DE2128744C3

DE2128744C3 - Verfahren zur Massenkultivation von Zellen und Geweben

Info

Publication number: DE2128744C3
Application number: DE2128744A
Authority: DE
Inventors: Donald S. 7800 Freiburg Hoelzl-Wallach; Manuel Dipl.- Chem. 7801 Bollschweil Modolell; Paul Gerhard Dr. 7830 Emmendingen Munder
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Priority date: 1971-06-09
Filing date: 1971-06-09
Publication date: 1979-03-29
Also published as: NL7207796A; BE784219A; DK145380C; GB1389411A; FR2140576A1; AT316755B; SE407422B; IT958261B; FR2140576B1; DK145380B; DE2128744A1; US3873423A; GB1389412A; CH573472A5; DE2128744B2

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Massenkultivation von Zellen und Geweben.

Für viele biochemische zellphysiologische und auch klinische Fragestellungen wie beispielsweise Untersuchungen von Arzneimitteln, Austestung von Geweben für die Transplantation ist die Kultivation von Zellen und Geweben über längere Zeiträume notwendig. Für viele Fragen der Zellphysiologie wie etwa Untersuchungen über das Wachstum von benignen und malignen Zellen ist es erforderlich, Parallelansätze durchzuführen, bei denen bestimmte Parameter wie beispielsweise der pH-Wert, der Sauerstoff- und Kohlendioxyddruck geändert werden. Die Kultivation von Gewebekulturen unter Veränderung des Sauerstoff- und Kohlendioxyddrucks durchzuführen, wäre sehr wichtig, da sich die ki-vitro-Kultivationsmethoden wesentlich mehr den Bedingungen im Organismus annähern müssen, als es bisher der Fall ist. Viele Zellen und Gewebe haben beispielsweise völlig unterschiedliche Sauerstoffdruckbedingungen im Organismus.

In dem lebenden Menschen oder Tier bewirkt eine Reihe physiologischer Rückkopplungsmechanismen, daß der Kohlendioxyddrudk und der Sauerstoffdruck In der Zellumgebung bei einem bestimmten Wert gehalten werden. Bei den bekannten Verfahren zur Zellkultivation kann man diesen Zustand nicht nachahmen.

Obgleich man bei den bekannten Verfahren den pH-Wert des Mediums genau messen kann und ihn sogar elektronisch regulieren kann, macht man von dieser Möglichkeit kaum Gebrauch, da dies bei den bekannten Verfahren schwierig ist und einen komplizierten Arbeitsaufwand erfordert Verfahren, um den Sauerstoff- und Kohlendioxyddruck in einer Zellschicht zu messen und beim Wachstum von Gewebekulturen zu kontrollieren, sind in der Literatur noch nicht beschrieben.

Weiche Wirkung der Kohlendioxyddruck auf die Vorgänge beim Kultivieren von Zellen hat, ist nicht genau bekannt Beispielsweise nimmt man an, daß Proteincarbamate gebildet werden. Es ist jedoch bekannt, daß Sauerstofürucke, die größer sind als der Sauerstoffdruck in der Luft, d. h. hyperbarische Drucke, für das ganze Tier tödlich sind und daß ebenfalls die Gewebe absterben und daß erhöhtes Tumorwachstum auftreten kann. Um diese Zusammenhänge näher zu untersuchen, besteht daher ein Bedarf nach einfachen Verfahren zur Massenkultivation von Zellen und Geweben unter automatischer Kontrolle des Sauerstoffdrucks und des Kohlendioxyddrucks.

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Massenkultivation von Zellen und Geweben unter automatischer Kontrolle des Sauerstoffdrucks und des Kohlendioxyddrucks zu schaffen.

Aus der DE-AS 14 67 779 sind zur Züchtung von Mikroorganismen Hüllen aus Kunststoff bekannt die luftdurchlässig, aber für den Nährboden undurchlässig sind. Das Material muß thermoplastisch und durchsichtig sein, um von außen beobachtet werden zu können. Zur Massenkultivation von Zellen und Geweben eignen sich diese Behälter nicht, da Zel'.en und Gewebe auf diesen Folien nicht anwachsen. Außerdem wird dort nicht gelehrt, wie es möglich ist, die Sauerstoff- und Kohlendioxiddrucke zu regeln, um die Bedingungen im Organismus zu simulieren.

Aus der DE-OS 20 24 763 ist ein Verfahren zum großtechnischen Züchten lebender Zeilen bekannt unter Verwendung einer Vielzahl von Kolonnen, die an den Enden durch Sammelrohre miteinander verbunden sind und mit veränderlicher Geschwindigkeit rotieren

4^r, gelassen und gekippt werden können. Dort wird auch angegeben, daß es möglich sei, den pH-Wert in den Kolonnen zu messen und das Verhältnis von Sauerstoff oder Luft zu Kohlendioxid entsprechend zu verändern oder gepuffertes Kulturmedium zuzuführen, um den pH-Wert einzuhalten. r-Jachteil dieses Verfahrens ist es, daß auch hier nicht angegeben wird, wie die kritischen Bedingungen im Organismus simuliert werden können und daß dieses Verfahren einen hohen Raumbedarf hat. Insbesondere aber wird nicht das Problem gelöst.

v, während der ganzen Züchtung die erwähnten Bedingungen regeln zu können und dabei die Sterilität aufrechtzuerhalten.

Aus der DE-AS 16 17 284 ist eine Vorrichtung zum Züchten von Gewebekulturzellen bekannt, bei welcher in einem Gefäß eine Anzahl Platten angeordnet ist und das Kulturmedium darin umlaufen gelassen wird. Außerdem ist eine Begasungsleitung vorhanden. Durch sie kann ein steriles Gemisch aus Luft und Kohlendioxid zugeführt Werden, um den nötigen Sauerstoff zur Verfugung zu stellen und den pH^Wert zu steuern. Da durch diese Art der Gaszufuhr eine Turbulenz auftritt, die das Zellenwachstum stört, erfolgt das Umpumpen. Diese Art der Gasversorgung führt jedoch in jedem

Falle zu einer Störung des Gewebewachstums und ermöglicht es nicht, ständig für die Einhaltung der physiologischen Bedingungen zu sorgen. Außerdem tritt auch hierbei ein hoher Raumbedarf auf.

Die Erfindung hat sich ebenfalls die Aufgabe gestellt, ein Kultivationsverfahren zu schaffen, gemäß dem man zahlreiche parallele Ansätze durchführen kann, wobei sich die einzelnen Ansätze durch verschiedene Versuchsbedingungen unterscheiden können.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Massenkultivation von Zellen und Geweben von Menschen oder Tieren, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man unter Verwendung eines Behälters für die Zellen, der aus einem Kunststoffilm besteht, der biologisch völlig inert, gasdurchlässig, transparent, thermoplastisch, UV-Licht-durchlässig und an der Innenseite chemisch so aufgerauht ist, daß er zur Haftung der Zeilen ausreichend hydrophil ist, den Sauerstoffdruck in der Gasphase des Brutschranks mißt, durch elektronische Rückkopplung ein Ventil steuert, wodurch der Sauerstoffdruck auf einem vorher festgelegten Wert konstant gehalten wird, den pH-Wert in dem Kulturmedium mit einer Elektrode Tiißt und, wenn der pH-Wert um mehr als 0,05 pH-Einheiten vom eingestellten und gewünschten pH-Wert abweicht, ein Einlaßventil für Kohlendioxid öffnet oder schließt, wodurch die Kohlendioxidzufuhr verstärkt oder vermindert wird, bis der pH-Wert wieder den gewünschten Wert erreicht hat, wobei man, um den Sauerstoffdruck konstant zu halten, in dem Maße, wie der Zufluß von Kohlendioxid erhöht oder erniedrigt wird, in reziproker Weise durch ein entsprechend gekoppeltes Ventil den Stickstoffzufluß erniedrigt oder erhöht, den Kohlendioxiddnick im Gasraum des Brutschranks mißt und, sobald der Druck einen bestimmten Wert überschreitet, neues Medium zupumpt und das alte Medium entfernt

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung verwendet man zur Durchführung von Vielfachansätzen mehrere bewegliche Kulturkammern, die, außer wenn sie sich in der Kontrollposition befinden, gasdicht sind. Bei dieser Ausführungsform legt man in jede Kulturkammer einen oder mehrere Behälter, enthaltend Impfzellen und Kulturmedien und führt jede Kulturkammer in einem bestimmten Zeitraum einmal durch die Kontrollposition, wobei man die Kulturkammer in der Kontrollposition aus einzelnen, kontrollierten Sauerstoff-, Stickstoff- und Kohlendioxidquellen begast, den Wasserdampfdruck durch Wasserdampfsättigung der eingeleiteten Gase konstant hält und den Sauerstoffdruck, den Kohlendioxiddruck und den pH-Wert automatisch kontrolliert und gegebenenfalls neues Kulturmedium zufügt und altes Kulturmedium en'sprechend entff rnt.

Überraschenderweise ermöglicht es das erfindungsgemäße Verfahren gegenüber den oben beschriebenen bekannten Methoden pH-Wert, Sauerstoffdruck und Kohlendioxiddruck in der unmittelbaren Umgebung der Zellen zu repeln und zu kontrollieren. Alle bisher bekannten Verfahren, die diese Parameter regulieren, basieren auf sehr aufwendigen Perfusionssystemen. Wenn jedoch Schütte!- oder Rührvorrichtungen angewendet werden, um Gradienten zu vermeiden, so entfällt damit die Möglichkeit, normale Zellen zu kultivieren.

Als Filmmaterial für den Behälter kann man alle Sorten Kunststoffe verwenden, die die angegebenen Eigenschaften besitzen. Besonders geeignet sind Fluor-Äthylen-Propylen-Miscbpolymerisate, Polytetrafluor^ äthylen und Mischpolymerisate von Hexafluorpropylen und Tetrafluoräthylen. Die Dicke des zur Herstellung der Kultivationsbehälter verwendeten Films ist unwesentlich, solange die geforderten Eigenschaften vorlie-■ > gen. Gute Ergebnisse wurden mit Filmdicken zwischen etwa 10 und 100 μπι erzielt. Die Filme werden chemisch an der Innenseite aufgerauht, damit sie ausreichend hydrophil sind, daß die Zellen an ihnen haften. Aus dem Film können mit einem einfachen Schweißgerät jede

in Sorte von Behältern angefertigt werden. Man kann beispielsweise Taschen oder Schläuche oder Beutel beliebiger Größe und jeder Form anfertigen. Im allgemeinen werden rechteckige Taschen verwendet, die z. B. eine Länge und Breite von 1 bis 200 cm und eine Höhe von 0,5 bis 50 cm besitzen.

Da das Material, das zum Herstellen der Behälter verwendet wird, UV-Licht-durchlässig ist, können die Kuitivationsbehälter beispielsweise durch 10- bis 15minütige UV-Bestrahlung sehr einfach sterilisiert werden.

Das Zellwachstum kann durch direkte visuelle Kontrolle verfolgt werden. Die opt'rche Klarheit der Behälter macht es aber auch mögücn, andere Methoden wie beispielsweise Mikrospektrophotometrie, Mikrospektrofluorometrie und Mikrokinomatographie zu verwenden.

Die Zellen können nach Auffüllen des gesamten Systems mit Kultivationsflüssigkeit entweder an einer Stelle eingeimpft werden, oder sie werden aus dem Flüssigkeitsreservoir zusammen mit der Kultivations

j» flüssigkeit zugepumpt Die Menge an verwendetem Kultivationsmedium hängt davon ab, wie lange ohne Wechsel des Mediums kultiviert werden soll.

Werden die Zellen aus dem Flüssigkeitsreservoir mit zugepumpt, wird der Umpumpmechanismus anschlie-

j-> ßend für mehrere Stunden abgestellt, damit die Zellen an den Behältern festwachsun können.

Nach der Kultivation können die Zellen aus den Behältern entnommen werden, indem man normale, bekannte chemische oder enzymatische Verfahren, beispielsweise Trypsinbehandlung, verwendet Da die Haftfähigkeit der Zellen auf dem aufgerauhten Filmmaterial zwar gut, aber bei weitem nicht so stark ist wie auf Glas, können die Zellen durch vorsichtige mechanische Manipulation ohne Schädigung von dem Film abgezo-

4'> gen werden. Dies gilt insbesondere dann, wenn sich eine Monoschicht ausgebildet hat.

Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich auch zur Herstellung von Viren, Antibiotika, Hormonen und Interferon, da die Massenkultivation von differenzierten

■so Zellen Voraussetzung für die Gewinnung dieser Substanzen in vitro ist.

Die Behälter können weiterhin Zusätze wie Zellen, Viren, Bakterien, Antibiotika usw. enthalten. Die^e Zusätze können entweder zusammen mit dem Kultur-

Y, rr-sdium eingefüllt werden, man kann sie aber auch einfüllen, nachdem das Kulturmedium und die Impfzellen bereits in den behälter eingefüllt wurden. Beispielsweise kann man diese Zusätze direkt durch den Film injizieren, wobei sich bei einer ganz kleinen Kanüle die

bo Einstichstelle von selbst wieder schließt, da der Film hinreichend plastisch ist. Bei Verwendung von größeren Nadeln kann man die Einstichstelle durch ein steriles Klebeband verschließen.

Die Behälter können auch in größeren Einheiten mit sterilem Medium gefüllt werden und dann durch Verschweißen in Untereinheiten gewünschter Größe und genau reproduzierbarer Form geteilt werden.
Gegebenenfalls können die Behälter bereits mit

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Zellen für die spätere Kultivation beschickt sein. In einem solchen Fall müßten die Behälter so aufbewahrt werden, daß die Zellen nicht zerstört werden. Beispielsweise kann man die Behälter dann tiefgefroren aufbewahren.

Man kann auch in die Behälter das gewünschte Kulturmedium abfüllen, die Behälter sterilisieren und sie steril lagern, wodurch es möglich ist, immer gebrauchs^ fertige Behälter zur Verfügung zu haben. Diese Behälter können auch gegebenenfalls in üblichen Labors, wo ι ο sterile Arbeitsplätze nicht vorhanden sind und wo ein steriles Arbeiten nicht möglich ist, direkt zum Kultivieren von Zellen benutzt werden, da sie zwar gasdurchlässig sind, nicht aber für Flüssigkeiten oder infektiöse Partikel durchlässig sind. Die Handhabung |5 solcher vorbereiteter Gewebekulturbehälter wäre sehr einfach, da man die Impfkeime oder irgendwelche Zusätze in den Behälter, wie bereits erwähnt, injizieren könnte, wobei es nur erforderlich wäre, eine eventuelle Einstichstelle kurz durch Abflammen zu sterilisieren.

Der Behälter kann auch mit mehreren gleichen Behältern zusammenhängend in Form von Rollen, Platten oder ähnlichen Formen vorliegen. Für die Kultivation würde man dann die benötigte Menge an Behältern abschneiden.

In Fig. 1 sind solche zusammenhängenden Behälter dargestellt

Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens legt man einzelne oder zusammenhängende Behälter in einen Brutschrank. Die Behälter können über eine peristaltische Pumpe mit einem Flüssigkeitsreservoir verbunden sein. Dadurch ist es möglich. Medium zu- oder abzupumpen. Der Umpumpmechanismus kann je nach Bedarf ab- und angestellt werden, und die Menge an zugepumptem und abgepumptem Medium kann entsprechend reguliert werden.

Der Wasserdampfdruck wird bei einer bestimmten Brutschranktemperatur im allgemeinen konstant gehalten, indem man die eingeleiteten Gasen mit Wasserdampf sättigt.

Der pH-Wert kann an irgendeiner beliebigen Stelle im Pumpsystem gemessen werden. Dabei wird das im allgemeinen bicarbonathaltige Medium an einer pH-Elektrode vorbeigepumpt. Man kann aber auch direkt eine pH-Elektrode in den Kultivationsbeutel 4*5 einführen und bei abgestelltem Pumpmechanismus den pH-Wert direkt in dem Kultivationsbeutel bestimmen.

Die Regulierung des pH-Wertes durch Einleiten von Kohlendioxyd ist aufgrund der Henderson-Hasselbach-Gleichung möglich. Diese Gleichung gibt eine Beziehung zwischen dem pH-Wert, der (HCO₃" )-Konzentration und dem Kohkndioxyddruck wieder. Die Henderson-Hasselbach-Gleichung lautet:

pH₃₇ = 6,06 + log

(HCO₃-)

0,024 ■ pCO₂

Im allgemeinen verwendet man bei den Kultivations- ·, versuchen (HCO₃-)-Konzentrationen von 0,024 Mol und einen pH-Wert von 7,1 ±0,05.

Der Kohlendioxyddruck wird durch eine Kohlendioxyd-EIektrode im Pumpsystem gemessen. Kommt es zu Akkumulation von Säuren im Medium, wird zuerst der pH-Wert durch das pH-Elektroden-Kohlendioxyd-Kontrollsystem aufrechterhalten. Wird aber ein besümmter pH-Wert überschritten, der durch den Kohlendioxyddruck nicht mehr ausgeglichen werden kann, d.h. wenn die Pufferreserve unter einen gewünschten Werf abfällt, kann automatisch neues Medium zugepumpl und das alle Medium entsprechend verringert werden.

In Fig.2 der Zeichnung ist eine beispielhafte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens dargestellt Die Kulturbehälter, die bei dieser Ausführungsform nebeneinander angebracht sind, liegen in Form vöri Schläuchen vor und sind an ihren Enden mit Zu- und Abflußjeitungeri für das Kulturmedium verbunden. Das Kulturmedium wird über eine peristaltische Pumpe eingeführt und bevor es über einen Strömungsteiler durch die Beutel geleitet wird, wird es über ein Milliporenfilter filtriert. In dem abfließenden Kulturmedium wird über eine pH-Elektrode der pH-Wert gemessen. Das pH-Meter ist über einen Verstärker auf geeignete Weise mit Ventilen verbunden, die die Stickstoff- und Kohlendioxydzufuhr regeln. Weicht der pH-Wert im Kulturmedium vom eingestellten und gewünschten nH-Weri ab. dann wird das Einlaßventil für das Kohlendioxyd entsprechend geöffnet und geschlossen, bis der pH-Wert wieder den gewünschten Wert erreicht hat. Reziprokerweise wird das Einlaßventil für den Stickstoff geöffnet oder geschlossen, um den Sauerstoffdruck in dem System konstant zu halten.

In dem abfließenden Medium wird gleichzeitig über eine Kohlendioxyd-Elektrode der Kohlendioxyddruck bestimmt Durch elektronische Rückkopplung wird über einen Verstärker das Einlaßventil für das Kulturmedium gesteuert Unterschreitet der Kohlendioxyddruck in dem Medium einen bestimmten Wert, wird automatisch neues Medium zugepumpt und alter Medium entfernt

Der Sauerstoff wird in der Gasphase gemessen und durch elektronische Rückkopplung wird das Einlaßventil für den Sauerstoff entsprechend gesteuert

Es wurde errechnet daß die Kapazität dieses automatischen und kontrollierten Kultivationssystems bei Benutzung eines Brutschranks mittlerer Größe bisherige Kultivationssysteme bei weitem überschreitet Bei optimaler Ausnützung des Raums kann ein Brutschrank etwa dieselbe Leistung bringen wie ein sogenannter 37°-Raum mit »roller machines«. Sterilität der Beutel und Elektroden kann leicht durch UV-Bestrahlung erreicht werden. Da das System nach Sterilisation und Inbetriebnahme vollständig geschlossen ist kommt es im Verlauf der Kultivation zu keinerlei Kontaminationsproblemen.

Unterteilt man den Gewebekulturraum in mehrere bewegliche Kulturkammern, so kann man Zellen unter kontrollierter Veränderung des Sauerstoffdrucks und des Kohlendioxyddrucks in zahlreichen paralk'en Ansätzen kultivieren. Die einzelne Kulturkammer ersetzt gewissermaßen einen Brutschrank. Auf diese Weise kann man vergleichende Untersuchungen durchführen, wobei man jeweils irgendwelche Parameter variiert

Bei dem Verfahren zur Massenkultivation von Zellen in Vielfachansätzen werden die Zellen, wie zuvor beschrieben, in den chemisch aufgerauhten Behältern beliebiger Größe kultiviert Die Behälter werden in den einzelnen Kulturkammem zwischen zwei Stahlnetzen inkubiert, damit man eine konstante Dicke des Päckchens erhält Die konstante Dicke des Päckchens schafft die Voraussetzung für konstante Länge des optischen Weges im Fall, wie weiter unten ausgeführt wird, der pH-Wert auf optischem Wege kontrolliert werden kann.

Die verwendeten Kulturkammern können ierle

beliebige Größe und Form besitzen; Sie können beispielsweise rechteckige, trapezförmige, quadratische, runde oder dreieckige Grundflächen und jede beliebige Höhe besitzen, Gegebenenfalls können sie auch so gebaut sein, daß sie übereinanderliegende Böden besitzen, auf die man die Kultivationsbehälter legen kann. Die Böden können beliebig ausgebildet sein, z. B. könnsri sie mit Löchern versehen sein oder sie können in F'orai eines Netzes Vorliegen.

Die Anzahl an Kultivationsbehältern, die in eine Kulturkammer gegeben wird, kann beliebig variiert werden. Man kann die Kulturkammern so bauen, daß sie nur wenige, beispielsweise 1 bis 10, Kultivationsbehälter aufnehmen können, man kann sie aber auch so bauen, daß viele, beispielsweise bis zu mehre^ren 100, Kultivationsbehälter in einer Kulturkammer gleichzeitig Platz haben. Die Größe und die Form der Kulturkammern hängt beispielsweise auch von der Größe der Kultivationsbehälter und von dem beabsichtigten Zweck der Kultivation ab.

Die einzelnen Kulturkammern sind an einer bewegbaren Vorrichtung befestigt. Man kann beliebig viele Kulturkammern gleichzeitig an einer solchen Vorrichtung befestigen. Als bewegbare Vorrichtung kann man beispielsweise einen drehbaren Tisch verwenden. Der drehbare Tisch kann so gebaut sein, daß er rund ist und sich im Innenkreis eines ringförmigen zweiten Tischs befindet, der gleichhoch ist und auf dem sich beispielsweise die Meßinstrumente befinden können.

Die bewegbare Vorrichtung kann aber auch so gebaut sein, daß die einzelnen Kulturkammern von oben nach unten oder von der einen zur anderen Seite bewegt werden.

Die Anordnung der einzelnen Kulturkammern kann so gewählt werden, daß sie beispielsweise nebeneinander, hintereinander, aufeinander usw. angeordnet sind. Es ist auch möglich, die Kulturkammern mäanderförmig anzuordnen. Eine solche Anordnung ist beispielsweise dann zweckmäßig, wenn man als bewegbaie Vorrichtung einen drehbaren Tisch verwendet.

Die Bewegung der Kulturkammern ist z. B. durch eine Karte oder ein Magnetband vorprogrammiert wie auch die Verweildauer in einer jeweiligen Position, die erforderlich ist, um die gewünschte Sauerstoffdruck- und Kohlendioxyddruck-Einstellung zu ermöglichen.

Der Zufluß jeder Kulturkammer liegt zentral, der Abfluß peripher.

Jede Kulturkammer enthält eine Tür zum Einschieben und zum Entfernen von Kultivationsbeuteln, und jede Kulturkammer ist an zwei sich gegenüberliegenden Seiten mit einem Qüafzfenster ausgerüstet; durch das in der Kontrollposition ein Lichtstrahl geht.

Bei dieser Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens versetzt man das Kulturmedium mit einem pH-Indikator, um so pH-Veränderungen als Veränderungen der Absorption des pH-Indikators zu bestimmen. Dieses Signal wird verstärkt und verstärkt oder vermindert den Zufluß von Kohlendioxyd, bis der pH-Wert wieder den gewünschten Wert erreicht hat.

In Pig.3 ist eine beispielhafte Ausführung für ein Verfahren zur Massenkultivatiön von Zellen und Geweben dargestellt.

Die Kulturkammer, die im Querschnitt gezeigt ist und in der sich die Kultivationsbehälter auf einem Drahtträger befinden, steht in Kontrollposition. Durch sich gegenüberliegende Fenster der Kulturkammer wird ein Lichtstrahl über Spiegel und Fokussierlinsen geleitet. Durch diesen Lichtstrahl werden nach entsprechender Verstärkung Einlaßventile für Stickstoff und Kohlendioxyd gesteuert.

Um festzustellen, wie weit das Zeil- oder Gewebewachstum fortgeschritten ist, wird weiterhin die Trübung oder die Absorption bei einer bestimmten Wellenlänge, beispielsweise bei 256 ιπμ, gemessen, wobei man entsprechend vorprogrammierte Filter oder entsprechend vorprogrammierte Monochromatoren verwendet.

Über Elektroden wird der Kohlendioxyd- und der Sauerstoffdruck in der Kulturkammer bestimmt, und wenn der Kohlendioxyddruck in einer bestimmten Kulturkammer eine zu niedrige [HCO3-] anzeigt, dann entsteht ein Signal, was bedeutet, daß ein Mediumwechsel angezeigt ist

Man kann für jede einzelne Kulturkammer so die verschiedensten Verfahrensbedingungen wie den Sauerstoffdruck, den Stickstoffdruck, den Kohlendioxyddruck usw. variieren.

In Fig.4 der Abbildung ist eine beispielhafte Ausführung für ein Verfahren zur Massenkultivatiön von Zellen und Geweben dargestellt, wobei die einzelnen Kulturkammern mäanderförmig angeordne' sind. Die Zeichnung ist eine Draufsicht auf ein mögliches »Karussell«.

Ein besonderer Vorteil des Verfahrens der Erfindung besteht darin, daß die normalen Zellen aus höheren Organismen an der Grenze zwischen Gasphase und Flüssigkeitsphase kultiviert werden können, zugleich aber die Gefahr einer Kontamination aus der Gasphase ausgeschlossen ist

Hierzu 4 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Massenkultivation von Zellen und Geweben von Menschen oder Tieren, dadurch gekennzeichnet, daß man unter Verwendung eines Behälters für die Zellen, der aus einem Kunststoffilm besteht, der biologisch völlig inert, gasdurchlässig, transparent, thermoplastisch, UV-Licht-durchlässig und an der Innenseite chemisch so aufgerauht ist, daß er zur Haftung der Zellen ausreichend hydrophil ist, den Sauerstoffdruck in der Gasphase des Brutschranks mißt, durch elektronische Rückkopplung ein Ventil steuert, wodurch der Sauerstoffdruck auf einem vorher festgelegten Wert konstant gehalten wird, den pH-Wert in dem Kulturmedium mit einer Elektrode mißt und. wenn der pH-Wert um mehr als 0,05 pH-Einheiten vom eingestellten und gewünschten pH-Wert abweicht, ein Einlaßventil für Kohlendioxid öffnet "der schließt, wodurch die Kohlendioxidzufuhr veresärkt oder vermindert wird, bis der pH-Wert wieder den gewünschten Wert erreicht hat, wobei man, um den Sauerstoffdruck konstant zu halten, in dem Maße, wie der Zufluß von Kohlendioxid erhöht oder erniedrigt wird, in reziproker Weise durch ein entsprechend gekoppeltes Ventil den Stickstoffzufiuß erniedrigt oder erhöht, den Kohlendioxiddruck im Gasraum des Brutschranks mißt und, sobald der Druck einen bestimmten Wert überschreitet, neues Medium zupumpt und das alte Medium entfernt

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man zur DurchT/hrung von Vielfachansätzen mehrere bewegliche Kulturkammern verwendet, die, außer wenn sie sich ;i der Kontrollposition, in der die Begasung erfolgt, befinden, gasdicht sind.