DE2363188A1 - Verfahren und vorrichtung der mikrospektrographie - Google Patents

Verfahren und vorrichtung der mikrospektrographie

Info

Publication number
DE2363188A1
DE2363188A1 DE19732363188 DE2363188A DE2363188A1 DE 2363188 A1 DE2363188 A1 DE 2363188A1 DE 19732363188 DE19732363188 DE 19732363188 DE 2363188 A DE2363188 A DE 2363188A DE 2363188 A1 DE2363188 A1 DE 2363188A1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
light
sample
wavelength
point
wavelengths
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
DE19732363188
Other languages
English (en)
Other versions
DE2363188B2 (de
Inventor
Setsuya Fujita
Ichiro Sawamura
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Olympus Corp
Original Assignee
Olympus Optical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Olympus Optical Co Ltd filed Critical Olympus Optical Co Ltd
Publication of DE2363188A1 publication Critical patent/DE2363188A1/de
Publication of DE2363188B2 publication Critical patent/DE2363188B2/de
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/17Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
    • G01N21/25Colour; Spectral properties, i.e. comparison of effect of material on the light at two or more different wavelengths or wavelength bands
    • G01N21/31Investigating relative effect of material at wavelengths characteristic of specific elements or molecules, e.g. atomic absorption spectrometry
    • G01N21/314Investigating relative effect of material at wavelengths characteristic of specific elements or molecules, e.g. atomic absorption spectrometry with comparison of measurements at specific and non-specific wavelengths

Description

betreffend
Verfahren und Vorrichtung der MikrosOektropirsOhie.
Die Erfindung betrifft ein photometrisches Vorfahren zur mikrospektrographischen Messung der Liclitabsorption einer Probe, und zwar insbesondere ein mit zwei Vfelleitlängen-Abtastung und Integrierung arbeitendes Verfahren, bei welchem die Probe mit Lichtpunkten» die zwei unterschiedliche Wellenlängen haben, abgetastet wird, und die elektrischen Signale, die von den durch-die Probe hindurchgegangenen Lichtpunkten hergeleitet werden, integriert werden. Die Erfindung betrifft
ferner ein mit zwei Wellenlängen-Abtastung und Integrierung ■ arbeitendes Mikrospektrometer zur selbsttätigen Durchführung des obigen Verfahrens.
Bei den bekannten Verfahren der Mikrospektrograpiiie zur Messung der· Lichtabsorption einer Probe lassen sich vier verschiedene Arten unterscheiden:
1) Verfahren mit einer Wellenlänge und einem Bereich,
2) Verfahren mit einer Wellenlänge und zwei Bereichen,
3) Verfahren mit zwei Wellenlängen und
4) Verfahren mit Einwellenlängen-Abtastung und Integrierung*
/2
403828/0744
Bei dem Verfahren mit einer Wellenlänge und einem Bereich wird ein Lichtpunkt verwendet, der kleiner als die zu messende Probe ist, bei der es sich z.B. um eine organische Zelle handelt, wobei ein homogener Teil der Probe -ausgesucht wird. Es wird dann die Licht abs orbans As des ausgewählten homogenen Teils innerhalb der Fläche des Lichtpunktes gemessen. Anschliessend wird die Fläche der Zelle S gemessen und die Gesamtmenge der lichtabsorbierenden Substanz der Probe insgesamt nach der Gleichung M = As χ S berechnet.
Dieses bekannte Verfahren mit einer Wellenlänge und einem Bereich hat den Nachteil", dass bei einer ungleichmässigen Verteilung der lichtabsorbierenden Substanz in der Probe, z.B. in der organischen Zelle, der Messfehler,.nämlich der sogenannte Verteilungsfehler aufgrund der Ungleichmässigksit der Probe gross wird, und dass aufgrund der Tatsache, dass die Fläche S der Probe nur ungefähr gemessen v/erden kann, die Gesamtmenge M der lichtabsorbierenden Substanz mit einem beträchtlichen Fehler behaftet ist.
Bei dem Verfahren mit einer Wellenlänge und zwei Bereichen wird ein Lichtpunkt verwendet, der kleiner als die Probe ist. Es wird die Transmittans dieses kleinen, durch die Probe hindurchgehenden Lichtpunktes gemessen. Ausserdem vir-d bei diesem Verfahren ein grosser Lichtpunkt verwendet, der von aussen auf die Probe gerichtet wird, und es wird die Trans-
die
mittans dieses grossen, durch/Probe hindurchgehenden Lichtpunktes gemessen. Aus den gemessenen Werten wird die Lichtabsorbans der lichtabsorbierenden Substanz in.der Probe ins-gesamt durch Rechnung ermittelt. Bei diesem bekannten Verfahren mit einer Wellenlänge· und zwei Bereichen müssen bestimmte Bedingungen eingehalten werden, damit die Berechnungsgleichung erfüllt ist. D±ese Bedingungen lassen sich für diö in der Praxis vorkommenden Proben jedoch nur weniger genau einhalten. So ist es unmöglich, den Verteilungsfehler der lichtabsorbierenden Substanz wesentlich herabzusetzen. Dieß führt zu dem Nachteil des Verfahrens mit einer Wellenlänge und zwei Bereichen, dass Fehler in die Messwerte eingehen,
409 828/07 4 4 ^
und dass ale Einstellung der Grosso des Lichtpunktes bei der praktischen Durchführung schwierig ist und zu grossen, durch .das Personal verursachten Fehlern führt.
Bei dein Verfahren mit zwei Wellenlängen v/iEd ein Lichtpunkt verwendet, der von aussen auf die Probe, z.B. auf eine organische Zelle, gerichtet wird und zwei verschiedene·,, in einer bestimmten Beziehung zueinander stehende Wellenlängen hat. Die Probe wird von den von aussen auf die Probe gerichteten Lichtpunkten mit diesen beiden Wellenlängen durchstrahlt, um die Transmittanzen T^ und T2 der Probe bezüglich der beiden Wellenlängen zu messen und daraus den Gesamtbetrag der lichtabsorbierenden Substanz In der Probe durch Rechnung zu bestimmen. .
Das Verfahren mit zwei Wellenlängen wurde.nach Fertigstel-, lung der Mendelζonschen Viertetabelle entwickelt, die praxisbezogene numerische Werte enthält, anhand deren die Lichtabsorbans der lichtabsorbierenden Substanz aus 'den beiden Transmittanzen T^ und T2 bezüglich der beiden Wellenlängen hergeleitet v/erden kann. Nach diesem Verfahren lässt sich die lichtabsorbierende Substanz in.der Probe unabhängig von Konzentrations-Verteilungsfehiern in der Probe und unabhängig von der-Grosse der Probe abschätzen. Das Verfahren ist also für die praxis geeignet.
Bei diesem üblichen Verfahren v/erden zur Festlegung der beiden Wellenlängen die Absorbans-Ind jces K^ und Kp zu den beiden Wellenlängen ^2 ^10 ^2 so ausSev*ählt, dass die Beziehung K1 ' = K2 gilt. Zu diesem Zweck wird der Teil der Probe., bei welchem die lichtabsorbierende Substanz gleichmässig vorliegt, ausgewählt, und es wird dann eine spektrale Absorptionskurve aufgetragen. Anhand dieser Kurve wird eine Wellenlänge /L^, bei welcher die Lichtabsorbans ein Maximum'ist, und eine weitere .Wellenlänge ?L2 ermittelt, bei v/elcher die Lichtabsorbans 50 % des Maximalwertes beträgt. Dieses zuletzt erläuterte Verfahren hat trotzdem jedoch die folgenden Kachteile:
409828/0744
1) Die Grosse des Lichtpunktes muss bei jeder Durchführung einer Messung je nach Grosse der Probe geändert v/erden. Die Messung der Grosse des Lichtpunktes ist schwierig und mühsam«
2) Es ist notwendig, dass die Wellenlänge des Lichtpunktes präzise eingehalten wird und dass die Probe vom Lichtpunkt gleichmässig bestrahlt wird, da anderenfalls Messfehler auftreten.
3) Bei der Festlegung der beiden Wellenlängen muss eine Wellenlänge so ausgewählt werden, dass" bei ihr die Lichtabsorbans ein Maximum hat,' und eine weitere Wellenlänge muss so ausgewählt werden, dass bei ihr die Lichtabsorbans 50 % des
•Maximalwertes hat. Auf diese Auswahl muss die grösste Sorgfalt verwandt werden, da eine fehlerhafte Festlegung der beiden Wellenlängen zu beträchtlichen Messfehlern führt.
4) Lichtverluste, die auf der Probe nicht eigene Lichtdiffusion ■.zurückgehen und durch Lichtreflexion und -brechung verursacht werden, können gegebenenfalls mit diesem Verfahren weder festgestellt noch korrigiert werden.
Bei dem Verfahren mit zwei Wellenlängen ist der Lichtpunkt so gaross, dass eine Plancksche Messung an der Glasoberfläche d„ort, v/o der zu untersuchende Teil der Probe nicht vorhanden ist, durchgeführt werden muss. Im Falle einer organischen Zelle beispielsweise wird der Lichtverlust, der für die Protoplasma-Struktur wie das Cytoplasma, den Kern und ähnliches nicht typisch ist und bei der Planckschen Messung nicht berücksichtigt wird, mit Fehlern behaftet.
Wie bereits erwähnt, ist das übliche Verfahren mit zwei Wellenlängen sehr mühsam in der- Durchführung der Messung und erfordert zur Ermittelung des Gesamtbetrags der lichtabsorbierenden Substanz in der Probe mit Hilfe der Lichttransmittans des Lichtpunktes mit den beiden Wellenlängen die Ablesung einer " Wertetabelle, was bedeutet, dass die selbsttätige Durchführung einer Messung äusserst schwierig ist.
; ■ /5
409828/0744
Bei dem Verfahren mit Einwellenlängen-Abtastung und Integrierung wird der zu untersuchende Teil der Probe in winzige, so klein wie möglich gewählte Bereiche aufgeteilt, so dass eine gleichfömige Verteilung der lichtabsorbierenden Substanz in den einzelnen Bereichen angenommen werden kann. Die Lichtabsorbans wird für jeden winzigen Bereich gemessen, wobei dieser Hessgang zur Erzielung von Messwerten für alle Bereiche wiederholt, wird. Dann wird die Gesamtsumme dieser Messwerte bestimmt. Dieses bekannte Verfahren besteht also darin, dass der zu untersuchende Teil der Probe in sehr kleine Bereiche aufgeteilt und die Probe relativ zum Lichtpunkt bewegt wird, um die Probe mit dem Lichtpunkt abzutasten und eine Lichtabsorptionskurve für jede Abtastung zu erhalten. Diese Lichtabsorptionskurve wird zur Messung der Lichtabsorptions jedes abgetasteten Teils der Probe und der.Menge der aufgeteilten lichtabsorbierenden Substanz integriert. Diese Messung wird über alle Bereiche durchgeführt. Die derart erhaltenen Beträge werden zur Ermittelung der durch die Probe insgesamt absorbierten Lichtmenge aufsummiert. Die Integration bei diesem Verfahren wird zur Ermittelung der Lichtabsorjrbion jedes einzelnen abgetasteten Teils durchgeführt. Dadurch ist es möglich, einen sehr genauen Messwert zu erhalten, der frei von einem Verteilungsfehler aufgrund einer unrege!massigen Verteilung der lichtabsorbierenden Substanz ist.
Obiges Verfahren hat. sich im Prinzip und in der Praxis als ideal zur Messung der Lichtmenge erwiesen, die von der lichtabsox'bierenden Substanz in dem zu messenden Teil der Probe absorbiert wird.
Bei diesen mit Einwellenlängen-Abtastung und Integrierung arbeitenden Verfahren geht jedoch' das Licht,'das vom Ljchtweg ißt Bereich einer Objektivlin.se aufgrund von Lichtdiffus ion verursacht durch Reflexion und Brechung des Lichtes in der Probe, abweicht» verloren* Dies führt zu einer Vergrösserung; der ermittelten, Lichtabsorbans, weshalb die Lichtraenge, die von der lichtabsorbierenden Substanz, absorbiert wird, fehlerhaft erweiso als grosser, als. sie tatsächlich ist, ermittelt
wird. -■ . ff
409828/0144 " J
Das Verfahren hat den Nachteil, dass der. Fehler, der durch Lichtverluste aufgrund für die Probe nicht typischer Phänomene verursacht wird, in den Messwert eingeht. Dies bedeutet, dass die Messung der wahren Lichtmenge, die durch den zu untersuchenden Teil der Probe absorbiert wird, -und die genaue Messung der Menge der li'chtabsorbierenden Substanz in dem nicht untersuchten Teil der Probe schwierig ist.
Λ-
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, unter Vermeidung der verschiedenen Nachteile der oben erläuterten üblichen Verfahren zur mikrosp elct r ogr aphi sehen Messimg der Lichtabs orbans einer Probe ein mit zwei Wellenlängen-Abtastung und Integration arbeitendes Verfahren zur mikrospektrograpliisciien Messung der Lichtabsorbans einer Probe zu schaffen., bei welchem der Verteilungsfehler aufgrund einer an den verschiedenen Stellen unregelmässigen Verteilung der lichtabsorbicvonisn Substanz in der Probe und der durch die Licht diffus ion aufgrund von Rexelxion, Brechung und Beugung des Lichtes in der Probe verursachte Fehler vermieden werden kann, lind mit welchem sich unmittelbar der wahre Betrag des von der Probe absorbierten "Lichtes ohne Zuhilfenahme von Berechnungen oder ohne Bezugnahme auf numerische Wertetafeln, ermitteln lässt und daher automatisch unter Vermeidimg von auf Bedienung beruhenden Fehlern durchgeführt werden kann. Mit der Erfindung soll ferner ein Mikrospektrometer zur selbsttätigen. Durchführung des Verfahrens geschaffen werden, mit vrelcnera sich die "Messwerte in arbeitssparender und genauer Weise automatisch ermitteln lassen. Diese Aufgabe ist erfindungsgemäss mit dem im. Anspruch 1 gekennzeichneten Verfahren und der im Anspruch 2 gekennzeichneten Vorrichtung gelöst.
Bei dem erfindungsgemässen Verfahren zur mikrospektrographischen Messung der Lichtabsorbans einer Probe wird die Probe relativ zu einem winzigen Lichtpunkt bewegt und dadurch mit dem Lichtpunkt abgetastet. Die Lichtabsorbans von jede der auf diese Weise abgetasteten winzigen Teile der Probe wird integriert und so die Lichtabsorbans des winzigen abgetasteten Teils erhalten. Dadurch wird der ¥erteilungsfehler
/7 40982 8/07 4 4
vermieden. Die Abtastung erfolgt über den gleichen. Lichtweg mit einem Lichtpunkt, der zwei verschiedene "Wellenlängen hat. Ss wird die Differenz zwischen den Lichtabsorbanzen ermittelt, die durch Abtastung des Lichtpunktes mit den zwei verschiedenen Wellenlängen erhalten werden. Dadurch wird der durch die Lichtabsorption, die für die Probe nicht typisch ist, erzeugte Fehler, und der durch Lichtdiffusion aufgrund von Reflexion, Brechung und Beugung.des.Lichtes in Probe verursachte Fehler vermieden.
Bei dem üblichem Zweiwellenlängen-Verfahren werden die beiden Wellenlängen ?l ^ und ^^ öes Lichtpunktes so ausgewählt, dass die Indeces K4 und K0 der Lichtabsorbans bei die-
sen beiden Wellenlängen der Gleichung K^ -= K^ genügen. Im Gegensatz dazu gestattet die Erfindung die Messung des Absorptionsspektrums des Farbstoffes und.die Festlegung der Wellenlänge ^, j. so, dass bei dieser die Lichtabsorbans des Absorptionsspektrums des Farbstoffes ein Maximum ist, und die Festlegung der Wellenlänge Pip εο> dass bei ihr die Lichtabsorbans Null ist und sie gegenüber dem Absorptionsspektrum versetzt ist und in der Häheder Wellenlänge %* liegt.
Im Falle einer organischen Probe, z.B. einer Zelle oder ähnlichem, wird im allgemeinen ein Feulgenscher Farbstoff verwendet, der an die lichtabsorbierende Substanz in der Probe angebunden werden kann und bei welchem die lichtabsorbierende Substanz der Lichtabsorbans der zu untersuchenden Probe proportional ist, und v/elcher einen kleinen Proportionalitätsfehler aufweist. In diesem Falle wird die Wellenlänge TV1, bei welchem die dem Farbstoff eigene Lichtabsorbans ein Maximum ist, auf 550 Um und die Wellen λ-2 auf 450 im festgelegt.
Bei dem üblichen Verfahren mit Einwellenlängen-Abtastung und Integration wird die von jedem winzigen abgetasteten Teil der Probe absorbierte Lichtmenge zur Ermittlung der Menge der lichtabsorbierenden Substanz "für alle abgetasteten Teile der Probe integriert. Zu diesem Zweck fällt das durch die Probe hindurchgetretene Licht auf eine Photoverv/ielfacher-Röhre,
4 0 9 8 2 8/0744
mittels welcher" das einfallende Licht in ein elektrisches Signal umgewandelt wird, das nach Verstärkung und Gleichrichtung einem Aufzeichnungsgerät zugeführt wird. Das Aufzeichnungsgerät kann eine. Lichtabsorbanskurve auf einem Aufzeichnungsträger aufzeichnen. Eine Anzahl quadratischer, von jeder Lichtabsorbanskurve umschlossener Abschnitte wird zur Messung der Fläche, anhand welcher der Wert der Lichtabsorbanskurve ermittelt wird, ausgezählt. Diese Werte wer-. den zur Ermittlung der Lichtabsorbans der Probe aufsummiert. Alternativ kann der Aufzeichnungsträger auch entlang jeder Lichtabsorbanskurve ausgeschnitten und das Gewicht der ausgeschnittenen Teile mittels einer Waage zur Ermittlung des integrierten Wertes der Lichtabsorbanskurve gerne s-s en v/erden. Jedoch ist die Arbeit des Zählens der Abschnitte des Aufzeichnungsträgers oder des Ausschneidens des Aufzeichnungsträgers entlang der Lichtabsorbanskurve sehr mühsam, zeitaufwendig und fehlerbehaftet.
Es-ist auch schon vorgeschlagen v/orden, die Lichtabsorbans der Zelle zur Messung der Menge der in der Zelle enthaltenen Substanz und zur Abschätzung des anormalen Zustandes.der Zelle zu messen, und zwar im Rahmen einer klinischen Untersuchung= In diesem Falle ist es besonders notwendig, die Information bezüglich der Lichtabsorbans der Zelle genau und schnell zu erhalten. Sogar in der Grundlagen- und in der Anwendungsforschung ist es von Vorteil, die genaue Information bezüglich der'Lichtabsorbans der Zelle schnell zu erhalten. Insbesondere ist es äusserst v/ichtig, quantitative Messungen organischer und medizinischer Proben, z.B. der Nucleinsäure DNA und dgl, in einer Zelle genau durchzuführen.
Bei der Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens mit einem Mikrospektrometer nach der Erfindung wird zuerst das Absorptionsspektrum des Farbstoffes gemessen. Dann wird die Wellenlänge p^^ , bei welchem die dem Farbstoff eigene
/9 4 0 9 8 2 8/0744
j —
Lichtabsorbaris ein Maximum ist, und die Wellenlänge ^2'. welche gegenüber dem Absorptionsspektrum des Farbstoffes versetzt ist und einen Mindestabstand von der Wellenlänge \^ hat, festgelegt. Z.B. v/ird bei der Messung der DNA eines Zellkernes ein Feulgenscher Farbstoff ausgewählt, bei dem die Menge des an die DNA anzubindenden Färbmittels der DNA proportional ist. Die Hellenlänge ^U., bei welchem-die dem Färbmittel pigene Lichtabsorbans ein Maximum ist, wird auf 550 nm und die Wellenlänge λ.2> welche gegenüber dem Absorptionsspektrum versetzt ist, v/ird auf 450 nm festgelegt.
Die beiden Wellenlängen λ.^ und Tt^ können selbsttätig und wiederholt dur"ch Voreinstellung dieser beiden Wellenlängen in der Schaltung zur Steuerung des Spektroskops gemessen werden. Wenn der Bereich, über welchen die Probe mittels des Lichtpunktes abgetastet wird, mittels der Bühnen-Steuerschaltung definiert ist, kann die genaue Lichtabsorbans dieses zu untersuchenden Teils der Probe, d.h. die durch diesen Proben-Abschnitt absorbierte· Lichtmenge selbsttätig und schnell nach Massgabe eines Programms-gemessen werden, das vorher festgelegt wurde und nach welchem die Wellenlänge gewechselt und die ^robe abgetastet werden kann. Das übliche, mit Abtastung und Integration arbeitende Mikrospektrometer zur Messung der Lichtabsorbans einer Probe gestattet nur eine mühsame Durchführung der Messung und erfordert Zeit bei der Berechnung der Messwerte, so dass nur ein oder zwei Proben pro Tag untersucht werden können und ausserdem noch Messfehler vorkommen. · ·
Im Gegensatz dazu können mit dem auf zwei Wellenlängen-Abtastung und Integrierung beruhenden Mikrospektrometer nach der Erfindung 50 bis 100 Proben pro Tag genau untersucht werden,, die Messungen können selbsttätig durchgeführt werden und die wahre,von der Probe absorbierte Lichtmenge kann genau ermittelt werden. Ausserdem können bei einer vorherigen Festlegung der Färbung die beiden Wellenlängen Tl^ und Ao benutzt werden,· ohne dass Ihre Messung notwendig ist.
/10 4 O 9 8 2 8 / Ö 7 4 4
Im folgenden ist die Erfindung mit weiteren vorteilhaften Einzelheiten' anhand von schematisch dargestellten Ausführungsbeispielen näher erläutert.
In den Zeichnungen zeigen:
Fig. 1 ein Blockschaltbild einer Ausführungsform eines Mikrospektrometers nach der Erfindung;
Fig. 2 eine,graphische Darstellung einer spektralen Absorptionskurve eines Farbmittels; ■ ■
Fig. 3 ein Diagramm zur Darstellung der Abtastwege des Mikrospektrometers nach Fig. 1;
Fig. 4 eine graphische Darstellung zur Erläuterung der Arbeitsschrittfolge des Mikrospektrometers nach Fig. 1;
Fig. 5 ein Diagramm zur Darstellung eines anderen Beispiels der Abtastwege nach Fig. 3.
In Fig. 1 ist mit dem Bezugszeichen Λ eine Lampe,z.B. eine Wolfram- oder Xenonlampe, bezeichnet, die als stabilisierte Lichtquelle benutzt wird. Das von der Lampe 1 ausgehende Licht fällt auf ein Spektroskop 2. Das Spektroskop 2 ist beispielsweise mit einem Prisma oder einem Beugungsgitter ausgerüstet, das drehbar ist, um die Wellenlänge des hindurchgehenden Lichtes ändern zu können. Die Abbildung des Austrittsschlitzes des Spektroskopes 2 wird mittels einer .Feldlinse 21 an der Stelle der Eintrittspupille einer Kondensorlinse 4 entworfen. Unmittelbar hinter der Feldlinse 21 ist eine Lochblende 3 angeordnet,, deren verkleinertes Abbild mittels eines als Kondensorlinse verwendeten Objektives 4 auf der Oberfläche einer Probe entworfen wird, die auf einer in X-Richtung und in Y—Richtung beweglichen Bühne 5 angeordnet ist. Das aus dem Spektroskop 2 austretende Licht ist monochromatisch, so dass das verkleinerte Abbild auf der Oberfläche der Probe ein monochromatischer Lichtpunkt ist, welcher auf den zu untersuchenden Teil der Probe gerichtet ist.
Das durch die Probe hindurchgehende Licht gelangt durch eine Objektivlinse 6, welche eine gleichzeitige Vergrösserung
409828/0744 /11
der Probe und des monochromatischen Lichtpunktes bewirkt, zu einer Photovervielfacher-Röhre 7. Das insoweit beschriebene optische System nach Koana und Naora, bei welchem"die Objektivlinse bzw. das Objektiv als Kondensor verwendet v/ird und bei welchem der monochromatische Lichtpunkt nur auf den zu untersuchenden Teil der Probe gerichtet wird, gestattet die Messung der Lichtmenge, die von dem örtlichen Teil der.Probe absorbiert wird. Zwisehen der Lochblende 3 und der Konden-. sorlinse 4 i*st eine Verdunklungsblende^fe ingefügt, welche mittels eines Betätigungsmagneten 9 derart bewegt v/erden kann, dass sich die /Verdunklungsblende wahlweise im Strahlengang oder ausserhalb desselben befindet, wie es durch den Doppelpfeil angedeutet ist. Ausserdem ist ein X-Antrieb zur Bewegung der Bühne 5 in X-Richtung und ein Y-Antrieb zur Bewegung der Bühne 5 in Y-Richtung vorgesehen.
Der Ausgang der Photovervielfacher-Röhre 7 wird einer Arbeitsschaltung 12 zugeführt, welche eine elektrische Spannungsquelle zur Lieferung der Hochspannung für die Photovervielfacher-Röhre 7, einen Verstärker zur Verstärkung des Ausgangssignals von der Photovervielfacher-Röhre und eine Gleichrichterschaltung umfasst. Der Ausgang der Arbeitsschaltung 12 wird einem Integrator 13 und einem Aufzeichungsgerät 14 zugeführt, welches auf einem Aufzeichnungsblatt eine Kurve schreiben, welche die Lichtabsorbans der Probe zeigt. Der Ausgang des Integrators 13 v/ird einer Rechenschaltung zugeführt, welche den integrierten Wert, der durch Abtastung der Probe mit Licht der Wellenlänge ^2 erhalten v/ird, von dem integrierten Wert, der durch Abtastung der Probe mit Licht der Wellenlänge^ erhalten wird, subtrahieren kann. Der Ausgang der Rechenschaltung 15 v/ird einem Addierer 16 zugeführt, welcher die von der Probe während aller Abtastvorgänge absorbierte Lichtmenge zur Ermittlung der gesamten von der Probe absorbierten Lichtmenge aufsummieren kann. Der Ausgang vom Addierer 16 wird einer Anzeige 17 zugeführt, v/elcher eine zahlenmässige Anzeige der gesamten von der Probe absolvierten Lichtmenge, d.h. von der Menge der in der Probe
.40-9828/0744
enthaltenen lichtabsorbierenden SubstanE liefert. Der Ausgang des Addierers wird ausserdem einem Drucker 18 zugeführt, welcher die gesamte, von der Probe absorbierte Lichtmenge ausdruckt. Mittels der Anzeige 17 können ausserdem die zuvor eingestellten Wellenlängen Ti^ und /I2 angezeigt v/erden. Die von der Probe bei der Abtastung mi-t dem Lichtpunkt der zuvor eingestellten Wellenlänge absorbierte Lichtmenge wird ; ebenfalls mittels der Anzeige 17 angezeigt und mittels des Aufzeichnungsgerätes 14 aufgezeichnet.
Die Differenz zwischen der von der Probe bei ihrer Abtastung mit dem Lichtpunkt der Wellenlänge oL·^ absorbierten Lichtmenge und der von der Probe bei ihrer Abtastung mit dem Lichtpunkt der Wellenlänge rip absorbierten' Lichtmenge während der Bewegung der Bühne 5 in Y-Richtung wird mittels der Anzeige 17 angezeigt und in dem Addierer 16 gespeichert. Ausserdem kann der Ausgang des Integrators 15 dem Drucker 18 zugeführt werden,- so dass die bei jeder Abtastung der Probe mit den beiden Wellenlängen TLi und/^ ρ von ^er Probe absorbierte Lichtmenge ausgedruckt wird, wie dies durch gestrichelte Linien angedeutet ist. ' ·
Alternativ kann der Ausgang der Rechenschaltung 15 der Anzeige 17 und dem Drucker 18 zugeführt werden, so dass die von der Probe bei ihrer Abtastung mit den Lichtpunkten der WellenlängeΛ, ^ bzw. r\ ~ absorbierte wahre Lichtmenge numerisch angezeigt und gedruckt wird.
Zu Steuerung der verschiedenen Bauteile des insoweit beschriebenen Mikrospektrometers ist eine Steuerschaltung 19 vorgesehen. Die Steuerschaltung 19 ist an das Spektroskop 2, den Solenoid oder Betätigungsmagnet 9, an den X-Antrieb und den Y-Antrieb 10 bzw. 11, an den Integrator 13, an das Aufzeichnungsgerät 14, an die Rechenschaltung 15, an den Addierer 16 und an den Drucker 18 angeschlossen, wodurch eine Steuerung dieser Bauteile in gegenseitiger Zuordnung bewirkt wird.
/13 A09828/0744
Die Wirkungsweise des in Fig. 1 gezeigten Mikrospektrometers wird nun anhand der Fig. 2 bis 4 erläutert.
Bei dem gezeigten Ausführungsbeispiel wird zuerst eine standarisierte Probe, die mit einem Färbmittel eingefärbt ist, vorbereitet'und dann zur Aufzeichnung einer spektralen Absorptionskurve des Färbmittels benutzt.
Dazu wird die Lampe 1 angeschaltet und der Solenoid 9 betätigt, damit die Verdunklungsblende 8 aus' dem Strahlengang entfernt ist. Unter diesen Umständen bewirkt die auf der Bühne 5 angeordnete standarisierte Probe sowohl eine Fokussierung der4 Probe als auch des Lichtpunktes.
In diesem Zustand kann die Bühne 5 sowohl von Hand als auch aus der Entfernung mittels des X- und des Y-Antriebes 10. bzw. "11 bewegt werden. Dann wird von der Steuerschaltung 19 ein Signal an das Spektroskop geliefert, wodurch dessen Prisma oder Beugungsgitter angetrieben und dadurch die Wellenlänge des aus dem Spektroskop 2 austretenden monochromatischen Lichtes kontinuierlich geändert wird. Gleichzeitig wird von der -Steuerschaltung 19 ein Signal zum Aufzeichnungsgerät 14 geliefert, durch das dieses so betätigt wird, dass die spektrale Absorptionskurve des Färbmittels der standarisierten Probe auf einem Aufzeichnungsblatt geschrieben wird.
Fig. 2 zeigt ein Beispiel einer spektralen Absorptionskurve auf dem Aufzeichnungsblatt des Aufzeichnungsgerätes 14. Bei dem in Fig. 2 gezeigten Beispiel ist Feulgenscher Farbstoff zur Einfärbung der standarisierten Probe verwendet und die Wellenlänge des Spektroskops 2 wird zwischen 400 nm und 700 nm geändert. Anhand dieser spektralen Absorptionskurve wird, eine Wellenlänge ^^ zu 550 nm ermittelt, bei welcher die Lichtabsorbans A ein Maximum ist und eine Wellenlänge Tl 2 zu ^50 nm, bei welcher die Lichtabsorbans A Null ist. " ι ,
/14 409828/0744
Die in der beschriebenen Weise festgelegten Wellenlängen /|x und/Ip werden an der Steuerschaltung 19 eingestellt, so dass monochromatisches Licht der Wellenlänge Tt* und monochromatisches Licht der Wellenlänge λ. ο wiederholt von dem Spektroskop 2 abgegeben, wird. Ausserden wird die Bühne 5 mit' dem Ziel bewegt, den rLichtpunkt an der richtigen Anfangs- ; stelle für das Abtasten anzuordnen.
In Fig. 3 ist gezeigt, wie die Bühne 5 mittels des Lichtpunktes abzutasten ist. In Fig. 3 sind voneinander getrennte Abtastwege mittels einer ausgezogenen Linie a.*, puriktierten Linien b^, strichpunktierten Linien c^ und ge- ■ strichelten Linien d,, dargestellt, damit die Übersichtlichkeit gewahrt ist. In'der Paxis jedoch verlaufen die einzelnen Abtastlinien entlang des gleichen Abtastweges-.
Die Grosse der durch den Lichtpunkt abzutastenden Fläche wird in Abhängigkeit von der Grosse der zu untersuchenden Probe festgelegt. Der Betrag der Bewegung XQ in X-Richtung und der Betrag der Bewegung YQ in Y-Riehtung werden an der Steuerschaltung 19 voreingestollt. Wenn bei dem vorliegenden Ausführungsbeispiel der Durchmessers des· Lichtpunktes beispielsweise : /1 /um ist, kann der Lichtpunkt bis zu 99- /um in X-Richtung und um einen-Sprung von 1 /um bis
zu 99 /um in Y-Richtung bewegt werden. Dies bedeutet, dass / ρ .
die maximale Abtastfläche 99 x .99 = 9801 /um gross ist und die Probe mittels des Lichtpunktes über diese gesamte Fläche abgetastet werden kann. .
Es sei angenommen ,dass der Lichtpunkt an der durch A in Fig. 3 bezeichneten Anfangsstellung für das Abtasten positioniert ist, dass monochromatisches Licht mit der Wellenlänge /1^ = 550 nm aus dem Spektroskop 2 austritt und dass der Solenoid abgeschaltet ist, wodurch sich die Verdunklung sblende 8 im Strahlengang befindet. Wenn ein an der Steuerschaltung 19 vorgesehener Startschalter zum Zeitpunkt ig der in Fig. 4 gezeigten Arbeitsschrittfolge herabgedrückt
/15 409828/0744
wird, wird der Solenoid 9 durch ein von der Steuerschaltung 19 geliefertes Signal erregt, wodurch die Verdunklungsblende 8 aus dem Strahlengang entfernt wird, und. der X-Antrieb 10 wird durch ein weiteres Signal von der Steuerschaltung 9 derart betätigt, dass die Bühne 5 mit einer konstanten Geschwindigkeit von 5 /um/sec in X-Richtung bewegt wird. Gleichzeitig wird der Integrator so angesteuert, dass er das von der Photovervielfacher-Röhre 7 gelieferte und in der Arbeitsschaltung 12 verstärkte Signal integriert. Zum Zeitpunkt t^j, nachdem die Bühne 5 um den in der Steuerschaltung 19 voreingesteilten Betrag XQ bewegt wurde, gibt die Steuerschaltung 19 an den X-Antrieb 10 ein Stopsignal ab, so dass die Bühne 5 anhält, und schaltet gleichzeitig den Solenoid ab, so dass die Verdünkelungsblende 8 wieder in den Strahlengang bewegt und dadurch das Licht unterbrochen wird. Ausserdem liefert die Steuerschaltung 19 ein Signal an öen Integrator 13", damit der Integriervorgang unterbrochen und ein integrierter Wert Apu festgehalten wird. Anschliessend liefert die Steuerschaltung 19 ein Signal an den X-Antrieb 10, aufgrund dessen dieser die Bühne 5 in der entgegengesetzten Richtung bewegt.
Kurze Zeit nach dem Zeitpunkt t^ gibt -die Steuerschaltung 19 einen Impuls an den Integrator 13 zur Abtastung des integrierten Wertes und zur Überstellung des integrierten Wertes Α'λ-ι an die Rechenschaltung 15 ab. Gleichzeitig wird der integrierte Viert A Tl* Ton der Anzeige 17 angezeigt. Dann wird von der Steuerschaltung 19 ein Signal an den Integrator · zur Rückstellung desselben geliefert..Der integrierte Wert' A Tt-j .wird in der Rechenschaltung 15 akkumuliert. Der integrierte Wert A^-j repräsentiert die von der Probe bei der Abtastung mittels des Lichtpunktes entlang des in Fig. 3 gezeigten Abtastweges a^ absorbierte Lichtmenge.
Während der Lichtmessung längs des Abtastweges a^ wird der Ausgang der Arbeitsschaltung 12 aüsserdem an das Aufzeichnungsgerät 14 geliefert, welches die Lichtabsorbanskurve,
409828/0744 /16
welche bei der Lichtmessung entlang des Abtastweges a^' erhalten wird, auf einem Aufzeichnungsblatt aufschreibt. Ausserdem wird der integrierte Wert A \* auch dem Drucker 18 zugeführt, der diesen ausdruckt.
Während der Rückführung der Bühne 5 in die Ausgangsstellung entlang des Abtastweges b^ liefert die Steuerscbaltung 19 ein Signal an das Spektroskop 2 zur Umschaltung der Wellenlänge des Lichtpunktes von /L· auf
Wenn die Bühne 5 in der entgegengesetzten Richtung um den Betrag XQ in die Ausgangsstellung A bewegt wird, liefert die Steuerschaltung 19 ein Signal an den X-Antrieb 10, damit die Bühne 5 zu dem in Fig. 4 gezeigten Zeitpunkt to anhält. Während der Zeitspanne bis zum Erreichen des Zeitpunktes tρ wurde die Wellenlänge des Lichtpunktes von 7t* auf /tp geändert.' .
Anschliessend wird ein Signal von der Steuerschaltung .19 zum Solenoid 9 geliefert, durch das die Verdunklungsblende 8 wieder aus dem Strahlengang entfernt wird. Gleichzeitig wird ein Signal von der Steuerschaltung 19 an den X-Antrieb 10 geliefert, durch das die Bühne 5 entlang des Abtastweges Cj bewegt wird. Die Bühne 5 wird in der gleichen, oben bereits beschriebenen Weise in X-Richtung um den Abstand Xn bewegt und dabei der Ausgang der Photovervielfacher-Röhre 7 mittels des Iri.tergr.a-t or s 13 integriert.
Sobald, die Bühne 5 um den Abstand XQ bewegt worden ist, wird der X-Antrieb 10 von der Steuerschaltung 19 angehalten und die Verdunkelungsblende 8 wieder in den Strahlengang eingesetzt. Ausserdem bewirkt die Steuerschaltung 19 eine Beendigung des Integriervorganges im Integrator 13 und die Speicherung des intergrierten Wertes
Kurze Zeit nach dem Zeitpunkt tv liefert die Steuerschaltung 19 einen impuls zum Intergrator 13 zur Abtastung
409828/0744 /1
des gespeicherten Wertes, und zur Überstellung des im Integrator 13 festgehaltenen gespeicherten Wertes A A<2 zur Rechenschaltung 15. Nach Abschluss der Überstellung wird der Integrator 13 zur Vorbereitung des nächsten Arbeitsschrittes wieder rückgestellt.
Zum Zeitpunkt t^ liefert die Steuerschaltung 19 ein Signal an den X-Antrieb 10, durch das' die Bühne 5 in der entgegengesetzten Richtung entlang des Abtastweges d^ be-r wegt wird. Gleichzeitig gelangt ein Signal von der Steuerschaltung 19 zum Spektroskop 2, durch das die Wellenlänge des Lichtpunktes" von ^2 auf Λ-, geändert' wird.
Nachdem die Bühne 5 in der entgegengesetzten Richtung entlang des Abtastweges d^ bewegt worden ist, liefert die Steuerschaltung 19 zum Zeitpunkt t/ ein Signal an den X-Antrieb 10.. Während der Rückführung der Bühne 5 entlang des Abtastweges d^ in die Ausgangsstellung A wird die Rechenschaltung 15 so betätigt, dass· die Lichtmenge ATu, die von der Probe während der Abtastung durch den Lichtpunkt der Wellenlänge /Lp entlang des Abtastweges c* absorbiert wurde, von der Lichtmenge AK* subtrahiert wird, welche von der Probe während der Abtastung mit dem Lichtpunkt der Wellenlänge ^*, entlang des Abtastweges a,, absorbiert wurde-, und dadurch ein Wert m,, = A'TU - AA0 erzeugt wird, welcher die von der Probe absorbierte wahre Lichtmenge ist.
Dieser Wert bzw. die wahre Lichtmenge nu wird dem Addierer 16,-der Anzeige"17 zur Anzeige und dem Drucker zum, Ausdrucken zugeführt.
Nach Abschluss der erläuterten Rechenvorgänge liefert die Steuerschaltung 19 ein Signal an die Rechenschaltung zur Rückstellung ,derselben.
Zum Zeitpunkt % ist die Wellenlänge des Lichtpunktes von/L> ■auf/Lj geändert und der Solenoid 9 abgeschaltet. Anschliessend liefert die Steuerschaltung 19 ein Signal an
409828/07 4-4 /18
den Y-Antrieb 11, wodurch die Bühne 5 um einen Schritt, der bein Ausführungsbeispiel 1 /urn beträgt, in Y-Richtung bewegt wird.· ■
Zum Zeitpunkt tj- liefert die Steuerschaltung 19 ein Signal an den Y-Antrieb 11, wodurch die Bewegung der Bühne 5 in Y-Richtung' angehalten wird. Dieser Zeitpunkt t,- entspricht dem, oben erläuterten Zeitpunkt tp. Ab diesem Zeitpunkt tj- werden die gleichen oben erläuterten Vorgänge entlang den nächstfolgenden Abtastwegen durchgeführt.
Dies bedeutet, dass das Licht bei der Wellenlänge λ~ des Lichtpunktes entlang einem Abtastweg a~ zur Ermittlung des integrierten Weges A*U, gemessen wird. Während die Bühne. 5 entlang des Abtastwegee bp in die Ausgangsstellung A zurückgeführt wird, wird die Wellenlänge des Lichtpunktes von ^Lj in Λρ geändert. Dann wird .das Licht bei der Wellenlänge ftp cles Lichtpunktes entlang des Abtastweges Cp zur Ermittlung des integrierten Wertes A^ gemessen. Während die Bühne 5 entlang des Abtastweges dp in die Ausgangsstellung A zurückgeführt wird, wird die Wellenlänge des Lichtpunktes von /Lp in /^L. geändert und gleichzeitig eine Subtraktion durchgeführt, durch welche eine von der Probe absorbierte wahre Lichtmenge nip = ATL1 - Atu für die zweite Abtastung ermittelt wird. Diese von der Probe absorbierte wahre Lichtmenge m2 wird dem Addierer 16 zugeführt, und schliesslich wird die Bühne 5 in Y-Richtung um 1 /um weiterbewegt.
Wie aus obigem ersichtlich, werden die gleichen Lichtmessungen für aufeinanderfolgende Abtastwege zur Ermittlung der von der Probe absorbierten wahren Lichtmengen m.., nu usv/. durchgeführt. Nachdem die Bühne 5 in Y-Richtung um den zuvor in der Steuerschaltung 19 voreingestellten Abstand Yp bewegt worden und die Lichtmessung für den letzten Abtastweg durchgeführt worden ist, hat die Rechenschaltung 15 die
409828/07
von der Probe absorbierten wahren LicMamengen M^, in^, · · · · mn geliefert und der Addierer 16 eine Gesamtsumme der von allen Teilen der Probe absorbierten wahren Lichtmengen H = m + ??.,.. + .... + mn erzeugt.
Diese Gesamtsumme M der von äer Probe absorbierten wahren Licht-nengen wird von der Inzeige 17 angezeigt und mittels des Druckers 18 ausgedruckt. Schliesslich wird der Addierer 16 zum Abschluss der Messung zurückgestellt.
Die Erfiiidung ist nicht auf das insoweit beschriebene Ausführungsbeispiel beschränkt; es sind verschiedene Abwandlungen möglich. Beim obigen Ausführuiigsbeispiel vrird die spektrale Lichtabsorbanskurve der standarisierten Probe geschrieben, damit die Wellenlänge P^ des Lichtpunktes, bei welchem die von der Probe absorbierte Licirfcinenge ein Maximum ist, und die Wellenlänge·^ des Lichtpunktes, bei welchem die von der Probe absorbierte Lichtaenge Hull ist9 abgelesen und in der Steuerschaltung 19 voreingestellt werden können.
Wie bereits erwähnt richten sich die Ycllenlöngen und Λρ nach der Art des Farbmittels. Es ist deshalb jsöglieh, die Wellenlängen λ,^ und /^2 ^es Lichtpunktes festzulegen, die dem Färbmittel richtig angepasst sind und eine Umschaltung zwisehen diesen beiden Wellenlängen zu bewirken.
Aus dem in Fig. 2 gezeigten Absorptionsspektrum lässt sich erkennen, dass bei einer Färbung mit Feulgenschem Färbmittel die Absorption des Lichtes auch bei einer Wellenlänge von 650 mn nicht beeinflusst wird und daher die Wellenlänge 'S auf 650 mn im roten Bereich festgelegt werden kann. Die
bei '
Lichtenergieyaer Wellenlänge 650 mn im roten Bereich ist im allgemeinen klein und die Photovervielfacher-Röhre 7 ist im Rotbereich weniger empfindlich, so dass eine Festlegung der Wellenlänge A^ auf den Viert von 450 na im blauen Bereich bevorzugt wird.
/20
409828/0744
Beim oben erläuterten Ausführungsbeispiel wird während der Umschaltung von /L, auf A2 entlang der Abtastwege b^ und bo und von A^ auf \* entlang der Abtastwege d. und d-, der Solenoid y abgeschaltet und da'durch die Verdunklungsblende 0 in den Strahlengang eingefügt. Die gleiche Wirkung lasst sich auch mittels eines elektronischen Schalters erreichen, der zwischen der/Photovervielfacher-Röhre 7 und dem Integrator 13 eingefügt ist und während'des Wechsels zwischen den Wellenlängen/Lj und ^ ρ abgeschaltet bzw. betrennt wird.
Die Photovervielfacher-Röhre 7 kann durch ein anderes photoelektrisches Wandler'element, z.B. durch eine photoelektrische Zelle, eine Photodiode, einen Phototransistor, einen Photowiderstand oder ein ähnliches Element ersetzt werden. Jedoch ist die Photovervielfacher-Röhre im Hinblick auf ihre Empfindlichkeit und ihre·Ansprechzeit am besten geeignet.
Beim obigen Ausführungsbeispiel wird der Lichtpunkt stationär gehalten, während die Bühne 5, auf der die Probe befestigt ist, in X- und Y-Richtung bewegt wird. Umgekehrt kann auch die Probe stationär gehalten und der Lichtpunkt in den beiden Richtungen bewegt v/erden. Ausserdem ist es nicht unbedingt notwendig, die Relativbewegung zwischen der Probe und dem Lichtpunkt so einzurichten, dass bei der Abtastung den in Fig. 3 gezeigten Abtastwegen gefolgt wird« Die Abtastwege können in verschiedenster Weise modifiziert v/erden. .
Beispielsweise kann die Probe mittels des Lichtpunktes der Wellenlänge A -, entlang des Abtastweges a.. abgetastet und dann die Wellenlänge von ^. auf/Ip gewechselt werden. Anschliessend wird die Probe entlang des gleichen -Abtastweges b^ in der zur ersten Richtung entgegengesetzten Richtung abgetastet. Dann wird die Wellenlänge des Lichtpunktes von Ti £ aui Λ ι gewechselt und die Probe entlang des Abtastweges äp und anschliessend entlang des gleichen Abtastweges. \>2_ in der gegenüber der ersten Richtung entgegengesetzten
' ' Λ21
A09Ö23/0744
Richtung abgetastet. Die obigen Vorgänge werden wiederholt, so dass die Probe durch den Lichtpunkt mit den Wellenlängen ^1 und rl ρ entlang dem gleichen Abtastweg ineinander entgegengesetzten Richtungen abgetastet wird. In diesem Fall durchläuft die Probe den Abtastweg in einander entgegengesetzten Richtungen, so dass die vom Aufzeichnungsgerät 14 wiedergegebene Kurve bei der Wellenlänge ^ gegenüber der bei der Wellenlänge /U umgekehrt ist. Da jedoch der Integrator 13 unabhängig von der Abtastrichtung arbeitet, sind die erhaltenen Ergebnisse die gleichen. In diesem Fall wird der gleiche Abtastweg vom Lichtpunkt in beiden Richtungen durchlaufen, wodurch der Betriebsablauf,relativ einfach und die Messzeit kürzer wird.
Dabei muss in den Stellungen X = O- und X = XQ die Wellenlänge gewechselt und die Bewegung für eine bestimmte Zeitspanne, während welcher die integrierten Werte verarbeitet v/erden, unterbrochen werden. Beim oben erläuterten Ausführungsbeispiel werden diese Massnahmen durchgeführt, während die Bühne 5 entlang' den Abtastwegen b^ und d,, in die Ausgangsstellung zurückgeführt wird. Deshalb müssen diese Vorgänge nicht an den Stellen X=O bzw. X = XQ unterbrochen werden.
Es ist auch möglich, die Abtastung mittels eines Lichtpunktes durchzuführen, der beide'Wellenlänge ^ und A? hat und in Verbindung zwei, jeweils für eine bestimmte Wellenlänge selektiv empfindliche photoelektrische Wandler zu benutzen. Dadurch lässt sich die von der Probe bei den beiden Wellenlängen ^ und A2 absorbierte Lichtmenge gleichzeitig und getrennt erhalten. In diesem Falle können auch Schaltungen zur getrennten Integrierung der Ausgänge der beiden photoelektrischen Wandler vorgesehen sein. Ausserdem kann der Ausgang des photoel'ektrischen Wandlers für die Wellenlänge A-] und der Ausgang d©s photoelektrischen Wandlers für die Wellenlänge ;\2 einem Differenzverstärker zugeführt; werden.
/22 ,4098 2 8/0744
Dann, "braucht nur ein Integrator zur Integrierung der Differenz zwischen diesen Ausgängen vorgesehen zu sein, mit v/elcIiCEi .sich direkt der integrierte Viert erzeugen lässt, . welcher die von der Probe absorbierte wahre Lichtmenge el, = ΛΑ-, - ATu, repräsentiert. '
Darüber hinaus kann der Ausgang der Arbeitsschaltung 12 einem elektronischen .Rechner zugeführt werden, mit welchem sowohl die Integration als auch die Subtraktion und Addition durchgeführt wird und die gesamte, von der Probe absorbierte wahre Lichtmenge H direkt ermittelt -wird. In diesem Fall kann der elektronische Rechner auch zum Vergleich zwischen verschiedenen Daten und zu ähnlichen Berechnungen im Rahmen einer automatischen Datenverarbeitung herangezogen werden. ■
/Ansprüche
409820/0744

Claims (2)

1.) Photometrisches Verfahren zur mikrospektrographischen Messung der JLachtabsorption einer Probe, dadurch ge
kennzeichnet
dass die Probe mit einem Farb
mittel eingefärbt wird, das eine Wellenlänge TL, eines Lichtpunktes festgelegt wird, bei v/elcher die dem Färbmittel eigene Lichtabsorbans ein Maximum ist, dass eine "WeI-lenlänge /L~ eines Lichtpunktes festgelegt wird, welche ausserhalb des Absorptionsspektrums des Färbmittels liegt, einen Hindestabstand von der Wellenlänge /L^ hat und bei der die dem Färbmittel eigene Lichtabsorbans Hull ist, dass der zu messende Teil der Probe mittels der Lichtpunkte mit den beiden ¥ellenlängen entlang des gleichen Abtastweges abgetastet v/ird, dass eine dem Farbmittel eigene Lichtabsorbanskurve integriert wird, und dass die Lichtabsorbans der Probe beim Durchgang des Lichtpunktes mit der Ivellonlänge A.~ von der Lichtabsorbans der Probe beim Durchgang
des Lichtpunktes'mit der Wellenlänge
-i
subtrahiert *.'irrl
so dass die Lichtabsorbans aufgrund des Lichtverlustes, der für die Probe nicht typisch ist und durch Lichtäiffusion aufgrund von Reflexion, Brechung und Beugung des Lichtes in der Probe verursacht wird,"von der für die Probe typischen Lichtabsorbans subtrahiert und dadurch die v/ahro Lichtabsorbans im Verhältnis"zur Menge der lichtabsorbierenden Substanz in dem. zu untersuchenden Teil der Probe erhalten wird.
2. Mikrospektrometer insbesondere zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch ein Spektroskop (2) mit einem Antrieb zur Umschaltung zwischen zwei verschiedenen Wellenlängen ^ , und 7{ Of wobei bei einer Wellenlänge χ ^ die einem Färbmittel, mit dem die untersuchte Probe gefärbt ist, eigene Lichtabsorbans ein
4098287Ü744
Maximum ist und bei der anderen, ausserhalt, des Absorptionsspektrums des Färbmittels liegenden 'Wellenlänge ^0 d.ie dem Farbmittel eigene Lichtabsorbans I-iull ist, durch eine" Bühne (5) -zur Aufnahme der Probe die mittels eines X-Aiitricbes (10) ind X-Eichtung und mittels eines Y-Antriebes (11) in Y-Riclitung bewegbar ist, durch einen photoelektrischen Wandler (7) •zur Umwandlung des durch den zu untersuchenden Teil der Probe hindurchgegangenen Lichtpunktes in ein elektrisches Signal, durch einen Integrator (13)-zur integration des elektrischen Signales vom photoelektrischen Wandler, und durch eine an den Antrieb des Spektroskops für den Wechsel der Wellenlänge, an den X-Antrieb und an den Y-Antrieb der Bühne· und an den Integrator (13) angeschlossene Steuerschaltung (19) zur Festlegung und Steuerung der Wellenlänge .des vom Spektroskop ausgehenden Lichtpunktes in Abhängigkeit vom Betrieb des X- und des Y-Antriebes, wodurch der zu untersuchende Teil der Probe mittels der Lichtpunkte mit den Wellenlängen ?i^ bzw. 'Ptρ en"tlanS ^es gleichen Abtastweges abtastbar und der Integrator derart steuerbar ist, dass die vom photoelektrischen Wandler abgegebenen elektrischen Signale für . jede Abtastung des zu untersuchenden Teils der Probe mittels der Lichtpunkte mit den beiden Wellenlängen /L-1 und \o getrennt integriert werden.
409828/0744
IS-Lee r s e: i t e
DE19732363188 1972-12-20 1973-12-19 Verfahren zur mikrophotometrischen messung der menge einer bestimmten substanz in einer probe, insbesondere in einem biologischen praeparat Ceased DE2363188B2 (de)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP47127097A JPS4984691A (de) 1972-12-20 1972-12-20

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE2363188A1 true DE2363188A1 (de) 1974-07-11
DE2363188B2 DE2363188B2 (de) 1977-07-07

Family

ID=14951496

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE19732363188 Ceased DE2363188B2 (de) 1972-12-20 1973-12-19 Verfahren zur mikrophotometrischen messung der menge einer bestimmten substanz in einer probe, insbesondere in einem biologischen praeparat

Country Status (3)

Country Link
US (1) US4012146A (de)
JP (1) JPS4984691A (de)
DE (1) DE2363188B2 (de)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0597951B1 (de) * 1991-07-26 1999-03-31 Dade Chemistry Systems Inc. Signalerkennungspruefung in der anwesenheit von einem suspendierten festen träger
US6453060B1 (en) * 1999-06-29 2002-09-17 Tri Path Imaging, Inc. Method and apparatus for deriving separate images from multiple chromogens in a branched image analysis system

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5540809B1 (de) * 1970-03-31 1980-10-20
US3813168A (en) * 1971-03-19 1974-05-28 Hitachi Ltd Two-wavelength spectrophotometer
US3781112A (en) * 1972-12-15 1973-12-25 Technicon Instr Method and apparatus for analysis of leukocytes using light scattered by each leukocyte at absorbing and non-absorbing wavelength
US3811781A (en) * 1973-01-26 1974-05-21 Baxter Laboratories Inc Multi-wavelength photometer employing a rotating variable wavelength filter

Also Published As

Publication number Publication date
JPS4984691A (de) 1974-08-14
DE2363188B2 (de) 1977-07-07
US4012146A (en) 1977-03-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE3908831C2 (de)
DE2137332C3 (de) Kolorimeter zur Bestimmung einer Anzahl von Substanzen in einem Fluid
DE2422016A1 (de) Diagnose von krankheitszustaenden durch fluoreszenzmessungen unter verwendung von abtastlaserstrahlen
DE2818841A1 (de) Mikroskop zum ermitteln von fluoreszenzen
DE19949029C2 (de) Verfahren und Vorrichtung zur Charakterisierung einer Kulturflüssigkeit
EP2316023B1 (de) Analysesystem mit Codierungserkennung
DE19533092A1 (de) Vorrichtung zur parallelisierten Zweiphotonen-Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (TPA-FCS) und deren Verwendung zum Wirkstoff-Screening
DE2502013B2 (de)
EP2380008B1 (de) Verfahren und system zur charakterisierung einer probe mittels bildgebender fluoreszenzmikroskopie
DE1472081B1 (de) Anordnung zur vergleichenden spektral-,insbesondere flammenphotometrischen Analyse
DE19915137C2 (de) Verfahren zur Quantifizierung mehrerer Fluorochrome in einer mehrfach gefärbten Probe bei der Fluoreszenzmikroskopie und Verwendungen des Verfahrens
EP2446314A1 (de) Verfahren zum auswerten von fluoreszenzereignissen in einem mikroskopbild
EP1461600B1 (de) Verfahren zur identifikation von fluoreszierenden, lumineszierenden und/oder absorbierenden substanzen auf und/oder in probenträgern
DE3546056C2 (de) Vorrichtung zur Messung der integralen Extinktion einer Probe
DE3206147A1 (de) Detektor fuer chromatographen
DE2537343C3 (de) Verfahren zur densitometrischen Messung einer auf einem Trägermaterial entwickelten Substanzzone und Densitometer zur Durchführung des Verfahrens
DE2405810B2 (de) Digital-photometer zur selbsttaetigen messung der enzymaktivitaet mehrerer proben
DE2015316B2 (de) Vorrichtung zur Analyse von Flüssigkeiten im Ablauf einer chromatographischen Säule
DE2103691A1 (de) Vorrichtung zum optischen Messen und Vergleichen der Charakteristiken von mit Probenmatenal versehenen Chromatographie platten
EP0315666A1 (de) Anordnung zur messung eines zustandswertes für organische gewebeflächen
DE2306764A1 (de) Mikroschwaerzungsmessverfahren und mikroschwaerzungsmesser bzw. mikrodensitometer
DE102010033614A1 (de) Spektroskopisches Reflektometer
DE867757C (de) Lichtelektrische Pruefeinrichtung
DE2363188A1 (de) Verfahren und vorrichtung der mikrospektrographie
DE2742957C2 (de) Mikroskop-Photometer

Legal Events

Date Code Title Description
8235 Patent refused