DE2238479A1

DE2238479A1 - Chemisches analysesystem

Info

Publication number: DE2238479A1
Application number: DE2238479A
Authority: DE
Inventors: Gerald L Paulson; Robert A Ray
Original assignee: Beckman Instruments Inc
Current assignee: Beckman Coulter Inc
Priority date: 1971-08-06
Filing date: 1972-08-04
Publication date: 1973-02-15
Also published as: DE2238479C3; GB1395223A; SE389736B; DE2238479B2; DK150805C; IT974628B; JPS5647497B2; CA972810A; JPS4829495A; CH583904A5; US3765841A; DK150805B

Description

Patentanwälte Dipl. Ing. C. Wallach

Dr. T. Haibach 13 803 -4, Aug. 1972

8 München 2 Kaufingerstr. 8, Tel. 240275

Beckman Instruments, Inc. Fullterton, Calif,, USA

Chemisches Analysesystem

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur chemischen Analyse und im besonderen ein Verfahren und eine Vorrichtung zur quantitativen Bestimmung der Konzentration von mit Enzymen reagierenden Substanzen.

Ein allgemeines Feld innerhalb des Anwendungsbereichs der vorliegenden Erfindung ist 'άί@ chemische Analyse von biologischen Substanzen zur Bestimmung deren chemischer Zusammensetzung. Beispielsweise ist es üblich, die Konzentration von Glukose im Blut oder Urin zu bestimmen, da die Konzentration der Glukose in diesen Körperflüssigkeiten eine Anzeige für die Tätigkeit verschiedener grundlegender Körperfunktionen ist. Ein anderes übliches Verfahren ist die Bestimmung der Konzentration von Harnstoff im Blutserum, da die Konzentration von Harnstoff in dieser Körperflüssigkeit eine Anzeige für die Nierenfunktion ist·

Die meisten heute verfügbaren Analysesysteme zur Bestimmung der chemischen Zusammensetzung von biologischen Substanzen beruhen auf kolorimetrischer Analyse. Beispielsweise beruht ein bekanntes Verfahren für die enzymatische Bestimmung der Glukose im Blut und Urin auf der Oxydation der Glukose im Blut mit dem Enzym Glukose-Oxydase unter Bildung von Wasserstoffsuperoxyd und Glukonsäure. Ein derzeitig verfüg-

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barer chemischer Analysator beruht auf der spektralphotometrischen Messung der Farbreaktion zwischen Wasserstoff* superoxyd, Peroxydase und einem Chromogen. Bin weiteres Beispiel wäre die Bestimmung von Harnstoff im Blut durch Reaktion des Harnstoffs mit dem Enzym Urease unter Bildung von Ammoniumcarbonat, unter Verwendung von kolorlnetrisohen Verfahren zur Bestimmung der Intensität des Reaktionsprodukts.

Wenngleich derartige kolorimetrisohe Analyseverfahren genaue Anseigen der Konzentration eines Bestandteils in einer Probe zu liefern vermögen, sind mit diesen Verfahren verschiedene Probleme verbunden. Zum einen unterliegen die meisten kolorimetrischen Verfahren erheb11ch/störungen und Einflüssen, welche die Anzeigegenauigkeit ganz erheblich beeinträchtigen können. Beispielsweise kann bei der enzymatischen Analyse von Glukose im Blut und Urin durch Oxydation von Olukose mit Qlukose-Oxydase das starke Oxydationsmittel Wasserstoffsuperoxyd mit anderen reduzierbaren Substanzen reagieren, und andere Unreinheiten überlagern sieh der Peroxyd-Peroxydase-Reaktion, was eine entsprechende Einbuße an Selektivität und Genauigkeit bedingt. Außerdem 1st bei den verfügbaren kolorimetrlsohen Analysesystemen eine Messung der Farbintensität des Produkts nach Abschluß der Reaktion erforderlich. Die Analyse ist daher leitraubend. Außerdem kann die Analyse häufig nicht ohne vorherige Entprotelhisierung der Blutproben oder Vorreinigung der Urinproben durchgeführt werden.

Für einige enzymatische Reaktionen wurde die Verwendung von Leitfähigkeitsmessungen zur Bestimmung der Konzentration eines Bestandteiles in einer Probe vorgeschlagen. Näherhin tritt in bestimmten enzymatischen Reaktionen eine

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änderung von einer nicht-ionischen in ©ine ionische Stoffr art oder von einer ioaisetien in eine nicht-ionische Stoffart auf. In derartigen Fällen dient die Wechselstromleitfähigkeit des Mediums als ©in direktes Mai für das Ausmaß der Reaktion,.und die Knuerungsgesehwindigkeit der Wechselstromleitfähigkeit mißt die Reaktionsgeschwindigkeit. Da die Reaktionsgeschwindigkeit direkt proportional den Konzentrationen bestimmter Reaktionst@iln@hme-r, wie beispielsweise des Enzyms und des Substrats, ist, können die.Konzentrationen dieser Bestandteil© dureh Messung der Änderungsgeschwindigkeit der Weehselstromleitfähigkeit überwacht und festgestellt werden.

Ein Beispiel für diesen Reakfcionstyp ist die beim Mischen von Harnstoff enthaltendem Blut mit de» Enzym urease stattfindende Reaktion. Der nicht-ionische Harnstoff in dem Serum reagiert mit dem Enzym Urease unter Bildung vq» ionischem Ammoniumcarbonat. Ausmaß und Geschwindigkeit der Ammoniumcarbonat bildung sind proportional der Harnstoffmenge in der Serumprobe. Da Ammoniumcarbonat ionisch ist, ändert sich die Wechselstromleitfähigkeit der Lösung mit einer der vorliegenden Harnstoffmenge proportionalen Geschwindigkeit.

In der US-Patentschrift 3 421 982 ist ein System zur Messung dieser Änderung der Wechselstromleitfähigkeit für Zwecke der enzymatischen Analyse vorgesehlagen. Bei diesem System werden herkömmliche Leitfähigkeitselektroden sowie bisher übliche Urease-Pegel zur Erzielung einer konstanten Änderungsgeschwindigkeit der Konzentration mit der Zeit verwendet. In der genannten Patentschrift ist angegeben, daß die Umwandlung des Substrats einige Minuten lang vor sich geht, daß jedoch die Änderungsgeschwindigkeit der Leitfähigkeit in der ersten Minute im wesentlichen linear ist. Diese Be-

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dingungen sind erforderlich, um ein Zweipunkt-kinetisches Verfahren sinnvoll anwenden zu können, mit einer angemessenen Annäherung an die zu bestimmende Reaktionsgeschwindigkeit durch Nessung der Über ein festes Zeitintervall innerhalb des linearen Bereichs der Reaktion auftretenden endlichen Leitfähigkeitsänderung. Mathematisch stellt dies eine Messung von ?r dar, worin AC die Änderung der Leitfähigkeit während des festen ZeitIntervalls At ist, das etwa eine Minute beträgt. Dieses bekannte System ist daher umständlich, zeitraubend und unterliegt Ungenauigkeiten.

In der US-Patentschrift ....... (US-Patentanmeldung Serial

No. 618 859 vom 27. Februar 1967» Anmelder James C. Sternberg, übertragen an die vorliegende Anmelderin und betreffend einen "Rate Sensing Batch Analyzer") ist ein System vorgeschlagen, das nioht nur die den bekannten kolorimetrisohen Analysesystemen anhaftenden Probleme sondern auch die vorstehend erwähnten Probleme des auf Leitfähigkeitsmessung beruhenden Systeme nach der US-Patentschrift 3 421 982 löst. Der Sternberg-Analysator gibt ein einfaches Verfahren zur raschen Gewinnung quantitativer Information über eine Reihe chemischer und insbesondere biologischer Proben an Hand. Mit diesem Analysator läßt sich die Konzentration von mit Enzymen reagierenden Substanzen rasch und genau und unter Verwendung kleiner Probenmengen bestimmen. Der Sternberg-Analysator beruht auf der Messung der wahren momentanen Reaktionsgeschwindigkeit in sehr frühen Stadien der Reaktion, bevor ein größerer Anteil der Reaktanten verbraucht ist. Das aufgezeichnete Geschwindigkeitssignal weist eine scharf , definierte Soheitelspitze auf, welche der scheinbaren Maximumgesohwindigkeit entspricht und direkt proportional der Anfangskonzentration ist. Das scheinbare Maximum der

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Reaktionsgeschwindigkeit wird in einem verhältnismäßig kurzem Zeitintervall erhalten, wodurch Analysezeit gespart wird und mehr Proben in einem gegebenen Zeitintervall vermessen werden können· Bei Anwendung zur direkten Bestimmung des Sauerstoffverbrauche in einer Qlukoae-Oxydaae - Glukose-Reaktion ist bei diesem System keine vorherige Reinigung oder Entproteihisierung der Blut-, oder Urinproben erforderlieh; das System liefert sehr genaue Ergebnisse auf absoluter Basis und ist für viele Unreinheiten, die bekanntermaßen ' ,viele anderweitige Analyseverfahren störend beeinträchtigen, unempfindlich.

Während somit der Rate Sensing Batch Analyzer nach Sternberg gemäß der erwähnten US-Patentschrift (Serial No. 618 859 vom 27» Februar 1967) die bei den bekannten zuvor diskutierten Systemen auftretenden Probleme löst, hat sich ergeben, daß der Sternberg-Analysator für viele Enzymreaktionen nicht ideal geeignet ist. Beispielsweise wird bei dem Sternberg-Analysesystem . die Menge von Glukose im Blut oder Urin unter Verwendung eines Sauerstoff-Meßfühlers zur Messung der Oxydationsgeschwindigkeit von Glukose mit Glukose-ÖüiyOaee unter Bildung von Wasserstoffsuperoxyd und Glukonsäüre bestimmt. Die Reaktion kann so kontrolliert werden, daß bei der Einbringung der Probe in Lösung mit dem Reagenz keine anfängliehe Änderung des Sauerstoffpegels auftritt. Andererseits kann bei der Bestimmung der Konzentration von Harnstoff in Blutserum durch Reaktion des Serums mit Urease unter Bildung von Ammoniumcarbonat offensichtlich kein Sauerstoff-Meßfühler tür Überwachung der Reaktion verwendet werden. Bei Verwendung «Ines Leitfähigkeit«-Meßfühlers zur Messung der Leitfähigkeitsänderung der Lösung ergeben sich Probleme in Zusammenhang mit der Messung des Maximum-Werts der Zeit- *bleitung der Ausgangsgröße des Meßfühlers, wie dies in der

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Sternberg-US-Anmeldung Serial No. 618 859 vom 27. Februar 1967 besahrieben ist. Die Schwierigkeiten beruhen darin, daft das Blutserum selbst leitend ist und daher eine große Leitfähigkeitsänderung in der Lösung bei der Zugabe des Serums su dem Reagens auftritt. Dieser augenblickliche sprunghafte Anstieg der Leitfähigkeit der Lösung fuhrt sum Auftreten eines gegen unendlich gehenden Maximum-Werts der seitliehen Xnderungsgeschwindigkeit der Leitfähigkeit, ao daß keine sinnvolle, auswertbar«} Ausgangsgröße erhalten werden kann.

Der vorliegenden Erfindung liegt daher als Aufgabe die Sohaffung eines Verfahrens und einer Vorrichtung sur chemischen Analyse zugrunde, mit deren Hilfe nicht nur.die von dem Sternberg-Analysesystem gelüsten Probleme der bekannten Systeme gelöst werden, sondern die ein Analysesystem darstellen, das auf eine breitere Vielfalt von Ensymereaktionen anwendbar ist als das Sternberg-Syst em. Das Verfahren und die Vorrichtung gemäß der Erfindung sollen ein· raten« Bestinnung der Konsentration eines Bestandteils in einer Probe, wie beispielsweise biologischen Flüssigkeiten, gestatten· Die Vorrichtung soll sich sum schnellen Aufbau und cur raschen Inbetriebnahme eignen und eine rasohe und genaue Bestimmung der Meßwerte unter Verwendung kleiner Proben und Messung der wahren Konsentration gestatten.

Das Verfahren und die Vorrichtung gemäß der Erfindung beruhen auf der Messung der wahren momentanen Geschwindigkeit in einem sehr frühen Stadium der Reaktion vor dem Verbrauoh der Reaktanten; selbst bei gasförmigen Reaktanten kennen die Reaktionen an der offenen Atmosphäre ablaufen, da die für die Anseige wesentlichen Daten gewonnen werden, bevor eine Rückdiffusion von Gas in die Lösung die Ergebnisse

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beeinflussen kann. Das Verfahren unä die Vorrichtung gemäß der Erfindung beruhen auf der Erkenntnis, daß die Einbringung der Probe in die Lösung mit dem Reagens eine !!©montane Änderung der der Messung zugrundegelegten eha3rakfc©ri,3ti&ch©n Eigenschaft der'Lösung verursachen kann» Demgemäß wird nach dem Grundgedanken der vorliegenden Erfindung die Messung des die Änderungsgeschwindigkeit darstellend©!·! Signals während einem vorgegebenen festen Zeitintervall, beginnend mit te»-Einbringung der 'Probe in das Reagens, gesperrt, wobei diese®. Zeitintervall hinreichend gi°©B gewählt wird, um die Auswirkung" der erwähnten momentanen Änderung in d@r Lösusag zu eliminieren sowie eine gründlieh© Durehmischung d©r Prob® mit dem Reagenz eu gewährleisten. Unmittelbar «aeh d@m Ablauf das fest vorgegebenen "Zeitintervalle wird erfindungsgemäß <ä©£» B@fes?ag der Änderungsgeschwindigkeit der Reaktion

Die Erfindung schafft ain Verfahren-und eiae ITorrishtung aur Bestimmung der Konzentration eines B@@tandteil@ss in einer Probe, beispielsweise der Konzentration v&n Härmstoff in biologischen Flüssigkeiten, wie beispielsweise Blutserum, wQbei die Probe nach der Einbringung in Lösung mit dem Reag©ms mit diesem reagiert und eine anhaltend® Änderung in einer eha^akteristisehen Eigenschaft der Lösung verursacht, wobei die Reaktionsgeschwindigkeit eine Anzeige für die Konzentration des Bestandteils in der Probe ist. Zur überwachung der charakteristischen Eigenschaft der Lösung und mir Erzeugung eines hierzu proportionalen ersten elektrischen Ausgangssignals ist ein Meßfühler vorgesehen. Eine Differenzierschaltung erzeugt ein der Zeitableitung des ersten Signals proportionales zweites elektrisches Signal, wobei dieses Zeitableitungssignal eine Anzeige für die Konzentration des Beatandteiles in der Probe darstellt.

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Die vorliegende Erfindung trägt auch den Pillen Rechnung, wo eine große momentane Änderung der der Messung zugrundegelegten charakteristischen Eigenschaft der Lösung bei der Zugabe der Probe stattfindet. Nach dem Grundgedanken der Erfindung ist daher eine Vorrichtung vorgesehen, welche die Meβsung des Betrags des Zeitableitungesignals in einem vorgegebenen, festen Zeitintervall nach der Zugabe der Probe in das Reagenz gewährleistet, um die Auswirkung der momentanen Xnderung der Charakteristlochen Eigenschaft der Lösung su eliminieren und eine gründliche Durchmisehung der Probe mit dem Reagens su gewährleisten« Auf diese Weise eignet sich das erfindungsgemäße System sur Bewältigung eines Reaktionsablaufs, in welchem auf eine große momentane Änderung in der Lösung, die für -en Meßvorgang ohne Xnteres&e ist, eine kleinere und langsamere Änderung folgt, die Signifikanz als Anzeige für die Konzentration des interessierenden Bestandteiles besitzt.

Durch die vorliegende Erfindung vrird somit ein Verfahren und eine Vorrichtung sur chemischen Analyse und näherhin zur quantitativen Bestimmung der Konzentration von Substanzen, die mit Enzymen reagieren, geschaffen. Die Erfindung gestattet die Bestimmung der Konzerttration einer mit einem Enzym reagierenden Substanz durch tfeasung des Betrags der Reaktionsgeschwindigkeit nach einem vorgegebenenen festen Zeitintervall nach der Einbringung der Substanz in das Enzym. Insbesondere gestattet die; Erfindung die Messung der Konzentration von Harnstoff im Blut;serum. Die Erfindung gestattet eine rasche und genaue Messung enssymatischer Reaktionen mit geringen Probenvoluiciria.

Die Erfindung betrifft auch eine Elektrode sur Messung der Wechselstromleitfähigkeit.

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Im folgenden werden Ausführoangsbeispiele der Erfindung an Hand der Zeichnung beschrieben; In dieser zeigen;

Pig. 1 eine graphische Darstellung der Sauerstoff (O₃) Konzentration als Funktion der Zeit (t) in einer Glukoseoxydase-Qliikose-Risaktien,

Pig, 2 eine graphische Darstellung der zeitlichen Ab2

leitung der Sauerstoffkonzentration 2 für die

Reaktion gemäß Pig. i,

Pig. 3 eine graphische Darstellung der tfeehsalstromleitfähigkeit (C) als Funktion der Zeit (t) für bestimmte Engym-Heakfeiosatm_s wie beispielsweise eine Hasmstof f -

die Pig. 4 bis 6 graphisehe Darstellungen der Knderungsgeschwindigkeit der Weßha@l3trcmleitfähigkeit || in Abhängigkeit von der Zeit (t) für dan Pall der graphischen Darstellung mm Pig. 3» und zwar aur Veranschauliehung dr©i@r alternativer Verfahren zur Messung d@r G^öße des itnderungsgesshwindigkeits" signals nach einem vorgegebenen festen Zeitintervall nach der Einbringung der Probe in das Reagenz.

Pig. 7 ein vereinfachtes Bloeksshema einer Vorrichtung gemäß ainer baversugt©« AuiifUhriingsform tier Erfindung,

Pig. 8 ein Teilblßöksehana mn· 7ox*a»soh&iiliehung ainsr Modifikation der Vori'i^h^uug a.Uii Pig. 7

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Fig. 9 In teilweise geschnittener Ansieht eine bevorzugte Auaflhrungs form eines Probenbechers zur Verwendung in der Vorrichtung nach Fig. 7

Fig. 10 in Seitenansicht eine bevorzugte Ausführungsform eines Meßfühlers sur Verwendung in der Vorrichtung nach Fig. 7

Flg. 11 eine Stirnansicht des Meßfühlers aus Flg. 10. Zn der eingangs erwähnten US-Patentschrift

(US-Patentanmeldung Serial No. 6l8 859 vom 27. Februar 1967» Anmelder James C. Sternberg, Obertragen auf die vorliegende Anmelderin) ist ein einfaches und bequemes Verfahren sur schnellen Bestimmung der Konsentration von mit Enzymen reagierenden Substanzen durch Messung der wahren augenblicklichen Reaktionsgeschwindigkeit in sehr frühen Stadien der Reaktion beschrieben. Beispielsweise wird sur Bestimmung des Olukosegehalts im Blut oder im Urin bei diesem Analysator eine Messung der Oxydationsgeschwindigkeit von Olukose mit Qlukose-Oxydase unter Bildung von Wasserstoffsuperoxyd und Qlukonsäure ins Auge gefaßt. Die Messung erfolgt durch Anbringung eines Säuerstoff-Meßfühlers in einem Probenbehälter und Messung der Xnderungsgesohwindigkeit der Sauerstoffkonzentration.

In Fig. 1 der vorliegenden Zeichnung habe im Zeitpunkt t_Q vor der Einbringung der Olukose-haltigen Prob· In die Sauerstoff-haltige Qlukose-Oxydase der O-~Pegel einen Betrag von O₉ . Nach dar Einbringung der Probe im Zeitpunkt . 1 ■

t. folgt der Sauerstoff-Pegel einer Kurve 10, die asymptotisch abnimmt. Wird die Ausgangsgröße das Sauerstoff-Meßfühlers einer DifferenslersehaltutiK sugoführt, so läßt sich

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ein elektrisches Signal gewinnen, das die seitliche Ableitung des Säuerstoff-Konzentr&tionssignals und damit proportional zur seitlichen Xaderungagesehwlnciigkeit der Sauerstoffkonzentration ist. In Fig» 2 stellen die Kurven 11, 12 und 13 drei möglich® Ausgangsgrößen einer derartigen Differenzierschaltung dar. Im einzelnen steigt die durch Differentiation der Ausgangsgröße des Sauerstoff-Meßfühlers erhaltene Zeitableitung zunächst auf ein Maximum an und nimmt sodann mit abnehmender Reaktionsgeschwindigkeit ab. Der Betrag des Maximums de« die zeitlieh© Änderung©geschwindigkeit darstellenden Ausgangssignals ist direkt proportional der anfänglichen Konzentration der Glukose und stellt ein einfaches, rasches und genaues Ausgangssignal dar.

Viele andere weitere enzymatisch© Reaktionen sind solcher Art, daß die Einbringung der Probe in Lösung mit dem Reagenz keine momentane Änderung der für die Messung zugrundegelegten Eigenschaft der Lösung bewirkt, derart, daß das erwähnte Sternberg-Verfahren anwendbar ist. Andererseits bewirkt in manchen enzymatisehen Reaktionen die Einbringung der Probe in Lösung mit dem Reagenz eine momentane, augenblickliche Änderung der charakteristischen Eigenschaft der Lösung, die gemessen werden soll. Beispielsweise kann man die Harnstoff konzentration in Blutserum dadurch bestimmen, daß man das Serum mit der Enzym-Urease unter Bildung von Ammoniumcarbonat zur Reaktion bringt. Die Geschwindigkeit der Ammoniumcarbonatbildung ist proportional d©r Harnstoffmenge' in der Serumprobe. Da das Serum anfänglich nichtionisch ist und da Ammoniumcarbonat ionischen Charakter hat, ändert sich die Wechselstrom-Leitfähigkeit der Lösung mit einer der vorliegenden Harnstoffmenge proportionalen Geschwindigkeit. Jedoch treten bei der Messung des Maximumwerte der Ausgangsgröße eines Wechselstrom-Leitfähigkeit-

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meßfühlere Probleme auf, da das Blutserum selbst leitfähig ist und daher eine große Leitfähigkeitsänderung in der Lösung bei der Zugabe des Serums zu dem Reagenz auftritt.

In Fig. 3 veranschaulicht die Kurve 15 die Änderung der Vechseletromleitfähigkeit mit der Zeit, bei Messung mit einem in einem Probenbehälter eingebrachten Leitf&higkeits-Meßfühler. Im Zeitpunkt t_Q, bei leerem Behälter, hat die Wechselstromleitfähigkeit einen Wert C_Q » 0. Im Zeitpunkt t~, in welchem der Probenbehälter mit der Enzym-Urease gefüllt wird, springt die Wechselstromleitfähigkeit infolge der Leitfähigkeit des Reagenz auf einen Wert C₁. Im Zeitpunkt %₂ der Einbringung des Serums in.den Probenbehälter tritt infolge der Leitfähigkeit des Blutserums ein Sprung der Leitfähigkeit auf einen Wert C. auf. Danach steigt die Leitfähigkeit asymptotisch auf einen Maxlmumwert C„ an, wobei die Leitfähigkeit sänderung von C- auf C, durch die Ammoniumcarbonat-Bildung verursacht wird.

Wie auf Fig. 4 ersichtlich, steigt infolge des momentanen Sprungs der Lösungeleitfähigkeit im Zeitpunkt t_o die

de Änderungsgeschwindigkeit ^ der Weeheelstromleitfähigkeit

anfänglich sprunghaft auf Unendlich an, wie durch die gestrichelte Kurve 16 angedeutet ist. Nach dem Zeltpunkt t,

de nimmt ^r asymptotisch längs der gestrichelten Kurve 17 ab. Für den Fachmann ist klar, daß dieser momentane Sprung in der Lösungsleitfähigkeit im Zeitpunkt t« ein scheinbares

AC

Maximum von jjr gegen Unendlich erzeugt, derart, daß ein System, das auf der Messung des Masiimumwerts der zeitlichen Xnderungsgesohwindigkeit der Meßfühler«usgarigsgröfce beruht, kein brauchbares Ausgangssignal zu liefern vermag.

In Fig. 7 ist ein vereinfachtes Blockschaltbild der Vor-

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richtung zur chemischen Analyse naeh dem erfindungsgemäßen Verfahren. Die als Ganzes mit 20 bezeichnete Apparatur weist einen Probenbehälter 21 auf, in welchem die Enzym-Reaktion stattfindet. 0er Probenbehälter 21 kann eine beliebige unter vielen bekannten Konfigurationen besitzen, er weist eine Vorrichtung zur Zufuhr des Hoagenz und der Probe sowie auch Mittel für eine grUndliehe Durchmischung der Lösung auf. Eine bevorzugte Ausführungsform des Probenbehälters 21 wird weiter unten an Hand v©n Fig. 9 beschrieben.

In dem Probenbehälter 21 erstreckt sish ein Meßfühler 22 zur überwachung einer charakteristischen Eigenschaft der Lösung oder eines Reaktionspartaer oder -Produktes; der Meßfühler erzeugt auf einer Leitung 23 ein dieser- charakteristischen Eigenschaft proportionales erstes elektrisches Ausgangssignal. Als Meßfühler 22 kommt jeder beliebige derartige Meßfühler in Betracht, beispielsweise der Sauerstoff-Meßfühler bei der zuvor genannten Sfc©rnbsrg-Anra@ldung oder ein spektralphotometriseher Meßfühler oder dgl. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Meßfühler 22 ein Leitfähigkeits-Meßfühler von weiter unten an Hand der Fig. 10 und 11 näher beschriebener Art mit in Abständen voneinander angeordneten ersten und zweiten Elektroden zur Messung der vfechselstromleitfähigkeit der Lösung in dem Probenbehälter 21.

Aus einem Oszillator 24 wird der einen Elektrode des Meßfühlers 22 eine Wechselspannung konstanter Amplitude zugeführt. Die Ausgangsgröße des Oscillators 24 kann eine symmetrische Schwingung von beliebiger Wellenform, d.h. eine Sinus-, Hechteck-, Dreieck- usw. Schwingung von jeweils gewünschter Frequenz, in Abhängigkeit von den Schaltungsparametern, sein, wia weite!· untesi noch im einzelnen be-

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schrieben wird. Die Änderung der Weehselstromleitfähigkeit der Lösung ruft eine Xnderung des Stroms in der mit der anderen Elektrode des Meßfühlers 22 verbundenen Leitung 23 hervor; dieser Strom trii;t als eine Amplitudenmodulation des von dem Oszillator 24 gelieferten Qrundfrequenzsignals auf.

Das von dem Meßfühler 22 gelieferte Amplituden-roodulierte Signal wird einem Demodulator 25 zugeführt, der eine der Wechselstromleitfähigkeit dor Lösung in dem Behälter 21 proportionale Gleichspannung auf der Leitung 26 erieugt. Die Leitung 26 ist mit einem Pestkontakt 27 eines Schalters 28 verbunden, der einen beweglichen Schalterkontakt 29 aufweist. Der bewegliche Kontakt 29 ist mit einer Anzeigebzw. Wiedergabevorrichtung 30, beispielsweise einen digitalen Voltmeter, verbunden.' Daher kann durch Schließen des beweglichen Kontakts 29 des Schalters 28 mit dem .Festkontakt 27 die der Wechselstromleitfählgkeit der Lösung proportionale Oleichspannung direkt an der Anzeige- bzw. Wiedergabevorrichtung 30 ausgelesen werden. Dieses Signal würde als Kurve 15 in Fig. 3 auftreten. Diese Maßnahme gestattet eine überwachung der jeweiligen tatsächlichen Wechselstrom-Leitfähigkeit der Lösung in dem Probonbehälter 21, zur Bestimmung der Werte von C_Q, C₁, C₂ und Oy

Die der Weohselstromleitfähigkeit proportionale Qleiohspannung auf der Leitung 26 wird ferner auch einer Differensierschaltung 31 zugeführt, die an einer Leitung 32 ein der Zeitableitung des auf der Leitung 26 zugeführten Wechselstrom-Leitfahigkeitssignals proportionales elektrisches Ausgangssignal erzeugt. Das elektrische Signal auf dir Leitung 32 ist somit proportional der zeitlichen Änderungsgeeohwindigkeit der WeohselstromleitfähUjkeit der lösung in

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dem Probenbehälter 21-uad damit direkt proportional der Konzentration der Reaktionstellnehmep in dem Probenbehälter

Man erkennt, daß die Apparatus» 2© die überwachung einer großen Klasse von ©najrraatisehen Reaktionen gestattet, beispielsweise solcher Reaktionen, fo®i den@n eine Änderung von einem nicht-ionischen Stoff in ein® ionische Stoffart oder umgekehrt auftritt, wie des näheren in d®r erwähnten US-Patentschrift ....... (US-Pat©n%araa©ldung Serial No. 618*859 von Sternberg) beschrieben ist. Eins derartige Reaktion findet beispielsweise statt, wenn Harniteff-haltiges Blutserum mit der Enzym-Urease untar Bildung von Ammoniumcarbonat zur Reaktion gebracht wird. Da der Harnstoff anfänglich nicht-ionisch ist und da Ammoniumcarbonat ionisch ist, ändert sich, wie weiter oben beschrieben, die Wechselstromleitfähigkeit der Lösung, und zwar mit einer der anfänglichen Harnst off konzentrat ion proportionalen Geschwindigkeit«

Wiederum an Hand der Fig. 3 und H veranschaulicht die Kurve 15 die Ausgangsgröße des Demodulators 25 auf der Leitung 26 in Abhängigkeit von der Zeit. Im Zeitpunkt t , bei leerem Probenbehälter 21, besitzt die Leitfähigkeit den Wert C_Q * O. Xm Zeitpunkt t* wird ein die Ensym Urease enthaltendes abgemessenes Reagenzvolumen in den Probenbehälter 21 eingebracht, wobei es den Meßfühler 22 vollständig bedeckt. Sobald dies der Fall ist, steigt die Wechselstromleitfähigkeit auf der Leitung 26 infolge der Leitfähigkeit des Reagenz sprungartig auf einen Wert C₁ an. Eine genauere Diskussion des Reagenz folgt -weiter unten. Sodann wird ein sehr kleines Volumen dee Probeserums in den Probenbehälter 21 im Zeitpunkt t₂ eingebracht und mit dem Reagenz gemischt. Dementsprechend tritt, wie in Fig. 3 dargestellt, im Zeltpunkt t_g

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infolge der Leitfähigkeit des Blutserums ein momentaner sprunghafter Anstieg der Leitfähigkeit auf einen Wert C₂ auf. Außerdem reagiert der nicht-ionische Harnstoff mit der Urease unter Bildung von Ammoniumcarbonat, und zwar mit einer Geschwindigkeit, die proportional dem Harnstoff* gehalt in der Probe ist. Dementsprechend steigt die Leitfähigkeit weiter bis zum Erreichen eines Maximumwertes C, an.

Die Differenziervorrichtung 31 liefert eine der Xnderungsgeschwindigkeit der Wechselstromleitfähigkeit proportionale Ausgangespannung. Infolge des augenblickliehen sprunghaften Anstiegs der LOsungsleitfähigkeit im Zeitpunkt t- steigt die Xnderungsgesohwindigkeit der Leitfähigkeit anfänglich sprungartig gegen Unendlich an (gestrichelte Linie 16), wodurch eine Messung des Maximumwertes der zeitlichen Anderungegeschwindigkeit verhindert wird. Gemäß der Erfindung wird jedoch die Ausgangsgröße auf der Ausgangsleitung 26 des Demodulators 25 einer Xnderungs-Fühlschaltung 35 zugeführt, welche die sprunghafte Änderung der Leitfähigkeit bei Zugabe der Serumprobe feststellt und in Abhängigkeit hiervon ein elektrisches .Signal auf einer Leitung 36 als Anzeige für diese sprunghafte Xnderung erzeugt. Alternativ kann die Ausgangsgröße auf der Leitung 26 des Demodulators 25 einer (nicht dargestellten) Leitfähigkeitspegel-Pühlsohaltung sugeführt werden, welche die sprunghafte Xnderung der Leitfähigkeit bei Einbringung der Probe fühlt und ebenfalls ein elektrisches Signal als Anzeige einer derartigen sprunghaften Xnderung erzeugt. In jedem Falle wird das Signal auf der Leitung 36 einer Zeitverzögerungsschaltung 37 zugeführt, die auf eine Leitung 38 ein elektrisches Steuerbzw. Regelsignal erzeugt, wobei sich eine charakteristische Größe dieses Signals nach einem vorgegebenen festen Zeit-

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Intervall ändert. Die Länge dieses festen Zeitintervalls wird auf der Grundlage mehrerer Überlegungen gewählt. Zum einen wird das Zeitintervall so gewählt, daß es genügend lang ist, um zu gewährleisten, daß die durch den Leitfähigkeitssprung bedingten Sprung- bzw. Übergangsvorgänge hinreichend abklingen können, um eine genaue Messung der Leitfähigkeitsähderungsgeschwindigkeit zu ermöglichen. Das Zeitintervall wird ferner auch so gewählt, daß anderweitige Übergangs- und Einschwingvorgänge, wie beispielsweise ein Temperaturstau und dergl., eliminiert werden können. Schließlich wird das feste Zeitintervall hinreichend lang gewählt, um eine gründliche Durchmischung des Probeserums mit dem Reagenz zu gewährleisten. In einer weiter unten beschriebenen bevorzugten Ausführungsform ist die Anordnung so getroffen, daß die Änderung der charakteristischen Eigenschaft der Ausgangsgröße der Zeitverzögerungsvorrichtung etwa 12 Sekunden nach der Probeneinbringung erfolgt.

In jedem Fall wird gemäß einer ersten Ausführungsform der Erfindung die Ausgangsgröße der Zeitverzögerungsvorrichtung 37 auf der Leitung 38 der Differenziervorrichtung 31 zugeführt, um deren Funktion bis zum Ende des Zeitintervalls im Zeitpunkt t- zu sperren. Im Zeitpunkt t-, d.h. nach Beendigung des Zeitintervalls, steigt - wie in Fig. 4 gezeigt - die Ausgangsgröße 41 der Differenziervorrichtung auf der Leitung 32 auf den jeweiligen tatsächlichen Signalpegel (gestrichelte Kurve 17) an und fällt dann mit der Reaktionsgeschwindigkeit ab. Hierbei wird eine Signalspitze 42 beobachtet, die proportional dem Betrag des Änderungsgeschwindigkeit ssignale nach einem vorgegebenen, festen Zeitintervall nach der Einbringung der Probe in das Reagenz und damit proportional der Harnstoffkonzentration in der Probe ist. Diese auf der Leitung 32 auftretende Ausgangs-

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größe der Differenziervorriehtung 31 wird einer Oeschwindigkeitsmeßschaltung 40 zugeführt, welche in dieser speziellen Ausführungsform den Spitzenwert 42 feststellt und speichert und diesen Wert über eine Leitung 43 einem zweiten Festkontakt 44 des Schalters 28 zuführt. Durch Umlegen des beweglichen Schalterarms 29 des Schalters 28 auf den Kontakt 44 kann daher das Spitzensignal der Differenziervorrichtung

31 an der Wiedergabe bzw. Anzeigevorrichtung 30 abgelesen -werden.

Für den Fachmann ist klar , daft die Wirkungsweise der Zeitverzögerungsvorrichtung 37* der Differenziervorriehtung 31 und der Geschwindigkeitsmeßschaltung 40,wie vorstehend beschrieben, nur eine spezielle Ausführung des Grundgedankens der vorliegenden Erfindung darstellt, nfimlich der Nessung des Betrages der Ausgangsgröße der Differenziervorrichtung 31 nach Ablauf eines vorgegebenen festen Zeitintervalls nach der Einbringung der Probe in das Reagens. Bei der in den Fig. 4 und 7 veranschaulichten Ausführungsform dient die Ausgangsgröße der Zeitverzögerungsvorrichtung 37 auf der Leitung 38 zur Sperrung der Differenzierschaltung 31 bis zum Zeitpunkt t._t wonach die aeschwindigkeitsmeßaohaltung 40 den Maximumwert des Signals auf der Leitung

32 unmittelbar darauffolgend mißt. Offensichtlieh sind aueh andere Verfahrensweisen möglich. Beispielsweise könnte, unter Bezugnahme auf die Fig. 5 und 8, die Qesehwindigkeitemeßsohaltung 40 in Form einer Sample-Abfrage-und Halteschaltung ausgebildet sein und die Ausgangsgröße der Zeitverzögerungsvorrichtung 37 auf der Leitung 38 könnte der Qesehwindigkeitsmeßsohaltung 40 zur Auswahl de· Zeitpunkts oder der Zeitpunkts für die Sample-Abfrage der Auegangsgröße der Differenziervorrichtung 31 zugeführt werden. Ib einzelnen könnte die Zeitverzögerung?vorrichtung 37 «ine

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streite Ausgangsgröße auf einer - Leitvmg 48 erzeugen» aev&n charakteristische Eigenschaft sieh in einem Zeitpunkt t^ nach dem Zeitpunkt t« jedQeh vor dem Zeitpunkt t- ändert. Wie in Fig. 5- dargestellt würde eli©se Ausgangsgröße auf der Leitung 48 die Diffepensiexworcdehtung 31 vom Seitpunkt tp bis zum Zeitpunkt t- sperren, um ein© Störung der Differenziervorrichtung 31 durch üen großen Leitfähigkeitssprung im Zeitpunkt t» zu vermeiden. Sobald dieser Sprung bzw. Einschwingvorgang abgeklungap ist_s gestattet die Ausgangsgröße auf der Leitung 48 den Beginn der Funktion der * Differenziervorrichtung 31» derart, daB deren Ausgangsgröße gemäß der Kurve Ί9 bis &um Brreieheri des jeweiligen tatsächlichen Signalpegels (gestel<eh©lt® Linie 17) ansteigt und sodann mit d©r Hsaktionsgeschwindigkeit abfällt. Wenngleich die Differensiervorriehtung 31 im Zeitpunkt tj. zu funktionieren beginnen darf, ist es jedoeh nash'wie vor erwünscht, mit der Messung der AusgsmgsgrdE® der Diff@£*enziervorriohtung 31 bis zum Eeitpunkt t» zu warten _ö um eine hinreichende Zeitdauer zur Ausschaltung der oben erwähnten Störeffekte zu gewährleisten. Demgemäß wird al® Ausgangsgröße der Zeitverzögerungsvorrichtung 37 auf der Leitung 38 der Oeschwindigkeiterneßsehaltung ¹SO sug©fühpt, die somit im Zeitpunkt t, aktiviert wird. Die Geschwindigkeitsmeßschaltung 40 mißt den Momentanwert 50 der Ausgangsgröße der Differenzierschaltung 31 im Zeitpunkt t,; dieses Signal wird über den Schalter 28 der Anzeige- bzw. Wiedergabe-vorrichtung 30 zugeführt. Gemäß einer anderen, in Fig. 6, veranschaulichten Ausführungsform der Erfindung bewirkt die Geschwindigkeitsmeßschaltung 40 eine Sample-Abfrage des Werts 51 des Signals auf der Leitung 32 in einem Zeitpunkt te, um den Betrag des Signals auf der Leitung 32 in einem vorgegebenen Zeitpunkt t_ zu erhalten, der nicht

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notwendigerweise nit der scheinbaren Oesohwliidigkeitsepitse 50 zusammenzufallen braucht.

Fig. 9 seigt eine bevorsugte Aueführungsform des Probenbehälters; diese weist einen zylindrischen Hohlkörper 60 mit einer Kammer 59 auf, deren Boden bei 61 konusfSrmig abgesohrägt ist. Zm Scheitel des konusförmigen oder abgesohrlgten Teil 61 mündet ein vertikaler Kanal 62, der mit einem ganz durch den OehäusekOrper 60 in der Nähe dessen Boden führenden horizontalen Kanal 63 in Verbindung steht. Das eine Ende 64 des Kanal 63 dient als EinlaA für das leitende Reagens von einer geeigneten Quelle über die Kanäle 63 und 62 in die Kammer 59* Das andere Ende 65 des Kanals 63 dient star Entleerung der Lösung aus dem Behälter 21. Selbstverständlich ist während dem Füllen des Behälters 21 der AuslaA 65 und während der Entleerung des Behälters 21 der EinlaA 64 gesperrt.

Der QehäusekOrper 60 ist an seinem oberen Ende bei 66 offen und kann, falls erwünsohty mit einem Kragen bew. Bund 67 versehen sein. Eine Pipette 69 reicht mit ihrer Spitte durch das offene obere Ende 66 des OehäusekOrpers 60, um ein sehr kleines Volumen der Probe, wie beispielsweise Serum, in das Reagens in der Kammer 59 einbringen su kOnnen. Um eine gründliche Durohmisohung der Probe mit dem Reagens in dem Probenbehälter 21 zu gewährleisten, weist der Probenbehälter 21 eine Rührvorrichtung 70 auf. Der Rührer 70 soll zweokmäAig etwa mit der in Fig. 9 gezeigten Formgestaltung ausgebildet sein. Um die direkte Ankupplung eines Antriebselemente an die Rührvorrichtung 70 zu erübrigen, kann der Rührer 70 magnetisch ausgebildet sein und duroh die rotierende Nagnetkraft angetrieben werden, die ein mittels einer Welle 72 duroh einen Motor 73 ange-

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triebener Drehmagnet 71 erzeugt. Zur drehbaren Lagerung dee Rührers 70 in dem Gehäusekörper 60 des Probenbehälters 21 kann der Rührer 70 an seinem unteren Ende bei 74 etwa mit dem gleichen Winkel wie der Bereich 61 der Kammer 59 abgeschrägt.bzw. verjüngt ausgebildet sein. Bei Herstellung des RUhrers 70 aus einem geeigneten Material wie beispielsweise Teflon bilden die Schrägflächen 74 und 61 geeignete Lagerflächen für den Rührer 70. Durch Schlitze 74* an der Unterseite des Rührers 70 wird ein Kanal für die Entleerung des Behälters 21 geschaffen. Eine für die vorliegenden Zwecke geeignete Ausführung eines Rührers ist in der US-Patentschrift Nr. 3 591 309 beschrieben.

Die Arbeitsweise ist wie folgt: Dar Motor 73 bewirkt im eingeschalteten Zustand eine Rotation des Magneten 71 mit beliebiger gewünschter Drehzahl, wobei der Rührer 70 dieser Drehbewegung folgt. Ober den Einlaßkanal 64 und die Kanäle 63 und 62 wird eine abgemessene Menge Reagenz in die Kammer 59 eingeführt. Danach wird ein kleines Probenvolumen, beispielsweise Serum, über die Pipette 69 in den Probenbehälter 21 eingebracht, wo es durch die Wirkung der Rührvorrichtung 70 mit dem Reagenz gemischt wird.

Wie in Fig. 9 gezeigt, kann der Gfehäusekörper·60 des Probenbehälters 21 eine öffnung 75 in einer Seitenwandung aufweisen, die öffnung 75 ist bei 76 teilweise mit Gewinde zur Aufnahme eines Meßfühlers 22 versehen. Zur Messung der Wechselstromleitfähigkeit kann jeder beliebige Meßfühler mit zwei Elektroden verwendet werden. Beispielsweise ist in der eingangs erwähnten US-Patentschrift 3 421 982 die Verwendung eines Paares paralleler Elektroden in einem L aitfähigkeits-MeSsystem beschrieben. Jedoch ist gemäß der vorliegenden Erfindung eine besondere Konstruktion derartiger

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Elektroden erwünscht, um viele Probleme, die in Leitfähigkeitsmeßsystemen auftreten, zu eliminieren. Bevor die bevor zugte Ausführungsform der Elektrodenkonstruktion gemäß der Erfindung im einzelnen beschrieben wird, sollen zunächst die auftretenden Probleme diskutiert werden.

Die klassische Leitfähigkeit ist als der Reziprokwert des elektrischen Gleichstromwideretands definiert gemäß der Gleichung

darin bedeutet C die Leitfähigkeit und R den Oleichstromwiderstand. Jedoch haben die Polarisationseffekte von Oleichstromsystemen dazu geführt, daß in den meisten Instrumenten •in· Wechselspannung zur Messung dieser sogenannten Leitfähigkeit verwendet wird. In Wirklichkeit mißt ein Wechselstromsystem die reziproke Impedanz gemäß der nachftlgenden Ol«iohung

Z . (X² ♦ H²)¹'²

darin bedeutet X die kapazitive Reaktanz infolg· von Ionon in der Lösung. Normalerweise bleibt der kapazitiv· Reaktanzt*r» Χ_Λ bit zu Frequenzen in der Größenordnung von mehreren MHi ziemlich groß. Da derart hohe Frequenzen praktisch nicht gut zu handhaben sind, weisen die meisten herkömmlichen Leitfähigkeits-Meßgeräte zur Lösung dieses Probleme eine •ingebaut· Kapazitätsneutraliaierungsschaltung auf.

Der vorliegenden Erfindung liegt die Erkenntnis zugrunde, daß der Orund für diesen großen kapazitiven Reaktanzterm in der Verwendung herkömmlicher Parallelplatten-Meßfühler zu sehen ist. In den Fig. 10 und 11 ist ein· bevorzugte

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erfindungsgemäie Au@führungsfown ©ines Meßfühlers 22 dargestellt, welcher dieses Problem w@itg©feeod löst. Der Meßfühler 22 weist einen längliehen zylindrischen Körper 80 auf» dessen Durchmesser gleich tea Durchmesser, aer öffnung 75 im Gehäusekörpe?» βθ &®s Prob'önb^älfcer)? 21 ist«. Der Körper 80 kann an seinem vorderen Ende bsi 81 mit Sehraubgewinde \ zum Eingriff mit dem G@wind@ ?β in der Öffnung 75 versehen sein. Der Körper 80 kann t®m@T eine ■ Haltemutter 82 aufweisen, die- gegen die Außesa©b©rfliehe. d©s Körpers 60 des Probenbehälters 21 festgesogen w®rd©a terra« Ein© ©berfläehe 83 des Körpers 80 erstreckt sieh in den Probenbehälter 21 hinein. Auf der Oberfläche 83 sind swei Elektroden 84 und 85 angebracht, die mit Leitungen 86 bsw. S? verbunden sind, welche durch den Körper 80 die© Meßfühlers 22 hindurchführen. Die Verbindungsleitungen 86 und 87 könnera mit dem Oszillator 24 und dem Demodulator 25 verbunden sein.

Gemäß der vorliegenden Erfindung kann der kapazitive Reaktanzterm weitgehend vermindert und s©gar praktisch eliminiert werden, indem man die Elektroden 84 nnd 85 planar ausbildet und sie koplanar anbringt. Puren diese Ausbildung und Anbringung der Elektroden 84 und 85 bleibt der Gleichetromwiderstand unbeeinflußt, während die Kapazität weitgehend verringert wird, wodurch der Term X₀ der kapazitiven Reaktanz b(ii eine·!· viel niedrigeren Frequenz sehr klein gemacht werden kann.,

Die Oberfläche 83 kann sine ebene· Oberfläche sein, wobei die Elektroden 84 und 85 auf dieser angebrachte Leitfähigkeit sbereiche sein können. Für praktische Zwecke ist die Ausführung der Oberfläche 33 als ebene planare Fläche mit der zylindrischen Konfiguration der Wandung der Kammer 59 nicht gut vereinbar und würde eine rasche und gründliche Durchmischung der in der Kammer befindlichen Lösung sowie

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eine wirksame Entleerung der Kammer behindern. Demgemäß ist, wie aus den Fig. 10 und 11 ersichtlich, die Oberfläche

83 insgesamt gekrümmt kugelijegmentförraig ausgebildet. Bei einer derartigen Konfiguration können die Elektroden

84 und 85 in Form von Halbkreisen ausgebildet sein, die mit ihren geraden Seiten parallel zueinander und im Abstand zueinander angeordnet sind. Mit einer derartigen Konfiguration hat sich ergeben, daß der kapazitive Reakt&nzterm X in der reziproken Impedanz Z praktisch auf Null verringert werden kann, wenn man die Frequenz des Oscillators 24 auf 10 kHz erhöht. Selbstverständlich ist die Frequenz, bei welcher die reziproke Impedanz abflacht, weitgehend von der Elektrodenkonfiguration abhängig und der angegebene spezielle Wert von 10 kHz entspricht nur d«r in den Fig. 9 bis 11 gezeigten Elektrodenkonfiguration. In jedem Fall wird jedoch mit einer derartigen Elektrodenkonfiguration die Wechselstromimpedanz eine sehr genaue Annäherung des Oleichstromwiderstands, und es ist keine Kapazitäts-Neutralisierungsschaltung erforderlich. Der Ausgang des Oszillators 24 kann direkt mit einer der Leitungen 86 oder 37 verbunden werden, während die andere Zuleitung das elektrische Signal auf der Leitung 23 zur direkten Weiterleitung an den Demodulator 25 liefert.

Wie eingangs erwähnt, hat die vorliegende Erfindung mit dem Rate Sensing Batch Analyzer von James C. Sternberg (entsprechend US-Anmeldung Serial No. 618 859 vom 27.2.1967) gemeinsam, daß sie einfache und bequeme Verfahren zur raschen Ermittlung quantitativer Information Ober biologische Proben an Hand geben. Der vorliegende Analysator beruht, wie auch der Sternberg-Analysator, auf der Messung wahrer Momentanwerte der Reaktionsgeschwindigkeit in einem sehr frühen'Stadium der Reaktion,, bevor ein wesentlicher Anteil der Reaktanten verbraucht int. Indem mim diese Oeschwin-

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digkeitsmessung in einem verhältnismäßig kurzem Zeitintervall erhält, wird Analysezeit eingespart, derart, daß mehr Proben in einem gegebenen Zeitintervall vermessen werden können. Die für die Messung verwertbare Reaktion ist eine annähernd exponentiell Leitfähigkeitsänderung, wie in den Fig. 1 und 3 ersichtlich, mit einer typischen Zeitkonstante von 20 Sekunden. Dies steht in diametralem Gegensatz zu dem System nach der US-Patentschrift 3 421 982, bei dem eine so geringe Reagenzmenge verwendet wird, daß die Reaktion sehr langsam verläuft und als annähernd linear angesehen werden kann.

PUr die Durchführung einer Leitfähigkeitsmessung nach dem erfindungsgemäßen System mufa noch ein weiterer Faktor berücksichtigt werden. Allgemein wird bei Enzym-Reaktionen das Reagenz üblicherweise mit hochleitfähigen Salzen gepuffert, derart, daß der pH-Wert der Lösung im Verlauf der fortschreitenden Reaktion verhältnismäßig konstant bleibt. Bei diesem Verfahren kann man die Reaktion mit . ihrer maximalen möglichen Geschwindigkeit ablaufen lassen. Bei dem Verfahren gemäß der Erfindung wäre dies offensichtlich nachteilig, da es gemäß der Erfindung erwünscht ist, daß die Leitfähigkeit der Lösung sich ändern kann, wobei diese Änderung und ihre Geschwindigkeit zur Bestimmung der Konzentration eines der Reaktionsteilnehmer gemessen wird. Demgemäß ist nach der vorliegenden Erfindung vorgesehen, mit im wesentlichen reiner Urease, in Wasser aufgelöst, su beginnen, einer verdünnten Salzlösung mit einer verhältnismäßig niedrigen Anfangsleitfähigkeit. Typischer·* weis« beträgt vor der Proben-Einbringung die Leitfähigkeit C^, wie aus Fig. 3 ersichtlich, etwa 20 bis 25* der endgültigen Leitfähigkeit C-. Die Konzentration des Enzyrareagenz ist wiederum relativ bezogen auf die übliche Konzentration des Enzyms verhältnismäßig hoch. Sobald die

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Probe im Zeitpunkt t~ eingebracht wird, springt die Leitfähigkeit auf C₂* d.h. auf einen Wert in der Nähe von etwa 8OX der späteren endgültigen Leitfähigkeit C.. Selbstverständlich kann die Anfangsleitfähigkeit C₁ des Reagenz einen Wert innerhalb eines weiten Bereichs besitzen, da während der Ammoniumcarbonatbildung immer noch eine Leitfähigkeitsänderung stattfindet. Infolge der inhärenten Schwierigkeit der Messung einer kleinen Xnderung in einem großen Signal ist es jedoch erwünscht, die anfängliche Konzentration so klein wie möglich zu halten.

Durch die vorliegende Erfindung wird daher ein Verfahren und eine Vorrichtung zur chemischen Analyse geschaffen, bei welcher nicht nur die von dem Rate Sensing Batch Analyzer von Sternberg gelösten Probleme der bekannten Systeme ebenfalls gelöst werden, sondern die darüber hinaus auf eine breitere Vielfalt von Enzym-Reaktionen anwendbar sind. Das Verfahren und die Vorrichtung gemäß der Erfindung gestatten die rasche Bestimmung der Konzentration eines Bestandteils in einer Probe, wie beispielsweise die Konsentration von Bestandteilen in biologischen Flüssigkeiten. Die durch das Blockschaltbild 20 wiedergegebene Vorrichtung und das diesbezügliche Verfahren können rasch aufgebaut und einsatzbereit gemacht werden, um quantitative Bestimmungen der wahren Konsentration rasoh und genau unter Verwendung kleiner Probenmengen durchzuführen.

Das Verfahren und die Vorrichtung gemä* der Erfindung beruhen auf der Messung wahrer Momentanwerte der Reaktionsgeschwindigkeit in einem sehr frühen Stadium der Reaktion, bevor der Reaktant verbraucht 1st, und während eines nichtlinearen Bereiohs des ReaktIonsverlaufe. Andererseits beruht die vorliegende Erfindung auf der Erkenntnis, daß die

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Einbringung einer Probe in Lösung mit einem Reagenz eine momentane Änderung der der Messung zugrundegelegten charakteristischen Eigenschaft der Lösung verursachen kann* Demgemäß wird bei dem erfindungsgemäßen System die Messung des Änderungsgeaehwindigkeitsslgnals während eines vorgegebenen, festen Zeitintervalls, beginnend mit der Einbringung der Probe in das Reagenz, gesperrt; das vorgegebene Zeitintervall ist hinreichend groß gewählt, um die Auswirkung der momentanen Änderung der Lösung zu eliminieren und gleichzeitig eine gründliche Durehmischung der Probe.mit dem Reagenz zu gewährleisten. Unmittelbar nach der Beendigung des festen ZeitIntervalls erfolgt erfindungsgemäß die Messung eines Werts der Änderungsgeschwindigkeit der Reaktion. Vorstehend wurden verschiedene spezielle Ausführungsformen hierfür beschrieben. Außerdem ist erfindungsgemäß auch ein neuartiger Meßfühler zur Eliminierung der kapazitiven Einflüsse in einer Leitfähigkeitsmessung vorgesehen.

Die Erfindung wurde vorstehend an Hand mehrerer konstruktiver AusfUhrungsbeispiele beschrieben, die jedoch selbstverständlich in mannigfacher Weise in Einzelheiten abgewandelt werden kann, ohne daß hierdurch der Grundgedanke der Erfindung verlassen wird.

Pat ent anaprüche:

3 0 ^fJ 8 0 7 / 1 2 U 5

Claims

1328· Patentansprüche

1. Chemische· Analysesystem zur Bestimmung der Konzentration eines Bestandteiles in einer Probe, bei welchem die Probe nach Einbringung in Lösung mit einem Reagenz mit diesem reagiert, wobei Ausmaß und Geschwindigkeit dieser Reaktion eine Anzeige far die Konzentration des Bestandteiles in der Probe ist, mit einem Meßfühler zur überwachung einer charakteristischen Eigenschaft der Lösung oder eines Reaktionsteilnehmers oder Reaktionsprodukts der genannten Reaktion und zur Erzeugung eines dieser charakteristischen ,Eigenschaft proportionalen ersten elektrischen Ausgangssignals sowie mit einer Differenzierschaltung zur Erzeugung eines der Zeitableitung des ersten Signals proportionalen zweiten elektrischen Signals, da· «ine Anzeige der Konzentration de· interessierenden Bestandteils in der Probe ist, gekennzeichnet duroh der Differenzierschaltung (31 # Fig.7»8) zugeordnete Vorrichtungen (37*38,40) zur Messung des Betrag« des zweiten oder Zeitableltungssignals naoh eine» vorgegebenen, festen Zeitintervall nach Einbringung der Probe in das Reagens. -

2. Chemisches Analysesystem naoh Anspruch 1, bei velohem di· Einbringung der Probe in Lösung mit dem Reagens eine augenblickliche Xnderung der für die Nessung verwendeten charakteristischen Eigenschaft Öler Lösung bewirkt, wobei die von dem Meßfühler festgestellte Xnderung eine sprunghafte Xnderung des ersten Ausgangssignals hervorruft, daduroh gekennzeichnet, daß die Meßvorriohtung eine auf die sprunghafte

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ORIGINAL INSPECTED

Änderung des ersten Signals ansprechende Zeitgebervorrichtung (36,37) zur Erzeugung eines dritten elektrischen Signals, dessen charakteristische Eigenschaft 3ich nach einem vorgegebenen, festen Zeitintervall ändert, sowie auf das zweite Ausgangssignal und auf die Änderung in der charakteristischen Eigenschaft des dritten elektrischen Signals ansprechende Vorrichtungen (37,48,38,40, Pig. 8) zur Bestimmung des jeweiligen Momentanwerts des zweiten Signals aufweist.

3. Chemisches Analysensystem nach Anspruch 2, dadurch gekenn zeichnet, daß die Zeitgebervorrichtung (37) ein viertes elektrisches Signal erzeugt, dessen charakteristische Eigen schaft sich vor dem Ablauf des vorgegebenen festen Zeit intervalls ändert» daß dieses vierte Signal der Differenzierschaltung (31) zur Sperrrung ihrer Funktion wahrend eines ersten Teils des fest vorgegebenen Zeitinter valle zugeführt wird, und daft das dritte Signal der Vor- riohtung zur Bestimmung des Betrags des »weiten Signals suseftthrt wird und deren Funktion wÄhrend de· fest vorgegebenen Zeitintervalle sperrt.

4. Chemisches Analysensystem nach einem oder mehreren der vorhergehenden Anspruch·, gekennzeichnet durch tin· Vor·* richtung lur Anzeige bzw. Wiedergabe des festgestellten Betragt de· sweiten Signal·.

5. Chemisfher Analysator sur Verwendung in dee Syst·« •in·« oder mehreren der vorhergehenden Ansprache, gekennzeichnet (türen ·ίη· Verrichtung (21) zur Auffeitet d*r Prob· und des Reagens; duroh einen der Aufnaheevorriehtung (21) in Wirkverbindung sugtordneiten ^eAfühler (22) tür überwachung der Konzentration ein·· Reaktionsteilnehmerο oder Reaktionsprodukts der Reaktion zwischen der Prob·

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und dem Reagenz, und zur Erzeugung eines dieser Konzentration proportionalen ersten Ausgangssignals; durch eine mit dem Meßfühler (22) verbundene Differeneierschaltung (31), welche in Abhängigkeit von dem ersten Ausgangssignal ein der Zeitableitung des ersten Ausgangssignals und damit der zeitlichen Xnderungsgeschwindigkeit der Konzentration des Reaktionsteilnehmers bzw. Reaktionsprodukts proportionales zweites Ausgangssignal erzeugt; sowie durch mit der Differenzierschaltung verbundene Vorrichtungen (40,37»35) zur Messung des Betrags des zweiten Signals nach einem vorgegebenen festen Zeitintervall nach Einbringung der Probe und des Reagenz in die Aufnahmevorrichtung (21).

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