DE2559410A1 - Ester der clavulansaeure, verfahren zu ihrer herstellung und diese verbindungen enthaltende arzneimittel - Google Patents

Description

DIPL-CHEM. DR. ELISABETH JUNG
DIPL-PHYS. DR. JÜRGEN SCHIRDEWAHN D R. -!N G. GERHARD SCHMITT-NI LS ON PATENTANWÄLTE

β WONCKEf: 4C, CLEMCNSS-RASSE CO TELEFON W 50

TELEGRAMM-ADRESSE: INVENT/MONCHEN TELEX 5-29 βθβ

u.Z.: J 561 C/Div.I (J/vdB/or)
Case A.826

30. April 1976

P 25 59

BEECHAM GROUP LIMITED

Brentford, Middlesex, Großbritannien

"Ester der Clavulansäure, Verfahren zu ihrer Herstellung und diese Verbindungen enthaltende Arzneimittel"

Beanspruchte Prioritäten:

20. April 1974 - Größbritannien

21. Juni 1974 - Großbritannien 9. Okt. 1974 - Großbritannien

11. Dez. 1974 - Großbritannien Nr. 17 410/74 Nr. 27 715/74 Nr. 43 651/74 Nr. 53 525/74

Die Erfindung betrifft neue Mittel gegen Bakterien, die aus Streptomyces clavuligerus isoliert werden können. Diese neuen Mittel sind Ester der Clavulansäure, die die nachstehende Formel I besitzt:

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_f CH₂OH

(D

Streptomyces clavuligerus ist ausführlich beschrieben worden wob Higgens und Mitarbeitern in Int.J.Systematic Bacteriology 21_ (1971)» S. 326. Dieser Mikroorganismus war insofern interessant, als er bestimmte ß-Lactam-Antibiotika erzeugt, wie Penicillin N, T-- (S-Amino-S-carboxy valeramido )-3-carbamoy loxymethyl-jj-cephem-²*-- sarbonsäure und 7-(5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-carbamoyloxy-Eaethyi-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure. Dieser Mikroorganismus
ist bei der Agricultural Research Service Collection unter der
Mummer NRRL 3585 und bei der American Type Culture Collection
■■ a%er der Nummer ATCG 27064 hinterlegt worden. Streptomyces cla- ¥Hligerus ist auch in der US-PS 3 770 590 und von Nagarajan und
Mitarbeitern in JcAmer.Chem.Soc. 93 (197I)₃ S. 2308, Brannon und Mitarbeitern in Anfcimicrob.Agents Chemother. 1_ (1972), S. 237 und g*7 und Higgens und Mitarbeitern in J.Antibiotics 27 (197*0,
So 298^ erwähnt worden.=

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ß-Lactamasen sind Enzyme, die den ß-Lactanning γοη Penicillinen und Cephalosporinen öffnen und Produkte liefern, die keine antibakterielle Wirksamkeit mehr besitzen. Derartige Enzyme werder; von verschiedenen Bakterien erzeugt, z.B. Spezies oder Stämmen von Escherichia,! Klebsiella, Proteus, Pseudomonas, Enterobacter und Staphylococcus; Diese Enzyme sind in vielen Fällen die Erklärung für eine Widerstandsfähigkeit bestimmter Stämme solcher Organismen gegenüber manchen Penicillinen und Cephalosporinen. Die Bedeutsamkeit einer ß-Lactamase-Erzeugung wird verständlich, wenn offensichtlich wird, daß ein hoher Anteil von klinisch isolierten Organismen ß-Lactamasen erzeugen (vgl. z.B. M. Wilson und I.A. Freeman in Bacteriological Proceedings 8θ (I969), wo in dem Aufsatz "Penicillin Inactivation by Gram-negative Bacilli" die Autoren gezeigt haben, daß 84 Prozent der gramnegativen Organismen, die in einem amerikanischen Krankenhaus isoliert worden sind, ß-Lactamase erzeugen). In zahlreichen Fällen sind bestimmte Penicilline oder Cephalosporine unwirksam bei der Behandlung von Krankheiten, die keine ß-Lactamase erzeugenden Organismen wegen des allgemeinen Auftretens einer Nebeninfektion durch einen ß-Lactamase-Erzeuger zugeschrieben werden (vgl. z.B. R. May und Mitarbeiter in Brit.J.Dis.Chest. 66 (1972), S. I85).

Anwendungsbeispiele von bestimmten ß-Lactamase-resistenten halbsynthetischen Penicillinen und Cephalosporinen als ß-Lactamase-Hemmstoffe und Synergisten für penicilline und Cephalosporine sind bereits in der Literatur beschrieben, z.B. von Sutherland wid Mitarbeiter in Nature 201 (1964), 868; Sabatn und Mitarbeiter in Nature 204 (1964), IO66; O'Callaghan und Mitarbeiter in Antimicrob. Agents and Chemotherapy I968 \:<jS9l, ^r7- Jeüocn

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besitzt keine dieser bekannten Substanzen einen besonders eindrucksvollen Effekt auf das Spektrum des anderen, im Gemisch vorliegenden Antibiotikums.

Es ist auch von einigen Actinomycetes-Züchtungen beschrieben worden, daß sie ß-Lactamase-Hemmstoffe erzeugen, z.B. die in · - -- .'..-. .

der GB-PS 1 363 075 und von Hata und Mitarbeitern in J.Antibio-

tics 25 (1972), S. 473 und Umezawa und Mitarbeitern in J.Antibiotics 26 (1973), S. 51, beschriebenen Züchtungen. Von diesen S-Lactamase-Hemmstoffen von Actinomycetes ist bisher noch keine klinische Verwendbarkeit festgestellt worden. Besonders bemerkenswerte Merkmale, die Clavulansäure von anderen ß-Lactamase-Hemm-

stoffen von Actinomyceten unterscheiden, sind ihre Extrahierbarkeit in organische Lösungsmittel aus dem Nährmedium bei pH 2, ihre hohe Stabilität in Menschenblut und ihr breites Antibiotika-Spektrum und ß-Lactamase-Hemmwirkung, ihr niedriges Molekulargewicht und .ihr hoher R_f-Wert bei der Papierchromatographie bei Anwendung zahlreicher Lösungsmittelsysteme.

Durch aerobes Züchten von Streptomyces clavuligerus in üblichen Nährmedien bei etwa 25 bis 3O⁰C unter annähernd neutralen Bedingungen kann man eine ß-Lactamase-Hemmsubstanz erzeugen, die auch eine antibakterielle Wirksamkeit besitzt. Diese

neue Substanz wird als "Clavulansäure" bezeichnet.

Clavulansäure hat folgende Eigenschaften:

(a) Sie ist eine Carbonsäure; ■ "

sie bildet ein Natriumsalz, das ein charakteristisches

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Infrarot-Spektrum besitzt, wie es im wesentlichen aus der Pig. I hervorgeht;

(e) sie vermag das Wachstum von Staphylococcus aureus-Stämmen zu hemmen;

(d) sie kann die antibakterielle Wirksamkeit von Ampicillin gegenüber ß-Lactamase erzeugenden Stämmen von Escherichia coil, Klebsieila aerogenes und Staphylococcus aureus synergistisch beeinflussen;

(e) sie kann die antibakterielle Wirksamkeit von Cephaloridin gegenüber ß-Lactamase erzeugenden Stämmen von Proteus mira-

- bills und Staphylococcus aureus synergistisch beeinflussen; und . .

(f) sie bildet einen Methylester, der aufgrund der Massenspektroskopie ein Molekulargewicht von 213*0635 entsprechend

der Formel C₁-JL ,NO_n besitzt,
y 11 D

Die Clavulansäure kann als einwertige Carbonsäure der Formel CoHgNOc betrachtet werden, die in Form des Natriumsalzes ein charakteristisches Infrarot-Absorptionsspektrum besitzt, das im wesentlichen dem in Fig. 1 gezeigten entspricht.

Die von Streptomyces clavuligerus erzeugte Verbindung mit den vorgenannten Eigenschaften besitzt die Formel II

CHpOH

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Die Clavulansäure kann als 3-(ß-Hydroxyäthyliden)-7-oxo-4-oxal-azabicyclo/5,2,07heptan-2-carbonsäure bezeichnet werden.

In stereochemischer Hinsicht sind die Kohlenstoffatome in 2- und 5-Stellung der Clavulansäure gleich wie bei den natürlich vorkommenden Penicillinen und Cephalosporinen, so daß die Clavulansäure durch die nachstehende Strukturformel (I) dargestellt werden kann:

(D

Deshalb ist der vollständigere chemische Name für Clavulansäure Z-(2R_i5R)-3~(ß-Hydroxyäthyliden)-7-oxo-4-oxa-l-azabicyclo^/3,2_J heptan-2-carbonsäure.

Gegenstand der Erfindung sind nun Ester der Clavulansäure der Formel I

CH OH

CD

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Zweckmäßige Ester der Clavulansäure sind diejenigen, die sich von den betreffenden Alkoholen ableiten, wie Methanol, Äthanol, Propariol, Butanol, 2,2,2-Triehloräthanol, 2,2,2-Trifluoräthanol, Benzylalkohol, p-Nitrobenzylalkohol, Phenol, Acetoxymethanol, Trimethylacetoxymethanol, 2-Dimethylaminoäthanol und anderen üblichen Alkoholen. Zahlreiche Ester der Clavulansäure sind wertvolle Zwischenprodukte bei bestimmten Verfahren zur Reindarstellung der Clavulansäure. Viele Clavulansäureester sind wertvolle synergistische Verbindungen. Die Wirksamkeit derartiger Ester dürfte in einer Hydrolyse des Esters zur freien Säure liegen.

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Wenn vorstehend der Ausdruck "Ester" verwendet wird, so schließt er die Ester mit ein, die sich begrifflich von einem Alkohol oder einem Thiol der allgemeinen Formeln ROH oder . RSH ableiten, in denen R ein organischer Rest ist. Geeignete Reste für R sind Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Aryl-, Arylalkyl- oder andere ähnliche Reste, die auch substituiert sein können. Um das Molekulargewicht nicht übermäßig zu erhöhen, sollten die Reste R normalerweise nicht über 16 Kohlenstoffatome, zweckmäßigerweise nicht über 12 Kohlenstoffatomen und besonders bevorzugt nicht über 8 Kohlenstoffatome enthalten.

Vorzugsweise leitet sich der Rest R von einem Alkohol ROH oder nicht ganz so bevorzugt von einem Thiol RSH ab, die pharmakologisch verträglich sind.

Beispiele von geeigneten Substituenten an den Resten R sind Halogenatome, Hydroxylgruppen, niedere Alkoxy-, niedere Acyloxy-, niedere Alkylamino- oder niedere Dialkylaminoreste. Der Ausdruck "nieder" gibt an , daß der Rest bis 6 Kohlenstoffatome und vorzugsweise bis zu 4 Kohlenstoff.atome enthält. Demzufolge kann R die Methyl-, Äthyl-, n-Propyl-, Isopropyl-, geradkettige oder verzweigte Butyl-, Pentyl-, Heptyl-, Octyl-, Nonyl-, Decyl-, ündecyl-, Dodecyl-, Vinyl-, Allyl-, Butenyl-, Cyclopropyl-, Cyclobutyl-, Cyclopentyl-, Cyclohexyl-, Cycloheptyl-, Cyclohexenyl-, Cyclohexadienyl-, Methylcyclopentyl-, Methylcyclohexyl-, Benzyl-, Benzhydril-, Phenyläthyl-, Naphthylmethyl-, Phenyl-, Naphthyl-, Propinyl-, Tolyl-, 2-Chloräthyl-, 2,2,2-Trichloräthyl-, 2,2,2-Trifluoräthyl-, Acety!methyl-, Benzoylmethyl-, 2-Methoxyäthyl-,

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2-Dimethylaminoäthyl-, 2-Diäthylaminoäthyl-, 2-Piperidinoäthyl-, 2-Morpholinoäthyl-, 3-Dimethylaminopropyl-, p-Chlorbenzyl-, p-Methoxybenzyl-, p-Nitrobenzyl-, p-Brombenzyl-, m-Chlorbenzyl-, ö-Methoxynaphthyl^-methyl-, p-Chlorphenyl- und die p-Methoxy-

bedeuten

phenylgruppe und ferner solche Gruppen^, die aus der Penicillinoder Cephalosporin-Chemie zur Herstellung solcher Ester bekannt sind, die in vivo leicht zur antibiotischen Stammsubstanz hydrolysieren.

Leicht hydrolysierbare Ester umfassen auch die Ester der allgemeinen Formeln V und VI, doch sind sie nicht auf diese beschränkt:

(V)

— CO A₅

(VI)

in denen A, ein Wasserstoffatom oder ein Alkyl-, Aryl- oder Aralkylrest ist, A₂ ein Wasserstoffatom oder die Methylgruppe bedeutet, A₅ für einen Alkyl-, Aryl- oder Aralkylrest steht, X und Y Sauerstoff- und/oder Schwefelatome sind und Z einen

609839/1013"··'"-' .

zweiwertigen organischen Rest darstellt. Ester der allgemeinen Formeln V und VI, die nach einer Verabreichung zeimlich leicht die Clavulansäure im Blutkreislauf freisetzen, schließen auch solche ein, in denen A, ein Wasserstoffatom, A₂ ein Wasserstoffatom oder die Methylgruppe und A-, die Methyl-, Äthyl-, Propyl-, Butyl-, Benzyl- oder die Phenylgruppe sind, sowie solche, in ,denen X ein Sauerstoffatom, Y ein Sauerstoffatom ist und Z eine der Gruppierungen -CH₂CH₂-, -CH:CH-,

OCH₃ oder ""^""""

OCH3 . darstellt.

Wenn in Verbindung mit den vorstehenden Formeln der Ausdruck ^SfÄlkyl" verwendet wird, schließt er Alkylreste bis zu 6 Kohlenstoffatomen ein. Der Ausdruck "Aryl" bedeutet die Phenyl- oder die Naphthylgruppe oder ferner einen Phenylrest, der durch einen inerten Substituenten, wie ein Fluor- oder Chloratom oder die Methyl- oder Methoxylgruppe oder dergleichen, substituiert ist. Wenn hierin der Ausdruck "Aralkyl" verwendet wird, bedeutet er einen durch einen Arylrest substituierten.Alkylrest.

Besonders zweckmäßige Ester der allgemeinen Formeln V und VT sind diejenigen,der allgemeinen Formeln VII und VIII:

- O - CH - O - CO - A₅

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,CH₂OH

(viii)

In diesen Formeln bedeutet Ah ein Wassers toff atom oder die Methylgruppe, At- die Methyl-, tert.-Butyl- oder die Phenylgruppe und Ag ein Wasserstoff atom und/oder die Methoxygruppe.

Zahlreiche Ester der Clavulansäure unterscheiden sich von analogen Estern von Penicillinen oder Cephalosporlnen darin, daß sie eine erhöhte Bereitschaft zur Hydrolyse zu Clavulansäure unter milden Bedingungen zeigen. So hydrolysieren z.B. einfache Alkylester, wie der Methylester, langsam in auf pH 7 gepuffertem V/asser zu Clavulansäure. Ester, die schon unter milden Bedingungen in gewissem Grad eine Hydrolyse erleiden, sind solche .,der allgemeinen Formel IX:

(IX)

In der R ein Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 9 Kohlenstoffatomen ist, der durch Halogenatome, niedere Alkoxyreste, Hydroxyl-

2 3 gruppen oder durch gegebenenfalls in Salzforra vorliegende NR R-

Reste substituiert sein kann, wobei R im α 3r gleich oder ver-

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schieden sind und Wasserstoffatome und/oder niedere Alkylreste bedeuten und auch zusammen mit dem Stickstoffatom einen 5- oder 6gliedrigen Ring bilden können.

Wenn unter Bezugnahme auf die allgemeine Formel IX der Ausdruck "nieder" verwendet wird, bedeutet er, daß der Rest 1 bis 4 Kohlenstoff atome enthält. ; ' .

Geeignete Reste für R sind Alkyl- und Aralkylreste, die gegebenenfalls durch Halogenatome, Hydroxyl- oder Methoxygruppen oder durch in Salzform vorliegende NR r - Reste substituiert sein können, wobei R der Methyl- oder Äthylrest und R^ der Methyloder Äthylrest ist oder mit dem Rest.R unter Einschluß des Stickstoffatoms zu einem Pyrrolidin-, Piperidin- oder Morpholinrest verbunden ist. , . r

Die zweckmäßigeten Alkylreste für R sind geradkettige Reste bis zu 6 Kohlenstoffatomen, die gegebenenfalls durch eine Methoxy-

p χ oder eine Hydroxylgruppe, einen in Salzform vorliegenden NRR-Rest oder ein Chlor-, Brom- oder Jodatom oder durch die CCl-,- oder CP,-Gruppe substituiert sind.

Die Ester der Clavulansäure sind besonders brauchbar als Synergisten, wenn sie in Geweben von Säugern, insbesondere im menschlichen Blut unter Bildung von Clavulansäure oder dessen Salz hydrolysieren, da man annimmt, daß Clavulansäure oder deren Salze etwas stärker wirksame antibakterielle Mittel als die Ester per se sein dürften. Zahlreiche Ester der allgemeinen Formeln V bis IX sind für diese Zwecke brauchbar.

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Eine weitere Gruppe besonders geeigneter Ester nach vorliegender Erfindung sind jene wertvollen Zwischenprodukte, die leicht in Clavulansäure oder deren Salz durch chemische oder biochemische Methoden, die aus der Penicillin- oder Cephalosporin-Chemie bekannt und ausreichend milde sind, die reaktionsfähigen säurelabilen ß-Lactamringe aufzuspalten. Überführt werden.

Am zweckmäßigsten ist natürlich ein Ester, der durch Hydrierung spaltbar ist. Übliche Ester für ein derartiges Verfahren sind die Benzyl-, substituierten Benzyl-, Benzhydril-, substituierten Benzhydr.il- oder die Tritylester. Der Benzylester hat sich als besonders zweckmäßig für dieses Verfahren erwiesen.

Im großen und ganzen ist die, Art eines Substituenten im Esterrest ohne Bedeutung, so lange er nicht bei der Spaltung durch Hydrierung stört. . . ' .

Es ist bereits vorstehend darauf hingewiesen worden, daß Ester der Clavulansäure, - _ wertvolle therapeutische Eigenschaften besitzen. Demgemäß bilden einen weiteren Gegenstand vorliegender Erfindung Arzneimittel mit einem Gehalt an Estern der Clavulansäure . gegebenenfalls zusammen mit

pharmakologisch unbedenklichen Trägerstoffen und/oder Verdünnungsmitteln. · .

Die Arzneimittel vorliegender Erfindung umfassen solche in einer Form, die für eine orale, lokale oder parenterale Anwendung geeignet sind, und die zur Behandlung von Infektionen bei Säugern, einschließlich Menschen, verwendet werden können.

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Zweckmäßige Formen der Arzneimittel vorliegender Erfindung sind Tabletten, Kapseln, Cremes, Sirupe, Suspensionen, Lösungen, Trokkensäfte und sterile, zu Injektions- oder Infusionszwecken geeignete Formen . Derartige Arzneimittel können übliche pharmakologisch verträgliche Substanzen, wie Verdünnungsmittel, Bindemittel, Farbstoffe, Geschmacksstoffe, Konservierungsmittel, Zerfallhilfsmittel und dergleichen gemäß einer üblichen pharmakologisehen Praxis zur Formulierung von Antibiotika enthalten, wie sie dem ^r Fachmann bekannt ist. - .■ '. ,^ . . ·

Einzeldosierungen mit einem Gehalt an Estern der Clavulansäure, die für eine orale Verabreichung angepaßt sind, bilden ein weiteres bevorzugtes Arzneimittel im Hinblick auf vorliegende Erfindung. * ' -

Unter bestimmten Voraussetzungen kann die Wirksamkeit der oralen Arzneimittel mit Estern der C±avulansäufe--vei·---" bessert werden, wenn derartige Arzneimittel eine Puffersubstanz enthalten oder mit einem erst im Darm löslichen Überzug versehen sind, so daß die Verbindungen vorliegender Erfindung keine lange Berührungszeit mit dem hochgradig sauren Magensaft haben. Derartige gepufferte oder mit einem erst im Darm löslichen Überzug versehene Arzneimittel können nach den üblichen pharmazeutischen Techniken hergestellt werden.

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Die Ester der Clavulansäure können in den Arzneimitteln als einziger therapeutischer Wirkstoff vorliegen oder sie können zusammen mit anderen therapeutischen Mitteln vergesellschaftet

Die Gesamtmenge der in einer Einzeldosierungsform vorhandenen antibakteriellen Ester liegt gewöhnlich zwischen 50 und I500 mg

und üblicherweise zwischen 100 und 1000 mg.

Die Arzneimittel vorliegender Erfindung können zur Behandlung von Infektionen von u.a. der Atemwege, des Harnsystems und der 'Weichteile beim Menschen verwendet werden. Sie können auch zur -Behandlung von Infektionen bei Haustieren, wie der Mastitis beim Vieh, eingesetzt werden. .-

üblicherweise werden zwischen 50 und 6000 mg des erfindungsgemäßen Arzneimittels je Behandlungstag verabreicht, jedoch Vorzugsweise zwischen 500 bis 3000 mg je Tag. Jedoch für eine Behandlung schwerer Körperinfektionen oder Infektionen eines besonders schwer beeinflußbaren Organismus können in Übereinstimmung mit der klinischen Praxis höhere Dosen verwendet werden.

Die genaue Form . der Arzneimittel vorliegender Erfindung hängt in bestimmtem Maß von de,m zu behandelnden Mikroorganismus ab. Für eine Behandlung von Infektionen werden die erfindungsgemäßen Arzneimittel üblicherweise so eingestellt, daß sie ein Maximum beim Blutspiegel von mindestens 0,1 ug/ml, noch zweckmäßiger von mindestens 0,25 #g/ml und vorzugsweise von mindestens 1 jig/ml Clavulansäure hervorrufen.

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Gegenstand vorliegender Erfindung ist auch ein Verfahren zur Herstellung der Ester der Clavulansäure, -das dadurchgekennzeichnet ist, daß man den Stamm Streptomyces clavuligerus züchtet und aus dem Kulturmedium die Clavulansäure oder deren Salz gewinnt und anschließend in an-„sic.h~:bekannten - - Weise ' einen Ester_dieser.:.JSäürjB-Jjild'et-r>- ■ . " -— ' . · '--■-:

.Vorzugsweise wird beim erfindungsgemäßen Verfahren der Stamm Streptomyces clavuligerus ATCC 27064 oder eine seiner, eine hohe . Ausbeute lief ernten Mutanten verwendet. · ^;-

• -

Der hier verwendete Ausdruck "züchten" bedeutet ein wohlerwogenes aerobes Wachstum eines Clavulansäure erzeugenden Organismus in Gegenwart von assimilierbaren Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und Mineralsalzen. Dieses aerobe Wachstum kann auf einem festen oder halbfesten Nährmedium oder in einem flüssigen Nährmedium stattfinden, in dem die Nährstoffe gelöst oder suspendiert sind. Das Züchten kann auf einer aeroben Oberfläche oder mittels einer Submers-Kultur stattfinden. Das Nährmedium kann aus komplexen Nährstoffen zusammengesetzt oder chemisch definiert sein. Es wurde diesseits gefunden, daß Medien mit komplexen Nährstoffen, wie Hefeextrakt, Sojabohnenmehl und dergleichen, besonders geeignet sind. ' .

Die Nährmedien, die.zum Züchten von Streptomyces clavuligerus

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yerwendet werden können, können 0,1 bis 10 Prozent einer komplexen organischen Stickstoffquelle, wie Hefeextrakt, Maisquellwasser, pflanzliches Protein, Saatprotein, Hydrolysate derartiger Proteine, Milchprotein-Hydrolysate, Fisch- und Fleischex-. trakte und Hydrolysate derartiger Peptone/. Gegebenenfalls können chemisch definierte Stickstoffquellen, wie Harnstoff, Amide, einzelne oder Gemische von gewöhnlichen Aminosäuren, z.B. Valin,, Asparaginsäure, Glutaminsäure, prolin und Phenylalanin, eingesetzt werden. Kohlenhydrate in einer Menge von 0,1 bis 5 Prozent können in den Nährmedien vorliegen, doch ist Glukose in bestimmten Medien unerwünscht, da sie eine nachteilige Wirkung auf die Ausbeute der erwünschten Clavulansäure hat. Stärke oder Stärkehydrolysate, wie Dextrine, Saccharose, "Lactose oder andere Zücker oder Glyzerin oder Glyzerinester können ebenfalls eingesetzt werden. Die Kohlenstoffquelle kann sich auch von pflanzlichen ölen oder tierischen Fetten ableiten. Carbonsäuren und ihre Salze können als Kohenstoffquelle für das Wachstum und die Erzeugung von ß-Lactamase-Hemmstoffen eingesetzt werden. Ein besonders geeignetes Medium, das preiswert ist, enthält Sojabohnenmehl, das unter dem Warenzeichen "Arkasoy" im Handel ist, zusammen mit Malzdestillat-Trockensaft, der unter dem Warenzeichen "Scotasol" im Handel ist, sowie Dextrin.

Der Zusatz von Antischaummitteln, wie Polyoxyalkylenderivate von Propylenglykol, wie das unter dem Warenzeichen "Pluronic L8l" bekannte Produkt, können zur Steuerung des Schäumens von bestimmten Medien im Fermenter erforderlich sein.

Mineralsalze, wie NaCl, KCl, MgCl2, ZnCl₂, FeCl,, Na₂SO^, FeSO^

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.und Natrium- oder Kaliumsalze der Phosphorsäure können den vorgenannten Medien zugegeben werden, insbesondere wenn sie ehe misch definiert sind. CaCO, kann als Quelle für Calciumionen oder zu Pufferungszwecken zugesetzt werden. Salze von Spurenelementen wie Nickel, Kobalt oder Mangan, können ebenfalls mit eingesetzt werden. Vitamine kann man gegebenenfalls ebenfalls zusetzen.

Wenn hierin der Ausdruck "Mutante" verwendet wird, umfaßt er beliebige Mutanten, die sich spontan entwickeln oder durch Einwirkung eines äußerlichen Mittels entstehen, gleichgültig ob dieses Mittel absichtlich oder in anderer Weise angewendet wird. Zweckmäßige Methoden zur Erzeugung von Mutantenstämmen sind von H.I. Adler in dem Kapitel "Techniques for the Development of Micro-Organisms" in dem Buch "Radiation and Radioisotopes for Industrial Micro-Organisms", Proceedings of a Symposium, Wien 1973* S. 241, International Atomic Energy Authority, beschrieben worden. Diese Techniken umfassen:

(1) Ionisierende Bestrahlung, wie 'Röntgen- oder ^"-Strahlen, UV-Licht, UV-Licht plus ein fotoempfindliches Mittel (wie 8-Methoxypsoralen), salpetrige Säure, Hydroxylamin, Pyrimidin-Analoga (wie 5-Bromuracil), Acridine, alkylierende Mittel (wie Senfgas, Äthyl-methan-sulfonat), Wasserstoffperoxid, Phenole, Formaldehyd, Wärme, und

(2) genetische Techniken, wie Rekombination, Transformation, Transduktion, Lysogenisation, lysogenetische Konversion, und selektive Techniken für spontane Mutanten.

Das Züchten von Streptomyces clavuligerus findet normalerweise bei Temperaturen von 15 bis ¹K)⁰C, gewöhnlich 20 bis 35°C und

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onen werden gesammelt, vereinigt, entsalst und gefriergetrocknet. Man erhält ein festes Rohsalz der Clavulansäure.

Eine Alternative des ExtraktionsVerfahrens besteht in einem in-Berührung-brIngen des Filtrats der Nährbouillon - gewöhnlich bei annähernd neutralem pH-Wert - , das ein Salz der Clavulansäure
enthält, mit einer organischen Phase,, in der ein wasserunlösliches Amin gelöst ist. Beispiele geeigneter organischer Lösungsmittel sind die üblichen, mit Wasser nicht mischbaren polaren
Lösungsmittel, wie Methylisobutylketon, Trichloräthylen und dergleichen. Beispiele geeigneter Amine sind sekundäre oder tertiäre Amine, in denen einer der Substituenten ein langkettiger aliphatischer Rest, z.B. mit 12 bis 16 Kohlenstoffatomen, und der andere Rest ein tertiärer Alkylrest ist, so daß das Molekül lipophil ist. Es^- ist festgestellt worden, daß "Amberlite LA2" sich als erfolgreiches Amin erwiesen hat. üblicherweise wird das Amin als Säureadditionssalz eingesetzt.

Nach diesem Extraktionsverfahren liegt die Clavulansäure in der organischen: Phase als Aminsalz vor. Die organische Phase wird
dann von dem Filtrat der Nährbouillon abgetrennt. Die Clavulansäure kann in die wässrige Phase mittels einer Salzlösung, vorzugsweise einer konzentrierten Lösung von Natriumchlorid, Natriumnitrat oder dergleichen, zurückextrahiert werden. Das rohe Salz der Clavulansäure kann dann durch Gefriertrocknen oder dergleichen erhalten werden. γ

Weitere Grundverfahren zur Isolierung, die angewendet werden
können, umfassen übliche Verfahren, wie cu<? Adsorption an Aktiv

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Beim Lösungsmittelextraktionsverfahren kühlt man das Fi!trat der Nährbouillon und erniedrigt den pH-Wert auf einen Bereich von 2 bis 5 durch Zugabe von Säure, währenddessen das Filtrat gründlich mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel vermischt wird, wie n-Butylacetat, Methylisobutylketon, n-Butanol oder Äthylacetat. Die zur Herabsetzung des pH-Wertes des Mediums verwendete Säure ist gewöhnlich eine Mineralsäure, wie Chlorwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Salpetersäure, Phosphorsäure oder dergleichen. n-Butanol ist ein besonders geeignetes Lösungsmittel zum Einsatz bei der Extraktion des angesäuerten Nährbouillon-Filtrats. Nach der Abtrennung der Phasen durch Zentrifugieren wird das die ß-Lactamase-inhibierende Stoffwechselprodukt aus dem Lösungsmittel in wässrigerBicarbonatlösung oder KaIiumhydrogenphosphat-Pufferlösung, Calciumcarbonat-Suspension oder Wasser rückextrahiert, währenddessen der pH-Wert annähernd neutral gehalten wird, z.B. bei pH 7,0. Dieser wässrige Extrakt nach der Trennung der Phasen kann unter vermindertem Druck eingedampft und gefriergetrocknet werden, um ein Rohprodukt eines Salzes der Clavulansäure zu erhalten. Dieses Rohprodukt ist stabil, wenn es im trockenen Zustand bei -20⁰C gelagert wird.

Bei dem Anionenaustauscherharz-Verfahren wird das geklärte Filtrat der Nährbouillon bei einem annähernd neutralen oder schwachsauren pH-Wert, z.B. bei pH 6 bis 7, an einer Säule mit einem schwach- oder stark basischen Anionenaustauscherharz, wie "Amber-Iite IR4b" oder "Zerolit FFIF", perkoliert, bis das Harz gesättigt ist und die ß-Lactamase-hemmende Substanz am Fuß der Säule austritt. Die Säule wird dann mit Wasser gewaschen und mit wässriger Natriumchloridlösung eluiert. Die ß-Lactamase-hemmenden Frakti-

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vorzugsweise 25 bis 3O°C und bei einem pH-Wert von 5 bis 8,5, vorzugsweise von 6 bis 7*5* statt.

Der Stamm Streptomyces clavuligerus kann in den oben genannten Medien in belüfteten konischen Glasflaschen durch Schütteln auf einem Drehschüttler oder in mit Prallblechen ausgerüsteten und mit Scheibenkreiselmischern gerührten und mittels Zerstäubereinrichtungen belüfteten Züchtungsgefaßen aus rostfreiem Stahl gegezüchtet werden. Die Fermentation kann auch kontinuierlich durchgeführt werden.

Der Ausgangs-pH-Wert der Fermentation ist typischerweise 7,0. Die höchste Ausbeute an Clavulansäure erhält man in 2 bis 10 Ta- · gen bei einer Temperatur von 20 bis 35°C. In einem Rührzüchtungsgefäß aus rostfreiem Stahl unter Verwendung des vorstehend beschriebenen Mediums mit Sojabohnenmehl, Malzdestillat-Trockensaft und Dextrin beträgt die bevorzugte Temperatur 26°C. Das Maximum an Clavulansäure wird innerhalb 5 Tagen erhalten.

Die Clavulansäure kann aus dem Filtrat der Nährbouillon auf die verschiedensten Weisen extrahiert werden. Die Lösungsmittel-Extraktion aus dem kalten, auf saure pH-Werte eingestellten Filtrat einerseits und die sich auf die anionische Natur des Stoffwechselprodukte beziehende Verfahren, wie die Verwendung von Anionenaustauscherharzen/ andererseits haben sich als besonders vorteilhaft erwiesen. Die Zellen des Streptomyces clavuligerus werden normalerweise zuerst aus dem Züchtungsmedium durch Abfiltrieren oder Zentrifugieren entfernt, bevor man mit der Extraktion beginnt. . .

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kohle, Ionenpaar-Extraktion, Ausfällen, Aussalzen und Molekularfiltration, doch sind diese Verfahren gewöhnlich nicht so erfolgreich wie die zuvor beschriebenen Verfahren , die deshalb bevorzugt sind. . .

Eine weitere Reinigung der festen, nach den vorgenannten Verfahren erhaltenen Salze kann mittels zahlreicher Methoden erreicht werden, doch ist die Ionenaustausch-Säulenchromatographie besonders geeignet, insbesondere unter Verwendung von "Isopor", "De-Acidite PPIP SRA64" oder "DEAE-Cellulose". Die "De-Acidite"-Säule wird nacheinander mit einer wässrigen Lösung eines Salzes, wie Natriumchlorid, von O-bis 0,5-molar eluiert. Die Säule von "DEAE-Cellulose" in einer 0,01-m Phosphatpufferlösung vom pH 7 wird mit einer Salzlösung, normalerweise einer Natriumchloridlösung von 0- bis 0,2-m Natriumchlorid in 0,01-m Phosphatpufferlösung vom pH 7, eluiert. Die aktiven Fraktionen können durch ihre ß-Lactamase-Hemmwirkung und ihre antibakterielle Wirksamkeit gegenüber Klebslella aerogenes beim Agardiffusionsversuch festgestellt werden. Die die Masse dieser Aktivität enthaltenen Fraktionen werden dann vereinigt und unter vermindertem Druck auf ein geringes Volumen eingeengt. Das erhaltene Rohprodukt von einem Clavulansäuresalz wird durch Perkolieren an einer Säule von "Biogel P2" entsalzt. Die aktive entsalzte Substanz wird dann eingeengt, mit Äthanol vermischt und nochmals an einer Cellulosesäule unter Verwendung eines Gemisches von Butanol, Äthanol und Wasser im Volumenverhältnis 4 : 1 : 5 in der oberen Phase als Lösungsmittel chromatographiert.

Die Fraktionen, die die Escherichia coli-ß-Lactamase inhibieren-

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de Substanz enthalten, werden gesammelt, unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft, in Wasser wieder aufgelöst und gefriergetrocknet. Man erhält das Salz der Clavulansäure als weißen Peststoff.

Die Verfahren, die erfindungsgemäße bei der Peststellung der Clavulansäure in den Filtraten der Nährbouillon am besten geeignet sind, sind die Papierchromatographie und das bioautographische Bestimmungssystem. Die Clavulansäure kann dadurch geprüft werden, daß von ihrer ß-Lactamase-Hemmwirkung Gebrauch gemacht wird. Die Dünnschicht-Chromatographie kann angewendet werden, um die Clavulansäure in festen Zubereitungen festzustellen. Diese Bestimmungs- und Versuchsverfahren werden nachstehend beschrieben.

Eine Abwandlung des Verfahrens zur Herstellung der reinen Clavulansäure oder ihrer Salze besteht in der Isolierung einer unreinen Clavulansäure oder ihres Salzes, Herstellen eines Esters der Clavulansäure in üblicher Weise, Reinigen des Esters und anschliessendes Wiedergewinnen der Clavulansäure oder deren Salz aus dem Ester. .

Die bei diesem Verfahren verwendete verunreinigte Clavulansäure oder ihr Salz enthält üblicherweise mindestens 1 Gewichtsprozent des Antibiotikums.

Geeignete Ester zur Verwendung bei diesem Verfahren sind solche, die durch Hydrogenolyse, durch enzymatische Methoden oder durch eine Hydrolyse unter sehr milden Bedingungen gespalten werden können.

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- in ~

Eine geeignete Gruppe von bei diesem Verfahren verwendeten Estern besitzt die nachstehende Formel X:

CH₂OH

C0-0-CH-A7

in der A ein Wasserstoffatom oder eine gegebenenfalls substituierte Phenylgruppe ist und Ag eine gegebenenfalls substituierte Phenylgruppe bedeutet.

Am zweckmäßigsten ist A₇ ein Wasserstoffatom oder die Phenyl-, ToIyI-, Chlorphenyl- oder Methoxyphenylgruppe und Ag die Phenyl-, ToIyI-, Chlorphenyl- oder Methoxypheny!gruppe.

Vorzugsweise ist A₇ ein Wasserstoff atom und Ag die Phenylgruppe.

Die Ester der allgemeine Formel X können durch Hydrogenolyse gespalten werden, wodurch man die Clavulansäure oder ihr Salz erhält. ·

Andere Gruppen von Estern, die bei diesem Verfahren verwendet werden können, besitzen die vorstehend beschriebenen allgemeinen Formeln V und VI. Derartige Ester können in Salze der Clavulansäure mittels milder alkalischer Hydrolyse, z.B. bei pH 7,5, umgewandelt werden.

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Die verunreinigte Form der Clavulansäure oder deren Salz, die nach diesem Verfahren gereinigt werden muß, kann in Form eines Feststoffes oder einer Lösung vorliegen, und zwar gewöhnlich auch mit einem Gehalt von beträchtlichen Mengen anorganischer oder organischer Verunreinigungen. . . . ·

• Pie Clavulansäure oder deren Salz kann in einen Ester durch die nachstehend beschriebenen Veresterungsreaktionen umgewandelt werden „ Das bevorzugte Verfahren zur Bildung eines erwünschten Esters der Clavulansäure besteht in der Reaktion eines Salzes der Clavulansäure mit einem Veresterungsmittel, wie einem reaktionsfähigen Halogenid, einem Sulfonatester oder dergleichen, wie nachstehend beschrieben wird. Derartige Reaktionen werden häufig in einem organischen Lösungsmittel mit einer hohen Dielektrizitätskonstanten durchgeführt, wie Dimethylformamid, einem Gemisch von Dimethylformamid und Aceton, in Dimethylsulfoxid, N-Methylacetamid, Hexamethylphosphoramid und dergleichen.

Nach der Bildung, kann eiir verunreinigter Ester der" Clavulansäure '

■ . . werden

Chromatograph! sch. ge reinigt/,. Bei derartigen Verfahrens schritten wird der Ester üblicherweise in einem organischen Lösungsmittel gelöst, wie Äthylacetat, Methylenchlorid, Chloroform, Cyclohexan oder ähnlichen Lösungsmitteln. Die bei dem chromatographischen Verfahren verwendete feste Phase ist normalerweise eine inerte Substanz, wie Sillkagel oder ähnliche, für chromatographische Zwecke geeignete Substanzen.

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Die aus der Säule austretenden Fraktionen können hinsichtlich des Vorliegens von Clavulansäure untersucht werden, indem von synergistischen Eigenschaften Gebrauch gemacht wird. Normalerweise vereinigt man die aktiven" Fraktionen und dampft das organische Lösungsmittel unter vermindertem Druck ab.

Der bei diesem Verfahren erhaltene Ester weist gewöhnlich eine annehmbare Reinheit auf, doch kann die Substanz gegebenenfalls nochmals chromatographiert werden.

Der gereinigte Ester der Clavulansäure kann in Clavulansäure oder deren Salz nach dem vorherbeschriebenen Verfahren umgewandelt werden. ... / .. . ;* -. ^:

Ester von Clavulansäure können durch Veresterung der Clavulansäure oder deren Salz durch übliche Verfahren hergestellt werden.

Zweckmäßige Verfahren einer Esterbildung sind

(a) die Umsetzung eines Salzes der Clavulansäure mit einer Verbindung der allgemeinen Formel Q - R, in der Q eine leicht ersetzbare Gruppe und R ein organischer Rest ist;

(b) die Umsetzung der Clavulansäure mit einem Diazoalkan und

(c) die Umsetzung der Clavulansäure mit einem Alkohol der

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allgemeinen Formel ROH in Gegenwart eines die Kondensation beschleunigenden Mittels, wie einem Carbodiimid oder dergleichen.

Geeignete Salze der Clavulansäure, die mit Verbindungen R-Q reagieren können, sind Alkalimetallsalze, wie das Natrium- oder Kaliumsalz oder andere übliche Salze, wie das Silbersalz.

Geeignete Reste Q schließen solche Atome oder Gruppen ein, die in bekannter Weise durch Garbonsaureanionen ersetzbar sind. Es handelt sich um Chlor-, Brom- und Jodatome, Sulfonsäureester, wie die -0-SOpCH-,- oder die -O-SOgCgH^CH^-Gruppen, um aktive Estergruppen, wie die -0-CO-H-oder -O-CO-CF,-Gruppen und andere übliche, durch nukleophile Reste ersetzbare Gruppen.

Die vorstehende Reaktion wird normalerweise in einem organischen Lösungsmittel mit einer verhältnismäßig hohen Dielektrizitätskonstanten, wie Dimethylformamid, Aceton, Dioxan, Tetrahydrofuran oder dergleichen, und bei einer nicht außergewöhnlichen Temperatur, wie von -5 bis 100⁰C, im allgemeinen bei 45 bis 50°C, z.B. bei Raumtemperatur, durchgeführt.

•Die Umsetzung der Clavulansäure mit einem Diazoalkan ist ein mildes Verfahren zur Herstellung von Alkyl-, Aralkyl- oder ähnlichen Estern.Die Diazotierung kann unter üblichen Reaktionsbedingungen erfolgen, z.B. bei einer nicht extremen Temperatur und in einem üblichen Lösungsmittel. Derartige Reaktionen werden üblicherweise bei Temperaturen von -5 bis 100⁰C, gewöhnlich bei '5 bis 30⁰C, z.B. bei Raumtemperatur, durchgeführt. Geeignete Lösungs-

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mittel für diese Reaktion sind niedere Alkanole, wie "Methanoi und Äthanol, und Lösungsmittel, wie Tetrahydrofuran, Dioxan und dergleichen. Äthanol hat sich als besonders zweckmäßiges Lösungsmittel bei diaser Reaktion erwiesen.

Die Reaktion der Clavulansäure mit einem Alkohol in Gegenwart eines die Kondensation beschleunigenden Mittels findet normalerweise in einem inerten organischen Lösungsmittel mit einer verhältnismäßig hohen Dielektrizitätskonstanten, wie Acetonitril, statt. Die Reaktion wird gewöhnlich bei Raumtemperatur oder bei erniedrigter Temperatur, z.B. bei -10 bis 22°C, gewöhnlich bei -5 bis l8°C, z.B. anfänglich bei 0⁰C und danach allmählich unter Erwärmen bis zu 15°C, durchgeführt. Die verwendeten, die Kondensation beschleunigenden Mittel sind üblicherweise solche, die Wasser aus dem Reaktionsgemisch entfernen. Beispiele geeigneter Mittel sind Carbodiimide, Carbodiimidazole oder äquivalente Reagentien. Dicyclohexylcarbodiimid hat sich als die Kondensation beschleunigendes Mittel 'zur Anwendung bei diesem Verfahren als besonders zweckmäßig erwiesen. Um eine Selbstkondensation der Clavulansäure weitgehend zu unterdrücken, wird die Reaktion gewöhnlich in Gegenwart eines beträchtlichen Überschusses an Alkohol durchgeführt.

Andere geeignete Verfahren zur Bildung eines Esters sind (d) ein Abspalten von Kohlendioxid aus einer Verbindung der allgemeinen Formel XI

(XI)

fco-O-CO-O-R^

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in der R ein inerter organischer Rest ist; und (e) die Umsetzung einer Verbindung der allgemeinen Formel XI mit einem Alkohol der allgemeinen Formel ROH (oder weniger begünstigt mit einem Thiol der allgemeinen Formel RSH).

Kohlendioxid kann aus einer Verbindung der allgemeinen Formel XI spontan während ihrer Herstellung oder gegebenenfalls durch Erhitzen einer Verbindung der allgemeinen Formel XI in einem inerten Lösungsmittel abgespalten werden. Geeignete inerte Lösungsmittel sind Äther, wie Diäthyläther, Tetrahydrofuran, Dioxan und dergleichen. In zahlreichen Fällen zersetzt sich eine Verbindung der allgemeinen Formel XI spontan sogar bei niedrigen Temperaturen, z.B. bei -5°C, um einen Ester der allgemeinen.Formel

zu liefern, in der R ein inerter Rest innerhalb der Definition von R ist.

Wenn eine Verbindung der allgemeinen Formel XI mit einem Alkohol (oder weniger begünstigt mit einem Thiol) umgesetzt werden muß, dann wird die Reaktion üblicherweise, in einem inerten Lösungsmittel, wie einem Äther, in Gegenwart überschüssigen Alkohols (oder Thiols) durchgeführt, um die Selbstkondensation des Clavulansäure. Derivats zu verhindern.

6098 39/1 01 3^:

Die Veres terungs verfahr en sind im allgemeinen nicht so bevorzugt wie jene, die die Reaktion eines Salzes der Clavulansäure mit einer zuvor beschriebenen Verbindung R-Cl betreffen.

Eine Verbindung der allgemeinen Formel XI kann durch die Umsetzung

4 eines Salzes der Clavulansäure mit einer Verbindung Cl-CO-O-R oder einer chemisch äquivalenten Verbindung davon hergestellt werden . üblicherweise wird diese Reaktion bei erniedrigter Temperatur, z.B. bei einer Temperatur nicht über 5°C, in einem inerten Lösungsmittel, z.B. Diäthylather, Tetrahydrofuran, Dioxan oder dergleichen, durchgeführt. Am zweckmäßigsten ist das bei dieser Reaktion verwendete Salz der Clavulansäure ein lipophiles Salz, so daß es sich in dem Lösungsmittel löst, obwohl gegebenenfalls das weniger begünstigte Natriumsalz eingesetzt werden kann, indem es in dem Reaktionsmedium suspendiert wird.

Beschreibung 1 '

Zur Bestimmung der Clavulansäure geeigneter Versuch Grundlagen des Versuchs

Lösungen mit einem Gehalt an Clavulansäure (Filtrat der Nährbouillon, Proben aus einem Isolierungsverfahren oder dergleichen) werden 15 Minuten mit einem ß-Lactamase-Präparat bei 37°C in einer 0,05-m Phosphatpufferlösung vom pH 7 bebrütet. Währenddessen tritt eine Enzymhemmung oder eine Inaktivierung auf. Dann wird ein Substrat (Benzylpenicillin) zugegeben und das Bebrüten bei 37°C 30 Minuten fortgesetzt. Die Menge des enzymatisehen Abbaus des Substrats zu Penicillansäure wird mittels des Hydroxyl-

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amin-Versuchs für Penicillin bestimmt. Die Menge der verwendeten ß-Lactamase errechnet sich aus einer 75p**ozentigen Hydrolyse des Benzylpenicillins in 30 Minuten bei 37°C.

Das Ausmaß der Hydrolyse ist der Einfluß der Menge des ungehemmt verbleibenden Enzyms. Die Ergebnisse werden ausgedrückt in Prozent Hemmung der Enzymaktivität durch eine gegebene Verdünnung der Clavulansäure enthaltenden Lösung (z.B. des Filtrats der Nährbouillon) oder durch die Konzentration der Clavulansäure in pg/ml bei gegebener 50prozentigen Hemmung des Enzyms unter den vorstehend genannten Bedingungen (1,-q).

ß-Lactamase-Enzym

Es wird die mittels Escheri.chia coil JT4 erzeugte ß-Lactamase als Enzym verwendet. Diese Züchtung ist ein Ampicillin-resistenter Stamm und verdankt seine Resistenz einer Erzeugung der den R-Faktor steuernden ß-Lactamase. Gegebenenfalls können ähnliche den R-Faktor steuernde ß-Lactamasen verwendet werden.

Die auf einem Schrägagar gehaltene Züchtung wird in einem 400 ml sterilen Trypton-Medium bebrütet, das in einer konischen Flasche von 2 Liter Inhalt enthalten ist. Dieses Medium hat die folgende Zusammensetzung: 32 g/Liter Trypton, 20 g/Liter Hefeextrakt,

5 g/Liter Natriumchlorid und 2,2 g/Liter Calciumchlorid mit

6 Mol Hydratwasser. Der pH-Endwert wird mit verdünnter Natronlauge auf 7,4 eingestellt. Die Flasche wird 20 Stunden auf einem Drehschüttler mit 240 UpM bei 25°C geschüttelt.

Die bakteriellen Zellen werden durch Zentrifugieren gesammelt,

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mit Oj,O5-m Phosphatpufferlösung vom pH 7 gewaschen (nochmals suspendiert und zentrifugiert) und dann in V/asser nochmals suspendiert, wodurch man eine 25fache Zellkonzentration in dem Kulturmedium erhält. Diese Zellsuspension wird dann bei 4°C in einem MSE-Ultraschall-Disintegrator zertrümmert. Die Zellbruchstücke werden durch Zentrifugieren entfernt, und aliquote Anteile der überstehenden Lösung werden im tiefgefrorenen Zustand gelagert. Zur Verwendung bei dem Versuchs verfahren wird das überstehende mit einer 0,005-m Phosphatpufferlösung verdünnt, bis man eine etwa 75prozentige Hydrolyse einer 1 mg/ml enthaltenden Lösung von Benzylpenicillin in 30 Minuten bei 37⁰C erhält.

Versuchsverfahren

Geeignete Verdünnungen des Hemmpräparats und der ß-Lactamase-Lösung werden vermischt und 15 Minuten bei 37⁰C bebrütet (Test). Ein Kontrollversuch mit einer Pufferlösung anstelle des Inhibitorpräparats wird ebenfalls bebrütet. Dann wird eine Benzylpenicillin-Lösung (Substrat) zu dem Test- und dem Kontrollgemisch gegeben. Dann wird die Bebrütung weitere 30 Minuten bei 37⁰C fortgesetzt. Es wird dann das restliche Benzylpenicillin in jedem Gemisch unter Verwendung des Hydroxylaminversuchs bestimmt, wie er beschrieben ist von Batchelor und Mitarbeitern in Proc.Roy. Soc. B 154 (1961), S. 498. Zu allen Tests werden 6 ml Hydroxylamin-Reagens zugegeben. Die Kontrollversuche und die Versuche mit den reinen Substanzen läßt man 10 Minuten bei Raumtemperatur reagieren, bevor man 2 ml eines Eisen(III)-ammoniumsulfat-Reagens zusetzt. Die Absorption der Endlösungen wii*d in einem E.E.L.-Colorimeter oder in einem Spektrophotometer bei 490 nm gegenüber dem reinen Reagens gemessen. Die Zusammensetzungen der Reaktions-

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lösungen, der Testlösungen und der reinen Substanzen vor dem Hydroxylamin-Versuch sind wie folgt.

Bestandteile (alle gelöst in oder verdünnt mit 0,005-m Phosphatpuffer vom pH 7)	reines Benzyl- Test peni cillin, ml	Kontroll versuch, ml	reines Reagens, ml
Escherichia coli- ß-Lactamase-Lösung	1,9 0,0	1,9	1,9
Inhibitor	0,1 0,0	0,0	0,0
Benzylpenioillin 5 mg/ml	0,5 0,5	0,5	0,0
0,005-m Phosphatpuffer vom pH 7	0,0 2,0	0,1	0,6

Berechnung der Ergebnisse

Die prozentuale Hemmung der ß-Lactamase wird wie folgt berechnet:

Absorption des reinen Benzylpenicillins minus Absorption der Kontroilösung (nicht gehemmte Reaktion) = χ

Absorption der Testlösung (gehemmte Reaktionslösung) minus Absorption der Kontrolllösung (nicht gehemmte Reaktion) = y

^y
Hemmung in % = — χ 100

Um den Ij-₀-Wert zu erhalten, wird das Hemmpräparat verdünnt, bis eine 50prozentige Hemmung der ß-Lactamase-lnaktivierung des Benzylpenicillins bei dem vorgenannten Verfahren erhalten wird.

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' - ³\ - . 2553AiO

Beschreibung 2 Papierchromatographische Bestimmung der Clavulansäure

Das Filtrat der Nährbouillon und eine Bezugslösung der Clavulansäure (250 ug/ml eines teilweise gereinigten Präparats) werden auf 1 cm breite Papierstreifen (Whatman No. l)(20 uLiter der Ausgangslösung) getüpfelt. Die Chromatοgramme laufen bei absteigender Chromatographie 16 Stunden bei 5⁰C unter Verwendung eines Gemisches von n-Butanol/Isopropanol/Wasser im Volumenverhältnis

7:7:6 als Lösungsmittel, Die Streifen werden bei 4o°C getrocknet und auf Agarplatten ausgelegt, die 6 pg/ml Benzylpenicillin enthalten und dann mit einem ß-Lactamase erzeugenden Stamm von Klebsieila aerogenes (,synergistisches System) beimpft. Die Platten werden über Nacht bei 30°C bebrütet, und die Clavulansäure zeigt sich als Zone eines gehemmten Wachstums. Der R-.-Wert der Zone ist Ö_tK6. Die Menge von 6 ug/ml Benzylpenicillin allein liegt unterhalb der erforderlichen Konzentration, um Klebsiella aerogenes abzutöten, Jedoch in Gegenwart eines ß-Lactamase-Hemmstoffes wird diese Konzentration toxisch, was hinsichtlich des Synergismus zu: sagen ist.

Die Verwendung des vorgenannten synergistischen Systems ermöglicht die Feststellung der Clavulansäure bei Konzentrationen unterhalb denjenigen, bei denen sie eine antibakterielle Wirksamkeit zeigt. ■

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Beschreibung 3 Dünnschicht-Chromatographische Bestimmung des Natriumsalzes

der Clavulansäure

Lösungen von Präparaten des Natriumsalzes der Clavulansäure werden auf Glasplatten, die mit einer 0,25 nrn dicken Schicht von Silikagel (F254) beschichtet sind, in einer Menge von 5 uLiter von 1 mg/ml getüpfelt. Die Chromatogramme laufen bei 22°C unter Verwendung einer oberen Phase eines Gemisches von n-Butanol/ftthanol/· Wasser im Volumenverhältnis von 4:1:5· Die Chromatogrammplatten werden bei 40°C getrocknet. Das Natriumsalz der Clavulansäure wird durch Bioautographie auf Agarplatten mit einem Gehalt von 6 Jig/ml Benzylpenicillin angeordnet und mit Klebsieila aerogenes beimpft (synergistisches System wie bei der vorstehend besprochenen Papierchromatographie). Die Agaroberflache wird mit einem feinen Filtertuch abgedeckt, bevor die Dünnschicht-Chromatographieplatte darübergelegt wird. Nach 15-bis 30minütigem Ruhenlassen zum Befeuchten und Diffundieren wird die Dünnschicht-Chromatographieplatte mit Hilfe des Filtertuches abgehoben und die Agarplatte über Nacht bei JJO⁰C bebrütet, um die Zonen eines gehemmten Wachstums aufzuzeigen. Der R_f-Wertd3s Natriumsalzes der Clavulansäure in dem vorgenannten Lösungsmittel beträgt annähernd 0,37. Zwei sprühbare Reagentien, nämlich Ehrlich¹sches Reagens und Triphenyltetrazolium-chlorid, werden ebenfalls verwendet, um die Zone des Natriumsalzes der Clavulansäure aufzuzeigen. Das erstgenannte Reagens besteht aus 300 mg p-Dimethylaminobenzaldehyd, das in 9 ml Äthanol, 54 ml n-Butanol und 9 ml konzentrierter Chlorwasserstoffsäure gelöst ist. Beim 1- bis 2minütigen Erhitzen der besprühten Dünnschicht-Chromatographieplatte auf 120⁰C er-

• 609839/1013

scheint das Natriumsalz der Clavulansäure als rosaroter Flecken.

Das Triphenyltetrazolium-chlorid-Reagens besteht aus einem Gemisch von 1 Volumenteil einer 4prozentigen Lösung dieser Verbindung in Methanol und 1 Volumenteil methanolischer Natronlauge. Nach dem Aufsprühen werden die Dünnschicht-Chromatographieplatten auf 8O°C erhitzt. Das Natriumsalz der Clavulansäure erscheint als roter Punkt auf weißem Untergrund. . ; . ■

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

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Beispiel I

Herstellung des Methylesters der Clavulansäure

CO₂

,Na

CH₂OH

CH₃

CO₂CH₅

19,8 mg des Natriumsalzes der Clavulansäure werden in 0,5 ml wasserfreiem Dimethylformamid gelöst und mit 0,25 ml Methyljodid behandelt. Nach 90minütigem Stehenlassen bei Raumtemperatur unter wasserfreien Bedingungen werden die Lösungsmittel unter vermindertem Druck abgedampft. Der Rückstand wird mittels Dünnschicht-

Chromatographie an Silikagel (Kieselgel 60F254) gereinigt, wobei das Eluieren mit Äthylacetat den Clavulansäure-Methylester als farbloses öl mit einem R_f-Wert von 0,38 und einer roten Farbe mit Triphenyltetrazolium-chlorid-Spray-Reagens liefert. Die Verbindung hat die folgenden Eigenschaften:

Analyse für

50,70 50,49

5,20 6,57 5,43 6,29

ber.:
gef.:

Xmax (Methanol): keine Absorption über 215

V max (Film): 3300-3600 (breit), 1800, 1750, 1695 cm"

Etwa. 1. Ordnung-NMR_Spektrum (CDC1·,): 2,49(breites s, 1, aus-, getauscht mit D₂O); 3,05 (d, 1, J=17,5 Hz); 3,54 (dd, 1, J=17,5 Hz, J₂=2,5 Hz),· 3,84 (s, 3); 4,2'4 (d, 2, J=7 Hz);

B0 9839/1013

■- 38 -

4,93 (dt, l, J=7 Hz, J₂=I,5 Hz); 5,07 (d, 1, J=I,5 Hz);
.5,72 (d, 1, J=2,5 Hz).

Molekulargewicht (Massenspektrum): 213,0635;
berechnet für C₉H₁₁NO₅: 213,0637·

Die Dünnschicht-Chromatographie des Methylesters zeigt eine einzige Zone bei den folgenden Lösungsmittelsystemen:
Butanol/Äthanol/Wasser-Gemisch als obere Phase im Volumenverhältnis von 4:1:5 einen R^-V/ert von 0,75;

Isopropanol/Wasser-Gemisch im Volumenverhältnis von 7 J 3 einen R--Wert von 0,95; und

Äthylacetat/Äthanol-Gemisch im Volumenverhältnis von 8 : 2 einen R_f-Wert von 0,87.

Diese Zonen werden mittels Bioautographie unter Verwendung von
Klebsiella aerogenes mit einem Zusatz von Benzylpenicillin (also unter Verwendung eines synergistischen Systems) bestimmt.

Beispiel 2 Herstellung des p-Nitrobenzy!esters der Clavulansäure

GH₂OH

CH₂OH

60 9 839/1013

" ³⁹ " 25594ΊΟ

Die Behandlung des Natriuinsalzes der Clavulansäure mit p-Nitrobenzylbroraid in wasserfreiem Dimethylformamid liefert nach der Dünnschicht-Chromatographie ein farbloses öl, das aus einem Gemisch von Chloroform und Äther kristallisiert und den p-Nitrobenzylester der Clavulansäure als weiße federartige Nädelchen vom Fp. 111 bis 112°C liefert, die beim Umkristallisieren einen Schmelzpunkt von 117*5 bis ll8°C haben.

Beispiel jj Herstellung des Benzylesters der Clavulansäure

CH₂OH

CH₂OH

\ CO₂CH₂Ph

Unreines Natriumsalz der 3-(ß-Hydroxyäthyliden)-7-OXo-¹UoXa-I-azabicyclo_//3,2,o7heptan-2-carbonsäure, von der man annimmt, daß sie roh gerechnet 55 mg reine Substanz enthält, wird in 6,4 ml wasserfreiem Dimethylformamid mit O, l8 ml Benzylbromid behandelt. Die Lösung wird 3 Stunden unter wasserfreien Bedingungen bei Raumtemperatur (etwa 17 bis l'8°C) gehalten. Das Reaktionsgemisch wird an Silikagel fraktioniert, mit Sthylacetat eluiert und liefert im wesentlichen in reiner Form den Benzylester der 3-(ß-Hydroxyäthyliden)-7-oxo-4-oxa-l-azabicyclo/3i2,07heptan-2-carbonsäure als farbloses öl in einer Ausbeute von.63 mg.

·-■·■■·■ 609839/1013

IR (Film): l800, 1745, 1695cm"¹;

NMR (CDCl₃): 2,25 (s, 1,. austauschbar mit D₂O); 3,05 (d,l, J-17 Hz); 3,51 (dd, 1, J=17 Hz, J_g=2,5 Hz); 4,24 (d, 2, J=7,5 Hz); 4,92 (dt, 1, J=7,5 Hz, J₂-1,5 Hz); 5,15 (d, 1, J=I,5 Hz.);. 5,24 (s, 2); 5,71 (d, 1, J=2,5 Hz); 7,45* (s, 5). .

Beispiel ^

Herstellung des Benzylesters der Clavulansäure aus rohen Extrakten des Kulturfiltrats von Streptomyces clavuligerus

20 Liter . eines Kulturfiltrats werden-.:- ^„«-^jL.i^wi-r .£_ unter Einsatz eines Kletterverdampfers auf 5 Liter eingeengt. Das Konzentrat wird unter Verwendung eines "Edwards E.F.6"-Gefriertrockenschranks gefriergetrocknet. Die derart erhaltenen 300 g Feststoff enthalten 3 g des Natriumsalzes der Clavulansäure, wie mittels des ß-Lactamase-Hemmversuches festgestellt worden ist. Der Feststoff wird in 900 ml wasserfreiem Dimethylformamid suspendiert und mit 150 ml Benzylbromid versetzt. Das Gemisch wird 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und dann mit 1 Liter Äthylacetat verdünnt. Dann wird das Reaktionsgemisch filtriert, und das Filtrat wird auf ein möglichst geringes Volumen eingedampft. Der ölige Rückstand wird mit einem weiteren Liter Äthylacetat extrahiert. Nach dem Filtrieren des Extrakts wird'das Filtrat wiederum eingedampft und man erhält einen öligen Rückstand, der auf eine 7,6 χ 35,6 cm große Silikagel-Säule Cßiogel Biosei A" mit einer Teilchengröße von 0,15 mm) in Cyclohexan gegeben. Die Säule wird mit Cyclohexan eluiert, um Benzylbromid zu entfernen. Das Lösungsmittel wird dann gegen Äthylacetat ausgetauscht. Man fängt 20 ml-

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Fraktionen auf. Die Fraktionen werden auf das Vorliegen des Benzylesters der Clavulansäure durch Tüpfeln auf mit Silikagel beschichteten Dünnschicht-Chromatographie-Glasplatten (Silikagel 6OF254) und Besprühen mit 2,3,5-Triphenyl-tetrazolium-chlorid-Sprüh-Reagens (TTC) untersucht.

Die Fraktionen, die mit diesem Reagens intensive rote Flecken liefern, werden weiterhin mittels Dünnschicht-Chromatographie an Silikagel-Platten unter Verwendung eines Chloroform-Äthylacetat-Gemisches im Verhältnis 8 : 2 als Lösungsmittel und durch Sprühen der entwickelten Platten mit TTC-Spray geprüft. Der Benzylester der Clavulansäure läuft bei 22° mit einem R_f-Wert von 0,31. Die diesen Ester enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und auf 15 ml eingeengt. Diese Lösung wird nochmals chromatographiert an einer 2,8 χ 4o cm Silikagel-Säule ("Silikagel H, Typ 6θ") mit einem Chloroform/Äthylacetat-Gemisch im Verhältnis 8 : 2 als Lösungsmittel. Es werden 15 ml-Fraktionen gesammelt und wie in der vorbeschriebenen Weise auf den Benzylester geprüft. Die diesen Ester enthaltenden Fraktionen werden auf 8 ml eingeengt und nochmals durch Säulenchromatographie an einer 2,5 x 40 cm Silikagel-Säule (Silikagel H, Typ 60") mit einem Äthylacetat/Cyclohexan-Gemisch im Verhältnis 8 : 2 als Lösungsmittel gereinigt. Die ausgewählten Fraktionen werden vereinigt und unter vermindertem Druck eingedampft. Man erhält ΙβΟ ml reinen Benzylester als öl.

Beispiel ^V5 Herstellung des Clavulansäure-benzylesters

kg eines sprühgetrockneten Feststoffes mit einem Gehalt von g Clavulansäure, wie es durch den ß-Lactamase-Hemmversuch

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festgestellt worden ist, werden wie in Beispiel 16 angegeben erhalten. Der Peststoff wird in 5,5 Liter Dimethylformamid aufgeschlämmt und mit 500 ml Benzylbromid versetzt. Nach 2stündigem Rühren bei Raumtemperatur werden 12 Liter Äthylacetat zugesetzt. Die Feststoffe werden abfiltriert. Das Filtrat wird unter vermindertem Druck eingedampft. Die erhaltenen 212 g öliger Rückstand werden auf eine Säule mit einer Sillkagel-Beschickung von 10 χ 33 cm in Cyclohexan gegeben. Die Säule wird mit 12 Liter Cyclohexan eluiert, um überschüssiges Benzylbromid zu entfernen. Das Eluierungsmittel wird dann gegen Äthylacetat ausgetauscht. Man fängt 500 ml-Fraktionen auf, die auf den Clavulansäure-Benzylester-Gehalt durch Tüpfeln auf Silikagel-Dünnschicht-Chromatographieplatten ("Silikagel 60F254") und Besprühen mit TTC-Sprüh-Reagens geprüft werden. Die intensive rote Flecken liefernden. Fraktionen- werden weiterhin mittels Dünnschicht-Chromatographie an Silikagel mit einem Chloroform/Äthylacetat-Gemisch im Verhältnis 8 : 2 als Lösungsmittel und Besprühen der entwickelten Platten mit TTC-Spray untersucht. Die Fraktionen Nr. 5 bis 13 enthalten den Hauptteil des Esters. Diese Fraktionen werden vereinigt und unter vermindertem Druck zu 79,3 g öl eingedampft. Dieses öl wird dann an einer 10 χ 46 cm-Säule von Silikagel ("Silikagel H, Typ 60") mit einem Chloroform/Äthylacetat-Gemisch im Verhältnis 8 : 2 als Lösungsmittel chromatographiert. Die Fraktionen werden wie zuvor beschrieben gesammelt und ergeben beim Konzentrieren 45*9 g eines Öls, das einen Reinheitsgrad von 62 Prozent aufweist, wie durch NMR-Spektroskopie festgestellt worden ist.

Dieses Produkt wird nochmals an einer 7 x 46 cm-Säule von vernetztem Dextran ("Sephadex LH 20^w) in einem Cyclohexan/Chloroform-

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Gemisch im Verhältnis 1 : 1 Chromatograph!ert. Nach der Auswahl der Fraktionen und nach Einengen erhält man 27>6 g eines farblosen Öls, das den Clavulansäure-benzy!ester mit einem Reinheitsgrad von 95 Prozent darstellt, wie durch NMR-Spektroskopie festgestellt worden ist.

Beispiel 6 Herstellung des Clavulansäure-benzylesters

150 Liter-eines Kulturfiltrats vom pH 7,0 mit einem Gehalt von 16,2 g des Natriumsalzes der Clavulansäure, wie bei dem ß-Lactamase-Hemmversuch festgestelt worden ist, werden mit 5 kg eines Anionenaustauscherharzes in der Chloridform ("Amberlyst A.26") 1 Stunde bei Raumtemperatur verrührt. Das Harz wird dann 'abfiltriert. Das Piltrat wird nochmals geprüft und zeigt, daß 6,4 g" Clavulansäure entfernt worden sind. Das Harz wird mit 20 Liter entsalztem Wasser, dann mit 20 Liter Aceton und schließlich mit 10 Liter Dimethylformamid gewaschen. Nach nochmaligem Filtrieren wird das Harz in 2,5 Liter Dimethylformamid mit einem Gehalt von 0,2-m Natriumiodid suspendiert. Ferner werden 200 ml Benzylbromid zugesetzt. Die Suspension wird gut gerührt. Nach l6stündigem Stehen bei Raumtemperatur fügt man 2 Liter Äthylacetat hinzu, filtriert dann das Harz ab, wäscht es wiederum mit Äthylacetat und vereinigt die Waschwässer mit dem Filtrat. Der Extrakt wird dann auf ein geringes Volumen eingeengt und an einer 7*6 χ 46 cm-Silikagel-Säule ("Silikagel H, Typ 60") mit einem Äthylacetat/Cyclohexan-Gemisch im Verhältnis 8 : 2 als Lösungsmittel chromatographiert. Die den Clavulansäure-benzylester enthaltenden Fraktionen werden ausgewählt, indem man auf Silikagel-Dünnschicht-Chromatographieplatten tüpfelt und mit TTC-Reagens wie im vorstehenden

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Beispiel 24 beschrieben besprüht. Die ausgewählten Fraktionen werden dann auf 20 ml eingeengt und dann an einer 3*8 χ 46 cm-Silikagel-Säule ("Silikagel H, Typ 60") mit einem Chloroform/-Äthylacetat-Gemisch im Verhältnis 8 : 2 als Lösungsmittel chromatographiert. Die ausgewählten Fraktionen werden vereinigt und zu einem farblosen öl eingedampft. Man erhält 440 mg Clavulansäureb'enzylester mit einem Reinheitsgrad von 90 Prozent, wie durch NMR-Spektroskopie festgestellt worden ist.'

B e i s ρ i e 1 J

Herstellung des Clavulansäure-benzylesters aus rohen Extrakten eines Kulturfiltrats von Streptomyces clavuligerus

Ein aliquoter Teil eines wässrigen Rückextraktes aus einem Butanol-Extrakt eines Kulturfiltrats. - - ,. "~ ..■.-..;.

:..i - . _fc wird unter Anwendung eines Gefriertrokkenschranks gefriergetrocknet. Ein Anteil von 24 g des erhaltenen Feststoffes weist einen Gehalt von 0,96 g des Natriumsalzes der Clavulansäure auf, wie durch den ß-Lactamase-Hemmversuch bestimmt worden ist. Dieser Feststoff wird in 75 ml wasserfreiem Dimethylformamid suspendiert. Dann werden 75 ml Benzylbromid zugegeben. Das Gemisch wird 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Dann wird die Suspension mit 500 ml Äthylacetat verdünnt. Nach dem Filtrieren des Gemisches wird das Filtrat unter vermindertem Druck auf einem Drehverdampfer zu einem öligen Rückstand eingedampft. Dieser Rückstand wird auf eine 5 χ 35,5 cm-Silikagel-Säule ("Biogel Biosil A" von einer Teilchengröße unter 0,15 mm) in Cyclohexan gegeben. Aus der Säule wird Benzylbromid eluiert. Dann wird das Lösungsmittel gegen Äthylacetat ausgetauscht. Man sammelt 10 ml-Fraktionen, wobei man den mit einem Gehalt an Clavulansäure-ben-

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zylester wie in Beispiel 24 angegebenen auswählt. Eine weitere Reinigung wird auch durch Säulenchromatographie, wie in Beispiel 24 angegeben, erreicht. Bei diesem Verfahren erhält man 220 mg des reinen Benzylesters. -

BeispielB Herstellung des Natriumsalzes der Clavulansäure

CH₂OH

CO₂CH₂C₆H₅

CH₂OH

,Na

.281 rag im wesentlichen reiner Clavulansäure-benzylester in 25 ml Äthanpl mit einem Gehalt an 82 mg Natriumbicarbonat werden 25 Minuten bei Raumtemperatur und Normaldruck in Gegenwart von 90 mg 10 Prozent Palladium auf Kohle hydriert. Nach dem Abfiltrieren des Katalysators und Waschen mit Wasser und Äthanol werden die vereinigten Filtrate unter vermindertem Druck bei Raumtemperatur eingedampft. Der halbfeste Rückstand wird mit Aceton verrieben, filtriert und mit Äther gewaschen. Man erhält 135 mg des Natriumsalzes der Clavulansäure.

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Beispiel9 " Aktivität des Clavulansäure-msthylesters

Untersuchungen hinsichtlich der antibakteriellen Wirksamkeit in Brühen zeigen, daß der Clavulansäure-methylester ein breites Wirkurigsspektrum, jedoch von etwas geringerer Stärke als die Clavulansäure selbst hat. Es ist nicht klar, ob es sich bei dieser Aktivität um die Aktivität der Verbindung selbst oder um die der durch langsame wässrige Hydrolyse des Esters freigesetzten Clavulansäure handelt. Clavulansäure-methylester zeigt einen bemerkenswerten antibakteriellen Synergismus in Verbindung mit Ampicillin oder Cephaloridin gegenüber solchen Bakterien, die gegen diese Antibiotika resistent sind. Dementsprechend wird die Mindest-Hemmkonzentration für Ampicillin gegenüber Staphylococcus aureus (Russell) von 500 ug/ml auf unter 0,4 in Gegenwart von 1,0 ug/ml Clavulansäure-methylester herabgesetzt. Die Mindest-Hemmkonzentration für Cephaloridin wird von 1,5 pg/ml auf unter 0*03 pg/ml in Gegenwart von 1 ug/ml Clavulansäure-methylester herabgesetzt. Die Mindest-Hemmkonzentration für Ampicillin gegenüber Proteus mirabilis C889 wird von 500 ug/ml auf yi ug/ml in Gegenwart von 5 ug/ml Clavulansäure-methylester herabgesetzt.

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- 1*7 - ■

Beispiel 10

Herstellung von Clavulansäure-Trimethylmethoxymethylester Zu einer gerührten Lösung von 0,37 ε Trimethylessigsäure-brommethylester in 5 ml wasserfreiem Dimethylformamid werden 0,49 g Natriumsalz der Clavulansäure gegeben. Nach 2 Stunden bei Raumtemperatur wird das Reaktionsgemisch mit 20 ml Äthylacetat, 10 ml Cyclohexan und 20 ml Wasser behandelt. Das Gemisch trennt sich in zwei Schichten auf. Die nicht-wässrige Schicht wird abgetrennt, mit 20 ml Wasser gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Die getrocknete Lösung wird eingedampft. Man erhält 500 mg eines Bchwachgelben Öls. -

KMR (CDCl₃): 1,26 (s, 9); 3,13 (d, 1, J=17 Hz);

3,62 (dd, 1, J=17 Hz, J₁=2,5 Hz); 4,3 (d, 2, ■ J=7,5 Hz); 5,0 (dt, 1, Vf,5 Hz, J₂=I,5 Hz); 5,16 (d, 1, J=I,"5 Hz); 5,79 (d, 1, J=2,5 Hz); 5,92<T(s, 2).

IR (flüssiger Film): ß-Lactam-C.O 1800cm"¹,

Ester-C=0 I76O cm"¹.

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Bei&piel ^¹

Herstellung des Clavulansäure-phthalidesters

Zu einer gerührten Lösung von 0,43 g 3-Bromphthalid in 5 ml wasserfreiem Dimethylformamid werden 0,5 g Natriumsalz der Clavulansäure gegeben. Die Lösung wird 2 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen, und dann mit 20 ml Äthylacetat, IO ml Cyclohexan und 30 ml Wasser gut durchgeschüttelt. Die nicht-wässrige Schicht wird mit 20 ml Wasser gewaschen, über'Natriumsulfat getrocknet und eingedampft..Man erhält eine blaßgelbe, gummiartige Substanz. Die beiden diastereomeren Ester werden unter Anwendung einer Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie an einer 40 cm χ 10 mm-Säule von Silikagel ("Merckosorb SI 6θ"' mit einem Teilchendurchmesser von 5 u) aufgetrennt, wobei mit Äthylacetat bei einer Fließgeschwindigkeit von 3 ml/Min, eluiert wird.

Der erste Phthalidester mit einer Rezensionszeit von 7,15 Minuten kristallisiert aus Äthylacetat als Nadeln vom Schmelzpunkt 102⁰C und hat die nachstehenden Eigenschaften.

IR (NujoL.warm); j/ ß-Lactam-C=O 1790 cm"^ Ester-C=0 1755 cm"¹ NMR (CD₃COCD₃): 3,l4 (d, 1, J=17,5 Hz); 3,76 (dd, 1,^=17,5 Hz,

J₂=2,5 Hz),- 4,25 (d, 2, J=7,5 Hz); 5,0 (dt, 1, J₁₌7,5 Hz, J₂=I,5 Hz); 5,4 (s, 1, J=I,5 Hz); . 5,82 (d, 1, J=2,5 Hz); 7,7 (s, 1); 8,06<f(m, 4); Molekulargewicht (Massenspektrum): 331,0696 entspricht C₁^H₁₃NO₇ (berechnet 331,0692).

Das zweite Diastereoisomere mit einer Retensionszeit von 8,85 Minuten hat die folgenden Eigenschaften:

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IR (CH₂C1₂-Lösung)i M ß-Lactam-C=O l8OO cm"¹,

Ester-^O I78O cm"¹; NMR (CDCl-,): 2,42 (breites s, 1 austauschbar mit DpO)j

3,12 (d, 1, J=I8 Hz); 3,60 (dd, 1, J₁₌l8 Hz,

J₂=2,5 Hz); 4,30 (d, 2, J=7,5 Hz);

5,0 (dt, X, J₁₌7,5 Hz, J₂=,!,5 Hz);

5,76 (d, 1, J=2,5 Hz); 7,52 (s, 1); 7,85^S(m, 4).

Beispiel. 12 Herstellung des Clavulansäure-nonylesters

44 mg des Natriumsalzes der Clavulansäure in 2 ml wasserfreiem Dimethylformamid werden mit 76 mg Nonyljodid behandelt und Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Die Lösung wird einge. dampft. Der Rückstand wird an Silikagel fraktioniert, wobei mit einem Gemisch aus Sthylacetat und Hexan im Verhältnis 2 : 1 elui'ert wird. Man erhält ein öliges Produkt.

IR (PiIm):' 1800, 1745, 1690 cm"¹;

Molekulargewicht (Massenspektrometrie): 325,1890 entspricht O₁₇H₂₇NO₅ (berechnet 325,1889).

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Be i s ρ i e 1 13~

Herstellung des Clavulansäure-methylesters

130 mg Clavulansäure in 10 ml Äthanol .werden mit überschüssigem Diazomethan in Äther behandelt. Nach 2 Minuten bei Raumtemperatur zeigt die Dünnschicht-Chromatographie, daß die Umsetzung vollständig ist. Die Lösung wird unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird durch Chromatographie an Silikagel unter Eluierung mit Sthylacetat gereinigt. Die den Clavulansäure- me thylester enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und eingedampft. Man erhält 1C4 mg eines klaren Öls.

Beispiel I¹T * .

Herstellung des Clavulansäure-methylesters " 200 mg Clavulansäure in 5 ml Acetonitril werden gekühlt und bei 0⁰C gerührt. Dann werden 0,5 ml Methanol und 206 mg Dicyclohexyl-

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dicarbodiimid zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Suspension wird filtriert. Das Piltrat wird unter vermindertem Druck eingedampft. Man erhält den rohen Clavulansäure-methylester der durch Chromatographie an Silikagel unter Eluieren mit Äthylacetat gereinigt wird. Man erhält l4o mg eines klaren Öls. .

• B ei s ρ i e 1 15

Herstellung des Clavulansäure-pheny!esters

100 mg Clavulansäure in 5 ml Acetonitril werden gekühlt und bei O⁰C gerührt. Zur Lösung werden 0,94 g Phenol und 100 mg Dicyclohexyldicarbodiimid gegeben. Das Reaktionsgemisch wird über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Suspension wird filtriert. Das Piltrat wird eingedampft. Der Rückstand wird an Silikagel unter Eluierung mit einem Gemisch von Äthylacetat und Hexan im Verhältnis 1 : 1 fraktioniert. Man erhält 70 mg Clavulansäure-Phenylester-,

IR (Film):i I800, 1770, 1690 cm"¹; ■· NMR (CDCl₃): 2,l8 (breites s, 1); 3,06 (dd, 1,J₁=I? Hz, J₂=0,9 Hz);

3,54 (dd, 1, J₁= 17 Hz, J₂=2,6 Hz); 4,29 (d, 2,

J=7,5 Hz); 5,1 (dt, 1, J^7,5 Hz, J₂= 1,5 Hz);

5,29 (d, 1, J=I,5 Hz); 5,76 (dd, 1, J_x=2,6 Hz,

J₂=0,9 Hz); 7,35$ (m, 5).

Molekulargewicht (Massenspektrometrie) = 275,0777 entspricht ^Cl4^H13^N05 (^berechnet 275,0794).

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Beispiel ±β

Herstellung von Clavulansäure-2_>2,2-trichloräthylester 221 mg Natriumsalz cfcr Clavulansäure werden in 5 ml wasserfreiem Tetrahydrofuran suspendiert und bei O⁰C gerührt. Dann werden .211 mg Trichlorathylchlorformiat in 1 ml wasserfreiem Tetrahydrofuran zu der vorgenannten Suspension innerhalb 20 Minuten zugegeben. Man läßt die Temperatur dieses Gemisches auf Raumtemperatur ansteigen und rührt über Nacht. Die Suspension wird filtriert, das Piltrat wird unter- vermindertem Druck eingedampft und der Rückstand wird an Silikagel unter Eluierung mit einem Gemisch mit Äthylacetat und Hexan im Verhältnis 2 : 1 chromatographiert. Man erhält das gewünschte Produkt als öl.

IR (Film): l800, I76O, 1690 cm"¹;

NMR (CDCl₇): 1,56 (breites s, l); 3,07 (dd, 1, ^=17,5 Hz,

J₂=O,7 Hz); 3,56 (dd, 1, J₁₌i7,5 Hz, J₂=2,5 Hz);

4,24 (d, 2, J=7,5 Hz); 4,69 (d, 1, J-12 Hz); ·

•4,92 (d, 1, J=12 Hz); 5,02 (dt, 1, «^=7,5 Hz,

J₂=I,3 Hz); 5,19 (d, 1, J=I,'3 Hz);

5,73^ (dd, 1, J₁₌2,5 Hz, J₂=0,7 Hz).

Molekulargewicht (Massenspektrometrie) = 328, 9621 entspricht Cl₃ (berechnet 328, 9625).

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H₂OH

, R=CH₂Cl₃

CICO.OR

co-aco-0-R

H₂OH

. B e i s ρ i e 1 17

Antibakterielles Spektrum von eiavniangäureestern Die antibakterielle Wirksamkeit von Estern der Clavulansäure gegenüber einer Reihe von Bakterien wird unter Anwendung der Mikrotiter-Methode bestimmt. Reihenverdünnungen von Estern ' - der Clavulansäure in der "Oxoid"-Empfindlichkeits-Testbouillon, die in einer Mikrotiter-Kunststoffcuvette enthalten ist, werden mit einer über Nacht bebrüteten Kulturlösung jedes Organismus beimpft, so daß die Endverdünnung des Impfstoffes 1/100 beträgt. Die Kulturen werden über Nacht bebrütet. Am nächsten Morgen werden die Punkte des bakteriellen Wachstums durch

Beobachtung der Eintrübung der. KUlturlösung beobachtet. Die Ergebnisse, ausgedrückt als angenäherte Mindest-Hemmkonzentrationswerte in ug/ml, sind in der Tabelle ; aufgeführt, die auch zeigt, daS die Verbindung ein breites Spektrum hinsichtlich der antibakteriellen Wirksamkeit besitzt.

60 9839/1013

. Tabelle"

Antibakterielle Wirksamkeit von Clavulansaureestern

Organismus	Mindest-Hemmkonzentrationen von Clavu lansaureestern	Nonyl- ester	Trimethyl- acetoxymethyl- ester	Phthali- dyl- . ester	■1 Mindest- Hemmkon- zentra- ' tion des Natrium salzes der Clavulan säure*
Bacillus subtilis A	3enzyl- 3ster	31	62	125	62
Stapluaüreus Oxford	250	31	31	31	15
Staph.aureus Russell	62	31	62		15
Eseherichia coil 104l8	125	250	125	125	125·
125

3E ' Die Mindest-Hemmkonzentration des Natriumsalzes der Clavulansäure ist zu Vergleichszwecken mit aufgeführt worden.

609839/ 1 013" .

Claims (1)

1. Patentansprüche Ester der Clavulansäure der Formel I

   2.. Ester nach Anspruch 1, die sich von einem Alkohol öder Thiol der allgemeinen Formeln ROH bzw. RSH ableiten, in denen R ein organischer Rest mit bis zu 16 Kohlenstoffatomen ist.

   5. Ester nach den Ansprüchen 1 oder 2, gekennzeichnet durch die allgemeine. Formel IX

   (ix)

   in der R einen Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 9 Kohlenstoffatomen ist, der durch Halogenatome, niedere Alkoxyreste, Hydroxyl-

   gruppen oder durch gegebenenfalls in Salzform vorliegende NR irReste substituiert sein kann, wobei R und B? gleich oder verschieden sind und Wasserstoffatome und/oder niedere Alkylreste ■ bedeuten und auch zusammen mit dem Stickstoffatom einen 5- oder 6-gliedrigen Ring bilden können. .

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   iJ. Methyl-, Äthyl-, Propyl-, Butyl-, 2,2,2-Trichloräthyl-, 2,2,2-Trifluoräthyl-, Benzyl-, p-Nitrobenzyl-, Phenyl-, Acetoxymethyl-, Trimethylacetoxymethyl- und 2-Dimethylamino-äthylester der Clavulansäure.

   5. Clavulansäure-methylester.

   6. Clavulansäure-benzylester.

   7. Clavulansäure-trimethylacetoxymethylester.

   8. Clavulansäure-phthalidylester.

   9. Clavulansäure-phenylester.

   10. Clavulansäure-nonylester.

   11. Clavulansäure-p-brombenzylester.

   12. Verfahren zur Herstellung der Ester der Clavulansäure nach den Ansprüchen 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß man den Stamm Streptomyces clavuligerus züchtet und aus dem Kulturmedium die Clavulansäure oder deren Salz gewinnt und anschliessend in an sich bekannter Weise einen Ester dieser Säure bildet.

   13. Verfahren nach Anspruch 13» dadurch gekennzeichnet, daß man bei der Züchtung den Stamm Streptomyces clavuligerus ATCC 27O6M einsetzt.

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   l4. Verfahren nach den Ansprüchen 12 oder 13, gekennzeichnet durch

   a) Umsetzen eines Salzes der Clavulansäure mit einer Verbindung der allgemeinen Formel Q-R, in der Q eine leicht ersetzbare Gruppe und. R ein organischer Rest ist;

   b) Umsetzen der Clavulansäure mit einem Diazomethan;

   c) Umsetzen der Clavulansäure mit einem Alkohol der allgemeinen Formel ROH, in der R ein organischer Rest ist, in Gegenwart eines die Kondensation beschleunigenden Mittels;

   d) Abspalten von Kohlendioxid aus einer Verbindung der allgemeinen Formel XI

   CH₂OH

   . ■ (XI)

   bo-o-co-o-R⁴

   in der R ein inerter organischer Rest ist, oder e) Umsetzen einer Verbindung der allgemeinen Formel XI mit einem Alkohol der allgemeinen Formel ROH oder einem Thiol der allgemeinen Formel RSH, in denen R organische Reste sind.

   15. Arzneimittel, gekennzeichnet durch einen Gehalt an mindestens einem Ester der Clavulansäure nach den Ansprüchen 1 bis 11.

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   16. Arzneimittel nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß es pharmakologisch verträgliche Verdünnungsmittel und/oder Trägerstoffe und/oder übliche Zusatzstoffe enthält.

   17. Arzneimittel nach den Ansprüchen 15 oder 16 in oral verabreichbarer Form.

   18. Arzneimittel nach mindestens einem der Ansprüche 15 bis 17* gekennzeichnet durch einen Gehalt von 50 bis I5OO mg einer Verbindung nach den Ansprüchen 1 bis 11 ..

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