10: CAGATCGGATCCACCCTTCTTATTCTGGTGGGT

Die Nukleotidsequenz des entwickelten Sechs-Finger-ZFP-VEGF3a/1 von KpnI bis BamHI ist wie folgt:
Die VEGF3a/1-Aminosäuretranslation (unter Verwendung des Einbuchstabencodes) ist wie folgt:
Das 18-bp-Bindungsprotein VEGF3a/1 wurde in E. coli als MBP-Fusionsprotein exprimiert, durch Affinitätschromatographie aufgereinigt und in EMSA-Experimenten, wie in Beispiel I beschrieben, untersucht. Die Zieloligonukleotide wurden wie beschrieben hergestellt und umfassten die folgenden komplementären Sequenzen:

(1) JVF9: AGCGAGCGGGGAGGATCGCGGAGGCTTGGGGCAGCCGGGTAG und
(2) JVF10: CGCTCTACCCGGCTGCCCCAAGCCTCCGCGATCCTCCCCGCT.

Für die EMSA-Studien enthielten die 20 μl Bindungsreaktionen 10 fmol (0,5 nM) 5'-³²P-markierte doppelsträngige Ziel-DNA, 35 mM Tris-HCl (pH 7,8), 100 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 5 mM Dithiothreitol, 10 % Glycerin, 20 μg/ml Poly-dI-dC, 200 μg/ml Rinderserumablumin und 25 μM ZnCl₂. Ein Fünftel Volumen Protein aus einer 3-fachen Verdünnungsserie wurde zugegeben. Eine Bindung wurde für 60 min entweder bei Raumtemperatur oder bei 37 ° C ermöglicht. Eine Polyacrylamid-Gelelektrophorese wurde bei Raumtemperatur oder 37 °C unter Verwendung von vorgefertigten 10 % oder 10–20 % Tris-HCl-Gelen (BioRad) und Tris-Glycin-Standardlaufpuffer durchgeführt. Der Raumtemperaturassay ergab eine apparente K_d für dieses VEGF3a/1-Protein von etwa 1,5 nM. Demzufolge band das 18-bp-Bindungs-ZFP mit hoher Affinität an seine Zielstelle. In einem parallelen Experiment wurde das VEGF1-Protein unter Verwendung der in Beispiel I beschriebenen Oligonukleotide auf sein Ziel hin untersucht, wodurch eine apparente K_d von etwa 2,5 nM erhalten wurde. Wurde die Bindung und die Elektrophorese bei 37 °C durchgeführt, so betrug die apparente K_d von VEGF3a/1 etwa 9 nM, wenn mit dem 18 bp langen Ziel untersucht wurde, verglichen mit einer K_d von 40 nM für VEGF1, das auf sein Ziel hin untersucht wurde. Dies deutet darauf hin, dass der Unterschied in den Bindungsaffinitäten bei den höheren Temperaturen hervorgehoben wird.
Die apparente K_d ist ein geeignetes Maß für die Affinität eines Proteins für sein DNA-Ziel. Für eine DNA-Bindungsstelle wird dessen Besetzung in vitro oder in vivo jedoch größtenteils durch die Off-Rate des DNA-Bindungsproteins bestimmt. Dieser Parameter kann, wie in 4 gezeigt, durch Kompetitionsexperimente bestimmt werden. Die Bedingungen für den EMSA waren wie oben beschrieben. Die Bindung und die Elektrophorese wurde bei 37 °C durchgeführt. Diese Daten deuten darauf hin, dass die Halbwertszeit des Protein-DNA-Komplexes für VEGF3a/1 verglichen mit VEGF1 um mehr als zehn Mal länger ist. Demzufolge ist die Besetzung unter diesen in vitro-Bedingungen für die Zielstelle viel höher für das 18-bp-Bindungsprotein als für das 9-bp-Bindungsprotein.
Beispiel III: Fusion von entwickelten ZFP-Sequenzen an funktionale Domänen in Säugetierexpressionsvektoren
Dieses Beispiel beschreibt die Entwicklung von Expressionsvektoren zur Herstellung von ZFPs in Säugetierzellen, die Translokation derselben in den Zellkern und die Bereitstellung von funktionellen Domänen, welche sich aufgrund des ZFP an der Ziel-DNA konzentrieren. Die verwendeten funktionellen Domänen sind die Kruppel-Associated-Box(KRAB)-Repressionsdomäne und die Herpes-Simplex-Virus(HSVI-1)-VP16-Aktivierungsdomäne.
Einige DNA-Bindungsproteine enthalten separable Domänen, welche als Transkriptionsrepressoren fungieren. Etwa 20 % der ZFPs enthalten eine Nicht-DNA-Bindungsdomäne von etwa 90 Aminosäuren, welche als Transkriptionsrepressor fungiert (Thiesen, The New Biologist 2: 363–374 (1990); Margolin et al., PNAS 91: 4509–4513 (1994); Pengue et al., (1994), supra; Witzgall et al., (1994), supra). Diese als KRAB-Domäne bezeichnete Domäne ist modular und kann mit anderen DNA-Bindungsproteinen verbunden werden, um die Expression von Genen, welche die Ziel-DNA-Sequenz enthalten, zu blockieren (Margolin et al., (1994); Pengue et al., (1994); Witzgall et al., (1994), supra). Die KRAB-Domäne hat selbst keinen Effekt. Sie muss mit einer DNA-Sequenz über ein DNA-Bindungsprotein verbunden sein, um als Repressor zu wirken. Die KRAB-Domäne ist zur Blockierung der Transkriptionsinitiation fähig und kann bei einer Entfernung von bis zu wenigstens 3 kb von der Transkriptionsinitiationsstartstelle fungieren. Die KRAB-Domäne des humanen KOX-1-Proteins (Thiesen, The New Biologist 2: 363–37 (1990)) wurde für die hier beschriebenen Studien verwendet. Diese 64 Aminosäure lange Domäne kann mit ZFPs fusioniert werden und ermöglicht eine Repression in Zellkulturen (Liu et al., supra).
Das VP16-Protein von HSV-1 wurde ausführlich untersucht und es hat sich gezeigt, dass die C-terminalen 78 Aminosäuren als eine Transaktivierungsdomäne wirken können, wenn diese mit einer DNA-Bindungsdomäne fusioniert vorliegen (Hagmann of al., J. Virology 71: 5952–5962 (1997)). Es wurde auch gezeigt, dass VP16 bei einer Entfernung und in einer orientierungsunabhängigen Art und Weise wirkt. Für diese Studien wurden die Aminosäuren 413 bis 490 der VP16-Proteinsequenz verwendet. DNA, welche diese Domäne codierte, wurde mithilfe des Plasmids pMSVP16ΔC+119 unter Verwendung der Primer mit den folgenden Sequenzen durch PRC amplifiziert:

(1) JVF24: CGCGGATCCGCCCCCCCGACCGATG und
(2) JVF25: CCGCAAGCTTACTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCGCTGCCCCCAC CGTACTCGTCAATTCC.

Der stromabwärts gelegene Primer JVF25 wurde so entwickelt, dass er eine stromabwärts liegende FLAG-Epitop codierende Sequenz enthält.
Drei Expressionsvektoren wurden für diese Studien konstruiert. Die allgemeine Konstruktion der Expressionsvektoren ist in 5 zusammengefasst. Die Vektoren sind von pcDNA3.1(+) (Invitrogen) abgeleitet und setzen die ZFP-Konstrukte unter die Kontrolle des Cytomegalovirus(CMV)-Promotors. Der Vektor trägt Ampicillin- und Neomycinmarker zur Selektion in Bakterien- bzw. Säugetierzellkulturen. Eine Kozak-Sequenz für eine genaue Translationsinitiation (Kozak, J. Biol. Chem. 266: 19867–19870 (1991)) wurde eingefügt. Um eine Lokalisierung der Produkte im Zellkern zu erzielen, wurde die Kernlokalisationssequenz (NLS) von dem SV40 großen T-Antigen (Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val) (Kalderon et al., Cell 39: 499–509 (1984)) eingefügt. Die Insertionsstelle für die ZFP-codierende Sequenz ist von der Sequenz der funktionellen Domäne gefolgt. Die drei Versionen des Vektors unterscheiden sich in der funktionellen Domäne. "pcDNA-NKF" trägt die KRAB-Repressionsdomänensequenz, "pcDNA-NVF" trägt die VP16- Aktivierungsdomäne und "NF-Kontrolle" trägt keine funktionale Domäne. Nach der funktionellen Domäne befindet sich die Flag-Epitop-Sequenz (Kodak), um einen spezifischen Nachweis der ZFPs zu ermöglichen.
Die Vektoren wurden wie folgt konstruiert. Das Plasmid pcDNA-ΔHB wurde durch Verdau des Plasmids pcDNA3.1(+) (Invitrogen) mit HindIII und BamHI erzeugt, wobei die cohäsiven Enden mit Klenow aufgefüllt wurden und eine Religation erfolgte. Dies zerstörte die HindIII-, KpnI- und BamHI-Stellen in dem Polylinker. Der Vektor pcDNA3.1(+) ist in dem Invitrogen-Katalog beschrieben. Das Plasmid pcDNA-NKF wurde durch Insertion eines Fragments in die EcoRI/XhoI-Stelle von pcDNA-ΔHB erzeugt, das die folgenden Segmente enthielt: 1) ein Segment von EcoRI bis KpnI, enthaltend die Kozak-Sequenz umfassend das Initiationscodon und die SV40-NLS-Sequenz, und damit zusammengenommen die DNA-Sequenz GAATTCGCTAGCGCCACCATGGCCCCCAAGAAGAAGAGGAAGGTGGG AATCCATGGGGTAC,
wobei die EcoRI- und KpnI-Stellen unterstrichen sind; und 2) ein Segment von KpnI bis XhoI, enthaltend eine BamHI-Stelle, die KRAB-A-Box von KOX1 (Aminosäure Nrn. 11–53 in Thiesem, 1990, supra), das FLAG-Epitop (aus dem Kodak/IBI-Katalog) und eine HindIII-Stelle, und damit zusammengenommen die Sequenz
wobei die KpnI-, BamHI- und XhoI-Stellen unterstrichen sind.
Das VEGF3a/1-KRAB-Effektorplasmid wurde durch Insertion einer KpnI-BamHI-Kassette, welche die ZFP-Sequenzen enthielt, in den mit KpnI und BamHI verdauten pcDNA-NKF erzeugt. Die VEGF1-KRAB- und VEGF3a-KRAB-Effektorplasmide wurden auf eine ähnliche Art und Weise erzeugt, außer dass die ZFP-Sequenzen zunächst in die NLS-KRAB-FLAG-Sequenzen des Plasmids pLitmus 28 (New England Biolabs) einkloniert wurden und anschließend in die BamHI-XhoI-Stellen von pcDNA3.1(+) als BglII-XhoI-Kassette überführt wurden, wobei die BglII-Stelle unmittelbar stromaufwärts der EcoRI-Stelle vorlag (siehe Beispiel IV zur Expression dieser Vektoren).
Die in Beispiel V verwendeten Effektorplasmide wurden wie folgt konstruiert. Das Plasmid pcDNA-NVF wurde durch PCR-Amplifikation der VP16-Transaktivierungsdomäne, wie oben beschrieben, und Insertion des Produkts in die BamHI/HindIII-Stellen von pcDNA-NKF, wodurch die KRAB-Sequenz ersetzt wurde, konstruiert. Die Sequenz des insertierten Fragments von BamHI bis HindIII war wie folgt:
Die VEGF1-VP16- und VEGF3a/1-VP16-Vektoren wurden durch Insertion einer KpnI-BamHI-Kassette, die die ZFP-Sequenzen enthielt, in den mit KpnI und BamHI verdauten pcDNA-NVF erzeugt.
Die in Beispiel V1 verwendeten Effektorplasmide wurden wie folgt konstruiert. Das Plasmid NF-Kontrolle wurde durch Insertion der Sequenz
in die EcoRI-XhoI-Stellen von pcDNA-NKF, wodurch die NLS-KRAB-FLAG-Sequenzen nur durch NLS-FLAG ersetzt wurden, erzeugt.
VEGF1-NF und VEGF3a/1-NF wurden durch Insertion einer KpnI-BamHI-Kassette, welche die ZFP-Sequenzen enthielt, in den mit KpnI und BamHI verdauten NF-Kontrolle erzeugt. CCR5-KRAB wurde auf die gleiche Art und Weise wie die VEGF-KRAB-Vektoren konstruiert, außer dass die ZFP-Sequenzen so entwickelt wurden, dass sie für eine DNA-Zielstelle, die mit den VEGF-Zielen nicht verwandt ist, spezifisch sind.
Schließlich wurden Kontrollversionen sowohl der KRAB- als auch der VP16-Expressionsplasmide konstruiert. Das Plasmid NKF-Kontrolle wurde so entwickelt, dass es NLS-KRAB-FLAG ohne die Zinkfingerproteinsequenzen exprimierte. Das Plasmid NVF-Kontrolle wurde so entwickelt, dass es NLS-VP16-FLAG ohne die ZFP-Sequenzen exprimierte. Diese Plasmide wurden durch Verdau von pcDNA-NKF bzw. pcDNA-NVF mit BamHI und Auffüllen der Enden mit Klenow und Religieren, um die stromabwärts gelegenen Domänen in den genauen Leserahmen zu bringen, hergestellt. Diese Plasmide dienen als strenge Kontrollen für Zellkulturstudien.
Die Säugetierexpression und die Kernlokalisation der konstruierten VEGF-ZFPs wurde durch Immunofluoreszenzstudien gezeigt. 293(humane embryonale Nieren)-Zellen wurden mit dem Expressionsplasmid, das für das chimäre Protein NLS-VEGF1-KRAB-FLAG codierte, transfiziert. Lipofectamin wurde, wie unten beschrieben, verwendet. Nach 24–48 Stunden wurden die Zellen fixiert und einem primären Antikörper gegen das FLAG-Epitop ausgesetzt. Ein sekundärer Antikörper, der mit Texas-Rot markiert war, wurde verwendet und die Zellen wurden mit DAPI gegengefärbt. Die Texas-Rot-Färbung wurde durchweg zusammen mit der DAPI-Färbung beobachtet, was darauf hindeutet, dass das durch dieses Plasmid exprimierte ZFP im Zellkern vorlag.
Beispiel IV: Repression von VEGF-Reportern in Cotransfektionsexperimenten
Dieses Beispiel zeigt die Verwendung von transienten Cotransfektionsstudien, um die Aktivität des ZFP-Repressorproteins in Zellen zu bestimmen. Solche Experimente beinhalten die Cotransfektion der ZFP-KRAB-Expressions("Eftektor")-Plasmide mit Reporterplasmiden, welche die VEGF-Zielstellen tragen. Die Wirksamkeit wird durch die Repression der Reportergenexpression in Gegenwart des Effektorplasmids relativ zu leeren Vektorenkontrollen bestimmt.
Das Reporterplasmidsystem basierte auf den pGL3-Glühwürmchenluciferasevektoren (Promega). Vier Kopien der VEGF-Zielstellen wurden stromaufwärts des SV40-Promotors, der das Glühwürmchenluciferasegen steuert, in das Plasmid pGL3-Kontrolle insertiert, um pVFR1-4× zu erzeugen. Dieses Plasmid enthielt den SV40-Enhancer und exprimierte die Glühwürmchenluciferase in vielen Zelltypen mit hohen Expressionsgraden. Die Insertionen wurden durch Zusammenligieren von Tandemkopien der zwei komplementären 42 bp langen Oligonukleotide, JVF9 und JVF10, die in Beispiel II beschrieben sind, durchgeführt. Adaptorsequenzen wurden aufligiert und der Zusammenschluss wurde in die MluI/BglII-Stellen von pGL3-Kontrolle insertiert. Dies führte zur Insertion der folgenden Sequenz zwischen diesen Stellen:
Die gezeigten ersten sechs und letzten sechs Nukleotide entsprechen den MluI- und BglII-Stellen. Die Kleinbuchstaben zeigen die HindIII-Stellen an. Die Bindungsstellen für VEGF1 und VEGF3a sind unterstrichen.
Die Effektorplasmidkonstruktion ist oben beschrieben. Die VEGF1-KRAB-, VEGF3a-KRAB- und VEGF3a/1-KRAB-Expressionsvektoren wurden so konstruiert, dass sie ein Fusionskontrukt aus der SV40-Kernlokalisationssequenz, dem VEGF-ZVP, der KRAB-Repressionsdomäne und einem FLAG-Epitopmarker, die sich alle unter der Kontrolle des CMV-Promotors befinden, erzeugen. Der leere pcDNA3.1-Expressionsvektor wurde als Kontrolle (pcDNA) verwendet.
Alle Vektoren wurden unter Verwendung von Qiagen DNA-Aufreinigungskits präpariert. 6 zeigt eine typische Reihe von Transfektionen unter Verwendung von COS-1 (African-Green-Monkey-Kidney)-Zellen. Etwa 40.000 Zellen wurden in jedes Well einer 24-Well-Platte gegeben und über Nacht in Dulbecco's Modified Eagle Medium (D-MEM), das 10 % fetales Rinderserum enthielt, bei 37 °C mit 5 % CO₂ kultiviert. Die Zellen wurden mit PBS gewaschen und mit 200 μl Serum-freiem D-MEM überlagert. Plasmide wurden unter Verwendung von Lipofectamin (Gibco-BRL) eingebracht. Jedes Well wurde mit etwa 0,3 μg des Effektorplasmids, 0,3 μg des Reporterplasmids und 0,01 μg des Plasmids pRL-SV40 (Promega), die mit 6 μl Lipofectamin und 25 μl D-MEM komplexiert waren, für 30 min bei 37 °C transfiziert. Die Transfektionen wurden dreifach durchgeführt. Nach 3 h wurde 1 ml Medium, das 10 % Serum enthielt, zu jedem Well zugegeben. 40–48 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen geerntet. Luciferase-Assays wurden unter Verwendung des Dual-Luciferase^TM Systems (Promega) durchgeführt. Das transfizierte dritte Plasmid, pRL-SV40, trägt das Renilla Luciferase-Gen und wurde als Standard für die Transfektionseffizienz cotransfiziert. Die in 6 gezeigten Daten entsprechen dem Durchschnitt aus dreifachen Assays, die gegen die Renilla Aktivität normalisiert wurden.
Bei dem Kontrollreporterplasmid pGL3-Kontrolle (pGL3-C) beeinflusst die Gegenwart oder Abwesenheit des ZFP-KRAB-Expressionsplasmids nicht das Ausmaß der Luciferase-Expression. Für pVFR1-4×, bei dem der Reporter vier Kopien der VEGF-Zielstelle enthielt, verringerte die Gegenwart des VEGF1(9-bp-Bindungs-ZFP)- oder VEGF3a/1(18-bp-Bindungs-ZFP)-Expressionsplasmids die Luciferase-Expression um einen Faktor von 2–3 relativ zu der leeren pcDNA-Vektorkontrolle. Das VEGF3a(9-bp-Bindungs-ZFP)-Expressionsplasmid scheint keinen oder nur einen geringen Effekt zu haben. Diese Experimente zeigen klar, dass ein konstruiertes ZFP seine Funktion in einer Zelle ausüben kann, wenn seine Zielstelle vorliegt, wodurch die Transkription eines Gens reprimiert wird. Ferner scheint ein bestimmter Affinitätsgrad für die Funktion notwendig zu sein, d.h. dass VEGF1 und VEGF3a/1 mit K_d's von 10 nM oder weniger funktionsfähig sind, während VEGF3a mit einer K_d von 200 nM dies nicht ist.
Ein zweites Reporterplasmid, pVFR2-4×, wurde durch Entfernen der vier Kopien der VEGF-Zielstellen unter Verwendung von HindIII und Insertieren derselben in die HindIII-Stelle von pGL3-Kontrolle (in Vorwärtsorientierung) konstruiert. Dadurch werden die Zielstellen zwischen die Transkriptionsinitiationsstelle für den SV40-Promotor und das Translationsinitiationscodon für das Luciferase-Gen gesetzt. Bei ähnlichen Cotransfektionsexperimenten, wie den oben beschriebenen, wurde eine etwa 3–4-fache Repression des Luciferase-Signals mit den VEGF1-KRAB- oder VEGF3a/1-KRAB-Repressoren relativ zu den pcDNA-Kontrollen (Daten nicht gezeigt) beobachtet. Dies deutet darauf hin, dass die Repressoren aktiv sind, wenn sie stromaufwärts oder stromabwärts des Transkriptionsinitiationspunkts gebunden werden.
Beispiel V: Aktivierung von VEGF-Rezeptoren in Cotransfektionsexperimenten
Dieses Beispiel verdeutlicht die Verwendung von transienten Cotransfektionsstudien, um die Aktivität der ZFP-Transkriptionsaktivatoren in Zellen zu bestimmen. Der experimentelle Aufbau ist ähnlich zu demjenigen des Beispiels IV, außer dass ein unterschiedliches Transfektionsverfahren, eine unterschiedliche Zelllinie und eine unterschiedliche Reihe von Reporter- und Effektorplasmiden verwendet wurden.
Für die Aktivierungsexperimente wurde ein als pVFR3-4× bezeichneter Reporter konstruiert. Dieser Reporter enthält vier Kopien der VEGF-Ziele mit der oben gezeigten Sequenz an den MluI/BglII-Stellen des Plasmids pGL3-Promotor (Promega). Dieser Vektor weist die SV40-Enhancersequenz nicht mehr auf und zeigt daher einen niedrigeren basalen Glühwürmchenluciferaseexpressionsgrad. pVFR3-4× wurde durch Austausch des KpnI/NcoI-Fragments von pVFR1-4× in die KpnI/NcoI-Stellen des pGL3-Promotors konstruiert.
Die Effektorplasmidkonstruktion ist oben beschrieben. Die VEGF1-VP16-, VEGF3a/VP16- und VEGF3a/1-VP16-Expressionsvektoren wurden so konstruiert, dass sie ein Fusionskonstrukt aus der SV40-Kernlokalisationssequenz, dem VEGF-ZFP, der VP16-Transaktivierungsdomäne und einem FLAG-Epitop-Tag, die alle unter der Kontrolle des CMV-Promotors stehen, erzeugen. Der leere pcDNA3-Expressionsvektor wurde als Kontrolle verwendet.
Alle Vektoren wurden unter Verwendung des Qiagen DNA-Aufreinigungskits präpariert. 7 zeigt eine typische Reihe von Transfektionen unter Verwendung von 293(menschliche embryonale Nieren)-Zellen. Etwa 40.000 Zellen wurden in jedes Well einer 24-Well-Platte gegeben und über Nacht in D-MEM-Medium, das 10 % fetales Rinderserum enthielt, bei 37 °C mit 5 CO₂ kultiviert. Die Zellen wurden mit Serum-freiem D-MEM gewaschen und mit 200 μl Serum-freiem D-MEM überlagert. Plasmide wurden unter Verwendung eines Calciumphosphattransfektionskits (Gibco-BRL) gemäß den Anweisungen des Herstellers eingebracht. Die Zellen in jedem Well wurden mit 1,5 μg Reporterplasmid, 1,5 μg Effektorplasmid und 0,5 μg eines Actin/β-Gal-Plasmids transfiziert. Die Plasmide wurden mit 15 μl CaCl₂ kombiniert und mit dH₂O auf 100 μl aufgefüllt. 100 μl HEPES-Lösung wurde tropfenweise unter Vortexen zugegeben. Die Mischung wurde für 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. 200 μl Calciumphosphat-behandelte DNA wurden dann zu dem Medium in jedem Well gegeben. Die Transfektionen wurden dreifach durchgeführt. Nach 5 Stunden wurde das Medium entfernt und 1 ml Medium, das 10 % Serum enthielt, wurde zugegeben. 40–48 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen geerntet. Luciferase-Assays wurden unter Verwendung des Dual-Light^TM Systems (Tropix) durchgeführt. Das transfizierte dritte Plasmid, Actin/β-Gal, trägt das β-Galactosidasegen unter der Kontrolle des Actinpromotors und wurde als Standard für die Transfektionseffizienz cotransfiziert. Der β-Galactosidaseassay wurde auch gemäß dem Protokoll des Herstellers (Tropix) durchgeführt. Die in 7 gezeigten Daten entsprechen dem Durchschnitt von dreifachen Assays, die gegen die β-Galactosidaseaktivität normalisiert wurden.
Bei dem Kontrollreporterplasmid, pGL-3-Promotor (pGL3-P), beeinflusste die Gegenwart oder Abwesenheit des ZFP-VP16-Expressionsplasmids den Luciferase-Expressionsgrad nicht wesentlich. Bei pVFR3-4×, bei dem der Reporter vier Kopien der VEGF-Zielstelle enthielt, zeigte die Gegenwart von VEGF1 (das 9-bp-Bindungs-ZFP) eine sehr schwache Aktivierung relativ zu der leeren pcDNA-Vektorkontrolle. Das VEGF3a/1(18-bp-Bindungs-ZFP)-Expressionsplasmid aktivierte die Luciferase-Expression beträchtlich, und zeigte eine etwa 14-fache Zunahme relativ zu pcDNA. Diese Experimente zeigen deutlich, dass ein konstruiertes ZFP, wenn es mit der VP16-Aktivierungsdomäne fusioniert ist, seine Funktion in einer Zelle ausüben kann, wenn seine Zielstelle vorliegt, wodurch die Transkription eines Gens aktiviert wird. Ferner zeigen diese Ergebnisse klar, dass ein 18-bp-Bindungsprotein, VEGF3a/1, in diesem Assay ein viel besserer Aktivator ist als das 9-bp-Bindungs-VEGF1-Protein. Dies könnte von der verbesserten Affinität oder der verringerten Oft-Rate des VEGF3a/1-Proteins herrühren.
Ein viertes VEGF-Reporterplasmid wurde durch Klonierung des KpnI/NcoI-Fragments von pVFR2-4× in den pGL3-Promotor, um das Plasmid pVFR4-4× zu erzeugen, konstruiert. Eine Aktivierung wurde bei Cotransfektionen, welche diesen Reporter zusammen mit den Effektorplasmiden, welche die VEGF1-VP16- und VEGF3a/1-VP16-Fusionskonstrukte exprimierten, verwendeten, beobachtet (Daten nicht gezeigt). Dies deutet darauf hin, dass diese artifiziellen Transaktivatoren funktionsfähig sind, wenn sie entweder stromaufwärts oder stromabwärts des Transkriptionsinitiationspunkts gebunden werden.
Diese Cotransfektionsdaten zeigen, dass ZFPs verwendet werden können, um die Expression von Reportergenen zu regulieren. Solche Experimente dienen als geeignetes Instrument zur Identifikation von ZFPs für eine weitere Verwendung als Modulatoren der Expression von endogenen zellulären Genen. Wie unten gezeigt, können die Modulationsergebnisse zwischen den Cotransfektionsexperimenten und den endogenen Genexperimenten variieren, wobei dieselben ZFP-Konstrukte verwendet werden.
Beispiel VI: Repression eines endogenen VEGF-Gens in humanen Zellen
Dieses Beispiel zeigt, dass ein konstruiertes ZFP die Expression eines endogenen zellulären Gens, das in seiner normalen Gen- und Chromatinstruktur vorliegt, reprimieren kann. Insbesondere wurden Effektorplasmide, welche VEGF-ZFPs fusioniert an die KRAB-Repressionsdomäne exprimieren, in Zellen eingebracht und es wurde gezeigt, dass diese die VEGF-Gene abregulieren.
Eukaryotische Expressionsvektoren wurden konstruiert, die die VEGF3a/1- und VEGF1-ZFPs mit SV40-NLS und KRAB, wie in Beispiel III beschrieben, fusionieren. Die Transfektionen wurden unter Verwendung von Lipofectamin, einer kommerziell erhältlichen Liposomenpräparation von Gibco-BRL, durchgeführt. Alle Plasmid-DNAs wurden unter Verwendung des Qiagen Midi-DNA-Aufreinigungssystems präpariert. 10 μg des Effektorplasmids wurden mit 100 μg Lipofectamin (50 μl) in einem Gesamtvolumen von 1600 μl Opti-MEM gemischt. Ein pCMVβ-Gal-Plasmid (Promega) wurde als interne Kontrolle für die Transfektionseffizienz auch zu der DNA-Mischung zugegeben. Nach einer 30-minütigen Inkubation wurden 6,4 ml D-MEM zugegeben und die Mischung wurde auf 3×10⁶ 293-Zellen gegeben. Nach fünf Stunden wurde die DNA-Lipofectamin-Mischung entfernt und frisches Kulturmedium, das 10 % fetales Rinderserum enthielt, wurde auf die Zellen gegeben.
Achtzehn Stunden nach der Transfektion wurden die 293-Zellen durch Behandlung mit 100 μM DFX (Desferrioxamin) induziert, was zu einer schnellen und andauernden Transkriptionsaktivierung des VEGF-Gens und auch zu einer graduellen Zunahme der VEGF-mRNA-Stabilität führte (Ikda et al., J. Biol. Chem. 270: 19761–19766 (1995)). Unter Routinekulturbedingungen sekretieren die 293-Zellen eine geringe Konzentration von VEGF in das Kulturmedium. Die Zellen wurden zusätzliche 24 Stunden inkubiert, bevor die Überstände für eine Bestimmung der VEGF-Konzentrationen durch einen ELISA-Assay gesammelt wurden.
In parallelen Experimenten, welche einen ähnlichen Repressionsgrad zeigten, wurde die Zellwachstumsfähigkeit unter Verwendung des Promega Celltiter-96^®-Aqueous-One-Solution-Zellproliferationsassays (Promega) überwacht. Nach DFX-Behandlung für 18 Stunden wurden 500 μl der ursprünglichen 2 ml Medium entfernt und, wie oben beschrieben, auf eine VEGF-Expression hin untersucht. Um die Zellwachstumsfähigkeit zu bestimmen, wurden 300 μl des Promega Celltiter-96^®-Aqueous-One-Solution-Reagenzes zu den verbleibenden 1,5 ml zugegeben. Die Zellen wurden dann bei 37 °C für etwa 2 Stunden inkubiert. 100 μl aus jedem Well wurden in eine 96-Well-Platte überführt und mit einem ELISA-Plattenauslesegerät bei einer OD von 490 nm ausgelesen. Es bestand keine signifikante Verringerung der Wachstumsfähigkeit der Zellen, welche das VEGF3a/1-KRAB-Konstrukt exprimierten, relativ zu denjenigen Zellen, die mit den leeren Vektorkontrollen transfiziert wurden, was darauf hindeutet, dass die beobachtete VEGF-Repression nicht auf einen verallgemeinerten Zelltod zurückzuführen ist.
Eine 40–50-fache Zunahme der VEGF-Expression wurde in den DFX-behandelten Zellen, die mit VEGF3a/1-KRAB, einem Expressionsvektor, der das hochaffine 18 bp-Bindungs-VEGF-ZFP codierte, transfiziert waren, beobachtet. Eine zweifache Zunahme der Expression wurde beobachtet, wenn die Zellen mit VEGF1-KRAB, einem Expressionsvektor, der für das hochaffine 9-bp-Bindungs-VEGF-ZFP codierte, transfiziert waren. Keine signifikante Zunahme der VEGF-Expression wurde in Zellen beobachtet, die mit Nicht-VEGF-ZFP (CCR5-KRAB) oder NKF-Kontrolle transfiziert waren (8). Ähnliche Ergebnisse wurden in drei unabhängigen Transfektionsexperimenten erhalten.
In einem separaten Experiment wurden die folgenden Ergebnisse erhalten (Daten nicht gezeigt). VEGF1-NF, der das 9-bp-Bindungs-VEGF1-ZFP ohne eine funktionelle Domäne exprimierte, zeigte keinen Effekt auf die VEGF-Genexpression. Eine signifikante Verringerung der VEGF-Expression wurde mit VEGF3a/1-NF, der das 18-bp-Bindungsprotein mit einer funktionellen Domäne exprimierte, beobachtet. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass eine Bindung an die Transkriptionsinitiationsstelle selbst ohne eine Repressionsdomäne die Transkription stört. Selbst bei einer Fusion an die KRAB-Domäne ist das VEGF3a-ZFP nicht zu einer Beeinflussung des Expressionsgrads fähig (Plasmid VEGF3a-KRAB). Ist VEGF1 jedoch mit KRAB fusioniert (VEGF1-KRAB), führt dies zu einer dramatischen Abnahme der Expression. VEGF3a/1 fusioniert an KRAB (VEGF3a/1-KRAB) verhindert die Expression von VEGF völlig.
Diese Daten zeigen, dass ein konstruiertes ZFP zur Auffindung und Bindung seiner Zielstelle auf dem Chromosom fähig ist und die Expression eines endogenen zellulären Zielgens verhindern kann. Insbesondere zeigen diese Ergebnisse, dass ZFPs mit einer K_d von weniger als etwa 25 nm (z.B. VEGF1 mit einer durchschnittlichen apparenten K_d von etwa 10 nM) zu einer dramatischen Abnahme der Expression führen können. Zudem zeigen die Daten, dass die funktionale KRAB-Domäne ein Gensilencing verstärkt. Da bei diesem Experiment die Induktion des Repressors vor der Zugabe des Induktors von VEGF (DFX) auftritt, zeigen die Daten die Fähigkeit eines konstruierten Repressors, die Aktivierung eines bereits stillen Gens zu verhindern. Zudem zeigen diese Ergebnisse, dass ein konstruiertes Sechs-Finger-ZFP (VEGF3a/1) mit einer nanomolaren Affinität für sein Ziel zur Inhibierung der Hypoxie-Antwort des VEGF-Gens fähig ist, wenn es an ein Ziel bindet, das mit der Transkriptionsinitiationsstelle überlappt.
Beispiel VII: Aktivierung des endogenen VEGF-Gens in humanen Zellen
Dieses Beispiel zeigt, dass ein konstruiertes ZFP die Expression eines Gens, das in seiner natürlichen Gen- und Chromatinstruktur vorliegt, aktivieren kann. Insbesondere wurden Effektorplasmide, die VEGF-ZFPs fusioniert mit der VP16-Aktivierungsdomäne exprimierten, in Zellen eingebracht und zeigten eine Rufregulation des VEGF-Gens.
Eukaryotische Expressionsvektoren wurden, wie in Beispiel III beschrieben, konstruiert, welche die VEGF3a/1- und VEGF1-ZFPs mit SV40 NLS und VP16 fusionieren. Die Transfektionen wurden unter Verwendung von Lipofectamin, einer kommerziell erhältlichen Liposomenpräparation von Gibco-BRL, durchgeführt. Alle Plasmid-DNAs wurden unter Verwendung des Qiagen Midi-DNA-Aufreinigungssystems präpariert. 10 μg des Effektorplasmids (enthaltend das konstruierte ZFP) wurde mit 100 μg Lipofectamin (50 μl) in einem Gesamtvolumen 1600 μl Opti-MEM gemischt. Ein pCMVβ-gal-Plasmid (Promega) wurde auch in die DNA-Mischung als interne Kontrolle für die Transfektionseffizienz gegeben. Nach einer 30-minütigen Inkubation wurden 6,4 ml D-MEM zugegeben und die Mischung wurde auf 3×10⁶ 293-Zellen gegeben. Nach fünf Stunden wurde die DNA-Lipofectaminmischung entfernt und frisches Kulturmedium, das 10 % fetales Rinderserum enthielt, wurde auf die Zellen gegeben. Ein Tag später wurde frisches Medium zugegeben und der Überstand wurde 24 Stunden später für eine Bestimmung der VEGF-Konzentrationen unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen ELISA-Kits (R- und D-Systeme) gesammelt.
Für das spezifische Drei-Finger-VEGF1-ZFP (VEGF1-VP16) wurde eine 7–10-fache Zunahme der VEGF-Expression beobachtet, wenn mit dem Kontrollplasmid (NVF-Kontrolle) und mock-transfizierten Zellen verglichen wurde (9). Ähnliche Ergebnisse wurden in 5 unabhängigen Experimenten erhalten. Es ist wichtig festzuhalten, dass das Ausmaß der VEGF-Sekretion in VEGF1-VP16-transfizierten Zellen gleich oder größer war als das Ausmaß in Zellen, die mit DFX behandelt wurden (9). Die Einbringung von VEGF3a/1-VP16 stimulierte eine bescheidenere Induktion von VEGF. Dieses Ergebnis stimmt mit der in Beispiel VI gemachten Entdeckung überein, wonach die Expression des 18-bp-Bindungsproteins ohne eine funktionale Domäne die Aktivierung zu einem gewissen Grad verhinderte. Dieses Ergebnis legt nahe, dass die starke Bindung dieses Proteins an die Transkriptionsinitiationsstelle die Aktivierung stört.
Diese Daten deuten darauf hin, dass ein konstruiertes ZFP zur Auffindung und Bindung seiner Zielstelle auf dem Chromosom, zur Präsentierung einer Transkriptionsaktivierungsdomäne und zum dramatischen Verstärken des Expressionsgrads dieses Gens fähig ist. Insbesondere deuten die Ergebnisse darauf hin, dass ZPFs mit einer K_d von weniger als etwa 25 nM (z.B. hat VEGF1 eine durchschnittliche apparente K_d von etwa 10 nM) zu dramatischen Zunahmen der Expression führen.
Beispiel VIII: RNase-Schutzassay
Um die Ergebnisse der Beispiele VI und VII weiter zu konkretisieren, wurde ein Ribonukleaseschutzassay (RPA) durchgeführt, um die erhöhten Konzentrationen des VEGF-Proteins mit einer Zunahme der VEGF-mRNA-Konzentrationen (Beispiel VIII) zu korrelieren und die verringerte Konzentration des VEGF-Proteins mit einer Abnahme der VEGF-mRNA-Konzentrationen (Beispiel VII) zu korrelieren.
RNA wurde unter Verwendung eines RNA-Isolationskits (Pharmingen) aus den transfizierten Zellen isoliert. Radioaktive Multitemplatsonden, die eine VEGF-spezifische Sonde umfassten, wurden durch in vitro-Transkription hergestellt und über Nacht bei 65 °C an 5 μg jeder der RNAs aus den experimentellen transfizierten Zellen und den transfizierten Kontrollzellen hybridisiert. Die Hybridisierungsmischung wurde mit RNase behandelt und die geschützten Sonden wurden aufgereinigt und einer denaturierenden 5 Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterzogen und die Radioaktivität wurde durch Autoradiographie bestimmt. 293-Zellen, die mit VEGF1-VP16 transfiziert waren, zeigten eine 2–4-fache Zunahme der Konzentration an VEGF-mRNA, wenn mit Zellen, die mit NVF-Kontrolle transfiziert waren, verglichen wurde (10, Panel A; siehe Beispiel VI für experimentelle Details). Die Größe der geschützten Sonde war identisch zu der Größe der Sonde, die aus der humanen Kontroll-RNA, die als Kontrolle für die RNA-Integrität bereitgestellt wurde, erzeugt wurde (10, Panel A).
In einem separaten Experiment wurde die Konzentration der VEGFspezifischen mRNA auch in Zellen quantifiziert, die mit einem VEGF-KRAB-Effektorplasmid transfiziert waren (10, Panel B; siehe Beispiel VI für experimentelle Details). Die Details für die Transfektion sind in Beispiel VI beschrieben. Eine dramatische Abnahme der VEGF-mRNA wurde beobachtet, wenn die Zellen mit dem VEGF3a/1-KRAB-Effektorplasmid transfiziert waren. Keine signifikante Abnahme der VEGF-mRNA wurde beobachtet, wenn Zellen mit NKF-Kontrolle oder einem nicht-VEGF spezifischen ZFP (CCR5-5-KRAB und CCR5-3-KRAB, welche unterschiedliche CCR5-Zielstellen erkennen) transfiziert waren.
Das Experiment zeigt, dass die infolge der Transfektion mit dem chimären VEGF1-VP16-Transkriptionsfaktor beobachtete Zunahme des VEGF-Proteins durch eine Zunahme der Konzentration der VEGF-mRNA vermittelt wird. Ähnlich wird die infolge der Transfektion mit dem chimären VEGF3a/1-KRAB-Transkriptionsfaktor beobachtete Abnahme des VEGF-Proteins durch eine Abnahme der Konzentration der VEGF-mRNA vermittelt.
Beispiel IX: Aktivierung von EPO, einem entwicklungsgemäß stillen Gen
EPO ist ein 30,4 kD großes Glykoproteinhormon und spielt eine Schlüsselrolle bei der Kontrolle der Produktion der roten Blutzellen. Das EPO-Gen wird normalerweise nur in fetaler Leber und Erwachsenennieren als Antwort auf eine Hypoxie exprimiert. Es fungiert durch Wechselwirkung mit dem EPO-Rezeptor auf den erythroiden Vorläuferzellen des Knochenmarks, um deren Proliferation und Differenzierung in reife Erythrozyten zu stimulieren (Jelkmann, Physiological Reviews 71: 449 (1992); Semenza, Hematology/Oncology Clinics of North America 8: 863 (1994); Ratcliffe et al., J. Exp. Bio. (1991)). Rekombinante humane EPO-Genprodukte wurden erfolgreich verwendet, um Anämien und chronisches Nierenversagen zu behandeln (Egrie, Pharmacotherapy 10: 3S (1990)).
Das EPO2C-ZFP wurde so konstruiert, dass es eine 9 bp lange DNA-Bindungsstelle, die 853 bp stromaufwärts der EPO-Transkriptionsinitiationsstelle lokalisiert ist, bindet.
Die EPO2C-Bindungsstellensequenz ist GCGGTGGCT.
Eukaryotische Expressionsvektoren wurden durch Fusion der das EPO2C-ZFP codierenden Sequenz mit dem SV40-Kernlokalisationssignal (NLS) und der HSV VP16-Transaktivierungsdomäne konstruiert.
Alle Plasmid-DNAs wurden unter Verwendung des Qiagen Midi-Präparationssystems präpariert. 2×10⁶ Hep3B-Zellen (eine menschliche Hepatomzelllinie) oder 5×10⁶ HEK293-Zellen (eine menschliche embryonale Nierenepithelzelllinie) wurden einen Tag vor der Transfektion in 6-Well-Platten gegeben. 500 ng des Effektorplasmids (codierend für das konstruierte ZFP) wurden unter Verwendung von Lipofectamin (Gibco-BRL) in die Zellen transient transfiziert. Eine mock-Transfektion und eine Transfektion mit einem leeren Expressionsvektor dienten als Kontrollen. Ein Tag später wurde das Wachstumsmedium entfernt und frisches D-MEM wurde zugegeben. Die Kulturüberstände wurden 24 Stunden später für eine Bestimmung der EPO-Proteinexpressionsgrade unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen ELISA-Kits (R&D Systems) gesammelt.
Die in 11a gezeigten Ergebnisse zeigen, dass die Transfektion eines Vektors, der für das EPO2C-ZFP-Transaktivierungsprotein codiert, den Grad der EPO-Expression signifikant erhöht, wenn mit dem Kontrollvektor (pcDNANVF) oder mit mock-transfizierten Zellen verglichen wird. Diese Aktivierung wurde sowohl in Hep3B- als auch in HEK293-Zellen (11a) beobachtet.
Hep3B-Zellen sind dafür bekannt, dass sie zur Expression des EPO-Gens unter bestimmten Bedingungen fähig sind (Goldberg et al., PNAS 84: 7972 (1987)). Diese Zellen stammen von Hepatocyten ab, der fetalen Quelle von EPO. In Hep3B-Zellen aktiviert eine Hypoxie (oder Behandlung mit CoCl₂, welches eine Hypoxie nachahmt) die Expression des EPO-Gens, das ansonsten still ist (siehe 11a). Die VEGF-Expression wird auch durch eine Hypoxie in Hep3B-Zellen kontrolliert.
Eine Hypoxie oder CoCl₂-Behandlung aktiviert die VEGF-Expression in HEK293-Zellen, was zeigt, dass die Hypoxie-Antwort in dieser Zelllinie normal funktioniert (siehe 8). Eine Hypoxie oder CoCl₂-Behandlung ist jedoch nicht zur Induktion der EPO-Expression in HEK293-Zellen fähig (11a). Dieses Ergebnis rührt daher, dass HEK293-Zellen von embryonalen Nierenepithelzellen, einem Gewebe, das nicht als EPO-Quelle wirkt, abgeleitet sind. Trotz der Inaktivierung von EPO in diesen Zellen ist das chimäre EPO2C-VP16-ZFP zur Aktivierung des EPO-Gens fähig (11a).
Die CoCl₂-Effekte und die ZFP-Effekte auf die EPO-Genexpression sind Effekte auf die EPO-Transkription. Eine quantitative RT-PCR wurde unter Verwendung eines als TagMan-Assay (PE Applied Biosystems) bekanntes Verfahren durchgeführt. Die Daten sind in 11b gezeigt.

Claims

Isolierte Zelle, umfassend ein mikrobielles oder virales Gen, das Teil eines die Zelle infizierenden natürlich vorkommenden mikrobiellen oder viralen Genoms ist, wobei der Zelle verabreicht worden ist: (i) ein erstes Protein, umfassend eine erste Zinkfinger-Domäne und eine regulatorische Domäne, wobei die erste Zinkfinger-Domäne so konstruiert ist, dass sie eine erste Zielstelle in dem mikrobiellen oder viralen Gen erkennt und eine K_d von weniger als 25 nM aufweist, oder (ii) eine Nukleinsäure, umfassend das erste Protein codierende Sequenzen in operativer Verknüpfung mit einem Promotor, so dass das erste Protein in der Zelle exprimiert ist.
Isolierte Zelle nach Anspruch 1, worin die Expression des mikrobiellen oder viralen Gens moduliert ist.
Therapeutische Zusammensetzung, umfassend ein Protein, wobei das Protein eine Zinkfinger-Domäne und eine regulatorische Domäne umfasst, wobei die Zinkfinger-Domäne (i) so konstruiert ist, dass sie eine erste Zielstelle in einem mikrobiellen oder viralen Gen, das Teil eines natürlich vorkommenden mikrobiellen oder viralen Genoms ist, erkennt, und (ii) eine Kd von weniger als 25 nM aufweist.
Therapeutische Zusammensetzung nach Anspruch 3, die ein Mittel zur Behandlung von Viren-, Pilz-, Protozoen- oder Bakterieninfektionen ist.
Therapeutische Zusammensetzung, umfassend ein Nukleinsäuremolekül, wobei das Nukleinsäuremolekül eine ein Protein codierende Sequenz in operativer Verknüpfung mit einem Promotor umfasst, wobei das Protein eine Zinkfinger-Domäne und eine regulatorische Domäne umfasst, wobei die Zinkfinger-Domäne (i) so konstruiert ist, dass sie eine erste Zielstelle in einem mikrobiellen oder viralen Gen, das Teil eines natürlich vorkommenden mikrobiellen oder viralen Genoms ist, erkennt, und (ii) eine K_d von weniger als etwa 25 nM aufweist.
Therapeutische Zusammensetzung nach Anspruch 5, die ein Mittel zur Behandlung von Viren-, Pilz-, Protozoen- oder Bakterieninfektionen ist.