DE2405498C2

DE2405498C2 - Verfahren zur Herstellung trägerfixierter biologisch aktiver Verbindungen

Info

Publication number: DE2405498C2
Application number: DE2405498A
Authority: DE
Inventors: Jiri Dipl.-Ing. Coupek; Jiri Dipl.-Ing. Hradil; Miroslava Dipl.-Ing. Krivakova; Jiri Dipl.-Ing. Stamberg; Artur Prag / Praha Stoy; Jaroslava Dipl.-Ing. Cesky Brod Turkova
Original assignee: Czech Academy of Sciences CAS
Current assignee: Czech Academy of Sciences CAS
Priority date: 1973-02-05
Filing date: 1974-02-05
Publication date: 1984-12-06
Also published as: AU6517174A; JPS49109580A; SE409328B; AT326596B; FR2216298B1; NL7401523A; DE2405498A1; CS167593B1; GB1412563A; BE810622A; CH615440A5; US3964973A; JPS58872B2; CA1025172A; ATA67774A; FR2216298A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung trägerfixierter biologisch aktiver Verbindungen nach dem Oberbegriff des Anspruchs 1.

Zur Trägerfixierung von biologisch aktiven Verbindungen, wie Enzymen, Coenzymen, Enzyminhibitoren, Hormonen, Antigenen, Antikörpern und immunaktiven Verbindungen wurden bereits poröses Glas, Cellulose und ihre Derivate, Stärke, Derivate von Polystyrolen, Ethylcn-Maleinsäureanhydrid-Copolymerisate, Polyacrylamid und Polysaccharide verwendet. Nachteile fast aller dieser Materialien sind die geringe mechanische Festigkeit, die geringe Hydrolysebeständigkeit bzw. die hydrophoben Eigenschaften der Oberfläche des Trägcrmaterials.

Bei geringer mechanischer Festigkeil des Trägcrmaterials scheidet ein Arbeiten unter Druck aus, was zur Erzielung höherer Durchflußgeschwindigkeiten durch Gelsäulen erforderlich ist. Nur geringe mechanische Festigkeit besitzen Polysaccharide und biologische Substanzen, die in weitmaschig vernetzte dreidimensionale Polymernetzwerke eingeschlossen sind, wodurch unter anderem durch Diffusionsprozesse die biologische Aktivität der eingeschlossenen Substanzen oft sehr stark beeinträchtigt wird. Die geringe Hydrolysebeständigkeit (z. B. von Polysacchariden) ist andererseits bei der Trägerfixierung von Enzymen nachteilig. Es sind ferner auch Fälle bekannt, in denen die Umsetzung eines Substrats mit einer biologisch aktiven, trägerfixierten Substanz durch ungenügende Hydrophtlie der Trägeroberfläche (z. B. bei Polystyrol) oder durch unspezifische Sorptionen an seiner Oberfläche kompliziert wird.

Die Vorteile trägerfixierter biologisch aktiver Substanzen kann am Beispiel unlöslicher Enzyme veranschaulicht werden. Die jährliche Weltproduktion von Enzymen, die zur Katalyse chemischer Reaktionen in der pharmazeutischen Industrie und in der Lebensmittelindustrie verwendet werden, beträgt Tausende von Tonnen. Ihre breitere Anwendung in industriellem MaB-stab wird jedoch durch Herstellungsschwierigkeiten, die relativ hohen Gestehungskosten, die geringe Stabilität und nicht zuletzt auch die unwirtschaftlichen Anwendungsbedingungen verhindert, da die bisher bekannteil Verfahren keine Regeneration der verwendeten Enzymeermöglichen.

Die Bindung löslicher Enzyme an einem polymeren Träger ermöglicht andererseits die Regeneration der Enzyme und ihre wiederholte Anwendung sowohl bei

diskontinuierlichen als auch bei kontinuierlichen Verfahren.

In Chemical Abstracts 74,20 260 r (1971), ist die Bindung von Enzymen an der Innenseite von Polyamidschläuchen durch kovalente Bindung beschrieben. Dabei werden durch Hydrolyse auf der Innenoberfläche der Schläuche freie Carboxylgruppen erzeugt, die danach mit ßenzidin bzw. durch Umwandlung in Säurehydrazidc für die Bindung der Enzymmoleküle aktiviert werden. Aus Chemical Abstracts 74 38 657 k (1971) ist ferner die Bindung von Enzymen an der Oberfläche von Polyamidschläuchen unter Verwendung von Glutaraldehyd als bifunktionelles Reagens zur Aktivierung bekannt, !n beiden Fällen ist der polymere Träger zwar im wesentlichen hydrophob, jedoch nicht makroporös und weistdahernichtdieerforderlichegroßeOberflächeauf. In Biochem. J. 120(1970)215—219 ist ferner die kovalente Bindung von Enzymen an eine Polystyrolmatrix beschrieben, wobei der polymere Tröger sowohl Perlenals auch Schlauchform aufweisen kann. Das als Trägermaterial dienende Polystyrol ist hydrophob und wird bei diesem Verfahren durch teilweise Nitrierung, nachfolgende Reduktion der Nitrogruppen und Diazotierung der entstandenen Aminogruppen aktiviert.

Aus der US-PS 37 11 574 ist die kovalente Bindung von biologisch aktiven Proteinen an polymere Träger beschrieben, der Copolymere aus Acrylamid, Ethylen, Maleinsäure oder Maleinsäureanhydrid und N₁N-Methylen-bis(acrylamid) darsteilen. Diese Copolymeren enthalten Säureanhydridgruppen, die zur Bindung der biologisch aktiven Proteine dienen können, sofern sie an ω der Oberfläche des Copolymers liegen. Die Säureanhydridgruppen stammen aus den Ausgangsmonomeren des Copolymers, werden also bereits bei der Copolymerisation /ur Herstellung des polymeren Trägers eingeführt. Die entsprechenden Copolymeren sind hydrophil und ferner wegen geringer Vernetzung extrem quellungsfähig. Durch stärkere Vernetzung wird andererseits die Bindungsfähigkeit verringert. Aus dieser Patentschrift geht ferner hervor, daß es schwierig ist. eine

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ausreichende Bindung der biologisch aktiven Substan- Die erfindungsgemäß eingesetzten Polymerisate bezen am Träger zu erzielen und zum anderen eine !nakti- sitzen entsprechend reaktive Säureanhydridgruppen an vierung der biologisch aktiven Substanzen zu vermei- der Oberfläche. Sie stellen reaktive Acylierungsmittel den. Hierzu werden Copolymere aus den angegebenen dar. die z. B. zu Umsetzungen rait Hydroxyl- oder Thiol-Monomeren in bestimmten Mischungsverhältnissen 5 grupper· herangezogen werden. Die Erzeugung der hergestellt, die einen hohen Gehalt an Säureanhydrid- Säureanhydridgruppen kann auch durch Erhitzen des gruppen aufweisen. Diese Säureanhydridgruppen befin- hydrophilisierten Polymerisats bzw. Copolymerisats auf den sich jedoch nicht nur an der Oberfläche des polyme- Temperaturen von 200 bis 250⁰C während 30 bis ren Trägers, sondern vor allem auch im Inneren der 300 min unter Drücken von 0.01 bis 0,27 mbar (0,2 bis Polymermatrix. Diese Säureanhydridgruppen im Inne- 10 0,01 Torr) durchgeführt werden,
ren der Polymermatrix können nach und nach auch hy- Erfindungsgemäß liegen die Säureanhydridgruppen drolysiert werden, wodurch der Träger seine Festigkeit in hoher Konzentration in einer hydrophilisierten Ober- und Form verliert Ferner ist auch bei hohem Gesamt- flächenschicht der Polymermatrix vor. die insbesondere gehalt an Säureanhydridgruppen die Konzentration der auf der Basis von Estern oder Nitrilen von Polyacryl-Säureanhydridgruppen an der Oberfläche für die Bin- 15 und Polymethacrylsäuren beruht, wobei die guten medung genügender Mengen biologisch aktiver Verbin- chanischen Eigenschaften des Ausgangspolymerisats düngen unzureichend. erhalten bleiben. Die guten mechanischen Eigenschaf-Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Vcr- ten der hydrophoben makroporösen Ausgangspolymefahren zur Herstellung trägerfixierter biologisch aktiver risate mit hydrophilisierter Oberfläche und mit reakti-Verbindungen anzugeben, bei dem die Nachteile her- 20 ven Säureanhydridgruppen ermöglichen nicht nur die kömmlicher Verfahren nicht auftreten und das zu Pro- Bindung biologisch aktiver Substanzen, sondern erleichdukten mit hoher mechanischer Festigkeit, hoher Hy- tern auch ihre Anwendung. Zum Verfahren nach der drolysebeständigkeit und hydrophilen Oberflächenei- Erfindung sind stark vernetzte Polymerisate am besten genschaften bei zugleich ausreichender Bindungsfähig- geeignet. Manche überhaupt nicht quellenden Polymerikeit führt 25 sate, wie Polyacrylnitril oder Polymethylmethacrylat, Die Aufgabe wird anspruchsgemäß gelöst können auch in unvernetztem oder gering vernetztem Vorteilhafte Weiterbildungen sind Gegenstand der Zustand verwendet werden. Eine Vernetzung kann Unteransprüche. nicht nur durch Zugabe von Vernetzungsmitteln, son-Das erfindungsgemäße Verfahren beruht darauf, daß dem auch durch Kettenübertragung erzielt werden, beaktive Säureanhydridgruppen, die zur Bindung biolo- 30 sonders bei Acrylnitril.

gisch aktiver Substanzen befähigt sind, in dünner Nach der Erfindung können Polymerisate mit den Schicht auf der Oberfläche eines makroporösen, im we- verschiedensten Gehalten an Säureanhydridgruppen in sentlichen hydrophoben Polymerisats oder Copolymer!- einfacher Weise hergestellt werden. So werden z. B. Posats durch Oberflächenhydrolyse und weitere Aktivie- lyacrylate. Polymethacrylate, Polyacrylnitrile bzw. PoIyrung gebildet werden, wonach der Träger mit der biolo- 35 methacrylnitrile durch Umsetzen mit 2 M- bis 9 M-Nagisch aktiven Substanz umgesetzt wird. Diese weitere tronlauge bei Temperaturen von 80 bis 130⁰C innerhalb Aktivierung besteht in der Umwandlung freier Carbox- von 0,5 bis 2 h zum erwünschten Grad hydrolysiert, woylgruppen durch Erhitzen unter vermindertem Druck bei die Reaktion bekannterweise in Mikroblöcken, vor- oder durch Einwirkung von Anhydride bildenden Mit- zugsweisc in Abschnitten mit ataktischer Struktur, fortteln in entsprechende Säureanhydridgruppen. 40 schreitet. Dadurch werden in der hydrophilisierten Nach der vorliegenden Erfindung können trägcrfi- Oberflächenschicht Bereiche gebildet, in denen eine xierte biologisch aktive Substanzen, wie z. B. Enzyme, ausgeprägte Disposition zur Bildung bevorzugt sechs-Coenzyme, Enzyminhibitoren, Antikörper, Antigene, gliedriger Säurcanhydridringe besteht. Dieses Ergebnis Hormone, immunaktive Verbindungen und Antibiotica, kann durch Copolymerisation monomerer Säuren nicht durch Bindung an oberflächlich hydrophilisierten, im 4? erreicht werden, weil die Carboxylgruppen dann in den wesentlichen hydrophoben und nicht quellenden ma- Ketten nur statistisch verteilt vorliegen wurden, wokroporöse Polymerisaten und Copolymerisaten herge- durch die Wahrscheinlichkeit der Bildung von cyclischer stellt werden, z. B. auf der Basis von Alkyldiacrylaten, Säureanhydridc verringert wäre. Nach dem erfindungs-Alkyldimethacrylaten, Oligo- oder Polyglycoldiacryla- gemäßen Verfahren erfolgt nach der partiellen alkaliten, Oligo- oder Polyglycoldimethacrylaten, Alkylendia- 50 sehen Hydrolyse eine saure Behandlung zur Freisetzung crylamiden, Hydroxyalkylacrylaten, Hydroxyalkylme- der Carboxylgruppen und schließlich die Bildung der thacrylaten, Oligo- oder Polyglycolacrylaten, Oligo- Säureanhydridgruppen durch thermische Dehydrata- oder Polyglycolmethacrylaten, Acrylnitril oder Metha- tion bei Temperaturen von 200 bis 250⁰C und unter crylnitril, wobei diese Monomeren teilweise durch Vi- einem Druck <O,27 mbar (0,2 Torr) sowie gegebenennylmonomere, z. B. Vinylanilin, Vinylpyridin oder Vinyl- 55 falls unter Umsetzung mit bekannten Mitteln zur BiI-carbazol, ersetzt werden können. Solche makroporösen dung von Säureanhydriden wie z. B. Acetanhydrid bei Copolymerisate werden oberflächlich durch partielle Temperaturen von 20 bis 140⁰C oder Thionylchlorid bei Hydrolyse hydrolysiert und dadurch aktiviert, daß be- Temperaturen von —10 bis +20°C. Die beiden letzten nachbarte Carboxylgruppen in Säureanhydridgruppen Reaktionen können vorteilhaft durch Pyridin oder andeübergeführt werden. Die so hydrophilisierten und akti- 60 re Stickstoffbasen katalysiert werden. Die entstandenen vierten Gele werden anschließend mit löslichen biolo- reaktiven Säureanhydridgruppen sind durch IR-Spekgisch aktiven Verbindungen so umgesetzt,daß diese un- tren(Banden bei 1785 und 1050cm-')nachweisbar,
ter Ausbildung kovalenter Bindungen und Erhaltung ihrer vollen Aktivität am Träger fixiert werden. Die Hy- Beispiel 1
drolyse wird in alkalischem oder saurem Milieu durch- 65

geführt, vorzugsweise mit 2 M- bis 10 M-Nalronlauge 2,5 Gew.-Teile eines wenig hydrophilen makroporö-

bei Temperaturen von 60 bis 135°C innerhalb von 30 bis sen Gels mit einer spezifischen Oberfläche von 209 m²/g

120min. aus 90Gew.-% Ethylendimethacrylat und 10Gew.-%

2-HydroxyethylmethacryIat werden mit 10 Gew.-Teilen 9 M-Natronlauge durch Erhitzen auf 125°C 1 h hydrolysiert Das so hydrophilisierte Gel wird abfiltriert, durch 200 Gew.-Teile 2 M-HCl in die H⁺ Form übergeführt, mit Wasser gründlich gewaschen und im Vakuumexsikkator getrocknet Reaktive Säursanhydridgruppen werden durch 4 h Erhitzen des an der Oberfläche hydrophilisierten Copolymerisats auf 230° C unter einem Druck von 0,13 mbar (0.1 Torr) gebildet Das dehydratisierte Gel wird dann in 75 Gew.-Teilen 2 M-Phosphatpuffer bei pH 74 quellen gelassen; nach dem Abkühlen des Gemischs wird unter Rühren eine Lösung aus 1 Gew.-Teil Chymotrypsin und 25 Gew.-Teilen 2 M-Phosphatpuffer zugefügt Danach wird das Gel mit dem chemisch gebundenen Enzym abgesaugt mit Puffer und Wasser gewaschen und durch Waschen mit 400 Gew.-Teilen einer 0,1 M-Natriumboratlosung und 1 M-Natronlauge (pH 8,5), danach mit 300 Gew.-Teilen 0,1 M-Natriumacetat (pH 4,1) unc* 300 Gew.-Teilen 0,01 M-Natriumacetat (pH 4.1) aktiviert. Die Konzentration des auf diese Weise trägerfixierten Enzyms betrag! 3 mg/ml Gel. Das gebundene Enzym weist esterspaltende und proteolytische Aktivität auf.

Beispiel 2

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2.4 Gew.-Teile hydrophobes makroporöses Polyethylendiacrylat einer Korngröße von 0,1 bis 0,2 mm werden in 10 Gew.-Teilen 9 M-NaOH gequollen und durch 0,5 h Erhitzen auf 130⁰C hydrolysiert Nach Überführung in die H+-Form werden durch 4 h Erhitzen auf 225°C unter einem Druck von 0,13 mbar (0,1 Torr) Säureanhydridgruppen gebildet. Danach wird wie in Beispiel 1 Chymotrypsin an das Gel gebunden. Die Menge des gebundenen Enzyms beträgt 13 mg/ml Gel.

Beispiel 3

2.5 Gew.-Teile eines wenig hydrophilen makroporösen Copolymerisats von Ethylendimethacrylat mit 50 Gew.-% 2-Hydroxyethylmethacrylat mit einer spezifischen Oberfläche von 97,2 m²/g werden 2 h mit 9 M-NaOH bei 125°C hydrolysiert. Nach Überführung in die

H+-Form wird durch 4 h Erhitzen des Gels auf 20O⁰C unter einem Druck von 0,07 mbar (0.05 Torr) auf der Oberfläche eine Säureanhydridschicht hergestellt. An das aktivierte Gel wird wie in Beispiel 1 Chymotrypsin gebunden. Die Menge des gebundenen aktiven Enzyms beträgt 7,6 mg/ml Gel.

Beispiel 4

50

23 Gew.-Teile eines Gels aus Diethylenglycolmethacrylat mit 50Gew.-% Diethylenglycoldimethacrylat werden mit 10 Gew.-Teilen 9 M-NaOH bei 80°C 2 h hydrolysiert. Nach der Reaktion wird das Gel abfiltriert und mit 200 Gew.-Teilen 2 M-HCl in die H⁺-Form übergeführt, mit Wasser gewaschen und bei 78°C und 0,07 mbar (0,05 Torr) getrocknet. Das auf der Oberfläche hydrolysierte Gel wird in 200 Gew.-Teilen Diethylether mit 2,5 Gew.-Teilen Pyridin suspendiert. Nach Zugabe von 2.5 Gew.-Teilen Acetanhydrid in 10 Gcw.-Teilen Diethylether wird bei Raumtemperatur 4 h lang gerührt. Danach wird auf einer Glasfritte abgesaugt, mit 100 Gew.-Teilen Eiswasscr und 10 Gew.-Teilen Ethanol μ gewaschen, abgesaugt und im Vakuum getrocknet. Unmittelbar anschließend wird wie in Beispiel I weiter verfahren.

Beispiel 5

2,5 Gew.-Teile eines makroporösen Copolymerisats aus Ethylendiacrylat und 5CGew.-% 2-Hydroxyithylmethacrylat werden wie in Beispiel 1 hydrolysiert mit dem Unterschied, daß das oberflächlich hydrolysierte Gel nach dem Waschen und Trocknen ohne weitere chemische Umsetzungen mit 5 Gew.-Teilen Acetanhydrid bei 118 bis 140⁰C Rückfluß erhitzt wird. Nach der Umsetzung wird die Suspension auf 0⁰C abgekühlt und abfiltriert; das Gel wird mit 200 Gew.-Teilen Eiswasser und Ethanol gewaschen und im Vakuum getrocknet Das auf diese Weise aktivierte Gel wird in 75 Gew.-Teilen Phosphatpuffer (pH 7.5) quellen gelassen. Dann wird das Gemisch abgekühlt und unter Rühren mit einer Lösung aus 1 Gew.-Teil Trypsin und 25 Gew.-Teilen Puffer versetzt Nach 24 h Rühren bei 4°C wird das Gemisch wie in Beispiel 1 weiterverarbeitet.

Beispiel 6

2.5 Gew.-Teile eines wenig hydrophilen makroporösen Gels aus 75Gew.-% Ethylendimethacrylat und 25 Gew.-% 2-Hydroxyethylmethacrylat mit einer spezifischen Oberfläche von 159,7 m²/g werden in 10 Gew.-Teilen 9 M-NaOH gequollen und bei 100⁰C 2 h an der Oberfläche hydrolysiert Dann wird das Gel gründlich mit Wasser gewaschen und bis zur Gewichtskonstanz getrocknet Das umgesetzte Gel wird in 20 Gew.-Teilen Diethylether suspendiert; das Gemisch wird dann auf — 10⁰C abgekühlt Zu der erhaltenen Suspension wird eine Lösung aus 0,6 Gew.-Teilen Thionylchlorid und 5 Gew.-Teilen Diethylether unter Rühren zugetropft, wobei sofort ein Niederschlag von Natriumchlorid ausfällt Dann wird noch 1 h bei -1O⁰C weiter gerührt, danach auf einer Glasfritte abgesaugt mit 100 Gew.-Teilen Eiswasser und 10 Gew.-Teilen Ethanol gewaschen, abgesaugt und im Vakuum getrocknet oder ohne weitere Umsetzungen wie in Beispiel 1 weiter behandelt.

Beispiel 7

2.4 Gew.-Teile eines hydrophoben makroporösen Copolymers aus Methylmethacrylat und Ethylendimethacrylat mit einer Korngröße von 100 bis 200 μηι werden an der Oberfläche hydrophilisiert. aktiviert und zur Trägerfixierung von Chymotrypsin nach Beispiel 1 verwendet. Die Menge des gebundenen Chymotrypsins beträgt 1.4 mg/ml Gel.

Beispiel 8

Ein makroporöses hydrophobes Copolymerisat aus 50 Gew.-% Acrylnitril und 50 Gew.-% Ethylendimethacrylat wird nach Hydrophilisierung und Aktivierung wie in Beispiel 1 zur Trägerfixierung von Enzymen verwendet.

Beispiel 9

Ein Gemisch aus 53 Gew.-Teilen Acrylnitril und 47 Gew.-Teilen 65%iger Salpetersäure wird mit 0,1 g Ammoniumperoxiddisulfat, 0,3 g Dimethylaminocthylacetat und 0,005 g Silbernitrat als Katalysatorsystem versetzt, wobei das Peroxydisulfat und das Silbernitrat als 10%ige wässerige Lösungen eingesetzt werden. Die Polymerisation wird 5d bei 15°C unter Sauerstoffaus-

Schluß in einem Glaszylinder durchgeführt. Die Lösung verwandelt sich dabei in eine weiße Substanz, die sich einfach aus dem Zylinder herausnehmen läßt, da bei der Polymerisation eine Schrumpfung eintritt. Der Zylinder aus porösem Polyacrylnitril wird dann zuerst 1 d lang mit Leitungswasser und 1 d lang in einer einige Male erneuerten l%igen wässerigen Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen, wobei die Waschflüssigkeit durch den in einem aufgezogenen Mantel aus Polyethylen dicht eingeschlossenen Zylinder hindurchgesaugt to wird. Danach wird die Alkalihydrolyse durchgeführt, indem 6 M-Natronlauge einer Temperatur von 90⁰C und schließlich destilliertes Wasser bis zur neutralen Reaktion durch die poröse Säule hindurchgesaugt wird. Die Säule wird dann mit durchgesaugier warmer Luft ge- is trocknet, abgekühlt und mit gekühltem Diethylether (-10⁰C) gewaschen. Danach wird unter äußerer Kühlung auf -1O⁰C eine gleichfalls abgekühlte 10%ige etherische Lösung von Thionylchlorid in die Säule angesaugt, wodurch reaktive Säureanhydridgruppen gebildet werden. Danach wird der Ether abgesaugt; durch die Säule wird destilliertes Wasser bis zur neutralen Reaktion durchgesaugt. Die Säule läßt sich in diesem Zustand zur Bindung biologisch aktiver Substanzen auf die in den vorhergehenden Beispielen beschriebene Weise verwenden.

Beispiel 10

Ein Gemisch aus 30 Gew.-Teilen Acrylnitril, 20 Gew.-Teilen Methylmethacrylat, 10 Gew.-Teilen Divinylbenzol und 40 Gew.-Teilen Toluol wird mit 0,2 Gew.-Teilen Azoisobuttersäuredinitril als Initiator versetzt und in Suspension in gesättigter Natriumchloridlösung bei 75°C copolymerisiert. Nach 8 h wird der Feststoff aus der Suspension abgetrennt, mit Ether gewaschen, getrocknet und in eine Kolonne gefüllt, durch die bei 100°C 1 h lang 5 M-Natronlauge im Kreislauf geführt wird. Anschließend wird das Polymerisat in der Kolonne mit Wasser bis zur neutralen Reaktion gewäsehen, mit einem durchgesaugten Warmluftstrom getrocknet, mit gekühltem Ether und mit einer Lösung von Thionylchlorid gespült und dann wie in Beispiel 9 weiter verarbeitet

Die Dicke der hydrolysierten Schicht auf der Oberfläehe des hydrophoben Polymerisats hängt sowohl von der Konzentration des Hydrolysemittels als auch von der Temperatur und der Einwirkungsdauer ab. Diese Bedingungen können daher beliebig nach bekannten Regeln geändert werden, z. B. so, daß man bei niedrige- ftf Rcägcriskönzcnifätiön höhere Temperaturen anwendet oder bei höherer Temperatur kürzere Zeit einwirken läßt.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist nicht auf die in den Beispielen angeführte alkalische Hydrolyse beschränkt; alternativ kann auch saure Hydrolyse unter Verwendung starker Mineralsäuren wie z. B. Schwefelsäure oder Salzsäure angewandt werden, wobei die Überführung des Polymerisats in die H+-Form dann entfällt Bei der Hydrolyse von Nitrilgruppen muß jedoch in diesem Fall mehr verdünnte Säure verwendet und bei höherer Temperatur hydrolysiert werden, da sonst vorwiegend Amidgruppen entstehen. Aus diesem Grund eignet sich die saure Hydrolyse besser zur Spaltung von Estergruppen z. B. von Polyacrylaten oder Polymethacrylaten als zur Hydrolyse von Nitrilgruppen.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung trägerfixierter biologisch aktiver Verbindungen, die kovalent an einen polymeren Trägergebunden sind.

durch Umsetzung der biologisch aktiven Verbindungen mit Säureanhydridgruppen auf dem polymeren Träger, dadurch gekennzeichnet, daß die Säureanhydridgruppen durch Oberflächenhydrolyse eines makroporösen, im wesentlichen hydrophoben und nicht quellenden Polymerisats oder Copolymerisats unter Bildung von freien Carboxylgruppen und deren Überführung in Säureanhydridgruppen gebildet werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Bildung der Säureanhydridgruppen durch Erhitzen unter vermindertem Druck oder durch wasserabspaltende Mittel vorgenommen wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als polymerer Träger ein Polymerisat oder Copolymerisat von Alkyldiacrylaten, Alkyldimethacrylaten, Oligo- oder Polyglycoldiacrylaten, Oligo oder Polyglycoldimethacrylaten, Alkylendiacrylamiden, Hydroxyalkylacrylaten, Hydroxyalkylmethacrylaten, Oligo- oder Polyglycolacrylaten, Oligo- oder Polyglycolmethacrylaten, Acrylnitril. Methacrylnitril oder Copolymerisate dieser Substanzen mit Vinylverbindungen wie Vinylanilin, Vinylpyridin und Vinylcarbazol verwendet wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Oberflächenhydrolyse des polymeren Trägers durch Erhitzen in alkalischem Milieu vorgenommen wird.

' 5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Oberflächenhydrolyse mit 2 M- bis 10 M-Natronlauge vorgenommen wird.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Oberflächenhydrolyse bei 60 bis 135° C 30 bis 120 min durchgeführt wird.

7. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Bildung der Säureanhydridgruppen durch 30 bis 300 min Erhitzen auf 200 bis 250°C unter einem Druck von 0,01 bis 0,27 mbar vorgenommen wird.